JP2024513713A

JP2024513713A - クローディン－３を標的とするキメラ抗原受容体および癌を治療する方法

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Publication number: JP2024513713A
Application number: JP2023557116A
Authority: JP
Inventors: トーマス、サウスゲート
Original assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2022-03-17
Publication date: 2024-03-27
Also published as: CN117377691A; EP4308605A1; CA3212615A1; KR20230160307A; US20230192842A1; AR125136A1; TW202304960A; BR112023018987A2; WO2022195535A1

Abstract

ヒトクローディン－３の、配列番号１３のＮ３８およびＥ１５３を少なくとも含んでなる不連続エピトープに結合する抗原結合タンパク質を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が記載される。また、本明細書に記載されるものとして、抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲ、ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞、免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物、および免疫エフェクター細胞で癌を治療する方法も含まれる。

Description

本発明は、細胞結合タンパク質の少なくとも１つのエピトープと結合する抗原結合タンパク質を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞結合タンパク質は細胞間結合内に位置し、細胞結合タンパク質の前記の１以上のエピトープは、癌細胞でのみ、前記ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能および／または利用可能であるＣＡＲに関する。

養子Ｔ細胞療法は、癌患者にとって治癒の可能性を持った画期的な治療法である。これらの強力な自家細胞療法を患者に合わせて操作するために、末梢血を用いてＴ細胞を得、遺伝的に改変する。これらの細胞にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を導入することで、選択抗原に特異的に結合できるようになる。これらの改変された細胞を、一致する抗原を発現する癌細胞に輸送して、その後死滅させる目的で、ｅｘｖｉｖｏで増殖させ、患者に再注入する(Yeku et al., Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2017; 37: 193-204; McBride et al., Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2019; 11(5): e1557)。

ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性、機能および持続性をリダイレクトする合成抗原受容体である。ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化ドメイン、例えば、ＣＤ３複合体のζ鎖、および共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８または４－１ＢＢに融合された単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗原結合タンパク質の抗原特異的領域から構成される。この構成は、抗原特異的活性化を促進し、ヒト初代Ｔ細胞の増殖および抗アポトーシス機能を増強する。

ＣＡＲ－Ｔ細胞は、様々な液性腫瘍であるＢ細胞悪性腫瘍に対して顕著な有効性を示しており、初期の臨床試験の結果では、多発性骨髄腫における活性が示唆されている(Sadelain et al., Nature. 2017; 545(7655): 423-31; June et al., N Engl J Med. 2018; 379(1): 64-73; Brudno et al., Nat Rev Clin Oncol. 2017; 15(1): 31-46)。リンパ腫および白血病に対するＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔの２０１７年のＦＤＡ承認により、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞開発への集中的な取り組みが再活性化された。しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法はこれまで固形腫瘍において限定的な有効性しか示していない。

固形癌に対する安全で効果的なＴ細胞療法を開発するためには、Ｔ細胞は製造中、高く有効な殺傷能を保持し、腫瘍に移動することができ、免疫抑制性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を克服しなければならない。主要な成功要因の一つは抗原標的の選択である。通常、標的化のために選択される抗原は、癌細胞表面で十分な量が発現しているが、正常組織での発現は低く抑えられ、健常細胞との低い交差反応性（オフターゲット効果およびオンターゲット効果の両方）を確保する。固形腫瘍におけるＣＡＲ免疫療法は、主として、発現が悪性組織に限定される適切な表面抗原がないために、依然として困難である。抗原標的の腫瘍外発現は、罹患臓器組織によって様々な程度の重症度で、オンターゲット毒性を引き起こす可能性がある(Watanabe et al., Front Immunol. 2018; 9: 2486; Park et al., Sci Rep. 2017; 7(1): 14366)。

よって、ＣＡＲ免疫療法のための、特に固形腫瘍および癌に対するＴ細胞療法を開発するための新たな標的を特定する必要がある。

第１の側面によれば、以下のドメイン：
ａ）ヒトクローディン－３の、配列番号１３のＮ３８およびＥ１５３を少なくとも含んでなる不連続エピトープに結合する単離されたクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；ならびに
ｃ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。

さらなる側面において、以下のドメイン：
ａ）配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列；配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列；配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列を含んでなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなるクローディン－３結合ドメインを含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；ならびに
ｃ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなるポリペプチドを含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。

さらなる側面において、ヒトクローディン－３の、配列番号１３の少なくともＮ３８およびＥ１５３を含んでなる不連続エピトープに結合する単離されたクローディン－３結合タンパク質が提供される。

さらなる側面において、配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列；配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列；配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列を含んでなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなるクローディン－３結合タンパク質が提供される。

さらなる側面において、本明細書に開示されるＣＡＲまたはクローディン－３結合タンパク質のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが提供される。

他の側面によれば、本明細書に開示されるＣＡＲまたはクローディン－３結合タンパク質をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチド、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列を含んでなるベクター、ならびに本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列および／またはベクターを含んでなるベクター産生細胞が提供される。

別の側面において、本明細書に開示されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含んでなる免疫エフェクター細胞が提供される。

別の側面において、本明細書に開示される免疫エフェクター細胞またはクローディン－３結合タンパク質と、薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物が提供される。

別の側面において、本明細書に開示されるＣＡＲを含んでなる免疫エフェクター細胞を作製する方法が提供され、前記方法は、免疫エフェクター細胞に本明細書に開示されるポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを導入することを含んでなる。

別の側面において、癌の治療における使用のための、本明細書に開示されるＣＡＲ、クローディン－３結合タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物が提供される。

別の側面において、対象において癌を治療する方法が提供され、前記方法は、対象に治療上有効な量の本明細書に開示される、ＣＡＲもしくはクローディン－３結合タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物を投与することを含んでなる。

別の側面において、癌を有する対象において癌細胞に対する細胞傷害性を増加させる方法が提供され、前記方法は、対象に有効量の本明細書に開示されるＣＡＲもしくはクローディン－３結合タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物を投与することを含んでなる。

別の側面において、癌を有する対象において癌細胞の数を減らす方法が提供され、前記方法は、対象に有効量の本明細書に開示されるＣＡＲもしくはクローディン－３結合タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物を投与することを含んでなる。

別の側面において、癌の治療のための医薬の製造における本明細書に開示されるＣＡＲもしくはクローディン－３結合タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物の使用が提供される。

別の側面において、療法における使用のための本明細書に開示されるＣＡＲもしくはクローディン－３結合タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物が提供される。

図１は、癌細胞と健常な非癌性細胞（「正常細胞」）における結合のためのクローディン－３の接近性を示す概略図である。ＣＬＤＮ３は、上皮細胞間の密着結合（ＴＪ）の形成に重要な内在性膜タンパク質の大きなファミリーに属す。正常組織構造の破壊は癌の特徴であり、変化したＣＬＤＮ３の発現は、大腸癌、乳癌、膵臓癌および卵巣癌などの強いアンメットニーズを有するものを含む種々の上皮癌の発生に関連づけられている(Singh, Sharma, and Dhawan 2010)。示されているように、ＣＬＤＮ３は、健常組織ではそうでないが、腫瘍ではＴＪの外側に不適切に局在している。このメカニズムにより、ＣＬＤＮ３は、ＣＬＤＮ３が密着結合に隠れている正常細胞を温存しつつ、腫瘍細胞を選択的に殺傷するためのＣＡＲ－Ｔ細胞標的となる。図２は、ＬＮＧＦＲ＋細胞の頻度を示す図である。図２Ａ：ＬＮＧＦＲ＋ＣＡＲ－Ｔバッチの濃縮。機能アッセイで使用するための１００％ＣＡＲ－Ｔ細胞集団を作製するために、ＣＡＲ－Ｔバッチに対してＥａｓｙＳｅｐＬＮＧＦＲ陽性選択を行った。図２Ｂ：ＬＮＧＦＲ＋細胞の必要頻度へのＣＡＲ－Ｔバッチ間の均一化。全構築物で３０％の形質導入効率を達成するために、非形質導入Ｔ細胞を加えてＣＡＲ－Ｔバッチを均一化した。図３Ａは、非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞および形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞のベースのＩＦＮγサイトカイン分泌プロファイルを示す図である。６名の異なる健常ドナーから得たＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた培養上清中のＩＦＮγの分泌濃度の平均および標準偏差（^＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法一元配置分散分析により算出；ＵＴ＝非形質導入）。図３Ｂ－Ｇは、非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞および形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞のベースの疲弊／活性化表現型（ＣＤ６９^＋、ＴＩＭ３^＋およびＰＤ－１^＋）を示す図である。平均および標準偏差を示す（ｐ値は、＜０．０２～＜０．０００１である。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ一元配置分散分析により算出；ＵＴ＝非形質導入）。図３Ｈは、形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ特異的ｐＣＤ３ζレベル（ＰＥＧＧＹ－ＳＵＥにより評価）を示す図である。陰性対照（抗ＣＤ１９ＣＡＲ）に対して正規化したｐＣＤ３ζ染色を示す。図４Ａは、クローディンタンパク質に応答したＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦαの分泌を示す図である。ｈＣＬＤＮ３、ｈＣＬＤＮ４、ｈＣＬＤＮ５、ｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ８、ｈＣＬＤＮ９、ｈＣＬＤＮ１７またはｍＣＬＤＮ３を過剰発現するＲＫＯＫＯ細胞株と共培養した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞または抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン放出の定量値（ｎ＝３の平均＋９５％信頼限界）である。図４Ｂ－Ｃは、クローディンタンパク質に応答したＩＦＮγの分泌を示す図である。ｈＣＬＤＮ３、ｈＣＬＤＮ４、ｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ９またはｍＣＬＤＮ３を過剰発現するＲＫＯＫＯと共培養した抗クローディン－３ＣＡＲＴ細胞、抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（対照）または非形質導入Ｔ細胞からのサイトカイン放出を示す。図４Ｂ：６名のドナーの平均＋９５％信頼限界として表したＩＦＮγの濃度。図４Ｃ：クローディンタンパク質を発現する細胞株とともに培養した場合の抗ＣＤ１９対照Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞と比較した、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌の倍率変化。図４Ｄ－Ｅは、クローディンタンパク質に応答して分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。サイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）が、対照Ｔ細胞とともに培養されたＲＫＯＫＯと比較した各条件の倍率変化を表すヒートマップに重ねられている。各試験およびドナー内で倍率変化を計算し、対数変換する。左の列に示された特定のドナーのＩＦＮγ（上のパネル）およびＩＬ－２（下のパネル）のデータを示す。図４Ｆは、クローディンタンパク質に応答して分泌されたサイトカインのレベルを示す図である。サイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）が、対照Ｔ細胞とともに培養されたＲＫＯＫＯと比較した各条件の倍率変化を表すヒートマップに重ねられている。各試験およびドナー内で倍率変化を計算し、対数変換する。左の列に示された、特定のドナーのＴＮＦαのデータを示す。図５Ａは、クローディンタンパク質を発現するＲＫＯＫＯ細胞と共培養した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の画像を示す。これらの画像は、ｈＣＬＤＮ３、ｈＣＬＤＮ４、ｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ９またはｍＣＬＤＮ３を発現する各細胞株について４日目に取得した。左のパネル：画像は、集密度％を算出するために使用した細胞領域を囲む黄色の線で示されるマスクと重ねられている。右のパネル：ＣＹＴＯＴＯＸレッド色素の強度および局在を示す赤色蛍光と重ねられている。図５Ｂは、クローディンタンパク質を発現するＲＫＯＫＯ細胞と共培養した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の画像を、４日間２時間毎に取得し、各時点の各ウェルの集密度％をＩＮＣＵＣＹＴＥソフトウエアで算出した結果を示す。この試験では、６名のドナーを３反復で用いた。３反復のウェルの平均を算出し、当該図の各点は６名のドナーの平均±ＳＥＭを表す。図６は、クローディンファミリータンパク質に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性応答を示す図である。抗クローディン－３ＣＡＲ（「９０６－００９」）、抗ＣＤ１９ＣＡＲ（「ＣＤ１９」；対照）および非形質導入Ｔ細胞（「ＵＴ」）を、ｈＣＬＤＮ３、ｈＣＬＤＮ４、ｈＣＬＤＮ６、ｈＣＬＤＮ９またはｍＣＬＤＮ３を発現するＲＫＯＫＯ細胞と４日間共培養した。ＣＹＴＯＴＯＸレッドの吸光度および結果としての赤色蛍光を、マスクを用いて分析し、このデータを用いて生細胞％を算出した。１名の代表的ドナーからのデータを３反復のウェルの平均±ＳＥＭとして表す。図７は、定量ビーズを用いた表面分子の定量結果を示す図である。図７Ａ：Ｔ細胞当たりのＬＮＧＦＲ分子の平均数。Ｔ細胞およびＱｕａｎｔｕｍＳｉｍｐｌｙＣｅｌｌｕｌａｒ定量ビーズを抗ＬＮＧＦＲＰＥで染色し、それらの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。ビーズのＭＦＩを用いて標準曲線を作成し、これを用いて細胞当たりのＬＮＧＦＲ数を内挿した。ドナー１２０３１および９２０２４についてはｎ＝３であり、ドナーＤ５についてはｎ＝５であり、エラーバーは標準偏差を示す。図７Ｂ：ＲＫＯヒト結腸癌細胞におけるｈＣＬＤＮ３発現の定量値。内在性のｈＣＬＤＮ３をノックアウトした後にｈＣＬＤＮ３を発現するように操作したＲＫＯ細胞を、ｈＣＬＤＮ３の低発現または高発現に関して選別した。ＲＫＯ細胞およびＱｕａｎｔｕｍＳｉｍｐｌｙＣｅｌｌｕｌａｒ定量ビーズを抗ｈＣＬＤＮ３－ＰＥで染色し、それらのＭＦＩを測定した。ビーズのＭＦＩを用いて標準曲線を作成し、これを用いて細胞当たりのｈＣＬＤＮ３数を内挿した。４反復で測定し、エラーバーは標準偏差を示す。図８は、ＩＮＣＵＣＹＴＥおよびＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ殺傷アッセイの例を示す図である。ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｌ１４とともに９０時間インキュベートした、ＬＮＧＦＲ濃縮抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ａ）または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｂ）のＩＮＣＵＣＹＴＥ生データを示す。図８Ａ～８Ｂの生データに基づく殺傷曲線例を図８Ｃに示す。３反復で測定し、エラーバーは標準偏差を示す。図８Ｄは、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ殺傷アッセイの例を示す。ＨＴ－２９－ＬＵＣ標的細胞株と１：１比で共培養した、無選別抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞の正規化データを示す。データをｎ＝３の平均±標準偏差として表す。図９は、様々な数のＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３発現標的細胞を用いたＩＮＣＵＣＹＴＥ殺傷アッセイを示す。ＲＫＯ－ＫＯおよびＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３ポリクローナル細胞を様々な比率で混合し、抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した。生細胞％を経時的に測定した。３反復で測定し、エラーバーは標準偏差を示す。図１０Ａ－Ｂは、ｈＣＬＤＮ３発現の勾配によるＴ細胞用量応答性を示す図である。ＲＫＯ－ＫＯ細胞は、勾配のあるｈＣＬＤＮ３ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションに供され、３名のドナーから作製した、ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞および抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した。図１０Ａ：ｈＣＬＤＮ３ｍＲＮＡのヌクレオフェクション量に対する、フローサイトメトリーにより評価したｈＣＬＤＮ３の発現。このデータは、平均蛍光強度または標的陽性集団の％として表されている。ｍＲＮＡ量と平均蛍光強度の間の相関に関して、ピアソンのＲ^２を算出した。図１０Ｂ：共培養の後、ＣＤ６９発現を特定するために抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を染色した。ＣＤ６９発現％を、３名のドナーの平均＋９５％ＣＩとして示す。図１０Ｃ－Ｄは、ｈＣＬＤＮ３発現の勾配によるＴ細胞用量応答性を示す図である。ＲＫＯ－ＫＯ細胞は、勾配のあるｈＣＬＤＮ３ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションに供され、３名のドナーから作製した、ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞および抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した。共培養上清を用いて、Ｔ細胞により分泌されたサイトカインの濃度を定量した。図１０Ｃ：３名のドナーの平均＋９５％信頼区間として表されるＩＦＮγ ｐｇ／ｍＬ。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞と抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌の比率。図１０Ｄ：３名のドナーの平均＋９５％信頼区間として表されるグランザイムＢｐｇ／ｍＬ。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞と抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞からのグランザイムＢ分泌の比率。図１１Ａは、適応症：大腸癌由来の細胞株に応答した、フローサイトメトリーおよびＲＴ－ｑＰＣＲによるＣＬＤＮ３発現ならびにＩＦＮγ分泌を示す図である。ｈＣＬＤＮ３発現をフローサイトメトリーによりタンパク質レベル（左）で、またＲＴ－ｑＰＣＲによりｍＲＮＡレベル（中央）で測定した。ＨＴ－２９－ＬＵＣ細胞株およびＲＫＯ－ＫＯ細胞株を総ての試験にそれぞれ陽性対照および陰性対照として含めた。また、適応症由来の細胞株に応答したＩＦＮγ分泌も評価した。Ｔ細胞を標的細胞株とともに１：１比で２４時間インキュベートし、ＩＦＮγ分泌をＭＳＤにより測定した（右）。図１１Ｂは、適応症：膵臓癌由来の細胞株に応答した、フローサイトメトリーおよびＲＴ－ｑＰＣＲによるＣＬＤＮ３発現ならびにＩＦＮγ分泌を示す図である。ｈＣＬＤＮ３発現をフローサイトメトリーによりタンパク質レベル（左）で、またＲＴ－ｑＰＣＲによりｍＲＮＡレベル（中央）で測定した。ＨＴ－２９－ＬＵＣ細胞株およびＲＫＯ－ＫＯ細胞株を総ての試験にそれぞれ陽性対照および陰性対照として含めた。また、適応症由来の細胞株に応答したＩＦＮγ分泌も評価した。Ｔ細胞を標的細胞株とともに１：１比で２４時間インキュベートし、ＩＦＮγ分泌をＭＳＤにより測定した（右）。図１１Ｃは、適応症：乳癌由来の細胞株に応答した、フローサイトメトリーおよびＲＴ－ｑＰＣＲによるＣＬＤＮ３発現ならびにＩＦＮγ分泌を示す図である。ｈＣＬＤＮ３発現をフローサイトメトリーによりタンパク質レベル（左）で、またＲＴ－ｑＰＣＲによりｍＲＮＡレベル（中央）で測定した。ＨＴ－２９－ＬＵＣ細胞株およびＲＫＯ－ＫＯ細胞株を総ての試験にそれぞれ陽性対照および陰性対照として含めた。また、適応症由来の細胞株に応答したＩＦＮγ分泌も評価した。Ｔ細胞を標的細胞株とともに１：１比で２４時間インキュベートし、ＩＦＮγ分泌をＭＳＤにより測定した（右）。図１２は、選択した細胞株の殺傷画像および生データの例を示す図である。完全な殺傷性を示した２つの細胞株（ＨＴ－２９－ＬＵＣおよびＭＤＡＭＢ４６８）、部分的な殺傷性を示した３つの細胞株（ＨＣＣ１９５４、ＨＰＡＣおよびＢｘＰＣ３）および殺傷性を示さなかった１つの細胞株（ＣＯＬＯ－３２０ＤＭ）の画像（上）および生データ（下）の例を示す。生データは、ウェル当たりのＣＹＴＯＴＯＸレッドの合計として示す。データは、異なる細胞株間で正規化できず、生データでの比較のみ可能であるので、生データを使用した。図１３は、プロテインＬ－ビオチン（一次）染色および抗ビオチン－ＰＥ（二次）染色により決定したＣＡＲ発現を示す図である。形質導入効率はＬＮＧＦＲ－ＰＥ染色により決定した。ここでは、命名されたＣＡＲバリアントを形質導入した後７日目の例示的なドナーＤ５のＣＡＲおよびＬＮＧＦＲの頻度を示す。図１４は、ＣＡＲＴ細胞（ドナーＤ５）による殺傷アッセイの結果を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞とルシフェラーゼを形質導入したＴ－４７Ｄ細胞との共培養においてルシフェラーゼ活性を測定した後に、溶解した標的細胞の頻度を算出した（各データ点は技術的反復の平均を表す。ｎ＝２）。図１５は、種々のｓｃＦｖ構築物を有する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞に応答して分泌したサイトカインの濃度を、ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカイン１２キット（ヒト）を用いて決定した結果を示す図である。Ｔ細胞とＴ－４７Ｄ細胞との共培養またはＴ細胞単独の上清を回収し、分析した（無希釈）。Ｔ細胞ドナーＤ５のＩＦＮγ（図１５Ａ）、ＩＬ－２（図１５Ｂ）およびＴＮＦ－α（図１５Ｃ）の分泌濃度を示す。図１６Ａ－Ｂは、ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１（ＲＫＯ－ｈＣＬＤ３として標識）細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞（ドナーＧ５）の長期共培養の結果（ドナーＧ５について１および２回目（図１６Ａ－Ｂ））を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞を合計３回、新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞に移した。ＧＦＰを発現するＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１の増殖を、ＩＮＣＵＣＹＴＥを用いて緑の目的集密度（％）でモニタリングし、最初の値（４時間目）に対して正規化した。図１６Ｃ－Ｄは、ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１（ＲＫＯ－ｈＣＬＤ３として標識）細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞（ドナーＧ５およびＨ５）の長期共培養の結果（ドナーＧ５について３回目（図１６Ｃ）、ドナーＨ５について１回目（図１６Ｃ）を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞を合計３回、新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞に移した。ＧＦＰを発現するＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１の増殖を、ＩＮＣＵＣＹＴＥを用いて緑の目的集密度（％）でモニタリングし、最初の値（４時間目）に対して正規化した。反復のない条件には星マーク（＊）を付けた。図１６Ｅ－Ｆは、ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１（ＲＫＯ－ｈＣＬＤ３として標識）細胞とＣＡＲ－Ｔ細胞（ドナーＨ５）の長期共培養の結果（ドナーＨ５について２および３回目（図１６Ｅ－Ｆ））を示す図である。ＣＡＲ－Ｔ細胞を合計３回、新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞に移した。ＧＦＰを発現するＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１の増殖を、ＩＮＣＵＣＹＴＥを用いて緑の目的集密度（％）でモニタリングし、最初の値（４時間目）に対して正規化した。反復のない条件には星マーク（＊）を付けた。図１７Ａ－Ｂは、抗ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）－ＶｉｏＢｌｕｅ、抗ＰＤ－１（ＣＤ２７９）－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０および抗ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）－ＡＰＣを用いて染色することにより決定した疲弊マーカー発現を示す図である。ＬＮＧＦＲ－陽性Ｔ細胞を、二重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１；黒丸で示す）および三重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＬＡＧ３；黒四角で示す）について評価した。ドナーＨおよびドナーＰの二重および三重陽性ＣＡＲＴ細胞の頻度を示す。０日目は標的細胞を加える前の頻度を、１日目は標的細胞の１回目の添加の後の頻度を示す。１、２および３日目に新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞を加えた。ドナーＨおよびドナーＰそれぞれの０日目（図１７ＡおよびＢ）の結果を示す。図１７Ｃ－Ｄは、抗ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）－ＶｉｏＢｌｕｅ、抗ＰＤ－１（ＣＤ２７９）－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０および抗ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）－ＡＰＣを用いて染色することにより決定した疲弊マーカー発現を示す図である。ＬＮＧＦＲ－陽性Ｔ細胞を、二重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１；黒丸で示す）および三重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＬＡＧ３；黒四角で示す）について評価した。ドナーＨおよびドナーＰの二重および三重陽性ＣＡＲＴ細胞の頻度を示す。０日目は標的細胞を加える前の頻度を、１日目は標的細胞の１回目の添加の後の頻度を示す。１、２および３日目に新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞を加えた。ドナーＨおよびドナーＰそれぞれの１日目（図１７ＣおよびＤ）の結果を示す。図１７Ｅ－Ｆは、抗ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）－ＶｉｏＢｌｕｅ、抗ＰＤ－１（ＣＤ２７９）－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０および抗ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）－ＡＰＣを用いて染色することにより決定した疲弊マーカー発現を示す図である。ＬＮＧＦＲ－陽性Ｔ細胞を、二重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１；黒丸で示す）および三重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＬＡＧ３；黒四角で示す）について評価した。ドナーＨおよびドナーＰの二重および三重陽性ＣＡＲＴ細胞の頻度を示す。０日目は標的細胞を加える前の頻度を、１日目は標的細胞の１回目の添加の後の頻度を示す。１、２および３日目に新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞を加えた。ドナーＨおよびドナーＰそれぞれの２日目（図１７ＥおよびＦ）の結果を示す。図１７Ｇ－Ｈは、抗ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）－ＶｉｏＢｌｕｅ、抗ＰＤ－１（ＣＤ２７９）－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０および抗ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）－ＡＰＣを用いて染色することにより決定した疲弊マーカー発現を示す図である。ＬＮＧＦＲ－陽性Ｔ細胞を、二重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１；黒丸で示す）および三重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＬＡＧ３；黒四角で示す）について評価した。ドナーＨおよびドナーＰの二重および三重陽性ＣＡＲＴ細胞の頻度を示す。０日目は標的細胞を加える前の頻度を、１日目は標的細胞の１回目の添加の後の頻度を示す。１、２および３日目に新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞を加えた。ドナーＨおよびドナーＰそれぞれの３日目（図１７ＧおよびＨ）の結果を示す。図１７Ｉ－Ｊは、抗ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）－ＶｉｏＢｌｕｅ、抗ＰＤ－１（ＣＤ２７９）－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０および抗ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）－ＡＰＣを用いて染色することにより決定した疲弊マーカー発現を示す図である。ＬＮＧＦＲ－陽性Ｔ細胞を、二重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１；黒丸で示す）および三重陽性疲弊マーカー発現（ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＬＡＧ３；黒四角で示す）について評価した。ドナーＨおよびドナーＰの二重および三重陽性ＣＡＲＴ細胞の頻度を示す。０日目は標的細胞を加える前の頻度を、１日目は標的細胞の１回目の添加の後の頻度を示す。１、２および３日目に新鮮なＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞を加えた。ドナーＨおよびドナーＰそれぞれの６日目（図１７ＩおよびＪ）の結果を示す。図１８は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６－００９）が、クローディン－３陽性標的細胞による刺激後に、他のスペーサーまたは配向バリアントを有する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６－００２、９０６－００４および９０６－００７）と比較してクローディン－３特異的増殖応答を増強することを示す図である。図１９Ａは、ＨＴ－２９ヒト結腸腺癌細胞株を接種したＮＳＧマウスにおける増殖速度を示す図である。接種７日後、腫瘍は触知可能であり、動物にＰＢＳ（Ｔ細胞非含有）、抗ＣＤ１９（対照ＣＡＲ）または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を１×１０^７細胞の用量で投与した。投与日をＤ０とする。図１９Ａ：各群、各測定時点での腫瘍体積の結果を９５％信頼区間の周辺平均として表す。図１９Ｂは、ＨＴ－２９ヒト結腸腺癌細胞株を接種したＮＳＧマウスにおける増殖速度を示す図である。接種７日後、腫瘍は触知可能であり、動物にＰＢＳ（Ｔ細胞非含有）、抗ＣＤ１９（対照ＣＡＲ）または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を１×１０^７細胞の用量で投与した。投与日をＤ０とする。図１９Ｂ：陰性対照抗ＣＤ１９群に対する各群の平均腫瘍体積間の差を示す。負の値が大きいほど、抗ＣＤ１９群は比較群よりも大きな腫瘍を有することを示す。統計的有意性を示すために星を記した：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。図２０は、ＣＡＲ－Ｔを投与したＮＳＧマウスの末梢血において、投与２８日後にフローサイトメトリーにより分析した、ヒトＣＤ３細胞集団（ＣＤ４５^＋、ＣＤ３^＋ＬＮＧＦＲ^＋）にゲートを設定したＬＮＧＦＲ陽性（＋）ＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージ（％）を示す図である。ＰＢＳ群（Ｔ細胞非含有）の６匹のマウス、抗ＣＤ１９ＣＡＲ群の３匹のマウスおよび抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞群の８匹のマウスは、２８日目になお試験中であったことに留意されたい。図２１は、ＰＢＳ（Ｔ細胞非含有）、抗ＣＤ１９（対照ＣＡＲ）－Ｔ細胞または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞投与前および投与後７日目のＨＴ－２９腫瘍担持ＮＳＧマウスの血清で測定されたＩＦＮγ放出を示す図である。各群Ｎ＝６～８匹のマウス、１データ点は、採取可能な血液容量によって、各マウスにつき単回の測定または技術的対照２反復もしくは３反復の平均を表す。図２１Ａ：処置前および処置後の群当たりのＩＦＮγ放出量（ｐｇ／ｍＬ）を表す。ＨＤは、最高密度を表す。図２１Ｂ：抗クローディン－３ＣＡＲと抗ＣＤ１９ＣＡＲ対照の間の処置前と処置後のＩＦＮγ放出の比較。抗クローディン－３ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ＣＡＲ群と比較した場合、ＩＦＮγ放出の１５倍の増加を示す。この変化が１倍の変化よりも大きいベイズの事後確率（すなわち、ＩＦＮγが処置で少しでも増加する確率）は９８．２％である。これは抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞による処置後にＩＦＮγが増加する高い確率を示す。図２２は、フローサイトメトリーによる大腸癌患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルの特性評価結果を示す図である。一方の試験はモデルＣＲ５０５２、ＣＲ５０８０、ＣＲ８９（パネルＡ、左側）を用い、他方の試験はモデルＣＲ５０３０、ＣＲ５０８７（パネルＢ、右側）を用いる２つの別個の試験において解凍後に検出されたＥｐＣＡＭ－ＣＬＤＮ３二重陽性（＋）細胞集団のパーセンテージ（％）をまとめている。両試験で、ＣＬＤＮ３陽性細胞株（ＨＴ－２９Ｌｕｃ、ＨＴ－２９と呼称）および陰性対照（ＲＫＯ－ＫＯ）細胞株を含めた。ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞集団のパーセンテージは、ＣＲモデルで４１～６５％であった。第１の試験では（パネルＡ、左側）、３４．６～５５．４％の範囲のＣＬＤＮ３発現腫瘍細胞が見られた。第２の試験では（パネルＢ、右側）、ＣＬＤＮ３発現腫瘍細胞のパーセンテージは２６～３８％であった。さらに、予想されたように、陽性対照（ＨＴ－２９）では高いＣＬＤＮ３発現が検出され、ＲＫＯ－ＫＯ細胞（陰性対照）ではＣＬＤＮ３は検出されなかった。ＯＶＰＤＸモデルは、ＥｐＣＡＭ－ＣＬＤＮ３二重陽性細胞を含む集団がサンプル中に存在しなかったことから、示されていない。各試験は、各モデルに１つの腫瘍サンプルを表す。これらの試験は、各モデルにつき複数の生物学的反復を可能にする、将来的なＰＤＸのｉｎｖｉｔｒｏアッセイのために、標的発現に着目したＰＤＸサンプルの特徴を設定するのに役立った。図２３は、一方の試験はモデルＣＲ５０３０、ＣＲ５０８７、ＯＶ５２８７（パネルＡ、左側；図２３Ａ、２３Ｃ、２３Ｅ）を用い、他方の試験はモデルＣＲ５０５２、ＣＲ５０８０、ＣＲ８９（パネルＢ、右側；図２３Ｂ、２３Ｄ、２３Ｆ）を用いる２つの共培養試験のサイトカイン放出を示す図である。両試験とも、対照細胞株ＨＴ－２９Ｌｕｃ（ＨＴ－２９、陽性対照と呼称）およびＲＫＯ－ＫＯ（陰性対照）を、パネルＡではウェル当たり５０，０００細胞で、パネルＢではウェル当たり２５，０００細胞で、またＴ細胞単独ではウェル当たり５０，０００細胞で行った。ＣＡＲ－Ｔ細胞（エフェクター）をＰＤＸ細胞（標的）に１：１の標的のエフェクターに対する比で加えた。サイトカインは、ＣＬＤＮ３発現の低いモデルＯＶ５２８７を含め、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞との総ての共培養物で上昇したが、ＣＬＤＮ３陰性対照ＲＫＯ－ＫＯおよびＴ細胞単独では上昇しなかった。各試験では、１名のＴ細胞ドナーで各モデルにつき１回の生物学的反復（腫瘍）を、利用可能な細胞数によって技術的２反復または３反復で使用した。これらのパイロット試験データについては、統計分析は行わなかった。図２４は、Ｂ細胞と比較した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２０＿９０６＿００９）の利用可能なＣＤ２０結合部位を示す図である。各条件について、ＣＤ２０^＋抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２０＿９０６＿００９）およびＢ細胞の蛍光強度中央値を用いて、ＣＤ２０結合部位の数を算出した。図２５は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の試験条件の概略を示す図である。図２６は、種々のＣＤＣ条件でのＣＤ２０発現を欠く細胞の割合の比較を示す図である。混合モデルは、４時間後に生存しているＣＴＶ細胞の割合について二項比率に固定した。補体および抗体の総ての組合せと、それらのＣＤ２０発現に対するの相互作用との固定効果。次に、ランダム効果をスプリットプロットデザインに当てはめ、ランダム切片内のドナーをランダム切片とした。図２７Ａ－Ｃは、スプライス部位の最適化（ＳＯ）を行った場合と行わなかった場合の、ＣＤ２０^＋抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２０＿９０６＿００９）および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６＿００９）を用いたＡＤＣＣによるＣＡＲ－Ｔ欠失を示す図である。種々のＡＤＣＣ条件でのＲＴＸ：ＨＩとＲＴＸ：ＲＡＢの間の「ＣＴＶ割合」の比率を示す。ＣＡＲＴ細胞はＦ（Ａｂ）２によるＣＡＲ発現を増強した。図２７Ｄ－Ｅは、スプライス部位の最適化（ＳＯ）を行った場合と行わなかった場合の、ＣＤ２０^＋抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２０＿９０６＿００９）および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６＿００９）を用いたＡＤＣＣによるＣＡＲ－Ｔ欠失を示す図である。種々のＡＤＣＣ条件でのＲＴＸ：ＨＩとＲＴＸ：ＲＡＢの間の「ＣＴＶ割合」の比率を示す。ＣＡＲＴ細胞はＦ（Ａｂ）２によるＣＡＲ発現を増強した。図２８は、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ細胞傷害性アッセイの２０時間目に生存している、ＣＤ２０^＋抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２０＿９０６＿００９）および対照抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６＿００９）の細胞生存率を示す図である。このデータには、線形混合効果モデルが当てはまる。生存率％は応答としてモデル化され、ＣＡＲは固定効果としてモデル化される。これはスプリットプロットデザインであるため、個々のアッセイおよびアッセイ内にネストされたドナーにランダム効果が含まれる。ＣＡＲ対間での期待生存率％の差を求めるために線形対比を使用し、これらをｐ値および９５％信頼区間とともに報告する。図２９は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６＿００９）およびＣＤ２０^＋抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２０＿９０６＿００９）のＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥＫＴ５０値を示す図である。ＫＴ５０に線形モデルを当てはめ、ＣＡＲ（ベクター）の固定効果と個々のアッセイおよびドナーのネストされたランダム効果が存在する。ＫＴ５０についてはｌｏｇ１０変換を使用する。図３０は、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ細胞傷害性アッセイの２０時間目に生存している細胞に対するスプライス部位の最適化の効果を示す図である。このデータには線形混合効果モデルが当てはまる。生存率％は応答としてモデル化され、ＣＡＲは固定効果としてモデル化される。これはスプリットプロットデザインであるため、個々のアッセイおよびアッセイ内にネストされたドナーにランダム効果が含まれる。ＣＡＲ対間での期待生存率％の差を求めるために線形対比を使用し、これらをｐ値および９５％信頼区間とともに報告する。図３１は、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥＫＴ５０値に対するスプライス部位の最適化の効果を示す図である。ＫＴ５０に線形モデルを当てはめ、ＣＡＲ（ベクター）の固定効果と個々のアッセイおよびドナーのネストされたランダム効果が存在する。ＫＴ５０についてはｌｏｇ１０変換した。図３２は、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるカルシウムフラックスに対するＣＤ２０の効果を示す図である。タプシガルギン（図３２Ａ）またはＤＭＳＯ（図３２Ｂ）で前処理した後に、イオノマイシンで刺激した非形質導入Ｔ細胞、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６＿００９）およびＣＤ２０^＋抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＣＤ２０＿９０６＿００９）のカルシウムフラックスを示す。図３３は、原形質膜タンパク質アレイの結果を示す図である。ドナー９０９２８由来の非形質導入細胞、ＢＣＭＡ－ＣＡＲＴ細胞および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６－００９）を用いたプレスクリーン試験を示す。ＨＥＫ２９３細胞（図３３Ａ）、非形質導入Ｔ細胞（図３３Ｂ）、ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞（図３３Ｃ）および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６－００９；図３３Ｄ）でのタンパク質発現のＺｓＧｒｅｅｎキースポッティングパターン。図３４は、原形質膜タンパク質アレイの確認スクリーン結果を示す図である。非形質導入細胞（図３４Ｂ）、ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞（図３４Ｃ）および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（９０６－００９；図３４Ｄ）におけるスポッティングパターンのキー（図３４Ａ）。図３５Ａ－Ｂは、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９投与後のＮＳＧ腫瘍担持マウスにおけるＩＦＮγの経時的分泌を示す図である。Ｔ細胞投与前（ベースライン）または９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９によるＴ細胞投与３、４、５、７および１４日後にＨＴ－２９Ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスの血清で測定された（図３５Ａ～３５Ｂ）ＩＦＮγの分泌レベル。分泌レベルはｐｇ／ｍＬで示す（ｙ軸）。各ドットは、所与のマウスの所与の時点でのサイトカイン濃度を示す。グラフ（図３５Ａ）は、データを総ての時点で平均および９５％信頼区間として示す。グラフ（図３５Ｂ）は、線形混合モデルからの周辺平均および９５％信頼区間を示し、ベースラインを除く総ての時点で生データに重ねられている。図３５Ｃ－Ｄは、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９投与後のＮＳＧ腫瘍担持マウスにおけるＩＬ－２の経時的分泌を示す図である。Ｔ細胞投与前（ベースライン）または９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９によるＴ細胞投与３、４、５、７および１４日後にＨＴ－２９Ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスの血清で測定された（図３５Ｃ～３５Ｄ）ＩＬ－２の分泌レベル。分泌レベルはｐｇ／ｍＬで示す（ｙ軸）。各ドットは、所与のマウスの所与の時点でのサイトカイン濃度を示す。グラフ（３５Ｃ）は、データを総ての時点で平均および９５％信頼区間として示す。グラフ（３５Ｄ）は、線形混合モデルからの周辺平均および９５％信頼区間を示し、ベースラインを除く総ての時点で生データに重ねられている。図３５Ｅ－Ｆは、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９投与後のＮＳＧ腫瘍担持マウスにおけるＴＮＦαの経時的分泌を示す図である。Ｔ細胞投与前（ベースライン）または９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９によるＴ細胞投与３、４、５、７および１４日後にＨＴ－２９Ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスの血清で測定された（図３５Ｅ～３５Ｆ）ＴＮＦαの分泌レベル。分泌レベルはｐｇ／ｍＬで示す（ｙ軸）。各ドットは、所与のマウスの所与の時点でのサイトカイン濃度を示す。グラフ（図３５Ｅ）は、データを総ての時点で平均および９５％信頼区間として示す。グラフ（図３５Ｆ）は、線形混合モデルからの周辺平均および９５％信頼区間を示し、ベースラインを除く総ての時点で生データに重ねられている。図３６は、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９投与後のＮＳＧ腫瘍担持マウスにおけるＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＴＮＦ－αの分泌の経時的変化を示す図である。９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与したＨＴ－２９Ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスにおけるＴ細胞投与後の各時点（３、４、５、７および１４日）とベースライン（Ｔ細胞投与前）を比較したＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－αの分泌変化を示すヒートマップである。線形対比を用いて、ベースラインレベルに対するＴ細胞投与後の種々の時点での分泌変化を算出し、ここでは倍率変化として表す。図３７は、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与した、エンドポイント「１４日目」からのＮＳＧ腫瘍担持マウスにおける腫瘍成長速度を示す図である。９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与した、エンドポイント「１４日目」からのＮＳＧ腫瘍担持マウスにおける腫瘍成長速度。ＳＤ０にマウスにＨＴ－２９Ｌｕｃ細胞を接種し、腫瘍が約３２０ｍｍ^３に達したＳＤ２３に、ＣＡＲＴ細胞を投与した。エンドポイント「１４日目」からのマウスは、ＳＤ３７、つまりＴ細胞投与１４日後に殺処分した。Ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ^３）を示し、ｘ軸は総てノギス測定の試験日を示す。二元配置分散分析と次いで、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較を行い、全時点で総てのＣＡＲＴ群を比較した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。ｎｓ＞０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図３８は、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与した、エンドポイント「４日目」および「７日目」からのＮＳＧ腫瘍担持マウスにおける腫瘍成長を示す図である。９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与した、（図３８Ａ）エンドポイント「４日目」および（図３８Ｂ）「７日目」からのＮＳＧ腫瘍担持マウスにおける腫瘍成長を示す。ＳＤ０にマウスにＨＴ－２９Ｌｕｃ細胞を接種し、腫瘍が約３２０ｍｍ^３に達したＳＤ２３にＣＡＲＴ細胞を投与した。エンドポイント「４日目」からのマウスをＳＤ２７、つまりＴ細胞投与４日後に殺処分した。エンドポイント「７日目」からのマウスは、ＳＤ３０、つまりＴ細胞投与７日後に殺処分した。Ｙ軸は腫瘍体積（ｍｍ^３）を示し、ｘ軸はＣＡＲＴ群を示す。一元配置分散分析とその後のテューキーの多重比較検定を行い、示されたエンドポイントでＣＡＲＴ群を比較した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。ｎｓ＞０．０５。総ての比較が有意でなかった。図３９は、研究デザインを示す模式図である。簡単に述べれば、雌ＮＳＧマウスに試験日（ＳＤ）０日目にＨＴ－２９Ｌｕｃを接種した。ＳＤ２３（腫瘍が約３２０ｍｍ^３に達した際）に、マウスにＣＡＲＴ細胞を投与した。ＳＤ５、ＳＤ２６、ＳＤ２７、ＳＤ２８、ＳＤ３０およびＳＤ３７に血液サンプルを採取した。ＳＤ２６、ＳＤ２７、ＳＤ３０およびＳＤ３７に組織および腫瘍を採取した。図４０は、マウスモデルを示す図である。ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスはマウスマクロファージを有し、ヒトサイトカインはトランスジェニック的に発現される。ヒトＰＢＭＣおよびヒト標的細胞（ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞）を共注入する。これらの細胞は同じ健常ドナーから作製されたものである。抗ＣＤ２０ｍＡｂリツキシマブを注射して、末梢血および組織においてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞の殺傷性を誘導する。対照マウスには、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞の存在下でアイソタイプもしくはビヒクルを施すか、またはＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞の不在下でリツキシマブを施す。図４１は、試験のタイムラインを示す図である。－１日目（Ｄ－１）に、細胞を接種した（１×１０^７のｈＰＢＭＣ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の形質導入効率３８％である１×１０^７のＴ細胞）。０日目（Ｄ０）に、各マウスから血液を採取し（ベースラインとしてのＲＴＸ前血液）、次いでｉ．ｐ．経路でＲＴＸ、アイソタイプまたはビヒクル注射を行う。ｍＡｂ投与２４時間および７２時間後に、再び各マウスから血液を採取した。ｍＡｂ投与７日および８日後に、マウスを人道的に犠死させ、最終血液および組織を、サンプル品質および実現可能性を確保するために交互法で採取した。図４２Ａは、注射日における接種物の特性評価を示す図である。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびＰＢＭＣ亜集団を同定するためのゲート設定戦略を示す。Ｆ（ａｂ’）２^＋ＣＤ２０^＋＝ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９。Ｆ（ａｂ’）２＝ＣＡＲ。図４２Ｂ－Ｃは、注射日における接種物の特性評価を示す図である。図４２Ｂは、接種物におけるＰＢＭＣ組成を示す。図４２Ｃは、接種物におけるＴ細胞のＣＡＲおよびＣＤ２０発現の特性評価を示す。グラフは、ＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＣＡＲとＣＤ２０を共発現するＴ細胞の平均（ｎ＝３反復）パーセンテージを示す。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｆ（ａｂ’）２^＋ＣＤ２０^＋＝ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９。Ｆ（ａｂ’）２＝ＣＡＲ図４３Ａ－Ｂは、マウス最終血液中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｈＰＢＭＣの特性評価および計数（フローサイトメトリー）を示す図である。（Ａ）ｍＡｂ／アイソタイプ処置７日後と８日後の最終血液におけるＣＤ３＋（Ｔ細胞）数とｆ（ａｂ’）２数の比較。（Ｂ）マウス最終血液のｆ（ａｂ’）２の総数。図４３Ｂの各ドットはマウス１個体を周辺平均および９５％信頼区間で表す。Ｆ（ａｂ’）２＝ＣＡＲ、ＣＤ３^＋＝Ｔ細胞、ｍＡｂ＝モノクローナル抗体（リツキシマブ）、ＩＳＯ＝抗ＲＳＶ抗体。^＊＝ｐ値≦０．０５、^＊＊＝ｐ値≦０．０１、^＊＊＊＝ｐ値≦０．００１。図４３Ｃ－Ｄは、マウス最終血液中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｈＰＢＭＣの特性評価および計数（フローサイトメトリー）を示す図である。（Ｃ）マウス最終血液のＣＤ３＋の総数。（Ｄ）マウス最終血液中のＣＤ３＋に対するＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の割合。各ドットはマウス１個体を周辺平均および９５％信頼区間で表す。Ｆ（ａｂ’）２＝ＣＡＲ、ＣＤ３^＋＝Ｔ細胞、ｍＡｂ＝モノクローナル抗体（リツキシマブ）、ＩＳＯ＝抗ＲＳＶ抗体。^＊＝ｐ値≦０．０５、^＊＊＝ｐ値≦０．０１、^＊＊＊＝ｐ値≦０．００１。図４４は、接種前および接種後のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９でのＣＡＲおよびＣＤ２０発現の比較を示す図である。注射日（接種日）の接種物中および殺処分日（ｍＡｂ投与７日後または８日後）のマウス血液からの、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞でのＣＤ２０およびＣＡＲ（Ｆ（ａｂ’）２）共発現を示すヒストグラムである。Ｆ（ａｂ’）２＝ＣＡＲ発現。図４５は、血液中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９が、ｍＡｂ処置マウスにおいてｍＡｂ投与２４時間後までに減少することを示す図である。ｍＡｂ前ならびにｍＡｂ処置の２４時間、７２時間および７／８日後（最終日）にマウスから血液サンプルを採取した。ＨＩＶＤＮＡコピーを、マウス血液中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の存在のマーカーとして、ｄｄＰＣＲを用いて測定した。（Ａ）ｍＡｂ前、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９存在および無ｍＡｂ対照、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ対照、ならびにＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂ、でそれぞれ処置したマウスは、血液において同等のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９発現を示した。ｍＡｂ投与２４時間後、ｍＡｂ処置群は、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ群に比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９を有意に低減し、これは試験終了時点まで持続した。グラフは、ＨＩＶコピー平均変化率％および９５％信頼区間を示す。黒三角はＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９および無ｍＡｂ対照で処置したマウスを示し、黒四角はＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ対照で処置したマウスを示し、□はＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂで処置したマウスを示す。グラフは、各マウスの幾何平均および９５％信頼区間を示す。（Ｂ）ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂとＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂの間のＨＩＶコピーの変化率％を算出し、これはアイソタイプｍＡｂ処置群に比べてｍＡｂ処置群で２４時間後のＨＩＶコピーにおける８５．１１％の減少を示す。ｍＡｂ処置７２時間後および試験終了時点において、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ対照に比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂのＨＩＶコピーに７０．４４％および６１．５６％の減少が見られた。グラフは、ＨＩＶコピーの平均変化率％および９５％信頼区間を示す。図４６Ａは、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、ｍＡｂ処置マウスの骨髄、肝臓、肺および脾臓では減少していることを示す図である。試験の最終時点（ｍＡｂ投与７／８日後）に、骨髄、肝臓、肺および脾臓を採取し、マウス組織中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の存在のマーカーとしてＨＩＶＤＮＡコピーを測定した。骨髄、肝臓、肺および脾臓では、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ群に比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂ群でＨＩＶコピーの有意な減少が見られた（総ての組織でｐ＜０．０００１）。また、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ群に比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９および無ｍＡｂ対照群で、有意に低いＨＩＶコピー数が見られた。グラフは、各マウスの幾何平均および９５％信頼区間を示す。黒三角はＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９および無ｍＡｂ対照で処置したマウスを示し、黒四角はＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ対照で処置したマウスを示し、□はＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂで処置したマウスを示す。（Ｂ）ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂとＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ対照の間のＨＩＶコピーの変化率％を算出した。骨髄で９５．７５％、肝臓で８８．０５％、肺で９５．７５％および脾臓で９８．６６％のＨＩＶコピーの減少が見られた。グラフは、ＨＩＶコピーの平均変化率％および９５％信頼区間を示す。図４６Ｂは、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、ｍＡｂ処置マウスの骨髄、肝臓、肺および脾臓では減少していることを示す図である。試験の最終時点（ｍＡｂ投与７／８日後）に、骨髄、肝臓、肺および脾臓を採取し、マウス組織中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の存在のマーカーとしてＨＩＶＤＮＡコピーを測定した結果を示す図である。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂとＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ対照の間のＨＩＶコピーの変化率％を算出した。骨髄で９５．７５％、肝臓で８８．０５％、肺で９５．７５％および脾臓で９８．６６％のＨＩＶコピーの減少が見られた。グラフは、ＨＩＶコピーの平均変化率％および９５％信頼区間を示す。図４７は、ＮＳＣＬＣ細胞株のパネルによるＣＬＤＮ３の発現を示す図である。（Ａ）ＣＬＤＮ３発現をＰＣＲにより測定し、２－ΔＣＴで表した。（Ｂ）ＣＬＤＮ３発現をフローサイトメトリーにより測定し、ＣＬＤＮ３陽性集団率％を示した。ＨＴ－２９およびＲＫＯＫＯをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。細胞を６週間培養し、３回の異なる実験を行った。このデータは平均＋標準誤差として示す。オレンジの細胞株を機能試験に用いた。図４８は、機能アッセイで使用するためのＮＳＣＬＣおよびＣＲＣ細胞株のパネルによるＣＬＤＮ３の発現を示す図である。（Ａ）相対ＣＬＤＮ３発現をｑＰＣＲにより測定し、２^－ΔＣＴで表した。このデータは平均＋／－標準誤差（ｎ＝２技術的反復）である。（Ｂ）ｈＣＬＤＮ３発現をフローサイトメトリーにより測定し、アイソタイプ対照に対して正規化したｈＣＬＤＮ３のＭＦＩとして表した。試験は、機能試験のための細胞を播種した日に行った。両グラフのデータは、相対的ＣＬＤＮ３が低いものから高いものへと編成されている。図４９は、ＮＳＣＬＣ細胞株と９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ、ＣＤ１９－ＬＮＧＦＲおよびＵＴとの共培養からの活性化因子の定量結果を示す図である。ＣＬＤＮ３発現レベルの異なる５つのＣＲＣ細胞株を対照として用いた。これは、１：１のＣＡＲ：標的比での共培養２４時間後の活性化因子レベルを表す。データは、標的細胞の播種日の相対ＣＬＤＮ３（２^－ΔＣＴ）発現により編成され、平均＋／－標準誤差として表す（ｎ＝３ドナー）。（Ａ）ＩＦＮγ ｐｇ／ｍＬ。（Ｂ）グランザイムＢｐｇ／ｍＬ。図５０は、Ｔ細胞の活性化と相対ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡ発現（ｄＣＴａｋａ２^－ΔＣＴにより定量）の間の関係性のモデル化を示す図である。（Ａ）ＩＦＮγ。（Ｂ）グランザイムＢ。グラフ上の点は、細胞株（ＣＬＤＮ３発現が異なる）と９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ（３ドナー）の共培養における活性化因子の分泌を表す。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ（黒）、ＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲ（濃いグレー）、ＵＴ（薄いグレー）。図５１は、結腸癌細胞株の標的細胞の死滅画像を示す図である。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲまたはＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞と結腸癌細胞株の共培養の画像。画像は３ドナーについて示す。画像は、アネキシンＶ染色を青で示し、紫の輪郭線はマスクを示す。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとの共培養におけるＨＴ－２９およびＤＬＤ１細胞株の標的細胞の死滅を示すために、アッセイエンドポイントからの画像を示す。ＲＫＯ－ＫＯは、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによる標的細胞の死滅を示さなかった。図５２は、ＮＳＣＬＣ細胞株における標的細胞の死滅画像を示す図である。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞と様々なＮＳＣＬＣ細胞株の共培養の画像。画像は３ドナーについて示す。標的細胞の死滅を示すために、アッセイエンドポイントからの画像を示す。図５３は、ＣＬＤＮ３発現の低い９０６－００９＿ＬＮＧＦＲまたはＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞の共培養の画像を示す図である。画像は３ドナーについて示す。アッセイエンドポイントからの画像を示し、この時点で部分的な細胞傷害性を示す。Ｃｏｌｏ３２０ＤＭは、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲを用いたドナーＰＲ１９Ｋ１３３９００でのみ部分的な標的細胞殺傷を示し、これはドナーＰＲ１９Ｃ１３３９０４およびＰＲ１９Ｗ１３３９１６では見られなかった。ＮＣＩ－Ｈ１６５０は、ドナーＰＲ１９Ｋ１３３９００およびＰＲ１９Ｃ１３３９０４９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの共培養により部分的な殺傷を示した。図５４Ａ－Ｆは、ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡの発現により細胞株：ＲＫＯＫＯ（ＣＬＤＮ３タンパク質ＫＯ）、ＮＣＩ－Ｈ１６５０、ＮＣＩ－Ｈ２０２３を並べた図である。（Ａ、Ｃ、Ｅ）アイソタイプ染色細胞株のプロット例。（Ｂ、Ｄ、Ｆ）ＣＬＤＮ３抗体染色プロットのプロット例。ゲートはアイソタイプ染色対照に基づいて設定した。図５４Ａ－Ｆは、ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡの発現により細胞株：ＮＣＩ－Ｈ１６５０、ＮＣＩ－Ｈ２０２３を並べた図である。（Ｇ、Ｉ）アイソタイプ染色細胞株のプロット例。（Ｈ、Ｊ）ＣＬＤＮ３抗体染色プロットのプロット例。ゲートはアイソタイプ染色対照に基づいて設定した。図５５Ａは、９０６－ｍＡｂ結合におけるＣＬＤＮ３変異の効果を示す図である。ＧＦＰ－ＦＩＴＣおよび９０６－ｍＡｂ－ＰＥ陽性集団を判定するために使用したゲート設定戦略を示す。図５５Ｂ－Ｃは、９０６－ｍＡｂ結合におけるＣＬＤＮ３変異の効果を示す図である。図５５Ｂは、ＲＫＯＫＯ標的細胞におけるＧＦＰ発現の代表的ヒストグラムの重ね合わせを示す。図５５Ｃは、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）により表されるＷＴと比較した変異細胞株への９０６－ｍＡｂ結合の倍率変化を示すグラフである。（Ｃｎ＝２、９５％信頼区間を示す）図５５Ｄは、９０６－ｍＡｂ結合におけるＣＬＤＮ３変異の効果を示す図である。９０６－ｍＡｂ陽性細胞の集団％の変化を示すグラフである。（ｎ＝２、９５％信頼区間を示す）図５６は、ＲＫＯＫＯ標的細胞との共培養後の９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの活性化に対するＣＬＤＮ３変異の効果を示す図である。１：１の標的：形質導入ＣＡＲＴ比で９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとＲＫＯＫＯ標的細胞を２４時間共培養した後のＩＦＮγ放出を示す。データは、ＷＴと比較したＩＦＮγ変化率％として表し、非形質導入Ｔ細胞に対して正規化した（ｎ＝３）。データは、３名のＴ細胞ドナー（ｎ＝３）の平均である。９５％信頼区間を示す。

