JP2024530036A - 抗体Ｆｃバリアント - Google Patents

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Abstract

本発明は、低減された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）を含む、低減されたエフェクター機能を有するコンパニオン動物のバリアントＦｃポリペプチドに関する。エフェクター機能ヌルＩｇＧは、広範な疾患領域における、並びにＦｃ融合タンパク質及び代替抗体フォーマットにおける多くの抗体の作用機序にとって重要である。【選択図】なし

Description

序論
抗体ベースの治療薬は、腫瘍学、炎症性疾患及び感染性疾患のような分野における増加する数のヒト悪性腫瘍に対する療法の重要な構成要素として浮上している。実際、抗体は、今日最も売れている薬物クラスのうちの１つであり、最も売れている上位１０個の薬物のうちの５つは、抗体である。抗体療法は、イヌなどの家畜の治療のための獣医学にもますます使用されている。
米国だけでも毎年６００万件のイヌのがんが診断され、ネコでも同様の数のがんが診断されているため、獣医学においてこれらの療法に対する必要性は非常に大きい（Ｃｅｋａｎｏｖａ ａｎｄ Ｒａｔｈｏｒｅ Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｕｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｅｖｅｌ Ｔｈｅｒ，８：１９１１－２，２０１４）“Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｕｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ”Ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ８：１９１１－１９２２）。更に、米国のイヌの４匹に１匹が何らかの形の関節炎と診断されている（Ｂｌａｎｄ“Ｃａｎｉｎｅ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ”Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ５（２）），２０１５）。したがって、多くの慢性獣医学的疾患に対する抗体治療薬の適用の可能性がある。モノクローナル抗体はまた、寄生虫性疾患、細菌性疾患及びウイルス性疾患の検出、予防及び制御に有益であり得る。
ヒトにおける治療的使用のための最初のモノクローナル抗体は、２５年前に市販承認を受け、それ以来８０種が承認され、５０種超が後期段階の臨床開発中である。対照的に、獣医学における抗体の使用は初期段階であり、開発中の抗体はごくわずかである。限られた進歩は、種特異的治療抗体の開発が技術的に困難であり、比較的最近の努力に過ぎないという事実を反映している。したがって、獣医学のための改良された抗体、及び獣医学のための抗体を作製するための方法を開発する必要がある。
抗体構造は、ヒトにおける疾患を標的とするために様々な異なるヒト抗体フォーマットを操作するために利用されている。一例は、ヒトＦｃドメインの最適化である。Ｆｃの最適化の基礎は、Ｆｃ受容体、Ｃ１ｑ、及びＦｃＲｎに結合するその能力を調節することである。Ｆｃドメインは、有益な機能獲得改変を得るために改変され得るが、場合によっては、抗体Ｆｃ機能を消失させることが有益であり得る。これらの状況は、受容体を架橋し、シグナル伝達を誘導するために受容体アゴニストとして使用される抗体、（シグナル伝達を防止するために受容体：リガンド相互作用を遮断する受容体アンタゴニスト、又は抗原発現標的細胞に１つ以上の薬物を送達するための薬物送達ビヒクルを含む。これらの事例では、エフェクター細胞上の受容体のＦｃ結合又はＣ１ｑの結合は、受容体を発現する生物学的に重要な細胞の望ましくない殺傷又はオフターゲット細胞への薬物コンジュゲート抗体の動員につながる可能性があるため、望ましくない。したがって、エフェクター機能ヌルＩｇＧは、広範な疾患領域における多くの抗体の作用機序にとって重要である。加えて、これは、Ｆｃ融合タンパク質、及び二重特異性抗体又は多重特異性抗体などの代替抗体フォーマットにおいても重要である。Ｆｃ配列への変化及びグリコシル化を含む、ヒト抗体のＦｃγＲ結合及び補体タンパク質Ｃ１ｑ結合を操作するためのいくつかの戦略は、Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ａｒｔｉｃｌｅ １２９６，Ｖｏｌｕｍｅ １０，７ Ｊｕｎｅ ２０１９に記載されている。
しかしながら、Ｆｃ領域内のアミノ酸配列を編集することによるＦｃ媒介機能の変化は、生体物理学的特性の変化をもたらし得、これは、Ｆｃベースの治療薬の更なる開発のために、熱安定性の低下、凝集傾向の増加、及びインビボ薬物動態の低下などの望ましくない結果をもたらし得る。加えて、改変は、プロテインＡ及び新生児型受容体（ＦｃＲｎ）結合などの他の分子とのＦｃ相互作用に影響を及ぼし得るコンフォメーション変化を引き起こし得る。これらの変化は、配列のみに基づいて予測不可能である。したがって、エフェクター機能を変化させるようにＦｃ断片を改変する場合、安定性及び凝集、並びにプロテインＡ及びＦｃＲｎへの結合を含む、物理化学的特性に対する任意の変異の影響を考慮し、慎重に評価することが重要である。これは、臨床的に有用な分子を開発する上で重要である。
Ｆｃ結合が低減又は消失した獣医学のための改良された抗体、及び獣医学のためのそのような抗体を作製するための方法を開発する必要性がある。本発明は、特に、改変された免疫グロブリンＦｃ領域を提供することにより、この必要性に対処することを目的とする。
細胞傷害及び食作用エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する強力な機構である。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体及びリガンドとの相互作用を介して、抗体の認識ドメインをこれらのエフェクター機能に連結する。Ｆｃ領域の変化によるこれらのエフェクター機能の操作は、多くの病状、例えば、がん、自己免疫疾患及び感染症の治療において重要な意味を有する。
本発明は、（ｗｔと比較して）有利な特性を有する改変イヌ及び改変ネコＦｃ領域を提供する。
イヌＩｇＧ－Ａ及びＩｇＧ－Ｄはエフェクター機能が欠損しているが、ＩｇＧ－Ｂ及びＩｇＧ－Ｃは、エフェクター機能に習熟していることが知られている。しかしながら、ＩｇＧ－ＢはプロテインＡ結合能及び他のイヌＩｇＧと比較して比較的長い半減期などの他の特徴のために、治療用抗体で現在使用されている主なＩｇＧである。したがって、エフェクター機能ヌルイヌＩｇＧ－Ｂを生成することは、ある特定の治療領域にとって魅力的である。
本発明者らは、野生型ＩｇＧ－Ｂ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、イヌＩｇＧ－Ｂエフェクター機能を低減又は消失するように改変されたイヌＩｇＧ－Ｂを有する。構造解析に基づいて、改変のためのＦｃドメインのアミノ酸配列において標的化された領域は、アミノ酸配列モチーフに基づいて、下部ヒンジ、プロリン領域、及びＳＨＥＤ領域を含み、ここで、ＦｃガンマＲ及びＣ１ｑとの潜在的な相互作用が生じる。完全にイヌ細胞に基づく機能アッセイにおけるＦｃバリアントの効果を実証した。
ネコＩｇＧについてはあまり知られていないが、天然のネコＩｇＧアイソフォームの特徴付けに関する以前の研究では、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２と呼ばれる２つのアイソフォームが同定されている。ＩｇＧ１はエフェクター機能に習熟していることが示されているが、ＩｇＧ２はエフェクター機能が欠損している。しかしながら、ＩｇＧ２は、ヒトＩｇＧ４と同様に、ヒンジジスルフィド結合不安定性を発揮する。これは、治療用途に直接使用される野生型ＩｇＧ２の適用を妨げる。したがって、そのエフェクター機能を消失させるためのネコＩｇＧ１の改変は、ある特定の治療領域について安定したエフェクター機能ヌルネコＩｇＧバリアントを得るための魅力的な選択肢である。
イヌＩｇＧ－Ｂ改変に対する同じアプローチを使用して、本発明者らは、野生型ネコＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、ネコＩｇＧ１エフェクター機能を低減又は消失するようにネコＩｇＧ１を改変した。構造解析に基づいて、改変のためのＦｃドメインのアミノ酸配列において標的化された領域は、アミノ酸配列モチーフに基づいて、下部ヒンジ、プロリン領域、及びＳＨＥＤ領域を含み、ここで、ＦｃγＲ及びＣ１ｑとの潜在的な相互作用が生じる。Ｆｃバリアントの効果は、細胞に基づく機能アッセイにおいて実証された。
したがって、本発明は、補体及びＦｃγＲ媒介エフェクター機能を低減させる、生物種化バリアントを含む、単離されたコンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、及びウマ）のＦｃバリアントを提供する。Ｆｃバリアントは、単離されたポリペプチド、例えば、抗体又は抗体断片の一部である。
本発明のＦｃバリアントは、野生型Ｆｃと比較して１つ以上のアミノ酸置換を含み、当該置換（複数可）は、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を変化させるか、又はＣＤＣ、ＡＤＣＣ及び／若しくはＡＤＣＰ活性を低下させる。したがって、本発明は、天然野生型配列と比較して、Ｆｃドメインに１つ以上の改変を有するＦｃバリアント、例えば、イヌ、ウマ又はネコのバリアントであって、改変が、下部ヒンジ、プロリン領域及びＳＨＥＤ領域におけるアミノ酸置換である、バリアントに関する。
配列番号１１に示される野生型イヌＩｇＧ－Ｂ定常領域配列及び配列番号３１に示されるネコＩｇＧ１定常領域配列に関して、下部ヒンジは残基１１９～１２５を含み、プロリン領域は残基２１１～２１７を含み、ＳＨＥＤ領域は残基１５１～１５６を含む。図２Ａ及び図１５Ａは、それぞれ、イヌ定常領域及びネコ定常領域についてのドメイン及び残基の番号付けを示す。野生型と比較した下部ヒンジ、プロリン領域及びＳＨＥＤ領域における本発明によるイヌバリアント配列を図２Ａに示し、野生型と比較した下部ヒンジ、プロリン領域及びＳＨＥＤ領域における本発明によるネコバリアント配列を図１５Ａに示す。残基の番号付けは、イヌＦｃについては配列番号１１（図２Ｂ）、ネコＦｃについては配列番号３１（図１５Ｂ）を参照している。これらの参照配列は、それぞれ、イヌＩｇＧＢ及びネコＩｇＧ１野生型定常領域アミノ酸配列を示す。図１は、イヌの完全なＩｇＧアイソフォーム野生型配列を示し、図１３は、以前に同定されたネコのＩｇＧ１及びＩｇＧ２アイソフォームを示す。また、本発明者によって同定、単離、及び特徴付けられた新規のアイソフォームＩｇＧ３も示している。
したがって、本発明は、以下に更に記載されるイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。本発明は、以下に更に記載されるネコ、キメラ若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。本発明は、単離されたネコＩｇＧ３ポリペプチド又はその一部分、及びＩｇＧ３ポリペプチド又はその一部分を含む組換え抗体分子に関する。
一態様では、本発明は、改変Ｆｃ領域を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／若しくは配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択されるアミノ酸置換、並びに／又は
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換を含み、かつ／あるいは
ｃ）アミノ酸置換が、以下の改変：
ｃ１）配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換と組み合わせた、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、
ｃ２）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、
ｃ３）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、又は
ｃ４）ｃ１～ｃ３の組み合わせのうちの１つから選択される、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
一態様では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、以下のａ）に記載されるアミノ酸置換、並びに、任意選択的に、以下のｂ）及び／又は以下のｃ）に記載されるアミノ酸置換を含み、
ａ）アミノ酸置換が、配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択され、
ｂ）アミノ酸置換が、配列番号１１の１５３位におけるＧへの改変、配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換から選択され、かつ／あるいは
ｃ）アミノ酸置換が、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換から選択される、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
一態様では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
１）
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
２）
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
３）
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
４）
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
５）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
６）
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
７）
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
８）
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへのアミノ酸置換、及び
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域、又は
９）
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、上記に示される改変を含むが、任意の更なる改変を有しない。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへのアミノ酸置換、及び
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換を含む、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、上記態様の一実施形態では、本発明は、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、Ｆｃ領域を含む、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、本発明は、ポリペプチドが、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０、又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含み、この配列が、野生型配列ではない、イヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
本発明はまた、本明細書に記載のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域を含む、薬学的組成物に関する。
本発明はまた、本明細書に記載のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域をコードする、核酸に関する。
本発明は更に、上記のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂ核酸又はそのＦｃ領域を含む、ベクターに関する。
本発明は更に、上記のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂ核酸を含む、宿主細胞に関する。
本発明は更に、疾患、例えば、炎症性疾患又は自己免疫疾患、の治療における使用のための、本明細書に記載のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はＦｃ領域、あるいは本明細書に記載のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はＦｃ領域を含む薬学的組成物に関する。
本発明は、対象における疾患を治療する方法であって、有効量の、上記のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域を含むポリペプチドあるいは薬学的組成物を、当該対象に含む、前記方法に関する。疾患は炎症性疾患又は自己免疫疾患であり得る。
本発明は、本明細書に記載のイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域、あるいは本明細書に記載の薬学的組成物、を含むキットに関する。
本発明は更に、エフェクター機能を抑制するためのインビトロ又はインビボ方法であって、細胞又は組織を、本明細書に記載のポリペプチド又はイヌ、キメラ若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域と接触させることを含む、方法に関する。
配列番号３１に示されるネコＩｇＧ１定常領域配列に関して、下部ヒンジは残基１１９～１２５を含み、プロリン領域は残基２１１～２１７を含み、ＳＨＥＤ領域は残基１５１～１５６を含む。図１５Ａは、ドメイン及び残基の番号付けを示す。配列番号３１（ＩｇＧ１）の野生型と比較した、下部ヒンジ、プロリン領域及びＳＨＥＤ領域における本発明によるネコバリアント配列を示す。残基の番号付けは、ネコＩｇＧ１野生型定常領域アミノ酸配列を示す配列番号３１（図１５Ｂ）を参照している。図１３Ａは、完全なネコＩｇＧアイソフォーム野生型配列を示す。
したがって、別の態様では、本発明は、改変Ｆｃ領域を含む、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、並びに／あるいは
ｂ）以下の改変：配列番号３１の２１７位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、改変Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は、
ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換を含み、配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換のいずれかを更に含むか、又は
ｂ）配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換を含み、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のいずれかを更に含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、改変Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換、及び任意選択的に、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、低減されたＦｃ媒介性エフェクター機能を有する。
一実施形態では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
一実施形態では、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）である。
一実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）に対するより低い親和性を有する。
一実施形態では、ポリペプチド又はＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合を保持する。
本発明はまた、上記のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域を含む、薬学的組成物に関する。
本発明はまた、エフェクター機能を抑制するためのインビトロ、エクスビボ又はインビボ方法であって、細胞又は組織を、上記のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域と接触させることを含む、前記方法に関する。
本発明は、更に、疾患、例えば、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療における使用のための、本明細書に記載のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域、あるいは本明細書に記載のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域を含む薬学的組成物に関する。
本発明は、対象における疾患を治療する方法であって、有効量の、上記のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域を含むポリペプチドあるいは薬学的組成物を、当該対象に含む、前記方法に関する。疾患は炎症性疾患又は自己免疫疾患であり得る。
一実施形態では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。
一実施形態では、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。
本発明はまた、上記のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域をコードする、核酸に関する。
本発明はまた、上記のネコ又はネコ化核酸を含む、ベクターに関する。
本発明はまた、上記のネコ若しくはネコ化核酸配列又はベクターを含む、宿主細胞に関する。
本発明はまた、上記のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域、あるいは薬学的組成物を含む、キットに関する。
本発明はまた、配列番号３３を含む、単離されたＩｇＧ３ネコポリペプチド、又はそのＦｃ領域に関する。
本発明はまた、上記のポリペプチド又はＦｃ領域をコードする、単離されたＩｇＧ３ネコポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、上記のポリペプチド又はＦｃ領域を含む、単離された組換え抗体に関する。
本発明は、以下の非限定的な図面において更に例示される。
