JP2024518998A - Ｄｎａ合成の生物発光による検出 - Google Patents

Abstract

本明細書では、修飾ヌクレオチドをＤＮＡに組み込み、ＤＮＡ合成を検出するための試薬及び方法が提供される。特に、ハロアルキル修飾された核酸塩基は、生物発光性結合剤による検出のために核酸に組み込まれるように提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年５月１３日に出願した米国仮出願第６３／１８８，２５９号の利益を主張するものであり、これは参照により本明細書に組み込まれる。

分野
本明細書では、修飾ヌクレオチドをＤＮＡに組み込み、ＤＮＡ合成を検出するための試薬及び方法が提供される。特に、ハロアルキル修飾された核酸塩基は、生物発光性結合剤による検出のために核酸に組み込まれるように提供される。

様々な生存率アッセイを用いて生細胞の数の変化を測定することを含む、細胞増殖を測定するためのいくつかの方法及びキットが利用可能である。しかし、細胞増殖を測定するための最も直接的かつ正確な方法は、新規なＤＮＡの合成を測定することによるものである。最初に、これは放射性ヌクレオシド（例えばＨ－チミジン）の組み込みにより行われた。しかし、放射能を避けるために、修飾ヌクレオシド類似体、例えば、ブロモ－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）及び５－エチニル－２’－デオキシウリジン（Ｅｄｕ）を使用する他の非放射性方法が開発されてきた。細胞複製中、チミジンの代わりに、デオキシウリジンヌクレオシド類似体が複製ＤＮＡに組み込まれる。ＢｒｄＵの取り込みは、標準的なＥＬＩＳＡを用いた抗ＢｒｄＵ抗体によって検出する。Ｅｄｕはアルキン基を含み、蛍光プローブを含むアジドとの化学反応により検出される。

本明細書では、修飾ヌクレオチドをＤＮＡに組み込み、ＤＮＡ合成（及び／または細胞増殖）を検出するための試薬及び方法が提供される。特に、ハロアルキル修飾された核酸塩基は、生物発光性結合剤による検出のために核酸に組み込まれるように提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、式（Ｉ）の化合物：
またはその塩であって、式中、Ｂは核酸塩基または修飾された核酸塩基であり、これには、限定するものではないが、修飾されたアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシンが挙げられ；Ｌはリンカーであり；かつＡはハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、化合物またはその塩は、以下：
のうちの１つを含む。

いくつかの実施形態では、Ｌは、独立して、アルキル、環状アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、及び－Ｃ（Ｏ）－から選択される１つ以上の基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは、－（ＣＨ₂）_m－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－、及び－ＣＨ₂Ｏ－から選択される１つ以上の基を含み、式中、ｍは、１～６である。いくつかの実施形態では、Ｌは：
から選択され、式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して１～６である。いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｃ≡Ｃ－Ｌ’であり、式中、Ｌ’は、アルキル、環状アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ₂）_m－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－、及び－ＣＨ₂Ｏ－から選択され、式中、ｍは１～６である。いくつかの実施形態では、Ａは、Ｃ₂－Ｃ₁₂ハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ａは、－（ＣＨ₂）_n－Ｘであり、ここで、ｎは、４、５、６、７または８であり、Ｘは、ハロである。いくつかの実施形態では、Ｘは、ＣｌまたはＢｒである。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。いくつかの実施形態では、ＸはＣｌである。

いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、以下：
から選択され、式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、独立して１～６である。

いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、以下：
から選択され、式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、独立して１～６である。

いくつかの実施形態では、式（ＩＶ）の化合物は、以下：
から選択され、
式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、独立して１～６である。

いくつかの実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、以下：
から選択され、
式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、独立して１～６である。

いくつかの実施形態では、化合物は、以下：
から選択される。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるのは、式（ＩＶ）の化合物：
；またはその塩であり、式中、Ｌは、リンカーであり；かつＡは、ハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、及び－Ｃ（Ｏ）－から選択される１つ以上の基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは、－ＣＨ₂－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－及びフェニレンから選択される１つ以上の基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌは以下：
から選択され、式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して１～６である。いくつかの実施形態では、Ｌは以下：
から選択される。いくつかの実施形態では、Ａは、Ｃ₂－Ｃ₁₂－ハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｃ≡Ｃ－Ｌ’であり、式中、Ｌ’は、アルキル、環状アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ₂）_m－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－、及び－ＣＨ₂Ｏ－から選択され、式中、ｍは１～６である。いくつかの実施形態では、Ａは、式：
－（ＣＨ₂）_n－Ｘを有し；式中、ｎは、４、５、６、７または８であり、Ｘは、ハロである。いくつかの実施形態では、ｎは６であり、かつＸはクロロである。特定の実施形態では、化合物は、以下：
から選択される。いくつか実施形態では、化合物は、以下：
から選択され、
式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、独立して１～６である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、及びハロアルキル修飾デオキシウリジンを含むポリヌクレオチド鎖が提供される。他の実施態様では、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、ならびにハロアルキル修飾デオキシウリジン、ハロアルキル修飾デオキシアデノシン、ハロアルキル修飾デオキシシチジン、及びハロアルキル修飾デオキシグアノシンのうち１つ以上を含むポリヌクレオチドが提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるのは、核酸を標識する方法であって、本明細書中に記載のハロアルキル修飾デオキシヌクレオチドを、他のデオキシヌクレオチド、鋳型ＤＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼと含むことと、ＤＮＡポリメラーゼにより、本明細書中に記載のハロアルキル修飾デオキシヌクレオチド及び他のデオキシヌクレオチドを、新たに合成された標識核酸に組み込むことを可能にすることと、を含む方法である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ハロアルキル基により細胞内の核酸を識別する標識の方法であり、この方法は、本明細書に記載のハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドと細胞とを接触させることと、このハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドを、この細胞内に導入することとを含む。次いで、細胞機構は、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドをハロアルキル修飾デオキシヌクレオチド三リン酸に変換し、このハロアルキル修飾デオキシヌクレオチド三リン酸は、対応する未修飾ヌクレオチドの一部の代わりに、ＤＮＡ合成中に細胞の核酸に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドを含有する培地中で培養される。ハロアルキル修飾デオキシウリジンを利用する実施形態が本明細書で例示され、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドのより広い有用性を一般的に実証する。

いくつかの実施形態では、本明細書において、本明細書の方法により生成された核酸（例えば、１つ以上のハロアルキル修飾デオキシヌクレオチドを含む核酸）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書の方法によって生成された核酸を含む細胞が本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（細胞内の核酸を検出すること、ＤＮＡ合成をモニタリングすること、細胞増殖をモニタリングすることなどの）方法であって：（ａ）核酸をハロアルキル基で本明細書の方法により同定することと；（ｂ）細胞を溶解して、ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｃ）細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体のペプチド成分との第１の融合物；（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と、（Ｂ）発光複合体のポリペプチド成分との第２の融合物、ならびに（ｉｉｉ）発光複合体用の基質と接触させることと；（ｄ）発光複合体からの発光を検出することであって、発光が、発光複合体の形成を促進する核酸に沿った位置で第１の融合物と第２の融合物とを結合させることを可能にする核酸のハロアルキル組込みが十分な密度であることを示すことと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、第１の修飾デハロゲナーゼ酵素及び第２の修飾デハロゲナーゼ酵素は、配列番号１６と少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体のペプチド成分は、配列番号１０と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体のポリペプチド成分は、配列番号９と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体のペプチド成分は、配列番号１４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、蛍光複合体のポリペプチド成分は、配列番号１２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光性複合体用の基質は、セレンテラジン、フリマジン、またはセレンテラジンの類似体もしくは誘導体を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（細胞内の核酸を検出すること、ＤＮＡ合成をモニタリングすること、細胞増殖をモニタリングすることなどの）方法であって：（ａ）核酸をハロアルキル基で、本明細書の方法により標識することと；（ｂ）細胞内で：（ｉ）（例えば、以下の発現を誘導する）第１の融合物であって（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体のペプチド成分との第１の融合物と；（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と、（Ｂ）発光複合体のポリペプチド成分との第２の融合物とを発現することと、（ｃ）細胞を発光複合体用の基質と接触させることと；（ｄ）発光複合体からの発光を検出することであって、発光が、発光複合体の形成を促進する核酸に沿った位置で第１の融合物と第２の融合物とを結合させることを可能にする核酸のハロアルキル標識の密度が十分であることを示すことと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、第１の修飾デハロゲナーゼ酵素及び第２の修飾デハロゲナーゼ酵素は、配列番号１６と少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体のペプチド成分は、配列番号１０と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体のポリペプチド成分は、配列番号９と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体のペプチド成分は、配列番号１４と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、蛍光複合体のポリペプチド成分は、配列番号１２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光性複合体用の基質は、セレンテラジン、フリマジン、またはセレンテラジンの類似体もしくは誘導体を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（細胞内の核酸を検出すること、ＤＮＡ合成をモニタリングすること、細胞増殖をモニタリングすることなどの）方法であって：（ａ）核酸をハロアルキル基で本明細書の方法により修飾することと；（ｂ）細胞を溶解して、ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｃ）細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光タンパク質との融合物；ならびに（ｉｉｉ）発光複合体用の基質と接触させることと；（ｄ）発光タンパク質からの発光を検出することであって、発光がハロアルキル標識核酸の量と比例することと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、発光タンパク質のポリペプチド成分は、配列番号５と少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光タンパク質のための基質は、セレンテラジン、フリマジン、またはセレンテラジンの類似体もしくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、第１の修飾デハロゲナーゼ酵素及び第２の修飾デハロゲナーゼ酵素は、配列番号１６と少なくとも７０％（例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞内の核酸を検出する方法であって：（ａ）核酸をハロアルキル基で本明細書の方法により修飾することと；（ｂ）細胞を溶解して、ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｃ）細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体の第１のペプチド成分との第１の融合物；（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と、（Ｂ）発光複合体の第２のペプチド成分との第２の融合物；（ｉｉｉ）発光複合体のポリペプチド成分；及び（ｉｖ）発光複合体用の基質、と接触させることと；（ｄ）発光複合体からの発光を検出することであって、発光が、この発光複合体の形成を促進する核酸に沿った位置で第１の融合物と第２の融合物とを結合させることを可能にする核酸のハロアルキル標識が十分な密度であることを示すことと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、第１の修飾デハロゲナーゼ酵素及び第２の修飾デハロゲナーゼ酵素は、配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体の第１のペプチド成分は、配列番号１３と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体の第２のペプチド成分は、配列番号１５と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、蛍光複合体のポリペプチド成分は、配列番号１２と少なくとも７０％（例えば、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、発光複合体用の基質は、セレンテラジンまたはフリマジンを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞内でのハロアルキル標識核酸の検出方法であって、（ａ）細胞を溶解し、ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｂ）細胞溶解物を、（ｉ）ハロアルキル基と共有結合し得る修飾デハロゲナーゼ及び（ｉｉ）検出可能シグナルを生成し得るレポーターと接触させることと；（ｃ）修飾デハロゲナーゼを核酸上のハロアルキル基に結合させることと；（ｄ）レポーターから検出可能シグナル検出することと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼなど）、フルオロフォア（例えば、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ、ＦＡＭなど）、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、それらのバリアントなど）、または検出可能な酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼなど）である。いくつかの実施形態では、方法は、さらに、ハロアルキル標識核酸に結合していない修飾デハロゲナーゼに連結されたレポーターを洗い流すステップを、ステップ（ｃ）と（ｄ）との間に含む。

いくつかの実施態様では、本明細書中で提供されるのは、ハロアルキル標識核酸を細胞内で検出する方法であって：（ａ）細胞を溶解して、ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｂ）細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る修飾デハロゲナーゼと（Ｂ）レポーター複合体の第１の成分との第１の融合物、及び（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る修飾デハロゲナーゼと（Ｂ）レポーター複合体の第２の成分との第２の融合物と接触させることであって、検出可能な複合体は、第１の成分が第２の成分と接触しているかまたは物理的に近接していると、検出可能シグナルを生成し得る、接触させることと；（ｃ）修飾デハロゲナーゼを核酸上のハロアルキル基に結合させることと；（ｄ）レポーター複合体から検出可能なシグナルを検出することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、レポーター複合体は、分割ルシフェラーゼ（例えばＮＡＮＯＢＩＴ）、分割蛍光タンパク質（例えば、分割ＧＦＰ）、または分割検出可能酵素である。いくつかの実施形態では、「分割」とは、２つ以上の相補的なフラグメントとして存在するレポーターを指し；複合体の成分が一緒に結合される場合には、個々の成分よりも大きな検出可能なシグナルが生成される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ＢＲＥＴによる細胞内でのハロアルキル標識核酸の検出方法であって：（ａ）細胞を溶解し、ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｂ）細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）修飾デハロゲナーゼであって、（Ｂ）第１の波長で発光し得るレポーター、に連結されたハロアルキル基を共有結合し得る修飾デハロゲナーゼと、（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基を共有結合し得る修飾デハロゲナーゼと、（Ｂ）第１の波長及び発光スペクトルと重複する励起スペクトルを有するフルオロフォアと、接触させることと；（ｃ）この修飾デハロゲナーゼが核酸上のハロアルキル基に結合することを可能にすることと；（ｄ）フルオロフォアの発光スペクトル内の波長を検出することと、を含む方法である。
いくつかの実施形態では、レポーターはルシフェラーゼであり、基質と接触すると第１の波長で光を放出する。いくつかの実施形態では、方法はさらに、細胞溶解物をルシフェラーゼの基質と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、レポーターは蛍光タンパク質であり、蛍光タンパク質が蛍光タンパク質の励起スペクトル内の波長に曝露されると、第１の波長で光を放出する。いくつかの実施形態では、方法はさらに、細胞溶解物を蛍光タンパク質の励起スペクトル内の波長に曝露することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の方法で検出された発光（または他のレポータシグナル）の量は、新たに合成された核酸に組み込まれるハロアルキルヌクレオチドの量に比例する。いくつかの実施形態では、ハロアルキルヌクレオチドの組み込み量は、細胞内のＤＮＡ合成の速度に比例する。いくつかの実施形態では、細胞内のＤＮＡ合成速度は、細胞複製速度に比例する。いくつかの実施形態では、検出は、発光（または他のレポーターシグナル）の経時的なモニタリングを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を刺激に曝露させること、及び発光（または他のレポーターシグナル）に対する刺激の効果をモニタリングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、刺激は、細胞死速度、細胞複製速度、及び／またはＤＮＡ合成速度における改変（例えば、増加または減少）をもたらす。

本明細書に記載された例示的な方法のステップを示す概略図である。 ＰＢＩ－７９３１（上）及びＰＢＩ－７９６０（下）の分子構造。 ハロアルキル修飾ヌクレオシドを新たに合成したＤＮＡに組み込んだ後に検出される発光、及びＨＡＬＯＴＡＧ－ＮＡＮＯＢＩＴ融合を用いた検出。 ハロアルキル修飾ヌクレオシドの新たに合成されたＤＮＡへの組み込み、及びＨＡＬＯＴＡＧ－ＮＡＮＯＢｉＴ融合を用いた検出の後に、増大したドキソルビシンの発光の減少によって検出される、ドキソルビシンによるＤＮＡ合成の阻害。 修飾ヌクレオシドＰＢＩ－９３９１、ＰＢＩ－９３９２及びＰＢＩ－９３９３を新たに合成されたＤＮＡに組み込み、ＮａｎｏＢｉＴを介して検出した。 修飾ヌクレオシドＰＢＩ－９３９１、ＰＢＩ－９３９２、ＰＢＩ－９３９３及びＰＢＩ－７９６０を、新たに合成されたＤＮＡに同時に組み込み、ＮａｎｏＢｉＴを介して検出した。光出力の増大は、修飾ヌクレオシドの存在下で見られる。 修飾クロロアルカンヌクレオシドＰＢＩ－７９６０の組み込みを、ＤＮＡ変性なしで検出した。 修飾クロロアルカンヌクレオシドＰＢＩ－９１９１の組込みを、細胞固定またはＤＮＡ変性なしでＮａｎｏＢｉＴを用いて、細胞溶解物中で直接検出した。

定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。相反する場合、定義を含めて、本書類が優先する。好ましい方法及び材料については後述するが、本明細書に記載されるものと類似するまたは同等の方法及び材料も、本開示の実施または試験に使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照により、それらの全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示にすぎず、限定することは意図されない。

