JP2025526005A

JP2025526005A - ３，６－アンヒドロ－ｌ－ガラクトース（ｌ－ａｈｇ）を含有する免疫抑制用組成物

Info

Publication number: JP2025526005A
Application number: JP2025507121A
Authority: JP
Inventors: ヨンホキム; シンヨンパク; ウォンヨンチャン
Original assignee: キョンプクナショナルユニバーシティインダストリー－アカデミックコオペレーションファンデイション
Priority date: 2022-08-10
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2025-08-07
Also published as: CN119677521A; KR102675876B1; US20250161337A1; KR102537335B1; WO2024034735A1; KR20240021690A; EP4349342A4; EP4349342A1

Abstract

本発明は、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（Ｌ－ＡＨＧ）を有効成分として含有する免疫抑制用組成物、前記有効成分を含有する免疫性疾患の予防または治療用の医薬組成物、健康機能食品及び機能性化粧料組成物に関する。本発明のＬ－ＡＨＧを含有する免疫抑制用組成物、医薬組成物、健康機能食品及び機能性化粧料組成物は、免疫抑制剤の主な標的であるＣＤ４Ｔ細胞の活性化、増殖及び分化を選択的かつ効果的に抑制する優れた効果を有するため、製薬産業、食品産業及び化粧品産業において非常に有用な発明である。
【選択図】図２

Description

本発明は、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（Ｌ－ＡＨＧ）を有効成分として含有する免疫抑制用組成物、前記有効成分を含有する免疫性疾患の予防または治療用の医薬組成物、健康機能食品及び機能性化粧料組成物に関する。

免疫系は場合によっては不適切に作用することもあり、代表的な例として、過度に反応して過敏反応を引き起こしたり、あるいは、自己分子と非自己分子を識別できずに自己分子に対する免疫反応を誘導した結果、自己免疫疾患を引き起したりするケースがある。また、治療目的で移植された同種移植片に対してレシピエントの免疫系が引き起こす免疫拒絶反応は、移植片の維持及び生存の観点からは不適切な免疫反応と言える。

人体で起こるアレルギーまたは１型過敏反応は、主に免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が関与して引き起こされる反応であり、体内の肥満細胞及び好塩基球の細胞表面に存在するＩｇＥに特異的な抗原が結合すると、これらの細胞から過敏状態と炎症を引き起こす媒介物質が放出される。過敏性反応の主な症状としては、くしゃみ、喘鳴、喘息、アトピー性皮膚炎、皮膚発疹などがある。

免疫系が自己と非自己の分子を識別する機能を失い、宿主を免疫学的に攻撃する自己免疫は、様々な慢性衰弱性疾患の原因となる。自己免疫によって引き起こされる主な疾患には、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、乾癬、橋本氏甲状腺炎、及び最近若年層で問題となっている急性炎症性腸疾患などがある。

人体の免疫系は、外来細胞や組織と接触すると、このような外来要素を除去するために強く反応する。しかし、場合によっては、患者の免疫系がそれを外来要素として認識し、それを拒絶する免疫反応を開始したとしても、他のドナーから提供された細胞、組織、または臓器の移植が、患者の疾患に対する唯一の治療方法である場合もある。例えば、米国だけでも毎年１００，０００人以上の人々が腎臓移植による治療を必要としていると推定されている。しかし、免疫系は、移植された細胞、組織、または臓器が自己として認識されない場合、免疫拒絶反応によって攻撃し、除去する。したがって、免疫拒絶反応は、このような生命を救う移植治療法の重大な障害障害となっている。移植におけるさらなるリスクは、移植された免疫細胞が新しい宿主を非自己と認識し、これに対抗して反応することである。この反応は移植片対宿主病と呼ばれ、致命的となることがある。

そのため、人体の免疫系が引き起こす過敏反応、自己免疫疾患、同種移植片に対する免疫拒絶反応及び移植片対宿主病などの不適切な免疫反応を調節するために、免疫抑制薬物を使用している。現在使用されている免疫抑制剤にはコルチコステロイド系（プレドニゾン）、抗増殖剤（マイコフェノール酸モフェチル（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標））、カルシニューリン阻害剤［タクロリムス（ＥｎｖａｒｓｕｓＸＲ（登録商標）またはＰｒｏｔｏｐｉｃ（登録商標））、シクロスポリン［Ｇｅｎｇｒａｆ（登録商標）、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）またはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ（登録商標））］、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤［ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（Ｒａｐａｍｕｎ（登録商標））］、免疫細胞を標的とするポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体などがある。現在使用されている免疫抑制剤は、腎機能不全などの他の臓器への損傷を引き起こす副作用も伴い、効果の面でも満足できるものではない。したがって、薬物の副作用を最小化するための安全で標的特異的な免疫抑制剤の開発が求められている。

最近まで、人体免疫系に対する理解の増進とバイオテクノロジーの発展により、臨床的に免疫抑制剤の投与が必要とされる過敏性反応の患者、自己免疫疾患患者、幹細胞移植または骨髄移植を含む臓器移植患者には、不適切な免疫反応を調節するために、患者の状態や症状に応じて様々なタイプの免疫抑制剤が単独または併用療法として治療に活用されてきている。

人体の免疫機能を人為的に抑制する目的で患者に使用される典型的な免疫抑制剤の作用標的はＴ細胞に集中しており、実際、Ｔ細胞の中でも主にＣＤ４Ｔ（Ｔｈ）細胞の機能抑制が代表的な作用機序（作用メカニズム）である。これは、エフェクターＴｈ細胞由来のサイトカインが、Ｔ細胞が主役である細胞性免疫反応のみならず、Ｂ細胞由来の抗体分子が主役である体液性免疫反応にも重要に関わっているからである。特に、細胞傷害性ＣＤ４＋Ｔ細胞が重要な原因として関与していることが報告されているシェーグレン症候群、ベーチェット病、全身性硬化症、多発性筋炎、および皮膚筋炎では、Ｔ細胞の活性化を阻害することが重要な治療選択肢となりうる。

したがって、休止Ｔｈ細胞の活性化、増殖、及びエフェクターＴｈ細胞への分化を適切に遮断することができる手段によって、免疫抑制効果が十分に発揮できる。免疫反応の誘導と調節に関与するＴｈ細胞の重要性は、ヒト免疫不全ウイルスに感染してＴｈ細胞の機能障害が発生した患者に免疫不全症が起こるという現象によってもよく証明されている。