Ａは、野生型イヌＩｇＧ（ｃＩｇ－Ｇ）ＩｇＧ－Ａ（配列番号２２）（ａ）、ＩｇＧ－Ｂ（配列番号２１）（ｂ）、ＩｇＧ－Ｃ（配列番号２３）（ｃ）、及びＩｇＧ－Ｄ（ｄ）（配列番号２４）のアミノ酸配列を示す。定常領域は、残基１４０から始まる。強調表示は、下部ヒンジ、プロリンサンドイッチ、及びＳＨＥＤ領域を識別する。 Ｂは、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって視覚化されたオファツムマブ可変領域を有する、野生型イヌキメラ（ｃＩｇ－Ｇ）ＩｇＧ－Ａ（配列番号２２）（ａ）、ＩｇＧ－Ｂ（配列番号２１）（ｂ）、ＩｇＧ－Ｃ（配列番号２３）（ｃ）、及びＩｇＧ－Ｄ（ｄ）（配列番号２４）を示す。ＩｇＧ－Ａ及びＩｇＧ－Ｄはヒンジ不安定性を示し、ＨＬ半抗体種は可視であることに留意されたい。 Ａは、本明細書に記載の野生型イヌＩｇＧ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ及び－Ｄ並びにＤｅｆ ＩｇＧ－Ｂ「ｄｅｆ１～９」のアミノ酸配列を示す。変異は、下部ヒンジ（アミノ酸残基１１９～１２５）、プロリンサンドイッチ（２１１～２１７）、及び「ＳＨＥＤ」領域（１５１～１５６）にある。太字は、野生型イヌＩｇＧ－Ｂ（ｃＩｇＧ－Ｂ）と比較してＤｅｆ変異体内で変異しているアミノ酸である。残基の番号付けは、イヌＩｇＧ－Ｂ野生型定常領域アミノ酸配列を示す配列番号１１を参照している。この配列を図２Ｂに示す。図２Ａを参照すると、ＩｇＧ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄの下部ヒンジは、それぞれ、配列番号４８、４９、５０、５１である。ＩｇＧ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－Ｄのプロリンサンドイッチは、それぞれ、配列番号５２、５３、５４、５５である。ＩｇＧ－Ａ、－Ｂ、－Ｃ、－ＤのＳＨＥＤ領域は、それぞれ、配列番号５６、５７、５８、５９である。Ｂ－ｄｅｆ１、Ｂ－ｄｅｆ２、Ｂ－ｄｅｆ３、Ｂ－ｄｅｆ４、Ｂ－ｄｅｆ５、Ｂ－ｄｅｆ６、Ｂ－ｄｅｆ７、Ｂ－ｄｅｆ８、Ｂ－ｄｅｆ９の下部ヒンジは、それぞれ、配列番号６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８である。Ｂ－ｄｅｆ１、Ｂ－ｄｅｆ２、Ｂ－ｄｅｆ３、Ｂ－ｄｅｆ４、Ｂ－ｄｅｆ５、Ｂ－ｄｅｆ６、Ｂ－ｄｅｆ７、Ｂ－ｄｅｆ８、Ｂ－ｄｅｆ９のプロリンサンドイッチは、それぞれ、配列番号６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７である。Ｂ－ｄｅｆ１、Ｂ－ｄｅｆ２、Ｂ－ｄｅｆ３、Ｂ－ｄｅｆ４、Ｂ－ｄｅｆ５、Ｂ－ｄｅｆ６、Ｂ－ｄｅｆ７、Ｂ－ｄｅｆ８、Ｂ－ｄｅｆ９のＳＨＥＤ領域は、それぞれ、配列番号７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６である。 ＩｇＧ－Ｂ変異体のＣＤＣ活性を示す。全てのＤｅｆバリアントは、ＩｇＧ－Ｂ ＣＤＣ活性を抑制する。野生型（ＷＴ）イヌＩｇＧ－Ｂと比較した場合、エフェクター機能欠損ＩｇＧ－Ｂ変異体Ｄｅｆ１、２、３、５、６、７、８、及び９によるヒトＣＤ２０（ＣＬＢＬ１ ｈＣＤ２０）を発現するイヌＴ細胞の低減された補体依存性殺傷を示す補体依存性細胞傷害性アッセイ。このアッセイで使用される全ての抗体は、オファツムマブ可変領域を有する。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は全ての細胞が殺傷されたことを意味し、０％はシグナルが対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。 キメラオファツムマブＩｇＧ－Ｂ及びリツキシマブＩｇＧ－ＢについてのＡＤＣＣ活性の比較を示し、可変領域配列がＡＤＣＣ活性の効力にも寄与しないことを示す。 野生型又はｈＣＤ２０発現ＭＤＣＫ ＩＩ細胞上のＩｇＧ－Ｂ変異体のＡＤＣＣ活性を示す。野生型（ＷＴ）イヌＩｇＧ－Ｂと比較した場合、ヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の細胞依存性殺傷を誘導する、オファツムマブ可変領域を有するＤｅｆ変異体１、２、３、５、６、７、８、及び９のイヌＩｇＧ－Ｂの低減された能力を示す、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性アッセイ。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は、全ての細胞が殺傷されることを意味し、０％は、シグナルが、対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。図５Ａは、個々のＤｅｆ変異体のグラフを示す。図５Ｂは、図５Ａに示されるデータの組み合わせである。上パネルは、ヒトＣＤ２０ ＭＤＣＫ細胞を使用した変異体について得られた結果を示し、下パネルは、野生型ＭＤＣＫ細胞を使用した結果を示す。 野生型又はｈＣＤ２０発現ＭＤＣＫ ＩＩ細胞上のＩｇＧ－Ｂ変異体のＡＤＣＣ活性を示す。野生型（ＷＴ）イヌＩｇＧ－Ｂと比較した場合、ヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の細胞依存性殺傷を誘導する、オファツムマブ可変領域を有するＤｅｆ変異体１、２、３、５、６、７、８、及び９のイヌＩｇＧ－Ｂの低減された能力を示す、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性アッセイ。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は、全ての細胞が殺傷されることを意味し、０％は、シグナルが、対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。図５Ｂは、図５Ａに示されるデータの組み合わせである。上パネルは、ヒトＣＤ２０ ＭＤＣＫ細胞を使用した変異体について得られた結果を示し、下パネルは、野生型ＭＤＣＫ細胞を使用した結果を示す。 野生型又はｈＣＤ２０発現ＭＤＣＫ ＩＩ細胞上のＩｇＧ－Ｂ変異体のＡＤＣＣ活性を示す。野生型（ＷＴ）イヌＩｇＧ－Ｂと比較した場合、ヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の細胞依存性殺傷を誘導する、オファツムマブ可変領域を有するＤｅｆ変異体１、２、３、５、６、７、８、及び９のイヌＩｇＧ－Ｂの低減された能力を示す、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性アッセイ。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は、全ての細胞が殺傷されることを意味し、０％は、シグナルが、対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。図５Ｂは、図５Ａに示されるデータの組み合わせである。上パネルは、ヒトＣＤ２０ ＭＤＣＫ細胞を使用した変異体について得られた結果を示し、下パネルは、野生型ＭＤＣＫ細胞を使用した結果を示す。 野生型又はｈＣＤ２０発現ＭＤＣＫ ＩＩ細胞上のＩｇＧ－Ｂ変異体のＡＤＣＣ活性を示す。野生型（ＷＴ）イヌＩｇＧ－Ｂと比較した場合、ヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の細胞依存性殺傷を誘導する、オファツムマブ可変領域を有するＤｅｆ変異体１、２、３、５、６、７、８、及び９のイヌＩｇＧ－Ｂの低減された能力を示す、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性アッセイ。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は、全ての細胞が殺傷されることを意味し、０％は、シグナルが、対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。図５Ｂは、図５Ａに示されるデータの組み合わせである。上パネルは、ヒトＣＤ２０ ＭＤＣＫ細胞を使用した変異体について得られた結果を示し、下パネルは、野生型ＭＤＣＫ細胞を使用した結果を示す。 Ｄｅｆ２、３、及び７変異体のＡＤＣＣ活性を示す。エフェクター欠損変異体であるＤｅｆ２、Ｄｅｆ３、及びＤｅｆ７は、ＩｇＧ－Ｂ野生型（エフェクター有効）対応物と比較して、広い用量範囲でＡＤＣＣ機能を完全に消失する。異なる抗体濃度でヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導するオファツムマブ可変領域の能力を有する、Ｄｅｆ２、Ｄｅｆ３及びＤｅｆ７変異体とのイヌＩｇＧ－Ｂ ＷＴの直接比較。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は全ての細胞が殺傷されたことを意味し、０％はシグナルが対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。 加速安定性試験（Ａ）及びプロテインＡ結合（Ｂ）の結果を示す。Ａ：ＷＴ及び全てのイヌＤｅｆ変異体はいずれも、１４日間の保管後４℃で％及びモノマーピークの面積の著しい減少を示さなかった（図示せず）。更に、全てのｄｅｆ変異体は、４０℃でインキュベートした１４日後に、ＷＴに対してより高い％及び同様のモノマーピーク面積を示し、これは、全体的なタンパク質安定性が、欠損変異体に影響を受けないことを意味する。 加速安定性試験（Ａ）及びプロテインＡ結合（Ｂ）の結果を示す。Ｂ：動態及び定常状態親和性分析はいずれも、ＩｇＧ－Ｂｗｔとｄｅｆ変異体との、プロテインＡ及びＦｃＲｎへの結合親和性に統計的差異を示さなかった。 オファツムマブＩｇＧ－Ｂ ＷＴ対Ｄｅｆ変異体のＦｃγＲ１結合能を示す。オファツムマブＩｇＧ－Ｂ ＷＴ及びＤｅｆ変異体１～８のＳＰＲ測定は、ＦｃγＲ１に対する結合親和性において統計的に有意な差を示した。これらの分子のＳＰＲとＡＤＣＣデータとの間には良好な相関がある（ＷＴ＞Ｄｅｆ５～８＞Ｄｅｆ１、２、３、６、７）ことは注目に値し、これは、ＦｃγＲ１に対するより高い親和性が、インビトロアッセイにおいてより高い殺傷％に対応することを示している。 Ｒａｇ１ ＫＯマウスに１ｍｇ／ｋｇのＯｆａ－ＩｇＧＢ ＷＴ、Ｄｅｆ２、Ｄｅｆ３、又はＤｅｆ７を単一用量で注射することによって得られたインビボＰＫを示す。（注射前血清によって得られた）検出のバックグラウンドレベルは、点線によって示される。Ｄｅｆ２，３，７変異体は、ＷＴ ＩｇＧ－Ｂ ＷＴと比較して同様の薬物動態プロファイルを有する。 イヌＤｅｆ変異体のＤＬＳ測定値を示す。全てのＩｇＧ－Ｂ変異体は、野生型ＩｇＧ－Ｂと同様の半径を示した。これは、導入された変異がＩｇＧ－Ｂ Ｆｃドメインの安定性を変化させなかったことを示している。 ＷＴと比較したイヌＤｅｆ変異体のＴｏｎｓｅｔ測定値を示す。全てのＩｇＧ－Ｂ変異体は、野生型ＩｇＧ－Ｂと同様のＴｏｎｓｅｔを示した。これは、温度ストレスによって引き起こされる凝集傾向が、ＩｇＧ－Ｂ Ｆｃ ＷＴドメインと比較して、全ての欠損変異体において同様であることを示している。 鋳型としてＴｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで入手可能なＦＡＣＢ－１６０Ａ１５商用ＢＡＣライブラリを使用して生成されたＰＣＲ産物（１８６９ｂｐ）のサンガー配列決定によって確認された、ネコＩＧＨＧ３の推定される遺伝子構造を示す。 Ａは、野生型ネコＩｇＧ（ｆＩｇＧ）１（配列番号３１）（ａ）、２（配列番号３２）（ｂ）、及び３（配列番号３３）（ｃ）のアミノ酸配列を示す。定常領域は、残基１４１で開始する。強調表示は、下部ヒンジ、プロリンサンドイッチ、及びＳＨＥＤ領域を識別する。（Ｂ）は、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって視覚化されたオファツムマブ可変領域を有する、野生型ネコキメラｆＩｇＧ１（配列番号３１）（ａ）、２（配列番号３２）（ｂ）、及び３（配列番号３３）を示す。ＩｇＧ２がヒンジ不安定性を有し、ＨＬ半抗体バンドが約７５ｋＤａの低分子量で移動することに留意されたい。 ネコＷＴ ＩｇＧ１、２、及び３のＡＤＣＣ活性を示す。野生型（ＷＴ）ネコＩｇＧ１と比較した場合に、オファツムマブ可変領域を有するＷＴ ＩｇＧ２及び３がヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の細胞依存性殺傷を誘導する能力の低下を示す、抗体依存性細胞媒介細胞傷害アッセイ。ＣＤ２０以外の異なる抗原を標的とするＷＴ ＩｇＧ１が陰性対照として示される。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は全ての細胞が殺傷されたことを意味し、０％はシグナルが対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。 本明細書に記載の野生型ネコＩｇＧ－１、２及び３、並びにＤｅｆ ＩｇＧ１「Ｄｅｆ１～４」のアミノ酸配列を示す。変異は、下部ヒンジ（アミノ酸残基１１９～１２５）、プロリンサンドイッチ（２１１～２１７）、及び「ＳＨＥＤ」領域（１５１～１５６）にある。太字では、野生型ネコＩｇＧ－１（ｆＩｇＧ－１）と比較してＤｅｆ変異体内で変異している強調されたアミノ酸である。残基の番号付けは、ネコＩｇＧ－１野生型定常領域アミノ酸配列を示す配列番号３１を参照している。この配列を図１５Ｂに示す。図１５Ａを参照すると、ＩｇＧ－１、－２、－３の下部ヒンジは、それぞれ、配列番号８７、８８、８９である。ＩｇＧ－１、－２、－３のプロリンサンドイッチは、それぞれ、配列番号９０、９１、９２である。ＩｇＧ－１、－２、－３のＳＨＥＤ領域は、それぞれ、配列番号９３、９４、９５である。１－ｄｅｆ１、１－ｄｅｆ２、１－ｄｅｆ３、１－ｄｅｆ４の下部ヒンジは、それぞれ、配列番号９６、９７、９８、９９である。１－ｄｅｆ１、１－ｄｅｆ２、１－ｄｅｆ３、１－ｄｅｆ４のプロリンサンドイッチは、それぞれ、配列番号１００、１０１、１０２、１０３である。１－ｄｅｆ１、１－ｄｅｆ２、１－ｄｅｆ３、１－ｄｅｆ４のＳＨＥＤ領域は、それぞれ、配列番号１０４、１０５、１０６、１０７である。 本明細書に記載の野生型ネコＩｇＧ－１、２及び３、並びにＤｅｆ ＩｇＧ１「Ｄｅｆ１～４」のアミノ酸配列を示す。変異は、下部ヒンジ（アミノ酸残基１１９～１２５）、プロリンサンドイッチ（２１１～２１７）、及び「ＳＨＥＤ」領域（１５１～１５６）にある。太字では、野生型ネコＩｇＧ－１（ｆＩｇＧ－１）と比較してＤｅｆ変異体内で変異している強調されたアミノ酸である。残基の番号付けは、ネコＩｇＧ－１野生型定常領域アミノ酸配列を示す配列番号３１を参照している。この配列を図１５Ｂに示す。 ＷＴと比較したネコＤｅｆ１、２、３、及び４変異体のＡＤＣＣ活性を示す。エフェクター欠損変異体Ｄｅｆ３は、野生型（エフェクター有効）の対応物と比較して、ＡＤＣＣ機能を完全に消失する。異なる抗体濃度でヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の抗体依存性細胞媒介細胞傷害性を誘導するオファツムマブ可変領域の能力を有するＤｅｆ１、２、３、及び４変異体とのイヌＩｇＧ１ ＷＴの直接比較。結果は、Ｄｅｆ３バリアントに存在する変異によってネコＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性が完全に消失したことを示す。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は全ての細胞が殺傷されたことを意味し、０％はシグナルが対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。 ＷＴと比較したネコＤｅｆ１、２、３、及び４変異体のＡＤＣＣ活性を示す。エフェクター欠損変異体Ｄｅｆ３は、野生型（エフェクター有効）の対応物と比較して、ＡＤＣＣ機能を完全に消失する。異なる抗体濃度でヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の抗体依存性細胞媒介細胞傷害性を誘導するオファツムマブ可変領域の能力を有するＤｅｆ１、２、３、及び４変異体とのイヌＩｇＧ１ ＷＴの直接比較。結果は、Ｄｅｆ３バリアントに存在する変異によってネコＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性が完全に消失したことを示す。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は全ての細胞が殺傷されたことを意味し、０％はシグナルが対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。 ＷＴと比較したネコＤｅｆ１、２、３、及び４変異体のＡＤＣＣ活性を示す。エフェクター欠損変異体Ｄｅｆ３は、野生型（エフェクター有効）の対応物と比較して、ＡＤＣＣ機能を完全に消失する。異なる抗体濃度でヒトＣＤ２０を発現するイヌ細胞の抗体依存性細胞媒介細胞傷害性を誘導するオファツムマブ可変領域の能力を有するＤｅｆ１、２、３、及び４変異体とのイヌＩｇＧ１ ＷＴの直接比較。結果は、Ｄｅｆ３バリアントに存在する変異によってネコＩｇＧ１のＡＤＣＣ活性が完全に消失したことを示す。データは、殺傷パーセンテージとしてプロットされ、１００％は全ての細胞が殺傷されたことを意味し、０％はシグナルが対照細胞で得られたものと同一であった（抗体は添加されなかった）ことを意味する。 全てのネコＤｅｆ変異体の天然のＳＤＳ－Ｐａｇｅ画像を示しており、これはＷＴ（Ａ）との明確な差異を示していない。全てのｄｅｆ変異体は、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ（Ｂ）によって決定されるように、％及びモノマーピークの面積の有意な減少を示さず、これは、全体的なタンパク質安定性は、Ｄｅｆ変異体に導入された変異の影響を受けないことを意味する。 全てのネコＤｅｆ変異体の天然のＳＤＳ－Ｐａｇｅ画像を示しており、これはＷＴ（Ａ）との明確な差異を示していない。全てのｄｅｆ変異体は、ＨＰＬＣ－ＳＥＣ（Ｂ）によって決定されるように、％及びモノマーピークの面積の有意な減少を示さず、これは、全体的なタンパク質安定性は、Ｄｅｆ変異体に導入された変異の影響を受けないことを意味する。 オファツムマブＩｇＧ１ ＷＴ及びＤｅｆ変異体１～４の動態及び定常状態親和性分析の両方のＳＰＲ測定値は、プロテインＡ（Ａ）及びＦｃＲｎ（Ｂ）への結合親和性において統計的差異を示さなかった。オファツムマブＩｇＧ１ ＷＴ及びＤｅｆ変異体１～４のＳＰＲ測定値は、ＦｃγＲ１への結合親和性に有意差を示し、ｄｅｆ変異体１～３は、野生型ｆＩｇＧ２及び３（Ｃ）のものと同様の結合を示した。 オファツムマブＩｇＧ１ ＷＴ及びＤｅｆ変異体１～４の動態及び定常状態親和性分析の両方のＳＰＲ測定値は、プロテインＡ（Ａ）及びＦｃＲｎ（Ｂ）への結合親和性において統計的差異を示さなかった。オファツムマブＩｇＧ１ ＷＴ及びＤｅｆ変異体１～４のＳＰＲ測定値は、ＦｃγＲ１への結合親和性に有意差を示し、ｄｅｆ変異体１～３は、野生型ｆＩｇＧ２及び３（Ｃ）のものと同様の結合を示した。 Ａ）ネコＤｅｆ変異体のＤＬＳ測定値を示す。全てのＩｇＧ１変異体は、野生型ＩｇＧ１と同様の直径を示した。これは、導入された変異が、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの安定性及び凝集特性を変化させないことを示す。Ｂ）Ｄｅｆ変異体のＴｏｎｓｅｔ測定値を示す。全てのＩｇＧ１変異体は、野生型ＩｇＧ１と同様のＴｏｎｓｅｔを示した。これは、温度ストレスによって引き起こされる凝集傾向が、ＩｇＧ１ Ｆｃ ＷＴドメインと比較して、全ての欠損変異体において同様であることを示す。
次に、本発明を更に記載する。次の節では、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。そのように定義された各態様は、反対のことが明確に示されない限り、任意の他の態様又は態様と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、好ましい又は有利であると示される任意の他の１つ以上の特徴と組み合わせてもよい。
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、及びそれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。別途示されない限り、本開示の方法及び技術は、一般に、当技術分野で周知の従来方法に従って実行され、本明細書全体を通じて引用され及び考察される様々な一般的及びより具体的な参照文献に記載されるように実行される。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｚｈｉｑｉａｎｇ Ａｎ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｗｉｌｅｙ，（２００９）、及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．１ ａｎｄ ２，Ｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｅｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０）を参照されたい。
酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って、当技術分野で一般的に達成されるように、又は本明細書に記載されるように実行される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、並びに医薬的及び薬学的化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験室の手順及び技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、及び送達、並びに患者の治療に使用される。
本発明は、獣医学的使用のための生物学的治療薬、特にイヌの治療における使用のための抗体ベースの治療薬を提供する。
本発明で使用される「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖で構成される、任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子又はその抗原結合部分若しくは断片、あるいはＩｇ分子の必須のエピトープ結合特徴を保持する、その任意の機能的断片、変異体、バリアント、又は誘導体を指す。そのような変異体、バリアント、又は誘導体の抗体フォーマットは当該技術分野で既知である。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のみを包含する。
全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域又はドメイン（本明細書ではＨＣＶＲと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つの定常重鎖ドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域又はドメイン（本明細書ではＬＣＶＲと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。
各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結し、一方、２つのＨ鎖はＨ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結する。各Ｈ鎖及びＬ鎖はまた、規則的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、続いてα鎖及びγ鎖のそれぞれについての３つの定常ドメイン（ＣＨ）、並びにμアイソタイプ及びεアイソタイプについての４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いてその他端に定常ドメインを有する。ＶＬはＶＨとアラインメントされ、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインメントされる。特定のアミノ酸残基は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨ及びＶＬの対合は一緒に単一の抗原結合部位を形成する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称することもある。これらのドメインは、一般に、（同じクラスの他の抗体と比較して）抗体の最も可変な部分であり、抗原結合部位を含有する。「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが抗体間で配列が大きく異なることを指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全スパンにわたって均一に分布していない。代わりに、それは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方において超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントにおいて濃縮される。可変ドメインのうちのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、ベータシート構造を接続するループを形成し、場合によってはその一部を形成する、３つのＨＶＲによって接続された、ベータシート構造を主に採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖からのＨＶＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
重鎖及び軽鎖可変領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている領域とともに散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域に更に細分化することができる。各重鎖及び軽鎖可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
免疫グロブリン分子は、一般に、任意のアイソタイプ、クラス又はサブクラスのものであり得る。本発明の様々な態様によるＣＨ３ドメインは、イヌＩｇＧサブタイプのＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ、及びＩｇＧ－Ｄである。本発明の他の態様によれば、ＣＨ３ドメインは、ネコＩｇＧサブタイプのＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１（配列番号３１）、ＩｇＧ２（配列番号３２）及びＩｇＧ３（配列番号３３）である。
