CN115010721A - 一种荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。其荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明的荧光探针具有水溶性和环境响应性，荧光强度能够在pH值5.0～11.0范围内相对稳定，可以用于PKM2的检测和活细胞成像。本发明的荧光探针用于检测PKM2时的荧光强度最高提高了约17倍，荧光量子产率最高提高到了52.4％，且对PKM2具有高选择性和高灵敏度。

Description

一种荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机合成技术领域，尤其涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

丙酮酸激酶(PK)催化糖酵解将磷酸从磷酸烯醇式丙酮酸转移到ADP，产生ATP和丙酮酸各一个分子。同工酶M1(PKM1)主要在分化的体细胞中表达，而PK的M2变体(PKM2)仅在干细胞和快速增殖的细胞(如大多数癌症)中表达。PKM2通过发挥大量的非代谢作用，为肿瘤的发生提供了选择性生长优势。PKM2具有二聚体和四聚体构型。在肿瘤细胞中，四聚体形式的PKM2将葡萄糖转化为乳酸以提供能量，而二聚体PKM2则合成细胞构建分子。此外，二聚体PKM2还可以作为共转录激活剂或蛋白激酶，帮助肿瘤细胞的生长和分裂。据报道，肿瘤PKM2的浓度随着肿瘤发展阶段的进展而显著增加，同时血浆中PKM2的释放也增加。因此，PKM2已被用作诊断或判断预后的标记物，以识别早期癌症或检查抗肿瘤药物的治疗反应。

然而，目前针对PKM2的荧光探针还很少，因此，有必要开发一种针对PKM2的荧光探针。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种荧光探针。

本发明还提供了一种荧光探针的制备方法。

本发明还提供了一种荧光探针的应用。

本发明的第一方面提供了一种荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

本发明关于荧光探针的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：

本发明的荧光探针具有水溶性和环境响应性，荧光强度能够在pH值5.0～11.0范围内相对稳定，可以用于PKM2的检测和活细胞成像。本发明的荧光探针用于检测PKM2时的荧光强度最高提高了约17倍，荧光量子产率最高提高到了52.4％，且对PKM2具有高选择性和高灵敏度，这是因为本发明的荧光探针是基于ICT的响应性荧光探针，其荧光基团以哌嗪基(电子供体)和(1-乙基吡啶基)作为电子受体直接共轭，形成D-π-A型分子，连接组成的推-拉电子体系。

本发明第二方面提供一种荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

将化合物4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和化合物3加入到第一有机溶剂中进行反应，得到式(Ⅰ)所示的化合物；

所述化合物3和化合物4的结构式如下：

根据本发明的一些实施方式，所述化合物3与所述化合物4的摩尔比为1：(1.2～1.5)。

根据本发明的一些实施方式，所述第一有机溶剂选自二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述反应的时间为2～6h。

根据本发明的一些实施方式，所述化合物3通过如下方法制备：

将化合物2与三氟乙酸在第二有机溶剂中进行反应，即得化合物3；

其中，所述化合物2的结构式如下所示：

根据本发明的一些实施方式，所述第二有机溶剂选自二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述反应的温度为60～80℃。

根据本发明的一些实施方式，所述化合物2通过如下方法制备：

将化合物1、1-乙基-4-甲基吡啶-1-铵和吡啶加入到溶剂中进行反应，得到化合物2；

所述化合物1的结构式如下：

根据本发明的一些实施方式，所述溶剂选自乙腈、水中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述化合物1通过如下步骤制备得到：