これまでに開発された免疫抑制剤の使用によって引き起こされる副作用、潜在的なリスク、または合併症を改善するためには、不適切な免疫反応のみを特異的に抑制できる新たな免疫抑制剤の開発が引き続き求められている。

本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、免疫抑制剤の主な標的であるＣＤ４Ｔ細胞の活性化、増殖及び分化を効果的に抑制することができる新規な免疫抑制用組成物、免疫性疾患の予防または治療用の医薬組成物、健康機能食品及び機能性化粧料組成物を提供することである。

上記目的を達成するために、本発明は、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを有効成分として含有する免疫抑制用組成物を提供する。

前記組成物は、ＣＤ４Ｔ細胞の活性化、増殖または分化を抑制することが好ましい。

前記組成物は、Ｇ１期またはＳ期の細胞周期の進行を遮断することが好ましい。

前記組成物は、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞への分化を抑制することが好ましい。

前記組成物は、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４またはインターロイキン－１３の産生を抑制することが好ましい。

また、本発明は、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを有効成分として含有する免疫性疾患の予防または治療用の医薬組成物を提供する。

前記免疫性疾患は、過敏性免疫疾患、自己免疫疾患、免疫拒絶反応、移植片対宿主病、シェーグレン症候群及びベーチェット病からなる群から選択されることが好ましい。

前記過敏性免疫疾患は、アレルギー、くしゃみ、喘鳴、喘息、アトピー性皮膚炎及びじんましん（蕁麻疹）からなる群から選択されることが好ましい。

前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、乾癬、橋本氏甲状腺炎、全身性エリテマトーデス及び急性炎症性腸疾患からなる群から選択されることが好ましい。

また、本発明は、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを含有する免疫性疾患の予防または改善用の健康機能食品を提供する。

また、本発明は、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを有効成分として含有する過敏性皮膚疾患の予防または改善用の機能性化粧料組成物を提供する。

前記過敏性皮膚疾患は、日光性皮膚炎、接触性皮膚炎及びアトピー性皮膚炎からなる群から選択されることが好ましい。

本発明の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（Ｌ－ＡＨＧ）を含有する免疫抑制用組成物、医薬組成物、健康機能食品及び機能性化粧料組成物は、免疫抑制剤の主な標的であるＣＤ４Ｔ細胞の活性化、増殖及び分化を選択的かつ効果的に抑制する優れた効果を有するため、製薬産業、食品産業及び化粧品産業において非常に有用な発明である。

マウス脾臓から分離したＧ０Ｔ細胞におけるＣＤ４（Ｔｈ）細胞及びＣＤ８（Ｔｃ）細胞の分布を示す図である。アガロースの酵素的加水分解から得られる３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（Ｌ－ＡＨＧ）、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ、ＮＡ２）、ネオアガロテトラオース（ｎｅｏａｇａｒｏｔｅｔｒａｏｓｅ、ＮＡ４）及びネオアガロヘキサオース（ｎｅｏａｇａｒｏｈｅｘｏｓｅ、ＮＡ６）の固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で活性化されたＴ細胞の増殖効果を［^３Ｈ］チミジン取り込みアッセイ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎａｓｓａｙ）の結果を示す図である。Ｌ－ＡＨＧのＣＤ４Ｔ細胞の細胞周期進行を特異的に遮断する結果を示す図であり、Ｇ０Ｔ細胞を活性化後２０時間経過したときにノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）で処理した。Ｌ－ＡＨＧのノコダゾール未処理のＣＤ４Ｔ細胞の細胞周期の進行を遮断する様相を示す図である。Ｌ－ＡＨＧの処理による、固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で活性化されたＴ細胞におけるＴｈ１分泌サイトカイン（ＩＮＦ－γ、ＩＬ－２）及びＴｈ２分泌サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－１３）の産生を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明では、非海洋性淡水環境から分離した寒天分解菌セルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１菌株（ＫＣＴＣ１３６２９ＢＰ）由来の組換えＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼ、ＧＨ５０Ａ β－アガラーゼ及びＧＨ１１７ α－ネオアガロビオース加水分解酵素を併用して処理する酵素プロセスによりアガロースを糖化させた後、最終分解産物として生成された単量体（モノマー）である３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースとＤ－ガラクトースの混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分画し、最終的にＬ－ＡＨＧを精製した。精製したＬ－ＡＨＧの免疫抑制活性を明らかにするために、マウス休止（Ｇ０）Ｔ細胞のｉｎｖｉｔｒｏ活性化及び細胞周期の開始を誘導するモデルを用いて、休止Ｔｈ細胞の活性化及び増殖に及ぼすＬ－ＡＨＧの影響を調べた。その結果、休止Ｔｈ細胞が、Ｔ細胞受容体複合体に結合した固定化抗ＣＤ３とＴ細胞共刺激受容体に結合した固定化抗ＣＤ２８の同時刺激により活性化され、Ｇ０期を脱し、Ｇ１→Ｓ→Ｇ２／Ｍ期の順に細胞周期を進行する際、Ｌ－ＡＨＧの存在は、活性化されたＴｈ細胞のＧ１期及びＳ期の進行を阻害することにより、Ｔ細胞の増殖を減少させる免疫抑制効果を発揮できることが確認された。

したがって、本発明は、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを有効成分として含有する免疫抑制用組成物を提供する。

前記有効成分は、アガロースの酸加水分解または酵素的分解から得ることができる。

好ましい具体例では、本発明の有効成分は、アガロースを酸加水分解反応させて得ることができる。

他の好ましい具体例では、本発明の有効成分は、寒天分解細菌セルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１菌株（ＫＣＴＣ１３６２９ＢＰ）由来の組換えＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼ、ＧＨ５０Ａ β－アガラーゼ及びＧＨ１１７ α－ネオアガロビオース加水分解酵素を併用して処理する酵素プロセスによりアガロースを糖化させた後、最終分解産物として生成された単量体（モノマー）である３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースとＤ－ガラクトースの混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分画して得ることができる。

