JP2540563B2 - プラスミノ―ゲンの測定法 - Google Patents

プラスミノ―ゲンの測定法

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JP2540563B2 JP62258482A JP25848287A JP2540563B2 JP 2540563 B2 JP2540563 B2 JP 2540563B2 JP 62258482 A JP62258482 A JP 62258482A JP 25848287 A JP25848287 A JP 25848287A JP 2540563 B2 JP2540563 B2 JP 2540563B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は色原体基質または蛍光発生性基質を用い、ス
トレプトキナーゼの存在下にプラスミノーゲンを測定す
る方法に関する。
プラスミノーゲンの測定は、繊維素溶解にとつてこの
タンパク質が重要であるゆえに今日血栓症の危険のある
人々の診断および監視にとつて通常の構成要素をなして
いる。プラスミノーゲンが欠乏するとしばしば血栓性の
出来事、例えば心筋梗塞、肺塞栓または足の深部静脈の
血栓症を生ずる。ストレプトキナーゼまたはウロキナー
ゼを用いる今日しばしば行われる血栓溶解療法は同じく
充分な濃度の活性化されるプラスミノーゲンが頼りであ
る。
比濁法または放射免疫拡散法を用いる免疫学的測定の
他に、プラスミノーゲンはストレプトキナーゼで活性化
した後に蛍光発生性ペプチド基質または色原体性ペプチ
ド基質を用いて機能的に測定することができる。この分
析法は、プラスミノーゲンがプラスミンに活性化された
後もストレプトキナーゼに結合したままでありそしてこ
の複合物（アクチベーター）は血漿中で遊離のプラスミ
ンと反対に直ちには阻害されないということを利用して
いる。色原体性トリペプチド基質の導入後に、この技法
は「Chromogenic Peptide Substrates,Chemistry and C
linical Usage」128頁、ScullyおよびKakkar編、Church
ill Livingstone,EdingburghおよびNew York、1979年に
はじめて記載された。しかしながらこの方法および他の
類似の知られた方法においては、血漿プラスミノーゲン
を完全にアクチベーター複合物に変換するためには試料
をストレプトキナーゼと約10分間という比較的長い時間
予備インキユベーシヨンすることが必要であり、そして
基質は別個に添加される。
今驚くべきことに、プラスミノーゲンはプラスミン用
の色原体基質の存在下にもストレプトキナーゼにより活
性化されうることが見出された。比較的短い遅滞時間の
のみプラスミンはストレプトキナーゼとの複合物として
形成され、そして基質が分解される。プラスミノーゲン
濃度の低い血漿試料中においても基質の加水分解が速や
かに始まる。かかる方法の利点は、予備インキュベーシ
ョンの必要がなく、さらに、ストレプトキナーゼとプラ
スミン用の色原体基質または蛍光発生性基質と混合物が
用いられる場合には、基質添加のための第２のピペット
操作工程も必要でないことにある。
それゆえ本発明はプラスミンの作用により光学的に測
定可能な分解産物が生成するプラスミン用の基質を用い
てストレプトキナーゼの存在下に体液中のプラスミノー
ゲンを測定するにあたり、体液に実質上同時にストレプ
トキナーゼおよびプラスミン用の色原体基質または蛍光
発生性基質を加え、そして所定の時間に形成された分解
産物の量または分解産物の生成速度、およびそれからプ
ラスミノーゲンの濃度を測定することを特徴とする方法
に関する。
本発明方法は以下のようにして実施されうる。すなわ
ち、試料のプラスミノーゲン濃度は色原体基質の他に過
剰のストレプトキナーゼ、好ましくは1000U/mlのストレ
プトキナーゼを含有する試薬を用いて測定されうる。そ
れにより試料のプラスミノーゲンがプラスミノーゲン−
ストレプトキナーゼ複合物に変換され、これが色原体基
質を変換させる。この方法における評価は色原体基質か
ら開裂された発色団の生成速度（δ単位／分）を測定す
ることにより行われる。しかしまた、所定の吸光差、好
ましくは0.1単位、の生成に必要な時間を測定すること
もできる。
この２種の評価において試料中のプラスミノーゲン濃
度は測定されるパラメーターに比例する。
この方法（態様１）を慣用の方法と比較すると40個の
患者試料でよく一致した（実施例１）。
しかしまた、以下のようにして操作することもでき
る。すなわち、この目的にはストレプトキナーゼ濃度が
より低い試薬が用いられる。その場合ストレプトキナー
ゼ−プラスミノーゲン複合物がプラスミノーゲンに作用
することにより生成するプラスミンの濃度から試料のプ
ラスミノーゲン含量が測定される。プラスミンの生成速
度を測定することにより、プラスミノーゲンを定量的に
測定することが可能であるのみならずプラスミノーゲン
の活性化可能性に対する情報を得ることも可能である
（態様２）。この評価は試薬の添加後に所定の吸光差、
好ましくは0.1U、に達するに必要な時間を測定すること
により行われる。
40人の患者の血漿試料において、34例で態様１と２の
結果が良く一致することが示された。６例においては、
態様１では正常なプラスミノーゲン濃度が見出された
が、態様２を用いる測定では正常値の50％以下の値が得
られた（実施例２）。
本発明による方法は好適には緩衝された溶液、例えば
pH6〜９を有する燐酸塩、トリス、HEPESまたは酢酸塩酸
緩衝、好ましくは燐酸塩緩衝液、特にpH7.5の0.1モル／
燐酸カリウムを用いて実施される。
色原体基質としてはすべてのプラスミン用色原体基質
が適当である。
Ｈ−Ｄ−CHA−NVA−Lys−pNA Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA Ｈ−Ｄ−NVA−CHA−Lys−pNA Ｈ−Ｄ−NLEU−CHA−Arg−pNA Ｈ−Ｄ−But−CHA−Lys−pNA Ｈ−Ｄ−NLEU−CHA−Lys−pNA Ｈ−Ｄ−Phe−Tyr−Arg−pNA 証明： CHA シクロヘキシルアラニン NVA ノルバリン pNA ｐ−ニトロアニリド NLEU ノルロイシン But ε−アミノ酪酸 以下の実施例により本発明を説明する。
実施例 １ ストレプトキナーゼ（Behringwerke AG社製、Marbur
g、西ドイツ）をpH7.5の0.1モル／燐酸カリウム緩衝
液中に約1000国際単位（IU）/mlの濃度に溶解させた。
この溶液4mlに色原体基質Ｈ−Ｄ−シクロヘキシルアラ
ニル−ノルバリル−リジル−ｐ−ニトロアニリド（Pent
apharm AG社製、Basel）の10ミリモル／溶液0.1mlを
混合しそしてこの溶液を37℃に加温する。この溶液500
μを37℃に予熱したキユベツト中血漿50μにピペツ
トで加えた。405nmでの吸収を測定した。吸収と時間と
の関係は約30秒後には事実上直線状であった。相関関係
の直線状の部分からδU/分を測定した。
標準曲線の作成： 血漿を等張食塩溶液で希釈することにより連続希釈物
を調製しそして各希釈物を前記したようにして処理し
た、標準曲線を得るには、40秒の遅滞期後の直線状をし
た、１分当りの吸光増大を用いるか、または所定の吸光
差に達するまでの時間を用いた。
その結果を下記の表に示す。
濃度に対するδU/分をプロツトすることにより直線が
得られた。吸光差0.1Uに達する時間を半逆数でプロツト
すると、同様に直線が得られた。
実施例 ２ プラスミノーゲンの測定は実施例１におけると同様に
行われるが、しかし40IU/mlのストレプトキナーゼ濃度
を有する試薬を用いた。ストレプトキナーゼ濃度が低下
すると、標準曲線の形状が変化する。特にストレプトキ
ナーゼ濃度が低い場合、例えば40IU/mlである場合は、
固定したδＵ例えば0.1の反応時間を測定することによ
り、ストレプトキナーゼによるプラスミノーゲンの活性
可能性についての情報を得ることができる。かかる情報
は心筋梗塞を有する患者にとつて重要である。
実施例１および２の方法による40例の患者試料のプラ
スミノーゲン測定を比較すると、合計34例の試料でプラ
スミノーゲン濃度が正常範囲内にあることが判明し、そ
の場合２種の方法の数値はよく一致している。しかしな
がら６個の試料では実施例２の方法によれば病的数値が
見られた（正常値の50％より少ない）。