イヌでは、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称される４つのＩｇＧ重鎖が存在する。これらの重鎖は、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ、及びＩｇＧ－Ｄと称される、イヌＩｇＧの４つの異なるサブクラスを表す。これらの４つの重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９－２７０（２００１））によって最初に特定された。これらの重鎖についての例示的なアミノ酸及びＤＮＡ配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である（ＩｇＧＡ：受託番号ＡＡＬ３５３０１．１、ＩｇＧＢ：受託番号ＡＡＬ３５３０２．１、ＩｇＧＣ：受託番号ＡＡＬ３５３０３．１、ＩｇＧＤ：受託番号ＡＡＬ３５３０４．１）。本発明者によって並びに本発明の態様及び実施形態に従って使用されるイヌＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄのアミノ酸配列を、図１及び表１に示す（配列番号２２、２１、２３及び２４）。
イヌ抗体はまた、２つのタイプの軽鎖、カッパ及びラムダを含有する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号カッパ軽鎖アミノ酸配列ＡＢＹ５７２８９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＹ５５５６９．１）。
イヌでは、ＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ、及びＩｇＧ－Ｄと呼ばれる４つのＩｇＧ重鎖アイソフォームがある。これらの４つの重鎖のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．８０：２５９－２７０（２００１））によって最初に特定された。これらの重鎖についてのアミノ酸及びＤＮＡ配列はまたＧｅｎＢａｎｋデータベースからも入手可能である（ＩｇＧ－Ａ：受託番号ＡＡＬ３５３０１．１、ＩｇＧ－Ｂ：受託番号ＡＡＬ３５３０２．１、ＩｇＧ－Ｃ：受託番号ＡＡＬ３５３０３．１、ＩｇＧ－Ｄ：受託番号ＡＡＬ３５３０４．１）。本発明者によって並びに本発明の態様及び実施形態に従って使用されるイヌＩｇＧ－Ａ、ＩｇＧ－Ｂ、ＩｇＧ－Ｃ及びＩｇＧ－Ｄのアミノ酸配列を、図１及び表１に示す（配列番号２２、２１、２３及び２４）。
イヌ抗体はまた、２つのタイプの軽鎖、カッパ及びラムダを含有する（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号カッパ軽鎖アミノ酸配列ＡＢＹ５７２８９．１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢＹ５５５６９．１）。
ネコでは、ＩｇＧ１の２つのバリアントは、Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ（Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．７３：５３－６２（２００１））によって最初に同定され、ＩｇＧ１ａ及びＩｇＧ１ｂと称されている。第２のＩｇＧは、Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ（Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．１５８：２１４－－２２３ （２０１４））によって同定され、ＩｇＧ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＦ８１１１７５．１）と称されている。これらのアイソフォームは、転写されたＲＮＡ配列からＲＡＣＥによって同定された。優性発現アイソフォームはＩｇＧ１であり、これはネコＰＢＭＣにおいて９０％超の発現ＩｇＧを占める（Ｌｕ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：１２７１３（２０１７）。発明者らは、ネコＩｇＧＨ領域のゲノム遺伝子座をアノテーションすることによって、ＩｇＧ３と称される第３のネコＩｇＧを同定した。本発明者によって並びに本発明の態様及び実施形態に従って使用されるネコＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３のアミノ酸配列を図１３及び表１（配列番号３１、３２、及び３３）に示す。
したがって、本発明の態様はまた、配列番号３３を含む単離されたポリペプチド若しくはその一部分、配列番号３３を含む単離された組換え抗体若しくはその一部分、配列番号３３を使用した組換え抗体を産生するための方法、並びに組換え抗体を産生するための方法における配列番号３３の使用に関する。
ネコ抗体は、２種類の軽鎖、カッパ及びラムダも含有する。カッパ定常鎖配列は、１９９９年にＷｅｂｅｒらによって最初に同定された（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１９８２５７．１）。ネコのラムダ定常領域は明確に定義されておらず、これまでに２つのバリアント（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿００３９９４９１０．１及びＥ０７３３９．１）が記載されている。ネコのＰＢＭＣ ＲＮＡ試料からこれら２つの公開されたラムダ配列までのＣＤＲ領域外で検出されたｃＤＮＡ配列の高い可変性は、より多くのアロタイプがネコに存在し、未定義であることを示唆している（Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ ２０１４及びＬｕ ｅｔ ａｌ ２０１７）。
「ＣＤＲ」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々において、可変領域の各々について、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と示される３つのＣＤＲが存在する。「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することができる単一の可変領域に生じる３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、当技術分野で既知の異なるシステムに従って異なって定義され得る。
Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、ヒト抗体のために最も一般的に使用される番号付けシステムのうちの１つである（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２－３９１及びＫａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。「Ｋａｂａｔ番号付け」、「Ｋａｂａｔ定義」、及び「Ｋａｂａｔラベリング」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当該技術分野で認識されているこれらの用語は、抗体又は抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域における他のアミノ酸残基よりも可変（すなわち、超可変）であるアミノ酸残基の番号付けシステムを指す。
別段記載されない限り、ある特定の位置でのイヌ残基を参照する場合に本明細書で使用される番号付けは、配列番号１１に示されるＩｇＧ－Ｂ定常領域を参照するものである（図２も参照されたい）。したがって、本明細書における「位置」は、例えば、図１を参照して、タンパク質の配列中の場所を意味する。対応する位置は、概略として、一般に、他の野生型配列とのアラインメントによって決定される。本明細書で使用される場合、「残基」、例えば、アミノ酸残基とは、タンパク質における位置及びその関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、グルタミン酸は、配列番号１１を参照して、イヌＩｇＧ－Ｂの定常領域の１１９位の残基である。
抗体のタンパク質分解消化は、Ｆｖ（断片可変）、Ｆａｂ（断片抗原結合）、及びＦｃ（断片結晶化）と称される異なる断片を放出する。Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。Ｆｃ断片の定常ドメインは、抗体のエフェクター機能を媒介することに関与する。
本発明において特に興味深いのはＦｃ領域である。本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域、及び場合によってはヒンジの一部を含むポリペプチドを意味する。
ヒトにおいて、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合は、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）、並びにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むと定義され、番号付けはＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスに従う。イヌアイソフォームを図１に示し、これらはＦｃ領域を含む。Ｆｃを含むＩｇＧ－Ｂのイヌ定常領域は、配列番号１１及び図２Ｂに示される。
本明細書で使用される場合、Ｆｃは、本明細書に記載されるように、単独でのこの領域、又はＦｃ融合（「融合組成物」若しくは「融合構築物」）との関連でのこの領域を指し得る。Ｆｃドメインは、Ｆｃ領域の全部又は一部を含み、すなわち、Ｎ又はＣ末端配列は、機能に影響を与えない限り、本明細書に記載の野生型又はバリアントＦｃドメインから除去され得る。
簡潔に述べると、ＩｇＧ機能は、一般に、ＩｇのＦｃ領域と、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）又は別の結合分子との間の相互作用を介して、時にはエフェクター細胞上で達成される。これは、抗体がそれらの可変（Ｖ）領域を通して結合される標的細胞を殺傷するようにエフェクター細胞を誘発することができる。また、可溶性抗原に対する抗体は、免疫複合体の取り込み（オプソニン化）又はエフェクター細胞の誘発及びサイトカインの放出をもたらす、ＦｃγＲを標的とする免疫複合体を形成し得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、又は「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域を結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。
ヒトでは、ＦｃγＲの３つのクラスが特徴付けられているが、複数の受容体形態の発生によって状況は更に複雑になっている。３つのクラスは次の通りである:
（ｉ）アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高い親和性でモノマーＩｇＧを結合し、マクロファージ、単球、並びに場合によっては好中球及び好酸球上で発現される；
（ｉｉ）ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧを中～低親和性で結合し、広く発現される。これらの受容体は、２つの重要なタイプ、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂに分類することができる。受容体の「ａ」形態は、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上に見られ、殺傷プロセスを活性化させることができるようであり、２つの代替対立遺伝子として生じる。「ｂ」形態は、阻害プロセスに役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球上に見られる。Ｂ細胞上では、ｂ形態は、更なる免疫グロブリン産生、及び、例えば、ＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを抑制するように機能するようである。マクロファージ上では、ｂ形態は、ＦｃγＲＩＩａを介して媒介されるような食作用を阻害するように作用する。好酸球及び肥満細胞上では、ｂ形態は、ＩｇＥがその別個の受容体に結合することにより、これらの細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。
（ｉｉｉ）ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中～低親和性でＩｇＧを結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩａは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上に見られ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩｂは、好中球上で高度に発現される。両方のタイプは、異なる同種の形態を有する。
イヌＦｃ受容体は、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ Ｌ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５７（２０１４）３１－４１に記載されている。イヌはＲＩ、ＲＩＩｂ、ＲＩＩＩを持っているが、Ｒｉｉａは持っていない。
イヌＦｃ受容体は、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ Ｌ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５７（２０１４）３１－４１に記載されている。イヌはＲＩ、ＲＩＩｂ、ＲＩＩＩを持っているが、Ｒｉｉａは持っていない。
ネコＦｃ受容体は、Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ７３（２０００）５３－６２、Ｓｔｒｉｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ；Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １５８（２０１４）２１４－２２３、及びＬｕ ｅｔ ａｌ；ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７（２０１７）１２７１３に記載されている。
ＦｃγＲへの結合だけでなく、ＩｇＧ抗体は補体を活性化させることができ、これはまた、細胞溶解、オプソニン化、又はサイトカイン放出及び炎症をもたらすことができる。Ｆｃ領域はまた、ＩｇＧの新生児への輸送（いわゆる「ＦｃＲｎ」を介して）、増加した半減期（ＦｃＲｎ型受容体を介してもたらされるとも考えられる）、及び自己凝集などの特性を媒介する。Ｆｃ領域はまた、プロテインＡ及びプロテインＧとの相互作用を担っている（この相互作用はＦｃＲｎの結合に類似しているように見える）。
本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
抗原結合又は他の断片も、本発明の態様及び実施形態に従って企図される。抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、例えば、ＶＨ単一ドメイン抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びビスｓｃＦｖ、並びにポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが挙げられる。本発明による断片は、Ｆｃドメイン若しくはその一部、又は定常領域を含み得る。したがって、本明細書に記載の改変Ｆｃポリペプチドを含む定常領域も本発明の範囲内である。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小限の抗体断片である。この断片は、密接な非共有性会合における、１つの重鎖可変領域ドメイン及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各々３つのループ）が発生する。しかしながら、単一可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性にあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略され、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。
「抗原結合部位」という用語は、抗原に特異的に結合する領域を含む抗体又は抗体断片の部分を指す。抗原結合部位は、１つ以上の抗体可変ドメインによって提供され得る。好ましくは、抗原結合部位は抗体又は抗体断片の関連するＶＨ及びＶＬ内に含まれる。
「キメラ抗体」は、１つの種に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含有する組換えタンパク質であり、一方、抗体分子の定常ドメインは、別の種、例えば、イヌ抗体の定常ドメインに由来する。例示的なキメラ抗体は、キメラヒト－イヌ抗体である。
「ヒト化抗体」は、１つの種に由来する抗体、例えば、げっ歯類抗体由来のＣＤＲが、げっ歯類抗体の重鎖可変鎖及び軽鎖可変鎖からヒト重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）に移される組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。ある特定の実施形態では、親（げっ歯類）抗体からの限られた数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、ヒト抗体フレームワーク領域配列内に置換され得る。
本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」又は「ネコ化抗体」という用語は、それぞれ、イヌ及び非イヌ（例えば、マウス）抗体の両方から、又はネコ及び非ネコ（例えば、マウス）抗体の両方からの配列を含有する組換え抗体の形態を指す。一般に、イヌ化抗体は、少なくとも１つ以上、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、超可変ループの全て又は実質的に全てが非イヌ（又は非ネコ）免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク（ＦＲ）領域の全て又は実質的に全て（及び典型的には、残りのフレームの全て又は実質的に全て）がイヌ（又はネコ）免疫グロブリン配列のものである。イヌ化又はネコ化抗体は、マウス又はヒト抗体からの３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲの両方を、イヌ若しくはネコフレーム又は改変されたイヌ若しくはネコフレームと一緒に含み得る。改変されたイヌ又はネコフレームは、例えば、その標的への結合を増加させるために、イヌ化又はネコ化抗体の有効性を更に最適化し得る１つ以上のアミノ酸変化を含む。
「生物種化」抗体（例えば、ヒト化、イヌ化、ネコ化、キメラ）は、それを標的種の抗体に類似させるように操作されたものである。一実施形態では、「生物種化」抗体は、標的種の抗体と約８０％、８５％又は９０％よりも類似している。そのような生物種化抗体は、本発明の範囲内である。
好ましい実施形態では、抗体又は抗体断片は、完全イヌである。
生物種化抗体とは対照的に、本発明の完全イヌ抗体又はネコ抗体は、イヌ可変領域又はネコ可変領域を有し、別の種からの完全又は部分的なＣＤＲ又はＦＲを含まない。有利には、本明細書に記載の完全イヌ又はネコ抗体は、イヌ又はネコ免疫グロブリン配列を含むトランスジェニックマウスから得られている。これらの免疫化されたマウスにおいて産生された抗体は、インビボＶ（Ｄ）Ｊ組換え、インビボ接合多様化、重鎖及び軽鎖のインビボ対合、並びにインビボ超変異を含む天然親和性成熟を可能にするために、インビボＢ細胞シグナル伝達及び発達を通じて開発される。このようにして産生された完全イヌ又はネコ抗体は、開発可能性のための最適な特性を有する抗体を生成し、大規模な産生前の長時間のリード最適化を最小限に抑える。有利には、そのような完全イヌ又はネコ抗体は、患者動物に導入された場合に免疫原性の最も低い可能性のリスクを提示し、これにより、反復投薬レジメンが容易になる。有害なインビボ免疫原性は、例えば、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生を同定するためのアッセイ、又はインビボでの経時的な有効性の喪失によって評価され得る。エクスビボでのｍＡｂ操作は、開発ライアビリティ、免疫原性、及び低減された親和性（上記で概説したように）を導入するリスクを冒すことを考慮すると、したがって、本発明の完全イヌ又はネコ抗体は臨床的文脈において有効な治療薬である可能性が最も高い。
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、単一のＢ細胞又は形質細胞に由来する抗体を指す。モノクローナル抗体調製物中の全ての抗体分子は、少量で存在し得る、可能な天然に存在する翻訳後改変（例えば、異性化、アミド化、炭水化物添加）を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向している。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向した異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向している。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン、抗体又は抗体断片が特異的に結合する抗原の表面上の部位を指す。一般に、抗原は、いくつか又は多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語は、具体的には、直鎖状エピトープ及び立体配座エピトープを含む。タンパク質抗原内のエピトープは、タンパク質の三次的折り畳み（通常は、立体配座エピトープ）によって並置された隣接アミノ酸（通常は、直鎖状エピトープ）又は非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、常にではないが、変性溶媒への曝露時に保持されるのに対して、三次的折り畳みによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理時に喪失される。エピトープは、典型的には、特有の空間立体配座内に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸を含む。所与の抗体又は抗体断片によって結合されるエピトープを決定するための方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当技術分野で周知であり、例えば、免疫ブロット及び免疫沈降アッセイを含み、重複又は隣接ペプチドは、所与の抗体又は抗体断片との反応性について試験される。抗体は、２つの抗体が同一又は立体的に重複するエピトープを認識するとき、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一又は立体的に重複するエピトープに結合するかどうかを決定するための最も広く使用され、かつ迅速な方法は、競合アッセイであり、これは標識された抗原又は標識された抗体のいずれかを使用して、異なるフォーマットで構成され得る。
「単離された」タンパク質又はポリペプチドという用語は、異なる抗原特異性を有する、他のタンパク質又はポリペプチドを実質的に含まないタンパク質又はポリペプチドを指す。更に、タンパク質又はポリペプチドは、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含み得ない。したがって、本明細書に記載のタンパク質、核酸、及びポリペプチドは、好ましくは単離されている。したがって、本明細書で使用される場合、「単離された」タンパク質又はポリペプチドは、その天然の細胞培養環境の構成要素から同定され、分離され、かつ／又は回収されたタンパク質又はポリペプチドを意味する。その天然の環境の混入構成要素は、タンパク質又はポリペプチドのための診断的又は治療的使用を妨げるであろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を挙げることができる。
本明細書における「アミノ酸」とは、特定の定義された位置に存在し得る２０個の天然に存在するアミノ酸又は任意の非天然類似体のうちの１つを意味する。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を包含する。ただし、ほとんどの場合、タンパク質が組換え的に産生される場合、天然に存在するアミノ酸のみが使用される。
本発明は、バリアントＦｃ領域を含むタンパク質を提供する。本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合、又は合成ペプチド模倣構造、例えば、ペプトイドなどの類似体から構成され得る。繰り返すが、タンパク質が組換え的に産生される場合、天然に存在するアミノ酸のみが使用される。