発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかに別段のことを示さない限り複数の指示対象を含む。よって、例えば、「ペプチド鎖」という場合には、１以上のペプチド鎖を指し、当業者に公知のその等価物を含む。

本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、用語「含んでなる」は、「含む」または「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含んでなる」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、または付加的要素、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。

用語「から本質的になる」は、その特徴の範囲を特定の材料または工程および特許請求される特徴の基本的な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。用語「からなる」は、いずれの付加的成分の存在も排除する。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または等価ないずれの組成物および方法も本開示の方法の実施または試験に使用可能であるが、例示的組成物および方法が本明細書に記載される。本明細書に記載される開示の側面および実施形態はいずれも組み合わせが可能である。例えば、本明細書に開示されるいずれの従属請求項または独立請求項の対象も多重に組み合わせることができる（例えば、各従属請求項からの１以上の記載を、それらが従属する独立請求項に基づいて単一の請求項に組み合わせることができる）。

本明細書に示される範囲には、記載の特定の範囲内の総ての値、および特定の範囲の端点に関する値が含まれる。また、本開示の図および表には、本明細書に開示される方法のいずれかの要素を構成し得る範囲、および離散値が記載されている。

本明細書に記載される濃度は周囲温度および周囲圧力で決定される。これは、例えば、室温またはプロセス流の特定部分内の温度および圧力であり得る。好ましくは、濃度は、２５℃および１バールの圧力の標準状態で決定される。

用語「約」は、特定の測定値について平均値の２標準偏差以内の値を意味する。

概要
ネオエピトープまたはネオアンチゲン（癌特異的突然変異または癌細胞によってのみ発現されるタンパク質）の認識は、抗癌療法の開発に重要とされてきた。このようなネオエピトープにより、癌細胞は健常な非癌性細胞と区別され、健常な非癌性細胞は影響を受けないまま、抗癌剤および患者自身の免疫系を特異的に標的化することができる。類似しているが特異性は低いアプローチとして、腫瘍関連自己抗原（健常な非癌性細胞に比べて癌細胞で上方制御または過剰発現されるタンパク質またはその他の細胞成分）を標的とする方法がある。しかし、これらのアプローチの欠点は、真に癌特異的なネオエピトープは稀であり、容易に予測できないこと、一方、腫瘍関連自己抗原を標的とすると、健常な非癌性細胞でのそれらの発現により、オフターゲット効果をもたらす可能性があることである。

これらの欠点に取り組むために、本明細書では、細胞結合タンパク質の少なくとも１つのエピトープと結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞結合タンパク質が細胞間結合内に位置し、細胞結合タンパク質の前記少なくとも１つのエピトープが、癌細胞でのみ、前記ＣＡＲの細胞外ドメインが結合するために接近可能である、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。このような１以上のエピトープは、癌細胞と健常な非癌性細胞および秩序ある組織（organized tissue）中の細胞との両方に存在または発現しているが、秩序ある組織中の細胞では、結合に対する１以上のエピトープの接近不能性および／または利用不能性のためにオフターゲット効果が低下する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
種々の実施形態において、本明細書に記載されるエピトープを発現する癌細胞に、免疫エフェクター細胞をリダイレクトする遺伝的に操作された受容体が提供される。本明細書ではキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と呼ぶこれらの遺伝的に操作された受容体は、特異的細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するために、抗体に基づく所望の抗原／エピトープに対する特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと合わせた分子である。用語「キメラ」は、異なる起源に由来する異なるタンパク質またはＤＮＡの部分から構成されることを表す。

特定の実施形態では、以下のドメイン：
ａ）配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列；配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列；配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列を含んでなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなるクローディン－３結合ドメインを含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。

ＣＡＲの抗原結合ドメインが標的細胞表面の標的抗原と会合すると、ＣＡＲがクラスター化し、ＣＡＲを有する細胞に活性化刺激を与える。ＣＡＲの主な特徴は、モノクローナル抗体、可溶性リガンドまたは細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を利用し、主要組織適合性（ＭＨＣ）に依存しない方法で、免疫エフェクター細胞の特異性をリダイレクトし、それにより増殖、サイトカイン産生、貪食または標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を誘発する能力である。

細胞外ドメイン
種々の実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン（例えば、クローディン－３特異的結合ドメイン）を含んでなる細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；１以上の共刺激シグナル伝達ドメイン；および１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。

用語「キメラ抗原受容体」（「ＣＡＲ」）は、本明細書で使用する場合、細胞外抗原結合ドメイン（通常、モノクローナル抗体、またはそのフラグメント、例えば、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の形態のＶＨドメインまたはｓｃＦｖの形態のＶＨドメインおよびＶＬドメインに由来する）、オプションのスペーサー領域、膜貫通領域、および１以上の細胞内エフェクタードメインを含んでなる操作された受容体を指す。特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの間にヒンジ領域をさらに含んでなる。ＣＡＲはまた、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインのいずれかの間にヒンジドメインまたはスペーサードメインを含んでなり得る。ＣＡＲは、キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）とも呼ばれている。ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性を所望の細胞表面抗原にリダイレクトするためにＴ細胞などの造血系細胞に遺伝的に導入してＣＡＲ－Ｔ治療薬とする。用語「スペーサードメイン」は、本明細書で使用する場合、膜貫通ドメインと細胞外抗原／標的結合ドメインを連結する働きをするオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。この領域はまた、「ヒンジドメイン」または「ストークドメイン」と呼ばれることもある。スペーサーのサイズは、ＣＡＲ：標的／抗原結合に最適な機能を持たせるために、標的エピトープの位置によって異なり得る。場合によって、理論に縛られるものではないが、最適な機能は、ＣＡＲ：標的／抗原結合に設定された距離（例えば１４ｎｍ）を維持することにより達成され得る。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、エピトープと特異的に結合する抗原結合タンパク質を含んでなる細胞外結合ドメインを含んでなり、ここで、エピトープは、複数の細胞上に存在するが、標的細胞、例えば、癌細胞でのみ結合のために接近可能および／または利用可能である。本明細書で使用する場合、用語「結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」は互換的に使用され、目的の標的抗原／エピトープと特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提供する。結合ドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源に由来し得る。

用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、タンパク質、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）および他の抗体由来タンパク質構築物、例えば、標的抗原に結合し得るドメイン抗体（ｄＡｂ）およびｓｄＡｂを含んでなる抗体由来タンパク質構築物を指す。用語「抗原結合タンパク質」および「エピトープ結合タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。これには天然の同族リガンドまたは受容体は含まれない。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、クローディン－３（ＲＶＰ１、ＨＲＶＰ１、Ｃ７ｏｒｆ１、ＣＰＥ－Ｒ２、ＣＰＥＴＲ２としても知られる）と結合することができ、「クローディン－３結合タンパク質」または「クローディン－３特異的結合タンパク質」と呼ぶことができる。「クローディン－３結合タンパク質」は、タンパク質、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）および他の抗体由来タンパク質構築物、例えば、クローディン－３、好ましくは、ヒトクローディン－３と結合し得るドメイン（例えば、ｄＡｂ、ｓｄＡｂなど）を含んでなる抗体由来タンパク質構築物を指す。

用語「抗原」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質により選択的に認識される高分子の構造体を指す。抗原には、限定するものではないが、タンパク質（多糖類を有するまたは有しない）または１以上のＴ細胞エピトープを含んでなるタンパク質組成物が含まれる。

用語「エピトープ」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質の特定の結合ドメインと接触する抗原の一部を指し、パラトープとしても知られる。エピトープは、線状または立体構造／不連続的であり得る。立体構造または不連続エピトープは、他の配列により分離されている、すなわち、抗原の一次配列においては連続した配列でなく、ポリペプチド鎖の三次元折りたたみにより集合され得る、アミノ酸残基を含んでなる。これらの残基はポリペプチド鎖の異なる領域に由来していてもよいが、抗原の三次元構造においては近接している。多量体抗原の場合、立体構造または不連続エピトープは、異なるペプチド鎖に由来する残基を含み得る。エピトープ内に含まれる特定の残基は、コンピュータモデル化プログラムまたはＸ線結晶学などの当技術分野で公知の方法によって得られる三次元構造により決定することができる。エピトープマッピングは、限定するものではないが、例えば、Methods in Molecular Biology ‘Epitope Mapping Protocols’, Mike SchutkowskiおよびUlrich Reineke (volume 524, 2009)およびJohan Rockberg and Johan Nilvebrant (volume 1785, 2018)の刊行物に記載されているものを含む、当業者に公知の種々の技術を用いて行うことができる。限定されない方法の例として、ペプチドに基づくアプローチ、例えば、ＥＬＩＳＡなどの技術を用いて結合に関する一連の重複するペプチドをスクリーニングするペプスキャン、または、ペプチドもしくはタンパク質変異体の、例えばファージによる、大規模ライブラリーのｉｎｖｉｔｒｏディスプレーが挙げられる。詳細なエピトープ情報は、限定するものではないが、Ｘ線結晶学、液相核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法および低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ－ＥＭ）を含む構造技術によって決定することができる。アラニンスキャニングなどの変異誘発は、結合消失解析をエピトープマッピングに使用する別の効果的なアプローチである。別の方法は、水素／重水素交換（ＨＤＸ）とタンパク質分解および液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を組み合わせて、不連続または立体構造エピトープの特性評価を行う方法である。

特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合ドメインを含んでなる。

用語「抗体」は、本明細書では、最も広義において、免疫グロブリン様ドメイン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）を有する分子を指して使用され、モノクローナル抗体、組換え抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）およびヘテロコンジュゲート抗体；ｄＡｂ、ｓｄＡｂ、抗原結合抗体フラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ジスルフィド連結ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＴＡＮＤＡＢなど、ならびに以上のいずれかの改変型が含まれる（選択的「抗体」形式の概要については、Holliger and Hudson 2005 Nature Biotechnology 23(9):1126-1136参照）。

本明細書で互換的に使用される完全抗体、全抗体またはインタクト（intact）な抗体という用語は、およその分子量が１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質を指す。インタクトな抗体は、共有ジスルフィド結合により連結された２つの同一の重鎖（ＨＣ）および２つの同一の軽鎖（ＬＣ）から構成される。このＨ_２Ｌ_２構造は折りたたまれて、２つの抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントとして知られる）と、「Ｆｃ」結晶性フラグメントとを含んでなる３つの機能的ドメインを形成する。Ｆａｂフラグメントは、アミノ末端の可変ドメイン（重鎖可変（ＶＨ）または軽鎖可変（ＶＬ））およびカルボキシル末端の定常ドメイン（ＣＨ１（重鎖）およびＣＬ（軽鎖））から構成される。Ｆｃフラグメントは、対になるＣＨ２領域およびＣＨ３領域それぞれの二量体化により形成された２つのドメインから構成される。Ｆｃは、免疫細胞上の受容体に結合することにより、または古典的補体経路の第１成分であるＣ１ｑと結合することによりエフェクター機能を惹起し得る。抗体ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤの５つのクラスは、それぞれμ、α、γ、εおよびδと呼ばれる異なる重鎖アミノ酸配列により定義され、各重鎖はκまたはλ軽鎖のいずれかと対になることができる。血清中の大多数の抗体はＩｇＧクラスに属し、ヒトＩｇＧには４つのアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）が存在し、それらの配列は主としてそれらのヒンジ領域において異なる。

完全ヒト抗体は、様々な方法を使用して、例えば、ヒト抗体のレパートリーを生産することができる酵母ベースのライブラリーまたはトランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して取得され得る。目的の抗原に結合するヒト抗体をその表面に提示する酵母は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）ベースの方法を使用することにより、あるいは、標識抗原を使用してビーズで捕捉することにより選択され得る。ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するように改変されたトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫し、次いで、Ｂ細胞選別技術を使用して単離された抗原特異的ヒト抗体を得ることができる。次いで、これらの技術を使用して生成されたヒト抗体は、望ましい特性、例えば、親和性、開発可能性および選択性について特徴付けられ得る。

代替的な抗体形式には、抗原結合タンパク質の１以上のＣＤＲが、好適な非免疫グロブリンタンパク質足場または骨格上に配置された別の足場、例えば、アフィボディ、ＳｐＡ足場、ＬＤＬ受容体クラスＡドメイン、アビマー（例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００８９９３２号および同第２００５／０１６４３０１号参照）またはＥＧＦドメインも含まれる。

本明細書を通じて、可変ドメイン配列中のアミノ酸残基および全長の抗原結合配列内の可変ドメイン領域中のアミノ酸残基、例えば、抗体重鎖配列または抗体軽鎖配列内の可変ドメイン領域中のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ付番規則に従って付番される。同様に、実施例で使用される用語「ＣＤＲ」、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、「ＣＤＲＬ３」、「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」および「ＣＤＲＨ３」もＫａｂａｔ付番規則に従う。さらなる情報は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4^th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。

当業者には、可変ドメイン配列および全長抗体配列のアミノ酸残基には別の付番規則もあることが自明である。例えば、Chothia et al., 1989 Nature 342(6252):877-83に示されている付番規則など、ＣＤＲ配列の別の付番規則もある。抗原結合タンパク質の構造およびタンパク質の折りたたみは、他の残基もＣＤＲ配列の一部とみなされることを意味し得、当業者にはそのように理解される。

当業者に利用可能なＣＤＲ配列の他の付番規則としては、「ＡｂＭ」法（バース大学）および「ｃｏｎｔａｃｔ」法（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）が含まれる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭおよびｃｏｎｔａｃｔ法のうち少なくとも２つを用いた最小重複領域を決定して「最小結合単位」を得ることができる。最小結合単位は、ＣＤＲの一部分であり得る。

下表１は、各ＣＤＲまたは結合単位の各付番規則を用いた１つの定義を示す。下表１では、可変ドメインアミノ酸配列を付番するためにＫａｂａｔ付番スキームが使用されている。ＣＤＲの定義は使用する個々の刊行物によって異なる場合があることに留意されたい。

例示的なクローディン－３結合タンパク質は、以下のＣＤＲのうちのいずれか１つまたは組合せ：
配列番号１のＣＤＲＨ１；
配列番号２のＣＤＲＨ２；
配列番号３のＣＤＲＨ３；
配列番号４のＣＤＲＬ１；
配列番号５のＣＤＲＬ２；および／または
配列番号６のＣＤＲＬ３
を含んでなり、あるいは、
配列番号７中のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３；および／または
配列番号８中のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３
を含んでなり、あるいは、
配列番号７中のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３；および
配列番号８中のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３
を含んでなる。

ＣＤＲは、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または付加により改変されてもよく、バリアント抗原結合タンパク質は、非改変タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。

ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３のそれぞれは単独で改変されてもよいし、または任意の順列もしくは組合せで他のいずれのＣＤＲと組み合わせて改変されてもよいことが理解される。１つの実施形態では、ＣＤＲは、最大３個のアミノ酸、例えば１または２個のアミノ酸、例えば１個のアミノ酸の置換、欠失または付加により改変される。一般に、改変は置換、特に保存的置換であり、例えば下表２に示される。

例えば、バリアントＣＤＲにおいて、例えばＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａなどの代替的な定義の一部としてＣＤＲを含んでなる隣接残基は、保存的アミノ酸残基で置換されてもよい。

上記のようなバリアントＣＤＲを含んでなるこのような抗原結合タンパク質は、本明細書では「機能的ＣＤＲバリアント」と呼ぶ場合がある。

１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列；配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列；配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列を含んでなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなる。１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）配列；配列番号５の軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）配列；配列番号６の軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）配列を含んでなる軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含んでなる。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲの細胞外ドメインは、本明細書に開示されるクローディン－３結合タンパク質を含んでなる。

１つの実施形態では、本開示のクローディン－３結合タンパク質は、ヒトクローディン－３と、マウスクローディン－３および／またはカニクイザルクローディン－３などの別の種に由来するクローディン－３との間に交差反応性を示す。１つの実施形態では、本明細書に記載のクローディン－３結合タンパク質は、ヒト、カニクイザルおよびマウスクローディン－３に特異的に結合する。薬物開発は一般に、薬物をヒトで試験する前にマウス系でのリード薬物候補の試験を必要とするので、このことは特に有用である。ヒトおよびマウス種と結合し得る薬物を提供することで、これらの系で結果を試験し、同じ薬剤を用いてデータを並べて比較することができる。これによって、マウスクローディン３に作用する薬物とヒトクローディン３に作用する別の薬物を見つけなければならないという複雑さを回避することができ、また、同一でない薬物を用いてヒトとマウスの結果を比較する必要もなくなる。また、イヌまたはサル、例えばカニクイザルなどの疾患モデルで使用される他種間での交差反応性も想定される。

「抗原結合ドメイン」は、抗原に特異的に結合し得る抗原結合タンパク質のドメインを指し、これは単一可変ドメインであってもよいし、または標準的な抗体に見出せるようなＶＨ／ＶＬドメイン対であってもよい。ｓｄＡｂまたはｓｃＦｖドメインも抗原結合部位を提供し得る。１つの実施形態では、抗原結合タンパク質は、クローディン－３結合タンパク質である。１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質はｓｄＡｂであり、重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなる。１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質はｓｃＦｖであり、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでなる。いくつかの実施形態では、ＶＬはＶＨのＮ末端に位置するか、またはＶＨはＶＬのＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、ＶＬとＶＨはペプチド結合を介して互いに直接融合しているか、またはペプチドリンカーを介して互いに連結している。

異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種内では比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域を合わせたものである抗体のフレームワーク領域は、三次元空間にＣＤＲを配置および整列する働きをする。ＣＤＲは、主として抗原のエピトープへの結合に関与する。

「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによりまたは単一の抗体の軽鎖および重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞により生産される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合からハイブリッド抗体形成細胞を作製することにより生産される。モノクローナル抗体には、ヒト化モノクローナル抗体が含まれる。

「キメラ抗体」は、ドナーＡｂに由来する天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）をアクセプターＡｂに由来する軽鎖および重鎖定常領域と結合させた、一種の操作されたＡｂである。よって、特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合ドメインである抗原結合ドメインを含んでなる。

いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトクローディン－３タンパク質と特異的に結合するヒト抗体（ヒトモノクローナル抗体など）またはそのフラグメントである。

１つの実施形態では、ＣＡＲは、「ヒト化」抗体または抗体結合フラグメントを含んでなる。「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ（または複数）のヒト免疫グロブリンに由来する操作された抗体の１タイプを指す。さらに、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更されてもよい（例えば、Queen, et al., Proc. Natl Acad Sci USA. 1989; 86(24): 10029-10032およびHodgson, et al., Biotechnology, 1991; 9(5): 421-5参照）。好適なヒトアクセプター抗体は、従来のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴデータベース、ＬｏｓＡｌａｍｏｓデータベースおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性によって選択されたものであり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性（アミノ酸に基づく）によって特徴付けられたヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適であり得る。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与し得る好適なアクセプター抗体も同様にして選択することができる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体に起源する必要はないことに留意されたい。このようなヒト化抗体を生産するための限定されない方法の例は、ＥＰ－Ａ－０２３９４００およびＥＰ－Ａ－０５４９５１に詳述されている。

クエリー核酸配列と対象核酸配列の間の「同一性パーセント」は、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、ＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅ、Ｔ－ＣｏｆｆｅｅおよびＤＮＡＳＴＡＲＬａｓｅｒｇｅｎｅなどの好適なアルゴリズムまたはソフトウエアを用いてペアワイズグローバル配列アラインメントを行った後に、クエリー配列の全長にわたって、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＴＡＲＬａｓｅｒｇｅｎｅ、ＧｅｎｅＤｏｃ、Ｂｉｏｅｄｉｔ、ＥＭＢＯＳＳｎｅｅｄｌｅまたはＥＭＢＯＳＳｉｎｆｏａｌｉｇｎなどの好適なアルゴリズムまたはソフトウエアを用いて算出されるパーセンテージとして表す「同一性」の値である。重要なこととして、クエリー核酸配列は、本明細書において１以上の請求項で特定される核酸配列により記載することができる。

クエリーアミノ酸配列と対象アミノ酸配列の間の「同一性パーセント」は、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、ＥＭＢＯＳＳＮｅｅｄｌｅ、Ｔ－ＣｏｆｆｅｅおよびＤＮＡＳＴＡＲＬａｓｅｒｇｅｎｅなどの好適なアルゴリズム／ソフトウエアを用いてペアワイズグローバル配列アラインメントを行った後に、クエリー配列の全長にわたって、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳＴＡＲＬａｓｅｒｇｅｎｅ、ＧｅｎｅＤｏｃ、Ｂｉｏｅｄｉｔ、ＥＭＢＯＳＳｎｅｅｄｌｅまたはＥＭＢＯＳＳｉｎｆｏａｌｉｇｎなどの好適なアルゴリズムまたはソフトウエアを用いて算出されるパーセンテージとして表す「同一性」の値である。重要なこととして、クエリーアミノ酸配列は、本明細書において１以上の請求項で特定されるアミノ酸配列により記載することができる。

クエリー配列は対象配列と１００％同一であり得、または対象配列に比べて特定の整数個までのアミノ酸もしくはヌクレオチドの変更を含んでもよく、これにより同一性％は１００％未満となる。例えば、クエリー配列は、対象配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。このような変更には、少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換（保存的置換および非保存的置換を含む）または挿入が含まれ、この変更は、クエリー配列のアミノ末端位置又はカルボキシ末端位置で起こり得、あるいは、それらの末端位置の間の、クエリー配列内のアミノ酸もしくはヌクレオチド間に個別に散在する任意の場所、またはクエリー配列内の１以上の連続した群に散在する任意の場所で起こり得る。