さらに他の好ましい具体例では、本発明の有効成分は、アガロースのアガラーゼ－３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトシダーゼ－アラビノースイソメラーゼ酵素複合体産物から得ることができる。

上述のＬ－ＡＨＧを得るためのいくつかの方法の他に、本発明の有効成分は、また、商業的に入手することもできる。例えば、カナダ、オンタリオ州ノースヨーク（Ｃａｎａｄａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，ＮｏｒｔｈＹｏｒｋ）所在のＴｏｒｏｎｔｏＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓから購入することができる。

本発明の有効成分を含有する免疫抑制用組成物及び医薬組成物は、それぞれの使用目的に合わせて、通常の方法に従い、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エアゾール剤などの経口剤形、滅菌注射溶液の注射剤など様々な形態に剤形化して使用することができ、経口投与することができ、静脈内、腹腔内、皮下、直腸、局所投与などを含む種々の経路を通じて投与することができる。

このような医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤などをさらに含み得、含まれ得る好適な担体、賦形剤または希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。また、本発明の医薬組成物は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含み得る。

好ましい具体例では、経口投与用の固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が挙げられ、これらの固形製剤は、前記免疫抑制用組成物及び医薬組成物に少なくとも１種の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチン等を混合して製剤化する。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の潤滑剤を使用することもできる。

好ましい具体例では、経口用液体製剤としては、懸濁剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる単純な希釈剤である水、液体パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。

好ましい具体例では、非経口投与製剤としては、滅菌済みの水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤などが挙げられる。非水性溶剤、懸濁剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが含まれ得る。注射剤には、溶解剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤などの従来の添加剤が含まれ得る。

本発明の有効成分は、薬学的に有効な量で投与される。本発明において、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野で公知の要素に基づいて決定することができる。本発明の免疫抑制用組成物及び医薬組成物は、単独の治療剤として投与することも、他の治療剤と併用して投与することも、従来の治療剤と順次又は同時に投与することも、単回又は複数回投与することもできる。上述した諸要素を考慮して、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者であれば容易に決定することができる。

好ましい具体例では、本発明の免疫抑制用組成物及び医薬組成物において、有効成分の有効量は、患者の年齢、性別、体重に応じて変化し得るが、一般には、体重１ｋｇ当たり１ｍｇ～１，０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ～２０ｍｇを毎日又は隔日に投与してもよく、１日１～３回に分けて投与してもよい。ただし、投与経路、疾患の重症度、性別、体重、年齢などに応じて投与量は増減し得るので、前記投与量はいかなる方法であれ本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の免疫抑制用組成物及び医薬組成物は、様々な経路で被験者に投与され得る。投与におけるあらゆる方式が予想され得るが、例えば、経口、直腸又は静脈、筋肉、皮下、子宮内、硬膜又は脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射により投与され得る。

本発明において、「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を提供することを意味し、本発明の免疫抑制用組成物及び医薬組成物は、標的組織に到達できる限り、一般的なあらゆる経路を介して経口又は非経口投与することができる。また、本発明の免疫抑制用組成物及び医薬組成物は、有効成分を標的細胞に送達できる任意の装置を用いて投与することもできる。

本発明において、「対象」とは、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットを含み、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを意味する。

本発明の健康機能食品は、免疫性疾患の予防または改善に効果的な食品及び飲料などに様々に利用され得る。本発明の有効成分を含有する食品としては、例えば、各種食品類、飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがあり、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは飲料の形態で使用することができる。

本発明の有効成分は、一般に、食品の総重量に対して０．００１～１０重量％で添加され得、健康飲料組成物は、１００ｍｌを基準として０．００１～１０ｇ、好ましくは０．０１～１ｇの割合で添加され得る。

本発明の健康機能食品は、表示された割合で必須成分として前記化合物を含有することに加えて、食品学的に許容される食品補助添加剤、例えば、天然炭水化物及び様々な香味剤などを追加成分として含有することができる。

前記天然炭水化物の例としては、単糖類（グルコース、フルクトース等）、二糖類（マルトース、スクロース等）及び多糖類（デキストリン、シクロデキストリン等）のような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトール等の糖アルコールが挙げられる。

前記香味剤としては、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（レバウディオサイドＡまたはグリチルリチン等）等）、及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム等）を用いることができる。前記天然炭水化物は、一般に、本発明の健康機能食品１００ｍｌ当たり約１～２０ｇ、好ましくは約５～１２ｇの量を使用する。

前記以外に、本発明の健康機能食品は、種々の栄養剤、ビタミン、ミネラル、合成風味剤及び天然風味剤等の風味剤、着色剤及び増進剤（エンハンサー）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等を含有し得る。

その他、本発明の健康機能食品は、天然果汁、果汁飲料及び野菜飲料等の製造に使用される果肉を含有することもできる。これらの成分は、単独で、または組み合わせて使用することができる。これらの添加剤の割合は、本発明の有効成分１００重量部当たり１０～約５０重量部の範囲で選択されるのが一般的である。

本発明の化粧料組成物の有効成分は、組成物の総重量に対して０．００１～１重量％、好ましくは０．０１～０．１重量％、より好ましくは０．０５～０．５重量％で含有されてもよい。このような含有量の範囲であれば、適切な剤形安定性を確保することができ、所望の抗酸化効果が期待できる。

本発明の前記組成物は、本発明の有効成分に加えて、本発明の有効活性を阻害しない限りにおいて、抗酸化、皮膚老化防止及び皮膚再生促進の効果のための公知の天然物抽出物やその他の成分をさらに含めて使用可能である。

さらに、前記組成物は、化粧料組成物に通常添加されている成分、例えば、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤（ｆｏａｍｉｎｇａｇｅｎｔ）、芳香剤、界面活性剤、水、イオン性または非イオン性乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤及びキレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性の活性剤など、化粧品学または皮膚科学の分野において通常用いられる補助剤や担体を含んで特定の剤形に成形可能である。

本発明の化粧料組成物は、当業界において通常製造されるいかなる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、パック、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、及びスプレーなどに剤形化可能であるが、これらに限定されるものではない。より具体的には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、粉末ファンデーション（パウダーファンデーション）、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、コンパクト、リップグロス、リップスティック、シャドウ、シャンプー、及びリンスなどの剤形に製造可能である。