将4-哌嗪-1-苯甲醛、溴乙酸叔丁酯和无机碱加入到乙腈中进行反应，得到化合物1。

根据本发明的一些实施方式，所述无机碱包括碳酸钾、碳酸钠中的至少一种。

本发明的第三方面提供上述所述的荧光探针在制备活细胞成像试剂中的应用。

根据本发明的一些实施方式，所述活细胞为肿瘤细胞。

本发明的第四方面提供一种检测丙酮酸激酶M2的方法，包括如下步骤：

S1、将上述所述的荧光探针与待测试样混合；

S2、在580～600nm处测定混合溶液的荧光比值。

附图说明

图1是本发明实施例1和对比例1在不同极性溶剂中的荧光强度图；

图2是本发明实施例1和对比例1在不同pH缓冲液中的荧光强度图；

图3是本发明实施例1的选择性柱状图；

图4是本发明实施例1的细胞毒性图；

图5是本发明实施例1的线性关系图；

图6是本发明实施例1和对比例1的活细胞荧光成像图；

图7是本发明实施例1的时间和浓度关系的活细胞荧光成像图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

以下实施例及对比例中采用的原料如下：

宫颈癌细胞(HeLa细胞)：购自无锡欣润生物科技有限公司；

PKM2阴性的人肾上皮细胞：购自无锡欣润生物科技有限公司。

实施例1

首先，1-乙基-4-甲基吡啶-1-铵的制备方法如下：

将碘乙烷(1g，6.41mmol)加入4-甲基吡啶(1g，10.74mmo1)和无水乙腈(200mL)溶液中。将得到的混合物在90℃下搅拌4h。经过过滤和浓缩，硅胶闪蒸柱层析(PE：EA＝1：1)得到1-乙基-4-甲基吡啶-1-铵(718.58mg，5.89mmol，收率：91.9％)。¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ(ppm):8.66(d,J＝6.3Hz,2H),7.47(d,J＝6.2Hz,2H),4.34(q,J＝7.2Hz,2H),2.19(d,J＝5.4Hz,3H),1.15(t,J＝7.5Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,Chloroform-d)δ(ppm):158.80,143.14,128.75,56.08,22.23,16.86.

实施例1提供一种荧光探针，结构式如下，制备方法如下：

S1、在4-哌嗪-1-苯甲醛(50mg，0.26mmo1)的无水乙腈(3mL)溶液中加入溴乙酸叔丁酯(61.6mg,0.32mmol)，然后加入碳酸钾(181.6mg,1.31mmol)将得到的混合物在60℃下搅拌6h。溶液冷却到室温，沉淀物用PE：EA(1：1)过滤洗涤，真空干燥，得到化合物1(66.92mg，0.22mmol，收率：82.3％)。¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ(ppm):9.76(s,1H),7.83-7.66(m,2H),6.90(d,J＝8.9Hz,2H),3.62-3.35(m,4H),3.17(s,2H),2.84-2.59(m,4H),1.47(s,9H).¹³C NMR(125MHz,Chloroform-d)δ(ppm):190.46,169.34,154.97,131.86,127.07,113.55,81.41,59.77,52.44,46.98,28.13.

S2、将1-乙基-4-甲基吡啶-1-铵(15mg，0.12mmol)加入1(30mg，0.098mmo1)和哌啶(10uL)的无水乙腈(3mL)溶液中。将得到的混合物在80℃下搅拌6h。经过过滤和浓缩，硅胶闪蒸柱层析(DCM：MeOH＝50：1)得到化合物2(36.47mg，0.09mmol，收率：74.8％)。¹H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ(ppm):5.32(d,J＝1.1Hz,11H),4.14(qd,J＝7.2,1.3Hz,5H),3.51(d,J＝1.4Hz,9H),2.07(d,J＝1.3Hz,7H),1.28(td,J＝7.2,1.3Hz,12H).¹³C NMR(125MHz,Chloroform-d)δ(ppm):169.20,154.29,152.94,143.07,142.75,130.52,124.58,123.27,117.73,114.67,81.56,59.65,55.96,52.40,47.18,31.24,28.16,16.83.

