JP2024531090A - 干渉散乱顕微鏡法 - Google Patents

Abstract

オブジェクトの特性を測定するための方法であって、オブジェクトを含む溶液に固体浸漬レンズを浸漬させることであって、それにより、オブジェクトが、固体浸漬レンズの表面と相互作用する、浸漬させることと、固体浸漬レンズの表面を照射源で照射し、オブジェクトからの散乱光を、干渉散乱顕微鏡を使用して検出することと、検出された散乱光を使用してオブジェクトの特性を測定することと、溶液から固体浸漬レンズを取り出すことと、その後、固体浸漬レンズを洗浄することであって、それにより、オブジェクトが固体浸漬レンズの表面から取り除かれる、洗浄することとを含む、方法。

Description

本発明は、干渉散乱顕微鏡法（本明細書でｉＳＣＡＴ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と呼ばれる）に関し、特に、ｉＳＣＡＴを使用してオブジェクトの特性を測定するための方法に関する。

ｉＳＣＡＴは、ユニークな時空間分解能を有する単一粒子追跡と単一分子レベルに至るまでの無標識感度の両方に対する強力なアプローチとして具現化された（ｍａｔｅｒｉａｌｉｚｅ）。ｉＳＣＡＴは、例えば、Ｋｕｋｕｒａら「Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｖｉｒｕｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９ ６：９２３－９３５、および、Ｏｒｔｅｇａ－Ａｒｒｏｙｏら「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ｉＳＣＡＴ）：ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ２０１２ １４：１５６２５－１５６３６において開示される。かなりの可能性があるにもかかわらず、ｉＳＣＡＴの広範な適用は、カスタム仕様の顕微鏡、非従来型カメラ、および複雑な試料照射についての要件によって制限されており、単一分子ほどの小さいオブジェクトの頑健かつ正確な検出、イメージング、および特徴付けについてのｉＳＣＡＴの能力を制限する。

ｉＳＣＡＴの１つの適用は、干渉光散乱がオブジェクトの質量を定量化するために使用されるマスフォトメトリー（ＭＰ：Ｍａｓｓ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）である。通常、ＭＰ測定は、倒立顕微鏡型幾何学的形状内の測定インターフェースにおいて行われる。これは、少量の被分析物を測定インターフェース上に配置することによって達成される。多数の試料が、マルチウェルプレート内でロボットプロセスによって調製され、その後、プレートリーダー型機器において読み出される生化学スクリーニングワークフローとＭＰとを組み合わせるときに、課題が生じる。ＭＰ測定プロセスの自動化は、ロボット式ピペット操作ステップによって試料キャリア上で各ウェルを複製することによって達成され得、その後、試料キャリアは、ｉＳＣＡＴ顕微鏡とインターフェースすることができる。しかしながら、このアプローチは、制限されたスループットを有し、さらなるロボットを必要とすることによって全体のワークフローにさらなる複雑さを導入する。自動化されたＭＰプロセスと生化学スクリーニングとの組み合わせの費用効率性を考慮するときの主要な課題は、マルチウェルプレート内で試料を複製するために必要とされる多数の試料キャリアである。

したがって、ｉＳＣＡＴ顕微鏡によって試料を測定するための効率的な自動化プロセスを提供するための要件が存在し、そのプロセスは、現行の生化学ワークフローと適合し、また、そのプロセスが幅広く実行されることを可能にする費用効率性および簡単さを達成することができる。プロセスが、単一分子レベルでの測定で使用するのに、また、マスフォトメトリー測定のために必要とされるようなインターフェースで測定を行うときに使用するのに適するように、プロセスが高い感度および分解能を達成する要件が存在する。

本発明が生じたのは、この背景においてである。

本発明の一態様によれば、オブジェクトの特性を測定するための方法が提供され、方法は、
オブジェクトを含む試料溶液に固体浸漬レンズを浸漬させることであって、それにより、オブジェクトが、固体浸漬レンズの表面と相互作用する、浸漬させることと、
固体浸漬レンズの表面を照射源で照射し、オブジェクトからの散乱光を、干渉散乱顕微鏡を使用して検出することと、
検出された散乱光を使用してオブジェクトの特性を測定することと、
溶液から固体浸漬レンズを取り出すことと、
その後、固体浸漬レンズを洗浄することであって、それにより、オブジェクトが固体浸漬レンズの表面から取り除かれる、洗浄することと
を含む。

オブジェクトとレンズの表面との間の相互作用は一時的とすることができる、または、相互作用は、オブジェクトとレンズの表面との間の永久的な相互作用である可能性がある。幾つかの実施形態において、相互作用は、オブジェクトが固体浸漬レンズの表面に吸着することを伴うことができる。他の実施形態において、オブジェクトと固体浸漬レンズの表面との間の相互作用は静電結合相互作用とすることができる、および／または、結合は、塩橋によって形成され得る。幾つかの実施形態において、相互作用は、オブジェクトと固体浸漬レンズの表面との間の疎水性相互作用を伴うことができる。

本発明の別の態様によれば、オブジェクトの特性を測定するための方法が提供され、方法は、
オブジェクトを含む試料溶液に固体浸漬レンズを浸漬させることであって、それにより、オブジェクトが、固体浸漬レンズの表面に吸着する、浸漬させることと、
固体浸漬レンズの表面を照射源で照射し、オブジェクトからの散乱光を、干渉散乱顕微鏡を使用して検出することと、
検出された散乱光を使用してオブジェクトの特性を測定することと、
溶液から固体浸漬レンズを取り出すことと、
その後、固体浸漬レンズを洗浄することであって、それにより、オブジェクトが固体浸漬レンズの表面から取り除かれる、洗浄することと
を含む。

本発明の方法は、固体浸漬レンズが溶液に浸漬され得るような構成で配置された固体浸漬レンズおよびｉＳＣＡＴ顕微鏡を利用する自動化ワークフローである。
固体浸漬レンズの浸漬を容易にするために、ｉＳＣＡＴ顕微鏡などの顕微鏡は、縦置き構成で配置され、その構成下で、試料溶液および洗浄溶液は移動され得る。本発明のｉＳＣＡＴ顕微鏡は、固体浸漬レンズが試料の上に位置し、上から溶液に浸漬され得るように構成される。試料が対物レンズの上に位置する従来のｉＳＣＡＴ顕微鏡セットアップと比較して、本発明の構成は反転される。さらに、浸漬レンズが表面を効果的に置換するため、顕微鏡は、試料がオブジェクトの検出のために表面に配置されることを必要としない。