本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「し得る、できる（ｃａｎ）」、「含む、含有する、備える（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及びそれらの変形は、追加の行為または構造の可能性を排除しないオープンエンドな移行句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「及び」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別段指示されない限り、複数の参照を含む。本明細書の多くの実施形態は、オープンな「～を含む、含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて説明される。そのような実施形態は、「からなる」及び／または「から本質的になる」という閉鎖形式の複数の実施形態を包含しており、これらは代替的に、そのような文言を使用して特許請求または記載され得る。本開示はまた、明示的に記載されるか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる」、及び「から本質的になる」他の実施形態を企図する。

本明細書における数値範囲の列挙のために、それらの間に同じ程度の精度で介在する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲については、数字７及び８は、６及び９に加えて企図され、６．０～７．０の範囲については、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。

本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１～１６個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₆アルキル）、例えば１～１４個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₄アルキル）、１～１２個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₂アルキル）、１～１０個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₀アルキル）、１～８個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₈アルキル）、１～６個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₆アルキル）、または１～４個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₄アルキル）を含む直鎖状または分枝鎖状の飽和炭化水素鎖を意味する。アルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、３－メチルヘキシル、２，２－ジメチルペンチル、２，３－ジメチルペンチル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、及びｎ－ドデシルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「アルキレン」という用語は、１～１６個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₆アルキレン）、例えば１～１０個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₁₀アルキレン）、または１～６個の炭素原子（Ｃ₁－Ｃ₆アルキレン）の直鎖または分岐鎖の炭化水素から誘導される二価の基を指す。アルキレンの代表的な例としては、限定するものではないが、－ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ（ＣＨ₃）－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₂－、－ＣＨ₂ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－、及び－ＣＨ（ＣＨ₃）ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂－が挙げられる。

本明細書で使用されるとき、「アルケニル」という用語は、２～１６個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を意味する。アルケニルの代表的な例としては、限定するものではないが、エテニル、２－プロペニル、２－メチル－２－プロペニル、３－ブテニル、４－ペンテニル、５－ヘキセニル、２－ヘプテニル、２－メチル－１－ヘプテニル、及び３－デセニルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「アルケニレン」という用語は、２～１６個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の炭化水素から誘導され、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する二価の基を指す。アルケニレンの代表的な例としては、限定するものではないが、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂－、及び－ＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂－が挙げられる。

本明細書で使用されるとき、「アルキニル」という用語は、２～１６個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１個の炭素－炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルキニルの代表的な例としては、限定するものではないが、エチニル、プロピニル、及びブチニルが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「アルキニレン」という用語は、２～１６個の炭素原子の直鎖または分岐鎖の炭化水素から誘導され、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する二価の基を指す。アルキニレンの代表的な例としては、限定するものではないが、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ≡ＣＣＨ₂－、及び－ＣＨ₂Ｃ≡ＣＣＨ₂－が挙げられる。

本明細書において用いる場合、「アリール」という用語は、フェニル基または二環式もしくは三環式芳香族縮合環系を指す。二環縮合環系の例は、親分子部に付加され、フェニル基に縮合したフェニル基である。三環縮合環系の例は、親分子部に付加され、２つの他のフェニル基に縮合したフェニル基である。二環式アリールの代表的な例としては、限定するものではないが、ナフチルが挙げられる。三環式アリールの代表的な例としては、限定するものではないが、アントラセニル及びフェナントレニルが挙げられる。

本明細書において用いる場合、「アリーレン」という用語は、二価のアリール基、例えばフェニレン基（例えば、１，２－フェニレン、１，３－フェニレン及び１，４－フェニレン）を指す。

本明細書で使用される「ハロゲン」及び「ハロ」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。

本明細書中で使用されるように、「ハロアルキル」という用語は、本明細書中で定義されるように、１個以上の水素原子がハロゲンで置き換えられているアルキル基を意味する。例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８個の水素原子は、ハロゲンによって置き換えられていてよく、または全ての水素原子は、ハロゲンによって置き換えられていてもよい。ハロアルキルの代表的な例としては、限定するものではないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、２－フルオロエチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、パーフルオロエチル、２－フルオロ－２－メチルプロピル、３，３，３－トリフルオロプロピル、４－クロロブチル、５－クロロペンチル、６－クロロヘキシル、７－クロロヘプチル及び８－クロロオクチルが挙げられる。

置換基が、左から右に記載されるそれらの従来の化学式によって特定される場合、これらは、右から左に構造を記載することによって生じる置換基を包含するものとし、例えば、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－はまた、－ＯＣＨ₂ＣＨ₂－も指し、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－はまた、－ＮＨＣ（Ｏ）－も指し、そして－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－はまた、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－も指すものとする。

本明細書で使用される場合、化学構造において、表示：
は、ある部分が別の部分に結合した点（例えば、コア化合物への置換基）を表す。

「生物発光」とは、酵素、タンパク質、タンパク質複合体、または他の生体分子（例えば、生物発光複合体）によって触媒されるかまたはそれによって可能になる化学反応による光の生成及び放出を指す。典型的な実施形態では、生物発光実体のための基質（例えば生物発光タンパク質または生物発光複合体）は、生物発光実体によって不安定な形態に変換され；続いて、基質は光を放出する。

「相補的」とは、互いにハイブリダイズするか、二量体化するか、またはその他の形で複合体を形成し得る２つ以上の構造要素（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子等）の特性を指す。例えば、「相補的なペプチド及びポリペプチド」は、一緒になって１つの複合体を形成し得る。相補的要素は、例えば、相補性のために適切な立体配座にその要素を置き、相補性の要素の位置を共同で決定し、相補性のために相互作用エネルギーをより低くするなどの、複合体（例えば、相互作用要素由来）を形成するための支援を必要とする場合がある。

「複合体」とは、互いに直接的及び／または間接的に接触している分子（例えば、ペプチド、ポリペプチドなど）の集合体または凝集体を指す。１つの態様において、「接触する」または特により具体的には「直接接触」とは、ファン・デル・ワールス力、水素結合、イオン性及び疎水性相互作用などの引力のある非共有相互作用が分子の相互作用を支配するように、２つ以上の分子が十分に近いことを意味する。そのような態様では、分子（例えば、ペプチド及びポリペプチド）の複合体は、この複合体が熱力学的に有利になるように（例えば、その構成分子の非凝集状態または非錯化状態と比較して）アッセイ条件下で形成される。本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、特に記載のない限り、２つ以上の分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせ）の集合体を指す。

「フラグメント」とは、より大きな全実体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素など）の解離または「フラグメンテーション」により得られるペプチドもしくはポリペプチド、またはそのまま同じ配列を有するように調製されたペプチドもしくはポリペプチドを指す。したがって、フラグメントとは、そのフラグメントが生成及び／または設計される全実体（例えば、タンパク質、ポリペプチド、酵素など）のサブシーケンスである。既存の全タンパク質のサブシーケンスではないペプチドまたはポリペプチドはフラグメントではない（例えば、既存のタンパク質のフラグメントではない）。「既存の生物発光タンパク質のフラグメントではない」ペプチドまたはポリペプチドは、（１）ペプチドまたはポリペプチドの設計及び／または合成の前に物理的に存在しており、（２）実質的な生物発光活性を示すタンパク質（例えば天然または合成）のサブシーケンスではないアミノ酸鎖である。

本明細書で使用される「細胞不透過性」とは、有効量の化合物または部分が細胞内に送達される程度まで細胞膜を通過することができない化合物または部分を指す。

本明細書で使用される「細胞透過性」とは、有効量の化合物が細胞内に送達される程度まで細胞膜を通過できる化合物または部分を指す。

本明細書で使用される「セレンテラジン」とは、天然に存在する（「天然」）セレンテラジンを指す。本明細書で使用される「セレンテラジン類似体」または「セレンテラジン誘導体」という用語は、合成（例えば、誘導体またはバリアント）及びその天然類似体を指し、これには、フリマジン、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、ビス－デオキシセレンテラジン（「セレンテラジン－ｈｈ」）、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、及び２－メチルセレンテラジンが、ＷＯ２００３／０４０１００号；米国特許出願公開、第１２／０５６，０７３（段落［００８６］）、米国特許第８，６６９，１０３号；ＷＯ２０１２／０６１５２９号、米国特許出願公開２０１７／０２３３７８９号及び米国特許出願公開第２０１８／００３００５９（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものに加えて、挙げられる。いくつかの実施形態では、セレンテラジン類似体としては、例えば、米国特許出願公開第１２／０５６，０７３；米国特許出願公開第２０１２／０７０７８４９号；米国特許出願公開第２０１４／００９９６５４号（その内容全体を参照により本明細書に援用する）に記載されているようなプロ基質が挙げられる。

本明細書で使用される「ペプチド」及び「ポリペプチド」とは、特に断らない限り、ペプチドアミド結合（－－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－－）によって主鎖を介して結合した２つ以上のアミノ酸のポリマー化合物を指す。「ペプチド」という用語は、一般的に、短いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個より少ないアミノ酸を有する鎖）を指すのに対して、「ポリペプチド」という用語は、一般的に、より長いアミノ酸ポリマー（例えば、２５個より多いアミノ酸を有する鎖）を指す。

本明細書で使用される「試料」、「試験試料」、「検体」、「対象由来の試料」、及び「患者試料」とは、交換可能に使用されてもよく、全血、組織、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞もしくは組織、内皮細胞、白血球、または単球などの血液の試料であってもよい。試料は、患者から得て直接使用してもよく、または濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害成分の不活性化、試薬の添加等によって前処理して、本明細書で考察されているか、そうでなければ当該技術分野で知られている通りに何らかの方法で試料の性質を改変してもよい。

「配列同一性」とは、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）がモノマーサブユニットの同じ配列組成を有する程度を指す。「配列類似性」という用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）が類似のポリマー配列を有する程度を指す。例えば、類似のアミノ酸は、同じ生物物理学的特徴を共有し、かつそのファミリーに分類され得るアミノ酸、例えば、酸性（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び無電荷極性アミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）である。「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）とは、（１）比較のウインドウ（例えば、長い配列の長さ、短い配列の長さ、指定されたウインドウ）にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、（２）同一の（または類似の）モノマーを含む位置（例えば、両方の配列で同一のアミノ酸が発生する、両方の配列で類似のアミノ酸が発生する）の数を決定して、マッチした位置の数を得ること、（３）マッチした位置の数を、比較ウインドウ（例えば、長い配列の長さ、短い配列の長さ、指定されたウインドウ）の位置の総数で除算すること、ならびに（４）その結果に１００を乗算して、パーセント配列同一性またはパーセント配列類似性を得ること、によって計算される。例えば、ペプチドＡ及びペプチドＢが両方とも２０アミノ酸の長さであり、かつ１つの位置を除いて全て同一のアミノ酸を有するならば、ペプチドＡ及びペプチドＢは、９５％の配列同一性を有する。非同一位置のアミノ酸が同じ生物物理学的特性（例えば、双方とも酸性であった）を共有する場合、ペプチドＡ及びペプチドＢは、１００％の配列類似性を有するであろう。別の例として、ペプチドＣが長さ２０アミノ酸であり、ペプチドＤが長さ１５アミノ酸であり、ペプチドＤの１５アミノ酸のうちの１４がペプチドＣの一部のアミノ酸と同一であるならば、ペプチドＣ及びＤは、７０％の配列同一性を有するが、ペプチドＤは、ペプチドＣの最適な比較ウインドウに対して９３．３％の配列同一性を有する。本明細書における「パーセント配列同一性」（または「パーセント配列類似性」）を計算する目的では、整列された配列における全てのギャップは、その位置でミスマッチとして扱われる。

本明細書で使用される「対象」及び「患者」とは、同義で、任意の脊椎動物を指し、この脊椎動物としては、限定するものではないが、哺乳類及びヒトが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象はヒトであっても、または非ヒトであってもよい。対象または患者は、治療形態を受けていてもよい。本明細書において用いる場合、「哺乳類」とは、哺乳類クラスの任意のメンバー、例としては、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、例えば、チンパンジー、ならびに他の類人猿及びサル種；家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、ラクダ及びウマ；飼育動物、例えば、イヌ、及びネコ；げっ歯類を含む実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどが挙げられる。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。従って、雌雄にかかわらず、成年、及び新生対象、ならびに胎児がこの用語の範囲内に包含されることが意図される。

「サブシーケンス」とは、別のより大きなペプチドまたはポリペプチドと１００％の配列同一性を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。このサブシーケンスは、より大きなアミノ酸鎖の一部について完全な配列一致である。

本明細書で使用される「実質的に」とは、列挙された特性、パラメーター、及び／または値が、必ずしも正確に達成される必要はないが、特性によって提供されることが意図されている効果を妨げない程度に、例えば、公差、測定誤差、測定精度の限界、及び当業者に公知の他の要因を含む偏差または変動が生じ得ることを意味する。実質的に存在しない（例えば、実質的に非発光）特性または特徴は、ノイズ内であるか、バックグラウンド下であるか、使用されているアッセイの検出能力を下回るか、または有意な特性（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体の発光強度）のわずかな部分（例えば、＜１％、＜０．１％、＜０．０１％、＜０．００１％、＜０．００００１％、＜０．０００００１％、＜０．００００００１％）であってもよい。

詳細な説明
本明細書では、修飾ヌクレオシドをＤＮＡに組み込み、ＤＮＡ合成を検出するための試薬及び方法が提供される。特に、ハロアルキル修飾されたヌクレオチドは、生物発光性結合剤による検出のために核酸に組み込まれるように提供される。

いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾ヌクレオシド試薬（例えば、ハロアルキル修飾デオキシウリジン、ハロアルキル修飾デオキシシチジンなど）を、レポーター剤（例えば、ハロアルキル基を結合する修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）及び検出可能レポーター要素（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ、ＮＡＮＯＢＩＴ、及び／またはＮＡＮＯＴＲＩＰ技術）と組み合わせて、ＤＮＡ合成を検出するための使用が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、増殖培地中に存在するハロアルキル修飾ヌクレオシドは、細胞に入ることができる。細胞内で、細胞機構は、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドをハロアルキル修飾デオキシヌクレオチド三リン酸に変換する。次いで、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオチド三リン酸は、分割（増殖）細胞内で新たに合成されたＤＮＡに組み込まれる。ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えば、デオキシウリジン－クロロアルカン、デオキシグアノシンブロモアルケンなど）を含有する培地中で細胞を培養すると、ヌクレオチド類似体が細胞に取り込まれ、ヌクレオチド三リン酸類似体に変換されて、新たに合成されたＤＮＡに有意な頻度で取り込まれる。例えば、増殖培地中に存在するハロアルキル修飾デオキシウリジン（本明細書に記載されるように）は、細胞に入ることができる。細胞は、ハロアルキル修飾デオキシウリジンをハロアルキル修飾ウリジン－５’－三リン酸に変換する。ウリジンの場合、ハロアルキル修飾ウリジン－５’－三リン酸を、デオキシチミジン三リン酸の一部の代わりに、増殖細胞の新たに合成したＤＮＡに組み込む。ハロアルキル修飾ヌクレオシド含有培地（例えば、デオキシウリジン－クロロアルカン含有培地）を除去した後、細胞を溶解し、ハロアルキル基質（例えば、クロロアルカン（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ））及び検出可能なレポーター（例えば、フルオロフォア、ルシフェラーゼ（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ）、または発光複合体の成分（例えば、ＮＡＮＯＢＩＴ、ＮＡＮＯＴＲＩＰ成分）に共有結合している修飾デハロゲナーゼの融合を用いて、修飾ヌクレオシド（例えば、デオキシ－ウリジン－クロロアルカン）の組み込みを検出する。いくつかの実施形態では、精製されたＨＡＬＯＴＡＧ－ＬｇＢｉＴ（ＨＴ－ＬｇＢｉＴ）及びＨＡＬＯＴＡＧ－ＳｍＢｉＴ（ＨＴ－ＳｍＢｉＴ）は、ハロアルキル修飾ヌクレオチドの新たに合成したＤＮＡへの組み込みを検出するための試薬として使用される。いくつかの実施形態では、核酸中の修飾されたヌクレオチドへのレポーター融合物（例えばＨＴ－ＮＡＮＯＬＵＣ）の結合は、合成された核酸の検出（したがって、ＤＮＡ合成及び／または細胞増殖の検出）を可能にする。いくつかの実施形態では、合成された核酸中の修飾ヌクレオチドに結合したレポーター融合物（例えばＨＴ－ＮＡＮＯＬＵＣ）の量は、核酸の定量（したがって、ＤＮＡ合成及び／または細胞増殖の量の定量）を可能にする。ハロアルキル結合部分（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）と、生物発光複合体の成分（例えば、ＮＡＮＯＢＩＴまたはＮＡＮＯＴＲＩＰ成分）とを各々が含む２つ以上の異なるレポーター融合が使用される実施形態では、検出は、ハロアルキル修飾ヌクレオチドがＤＮＡに有意に組み込まれる場合、２つのハロアルキル修飾ヌクレオチドが、生物発光複合体の成分の容易な補完を観察するのに十分な頻度で十分に近接して存在すると仮定することに基づく。例えば、ＨＴ－ＳｍＢｉＴ及びＨＴ－ＬｇＢｉＴが隣接または近傍のヌクレオチドに結合すると、２つのＢｉＴは一緒になって活性ルシフェラーゼ複合体を生成し、その後その活性を検出することができる。２つのＨＴ－ＳｍＢｉＴまたは２つのＨＴ－ＬｇＢｉＴの実体の非相補的で近接した結合が起こる一方で、相補的な結合の頻度は、検出を可能にするのに十分である。ルシフェラーゼ基質の存在下では、細胞増殖の直接的な指標である細胞内へのハロアルキル修飾ヌクレオチドの取り込み量に直接比例して発光が生じる。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ合成モニタリング法に用途を見出す、ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えば、ハロアルキル修飾デオキシウリジン、ハロアルキル修飾デオキシアデノシン、ハロアルキル修飾デオキシシチジン；ハロアルキル修飾デオキシグアノシンなど）である。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、式（Ｉ）の化合物：
またはその塩であって、式中：Ｂは核酸塩基または修飾された核酸塩基であり、これには、限定するものではないが、修飾されたアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシンが挙げられ；Ｌはリンカーであり；かつＡはハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｂは以下から選択される：
例えば、Ｂがウラシルである場合、本明細書の特定の実施形態は、式（ＩＶ）のハロアルキル修飾ヌクレオシド：
またはその塩を提供し、式中、Ｌは、リンカーであり、かつＡは、ハロアルキル基である。本明細書における実験によって、ハロアルキル修飾デオキシウリジンヌクレオシドの細胞内でのＤＮＡ合成への組み込み、及びそれから生成される核酸の検出／定量が実証される。このような実験によって、本明細書のアッセイ及びシステムにおけるハロアルキル修飾ヌクレオシドの使用が実証される。本明細書における実施形態は、ハロアルキル修飾デオキシウリジンヌクレオシドの使用に限定されない。いくつかの実施形態では、Ｂは、グアニン、アデニン及び／またはシトシンであり、ハロアルキル修飾ヌクレオシドは、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び／または（Ｖ）：
；またはそれらの塩のうちの１つ以上で提供され、式中、Ｌは、リンカーであり、かつＡは、ハロアルキル基である。