本明細書で「バリアント」又は「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸改変により野生型配列のそれとは異なるポリペプチド配列を意味する。本明細書で使用される場合、本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列における別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基の置換」は、別のアミノ酸残基による「アミノ酸残基を置き換えること」と等価であり、元の（例えば、野生型／生殖系列）アミノ酸配列における特定の位置での特定のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基によって置き換えられている（又は置換されている）ことを示す。これは、当業者に利用可能な標準的な技術、例えば、組換えＤＮＡ技術を使用して行うことができる。アミノ酸は、野生型（ｗｔ）における自然界に見出されるような天然の（野生型／生殖系列）配列と比較して変化するが、天然の配列と比較して他の変化を含有するＩｇＧ分子において作製され得る。
アミノ酸改変は、一般に、置換、挿入、及び欠失を含み、多くの場合、前者が好ましい。本発明のバリアントはＦｃドメイン内のアミノ酸置換を含み、本明細書に記載されるように、タンパク質の機能が依然として存在する限り、それらは任意の数の更なる改変を含むことができる。しかしながら、一般に、最小数の改変で機能を変更することが目標である場合が多いため、Ｆｃ改変に加えて、１から２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の改変が一般的に利用される。いくつかの場合において、１～５個の改変が存在し、１～２個、１～３個及び１～４個の改変もまた、多くの実施形態では使用される。アミノ酸改変の数は、機能ドメイン内にあり得ることに留意されたい：例えば、野生型タンパク質又は操作タンパク質のＦｃ領域に１～６個の改変、並びにＦｖ領域に１～５個の改変を有することが望ましい場合もある。バリアントポリペプチド配列は、好ましくは、野生型配列又は親配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、又は最大９８％若しくは９９％の同一性を有する。配列のサイズに応じて、同一性パーセントはアミノ酸の数に依存することに留意すべきである。
本明細書における「タンパク質バリアント」又は「バリアントタンパク質」とは、少なくとも１つのアミノ酸改変により野生型タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するか、又は野生型（ＷＴ）ポリペプチドであってもよく、又はＷＴポリペプチドの改変されたバージョンであってもよい。バリアントポリペプチドとは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸改変、例えば、親と比較して約１～約１０個のアミノ酸改変、好ましくは約１～約５個のアミノ酸改変を有する。本明細書のバリアントポリペプチド配列は、好ましくは、親ポリペプチド配列と少なくとも約８０％の同一性、及び最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性を有する。
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、又は「前駆体タンパク質」とは、バリアントを生成するようにその後に改変される非改変ポリペプチドを意味する。当該親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、又は天然に存在するポリペプチドのバリアント若しくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドとは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、又はそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。
したがって、本明細書で使用される場合、「親Ｆｃポリペプチド」とは、バリアントを生成するように改変されるＦｃポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」とは、バリアント抗体を生成するように改変される抗体を意味する。別途指定されない限り、親ポリペプチドは、例えば、定常領域アミノ酸配列の配列番号１１に示されるような、野生型ＩｇＧ－Ｂ Ｆｃドメインを含む。
本明細書における「野生型」又は「ＷＴ」、「ｗｔ」又は「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリンＩｇＧなどは、意図的に改変されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。イヌ野生型ＩｇＧを図１に示す。ＩｇＧ－Ｂのイヌ野生型定常領域を図２Ｂに示す。ネコ野生型ＩｇＧを図１３Ａに示す。ＩｇＧ１のネコ野生型定常領域を図１５Ｂに示す。
本明細書で「バリアント又は変異体Ｆｃ領域」とは、少なくとも１つのアミノ酸改変により野生型Ｆｃ配列のそれとは異なるＦｃ配列を意味する。好適な置換は本明細書に記載されている。Ｆｃバリアントは、Ｆｃ領域のみを包含し得るか、又はＦｃによって実質的にコードされる抗体、抗体断片、Ｆｃ融合物、単離されたＦｃ、Ｆｃ断片、又は他のポリペプチドとの関連で存在し得る。Ｆｃバリアントとは、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃバリアントポリペプチドを含む組成物、又はアミノ酸配列を指し得る。野生型と比較した下部ヒンジ、プロリン領域及びＳＨＥＤ領域における改変を伴う本発明によるイヌバリアント配列を図２Ａに示す。残基の番号付けは、イヌＩｇＧ－Ｂ野生型定常領域アミノ酸配列を示す配列番号１１を参照している。ネコＦｃについて、番号付けは、ＩｇＧ１（配列番号３３）を参照している。
Ｆｃバリアントは、野生型Ｆｃポリペプチドと比較して１つ以上のアミノ酸改変を含み、アミノ酸改変（複数可）は、１つ以上の最適化された特性を付与する。アミノ酸改変は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失であり得、複数の改変は、これらから独立して選択される。本明細書における「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸の別のアミノ酸との置換を意味する。例えば、置換Ｅ１１９Ｇとは、ＩｇＧ－Ｂにおける１１９位のグルタミン酸がグリシンで置き換えられるバリアントポリペプチドを指す。番号付けは、配列番号１１を参照している。本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」又は「欠失」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。
本明細書に開示されるＦｃバリアントは、親と比較して複数のアミノ酸改変、例えば、親と比較して約１～５０個のアミノ酸改変、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸改変、約１～約５個のアミノ酸改変などを有し得る。本明細書のバリアントＦｃバリアント配列は、親Ｆｃバリアント配列と約８０％の同一性、例えば、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性などを有する。本明細書に開示される改変には、以下に記載されるグリコフォーム改変及び他の翻訳後改変も含まれる。改変は、分子生物学を使用して遺伝的に行われ得るか、又は酵素的若しくは化学的に行われ得る。
ｂｓＡｂを作製するための多くのプラットフォームの中で、制御されたＦａｂ－アーム交換（ｃＦＡＥ）は、天然Ａｂ構造への最小限の変化及びｂｓＡｂが２つの親Ａｂから形成され得る単純さに基づいて有用であることが証明されている（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ，（２０１３）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆａｂ－ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１０，５１４５－５１５０）。制御されたＦａｂ－アーム交換は、最小限の変異セットを使用し、正しい重鎖－軽鎖相互作用を妨害することなく半Ａｂの交換を実行することができるため、軽鎖対合の問題を回避する。したがって、ｃＦＡＥはまた、本明細書に記載される変異に加えて、本発明で使用することもできる。
したがって、一態様では、本発明は、天然野生型配列と比較してＦｃドメインにおける１つ以上の改変を有する、単離されたＦｃバリアント、例えば、イヌ、ウマ又はネコバリアントであって、改変が、下部ヒンジ、プロリン領域及び／又はＳＨＥＤ領域におけるアミノ酸置換であり、配列番号１１を参照して、下部ヒンジが残基１１９～１２５を含み、プロリン領域が残基２１１～２１７を含み、ＳＨＥＤ領域が残基１５１～１５６を含む、バリアントに関する。
変異領域及びそれらの配列識別子を図２及び１５に示す。
以下は、イヌＩｇＧ－Ｂ野生型定常領域アミノ酸配列を示す、配列番号１１に示される野生型イヌＩｇＧ－Ｂ Ｆｃを参照して、本発明の態様を提供する。
一態様では、本発明は、改変Ｆｃ領域を含む、単離されたイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／若しくは配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択されるアミノ酸置換、並びに／あるいは
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへの改変、配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換から選択されるアミノ酸置換、並びに／あるいは
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換から選択されるアミノ酸置換を含むか、又はそれからなる、単離されたイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
例えば、ａ）について、アミノ酸置換は、配列番号１１の１２０位におけるＳ又はＡへの、及び配列番号１１の１２１位におけるＡへのものである。
例えば、ｃ）の場合、アミノ酸置換は、配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換であり、その結果、３個の置換が存在する。一実施形態では、更に、配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換及び／又は配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換が存在する。ｃ）の一実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１１の２１３位におけるＧへのものである。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、２つの置換、すなわち、配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換のみを有するＦｃ領域ではなく、当該Ｆｃ領域は、イヌＣＤ２０を結合するイヌ抗体のＦｃ領域である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＤ２０を結合するＦｃ領域ではない。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、２つの置換、すなわち、配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換のみを有するＦｃ領域ではない。
ＣＤ２０という用語はＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指す。抗体及びその抗原結合部分は、配列番号２６（ヌクレオチド配列）及び配列番号２７（アミノ酸配列）において定義される野生型イヌＣＤ２０に特異的に結合する。別途明記されない限り、本明細書で使用されるＣＤ２０という用語はイヌＣＤ２０を指す。Ｂリンパ球抗原ＣＤ２０又はＣＤ２０は全てのＢ細胞の表面上で発現され、プロＢ期（ＣＤ４５Ｒ＋、ＣＤ１１７＋）で始まり、成熟まで濃度が漸進的に上昇する。ヒト及びイヌではＣＤ２０はＭＳ４Ａ１遺伝子によってコードされる。
したがって、イヌＩｇＧ－Ｂ定常領域（配列番号１１）内の野生型残基を参照して、以下の位置における以下のアミノ酸置換は本発明の範囲内である：
Ｅ１１９Ｇ、
Ｍ１２０Ｓ又はＡ、
Ｌ１２１Ａ、
Ｄ１５３Ｇ、
Ｐ１５４Ｒ、
Ｄ１５６Ｎ、
Ｎ２１１Ｈ、
Ｋ２１２Ｉ、
Ａ２１３Ｇ、
Ｐ２１５Ｇ、及び／又は
Ｐ２１７Ｓ。
したがって、（配列番号１１を参照して）野生型ＩｇＧ－Ｂ定常領域配列における１１９位のＥは、Ｇなどで置換される。上に列挙されたこれらの置換の様々な組み合わせは、本発明の範囲内である。したがって、変異体は、上に列挙されたような１～１１個の置換、例えば、１、２、３、４、５、又は６つの置換を有し得る。
したがって、一態様では、本発明は、改変Ｆｃ領域を含む、単離されたイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／若しくは配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択されるアミノ酸置換、並びに／あるいは
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換を含み、かつ／あるいは
ｃ）アミノ酸置換が、以下の改変：
ｃ１）配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換と組み合わせた、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、
ｃ２）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、
ｃ３）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、又は
ｃ４）ｃ１）～ｃ３）の組み合わせのうちの１つから選択される、単離されたイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、改変Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は、以下のａ）に記載されるアミノ酸置換、並びに、任意選択的に、以下のｂ）及び／又は以下のｃ）に記載されるアミノ酸置換を含み、
ａ）アミノ酸置換が、配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択され、
ｂ）アミノ酸置換が、配列番号１１の１５３位におけるＧへの改変、配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換から選択され、かつ／あるいは
ｃ）アミノ酸置換が、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換から選択される。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、
配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換を含み、Ｆｃ領域は、２つの置換、すなわち、配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換のみを有するＦｃ領域ではなく、当該Ｆｃ領域は、イヌＣＤ２０を結合するイヌ抗体のＦｃ領域である。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへのアミノ酸置換、及び
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はＦｃ領域は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、上記に示される改変を含むが、任意の更なる改変、例えば、下部ヒンジ、ｓｈｅｄ領域、又はプロリンサンドイッチ内の他の位置における任意の他のアミノ酸置換若しくは置換を有しない。
一実施形態では、ポリペプチド又はＦｃドメインは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなり、その配列は、野生型配列ではない。
したがって、本発明はまた、図２Ａに示され、本明細書で提供される配列、例えば、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０に示される改変を有するイヌＩｇＧ－Ｂ－ｄｅｆバリアント１、２、３、４、５、６、７、８、又は９として本明細書で定義されるＦｃバリアントに関する。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれらからなり、その配列は、配列番号１１に示される野生型配列ではない。一実施形態では、定義されるイヌＦｃバリアントは、イヌＩｇＧ－Ｂ－ｄｅｆ変異体２、３又は７である。ＩｇＧ－Ｂ－ｄｅｆ変異体２、３又は７は、特に、図５に示されるＡＤＣＣ活性について、エフェクター機能を完全に不活性化させる。
一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなり、その配列は、配列番号１又は１１に示される野生型配列ではない。
上記の実施形態は、改変されたイヌＦｃドメインに関する。本発明の範囲内には、ネコ及びウマの改変Ｆｃドメインも含まれる。当業者は、イヌ、ネコ及びウマのＦｃドメインのアラインメントに基づいて、ネコ及びウマのＦｃドメインにおける改変用等価位置を決定することができるであろう。
したがって、本発明はまた、改変ネコＦｃ領域に関する。これらは、下部ヒンジ及び／又はプロリンサンドイッチ領域に改変を有する。以下は、ネコＩｇＧ１野生型定常領域アミノ酸配列を示す、配列番号３１に示される野生型ネコＩｇＧ１ Ｆｃを参照して、本発明の態様を提供する。下部ヒンジ領域は、残基１１９～１２５にあり、プロリンサンドイッチは、残基２１１～２１７にあり、ＳＨＥＤ領域は、残基１５１～１５６にある。
したがってネコＩｇＧ１定常領域（配列番号３１）内の野生型残基を参照して、以下の位置における以下のアミノ酸置換は、本発明の範囲内である：
Ｍ１２０Ａ、
Ｍ１２０Ｉ、
Ｉ１２１Ａ、
Ｉ１２１Ｐ、
Ｇ１２３Ａ、
Ｐ２１５Ｇ、
Ｐ２１７Ｓ、及び／又は
Ｐ２１７Ａ。
有利には、Ｐ２１７Ａの置換は、本明細書に示すように、下部ヒンジの他の置換と組み合わせることができる。
したがって、別の態様では、本発明は、改変Ｆｃ領域を含む、ネコｇＩＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、当該Ｆｃ領域が、
ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、並びに／あるいは
ｂ）以下の改変：配列番号３１の２１７位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域に関する。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、改変Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は、
ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換を含み、配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換のいずれかを更に含むか、又は
ｂ）配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換を含み、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のいずれかを更に含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、改変Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換、及び任意選択的に、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、低減されたＦｃ媒介性エフェクター機能を有する。
一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号、３８、３９、４０若しくは４１、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、又はそれからなり、その配列は、例えば、配列番号３１に示されるような野生型配列ではない。
一実施形態では、定義されるネコＦｃバリアントは、ネコＩｇＧ１－ｄｅｆ変異体２又は３である。ＩｇＧ－１ｄｅｆ変異体２及び３は、エフェクター機能を完全に不活性化させる。
一実施形態では、Ｆｃ領域は、上記に示される改変を含むが、任意の更なる改変、例えば、下部ヒンジ、ｓｈｅｄ領域、又はプロリンサンドイッチ内の他の位置における任意の他のアミノ酸置換若しくは置換を有しない。
実施形態は、それぞれ改変Ｆｃドメインを含む単離されたポリペプチド、例えば、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はネコＩｇＧ１ポリペプチド、及び上記に記載される１つ以上の改変を含む単離されたＦｃドメインに関する。したがって、当業者は、本明細書に記載される改変されたＦｃドメインが、それぞれ任意の抗体、例えば、イヌ抗体又はネコ抗体において使用され得ることを理解するであろう。したがって、Ｆｃドメインは、特異的な抗原結合を提供する可変ドメインに連結され得る。好適な例を、実施例の章に示す。
一実施形態では、ポリペプチド又はＦｃドメインは、１つ以上の追加の改変を有し得る。一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又はＦｃドメインは、本明細書に特定されたもの以外、Ｆｃドメイン内に任意の追加の改変、例えば、アミノ酸置換を有していない。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、野生型ＩｇＧ－Ｂ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、低減されたＦｃ媒介性エフェクター機能を有する。一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、野生型ＩｇＧ－１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、低減されたＦｃ媒介性エフェクター機能を有する。
本明細書で使用される場合、低減は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上であり得る。
一実施形態では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）である。
本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」は、ＦｃｖＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃＹＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃＹＲＩＩ Ｉａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。
本明細書で使用される場合、「ＡＤＣＰ」又は抗体依存性細胞媒介性細胞食作用は、ＦｃｖＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。
一実施形態では、ＡＤＣＣ活性の低減がある。一実施形態では、ＡＤＣＣ活性の消失がある。
一実施形態では、Ｆｃ変異体は、完全にＣＤＣ及びＡＤＣＣ欠損である。
有利には、図７、８、１８及び１９に示されるように、本明細書に記載のＦｃバリアントは、良好な生物物理学的特性を保持する。
Ｆｃバリアントの活性を測定するための様々なアッセイを実施例に示す。
一実施形態では、エフェクター機能は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。「ＣＤＣ」という用語は、本明細書で使用される場合、補体依存性細胞傷害、すなわち、補体系によって媒介される標的細胞破壊の生化学的事象を指す。
図７及び１８は、プロテインＡ結合を示す。イヌＩｇＧ－Ｂにおける改変は、プロテインＡ及びＦｃＲｎ結合を変化させない。ネコＩｇＧ１における改変は、プロテインＡ及びＦｃＲｎ結合を変化させない。
一実施形態では、野生型ＩｇＧ－Ｂ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するより低い親和性を有する。親和性は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、又はそれ以上低減され得る。