本発明の製剤がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが使用可能である。

本発明の製剤がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが使用可能であり、特に、スプレーである場合には、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルなどの推進体をさらに含んでいてもよい。

本発明の製剤が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が使用され、その例としては、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられる。

本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラカントなどが使用可能である。

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが使用可能である。

また、本発明は、Ｌ－ＡＨＧを含有するＴ細胞の活性化、増殖または分化抑制用の試薬組成物を提供する。

前記Ｔ細胞は、ＣＤ４Ｔ細胞であることが好ましい。

前記活性化は、休止Ｔ細胞の活性化を意味する。

前記増殖とは、Ｔ細胞の細胞周期の進行による個体数の増加を意味する。

前記分化とは、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞への分化を意味する。

前記組成物は、生体外条件下、好ましくは試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）条件下でＴ細胞に適用することにより、Ｔ細胞の活性化、増殖及び分化を抑制することができる。

また、本発明は、生体外（ｅｘｖｉｖｏ）条件下で、Ｔ細胞に本発明のＬ－ＡＨＧを処理することを特徴とするＴ細胞、好ましくはＣＤ４Ｔ細胞の活性化、増殖または分化抑制方法を提供する。

前記生体外条件とは、Ｔ細胞が生体から物理的に完全に分離されて存在する状態を意味し、試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）条件であることが好ましい。

前記Ｔ細胞は、被験者の血液から分離された細胞、これを継代培養した細胞、または細胞株であり得る。

前記処理は、例えば、細胞培養皿内のＴ細胞を含む培地にＬ－ＡＨＧを添加することにより行うことができ、処理濃度は１．０～１，０００μｇ／ｍＬ、好ましくは１２．５～４００μｇ／ｍＬであることが好ましい。

前記分化抑制は、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞への分化抑制であってもよい。Ｔｈ１及びＴｈ２細胞への分化抑制により、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４またはインターロイキン－１３の分泌量が減少する可能性がある。

以下、具体的な実施例に基づいて本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明の好ましい一具体例を示すものであり、本発明の権利範囲は、以下の実施例に記載された事項によって限定されると解釈されるものではない。

１．材料及び方法
１．１．動物
５～６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスをオリエント社（京畿道城南市中原区カルマチロ３２２、韓国）から購入し、ＫｙｕｎｇｐｏｏｋＮａｔｉｏｎａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ－ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＲｅｓｏｕｒｃｅｓＣｅｎｔｅｒ（大邱広域市中区国債補償路６８０、韓国）において特定の病原菌フリー条件下で維持しながら実験に使用した。

１．２．化学物質、抗体、試薬及び培地
マウス組換えＩＬ－２（ｒＩＬ－２）はＣａｍｂｒｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。ウサギ由来の抗マウスＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入し、抗ＣＤ３はＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＩＬ－２活性を中和するためのヤギ由来の抗マウスＩＬ－２抗体はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から購入し、ラット由来のＩＬ－２Ｒ中和抗体はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。ＥＣＬウェスタンブロッティングキットはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）から購入した。ウェスタン分析用のＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ膜はＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。微小管脱重合剤であるノコダゾール及びその他のすべての電気泳動用試薬はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ．，ＵＳＡ）から購入した。

アガロースの加水分解産物であるネオアガロテトラオース（ＮＡ４）及びネオアガロヘキサオース（ＮＡ６）を得るために、熱処理により水に溶解した９．０％アガロースを、ＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼ（１．６μｇ／ｍＬ）を用いて、最適反応条件（１ｍＭのＭｎＣｌ_２及び１０ｍＭのＴＣＥＰ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（トリス塩酸塩）、ｐＨ７．０，５０℃）下で、マグネチックスターラーで連続的に攪拌しながら１４時間加水分解し、ＮＡ４とＮＡ６を生成した。生成したＮＡ４／ＮＡ６混合物を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分画し精製した。アガロースからネオアガロビオース（ＮＡ２）を得るために、まず、９％アガロースをＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼで５０℃にて処理してＮＡ４／ＮＡ６を含むネオアガロオリゴ糖（ＮＡＯＳ）に１次加水分解し、次いで、温度を３５℃に下げ、ＧＨ５０Ａ β－アガラーゼ（２０μｇ／ｍＬ）を加え、１４時間反応させることでＮＡ２を生成した。反応生成物中のＮＡ２を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分画し精製した。また、アガロースの構成単量体であるＬ－ＡＨＧを得るために、まず、９％アガロースをＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼで５０℃にて処理してＮＡ４とＮＡ６を含むＮＡＯＳに１次加水分解し、次いで、温度を３５℃に下げ、ＧＨ５０Ａ β－アガラーゼ（２０μｇ／ｍＬ）とＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（６０μｇ／ｍＬ）を同時に加え、１４時間反応させることにより、単量体であるＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースの混合物を最終生成物として得た。この混合物中のＬ－ＡＨＧを最終精製するために、混合物を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１０カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分画した。

Ｔリンパ球の活性化及び培養に使用した培地は、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，ＬｏｇａｎＵｔａｈ，ＵＳＡ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭのβ－メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０を、完全培地と名付けた。

１．３．休止（Ｇ０）Ｔ細胞の分離、活性化及び［^３Ｈ］チミジン取り込みの測定
４～５ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス由来の脾臓から休止（Ｇ０）Ｔリンパ球の分離は、Ｔ細胞精製カラムキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いた脾臓細胞からのネガティブセレクション（ｎｅｇａｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により行われた。このとき、Ｇ０Ｔ細胞の活性化のためには、前述のＫｉｍらの方法に変更して行い、この場合、培養プラスチック容器の表面に抗ＣＤ３（２．０μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（２．０μｇ／ｍＬ）を円滑にコーティングするために、ウサギ抗ハムスターＩｇＧ抗体（２０μｇ／ｍＬ）による前処理を行った。