基Ｌは、リンカーである。広範な種類のリンカーを、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）及び／または（Ｖ）の化合物において使用し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、及び－Ｃ（Ｏ）－から独立して選択される１つ以上の基を含む。例えば、リンカーは、かかる基の様々な組み合わせを含み、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、エステル（－Ｃ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、及び／またはオリゴ－及びポリ－エチレングリコール（－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_x－）結合などを有するリンカーを提供し得る。例えば、いくつかの実施形態では、Ｌは、－ＣＨ₂－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－及びフェニレンから選択される１つ以上の基を含む。いくつかの実施形態では、前述の任意の官能基を、本明細書の化合物及び方法で使用するのに適した任意のリンカーで組み合わせてもよい。そのようなリンカー及びそのようなリンカーを組み込んだ化合物の例は、本明細書で提供される。しかし、本明細書の範囲内の実施形態は、本明細書で提供される特定の実施例に限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーは、２個以上の原子（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００個の原子、またはそれらの間のあらゆる範囲（例えば、２～２０、５～１０、１５～３５、２５～１００など）の２～２００個の原子）を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、リンカーＬは、以下から選択される式を有する：
いくつかの実施形態では、Ｌは、Ｃ≡Ｃ－Ｌ’であり、ここで、Ｌ’は、アルキル、環状アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ₂）_m－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－、及び－ＣＨ₂Ｏ－から選択され、式中、ｍは１～６である。

いくつかの実施形態では、Ａは、ハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ａは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ及びＩから選択される末端ハロゲンを含む。いくつかの実施形態では、末端ハロゲンはＣｌである。いくつかの実施形態では、末端ハロゲンはＢｒである。いくつかの実施形態では、Ａは、（ＣＨ２）ｎなどの適切なアルキル鎖を含み、式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれより大きい。いくつかの実施形態では、Ａは、Ｃ₂－Ｃ₁₂－ハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ａは、－（ＣＨ₂）_n－Ｘであり、式中、ｎは、４、５、６、７または８であり、Ｘは、ハロである。いくつかの実施形態では、ＸはＣｌまたはＢｒである。いくつかの実施形態では、ｎは、６である。いくつかの実施形態では、ＸはＣｌである。

いくつかの実施形態では、式（Ｉａ）化合物が提供され：
式中、Ｌ’は、リンカーである。リンカーＬ’は、リンカーＬについて本明細書に記載されている任意の基であり得る（例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、エステル（－Ｃ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、オリゴ－及びポリ－エチレングリコール（－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_x－）連結、－ＣＨ₂－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－、フェニレン、などから独立して選択される１つ以上の基を含んでもよい）。例えば、Ｌ’は、以下から選択される式を有していてよい：
いくつかの実施形態では、Ｃ≡Ｃ－Ｌ’は以下：
から選択され、式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して１～６である。いくつかの実施形態では、Ａは、本明細書に記載されるハロアルキル基である。基Ａは、ハロアルキル基である。例えば、いくつかの実施形態では、Ａは、Ｃ₂－Ｃ₁₂ハロアルキル基、例えばＣ₂－Ｃ₁₀ハロアルキル基またはＣ₂－Ｃ₈ハロアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ａは式－（ＣＨ₂）_n－Ｘを有し、式中、ｎは、４、５、６、７または８であり、かつＸは、ハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）である。いくつかの実施形態では、ＸはＣｌである。いくつかの実施形態では、ｎは６であり、かつＸはＣｌであり、その結果、Ａは式－（ＣＨ₂）₆－Ｃｌを有する。いくつかの実施形態では、ハロアルキル基は、変異体デハロゲナーゼとの相互作用を妨げない置換基でさらに置換され得る。

このような実施態様では、Ａは、デハロゲナーゼの基質、例えば、ハロアルカンデハロゲナーゼである。その基質（例えばハロアルキル基質）に共有結合する変異体ヒドロラーゼ（例えば、変異体デハロゲナーゼ）を含むシステムが、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号；米国特許第７，４２５，４３６号；米国特許第７，４２９，４７２号；米国特許第７，８６７，７２６号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。ＨＡＬＯＴＡＧは、ハロアルキル基質と安定な（例えば、共有結合した）結合（例えば、エステル結合）を形成する、市販の修飾デハロゲナーゼ酵素であり、これは本明細書の実施形態で用途を見出す。

いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるのは、式（ＩＩａ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶａ）、またはＶａ）の化合物：
であり；式中、Ａは、本明細書に記載されているハロアルキル基であり、Ｌ’は、リンカーＬについて本明細書に記載されている任意の基を含むリンカーである（例えば、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、アミド（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）、カルバメート（－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－）、エステル（－Ｃ（Ｏ）Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ－）、オリゴ－及びポリ－エチレングリコール（－（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）_x－）連結、－ＣＨ₂－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－、フェニレン、などから独立して選択される１つ以上の基を含んでもよい）。例えば、Ｌ’は、以下から選択される式を有してもよい：
いくつかの実施形態では、－Ｃ≡Ｃ－Ｌ’は以下：
から選択され、式中、ｐ、ｑ、ｒ及びｓは、それぞれ独立して１～６である。

いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾ヌクレオシドは、本明細書において、例えば上記のように提供される。他の実施形態では、ハロアルキル修飾された核酸塩基が提供される：
特定の実施形態では、ハロアルキル修飾ヌクレオチド一リン酸、例えば：
が提供される。いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾ヌクレオチド三リン酸が提供される：
ハロアルキル修飾された核酸塩基、ハロアルキル修飾されたヌクレオチド一リン酸、及びハロアルキル修飾されたヌクレオチド三リン酸の場合、Ｂ（存在する場合）は、以下から選択され：
、及び、Ａ及びＬは、ハロアルキル修飾ヌクレオシドについて本明細書に記載されたＡ基及びＬ基のいずれかから選択される。

特定の実施形態では、式（ＩＶ）の化合物が提供される。そのような実施形態を本明細書で十分に例示しており、本明細書の組成物及び方法におけるハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドの使用を実証する。

式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＩＶｄ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）、及び（Ｖｄ）の化合物は、塩の形態であってもよい。酸性塩は、化合物の最終的な単離及び精製の間に調製されてもよく、または化合物の適切な基、例えばアミノ基を適切な酸と反応させることによって別々に調製されてもよい。例えば、化合物は、限定するものではないが、メタノール及び水などの適切な溶媒に溶解され、少なくとも１当量の酸、例えば、塩酸で処理され得る。得られた塩は沈殿し、濾過により単離され、減圧下で乾燥され得る。あるいは、溶媒及び過剰の酸を減圧下で除去して、塩を提供してもよい。代表的な塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、イセチオン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルタミン酸塩、パラ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等が挙げられる。化合物のアミノ基はまた、塩化アルキル、臭化物、及びヨウ化物、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ラウリル、ミリスチル、ステアリルなどで４級化されてもよい。

塩基性付加塩は、カルボキシル基と、適切な塩基、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、もしくはアルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩、または有機第一級、第二級もしくは第三級アミンとの反応により、開示される化合物の最終的な単離及び精製の間に調製され得る。第四級アミン塩、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェンアミン、及びＮ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン等から誘導される塩が調製され得る。

本明細書の化合物は、スキーム１及びスキーム２に示したものを含む様々な方法によって合成され得る。

スキーム１に記載されているように、プロパギルアルコールをｐ－ニトロフェニルクロロホルマートで活性化させ、次いでクロロヘキシル－ＰＥＧ２－アミンと反応させて、プロパギルヘキシル－クロロ－ＰＥＧ２－カルバメートを得た。プロパギルヘキシル－クロロ－ＰＥＧ２－カルバメートを、パラジウムテトラキス及びＣｕＩにより触媒される５－ヨード－ｄＵに結合させて、化合物ＰＢＩ ７９３１を生成した。

ＰＢＩ ７９６０は、スキーム２に記載されている方法を使用することによって得た。標準的なＨＡＴＵカップリング条件下でテレフタル酸をヘキシルクロロ－ＰＥＧ２－アミンに結合させて、４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸を得た。４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸を、ＴＳＴＵによって活性化し、次いでプロパギルアミンと反応させて、Ｎ１－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）－Ｎ４－（プロパ－２－イン－１－イル）テレフタルアミドを生成した。Ｎ１－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）－Ｎ４－（プロパ－２－イン－１－イル）テレフタルアミドを、パラジウムテトラキス及びＣｕＩにより触媒される５－ヨード－ｄＵに結合させて、化合物ＰＢＩ ７９６０を生成した。

化合物（例えば、または式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＩＶｄ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）及び／または（Ｖｄ））、ならびに中間体を、有機合成の当業者に周知の方法によって単離及び精製し得る。化合物を単離及び精製するための慣用の方法の例は、例えば、Ｆｕｒｎｉｓｓ、Ｈａｎｎａｆｏｒｄ、Ｓｍｉｔｈ、及びＴａｔｃｈｅｌｌによる、“Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）、ｐｕｂ． Ｌｏｎｇｍａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ， Ｅｓｓｅｘ ＣＭ２０ ２ＪＥ， Ｅｎｇｌａｎｄに記載されているような、任意の活性炭による前処理を用いた高温または低温での再結晶、薄層クロマトグラフィー、様々な圧力での蒸留、真空下での昇華、及び摩砕によるシリカゲル、アルミナ、またはアルキルシラン基で誘導体化されたシリカなどの固体担体でのクロマトグラフィーを含み得るがこれらに限定されない。

個々のステップごとの反応条件及び反応時間は、使用される特定の反応物及び使用される反応物中に存在する置換基に応じて変化し得る。反応は、従来の方法で、例えば残留物から溶媒を除去することにより後処理されてもよく、さらに、限定するものではないが、結晶化、蒸留、抽出、摩砕及びクロマトグラフィーなどの当該技術分野で一般的に公知の方法に従って精製されてもよい。別段の記載がない限り、出発材料及び試薬は、市販されているか、または化学文献に記載された方法を用いて市販されている材料から当業者により調製され得る。

反応条件の適切な操作、合成経路の試薬及び順序、反応条件と適合し得ない任意の化学的機能の保護、及び方法の反応順序における適切な時点での脱保護を含む日常的な実験が、本開示の範囲に含まれる。適切な保護基、及びそのような適切な保護基を使用して異なる置換基を保護及び脱保護する方法は、当業者に周知であり、その例は、Ｇｒｅｅｎｓの書籍、表題Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４^th ｅｄ．）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（２００６）に記載されているＰＧＭ Ｗｅｔｓ ａｎｄ ＴＷ Ｇｒｅｅｎｅに見出すことができ、その全体が参照により本明細書に援用される。本開示の化合物の合成は、本明細書に記載された合成方式及び特定の実施例に記載されたものと類似の方法によって達成することができる。

本開示の化合物のいくつかは、少なくとも１つの不斉中心を有する。様々な置換基の性質に応じて、追加の不斉中心が存在し得る。不斉中心を有する化合物は、エナンチオマー（光学異性体）、ジアステレオマー（立体配置の異性体）またはその両方を生じさせ、かつ混合物中及び純粋なまたは部分的に精製された化合物における考えられるエナンチオマー及びジアステレオマーのすべてが本開示の範囲内に含まれることが意図される。

エナンチオマーもしくはジアステレオマーに富んだ化合物の独立した合成またはそれらのクロマトグラフィー分離は、本明細書に開示された方法の適切な改変によって、当該技術分野で知られている通りに達成され得る。化合物の絶対立体化学は、Ｘ線結晶構造解析を使用して、必要に応じて、既知の絶対配置の不斉中心を含む試薬で誘導体化された結晶性生成物または結晶性中間体の結晶構造を決定することによって決定され得る。

必要に応じて、化合物のラセミ混合物を分離することができ、それにより個々のエナンチオマーが単離される。この分離は、化合物のラセミ体混合物をエナンチオマーとして純粋な化合物にカップリングさせてジアステレオマー混合物を形成し、次に個々のジアステレオマーを分別結晶化またはクロマトグラフィーなどの標準的な方法で分離するなどの、当該技術分野で周知の方法によって行うことができる。カップリング反応は、多くの場合、エナンチオマーとして純粋な酸または塩基を使用した塩の形成である。次いで、ジアステレオマー誘導体は、付加されたキラル残基の開裂により純粋なエナンチオマーへと転化され得る。化合物のラセミ混合物はまた、当該技術分野で周知の方法であるキラル固定相を用いたクロマトグラフィー法によって直接分離されてもよい。あるいは化合物の任意のエナンチオマーは、光学純粋な出発材料または当該技術分野で周知の方法による公知の立体配置の試薬を用いた立体選択的合成によって得てもよい。

本開示はまた、アイソトープで標識された化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＩＶｄ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）、（Ｖｄ）などの同位体標識された化合物）を含み、これは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＩＶｄ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）、及び（Ｖｄ）、等に挙げられる化合物と同一だが、１つ以上の原子が、通常の自然界で見られる原子質量または質量数と異なる原子質量または質量数を有する原子に置き換えられるという事実がある。開示の化合物に組み込むのに適した同位体の例は、それぞれ、限定するものではないが、²Ｈ、³Ｈ、¹³Ｃ、¹⁴Ｃ、¹⁵Ｎ、¹⁸Ｏ、³¹Ｐ、³⁵Ｓ、¹⁸Ｆ、及び³⁶Ｃｌなどの水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、及び塩素である。同位体標識された式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉｄ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｄ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（ＩＶｄ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（Ｖｃ）、（Ｖｄ）、などの化合物は、一般的に、当業者に公知の従来の技法により、または同位体標識されていない試薬の代わりに適切な同位体標識された試薬を使用することによって、本明細書に記載されるプロセスに類似するプロセスにより調製され得る。