以前は、生化学ワークフローにおけるｉＳＣＡＴ顕微鏡の広範な使用は、試料を測定インターフェースの光学表面上に直接塗布するおよび／または光学表面上で成長させる必要性によって妨げられた。本発明の方法は、固体浸漬レンズが溶液に直接浸漬され得るように、試料および／または洗浄溶液を含むマルチウェルプレートが、ｉＳＣＡＴ顕微鏡の下に位置決めされることを可能にする。したがって、本発明の方法は、測定が、マルチウェルプレートのウェル内で直接行われることを可能にし、標準的な生化学ワークフローとの適合性を達成する。これは、例えば、生体試料の高スループットスクリーニングを可能にする。

幾つかの実施形態において、試料がウェルプレートに付加されると、プレートは、温度制御および／または撹拌を伴って維持され得る。幾つかの実施形態において、撹拌は、測定の継続時間の間、停止される。

幾つかの実施形態において、マルチウェルプレートは、固体浸漬レンズが溶液に浸漬されるまで、上方に移動され得る。固体浸漬レンズの固定焦点は、測定が即座に開始することを可能にし、真の平衡状態における測定を可能にする。幾つかの実施形態において、測定の継続時間後、固体浸漬レンズは、マルチウェルプレートが降下されるにつれて、溶液から取り出される。幾つかの実施形態において、測定の継続時間は１０秒～５分とすることができる。幾つかの実施形態において、測定の継続時間は、１０秒、３０秒、１分、２分、３分、または４分より長いとすることができる。幾つかの実施形態において、測定の継続時間は、５分、４分、３分、２分、１分、または３０秒より短いとすることができる。

本発明の方法における固体浸漬レンズの使用は、測定インターフェースにおける高感度と高屈折率（ＲＩ：ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）の両方が達成されることを可能にする。従来のレンズと比較した固体浸漬レンズのより高い開口数は、より多数の散乱光子の収集を容易にし、したがって、方法の感度を高める。さらに、固体浸漬レンズの高屈折率は、本発明の方法が、従来のｉＳＣＡＴ顕微鏡と比較して、より広い範囲の溶剤に適合することを意味する。固体浸漬レンズの高屈折率は、十分な屈折率差が、高屈折率溶剤に関してさえ達成されることを可能にする。例えば、本発明の方法は、ＲＩ １．４以上の溶剤に可溶性であるだけである傾向がある有機ポリマーを測定するために使用され得る。

本発明の方法は、固体浸漬レンズが後続の測定で再使用され得るように固体浸漬レンズの制御された洗浄を同様に容易にする。洗浄プロセスは、ユーザ相互作用なしで実行され、それは、レンズに対する損傷またはユーザに対するリスクなしで、オブジェクトの全体が、固体浸漬レンズの表面から取り除かれることを保証するために洗浄プロセスが最適化されることを可能にする。固体浸漬レンズの効果的な洗浄を可能にすることは、使い捨て固体浸漬レンズについての要件を阻み、本発明の方法が、高スループット生化学スクリーニングワークフローに適合することを保証する。

幾つかの実施形態において、オブジェクトの特性を測定することは、オブジェクトの質量を定量化することを含むことができる。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、オブジェクトの質量が干渉光散乱によって定量化されるマスフォトメトリーを実行するために使用され得る。幾つかの実施形態において、質量は、５％質量誤差まで定量化され得る。

幾つかの実施形態において、オブジェクトの特性を測定することは、オブジェクトの質量の変化を測定または定量化することを含むことができる。
幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズを洗浄することは、固体浸漬レンズを少なくとも１つの洗浄溶液に浸漬させることを含むことができる。オブジェクトおよび任意の試料溶液が表面から取り除かれるように固体浸漬レンズを洗浄することは、種々の方法で達成され得る。洗浄ステップは、同じ固体浸漬レンズが後続の測定において使用されることを可能にし、使い捨てレンズを必要とすることを回避するために重要である。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、オブジェクトの全てがレンズ表面から取り除かれたことを保証するために、同じまたは異なる洗浄流体に繰り返し浸漬され得る。浸漬は、洗浄流体の撹拌を伴うとすることができるまたは伴わないとすることができる。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、エタノール、イソプロパノール、または同様のアルコールに連続して浸漬させ、それに続いて、水に浸漬させることによって洗浄され得る。幾つかの実施形態において、より高反応性の洗浄が、固体浸漬レンズの表面に吸着した、または、固体浸漬レンズの表面と相互作用するオブジェクトに応じて、必要とされる場合がある。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、塩酸および／または硫酸などの酸に浸漬され得、それに続いて、水に浸漬され得る。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズを硫酸などの酸化性の酸に浸漬させることは、表面を官能基化することもできる。

本発明の方法は自動化ワークフローであるため、洗浄手順は、ユーザに対するリスクなしで、高反応性の溶液および／またはより複雑な洗浄手順を利用することができる。これは、固体浸漬レンズの表面に対する損傷を防止しながら、洗浄ステップ中に固体浸漬レンズからのオブジェクトの完全な除去を保証する適切な洗浄溶液が選択されることを可能にする。したがって、洗浄ステップは、オブジェクトとレンズとの間の「永久的な（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）」相互作用さえも取り除くことができる。

幾つかの実施形態において、洗浄溶液は、洗浄ウェルに保持され得る。幾つかの実施形態において、洗浄ウェルは、固体浸漬レンズとのシールを作成することができる。幾つかの実施形態において、洗浄ウェルは、洗浄溶液を固体浸漬レンズに噴霧することができる。

幾つかの実施形態において、方法は、固体浸漬レンズにわたって空気を流すステップをさらに含むことができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、洗浄ステップに続いて空気乾燥され得る。これは、固体浸漬レンズ上の任意の洗浄溶液が、後続の測定において試料溶液を汚染することを防止する。

幾つかの実施形態において、方法は、洗浄溶液を撹拌するステップをさらに含むことができる。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、固体浸漬レンズを洗浄溶液に浸漬させることと、ソニケーターバスを使用して洗浄溶液を撹拌させることであって、それにより、固体浸漬レンズの表面からのオブジェクトの除去を容易にする、撹拌させることとを含むことができる。