固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により活性化されたＴ細胞の増殖を評価するために、抗ＣＤ３（２．０μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（２．０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた９６ウェルプレートの各ウェルに、１×１０^５個のＧ０Ｔ細胞と各濃度のＬ－ＡＨＧを２００μＬのＲＰＭＩ１６４０完全培地と共に添加して培養することで活性化を開始し、活性化後２９時間経過したときに、各ウェルに０．２５μＣｉの［^３Ｈ］チミジンを入れ、１２時間さらに培養しながら、増殖するＴ細胞のＤＮＡ内に取り込まれた［^３Ｈ］チミジンの量を液体シンチレーションカウンターで定量した。

固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により活性化されたＴ細胞の細胞周期を分析するため、あるいは培養上清中のサイトカイン濃度を分析するために、抗ＣＤ３（２．０μｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ２８（２．０μｇ／ｍＬ）でコーティングされた３５ｍｍプレートの各ウェルに、３×１０^６個のＧ０Ｔ細胞と各濃度のＬ－ＡＨＧを２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０完全培地と共に添加して培養することで活性化を開始し、活性化後３０時間経過した時点で培養を停止し、遠心分離により細胞と培養上清を回収した。

同じ培養条件下で、Ｇ０Ｔ細胞の活性化により開始された最初の細胞周期の進行を、ノコダゾール処理によって前中期で停止させるために、Ｔリンパ球を２０時間活性化した後、ノコダゾールを０．２μｇ／ｍＬの濃度で添加し、さらに１０時間培養した。培養終了後、培養物を遠心分離して、細胞と培養上清を回収した。

１．４．蛍光標識抗ＣＤ４／抗ＣＤ８抗体を用いたＴ細胞表面染色及びＤＡＰＩを用いた細胞内ＤＮＡ染色
Ｔ細胞精製カラムキット（Ｒ＆Ｄ）を用いてマウス脾臓細胞から分離した休止（Ｇ０）Ｔ細胞、及び、固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でＧ０Ｔ細胞を一定時間活性化して得たＴ細胞を対象にして、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及びＤＡＰＩ染色を行った。約５×１０^５個の細胞を１００μＬの１ＸＰＢＳ／１％ＦＢＳ溶液に懸濁した後、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８をそれぞれ０．５μ添加し、４℃で１５分間反応させ、次いで、１ＸＰＢＳ／１％ＦＢＳで２回洗浄した。その後、細胞を１％パラホルムアルデヒド溶液で４℃にて１５分間固定し、固定した細胞を１ＸＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、１０μＭのＤＡＰＩで１５分間染色した。染色された細胞をフローサイトメーター（ＡｔｔｕｎｅＮｘＴｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で測定し、ＣＤ３Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞の比率と細胞内ＤＮＡに結合したＤＡＰＩ量による青色蛍光の増加に基づく細胞周期分布を分析した。

１．５．酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）
Ｔ細胞の培養上清を回収した後、ＥＬＩＳＡキット（ＭｏｕｓｅＵｎｃｏａｔｅｄＥｌｉｓａＫｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、メーカーの指示に従って、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４及びＩＬ－１３の濃度を分析した。要約すると、まず、捕捉抗体（ｃａｐｔｕｒｅａｎｔｉｂｏｄｙ）が希釈された溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ入れ、４℃で１６時間処理した後、洗浄液で３回洗浄した。各ウェルに２００μｌのブロッキング溶液を入れ、２５℃で１時間ブロッキングし、洗浄液で１回洗浄した。次いで、標準試料及び培養上清を適切に希釈した溶液を各ウェルに１００μｌずつ入れ、２５℃で２時間反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、２次抗体（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｙ、検出抗体）溶液１００μｌを各ウェルに入れ、２５°Ｃで１時間反応させた。洗浄液で３回洗浄した後、各ウェルに１００μｌのアビジン－ＨＲＰ（Ａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ）溶液を入れ、２５℃で３０分間反応させた。洗浄液で５回洗浄した後、各ウェルに１００μｌの基質溶液を加え、光を遮断した状態で、２５℃で１５分間反応させた。各ウェルに１００μｌの反応停止液を加えて反応を終了させ、プレートリーダー（ＶａｒｉｏｓｋａｎＬｕｘＭｕｌｔｉｍｏｄｅＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４５０ｎｍ及び５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。このとき、４５０ｎｍの波長で測定した吸光度から５７０ｎｍの波長で測定した吸光度を引いた値を標準曲線と比較換算し、培養上清中のサイトカイン濃度を算出した。標準曲線の作成には、連続希釈した組換えＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４及びＩＬ－１３を標準試料として用いた。

２．結果
２．１．固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によって刺激されたＧ０Ｔ細胞における［^３Ｈ］チミジン取り込みに及ぼすアガロースの酵素的加水分解物の影響
マウス脾臓からの休止（Ｇ０）リンパ球の分離は、パーコール濃度勾配遠心分離法により行われた。Ｇ０リンパ球からのＧ０Ｔリンパ球の分離は、Ｔ細胞精製カラムキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いたネガティブセレクション法により行われた。Ｔ細胞精製カラムで分離されたＧ０Ｔ細胞は、蛍光標識された抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、及び抗ＣＤ８抗体を用いて表面染色した結果、９６％の細胞がＣＤ３＋Ｔ細胞であることが確認された（図１）。また、これらのＣＤ３＋Ｔ細胞のうち５０．６％がＣＤ４＋Ｔ（Ｔｈ）細胞、そして４３．８％がＣＤ８＋Ｔ（Ｔｃ）細胞であることが確認された。

分離した休止Ｔ細胞を９６ウェルプレートにおいて固定化抗ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激して活性化させた。このとき、アガロースをＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼで加水分解して得られたＮＡ４及びＮＡ６と、アガロースをＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼで１次加水分解した後、ＧＨ５０Ｂ β－アガラーゼを追加作用させて得られたＮＡ２と、アガロースをＧＨ１６Ｂ β－アガラーゼで１次加水分解した後、ＧＨ５０Ｂ β－アガラーゼ及びＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨを同時に追加作用させて得られたＬ－ＡＨＧ等とを１２．５～４００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加し、休止Ｔ細胞の活性化による細胞周期の進行及び増殖に及ぼすこれらのアガロース分解産物（Ｌ－ＡＨＧ、ＮＡ２、ＮＡ４、ＮＡ６）の影響を調べた。