S3、在CH₂Cl₂中加入化合物2(19mg，0.0465mmol)，向反应液中缓慢滴入三氟乙酸(0.5mL，6.53mmol)。混合物在室温下搅拌3小时。沉淀物立即出现，经过过滤，残留物用甲醇溶解，用高效液相色谱法进行纯化。通过蒸发除去溶剂，得到化合物3。

S4、将化合物4(7.5mg，0.02mmol)加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(4.6mg，0.024mmol)，1-羟基苯并三唑(HOBt)(3.7mg，0.024mmol)和化合物3(10.6mg，0.03mmol)的二甲基甲酰胺(10mL)溶液中，室温搅拌4h，立即生成沉淀，过滤，残留物用甲醇溶解，高效液相色谱(HPLC)纯化。通过蒸发除去溶剂，得到式(Ⅰ)化合物(8.87mg，0.0126mmol，收率：62.8％)。¹H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ(ppm):8.67(d,J＝6.3Hz,2H),8.42(d,J＝6.4Hz,1H),8.24(s,1H),8.05(d,J＝6.4Hz,1H),7.85–7.76(m,2H),7.60(dd,J＝16.0,9.7Hz,3H),7.33(t,J＝8.0Hz,1H),7.18(d,J＝6.3Hz,1H),7.07(t,J＝8.1Hz,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),6.81–6.69(m,1H),5.42(d,J＝15.3Hz,2H),5.31(s,1H),4.53(d,J＝7.4Hz,2H),4.26(d,J＝8.9Hz,3H),3.38(d,J＝6.2Hz,3H),3.08(d,J＝7.3Hz,3H),2.78(t,J＝5.1Hz,3H),2.68(s,4H),2.04(s,1H),1.64(t,J＝7.4Hz,3H).¹³C NMR(125MHz,Methanol-d4)δ(ppm):152.71,151.29,142.95,129.79,125.41,122.96,114.53,55.42,52.64,48.56,47.35,43.01,39.00,33.26,15.23.¹³C NMR(125MHz,Methanol-d4)δ(ppm):155.36,152.71,151.29,145.50,142.95,142.08,138.15,132.51,129.79,128.81,125.41,123.81,122.96,119.15,118.12,117.08,114.65,113.32,55.42,53.76,52.64,48.57,46.73,43.01,33.26,15.23.

对比例1

以实施例1中制备的化合物3作为对比例1。

试验例1

以本发明的实施例1和对比例1为例，检测了不同极性环境和不同pH值对荧光强度的影响。

首先以二氧六环、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇和水为溶剂进行荧光强度检测，在二甲基亚砜(DMSO)中制备了1mM实施例1化合物和对比例1化合物的原液。然后，将实施例1化合物和对比例1化合物原液分别加入二氧六环、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇中，得到最终的10μΜ染料浓度。在所有的测量中，激发波长为419nm，激发狭缝宽度为2nm，发射狭缝宽度为2nm。结果如图1所示，对比例1的化合物和实施例1的化合物从水溶液中显示出非常弱的发射，并且随着溶剂极性的降低也显示出增强的发射。对比例1的化合物和实施例1的化合物在水溶液中的发射强度随着溶液酸度的增加而增强。

进一步地，测试了pH3.0～11.0的PBS缓冲溶液对荧光强度的影响，在PBS中制备了1mM对比例1化合物和实施例1化合物的原液和1mM盐酸溶液和1mM氢氧化钠溶液。利用pH检测仪分别配置对比例1化合物与实施例1化合物的pH＝3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5和11的待测溶液，在室温下419nm激发下，在pH为3.0-11.0的PBS缓冲液中测定实施例1化合物和对比例1化合物的发射光谱图，结果如图2所示，此外，实施例1的化合物的荧光强度在pH为5.0-11.0的范围内相对稳定，这涵盖了活细胞的pH条件。因此实施例1的化合物是一种环境响应型分子，可以进一步用于PKM2的检测和成像。而对比例1的化合物的荧光强度随着pH值变化较大。