同一性パーセント（％）は、ＣＤＲを含む、クエリー配列の全長にわたって決定することができる。あるいは、同一性パーセントは、ＣＤＲの１以上または全部を除外してもよく、例えば、ＣＤＲは総て対象配列と１００％同一であり、同一性パーセントの変動はクエリー配列の残りの部分、例えばフレームワーク配列にあり、そのためＣＤＲ配列は固定されインタクトである。

当業者には、本明細書に開示されるＶＨおよび／またはＶＬドメインが、例えば、ｓｄＡｂまたはｓｃＦｖの形態でＣＡＲ－Ｔ治療薬に組み込まれ得ることが認識される。

組織構造の無秩序化は癌の特徴であり、その結果、細胞間結合が破壊されると、秩序ある組織または健常な組織では「隠れた」ままであったエピトープが、癌組織および癌細胞では接近可能／利用可能になる場合がある[Corsini et al. (2018) Oncotarget]。細胞間接触の変化はまた、細胞極性の喪失、および、増殖因子からのシグナルなどいくつかの細胞外シグナルの暴露につながり、頂底極性がない場合には、頂端領域の上皮細胞だけでなく、増殖シグナルを受け取った上皮細胞は、分裂軸の方向性のずれによって促進される分裂面外の分裂によって増殖する傾向がある。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞間結合内に位置する細胞結合タンパク質（例えば、クローディン－３）の少なくとも１つのエピトープと結合する抗原結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメインを含んでなる。細胞結合タンパク質（例えば、クローディン－３）の少なくとも１つのエピトープは、細胞結合タンパク質が細胞間結合の外側に不適切に局在し、それにより細胞表面に露出している場合にのみ、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合するために接近可能である。細胞間結合の外側に不適切に局在する細胞結合タンパク質は、細胞結合タンパク質が細胞間結合、例えば、密着結合に限局されていないような細胞結合タンパク質の異常な局在を指す。例示的および限定されない例として、細胞結合タンパク質（例えば、クローディン－３）は、癌において細胞間結合の外側に不適切に局在し、本明細書に開示されるＣＡＲまたは抗体が認識および結合することができる細胞表面に露出している。対照的に、健常または非癌性組織では、密着結合内に位置する細胞結合タンパク質（例えば、クローディン－３）は、密着結合に限局され、それにより、細胞結合タンパク質を標的とするＣＡＲまたは抗体による接近を妨げる。

よって、本明細書に記載のＣＡＲが標的とするエピトープは、健常（非癌性）細胞と癌細胞の両方で発現される細胞結合タンパク質に見られる。しかしながら、ＣＡＲ細胞外ドメインの抗原結合タンパク質が結合する細胞結合タンパク質のエピトープは、エピトープが細胞間結合の外側に不適切に局在するかまたは提示され、細胞表面に細胞結合タンパク質を露出している場合（例えば、癌細胞または無秩序な組織中の細胞）に、結合のために利用可能および／または接近可能である。あるいは、ＣＡＲ細胞外ドメインの抗原結合タンパク質が結合するエピトープは、細胞間結合が損なわれた（例えば、漏出）または破壊された場合に、癌細胞において結合のために利用可能および／または接近可能である。例えば、健常な非癌性細胞または秩序ある組織中の細胞では、これらの１以上のエピトープは、細胞間結合内に位置するので隠れており、そのためにＣＡＲ細胞外ドメイン、抗体または抗原結合フラグメントは、エピトープに結合することをブロックされている。よって、健常な非癌性細胞または健常な非癌性細胞間の細胞間結合または秩序ある組織中の細胞間に位置する細胞間結合では、これらの１以上のエピトープは、ＣＡＲ細胞外ドメインの結合のために接近不能／利用不能である。

したがって、特定の理論に縛られることを望まないが、本明細書に記載のＣＡＲ細胞外ドメインは健常な非癌性細胞および癌細胞の両方に存在する１以上のエピトープと結合するが、このエピトープは、癌細胞でのみまたは無秩序な組織中の細胞間でのみ結合のために接近可能および／または利用可能であるとの仮説が立てられる（図１参照）。ＣＡＲ細胞外結合ドメインによる結合のためのこのような接近および利用可能性は、例えば、細胞結合タンパク質内に埋没したループを展開することによって、または、健常な非癌性細胞もしくは秩序ある組織では近接していないアミノ酸を癌細胞内で近接させることによって、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合する１以上のエピトープの形成または露出をもたらす細胞結合タンパク質内の立体構造の変化によるものであり得る。あるいは、利用可能性および／または接近は、健常な非癌性細胞または秩序ある組織に比べて癌細胞では、細胞結合タンパク質が結合相手と複合体を形成しない、または会合しないためであり得る。細胞間結合内に位置する細胞結合タンパク質は、この点で、ＣＡＲにより標的化するために特に魅力的なエピトープを含んでなる場合があり、秩序ある組織におけるインタクトなまたは損なわれていない（例えば、破壊されていない）細胞間結合は、ＣＡＲの接近を妨げ、エピトープを結合のために接近不能および／または利用不能にすることが認識される。

よって、特定の実施形態では、１以上のエピトープは健常な非癌性細胞に存在し、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近不能であり、かつ／あるいは、１以上のエピトープは細胞間結合内に位置し、細胞間結合が健常な非癌性細胞間に存在する場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近不能である。さらなる実施形態では、ＣＡＲ細胞外ドメインは、健常な非癌性細胞において、１以上のエピトープに結合することを立体的に妨害され、かつ／あるいは、健常な非癌性細胞間の細胞間結合内に位置する１以上のエピトープに結合することを立体的に妨害されている。

よって、１つの実施形態では、細胞間結合は破壊され、例えば、秩序ある組織中の細胞間、例えば健常な非癌性細胞間に存在する細胞間結合に比べて、無秩序な組織中の細胞間または癌細胞間では破壊されている。さらなる実施形態では、細胞間結合は損なわれ、例えば、細胞間結合が無秩序な組織中の細胞間、癌細胞間、または癌細胞と健常な非癌性細胞の間に存在する場合に損なわれている。したがって、用語「損なわれている」と「破壊されている」は本明細書では互換的に使用可能であり、細胞間結合が物理的に破壊されている、例えば、その構造が変化している場合、および／または細胞間結合が機能的に損なわれている、例えば、漏出性が増している場合を含むことが認識されるであろう。なおさらなる実施形態では、細胞間結合は、結合内に含まれるタンパク質が不適切に局在している場合に、損なわれているおよび／または破壊されている。別の実施形態では、細胞間結合内に含まれるタンパク質は、結合が損なわれているおよび／または破壊されている場合に不適切に局在している。

特定の理論に縛られることを望まないが、構造的に破壊されている細胞間結合は、非破壊細胞間結合では通常「隠されている」エピトープを結合のために接近可能／利用可能とする（例えば、結合のために立体的に接近可能／利用可能とする）ことができ（例えば露出させる）、かつ／あるいは、機能的に損なわれた（例えば、「漏出性」が増している）細胞間結合は、細胞間結合を介したリンパ球の浸潤／移動を増加させ、例えば、抗原結合タンパク質（ＣＡＲに組み込まれた抗原結合タンパク質を含む）が結合するための特定のエピトープの接近可能性／利用可能性をもたらし得るという仮説が立てられる。

１つの実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が破壊されていない場合、例えば、細胞間結合が健常な非癌性細胞間または秩序ある組織内の細胞間に存在する場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近不能／利用不能である（図１、左のパネル参照）。別の実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が破壊されている場合、例えば、細胞間結合が癌もしくは腫瘍細胞間に存在するか、または細胞間結合が健常な非癌性細胞と癌細胞の間に存在するか、または無秩序な組織内の細胞間に存在する場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能／利用可能である（図１、右のパネル参照）。さらなる実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が破壊されている場合にのみ、例えば、細胞間結合が癌もしくは腫瘍細胞間に存在するか、または細胞間結合が健常な非癌性細胞と癌もしくは腫瘍細胞間に存在するか、または無秩序な組織内の細胞間に存在する場合にのみ、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能／利用可能である。

さらなる実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が損なわれていない場合、例えば、細胞間結合が健常な非癌性細胞間または秩序ある組織内の細胞間に存在する場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近不能／利用不能である。別の実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が損なわれている場合、例えば、細胞間結合が癌もしくは腫瘍細胞間に存在するか、細胞間結合が健常な非癌性細胞と癌細胞の間に存在するか、または細胞間結合が無秩序な組織内の細胞間に存在する場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能／利用可能である。さらなる実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が損なわれている場合にのみ、例えば、細胞間結合が癌もしくは腫瘍細胞間に存在するか、細胞間結合が健常な非癌性細胞と癌細胞間に存在するか、または細胞間結合が無秩序な組織内の細胞間に存在する場合にのみ、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能／利用可能である。

癌に関してのみ結合のために接近可能および／または利用可能なエピトープのさらなる例としては、健常な非癌性細胞に比べて癌細胞で不適切に局在している細胞成分（例えば、細胞結合タンパク質）内に存在するものが挙げられる。このような不適切な局在は、細胞成分の過剰発現もしくは上方制御、変異、タンパク質の翻訳後修飾の変化、細胞分極の変化および／または組織の無秩序化の結果であり得る。よって、いくつかの実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が、不適切に局在していない標的エピトープを有する細胞結合タンパク質を含んでなる場合、例えば、細胞間結合が健常な非癌性細胞間または秩序ある組織内の細胞間に存在する場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近不能／利用不能である。さらなる実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が不適切に局在した標的エピトープを有する細胞結合タンパク質を含んでなる場合、例えば、細胞間結合が癌もしくは腫瘍細胞間に存在するか、細胞間結合が健常な非癌性細胞と癌もしくは腫瘍細胞の間に存在するか、または細胞間結合が無秩序な組織内の細胞間に存在する場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能／利用可能である。他の実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が不適切に局在した標的エピトープを有する細胞結合タンパク質を含んでなる場合にのみ、例えば、細胞間結合が癌もしくは腫瘍細胞間に存在するか、細胞間結合が健常な非癌性細胞と癌細胞の間に存在するか、または細胞間結合が無秩序な組織内の細胞間に存在する場合にのみ、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能／利用可能である。なおさらなる実施形態では、１以上のエピトープは、細胞間結合が細胞間結合の外側に不適切に局在した標的エピトープを有する細胞結合タンパク質を含んでなる場合にのみ、例えば、細胞間結合が癌細胞間に存在するか、細胞間結合が健常細胞と癌細胞の間に存在する場合、または細胞間結合がそれ以外の点で損なわれているもしくは破壊されている（例えば無秩序な組織内の細胞間に存在する）場合にのみ、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能／利用可能である。

よって、認識されているように、用語「接近可能」および「利用可能」は本明細書では互換的に使用され、エピトープの空間的および／または立体的な接近可能性／利用可能性を指し得、あるいは、健常な非癌性細胞に比べた場合の癌細胞におけるエピトープの発現を指し得る。同様に、用語「接近不能」および「利用不能」も本明細書で互換的に使用される。

特定の実施形態では、１以上のエピトープは、密着結合内に位置する細胞結合タンパク質に存在する。

密着結合（閉鎖結合または閉鎖帯としても知られる）は、上皮細胞間の多タンパク質複合体であり、その一般的な機能は、輸送された溶質および水の上皮バリアを越える漏出を防ぎ、傍細胞経路を封鎖することである。密着結合はまた、陽イオン、陰イオンまたは水などの小分子に対して選択的なチャネルを形成することによって漏出経路（leaky pathway）を提供することもある。上皮バリアが「密着性（tight）」または「漏出性（leaky）」のいずれに分類されるかは、溶質および水の移動を阻止する細胞間の密着結合の能力によって決まる。「密着性」上皮バリアの非限定的な例は血液脳関門であり、「漏出性」上皮バリアの非限定的な例は腎臓近位尿細管である。したがって、密着結合は、上皮バリアを形成するために細胞同士を保持する機能を果たすだけでなく、隣接する細胞の膜の間の空間を分子およびイオンが通過するのを阻止／制御するとともに、細胞膜成分の頂端面と側面／基底面の間の側方拡散を阻止することによって細胞の極性を維持する働きをする。

密着結合は、各ストランドが他のストランドとは独立に作用する、シーリングストランドの分岐ネットワークから構成されている。各ストランドは、上皮細胞の原形質膜に埋め込まれた膜貫通タンパク質の列から形成され、細胞外ドメインは互いに直接結合している。密着結合には少なくとも４０種類のタンパク質が存在し、これらのタンパク質は、膜貫通タンパク質および細胞質タンパク質の両方を含む。密着結合に見られる３つの主要な膜貫通タンパク質は、オクルディン、クローディンおよびジャンクション接着分子（ＪＡＭ：junction adhesion molecule）タンパク質である。これらは、原形質膜の細胞内側に位置するＺＯ－１などの異なる表在性膜タンパク質と会合し、細胞骨格のアクチン成分にストランドを固定する。このようにして、密着結合は隣接する細胞の細胞骨格をつないでいる。

オクルディンは、グルコース取り込み、ＡＴＰ生産および遺伝子発現などの細胞代謝の特定の側面に影響を及ぼすＮＡＤＨオキシダーゼである。また、オクルディンは、密着結合の機能にも重要であり、タイトジャンクションタンパク質１、タイトジャンクションタンパク質２およびＹＥＳ１と相互作用することが示されており、密着結合の集合には必要ではないが、バリア特性の維持に役割を果たす。オクルディンの変異または不在は上皮の漏出性を増し、オクルディンの喪失または異常発現は乳癌組織において浸潤の増加、接着の低下および密着結合機能の著しい低下を引き起こすことが示されている。

クローディンは、多くの生物に見られる小さな（２０～２７ｋＤａ）膜貫通タンパク質である。クローディンは細胞膜を４回貫通し（すなわち、４つの膜貫通ドメインを有する）、Ｎ末端とＣ末端はともに細胞質に位置し、最も高い保存性を示す２つの細胞外ループを有する。第１の細胞外ループ（ＥＣＬ１）の長さは約５３アミノ酸であり、第２の細胞外ループ（ＥＣＬ２）の長さは約２４アミノ酸である。ＥＣＬ１は傍細胞イオン選択性を制御し、ＥＣＬ２は密着結合内で隣接するクローディンタンパク質とのホモおよびヘテロ二量体形成を制御する。Ｎ末端側は通常短く（例えば、４～１０アミノ酸）、Ｃ末端側は長く、例えば２１～６３アミノ酸で変動し、これらのタンパク質の密着結合への局在に必要である。個々のまたは別個のクローディンのシステインがジスルフィド結合を形成していると思われる。総てのヒトのクローディン（クローディン１２を除く）は、それらを足場タンパク質のＰＤＺドメインに結合させるドメインを有する。

ジャンクション接着分子（ＪＡＭ）タンパク質は、高内皮細胞（high endothelial cell）間の密着結合内に位置し、これらの結合の形成に関与しているだけでなく、免疫細胞の接着リガンドとしても機能している。また、それらはＰＡＲ－３およびＪＡＭ３との相互作用を介して、内皮細胞の極性にも関連づけられている。

１つの実施形態では、細胞結合タンパク質は、クローディンファミリータンパク質のメンバーであり、例えば、クローディン－１、クローディン－２、クローディン－３、クローディン－４、クローディン－５、クローディン－６、クローディン－７、クローディン－８、クローディン－９、クローディン－１０ａ、クローディン－１０ｂ、クローディン－１１、クローディン－１２、クローディン－１４、クローディン－１５、クローディン－１６、クローディン－１７、クローディン－１８、クローディン－１９、クローディン－２０、クローディン－２２、クローディン－２３およびクローディン－２５、または関連するクローディンドメイン含有１（claudin domain containing 1）、クローディンドメイン含有２（claudin domain containing 2）、膜貫通タンパク質２０４および末梢ミエリンタンパク質２２のいずれかから選択される。

なおさらなる実施形態では、細胞結合タンパク質は、クローディン－３である。特定の実施形態では、細胞結合タンパク質は、ヒトクローディン－３（例えば、配列番号１３に示されるヒトクローディン－３）である。

クローディン－３（ＣＬＤＮ３としても知られる）は、ヒトではＣＬＤＮ３遺伝子によりコードされ、密着結合の不可欠な成分であるだけでなく、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)腸毒素に対する低親和性の受容体でもある。クローディン－３は、ＣＬＤＮ１およびＣＬＤＮ５と相互作用することが示されており、ヒトクローディン－３は以下のアミノ酸配列を有する。

上の下線の付された太字の残基は、Ｎ３８およびＥ１５３を示す。さらなる実施形態では、１以上のエピトープは、細胞結合タンパク質の１以上の細胞外ループに存在する。いくつかの実施形態では、細胞外ループは、以下の配列：
ＷＳＡＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号１４）
を含んでなるヒトクローディン－３の細胞外ループ２（ＥＣＬ２）を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ループは、以下の配列：
ＲＶＳＡＦＩＧＳＮＩＩＴＳＱＮＩＷＥＧＬＷＭＮＣＶＶＱＳＴＧＱＭＱＣＫＶＹＤＳＬＬＡＬＰＱＤＬＱＡＡＲ（配列番号２６）
を含んでなるヒトクローディン－３の細胞外ループ１（ＥＣＬ１）を含む。

なおさらなる実施形態では、１以上のエピトープは、クローディン－３にユニークに存在する。用語「ユニーク」および「ユニークに存在する」は、本明細書で使用する場合、記載された特徴が同じタンパク質ファミリー内の他の密接に関連するタンパク質には見られないことを指す。例えば、１以上のエピトープがクローディン－３にユニークに存在する場合、１以上のエピトープは、別のクローディンファミリータンパク質、例えば、密接に関連するタンパク質であるクローディン－４、クローディン－６、クローディン－５、クローディン－９またはクローディン－１７には見られず、特に、１以上のエピトープは、クローディン－４、クローディン－６、クローディン－５またはクローディン－９、例えば、クローディン－３に最も近い既知のホモログであるクローディン－４に存在しない。このようなエピトープは小さいものであってよく、または短いアミノ酸長、例えば４～１０アミノ酸、例えば４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸であり得る。よって、１つの実施形態では、１以上のエピトープは４アミノ酸長である。クローディン－３にユニークに存在するエピトープは、線状エピトープまたは立体構造エピトープであり得る。線状エピトープは、タンパク質一次配列内の連続残基から構成される。例えば、アミノ酸配列ＰＶＶＰ（配列番号１５）を含んでなるエピトープは、クローディン－３に存在するが他の密接に関連するクローディンファミリータンパク質、例えば、クローディン－４には存在せず、したがって、クローディン－３にユニークに存在するエピトープと見なされ得る線状エピトープである。立体構造エピトープは、一次タンパク質配列では不連続ながら、タンパク質／抗原の三次元構造では近接して抗原表面を形成するようになる残基から構成される。クローディン－３にユニークに存在するエピトープはまた、立体構造エピトープであってもよい。

いくつかの実施形態では、１以上のエピトープは、クローディン－３のＥＣＬ１およびＥＣＬ２に存在する残基から構成される立体構造エピトープである。いくつかの実施形態では、１以上のエピトープは、クローディン－３のＥＣＬ１に存在する少なくとも１つの残基とクローディン－３のＥＣＬ２に存在する少なくとも１つの残基を含んでなる立体構造エピトープである。いくつかの実施形態では、１以上のエピトープは、配列番号１３に従って付番した場合に、クローディン－３のＥＣＬ１に存在する少なくともＮ３８とクローディン－３のＥＣＬ２に存在する少なくともＥ１５３を含んでなる立体構造エピトープである。いくつかの実施形態では、１以上のエピトープは、配列番号１３の少なくともＮ３８およびＥ１５３を含んでなる。いくつかの実施形態では、１以上のエピトープは、配列番号１３のＮ３８およびＥ１５３から本質的になる。

１つの実施形態では、配列番号１３の少なくともＮ３８およびＥ１５３を含んでなるヒトクローディン－３の不連続エピトープに結合する単離されたクローディン－３結合タンパク質が提供される。１つの実施形態では、配列番号１３のＮ３８およびＥ１５３から本質的になるヒトクローディン－３の不連続エピトープに結合する単離されたクローディン－３結合タンパク質が提供される。１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質はキメラまたはヒト化型であり；かつ／あるいは、クローディン－３結合タンパク質はモノクローナル抗体、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ＣａｍｅｌＩｇ、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）およびｓｄＡｂからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、ａ）配列番号１３の少なくともＮ３８およびＥ１５３を含んでなるヒトクローディン－３の不連続エピトープに結合する単離されたクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン；ｂ）膜貫通ドメイン；およびｃ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなるポリペプチドを含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。別の実施形態では、細胞外ドメインは、配列番号１３のＮ３８およびＥ１５３から本質的になるヒトクローディン－３の不連続エピトープに結合する単離されたクローディン－３結合タンパク質を含んでなる。

「特異的結合親和性」、「特異的に結合する」、「特異的に結合した」、「特異的に結合している」または「特異的に標的とする」という用語は、本明細書で使用する場合、癌細胞でのみ結合のために接近可能および／または利用可能なエピトープへの抗原／エピトープ結合ドメイン（またはそれを含んでなるＣＡＲ）の結合を表す。特定の実施形態では、結合ドメイン（または結合ドメインを含んでなるＣＡＲまたは結合ドメインを含有する融合タンパク質）は、約１０^６Ｍ^－１、１０^７Ｍ^－１、１０^８Ｍ^－１、１０^９Ｍ^－１、１０^１０Ｍ^－１、１０^１１Ｍ^－１または１０^１２Ｍ^－１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）は、少なくとも１０^７Ｍ^－１、少なくとも１０^８Ｍ^－１、少なくとも１０^９Ｍ^－１、少なくとも１０^１０Ｍ^－１、少なくとも１０^１１Ｍ^－１または少なくとも１０^１２Ｍ^－１またはそれ以上のＫａを有する結合ドメインを指す。結合ドメイン（または結合ドメインを含んでなるＣＡＲまたは結合ドメインを含有する融合タンパク質）は、例えば１０^３Ｍ^－１～１０^１０Ｍ^－１の親和性またはＫａ（すなわち、Ｉ／Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡会合定数）でクローディン－３と結合または会合する場合にクローディン－３と「特異的に結合する」と見なすことができる。

あるいは、親和性は、Ｍを単位とする特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０^－５Ｍ～１０^－１３Ｍ、またはそれより低い）と定義することができる。本開示に従う結合ドメインポリペプチドおよびＣＡＲの親和性は、従来の技術を用いて、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着アッセイ）により、標識リガンドを用いた結合会合－解離アッセイ、ＢｉａｃｏｒｅＴ１００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能）などの表面プラズモン共鳴装置を用いた結合会合－解離アッセイ、またはＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅ（それぞれＣｏｒｎｉｎｇおよびＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから入手可能）などの光学バイオセンサー技術を用いた結合会合－解離アッセイにより容易に決定することができる（また、例えば、Scatchard, Ann NY Acad Sci. 1949; 51(4): 660および米国特許第５，２８３，１７３号または等価文献も参照）。

しかしながら、当業者は、本明細書に開示される抗原／エピトープ結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメインを含んでなるＣＡＲが、同じ抗原／エピトープ結合ドメインを含んでなる抗体よりも高い感受性および選択性を示し得ることを認識する。これは、結合が直接的に（例えば、標識抗体またはＣＡＲを用いて結合を可視化することによる）検出できない場合にも、結合が間接的に（例えば、細胞機能アッセイおよび測定による）決定可能であることを意味する。例えば、結合は、標識抗体もしくはＣＡＲ、例えば、蛍光標識可溶性抗体を用いて結合を可視化することにより直接的に検出可能であり、あるいは、サイトカイン放出アッセイ（例えば、ＩＦＮγ放出の測定）、細胞殺傷の測定または以下の実施例のセクションに詳細に記載されるような他の機能的測定／技術によるなど、抗体またはＣＡＲを発現する細胞の機能（活性化など）を介して間接的に検出可能である。よって、特定の実施形態では、結合は、抗体または抗原／エピトープ結合フラグメントがＣＡＲに含まれる場合、したがって非可溶性の細胞形式で細胞で発現する場合には、例えばＣＡＲ発現細胞の活性化により検出されるが、抗体または抗原／エピトープ結合フラグメントが可溶性の非細胞形式（例えば、可溶性抗体またはその抗原結合フラグメント）に含まれる場合には検出されない。さらに当業者には、本明細書に記載されるようなＣＡＲは、クローディン－３などの標的抗原／エピトープに対して、他の関連タンパク質、例えば、クローディン－４、クローディン－５、クローディン－６および／またはクローディン－９を含む他のクローディンファミリーメンバーのタンパク質よりも高い選択性を有し得ることが認識される。

特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗クローディン－３結合タンパク質などの抗原結合タンパク質を含んでなり、抗原結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントから選択される。

特定の実施形態では、抗原結合タンパク質、例えば、抗クローディン－３抗体またはその抗原結合フラグメントは、限定するものではないが、ＣａｍｅｌＩｇ（ラクダ科抗体（ＶＨＨ））、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）およびｓｄＡｂ（ナノボディとしても知られる）が含まれる。

１つの実施形態では、抗原結合タンパク質、例えば、抗クローディン－３抗体またはその抗原結合フラグメントはｓｃＦｖである。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ細胞外ドメインは、クローディン－３結合タンパク質を含んでなる。例示的なクローディン－３結合タンパク質は、少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含んでなる、クローディン－３に特異的な免疫グロブリン可変領域である。「ヒトフレームワーク領域」は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型（すなわち天然に存在する）フレームワーク領域、その領域のアミノ酸の約５０％未満（例えば、好ましくは、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満）が欠失もしくは置換されている（例えば、対応する位置において非ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１以上のアミノ酸残基で置換されている）ヒト免疫グロブリン可変領域の変化したフレームワーク領域、またはその領域のアミノ酸の約５０％未満（例えば、好ましくは、約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％未満）が欠失もしくは置換され（例えば、露出した残基の位置でおよび／または対応する位置におけるヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１以上のアミノ酸残基で置換され）、その結果、１つの実施形態では、免疫原性が低減されている非ヒト免疫グロブリン可変領域の変化したフレームワーク領域を指す。

特定の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型フレームワーク領域である。特定の他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える位置にアミノ酸欠失または置換を有するヒト免疫グロブリン可変領域の変化したフレームワーク領域である。他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える位置にアミノ酸欠失または置換を有する非ヒト免疫グロブリン可変領域の変化したフレームワーク領域である。

特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、ヒト軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）１、ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、ヒト重鎖ＦＲ３、ヒト軽鎖ＦＲ４およびヒト重鎖ＦＲ４から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでなる。

クローディン－３特異的結合ドメインに存在し得るヒトＦＲにはまた、例示的なＦＲの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超えるアミノ酸が置換または欠失されている、本明細書で提供される例示的なＦＲのバリアントが含まれる。

特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、（ａ）ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３およびヒト軽鎖ＦＲ４を含んでなるヒト化軽鎖可変領域；ならびに（ｂ）ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ３およびヒト重鎖ＦＲ４を含んでなるヒト化重鎖可変領域を含んでなる。

本明細書で提供されるクローディン－３結合タンパク質はまた、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＣＤＲを含んでなる。このようなＣＤＲは、重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３ならびに軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択される非ヒトＣＤＲまたは変化した非ヒトＣＤＲであり得る。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ１および重鎖ＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖可変領域を含んでなる。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２および軽鎖ＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、（ａ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ１および重鎖ＣＤＲＨ３を含んでなる重鎖可変領域；ならびに（ｂ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２および軽鎖ＣＤＲＬ３を含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる。

よって、１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７中のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３；および／または配列番号８中のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲのいずれか１つまたは組合せを含んでなる。さらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７および８中の６つ総てのＣＤＲを含んでなる。

１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１～３に示される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１～３に示される重鎖ＣＤＲ配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。さらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１～３に示される重鎖ＣＤＲ配列と少なくとも９０％同一の少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ１、配列番号２と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ２および／または配列番号３と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ３を含んでなる。他の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２および／または配列番号３のＣＤＲＨ３を含んでなる。

１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号４～６に示される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号４～６に示される軽鎖ＣＤＲ配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。さらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号４～６に示される軽鎖ＣＤＲ配列と少なくとも９０％同一の少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ配列を含んでなる。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号４と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ１、配列番号５と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ２および／または配列番号６と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ３を含んでなる。他の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２および／または配列番号６のＣＤＲＬ３を含んでなる。

いくつかの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ１、配列番号２と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ２、配列番号３と少なくとも９０％同一のＣＤＲＨ３、配列番号４と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ１、配列番号５と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ２および配列番号６と少なくとも９０％同一のＣＤＲＬ３を含んでなる。

なおさらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１のＣＤＲＨ１、配列番号２のＣＤＲＨ２、配列番号３のＣＤＲＨ３、配列番号４のＣＤＲＬ１、配列番号５のＣＤＲＬ２および配列番号６のＣＤＲＬ３を含んでなる。

「ＶＨ」という場合には、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ｓｄＡｂ、または本明細書に開示されるその他の抗体フラグメントの可変領域を含む、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。本明細書で企図されるクローディン－３結合タンパク質を構築するために好適な重鎖可変領域の具体例としては、限定するものではないが、配列番号７に示される重鎖可変領域配列が挙げられる。

「ＶＬ」という場合には、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示されるその他の抗体フラグメントの可変領域を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。本明細書で企図されるクローディン－３結合タンパク質を構築するために好適な軽鎖可変領域の具体例としては、限定するものではないが、配列番号８に示される軽鎖可変領域配列が挙げられる。

１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７の配列と少なくとも７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のＶＨ配列を含んでなる。別の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７の配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列を含んでなる。代替の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７のＶＨ配列を含んでなる。

さらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号８の配列と少なくとも７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のＶＬ配列を含んでなる。別の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号８の配列と少なくとも９０％同一のＶＬ配列を含んでなる。代替の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号８のＶＬ配列を含んでなる。

よって、１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７の配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列および配列番号８の配列と少なくとも９０％同一のＶＬ配列を含んでなる。さらなる実施形態では、クローディン－３結合ドメインは、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含んでなる。

特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７の配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列を含んでなるｓｄＡｂである。１つの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７のＶＨ配列を含んでなるｓｄＡｂである。

特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号７の配列と少なくとも９０％同一のＶＨ配列および配列番号８の配列と少なくとも９０％同一のＶＬ配列を含んでなるｓｃＦｖであり、好ましくは、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含んでなる。

いくつかの実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へＶＨ配列およびＶＬ配列を含んでなるｓｃＦｖであり、ＶＨ配列とＶＬ配列は場合によりリンカー配列により分離されている。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含んでなるｓｃＦｖである。他の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へＶＬ配列およびＶＨ配列を含んでなるｓｃＦｖであり、ＶＬ配列とＶＨ配列は場合によりリンカー配列により分離されている。特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ配列番号８のＶＬ配列および配列番号７のＶＨ配列を含んでなるｓｃＦｖである。

特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１１の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含んでなる。さらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１１と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１１の配列を含んでなる。

特定の実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１８の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含んでなる。さらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１８と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、クローディン－３結合タンパク質は、配列番号１８の配列を含んでなる。

リンカー
特定の実施形態では、ＣＡＲは、様々なドメイン間に、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、分子の適当な間隔および立体構造のために付加されるリンカー残基を含んでなる。特定の実施形態では、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」は、ＶＨドメインとＶＬドメインを接続し、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供し、その結果、生じたポリペプチドが同じ軽鎖および重鎖可変領域を含んでなる抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持するアミノ酸配列である。特定の実施形態では、リンカーは、１以上の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメインおよび／または細胞内シグナル伝達ドメインを分離する。ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超えるリンカーを含んでなり得る。特定の実施形態では、リンカーの長さは、約１～約２５アミノ酸、約５～約２０アミノ酸、約１０～約２０アミノ酸またはその間の任意のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５またはそれを超えるアミノ酸長である。

リンカーの具体例には、グリシンポリマー（Ｇ）_ｎ；グリシン－セリンポリマー（Ｇ_１－５Ｓ_１－５）_ｎ［式中、ｎは少なくとも１、２、３、４または５の整数である］；グリシン－アラニンポリマー；アラニン－セリンポリマー；および当技術分野で公知のその他のフレキシブルリンカーである。例示的なリンカーは、配列番号９に示されるグリシン－セリンポリマーである。

スペーサードメイン
特定の実施形態では、細胞外ドメイン（すなわち、ＣＡＲの結合ドメイン）の後に１以上の「スペーサードメイン」が続き、このスペーサードメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にするために抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から遠ざける領域を指す(Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419)。スペーサードメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源のいずれに由来してもよい。特定の実施形態では、スペーサードメインは、限定するものではないが、１以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含む免疫グロブリンの一部分である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。

１つの実施形態では、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでなる。

ヒンジドメイン
一般に、ＣＡＲの結合ドメインの後には１以上の「ヒンジドメイン」が続き、このヒンジドメインは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合および活性化を可能にするために抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から遠ざける役割を果たす。ＣＡＲは一般に、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）の間に１以上のヒンジドメインを含んでなる。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源のいずれに由来してもよい。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンヒンジ領域または変化した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。

本明細書に記載のＣＡＲで使用するために好適な例示的ヒンジドメインとしては、Ｉ型膜タンパク質、例えばＣＤ８αおよびＣＤ４の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これらの分子に由来する野生型ヒンジ領域であっても、または変化していてもよい。特定の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域に由来するかまたはそれを含んでなる。

膜貫通ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインをさらに含んでなる。「膜貫通ドメイン」（ＴＭ）は、細胞外結合部分と共刺激ドメイン／細胞内シグナル伝達ドメインを融合させ、免疫エフェクター細胞の原形質膜にＣＡＲを、例えば細胞膜を貫通することによって、固定するＣＡＲの一部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成または組換え供給源のいずれに由来してもよい。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖またはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）およびＰＤ１の少なくとも膜貫通領域に由来し得る（例えば、それを含んでなり得る）。特定の実施形態では、ＴＭドメインは合成であり、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含んでなる。

１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含んでなる。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインおよび短い、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸長のオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーを含んでなり、オリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲのＴＭドメインおよび共刺激／細胞内シグナル伝達ドメインを連結する。グリシン－セリン系リンカーは、特に好適なリンカーを提供する。ＣＤ８αに由来する例示的なＴＭドメインは、配列番号１９で示される。

細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含んでなる。「細胞内シグナル伝達ドメイン」（「細胞内エフェクタードメイン」または「シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、標的抗原（例えば、クローディン－３タンパク質）への細胞外ドメインの有効な結合（例えば、抗クローディン－３ＣＡＲ結合）のメッセージを免疫エフェクター細胞内に伝達してエフェクター細胞機能を惹起することに関与するＣＡＲの部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の正常なエフェクター機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖および／もしくは細胞傷害活性（ＣＡＲが結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含む）、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で惹起される他の細胞応答のうち少なくとも１つの活性化を担う。

用語「エフェクター機能」は、免疫エフェクター細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。よって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊な機能を実行させるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート型部分を使用する限り、このようなトランケート型部分（truncated portion）は、それがエフェクター機能シグナルを形質導入する限り、ドメイン全体の代わりに使用可能である。

細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのトランケート型部分を含むことを意味する。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）単独により生じるシグナルではＴ細胞の完全な活性化に不十分であることおよび二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要とされることが知られている。よって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスのシグナル伝達ドメイン：ＴＣＲによって抗原依存性一次活性化を開始させる細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）；および、抗原非依存的に二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供する働きをする共刺激シグナル伝達ドメインにより媒介されると言うことができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの「共刺激シグナル伝達ドメイン」および少なくとも１つの「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含んでなる。

細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激的にまたは抑制的に制御する。刺激的様式で働く細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。

本明細書に記載のＣＡＲの特定の実施形態における使用のために好適なＩＴＡＭ含有細胞内シグナル伝達ドメインの具体例は、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂに由来するものが挙げられる。１つの実施形態では、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζである。例示的なＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２１で示される。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインおよび１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでなる。細胞内シグナル伝達と共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に任意の順序で直列に連結され得る。

共刺激ドメイン
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲを発現するＴ細胞の有効性および拡大増殖を高めるために１以上の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含んでなる。本明細書で使用する場合、用語「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合した際にＴリンパ球の効率的な活性化および機能に必要とされる二次シグナルを提供する、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。このような共刺激分子の具体例としては、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０が挙げられる。

１つの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）およびＣＤ１３７（４－１ＢＢ）からなる群から選択される１以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでなる。さらなる実施形態では、１以上の共刺激ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である。例示的なＣＤ１３７（４－１ＢＢ）共刺激ドメインは、配列番号２０で示される。

別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）共刺激シグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。

特定の実施形態では、ＣＡＲは、リーダー配列をさらに含んでなる。特定の実施形態では、リーダー配列は、ＣＤ８リーダー配列である。例示的なＣＤ８リーダー配列は、配列番号１０で示される。

よって、特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８または３９の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８または３９と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８または３９の配列を含んでなる。

特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、配列番号２５の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２５と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２５の配列を含んでなる。

特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、配列番号２７の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２７の配列を含んでなる。

特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、配列番号２８の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２８と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２８の配列を含んでなる。

特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、配列番号２９の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２９の配列を含んでなる。

特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、配列番号３０の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％のアミノ酸同一性を有する配列を含んでなる。さらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０と少なくとも９０％同一の配列を含んでなる。なおさらなる実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３０の配列を含んでなる。

特定の実施形態では、以下のドメイン：
ａ）本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに従うクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメイン；および
ｃ）ＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。

別の特定の実施形態では、以下のドメイン：
ａ）配列番号１のＣＤＲＨ１配列；配列番号２のＣＤＲＨ２配列；配列番号３のＣＤＲＨ３配列；配列番号４のＣＤＲＬ１配列；配列番号５のＣＤＲＬ２配列；および配列番号６のＣＤＲＬ３配列を含んでなるクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメイン；
ｃ）ＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ｄ）ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来する共刺激ドメイン
を含んでなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が提供される。

いくつかの実施形態では、細胞外ドメインのクローディン－３結合タンパク質は、ｓｄＡｂである。他の実施形態では、細胞外ドメインのクローディン－３結合タンパク質は、配列番号１のＣＤＲＨ１配列；配列番号２のＣＤＲＨ２配列；配列番号３のＣＤＲＨ３配列を含んでなるｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインのクローディン－３結合タンパク質は、ｓｃＦｖである。他の実施形態では、細胞外ドメインのクローディン－３結合タンパク質は、配列番号１のＣＤＲＨ１配列；配列番号２のＣＤＲＨ２配列；配列番号３のＣＤＲＨ３配列；配列番号４のＣＤＲＬ１配列；配列番号５のＣＤＲＬ２配列；および配列番号６のＣＤＲＬ３配列を含んでなるｓｃＦｖである。さらに他の実施形態では、細胞外ドメインのクローディン－３結合タンパク質は、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含んでなるｓｃＦｖである。