まず、９６ウェルプレートを用いて、休止Ｔ細胞（１×１０^５Ｇ０Ｔ細胞／ウェル）を、様々な濃度（０、１２．５、２５、５０、１００、２００、及び４００μｇ／ｍＬ）のＬ－ＡＨＧ、ＮＡ２、ＮＡ４、またはＮＡ６の存在下で、固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激して活性化した。活性化後２９時間経過したとき、各ウェルに０．２５μＣｉの［^３Ｈ］チミジンを加え、１２時間さらに培養し、この追加培養時間中に生じたＴ細胞増殖に伴いＤＮＡに取り込まれた［^３Ｈ］チミジンの量を液体シンチレーションカウンター（Ｌｉｑｕｉｄｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎｃｏｕｎｔｅｒ）で定量することにより、各ウェルで生じたＴ細胞増殖の程度を測定した。

その結果、図２に示すように、１２．５μｇ／ｍｌのＬ－ＡＨＧは、活性化されたＴ細胞の増殖にあまり影響を及ぼさないため、［^３Ｈ］チミジン取り込みのレベルは、Ｌ－ＡＨＧ無添加の対照群の場合とほぼ同じであった。一方、２５～４００μｇ／ｍｌのＬ－ＡＨＧの存在下では、濃度依存的に［^３］Ｈ］チミジンの取り込みが阻害された。特に、１００μｇ／ｍＬのＬ－ＡＨＧ存在下では、［^３Ｈ］チミジンの取り込みがＬ－ＡＨＧ無添加の対照群の約２２％まで減少し、２００～４００μｇ／ｍＬのＬ－ＡＨＧ濃度では、［^３］Ｈ］チミジンの取り込みがほとんど測定できないレベルまで著しく減少することが示された。しかし、同じ条件下でのＮＡ２、ＮＡ４及びＮＡ６などのアガロース分解産物は、２５～４００μｇ／ｍＬの濃度では活性化されたＴ細胞の［^３Ｈ］チミジン取り込みに有意な影響を及ぼさないことが示された。

したがって、これらの結果から、調べたアガロースの酵素的加水分解産物のうち、Ｌ－ＡＨＧのみが活性化されたＴ細胞の増殖を著しく抑制する生理活性を有することが確認された。

最近まで、寒天分解物（ＮＡ２、Ｌ－ＡＨＧ、ＮＡＯＳ、ＡＯＳ）の様々な生理学的活性が報告されてきた。すなわち、抗酸化、プレバイオティクス、抗腫瘍、抗炎症、抗糖尿病、抗肥満、皮膚の保湿及び美白などの活性である。さらに、マウスモデルにＮＡ４を経口投与すると、腸内微生物叢（腸内細菌叢、マイクロバイオータ）の調節により、激しい運動による疲労と肝障害に対する保護効果を示すことが報告されている。しかし、活性化されたＴ細胞の増殖に対するＬ－ＡＨＧの抑制効果は、これまで報告されていない新しい生理学的活性である。

２．２．固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により刺激されたＧ０Ｔ細胞の細胞周期進行に及ぼすＬ－ＡＨＧの影響

免疫系を構成するＴリンパ球は、ＣＤ４Ｔ（Ｔｈ）リンパ球とＣＤ８Ｔ（Ｔ_Ｃ）リンパ球との２種類に大きく分けられる。［^３Ｈ］チミジン取り込み測定法で確認された結果として、Ｌ－ＡＨＧが示す、活性化されたＴ細胞におけるＤＮＡ合成阻害による増殖抑制活性が、ＣＤ４Ｔｈ細胞とＣＤ８Ｔｃ細胞で共通して生じるのか、あるいは２種類のＴ細胞のいずれか一方のみに限って生じるのかを調べた。

この目的のために、休止Ｔ細胞を固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激して活性化させ、Ｇ０期（休止期）を脱し、Ｇ１期に入って進行した後にＳ期が始まる時点に達したとき、すなわち活性化後２０時間経過したとき、微小管脱重合剤であるノコダゾール［ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ、真核細胞の細胞周期の進行を有糸分裂期の前中期（ｐｒｏｍｅｔａｐｈａｓｅ）で停止させる細胞周期停止剤］を添加し、さらに１０時間培養した。このユニークな実験方法により、休止Ｔ細胞の活性化によって開始する最初の細胞周期の進行は、Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２期を経て、ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）の影響による微小管損傷によりＭ期の前中期で停止した。次いで、これらの細胞を回収した後、蛍光標識抗ＣＤ４抗体及び蛍光標識抗ＣＤ８抗体、並びにＤＮＡ蛍光染色試薬ＤＡＰＩで処理して染色し、フローサイトメーター（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で分析した。その結果、本発明者らは、休止ＣＤ４Ｔ細胞及び休止ＣＤ８Ｔ細胞の活性化によって開始される最初の細胞周期進行（Ｇ１期、Ｓ期、及びＧ２／Ｍ期）の様相が、Ｌ－ＡＨＧによってどのような影響を受けるかを明らかにしようとした。

図３のＡ及び図３のＢに示すように、染色された細胞をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した結果、休止Ｔ細胞を固定化抗ＣＤ／抗ＣＤ２８で刺激して活性化させたとき、ＣＤ８Ｔ細胞は、４．４％、８．８％、７７．９％の細胞がそれぞれＧ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期に分布しているのに対し、ＣＤ４Ｔ細胞は、９．９％、３５．４％、４９．９％の細胞がそれぞれＧ１期、Ｓ期、Ｇ２／Ｍ期に分布していることがわかった。すなわち、ＣＤ８Ｔ細胞は、活性化後３０時間が経過したとき、Ｇ２／Ｍ期に進入せず、Ｇ１＋Ｓ期にとどまっている細胞の割合が約１３．２％に過ぎなかったが、ＣＤ４Ｔ細胞は、Ｇ１＋Ｓ期にとどまっている細胞の割合が約４５．３％と高かった。これらの結果は、休止Ｔ細胞の中でＣＤ４Ｔ細胞に比べてＣＤ８Ｔ細胞が、固定化抗ＣＤ／抗ＣＤ２８による活性化後、細胞周期を比較的迅速かつ円滑に進行することを示している。