试验例2

为了评价实施例1的化合物对PKM2的选择性，选择实施例1化合物(10μM)与丙酮酸激酶M2(17.94μM)、牛血清白蛋白(17.94μM)、溶菌酶((17.94μM))、谷胱甘肽(17.94μM)、纤维素酶(17.94μM)、人血清白蛋白(17.94μM)、胃蛋白酶(PEP)(17.94μM)和乙酰胆碱酯酶(AChE)(17.94μM)在37℃作用10min，在419nm激发波长下记录荧光发射光谱。激发狭缝宽度为2nm，发射狭缝宽度为2nm。结果如图3所示，只有PKM2能显著增强实施例1的化合物的荧光强度，其他生物分子不具有上述效果。

试验例3

测试了实施例1化合物的细胞毒性，HeLa或HK-2细胞在含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养。细胞在37℃、5％CO2孵箱中孵育。MTT法检测实施例1化合物和对比例1化合物的细胞毒性作用。将不同浓度的实施例1化合物和实施例化合物(0～55μM)与HeLa细胞孵育24h。细胞与噻唑蓝溶液孵育4h。然后，用二甲基亚砜(DMSO)完全溶解噻唑蓝溶液，用多功能酶标仪(490nm)测定溶液的吸光度。进行了四联试验，结果如图4所示，实施例1的化合物在活性浓度范围内(0-50μM)对细胞活力没有明显的副作用。

试验例4

采用了实施例1的化合物检测不同浓度的PKM2蛋白，结果如图5所示，实施例1的化合物的荧光强度随PKM2浓度的增加而线性增加。17.94μM PKM2的加入使实施例1的化合物的发射强度提高了约17倍，荧光量子产率从3.7％提高到52.4％。实施例1的化合物的荧光强度与PKM2浓度呈良好的线性关系(R²＝0.996)，检测下限为35.66nM。这些结果表明，实施例1的化合物可以定量检测PKM2。

试验例5

用实施例1的化合物和对比例1的化合物进行了活体细胞成像。分别采用PKM2高表达的宫颈癌细胞HeLa和PKM2阴性的人肾上皮细胞(HK-2)。从图6中的A和B看，实施例1的化合物在HeLa细胞中发出明显的荧光信号，而在HK-2细胞中不发出明显的荧光信号。相比之下，对比例1的化合物在两种细胞中都显示出低荧光发射。因此，实施例1的化合物可用于活细胞内PKM2的荧光成像。

此外，我们对实施例1的化合物进行了时间和浓度依赖的荧光成像，结果如图7所示，其中，图7中的A表明实施例1的化合物随着时间从0.5h到6h荧光强度逐渐增大，从图7中的B表明，PKM2的浓度从0.5μM～40μM增大时，荧光强度也增大。A和B的结果如图7中C的所示。即便如此，为了验证实施例1的化合物在活细胞中对PKM2的特异性靶向性，我们使用实施例1的化合物和抗体标记的PKM2进行了荧光共定位成像。结果如图7中的D所示，在HeLa细胞中，实施例1的化合物的荧光信号与抗体显示的PKM2的荧光信号高度重叠，表明实施例1的化合物特异性地针对细胞中的PKM2。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

2.根据权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将化合物4、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑和化合物3加入到第一有机溶剂中进行反应，得到式(Ⅰ)所示的化合物；

所述化合物3和化合物4的结构式如下：

3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物3与所述化合物4的摩尔比为1：(1.2～1.5)。

4.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物3通过如下方法制备：

将化合物2与三氟乙酸在第二有机溶剂中进行反应，即得化合物3；

其中，所述化合物2的结构式如下所示：

5.根据权利要求4所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为60～80℃。

6.根据权利要求4所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物2通过如下方法制备：

将化合物1、1-乙基-4-甲基吡啶-1-铵和吡啶加入到溶剂中进行反应，得到化合物2；

所述化合物1的结构式如下：

7.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂选自二甲基甲酰胺、二氯甲烷中的至少一种。

8.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为2～6h。

9.根据权利要求1所述的荧光探针在制备活细胞成像试剂中的应用。

10.一种检测丙酮酸激酶M2的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将如权利要求1所述的荧光探针与待测试样混合；

S2、在580～600nm处测定混合溶液的荧光比值。

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