また、結合をめぐって、配列番号１のＣＤＲＨ１配列；配列番号２のＣＤＲＨ２配列；配列番号３のＣＤＲＨ３配列；配列番号４のＣＤＲＬ１配列；配列番号５のＣＤＲＬ２配列；および配列番号６のＣＤＲＬ３配列を含んでなるクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメインを含んでなるＣＡＲと競合するクローディン－３結合タンパク質またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も本明細書で提供される。特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、結合をめぐって、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含んでなるクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメインを含んでなるＣＡＲと競合する。好適には、前記ＣＡＲは、ｓｃＦｖであるクローディン－３結合タンパク質を含んでなる。

ポリペプチド
限定するものではないが、ＣＡＲポリペプチドおよびそのフラグメントを含む種々のポリペプチド、それを含んでなる細胞および組成物、抗体およびポリペプチドを発現するベクターが本明細書で企図される。好ましい実施形態では、１以上のＣＡＲを含んでなるポリペプチドが提供される。特定の実施形態では、ＣＡＲは、配列番号１１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含んでなる、好ましくは、配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８または３９と少なくとも９０％同一の配列を含んでなるクローディン－３結合ＣＡＲである。

「ポリペプチド」、「ポリペプチドフラグメント」、「ペプチド」および「タンパク質」は、別段のことが明示されない限り、従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列として互換的に使用される。ポリペプチドは、合成または組換え生産され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、全長タンパク質配列または全長タンパク質のフラグメントを含んでなり得、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの翻訳後修飾、ならびに当技術分野で公知の天然に存在するおよび天然に存在しない他の修飾を含み得る。種々の実施形態において、ＣＡＲポリペプチドは、タンパク質のＮ末端側に、そのタンパク質の移行を同時翻訳的にまたは翻訳後に指示するシグナル（またはリーダー）配列を含んでなる。本明細書で企図されるＣＡＲに有用な好適なシグナル配列の具体例としては、限定するものではないが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチドまたはヒトＧＭ－ＣＳＦ受容体αシグナルポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドは、様々な周知の組換えおよび／または合成技術のいずれかを用いて作製することができる。本明細書で企図されるポリペプチドは、具体的には、本開示のＣＡＲ、または本明細書で企図されるＣＡＲの１以上のアミノ酸の欠失、付加および／もしくは置換を有する配列を包含する。

「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、本明細書で使用する場合、ペプチドまたはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の成分との会合からのｉｎｖｉｔｒｏ単離および／または精製を指し、すなわち、それはｉｎｖｉｖｏ物質と有意に会合していない。同様に、「単離された細胞」は、ｉｎｖｉｖｏ組織または器官から取得された細胞を指し、細胞外マトリックスを実質的に含まない。

ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、天然に存在するポリペプチドとは１以上の置換、欠失、付加および／または挿入の点で異なり得る。このようなバリアントは天然に存在するものであってもよいし、または例えば、上記ポリペプチド配列の１以上を改変することによって合成的に生成することもできる。

本明細書で提供される配列番号１１または配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９のアミノ酸配列を含んでなるＣＡＲなどのＣＡＲを含んでなるポリペプチドは、さらなるおよび／または付加的なポリペプチド配列またはエレメントを含んでなり得ることが認識される。このような付加的エレメントとしては、限定するものではないが、細胞内のポリペプチド配列の発現を制御するかまたはポリペプチドを含む細胞を標的化するために使用され得るアブレーションエレメント（ablation element）または制御エレメントが含まれる。発現を制御するエレメントまたはポリペプチド配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、翻訳開始配列および／または翻訳後にポリペプチド配列のエレメントの分離を可能とする切断部位を含んでなり得る。

よって、１つの実施形態では、本明細書で企図されるポリペプチドは、アブレーションエレメントをさらに含んでなる。本明細書で使用する場合、「アブレーションエレメント」は、細胞の表面に発現し、細胞を標的化または検出するために使用可能な（「排除マーカー（elimination marker）」としても知られる）ポリペプチド配列および／またはタンパク質を指す。例えば、アブレーションエレメントは、抗体またはその抗原結合フラグメントの細胞外エピトープまたは結合領域を含んでなる細胞表面タンパク質のポリペプチド配列であり得る。よって、１つの実施形態では、アブレーションエレメントは、細胞表面タンパク質に特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の標的とされる細胞表面タンパク質である。したがって、このような機構を利用することにより、本明細書で企図されるポリペプチドを発現する細胞は特異的に標識／検出され得、例えば、形質導入細胞と非形質導入細胞の混合集団から特異的に選択または単離され得ることが認識される。さらに、アブレーションエレメントを含んでなるポリペプチドを発現する細胞は、処置対象の循環から特異的かつ選択的に排除、例えば排除／除去され得る。

好適なアブレーションエレメントの例としては、限定するものではないが、トランケート型ヒトＥＧＦＲポリペプチド（ｈｕＥＧＦＲｔ）およびＣＤ２０が挙げられ、それぞれセツキシマブおよびリツキシマブによって認識され得る(Wang et al., Blood, 2011; 118(5): 1255-1263, Paszkiewicz et al., J Clin Invest, 2016; 126(11):4262-4272, Vogler et al., Mol Ther J Am Soc Gene Ther, 2010; 18:1330-8, Griffioen et al., Haematologica, 2009; 94:1316-20およびPhilip et al., Blood, 2014; 124:1277-87)。好適なアブレーションエレメントの別の例として、ＣＡＲの細胞外ドメインに組み込まれる短いポリペプチドエピトープタグ（いわゆる「Ｅ－タグ」）があり、次にこれに対して抗エピトープタグＣＡＲが作製できる(Koristka et al., Cancer Immunol Immunother CII, 2019; 68:1401-15)。

よって、１つの実施形態では、アブレーションエレメントは、トランケート型ヒトＥＧＦＲポリペプチド（ｈｕＥＧＦＲｔ）およびＣＤ２０からなる群から選択される。特定の実施形態では、アブレーションエレメントはＣＤ２０である。

いくつかの実施形態では、アブレーションエレメントは、ＣＡＲポリペプチド配列から切断される。よって、１つの実施形態では、本明細書で企図されるポリペプチドは、Ｐ２Ａ切断部位などの切断部位を含んでなる。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２４に示される配列を含んでなる。

ポリヌクレオチド
別の側面において、本明細書に記載されるような１以上のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（－））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれる。

種々の例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドには、発現ベクター、ウイルスベクターおよび導入プラスミドならびにそれらを含んでなる組成物および細胞が含まれる。種々の例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９の配列を有するＣＡＲ、または配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９をコードするポリヌクレオチド配列、または配列番号１６および１７に示されるポリヌクレオチド配列を含む、本明細書で企図されるＣＡＲまたはポリペプチドをコードする。

よって、配列番号１６および／または１７と少なくとも７５％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む、本明細書に開示される抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１６および／または１７の配列を含んでなる。

本明細書で使用する場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、フラグメントに通常隣接する配列から取り出されたＤＮＡフラグメントを指す。「単離されたポリヌクレオチド」はまた、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または天然には存在しない、人の手で作り出された他のポリヌクレオチドも指す。

当技術分野で既知かつ利用可能な十分に確立された様々な技術のいずれかを用いて、ポリヌクレオチドを作製、操作および／または発現することができる。所望のポリペプチドを発現させるために、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適当なベクターに挿入することができる。

ベクター
別の側面において、本発明は、本明細書に記載される１以上のＣＡＲおよび／またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。

用語「ベクター」は、別の核酸分子を導入または送達することができる核酸分子を指して本明細書で使用される。導入される核酸は一般に、ベクターの核酸分子に連結、例えば挿入される。ベクターは、細胞内で自律的複製を指示する配列を含んでもよく、または宿主細胞のＤＮＡへの組込みを可能とするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体およびウイルスベクターが含まれる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルスおよびレンチウイルスが含まれる。

特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、本明細書で企図されるＣＡＲおよびポリペプチドを産生するために使用することができる。さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの生産を可能とする付加的成分を含むことができ、このベクターは本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含んでなる。ウイルスベクターは、本明細書で企図されるポリヌクレオチドを対象または対象の細胞へ送達するために使用可能である。発現ベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、自律複製配列および転移エレメントが挙げられる。さらなる例示的なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、トランスポゾン、人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ））、バクテリオファージ（例えば、λファージまたはＭｌ３ファージ）および動物ウイルスが挙げられる。

発現ベクターのさらなる例としては、哺乳動物細胞での発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；レンチウイルス媒介遺伝子導入および哺乳動物細胞での発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５－ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲおよびポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるＣＡＲおよび／またはポリペプチドの発現のためにこのような発現ベクターに連結することができる。

特定の実施形態では、本明細書で提供される発現ベクターは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含んでなるＢＡＣである。特定の実施形態では、ＢＡＣは、産生細胞株またはパッケージング細胞株で発現させた場合にウイルスベクターの産生を可能とするのに必要なタンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドをさらに含んでなる。例として、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／０８９３０７およびＷＯ２０１７／０８９３０８には、レトロウイルスベクター、特に、レンチウイルスベクターを産生するために使用される発現ベクターが記載されている。特定の実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含んでなる、ＷＯ２０１７／０８９３０７およびＷＯ２０１７／０８９３０８に記載の発現ベクターが提供される。

発現ベクターに存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳領域（複製起点、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（ＳｈｉｎｅＤａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）、イントロン、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域）である。このようなエレメントは、それらの強度および特異性が様々であり得る。利用するベクター系および宿主によって、偏在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、いずれかの数の好適な転写および翻訳エレメントを用いてもよい。

送達用ベクター
対象および／または対象の細胞に本明細書に記載のポリヌクレオチドを送達するためのベクターも提供される。このようなベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、自律複製配列、転移エレメント、ファージミド、コスミド、人工染色体（例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰＩ由来人工染色体（ＰＡＣ））、バクテリオファージ（例えば、λファージまたはＭｌ３ファージ）およびウイルスベクターが挙げられる。

ウイルスベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定するものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。これらのベクターは、本明細書では「ウイルスベクター」と呼ばれる。

当業者が認識するように、用語「ウイルスベクター」は、一般に細胞のゲノムへの核酸分子の導入または組込みを促進するウイルス由来核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、導入プラスミド）または核酸導入を媒介するウイルス粒子を指して広く使用される。

レトロウイルスは、遺伝子送達の一般的ツールである(Miller, 2000, Nature. 357: 455-460)。特定の実施形態では、レトロウイルスは、本明細書に記載されるようなＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。本明細書で使用する場合、用語「レトロウイルス」は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーに逆転写した後にそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。ひと度、ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれれば、それは「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型となり、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示する。

特定の実施形態で使用するために好適な例示的レトロウイルスとしては、限定するものではないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）およびレンチウイルスが挙げられる。

本明細書で使用する場合、用語「レンチウイルス」は、複雑なレトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスとしては、限定するものではないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、１型ＨＩＶ、および２型ＨＩＶを含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。１つの実施形態では、ＨＩＶに基づくベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列エレメント）が好ましい。

レトロウイルスベクター、特に、レンチウイルスベクターは、特定の実施形態の実施において使用され得る。よって、用語「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」は、本明細書で使用する場合、それぞれ「レンチウイルス」および「レンチウイルスベクター」を含むことを意味する。

ウイルス粒子は一般に、種々のウイルス成分、および場合によっては宿主の細胞成分核酸および核酸も含む。

用語ウイルスベクターは、核酸を細胞に導入することができるウイルスまたはウイルス粒子、または導入された核酸自体を指し得る。ウイルスベクターおよび導入プラスミドは、主としてウイルスに由来する構造的および／または機能的遺伝子エレメントを含む。用語「レトロウイルスベクター」は、主としてレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子エレメントまたはその一部を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。用語「レンチウイルスベクター」は、主としてレンチウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子エレメントまたはその一部（ＬＴＲを含む）を含有するウイルスベクターまたはプラスミドを指す。用語「ハイブリッドベクター」は、レトロウイルス、例えば、レンチウイルスの配列と非レンチウイルスウイルスの配列の両方を含有するベクター、ＬＴＲまたは他の核酸を指す。１つの実施形態では、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組込みおよび／またはパッケージングのためのレトロウイルス、例えば、レンチウイルス配列を含んでなるベクターまたは導入プラスミドを指す。

特定の実施形態では、用語「レンチウイルスベクター」および「レンチウイルス発現ベクター」は、レンチウイルス導入プラスミドおよび／または感染性レンチウイルス粒子を指して使用し得る。本明細書においてクローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントについて記述する場合、これらのエレメントの配列はレンチウイルス粒子内にはＲＮＡ形態で存在し、ＤＮＡプラスミド内にはＤＮＡ形態で存在すると理解されるべきである。

プロウイルスの各末端には、「長い末端反復配列」または「ＬＴＲ」と呼ばれる構造が存在する。用語「長い末端反復配列（ＬＴＲ）」は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの天然配列関係において、直列反復配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含む。ＬＴＲは一般に、レトロウイルス遺伝子の発現に基本的な機能（例えば、促進、開始および遺伝子転写産物のポリアデニル化）およびウイルス複製に基本的な機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナルならびにウイルスゲノムの複製および組込みに必要な配列を含む多くの調節シグナルを含む。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域の間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（リピート）領域には、Ｕ３領域およびＵ５領域が隣接する。ＬＴＲは、Ｕ３、ＲおよびＵ５領域を含んでなり、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端の両方に見られる。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）およびウイルスＲＮＡの粒子への効率的なパッケージングに必要な配列（Ｐｓｉ部位）が隣接している。

本明細書で使用する場合、用語「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」は、レトロウイルスゲノム内に位置する、ウイルスＲＮＡのウイルスキャプシドまたは粒子への挿入に必要な配列を指す（例えば、Clever et al., J Virol. 1995; 69(4): 2101-9を参照されたい）。いくつかのレトロウイルスベクターでは、ウイルスゲノムのキャプシド封入に必要な最小のパッケージングシグナル（ｐｓｉ［Ｗ］配列とも呼ばれる）が使用されている。よって、本明細書で使用する場合、用語「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「ｐｓｉ」および記号「Ｗ」は、ウイルス粒子の形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド封入に必要な非コード配列を表して使用される。

種々の実施形態では、ベクターは、改変された５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲを含んでなる。ＬＴＲの一方または両方は、限定するものではないが、１以上の欠失、挿入または置換を含む１以上の改変を含んでなり得る。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルス複製を欠損させることによりレンチウイルスまたはレトロウイルス系の安全性を向上させるために行われる。本明細書で使用する場合、用語「複製欠損」は、完全で有効な複製ができず、感染性ビリオンが産生されない（例えば、複製欠損レンチウイルスの後代を産生する）ウイルスを指す。用語「複製可能（replication-competent）」は、複製が可能であり、ウイルスのウイルス複製により感染性ビリオン（例えば、複製可能レンチウイルスの後代）を産生することができる野生型ウイルスまたは変異型ウイルスを指す。

「自己不活型」（ＳＩＮ）のベクターは、複製欠損ベクター、例えば、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域が、初回のウイルス複製以降のウイルス転写を防止するように（例えば、欠失または置換により）改変されているレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、ウイルス複製の際に右（３’）ＬＴＲＵ３領域が左（５’）ＬＴＲＵ３領域の鋳型として用いられ、したがってウイルス転写産物はＵ３エンハンサー－プロモーターなしでは作製できないためである。さらなる実施形態では、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が例えば、理想的なポリ（Ａ）配列で置換されるように改変されている。３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’および５’ＬＴＲの両方の改変などのＬＴＲに対する改変も含まれることに留意されたい。

さらなる安全性の向上は、ウイルス粒子の産生中にウイルスゲノムの転写を駆動するために５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置換することによってもたらされる。使用可能な異種プロモーターの例としては、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター（例えば、初期または後期プロモーター）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えば、前初期プロモーター）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ非依存的に高レベルの転写を駆動することができる。このウイルス生産系には完全なＵ３配列が存在しないため、この置換は複製可能なウイルスを生成する組換えの可能性を減らす。特定の実施形態では、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御にさらなる利点を持つ。例えば、異種プロモーターは、誘導因子が存在する場合にのみウイルスゲノムの全部または一部の転写が起こるように誘導することができる。誘導因子としては、限定するものではないが、１以上の化学物質または生理学的条件（例えば、宿主細胞が培養される温度またはｐＨ）が含まれる。

ある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全部がレンチウイルス、例えばＨＩＶ－Ｉに由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／またはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源が使用または組合せ可能であり、特定のレンチウイルス配列における多くの置換および変更は、導入ベクターが本明細書に記載の機能を実行する能力を損なうことなく達成され得ることが理解されるべきである。さらに、様々なレンチウイルスベクターが当技術分野で公知であり（Naldini et al., (Science. 1996; 272(5259): 263-7; Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93(21): 11382-8; Curr Opin Biotechnol. 1998; 9(5): 457-63); Zufferey al., Nat Biotechnol. 1997; 15(9): 871-5; Dull et al., J Virol. 1998; 72(11): 8463-71；米国特許第６，０１３，５１６号；および同第５，９９４，１３６号参照）、その多くはウイルスベクターまたは導入プラスミドを生産するように適合させることができる。

種々の実施形態では、ベクターは本明細書に記載されるようなＣＡＲまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる。

特定の実施形態では、ベクターは、限定するものではないが、エピソームベクターまたは染色体外で維持されるベクターを含む、非組み込み型のベクターである。本明細書で使用する場合、用語「エピソーム」は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれずに、また、分裂する宿主細胞から徐々に喪失されることなく複製可能なベクターを指し、これはまたベクターが染色体外でまたはエピソームで複製することを意味する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターは、ウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるレトロウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ－Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１７の配列を含んでなる核酸を含んでなる。いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号１７の配列を含んでなる核酸配列を含んでなるウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号１７の配列を含んでなる核酸配列を含んでなるレトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、レトロウイルスベクターは、配列番号１７の配列を含んでなる核酸を含んでなるレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、配列番号１７の配列を含んでなる核酸を含んでなるレトロウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ－Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスベクターである。

制御エレメント
特定の実施形態では、限定するものではないが発現ベクターおよびウイルスベクターを含むベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの外来性、内在性または異種制御配列を含む。「内在性」制御配列は、ゲノム内の所与の遺伝子と天然に連結されているものである。「外来性」制御配列は、遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によってその遺伝子と近位に配置されているものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作される細胞とは異なる種に由来する外来性配列である。

用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態では、哺乳動物細胞で作動するプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域および／または転写開始部から７０～８０塩基上流に見られる別の配列ＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎはいずれのヌクレオチドであってもよい）を含んでなる。

用語「エンハンサー」は、転写の増強をもたらし得、場合によって別の制御配列に対するそれらの配向に依存せずに機能することができる配列を含むＤＮＡセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントとともに協調してまたは相加的に機能し得る。用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能をもたらし得る配列を含むＤＮＡセグメントを指す。

用語「作動可能に連結される」は、記載される成分がそれらの意図される様式でそれらが機能することを可能とする関係にある並置を指す。１つの実施形態では、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に相当する核酸の転写を指示する。

本明細書で使用する場合、用語「構成的発現制御配列」は、作動可能に連結された配列の転写を継続的または持続的に可能とするプロモーター、エンハンサーまたはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、多様な細胞および組織種での発現を可能とする「遍在性」のプロモーター、エンハンサーもしくはプロモーター／エンハンサーまたは限定された種類の細胞および組織種での発現を可能とするそれぞれ「細胞特異的」、「細胞種特異的」、「細胞株特異的」もしくは「組織特異的」なプロモーター、エンハンサーもしくはプロモーター／エンハンサーであり得る。

特定の実施形態での使用に好適な例示的な遍在性発現制御配列としては、限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＮ４ＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５およびＰ１１プロモーター、伸長因子１－α（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期成長応答１（ＥＧＲ１：early growth response 1）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａβメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β－キネシン（βＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007))、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β－アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、ネガティブコントロール領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター(Challita et al., J Virol. 69(2)・748-55 (1995))が挙げられる。

１つの実施形態では、ベクターは、ＰＧＫプロモーターを含んでなる。

特定の実施形態では、Ｔ細胞特異的プロモーターに由来するＣＡＲを含んでなるポリヌクレオチドを発現することが望ましい場合がある。

本明細書で使用する場合、「条件付き発現」は、限定するものではないが、誘導性発現；抑制的発現；特定の生理学的状態、生物学的状態または病態などを有する細胞または組織での発現を含むいずれのタイプの条件付き発現も指し得る。この定義は、細胞種特異的発現または組織特異的発現を除外する意図はない。特定の実施形態は、目的のポリヌクレオチドの条件付き発現を提供し、例えば、細胞、組織、生物などを、ポリヌクレオチドを発現させる処理もしくは条件、または目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現の増強もしくは低下を引き起こす処理もしくは条件に供することによって発現が制御される。

誘導プロモーター／系の具体例としては、限定するものではないが、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーター（対応するホルモンによる処理により誘導）などのステロイド誘導プロモーター、メタロチオネインプロモーター（種々の重金属による処理により誘導）、ＭＸ－Ｉプロモーター（インターフェロンにより誘導）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節系(Sirin et al., 2003, Gene, 323 :67)、ｃｕｍａｔｅ誘導型遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含んでなる細胞は、直接的毒性および／または無制御の増殖のリスクを軽減するために誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態では、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含んでなる宿主に免疫原性がない。使用可能な自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ－９またはカスパーゼ－８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ－９は、特定のタンパク質二量体化誘導化合物（ＣＩＤ）を用いて活性化させることができる。

特定の実施形態では、ベクターは、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞がｉｎｖｉｖｏで負の選択を受けやすくする遺伝子セグメントを含んでなる。「負の選択」とは、注入した細胞が個体のｉｎｖｉｖｏ条件下での変化の結果として排除され得ることを意味する。負の選択が可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入によるものであり得る。

負の選択が可能な遺伝子は当技術分野で公知であり、とりわけ以下のものが挙げられる：ガンシクロビル感受性を付与するＩ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＩＴＫ）遺伝子(Wigler et al., Cell I :223, 1977)；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子；細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子；および細菌シトシンデアミナーゼ(Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992; 89(33))。

いくつかの実施形態では、遺伝的に改変されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでの負の選択が可能な表現型の細胞の選択を可能とする陽性マーカーをさらに含んでなるポリヌクレオチドを含んでなる。陽性選択マーカーは、宿主細胞に導入された際に遺伝子を保有する細胞の正の選択を可能とする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。このタイプの遺伝子は当技術分野で公知であり、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシン－Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が挙げられる。

好ましくは、負の選択が可能なエレメントの喪失が必ず正の選択マーカーの喪失を伴うように、正の選択マーカーと負の選択が可能なエレメントは連結される。より一層好ましくは、正の選択マーカーと負の選択マーカーは、一方の喪失が強制的に他方の喪失をもたらすように融合される。上記の所望の正の選択の特徴と負の選択の特徴の両方を付与するポリペプチドを発現産物として生じる融合されたポリヌクレオチドの例として、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）がある。この遺伝子の発現は、ｉｎｖｉｔｒｏでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性とｉｎｖｉｖｏでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドを生じる。Lupton S. D., et al., Mol. And Cell. Biology, 1991; 11:3374-3378を参照されたい。さらに、好ましい実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、融合遺伝子、特に、ｉｎｖｉｔｒｏでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性とｉｎｖｉｖｏでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与する融合遺伝子を含むレトロウイルスベクター、例えば、上記Lupton, S. D. et al. (1991)に記載のＨｙＴＫレトロウイルスベクター内に存在する。

ベクターの生産
特定の実施形態では、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）に、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターが形質導入される。例えば、免疫エフェクター細胞に、本明細書に記載されるようなＣＡＲをコードするベクターが形質導入される。これらの形質導入細胞は、ＣＡＲ媒介細胞傷害性応答を惹起し得る。

「宿主細胞」としては、ｉｎｖｉｖｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏにおいてベクターまたはポリヌクレオチドによるエレクトロポレーション、トランスフェクション、感染または形質導入を受けた細胞が含まれる。宿主細胞には、パッケージング細胞、産生細胞およびウイルスベクター導入細胞を含み得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターが導入された宿主細胞が、治療を必要とする対象に投与される。特定の実施形態では、用語「標的細胞」は、宿主細胞と互換的に使用され、所望の細胞種のトランスフェクト、感染または形質導入細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。

適切なウイルス力価を達成するためには、多くの場合で大規模なウイルスベクターの生産が必要である。ウイルス粒子は導入ベクターを、ウイルスの構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ＰＯＩ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘもしくはｎｅｆ遺伝子または他のレトロウイルス遺伝子を含んでなるパッケージング細胞株にトランスフェクトすることにより生産することができる。

本明細書で使用する場合、用語「パッケージングベクター」は、パッケージングシグナルを欠き、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれを超えるウイルス構造遺伝子および／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。一般に、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入または感染を介して細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染の方法は当業者に周知である。特定の実施形態では、レトロウイルス／レンチウイルス導入ベクターがトランスフェクション、形質導入または感染を介してパッケージング細胞株に導入されて産生細胞または細胞株が作製される。特定の実施形態では、パッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む標準的な方法によりヒト細胞または細胞株に導入される。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、ＧｌｎシンセターゼまたはＡＤＡなどの優性選択マーカーとともに細胞に導入され、その後、適当な薬剤の存在下での選択とクローンの単離が行われる。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクター、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断ウイルスペプチドによりコードされる遺伝子に物理的に連結することができる。

本明細書で使用する場合、用語「パッケージング細胞株」は、パッケージングシグナルを含まないがウイルス粒子の適正なパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定発現または一過性発現する細胞株を指して使用される。いずれの好適な細胞株もパッケージング細胞の作製のために使用可能である。一般に、これらの細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、パッケージング細胞株を作製するために使用されるこれらの細胞は、ヒト細胞である。使用可能な好適な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＯＣＫ細胞、Ｃ３ＨＩＯＴ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ２細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ１細胞、ＢＳＣ４０細胞、ＢＭＴ１０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞および２１ＩＡ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。別の好ましい実施形態では、細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。

本明細書で使用する場合、用語「産生細胞株」は、パッケージング細胞株と、パッケージングシグナルを含んでなるベクター構築物とを含んでなる、組換えレトロウイルス粒子を産生できる細胞株を指す。感染性ウイルス粒子およびウイルス原液の作製は、従来の技術を用いて行うことができる。産生細胞株としては、例えば、ＷＯ２０１７／０８９３０７およびＷＯ２０１７／０８９３０８に記載のものが挙げられ、これらは宿主細胞ゲノム内の単一の位置にレトロウイルスベクターの生産に必要なエレメントの総てを含んでなる。

ウイルス原液を作製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Y. Soneoka et al., (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633およびN. R. Landau et al., (1992) J. Virol. 66:5110-5113により示されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技術を用いてパッケージング細胞から回収することができる。例えば、感染性粒子は、当技術分野で公知のように、細胞溶解、または細胞培養の上清の回収により回収することができる。場合により、回収されたウイルス粒子は、所望により精製することができる。好適な精製技術は当業者に周知である。

ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）が、それらの細胞株から生成された組換えレトロウイルスにより最終的に感染および形質転換できる宿主細胞の範囲を決める。ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびＥＩＶなどのレンチウイルスの場合、ｅｎｖタンパク質はｇｐ４１およびｇｐ１２０を含む。

用語「偽型」または「偽型化」は、本明細書で使用する場合、ウイルスエンベロープタンパク質を、好ましい特徴を有する他のウイルスのもので置換したウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質で偽型化することができ、これにより、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされる）は、通常、ＣＤ４^＋提示細胞にウイルスを標的化するため、ＨＩＶは、より広範囲の細胞に感染することができる。好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質はＶＳＶ－Ｇで偽型化される。１つの実施形態では、パッケージング細胞は、ＶＳＶ－Ｇエンベロープ糖タンパク質で偽型化された組換えレトロウイルス、例えばレンチウイルスを産生する。

他の実施形態では、ウイルスベクターは、別のレトロウイルスまたは無関連のウイルスに由来するエンベロープタンパク質で偽型化され得る。当業者は、本明細書に記載のウイルスベクターは好適ないずれのエンベロープタンパク質でも偽型化可能であることを認識するであろう。

トランスフェクションではなくウイルス感染によるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いた遺伝子またはその他のポリヌクレオチド配列の送達は、「形質導入」と呼ばれる。１つの実施形態では、レトロウイルスベクターは、感染およびプロウイルスの組込みによって細胞に形質導入される。特定の実施形態では、標的細胞、例えば、Ｔ細胞は、それがウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いた感染により細胞に送達された遺伝子またはその他のポリヌクレオチド配列を含んでなる場合に、「形質導入された」と言われる。特定の実施形態では、形質導入された細胞は、その細胞ゲノム内にレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターにより送達された１以上の遺伝子またはその他のポリヌクレオチド配列を含んでなる。

免疫エフェクター細胞
別の側面において、本明細書に記載されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含んでなる免疫エフェクター細胞が提供される。種々の実施形態において、癌の治療において使用するために本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように遺伝的に改変された細胞が提供される。本明細書で使用する場合、用語「遺伝的に操作された」または「遺伝的に改変された」は、細胞内の全遺伝物質への、ＤＮＡまたはＲＮＡ形態での外来遺伝物質の付加を指す。「遺伝的に改変された細胞」、「改変された細胞」および「リダイレクトされた細胞」という用語は互換的に使用される。本明細書で使用する場合、用語「遺伝子療法」は、遺伝子の発現を回復、修正もしくは改変する、または治療用ポリペプチド、例えばＣＡＲを発現させる目的のための、細胞内の全遺伝物質への、ＤＮＡまたはＲＮＡ形態での外来遺伝物質の導入を指す。

特定の実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲは、細胞間結合内に位置する目的の標的抗原、例えば、細胞結合タンパク質、例えば、クローディンファミリータンパク質のメンバー、特に、クローディン－３に免疫エフェクター細胞の特異性をリダイレクトするために、免疫エフェクター細胞に導入され、発現させる。

「免疫エフェクター細胞」は、１以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性殺細胞活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書で企図される例示的免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）である。１つの実施形態では、免疫エフェクター細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。１つの実施形態では、免疫エフェクター細胞としては、ナチュラルキラーＴ細胞が含まれる。別の実施形態では、免疫エフェクター細胞としては、マクロファージが含まれる。免疫エフェクター細胞は、自家／自生（「自己」）または「非自家」（「自己でない」）、例えば、同種異系、同系または異種）であり得る。

「自家」は、本明細書で使用する場合、同じ対象に由来する細胞を指す。

「同種異系」は、本明細書で使用する場合、比較する細胞と遺伝的に異なる同種の細胞を指す。

「同系」は、本明細書で使用する場合、比較する細胞と遺伝的に同一の異なる対象の細胞を指す。

「異種」は、本明細書で使用する場合、比較する細胞と異なる種の細胞を指す。

好ましい実施形態では、細胞、例えば、免疫エフェクター細胞は同種異系である。

本明細書で企図されるＣＡＲで使用される例示的免疫エフェクター細胞としては、Ｔリンパ球が含まれる。用語「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、技術分野で認識されており、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパーＩ（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４^＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８^＋Ｔ細胞）、ＣＤ４^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４^－ＣＤ８^－Ｔ細胞またはＴ細胞の他の任意のサブセットであり得る。特定の実施形態における使用に好適なＴ細胞のその他の例示的集団としては、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。

いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される。

１つの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８^＋）である。

当業者により理解されているように、他の細胞も本明細書に記載されるようなＣＡＲとともに免疫エフェクター細胞として使用可能である。特に、免疫エフェクター細胞にはまた、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球およびマクロファージも含まれる。免疫エフェクター細胞はまた、エフェクター細胞の前駆体も含まれ、このような前駆細胞は、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏで免疫エフェクター細胞へと分化誘導することができる。よって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞としては、対象に投与した際に成熟免疫エフェクター細胞へと分化する、またはｉｎｖｉｔｒｏで成熟免疫エフェクター細胞へと分化誘導が可能な、臍帯血、骨髄または動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４集団に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆体が含まれる。

本明細書で使用する場合、例えばクローディン－３特異的ＣＡＲを含むように遺伝的に操作された免疫エフェクター細胞は、「抗原特異的リダイレクト免疫エフェクター細胞」または「ＡＧ特異的リダイレクト免疫エフェクター細胞」と呼ばれることがある。

本明細書に記載のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製または生成するための方法が、特定の実施形態で提供される。種々の実施形態では、このような方法は、免疫エフェクター細胞に本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドおよび／またはベクターを導入することを含んでなる。１つの実施形態では、この方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書で企図される１以上のＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞をトランスフェクトまたは形質導入することを含んでなる。特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、個体から単離され、ｉｎｖｉｔｒｏでさらに操作することなく遺伝的に改変される。このような細胞をその後、その個体に直接再投与することができる。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変する前に、まず、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖するように活性化および刺激する。これに関して、免疫エフェクター細胞は、遺伝的に改変する（すなわち、本明細書で企図されるＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトする）前および／または後に培養することができる。よって、特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、細胞をＣＤ３と結合する抗体または抗原結合フラグメントおよび／またはＣＤ２８に結合する抗体または抗原結合フラグメントと接触させ、それにより免疫エフェクター細胞集団を形成することにより、増殖するように刺激および誘導することができる。さらなる実施形態では、本明細書で企図される免疫エフェクター細胞を作製する方法は、細胞をＣＤ３と結合する抗体または抗原結合フラグメントおよびＣＤ２８に結合する抗体または抗原結合フラグメントと接触させ、それにより免疫エフェクター細胞集団を形成することにより、増殖するように免疫エフェクター細胞を刺激することおよび細胞を誘導することを含んでなる。

特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫エフェクター細胞のｉｎｖｉｔｒｏ操作または遺伝的改変前に、免疫エフェクター細胞を対象から取得する。特定の実施形態では、ＣＡＲにより改変された免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含んでなる。

特定の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、本明細書で企図される方法を用いて、ＣＡＲを発現するように直接遺伝的に改変することができる。特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離の後、Ｔリンパ球をさらに単離し、特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝的改変および／または拡大培養の前または後にナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞およびエフェクターＴ細胞の亜集団へと選別することができる。

Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、既知の方法を用いて単離した後に遺伝的に改変することもできるし、または免疫エフェクター細胞は、遺伝的に改変する前にｉｎｖｉｔｒｏで活性化し、拡大培養する（または前駆体の場合には分化させる）こともできる。特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書で企図されるＣＡＲで遺伝的に改変し（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含んでなるウイルスベクターで形質導入し）、次に、ｉｎｖｉｔｒｏで活性化および拡大培養する。種々の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現させるための遺伝的改変の前または後に活性化および拡大培養することができる。

特定の実施形態では、癌の治療のための改変免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に開示されるＣＡＲを含んでなる。例えば、改変免疫エフェクター細胞の集団は、癌と診断された患者から取得した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される（自家ドナー）。ＰＢＭＣは、ＣＤ４^＋、ＣＤ８^＋、またはＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋であり得るヘテロなＴリンパ球集団を形成する。

ＰＢＭＣはまた、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球も含み得る。本明細書に記載のＣＡＲのコード配列を運ぶベクターを、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞の集団に導入することができる。特定の実施形態では、発現ベクターを保有する形質導入に成功したＴ細胞を、フローサイトメトリーを用いて選別してＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、その後、さらに増殖させて、抗ＣＤ３抗体およびまたは抗ＣＤ２８抗体およびＩＬ－２または本明細書の他所に記載されるような当技術分野で公知の他の任意の方法を用いた細胞の活性化に加えて、これらのＣＡＲタンパク質発現Ｔ細胞の数を増やす。

ヒト対象において使用するための貯蔵および／または調製のための、ＣＡＲタンパク質発現Ｔ細胞の凍結保存には、標準的な手順が使用される。

さらなる実施形態では、各ベクターが本明細書で企図されるような異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードするドナー免疫エフェクター細胞の集団の遺伝的改変には、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれを超える異なるベクターの混合物が使用可能である。結果として得られる改変免疫エフェクター細胞は、改変細胞の混合集団を形成し、ある割合の改変細胞が２種類以上の異なるＣＡＲタンパク質を発現する。

Ｔ細胞製造方法
ヒト療法のためのＴ細胞を製造する方法は当技術分野で公知である。好ましい実施形態では、本明細書で企図される方法により製造されたＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物を提供する。いずれの特定の理論にも縛られるものではないが、本明細書で企図される特定の実施形態の方法により製造されるＴ細胞組成物は、生存率の増大、比較的分化のない拡大増殖、ｉｎｖｉｖｏにおける持続性およびより優れた抗疲弊特性を含むより優れた特性を付与されると考えられる。例えば、抗クローディン－３ＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞は、接近可能なクローディン－３に対してより低い結合動態を示し、ｉｎｖｉｖｏにおいて接近可能なクローディン－３標的の存在下で疲弊の可能性がより低い。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊傾向が低いと、それらのエフェクター機能が保持され、抑制性受容体の持続的発現が低くなり、機能的エフェクターまたはメモリーＴ細胞の転写状態が保持される。疲弊は感染および腫瘍の最適な制御を妨げるので、ＣＡＲ－Ｔ療法に望まれる特徴ではない。

１つの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞を本明細書で企図される抗クローディン－３ＣＡＲを含んでなるウイルスベクターで形質導入することにより改変される。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗原の不在下で低レベルのベースのＣＡＲの活性化およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮγ）分泌を示し、これはＣＡＲ－Ｔ療法の望ましい特性である。ＣＡＲの抗原非依存的（ベース）シグナル伝達傾向は、自己凝集を示して抗原非依存性のＣＡＲの活性化をもたらし得、これが次に早期のＣＡＲ疲弊を引き起こして治療効力の低下を招き得る(Ajina and Maher, 2018およびLong et al., 2015a)。ＣＡＲ－Ｔ細胞のベースの活性化は、活性化マーカーＣＤ６９、疲弊マーカーＰＤ１およびＴＩＭ３、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインのリン酸化、および抗原の不在下でのＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ分泌能のレベルによって決定することができる。ヒト化抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、非導入細胞と同等レベルの、そして陽性対照ＣＡＲで形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて低いレベルのＩＦＮγ分泌、活性化および疲弊マーカー発現ならびにｉｎｖｉｔｒｏ持続的ＣＤ３ζシグナル伝達レベルを示した。

１つの実施形態では、Ｔ細胞を、活性化されるのにより高い標的閾値を必要とし、「より安全な」ＣＡＲとする本明細書で企図される抗クローディン－３ＣＡＲを含んでなるウイルスベクターで形質導入することによってＴ細胞を改変する。親和性の高いＣＡＲは健常組織の副次的標的化をもたらし、オン／オフターゲット、腫瘍外毒性を生じることがあることが示されている(Johnson et al., 2015; Park et al., 2017; Watanabe et al., 2018)。

医薬組成物
本明細書に記載の免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載のヒト疾患の治療において使用するための医薬組成物に調合することができる。１つの実施形態では、医薬組成物は、免疫エフェクター細胞を場合により１以上の薬学上許容可能な担体および／または賦形剤と組み合わせて含んでなる。