一実施形態では、ＦｃγＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される。
一実施形態では、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合を保持するが、エフェクター機能を低減又は消失する。一実施形態では、ネコＩｇＧ１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合を保持するが、エフェクター機能を減少又は消失する。
ポリペプチドは、完全長抗体又は抗体断片の一部であり得る。一実施形態では、抗体は多重特異性抗体又はその断片である。多重特異性タンパク質、例えば、多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる標的に結合する、すなわち、少なくとも二重特異性である。したがって、一実施形態では、抗体は、二重特異性抗体又はその断片である。他の実施形態では、多重特異性抗体又はその断片は、３つ、４つ以上の標的に結合する。
２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むＩｇＧフォーマットに基づく本発明の二重特異性抗体は、当該技術分野で既知の様々な方法によって産生され得る。例えば、二重特異性抗体は、２つの抗体分泌細胞株を融合させて新しい細胞株を作製することによって、又は組換えＤＮＡ技術を使用して単一の細胞内で２つの抗体を発現させることによって産生され得る。これらのアプローチは、各抗体からのそれぞれの重鎖が、同じ特異性を有する２つの同一の対合した重鎖を含有する単一特異性二量体（ホモ二量体とも呼ばれる）、及び異なる特異性を有する２つの異なる対合した重鎖を含有する二重特異性二量体（ヘテロ二量体とも呼ばれる）を形成し得るため複数の抗体種をもたらす。更に、各抗体からの軽鎖及び重鎖はランダムに対合して不適切で非機能的な組み合わせを形成する場合がある。この問題は、重鎖及び軽鎖の誤対合として知られており、二重特異性としての発現のための共通の軽鎖を共有する抗体を選択することによって解決することができる。軽鎖重鎖の誤対合問題に対処する方法は、単一の軽鎖を使用して二重特異性抗体を生成することを含む。これには、多様性を制限する単一の軽鎖を利用する重鎖操作又は新規の抗体ライブラリが必要である。加えて、共通の軽鎖を有する抗体が、単一の軽鎖を有するトランスジェニックマウスから同定されている。別のアプローチは、１つの重鎖のＣＨ１ドメインを、その同族の軽鎖のＣＬドメインと交換することである（Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術）。ｓｃＦｖ形式もカバーされている。
一実施形態では、特にがんの治療のために、タンパク質はＣＤ３を標的としてもよく、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）のフォーマットで提供される。
一実施形態では、タンパク質は、多重パラトピック（ｍｕｌｔｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）である、すなわち、同じ標的上の２つ以上のエピトープに結合する。
二重特異性抗体は２つ以下のエピトープに対する特異性を有する。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とによって特徴付けられる。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（又は多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは重複する。実施形態では、第１及び第２のエピトープは重複しない。一実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。別の実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列、並びに第２のエピトープに対して結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列を含む。更なる実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する抗体と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する抗体とを含む。一実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対して結合特異性を有する抗体又はその断片と、第２のエピトープに対して結合特異性を有する半分の抗体又はその断片とを含む。一実施形態では、二重特異性抗体又はその断片は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するＦａｂと、第２のエピトープに対する結合特異性を有するＦａｂとを含む。
ｓｃＦｖフォーマットも本発明の範囲内である。
別の実施形態では、ポリペプチド、Ｆｃポリペプチド若しくは抗体、又はその断片は、更なる構成部分を含む。
例えば、タンパク質はＦｃ受容体融合タンパク質である。本明細書における「Ｆｃ融合タンパク質」又は「イムノアドヘシン」とは、一般に（任意選択的に、本明細書に記載のリンカー部分を介して）異なるタンパク質、例えば本明細書に記載の標的タンパク質への結合部分に連結したＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。
例えば、本明細書に記載のＦｃポリペプチドは、標的分子に特異的に結合することができる結合ドメインと組み合わされ得る。したがって、本発明の態様において、本発明は、本明細書に記載されるＦｃ領域を含む融合タンパク質に関する。融合タンパク質において、１つ以上のポリペプチドが本発明のＦｃ領域に作動可能に連結されている。例えば、ＦｃドメインはＦａｂ結合ドメインに連結されていてもよい。結合ドメインは、例えば、共有結合又は他の結合（例えば、疎水性相互作用、イオン性相互作用、又は硫化物橋を介して連結される）において、２つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。
本明細書に記載の改変はまた、任意の他のＦｃ改変と、例えば、改変エフェクター機能と組み合わせることができる。
一般に、本発明のＦｃ領域に作動可能に連結された１つ以上のポリペプチドは、任意のタンパク質又は小分子、例えば、別の分子に対して特異性を有し、当該分子を結合することができる任意の分子に由来する結合ドメインであり得る。結合ドメインは、好ましくは別のポリペプチドであるが、任意の標的（例えば、炭水化物、脂質（リン脂質など）又は核酸）であり得る標的分子と相互作用する能力を有する。好ましくは、相互作用は特異的であろう。典型的には、標的は、細胞上に存在する抗原、又は可溶性リガンドを有する受容体である。これは、治療標的であるとして選択されてもよく、それによって、上記の特性を有する分子とそれを結合することが望ましい。標的は、標的細胞、例えば、溶解することが望ましい標的細胞、又はアポトーシスを誘導することが望ましい標的細胞上又は標的細胞内に存在し得る。したがって、タンパク質融合パートナーは、任意の抗体の可変領域、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、抗原、ケモカイン、又は任意の他のタンパク質若しくはタンパク質ドメインを含み得るが、これらに限定されない。低分子融合パートナーは、Ｆｃ融合を治療標的に誘導する任意の治療剤を含んでもよい。かかる標的は、疾患に関与する任意の分子、好ましくは細胞外受容体であり得る。
別の実施形態では、本発明の抗体は更なる構成部分を含む。例えば、構成部分は半減期延長部分であり、例えば、イヌ血清アルブミン若しくはイヌ化血清アルブミン又はそのバリアント、あるいはネコ血清アルブミン若しくはネコ化血清アルブミン又はそのバリアントである。抗体はまた、例えば、化学修飾、特にＰＥＧ化、又はリポソームへの組み込みによって半減期を増加させるように改変され得る。
半減期は、半減期延長を伴わない対応する抗体の半減期よりも少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍、又は２０倍超延長されてもよい。例えば、延長された半減期は、半減期延長部分を伴わない対応する抗体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又は更に２４時間、４８時間若しくは７２時間超であり得る。
別の実施形態では、この構成部分は、薬物、酵素、又は毒素などの治療要素である。一実施形態では、治療要素は、毒素、例えば、細胞傷害性放射性核種、化学毒素又はタンパク質毒素である。したがって、本発明は、免疫複合体、例えば、第２の分子、通常は毒素、放射性同位体又は標識にコンジュゲート（接合）された抗体も包含する。これらのコンジュゲートは、しばしば抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として知られている場合、免疫療法において使用され、標的化された形態の化学療法としてモノクローナル抗体療法を開発することに使用される。
毒性ペイロードは、小分子（例えば、メイタンシノイド、アウリスタチン）、タンパク質毒素（例えば、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素）、標的細胞を殺傷するための細胞溶解性免疫調節タンパク質（例えば、Ｆａｓリガンド）、天然ペプチドの薬理学的半減期を延長するための生物学的に活性なペプチド（例えば、ＧＬＰ－１）、標的微小環境の生化学を改変するための酵素（例えば、ウレアーゼ）、又は腫瘍細胞の殺傷又は撮像のための放射性核種（例えば、９０Ｙ、１１１Ｉｎ）から選択され得る。
別の実施形態では、抗体は、検出可能又は機能的標識で標識される。標識は、フルオロフォア、蛍光体、放射性標識、酵素、化学発光体、核磁気共鳴活性標識、又は光増感剤を含むが、これらに限定されない、シグナルを産生するか、又はシグナルを産生するように誘導することができる任意の分子であり得る。したがって、結合は、蛍光又は発光、放射能、酵素活性、又は光吸光度を検出することによって検出及び／又は測定され得る。
この構成部分は、例えば、化学リンカー又はペプチドリンカーを介して、当該技術分野で既知のリンカーを使用して、ポリペプチド、例えば、抗体に連結することができる。結合は共有結合性であっても非共有結合性であってもよい。例示的な共有結合は、ペプチド結合を介してである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリペプチドリンカー（Ｌ）である。好適なリンカーとしては、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどのＧＳ残基を有するリンカーが挙げられ、ｎは１～２０であり得る。他の連結／コンジュゲーション技術としては、例えば、毒性ペイロードへのシステインベースの部位特異的抗体コンジュゲーションのためのシステインコンジュゲーションが挙げられる。
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。核酸は単離された核酸であることが好ましい。
「単離された核酸分子」とは、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、若しくは合成起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらのある組み合わせであって、単離されたポリヌクレオチドが自然界に見出されるポリヌクレオチドの全て若しくは一部と会合していないか、又は単離されたポリヌクレオチドが自然界では連結されていないポリヌクレオチドに連結されているものを意味する。
更に、上記で定義される少なくとも１つの核酸を含む単離された核酸構築物が提供される。構築物は、プラスミド、ベクター、転写、又は発現カセットの形態であってもよい。したがって、本発明はまた、本発明の核酸を含むプラスミド、ベクター、転写又は発現カセットに関する。本発明で使用する発現ベクターは市販のベクターなどの出発ベクターから構築され得る。ベクターが構築され、重鎖、又は軽鎖及び重鎖配列をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現のために好適な宿主細胞に挿入され得る。
「ベクター」という用語は、宿主細胞において目的の１つ以上の遺伝子又は配列を送達することができ、いくつかの態様では、発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては、限定されないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに封入されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、並びにプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。
本発明はまた、上記の１つ以上の核酸分子プラスミド、ベクター、転写又は発現カセットを含む、単離された組換え宿主細胞に関する。発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の既知の技術を含む既知の方法によって達成され得る。選択される方法は、部分的には、使用される宿主細胞のタイプの関数である。
宿主細胞は、真核性又は原核性、例えば、細菌、ウイルス、植物、真菌、哺乳動物、又は他の好適な宿主細胞であり得る。一実施形態では、細胞は大腸菌細胞である。別の実施形態では、細胞は酵母細胞である。別の実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、又は当業者に明らかであろう他の細胞である。発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含むが、これらに限定されず、当技術分野で周知の発現システムで使用される任意の細胞株を使用して、本発明の組換えポリペプチドを作製することができる。
一般に、宿主細胞は、所望の二重特異性抗体をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。使用され得る宿主細胞の中には、原核生物、酵母又は高等真核細胞がある。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ又は桿菌が含まれる。高等真核細胞には、昆虫細胞及び哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。好適な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＣＯＳ－７細胞、Ｌ細胞、ＣＩ２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はそれらの誘導体、及び血清遊離培地中で成長する関連細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞株、ＣＶＩＩＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡ又はＭＳＲ２９３などのヒト胎児腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養に由来する細胞株、一次外植物、ＨＬ－６０、Ｕ９３７、ＨａＫ又はＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。任意選択的に、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３又はＳ４９などの哺乳動物細胞株は、様々なシグナル伝達又はレポーターアッセイでポリペプチドを使用することが望ましい場合に、ポリペプチドの発現のために使用することができる。
他の好適な宿主細胞としては、バキュロウイルスなどの発現系を用いた昆虫細胞、ウイルス及び核酸ベクターによる発現系を用いた植物細胞、トランスジェニック植物及びトランスジェニック動物が挙げられる。
あるいは、真菌細胞株及び酵母などの低級真核生物、又はバクテリアなどの原核生物中でポリペプチドを産生することが可能である。好適な酵母としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、又は異種ポリペプチドを発現することができる任意の酵母株が挙げられる。好適な細菌株としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、又は異種ポリペプチドを発現することができる任意の細菌株が挙げられる。二重特異性抗体が酵母又は細菌中で作製される場合、機能的生成物を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化又はグリコシル化によって、その中で産生される生成物を改変することが望ましい場合がある。そのような共有結合は、既知の化学的又は酵素的方法を使用して達成することができる。
宿主細胞は、適切な条件下で培養すると、二重特異性抗体を発現させるために使用することができ、二重特異性抗体は、その後、培養培地から収集することができる（宿主細胞が培地中に分泌する場合）か、又は宿主細胞から直接収集することができる（分泌されていない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましい又は必要なポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化など）、及び生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さなどの様々な因子に依存する。
当業者は、インビトロ及びインビボ発現ライブラリを含む、本明細書に記載のポリペプチドを同定し、取得し、最適化するための異なる方法が存在することを知っているであろう。ディスプレイ（例えば、リボソーム及び／又はファージディスプレイ）及び／又は変異誘発（例えば、エラーが発生しやすい変異誘発）などの当技術分野で既知の最適化技術が使用され得る。
このような方法では、アミノ酸配列のセット、コレクション、又はライブラリは、例えば、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム、又は好適な微生物（酵母など）上に表示され得る。アミノ酸配列（のセット、コレクション、又はライブラリ）を表示及びスクリーニングするための好適な方法、技術、及び宿主生物は、当業者には明白であろう（例えば、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｒｉａｎ Ｋ．Ｋａｙ，Ｊｉｌｌ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊｏｈｎ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，１９９６を参照されたい）。
ライブラリ、例えばファージライブラリは、抗体又は重鎖を発現する細胞又は組織を単離し、単離された細胞又は組織に由来するｍＲＮＡからの遺伝子をコードする配列をクローニングし、ライブラリを使用してコードされたタンパク質を表示することによって生成される。重鎖は、哺乳動物、細菌、酵母、又は他の発現系において発現され得る。
したがって、別の態様では、本発明はまた、本明細書に記載される複数のポリペプチド、Ｆｃドメイン又は抗体を含む、発現ライブラリに関する。ファージディスプレイライブラリスクリーニングは、単一のファージディスプレイライブラリに含まれ得る膨大な数の異なるポリペプチド（典型的には１０9を超える）に起因して、いくつかの他のスクリーニング方法よりも有利である。これにより、単一のスクリーニングステップにおける非常に多様なライブラリのスクリーニングが可能になる。一般に、ライブラリは、糸状バクテリオファージの表面上に関連する重鎖及び軽鎖可変ドメインを表示するためにクローニングされるＶ遺伝子（例えば、リンパ球集団から収穫されるか、又はインビトロで組み立てられる）のレパートリーを含む。ファージは抗原に結合することによって選択される。可溶性抗体は、ファージ感染細菌から発現され、抗体は、例えば、変異誘発によって改良され得る。抗体及び抗体ライブラリを作製、スクリーニング、及び進化させることによって抗体を産生する方法が確立される。
更なる態様において、本発明は、本明細書に記載のイヌバリアントＦｃドメインを作製するための方法であって、ＩｇＧ－Ｂ Ｆｃドメインにアミノ酸置換を導入することを含み、
当該アミノ酸置換が、
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへのアミノ酸置換、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／若しくは配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに／あるいは
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換から選択され、かつ／あるいは
ｃ）アミノ酸置換が、以下の改変：
ｃ１）配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換と組み合わせた、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、
ｃ２）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、
ｃ３）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、又は
ｃ４）ｃ１０～ｃ３０の組み合わせのうちの１つから選択される、前記方法に関する。
一態様では、アミノ酸置換は、以下のａ）に記載されるものであり、任意選択的に、以下のｂ）及び／又は以下のｃ）に記載されるアミノ酸置換であり、
ａ）アミノ酸置換が、配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択され、
ｂ）アミノ酸置換が、配列番号１１の１５３位におけるＧへの改変、配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換から選択され、かつ／あるいは
ｃ）アミノ酸置換が、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換から選択される。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
ｂ）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへのアミノ酸置換、及び
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換である。
一態様では、アミノ酸置換は、
ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、
ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換、並びに
ｃ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換である。
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載のネコバリアントＦｃドメインを作製するための方法であって、ＩｇＧ１ Ｆｃドメインにアミノ酸置換を導入することを含み、当該アミノ酸置換が、
ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、並びに／あるいは
ｂ）以下の改変：配列番号３１の２１７位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のうちの１つ以上から選択される、前記方法に関する。
一実施形態では、置換は、
ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択され、配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換のいずれかを更に含むか、又は
ｂ）配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換から選択され、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のいずれかを更に含む。
一実施形態では、ネコＩｇＧ－１ポリペプチド若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域は、改変Ｆｃ領域を含み、当該Ｆｃ領域は、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む。
一実施形態では、置換は、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換から選択される。
一実施形態では、置換は、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換、及び任意選択的に、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換から選択される。