幾つかの実施形態において、方法は、固体浸漬レンズの表面にプラズマを適用するステップをさらに含むことができる。幾つかの実施形態において、プラズマは、例えば環境圧プラズマトーチによって固体浸漬レンズの表面に適用され得る。幾つかの実施形態において、プラズマは、レンズの表面に吸着したオブジェクトを取り除くために、洗浄プロセスの一部として固体浸漬レンズの表面に適用され得る。幾つかの実施形態において、プラズマは、固体浸漬レンズの表面を官能基化するために使用され得る。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、１～５ｍｍの直径を有する。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの直径は、１、１．５、２、または２．５ｍｍより大きいとすることができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの直径は、３、２．５、２、または１．５ｍｍより小さいとすることができる。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、レンズアセンブリに取り付けられ得る。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、レンズアセンブリが耐溶剤性であるようにレンズアセンブリに取り付けられ得る。これは、固体浸漬レンズの溶液内への浸漬中に溶液がレンズアセンブリ内に漏洩することを回避することができる。溶剤耐性化についての設計考慮事項は、レンズアセンブリが固体浸漬レンズにオーバーラップすることを保証すること、固体浸漬レンズをアセンブリ内に接着または固定することを含むことができるが、それに限定されない。

幾つかの実施形態において、レンズアセンブリは、２～６ｍｍの直径を有する。幾つかの実施形態において、レンズアセンブリの直径は、２、３、４、または５ｍｍより大きいとすることができる。幾つかの実施形態において、レンズアセンブリの直径は、６、５、４、または３ｍｍより小さいとすることができる。

幾つかの実施形態において、レンズアセンブリは、集光レンズを備えることができる。幾つかの実施形態において、１ｍｍ直径の固体浸漬レンズは、例えば、４ｍｍ直径の集光レンズを必要とすることができる。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、６～１０ｍｍの長さを有することができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの長さは、６、７、８、または９ｍｍより長いとすることができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの長さは、１０、９、８、または７ｍｍより短いとすることができる。固体浸漬レンズの設計は、本発明の方法が、マルチウェルプレート内で試料を保持する生化学スクリーニングワークフローで使用するために適合性があるために重要である。例えば、９６ウェルプレートは、下部タイプに応じて、６．９４ｍｍのウェル直径および約１１ｍｍの最大ウェル深さを有する。したがって、幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズが小さい直径の円筒幾何形状を有することが望ましいとすることができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、６ｍｍより長さが短いとすることができる。しかしながら、より短いレンズは、ウェルを充填するためにより多い量の試料を必要とする場合があり、これは実際的でないことがある。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは、半球とすることができるまたは超半球とすることができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズは回折光学素子で作られ得る。幾つかの実施形態において、超半球固体浸漬レンズが、好ましいとすることができる。超半球固体浸漬レンズは、システムの開口数をη^２（ηは固体浸漬レンズの屈折率）だけ増加させることができる。より高い開口数が有益である。なぜなら、より高い開口数が、散乱光子の収集を増加させ、測定の改善された感度をもたらすことができるからである。

幾つかの実施形態において、干渉顕微鏡は、固体浸漬レンズの収差を補償するように構成される少なくとも１つの光学素子をさらに備えることができる。幾つかの実施形態において、小さい直径を有する固体浸漬レンズは、最適形態からの著しい偏差を示す可能性がある。完全に球の表面を有する固体浸漬レンズは、著しい収差、色収差およびコマ収差（軸外）を有することになる。幾つかの実施形態において、これらの収差を補償する光学素子は、光学経路に一体化され得る。幾つかの実施形態において、光学素子は、固体浸漬レンズに整合するフリーフォーム素子または高分解能空間光変調器などのフレキシブル素子とすることができる。幾つかの実施形態において、光学素子は、球レンズおよび／または修正リレーレンズ系を含むことができる。小さい直径の固体浸漬レンズの偏差を補正することができる光学系は、有利である。なぜなら、その光学系が、ウェルプレートに含まれる溶液に容易に浸漬され得る固体浸漬レンズによって高分解能イメージが取り込まれることを可能にするからである。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズ材料は、ダイヤモンドとすることができる、または、ジルコニアとすることができる、または、サファイアとすることができる、または、ニオブ酸リチウムとすることができる。幾つかの実施形態において、ダイヤモンド（η≒２．４）のような高屈折率材料が使用され得る。幾つかの実施形態において、ダイヤモンド超半球固体浸漬レンズ材料は、０．３の開口数を有する対物レンズを伴うことができる。幾つかの実施形態において、リレーレンズ系内にフリーフォーム光学素子を有するダイヤモンド固体浸漬レンズを使用することが必要である場合がある。幾つかの実施形態において、これは、製造問題の結果として固体浸漬レンズの形状の不規則さを克服するために利用され得る。

幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズ材料はガラスとすることができる。幾つかの実施形態において、高屈折率ガラス固体浸漬レンズは、０．５の開口数を有する対物レンズと共に使用され得る。幾つかの実施形態において、半球固体浸漬レンズは、０．８＋の高い開口数を有する集光対物レンズと組み合わされ得る。

幾つかの実施形態において、方法は、固体浸漬レンズの表面を官能基化するステップをさらに含むことができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの表面は、固体浸漬レンズを試料溶液に浸漬させるのに先立って官能基化され得る。固体浸漬レンズの表面の官能基化は、固体浸漬レンズを適切な溶液内で培養することによって達成され得る。幾つかの実施形態において、被分析物特異性を達成するために固体浸漬レンズの表面を官能基化することが望ましいとすることができる。

レンズとオブジェクトとの間の相互作用は、疎水性から共有結合形成までの任意の種類の相互作用によるとすることができる。レンズとオブジェクトとの間の相互作用は、イオン／静電相互作用によるとすることができる。これらの相互作用は、オブジェクトの物理的特性による。

レンズの表面は、官能基化され得る。表面は、不動態化、活性化、コーティング、処理、または誘導され得る。表面は、不動態化表面とすることができる。不動態化は、化学反応を増大または減少させ、したがって、相互作用事象の数を増加または減少させるために、表面を処理またはコーティングするプロセスである。

レンズの表面は、表面の化学的性質を変更するために活性化、コーティング、処理、および／または誘導され得る。表面の官能基化は、化学的相互作用（例えば、共有結合）または物理的相互作用（例えば、吸着）などの種々の相互作用を可能にすることであるとすることができる。表面が、コーティング、誘導、または修飾される場合、薄表面改変が望ましいとすることができる。厚過ぎる改変済み表面層は、表面の光散乱特性を変更する可能性がある。一番外の少数の分子層（３～１０ｎｍ）のみの改変が望ましいとすることができる。