このような組成物は、知られているような、許容可能な製薬慣行によって要求される薬学上許容可能な担体を含んでなる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^th edition (1980) Mack Publishing Co.参照）。

医薬組成物は、注射または連続的注入（例としては、限定するものではないが、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内、眼内および門脈内が挙げられる）により投与され得る。１つの実施形態では、組成物は静脈内投与に好適である。

遺伝的に改変された治療用細胞の「治療上有効な量」は、病態、個体の年齢、性別および体重、および幹細胞および前駆細胞の個体において所望の応答を惹起する能力などの因子に従って変更することができる。治療上有効な量はまた、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のいずれの毒性作用または有害作用にも治療上有益な効果が上回るものである。用語「治療上有効な量」は、対象（例えば、患者）を治療するために有効な量を含む。治療量が示される場合、投与される組成物の厳密な量は、個体の年齢、体重、腫瘍サイズの違い、患者（対象）の感染または転移および病態の程度を考慮して医師が決定することができる。一般に、本明細書に記載のＴ細胞を含んでなる医薬組成物は、１０^２～１０^１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内の総ての整数値を含む）の用量で投与され得ると言うことができる。細胞数は、組成物が意図される最終的な使用ならびにそこに含まれる細胞のタイプによって異なる。本明細書で提供される使用のためには、細胞は一般に、１リットル以下の体積であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。ゆえに所望の細胞の密度は一般に、１０^６細胞／ｍＬを超え、例えば１０^６、１０^７、１０^８または１０^９細胞／ｍＬを超える。

累積的に１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１または１０^１２細胞に相当するまたはそれを超える臨床上適切な数の免疫細胞を複数回の注入に割り当てることができる。いくつかの実施形態では、特に、注入された細胞は総て特定の標的抗原にリダイレクトされるので、１０^６／キログラム（患者当たり１０^６～１０^１１）の範囲のより少ない数の細胞を投与してもよい。特定の実施形態では、１×１０^７～９×１０^７のＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することができる。ＣＡＲ発現細胞組成物は、これらの範囲内で複数回投与することができる。例えば、ＣＡＲ発現細胞組成物は、７日ごとに投与することができる。あるいは、ＣＡＲ発現細胞組成物は、単回用量として投与することができる。細胞は療法を受ける患者に対して同種異系、同系、異種または自家であり得る。所望により、処置はまた、免疫応答の誘導を高めるために、本明細書に記載されるような分裂促進因子（例えば、ＰＨＡ）、またはリンホカイン、サイトカインおよび／またはケモカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦα、ＩＬ－１８、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与も含み得る。

一般に、本明細書に記載されるように活性化および拡大培養された細胞を含んでなる組成物は、免疫不全者に生じる疾患の治療および予防において使用することができる。特に、本明細書で企図されるＣＡＲにより改変されたＴ細胞を含んでなる組成物は、癌の治療において使用される。特定の実施形態では、ＣＡＲにより改変されたＴ細胞は、単独で、あるいは担体、希釈剤、賦形剤と、および／またはＩＬ－２などの他の成分もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、一定量の遺伝的に改変されたＴ細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含んでなる。

Ｔ細胞などのＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団を含んでなる医薬組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などのバッファー；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの糖類；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでなり得る。特定の実施形態では、組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与向けに処方される。

液体医薬組成物は、溶液であれ懸濁液であれ、または他の同様の形態であれ、以下の１以上を含み得る：無菌希釈剤、例えば、注射水、生理食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、硬化油、例えば、溶媒または懸濁媒として機能し得る合成モノまたはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張力の調節のための薬剤。非経口調製物は、アンプル、ディスポーザブルシリンジまたはガラスもしくはプラスチック製の多回用量バイアルに封入することができる。注射用医薬組成物は好ましくは無菌である。

１つの実施形態では、本明細書で企図されるＴ細胞組成物は、薬学上許容可能な細胞培養培地中に処方される。このような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態では、薬学上許容可能な細胞培養培地は、無血清培地である。

別の好ましい実施形態では、本明細書で企図されるＴ細胞を含んでなる組成物は、凍結保存媒体を含んでなる溶液中に処方される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存媒体は、解凍後に高い細胞性存率の結果を維持するために使用することができる。特定の組成物で使用される凍結保存媒体の具体例としては、限定するものではないが、ＣＲＹＯＳＴＯＲＣＳ１０、ＣＲＹＯＳＴＯＲＣＳ５、およびＣＲＹＯＳＴＯＲＣＳ２が挙げられる。

特定の実施形態では、組成物は、有効量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を単独で、または１以上の治療剤と組み合わせて含んでなる。よって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は単独で、または放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学療法などの他の既知の癌治療と組み合わせて投与することができる。組成物はまた、抗生物質と組み合わせて投与することもできる。このような治療剤は、特定の癌などの本明細書に記載の特定の病態のための標準的治療として当技術分野で認知されているといえる。企図される例示的な治療剤としては、サイトカイン、増殖因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法剤、放射線療法剤、治療抗体、またはその他の活性剤および補助剤が挙げられる。

特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含んでなる組成物は、当技術分野で公知の任意の数の化学療法薬とともに投与することができる。

様々な他の治療剤は、本明細書に記載の組成物とともに使用することができる。１つの実施形態では、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含んでなる組成物は、抗炎症剤とともに投与される。抗炎症剤または薬物は当技術分野で公知である。

特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、サイトカインとともに投与される。「サイトカイン」は、本明細書で使用する場合、ある細胞集団により放出される、別の細胞に細胞間メディエーターとして働くタンパク質をいう一般用語を意味する。このようなサイトカインの例は、当技術分野で公知である。

さらなる実施形態では、本明細書で企図される組成物およびＣＡＲは、他のＣＡＲもしくはＣＡＲ発現細胞および／または組成物とともに投与される。例えば、抗クローディン－３ＣＡＲまたは組成物は、抗細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）ＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞組成物とともに投与され得る。１つの実施形態では、抗ＭＵＣ１ＣＡＲは、癌細胞によって発現されるものなど、異常にグリコシル化されたＭＵＣ１タンパク質（「ＡＧ－ＭＵＣ１」、例えば、ＴｎＭＵＣ１、ＳＴｎＭＵＣ１など）を標的とする。あるいは、本明細書で企図される抗クローディン－３ＣＡＲまたは組成物は、抗ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはＴＣＲ発現細胞組成物とともに投与され得る。

医薬組成物は、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を他の薬剤、場合により、および／または使用説明書とともに含むパーツキットに含まれていてもよい。便宜上、キットは、使用説明書とともに所定量の試薬を含んでなり得る。キットはまた、医薬組成物の投与に使用されるデバイスを含んでもよい。

用語「個体」、「対象」および「患者」は本明細書で互換的に使用され、本明細書の他所で企図されるＣＡＲ、遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法で治療可能な疾患、障害または病態の症状を呈するいずれの動物も指す。好ましい実施形態では、対象には、本明細書の他所で企図されるＣＡＲ、遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬および方法で治療可能な、癌に関連する疾患、障害または病態の症状を呈するいずれの動物も含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギまたはモルモットなど）、農用動物、および家庭内動物またはペット（ネコまたはイヌなど）を含む。非ヒト霊長類、好ましくは、ヒト患者が含まれる。典型的な対象としては、接近可能なクローディン－３タンパク質を発現する癌と診断された、または癌を有するリスクがあるヒト患者が含まれる。よって、１つの実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、マーモセットまたはサルである。別の実施形態では、対象はヒトである。さらなる実施形態では、対象はマウスである。

本明細書で使用する場合、用語「患者」は、本明細書の他所で企図されるＣＡＲ、遺伝子療法ベクター、細胞に基づく治療薬、および方法で治療可能な特定の疾患、障害または病態と診断された対象を指す。

本明細書で使用する場合、「治療」または「治療する」は、疾患または病態の症状または病理に有益なまたは望ましいいずれの効果も含み、治療される疾患または病態の１以上の測定可能なマーカーが最小の低下を示すことも含み得る。治療は場合により、疾患もしく病態の退縮、または疾患もしくは病態の進行の遅延、例えば、腫瘍成長の遅延を含み得る。「治療」は、疾患もしくは病態、またはその関連の症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示すものではない。

本明細書で使用する場合、「予防」および「予防された」、「予防する」などの類似の用語は、疾患または病態の発生または再発の可能性を回避、阻害または低減するためのアプローチを示す。この用語はまた疾患もしくは病態の発生もしくは再発の遅延、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発の遅延も指す。本明細書で使用する場合、「予防」および類似の用語はまた、疾患または病態の発生または再発前の疾患または病態の強度、影響、症状および／または負荷の低減も含む。

癌
本明細書で使用する場合、用語「癌」、「新生物」および「腫瘍」は互換的に使用され、単数形または複数形で、悪性化を受けたまたは異常なもしくは無秩序な成長もしくは過剰増殖をもたらす細胞変化を受けた細胞を指す。このような変化または悪性化は通常、そのような細胞を宿主生物にとって病的なものとし、よって、病的であるもしくは病的となる可能性があり、介入を必要とするまたは介入から利益を受け得る前癌または前癌性細胞も含まれるものとする。原発性癌細胞（すなわち、悪性化部位の近傍から得られる細胞）は、組織学的検査などのよく確立された技術により非癌性細胞から容易に識別することができる。例えば、このような組織学的検査は、密着結合などの細胞間結合の破壊または傷害を特定することにより癌細胞を非癌性細胞から識別することができる。

よって、特定の実施形態では、癌細胞は、細胞間結合の破壊または傷害を含んでなる。さらなる実施形態では、癌細胞は密着結合の破壊または傷害を含んでなる。このような実施形態では、細胞間結合、例えば密着結合内に位置する細胞結合タンパク質は不適切に局在し、本明細書に記載のＣＡＲおよびＣＡＲ発現細胞が結合するために接近可能および／または利用可能となる。他の実施形態では、癌細胞は、例えば細胞間結合に位置する細胞結合タンパク質が不適切に局在したものを表面に含んでなる。よって、いくつかの実施形態では、癌細胞は、不適切に局在した細胞結合タンパク質が表面に露出したものを含んでなる。

癌細胞の定義は、本明細書で使用する場合、原発性癌細胞だけではなく前癌細胞に由来するいずれの細胞も含む。これには転移癌細胞、および癌細胞に由来するｉｎｖｉｔｒｏ培養物および細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として顕在化するタイプの癌という場合には、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、腫瘍塊に基づいて、例えば、ＣＡＴスキャン、ＭＲイメージング、Ｘ線、超音波もしくは触診などの手段により検出可能なもの、および／または患者から取得可能なサンプルでの１以上の癌特異的抗原の発現によって検出可能なものである。言い換えれば、本明細書のこれらの用語は、臨床家が前癌、腫瘍、限局成長、ならびに後期転移成長と呼ぶものを含むいずれの病期の細胞、新生物、癌、および腫瘍も含む。

用語「治療する」、「治療」、およびその派生語は、本明細書で使用する場合、治療的療法を意味する。特定の病態に関して、治療するまたは治療は、（１）病態または病態の生物学的発現の１以上を改善すること、（２）（ａ）病態につながる、もしくは病態の原因となる生物学的カスケードにおける１以上のポイント、または（ｂ）病態の生物学的発現の１以上を阻害すること；（３）病態に関連する症状、影響もしくは副作用の１以上または病態もしくはその治療に関連する症状、影響もしくは副作用の１以上を軽減すること；あるいは（４）病態または病態の生物学的発現の１以上の進行を遅延させることを意味する。

本明細書で使用する場合、「予防」は、病態もしくはその生物学的発現の可能性もしくは重症度を実質的に低減するか、またはそのような病態もしくはその生物学的発現の発症を遅延させるための、薬剤などの薬物の予防的投与を意味する。当業者は、「予防」が絶対的な用語ではないことを認識するであろう。予防的療法は、例えば、対象が癌の強い家族歴を有する場合、または対象が発癌物質に曝露された場合など、対象が癌を発症するリスクが高いと考えられる場合に適切である。

本明細書で使用する場合、用語「悪性」は、腫瘍細胞の一群が制御を欠いた成長（例えば、正常な限界を超えた分裂）、浸潤（例えば、隣接組織の侵入および破壊）、ならびに転移（例えば、リンパまたは血液を介した身体の他の場所への拡散）のうち１以上を示す癌を指す。

「癌細胞」は、癌性成長または組織の個々の細胞を指す。癌細胞は、固形癌と液性癌の両方を含む。「腫瘍」または「腫瘍細胞」は一般に、細胞の異常な成長により形成された、良性、前悪性、または悪性であり得る腫脹または病変を指す。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、液性癌、例えば白血病は必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成する癌の場合、癌（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は互換的に使用される。個体の腫瘍の量は、腫瘍の数、体積または重量として測定可能な「腫瘍量」である。

１つの実施形態では、標的細胞（例えば、癌細胞）は、健常な非癌性細胞上でも、場合によって健常な非癌性細胞と同レベルで発現する抗原またはエピトープを含んでなる細胞結合タンパク質を発現する。さらなる実施形態では、細胞結合タンパク質の抗原またはエピトープは、癌細胞により発現された場合にのみ利用可能および／または接近可能である。よって、特定の実施形態では、細胞結合タンパク質の抗原またはエピトープは、健常な非癌性細胞により発現された場合には利用不能または接近不能である（例えば、隠されている）。

特定の実施形態では、癌は、クローディン－３が本明細書に記載されるようなＣＡＲが結合するために接近可能となるような、密着結合の外側へのクローディン－３の不適切な局在および／または密着結合の破壊を含んでなる、またはそれによって特徴付けられる。

１つの実施形態では、標的細胞は、骨の細胞、骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、グリア細胞、星状細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、結腸細胞、食道細胞、消化管細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、鼻咽頭細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、子宮頸細胞、膣細胞、子宮細胞、膵臓細胞、膵臓実質細胞、膵管細胞、膵島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、性腺細胞、精巣細胞、造血系細胞、リンパ細胞、または骨髄細胞である。

１つの実施形態では、標的細胞は、クローディン－３タンパク質を発現する。１つの実施形態では、標的細胞は、造血系細胞、食道細胞、肺細胞、卵巣細胞、子宮頸細胞、膵臓細胞、胆嚢もしくは胆管細胞、胃細胞、結腸細胞、乳房細胞、杯細胞、腸細胞、幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、またはクローディン－３タンパク質を発現する任意の細胞である。特定の実施形態では、標的細胞は、内皮細胞または上皮細胞である。

特定の実施形態で企図される組成物および方法により標的化され得る細胞の具体例としては、限定するものではないが、以下の固形癌：副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜癌、脳室上衣細胞腫、食道癌、嗅神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、膀胱癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、生殖細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽細胞腫、髄膜腫、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌、口腔癌（mouth cancer）、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、乏突起膠腫、口腔癌（oral cancer）、口腔癌（oral cavity cancer）、口咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌、滑液膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍の細胞が挙げられる。

別の実施形態では、細胞は、接近可能なクローディン－３タンパク質を発現する固形癌細胞である。なおさらなる実施形態では、癌は固形癌である。本明細書に記載のＣＡＲ、ＣＡＲ発現細胞および組成物で予防、治療、または改善され得る、接近可能なクローディン－３タンパク質を発現する固形癌細胞例としては、限定するものではないが、食道癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、胆管癌、胃癌、結腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎臓癌、および乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ））細胞が挙げられる。

特定の実施形態では、癌細胞は、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、または肺癌である。いくつかの実施形態では、乳癌は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。よって、さらなる実施形態では、癌は、大腸癌、膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、卵巣癌および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）から選択される。

他の実施形態では、細胞は上皮細胞である。なおその他の実施形態では、癌は上皮癌である。上皮癌例としては、限定するものではないが、上記のものなどの固形癌が挙げられる。

本明細書で企図されるＣＡＲ、ＣＡＲ発現細胞および組成物で予防、治療、または改善され得る液性癌または血液癌の具体例としては、限定するものではないが、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が挙げられる。本明細書で企図されるＣＡＲおよび組成物により標的化が可能な細胞の具体例としては、限定するものではないが、以下の白血病：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＮＮＬ）および真性赤血球増加症の細胞が挙げられる。

治療法および細胞傷害性増強法
本明細書で企図されるＣＡＲ分子は、本明細書に記載の癌を処置し、それにより前記癌に関連する少なくとも１つの症状を予防、治療、または改善するための組成物、細胞、および方法で使用することが意図される。特定の実施形態では、本発明は、遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞を用い、前記癌でのみＣＡＲの結合のために接近可能および／または利用可能なエピトープを発現する癌の改善された細胞療法に関する。

本明細書で企図される養子細胞療法の改善された組成物および方法は、容易に拡大培養可能で、ｉｎｖｉｖｏで長期持続性を示し、本明細書に記載するエピトープを発現する癌細胞に対して抗原依存性細胞傷害性を示す遺伝的に改変された免疫エフェクターを提供する。

用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書で互換的に使用される。１つの実施形態では、対象は動物である。別の実施形態では、対象は哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、マーモセットまたはサルである。別の実施形態では、対象はヒトである。

よって、他の側面において、本明細書に記載のＣＡＲ、ポリペプチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、および組成物を用いた癌の治療のための方法が提供される。本明細書で企図される遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞は、接近可能なクローディン－３タンパク質を発現する癌の予防、治療および改善において使用するため、または接近可能なクローディン－３タンパク質発現癌に関連する少なくとも１つの症状を予防、治療もしくは改善するための養子免疫療法の改善された方法を提供する。

種々の実施形態において、本明細書で企図される遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞は、癌を有する対象において癌細胞に対する細胞傷害性を増強する、または癌を有する対象において癌細胞の数を減少させる上で使用するための養子免疫療法の改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、癌または癌細胞は、本明細書に記載のＣＡＲおよびＣＡＲ発現細胞が結合するために接近可能および／または利用可能なクローディン－３タンパク質を発現する。

特定の実施形態では、初代免疫エフェクター細胞の特異性は、本明細書で企図されるＣＡＲで初代免疫エフェクター細胞を遺伝的に改変することにより、接近可能なクローディン－３タンパク質を発現する細胞、例えば癌細胞にリダイレクトされる。種々の実施形態において、クローディン－３結合タンパク質、例えば、抗クローディン－３抗体または抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通（ＴＭ）ドメイン；１以上の共刺激ドメイン；および１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなるＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドで免疫エフェクター細胞を遺伝的に改変するためにウイルスベクターが使用される。

１つの実施形態では、Ｔ細胞が本明細書に記載されるようなＣＡＲを発現するように遺伝的に改変されてＣＡＲ－Ｔ細胞を提供し、そのＣＡＲ－Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントまたは対象に注入されるタイプの細胞療法が提供される。注入された細胞は、レシピエントにおいて疾患原因細胞を殺傷することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｖｏで複製して持続的な癌療法をもたらし得る長期持続性を生じ得る。さらに、本明細書で企図されるＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、本明細書に前記したように抗体療法に比べて高い感受性および選択性を示し得る。例えば、本明細書に記載されるような抗原／エピトープ結合ドメインを含んでなる細胞外ドメインを含んでなるＣＡＲは同じ抗原／エピトープ結合ドメインを含んでなる抗体よりも大きな感受性および選択性を示すことができ、したがって、ＣＡＲ発現細胞の活性化は検出されるが（すなわち、抗体または抗原／エピトープ結合ドメインがＣＡＲに含まれ、したがって、非可溶性細胞形式の細胞によって発現される場合）、可溶性抗体の結合は直接的可視化法によっては検出されない。

１つの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、堅牢なｉｎｖｉｖｏＴ細胞拡大培養を受けることができ、長期間持続可能である。別の実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、さらなる腫瘍形成または成長を阻害するために再活性化可能な特異的メモリーＴ細胞に進化する。

いくつかの実施形態では、本明細書で企図されるＣＡＲを含んでなる免疫エフェクター細胞を含んでなる組成物は、接近可能なクローディン－３タンパク質を発現する癌細胞または癌幹細胞に関連する病態の治療において使用される。

本明細書で使用する場合、「少なくとも１つの症状を改善する」という語句は、対象が治療される疾患または病態の１以上の症状を軽減することを指す。特定の実施形態では、治療する疾患または病態は癌であり、改善する１以上の症状としては、限定するものではないが、虚弱、倦怠感、息切れ、易打撲傷性および易出血性、頻回の感染、リンパ節腫大、（腹部臓器の腫大による）腹部の膨張または疼痛、骨または関節痛、骨折、予定外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的な微熱、および（腎機能の低下による）排尿減少が挙げられる。

本明細書で使用される用語「増強」、「促進」、「増大」または「拡大」は、一般に、本明細書で企図される組成物、例えば、遺伝的に改変されたＴ細胞またはＣＡＲをコードするベクターの、対照分子／組成物によりまたは対照病態において引き起こされる応答に比べて大きな生理反応（すなわち、下流効果）を生成する、惹起するまたは引き起こす能力を指す。測定可能な生理反応は、当技術分野での理解および本明細書での記載から明らかな、とりわけ、Ｔ細胞拡大培養の増大、活性化、持続性および／または癌細胞殺傷能の増大を含み得る。「増大した」または「増強された」量は一般に「統計的に有意な」量であり、対照組成物または対照細胞株によって生成された応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、５００倍またはそれを超える倍数を含み得る。例えば、このような増大したまたは増強された量は、接近不能／利用不能のクローディン－３タンパク質を発現し、かつ／またはインタクトのまたは損なわれていない（例えば、破壊されていない）細胞間結合を含んでなる健常な非癌性細胞に見られる応答と比較することができる。よって、いくつかの実施形態では、このような増大したまたは増強された応答は、接近可能なクローディン－３タンパク質を発現し、かつ／または損なわれた／破壊された細胞間結合を含んでなる癌細胞に見られる。

用語「低減」、「低下」、「減弱」、「減少」または「軽減」は、一般に、本明細書で企図される組成物の、対照分子／組成物によりまたは対照病態において引き起こされる応答に比べて低い生理反応（すなわち、下流効果）を生成する、惹起する、または引き起こす能力を指す。「低減された」または「減少した」量は一般に、「統計的に有意な」量であり、対照組成物または特定の細胞株によって生成された応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、５００倍またはそれを超える倍数の低減を含み得る。

１つの側面において、療法における使用のため、例えば、癌の療法および／または治療において使用するための、本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または組成物が提供される。さらなる側面において、抗癌剤などの医薬として使用するための、本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または組成物が提供される。いくつかの実施形態では、療法における使用のための本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または組成物は、癌療法の方法および／または癌を治療する方法などの療法の方法および／または治療方法において使用するためのものである。

１つの側面において、癌の治療における使用のための、本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または組成物が提供され、癌は、細胞間結合の破壊および／または損なわれた細胞間結合を含んでなる。別の側面において、癌に罹患している対象を治療するための方法が提供され、前記方法は、対象に治療上有効な量の本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または医薬組成物を投与することを含んでなり、癌は、細胞間結合の破壊および／または損なわれた細胞間結合を含んでなる。よって、いくつかの実施形態では、必要とする対象において癌を治療するための方法は、有効量、例えば、治療上有効な量の、本明細書で企図される遺伝的に改変された免疫エフェクター細胞を含んでなる組成物を投与することを含んでなる。適当な用量は臨床試験によって決定できるが、投与量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの因子によって決定される。

当業者は、所望の療法に影響を及ぼすためには、本明細書で企図される組成物の複数回の投与が必要とされる場合があることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年、２年、５年、１０年、またはそれを超える期間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０回またはそれを超える回数で投与され得る。あるいは、本明細書で企図される組成物の１回だけの投与が必要とされる。

１つの実施形態では、それを必要とする対象に、対象において癌に対する細胞性免疫応答を増強するために有効量の組成物が投与される。よって、さらなる側面において、癌に罹患している対象などの、それを必要とする対象において破壊された細胞間結合を含んでなる癌細胞に対する細胞傷害性を増強するための方法が提供され、前記方法は、対象にある量の本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または組成物を投与することを含んでなる。

免疫応答は、感染細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、およびヘルパーＴ細胞応答により媒介される細胞性免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化する、したがって抗体産生をもたらすことができるヘルパーＴ細胞により主として媒介される体液性免疫応答もまた誘導され得る。組成物により誘導される免疫応答のタイプを分析するために様々な技術が使用可能であり、これらは例えば、Current Protocols in Immunology, John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober編 (2001) John Wiley & sons, NY, N.Y.などの当技術分野で十分に記載されている。

Ｔ細胞により媒介される殺傷の場合、ＣＡＲ－リガンド結合は、Ｔ細胞へのＣＡＲシグナル伝達を誘導し、その結果、Ｔ細胞に種々の機序により標的細胞のアポトーシスを誘導し得るタンパク質の産生または放出を誘導する様々なＴ細胞シグナル伝達経路の活性化をもたらす。これらのＴ細胞により媒介される機序には、（限定するものではないが）Ｔ細胞から標的細胞への細胞内細胞傷害性顆粒の移行、直接（または他のキラーエフェクター細胞の動員により間接的に）標的細胞の殺傷を誘導し得る炎症誘発性サイトカインのＴ細胞分泌、およびＴ細胞表面での、標的細胞にそれらの同族細胞死受容体（例えば、Ｆａｓ）が結合した後に標的細胞のアポトーシスを誘導する細胞死受容体リガンド（例えば、ＦａｓＬ）の上方制御が挙げられる。よって、１つの側面において、癌に罹患している対象において、破壊された細胞間結合を含んでなる癌細胞の数を低減するための方法が提供され、前記方法は、対象に治療上有効な量の、本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または組成物を投与することを含んでなる。１つの実施形態では、破壊された細胞間結合を含んでなる癌細胞の数の低減は、Ｔ細胞により媒介される殺傷を含んでなる。

１つの実施形態では、治療上有効な量を含み得る「有効量」は、投与前の破壊された細胞間結合および／または損なわれた細胞間結合を含んでなる癌細胞に対する細胞傷害性に比べて、癌細胞、例えば、破壊された細胞間結合および／または損なわれた細胞間結合を含んでなる癌細胞に対する細胞傷害性を増強するのに十分なものである。別の実施形態では、「有効量」は、投与前の、破壊された細胞間結合および／または損なわれた細胞間結合を含んでなる癌細胞数に比べて、癌細胞、例えば、破壊された細胞間結合および／または損なわれた細胞間結合を含んでなる癌細胞の数を低減するのに十分なものである。

特定の実施形態では、本明細書で企図される方法は、アブレーションエレメントの活性化剤または結合剤を投与することをさらに含んでなる。このような活性化剤または結合剤としては、限定するものではないが、抗体（例えば、臨床承認されている抗体）、例えば、ｈｕＥＧＦＲｔまたはＣＤ２０を認識して結合するもの、すなわち、それぞれセツキシマブまたはリツキシマブ、ＣＤ２０の小分子アンタゴニストなどが挙げられる。アブレーションエレメントの活性化剤または結合剤の投与は、対象または癌の完全奏効後など、対象の治療が完了したとみなされた時点で行うことができる。よって、アブレーションエレメントの活性化剤または結合剤の投与は、対象における慢性的なＣＡＲ発現Ｔ細胞活性を妨げることが認識されるであろう。さらなる実施形態では、本明細書で企図される方法は、アブレーションエレメントを利用して、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のためにＣＡＲ発現細胞を標的化することをさらに含んでなる。よって、特定の実施形態では、本明細書で企図される方法は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞などのＣＡＲ発現細胞の排除をさらに含んでなる。他の実施形態では、対象における急性のＣＡＲ発現Ｔ細胞活性を抑制すること、例えばステロイド投与によるなどのサイトカインストームを治療することが望ましい場合がある。

さらなる側面において、抗癌剤としてなどの医薬の製造のための、本明細書で企図されるＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞または組成物の使用が提供される。１つの実施形態では、本明細書で企図される医薬の製造のための使用は、癌の治療のための医薬の製造である。

１つの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ａ）細胞結合タンパク質の少なくとも１つのエピトープと結合する抗原結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン、前記細胞結合タンパク質は細胞間結合内に位置し、前記細胞結合タンパク質の少なくとも１つのエピトープは、癌細胞でのみ前記ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近可能である；ｂ）膜貫通ドメイン；およびｃ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。１つの実施形態では、ＣＡＲは、１以上の共刺激ドメインをさらに含んでなる。１つの実施形態において、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに従うＣＡＲでは、細胞結合タンパク質は密着結合タンパク質であり、かつ／または少なくとも１つのエピトープは、細胞間結合が秩序ある組織内の細胞間に存在する場合；および／もしくは細胞間結合が損なわれていない場合には、ＣＡＲ細胞外ドメインが結合するために接近不能であり；かつ／または少なくとも１つのエピトープは、細胞間結合が癌細胞間、癌細胞と非癌性細胞の間に存在する場合、細胞間結合が損なわれている場合、および／または細胞結合タンパク質が細胞間結合の外側に不適切に局在する場合には、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合するために接近可能である。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、細胞結合タンパク質は、クローディンファミリータンパク質のメンバーであり；かつ／または少なくとも１つのエピトープは、細胞結合タンパク質の１以上の細胞外ループに存在し；かつ／または細胞結合タンパク質はクローディン－３であり；かつ／またはクローディン－３は、破壊されたもしくは無秩序な密着結合を有する固形癌では細胞表面に露出しており；かつ／またはクローディン－３は、正常な細胞もしくは非癌性細胞では、細胞表面に露出しておらず、細胞間結合内に位置する。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、少なくとも１つのエピトープは、クローディン－３内にユニークに存在し；かつ／または少なくとも１つのエピトープは、４アミノ酸長であり；かつ／または少なくとも１つのエピトープは、不連続エピトープである。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、抗原結合タンパク質は、抗体またはその抗原結合フラグメントから選択され；かつ／または抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ＣａｍｅｌＩｇ、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）およびｓｄＡｂからなる群から選択され；かつ／または抗原結合タンパク質はｓｃＦｖである。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、抗原結合タンパク質は、配列番号７中のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３ならびに／もしくは配列番号８中のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３から選択されるＣＤＲのいずれか１つもしくは組合せを含んでなるか；または抗原結合タンパク質は、配列番号７および８に由来する６つのＣＤＲ総てを含んでなるか；または抗原結合タンパク質は、配列番号１のＣＤＲＨ１配列；配列番号２のＣＤＲＨ２配列；配列番号３のＣＤＲＨ３配列；配列番号４のＣＤＲＬ１配列；配列番号５のＣＤＲＬ２配列；および配列番号６のＣＤＲＬ３配列を含んでなる。これらの実施形態と一致して、抗原結合タンパク質は、配列番号７の配列と少なくとも９０％同一の可変重鎖（ＶＨ）配列、および配列番号８の配列と少なくとも９０％同一の可変軽鎖（ＶＬ）配列を含んでなるか；または抗原結合タンパク質は、配列番号７の可変重鎖（ＶＨ）配列、および配列番号８の可変軽鎖（ＶＬ）配列を含んでなるか；または抗原結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号７のＶＨ配列および配列番号８のＶＬ配列を含んでなるか；または抗原結合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、配列番号８のＶＬ配列および配列番号７のＶＨ配列を含んでなる。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来するか；または膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂからなる群から選択される細胞内シグナル伝達分子に由来するか；または１以上の細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζである。１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、ＣＡＲは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する１以上の共刺激ドメインをさらに含んでなるか；または１以上の共刺激ドメインは、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、細胞外ドメインは、配列番号１１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％，９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含んでなるか；またはＣＡＲは、配列番号１１のアミノ配列を含んでなる。１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、細胞外ドメインは、配列番号１８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％，９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸を含んでなるか；またはＣＡＲは、配列番号１８のアミノ配列を含んでなる。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、ＣＡＲは、配列番号１２、２４、２５、２７、２８、２９もしくは３０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％，９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるか；またはＣＡＲは、配列番号１２、２４、２５、２７、２８、２９、もしくは３０のアミノ酸配列を含んでなるか；またはＣＡＲは、配列番号１０のＣＤ８リーダー配列を含まない、配列番号１２、２４、２５、２７、２８、２９もしくは３０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％，９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。当業者は、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲに導入される配列番号１０のＣＤ８リーダー配列は、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて、ＣＡＲの機能に影響を及ぼすことなく修飾するまたは欠失させることができることを認識するであろう。これらの実施形態と一致して、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、ＣＡＲは、配列番号３４、３５、３６、３７、３８または３９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％，９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲにおいて、ＣＡＲは、ａ）配列番号１のＣＤＲＨ１配列；配列番号２のＣＤＲＨ２配列；配列番号３のＣＤＲＨ３配列；配列番号４のＣＤＲＬ１配列；配列番号５のＣＤＲＬ２配列；および配列番号６のＣＤＲＬ３配列を含んでなるクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン；ｂ）ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメイン；ｃ）ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来する共刺激ドメイン；およびｄ）ＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含んでなる。１つの実施形態では、結合をめぐって前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲと競合するＣＡＲが提供される。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが提供される。さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、アブレーションエレメントをさらに含んでなる。これらの実施形態と一致して、アブレーションエレメントは、抗体または抗原結合フラグメントを用いて抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のために標的化される細胞表面タンパク質であり；かつ／またはアブレーションエレメントは、トランケート型ヒトＥＧＦＲポリペプチド（ｈｕＥＧＦＲｔ）およびＣＤ２０からなる群から選択されるポリペプチドに由来するか：またはアブレーションエレメントはＣＤ２０である。１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うポリヌクレオチドを含んでなるベクターが提供される。さらに別の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり；かつ／またはウイルスベクターは、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターであり；かつ／またはレトロウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ－Ｉ）；ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；およびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択される。１つの実施形態では、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに従うポリヌクレオチド配列および／または前記実施形態のうちいずれか１つに従うベクターを含んでなるベクター産生細胞が提供される。

１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含んでなる免疫エフェクター細胞が提供される。これらの実施形態に一致して、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択されるか；または免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８^＋）である。１つの実施形態では、前記実施形態のうちいずれか１つに従う免疫エフェクター細胞および薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物が提供される。また、提供されるものとして、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲを含んでなる免疫エフェクター細胞を生成する方法が含まれ、前記方法は、免疫エフェクター細胞に前記実施形態のうちいずれか１つに従うポリヌクレオチドおよび／またはベクターを導入することを含んでなる。これらの実施形態に一致して、前記方法は、細胞をＣＤ３と結合する抗体またはその抗原結合フラグメントおよびＣＤ２８に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることにより、免疫エフェクター細胞を刺激し、細胞を増殖するように誘導し、それにより、免疫エフェクター細胞集団を生成することをさらに含んでなる。１つの実施形態では、免疫エフェクター細胞の刺激は、細胞に前記実施形態のうちいずれか１つに従うベクターを導入する前に行われ；かつ／または免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含んでなる。

１つの実施形態では、癌の治療における使用のための、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、または医薬組成物が提供される。１つの実施形態では、必要とする対象において癌を治療する方法が提供され、前記方法は、対象に治療上有効な量の前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、または医薬組成を投与することを含んでなる。さらに他の実施形態では、癌を有する対象において癌細胞に対する細胞傷害性を増強する方法が提供され、前記方法は、対象に有効量の前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を投与することを含んでなる。１つの実施形態では、癌を有する対象において癌細胞に対する細胞傷害性を増強する方法が提供され、前記方法は、対象に有効量の前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を投与することを含んでなる。他の実施形態では、癌を有する対象において癌細胞の数を低減する方法が提供され、前記方法は、対象に有効量の前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、または医薬組成物を投与することを含んでなる。これらの実施形態に一致して、癌は、結合のためにクローディン－３が接近可能となるような密着結合の外側におけるクローディン－３の不適切な局在および／もしくは密着結合の破壊を特徴とするか；または癌は、密着結合の破壊のために細胞表面に露出したクローディン－３を特徴とする。１つの実施形態では、癌は固形癌であるか；または固形癌は、大腸癌、膵臓癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ））、卵巣癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、もしくは前立腺癌であるか；または癌は上皮癌である。

１つの実施形態では、癌の治療のための医薬の製造における、前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、または医薬組成物の使用が提供される。さらに他の実施形態では、療法における使用のための、請求項４８に記載の前記実施形態のうちいずれか１つに従うＣＡＲ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、免疫エフェクター細胞、または医薬組成物が提供される。

以上の実施形態は、理解を明瞭にする目的で、例示および実施例によってある程度詳細に説明されているが、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正がなされ得ることは、本明細書で企図される教示に照らして、当業者には容易に明らかであろう。以下の実施例は、例示として提供されるにすぎず、限定するものではない。当業者は、本質的に同様の結果を得るために変更または修正され得る様々な重要でないパラメーターを容易に認識するであろう。

実施例１：ＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
健常ヒト末梢血由来のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離した後、抗クローディン－３ＣＡＲ構築物または対照ＣＡＲ構築物（対照ＣＡＲは抗ＣＤ１９ＣＡＲであった）のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。健常ドナーから単離したＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は総て、抗クローディン－３ＣＡＲまたは対照抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでの形質導入に成功した。ＣＡＲＴ細胞は、複数のドナーから単離した細胞から作製し、拡大培養し、その後のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ機能アッセイのために必要に応じて凍結した。

材料および方法
ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の単離ならびにＴ細胞の活性化
末梢血単球（ＰＢＭＣ）は、末梢全血およびＮＨＳＢｌｏｏｄａｎｄＴｒａｎｓｐｌａｎｔ（ＮＨＳＢＴ）コーンから、以下のように、製造者の説明書に従いＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号１０７７１）を用いて単離した。細胞をＡｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファーに再懸濁させ、１０^７細胞当たりにＦｃＲブロッキング試薬、ＣＤ４マイクロビーズおよびＣＤ８マイクロビーズ（総てＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を加えた。細胞を混合し、４℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、遠心分離し、１０^８細胞当たりに冷ＡｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファーに再懸濁させた。細胞溶液を、Ｐｏｓｓｅｌ＿Ｓ分離プロトコールを用い、ＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ－ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に流した。ＥＤＴＡはＴ細胞の活性化に影響を及ぼし得るので、細胞溶液のＥＤＴＡ量が最大で２００分の１となるのを保証するために、磁気標識されたＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞を含有する陽性画分をＰＢＳで３回洗浄した。最終のＰＢＳ洗浄の後、細胞ペレットを適当な容量のＴＥＸＭＡＣＳ培地（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）に再懸濁させ、ＮＣ－２５０Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）で計数するためにサンプルを取り出した。

細胞をＴＥＸＭＡＣＳ培地に再懸濁させた。ＴｒａｎｓＡｃｔＴ細胞活性化試薬（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）ならびにＩＬ－７およびＩＬ－１５を細胞に加え、各サイトカインについて終濃度を１０ｎｇ／ｍＬとした。細胞溶液を細胞培養プレートに播種し（１×１０^６細胞／ｍＬ）、次に、細胞を５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター内で３７℃にて２４時間インキュベートした。