一実施形態では、置換は、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換から選択される。
親ポリペプチドは、野生型ポリペプチド、例えば、Ｆｃドメイン若しくはＦｃドメインを含むポリペプチド、又は野生型配列と比較して改変を有するポリペプチドであり得る。
別の態様では、本発明のポリペプチド又はＦｃドメイン、例えば、本明細書に記載のＦｃドメインと、任意選択的に、薬学的に許容可能な担体と、を含むイヌ、イヌ化、ネコ、又はネコ化Ｆｃドメイン又はポリペプチドを含む、薬学的組成物が提供される。本明細書に記載のポリペプチド又は薬学的組成物は、経口、局所、非経口、舌下、直腸、膣、眼、鼻腔内、肺、皮内、硝子体内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、脳内、経皮、経粘膜、吸入による、又は局所、特に耳、鼻、眼、又は皮膚に対して、又は吸入によるものを含むが、これらに限定されない、任意の便利な経路によって投与され得る。別の実施形態では、送達は、薬物をコードする核酸のものであり、例えば、本発明の分子をコードする核酸が送達される。
非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸、膀胱内、皮内、局所、又は皮下投与を含む。好ましくは、組成物は非経口投与される。
薬学的に許容される担体又はビヒクルは、組成物が、例えば、錠剤又は粉末形態であるように、粒子状であり得る。「担体」という用語は、本発明の薬物抗体コンジュゲートとともに投与される希釈剤、アジュバント又は賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、液体、例えば、水及び油であってもよく、石油、動物、植物又は合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。担体は、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用してもよい。一実施形態では、動物に投与される場合、本発明のポリペプチド又は組成物及び薬学的に許容される担体は、無菌である。水は、本発明の薬物抗体コンジュゲートが静脈内に投与される場合、好ましい担体である。生理食塩水溶液及びデキストロース水溶液及びグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。好適な薬学的担体には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどの賦形剤も含まれる。所望な場合、本組成物はまた、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することができる。
薬学的組成物は、液体の形態、例えば、溶液、シロップ、溶液、エマルション又は懸濁液であり得る。液体は、経口投与に、又は注射、注入（例えば、ＩＶ注入）、若しくは皮下による送達に有用であり得る。
経口投与を意図する場合、組成物は、固体又は液体の形態であり得、半固体、半液体、懸濁液及びゲル形態は、本明細書において固体又は液体のいずれかとして考慮される形態内に含まれる。
経口投与用の固体組成物として、組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、ピル、カプセル、チューインガム、ウエハーなどの形態で製剤化され得る。そのような固体組成物は、典型的には、１つ以上の不活性希釈剤を含有する。加えて、以下のうちの１つ以上が存在し得る：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、又はゼラチンなどの結合剤、デンプン、ラクトース、又はデキストリンなどの賦形剤、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロース又はサッカリンなどの甘味剤、ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ風味などの風味剤、及び着色剤。組成物がカプセルの形態（例えば、ゼラチンカプセル）にある場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン又は脂肪油などの液体担体を含有することができる。
経口投与を意図する場合、組成物は、甘味剤、保存剤、染料／着色剤、及び風味増強剤のうちの１つ以上を含み得る。注射による投与のための組成物において、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤、及び等張剤のうちの１つ以上も含まれ得る。
組成物は、１つ以上の投薬単位の形態をとっていてもよい。
特定の実施形態では、組成物を、治療を必要としている領域に局所的に、又は静脈内注射若しくは注入によって投与することが望ましい場合がある。
特定の疾患又は状態の治療に有効／活性である本明細書に記載のポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物の量は、疾患又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な投薬範囲を特定するのに役立つように、インビトロ又はインビボアッセイを任意選択的に用いてもよい。組成物において用いられる正確な用量はまた、投与経路、及び疾患又は疾患の重篤度に依存し、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。年齢、体重、性別、食生活、投与時間、排泄速度、宿主の状態、薬物の組み合わせ、反応感受性、及び疾患の重症度などの要因を考慮する必要がある。
典型的には、この量は、組成物の重量に対して、本発明のポリペプチド、Ｆｃドメインの少なくとも約０．０１％である。経口投与を意図する場合、この量は、組成物の約０．１重量％～約８０重量％の範囲で変化させることができる。好ましい経口組成物は、組成物の重量に対して、約４％～約５０％の本発明のポリペプチドを含み得る。
非経口投薬単位が、約０．０１重量％～約２重量％の本発明のポリペプチド又はＦｃドメインを含有するように、組成物を調製することができる。
注射による投与のために、組成物は、およそ典型的には、動物の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、動物の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、及びより好ましくは、動物の体重の約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇを含み得る。一実施形態では、組成物は、約１～３０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約５～２５ｍｇ／ｋｇ、約１０～２０ｍｇ／ｋｇ、約１～５ｍｇ／ｋｇ、又は約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投薬スケジュールは、例えば、週に１回から２、３、４週間に１回まで変化し得る。
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチド、Ｆｃドメイン、例えば、抗体若しくはその断片、又は薬学的組成物の療法的治療用途に関する。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、又は「治療」は、疾患又は疾患を阻害又は緩和することを意味する。例えば、治療は、疾患若しくは疾患に関連する症状の発症の延期、及び／又は当該疾患とともに発症するであろう、又は予想されるそのような症状の重症度の低減を含み得る。これらの用語には、既存の症状の改善、追加の症状の予防、及びそのような症状の根底にある原因の改善又は予防が含まれる。したがって、これらの用語は、治療される哺乳動物、例えば、イヌ患者の少なくとも一部に有益な結果が付与されていることを示す。多くの医学的治療は、治療を受ける一部の患者に有効であるが、全ての患者に有効ではない。
「対象」又は「患者」という用語は、治療、観察、又は実験の対象である動物、好適にはコンパニオン動物、具体的にはイヌを指す。
本発明はまた、疾患の治療又は予防における使用のための、本明細書に記載のポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物に関する。
別の態様では、本発明は、疾患の治療又は予防における、本明細書に記載のポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物の使用に関する。別の態様では、本開示は、本明細書に列挙される疾患の治療又は予防のための医薬品の製造における、本明細書に記載されるポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物の使用に関する。本発明は、対象における疾患を治療する方法であって、有効量の、本明細書に記載されるポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物を、当該対象に含む、前記方法に関する。
例えば、疾患は、炎症性疾患又は自己免疫疾患から選択される。
この疾患は、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、掻痒症、乾癬、強皮症、又は湿疹を含む炎症性皮膚疾患；炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）に関連する応答；虚血性再灌流；成人呼吸困難症候群；喘息；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；リウマチ性関節炎、シェーグレン症候群、血管炎などの自己免疫疾患；白血球の血管外漏出を伴う疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、敗血症又は外傷に続く多臓器損傷症候群、細菌性肺炎、抗原抗体複合体媒介性疾患；胸膜症、肺胞炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支炎、及び嚢胞性線維症を含む肺の炎症であり得る。
一実施形態では、抗体又は断片、結合分子、薬学的組成物は、１つ以上の治療剤とともに投与される。
例えば、当該１つ以上の治療剤は、ラパマイシン（シロリムス）、タクロリムス、シクロスポリン（例えば、Ａｔｏｐｉｃａ（登録商標））、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン）、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、抗ＣＤ２８抗体、抗ＩＬ１２／ＩＬ－２３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３０抗体、ＣＴＬＡ４－Ｆｃ分子、ＣＣＲ５受容体アンタゴニスト、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＶＩ＿Ａ４抗体、抗ＬＦＡ１抗体、フルダラビン、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ４５抗体、シクロホスファミド、抗胸腺細胞グロブリン、抗補体Ｃ５抗体、抗ａ４ｂ７インテグリン抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ６－Ｒ抗体、抗ＩＬ２Ｒ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＴＮＦａ／ＴＮＦａ－Ｆｃ分子、ＨＤＡＣ阻害剤、ＪＡＫ－１及びＪＡＫ－３阻害剤などのＪＡＫ阻害剤、抗ＩＬ－３１抗体、ＳＹＫ阻害剤、抗ＩＬ－４Ｒａ抗体、抗ＩＬ－１３抗体、抗ＴＳＬＰ抗体、抗ＰＤＥ４阻害剤、ロキエトマブ（Ｃｙｔｏｐｏｉｎｔ（登録商標））、並びにオクラシチニブ（Ａｐｏｑｕｅｌ（登録商標））などから選択される。
本明細書に記載のポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物は、他の療法又は治療化合物又は療法と同時に、又は異なる時間に、例えば、同時に、別個に、又は逐次的に投与され得る。
本発明はまた、エフェクター機能を抑制するためのインビトロ又はインビボ方法であって、細胞又は組織を、上記のポリペプチド又はそのＦｃ領域と接触させることを含む、前記方法を提供する。エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）であり得る。
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物を含む、疾患の治療若しくは予防、診断、予後、又は疾患のモニタリングのためのキットを提供する。そのようなキットは、他の構成要素、包装、及び／又は説明書を含み得る。
キットは、本明細書に記載の標識されたポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物と、標識を検出するための１つ以上の化合物と、を含んでもよい。
別の態様において、本発明は、凍結乾燥形態で包装されているか、又は水性媒体中に包装されている本発明の本明細書に記載のポリペプチド、Ｆｃドメイン又は薬学的組成物を提供する。
別の態様では、本明細書に記載のポリペプチド又はＦｃドメインは、診断試験及びアッセイなどの非治療目的で使用される。
本発明の更なる態様及び実施形態は、以下の実験的例示を含む本開示を考慮すると、当業者には明白であろう。
別途本明細書で定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有するものとする。前述の開示は、本発明の範囲内に包含される主題の一般的な説明を提供し、本発明を作製及び使用する方法、並びにその最良のモードを含むが、一方、以下の実施例は、当業者が本発明を実施し、その完全な書面による説明を更に提供できるようにするために提供される。しかしながら、当業者であれば、これらの実施例の詳細が本発明を限定するものとして読まれるべきではないことを理解するであろう。本発明の範囲は、本開示に添付された特許請求の範囲及びその等価物から理解されるべきである。本発明の種々の更なる態様及び実施形態は、本開示を考慮して、当業者には明らかであろう。
本明細書において言及される全ての文書は、遺伝子受託番号に対する任意の参照及び特許刊行物に対する参照を含む参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、他方を伴うか若しくは伴わない２つの特定の特徴又は構成成分の各々の具体的な開示としてみなされるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、各々が本明細書で個別に記載されるのと同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の特定の開示とみなされるべきである。文脈が別途指示しない限り、上記の特徴の説明及び定義は、本発明の任意の特定の態様又は実施形態に限定されず、記載される全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
本発明は、非限定的な実施例によって更に説明される。
方法：
１．イヌ抗体構築物
野生型イヌＩｇＧＡ、Ｂ（配列番号１）、Ｃ及びＤのアミノ酸配列を図１Ａに示す。図２は、エフェクター機能欠損イヌＩｇＧＢバリアントを生成するためのアミノ酸置換を示す表である。
抗体産生のために、抗ヒトＣＤ２０抗体、リツキシマブ（ＵＳ５，７３６，１３７を参照されたい）又はオファツムマブ（Ｄｒｕｇｂａｎｋ ｈｔｔｐｓ：／／ｇｏ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃｏｍ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ０６６５０で入手可能な配列）の可変領域に融合された選択されたイヌ及びＩｇＧ定常領域を含むキメラ抗体をコードするＤＮＡ構築物を生成した。野生型イヌ免疫グロブリンをＳＤＳ－ＰＡＧＥ（４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液、及びＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ ２標準物を使用（全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製））によって評価し、図１Ｂに示す。
イヌＩｇＧ－Ｂバリアント（Ｄｅｆ１～９、配列番号２～１０、及び１２～２０）は、部位特異的変異誘発によって生成された。具体的には、ヒトオファツムマブ又はリツキシマブ可変領域及びイヌＩｇＧ－Ｂバリアントを、Ｑ５高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨＩＦＩ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、哺乳動物類発現ベクターＰｅｔＭＬ５に組み立てる。発現ベクターでは、重鎖及び抗生物質耐性遺伝子発現単位にＤＮＡトランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃ末端反転反復が隣接しており、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼの存在下で宿主細胞への安定した組み込みを媒介している。重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼとともにＣＨＯ細胞などの好適な哺乳動物細胞株に共トランスフェクションして、安定した発現を得る。抗体産生のために、３×１０6個の選択されたＣＨＯ細胞を３ｍｌの培養培地中に播種し、２００ｒｐｍで振盪しながら３２℃、５％のＣＯ2でインキュベーションする。４％ ＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａサプリメント＋０．４％ ＨｙＣｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂサプリメント＋１％グルコースを１、４、７、及び１０日目に培地に添加する。培養上清を１２日目に収集し、プロテインＡチップを使用する表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ、Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＩｇＧ濃度を決定する。
２．ネコ抗体構築物
ＩＧＨＧ１及びＩＧＨＧ２の可溶性アイソフォームを包含するゲノム領域を、ＰａｃＢｉｏ配列決定によって社内で検証した。Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで入手可能な市販のＢＡＣライブラリから調達した細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＦＣＡＢ－１６０Ａ１５は、ネコ免疫グロブリン重鎖遺伝子を包含することが見出された。ＢＡＣのＰａｃＢｉｏ配列決定により、既知のアイソフォームＩＧＨＧ１及びＩＧＨＧ２の遺伝子構造及び配列が明らかになった。興味深いことに、可溶性アイソフォームがエクソンＣＨ１、Ｈ、ＣＨ２、及びＣＨ３－ＣＨＳで構成される、ここでＩＧＨＧ３として指定される、以前は知られていなかった第３のＩｇＧファミリーメンバーも、ネコのＩＧＨＧ１及びＩＧＨＧ２遺伝子構造に対する相同性検索によって同定された。ＩＧＨＧ３遺伝子構造は、ＩＧＨＧ１とＩＧＨＧ２との間に位置し、ＩＧＨＧ３エクソンＣＨ１は、ＩＧＨＧ１エクソンＭ２のおよそ１３ｋｂ下流に位置し、ＩＧＨＧ３エクソンＣＨ３－ＣＨＳは、ＩＧＨＧ２エクソンＣＨ１のおよそ１７ｋｂ上流に位置する。ＰａｃＢｉｏ配列決定に加えて、可溶性ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、及びＩＧＨＧ３アイソフォームのエクソンを包含するゲノム領域は、ＦＣＡＢ－１６０Ａ１５を鋳型として使用するサンガー配列決定によって確認されている。ＩＧＨＧ１ ＰＣＲ及び配列決定に使用されるオリゴ（１８９５ｂｐ）：順方向：ＴＧＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧ（配列番号４２）、逆方向：ＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＧ（配列番号４３）。ＩＧＨＧ２ ＰＣＲ及び配列決定に使用されるオリゴ（１８９５ｂｐ）：順方向：ＴＧＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＣＧＡＧ（配列番号４４）、逆方向：ＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡ（配列番号４５）。ＩＧＨＧ３ ＰＣＲ及び配列決定に使用されるオリゴ（１８６９ｂｐ）：順方向：ＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣ（配列番号４６）、逆方向：ＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＴＧ（配列番号４７）。
可溶性ＩＧＨＧ３の推定される遺伝子構造は、図１２に見出すことができる。ネコＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、及びＩＧＨＧ３の可溶性アイソフォームを包含するゲノム配列は、配列番号２８、２９、及び３０で提供され、コード領域は太字で下線が引かれている。野生型ネコＩｇＧ１、２及び３のアミノ酸配列（配列番号３１～３３）を図１３Ａに示す。野生型ネコ免疫グロブリンをＳＤＳ－Ｐａｇｅ（４～１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液、及びＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ ２標準物を使用（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製））によって評価し、図１３Ｂに示す。図１５Ａは、エフェクター機能欠損ネコＩｇＧ１バリアントを生成するためのアミノ酸置換を示す表である。
ネコＩｇＧ ＷＴ及びＩｇＧ１変異体バリアント（Ｄｅｆ１～４、配列ＩＤ３４～３７及び３８～４１）は、ヒトオファツムマブ可変領域を使用して、イヌバリアントと同じ方法で生成した。
３．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性
ＣＬＢＬ１（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｖｉｅｎｎａ）又はＣＬＣ（Ｕｍｅｋｉ Ｓ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，７５：４６７－４７４（２０１３）ＰｕｂＭｅｄ＝２３１９６８０１；ＤＯＩ＝１０．１２９２／ｊｖｍｓ．１２－０４４８）などのイヌリンパ球腫瘍細胞株を標的細胞として使用し得る。これらの細胞に、ヒトＣＤ２０タンパク質（配列ＩＤ２５）をコードする発現構築物を安定的にトランスフェクトするか、又はヌクレオフェクトして、ｈＣＤ２０発現細胞を生成する。発現構築物は、抗体発現について上述したのと同じ方法を使用して生成した。
トランスフェクトされた細胞をピューロマイシン耐性について選択し、ｈＣＤ２０高（上位５％）細胞を、抗ヒトＣＤ２０抗体（クローン：２Ｈ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用してｈＣＤ２０発現について染色することによってＦＡＣＳソートした。
ＣＤＣ活性を評価するために、トランスフェクトされていない（野生型）標的リンパ球又は同等のｈＣＤ２０発現細胞を細胞殺傷アッセイで使用し、９６ウェルプレートのウェル当たり５０００個の標的細胞を、上述の抗ヒトＣＤ２０イヌ又はネコＦｃキメラ抗体と、イヌ補体保存血清（ＢｉｏＩＶＴ）とともに、１：１２の最終希釈で、３７℃、５％ＣＯ2で２時間インキュベートした。アッセイは、イヌ補体保存血清が補体の唯一の供給源となるように、熱不活性化血清を使用して作製したＣＬＢＬ－１細胞用培地（ＲＰＭＩ＋１％ Ｌ－グルタミン＋２０％ウシ胎仔血清を使用して設定した。
次いで、アッセイプロトコルに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して生細胞を定量した。このアッセイは、細胞生存率の指標として生細胞のＡＴＰ含有量を使用する。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で発光を測定した。データをＭＡＲＳソフトウェア（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して分析し、残存する生細胞の数を使用して、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して抗体の存在下での殺傷パーセンテージを計算した。バックグラウンドシグナルを、１％ ｔｒｉｔｏｎで処理した細胞の試料（生存細胞はなかった）から得て、各試験試料から得たシグナルから差し引いた。同一に処理されたが、抗体が省略された細胞の試料から、最大シグナル（０％殺傷）を得た。グラフを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。