上記のように確認された休止ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の活性化に伴う最初の細胞周期の進行は、２５～１００μｇ／ｍｌ濃度のＬ－ＡＨＧの添加によって互いに著しく異なる影響を受けることがわかった。すなわち、休止ＣＤ４Ｔ細胞は、固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による活性化後、Ｇ２／Ｍ期に入ることなくＧ１期及びＳ期にとどまる細胞の割合が、Ｌ－ＡＨＧの濃度に依存して増加した。特に、１００μｇ／ｍＬ濃度のＬ－ＡＨＧを添加した場合、Ｇ１期の細胞の割合は３５．４％、Ｓ期の細胞の割合は５４．６％であったのに対し、Ｇ／Ｍ期の細胞の割合はわずか約８．８％であり、Ｌ－ＡＨＧによって細胞周期の進行が著しく抑制されることがわかった。一方、休止ＣＤ８Ｔ細胞を活性化した後の細胞周期の進行は、２５～５０μｇ／ｍＬのＬ－ＡＨＧを添加してもほとんど影響を受けず、１００μｇ／ｍＬのＬ－ＡＨＧを添加した場合、Ｇ１期細胞の割合の変化は無視できる程度であったが、Ｓ期細胞の割合は４６．６％に増加し、Ｇ２／Ｍ期細胞の割合は４１．８％であった。

このような研究結果から、休止ＣＤ４Ｔ細胞の活性化に伴う細胞周期の進行は、２５～１００μｇ／ｍＬのＬ－ＡＨＧの添加によって主にＧ１期及びＳ期において濃度依存的に阻害され、特に１００μｇ／ｍｌのＬ－ＡＨＧを添加した場合には、Ｇ２／Ｍ期に進入できずにＧ１＋Ｓ期にとどまる細胞の割合が全体の約９０．０％であることがわかった。同じ条件で、休止ＣＤ８Ｔ細胞の活性化に伴う細胞周期の進行は、２５～５０μｇ／ｍＬのＬ－ＡＨＧを添加してもあまり影響を受けず、１００μｇ／ｍＬのＬ－ＡＨＧを添加した場合でも、Ｇ１期の進行は影響を受けなかったが、Ｓ期の進行は多少阻害されたことを示している。このように、休止ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の活性化に伴う細胞周期の進行は、Ｌ－ＡＨＧ（２５～１００μｇ／ｍＬ）の存在により異なる様相で阻害されたものの、これらの細胞ではＬ－ＡＨＧによるアポトーシス性細胞死（アポトーシス性サブＧ１細胞の割合に基づく）は誘導されなかったことが確認された。

一方、同じ条件下で固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で休止Ｔ細胞を刺激して活性化させ、ノコダゾールを添加せずに３０時間培養した場合、休止ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の活性化に伴う細胞周期進行に及ぼすＬ－ＡＨＧの阻害効果をフローサイトメトリーで確認することは容易ではないことがわかった（図４のＡ及び図４のＢ）。これは、休止ＣＤ４Ｔ細胞または休止ＣＤ８Ｔ細胞の活性化により開始された細胞周期の進行が、一部の細胞ではＬ－ＡＨＧの存在により阻害されるのに対し、残りの他の細胞ではＬ－ＡＨＧによる阻害を受けず、最初の細胞周期進行を完了し、再びＧ１期、Ｓ期及びＧ２期へと進行し、最終的にはＬ－ＡＨＧによって細胞周期の進行が阻害された細胞と、Ｌ－ＡＨＧの存在下でも細胞周期の進行が生じた細胞とが一緒に混在して共存するためと考えられる。

これらの結果を総合すると、Ｌ－ＡＨＧが活性化Ｔ細胞の増殖を抑制する効果は、ＣＤ８Ｔ細胞よりもむしろＣＤ４Ｔ細胞を主な標的とし、Ｇ１期及びとＳ期における細胞周期の進行を阻害することによるものであることが示唆される。

２．３．固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により刺激されたＧ０Ｔ細胞のサイトカイン産生に及ぼすＬ－ＡＨＧの影響
ＣＤ４Ｔ細胞は、ＣＤ８Ｔ細胞とは異なり、機能面で差別化されるいくつかのエフェクターＣＤ４Ｔ細胞亜型に分化し、様々な免疫反応を調整する。エフェクターＣＤ４Ｔ細胞亜型としては、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｆｈ及びＴｒｅｇ細胞などが知られている。これらの各亜型は、分泌するサイトカインの組み合わせの特徴に基づいて互いに区別できる。

Ｔｈ１細胞はＩＦＮ－γを産生し、マクロファージ（大食細胞）の活性化を促進することで、マクロファージ内で生存または増殖可能な微生物のより効率的な破壊を可能にする。Ｔｈ２細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３などのサイトカインを産生することにより、好酸球（ＩＬ－５）と肥満細胞／好塩基球（ＩＬ－４）のリクルートと活性化に関与し、また、粘膜表面（ＩＬ－１３）のバリア免疫を高める。主にＩｇＥを介して防御反応を促進することにより、寄生虫による感染の抑制に寄与する。特に、ＩＬ－４及びＩＬ－１３は、ＩｇＥを産生するＢ細胞のクラススイッチにも必要である。このようにＴｈ２細胞の助けを借りてＢ細胞が産生するＩｇＥは、アレルギーや喘息などの過敏性反応を引き起こす原因にもなる。Ｔｈ１７細胞はＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２を分泌し、局所上皮細胞及び基質細胞が、感染部位に好中球をリクルートするケモカインを産生するように誘導する。これにより、細胞外細菌及び真菌などの病原体を除去する好中球の反応を増幅させる。さらに、粘膜上皮組織及び皮膚の上皮細胞を活性化させ、細菌を攻撃する抗菌ペプチドを産生するようにする。Ｔｆｈ細胞は、リンパ組織内でＢ細胞を助けるエフェクターＣＤ４Ｔ細胞亜型である。Ｔｆｈ細胞は、Ｂ細胞濾胞へのトラフィック（ｔｒａｆｆｉｃ）と抗原に対する連鎖認識（ｌｉｎｋｅｄｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）などの機序（メカニズム）を通じて、ナイーブＢ細胞と相互作用関係を形成し、胚中心反応を促進し、Ｂ細胞の抗体産生及びクラススイッチを助ける。Ｔｆｈ細胞はＢ細胞の増殖と抗体産生血漿細胞への分化をサポートするサイトカインＩＬ－２１を大量に産生する。Ｔｒｅｇ細胞は、ＴＧＦ－βとＩＬ－１０の産生によりＴ細胞活性と内在免疫細胞の活性を通常抑制することで免疫反応を制限し、免疫反応中に自己免疫が発症するのを防ぐのに役立つ。