レンチウイルスベクターによるＴ細胞の形質導入およびＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大培養
細胞に抗クローディン－３ＣＡＲ（９０６＿００９）をリポーター遺伝子（ＬＮＧＦＲ）とともにコードするレンチウイルスベクター（９０６＿００９－ＬＮＧＦＲと呼称）、または抗ＣＤ１９ＣＡＲベクター（対照）で、ＭＯＩ３で形質導入を行った。ＣＡＲ構築物は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の検出および／または濃縮を可能とするためのＬＮＧＦＲマーカーを含んでいた。ＬＮＧＦＲマーカー系は、トランスフェクトされた細胞を検出および／または選択するために、表面マーカーとして一過性発現されるトランケート型ヒト低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）分子を使用する。細胞を加湿インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞は、培養期間中、ＴＥＸＭＡＣ培地、各サイトカイン濃度１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１７およびＩＬ－１５で維持した。一部のバッチでは、細胞をＩＬ－７およびＩＬ－１５の代わりにＩＬ－２で培養した。ＩＬ－２を使用した場合、同じ培養手順に従ったが、１００国際単位（ＩＵ）／ｍＬのＩＬ－２をＩＬ－７およびＩＬ－１５の代わりに加えた。Ｔ細胞を形質導入１２日後に採取し、１×１０^７～１×１０^８細胞／ｍＬの細胞密度で、ＣＳ５凍結媒体（Ｓｉｇｍａ、＃Ｃ２９９９）中で凍結させた。

形質導入効率は、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｓｅｒ１０）を用い、ＰＥコンジュゲート抗ＬＮＧＦＲ抗体（Ａｂ）により、トランケート型ヒト低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ；ＣＤ２７１）の発現を検出することによって決定した。データはＦｌｏｗＪｏｖ１０．１を用いて解析した。

特定のＣＡＲ－Ｔバッチについては、最低の形質導入効率に対して総てのＣＡＲ－Ｔ集団間で均一化する必要があった。ＣＡＲ－Ｔ細胞集団間で正確に均一化するために、ＬＮＧＦＲ^＋細胞の頻度を分析し、細胞を計数した。この後に、ＬＮＧＦＲ^＋細胞頻度を規定のレベルに引き下げるのに必要な非導入Ｔ細胞の体積を計算し、各細胞集団に適宜加えた。

抗クローディン－３ＣＡＲベクター（９０６＿００９－ＬＮＧＦＲ）で形質導入した２つの細胞調製物を作製し、１つは浮遊細胞（「ベクター１」と呼称）、１つは接着細胞（「ベクター３」と呼称）であった。２つの異なる細胞調製物間の形質導入効率の違い（以下の考察参照）以外には、２つの異なる細胞調製法の間に有意な差は見られなかった。

純粋なＣＡＲ－Ｔ細胞集団の作製のためのＴ細胞の濃縮
一部のＣＡＲ－Ｔバッチでは、誘導後１２日目に、純粋なＣＡＲ－Ｔ細胞集団を作製するために、以下に記載されるようにＡｕｔｏＭＡＣｓＰｒｏ－Ｓｅｐａｒａｔｏｒ濃縮またはＥａｓｙＳｅｐ濃縮を用いた正の選択によってＴ細胞を濃縮した。

ＡｕｔｏＭＡＣｓＰｒｏ－Ｓｅｐａｒａｔｏｒ濃縮については、１０^７細胞当たりにＬＮＧＦＲマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を加え、細胞をよく混合した後、１５分間４℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、細胞溶液を、Ｐｏｓｓｅｌ＿Ｓ分離プロトコールを用い、ＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ－ｓｅｐａｒａｔｏｒに流した。ＥＤＴＡはＴ細胞の活性化に影響を及ぼし得るので、細胞溶液のＥＤＴＡ量が最大で２００分の１となるのを保証するために、磁気標識されたＬＮＧＦＲ^＋Ｔ細胞を含有する陽性画分をＰＢＳで３回洗浄した。

ＥａｓｙＳｅｐ濃縮は、アッセイの要求および培養物の総細胞数によって形質導入後９日目または形質導入後１２日目のいずれかに行った。ＬＮＧＦＲタグを有する種々のＣＡＲで形質導入されたＴ細胞に、ＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＣＤ２７１ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＫｉｔＩＩ（ＳＴＥＭＣＥＬＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＵＫＬｔｄ）およびＥＡＳＹＳＥＰｒａｐｉｄｓｈｅｒｅビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて正の選択を行った。濃縮する形質導入Ｔ細胞の数によって、ＥＡＳＹＰＬＡＴＥマグネット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥＡＳＹＥＩＧＨＴマグネット（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかを使用した。新たに解凍したまたは培養した形質導入Ｔ細胞を、ＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＦｃＲＢｌｏｃｋｅｒ（２５μＬ／ｍＬ）およびＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＣＤ２７１ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＣｏｃｋａｉｌ（５０μＬ／ｍＬ）を添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地に１×１０^７～２×１０^７の密度で再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。

より高い細胞密度では、１×１０^８～２×１０^８細胞を、ＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＦｃＲＢｌｏｃｋｅｒおよびＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＣＤ２７１ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＣｏｃｋａｉｌを添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地に示された濃度で再懸濁させた。５０μＬ／ｍＬのＥＡＳＹＳＥＰｒａｐｉｄｓｈｅｒｅビーズを各サンプルに加え、細胞を室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルに洗浄バッファー（２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および２ｍＭＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）を追加し、ＥＡＳＹＰＬＡＴＥまたはＥＡＳＹＥＩＧＨＴＥＡＳＹＳＥＰマグネット上に移し、１０分間インキュベートした。ビーズに付着した、正の選択を受けた細胞を乱さないように上清を注意深く除去した。さらに３回洗浄を行った後、細胞をＴＥＸＭＡＣＳ培地に再懸濁させ、濃縮が成功したことを確認するためのＮＣ－２５０ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒでの計数および濃縮後ＬＮＧＦＲ分析のためにサンプルを取り出した。

形質導入後９日目に濃縮を行った場合には、濃縮されたＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を１０ｎｇ／ｍＬ濃度で含むＴＥＸＭＡＣＳ培地に再播種した。細胞は加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間インキュベートし、形質導入後１２日目に上記のように凍結させた。

形質導入後１２日目に濃縮を行った場合には、濃縮された細胞をすぐに機能アッセイに使用したか、または凍結させた。

結果
Ｔ細胞の拡大培養、形質導入効率ならびにＣＡＲ－Ｔ細胞集団の濃縮および均一化
全Ｔ細胞集団で拡大培養に成功し、拡大倍率は特定のドナーによって１４倍～１７８倍であった。全Ｔ細胞集団の平均拡大倍率は７６であった。

ＭＯＩ３で抗クローディン－３ＣＡＲベクター１により形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率（ＬＮＧＦＲ陽性細胞頻度に基づく）は、複数のドナーおよびベクターバッチで４１～６０％であった。ＭＯＩ３で抗クローディン－３ＣＡＲベクター３により形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞は、使用した３名のドナーで２９～３７％という、より低い形質導入効率であった。全対照ＣＡＲＴ細胞（抗ＣＤ１９ＣＡＲ）は、ＭＯＩ３を用い、複数のドナーおよびベクターバッチで４８～７５％の形質導入効率であった。

１００％のＬＮＧＦＲ^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞集団を生成するためのＬＮＧＦＲ^＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃縮は、生産された総てのＣＡＲ－Ｔ細胞バッチで、ＡｕｔｏＭＡＣＳｐｒｏ－ｓｅｐａｒａｔｏｒ濃縮（データは示されていない）と図２Ａに示されるようにＥａｓｙＳｅｐＬＮＧＦＲ濃縮の両方で成功した。

必要とされるＬＮＧＦＲ発現Ｔ細胞頻度に対するＣＡＲ－Ｔ細胞集団間の均一化は、生産されたＣＡＲ－Ｔバッチに関して図２Ｂに示されるように成功した。

ＡｕｔｏＭＡＣＳＰｒｏ－Ｓｅｐａｒａｔｏｒを用いたＣＤ４およびＣＤ８陽性選択により、０日目に＞９５％のＣＤ３^＋細胞集団を形質導入することができた。これによりベクターを所望の細胞種にのみ効率的に形質導入することができた。ＣＤ４／ＣＤ８陽性選択後の単球混入は最小限であり（＜５％）、残存する単球は培養期間中に死滅し、形質導入後１２日目に純粋なＣＤ３^＋細胞集団が得られた。

健常ドナーから単離されたＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋Ｔ細胞は総て、抗クローディン－３ＣＡＲまたは対照抗ＣＤ１９ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターでの形質導入に成功した。レンチウイルスベクター１と３で形質導入効率に差が見られた。全Ｔ細胞集団で拡大培養に成功し、特定のＣＡＲ構築物では、ドナー内にいくらかの異常な拡大増殖が見られた。

ＡｕｔｏＭＡＣｓｐｒｏ－ｓｅｐａｒａｔｏｒおよびＥａｓｙＳｅｐＬＮＧＦＲマイクロビーズの両方の使用によるＣＡＲ－Ｔ細胞濃縮が成功し、その後の機能アッセイに１００％のＬＮＧＦＲ^＋ＣＡＲ－Ｔ集団の提供が可能であった。これに加え、必要とされるＬＮＧＦＲ^＋細胞頻度に対するＣＡＲ－Ｔ細胞集団間の均一化にも成功した。

生産された全ＣＡＲ－Ｔ細胞が、抗クローディン－３ＣＡＲベクター１を試験するための機能アッセイで使用することができた。浮遊細胞で生産されたＣＡＲ－Ｔ細胞を次の実験に使用した。

実施例２：ＣＡＲ発現の効果およびＴ細胞表現型
本研究の目的は、ｉｎｖｉｔｒｏで抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞のトニックシグナル伝達（tonic signalling）（抗原非依存的シグナル伝達）の効果を評価することであった。トニックシグナル伝達を示すＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏＴ細胞機能の障害および疲弊ならびにｉｎｖｉｖｏ有効性の劣化をもたらす。トニックシグナル伝達は、ＣＡＲ構造、リンカーまたはヒンジ、シグナル伝達ドメイン、表面での発現位置およびレベルの特性の組合せにより影響を受ける。トニックシグナル伝達は、細胞上清に分泌されるサイトカイン（ＩＦＮγ）のベースレベルの測定、活性化マーカー（ＣＤ６９）および疲弊マーカー（ＰＤ－１およびＴＩＭ－３）の測定による持続型のＴ細胞表現型への分化、ならびに抗原非依存的シグナル伝達（ｐＣＤ３ζ）の増強の測定により評価した。応答は、陰性対照の抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）ＣＡＲ（それぞれ低レベルおよび高レベルのトニックシグナル伝達を示す）に対して評価した。

これらの結果は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ陰性対照および抗クローディン－３ＣＡＲは両方とも、陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて低レベルのトニックシグナル伝達を付与したことを示し、クローディン－３ＣＡＲ構築物に関してｉｎｖｉｔｒｏにおける低レベルの抗原非依存的活性化を示す。

材料および方法
陰性対照ＣＡＲおよび陽性対照ＣＡＲの作製
陰性対照抗ＣＤ１９ＣＡＲは、４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ細胞質シグナル伝達ドメインを有するＦＭＣ６２ＳｃＦｖを用いて作製し、低レベルのトニックシグナル伝達応答を評価するための対照として本明細書で使用された。陽性対照ＣＡＲ（ＧＤ２－２８ζ）は、ＣＨ_２－ＣＨ_３ＩｇＧ_１リンカーならびにＣＤ２８－ＣＤ３ζの膜貫通および細胞質にわたるドメイン（CD28-CD3ζ transmembrane and cytosolic spanning domain）を有する１４ｇ２ａｓｃＦｖを用いて作製した。ここで、ＥＦ１ａプロモーターはＣＡＲの形質導入効率を高めるために使用され、トニックシグナル伝達応答を促進する傾向を高めるはずである。ＣＤ２８ζ膜貫通および細胞質ドメインは、使用するレンチベクター形質導入プロモーターに依存しない４－１ＢＢζ細胞質ドメインに比べて、トニックシグナル伝達レベルを上昇させるはずである。さらに、１４ｇ２ａ抗ＧＤ２ｓｃＦｖクローンはオリゴマー化傾向を持ち、この特徴はＧＤ２－２８ζ ＣＡＲ構造を特徴とし、ＣＡＲ依存的シグナル伝達の内在的活性化をもたらす。陽性対照ＣＡＲで使用されるＩｇＧ_１ＣＨ_２－ＣＨ_３細胞外リンカーも、観察されるトニックシグナル伝達レベルに寄与する可能性がある。

ＣＡＲＴ細胞の解凍および培養
ＣＡＲ－Ｔ細胞（低温凍結ストックから解凍した細胞または新鮮細胞）をＴＥＸＭＡＣＳ培地に再懸濁させ、細胞密度を、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７／ＩＬ－１５を含むＴＥＸＭＡＣＳ培地で２×１０^６細胞／ｍＬに調整した。再懸濁細胞を３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターに２４時間置いた後、ＬＮＧＦＲ濃縮を行った。

解凍後のＣＡＲ－Ｔ細胞ＬＮＧＦＲ濃縮
ＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＣＤ２７１ＰｏｓｉｔｉｖｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＫｉｔおよびＥＡＳＹＳＥＰＤｅｘｔｒａｎＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳを用い、ＬＮＧＦＲ発現ＣＡＲ－Ｔ細胞に正の選択を行った。ＣＡＲ－Ｔ細胞を採取し、組織培養処理を施していない９６ウェルプレートにて、ＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＦｃＲＢｌｏｃｋｅｒおよびＥＡＳＹＳＥＰＨｕｍａｎＣＤ２７１ＰｏｓｉｔｉｖｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎＣｏｃｋａｉｌを添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地で１０～２０×１０^６細胞の密度に再懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。細胞懸濁液にＥＡＳＹＳＥＰＤｅｘｔｒａｎＲＡＰＩＤＳＰＨＥＲＥＳを加え、室温で１５分間インキュベートした。その後、ＥＡＳＹＰＬＡＴＥＥＡＳＹＳＥＰマグネットを用いてＬＮＧＦＲ発現細胞を選択し、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ－７／ＩＬ－１５を添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地に再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターに７２時間置いた後、続いてのアッセイまたは凍結保存を行った。凍結保存したＬＮＧＦＲ濃縮細胞を解凍し、１０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加したＴＥＸＭＡＣＳ培地中、２．５×１０^６／ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーターに２４時間置いた。上清および細胞を続いてのアッセイに提供した。

溶解液の作製およびタンパク質の定量
ＣＡＲ－Ｔおよび非形質導入Ｔ細胞を培養物から採取し、２×１０^６細胞を冷ｄＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムを含む）に再懸濁させ、遠心分離し、得られた細胞ペレットを、冷溶解バッファーを繰り返しピペット操作することで溶解させた。この溶解液を遠心分離し、アリコートに分け、急速冷凍し、長期貯蔵のために－８０℃で保存した。溶解液のタンパク質レベルは、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いて定量した。

ＣＡＲ－Ｔ細胞上清中のＩＦＮγサイトカイン分泌の決定
ヒトＩＦＮγメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）プレートに試験サンプルを入れた。次に、これらのプレートを密封し、室温にてプレートシェーカーで９０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、各ウェルに検出抗体を加えた。これらのプレートを密封し、室温にてプレートシェーカーで２時間インキュベートした。この後、プレートを洗浄し、ＭＳＤＳｅｃｔｏｒ６００イメージャーで読み取った。６名のドナーの試験ＣＡＲＴ細胞のＩＦＮγの分泌レベルの平均と平均の標準誤差を算出し、ＧｒａｐｈＰＡＤＰＲＩＳＭ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ一元分散分析）を用いてデータをプロットした。

ＣＡＲ－Ｔ細胞表現型（ＣＤ６９、ＴＩＭ－３、ＰＤ－１）の決定
非形質導入Ｔ細胞およびＣＡＲ－Ｔ細胞を解凍し、計数した。２．５×１０^５細胞／ウェルを９６ウェルプレートに分注した。次に、細胞を洗浄し、適当な抗体混合物（ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＰＤ１に対する抗体を含有する）を各ウェルに加えた。細胞を暗所、室温で１５分間インキュベートした後、ＤＡＰＩｌｉｖｅ／ｄｅａｄ色素を終濃度１μｇ／ｍＬで含む培地に再懸濁させた。サンプルをフローサイトメトリーで分析し、フローサイトメトリーデータは、ＦＬＯＷＪＯＶ１０ソフトウエアを用いて解析した。

活性化／疲弊マーカーＣＤ６９、ＰＤ－１およびＴＩＭ－３の発現および共発現は、単一の生細胞をＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋集団によって分類することにより生成した。ＣＤ４^＋細胞集団またはＣＤ８^＋細胞集団としてゲーティングした後、活性化／疲弊マーカーを単一の陽性判定によってのみ特定した。続いて、３つの活性化／疲弊マーカーの単一、二重および三重陽性／陰性細胞集団を特徴付けるためにブールゲーティングロジックを適用した。

データ解析のために、陰性対照（抗ＣＤ１９ＣＡＲ）、陽性対照（ＧＤ２－２８ζ ＣＡＲ）および抗クローディン－３ＣＡＲに対する、三重陽性（ＰＤ－１、ＴＩＭ－３およびＣＤ６９）、二重陽性（ＣＤ６９およびＴＩＭ－３、またはＣＤ６９およびＰＤ－１、またはＴＩＭ－３およびＰＤ－１）ならびに単一陽性（ＰＤ－１またはＴＩＭ－３またはＣＤ６９）の平均パーセンテージを６名のＰＢＭＣドナーについて算出した。データは、ＧｒａｐｈＰＡＤＰＲＩＳＭ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ一元分散分析）を用いて解析した。

ＣＡＲ特異的ＣＤ３ζのリン酸化を介した下流シグナル伝達の決定
２×１０^６のＣＡＲ－Ｔ細胞から溶解液を得、濃度を３００μｇ／ｍＬに均一化し、加熱した。これらの溶解液に抗ｐＣＤ３ζ、抗ＣＤ３ζ、ＧＡＰＤＨおよび二次抗体を加えた後にロードした。タンパク質レベルは、ＰＥＧＧＹ－ＳＵＥハイスループットキャピラリーウエスタン技術を用いて評価した。最大６名のドナーからの総ＣＤ３ζおよびＧＡＰＤＨローディング対照に基づき、リン酸化ＣＤ３ζ（ｐＣＤ３ζ）の正規化レベルを算出した。

抗原非依存的シグナル伝達データ解析は、ＣｏｍｐａｓｓｆｏｒＳＷソフトウエア（ＰＥＧＧＹ－ＳＵＥ）を用いて行い、主要な指標を作成した。ここで、各染色のピーク下面積（ＡｕＰ）を、ソフトウエアを用いて決定し、応答をＧＡＰＤＨ（総タンパク質のロード量）レベルのＡｕＰに基づいて正規化した。試験ＣＡＲ－Ｔ細胞（陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞）の正規化ｐＣＤ３ζレベルを、陰性対照ＣＡＲ－Ｔ細胞（抗ＣＤ１９ＣＡＲ）で検出されたｐＣＤ３ζレベルの正規化値で割った。６名のドナーの試験ＣＡＲＴ細胞に関するＣＡＲ特異的リン酸化（ｐＣＤ３ζ）レベルの平均と平均の標準誤差を算出した。データは、ＧｒａｐｈＰＡＤＰＲＩＳＭ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ一元分散分析）を用いてプロットした。

結果
ＣＡＲＴ細胞からのベースレベルのＩＦＮγ分泌
Ｔ細胞によるＩＦＮγ分泌はＴ細胞の活性化の重要な指標であり、抗原非依存的シグナル伝達は、部分的には、このサイトカインの分泌により評価することができる。図３Ａに示されるデータは、陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）ＣＡＲ－Ｔ細胞からのＩＦＮγ分泌（２２５５７±１２９０３ｐｇ／ｍＬ）に比べて、抗クローディン－３ＣＡＲＴ細胞からのＩＦＮγ分泌（６１１．８±７５５．１ｐｇ／ｍＬ）が有意に低いことを示す。非形質導入Ｔ細胞（１２３．７±１０３．０ｐｇ／ｍＬ）、陰性対照（抗ＣＤ１９ＣＡＲ；６６６．４±７２５．１ｐｇ／ｍＬ）および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の間に有意差は見られなかった（図３Ａ）。

ベースのＴ細胞の活性化（ＣＤ６９^＋）および疲弊（ＴＩＭ－３^＋およびＰＤ－１^＋）表現型
活性化マーカー（ＣＤ６９^＋）および疲弊マーカー（ＴＩＭ－３^＋およびＰＤ－１^＋）の増加を示すベースＴ細胞の持続型表現型への分化は、トニックシグナル伝達を検出するために使用したアッセイの一部を補完することができる。図３Ｂに示されるデータは、陰性対照（抗ＣＤ１９ＣＡＲ）および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて、陽性対照（ＧＤ２－２８ζ ＣＡＲ）で活性化および疲弊表現型が有意に増加していることを示す。陽性対照（ＧＤ２－２８ζ ＣＡＲ）では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（三重陽性：２．０５±１．５７％、二重陽性：６．８９±３．６１、単一陽性：１４．５９±７．３６％）は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞（三重陽性：０．４２±０．４％、二重陽性：３．９±２．３１％、単一陽性：１４．１８±４．７５％）に比べて、活性化および疲弊表現型のより高い増加を示した。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞では、ＣＤ４^＋Ｔ細胞（三重陽性：０．０６±０．０６％、二重陽性：０．７１±０．４４、単一陽性：２．９９±０．９６％）は、有意に低いＣＤ８^＋Ｔ細胞（三重陽性：０．５４±０．５％、二重陽性：０．６１±０．２５％、単一陽性：３．５１±１．３７％）に比べて、活性化および疲弊表現型のより高い増加を示した（図３Ｂ－Ｇ）。

ＣＡＲ特異的ＣＤ３ζのリン酸化
結果の分析から、抗クローディン－３ＣＡＲのＣＡＲｐＣＤ３ζの正規化レベル（０．６８±０．３９）は、陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）ＣＡＲ（７．３２±３．８４）に比べて有意に低く、陰性対照（抗ＣＤ１９）ＣＡＲｐＣＤ３ζとは有意差が見られなかった（図３Ｈ）。

ＩＦＮγ分泌、活性化（ＣＤ６９^＋）および疲弊（ＴＩＭ－３^＋およびＰＤ－１^＋）表現型ならびにＣＡＲｐＣＤ３ζレベルから得られた結果から、抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび抗クローディン－３ＣＡＲは両方とも、陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて低レベルのトニックシグナル伝達をもたらした。総ＣＤ３ζ染色から評価したＴ細胞のＣＡＲ形質導入レベルは、使用したプロモーターに基づいて差異を示した。ＥＦ１ａプロモーターを用いて形質導入した陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＰＧＫプロモーターを用いて発現させた抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび抗クローディン－３ＣＡＲに比べてより高レベルのＣＡＲ特異的総ＣＤ３ζをもたらした。結果として、抗ＣＤ１９ＣＡＲおよび抗クローディン－３ＣＡＲはまた、より低レベルのリン酸化ＣＤ３ζ、サイトカイン放出ならびに活性化および疲弊表現型への分化も示した。このことにより、ベクターの効率がトニックシグナル伝達を誘導する寄与因子となり得ることが再確認される。

プロモーター以外に、陽性対照（ＧＤ２－２８ζ）ＣＡＲ－Ｔ細胞とは異なり、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞および抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩｇＧ１ＣＨ_２－ＣＨ_３リンカーを含まない４－１ＢＢζの細胞質ドメインでも作製されて、トニックシグナル伝達効果を改善する。このデータにより、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏでＣＡＲ－Ｔ細胞機能に悪影響を及ぼすようなトニックシグナル伝達および抗原非依存的活性化が低レベルであることが再確認される。

実施例３：クローディン発現細胞株に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性
これらの研究の目的は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異性の検証および機能活性の評価のためのクローディン－３発現細胞株を作製することであった。具体的には、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を、ＣＹＴＯＴＯＸレッドアッセイおよび標的細胞の集密度を用いて測定した。さらに、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は、クローディン－３発現細胞と２４時間共培養した後にメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイを用いてＩＦＮγ放出を測定することにより評価した。結果は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は主としてｈＣＬＤＮ３に応答して殺傷し、他のヒトクローディンとの細胞傷害性の交差反応性はほとんど無いか全く無いことを示す。

材料および方法
ＲＫＯ－ＫＯ細胞株、ＲＫＯ－ＫＯヒトＣＬＤＮ３ＧＦＰ細胞株およびＲＫＯ－ＫＯマウスＣＬＤＮ３ＧＦＰ細胞株の作製および特性評価
ＲＫＯ－ＫＯ細胞株は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ編集技術を用いて大腸癌（ＲＫＯ）細胞株のＣＬＤＮ３遺伝子をノックアウトすることにより作製した。

選択されたＲＫＯ－ＫＯクローンを、抗ＣＬＤＮ３抗体を用いたフローサイトメトリーによりさらに試験して、細胞外ＣＬＤＮ３発現の検出の欠如を確認した。ｈＣＬＤＮ３を過剰発現する細胞株、ｍＣＬＤＮ３を過剰発現する細胞株および他のヒトクローディンを過剰発現する細胞株のさらなる作製のための親株として、ＲＫＯ－ＫＯクローン２６．１を一次クローンとして選択した。

ヒトＣＬＤＮ３を過剰発現するＲＫＯ－ＫＯ細胞株およびマウスＣＬＤＮ３を過剰発現するＲＫＯ－ＫＯ細胞株は、ＲＫＯ－ＫＯクローン２６．１細胞株に、ＭＯＩ５の（ｉ）Ｃ末端モノマーＧＦＰタグでタグ付けされたタンパク質として発現させるヒトＣＬＤＮ３遺伝子または（ｉｉ）Ｃ末端モノマーＧＦＰタグでタグ付けされたタンパク質として発現させるマウスＣＬＤＮ３遺伝子のいずれかを含有する市販のレンチウイルスベクター（ＬＶ）と、ピューロマイシン選択マーカーとで形質導入を行うことにより作製した。フローサイトメトリーを使用して形質導入効率（ＧＦＰ発現）を評価した。

モノクローナル細胞株は、ヘテロ集団からの単一細胞選別により、ＧＦＰを高、中および低レベルで発現する細胞を選択することによって樹立した。

ヒトＣＬＤＮファミリーメンバーであるＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ９またはＣＬＤＮ１７を発現するポリクローナルＲＫＯ－ＫＯ細胞株は、上記と同様の方法を用いて、ＲＫＯ－ＫＯクローン２６．１細胞株に、Ｃ末端モノマーＧＦＰでタグ付けされたタンパク質として発現させるＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ５、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ８、ＣＬＤＮ９またはＣＬＤＮ１７遺伝子のいずれかをコードする市販のレンチウイルスで、ピューロマイシン選択マーカーとともに形質導入を行うことにより作製した。

ｑＰＣＲによるＲＫＯ－ＫＯ細胞株およびＲＫＯ－ＫＯ形質導入細胞株の特性評価
ＲＫＯ－ＫＯ非形質導入細胞ならびにＣＬＤＮ３、４、６、９、１７およびｍＣＬＤＮ３をそれぞれ過剰発現するＲＫＯ－ＫＯにおいて、ヒトクローディン３、４、５、６、９および１７ならびにマウスＣＬＤＮ３遺伝子のｍＲＮＡ発現をハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢと比較して評価した。ｍＲＮＡ発現は、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により検出した。ＲＴ－ｑＰＣＲの結果は、形質導入されたＣＬＤＮは各ＲＫＯ－ＫＯ細胞株において過剰発現していることを示した（データは示されていない）。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の解凍および培養
低温凍結ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した場合、細胞を解凍し、ＴＥＸＭＡＣＳに再懸濁させた。いくつかの実験では、本明細書の他所に記載したようにＣＡＲ－Ｔ細胞を濃縮した。

ＩＮＣＵＣＹＴＥ殺傷アッセイのための共培養設定
標的細胞を細胞培養培地に２×１０^５細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた後、アッセイプレートの各ウェルに移し、２×１０^４細胞／ウェルとした。次に、アッセイ培養プレートを３６．５℃／５％ＣＯ_２の加湿ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３に移し、２４時間後にＣＡＲ－Ｔ細胞との共培養を行った。

各アッセイウェルから細胞上清を取り出し、５００ｎＭのＣＹＴＯＴＯＸレッド試薬を含有する新鮮な細胞培養培地に置き換え、次いで、プレートを３６．５℃／５％ＣＯ_２の加湿ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３に移した後、エフェクター細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）を加えた。ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入Ｔ細胞を細胞培養培地に再懸濁させて密度を２×１０^５細胞／ｍＬとし、ウェルに加えた。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ_２の加湿ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３に入れた。画像の取得は、６日間にわたって２時間間隔とした。画像解析を行って、標的細胞の死滅を示す赤色総面積の特異的可視化の増加を確認し、赤色総面積マスクを作成して総面積（μｍ^２／画像）を決定した。正規化は各ドナー内で行った。

ＭＳＤによるサイトカイン濃度の測定
均一化または濃縮したＴ細胞を標的細胞と１：１のＥ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞、ここで、「エフェクター」は形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞である）で混合し、３７℃、５％ＣＯ_２で共培養した。２４時間後、プレートを遠心分離し、適当な検出抗体（スルホタグ抗ｈＩＦＮγ、スルホタグ抗ｈＴＮＦａおよびスルホタグ抗ｈＩＬ２Ａｂ）を用い、実施例２で上記されたものと同様の方法を用いてサイトカイン分泌を定量するために上清を採取した。

結果
クローディンを発現するＲＫＯＫＯに対するＣＡＲＴ細胞の活性化応答
非形質導入細胞、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞（対照）または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を、クローディン３と密接に関連するクローディンタンパク質を発現するＲＫＯＫＯ細胞株と共培養した。次いで、これらの共培養物から上清を採取し、目的のサイトカインを定量した。これらの実験からのデータを図４Ａ～４Ｄおよび表３に示す。

まず、全パネルの細胞株に応答したＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＬ－２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαの分泌を調べた。ｈＣＬＤＮ３に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の劇的な応答以外、図４Ａに示されるデータは、ｈＣＬＤＮ４に応答した３種類のサイトカイン総ての分泌増加は小さいことを示す。

次に、６名のドナーのＩＦＮγ応答を調べた実験において、コアパネルの細胞株（ｈＣＬＤＮ４、ｈＣＬＤＮ６およびｈＣＬＤＮ９）に着目した（図４Ｂおよび４Ｃに示す）。この場合にも、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞はｈＣＬＤＮ４に応答し、この実験では、ｈＣＬＤＮ９に対する応答も見られた。ｈＣＬＤＮ４およびｈＣＬＤＮ９に応答した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞から分泌されたＩＦＮγの抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する倍率変化は、それぞれ２５および１４．３であった。この応答は有意であるが、ｈＣＬＤＮ３共培養における２４９５倍という高い応答と比べると大局的に把握される。

これらの２つの実験からのデータは、７名の追加のドナーからのサイトカイン分泌を示した図４Ｄに示される情報によってさらに裏付けられる。これらのドナーのうち１名だけがｈＣＬＤＮ９に対する応答を示したが、ｈＣＬＤＮ４にはより一貫した応答が見られた（この場合もやはり、これは最小であった）。この図に示されるドナーの一部をまた次に使用した（１２０３１、９２０２４およびＣ１７００６５７）。これらの各場合において、データは従前の結果を裏付けた。

ｈＣＬＤＮ３に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の強い応答以外に、最も一貫した応答はｍＣＬＤＮ３に対する応答であった。これはＩＦＮγだけでなくＩＬ－２およびＴＮＦαの上方制御の形でも見られた（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）。この応答の有意性は図４Ｂおよび４Ｃならびに表３にも示され、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ応答は、抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の応答の４３９倍であった。

ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＲＫＯ細胞の殺傷
ＣＡＲ－Ｔ細胞と培養した際の標的細胞の生存率を具体的に調べるために、いくつかの殺傷アッセイを行って、Ｔ細胞の活性化（サイトカイン応答により測定）がどのように細胞傷害性およびその後の標的細胞のアポトーシスに変換されるかを決定した。

この一連の実験から収集したデータを表４にまとめる（アッセイエンドポイントにおける生細胞率％として報告）。ｈＣＬＤＮ４、ｈＣＬＤＮ６またはｈＣＬＤＮ９の生存率の低下に至った実験はなかったが、ｍＣＬＤＮ３に対する応答が見られる場合があった。これは９６時間で最も顕著であり、ＲＫＯＫＯｍＣＬＤＮ３は７１％および８６％に達するか、または２名のドナーからの抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞とともに培養した場合には最大応答に達した。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＬＤＮ３特異的細胞傷害性応答を確認するために、６名のドナーおよびコアパネルの細胞株で実験を行った。集密度％（図５Ａおよび５Ｂ）およびＣＹＴＯＴＯＸ発色または生細胞率％（図６Ａ－Ｃ）の２つの測定値を使用した。これらのうち第１の集密度％は、特定の共培養に特異的な標的細胞数の変化によって細胞殺傷を示す。第２の測定値は、生存率の低下がＣＹＴＯＴＯＸ色素の流入をもたらす場合に起こる赤い発色を定量する。細胞死が増加すると、ＣＹＴＯＴＯＸレッド応答が高くなり、生細胞率％は低くなった。このデータを収集するために使用した画像の例を図５Ａに示す。

集密度％の変化は、特に、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を、ｈＣＬＤＮ３またはｍＣＬＤＮ３のいずれかを発現するＲＫＯＫＯとともに培養した場合に見られたが、ＩＦＮγ分泌の場合と同様に、ｈＣＬＤＮ３に対する応答の規模がはるかに大きかった。このことは生細胞率％の測定値により確認され、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞をＲＫＯＫＯｍＣＬＤＮ３またはＲＫＯＫＯｈＣＬＤＮ３と共培養した場合に対照に比べて有意な細胞傷害性効果が見られた。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞のｍＣＬＤＮ３発現細胞との交差反応
マウス組織を用いていくつかの関連実験を行うことができるため、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞がどのようにｍＣＬＤＮ３と反応するかの理解のために有用である。本明細書で行った実験は一貫して、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞がｍＣＬＤＮ３発現により活性化されてＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２の分泌をもたらすことを示す。ｈＣＬＤＮ３に対する応答ほど高くはないが、活性化されたＴ細胞は、標的細胞の消失によって示される有意な細胞傷害性応答を示す。

このデータの大部分は異なるレベルのｍＣＬＤＮ３を発現する細胞株で行ったものであるが、応答をさらに理解するために、高レベルまたは低レベルのｍＣＬＤＮ３を発現する少数の細胞株も使用した。これらの条件では、活性化応答は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を、高レベルでｍＣＬＤＮ３を発現するＲＫＯＫＯ細胞とともに培養した場合にのみ見られた。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は他のヒトクローディンタンパク質に応答して殺傷しない
本明細書に示されるいずれの実験でも、ｈＣＬＮＤ６、ｈＣＬＤＮ５、ｈＣＬＤＮ８またはｈＣＬＤＮ１７に応答した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は見られなかった。しかしながら、サイトカインの分泌により示されたｈＣＬＤＮ４およびｈＣＬＤＮ９に対する反応性はいくらかあった。図４Ａで有意な活性化応答が示されているが、それはｈＣＬＤＮ３およびｍＣＬＤＮ３に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の応答には匹敵しない。明らかに、これは殺傷応答に当たらず、これは抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞がｈＣＬＤＮ３以外のヒトクローディンに応答して有意に殺傷しないことを示す。

本明細書に示されるデータは、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞が、少なくとも一部は、ｈＣＬＤＮ４およびｈＣＬＤＮ９により活性化されることを示す。この応答はｈＣＬＤＮ３に対する応答よりも有意に低く、細胞傷害性効果または細胞死に当たらない。しかしながら、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｍＣＬＤＮ３と交差反応し、標的細胞の部分的な殺傷が示されている。このデータは、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞が主としてｈＣＬＤＮ３に応答して殺傷し、他のヒトクローディンとの細胞傷害性の交差反応性はほとんどないか全く無いことを示す。

実施例４：クローディン－３陽性腫瘍細胞株に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性
本研究の目的は、この構築物を発現するＴ細胞の、ヒトクローディン－３（ｈＣＬＤＮ３）発現標的細胞を特異的に殺傷する傾向に基づき、抗クローディン－３ＣＡＲの発現および細胞傷害効力を示すことである。これらのデータは、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞がＩＦＮγを分泌し、大腸癌、乳癌および膵臓癌に由来するｈＣＬＤＮ３発現癌細胞株を殺傷できることを示す。

材料および方法
ＭＡＣＳＱｕａｎｔＴｙｔｏ選別によるＬＮＧＦＲ陽性ＣＡＲ－Ｔ細胞の濃縮
細胞をバッファーで洗浄し、１：５０希釈のＬＮＧＦＲＰＥ抗体で４℃にて３０分間染色した後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔＴｙｔｏ選別を用いて、製造者の説明書に従って細胞を選別した。本明細書に記載の実験に使用したＣＡＲ－Ｔ細胞は総て、少なくとも９０％ＬＮＧＦＲ陽性の純度を有した。

Ｔ細胞表面のＣＡＲ分子の定量
１×１０^５細胞および５０μＬのＢａｎｇｓＬａｂｓＱｕａｎｔｕｍＳｉｍｐｌｙＣｅｌｌｕｌａｒビーズを抗ＬＮＧＦＲＰＥに１：２０希釈で、または抗ｈＣＬＤＮ３ＰＥに１：５０希釈で再懸濁させ、４℃で３０分間インキュベートした。細胞およびビーズを２回洗浄した後、細胞およびビーズのＰＥシグナルをＣｙｔｏＦＬＥＸＳ機で測定した。

細胞殺傷アッセイのための共培養設定
ＩＮＣＵＣＹＴＥ殺傷アッセイのための共培養は、ＩＮＣＵＣＹＴＥＳ３に代えてＩＮＣＵＣＹＴＥＺｏｏｍを使用したこと以外は、実施例３で上記したように設定した。

ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ殺傷アッセイのための共培養は、標的細胞を細胞培養プレートに２５，０００細胞／ウェルの密度で播種することにより設定し、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥリアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）装置の細胞培養インキュベーター内で培養した。播種のおよそ２０時間後に、エフェクター細胞を０．５：１または１：１ＣＡＲ－Ｔ細胞：標的細胞比で加え、細胞培養インキュベーターに戻した。使用した標的細胞は、下表５に示す癌細胞株であった。

ＭＳＤによるサイトカイン濃度の測定
標的細胞株を再懸濁させた後、２×１０^４または２．５×１０^４細胞を９６ウェルプレート播種した。次に、均一化または濃縮したＴ細胞をプレートに１：１のＥ：Ｔ比（エフェクター細胞：標的細胞、ここで、「エフェクター」は形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞である）で加え、３７℃、５％ＣＯ_２で２４～４８時間共培養した。共培養後、プレートを遠心分離し、実施例２で上記したように、適当な検出抗体を用いてサイトカイン分泌を定量するために上清を採取した。