図３は、ＣＬＢＬ１細胞及びＷＴ ＣＬＢＬ１細胞並びにイヌＩｇＧ－Ｂ ＷＴを発現するか、又はＤｅｆ１、２、３、５、６、７、８、９の変異を含むｈＣＤ２０を使用して実行される例示的なＣＤＣアッセイの結果を示す。抗体を、１０μｇ／ｍｌ～０．０１ １０μｇ／ｍｌの範囲の１：３連続希釈で使用した。試験した全てのＤｅｆ変異体（Ｄｅｆ１、２、３、５、６、７、８、９）は、補体依存性細胞傷害性によって、イヌＩｇＧＢ ＷＴがｈＣＤ２０ ＣＬＢＬ１細胞を死滅させる能力を完全に消失させた（図３）。試験した全てのバリアントはＣＤＣ活性の完全な抑制を示し、これは、ＦｃとのＣ１ｑ相互作用が、Ｆｃ、下部ヒンジ、ＳＨＥＤ領域及びプロリンサンドイッチの３つの領域全てからの配列文脈の厳格な要件を有することを示唆している。
４．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性
ＭＤＣＫ ＩＩ細胞（ＡＴＣＣ）などのイヌ細胞株に、上記のように、ヒトＣＤ２０タンパク質をコードする構築物及び蛍光タンパク質（すなわち、ＧＦＰ）を発現する構築物を安定的にトランスフェクト又はヌクレオフェクトした。野生型ＭＤＣＫ ＩＩ細胞を対照として使用した。イヌ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｅｎｖｉｇｏ）をエフェクター細胞の供給源として使用した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓ（Ｃｙｔｉｖａ、ＧＥ１７－１４４０－０２）密度勾配遠心分離を使用して、ヘパリンナトリウム抗凝固剤を用いて、新たに採取した全血から単離した。手短に言えば、１０ｍｌの血液をリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で１：１に希釈し、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌ－ｐａｑｕｅ ｐｌｕｓの上に慎重に層化し、８００ｒｃｆで２０’の間、ゆっくりと加速しながら遠心分離し、最後に切断しなかった。最上層及び相間ディスクをＰＢＳで希釈し、１３００ｒｐｍで１０’の間遠心分離して、ＰＢＭＣをペレットに収集し、ＰＢＳで２回洗浄して、Ｆｉｃｏｌｌの残留物を全て除去した。２回目の遠心分離後、ＰＢＭＣを、５０ｎｇ／ｍｌの組換えイヌＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した培地（ＰＢＭＣ培地＝ＲＰＭＩ＋１０％熱不活性化ウシ胎仔血清＋１％ペニシリン－ストレプトマイシン＋１％非必須アミノ酸＋１％ Ｌ－グルタミン＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％ＨＥＰＥＳ）中に再懸濁し、３７℃、５％ ＣＯ2で２４時間インキュベーションした後、ＡＤＣＣアッセイで使用した。
まず、ＷＴイヌＩｇＧ－Ｂとして製剤化された、２つの周知の抗ヒトＣＤ２０抗体、オファツムマブ及びリツキシマブのＡＤＣＣ活性を比較した（図４）。我々のデータは、ヒトＦｃ上で製剤化されたオファツムマブ及びリツキシマブについて生成された公開されたＡＤＣＣデータに匹敵する。オファツムマブ：Ｂｌｅｅｋｅｒ ＷＫ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ２００８；１４０：３０３－３１２。リツキシマブ：ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｅａｎ－ｃｅｌｌｓ．ｃｏｍ／ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ／ｂｉｏａｓｓａｙ－ａｎｄ－ｒｄ／ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ－ａｓｓａｙｓ／
アッセイ設定と標的細胞間で多少の相違が予想され、許容される。次に、ＡＤＣＣ活性を評価した。イヌＡＤＣＣ活性を評価するために、１０，０００個（図５、アッセイ設定１）又は５，０００個の細胞（図６、アッセイ設定２）の野生型又はｈＣＤ２０を発現するＭＤＣＫ ＩＩ細胞を、ＭＤＣＫ ＩＩ培地（ＤＭＥＭ＋１％ Ｌ－グルタミン＋１０％ウシ胎仔血清）とＰＢＭＣ培地との１：１の混合物中で、３７℃、５％ ＣＯ2で２４時間、図５及び６に示すように、５０：１（アッセイ設定１）又は１００：１（アッセイ設定２）のエフェクター：標的比及び抗体滴定でＰＢＭＣと共培養した。
ネコＡＤＣＣ活性を評価するために、１０，０００個（図１４、アッセイ設定３）の野生型又はｈＣＤ２０を発現するＭＤＣＫ ＩＩ細胞を、ＭＤＣＫ ＩＩ培地（ＤＭＥＭ＋１％ Ｌ－グルタミン＋１０％ウシ胎仔血清）とＰＢＭＣ培地との１：１の混合物中で、３７℃、５％ ＣＯ2で２４時間、図１４に示すように、２５：１（アッセイ設定３）のエフェクター：標的比及び抗体滴定でＰＢＭＣと共培養した。
ウェル当たりの生細胞の数に比例するＧＦＰシグナルを、２４時間のインキュベーションの終了時にウェルに残存する生細胞の数の尺度として使用した。ＧＦＰシグナルをＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で測定した。データをＭＡＲＳ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して分析し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用して抗体の存在下での殺傷のパーセンテージを計算した。バックグラウンドシグナルを、１％ ｔｒｉｔｏｎで処理した細胞の試料（生存細胞はなかった）から得て、各試験試料から得たシグナルから差し引いた。同一に処理されたが、抗体が省略された細胞の試料から、最大シグナル（０％殺傷）を得た。グラフを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。
イヌＤｅｆ変異体２、３、及び７は、最大１０μｇ／ｍｌでＩｇＧ－Ｂ ＡＤＣＣ活性を完全に抑制する。このアッセイでは、他の変異体の部分的なエフェクター機能を観察した。結果を、図５ａ）及びｂ）に示す。図５ｂ）は、図５ａ）に示されるデータの組み合わせである。左パネルはヒトＣＤ２０ ＭＤＣＫ細胞を使用した変異体について得られた結果を示し、右パネルは野生型ＭＤＣＫ細胞を使用した結果を示す。
図５は、野生型ＩｇＧ－Ｂと比較した個々のイヌバリアントのＡＤＣＣ活性の抑制の程度を示すだけでなく、変異体間を比較することによって、個々の領域及び変異に関する配列及び機能相関に関する知識を更に導き出すことができる。
Ｄｅｆ１対Ｄｅｆ２：Ｄｅｆ２はＤｅｆ１と比較して追加の「ＳＨＥＤ」領域変異を持っている。ＡＤＣＣアッセイでは、Ｄｅｆ１は部分的に不活性であるが、Ｄｅｆ２はＡＤＣＣ活性が完全に欠損している。これは、下部ヒンジにおけるＭ１２０Ｓ及びプロリンサンドイッチ領域におけるＮ２１０Ｈ＋Ｋ２１２Ｉ＋Ａ２１３Ｇトリプル変異が、ＡＤＣＣ活性を不活性化させるために重要であるが、Ｄ１５３Ｇ＋Ｐ１５４Ｒ二重変異が、ＡＤＣＣ活性の完全な不活性化に必要であることを示唆する。
Ｄｅｆ２対Ｄｅｆ３：Ｄｅｆ３は、Ｄｅｆ２と比較してＰ２１７Ｓの追加の変異を持っている。Ｄｅｆ２とＤｅｆ３はいずれも、ＡＤＣＣ活性の完全な欠損を示している。これは、Ｄｅｆ２変異の組み合わせがＡＤＣＣ機能を不活性化させるのに十分であるが、この組み合わせではＰ２１７Ｓの効果を利用できなかったことを示唆している。
Ｄｅｆ５対Ｄｅｆ６及びＤｅｆ７：Ｄｅｆ５は、ヒト同等の「ＬＡＬＡ」変異、イヌＩｇＧ－Ｂの場合にはＭ１２０Ｌ＋Ｌ１２１Ａを有する。Ｄｅｆ６及びＤｅｆ７は、それぞれ、プロリンサンドイッチ領域、Ｐ２１７Ｓ及びＰ２１５Ｇに追加の単一変異を有する。Ｄｅｆ５及びＤｅｆ６はいずれも、ＡＤＣＣ活性に対して同様の範囲で部分的に機能し、追加のＰ２１７Ｓ変異がＡＤＣＣ活性抑制に寄与していないことを示唆している。対照的に、Ｄｅｆ７は、Ｄｅｆ５の部分的な効果と比較してＡＤＣＣ活性を完全に抑制し、Ｐ２１５ＧがＡＤＣＣ抑制において役割を果たすことを示唆している。
Ｄｅｆ６対Ｄｅｆ７：同じＭ１２０Ｌ＋Ｌ１２１Ａ下部ヒンジ変異を共有しているにもかかわらず、プロリンサンドイッチ領域内の異なる変異は、これら２つの変異体の異なる機能的結果をもたらす。先に検討したように、Ｐ２１５ＧはＡＤＣＣ活性の抑制において重要であるが、Ｐ２１７Ｓは影響を及ぼさない。
ＷＴネコＩｇＧ ＡＤＣＣ活性の事前の知識が報告されていないため、全てのＩｇＧアイソフォームをＡＤＣＣ活性について評価した。図１４に示すように、ネコＩｇＧ１はエフェクター機能に習熟していることが示されたが、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の両方がエフェクター機能欠損であり、最大３μｇ／ｍｌでほとんどＡＤＣＣ活性が観察されなかった。
全てのネコＤｅｆバリアントはエフェクター機能の低下をもたらし、Ｄｅｆ３及びＤｅｆ２は、ＷＴ ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の両方で観察されるレベルまでＩｇＧ１ ＡＤＣＣ活性を大きく低下させた。結果を図１６に示す。イヌと同様に、図１６で生成された結果に基づいて個々の領域及び変異に関する配列及び機能の相関関係に関する知識を更に導き出すことができる。
Ｄｅｆ１対Ｄｅｆ２：Ｄｅｆ１及びＤｅｆ２は、ヒト同等の「ＬＡＬＡ」変異、ネコＩｇＧ１の場合にはＭ１２０Ａ＋Ｌ１２１Ａを共有する。これらは、それぞれ、プロリンサンドイッチ領域、Ｐ２１７Ｓ及びＰ２１５Ｇにおける追加の単一の変異によって異なる。したがって、これらは、それぞれ、イヌＤｅｆ６及びＤｅｆ７変異体のものと同等である。イヌ系と同様に、追加のＰ２１７Ｓ変異は、ＡＤＣＣ活性抑制への寄与が最小限であったが、Ｐ２１５ＧはＡＤＣＣ活性の６０％の低下をもたらし、Ｐ２１５ＧがＡＤＣＣ抑制において役割を果たすことを示唆している。
Ｄｅｆ３対Ｄｅｆ４：Ｄｅｆ３及びＤｅｆ４は同様に、下部ヒンジ領域内に、ネコＩｇＧ１の場合にはＭ１２０位及びＬ１２１位にアミノ酸変異を有する。「ＬＡＬＡ」変異を利用するのではなく、ネコＩｇＧ１を、天然エフェクター機能欠損のネコＩｇＧ２及びＩｇＧ３（図１５Ａ）、Ｍ１２０Ｉ及びＬ１２１Ｐで観察されるものに戻した。Ｄｅｆ３は、ＷＴ ＩｇＧ２に類似したこの下部ヒンジ領域内にＧ１２３Ａの追加の変異を有するが、Ｄｅｆ４は、ＷＴ ＩｇＧ１及びＩｇＧ３の両方で観察されたものと同様にＧ１２３を保持する。Ｄｅｆ４は、ＷＴ ＩｇＧ２及びＩｇＧ３の両方で観察されたような、追加のプロリンサンドイッチ変異Ｐ２１７Ａを有する。ＡＤＣＣアッセイでは、Ｄｅｆ４は部分的に不活性（ＷＴと比較して３２％低下）である一方で、Ｄｅｆ３はＡＤＣＣ活性が欠損しているため、ＷＴ ＩｇＧ２及び３で観察されたものと同等である（図１４、図１６）。これは、下部ヒンジ内のＧ１２３Ａの追加の変異がＡＤＣＣ活性の不活性化に必要であり、Ｐ２１７の改変のＡＤＣＣ活性抑制への寄与が再び最小限であったことを示唆している。
まとめると、これらの観察により、個々の変異及び領域寄与は、ＡＤＣＣ機能抑制の程度という観点で、配列のみから予測できないことが実証された。完全に機能不全のイヌ変異体、すなわち、完全にＣＤＣ及びＡＤＣＣが欠損しているのは、Ｄｅｆ２、３、７である。ＡＤＣＣ機能は、エフェクター機能欠損のより感度の高い尺度であることが示されたので、これだけをネコ変異体とともに利用した。完全に機能不全のネコ変異体、すなわちＡＤＣＣが欠損しているのは、Ｄｅｆ２及びＤｅｆ３である。
５．安定性と熱ストレス
ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬのイヌＩｇＧ－Ｂ重量及びＤｅｆ２、Ｄｅｆ３及びＤｅｆ７の６×５０ｕＬのアリコートを調製し、４℃（１分子当たり２アリコート）又は４０℃（１分子当たり４アリコート）のいずれかで、密封ＰＣＲチューブ中で１、４又は１４日間保管した。
ＨＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラフィー（カラム：ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＳＥＣ ｍＡｂ ２００Ａ、２．５ｕｍカラム ＷＡＴＥＲＳ）を、イソクラティックな０．５７５ｍＬ／分の流速を有する移動相としてＰＢＳを使用するＷＡＴＥＲＳ製のＡＣＱＵＩＴＹ Ｈ－ｃｌａｓｓ Ｂｉｏを使用して実行した。各時点（０日目、１日目、４日目、及び１４日目）で、上記の全ての分子を５’、２００００ｇで遠心分離して（標準テーブルトップ遠心分離機を使用して）あらゆる沈殿物を除去し、次いで、上記のプロトコルを使用して、１０ｕＬの各試料をＨ－ＳＥＣに注入した。各分子／時点についてモノマー種及び面積（抗体濃度を示す）の割合を決定し、参照ラン（０日目）と比較した。結果は、図７Ａに要約し、イヌＩｇＧＢ Ｄｅｆ２、３、及び７の熱安定性がＷＴ ＩｇＧＢの熱安定性に匹敵することを示している。
ネコ用ＩｇＧ１ ＷＴ（図１３Ｂ）及びＤｅｆ１、Ｄｅｆ２、Ｄｅｆ３、及びＤｅｆ４バリアント（図１７Ａ）を、４～１２％のＢｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動用緩衝液、及びＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ ２標準物を使用して、ＳＤＳ－Ｐａｇｅにより全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製のものを非還元条件下で評価した。明確な差異は観察されなかった。ＨＰＬＣ－ＳＥＣクロマトグラフィーは、ＩｇＧ１ ＷＴ及びＤｅｆ変異体について上述の方法を使用しても実行された。図１７Ｂは、全てのＩｇＧ１ ＷＴ及び変異体が、無傷のモノマー種の高い割合（９６％を超える）を示したことを示す。
６．プロテインＡ結合親和性検証
ＰＢＳ中の精製イヌ抗体（図２を参照して、上述のオファツムマブイヌＩｇＧ－Ｂ ｗｔ並びに欠損変異体「ＩｇＧ－Ｂ ｗｔ」及び「Ｄｅｆ－２．」、「Ｄｅｆ３」、及び「Ｄｅｆ７」）を、遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ－ＶＳ０２Ｈ２２）を使用して５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質濃度を、標準ＩｇＧパラメータを使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を用いて、２８０ｎｍでのＵＶ吸光を使用して評価した。
ＩｇＧのプロテインＡへの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して評価した。手短に言えば、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｃｙｔｉｖａ）をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにドッキングし、室温で３０分の間平衡化し、次いで、泳動用緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）をＳＰＲチップ表面に適用した。
ＩｇＧ－Ｂ ＷＴ、Ｄｅｆ２、Ｄｅｆ３、及びＤｅｆ７を１ｕＭから４ｎＭに希釈する抗体希釈液（１：３希釈で６濃度）を泳動用緩衝液中で調製し、単一サイクル動態法（Ｂｉａｃｏｒｅ Ａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｃｙｔｉｖａ）を使用して動態を評価した。 動態及び／又は親和性定量化は、標準分析方法に従ってＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔを使用して実行されている。
結果は、プロテインＡの結合がイヌＩｇＧ－Ｂ Ｄｅｆ２、３、及び７において維持されることを示す（図７Ｂ上パネル）。
抗体（図１５を参照して、上述のオファツムマブネコＩｇＧ１ ＷＴ並びに欠損変異体「ＩｇＧ１ ＷＴ」及び「Ｄｅｆ１．」、「Ｄｅｆ２」、「Ｄｅｆ３」及び「Ｄｅｆ４」）のプロテインＡへの結合親和性を同様にＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して評価した。イヌＩｇＧについては上述した方法を使用して。
抗体希釈液を、ＩｇＧ１ ＷＴ」並びに「Ｄｅｆ１」、「Ｄｅｆ２」、「Ｄｅｆ３」及び「Ｄｅｆ４」を、５００ｎＭ～３１．２５ｎＭ（１：２希釈で５濃度）の泳動用緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）中で希釈することによって調製し、単一サイクル動態法（Ｂｉａｃｏｒｅ Ａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｃｙｔｉｖａ）を使用して動態を評価した。動態及び／又は親和性定量化は、標準分析方法に従ってＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔを使用して実行されている。
結果は、プロテインＡの結合がネコＩｇＧ１ Ｄｅｆ１、２、３及び４で維持されていることを示している（図１８Ａ）。
７．ＦｃＲｎ結合親和性検証
ＰＢＳ中の精製イヌ抗体（図２を参照して、上述のオファツムマブイヌＩｇＧ－Ｂ ｗｔ並びに欠損変異体－「ＩｇＧ－Ｂ ｗｔ」及び「Ｄｅｆ２」、「Ｄｅｆ３」及び「Ｄｅｆ７」）を、遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ－ＶＳ０２Ｈ２２）を使用して５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質濃度を、標準ＩｇＧパラメータを使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を用いて２８０ｎｍでのＵＶ吸光を使用して評価した。
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、イヌＩｇＧのＦｃ新生児型受容体への結合親和性を評価した。手短に言えば、ＣＭ５ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｃｙｔｉｖａ）をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにドッキングし、室温で３０分の間平衡化し、次いで、泳動用緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）をＳＰＲチップ表面に適用した。
イヌＦｃＲｎ－Ｂ２Ｍ組換えタンパク質（Ｉｍｍｕｎｉｔｒａｃｋ、ＩＴＦ１２）を４ｎＭ（ストックから１：２０００希釈）でｐＨ４．５の１０ｍＭの酢酸緩衝液に希釈し、標準的なアミンカップリング反応を使用して固定化した。
ＩｇＧ－Ｂ ＷＴ、Ｄｅｆ２、Ｄｅｆ３、及びＤｅｆ７を３ｕＭから３７ｎＭに希釈する抗体希釈液（１：３希釈で５濃度）を泳動用緩衝液中で調製し、多サイクル動態法（１２０秒の会合－３００秒の解離）を使用して動態を評価した。動態及び／又は親和性定量化は、標準分析方法に従ってＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔを使用して実行されている。
ＩｇＧ－Ｂ Ｄｅｆ２、３及び７のＦｃＲｎへの親和性は、ＩｇＧ－Ｂ ＷＴの親和性に匹敵した（図７Ｂ下パネル）。
ネコ抗体（図１５を参照して、上述のオファツムマブネコＩｇＧ１ ＷＴ並びに欠損変異体「ＩｇＧ１ ＷＴ」及び「Ｄｅｆ１．」、「Ｄｅｆ２」、「Ｄｅｆ３」及び「Ｄｅｆ４」）のＦｃ新生児型受容体への結合親和性を同様にＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して評価した。手短に言えば、ＣＡＰ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｃｙｔｉｖａ）をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにドッキングし、室温で一晩の間平衡化し、次いで、泳動用緩衝液（１×ＰＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）をＳＰＲチップ表面に適用した。
ネコＦｃＲｎ－Ｂ２Ｍ組換えタンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、連続緩衝液中で０．５ｕｇ／ｍＬに希釈し、Ｂｉｏｔｉｎ ＣＡＰｔｕｒｅキット標準プロトコルを使用して固定化した。
ＩｇＧ１ ＷＴ、Ｄｅｆ１、Ｄｅｆ２、Ｄｅｆ３、及びＤｅｆ４を２５ｎＭから０．７８１ｎＭに希釈する抗体希釈液（１：２希釈で６濃度）を泳動用緩衝液中で調製し、多サイクル動態法（６０秒の会合－１２０秒の解離）を使用して動態を評価した。動態及び／又は親和性定量化は、標準分析方法に従ってＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔを使用して実行されている。
ネコＩｇＧ１ Ｄｅｆ１、２、３及び４のＦｃＲｎに対する親和性は、ＩｇＧ１ ＷＴの親和性に匹敵した（図１８Ｂ）。
８．ＦｃγＲ１ａ（ＣＤ６４）結合親和性の決定
ＰＢＳ中の精製イヌ抗体（図２を参照して、上述のオファツムマブイヌＩｇＧ－Ｂ ＷＴ及び欠損変異体－「ＩｇＧ－Ｂ ｗｔ」及び「Ｄｅｆ１～「Ｄｅｆ８」）を０．５ｍｇ／ｍＬに正規化し、タンパク質濃度を、標準ＩｇＧパラメータを使用して、ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を用いて２８０ｎｍの紫外線吸光度を使用して評価した。
Ｆｃガンマ１受容体（ＣＤ６４）へのイヌＩｇＧの結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して評価した。
手短に言えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ（Ｃｙｔｉｖａ）をＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋにドッキングし、室温で３０分の間平衡化し、次いで、泳動用緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４ １５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）をＳＰＲチップ表面に適用した。
オファツムマブイヌＩｇＧ－Ｂ ＷＴ又はＤｅｆ変異体を、６ｎＭの濃度で泳動緩衝液に希釈した。これらは、捕捉ステップとして１０ｕＬ／分で９０秒の会合を使用して固定化され、続いて泳動用緩衝液を注入して、結合していない生成物を除去した。
ヒトＣＤ６４／ＦＣＧＲ１Ａタンパク質（Ｓｔｒａｔｅｃｈ製－カタログ番号：１０２５６－Ｈ０８Ｈ－ＳＩＢ）を、９．３７５ｎＭまで１：２の更なる希釈で、１５０ｎＭの泳動用緩衝液中で希釈した。捕捉ステップ法（６０秒間の会合－４５０秒間の解離）、続いて再生ステップ（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．２、接触時間６０秒、ＦＲ ３０ｕＬ／分）を用いて、多サイクル動態を使用して動態を評価した。動態定量化は、標準的な分析方法に従ってＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔを使用して実行した。
Ｄｅｆ変異体のＣＤＣ活性の低下の確認として、ＩｇＧ－Ｂ Ｄｅｆ１、２、３、５、６、７、及び８のＦｃγＲ１ａに対する親和性は、ＷＴ ＩｇＧＢの親和性と比較して低下した（図８）。
ネコ抗体（図１５を参照して、上述のオファツムマブネコＩｇＧ ＷＴ並びに欠損変異体－「ＩｇＧ１ ＷＴ」、「ＩｇＧ２ ＷＴ」、「ＩｇＧ３ ＷＴ」及び「Ｄｅｆ１」～「Ｄｅｆ４」）のＦｃガンマ１受容体（ＣＤ６４）への結合親和性を同様にＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して、イヌに記載されている方法に従って評価した。Ｄｅｆ変異体の低下したエフェクター機能活性の確認として、ＩｇＧ１ Ｄｅｆ１、２、３及び４のＦｃγＲ１ａに対する親和性は、ＷＴ ＩｇＧ１の親和性と比較して低下した（図１８Ｃ）。
合わせて考慮すると、ＦｃγＲ１ａ相互作用はエフェクター機能と相関する、すなわち、機能的欠損は、より低いＦｃγＲ１ａ親和性を有する傾向がある。しかしながら、ＦｃγＲ１ａ相互作用は、図８及び図１８Ｃに示すイヌ及びネコの両方の症例における完全なＡＤＣＣヌル変異体バリアントを予測することができない。
８．変異体バリアントの抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）活性検証
フローサイトメトリーベースのＡＤＣＰアッセイは、ヒトモノクローナル抗体のＡＤＣＰ機能を試験するために記載される同等のプロトコルに基づいて開発され得る。ＦｃγＲＩＩａを発現するイヌ及びネコ食細胞を同定し、エフェクター細胞として使用する。これらは、ヒト単球由来マクロファージ（Ｊｉｎ ａｎｄ Ｋｒｕｔｈ， Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ（１１２）；２０１６ ５４２４４）、又はそれぞれＤＨ８２（ＡＴＣＣ）若しくはＦｃｗｆ－４（ＡＴＣＣ）のようなイヌ又はネコマクロファージ細胞株のために樹立されたプロトコルを適合させることによって、ＰＢＭＣ由来単球から分化された一次イヌ又はネコマクロファージであり得る。好適な標的は、例えば、ｈＣＤ２０の目的の抗原を発現するＣＬＢＬ－１、ＭＤＣＫ ＩＩ又はＣＲＦＫなどの細胞株、又は抗原でコーティングされたビーズ／粒子（すなわち、ウイルス様粒子）であり得る。エフェクター及び標的を、フローサイトメーター上で測定することができる異なる蛍光（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ）の好適な組み合わせでそれらを標識することによって区別する。