本開示は、新たに合成されたＤＮＡへのハロアルキル修飾ヌクレオシドの組込みをモニタリングすることにより、ＤＮＡ合成を検出及び／または測定するためのアッセイ、システム及び方法を提供する。これらの実施形態によれば、本開示は、ハロアルキル修飾ヌクレオシドが組み込まれたＤＮＡを検出及び／または定量するための材料及び方法を提供する。いくつかの実施形態では、生物発光／蛍光ポリペプチド及び／または生物発光／蛍光複合体は、ＤＮＡ上のハロアルカンに共有結合するタンパク質剤（例えば、修飾されたハロ－アルカンデヒドロゲナーゼタンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）等）を用いて、ＤＮＡ上のハロアルキル標識に結合される。

いくつかの実施形態では、細胞または細胞溶解物を用いたハロアルキル含有ＤＮＡの検出のためのバイオアッセイに関連する物質及び方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ハロアルキル標識ＤＮＡ（例えば、ハロアルキル修飾ヌクレオシドを含む）と、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ、ＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼのルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；米国特許第８，５５７，９７０号；米国特許第８，６６９，１０３号；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＮＡＮＯＢｉＴ（Ｕ．Ｓ．９，７９７，８８９号；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ＮａｎｏＴｒｉｐ（米国特許出願公開第２０２０／０２７０５８６号；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及び／または他の多部生物発光技術（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／３６８４４；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／６２４９９及び米国出願番号１７／１０５，９２５号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に基づく（例えば、構造的、機能的などに）生物発光ポリペプチド及び／または生物発光複合体（複合体形成時に発光が増強されるペプチド（複数可）及び／またはポリペプチド成分の）とを組み込んだバイオアッセイである。本明細書に記載の通り、バイオアッセイは、市販のＮＡＮＯＬＵＣベース技術（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼ、ＮａｎｏＢＲＥＴ、ＮＡＮＯＢｉＴ、ＮａｎｏＴｒｉｐ、ＮＡＮＯＧＬＯ等）を組み込むことができるが、他の実施形態では、市販のＮＡＮＯＬＵＣベース技術からの様々な組み合わせ、変形、または誘導体が利用される。

ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３３４４９、米国特許第８，５５７，９７０号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／２０１１／０５９０１８及び米国特許第８，６６９，１０３号（その各々は、参照によりその全体があらゆる目的で本明細書に組み込まれる）には、生物発光ポリペプチドを含む組成物及び方法が記載されている。そのようなポリペプチドは、本明細書の実施形態において用途を見出し、本明細書に記載の組成物、アッセイ、及び方法と併せて使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物、アッセイ、及び方法は、配列番号５の、または配列番号５と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有する生物発光ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、前述の生物発光ポリペプチドのいずれかは、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）に結合するか（例えば、融合、化学的に結合するか等）、または相補的結合パートナーから構成される別のシステムを利用する。

天然型Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓルシフェラーゼ（ＯｇＬｕｃ）及び市販のＮＡＮＯＬＵＣルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、それぞれ１０本のβ（ベータ）鎖（β１、β２、β３、β４、β５、β６、β７、β８、β９、β１０）のポリペプチドを含む。米国特許第９，７９７，８８９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、β１－９様ポリペプチド及びβ１０様ペプチド（米国特許第９，７９７，８８９号における実際のポリペプチド及びペプチド配列は、ＮＡＮＯＬＵＣ及び野生型ネイティブＯｇＬｕｃの対応する配列とは異なる）を含む相補システムの開発及び使用を記載している。

これらのルシフェラーゼの１０β（ベータ）鎖のフルセットに集合的に対応するペプチド及びポリペプチドを組み合わせることによって、多部相補システム（例えば、二部、三部など）が開発された。相補的なペプチド及びポリペプチドのセットを組み合わせると、適切な条件下で（例えば、捕捉要素の相補性成分に融合された捕捉試薬の結合によって促進され）、生物発光複合体が形成される。いくつかの実施形態では、生物発光複合体のペプチド及びポリペプチド成分は、本明細書に記載の組成物及び方法により標識されたタンパク質の検出（それによって細胞死が検出される）のための検出試薬（例えば、捕捉剤に融合されている）としての用途が見出されている。これらの多部相補システムは、例えばＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／２６３５４；米国特許第９，７９７，８８９号；米国特許出願公開第２０２０／０２７０５８６号；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／３６８４４；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／６２４９９及び米国出願番号１７／１０５，９２５（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており；これらの技術の例は以下に記載される。

ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／２６３５４及び米国特許第９，７９７，８８９号（それぞれ、参照によりその全体がすべての目的で本明細書に組み込まれる）は、生物発光複合体のアセンブリのための組成物及び方法を記載しており；そのような複合体、及びそのペプチドとポリペプチド成分は、本明細書の実施形態で用途が見出されており、本明細書に記載された組成物、アッセイ及び方法と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、ＮＡＮＯＢｉＴ及び他の関連技術は、ペプチド成分及びポリペプチド成分を利用しており、複合体へのアセンブリの際に、ペプチド成分及びポリペプチド成分のみと比較した場合、適切な基質（例えばセレンテラジンまたはセレンテラジン類似体）の存在下で有意に増強された（例えば、２倍、５倍、１０倍、１０²倍、１０³倍、１０⁴倍、またはそれより以上の）発光を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号９と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するポリペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号５及び／または配列番号６と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号１０と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号５及び／または配列番号８と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本明細書において、配列番号１１と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはそれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号５及び／または配列番号８と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、生物発光複合体の任意の前述のペプチドまたはポリペプチド成分のいずれかは、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）に結合（例えば、融合、化学的に結合など）されているか、または相補的結合パートナーから構成される別のシステムを利用している。いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１０と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号５及び／または配列番号８と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、生物発光複合体の任意の前述のペプチドまたはポリペプチド成分は、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）に結合（例えば、融合、化学的に結合など）されているか、または相補的結合パートナーから構成される別のシステムを利用している。

米国特許出願公開第２０２０／０２７０５８６号；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０／６２４９９；及び米国出願公開第１７／１０５，９２５（参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる）には、３つ以上のペプチド及びポリペプチド成分からの生物発光複合体のアセンブリのための組成物、システム、及び方法が記載されている。そのような複合体、ならびにそのペプチド及びポリペプチド成分は、本明細書に記載の組成物、アッセイ及び方法と組み合わせて使用され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１２または配列番号１９と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有するポリペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号６及び／または配列番号９と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１１と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号４、配列番号５、及び／または配列番号８と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１３と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、及び／または配列番号７と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。

いくつかの実施形態では、本明細書では、配列番号１４と少なくとも６０％（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの間の範囲）の配列同一性を有するペプチド成分が提供される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７及び／または配列番号８と１００％未満（例えば、＜９９％、＜９８％、＜９７％、＜９６％、＜９５％、＜９４％、＜９３％、＜９２％、＜９１％、＜９０％）の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、任意の前述のペプチドまたはポリペプチド成分は、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）に結合（例えば、融合、化学的に結合など）されているか、または相補的結合パートナーから構成される別のシステムを利用している。

ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１３／７４７６５；米国特許出願番号第１５／２６３，４１６（参照によりその全体があらゆる目的で組み込まれる）及び他の特許及び出願には、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）組成物、アッセイ、及び方法（例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ベースの技術を組み込む）が記載されており；そのような組成物、アッセイ及び方法、ならびに生物発光ポリペプチド及びそのフルオロフォア結合成分は、本明細書に記載された組成物、アッセイ及び方法と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、任意のＮＡＮＯＬＵＣベース、ＮＡＮＯＢｉＴベース、及び／もしくは多部ＮＡＮＯＬＵＣベースのまたは関連のペプチド、ポリペプチド、複合体、融合物、及びコンジュゲートは、本明細書に記載された組成物、アッセイ及び方法を用いるＢＲＥＴベースの適用において用途が見出され得る。例えば、ハロアルキル結合部分（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）、及び第１の発光波長でシグナルを発するレポーター（例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質等）を含む第１の検出剤と、ハロアルキル結合部分（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）と、第１の発光波長と重なり、第２の発光波長でシグナルを発する励起スペクトルを有する蛍光レポーター（例えば、蛍光タンパク質及びフルオロフォア等）とを含む第２の検出剤を用いて、ＢＲＥＴを介した核酸へのハロアルキル組み込みを検出する。発光部分及び蛍光部分の他の組み合わせ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧに融合）は、本明細書に記載のシステム及び方法を使用するハロアルキル修飾核酸のＢＲＥＴ媒介検出／定量に用途が見出され得る。

本明細書で使用される「エネルギーアクセプター」という用語は、任意の小分子（例えば、発色団）、高分子（例えば、自己蛍光タンパク質、フィコビリタンパク質、ナノ粒子、表面等）、またはエネルギー吸収に応じて容易に検出可能なシグナルを生成する（例えば、共鳴エネルギー移動）分子複合体を指す。特定の実施形態では、エネルギーアクセプターとは、フルオロフォアまたは他の検出可能な発色団である。適切なフルオロフォアとしては、限定するものではないが：キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、テキサスレッドなど）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニンなど）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル及びプロダン誘導体）、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール、ベンゾオキサジアゾールなど）、ピレン誘導体（例えば、カスケードブルー）、オキサジン誘導体（例えば、Ｎｉｌｅレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーンなど）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビンなど）、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＡＬＥＸＡ ＦＬｕｏＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤＹＬＩＧＨＴ ＦＬＵＯＲ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｅｒｃｅ）、ＡＴＴＯ及びＴＲＡＣＹ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、ＤＹ及びＭＥＧＡＳＴＯＫＥＳ（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、ＳＵＬＦＯ ＣＹ色素（ＣＹＡＮＤＹＥ，ＬＬＣ）、ＳＥＴＡＵ ＡＮＤ ＳＱＵＡＲＥ ＤＹＥＳ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＱＵＡＳＡＲ及びＣＡＬ ＦＬＵＯＲ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＳＵＲＥＬＩＧＨＴ ＤＹＥＳ（ＡＰＣ，ＲＰＥ，ＰｅｒＣＰ，Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓ）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ）、自己蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＫａｔｅ）、量子ドットナノクリスタル等が挙げられる。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ローダミン類似体（例えば、カルボキシローダミン類似体）、例えば、米国出願番号１３／６８２，５８９（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、本明細書の技術のＢＲＥＴ用途のアクセプターである。

本開示のアッセイ及び方法は、発光原性基質の使用を含む。「生物発光」とは、本明細書において記載する場合、一般には、酵素、タンパク質、タンパク質複合体、または他の生体分子（例えば、生物発光複合体）によって触媒されるかまたはそれによって可能になる化学反応による光の生成及び放出を指す。典型的な実施形態では、生物発光実体のための発光原性の基質（例えば、生物発光タンパク質または生物発光複合体）は、生物発光実体によって不安定な形態に変換され；続いて、基質は光を放出する。検出試薬（例えば、生物発光複合体のポリペプチド成分（複数可））及び基質（例えば、セレンテラジンまたはセレンテラジン類似体）の存在下で、生物発光シグナルが生成される。本明細書において、セレンテラジンまたはその類似体または誘導体などの発光原性基質を含む組成物が提供される。例示的なセレンテラジン類似体としては、セレンテラジン－ｈ、セレンテラジン－ｈ－ｈ及びフリマジンが挙げられる。

いくつかの実施形態では、この基質は、以下の構造を有するセレンテラジンである。

いくつかの実施形態では、基質はセレンテラジンの類似体または誘導体である。例示的なセレンテラジン類似体としては、セレンテラジン－ｈ（２－デオキシセレンテラジンまたは２，８－ジベンジル－６－（４－ヒドロキシフェニル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）、セレンテラジン－ｈ－ｈ（ジデオキシセレンテラジンまたは２，８－ジベンジル－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）、及びフリマジン（８－ベンジル－２－（フラン－２－イルメチル）－６－フェニルイミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン）が挙げられ、これらは以下の構造を有する：

追加の例示的なセレンテラジン類似体としては、セレンテラジン－ｎ、セレンテラジン－ｆ、セレンテラジン－ｈｃｐ、セレンテラジン－ｃｐ、セレンテラジン－ｃ、セレンテラジン－ｅ、セレンテラジン－ｆｃｐ、セレンテラジン－ｉ、セレンテラジン－ｉｃｐ、セレンテラジン－ｖ、２－メチルセレンテラジン等が挙げられる。いくつかの実施形態では、化合物は、ＷＯ２００３／０４０１００；米国出願番号第１２／０５６，０７３（段落［００８６］）、米国特許第８，６６９，１０３号；ＷＯ２０１２／０６１５２９号、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７８９号、及び米国特許出願公開第２０１８／００３００５９（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているセレンテラジン類似体であってよい。いくつかの実施形態では、セレンテラジン類似体または誘導体としては、例えば、米国特許出願公開第１２／０５６，０７３号；米国特許出願公開第２０１２／０７０７８４９号；米国特許出願公開第２０１４／００９９６５４号（その内容全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるものなどのプロ－基質が挙げられる。いくつかの実施形態では、化合物は、フリマジンである。

セレンテラジン及びその類似体及び誘導体は、多くのアッセイ、例えば、本明細書に記載された生物発光法で使用される緩衝系への再構築に関連する課題に悩まされ得る。例えば、セレンテラジン、またはフリマジンなどのセレンテラジンの類似体もしくは誘導体は、（例えば、固体材料の不均一な微晶質に起因して）緩衝液に緩慢にかつ／または一貫性なく溶解し得る。緩衝液で希釈する前の有機溶媒への溶解は、より速く、より一貫した結果をもたらし得るが、セレンテラジン化合物は、熱不安定性及び光不安定性の両方を含む保管上の有機溶液の不安定性に悩まされる場合がある。いくつかの実施形態では、組成物はさらにポリマーを含む。本明細書でさらに記載されるように、ポリマーの存在により、分解に対して化合物を安定化し得、ポリマーの存在により、水または水溶液中での化合物の溶解性を改善し得る。

ポリマーは、天然に存在するバイオポリマーであっても、または合成ポリマーであってもよい。いくつかの実施形態では、ポリマーは天然に存在するバイオポリマーである。適切な天然に存在するバイオポリマーは、二糖類（例えば、トレハロース及びマルトース）を含む炭水化物、ならびに多糖類（例えば、プルラン、デキストラン及びセルロース）である。天然に存在するバイオポリマーの混合物も使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリマーは、マルトトリオース繰り返し単位を含む多糖であるプルランである。マルトトリオースは、α－１，４グリコシド結合を介して連結された３つのグルコース単位を含む三糖類である。プルランポリマー中のマルトトリオース単位は、α－１，６グリコシド結合を介して互いに結合される。

いくつかの実施形態では、ポリマーは、合成ポリマーである。合成ポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、またはブロックコポリマー（例えば、ジブロックコポリマー、トリブロックコポリマーなど）であってもよい。適切なポリマーの非限定的な例としては、限定するものではないが、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアクリレートが挙げられる。特定のポリマーの非限定的な例としては、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレンビニルアセテートポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＥＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＰＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン（例えば、ポリエチレン及びポリプロピレン）、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））、ポリアルキレンテレフタレート（例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）など）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル（例えば、ポリ（酢酸ビニル）など）、ポリビニルハロゲン化物（例えば、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）など）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース（例えば、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなど）、アクリル酸のポリマー（「ポリアクリル酸」）（例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリジオキサノン及びそのコポリマー（例えば、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート）、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ならびにそれらの混合物及びコポリマーが挙げられる。

化合物及びポリマーに加えて、組成物は、緩衝剤、界面活性剤、塩、タンパク質またはそれらの任意の組み合わせなどの追加の成分を含み得る。例えば、組成物は、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、もしくはクエン酸緩衝液、または他の一般的な緩衝液、例えばビシン、トリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）等を含み得る。

いくつかの実施形態では、組成物は界面活性剤を含み得る。例示的な界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性イオン性界面活性剤が挙げられる。例えば、界面活性剤は、ソルビタン２０などの非イオン性界面活性剤であってもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどの塩を含み得る。いくつかの実施形態では、組成物は、タンパク質を含んでもよい。例えば、組成物は、下流アッセイで添加され得る発光原性酵素の表面吸着を防ぐために担体タンパク質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であってもよい。