エフェクターＣＤ４Ｔ細胞亜型の安定性は互いに異なる。ナイーブＣＤ４Ｔ細胞は様々な可能性を持っているが、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞は比較的安定した基底状態を示し、他の亜型への転換に対する耐性が高い。一方、ｉＴｒｅｇ細胞とＴｈ１７細胞は安定性が低く、主に影響を与えるサイトカインによって他の亜型へ転換され得る。ｉＴｒｅｇ細胞は、ＩＬ－６及びＩＬ－１に反応してＴｈ１７細胞に転換され得、ＩＬ－１２に反応してＴｈ１細胞になり得る。Ｔｈ１７細胞の場合も、ＩＬ－１２に反応してＴｈ１細胞に転換され得る。このとき、ｉＴｒｅｇ細胞からＴｈ１７細胞への転換およびＴｈ１７細胞からＴｈ１細胞への転換は、一方向性または不可逆的であることが理解される。

エフェクターＣＤ４Ｔ細胞亜型の差別化される免疫関連機能に基づき、過敏性反応の患者、自己免疫疾患患者、幹細胞移植または骨髄移植患者を含む臓器移植患者に生じる不適切な免疫反応を必要なレベルまで調整するためには、エフェクターＣＤ４Ｔ細胞亜型の中でもＴｈ１及びＴｈ２を標的とする特異的な抑制能を発揮する免疫抑制剤を使用することがより効果的であることが期待される。

Ｌ－ＡＨＧ（２５～１００μｇ／ｍＬ）は、活性化されたＣＤ４Ｔ細胞の細胞周期の進行を主にＧ１期とＳ期で濃度依存的に阻害することにより、増殖を著しく抑制することがわかった。同条件下で固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で刺激して休止Ｔ細胞を活性化させた後３０時間経過したとき、培養上清を回収し、Ｔｈ１細胞が特徴的に分泌することが知られているＴｈ１シグネチャーサイトカイン（Ｔｈ１ｓｉｇｎａｔｕｒｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓ；ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２）とＴｈ２細胞が特徴的に分泌することが知られているＴｈ２シグネチャーサイトカイン（Ｔｈ２ｓｉｇｎａｔｕｒｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓ；ＩＬ－４，ＩＬ－１３）の濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。

その結果、活性化したＴ細胞の培養上清中に含まれる、Ｔｈ１亜型によって分泌されるＩＬ－２とＩＦＮ－γだけでなく、Ｔｈ２亜型によって分泌されるＩＬ－４とＩＬ－１３の場合も、Ｌ－ＡＨＧ（２５、５０、及び１００μｇ／ｍＬ）の添加によって濃度依存的に顕著に減少することが示された（図５のＡ及び図５のＢ）。興味深いことに、Ｔｈ１シグネチャーサイトカインの濃度と比較して、Ｔｈ２シグネチャーサイトカインの濃度において、より顕著な減少が観察された。特に、２５μｇ／ｍＬの濃度のＬ－ＡＨＧの存在下では、ＩＦＮ－γ濃度はほとんど影響を受けなかったが、ＩＬ－４濃度はＬＡＨＧ未処理の対照群の３８，５％まで顕著に減少したことが確認された。

結論として、固定化抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８による刺激で休止Ｔｈ細胞の細胞周期が開始されるように活性化し、細胞増殖に伴うクローン拡大及びエフェクターＴｈ細胞亜型への分化が起こった場合、Ｌ－ＡＨＧの存在は、ＣＤ４Ｔ細胞の細胞周期進行を阻害することにより、Ｔｈ１亜型及びＴｈ２亜型への分化を抑制することができ_、Ｔｈ１亜型に比べてＴｈ２亜型への分化をより強く抑制できることが示唆された。

［微生物寄託］
寄託機関名：韓国生命工学研究院の生物資源センター（ＫＣＴＣ：ＫｏｒｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅｓ）
受託番号：ＫＣＴＣ１３６２９ＢＰ
受託日付：２０１８０８２７

Claims

３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを有効成分として含有する、免疫抑制用組成物。
ＣＤ４Ｔ細胞の活性化、増殖または分化を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の免疫抑制用組成物。
Ｇ１期またはＳ期の細胞周期の進行を遮断することを特徴とする、請求項２に記載の免疫抑制用組成物。
Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞への分化を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の免疫抑制用組成物。
インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４またはインターロイキン－１３の産生を抑制することを特徴とする、請求項４に記載の免疫抑制用組成物。
３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを有効成分として含有する、免疫性疾患の予防または治療用の医薬組成物。
前記免疫性疾患は、過敏性免疫疾患、自己免疫疾患、免疫拒絶反応、移植片対宿主病、シェーグレン症候群及びベーチェット病からなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物。
前記過敏性免疫疾患は、アレルギー、くしゃみ、喘鳴、喘息、アトピー性皮膚炎及びじんましん（蕁麻疹）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、乾癬、橋本氏甲状腺炎、全身性エリテマトーデス及び急性炎症性腸疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを含有する、免疫性疾患の予防または改善用の健康機能食品。
前記免疫性疾患は、過敏性免疫疾患、自己免疫疾患、免疫拒絶反応、移植片対宿主病、シェーグレン症候群及びベーチェット病からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の健康機能食品。
前記過敏性免疫疾患は、アレルギー、くしゃみ、喘鳴、喘息、アトピー性皮膚炎及びじんましん（蕁麻疹）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の健康機能食品。
前記自己免疫疾患は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、乾癬、橋本氏甲状腺炎、全身性エリテマトーデス及び急性炎症性腸疾患からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の健康機能食品。
３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースを有効成分として含有する、過敏性皮膚疾患の予防または改善用の機能性化粧料組成物。
前記過敏性皮膚疾患は、日光性皮膚炎、接触性皮膚炎及びアトピー性皮膚炎からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の機能性化粧料組成物。