任意の適切な表面コーティングが、表面の化学的性質を変更するためにレンズに塗布され得る。表面は、疎水性を増加させるかまたは親水性を増加させるために改変され得る。
幾つかの実施形態において、理想的な固体浸漬レンズ材料は、生体分子との強いが非特異的な相互作用を示すことができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの表面は、表面のカルボキシル化および／または酸化によって条件付けられ得る。幾つかの実施形態において、ダイヤモンド固体浸漬レンズのカルボキシル化および／または酸化は、タンパク質などの被分析物の吸着を改善することができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの表面は、硫酸、塩酸、および／または硝酸などの強酸に浸漬させることによってカルボキシル化および／または酸化され得る。固体浸漬レンズは、水酸化ナトリウム溶液にも浸漬され得る。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの表面は、表面をプラズマで処理することによって酸化され得る。反復測定が、同じ固体浸漬レンズに関して実施される幾つかの実施形態において、官能基化は、洗浄ステップの後でかつ固体浸漬レンズの試料溶液への浸漬に先立って実行され得る。これは、固体浸漬レンズの官能基化および臨界表面特性が維持されることを保証する。

試料は、任意の適切な試料とすることができるが、好ましくは、生体分子であるオブジェクトを含む。
試料は、好ましくは、溶液または懸濁液などの液体である。溶液または懸濁液は、任意の適切な溶剤、特に、水を含むことができる。試料は、有機溶剤を含むことができる。特に、溶剤、溶液、または懸濁液は、水より高い屈折率を有することができる。本発明の利点は、ダイヤモンドなどのレンズ材料の使用が有機溶剤および同様なものの使用を可能にすることである。

試料は、医療用または獣医用試料などの生体試料とすることができる。そのような生体試料は、任意の適切なタイプの体液とすることができる、または、任意の適切なタイプの組織の懸濁液とすることができる。試料は、環境試料とすることができる。そのような環境試料は、水試料、または、環境から採取され、溶剤内に懸濁された試料とすることができる。試料は、生産プロセスからの試料などの産業用試料とすることができる。

試料は、濃縮しているらしいと疑われる場合、適切に希釈され得る。希釈は、水などの任意の適切な溶剤を使用することができる。
オブジェクトは、生物学的分子または生体分子または化学分子とすることができる。

幾つかの実施形態において、オブジェクトは、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、脂質、炭水化物、有機ポリマー、タンパク質複合体、抗体もしくは抗体の抗体フラグメント、酵素とすることができる、または、オブジェクトは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖などの核酸分子とすることができる、または、オブジェクトは、ウィルスもしくはウィルスベクター、例えば、アデノウィルスおよび／またはレンチウィルス、ウィルス様粒子、または小分子、エクソソーム、小胞、複合体集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）、ナノ粒子、化合物、イオン、または量子ドットとすることができる。

幾つかの実施形態において、オブジェクトは、単一分子、巨大分子、超分子、または、分子、巨大分子（ポリマーなど）、および超分子の会合とすることができる。適切な巨大分子の例は、核酸分子、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）などの天然核酸、または、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、モルフォリノ（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）およびロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ：ｇｌｙｃｏｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）およびトレオース核酸（ＴＮＡ：ｔｈｒｅｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）などの人工核酸のいずれかを含むことができるが、それに限定されない。分子の会合は、エンベロープまたはカプシドタンパク質が会合するウィルス様粒子などの集合を含むことができる。

幾つかの実施形態において、オブジェクトは、モノマー、ダイマー、またはトリマー種などのタンパク質を含む化合物の凝集体あるいは他の高次凝集体を含む多分子複合体とすることができる。

幾つかの実施形態において、照射光は、空間的にかつ時間的にコヒーレントとすることができる。幾つかの実施形態において、固体浸漬レンズの表面は、レーザー光源によって照射され得る。幾つかの実施形態において、レーザー光源は、コリメートされたレーザービームをイメージング対物レンズの後方焦点面にフォーカスさせることによって、顕微鏡内で広視野照射を達成することができ、全体のイメージング性能に及ぼす影響を最小限にしながら、レーザービームが、顕微鏡に入るおよび顕微鏡から出るよう効率的に結合され得ることを示唆する。

幾つかの実施形態において、干渉散乱顕微鏡は、空間フィルタをさらに備えることができる。幾つかの実施形態において、ｉＳＣＡＴ顕微鏡は、空間フィルタをさらに備えることができ、試料場所から散乱された光と試料場所から反射された照射光の両方を含む出力光の空間フィルタリングを、出力光の検出に先立って実施することができる。空間フィルタリングは、反射された照射光を通過させるが、より大きい開口数においてよりも所定の開口数以内において大きい強度の減少を伴う。これは、特に、弱い散乱体であるオブジェクトの場合、コヒーレント照射についてイメージングコントラストを増大させる。

空間フィルタは、所定の開口数以内における強度の、１０^－２の入射強度以下までの減少を有する出力光を通過させるように配置される。通常、空間フィルタは、所定の開口数以内における強度の、１０^－４の入射強度以上、例えば、１０^－２～１０^－４の入射強度の範囲内への減少を有する出力光を通過させるように配置され得る。そのため、これらの弱く散乱するオブジェクトを検出するために、特定の開口数が使用され得る。

空間フィルタは、反射された照射光の開口数と試料場所における試料内のオブジェクトから散乱された光の開口数との間の不整合を利用することによって、散乱光を上回って照射光の強度を選択的に減少させる。そのため、空間フィルタは、これらの２つの光源の異なる方向性を利用する。反射された照射光は、通常、比較的小さい開口数を有することになり、一方、試料の表面の近くのサブ回折サイズのオブジェクトは、光を優先的に高開口数へと散乱させる。したがって、低開口数における空間フィルタによる強度の減少は、照射光に優先的に影響を及ぼし、散乱光に対して及ぼす影響は最小限とし、それにより、イメージングコントラストを最大にする。

この効果は、所定の開口数が、試料場所から反射される照射光の開口数と同一または同様であるように、空間フィルタを配置することによって最大にされ得る。
本発明は、ここで、単に例によってまた添付図面を参照して、さらにかつより詳細に説明される。