本明細書の実施形態は、ＤＮＡ（及び／またはハロアルキル基を示すＤＮＡ）へのハロアルキル修飾ヌクレオシドの組み込みを含む。本明細書のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ上のハロアルキル基は、デハロゲナーゼ、例えば、ハロアルカンデハロゲナーゼのための基質として利用される。その基質（例えばハロアルキル基質）に共有結合する変異体ヒドロラーゼ（例えば変異体デハロゲナーゼ）を含むシステムは、例えば、米国特許第７，２３８，８４２号；同第７，４２５，４３６号；同第７，４２９，４７２号；同第７，８６７，７２６号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。ＨＡＬＯＴＡＧは、ハロアルキル基質と安定な（例えば、共有結合の）結合（例えば、エステル結合）を形成する、市販の修飾デハロゲナーゼ酵素であり、これは本明細書の実施形態で使用されている。いくつかの実施形態では、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）は、ＤＮＡ合成中にＤＮＡに組み込まれたハロアルキル基に（共有結合で）結合する。

ハロアルキル基質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）と共有結合を形成する修飾デハロゲナーゼを、他のタンパク質（例えば、レポータータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）との融合に、それらの基質を共有結合する能力を維持しながら組み込むことができることが実証された。いくつかの実施形態では、本明細書では、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）と検出可能なレポーター（例えば、生物発光タンパク質、生物発光複合体の成分など）との融合が提供される。いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾ＤＮＡ上のハロアルキル基への修飾デハロゲナーゼ（例えばＨＡＬＯＴＡＧ）の結合に際して、ＤＮＡを定量し、及び／またはＤＮＡ上での合成をモニター／定量する。

ＤＮＡの合成中にＤＮＡをハロアルキル基で修飾するためのシステム及び方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシド（例えばデオキシウリジン）には、ＤＮＡ複製の他の典型的な成分（例えば、ＤＮＡテンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ、未標識デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＴ、ｄＣ、ｄＧ）等）が提供される。いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドが、新たに合成されたＤＮＡ中に、ドキシチミジンの一部の代わりに（例えば一定または比較的一定の速度で（例えば、存在するハロアルキル修飾デオキシウリジン対デオキシチミジンの比に比例して）、組み込まれる。次いで、この新規に合成されたＤＮＡを、（ｉ）ハロアルキル基に結合し得、かつ（ｉｉ）検出可能な特性を示す結合／検出剤に曝露することにより検出する。

いくつかの実施形態では、結合／検出剤は、ハロアルキル結合部分及び検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態では、ハロアルキル結合部分は、そのハロアルキル基質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）に共有結合する修飾されたデハロゲナーゼである。いくつかの実施形態では、検出可能な部分は、発光ポリペプチド、ルシフェラーゼ酵素及び／または発光複合体の成分である。検出可能な部位が発光ポリペプチドまたはルシフェラーゼ酵素であるならば、（過剰な遊離結合／検出剤を洗い流した後の）新たに合成されたＤＮＡの存在下で検出される発光の量は、新たに合成されたＤＮＡの量に（及びＤＮＡへのデオキシウリジンの組み込み速度）に比例する。検出可能な部分が発光複合体の成分であるならば、発光複合体の相補的成分が新たに合成されたＤＮＡに近接して結合されるのに十分な密度で、このハロアルキル修飾デオキシウリジンが、新たに合成されたＤＮＡに組み込まれると、発光が検出可能である。

いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるのは、核酸を修飾する方法であって、本明細書中に記載のハロアルキル修飾デオキシウリジンを、他のデオキシヌクレオチド、鋳型ＤＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼと含むことと、ＤＮＡポリメラーゼにより、本明細書中に記載のハロアルキル修飾デオキシウリジン及び他のデオキシヌクレオチドを、新たに合成された標識核酸に組み込むことを可能にすることと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ合成は細胞内で行われる。他の実施形態では、ＤＮＡ合成は、細胞溶解物またはインビトロシステム内で行われる（例えば、ハロアルキル修飾デオキシウリジンは、インビトロのＤＮＡ合成システムにおいて、ＤＮＡ合成に必要な他の既知の成分とともに含まれる）。

いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾デオキシウリジンは細胞透過性であるため、増殖培地にハロアルキル修飾デオキシウリジンを含ませると、細胞内へのハロアルキル修飾デオキシウリジンの取り込みが生じる。このような実施形態では、ハロアルキル修飾デオキシウリジンを含む増殖培地中／上で成長した細胞は、新たに合成されたＤＮＡにハロアルキル修飾デオキシウリジンを組み込むことになる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ハロアルキル基で細胞内の核酸を修飾する方法であり、この方法は、本明細書に記載のハロアルキル修飾デオキシウリジンと細胞とを接触させること、ハロアルキル修飾デオキシウリジンを細胞に入れ、デオキシチミジンヌクレオチドの一部の代わりにＤＮＡ合成中に細胞の核酸に組み込むこと可能にすることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ハロアルキル修飾デオキシウリジンを含有する培地中で培養される。

いくつかの実施形態では、本明細書では、細胞内の核酸を検出する方法が提供される。ハロアルキル修飾デオキシウリジンが細胞内に侵入して、デオキシチミジンの一部の代わりにＤＮＡ合成に組み込まれることを可能にするのに十分な濃度で、この細胞に、ハロアルキル修飾デオキシウリジンを接触させる。いくつかの実施形態では、ハロアルキル修飾デオキシウリジンは、細胞増殖培地に含まれる。次いで、この細胞を溶解させることで、選択された時点で細胞溶解物が生成される。ハロアルキル修飾デオキシウリジンがＤＮＡ合成により細胞の核酸に組み込まれている場合、この細胞溶解物はハロアルキル標識核酸を含むであろう。次いで、この細胞溶解物を結合／検出剤と接触させる。この結合／検出剤は、ハロアルキル結合部分（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）及び検出可能な部分を含む。本明細書に記載されるように、様々な異なる検出可能な部分が、本明細書の実施形態内で用途を見出される。適切な検出可能な部分には、フルオロフォア、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、及び発光複合体の成分が含まれる。好ましい実施形態では、検出可能な部分は、生物発光複合体の成分である。生物発光複合体の相補性成分を含む結合／検出剤が、近くの箇所でハロアルキル標識ＤＮＡに結合すると、発光性複合体用の基質の存在下で発光が生じ、それによって、発光性複合体を補完および形成することが可能になる。いくつかの実施形態では、結合パートナーによる促進がない場合に複合体を形成しない生物発光複合体の成分を選択する。いくつかの実施形態では、検出可能な部分としての生物発光複合体の成分の使用は、洗浄ステップなしで検出を容易にする（結合／検出剤は、促進がない場合に複合体を形成しないので、結合されていない結合／検出剤は、有意な発光を生じない）。

特定の実施形態では、細胞溶解物と結合／検出剤との接触は、細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基に共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と、（Ｂ）発光複合体のペプチド成分との第１の融合物；（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基に共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と、（Ｂ）発光複合体のポリペプチド成分との第２の融合物、及び（ｉｉｉ）発光複合体用の基質と、接触させることを含む。発光の検出は、生物発光複合体を形成するのに十分な密度で、第１の修飾デハロゲナーゼ酵素が、ＤＮＡ上のハロアルキル基に結合することを示す。したがって発光量は、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドの存在下で合成されたＤＮＡの量に比例する。

いくつかの実施形態では、合成されたＤＮＡの量は、細胞増殖の量に関する読み出しである。したがっていくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステム及び方法を用いて細胞増殖の量を検出／モニタリングするための方法が提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞内の核酸を検出する方法であって：（ａ）細胞内で：（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体のペプチド成分との第１の融合物と；（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と、（Ｂ）発光複合体のポリペプチド成分との第２の融合物とを発現することと；（ｂ）核酸を、本明細書の方法によって、ハロアルキル基で修飾することと；（ｃ）細胞を発光複合体用の基質と接触させることと；（ｄ）発光複合体からの発光を検出することであって、発光が、発光複合体の形成を促進する核酸に沿った位置で第１の融合物と第２の融合物とを結合させることを可能にする核酸のハロアルキル標識の密度が十分であることを示す、検出することと、を含む方法である。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞内の核酸を検出する方法であって：（ａ）核酸をハロアルキル基で本明細書の方法により修飾することと；（ｂ）細胞を溶解して、ハロアルキル修飾核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｃ）細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光タンパク質との融合物と；ならびに（ｉｉｉ）発光複合体用の基質と接触させることと；（ｄ）発光タンパク質からの発光を検出することであって、発光はハロアルキル修飾核酸の量と比例する、検出することと、を含む方法である。いくつかの実施形態では、融合物の検出可能な部分として発光タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ））が使用される場合、検出された発光がＤＮＡ結合発光タンパク質のものであることを保証するために、発光を検出する前に洗浄ステップが必要とされる。ＤＮＡから遊離試薬を洗浄するための適切な方法は、この分野において理解されている。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞内の核酸を検出するための三部相補システムを用いる方法であって：（ａ）核酸をハロアルキル基で本明細書の方法により修飾することと；（ｂ）細胞を溶解して、ハロアルキル修飾核酸を含む細胞溶解物を生成することと；（ｃ）細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体の第１のペプチド成分との第１の融合物；（ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基と共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と、（Ｂ）発光複合体の第２のペプチド成分との第２の融合物、（ｉｉｉ）発光複合体のポリペプチド成分；及び（ｉｖ）発光複合体用の基質、と接触させることと；ならびに（ｄ）発光複合体からの発光を検出することであって、発光が、発光複合体の形成を促進する核酸に沿った位置で第１の融合物と第２の融合物とを結合させることを可能にする核酸へのハロアルキル組み込みが十分な密度であることを示す、検出することと、を含む方法である。

いくつかの実施形態では、選択された環境条件または刺激に応じて細胞（複数可）内の細胞増殖及び／またはＤＮＡ合成の速度をモニタリングするためにアッセイが実行される。例えば、本明細書におけるシステム及び方法を使用して、薬物、化合物、外部刺激などに応じて、ＤＮＡ合成及び／または細胞増殖の速度をモニタリングする。いくつかの実施形態では、本明細書の方法は、細胞を刺激または条件に曝露させることを含む。いくつかの実施形態では、刺激または条件は、細胞（または細胞培地）へのハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドの添加の前、後または同時に適用される。いくつかの実施形態では、細胞のパネルは、細胞溶解の前の可変量の時間にわたって刺激に曝露され、それによって刺激の効果が経時的に観察されることが可能になる。いくつかの実施形態では、刺激または条件は、本明細書に記載される方法における任意のステップで、例えば、ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドの添加前に；ハロアルキル修飾デオキシヌクレオシドの添加後に、ただし、細胞の溶解前等に細胞に適用されてもよい。いくつかの実施形態では、刺激は、細胞増殖／ＤＮＡ合成の速度に変化をもたらす。いくつかの実施形態では、刺激は、細胞死をもたらす。いくつかの実施形態では、刺激は、増強された細胞増殖をもたらす。

本発明は、生物発光検出と共に新規の修飾ヌクレオシドを組み込むことに関する。したがって、生物発光ベースの検出により提供される感度をプレートベースのアッセイで利用し、ＮＡＮＯＢｉＴ「ｎｏ ｗａｓｈ（洗浄なし）」の検出アプローチを使用して試料の調製ステップを最小限に抑えることにより、より使いやすいアッセイが可能になる。

限定するものではないが、その複製及び／またはＤＮＡ合成が本明細書の実施形態によって測定可能である標的細胞は、本明細書に提供される材料及び方法を使用して標識することが可能な任意の供給源由来の任意の細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は患者に由来する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、細胞培養実験及び／または臨床環境において一般的に使用される細胞型のものである。いくつかの実施形態では、標的細胞は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、黒色腫、脳または脊髄腫瘍、生殖細胞腫瘍、神経内分泌腫瘍またはカルチノイド腫瘍に由来する。いくつかの実施形態では、標的細胞は、任意のがん性または非がん性一次細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、以下に限定されるものではないが、骨髄、胚性胚芽細胞または卵黄嚢、脾臓、末梢血及び臍帯血を含む血液、脂肪組織、ならびに他の組織及び器官を含む様々な差分源に由来する幹細胞または幹細胞由来の細胞である。いくつかの実施形態では、標的細胞は、造血幹細胞、内皮前駆細胞、胚性幹細胞、または間葉系幹細胞である。

本明細書における細胞透過性ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えば、ハロアルキル修飾デオキシウリジン）は、目的の特定の細胞型の新たに合成されたＤＮＡを修飾する能力を提供し、この細胞型としては、限定するものではないが、細胞を遺伝子工学的に操作する必要なく、患者試料から単離された初代細胞または細胞が挙げられる。このタイプのＤＮＡ修飾によって、細胞集団のＤＮＡ合成の速度を、高感度で定量的な生物発光アプローチを用いて追跡することが可能になる。高スループットで多くの異なるアッセイプラットフォームに適用可能な便利な「アッド・アンド・リード」フォーマットを使用して、変更をエンドポイントとして、またはリアルタイムで測定することができる。

本明細書の実施形態は、本明細書に記載されたＨＡＬＯＴＡＧ、ＮＡＮＯＬＵＣ、ＮＡＮＯＢｉＴ、ＮａｎｏＴｒｉＰ等の成分に限定されない。むしろ、他の修飾されたデハロゲナーゼ（例えば、米国特許第７，２３８，８４２号；米国特許第７，４２５，４３６号；米国特許第７，４２９，４７２号；米国特許第７，８６７，７２６号（各々は、その全体が参照によって本明細書に援用される））及び相補的な検出システム（例えば、他の二部、三部、及び多部生物発光複合体システム（例えば、米国仮特許出願番号６２／６８４，０１４号；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１９／３６８４４；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１４／２６３５４号；及び／または米国特許第９，７９７，８８９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））もまた、本明細書の実施形態で用途を見出される。試薬はまた、補完に際して蛍光部位を形成する蛍光タンパク質または蛍光タンパク質のフラグメントもしくは非蛍光サブユニットも含む。例えば、蛍光タンパク質または蛍光タンパク質のフラグメントもしくは非蛍光サブユニットとしては、Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖｏｌ．８，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｌｉｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ”（２０１７））、Ｆｏｇｌｉｅｎｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，ｖｏｌ．７，“Ｓｐｌｉｔ ＧＦＰ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｔｏ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＦＴＤ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１７））、及びＫｏｒａｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１３１，“Ｈｉｇｈ－ｃｏｎｔｅｎｔ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｓｐｌｉｔ－ＧＦＰ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＧＴＰａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”（２０１８））に開示されるものが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、検出剤は、本明細書に記載の方法に従って、ＨＡＬＯＴＡＧ部分をハロアルキル修飾核酸に結合する際に、アセンブルされて、検出されるスプリット蛍光タンパク質のＨＡＬＯＴＡＧ融合成分を含む。

本開示に基づいて当業者によって認識されるように、本明細書の方法及びアッセイは、細胞ＤＮＡ合成の速度の変化を直接的または間接的に導く任意の細胞応答を検出し得る。いくつかの実施形態では、細胞応答は、細胞自体が生理的刺激に応答した結果として生じる。他の実施形態では、細胞応答は、実験的操作（例えば、細胞を薬物または毒素に曝露）の結果として生じる。

いくつかの実施形態では、本明細書における方法、アッセイ、材料及び試薬は、疾患細胞（例えば、がん細胞、腫瘍細胞など）を死滅させるための特定の治療または療法の有効性を決定するためのアッセイにおいて用途を見出す。例えば、本明細書において、治療後の細胞のＤＮＡ合成の速度をモニタリングすることによって化学療法に対する生検された腫瘍細胞の感受性をアッセイするための方法が提供される。標的細胞型のインビトロ薬剤感受性及び／または化学感受性を決定するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、本明細書における方法、アッセイ、材料及び試薬は、アッセイにおいて、細胞集団内でのＤＮＡ合成の速度に対する特定の薬剤または状態の影響を決定するのに用途を見出す。

いくつかの実施形態では、標的細胞は、研究者、臨床医、または他のユーザーが細胞死をモニタリングしたい任意の適切な種類のものであってよい。細胞は、固形腫瘍細胞（例えば、細胞培養由来、対象から生検されたもの等）、非固体がん細胞、非がん細胞、健康なヒト細胞、モデル動物から得られた細胞、細胞株等であってよい。

本開示の実施形態はまた、本明細書に記載の様々な構成要素を備えるキットも備える。本開示の実施形態は、ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えばデオキシウリジン）及び生物発光複合体の１つ以上の成分（例えば、各成分は、修飾デハロゲナーゼ（例えばＨＡＬＯＴＡＧ）に縮合または結合されている）を備えるキットを含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、発光原性基質を含んでもよい。キットは、容器及び／または指示を備えてもよい。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチドまたはポリペプチド（例えば、ＨｉＢｉＴ、ＬｇＢｉＴ）または修飾デハロゲナーゼタンパク質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧ）をコードする配列を含むドナーＤＮＡテンプレートを含む。