結果
ＣＡＲ発現およびｈＣＬＤＮ３発現の定量
Ｔ細胞表面でのＣＡＲ分子の発現は、ＣＡＲ機能の必要条件である。ＬＮＧＦＲ発現を、ＣＡＲ発現の代わりに測定した。ＬＮＧＦＲおよびＣＡＲ分子は１：１比で変換されるはずであるが、タンパク質の安定性の潜在的な違いのために、ＬＮＧＦＲの定量はＣＡＲ分子数の推定に過ぎない。

非形質導入細胞（ＵＴ）は１０，０００～２０，０００（図７Ａ）というＬＮＧＦＲ発現の極めて低いシグナルを示したに過ぎず、これはバックグラウンドシグナルであると考えられた。

ドナー１２０３１および９２０２４は、表面に平均１９０，０００および１６６，０００のＬＮＧＦＲ分子を有し、ドナーＤ５は、表面に３０１，０００の分子を有した。この違いはおそらくＴ細胞生成の変動によるものであった。

本明細書で従前に記載されたように、ｈＣＬＤＮ３ノックアウトＲＫＯ細胞株（ＲＫＯ－ＫＯ）を作製し、機能アッセイの陰性対照として使用した。種々のレベルでｈＣＬＤＮ３を発現するＲＫＯ－ＫＯ細胞（ポリクローナルＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３細胞株；選別された非単一細胞）または高発現に関して選別されたＲＫＯ－ＫＯ細胞（ＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３Ｈ１２）または低発現に関して選別されたＲＫＯ－ＫＯ細胞（ＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３Ｌ１４）の殺傷は、ＣＡＲ効力の指標である。ｈＣＬＤＮ３発現の差は、発現をＱｕａｎｔｕｍＳｉｍｐｌｙＣｅｌｌｕｌａｒビーズおよび抗ＣＬＤＮ３ＰＥで定量することにより確認した（図７Ｂ）。ＲＫＯ－ＫＯ細胞は、ビーズレベルを下回るシグナルを示したので、それらのｈＣＬＤＮ３レベルは０と見なされた。ＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３Ｌ１４低細胞は、表面に平均数８０，０００のｈＣＬＤＮ３分子を有し、一方、ＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３Ｈ１２高細胞は、表面に平均数８００，０００のｈＣＬＤＮ３分子を有した。よって、これらの２つの細胞株は、ｈＣＬＤＮ３発現に１０倍の差を有した。

ＣＡＲ－Ｔ細胞による細胞傷害性
図８Ａ～８Ｄは、９０時間のインキュベーションでのＩｎｃｕＣｙｔｅ殺傷アッセイ例を示す。ｈＣＬＤＮ３を低レベルで発現するＲＫＯ－ＫＯ細胞またはＲＫＯ－ＫＯ細胞とともにインキュベートしたＬＮＧＦＲ濃縮抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ａ）または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞（図８Ｂ）の画像例を示し、対応する殺傷曲線は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞では細胞傷害性を示すが、対照では示さない（図８Ｃ）。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を標的細胞株とともにインキュベートすると、赤色色素の面積で測定されるシグナル生成が認められた。定量および正規化データは図８Ｃに示され、標的陰性細胞とともにインキュベートした抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は細胞溶解に至らなかったが、ｈＣＬＤＮ３発現ＲＫＯ細胞とともにインキュベートした抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は完全な標的細胞殺傷に至り、一方、抗ＣＤ１９対照は至らなかった。

表６は、標的細胞の５０％が殺傷されたことを示す、最大応答の５０％に達するのに必要とされる時間を示す。これらの値は、ｈＣＬＤＮ３発現の差により説明され得るアッセイ間の差を明らかにしたが、これは実験間で一貫性がなかった。いくつかの実験では、最大応答の５０％は２４～４１時間後に達成されたが、他の実験では、５１時間後、７４時間までに最大応答の５０％を示した。Ｔ細胞および標的細胞が６名のドナーの総てで等しく処理された他のデータ（示されていない）は、６名中４名のドナーで８０～８６時間に、１名のドナーでは６８時間に拡散の低下を示し、１名のドナーは、９６時間の実験内に５０％の細胞傷害性に達しなかった。殺傷速度の差は説明できなかったが、重要なことに、総て実験で完全な標的細胞溶解に至った。

クローディン－３発現細胞株ＨＴ－２９－ＬＵＣに対するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ法でも、同様の細胞傷害性結果が得られた（図８Ｄ）。１００％の細胞傷害性が３名のドナーに１：１比で見られ、１００％の細胞傷害性は８０時間後、３０時間後および５０時間後に達成された。１：２比（エフェクター：標的）での１００％の細胞傷害性は、４０時間後および６０時間後に達成された。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ実験と同様にして行った共培養は、ＭＳＤによりサイトカイン分泌に関して分析した（データは示されていない）。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、凍結および解凍したドナーおよびＴ細胞をＨＴ－２９－ＬＵＣと共培養した際に新鮮状態で使用したドナーに検出されたが、細胞株を伴わずにインキュベートした場合には検出されなかった。

クローディン－３発現細胞に応答した非形質導入細胞または抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌は、クローディン－３を発現しない細胞に応答したものと同レベルであった。これらの結果は、非特異的サイトカイン分泌が見られなかったことを示唆する。クローディン－３を発現しない標的細胞に応答した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞による分泌は、陰性対照と同等のバックグラウンドサイトカイン分泌をもたらしたが、このことは抗クローディン－３ＣＡＲは標的細胞上の他の分子を認識しないことを示す。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞をクローディン－３発現標的細胞と培養すると、実施した８実験の総てでＩＦＮγ分泌をもたらした。実際のサイトカイン測定量は実験間で異なったが、総ての場合で、その標的に応答した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞による特異的サイトカイン分泌は、標的陰性細胞に応答した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の少なくとも１００倍であった。

ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３発現標的細胞の力価測定
最大応答（完全な標的細胞殺傷）は細胞株間で異なるが、部分的な標的細胞殺傷も示し得る。これは不十分な細胞傷害性エフェクター機能によるものである可能性があり、総てではない腫瘍細胞が標的を発現する場合にも起こる。最大応答の違いを決定するためおよびＩｎｃｕＣｙｔｅアッセイで部分的な殺傷が達成可能であることを確認するために、標的細胞の力価測定を行った。ＲＫＯ－ＫＯおよびＲＫＯ－ＫＯｈＣＬＤＮ３ポリクローナル細胞を種々の比率で混合し、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞とともにインキュベートした。ＲＫＯ－ＫＯ細胞の２％だけがｈＣＬＤＮ３を発現した場合にはシグナルは確認されなかったが、シグナルの増大はより高い割合のｈＣＬＤＮ３発現細胞で確認できた（図９）。これらの結果は、同じ標的細胞株を比べた場合に、最大応答の違いで確認可能な部分的な殺傷が達成され得ることを示す。

ｈＣＬＤＮ３発現とＣＡＲ－Ｔの活性化の間の関係
ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的の密度にどのように応答するかを理解することは、別の状況での標的発現の効果を予測する助けとなり得る。Ｔ細胞の活性化と標的発現の間の関係を調べるために実験を行った。

ｈＣＬＤＮ３発現は、ｈＣＬＤＮ３発現の勾配を作り出すために、ｈＣＬＤＮ３ｍＲＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏで線状化プラスミドからｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥＴ７Ｕｌｔｒａキットを用いて生成）によるｈＣＬＤＮ３ノックアウト（ＫＯ）細胞株（ＲＫＯ－ＫＯ）のヌクレオフェクションによって厳格に制御した（図１０Ａ）。これにより、ｈＣＬＤＮ３に対するＴ細胞応答に影響を及ぼす可能性のある変動因子（他のバイオマーカーなど）とは独立した、十分に定義された系で研究を実施することができた。ｈＣＬＤＮ３の発現を確認した後、標的細胞をＣＡＲ－Ｔ細胞とともに培養し、活性化応答をＣＤ６９発現（これまでの実施例に記載されているようにフローサイトメトリーにより測定）またはサイトカイン分泌（ＩＦＮｇ／グランザイムＢ）のいずれかによって評価した。

各実験において、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞およびｈＣＬＤＮ３発現に特異的な活性化を観察した。このｈＣＬＤＮ３依存的活性化は、標的発現とＩＦＮγおよびグランザイムＢの分泌の間の相関を示した（図１０Ｃおよび１０Ｄおよび表７）。統計学的解析は行わなかったが、ｈＣＬＤＮ３陽性集団の大きさとＣＤ６９発現の間にも明確な関係があり、標的発現１００％でプラトーとなった（図１０Ｂ）。全体として、これは標的発現とＣＡＲ－Ｔ活性化との関係を示している。

上記の実験において、ＲＫＯ－ＫＯに、ｈＣＬＤＮ３陽性集団が漸減する標的勾配を作り出す最適化された勾配でヌクレオフェクションを行った。別の実験で、細胞集団全体でｈＣＬＤＮ３の漸減発現の効果を検討した（表８）。この場合、データは、ｈＣＬＤＮ３発現が漸増すると、Ｔ細胞の活性化が漸減する（ＩＦＮγ分泌により示される）ことを示唆した。ＣＤ６９発現は、各発現レベル間で一貫していた。

評価値は、抗クローディン－３と抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞の間のＩＦＮγレベルの倍率変化として報告する。ＣＬ＝信頼区間。

３つの異なる適応症からの癌細胞株のｈＣＬＤＮ３発現およびＴ細胞の活性化に関するスクリーニング
上記の研究では、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の応答は、種々のレベルの外来性ｈＣＬＤＮ３を発現する１つの大腸癌細胞株についてのみ検討した。ここでは、内在性ｈＣＬＤＮ３を発現する３つの主要な適応症（大腸、膵臓および乳癌）からの３１の癌細胞株のパネルに対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の応答を、それぞれ陽性対照および陰性対照としてＨＴ－２９－ＬＵＣ細胞株およびＲＫＯ－ＫＯ細胞株を含めて評価した。まず、大腸癌（図１１Ａ）、膵臓癌（図１１Ｂ）および乳癌（図１１Ｃ）由来の細胞株を、フローサイトメトリーおよびリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）により、ｈＣＬＤＮ３発現に関してスクリーニングした。総ての細胞株で０％～１００％の範囲の種々のレベルのｈＣＬＤＮ３発現が検出された（図１１Ａ～１１Ｃ、左）。興味深いことに、ＳＷ４０３またはＳＷ４８０などの部分的陽性細胞株において、十分に定義された陽性および陰性集団の代わりにｈＣＬＤＮ３抗体とともに細胞をインキュベートした場合に、全集団のシフトが見られた。ｈＣＬＤＮ３遺伝子の発現レベルを同じ細胞株パネルにおいてＲＴ－ｑＰＣＲにより定量したところ（図１１Ａ～１１Ｃ、中央）、ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡの量に同様のパターンが見られた。ＣＲＩＳＰＲの方法論により、陰性細胞株対照（ＲＫＯ－ＫＯ）でも少量のｈＣＬＤＮ３ｍＲＮＡが検出できた。ＲＴ－ｑＰＣＲとフローサイトメトリーのデータを比較すると、両アッセイでＨＴ－２９－ＬＵＣ、Ｔ８４およびＳＷ４０３は最高のクローディン３発現株であり、ＲＫＯ－ＫＯおよびＣＯＬＯ３２０－ＤＭは最低の発現株であったことが認められた。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化はまた、陰性ＣＡＲ対照として抗ＣＤ１９を用いた選択癌細胞株との共培養の後にも検討した（図１１Ａ～１１Ｃ、右）。重要なことに、ｈＣＬＤＮ３を発現する総ての細胞株が、高レベルのＩＦＮγにより示されるように、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し、ＲＫＯ－ＫＯと共培養した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞からの応答は見られなかった。それにもかかわらず、フローにより検出可能なｈＣＬＤＮ３発現を示さなかったいくつかの細胞株、ＣＯＬＯ３２０－ＤＭ（０．０６８％）、ＤＬＤ－１（０．３４７％）、ＨＣ１９５４（０．５５％）およびＢｘＰＣ３（１．９５％）もまた抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化することができた。１つの可能性のある説明は、使用した市販の抗体の検出限界である。

ｈＣＬＤＮ３陽性細胞株は総て抗クローディン－３を活性化することができたが、抗ＣＤ１９対照ＣＡＲ－Ｔ細胞はできなかった。しかしながら、フローサイトメトリーまたはＲＴ－ｑＰＣＲによって、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔの活性化とｈＣＬＤＮ３発現レベルの間に明らかな相関は見られなかった。

３つの適応症からの癌細胞株の殺傷
広範な腫瘍に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性を調べるために、ｈＣＬＤＮ３発現レベルが異なる数種の癌細胞株を選択して殺傷アッセイを行った。表９は、各３名のドナーで行った３回のＩｎｃｕＣｙｔｅ試験の概要を示す。結果はドナー間でかなり一致していたので、表９は各実験で３名のドナーをまとめたものである。３つの適応症からの細胞株が抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞により殺傷されたが、このことは、このＣＡＲが数種の適応症に使用できる可能性があることを示している。ＨＴ－２９－ＬＵＣの完全な殺傷も確認された（データは示されていない）。１つの大腸癌株ＣＯＬＯ－３２０ＤＭだけが抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞によって殺傷されなかった。３つの細胞株ＨＣＣ１９５４、ＢｘＰＣ３およびＨＰＡＣは、部分的に殺傷された。部分的な殺傷は、顕微鏡画像でアポトーシス細胞または細胞層の穴として確認されたが、生データで確認されるように、得られたシグナルは極めて低いか、または存在しなかった（図１２）。

ＬＮＧＦＲ分子の定量は堅牢なＣＡＲ発現を示す
１６６，０００～３０１，０００のＬＮＧＦＲ数が検出された。ＣＡＲ発現とＬＮＧＦＲ発現は同等であると仮定し、通常のＣＤ８^＋Ｔ細胞が表面に５０，０００のＴ細胞受容体を有すると考えると、Ｔ細胞表面のｈＣＬＤＮ３ＣＡＲの存在量は、Ｔ細胞の活性化に十分であると評価される。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞殺傷速度論は実験間で異なる
ＣＡＲ－Ｔ細胞の効力を決定するための１つの側面は、どれだけ速く細胞傷害性が誘導されるかである。これは、どれだけの時間の後に最大応答の５０％が達成されるかを決定することにより分析された。これらの結果は実験間で異なり、結果を導くのが困難となる。しかしながら、総ての場合で、完全な標的細胞殺傷が達成されたことはＣＡＲ効力を決定するために重要な側面であると言える。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞はＣＬＤＮ３発現細胞を特異的に殺傷する
抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈＣＬＤＮ３を発現する標的細胞に特異的である。この証拠は、内在性のｈＣＬＤＮ３がノックアウトされたＲＫＯ細胞（ＲＫＯ－ＫＯ）が抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞により殺傷されなかった実験から得られる。対照的に、ｈＣＬＤＮ３発現を示した細胞株は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞により殺傷された。さらに、ＲＫＯ－ＫＯ細胞および外来性のｈＣＬＤＮ３過剰発現するＲＫＯ－ＫＯ細胞を混合した場合には、部分的な細胞傷害性が検出されるに過ぎず、このことは、一様にＴ細胞がｈＣＬＤＮ３を発現する標的細胞によってのみ特異的に活性化されることを示す。これらの結果は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞活性がｈＣＬＤＮ３に特異的であったことを示唆する。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞活性化の増強はクローディン３発現の増強と相関する
どの患者集団が抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞処置に応答し得るかを検討するためには、ＣＡＲの活性化閾値を理解することが有用である。上記のように、標的発現とＴ細胞の活性化の間の関係を具体的に検討するために、制御モデルを使用した。この目的は、フローサイトメトリーによってもはや検出できないところまで標的の発現を低下させることにより、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化させるために必要な標的発現レベルを定義することであった。

ＩＦＮγ分泌はＴ細胞の活性化応答の重要な測定値であり、ＣＤ６９は慣用される活性化マーカーである。標的細胞アポトーシスの不可欠な誘導因子であるグランザイムＢの定量も、標的発現とＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性の間の関係の明らかな証拠を得るために使用した。ＲＫＯ－ＫＯに１ｎｇのクローディン３ｍＲＮＡでヌクレオフェクションを行った場合（５％の陽性集団をもたらす）のこれらの指標の上方制御は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の感受性を明らかに示す。抗原の利用率が低い場合であっても、ＣＡＲ－Ｔ細胞の応答は効率的である。培養培地中のグランザイムＢの存在は、標的細胞アポトーシスが起こったことを示唆するが、標的細胞自体を検討しなければ、このことは明確に言えない。

抗体の検出限界のために、観察された発現が小集団のクローディン３発現細胞であるか発現の低い１００％標的陽性集団であるかを述べるのは難しい。観察された標的細胞アポトーシスは、クローディン陽性集団の正確な定量と相関させることはできなかった。

抗原発現と抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化の間に明らかな関係が見られたにもかかわらず、活性化の閾値は、主として抗原検出の限界のために確立することはできなかった。しかしながら、重要なことに、この人工システムでは、クローディン３の発現に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の用量応答が存在した。

種々の適応症からの細胞株のパネルと共培養した際に抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化が見られた
標的細胞のより広範なパネルを用いて抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を検討するために、大腸癌、膵臓癌および乳癌を含む３１の癌細胞株を、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でクローディン３発現に関してスクリーニングした。特に、ｈＣＬＤＮ３を発現する総ての細胞株が抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化することができ、これはこのＣＡＲの有効性を癌適応症のより広範なパネルに拡大する。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は種々の適応症に由来する腫瘍細胞を殺傷する可能性を有する
抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化が標的細胞の殺傷をもたらさない可能性があるため、３つの腫瘍適応症で細胞傷害性を試験した。ほとんどの供試標的細胞株で完全なまたは部分的な殺傷が確認され、これはＣＡＲ－Ｔ細胞のＩＦＮγ放出と一致した（図１１Ａ～１１Ｃ）。大腸癌株ＣＯＬＯ－３２０ＤＭだけが抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞により殺傷されず、これは部分的にＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化できたとしてもｈＣＬＤＮ３発現を示さなかったためである可能性が高い。

抗クローディン－３ＣＡＲはＴ細胞上に、それがＴ細胞活性をｈＣＬＤＮ３発現腫瘍細胞にリダイレクトできることを示唆するレベルで発現される。それは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術によって抗原が除去された細胞を温存しつつ、ｈＣＬＤＮ３を外来的に発現する標的細胞を特異的に殺傷する。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＩＦＮγを分泌し、大腸癌、乳癌および膵臓癌に由来するｈＣＬＤＮ３発現癌細胞株を殺傷することができるが、活性化閾値は検出試薬の限界のために定義することができなった。これは、ＣＡＲがＴ細胞を数種の癌にリダイレクトし得ることを示唆する。最後に、これらの細胞株のｈＣＬＤＮ３発現とＩＦＮγ放出レベルの間には、おそらくはこれらの細胞株の生物学的特徴の違いのために、明らかな相関は見られなかった。

実施例５：ｉｎｖｉｔｒｏにおける抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の長期抗腫瘍活性を評価するための反復抗原依存性刺激
本研究の目的は、同じｓｃＦｖバリアントに基づく６つの抗クローディン－３ＣＡＲ構築物の発現、サイトカイン分泌および細胞傷害性効力を分析することであった。さらに、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の長期機能性を反復抗原刺激により評価した。

材料および方法
ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＣＡＲスペーサーライブラリーの３つの骨格（Ｌ、Ｓ、ＸＳ）へのクローディン－３に対するｓｃＦｖのクローニング
ｓｃＦｖバリアントをコードするプラスミドを２つの異なる配向で作製した：重鎖－軽鎖（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）および軽鎖－重鎖（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ）。ｓｃＦｖを、長鎖スペーサー（Ｌ、ｈＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３）、短鎖スペーサー（Ｓ、ｈＣＤ８）および超短鎖スペーサー（ＸＳ、ｈＩｇＧ４ヒンジ）の、スペーサー長の異なるＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃＣＡＲスペーサーライブラリーの３つの骨格にクローニングして、６つの異なる構築物を作製した。

ＰＢＭＣの調製およびＰａｎＴ細胞の単離
ＰＢＭＣは、２名の健常ドナーから得たバフィーコートから単離した。Ｔ細胞は、ＰａｎＴ細胞ヒト単離キットを用いてそのまま単離した。ＰａｎＴ細胞の単離は、２×１０^８の白血球を用い、製造者のプロトコールに従って行った。Ｔ細胞を、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＴ細胞ＴＲＡＮＳＡＣＴヒト（１：１００）を含有するＴＥＸＭＡＣＳ培地に再懸濁させ、１×１０^６細胞／ｍＬの濃度に調整した。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成および拡大培養
ＰａｎＴ細胞を１×１０^６細胞／ｍＬおよび２ｍＬ／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに播種した（上記参照）。Ｔ細胞をＴＲＡＮＳＡＣＴで活性化した１日後に、形質導入を行った。レンチウイルスベクターを多重感染度（ＭＯＩ）５でＴ細胞に加えた。形質導入２４～４８時間後に、各ウェルの上清を除去し、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含有する新鮮なＴＥＸＭＡＣＳを加えた。Ｔ細胞密度によって、Ｔ細胞培養を２～３日ごとに１：２または１：３分割して、細胞を０．５×１０^６～２×１０^６細胞／ｍＬの濃度に維持した。

形質導入効率の決定（ＬＮＧＦＲによる）およびＣＡＲの発現
生成されたＣＡＲ構築物はマーカー遺伝子としてＬＮＧＦＲを含むので、形質導入効率は、従前に記載したように、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｚｅｒ１０）により、抗ＬＮＧＦＲ－ＰＥを用いた抗ＬＮＧＦＲ染色を介して分析した。

ＣＡＲの発現を分析するために、プロテインＬを用いて可変軽鎖（κ鎖）を介してＣＡＲを染色した。細胞をプロテインＬ－ビオチン（５μｇ／１０００μＬ）を含有するバッファーに再懸濁させ、４℃で４５分のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、抗ビオチン－ＰＥを含有するバッファーに再懸濁させた。次に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｚｅｒ１０）により分析した。

長期共培養：ＩＮＣＵＣＹＴＥ
標的細胞ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１（レンチウイルス形質導入によるヒトクローディン－３ノックアウト＋ヒトクローディン－３およびＧＦＰマーカーの導入）をこのアッセイに使用した。Ｔ細胞はアッセイを設定する７２時間前に解凍し（上記参照）、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＴＥＸＭＡＣＳ中に回収した。アッセイ当日、Ｔ細胞を十分に再懸濁させ、同じ条件（同じドナーおよび同じＣＡＲ構築物を発現）をプールし、細胞濃度およびＬＮＧＦＲ陽性Ｔ細胞の頻度を考慮して、Ｔ細胞をそれらの形質導入効率に対して調整し、４×１０^４および３×１０^４の標的細胞に対してエフェクター：標的２．５：１で共培養を設定した。Ｔ細胞懸濁液を加え、共培養物をＩＮＣＵＣＹＴＥ中でインキュベートして、緑色の集密度を介して標的細胞の増殖をモニタリングした。３日目に、新鮮な標的細胞培地を加えた。４日目に、新鮮な標的細胞を１回目と同じ濃度で新たな細胞培養プレートに播種した後、およそ４～５時間後にＴ細胞を加えた。同じ条件のＴ細胞をプールし、調整したＴ細胞を新たに播種した標的細胞に２．５：１のＥ：Ｔ比で加えた。細胞培養プレートをＩＮＣＵＣＹＴＥでインキュベートし、緑色の集密度により標的細胞増殖をモニタリングした。７日目に、新鮮な標的細胞を新たな細胞培養プレートに３×１０^４標的細胞の濃度で播種し、およそ４～５時間後にＴ細胞を加えた。同じ条件の総てのＴ細胞をプールした。

反復抗原刺激：抗原のスパイクイン
標的細胞ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１（ヒトクローディン－３ノックアウト＋ヒトクローディン－３およびマーカーＧＦＰ）をＴ細胞と共培養した。ドナーＨ５およびＰからのＴ細胞を解凍した９６時間後に共培養を設定し、ＩＬ－７およびＩＬ－１５を含むＴＥＸＭＡＣＳ中で回復させた。

疲弊マーカー、形質導入効率、ＣＤ４およびＣＤ８に関して染色するために、以下のコンジュゲートを使用した：ＬＡＧ３（ＣＤ２２３）－ＶｉｏＢｌｕｅ、ＰＤ－１（ＣＤ２７９）－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０、ＴＩＭ３（ＣＤ３６６）－ＡＰＣ、ＣＤ８－ＡＰＣ－Ｖｉｏ７７０、ＣＤ４－ＶｉｏＧｒｅｅｎ、ＬＮＧＦＲ－ＰＥおよび７－ＡＡＤ。これらのコンジュゲートのマスターミックスを調製した。細胞をマスターミックスに再懸濁させた後、４℃で１０分間インキュベートした（暗所）。細胞をＰＥＢ（０．５％ＢＳＡを含むＣｌｉｎｉＭＡＣＳ）に再懸濁させ、サンプルをＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｚｅｒ１０で測定した。形質導入Ｔ細胞に基づきＥ：Ｔが２：１に到達するのに必要とされるＴ細胞懸濁液の容量を適当な容量の標的細胞培地に再懸濁させ、Ｔ細胞懸濁液を標的細胞に加え、共培養物を加湿インキュベーター（３７℃および５％ＣＯ_２）でインキュベートした。２４時間ごとに、Ｔ細胞を疲弊マーカーに関して染色し、この共培養物に新鮮な標的細胞を加えた。新鮮な標的細胞の最後の添加は３日目であった。

結果
形質導入効率（ＬＮＧＦＲによる）およびＣＡＲ発現を分析するためのＴ細胞の染色
ドナーＤ５（上記参照）から生成されたＣＡＲＴ細胞の形質導入効率を分析するために、ＬＮＧＦＲマーカー遺伝子発現をフローサイトメトリーにより、７日目に測定した。染色から得られたデータは、形質導入に成功し、３９％～５０％ＬＮＧＦＲ陽性Ｔ細胞の頻度が達成されたことを示した（図１３参照）。さらに、機能性試験のためにそれらの形質導入効率に対してＴ細胞を調整するため、１５日目にＬＮＧＦＲ発現を再び分析した（図１３参照）。Ｔ細胞表面でのＣＡＲ分子の発現は、ＣＡＲ機能の必要条件である。したがって、ＣＡＲ発現はプロテイン質Ｌ染色により決定した（上記参照）。得られたデータは、生じたＣＡＲバリアントは総て発現され、３５％～４３％の範囲のＣＡＲ陽性Ｔ細胞集団頻度が達成されたことを示した（図１３参照）。さらに、クローディン－３に対する種々のｓｃＦｖを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を陽性対照として含めた。

ルシフェラーゼ殺傷アッセイ
抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を評価するために、ルシフェラーゼに基づく殺傷アッセイを行った。共培養には、乳癌細胞株Ｔ－４７Ｄを使用した。この標的細胞株を、ルシフェラーゼおよびｅＧＦＰの両方をコードするレンチウイルスベクターを形質導入することで、これら２つのマーカーを発現するようにこの標的細胞株を操作した。種々の抗クローディン－３ＣＡＲを発現するＴ細胞または非形質導入Ｔ細胞を作製し、拡大培養し、サイトカイン無しで４８時間培養した後に共培養した。次に、これらのＴ細胞を標的細胞株に、最低の形質導入効率（ＬＮＧＦＲ陽性細胞頻度）に従い調整された３つの異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、すなわち５：１、１：１および０．２：１で加え、共培養物をインキュベートした（加湿、３７℃、５％ＣＯ_２）。共培養の設定から２０時間後に上清を除去し、ＭＡＣＳＰｌｅｘアッセイでサイトカインを測定するまで保存した。Ｄ－ルシフェリン溶液を細胞に加え、インキュベーション５分後に、照度計（ＶＩＣＴＯＲ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で発光を読み取った。

クローディン－３に対する種々のｓｃＦｖを発現するＣＡＲＴ細胞を陽性対照として使用した。グラフ（図１４）は、共培養２０時間後の殺傷標的細胞の頻度を示す。非形質導入Ｔ細胞と共培養した際には殺傷標的細胞の頻度に増加は見られなかった。ヒトクローディン－３を発現していたＴ－４７Ｄと共培養した、種々の抗クローディン－３ＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞は、Ｅ：Ｔ比に応じて殺傷標的細胞の頻度および細胞傷害性の増加を示した。Ｅ：Ｔが５：１で、殺傷標的細胞の頻度は９６％～９９．７％であり、殺傷標的細胞の頻度はＥ：Ｔ比が低いほど低下することが判明した。さらに、殺傷標的細胞の頻度は、７つの供試ＣＡＲ構築物間で類似していた。

ＭＡＣＳＰｌｅｘアッセイによる上清中のサイトカイン分泌の決定
共培養上清（上記参照）を、ＭＡＣＳＰｌｅｘアッセイを用いてサイトカインＩＬ－２、ＩＦＮγおよびＴＮＦ－αの濃度に関して分析した。Ｅ：Ｔ比１：１の共培養からのサンプルのみを分析した。サンプルおよびＭＡＣＳＰｌｅｘアッセイは、ＭＡＣＳＰｌｅｘサイトカイン１２キット（ヒト）の製造者のプロトコールに従って調製し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｚｅｒ１０で分析した。得られた濃度をｐｇ／ｍＬで表す（図１５Ａ～１５Ｃ）。分析に使用した上清は無希釈であった。非形質導入Ｔ細胞を癌細胞株Ｔ－４７Ｄと共培養した条件からの上清では、ＩＬ－２、ＩＦＮγおよびＴＮＦ－αレベルの上昇は検出されなかった。また、「標的細胞単独」条件からのサンプルでは、サイトカインは検出できなかった。９０６バリアントに基づく種々の抗クローディン－３ＣＡＲを発現するＣＡＲＴ細胞をＴ－４７Ｄ細胞と共培養した総ての条件で、モックＴ細胞に比べてＩＬ－２およびＩＦＮγのレベルの上昇を示した。Ｔ－４７Ｄの存在下で９０６＿００４、９０６＿００９および陽性対照クローディン－３ＣＡＲにより最高量のＩＬ－２が分泌された。９０６＿００５を含むこれらの構築物はまた最高のＩＦＮγ分泌も示した。ＴＮＦ－αは低レベルしか検出されず、そのうち最高濃度はサンプル９０６＿００９および陽性対照クローディン－３ＣＡＲで検出された。

反復抗原刺激を有するＴ細胞の長期共培養
９０６＿００２（長鎖スペーサー）、９０６＿００４（短鎖スペーサー）または９０６＿００５（超短鎖スペーサー）ＣＡＲバリアントを発現するＴ細胞との共培養での標的細胞の増殖を、ＩＮＣＵＣＹＴＥによりモニタリングした。結果は、両ドナー（Ｇ５およびＨ５）に関して、１回目の標的細胞曝露で、標的細胞は３つのＣＡＲ構築物の総てにより効率的に排除されたことを示した（図１６Ａおよび１６Ｄ）。一方、標的細胞ＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１を単独で培養した対照では、増殖が見られた。２回目および３回目の標的細胞曝露のためにＣＡＲＴ細胞を新鮮な標的細胞に移した後に、ＣＡＲバリアント間の差が見られるようになった。長鎖スペーサーを有するＣＡＲバリアントを発現するＴ細胞は、短鎖および超短鎖スペーサーバリアントを有する抗クローディン－３ＣＡＲを発現するＴ細胞に比べて、標的細胞増殖を制御する効率が低かった（図１６Ｃおよび１６Ｅ）。ドナーＨ５では、２回目の後に十分なＬＮＧＦＲ陽性Ｔ細胞が得られなかったため、３回目は行わなかった。

反復抗原刺激：抗原のスパイクイン
疲弊マーカー（ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＬＡＧ３）の発現は、フローサイトメトリーにより０、１、２、３および６日目に分析した。二重陽性（ＴＩＭ３、ＰＤ－１）および三重陽性（ＴＩＭ３、ＰＤ－１、ＬＡＧ３）Ｔ細胞の分析では、ＬＮＧＦＲ陽性Ｔ細胞のみを含めた。

図１７Ａ～１７Ｄに示される結果は、０日目の最初の標的細胞の添加前の二重および三重陽性形質導入Ｔ細胞の頻度は５％未満であったことを示した。しかしながら、両ドナーとも、１日目～３日目の標的細胞曝露により二重および三重陽性Ｔ細胞の頻度は増加した。ドナーＰは、ドナーＨ５に比べて疲弊マーカーの発現のより高い増加を示した（図１７Ｂ）。２日間（４日目および５日目）を経た６日目の、新鮮な標的細胞を添加しない染色は、二重および三重陽性形質導入Ｔ細胞の頻度が低下し、これはドナーＨ５よりもドナーＰで顕著であったことを示した。

９０６ｓｃＦｖバリアントに基づく種々の抗クローディン－３ＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞を、ヒトクローディン－３を発現していたＴ－４７Ｄと共培養したところ、Ｅ：Ｔ比に応じて殺傷された標的細胞の頻度が増加した。これは癌細胞株を非形質導入Ｔ細胞と共培養した際には見られなかった。このことは、抗ヒトクローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養した場合のヒトクローディン－３発現標的細胞の特異的溶解を示した。さらに、ｓｃＦｖ配向およびスペーサー長（Ｌ、ＳおよびＸＳ）の異なる総ての抗クローディン－３ＣＡＲ構築物発現Ｔ細胞が、供試標的細胞に対して同等の溶解能を示した。全体的に見れば、ヒトクローディン－３を発現する標的細胞の溶解に関する抗クローディン－３ＣＡＲの機能は、陽性対照クローディン－３構築物を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。

上清中に分泌されたサイトカインＩＬ－２およびＩＦＮγの濃度は、非形質導入Ｔ細胞に比べてＴ－４７Ｄと共培養した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞では増加していた。このことは、ヒトクローディン－３を発現する標的細胞の存在下での、９０６バリアントに基づく抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的なサイトカイン分泌を示した。構築物９０６＿００９および９０６＿００４は、最高の分泌サイトカイン濃度を示し、ともに共通して短鎖スペーサーを持つ。これらの構築物では、分泌サイトカインレベルは陽性対照クローディン－３構築物を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であるかまたはさらには高かった。

９０６ｓｃＦｖに基づく種々のＣＡＲバリアントを発現するＴ細胞の性能をさらに評価するために、より難しいアッセイを行った。そこで、長期共培養を行い、新鮮な標的細胞を３回添加した。初回の標的細胞曝露では、３種類の異なるスペーサー（Ｌ、ＳおよびＸＳ）を有する９０６バリアントを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞は等しく良好な性能を示した。しかしながら、短鎖および超短鎖スペーサーを発現するバリアントは、３回の共培養の総てで、新たに加えたＲＫＯ－ＫＯＣＬＤＮ３Ｈ１細胞を排除することができた。長鎖スペーサーバリアントに基づくＣＡＲでは、１名のドナー（Ｈ５）からのＣＡＲ－Ｔ細胞は初回にのみ、また、第２のドナー（Ｇ５）からのＣＡＲＴ細胞は最初の２回の標的細胞曝露中にのみ、標的細胞を排除した。ｓｃＦｖの配向はこれらの結果に影響を及ぼさないと思われる。

抗原スパイクインによる反復抗原刺激を行ったアッセイでは、反復抗原曝露後のＬＮＧＦＲ陽性Ｔ細胞の疲弊マーカーの発現の増強は明らかであった（図１７Ａ～１７Ｅ）が、２名の供試ドナー間の差は９０６ｓｃＦｖに基づく種々のＣＡＲ構築物を発現するＴ細胞よりも顕著であった。したがって、このアッセイでは、特定のＣＡＲ構築物バリアントの機能性の違いに関する結論は得られなかった。さらに、６日目のデータは、疲弊マーカー二重および三重陽性ＣＡＲＴ細胞の頻度は、４日目および５日目に新たな標的細胞を加えなかった後に減少したことを示した。この頻度の減少が、ＬＮＧＦＲ陽性Ｔ細胞上のこれらのマーカーの実際の減少によって起こったものか、または別の理由、例えば、非疲弊Ｔ細胞の拡大増殖に起因し、非疲弊Ｔ細胞の全体的な頻度の減少につながり得るのかは、決定されなかった。

抗クローディン－３ＣＡＲは、初代Ｔ細胞に、それらがＴ細胞活性をクローディン－３発現腫瘍細胞へリダイレクトできることを示唆するレベルで発現される。これらの抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、クローディン－３を発現する標的細胞を溶解させることができ、標的の存在下でＩＬ－２およびＩＦＮγを選択的に分泌した。さらに、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、数回の標的細胞曝露の際に、クローディン－３発現腫瘍細胞を排除することができた。

実施例６：ＣＬＤＮ３陽性腫瘍細胞に対する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖性応答
本研究の目的は、クローディン－３陽性標的細胞による抗原刺激に応答して増殖する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を評価することであった。

材料および方法
実験準備
ＣＡＲＴ細胞の増殖は、エフェクターおよび標的細胞を７２時間培養することにより評価した。

これらの実験で、２回の独立した実験で６名のドナーからのＴ細胞に、同じｓｃＦｖバリアント（９０６－００２、９０６－００４、９０６－００７および９０６－００９；実施例５参照）に基づく４つの構築物でレンチウイルスによる形質導入を行った。Ｔ細胞は、ＣＡＲ配列へ低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）マーカー遺伝子を直接導入して操作し、ＣＡＲ分子の細胞外部分で発現するＬＮＧＦＲマーカー遺伝子を標的とする免疫磁性ビーズを用いて選別することによるＣＡＲ陽性細胞の単離を可能とした。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖は、７２時間、クローディン－３陽性（ＲＫＯ）細胞株とクローディン－３陰性（ＲＫＯ－ＫＯ）細胞株を１：１で共培養した後、［^３Ｈ］チミジンの組み込みにより測定した。このチミジン組み込みアッセイは、有糸細胞分裂中に染色体ＤＮＡの新しい鎖に放射性ヌクレオシドである３Ｈ－チミジンが組み込まれるという戦略を利用する。