ｉＳＣＡＴ顕微鏡の略図である。 固体浸漬レンズを備える倒立（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ｉＳＣＡＴ顕微鏡の略図である。 マルチウェルプレート内の試料溶液の上に位置決めされた図２の顕微鏡セットアップを示す図である。 試料溶液に浸漬されるように配置された固体浸漬レンズを示す図である。 マルチウェルプレート内の洗浄溶液の上に位置決めされた図２の顕微鏡セットアップを示す図である。 洗浄溶液に浸漬されるように配置された固体浸漬レンズを示す図である。 概略的なレンズ系を示す図である。 バレル（浸漬先端）内に取り付けられた２つのレンズを示す図である。 生体溶液を含むウェルに浸漬されたレンズ系を示す図である。 半球ＳＩＬを示す図である。

本発明は、自動化ワークフローを使用してオブジェクトの特性を測定するための方法および固体浸漬レンズを備える倒立干渉散乱顕微鏡を提示する。本発明の方法は、試料溶液内でオブジェクトの特性を直接測定するために使用され得、標準的な生化学スクリーニングワークフローで使用されるマルチウェルプレートに適合する。

図１は、国際公開第２０１８／０１１５９１号において開示されるｉＳＣＡＴ顕微鏡構成を示す。国際公開第２０１８／０１１５９１号の開示は、参照により本明細書に組み込まれる、しかしながら、完全のために、以下の説明は、国際公開第２０１８／０１１５９１号のものと共通であり、図１に示される、本発明のｉＳＣＡＴ顕微鏡の構成要素および機能を提示し、その後、本開示によって提供される上記構成に対する種々の改良を説明し、その例の実施形態を提供することになる。

図１は、次の通りに配置されるｉＳＣＡＴ顕微鏡１を示す。顕微鏡１は、以下でより詳細に説明される空間フィルタを除いて、顕微鏡の分野で従来型である構造を有する以下の構成要素を含む。

顕微鏡１は、試料場所において試料３を保持するための試料ホルダー２を備える。試料３は、以下でより詳細に説明される、イメージングされるオブジェクトを含む液体試料とすることができる。試料ホルダー２は、試料３を保持するのに適する任意の形態をとることができる。通常、試料ホルダー２は、試料ホルダー２と試料３との間のインターフェースを形成する表面に試料３を保持する。例えば、試料ホルダー２は、カバースリップとすることができる、および／または、ガラスから作られ得る。試料３は、直接的な方法で、例えば、マイクロピペットを使用して、試料ホルダー２上に提供され得る。

顕微鏡１は、照射源４および検出器５をさらに備える。
照射源４は、照射光を提供するために配置される。照射光はコヒーレント光とすることができる。例えば、照射源４はレーザーとすることができる。照射光の波長は、試料３の性質および／または検査される特性に応じて選択され得る。一例において、照射光は４０５ｎｍの波長を有する。

任意選択で、照射光は、例えば、Ｋｕｋｕｒａら「Ｈｉｇｈ－ｓｐｅｅｄ ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｖｉｒｕｓ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００９ ６：９２３－９３５に詳述されるように、照射およびレーザーノイズのコヒーレントな性質から生じるスペックルパターンを除去するために、空間変調され得る。

検出器５は、試料場所からの反射で出力光を受信する。通常、顕微鏡１は、広視野モードで動作することができ、その場合、検出器５は、試料３のイメージを取り込むイメージセンサとすることができる。顕微鏡１は、代替的に、共焦点モードで動作することができ、その場合、検出器５は、イメージセンサとすることができる、または、フォトダイオードなどの点様検出器とすることができ、その場合、走査配置構成が、イメージを構築するため試料３の領域を走査するために使用され得る。検出器５として使用され得るイメージセンサの例は、ＣＭＯＳ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ－ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ、相補的金属酸化物半導体）イメージセンサまたはＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ、電荷結合素子）を含む。

顕微鏡１は、試料ホルダー２と、照射源４と、検出器５との間に配置された光学系１０をさらに備える。光学系１０は、次の通りに配置されて、試料３を照射するために試料場所に照射光を方向付け、試料場所からの反射で出力光を収集し、出力光を検出器５に方向付ける。

光学系１０は、試料ホルダー２の前に配設されたレンズ系である対物レンズ１１を含む。光学系１０は、コンデンサレンズ１２およびチューブレンズ１３も含む。
コンデンサレンズ１２は、光源１１からの照射光（図１において連続線で示す）を、対物レンズ１１を通して試料場所の試料３上に集光する。

対物レンズ１１は、（ａ）試料場所から反射された照射光（図１において連続線で示す）と（ｂ）試料場所の試料３から散乱された光（図１において点線で示す）の両方を含む出力光を集光する。反射光は、試料ホルダー２と試料３との間のインターフェースから主に反射される。通常、これは、比較的に弱い反射、例えば、ガラス水反射である。例えば、反射された照射光の強度は、入射照射光の強度の０．５％のオーダーとすることができる。散乱光は、試料３内のオブジェクトによって散乱される。

従来のｉＳＣＡＴと同様の方法で、試料の表面にあるかまたはその近くのオブジェクトからの散乱光は、反射光と建設的に干渉し、そのため、検出器５によって取り込まれるイメージにおいて目に見える。この効果は、検出器に達する照射光が、試料の深さを通して透過される透過式で動作する顕微鏡と異なり、ずっと小さいイメージングコントラストをもたらす。

図１に示すように、反射された照射光および散乱光は、異なる方向性を有する。特に、反射された照射光は、光源４および光学系１０によって出力される光ビームの幾何学的形状から生じる開口数を有する。散乱光は、広い範囲の角度にわたって散乱され、それにより、反射された照射光より大きい開口数を満たす。

チューブレンズ１３は、対物レンズ１１からの出力光を検出器５上にフォーカスする。
光学系１０は、光源４からの照射光および検出器５に方向付けられる出力光についての光学経路を分割するために配置されるビームスプリッタ１４も含む。以下で説明される空間フィルタの提供を除いて、ビームスプリッタ１４は、ビームスプリッタ１４に入射する光の部分的反射および部分的透過を提供する従来の構造を有することができる。例えば、ビームスプリッタ１４は、光学経路に対して４５°で配置された、金属または誘電体とすることができるフィルムを、通常備えるプレートとすることができる。代替的に、ビームスプリッタ１４は、整合した対のプリズムによって形成されるキューブビームスプリッタであって、プリズムの間のインターフェースに部分的に反射性のフィルムを有する、キューブビームスプリッタとすることができる。代替的に、ビームスプリッタ１４は、ビームスプリッタ１４と試料３との間の１／４波長板と組み合わせて使用される偏光ビームスプリッタとすることができる。