いくつかの実施形態では、キットは、種々の検出試薬を含んでよく、これには限定するものではないが、ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えば、デオキシウリジン）を含む容器、生物発光複合体の第１の成分（例えばＨＡＬＯＴＡＧに融合）を含む容器、生物発光複合体の第２の成分（例えばＨＡＬＯＴＡＧに融合）を含む容器、及び場合により生物発光複合体の第３の成分を含む容器、を備えてもよい。いくつかの実施形態では、生物発光複合体の成分は、単一の容器または別個の容器に供給される。キットはまた、発光原性基質（例えば、ＮＡＮＯ－ＧＬＯルシフェラーゼアッセイ基質）も含んでもよい。このキットは、生物発光バイオアッセイを実施するために必要とされる種々の緩衝剤及び他の試薬も含み得る。

本明細書の実施形態の開発中に行われる実験、ならびに本明細書におけるアッセイ、キット等のいくつかの構成要素に関する先の研究によって、様々な構成要素のモジュール性が実証される。例えば、ヌクレオシド（例えば、デオキシウリジン）は、修飾デハロゲナーゼの適切な基質である種々のハロアルキル基に、直接的に、または種々の異なるリンカーによって結合されていてもよい。同様に、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧまたは構造的または機能的に関連するデハロゲナーゼ）は、修飾デハロゲナーゼの機能を変更することなく、任意の適切な検出試薬（例えば、多部相補システム（例えば、二部（例えば、ＮＡＮＯＢｉＴ）、三部（例えば、ＮａｎｏＴｒｉｐ）等）、フルオロフォア等の生物発光ポリペプチド、ペプチドまたはポリペプチド成分）に融合または連結し得る。活性生物発光複合体を形成する能力を保持しながら、多部相補システムのペプチド成分またはポリペプチド成分（例えば、二部（例えば、ＮＡＮＯＢｉＴ）、三部（例えば、ＮａｎｏＴｒｉｐ）等）を、フルオロフォア、修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧまたは構造的もしくは機能的に関連するデハロゲナーゼ）等の様々な他の成分に融合または連結し得る。本明細書に記載される構成要素のモジュール性に照らして、そのような構成要素の任意の組み合わせ（例えば、融合物、連結された対として、キットまたはアッセイにおいて共に、など）は本明細書で検討し、かつ本明細書の範囲内である。

いくつかの実施形態では、キットは、ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えばデオキシウリジン）；生物発光複合体のポリペプチド成分に融合されたその基質と共有結合を形成し得る修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧまたは構造的もしくは機能的に関連するデハロゲナーゼ）；ならびに生物発光複合体（例えば、ポリペプチド成分に低い親和性を示すペプチド（例えば、複合体形成の促進を必要とする）のペプチド成分と融合する、その基質（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧまたは構造的もしくは機能的に関連するデハロゲナーゼ）と共有結合を形成し得る修飾デハロゲナーゼを備え；ここで、このペプチド成分及びポリペプチド成分は、互いに適切な近接／配向にもたらされたときに、生物発光複合体を形成する。いくつかの実施形態では、キットは、生物発光複合体用の基質をさらに含む。いくつかの実施形態では、前述の成分を利用するアッセイが提供される。

いくつかの実施形態では、キットは、ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えば、デオキシウリジン）；生物発光複合体のポリペプチド成分に融合された、その基質と共有結合を形成し得る修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧまたは構造的もしくは機能的に関連するデハロゲナーゼ）；及び生物発光複合体のペプチド成分（例えば、ポリペプチド成分に対して高い親和性を示すペプチド）に連結されたフルオロフォアを含み；ここでペプチド及びポリペプチド成分は、共局在化の際に生物発光複合体を形成する。いくつかの実施形態では、キットは、生物発光複合体用の基質をさらに含む。いくつかの実施形態では、前述の成分を利用するアッセイが提供される。

いくつかの実施形態では、キットは、ハロアルキル修飾ヌクレオシド（例えば、デオキシウリジン）と；生物発光複合体の第１のペプチド成分に融合された、その基質と共有結合を形成し得る修飾デハロゲナーゼ（例えばＨＡＬＯＴＡＧまたは構造的もしくは機能的に関連するデハロゲナーゼ）と；生物発光複合体の第２のペプチド成分に融合された、その基質と共有結合を形成し得る修飾デハロゲナーゼ（例えば、ＨＡＬＯＴＡＧまたは構造的もしくは機能的に関連するデハロゲナーゼ）と；生物発光複合体のペプチド成分とを備え；ここでこの第１のペプチド、第２のペプチド及びポリペプチド成分は、捕捉剤が、捕捉要素に結合して、互いに適切な近接／配向にもたらされたペプチド成分を生じたときに、生物発光複合体を形成する。いくつかの実施形態では、キットは、生物発光複合体用の基質をさらに含む。いくつかの実施形態では、前述の成分を利用するアッセイが提供される。

アッセイ／キット構成要素の他の適切な組合せは、本明細書の開示に基づき当業者によって理解されるであろう。

実験
実施例１
新たに合成されたＤＮＡへの修飾ヌクレオシド（ＰＢＩ－７９３１及びＰＢＩ－７９６０）の組み込みと、ＮＡＮＯＢｉＴ技術を用いた検出とを実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った。５００個の細胞／ウェルでプレートしたＡ５４９細胞を、ＰＢＩ－７９３１（図２Ａ、上）またはＰＢＩ－７９６０（図２Ａ、下）を含有する培地中にて１０ｕＭの最終濃度にて４時間培養した。修飾ヌクレオシドを含まない細胞を対照として使用した。培養後、培地を取り出し、細胞を固定し、透過処理し、そして酸処理を用いてＤＮＡを変性した。新しく合成されたＤＮＡに組み込まれた修飾ヌクレオシドの数を測定するために、ＨＴ－ＬｇＢｉＴ及びＨＴ－ＳｍＢｉＴを最終濃度５０ｎＭで細胞に加えた。１時間インキュベートした後、ＮＡＮＯＬＵＣ基質を加え、発光を測定した（図２Ｂ）。

実施例２
ＤＮＡ複製の阻害が本明細書に記載の方法を使用して測定可能であることを実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った。２，０００個の細胞／ウェルにプレートしたＡ５４９細胞を、ＤＮＡ複製抑制剤であるドキソルビシンの濃度を上昇させながら、組織培養インキュベーター中で２時間処理した。２時間の処理後、化合物ＰＢＩ－７９３１または－７９６０を、１０ｕΜの最終濃度で培地に添加し、細胞を組織培養インキュベーターにさらに４時間戻した。対照の細胞には化合物を添加しなかった。新たに合成されたＤＮＡの量を測定するために、ＨＴ－ＬｇＢｉＴ及びＨＴ－ＳｍＢｉＴを、５０ｎＭの最終濃度で細胞に加えた。１時間インキュベートした後、ＮＡＮＯＬＵＣ基質を加え、発光を測定した（図３）。

実施例３
化合物ＰＢＩ ７９３１の合成
プロパギルｐ－ニトロフェニルカーボネート（ｍｚ－１０７３）の合成
プロパギルアルコール（１ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）及びｐ－ニトロフェニルクロロマタ（５．３９ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの乾燥ＴＨＦ中で混合した。混合物を氷水浴中で撹拌し、ピリジン（４．３ｍＬ、５３．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと反応混合物に添加した。白色の沈殿物が直ちに形成された。添加後、この反応混合物を氷水浴中でさらに１時間撹拌し続けた。沈殿物を遠心分離により除去した。この固体をアセトニトリル２０ｍＬですすぎ、再び遠心分離した。液体部分を合わせて、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン－酢酸エチル、１０～５０％）で精製した。約１．３９ｇの白色固体を得た（収率３５％）。

プロパギルクロロ－ＰＥＧ２カルバメート（ｍｚ－１０７４）の合成
プロパギルｐ－ニトロフェニルカーボネート（１１１ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及びクロロヘキシル－ＰＥＧ２－アミン（１０２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＴＨＦ中で混合し、続いてトリエチルアミン（１２５μＬ、０．９１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を室温で撹拌した。３０分後、ＬＣ－ＭＳは、ＭＳ⁺３０６及び３０８（クロロ同位体）での生成物ピークを示した（ＬＣピークなし）。また、未反応の炭酸塩を検出した。さらに１００ｍｇのクロロヘキシル－ＰＥＧ２－アミンを加えた。さらに１時間後、出発物質（炭酸塩）は、ＬＣ－ＭＳでは検出されなかった。その混合物をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ－ヘプタン、１５分で０～２０％、１分で２０～５０％）で精製し、生成物を５０％ＥｔＯＡｃで溶出した。（標的分子中に発色団が存在しないため、溶出画分は、副生成物についてはＵＶ－Ｖｉｓにより、標的分子については光散乱検出器により検出した）。約１１０ｍｇの標的分子（無色の油、収率７９％）を得た。

ＰＢＩ ７９３１（ｍｚ－１０７５）の合成
５－ヨード－ｄＵ（８５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ－ｉｍｐｅｘ）、テトラキス（２４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）及びヨウ化銅（Ｉ）（９．１４ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で２．５ｍＬのＤＭＦ中で一緒に混合した。そのシステムを真空にし、窒素で２回再充填した。２．５ｍＬのＤＭＦ中のプロパギルクロロヘキシル－ＰＥＧ２カルバメート（１１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液を、６５．６μＬのトリエチルアミン（０．４８ｍｍｏｌ）と混合し、その混合物を反応フラスコに注入した。清明な溶液全体を２５℃で一晩撹拌した。
ＬＣ－ＭＳは、２９０ｎｍでＭＳ⁺５３２，５３４（クロロ同位体）での主要なピークを示した。混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、約３０ｍｇの白色固体を得た（収率２３％）。

実施例４
化合物ＰＢＩ ７９６０の合成
４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸
無水ＤＭＦ（４０ｍｌ）中のテレフタル酸（２．９７ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（１２．５ｍｌ、７１．５ｍｍｏｌ）、続いてＨＡＴＵ（ヘキサフルオロホスフェートアザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム、３．４０ｇ、８．９４ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を１０分間撹拌し、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（２．０ｇ、８．９４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。次いで、得られた反応混合物を一晩撹拌した。この溶液を酢酸エチル及び酢酸溶液（２Ｍ）で抽出し、ブラインで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有機溶媒を蒸発させ、その残渣をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ８．１１（ｍ，２Ｈ），７．８５（ｍ，２Ｈ），６．８３（ｓ，１Ｈ），３．７０－３．５９（ｍ，８Ｈ），３．５２－３．４５（ｍ，４Ｈ），１．７５－１．６９（ｍ，２Ｈ），１．５８－１．５４（ｍ，２Ｈ），１．４３－１．３３（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ ３７１［Ｍ＋Ｈ］。

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート
ジクロロメタン中の４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸（１．０２ｇ、２．７６ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．９６ｍｌ、５．５１ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＳＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート、０．９１ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）を続けて添加し、反応混合物を２０分間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．８４（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２０（ｍ，２Ｈ），８．０８（ｍ，２Ｈ），３．６２－３．５４（ｍ，６Ｈ），３．５０－３．４３（ｍ，４Ｈ），３．３８－３．３０（ｍ，２Ｈ），２．９１（ｓ，４Ｈ），１．７１－１．６４（ｍ，２Ｈ），１．４９－１．４２（ｍ，２Ｈ），１．３９－１．２２（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ ｍ／ｚ ４６８［Ｍ＋Ｈ］。

Ｎ１－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）－Ｎ４－（プロパ－２－イン－１－イル）テレフタルアミド（ＨＷ－０８２０）
ＤＭＦ中の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート（３４ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）の溶液に、プロパルギルアミン（１２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。この反応物を２時間撹拌し、溶媒を蒸発させて乾燥させた。残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。ＭＳ ｍ／ｚ ４０９［Ｍ＋Ｈ］。

Ｎ１－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）－Ｎ４－（３－（１－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２，４－ジオキソ－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）テレフタルアミド（ＰＢＩ ７９６０）
テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６．７８ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２．２４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１２ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）、及びＮ１－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）－Ｎ４－（プロパ－２－イン－１－イル）テレフタルアミド（２４ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中の５－ヨード－２’－デオキシシチジン（２１ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。オレンジ色の反応混合物を室温で４時間、窒素雰囲気下で撹拌した。その後、ＥＤＴＡ／Ｈ２Ｏの５％の二ナトリウム塩を数滴、反応混合物に添加し、その内容物を真空中で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製した。ＭＳ ｍ／ｚ ６３５［Ｍ＋Ｈ］。

実施例５
ベンズアミドリンカー合成
化合物１：
４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）安息香酸
テレフタル酸（３．００ｇ、１８．０６ｍｍｏｌ）及び２０ｍｌの無水ＤＭＦを、２５０ｍｌの丸底フラスコに添加し、続いて、ジイソプロピルエチルアミン（１２．５８ｍｌ、７２．２３ｍｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（ヘキサフルオロリン酸アザベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム、３．４３ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を１０分間撹拌した後、２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン－１－アミン（２．０２ｇ、９．０３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。得られた反応混合物を、窒素バルーンで封止して、室温で一晩撹拌した。この溶液を酢酸エチル及び酢酸溶液（２Ｍ）で抽出し、ブラインで洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥させた後、有機溶媒を濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％グレードのメタノール：ＤＣＭ）で精製した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ８．１４－８．０３（ｍ，２Ｈ），７．８８－７．８２（ｍ，２Ｈ），６．９４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７６－３．６８（ｍ，５Ｈ），３．６２（ｄｄ，Ｊ＝５．８，３．０Ｈｚ，２Ｈ），３．４８（ｄｔ，Ｊ＝１３．１，６．７Ｈｚ，４Ｈ），２．９７（ｓ，１Ｈ），２．９０（ｓ，１Ｈ），１．８０－１．６７（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．４９－１．２６（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ⁺３７２，３７４

化合物２：
２，５－ジオキソピロリジン－１－イル４－（（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）ベンゾエート
化合物１（４１０ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）及び５ｍｌのジクロロメタンを２５０ｍｌの丸底に添加し、続いて、ジイソプロピルエチルアミン（０．３８４ｍＬ、２．２１ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボラート、０．３６５ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を窒素バルーンで封止して、室温で２０分間撹拌した。溶媒を濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（２０％グレードのアセトン：ＤＣＭ）で精製した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ８．２０（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．７２－３．６３（ｍ，６Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝５．９，３．１Ｈｚ，２Ｈ），３．４９（ｄｔ，Ｊ＝２２．１，６．７Ｈｚ，４Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ），２．１７（ｓ，１Ｈ），１．７４（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．６１－１．５３（ｍ，２Ｈ），１．４８－１．２７（ｍ，４Ｈ）。ＭＳ⁺４６９，４７１。

化合物３：
Ｎ１－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）－Ｎ４－（プロパ－２－イン－１－イル）テレフタルアミド
化合物２（１１０ｍｇ、０．２３５ｍｍｏｌ）及び４ｍｌのＤＭＦを、２５０ｍｌの丸底フラスコに加え、続いてプロパルギルアミン（３８．７６ｍｇ、０．７０４ｍｍｏｌ）を添加した。その反応物を窒素バルーンで封止して、室温で２０分間撹拌した。溶液を濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（１０％グレードのメタノール：ＤＣＭ）で精製した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．９０－７．８０（ｍ，４Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｄｄ，Ｊ＝５．２，２．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７３－３．６４（ｍ，６Ｈ），３．６０（ｄｄ，Ｊ＝５．７，３．０Ｈｚ，２Ｈ），３．５１（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．７３（ｓ，３Ｈ），２．３１（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），１．７３（ｐ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），１．５６（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，４Ｈ），１．４７－１．３９（ｍ，３Ｈ），１．３９－１．３５（ｍ，２Ｈ），１．３５－１．２８（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，３Ｈ），０．９２－０．８４（ｍ，４Ｈ），０．８３（ｓ，１Ｈ）。ＭＳ⁺４０９，４１１