エフェクター：標的比、培養期間、エフェクター細胞の事前活性化等のアッセイ条件を最適化する。エフェクター及び標的細胞は、最適化されたアッセイ条件下で抗体の滴定の存在下で共培養する。抗体又は適切なアイソタイプコントロール抗体の不在を陰性対照として使用する。エフェクター細胞の蛍光は、好適なフローサイトメーターを使用して測定し、データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析する。ＡＤＣＰのパーセンテージ、すなわち食作用は、標的細胞に関連する蛍光が陽性になったエフェクター細胞（生細胞、単一細胞にゲーティング）のパーセンテージとして決定される。
９．イヌ変異体バリアントのＦｃＲｎ結合検証
イヌＩｇＧ－ＢがマウスＦｃＲｎに結合することができるという事実を考慮すると、変異体バリアントのインビボ半減期検証は、免疫不全マウス（すなわち、ＲＡＧ１KOマウス）において実行することができる。イヌＩｇＧ－Ｂ野生型及びＤｅｆ変異体抗体をそのようなマウスに（腹腔内又は静脈内に）注射し、注射された抗体の血清力価を経時的に測定することができる。異なる時点（すなわち、注射の７日前、１０分後、２４時間後、７２時間後、７日後、１４日後、２１日後、及び２８日後）で、伏在静脈から少量の血液（２０～５０ｕｌ）を収集する。血清は、血液を遠心分離することによって細胞成分から分離する（５’の場合は７０００ｒｃｆ）。マウス血清中のイヌＩｇＧは、抗イヌＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（すなわち、Ａｂｃａｍ ａｂ１９３７６８）を使用することによって定量化することができる。これにより、薬物動態プロファイル（ｐＫ）の決定が可能になる。
図９に示す実施例では、Ｒａｇ１ ＫＯマウスに、Ｏｆａ－ｃＩｇＧＢ－ＷＴ、Ｏｆａ－ｃＩｇＧＢ－Ｄｅｆ２、Ｏｆａ－ｃＩｇＧＢ－Ｄｅｆ３、又はＯｆａ－ｃＩｇＧＢ－Ｄｅｆ７のいずれか（１ｍｇ／Ｋｇ、抗体当たり５匹のマウス）を静脈内注射した。抗体注入から３０分、１日、３日、１週間、２週間、３週間、及び４週間後に採取した全血から血清を作製した。検出のバックグラウンドレベルを決定するために、抗体注射の１週間前に血液も採取した。イヌＩｇＧ血清力価は、抗イヌＩｇＧ ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｒｂｙｔ）を使用して決定した。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ）を使用して、６５０ｎｍ補正で４５０ｎｍにてＥＬＩＳＡプレートを読み取った。キットに存在する標準曲線を使用し、希釈係数を掛け合わせて、ＭＡＲＳソフトウェア（ＢＭＧ）を使用して血清中の血清濃度を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄを使用してデータを解析した。
１０．Ｔｏｎｓｅｔ及び半径の測定
ＰＢＳ中の精製イヌ抗体（図２を参照して、上述のオファツムマブ イヌＩｇＧ－Ｂ ｗｔ及び欠損変異体－「ＩｇＧ－Ｂ ｗｔ」及び「Ｄｅｆ１～「Ｄｅｆ８」）を５ｍｇ／ｍＬに正規化し、標準ＩｇＧパラメータを使用して、タンパク質濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を用いて２８０ｎｍの紫外線吸光度を使用して評価した。
動的光散乱実験並びに温度誘導凝集のモニタリングを使用してこれらの分子のサイズを推定し、欠損変異体によって誘導される任意のタンパク質折り畳み不安定化を強調するためにＤｙｎａＰｒｏ（登録商標）（ＷＹＡＴＴ）プレートリーダーＩＩＩを使用した。
端的には、１０ｕＬの各抗体を９６ウェルプレートに添加し、室温で平衡化したプレートリーダーに配置した。各ＤＬＳ測定は、１０×１０秒の取得で構成された。同じパラメータを、℃＝＋１℃／分のΔＴでの温度ランプ実験に使用した。測定値は、ＤＹＮＡＭＩＣＳソフトウェアによって評価した。値を分析し、ＧｒａｐｈＰａｄを使用してプロットした。
ＵＮｃｌｅ安定性プラットフォーム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）を用いて、ネコＩｇＧ１ ＷＴ及びＤｅｆ変異体１、２、３、及び４の一般的な安定性を評価した。示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）及び動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用して、２５℃から９５℃への２℃／分の温度上昇後のタンパク質サイズ及び構造分布の変化を監視した。各試料の合計９μＬを、ＤＬＳ及び３回の固有蛍光試験のために試料ウェルに充填した。測定は、ＵＮｃｌｅ分析プラットフォーム（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、Ｎｏｒｔｏｎ，ＭＡ）を使用して評価した。
ネコ抗体（図１５を参照して、上述のオファツムマブネコＩｇＧ１ ＷＴ及び欠損変異体「ＩｇＧ１ ＷＴ」及び「Ｄｅｆ１」、「Ｄｅｆ２」、「Ｄｅｆ３」及び「Ｄｅｆ４」）は、Ｔｏｎｓｅｔ及び直径測定の両方において最小限の変化を示した（図１９Ａ及びＢ）。
１１．考察
巨視的に、異なる種からのＩｇＧは構造について大部分が保存されているが、異なる種からの配列前後関係の違いがＩｇＧの特性に影響を与えるという証拠が増えている。ヒトとイヌ又はネコＩｇＧの間の構造保存に基づいて、Ｃ１ｑ及びＦｃＲ受容体と相互作用し、エフェクター機能を媒介するＩｇＧの主な相互作用パートナーである下部ヒンジ、プロリンサンドイッチ、及びＳＨＥＤ領域の周りの位置をマッピングすることができた。エフェクター機能調節のためにヒトにおいて異なる変異の組み合わせが特定されているが、変異の性質、位置及び組み合わせは、完全なエフェクター機能欠損を達成するために重要であり、種依存性である。したがって、一次配列に基づく予測のみでエフェクター機能に影響を及ぼす位置の特定につながることができるが、完全なエフェクター機能欠損バリアントを生じる変異の組み合わせを予測することは十分ではない。更に、ＦｃのＦｃγＲ１ａ相互作用親和性は、完全なエフェクター機能欠損バリアントを予測するのに十分ではなく、ＣＤＣ及びＡＤＣＣ活性のインビトロでの（可能であればインビボでの）実験が、エフェクター機能欠損を決定する唯一の信頼できる方法であることを強調している。
我々の設計戦略は、ヒトドメインからの知識と種内の天然ＩｇＧアイソフォームの特性に基づいている。全ての変異バリアントがエフェクター機能にある程度の影響を有するという事実は、種とアイソフォームとの間の保存が設計を導くことができ、機能に対する配列の影響をある程度予測することができることを明確に示唆している。しかしながら、例えば全ての設計のうちのイヌの場合では、この結果が予測可能ではなく、厳格な機能評価を使用した検証を必要とすることを実証する完全なエフェクター機能欠損であるのはＤｅｆ２、３、７のみである。同様に、ネコの場合、ヒト及びイヌ系の両方においてエフェクター機能欠損ＩｇＧを生成するために使用される設計戦略を利用すると、試験された４つの変異体のうちの１つのみが完全に機能欠損となる。ネコの場合、このことは、配列保存のみからの予測を使用するのではなく、機能検証の重要性を更に強調する。
機能の観点に加えて、変異が抗体配列に導入されるとき、その生物物理学的特性並びにプロテインＡ及び新生児型受容体（ＦｃＲｎ）への結合能などの他の特性を評価する必要がある。これらの特性は、導入された変異によって変化し得、変異が、改変領域以外の領域に影響を及ぼし得る抗体構造への確認的変化を引き起こす可能性があるため、しばしば予測不可能である。この目的のために、エフェクター機能（ＣＤＣ及びＡＤＣＣ）を完全に消失したイヌＩｇＧ－Ｂ変異バリアント、特にＤｅｆ２、３、７を、それらの生物物理学的特性（図７）並びにプロテインＡ及びＦｃＲｎ結合能（図８）の観点から広範囲に特徴付けた。ネコ、変異体バリアントについて、同様に、それらの生物物理学的特性（図１６）並びにプロテインＡ、ＦｃガンマＲ１及びＦｃＲｎ結合能（図１７）の観点から、変異体バリアントを特徴付けた。データは、変異バリアントが、研究及び治療の文脈で考慮すべき重要なパラメータであるこれらの特性を変化させないことを実証した。これらの特性の結果に基づいて、発見した変異体バリアントは本発明のものであり、既存のイヌ、ネコ、又はヒトについての文献に基づいて予測可能ではない。

Claims (49)

  1. 改変Ｆｃ領域を含む、イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／若しくは配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択されるアミノ酸置換、並びに／又は
    ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換を含み、かつ／あるいは
    ｃ）アミノ酸置換が、以下の改変：
    ｃ１）配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換と組み合わせた、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、
    ｃ２）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、
    ｃ３）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、又は
    ｃ４）ｃ１～ｃ３の組み合わせのうちの１つから選択され、
    前記Ｆｃ領域が、２つの置換、すなわち、配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換のみを有するＦｃ領域ではなく、前記Ｆｃ領域が、イヌＣＤ２０を結合するイヌ抗体のＦｃ領域である、前記イヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  2. 前記Ｆｃ領域が、以下のａ）に記載されるアミノ酸置換、並びに、任意選択的に、以下のｂ）及び／又は以下のｃ）に記載されるアミノ酸置換を含み、
    ａ）前記アミノ酸置換が、配列番号１１の１１９位におけるＧへの改変、配列番号１１の１２０位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換から選択され、
    ｂ）前記アミノ酸置換が、配列番号１１の１５３位におけるＧへの改変、配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換から選択され、かつ／あるいは
    ｃ）前記アミノ酸置換が、配列番号１１の２１１位におけるＨへの改変、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換から選択される、請求項１に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  3. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
    ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
    ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  4. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
    ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
    ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  5. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、
    ｂ）配列番号１１の１５３位におけるＧへのアミノ酸置換及び配列番号１１の１５４位におけるＲへのアミノ酸置換、並びに
    ｃ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  6. 前記Ｆｃ領域が、配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  7. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
    ｂ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  8. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、並びに
    ｂ）配列番号１１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  9. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１１９位におけるＧへのアミノ酸置換、
    ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  10. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１２０位におけるＡへの、及び１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、
    ｂ）配列番号１１の１５６位におけるＮへのアミノ酸置換、並びに
    ｃ）配列番号１１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  11. 前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号１１の１２０位におけるＳへのアミノ酸置換、並びに
    ｂ）配列番号１１の２１１位におけるＨへのアミノ酸置換、配列番号１１の２１２位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号１１の２１３位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  12. 前記ポリペプチドが、配列番号１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０、又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  13. 前記ポリペプチドが、野生型ＩｇＧ－Ｂ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、低減されたＦｃ媒介性エフェクター機能を有する、先行請求項に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  14. 前記エフェクター機能が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項１３に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  15. 前記エフェクター機能が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）である、請求項１３に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  16. 前記ポリペプチドが、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するより低い親和性を有する、先行請求項に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  17. 前記ポリペプチド又はＦｃ領域が、ＦｃＲｎ結合を保持する、先行請求項に記載のイヌＩｇＧ－Ｂポリペプチド若しくはイヌ化ＩｇＧ－Ｂポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  18. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド又はそのＦｃ領域を含む、薬学的組成物。
  19. エフェクター機能を抑制するためのインビトロ、エクスビボ、又はインビボ方法であって、細胞又は組織を、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド又はそのＦｃ領域と接触させることを含む、前記方法。
  20. 前記エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記エフェクター機能が補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である、請求項１９に記載の方法。
  22. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド又はそのＦｃ領域をコードする、核酸。
  23. 請求項２２に記載の核酸又はそのＦｃ領域を含む、ベクター。
  24. 請求項２２に記載の核酸又は請求項２３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  25. 請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくはそのＦｃ領域、又は請求項１８に記載の薬学的組成物を含むキット。
  26. 改変Ｆｃ領域を含む、ネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域であって、前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、並びに／あるいは
    ｂ）以下の改変：配列番号３１の２１７位におけるＳ若しくはＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む、ネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  27. 改変Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、
    ａ）配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換を含み、配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換のいずれかを更に含むか、又は
    ｂ）配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換を含み、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換、若しくは配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換のいずれかを更に含む、請求項２６に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  28. 前記Ｆｃ領域が、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＳへのアミノ酸置換を含む、改変Ｆｃ領域を含む、請求項２６又は２７に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  29. 前記Ｆｃ領域が、配列番号３１の１２０位におけるＡへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＡへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１５位におけるＧへのアミノ酸置換を含む、請求項２６又は２７に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  30. 前記Ｆｃ領域が、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の１２３位におけるＡへのアミノ酸置換、及び任意選択的に、配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換を含む、請求項２６又は２７に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  31. 前記Ｆｃ領域が、配列番号３１の１２０位におけるＩへのアミノ酸置換、配列番号３１の１２１位におけるＰへのアミノ酸置換、及び配列番号３１の２１７位におけるＡへのアミノ酸置換を含む、請求項２６又は２７に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  32. 前記ポリペプチドが、野生型ＩｇＧ－１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、低減されたＦｃ媒介性エフェクター機能を有する、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  33. 前記エフェクター機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  34. 前記エフェクター機能が補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）である、請求項３３に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  35. 前記ポリペプチドが、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む同じポリペプチドと比較した場合、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）に対するより低い親和性を有する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  36. 前記ポリペプチド又はＦｃ領域がＦｃＲｎ結合を保持する、請求項２６～３５のいずれか一項に記載のネコ若しくはネコ化ＩｇＧ－１ポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  37. 請求項２６～３６のいずれか一項に記載のポリペプチド又はそのＦｃ領域を含む、薬学的組成物。
  38. エフェクター機能を抑制するためのインビトロ、エクスビボ、又はインビボ方法であって、細胞又は組織を、請求項２６～３６のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくはそのＦｃ領域、又は請求項３７に記載の薬学的組成物と接触させることを含む、前記方法。
  39. 前記エフェクター機能が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記エフェクター機能が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である、請求項３９に記載の方法。
  41. 請求項２６～３６のいずれか一項に記載のポリペプチド又はそのＦｃ領域をコードする核酸。
  42. 請求項４１に記載の核酸を含むベクター。
  43. 請求項４１に記載の核酸又は請求項４２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  44. 請求項２６～３６のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくはそのＦｃ領域、又は請求項３７に記載の薬学的組成物を含む、キット。
  45. 疾患、例えば、炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療における使用のための、請求項２６～３６のいずれか一項に記載のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域、あるいは請求項３７に記載の薬学的組成物。
  46. 対象における疾患を治療する方法であって、有効量の請求項２６～３６のいずれか一項に記載のネコ若しくはネコ化ポリペプチド又はそのＦｃ領域、あるいは請求項３７に記載の薬学的組成物を含み、前記疾患が炎症性疾患又は自己免疫疾患であり得る、前記方法。
  47. 配列番号３３を含む、単離されたＩｇＧ－３ネコポリペプチド又はそのＦｃ領域。
  48. 請求項４７に記載のポリペプチドをコードする、単離されたＩｇＧ－３ネコポリヌクレオチド。
  49. 請求項４７に記載のポリペプチド又はそのＦｃ領域を含む、単離された組換え抗体。
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