図１に示す例において、光源４は、対物レンズ１１の光学経路からオフセットするため、光源４からの照射光は、ビームスプリッタ１４によって反射されて対物レンズ１１に入り、逆に、検出器５は、対物レンズ１１の光学経路に整列するため、試料場所からの出力光は、ビームスプリッタ１４を透過し検出器５に向かう。

従来の構造とすることができる上記で説明した構成要素に加えて、顕微鏡１は、空間フィルタ２０を含む。図１に示す例において、空間フィルタ２０は、ビームスプリッタ１４上で形成され、それにより、対物レンズ１１のバックアパーチャの背後に位置決めされ、それにより、対物レンズ１１の後方焦点面１５の背後に直接位置決めされる。そのため、空間フィルタ２０は、位相コントラスト顕微鏡法の場合と同様に対物レンズに入ることなく実装され得る。空間フィルタを、共役平面（例えば、以下で説明される）内ではなく、対物レンズの入口アパーチャのすぐ背後に配置することは、高開口数の顕微鏡対物レンズ内の多数のレンズから生じる後方反射を強く抑制するという明白な利点を有する。これは、次に、イメージングノイズを低減し、非干渉背景を低下させ、そして、実験的複雑さ、光学系の数、および光路長を減少させ、光学的セットアップ、したがって、イメージ品質の安定性の増加をもたらす。

しかしながら、この位置付けは、本質的でなく、同等の機能を有する空間フィルタは、以下で説明するように、他の所で設けられ得る。
空間フィルタ２０は、それにより、検出器５まで通過する出力光をフィルタリングするために位置決めされる。検出器５が対物レンズ１１の光学経路に整列する図１に示す例において、空間フィルタ２０は、したがって、透過性である。

空間フィルタ２０は、部分的に透過性であり、したがって、反射された照射光を含む出力光を通過させるが、その強度を減少させる。空間フィルタ２０は、光軸にも整列し、所定のアパーチャを有するため、所定の開口数以内において強度の減少を提供する。本明細書において、開口数は、出力光がそこから生じる試料場所に対する或る範囲の角度を特徴付ける無次元量であるとして、その通常の方法で定義される。特に、開口数ＮＡは、方程式ＮＡ＝ｎ・ｓｉｎ（θ）によって定義され得、ここで、θは集光半角（ｈａｌｆ ａｎｇｌｅ ｏｆ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）であり、ｎは、出力光が通過する材料（例えば、光学系１０の構成要素の材料）の屈折率である。

図２は、図１に示す装置を、倒立構成で、かつ、試料ホルダー２が固体浸漬レンズ２２と置換された状態で示す。顕微鏡構成は、検出器５および照射源４が固体浸漬レンズ２２の上に位置するため、倒立型として説明され、一方、図１において、また、従来のｉＳＣＡＴ顕微鏡の場合、検出器５および照射源４は試料ホルダー２の下に位置する。倒立顕微鏡構成は、図１の顕微鏡セットアップに示すように試料３が試料ホルダー２上に配置されることを必要とすることと対照的に、固体浸漬レンズ２２が溶液に上から容易に浸漬されることを可能にする。従来のレンズと比較すると、固体浸漬レンズ２２は、感度の増加を達成し得、より広い範囲の溶剤と共に使用するのに適する。固体浸漬レンズ２２は、ガラス、ダイヤモンド、ジルコニア、サファイア、ニオブ酸リチウム、または任意の他の適切な材料とすることができる。固体浸漬レンズ２２は、半球、超半球とすることができる、または、回折光学素子とすることができる。

図３Ａ～３Ｄは、本発明の自動化方法、および、オブジェクトの特性を測定するために使用される図２の倒立顕微鏡セットアップを示す。オブジェクトは、タンパク質、核酸分子、ウィルス様粒子、単一分子、巨大分子、超分子、または、分子、巨大分子（ポリマーなど）、および超分子の会合とすることができる。

倒立顕微鏡幾何学的形状および固体浸漬の浸漬は、測定が試料溶液内で直接行われることを可能にする。倒立顕微鏡構成は、溶液が、自動的に固体浸漬レンズ２２の下で移動しかつ固体浸漬レンズ２２に整列することを可能にし、それにより、固体浸漬レンズは、要求されるシーケンスで溶液に浸漬され得る。本発明の方法は、マルチウェルプレート４６に適合し、したがって、標準的な生化学ワークフローに一体化され得る。図３Ａ～３Ｄに示すマルチウェルプレート４６は、単に例として６つのウェルを示し、本発明の方法が、一般的に使用される９６ウェルプレートフォーマットを含む他のウェルプレートフォーマットに適合することが理解されるべきである。

さらに、本発明の方法は、固体浸漬レンズ２２が後続の測定で再使用され得るように制御された洗浄ステップも提供する。したがって、固体浸漬レンズ２２は、使い捨てである必要はなく、そのことは、本発明の方法を、費用効果がありかつ高スループットワークフローに実装するのに適するように保つ。

図３Ａに示すように、本発明の１つの例の実施形態は、同じマルチウェルプレート４６内に配置された試料溶液４４ならびに洗浄溶液４２および５２を共に示す。代替的にまたは付加的に、溶液の一部または全ては、必要に応じて、固体浸漬レンズ２２の下で移動し、固体浸漬レンズ２２に整列することができる別個の容器内に保持され得る。例えば、マルチウェルプレート４６は、試料溶液４４のみを含むことができ、１つまたは複数の洗浄溶液４２および５２は、測定の間に固体浸漬レンズ２２の下で移動することができる別個の容器またはウェルプレート内に保持され得る。ウェルプレート４６は、温度制御および／または撹拌を伴って維持され得る。

図３Ａは、固体浸漬レンズ２２の下で整列したマルチウェルプレート４６内の試料溶液４４を示す。試料溶液４４は、関心のターゲットオブジェクトを含む。マルチウェルプレート４６は、図３Ａに示す矢印４８で示すように、固体浸漬レンズ２２に向かって上に移動され得る。

図３Ｂに示すように、マルチウェルプレート４６は、測定されるオブジェクトを含む試料溶液４４に固体浸漬レンズ２２が浸漬されるまで、上に移動され得る。固体浸漬レンズ２２は、試料溶液４４に浸漬された状態で保持され、それは、関心のオブジェクトが固体浸漬レンズ２２の表面に吸着することを可能にする。関心のオブジェクトの吸着を容易にするために、固体浸漬レンズ２２の表面は、試料溶液４４に浸漬するのに先立って官能基化され得る。レンズ表面の官能基化は、固体浸漬レンズ２２を、水酸化ナトリウム溶液、硫酸、塩酸、および／または硝酸に浸漬させることによって行うことができる。レンズ表面の官能基化は、例えば、プラズマ処理によって行うこともできる。固体浸漬レンズ２２の表面は、カルボキシル化および／または酸化され得る。