化合物４ａ（ＰＢＩ－９４２５）：
Ｎ１－（３－（４－アミノ－１－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２－オキソ－１，２，５，６－テトラヒドロピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）－Ｎ４－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）テレフタルアミド
５－ヨード－ｄＣ（４３．７７ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ－ｉｍｐｘ）、テトラキス（７．６３ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅（Ｉ）（３．３７ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で、２．５ｍＬのＤＭＦに混合した。そのシステムを真空にし、窒素で２回再充填した。別個の２０ｍｌのバイアル内で、１．５ｍＬのＤＭＦ中の化合物３（４５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、２４μＬのトリエチルアミン（０．１７３ｍｍｏｌ）と混合し、この混合物を反応フラスコに注入した。透明な溶液を室温で２時間撹拌した。その混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、濃縮したところ、約１５ｍｇの白色固体（収率２１．４３％、純度９３．３３％）が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，塩化メチレン－ｄ₂＆３滴のＣＤ₃ＯＤ）δ８．４７（ｓ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），６．０７（ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｓ，９Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｓ，２Ｈ），３．９７（ｓ，１Ｈ），３．８６（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７６（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６８－３．５８（ｍ，７Ｈ），３．５８－３．５４（ｍ，３Ｈ），３．４７（ｄｔｄ，Ｊ＝２８．９，６．７，２．２Ｈｚ，５Ｈ），３．３５（ｓ，１Ｈ），２．４５－２．３７（ｍ，１Ｈ），２．１９（ｄｔ，Ｊ＝１３．４，６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．８８（ｓ，７Ｈ），１．７２（ｐ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ），１．５２（ｓ，２Ｈ），１．３４（ｄｄｄ，Ｊ＝３７．３，１８．２，１０．４Ｈｚ，５Ｈ）；ＭＳ⁺６３４，６３６

化合物４ｂ（ＰＢＩ－９４２９）：
Ｎ１－（３－（２－アミノ－７－（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－オキソ－４，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）－Ｎ４－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）テレフタルアミド
５－ヨード－ｄＧ（４２．９６ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ－ｉｍｐｅｘ）、テトラキス（６．７８ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅（Ｉ）（３．３５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で２．５ｍＬのＤＭＦ中で混合した。そのシステムを真空にし、窒素で２回再充填した。別個の２０ｍｌのバイアル内で、１．５ｍＬのＤＭＦ中の化合物３（４０ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を、３０μＬのトリエチルアミン（０．２１５ｍｍｏｌ）と混合し、その混合物を反応フラスコに注入した。透明な溶液を室温で一晩撹拌した。その混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、濃縮したところ、約２４ｍｇの白色固体（収率３６．４５％、純度９７．４５％）が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ₄）δ８．００－７．８９（ｍ，４Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），６．３７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４６（ｄｄ，Ｊ＝６．１，３．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４１（ｓ，２Ｈ），３．９３（ｔ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７９－３．７２（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｔｄ，Ｊ＝１０．５，８．８，４．８Ｈｚ，５Ｈ），３．６０（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ），３．５０（ｄｔ，Ｊ＝２０．２，６．９Ｈｚ，４Ｈ），２．４９（ｄｔ，Ｊ＝１４．０，７．０Ｈｚ，１Ｈ），２．３０－２．２１（ｍ，１Ｈ），１．７２（ｐ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．５６（ｐ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．４２（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３４（ｄｔ，Ｊ＝１６．７，８．８Ｈｚ，３Ｈ）；ＭＳ⁺６３４，６３６

化合物４ｃ（ＰＢＩ－９４２８）：
Ｎ１－（３－（４－アミノ－７－（（２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル）－Ｎ４－（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）テレフタルアミド
５－ヨード－ｄＡ（４１．２１ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ－ｉｍｐｅｘ）、テトラキス（６．７８ｍｇ、０．００６ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅（Ｉ）（３．３５ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で２．５ｍＬのＤＭＦ中で混合した。そのシステムを真空にし、窒素で２回再充填した。別個の２０ｍｌのバイアル内で、１．５ｍＬのＤＭＦ中の化合物３（４０ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ）を、３０μＬのトリエチルアミン（０．２１５ｍｍｏｌ）と混合し、その混合物を反応フラスコに注入した。その透明な溶液を室温で一晩撹拌した。その混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、濃縮したところ、約１０ｍｇの白色固体（収率１５．５６％、純度９９．６８％）が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ₄）δ８．２７（ｓ，１Ｈ），８．００－７．８８（ｍ，５Ｈ），６．６２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．５１（ｈ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，１Ｈ），４．３６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｐ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８３－３．７５（ｍ，１Ｈ），３．７５－３．６７（ｍ，２Ｈ），３．６７－３．５６（ｍ，７Ｈ），３．５５－３．４３（ｍ，４Ｈ），２．５４（ｄｔ，Ｊ＝１３．９，６．７Ｈｚ，１Ｈ），２．４０（ｄｄｔ，Ｊ＝１３．３，６．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７０（ｐ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．５４（ｐ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｄｑ，Ｊ＝２３．１，７．５Ｈｚ，４Ｈ）；ＭＳ⁺６５７，６５９

実施例６
カルバメートリンカー合成
化合物１：
４－ニトロフェニルプロパ－２－イン－１－イルカーボネート
プロパルギルアルコール（１ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）、ｐ－ニトロフェニルクロロホルメート（５．３９ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）及び２０ｍＬの乾燥ＴＨＦを、２５０ｍｌの丸底フラスコに加え、窒素バルーンで封止した。その混合物を氷水浴中で撹拌し、ピリジン（４．３ｍＬ、５３．５ｍｍｏｌ）をゆっくりとフラスコに注入した。白色の沈殿物が直ちに形成された。ピリジン添加後、この混合物を氷水浴中でさらに１時間撹拌し続けた。沈殿物を遠心分離により除去し、得られた固体を、２０ｍＬのＴＨＦですすぎ、再び遠心分離した。上澄液の部分を合わせて、濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（５０％グレードのＥｔＯＡｃ：ヘプタン）で精製した。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ８．３９－８．３２（ｍ，２Ｈ），８．３２－８．２５（ｍ，１０Ｈ），７．５４－７．４６（ｍ，２Ｈ），７．４５－７．３７（ｍ，１０Ｈ），４．８８（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１０Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，５Ｈ），１．３２－１．２２（ｍ，１Ｈ）。ＭＳの酸性条件では安定していないため、フェノキシド副生成物のＭＳ⁺１３８のみを認めた。

化合物２：
プロパ－２－イン－１－イル（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート
化合物１（３００ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）、クロロヘキシル－ＰＥＧ２－アミン（３２４．７１ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）及び６ｍＬのＴＨＦを、２５０ｍｌの丸底フラスコに加え、次いで、トリエチルアミン（３４４．１μＬ、２．４７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を室温で３０分間撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、ＭＳ⁺３０６及び３０８（ＬＣピークなし）及び未反応の炭酸塩を有する生成物ピークを示した。さらに３００ｍｇのクロロヘキシル－ＰＥＧ２－アミンを添加し、一晩撹拌し続けた。得られたＬＣＭＳは、出発物質（炭酸塩）を示さなかった。混合物をフラッシュクロマトグラフィー（４０％グレードのＥｔＯＡｃ：ヘプタン）で精製した。標的分子中に発色団が存在しないので、生成物はＵＶ－Ｖｉｓ及び光散乱検出器によって検出された。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ５．３６（ｓ，１Ｈ），４．６８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，３Ｈ），３．６５－３．３５（ｍ，２０Ｈ），２．５４－２．４３（ｍ，２Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．６２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，５Ｈ），１．５２－１．３１（ｍ，７Ｈ）。

化合物３ａ（ＰＢＩ－９３９１）：
３－（４－アミノ－１－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート
５－ヨード－ｄＣ（９１．５４ｍｇ、０．４０３ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ－ｉｍｐｘ）、テトラキス（２４．１１ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅（Ｉ）（９．１８ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で２．５ｍＬのＤＭＦ中で混合した。そのシステムを真空にし、窒素で２回再充填した。別々の２０ｍｌバイアルに、化合物３（１１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、１．５ｍＬのＤＭＦ及び２４μＬのトリエチルアミン（０．１７３ｍｍｏｌ）を混合し、反応フラスコに注入した。その透明な溶液を室温で一晩撹拌した。その混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、濃縮したところ、約４４ｍｇの白色固体（収率２３．０４％、純度８５．５８％）が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ８．５６（ｓ，１Ｈ），６．０７（ｓ，１Ｈ），６．０２－５．９７（ｍ，１Ｈ），４．８１（ｓ，２Ｈ），４．４９（ｓ，１Ｈ），４．００（ｄｄ，Ｊ＝１５．４，６．１Ｈｚ，３Ｈ），３．８８（ｓ，２Ｈ），３．７０－３．５８（ｍ，１０Ｈ），３．５７（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１０Ｈ），３．４９（ｄｔ，Ｊ＝２７．９，６．７Ｈｚ，２２Ｈ），３．４０－３．３１（ｍ，８Ｈ），３．２２（ｓ，２Ｈ），３．０６（ｓ，１Ｈ），２．４９（ｓ，１Ｈ），２．２７（ｓ，１Ｈ），１．７６（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，８Ｈ），１．５９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，７Ｈ），１．３９（ｄｐ，Ｊ＝２８．７，７．８Ｈｚ，１６Ｈ）。ＭＳ⁺５３１，５３３。

化合物３ｂ（ＰＢＩ－９３９２）：
３－（２－アミノ－７－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－オキソ－４，７－ジヒドロ－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート
５－ヨード－ｄＡ（９４．０４ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ－ｉｍｐｘ）、テトラキス（２７．７１ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅（Ｉ）（９．１３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で２．５ｍＬのＤＭＦ中で混合した。そのシステムを真空にし、窒素で２回再充填した。別々の２０ｍｌバイアルに、化合物３（１１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、１．５ｍＬのＤＭＦ及び６７μＬのトリエチルアミン（０．４８ｍｍｏｌ）を混合し、反応フラスコに注入した。その透明な溶液を室温で一晩撹拌した。その混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、濃縮したところ、約３９ｍｇの白色固体（収率２８．５３％、純度９１．７３％）が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，塩化メチレン－ｄ₂）δ１０．９０（ｓ，２Ｈ），７．５７（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｓ，２Ｈ），５．９８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），５．３２（ｓ，１６Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．９０（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，２Ｈ），４．７７（ｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ），４．１０（ｓ，２Ｈ），３．９１（ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，２Ｈ），３．８１（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，２Ｈ），３．５４（ｄｑ，Ｊ＝１５．６，８．８，６．３Ｈｚ，２０Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，７Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），２．９６（ｓ，１Ｈ），２．２１（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，２Ｈ），１．７５（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，６Ｈ），１．５６（ｓ，４Ｈ），１．４３（ｐ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，６Ｈ），１．３４（ｑ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，６Ｈ），１．２６（ｓ，２Ｈ），０．８７（ｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，１Ｈ）；ＭＳ⁺５７０，５７２。

化合物３ｃ（ＰＢＩ－９３９３）：
３－（４－アミノ－７－（（２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－５－イル）プロパ－２－イン－１－イル（２－（２－（（６－クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバメート
５－ヨード－ｄＧ（９４．３１ｍｇ、０．２４０ｍｍｏｌ、Ｃｈｅｍ－ｉｍｐｘ）、テトラキス（２８．９７ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、及びヨウ化銅（Ｉ）（９．５５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で２．５ｍＬのＤＭＦ中で混合した。そのシステムを真空にし、窒素で２回再充填した。別々の２０ｍｌバイアルに、化合物３（１１０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、１．５ｍＬのＤＭＦ、及び７０μＬのトリエチルアミン（０．５ｍｍｏｌ）を混合し、反応フラスコに注入した。その透明な溶液を室温で一晩撹拌した。その混合物を分取ＨＰＬＣで精製し、濃縮したところ、約１１３ｍｇの白色固体（８１．３５％、純度９８．２３％）が得られた。¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ７．８３（ｓ，１Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），６．２０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４２（ｄｔ，Ｊ＝５．６，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｓ，１Ｈ），３．６０－３．５２（ｍ，１Ｈ），３．３８－３．１２（ｍ，１４Ｈ），２．３９（ｔｄ，Ｊ＝１２．０，１０．５，５．２Ｈｚ，１Ｈ），２．１６（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．６，６．０，２．７Ｈｚ，１Ｈ），１．４９（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３３（ｐ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．１４（ｄｔｄ，Ｊ＝２７．９，９．０，４．８Ｈｚ，５Ｈ）；ＭＳ⁺５５４，５５６。

実施例７
新たに合成されたＤＮＡへの修飾ヌクレオシド（ＰＢＩ－９３９１、ＰＢＩ－９３９２、及びＰＢＩ－９３９３）の組み込み、及びＮＡＮＯＢｉＴ技術を用いた検出を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った（図４）。５０００個の細胞／ウェルでプレートしたＡ５４９細胞を、ＰＢＩ－９３９１、ＰＢＩ－９３９２またはＰＢＩ－９３９３を含有する培地中で２０ｕΜ（淡青色のバー）または５０ｕΜ（暗青色のバー）の最終濃度において４．５時間培養した。修飾ヌクレオシドを含まない細胞を対照として使用した（褐色のバー）。修飾ヌクレオシドのＤＮＡへの組み込みは、培地を除去すること、細胞を固定して透過処理すること、ＤＮＡを変性すること、そして５０ｎＭの最終濃度で０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳに希釈したＨａｌｏＴａｇ－ＬｇＢｉＴ（ＨＴ－ＬｇＢｉＴ）及びＨａｌｏＴａｇ－ＳｍＢｉＴ（ＨＴ－ＳｍＢｉＴ）でインキュベートすることによって決定した。２時間のインキュベーション後、試薬を除去し、試料をＰＢＳで洗浄し、ＮａｎｏＬｕｃ基質を添加し、発光を測定した（図４）。

実施例８
新たに合成されたＤＮＡへの修飾ヌクレオシド（ＰＢＩ－９３９１、ＰＢＩ－９３９２、ＰＢＩ－９３９３及びＰＢＩ－７９６０）の組み込み、ならびに全てのプローブを一緒に各々最終的に５または１２．５ｕＭで加えたＮａｎｏＢｉＴ技術による検出を実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った（図５）。その実験を、実施例７に記載されているのと同様に、１ウェルあたり５，０００個及び１，０００個の細胞でプレートしたＡ５４９の細胞を用いて実施した。図５は、５ｕＭ（淡青色のバー）または１２．５ｕＭ（暗青色のバー）で添加された修飾ヌクレオシドの存在下での対照細胞（褐色のバー）と比較した光出力の増大を示す。

実施例９
修飾クロロアルカンヌクレオシドの組み込みをＤＮＡ変性なしで測定できることを実証するために、本明細書の実施形態の開発中に実験を行った（図６）。５０００個の細胞／ウェルでプレートしたＡ５４９細胞を、ＰＢＩ－７９６０を含有する培地中で１０ｕΜの最終濃度で、０．５時間（淡青色のバー）または４時間（暗青色のバー）培養した。修飾ヌクレオシドを含まない細胞を対照として使用した（褐色のバー）。修飾ヌクレオシドのＤＮＡへの組み込みは、培地を除去すること、細胞を固定して透過処理すること、ならびに２５ｎＭの最終濃度で０．０１％ＢＳＡを含むＰＢＳに希釈したＨＴ－ＬｇＢｉＴ及びＨＴ－ＳｍＢｉＴでインキュベートすることによって決定した。１時間のインキュベーション後、ＮａｎｏＬｕｃ基質を添加し、発光を測定した。

実施例１０
新たに合成されたＤＮＡへの修飾クロロアルカンヌクレオシドの組み込みを細胞溶解液中で直接測定できることを実証するために、本明細書の実施形態の開発中の実験を行った（図７）。５，０００個の細胞／ウェルでプレートしたＡ５４９細胞を、ＰＢＩ－９１９１を含有する培地中で２０ｕΜの最終濃度で２時間、３７℃（暗青色のバー）、氷上（淡青色のバー）で培養するか、またはプローブを加え、直ちに除去した（褐色のバー）。修飾ヌクレオシドのＤＮＡへの組み込みを、培地を除去すること、ＰＢＳで細胞を洗浄すること、及び３．２ｎＭの最終濃度でＨＴ－ＬｇＢｉＴ及びＨＴ－ＳｍＢｉＴを含有するパッシブ・ライシス・バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｃａｔ．Ｎｏ Ｅ１９４１）に溶解することによって決定した。１時間のインキュベーション後、ＮａｎｏＬｕｃ基質を添加し、発光を測定した。