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】基質に対するプラスミンの作用により光学
    的に測定可能な分解産物が生成するものである、プラス
    ミン用の基質を用いて、ストレプトキナーゼの存在下に
    体液中のプラスミノーゲンを測定するにあたり、体液に
    実質上同時にストレプトキナーゼおよびプラスミン用の
    色原体基質または蛍光発生性基質を加え、そして所定の
    時間に生成した分解産物の量または分解産物の生成速
    度、およびそれからプラスミノーゲン濃度を測定するこ
    とを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】体液が血漿であることを特徴とする特許請
    求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】存在するプラスミノーゲン量に対し過剰モ
    ルのストレプトキナーゼを用いることによりプラスミノ
    ーゲンの総濃度を測定することを特徴とする特許請求の
    範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】存在するプラスミノーゲンが過剰モルとな
    るような量のストレプトキナーゼを用いることによりプ
    ラスミノーゲンの活性化速度を測定することを特徴とす
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】ストレプトキナーゼとプラスミン用の色原
    体基質または蛍光発生性基質とがそれらの混合物の形態
    で体液に加えられることを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載の方法。
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DE3784000D1 (de) 1993-03-18
EP0264753A2 (de) 1988-04-27
AU7980187A (en) 1988-04-21
JPS63105698A (ja) 1988-05-10
DE3635191A1 (de) 1988-04-21
ATE85364T1 (de) 1993-02-15
EP0264753B1 (de) 1993-02-03
CA1316088C (en) 1993-04-13
EP0264753A3 (en) 1988-12-28
AU602535B2 (en) 1990-10-18
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