固体浸漬レンズ２２は、所定の量の時間の間、試料溶液４４内に保持される。この時間の間、関心のオブジェクトは、固体浸漬レンズ２２の表面に吸着し、測定が、ｉＳＣＡＴ顕微鏡１を使用して行われる。固体浸漬レンズ２２の表面は、照射源４によって照射され、オブジェクトからの散乱光は、ｉＳＣＡＴ顕微鏡１の検出器５によって検出される。散乱光は、固体浸漬レンズ２２の表面に吸着したオブジェクトの特性を測定するために使用される。図３Ｂに示すように固体浸漬レンズ２２が試料溶液４４内に保持される継続時間は、１０秒と５分との間とすることができる。

所定の時間が経過し、オブジェクトの測定がｉＳＣＡＴ顕微鏡１を使用して行われた後、マルチウェルプレート４６は、図３Ｂの矢印５０で示すように降下され得る。マルチウェルプレート４６の降下は、固体浸漬レンズ２２が試料溶液４４から取り出されるようなものである。この時点で、関心のオブジェクトは、固体浸漬レンズ２２の表面に吸着したままである。

本発明の方法のコストを著しく増加させることになる、固体浸漬レンズ２２が使い捨てでなければならないことを防止するために、本発明は、測定が行われた後に固体浸漬レンズ２２を洗浄するための方法を含み、それにより、オブジェクトは、固体浸漬レンズ２２の表面から取り除かれる。

図３Ｃに示すように、マルチウェルプレート４６は、洗浄溶液４２が、固体浸漬レンズ２２の下に位置決めされ、固体浸漬レンズ２２に整列するように、自動的に移動され得る。代替的に、洗浄溶液４２は、測定の間に固体浸漬レンズ２２の下に自動的に位置決めされ得る別個の容器内に保持され得る。

固体浸漬レンズ２２は、矢印５４で示すように、マルチウェルプレート４６を上に移動させることによって、図３Ｃに示すように洗浄され得る。図３Ｄは、洗浄溶液４２に浸漬された固体浸漬レンズ２２を示す。所定の時間後に、マルチウェルプレート４６は、矢印５６で示すように降下され得、洗浄された固体浸漬レンズ２２は、その後、さらなる試料溶液４４に浸漬され、さらなる測定のために使用され得る。代替的に、固体浸漬レンズ２２を洗浄溶液４２から取り出した後に、固体浸漬レンズ２２は、その後、１つまたは複数のさらなる洗浄溶液５２に浸漬され得る。これは、試料溶液４４および固体浸漬レンズ２２の表面に吸着したオブジェクトに応じて、洗浄ルーチンが適合されることを可能にし、それにより、オブジェクトおよび試料溶液４４の全てが、固体浸漬レンズ２２から取り除かれ、さらなる測定を汚染しない。洗浄溶液４２および／または５２は、エタノール、イソプロパノール、水、塩酸、および／または硫酸を含むことができるが、それに限定されない。洗浄溶液４２および／または５２からの固体浸漬レンズ２２の取り出し後に、レンズ表面にわたる空気流が、残留するいずれの洗浄溶液をも取り除くため表面を乾燥するために使用され得る。

代替的にまたは付加的に、洗浄溶液４２および／または５２は、固体浸漬レンズ２２表面からのオブジェクトの除去を支援するために、例えば、ソニケーターバスによって撹拌され得る。

代替的にまたは付加的に、固体浸漬レンズ２２は、洗浄プロセスを容易にするために測定の間に、プラズマによって、例えば、環境圧プラズマトーチによって処理され得る。代替的にまたは付加的に、固体浸漬レンズ２２は、洗浄プロセス後に、プラズマで処理されて、固体浸漬レンズ２２の表面を官能基化し、固体浸漬レンズ２２が試料溶液４４に浸漬されると、ターゲットオブジェクトの吸着を容易にすることができる。

図４を参照すると、超半球固体浸漬レンズ（ｓ－ＳＩＬ）６４にフォーカスする非球面レンズ６２を有するレンズ系６０が示される。幾つかの実施形態において、半球固体浸漬レンズおよび／またはワイエルシュトラスレンズ（Ｗｅｉｅｒｓｔｒａｓｓ ｌｅｎｓ）は、球状とすることができ、その後、厚さｔ＝ｒ×（１＋１／ｎ）（ｒは半径、ｎは屈折率）に切頭され得る。この厚さの場合、レンズは、球面収差を付加することなく、入力ビームのＮＡをｎ^２だけ増加させる。ダイヤモンド（ｎ＝２．４２）を用いて、２．１ＮＡが、０．３６ＮＡ非球面レンズに関して達せられ得る。代替の材料、高屈折率ガラス（Ｓ－ＬＡＨ７９、ｎ＝２）またはキュービックジルコニア（ｎ＝２．１７）は、０．４５ＮＡ非球面レンズに関して１．８ＮＡを超えることができる。

図５を参照すると、２つのレンズ６２、６４は、１つまたは複数の標準的なウェルプレート（直径６．５～７ｍｍ）に浸漬され得るのに十分に小さいステンレス鋼バレルなどのバレル６６に取り付けられる。２ｍｍ直径半球固体浸漬６４が図５に示されるが、他のサイズが可能である。

測定は、生体溶液６８、例えば、ウェル７０内に含まれる図６に示すタンパク質溶液にレンズ６２、６４を浸漬させることによって行われ得る。バレル（浸漬先端）６６は、水、食塩水、アルコール、および他の溶剤に耐性があるとすることができる。

ウェルは、プラスチックから作られ得るが、当業者に知られている他の適切な材料からも作られ得る。少なくともＳＩＬ６４は、その後、水溶液およびイソプロパノールなどの有機溶剤を用いて浸漬させ噴霧することによって洗浄され得る。付加的にまたは代替的に、両方のレンズ６２、６４は、水溶液およびイソプロパノールなどの有機溶剤を用いて浸漬させ噴霧することによって洗浄され得る。したがって、レンズ系は、十分にシールされかつ化学的耐性がある必要がある。試料溶液を汚染することを回避するために、レンズバレルについて使用される材料に関して制限が存在する可能性がある。ステンレス鋼３１６はオプションとすることができる。ダイヤモンドボンディングの場合、半球レンズは、光学系の残りの部分と、その後一体化され得るように確実に取り付けられ得る。光学系は、本明細書で説明するように、ビームの一部を減衰させるために、部分的に透過なマスクを有する標準的なオイル浸漬対物レンズと共に使用され得る。