配列
ＷＴ ＯｇＬｕｃ（配列番号１）：
ＭＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
ＷＴ ＯｇＬｕｃ Ｌｇ（配列番号２）：
ＭＦＴＬＡＤＦＶＧＤＷＱＱＴＡＧＹＮＱＤＱＶＬＥＱＧＧＬＳＳＬＦＱＡＬＧＶＳＶＴＰＩＱＫＶＶＬＳＧＥＮＧＬＫＡＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＦＱＭＧＬＩＥＭＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＩＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＰＧＩＡＶＦＤＧＫＱＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＹＤＥＲＬＩＮＰＤ
ＷＴ ＯｇＬｕｃ β９（配列番号３）：ＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮ
ＷＴ ＯｇＬｕｃ β１０（配列番号４）：ＧＶＴＧＷＲＬＣＥＮＩＬＡ
ＮａｎｏＬｕｃ（配列番号５）：
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
ＮａｎｏＬｕｃ Ｌｇ（配列番号６）：
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤ
ＮａｎｏＬｕｃ β９（配列番号７）：ＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮＶ
ＮａｎｏＬｕｃ β１０（配列番号８）：ＧＶＴＧＷＲＬＣＥＲＩＬＡ
ＬｇＢｉＴ（配列番号９）：
ＭＶＦＴＬＥＤＦＶＧＤＷＲＱＴＡＧＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＦＱＮＬＧＶＳＶＴＰＩＱＲＩＶＬＳＧＥＮＧＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＧＤＱＭＧＱＩＥＫＩＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＨＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＭＩＤＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＶＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＮＰＤＧＳＬＬＦＲＶＴＩＮ
ＳｍＢｉＴ（配列番号１０）：ＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ
ＨｉＢｉＴ（配列番号１１）：ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
ＬｇＴｒｉｐ（３５４６）（配列番号１２）：
ＭＫＨＨＨＨＨＨＶＦＴＬＤＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＭＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ
ＳｍＴｒｉｐ９（配列番号１３）：ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳ
β９／β１０ジペプチド（配列番号１４）：ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
ＳｍＴｒｉｐ１０（配列番号１５）：ＶＳＧＷＲＬＦＫＫＩＳ
ＨａｌｏＴａｇ（配列番号１６）：
ＭＡＥＩＧＴＧＦＰＦＤＰＨＹＶＥＶＬＧＥＲＭＨＹＶＤＶＧＰＲＤＧＴＰＶＬＦＬＨＧＮＰＴＳＳＹＶＷＲＮＩＩＰＨＶＡＰＴＨＲＣＩＡＰＤＬＩＧＭＧＫＳＤＫＰＤＬＧＹＦＦＤＤＨＶＲＦＭＤＡＦＩＥＡＬＧＬＥＥＶＶＬＶＩＨＤＷＧＳＡＬＧＦＨＷＡＫＲＮＰＥＲＶＫＧＩＡＦＭＥＦＩＲＰＩＰＴＷＤＥＷＰＥＦＡＲＥＴＦＱＡＦＲＴＴＤＶＧＲＫＬＩＩＤＱＮＶＦＩＥＧＴＬＰＭＧＶＶＲＰＬＴＥＶＥＭＤＨＹＲＥＰＦＬＮＰＶＤＲＥＰＬＷＲＦＰＮＥＬＰＩＡＧＥＰＡＮＩＶＡＬＶＥＥＹＭＤＷＬＨＱＳＰＶＰＫＬＬＦＷＧＴＰＧＶＬＩＰＰＡＥＡＡＲＬＡＫＳＬＰＮＣＫＡＶＤＩＧＰＧＬＮＬＬＱＥＤＮＰＤＬＩＧＳＥＩＡＲＷＬＳＴＬＥＩＳＧ
生物発光複合体の集合的塩基配列（配列番号１７）：
ＭＶＦＴＬＤＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＭＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ
ＷＴ鎖９－ＳｍＢｉＴ（配列番号１８）：ＧＳＭＬＦＲＶＴＩＮＳＶＴＧＹＲＬＦＥＥＩＬ
ＬｇＴｒｉｐ ３５４６（１－８）（配列番号１９）：
ＭＶＦＴＬＤＤＦＶＧＤＷＥＱＴＡＡＹＮＬＤＱＶＬＥＱＧＧＶＳＳＬＬＱＮＬＡＶＳＶＴＰＩＭＲＩＶＲＳＧＥＮＡＬＫＩＤＩＨＶＩＩＰＹＥＧＬＳＡＤＱＭＡＱＩＥＥＶＦＫＶＶＹＰＶＤＤＨＨＦＫＶＩＬＰＹＧＴＬＶＩＤＧＶＴＰＮＫＬＮＹＦＧＲＰＹＥＧＩＡＶＦＤＧＫＫＩＴＴＴＧＴＬＷＮＧＮＫＩＩＤＥＲＬＩＴＰＤ

Claims (53)

1. 式（Ｉ）：
   の化合物またはその塩であって、式中、
   Ｂは、核酸塩基または修飾された核酸塩基であり、限定するものではないが、修飾されたアデニン、グアニン、ウラシルまたはシトシンを含み；
   Ｌは、リンカーであり；
   Ａは、ハロアルキル基である、化合物またはその塩。
2. 式（Ｉ）が
   を含む、請求項１に記載の化合物またはその塩。
3. Ｌが、アルキル、環状アルキル、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、－Ｏ－、－ＮＨ－、及び－Ｃ（Ｏ）－から独立して選択される１つ以上の基を含む、請求項２に記載の化合物またはその塩。
4. Ｌが、－（ＣＨ₂）_m－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－Ｃ≡Ｃ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ－、及び－ＣＨ₂Ｏ－から選択される１つ以上の基を含み、
   ここで、ｍが、１～６である、請求項１もしくは２に記載の化合物またはその塩。
5. Ｌが
   から選択され、ｐ、ｑ、ｒ及びｓが、それぞれ独立して１～６である、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物またはその塩。
6. Ａが、Ｃ₂－Ｃ₁₂ハロアルキル基である、請求項１～２のいずれか１項に記載の化合物またはその塩。
7. Ａが、式：
   －（ＣＨ₂）_n－Ｘ
   を有し、式中、ｎが、４、５、６、７、または８であり、Ｘがハロである、請求項１～２のいずれか１項に記載の化合物またはその塩。
8. ｎが６であり、Ｘがクロロである、請求項７に記載の化合物。
9. 前記化合物が、式（ＩＩ）：
   から選択され、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓが、独立して１～６である、請求項２～８のいずれか１項に記載の化合物。
10. 前記化合物が、式（ＩＩＩ）：
    から選択され、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓが、独立して１～６である、請求項２～８のいずれか１項に記載の化合物。
11. 前記化合物が、式（ＩＶ）：
    から選択され、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓが、独立して１～６である、請求項２～８のいずれか１項に記載の化合物。
12. 前記化合物が、式（Ｖ）：
    から選択され、ｐ、ｑ、ｒ、及びｓが、独立して１～６である、請求項２～８のいずれか１項に記載の化合物。
13. 前記化合物が、以下：
    から選択される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物。
14. 前記化合物が、以下：
    から選択される、請求項１３に記載の化合物。
15. デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、及び請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物のうちの１つ以上を含む、ポリヌクレオチド鎖。
16. 請求項１～１４のいずれか１項に記載のハロアルキル基修飾ヌクレオシドを、細胞内でＤＮＡ複製に組み込む方法。
17. 前記細胞を請求項１～１５のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程と、前記化合物を前記細胞内に入らせる工程と、前記化合物を細胞内の酵素によって修飾デオキシヌクレオチド三リン酸に変換させる工程と、さらに前記修飾デオキシヌクレオチド三リン酸を、ＤＮＡ合成中にＤＮＡ複製に組み込ませる工程とを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞を、請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物を含有する培地中で培養する、請求項１７に記載の方法。
19. 請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法によって生成された核酸。
20. 請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法によって生成された核酸を含む細胞。
21. 細胞中の核酸を検出する方法であって：
    （ａ）前記核酸を請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法によりハロアルキル基で標識する工程と；
    （ｂ）前記細胞を溶解して、前記ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成する工程と；
    （ｃ）前記細胞溶解物を、以下：
    （ｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体のペプチド成分との第１の融合物；
    （ｉｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）前記発光複合体のポリペプチド成分との第２の融合物、及び
    （ｉｉｉ）前記発光複合体用の基質
    と接触させる工程と；
    （ｄ）前記発光複合体からの発光を検出する工程であって、前記発光複合体が、前記基質の存在下で、ポリペプチド成分のみのペプチド成分よりも大きな発光を生じ、発光は、前記発光複合体の形成を促進する前記核酸に沿った位置で前記第１の融合物及び前記第２の融合物の結合を可能にするのに十分な前記核酸のハロアルキル標識の密度を示す、工程と
    を含む、方法。
22. 細胞中の核酸を検出する方法であって：
    （ａ）前記細胞内で以下：
    （ｉ）（Ａ）ハロアルキル基に共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体のペプチド成分との第１の融合物；
    （ｉｉ）（Ａ）ハロアルキル基に共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）前記発光複合体のポリペプチド成分との第２の融合物、
    を発現する工程と、
    （ｂ）前記核酸を、請求項１３に記載の方法によりハロアルキル基で標識する工程と；
    （ｃ）前記細胞を、前記発光複合体用の基質と接触させる工程と；
    （ｄ）前記発光複合体からの発光を検出する工程であって、発光が、前記発光複合体の形成を促進する前記核酸に沿った位置で前記第１の融合物と前記第２の融合物との結合を可能にするのに十分な前記核酸のハロアルキル標識の密度を示す、工程と、
    を含む、方法。
23. 前記第１の修飾デハロゲナーゼ酵素及び前記第２の修飾デハロゲナーゼ酵素が、配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 前記発光複合体の前記ペプチド成分が、配列番号１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項２１または２２に記載の方法。
25. 前記発光複合体の前記ペプチド成分が、配列番号９と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項２１または２２に記載の方法。
26. 前記発光複合体の前記ペプチド成分が、配列番号１４と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項２１または２２に記載の方法。
27. 前記発光複合体の前記ポリペプチド成分が、配列番号１２と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項２１または２２に記載の方法。
28. 前記発光複合体用の前記基質が、セレンテラジンまたはフリマジンを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
29. 前記第１の融合物及び前記第２の融合物の発現が、前記核酸の標識後に誘導される、請求項２２に記載の方法。
30. 細胞中の核酸を検出する方法であって：
    （ａ）前記核酸を請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法によりハロアルキル基で標識する工程と；
    （ｂ）前記細胞を溶解して、前記ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成する工程と、
    （ｃ）前記細胞溶解物を、以下：
    （ｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光タンパク質との融合物、及び
    （ｉｉｉ）前記発光タンパク質のための基質
    と接触させる工程と；
    （ｄ）前記発光タンパク質からの発光を検出する工程であって、前記発光が、ハロアルキル標識核酸の量に比例する、工程と、
    を含む、方法。
31. 前記発光タンパク質のポリペプチド成分が、配列番号５と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記発光タンパク質の前記基質が、セレンテラジンまたはフリマジンを含む、請求項３０に記載の方法。
33. 前記第１の修飾デハロゲナーゼ酵素及び前記第２の修飾デハロゲナーゼ酵素が、配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項３０に記載の方法。
34. 細胞中の核酸を検出する方法であって：
    （ａ）前記核酸を請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法によりハロアルキル基で標識する工程と；
    （ｂ）前記細胞を溶解して、前記ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成する工程と；
    （ｃ）前記細胞溶解物を、以下：
    （ｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る第１の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）発光複合体の第１のペプチド成分との第１の融合物；
    （ｉｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る第２の修飾デハロゲナーゼ酵素と（Ｂ）前記発光複合体の第２のペプチド成分との第２の融合物；
    （ｉｉｉ）前記発光複合体のポリペプチド成分；及び
    （ｉｖ）前記発光複合体用の基質
    と接触させる工程と；
    （ｄ）前記発光複合体からの発光を検出する工程であって、発光が、前記発光複合体の形成を促進する前記核酸に沿った位置で前記第１の融合物と前記第２の融合物との結合を可能にするのに十分な前記核酸のハロアルキル標識の密度を示す、前記検出する工程と、
    を含む、方法。
35. 前記第１の修飾デハロゲナーゼ酵素及び前記第２の修飾デハロゲナーゼ酵素が、配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の方法。
36. 前記発光複合体の前記第１のペプチド成分が、配列番号１３と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の方法。
37. 前記発光複合体の前記第２のペプチド成分が、配列番号１５と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の方法。
38. 前記発光複合体の前記ポリペプチド成分が、配列番号１２と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項３４に記載の方法。
39. 前記発光複合体用の前記基質が、セレンテラジンまたはフリマジンを含む、請求項３４に記載の方法。
40. 発光の量が、生成されたハロアルキル標識核酸の量に比例する、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の方法。
41. 生成されたハロアルキル標識核酸の量が、前記細胞内のＤＮＡ合成速度に比例する、請求項２５に記載の方法。
42. 前記細胞内のＤＮＡ合成の速度が、細胞複製の速度に比例する、請求項２６に記載の方法。
43. 前記検出工程が、前記発光を経時的にモニタリングすることを含む、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記細胞を刺激に曝露させることと、発光に対する前記刺激の効果をモニタリングすることとをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
45. 前記刺激が、細胞死速度、細胞複製速度、及び／またはＤＮＡ合成速度における改変をもたらす、請求項４４に記載の方法。
46. 細胞内のハロアルキル標識核酸を検出する方法であって：
    （ａ）前記細胞を溶解して、前記ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成する工程と；
    （ｂ）前記細胞溶解物を、（ｉ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る修飾デハロゲナーゼ及び（ｉｉ）検出可能なシグナルを生成し得るレポーターと接触させる工程と；
    （ｃ）前記修飾デハロゲナーゼを、前記核酸上の前記ハロアルキル基に結合させる工程と；
    （ｄ）前記レポーターから前記検出可能なシグナルを検出する工程と
    を含む、方法。
47. 前記レポーターが、ルシフェラーゼ、フルオロフォア、蛍光タンパク質、または検出可能な酵素である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記ハロアルキル標識核酸に結合していない修飾デハロゲナーゼに連結されたレポーターを洗い流す工程を、工程（ｃ）と（ｄ）の間にさらに含む、請求項４６に記載の方法。
49. 細胞内のハロアルキル標識核酸を検出する方法であって：
    （ａ）前記細胞を溶解して、前記ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成する工程と；
    （ｂ）前記細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る修飾デハロゲナーゼと（Ｂ）レポーター複合体の第１の成分との第１の融合物、及び（ｉｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る修飾デハロゲナーゼと（Ｂ）レポーター複合体の第２の成分との第２の融合物と接触させる工程であって、検出可能な複合体は、前記第１の成分が前記第２の成分と接触または物理的に近接すると検出可能シグナルを生成し得る、工程と；
    （ｃ）前記修飾デハロゲナーゼを、前記核酸上の前記ハロアルキル基に結合させる工程と；
    （ｄ）前記レポーター複合体から前記検出可能なシグナルを検出する工程と
    を含む、方法。
50. 前記レポーター複合体が、分割ルシフェラーゼ、分割蛍光タンパク質、または分割検出可能酵素である、請求項４９に記載の方法。
51. 細胞内のハロアルキル標識核酸を検出する方法であって：
    （ａ）前記細胞を溶解して、前記ハロアルキル標識核酸を含む細胞溶解物を生成する工程と；
    （ｂ）前記細胞溶解物を、（ｉ）（Ａ）修飾デハロゲナーゼであって、（Ｂ）第１の波長で光を放出し得るレポーター、に連結された前記ハロアルキル基に共有結合し得る前記修飾デハロゲナーゼと、（ｉｉ）（Ａ）前記ハロアルキル基に共有結合し得る修飾デハロゲナーゼ、及び（Ｂ）前記第１の波長及び発光スペクトルと重なる励起スペクトルを有するフルオロフォアとに接触させる工程と；
    （ｃ）前記修飾デハロゲナーゼを、前記核酸上の前記ハロアルキル基に結合させる工程と；
    （ｄ）前記フルオロフォアの前記発光スペクトル内の波長を検出する工程と
    を含む、方法。
52. 前記レポーターが、ルシフェラーゼであり、かつ基質との接触の際に前記第１の波長で光を放出する、請求項５１に記載の方法。
53. システムであって：
    （ａ）請求項１～１４のいずれか１項に記載の化合物と；
    （ｂ）ハロアルキル基質と共有結合を形成し得る修飾デハロゲナーゼと、生物発光複合体のペプチド成分とを含む融合物と；
    （ｃ）ハロアルキル基質と共有結合を形成し得る修飾デハロゲナーゼと、生物発光複合体のポリペプチド成分とを含む融合物と；
    （ｄ）前記生物発光複合体用の基質と
    を含む、システム。