図７を参照すると、固体浸漬レンズに対する代替の設計が提供される。半球固体浸漬レンズ８０が使用され得るが、入力ビーム８２のＮＡは、ｎ^２ではなくｎだけ増加する。これは、単一非球面レンズであるよりもマルチエレメントシステムであるように見える０．８＋ＮＡ入力レンズを必要とする場合がある。小さい直径、０．５～１ｍｍのＳＩＬが必要とされ得るため、入力対物レンズは過剰の作業距離を必要としない。

［材料および方法］
［オプティカル］
動作波長範囲は、５１５～５３５ｎｍとすることができる。色収差は、（０．２／５）ｎｍにリフォーカスすることなく、指定された性能について波長範囲を制限することができる。良好なイメージング性能は、光軸に中心を持つ視野（１５μｍ／３０μｍ）直径、ダイヤモンドの場合のＮＡ（１．８／２．１）、高屈折率ガラスまたはキュービックジルコニアの場合のＮＡ（１．６／１．８）、視野にわたる回折限界イメージング、ストレール比（Ｓｔｒｅｌｌ ｒａｔｉｏ）＞（０．９／０．９５）として定義され得る。

［他の光学特性］
ｓ－ＳＩＬにおいて上記ＮＡに達するために、非球面レンズのＮＡは、約０．３５とすることができる。４ｍｍの直径は、先端に嵌合するために設けられ得る。ＡＲコーティングが、非球面レンズおよび／またはリレーレンズに塗布され得、Ｒ＜１％である。低い迷光およびイメージング経路に沿って送り返される反射を回避すること。拡大率を決定するためのＳＩＬ非球面システムの有効焦点距離、０．５～５ｍｍ。ｓ－ＳＩＬのｎ^２拡大率に留意されたい。偏光としての低応力複屈折が重要であるとすることができる。

レーザー損傷閾値は、２Ｗビームが非球面レンズクリアアパーチャの面積の任意の１０％を占めることを可能にするのに十分に高く提供され得る。固定されたインターフェースはなし。付加的にまたは代替的に、ＳＩＬは、平坦表面（２、＜１）ｎｍＲＭＳのアスフェリコン（Ａｓｐｈｅｒｉｃｏｎ）表面粗さによって作られ得る。

［メカニカル］
システムは、ｓ－ＳＩＬの平坦表面から１０ｍｍの長さについて、シールされた浸漬用先端６ｍｍ最大直径で構築され得る。ｓ－ＳＩＬおよび非球面レンズは、上記光学性能を達成するために、所定の位置に確実に取り付けられるべきである。構成要素の熱膨張は、摂氏２０°～２２°、１５°～４０°の範囲の温度にわたるフォーカシングを妨げるべきでない。

本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮して当業者に明らかになるであろう。
本明細書で使用される「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」は、２つの指定された特徴または構成要素のそれぞれについての、他の特徴または構成要素がある場合またはない場合の特定の開示として考えられる。例えば、「Ａおよび／またはＢ（Ａ ａｎｄ／ｏｒ Ｂ）」は、それぞれが本明細書で個々に提示されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれの特定の開示として考えられる。

別段に文脈が指示しない限り、上記で提示された特徴の説明および規定は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定されず、説明される全ての態様および実施形態に同様に適用される。

本発明が、幾つかの実施形態を参照して例として説明されたが、本発明が、開示された実施形態に限定されないこと、および、代替の実施形態が、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく、考えられ得ることが当業者によってさらに認識されるであろう。

Claims (19)

1. オブジェクトを含む試料溶液に固体浸漬レンズを浸漬させることであって、前記オブジェクトは前記固体浸漬レンズの表面と相互作用することと、
   前記固体浸漬レンズの前記表面を照射源で照射し、前記オブジェクトからの散乱光を、干渉散乱顕微鏡を使用して検出することと、
   検出された前記散乱光を使用して前記オブジェクトの特性を測定することと、
   前記溶液から前記固体浸漬レンズを取り出すことと、
   その後、前記固体浸漬レンズを洗浄することであって、前記オブジェクトは前記固体浸漬レンズの前記表面から取り除かれることと
   を含む、
   オブジェクトの特性を測定するための方法。
2. 前記オブジェクトの特性を測定することは、前記オブジェクトの質量を定量化することを含む、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記オブジェクトの特性を測定することは、前記オブジェクトの前記質量の変化を測定または定量化することを含む、
   請求項１に記載の方法。
4. 前記固体浸漬レンズを洗浄することは、前記固体浸漬レンズを少なくとも１つの洗浄溶液に浸漬させることを含む、
   請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記固体浸漬レンズにわたって空気を流すことをさらに含む、
   請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記洗浄溶液を撹拌することをさらに含む、
   請求項４に記載の方法。
7. 前記固体浸漬レンズの前記表面にプラズマを適用することをさらに含む、
   請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記固体浸漬レンズは、１～５ｍｍの直径を有する、
   請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記固体浸漬レンズは、レンズアセンブリに取り付けられる、
   請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記レンズアセンブリは、２～６ｍｍの直径を有する、
    請求項９に記載の方法。
11. 前記固体浸漬レンズは、６～１０ｍｍの長さを有する、
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記固体浸漬レンズは、半球であるかまたは超半球である、
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記干渉顕微鏡は、前記固体浸漬レンズの収差を補償するように構成される少なくとも１つの光学素子をさらに備える、
    請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記固体浸漬レンズの材料は、ダイヤモンドである、または、ジルコニアである、または、サファイアである、または、ニオブ酸リチウムである、
    請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記固体浸漬レンズの材料は、ガラスである、
    請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記固体浸漬レンズの前記表面を官能基化することをさらに含む、
    請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記オブジェクトは、タンパク質、脂質、炭水化物、有機ポリマー、核酸分子、ウィルス、小胞、複合体集合、またはウィルス様粒子である、
    請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記照射光は、空間的にかつ時間的にコヒーレントである、
    請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記干渉散乱顕微鏡は、空間フィルタをさらに備える、
    請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
    

Images