実験プロトコール
ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖は、エフェクター細胞と標的細胞を１：１比で共培養することにより測定した。１×１０^５の濃縮ＣＡＲ－Ｔ細胞を、１×１０^５のＣＬＤＮ－３陽性ＲＫＯ細胞株またはＣＬＤＮ－３陰性（ＲＫＯｈｕＣＬＤＮ－３ｋｏ）細胞株と共培養した。４８時間後、細胞に１μＣｉ（３７Ｂｑ）の［^３Ｈ］－チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をパルス添加し、さらに２１時間インキュベートして、Ｔ細胞の分裂細胞の新たに合成されたＤＮＡへの放射能の組み込みを可能とした。細胞は、セルハーベスター（Ｍｉｃｒｏ９６ｈａｒｖｅｓｔｅｒ、ＳｋａｔｒｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてフィルターマットに採取した。［^３Ｈ］チミジンの組み込みに応答して生じた細胞分裂の程度を決定するために、ＤＮＡに組み込まれた放射能を、Ｗａｌｌａｃ１４５０ＭｉｃｒｏＢｅｔａトリラックスリキッドシンチレーションおよび発光ベータカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定し、これを毎分のカウント（ＣＰＭ）として表した。データ解析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ、バージョン５．０．４で行った。データは平均±標準誤差で表し、解析は図の凡例に示すように、両側スチューデントのｔ検定によって行った。所見の有意性は次のように定義する：ＮＳ＝有意でない；^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。

結果
２つの異なる配向（Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬおよびＶ_Ｌ－Ｖ_Ｈ）および２つのスペーサー長の抗クローディン－３ｓｃＦｖをコードする４つのレンチウイルス構築物（９０６－００２、９０６－００４、９０６－００７および９０６－００９）で形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を比較した。

結果は、９０６－００９抗クローディン－３ＣＡＲＴ細胞がｉｎｖｉｔｒｏにおいて、クローディン－３発現細胞株（ＲＫＯ）に対して、他の構築物９０６－００２、９０６－００４、９０６－００７ＣＡＲを形質導入したＴ細胞よりも有意に大きな抗原特異的増殖を示したことを示す（図１８）。

ＲＫＯ－クローディン－３ＫＯ細胞株と培養した際は、どの抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞も増殖を示さなかった。

クローディン－３ＲＫＯ細胞と培養した際は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞は、増殖を示さなかった。

これらのデータから、９０６－００９抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞はより大きなｉｎｖｉｖｏ増殖を示し、これがより大きな抗腫瘍臨床活性をもたらし得ると予想される。これらの所見は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を結腸癌の癌免疫療法として使用すると、増殖性および腫瘍抗原に対する細胞傷害性応答が持続されることを示唆する。

実施例７：ＣＤＸＮＳＧモデルにおける抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞活性のＩｎＶｉｖｏ評価およびヒトＣＲＣＰＤＸサンプルに対するＩｎＶｉｔｒｏ評価
本研究の目的は、ｉｎｖｉｖｏでのマウスモデルにおける抗クローディン－３ＣＡＲで形質導入したＴ細胞の有効性およびｉｎｖｉｔｒｏでの患者由来ヒト異種移植（ＰＤＸ）モデルにおけるその機能性を評価することであった。結果は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞がマウスの生存を延長し、腫瘍成長を制御したことを示す。

材料および方法
ｉｎｖｉｖｏにおいて腫瘍細胞を殺傷する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を評価するために、ＣＬＤＮ３発現結腸癌細胞株ＨＴ－２９Ｌｕｃを使用した。本研究の主要評価項目は、（１）腫瘍成長およびマウスの生存への影響であった。副次的評価項目は、（２）Ｔ細胞活性化を評価するための血清サイトカイン放出、（３）組織病理学による腫瘍およびマウス組織におけるＴ細胞の分布、ならびに（４）血中でのＣＡＲＴ検出であった。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性を、患者由来ヒト異種移植（ＰＤＸ）モデルでさらに評価した。０日目（Ｄ０）に、ＰＤＸ細胞を解凍し、フローサイトメトリーにより特性評価し、播種した。１日目（Ｄ１）に、Ｔ細胞を解凍し、ＰＤＸ細胞の上に１：１比で播種した。２日目（Ｄ２）に、上清を回収し、ＭＳＤアッセイによりサイトカインレベルを評価した。ＰＤＸおよびＴ細胞を採取し、フローサイトメトリーにより、ＣＬＤＮ３、ＰＤ－Ｌ１、ＥｐＣＡＭ（腫瘍細胞）およびＣＤ６９（Ｔ細胞）発現の特性評価を行った。

ＮＳＧマウス
試験開始前に、接種に用いたＨＴ－２９Ｌｕｃ細胞をヒトおよびマウス病原体の包括的パネル（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）でスクリーニングし、結果は総て陰性であった。並行して、ドナー血液はＢ型肝炎、Ｃ型肝炎およびＨＩＶＩ／ＩＩに関して陰性判定であった。

試験中、マウスの糞便をさらなる病原体に関して検査した。試験中のマウスならびに別の試験の同じ供給者からのマウスの糞便は、アストロウイルス－１およびセグメント細菌(Segmented Filamentous Bacteria)（ＳＦＢ）に関して陽性判定であった。獣医に相談したところ、両生物は臨床的健康に関与しないと思われた。ＳＦＢおよびアストロウイルス－１は両方とも、適格な免疫系の発達に関与し、ＳＦＢはまた炎症調節に役割を持つことが報告されている。

腫瘍細胞の調製およびＮＳＧマウスへの接種
ＨＴ－２９Ｌｕｃ細胞を採取し、細胞が病原体を含まない状態であることを確認するための、ヒトおよびマウス病原体の検査のために上清を回収した。採取した細胞を計数し、次に、各ＮＳＧマウスの右側腹部への０．５×１０^６のＨＴ－２９Ｌｕｃ細胞の皮下（ｓ／ｃ）接種に使用した。

腫瘍成長、安楽死および組織採取
本研究の終了までマウスを密接にモニタリングした。総てのマウスの腫瘍サイズを、触診／ノギス測定により測定し、週３回記録し、その後、体重を週２回記録した。

腫瘍体積などのエンドポイント基準によって、個々のエンドポイントでマウスを殺処分し、組織を採取した。腫瘍および脾臓（全組織／器官、インタクト）を氷上のＰＢＳ中に採取した。半分を組織処理に使用し、もう半分を組織病理学的検査のために最大４８時間、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）で固定した。心臓、肺、結腸、腎臓、肝臓、卵巣および脳を採取し、そのまま１０％ＮＢＦで固定した。総ての固定組織をＧＳＫＴＭＣＰＵＫＨｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｗａｒｅに供給した。

Ｔ細胞の解凍、培養および投与
グループ間で腫瘍サイズの均等なばらつきを確保するために、マウスは腫瘍体積に応じて７～８匹の群にブロックランダム化した。腫瘍が触知可能（約１００ｍｍ^３）になった時点で、下表１０に示すように、ＣＡＲ－Ｔ細胞をマウス１匹あたり１×１０^７細胞の用量で尾静脈注射した。

血清サイトカインアッセイおよび血中でのＣＡＲ－Ｔ細胞検出
試験下の総てのマウスからの血液サンプルをＴ細胞投与前と、血清サイトカイン放出の評価のためには７日後に、血中のＣＡＲ－Ｔ細胞を評価するためには投与後２８日目に採取した。

サイトカインは、採取したマウス血清サンプルで、以下の検出抗体：スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＦＮγ抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－１β抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－２抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－４抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－６抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－８抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－１０抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－１２ｐ７０抗体、スルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＩＬ－１３抗体およびスルホ－ＴＡＧ抗ｈｕＴＮＦα抗体を用い、ＭＳＤにより検出した。

投与後２８日目になお試験下にあった各マウスからの全血を採集し、以下の抗体：ＣＤ４５－ＦＩＴＣ（１／１００希釈）；ＣＤ３－ＢＵＶ３９５（１／５０希釈）；ＣＤ８－ＡＰＣＶｉｏ７７０（１／２００希釈）；ＣＤ４－ＰｅｒＣＰＶｉｏ７７０（１／５０希釈）；およびＬＮＧＦＲ－ＰＥＶｉｏ７７０（１／６００希釈）で染色した。

ＰＤＸ共培養およびフローサイトメトリー
５つの大腸癌モデルおよび１つの卵巣癌モデルを用いて患者由来ヒト異種移植（ＰＤＸ）モデルを確立した。ＰＤＸ大腸癌細胞モデル（ＣＲ５０５２、ＣＲ５０８０、ＣＲ５０８９、ＣＲ５０３０、ＣＲ５０８７）およびＰＤＸ卵巣癌細胞モデル（ＯＶ５２８７）をＣｒｏｗｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。

０日目：
ＰＤＸ細胞懸濁液を解凍し、計数し、５０，０００～１００，０００細胞／ウェルで播種した。

残留するＰＤＸ細胞は、以下の抗体パネル：ＥｐＣＡＭ－ＢＶ６５０（１／６００希釈）；Ｃｌｄｎ３－ＰＥ（１／１０希釈）；ＰＤＬ１－ＢＶ４２１（１／１００希釈）；ＣＤ４５－ＦＩＴＣ（１／１００希釈）；ＬＮＧＦＲ－ＰＥＶｉｏ７７０（１／１００希釈）；およびＣＤ６９－ＢＶ７８６（１／１００希釈）を用い、フローサイトメトリー分析により特性評価した。

１日目：
Ｔ細胞を解凍し、ＰＤＸ細胞に１：１のＣＡＲ－Ｔ細胞：ＰＤＸ細胞比で加えた。ＰＤＸ細胞単独およびＴ細胞単独を含むさらなるウェルを使用した。

２日目：
上清を回収し、サイトカインアッセイを行った。さらに、共培養細胞を採取し、Ｄ０に使用したものと同じパネルを用いてフローサイトメトリーにより評価した。

上清を回収し、上記のようにサイトカインアッセイを行った。

結果
腫瘍成長の遅滞および生存率
ｉｎｖｉｖｏにおける本研究の主要な目的は、ｉｎｖｉｖｏでＨＴ－２９Ｌｕｃ結腸癌モデルにおける抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を評価することであった。

ヒトＴ細胞に対して、ｉｎｖｉｖｏ投与と同じ日に形質導入効率、記憶および疲弊表現型の表現型分析を行った。高い生存率（８７～９２％）および形質導入効率を示した細胞は、ＬＮＧＦＲ染色により、抗ＣＤ１９ＣＡＲでは３２％、抗クローディン－３ＣＡＲでは３５．８％と決定された。これは、Ｔ細胞を３０％形質導入効率に対して正規化した場合、凍結前に得られた形質導入効率および生存率と一致していた。さらに、より複雑なＴ細胞表現型分析から、細胞の３０％（ＣＤ１９では２７％および抗クローディン－３ＣＡＲでは３２．７％）にＬＮＧＦＲ発現が確認され、両ＣＡＲとも、ＣＤ８Ｔ細胞はＣＤ４Ｔ細胞よりも豊富であったことが示された。ＬＮＧＦＲ発現のパーセンテージは、ＣＤ８Ｔ細胞よりもＣＤ４Ｔ細胞で高かった。ＣＤ３Ｔ細胞では、ＴＩＭ３およびＰＤＬ－１がそれぞれ９７％および８６～８８％発現していた。

抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、腫瘍成長を制御した（図１９Ａ～１９Ｂ）。腫瘍接種部位からの組織にｅｘｖｉｖｏで組織学的分析を行った。腫瘍細胞は検出できなかったので、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は腫瘍を完全に破壊した。本研究の生存期間は、「マウスの腫瘍が１０００ｍｍ^３に達するのに必要な期間」と定義された。１０００ｍｍ^３未満の腫瘍を有する各群のマウスの割合を図１９Ａに示し、これにより、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞と抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の間の生存期間に有意差が確認された。

Ｔ細胞の接種後３０日目から、一部のマウスは、沈んだ姿勢、細目、脱毛、呼吸不良、異常歩行、立毛および体重減少の徴候を示した。これらのマウスは、動物福祉法に従い、これらの症状の最初の徴候時に殺処分した。これらの症状は、発症時期を考慮すると、腫瘍破壊に関連するサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）であった可能性がある。これらの臨床症状は抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞処置群でのみ観察され、抗ＣＤ１９ＣＡＲ処置対照群のマウスは総て腫瘍体積が大きかったため、早い時点で犠死させた。

腫瘍および健常組織（ＩＨＣ）における抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の分布
抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の組織分布および潜在的マウス組織損傷を組織病理学により評価した。本研究の評価は、両Ｔ細胞投与群とも、マウス組織に広範な血管周囲のヒトＴ細胞の蓄積を示した。抗クローディン－３ＣＡＲはマウスＣＬＤＮ３を認識し得るので、潜在的な毒性効果を考慮する必要がある。抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞または抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与した動物では、肝細胞および上皮のターンオーバーの増加はごくわずかであった。さらに、結腸または肺の上皮傷害は観察されなかった。したがって、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞に関連した組織損傷またはマウス内在性標的の破壊の組織学的証拠を見出すことはできなかった。

末梢血のＣＡＲＴ細胞
投与２８日目に、なお試験下にある総てのマウスについて血液のフローサイトメトリー分析を行い、ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在を確認した。これらの細胞は、２５～４４３８ＣＡＲ－Ｔ細胞総数／ｕＬ全血の範囲で検出された。Ｔ細胞上でのＬＮＧＦＲ発現により測定した場合のＣＡＲ－Ｔ細胞のパーセンテージは３０～４０％前後で維持され、投与日に試験した発現と同等であった（図２０）。試験群の間で顕著な差はなかった。ＬＮＧＦＲ発現の頻度は、抗ＣＤ１９ＣＡＲと抗クローディン－３ＣＡＲの両群で、ＣＤ８Ｔ細胞よりＣＤ４Ｔ細胞で高かった。

血清サイトカインレベル
血清中のサイトカインレベルを評価するために、Ｔ細胞投与前および投与後７日目の総てのマウスからサンプルを採取した。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞投与マウスは、図２１Ａ～２１Ｂに示されるように、処置７日後にＩＦＮγレベルの上昇を示した（中央値で、ＣＤ１９の３２ｐｇ／ｍＬに対して２２５ｐｇ／ｍＬ）。他の供試サイトカインは明らかな傾向を示さなかったか、または測定値が検出レベルを下回った。

患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の特性評価および共培養の確立
抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性を患者由来ヒト異種移植（ＰＤＸ）モデルで試験した。これらのモデルは、ヒトの腫瘍に見られる腫瘍細胞の不均質性の再現を可能とする。５つの大腸癌モデルをＣＬＤＮ３発現、組織病理学的腫瘍特性およびｉｎｖｉｔｒｏ培養における細胞生存率に基づいて選択した。さらに、１つの卵巣癌モデルを低ＣＬＤＮ３発現株として選択した。

次に、ＰＤＸサンプルを、抗クローディン－３ＣＡＲＴ細胞対、抗ＣＤ１９ＣＡＲ（陰性対照）Ｔ細胞との共培養を設定するために使用した。主要評価項目は、（１）解凍後（Ｄ０）のＰＤＸサンプルの、腫瘍マーカーＥｐＣＡＭ、ＰＤＬ－１およびＣＬＤＮ３を用いるフローサイトメトリーによる特性評価、ならびに（２）サイトカイン放出（２４時間の共培養物からの上清に対するＭＳＤアッセイ）により測定したＴ細胞活性化であった。副次的評価項目は、（３）共培養サンプルの、腫瘍マーカーＥｐＣＡＭ、ＰＤＬ－１およびＣＬＤＮ３ならびにＴ細胞マーカーＣＤ４５、ＬＮＧＦＲ（ＣＡＲＴ細胞の指標）、ならびにＣＤ６９（活性化マーカー）を用いたフローサイトメトリーによる特性評価であった。これらの実験は、ＣＬＤＮ３陽性対照としてＨＴ－２９細胞およびＣＬＤＮ３陰性対照としてＲＫＯ－ＫＯ細胞を用いて行った。

ＰＤＸモデル供給者から得たＲＮＡｓｅｑデータは、ＥｐＣＡＭは大腸（ＣＲ）ＰＤＸモデルでは好適な腫瘍細胞マーカーとなるが、卵巣（ＯＶ）ＰＤＸモデルではそうではないことを示した。ＥｐＣＡＭ陽性細胞集団のパーセンテージは、ＣＲモデルでは４１～６５％の範囲であったが、ＯＶＰＤＸサンプルでは１４～１７％が検出されたに過ぎなかった。ＣＲＰＤＸサンプルの特性評価により、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞上でのＣＬＤＮ３発現が２６～５５％であることが示された（図２２）。ＣＬＤＮ３は、ＯＶモデルではフローサイトメトリーにより検出できなかった（０．２９％）。さらに、予想されたように、いずれの実験でもＲＫＯ－ＫＯ細胞（陰性対照）にＣＬＤＮ３は検出されなかった。ＰＤＬ－１発現標的細胞（ＥｐＣＡＭ^＋ＣＬＤＮ３^＋ＰＤＬ－１^＋集団）のパーセンテージは、Ｄ０のＰＤＸサンプルでは２％未満であったが、共培養後に増加し、Ｄ２において、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞共培養に比べて抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞共培養で上昇した。

このパイロット共培養実験で試験した総てのＰＤＸモデル（ＣＲ５０３０、ＣＲ５０８０、ＣＲ５０５２、ＣＲ５０８７、ＣＲ５０８９、ＯＶ５２８７）および陽性対照（ＨＴ－２９）は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン放出（ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α）を誘導したが、陰性対照（ＲＫＯ－ＫＯ、Ｔ細胞単独および抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞との全共培養）は、ＭＳＤアッセイで測定した場合に、Ｔ細胞応答を誘導しなかった（図２３）。

Ｔ細胞の特性評価により、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞共培養と抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞共培養を比較した場合に、初期のＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現上昇が示された（ＣＤ４５^＋ＬＮＧＦＲ^＋ＣＤ６９^＋集団は、抗ＣＤ１９Ｔ細胞共培養では１１～２２％であったのに対し、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞共培では６９～８２％の範囲であった）。

触知可能なＨＴ－２９Ｌｕｃ腫瘍を有するＮＳＧマウスに、細胞総数１×１０^７の用量の抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞または抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞、またはＰＢＳ（Ｔ細胞非含有）を接種した。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウスの生存率を延長し、腫瘍塊の完全な破壊（組織学）により確認されたように腫瘍成長を抑制した。これらのデータは、Ｔ細胞投与後７日目のＩＦＮγの血清レベルの上昇により裏付けられた。よって、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｖｏ腫瘍殺傷に関して高い有効性を示した。

マウス組織の組織病理学的分析により、両Ｔ細胞投与群の広範な血管周囲のヒトＴ細胞の蓄積が示された。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞関連の組織損傷の証拠は見られなかった。このことは、健常組織の密着結合（ＴＪ）に制限されたＣＬＤＮ３は抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞が接近可能でないという仮説によって裏付けられる。しかしながら、ＴＪの外側に不適切に局在した場合、ＣＬＤＮ３は腫瘍内の抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞によって認識された。

結論として、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｉｎｖｉｖｏにおいて効率的な抗癌療法であることが証明された。

ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を別のモデルで評価するために、ヒトで見られるような腫瘍細胞の不均質性の模倣を可能とする患者由来ヒト異種移植（ＰＤＸ）モデルを使用した。それらを使用してｉｎｖｉｔｒｏにおける抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能性を評価した。５つの大腸ＰＤＸモデルおよびＣＬＤＮ３陽性対照細胞（ＨＴ－２９）を用いた実験は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン放出（ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α）の上昇を示したが、陰性対照（ＲＫＯ－ＫＯ共培養およびＴ細胞単独および抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞との全共培養）はＴ細胞応答を誘導しなかった。また、ＲＮＡｓｅｑによりＣＬＤＮ３発現が極めて低かったＯＶモデルも抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞応答を誘導したが、同じ実験で実施した２つのＣＲモデルに比べてＩＦＮγおよびＩＬ－２レベルは低く、ＴＮＦ－αの測定値は同等であった。

下流ＰＤＸ細胞の特性評価は、卵巣モデルではフローサイトメトリーによりＣＬＤＮ３発現がないことを示した。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、他のクローディンファミリーメンバーに対して細胞傷害性の交差反応性を示さず（上記参照）、オフターゲット結合効果はスクリーニングで見られなかった（下記参照）ことから、卵巣細胞はフローサイトメトリーの検出レベル未満の低いＣＬＤＮ３レベルを発現している可能性がある。これは、ＣＬＤＮ３の発現が極めて低い細胞株の存在下でサイトカインレベルの上昇を示した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた以前の共培養実験と一致している。予想通り、どの実験でもＲＫＯ－ＫＯ細胞（陰性対照）ではＣＬＤＮ３は検出されなかった。共培養後、標的を発現している腫瘍細胞のＰＤＬ－１レベルは、抗ＣＤ１９対照群と比較して、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞群で上昇していた。さらに、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較してＣＤ６９レベルの上昇を示し、共培養に対する反応がさらに確認された。

実施例８：抗クローディン－３ＣＡＲベクターにＣＤ２０を含めることで抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的とする細胞傷害活性を変化させることなく制御された抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を除去する機構が得られる
クローディン－３の提示は、腫瘍に関係しない異常なクローディン－３の発現がＣＡＲ－Ｔ細胞を再活性化し、細胞傷害性Ｔ細胞を正常細胞上の癌抗原を攻撃するようにリダイレクトするというリスクを伴う。クローディン－３を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の安全性プロファイルを改善するために、Ｔ細胞除去技術という形で予めプログラムされた制御安全対策を治療ベクター内に導入し、Ｔ細胞産物を、Ｔ細胞除去を受けやすくすることができる。

細胞表面のＢ細胞抗原ＣＤ２０は、いくつかの治療用抗体、すなわち、ＣＤ２０主要細胞外ループのジスルフィド拘束部分に結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ；Golay et al., 2013 MAbs 5:826-837）によりアポトーシスを誘導するＩ型抗体であるＦＤＡ承認のリツキシマブの標的である。

本研究目的は、ｉ）有効なＣＡＲ－Ｔ細胞除去技術としてのＣＤ２０を評価すること、ｉｉ）９０６＿００９治療用ベクターにＣＤ２０を含めることで、クローディン３発現標的細胞に対する９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性応答が変化するかどうか評価すること、ｉｉｉ）ＣＤ２０を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるカルシウムフラックスの変化を観察すること、およびｉｖ）ＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯ（抗クローディン－３ＣＡＲ、スプライス部位最適化（ＳＯ）ベクター）の免疫原性を予測することであった。これらの結果は、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞療法戦略へのＣＤ２０の包含が、ＣＡＲ－Ｔ細胞除去技術として使用可能であることを示す。

材料および方法
ＣＤ２０の活性を評価するために、ＣＤ２０アブレーションエレメントを含む（ＣＤ２０＿９０６＿００９）またはＣＤ２０アブレーションエレメントを欠く（９０６＿００９）いずれかのクローディン－３ＣＡＲベクターで形質導入したＣＡＲ－Ｔ細胞間で比較を行った。非形質導入およびＣＤ２０＿ＺＳＧｒｅｅｎ（ＣＤ２０およびＺＳＧｒｅｅｎ蛍光タンパク質を発現するベクター）またはＣＤ２０＿ＣＤ１９（ＣＤ２０およびＣＤ１９を発現するベクター）形質導入Ｔ細胞を対照として含めた。標的化Ｔ細胞除去に関して、ＣＤ２０をＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイにより評価した。９０６＿００９の上流にＣＤ２０を含めることによるＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害活性の変化を、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ細胞傷害性アッセイにより評価した。

レンチウイルス導入ベクターの設計および作製
９０６＿００９ＣＡＲの上流にＣＤ２０細胞アブレーション遺伝子をコードするレンチウイルス（ｐＧ３）導入構築物を設計してＣＤ２０＿９０６＿００９を作製した。これと並行して、上流のＣＤ２０と短鎖スペーサーＣＤ８αヒンジを有する抗ＣＤ１９ＣＡＲ分子（９０６＿００９ＣＡＲに存在する２つのアーキテクチャーを反映している）も設計し、ＣＤ２０＿ＣＤ１９＿ＧＳＫとした。配列はコドンが最適化され、さらに配列からスプライスの可能性のある部位を除去するために修正した。得られた遺伝子導入プラスミドＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯおよび９０６＿００９＿ＳＯは、それぞれ前身のＣＤ２０＿９０６＿００９および９０６＿００９と同じタンパク質配列を有する。

ＣＡＲＴ－細胞の濃縮
形質導入の１３日後に、抗ＬＮＧＦＲ／ＣＤ２７１Ａｂではなくヤギ抗マウスＦ（Ａｂ）２－ビオチンに細胞を再懸濁させたこと以外は、実施例２で上記したようにＲａｐｉｄｓｐｈｅｒｅｓを用いてＣＡＴ－Ｔ細胞をＣＡＲ発現により選択した。

ＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイ
ＣＡＲ－Ｔ細胞および対照細胞を染色溶液に再懸濁させた。特に、ＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＶｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色し、９０６＿００９ＣＡＲＴ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅＦａｒＲｅｄ（ＣＴＦＲ）で染色した（ＣＴＦＲは非形質導入細胞または抗クローディン－３ＣＡＲのみを発現する細胞を染色するために使用し、ＣＴＶはＣＤ２０を発現する細胞を染色するために使用した）。ＣＴＶ染色細胞およびＣＴＦＲ染色細胞を、ドナーごとに１：１比でペアとした。

ＣＤＣアッセイでは、次に、ペアをリツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ）または抗ＲＳＶアイソタイプ対照およびウサギ補体（Ｒａｂ）または熱不活化ウサギ補体（ＨＩ）で処理した（図２５）。図２６に、１３名のドナーの全細胞プールに占めるＣＴＶの割合をＣＤ２０発現細胞に対してプロットした。

ＡＤＣＣアッセイでは、新鮮血液を献血ユニット（ＧＳＫ－Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ）から入手した。ＰＢＭＣは前述のように単離した。次に、ＮＫ細胞ビオチン抗体およびマイクロビーズを用いて、ＮＫ細胞の負の選択を行った。その後、細胞をＬＳカラムで磁気分離し、非標識細胞を回収し、染色しペアにしたＴ細胞に加えた。共培養物を３７℃で２０時間インキュベートした。

ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ細胞傷害性アッセイ
ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ殺傷アッセイのための共培養を、エフェクター細胞（ＣＡＲ－Ｔおよび対照Ｔ細胞）と１：１比のエフェクター細胞：標的細胞で共培養した標的細胞Ｋ５６２およびＲＫＯ－ＫＯを用いて、実施例４で上記したように設定した。存在する対照は、標的細胞単独、エフェクター細胞単独および標的と１００％溶解液（０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ）であった。

カルシウムフラックス分析
ＣＡＲ－Ｔ細胞および非形質導入対照を細胞培養プレートに５×１０^４細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした後、１）タプシガルギン（５ＸＦＡＣ＝１８μＭ、３．６μＭＦＡＣ）およびＤＭＳＯ（５ＸＦＡＣ＝０．６％ｖ／ｖ、０．１２％ｖ／ｖＦＡＣ）；および２）イオノマイシン（６ＸＦＡＣ＝４μＭ、０．６７μＭＦＡＣ）を含有するアッセイバッファーを添加した。その後、処理した細胞をＦＬＩＰＲにより分析した。

ＣＤ２０は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の両方からリツキシマブにより標的とされる
抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞にＣＤ２０を含めるとリツキシマブによる治療細胞の欠失のマーカーとなり得るかどうかを確認するために、ＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイを行った。

治療用抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＤ２０の発現レベルは、十分に確立されたリツキシマブ標的であるＢ細胞と比較した（図２４）。既知のヒトＦｃ結合部位を有するビーズおよびＣＤ２０に対するヒトｍＡｂ（それぞれ、抗ヒトＱｕａｎｔｕｍＳｉｍｐｌｙＣｅｌｌｕｌａｒビーズおよび抗ＣＤ２０－ＰＥ－Ｖｉｏ７７０）を使用することにより、潜在的ＣＤ２０結合部位の数を、ＣＤ２０の蛍光強度中央値を用いて算出した。データは、ＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＣＤ２０結合部位の数が３名のドナーで５．１６～５．２４の範囲であったのに対し、ドナーが適合するＢ細胞では５．７５～５．９の範囲であったことを示す。ＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞内のＣＤ２０＋集団は３５～４１％の範囲であった。ＣＤＣおよびＡＤＣＣデータで使用したＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２０＋発現の範囲は３５～７４％であるので、このアッセイの細胞はより低い形質導入率を示し、これによりＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２０発現はＢ細胞と同等であるという結論に至る。

ＣＤ２０を発現する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞は、リツキシマブおよび補体で処理した場合に欠失可能であることを確認するために、ＣＤＣアッセイを行った。このデータは、ウサギ補体（Ｒａｂ）に加えてリツキシマブで処理した場合にＣＴＶ染色細胞で欠失が起こるが、アイソタイプおよびＨＩで処理したＣＴＶ染色細胞（対照）は欠失されないことを示す（図２５および２６）。欠失の効果はまた、ＣＴＶ染色細胞内のＣＤ２０発現率％にも依存し、それにより、ＣＤ２０＋集団が増加するにつれより多くの細胞欠失が見られる。さらなる分析で、Ｒａｂ処理条件とＨＩ処理条件のＣＴＶ細胞（ｐＣＴＶ）の割合を比較する。

リツキシマブがＣＤ２０＋細胞を欠失させる機構は完全には解明されておらず、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣによる可能性があり、ヒト補体の代わりにウサギ補体を用いてもヒトでのＣＤＣを正確に予測できない可能性があるため、ＡＤＣＣアッセイを実施して、ＣＤ２０を発現する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞をリツキシマブに加えてＮＫ細胞で処理した場合に欠失させることができることを確認した。元のＣＤ２０＿９０６＿００９および９０６＿００９ベクターで作製した抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞を、スプライス部位最適化（ＳＯ）ベクターＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯおよび９０６＿００９＿ＳＯと比較した。ここに示したＡＤＣＣのデータセットは３名のドナーのものである。

図２７は、アイソタイプまたはリツキシマブ条件について、培地対照と比較したＮＫ処理のｐＣＴＶ比をプロットしたものを示す。ドナー６２のアッセイを繰り返し、１回目と２回目の実験にそれぞれ１と２のラベルを付けた。結果は、元のＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯＣＡＲ－Ｔ細胞の両方で細胞数の減少があることを示唆する。ドナー６２では、欠失事象はオリジナルとＳＯバリアントの間で、独立したアッセイのそれぞれで類似しているが、ＣＤ２０発現はそれぞれ５４％と７６％で異なっている。２回目のアッセイは新たに解凍した細胞で行われ、結果が阻害された可能性がある。ドナー７９のＡＤＣＣも新たに解凍した細胞で行ったが、この場合にもＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯＣＡＲ－Ｔ細胞で顕著な結果を示さない。ドナー８７におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の欠失は、ＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯＣＡＲ－Ｔ細胞の方が多く、これはＣＤ２０の発現がそれぞれ８３％と６２％であるためであり得る。ＡＤＣＣの効果を高めるために、ドナー６２および８７のＣＤ２０＿９０６＿００９および９０６＿００９非凍結保存ＣＡＲ－Ｔ細胞を９０６＿００９ＣＡＲ発現によって濃縮した。おそらくＣＴＶ染色条件ではＣＤ２０＋集団が増加したために、ｐＣＴＶ比に差が見られる。

ＣＤ２０はクローディン－３標的細胞の９０６＿００９ＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性を変化させない
ＣＤ２０の有無による抗クローディン３ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性の検証は、ＸＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥアッセイによってリアルタイムで測定し、ここでは細胞の成長をインピーダンスの測定を用いて経時的に追跡する。クローディン３発現細胞株ＨＴ－２９－Ｌｕｃは、１３名のドナーの９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞によって標的とされた。非形質導入のＣＤ２０－ＺＳＧｒｅｅｎＴ細胞とＣＤ２０＿ＣＤ１９＿ＧＳＫＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として含めた。細胞傷害性は３０分ごとに測定し、インピーダンスの欠如は腫瘍細胞の殺傷と相関していた。対照標的細胞はコンフルエンシーを超えていたため、細胞傷害性分析は２４時間までしか有効ではなかった。図２８は、２０時間後に生存している細胞の％は、ＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞と９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞で有意差がなく、両値とも０％に近いが、対照細胞は１００％の生存率に近いことを示す。図２９のＫＴ５０値は標的細胞の５０％を殺傷するためにかかる時間を示し、ＣＤ２０＿９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞および９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞の間で有意差はないことを示す。

図３０は、４名のドナーからのＳＯＣＡＲ－Ｔ細胞および元のＣＡＲ－Ｔ細胞に関する、２０時間での細胞生存率％を示す。総ての条件で、２０時間での細胞生存率は０％付近であったが、２０時間での細胞生存率％はＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯよりもＣＤ２０＿９０６＿００９で有意に低く、９０６＿００９＿ＳＯに比べて９０６＿００９で低いことが示唆される。さらに、ＫＴ５０値は、ＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯよりもＣＤ２０＿９０６＿００９で有意に低く、９０６＿００９＿ＳＯに比べて９０６＿００９で低いことが示唆される（図３１）。

ＣＤ２０の有無でＣＡＲ－Ｔ細胞のカルシウムフラックスに変化はない
ＣＤ２０がＣＡＲ－Ｔ細胞のカルシウムフラックスに影響を及ぼすかどうかを判定するために、４名のドナーからの非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯＣＡＲ－Ｔ細胞および９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞をまずタプシガルギンに曝し、タプシガルギンは、小胞体Ｃａ２＋依存性アデノシン三リン酸分解酵素を阻害して、細胞質カルシウムレベルの上昇をもたらし、その後、カルシウム流入を刺激するためにイオノマイシンを添加した。ＤＭＳＯを対照として含め、処理した細胞はＦＬＩＰＲにより分析した。ドナー９９の９０６＿００９＿ＳＯＣＡＲ－Ｔ細胞のＤＭＳＯ条件は、プレートから剥離していたため、負の外れ値を生じた。図３２の結果は、非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＣＤ２０を含むもしくは含まないＣＡＲ－Ｔ細胞の間にカルシウムフラックスの違いはないことを示す。

本明細書に示されるデータは、ＣＡＲ－Ｔ細胞欠失技術としての抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞療法戦略におけるＣＤ２０の使用を裏付ける。

ＣＤＣデータは、ＣＤ２０を発現する抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞がリツキシマブによる欠失のマーカーとなることを示した。予備的なＡＤＣＣデータもまた、リツキシマブによる欠失がＮＫ細胞でも達成されることを裏付ける。ＣＤＣおよびＡＤＣＣアッセイの両方におけるＣＡＲ－Ｔ細胞欠失の性能はＣＤ２０＋集団に依存しており、このことはこれらのｉｎｖｉｔｒｏ法においてＣＤ２０＋ＣＡＲ－Ｔ細胞の完全な除去の可能性を示唆し得る。導入遺伝子ベクターの９０６＿００９ＣＡＲの上流にＣＤ２０をコードしても、抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性には影響を及ぼさなかった。

ＣＤ２０は、Ｂ細胞においてカルシウムチャネルとして働くと考えられるが、ＣＤ２０は、ＣＤ２０＿９０６＿００９＿ＳＯを用いて作製された抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞のカルシウムフラックスを、非形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞または９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して変化させないようである。

実施例９：原形質膜タンパク質アレイを用いた意図した標的以外のタンパク質への抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の結合（オフターゲット結合）の評価
本研究の目的は、形質導入Ｔ細胞のオフターゲット活性を確認することであった。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の意図した標的以外のタンパク質への結合は、多くのタンパク質が多重バリアントとして表される３５００を超える異なる原形質膜タンパク質を網羅する５０００を超える全長クローンからなるパネルを持つ発現ベクターセットを用いた原形質膜タンパク質アレイで評価した。ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞を陽性対照として研究に含めた。

材料および方法
プレスクリーニング、一次スクリーニングおよび確認スクリーニングを補助するためのＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
実施例１に記載するようにヒト血液から単離したＰＢＭＣから精製したＴ細胞に、ＢＣＭＡ－ＣＡＲレンチウイルスベクター（ＢＣＭＡ－０３０）をＭＯＩ２．４で、またはクローディン３ＣＡＲレンチウイルスベクター（９０６－００９）をＭＯＩ５で、形質導入を行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、培養期間中、ＴＥＸＭＡＣＳ培地および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で維持した。形質導入の１２日後に細胞を採取し、ＣｒｙＳｔｏｒＣＳ５凍結保存培地中、１×１０^８細胞／ｍＬで凍結した。非形質導入Ｔ細胞を陰性対照として作製した。Ｔ細胞は１名のドナー９０９２８から作製した。

ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は、フローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｓｅｒ１０）を用いてＢＣＭＡ－ＡＦ６４７への結合を測定することにより決定した。抗クローディン－３ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は、ＰＥコンジュゲート抗ＬＮＧＦＲＡｂおよびフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔＡｎａｌｙｓｅｒ１０）を用いてＬＮＧＦＲ発現を測定することにより決定した。データは、ＦｌｏｗＪｏｖ１０．１を用いて解析した。

原形質膜タンパク質アレイ
プレスクリーニング試験
非形質導入およびＣＡＲ形質導入Ｔ細胞（ドナー９０９２８）を、固定した非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞ならびにＢＣＭＡ、クローディン３、既知のＴ細胞相互作用因子および対照タンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞のスライドに加え、一次スクリーニングの前にバックグラウンド染色のレベルを調べた。

一次スクリーニング
一次スクリーニングでは、全長ヒト原形質膜タンパク質をコードする４０７０のタンパク質を、リバーストランスフェクションを用いてヒトＨＥＫ２９３細胞で個々に発現させた。細胞を１３のマイクロアレイスライドに二反復で並べ、固定した。ドナー９０９２８からの非形質導入Ｔ細胞およびＣＡＲ形質導入Ｔ細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅｒＲｅｄ色素で標識し、事前に最適化したＴ細胞：ＨＥＫ２９３細胞比で原形質膜タンパク質アレイに適用した。

確認スクリーニング
一次スクリーニングで特定されたヒットをコードするベクターを二反復でスポットし、ヒトＨＥＫ２９３細胞をリバーストランスフェクションさせるために使用した。二反復のスライドを設定した。ドナー９０９２８からの非形質導入Ｔ細胞および形質導入Ｔ細胞（３．２×１０^７細胞／スライド）を原形質膜タンパク質アレイに適用した。

結合は蛍光イメージングによって評価し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）を用いて形質導入効率を定量した。タンパク質の「ヒット」は、バックグラウンドレベルと比較してシグナルの上昇を示す二反復スポットとして定義した。これは、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア上でグリッド化された画像を用いた目視検査によって行った。ヒットは、二反復スポットの強度によって「強い」、「中程度」、「弱い」、または「微弱」に分類した。

結果
一次スクリーニングおよび確認スクリーニングを補助するためのＣＡＲ－Ｔ細胞の作製
形質導入効率は、形質導入の１２日後に決定した。ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は６３．１％であり、９０６－００９ＣＡＲ－Ｔ細胞の形質導入効率は５０％であった。

原形質膜タンパク質アレイ：プレスクリーニング
ドナー９０９２８を一次スクリーニングのために選択した。ＨＥＫ形質導入細胞のスポッティングパターンを図３３Ａに示す。非形質導入Ｔ細胞で、既知のＴ細胞相互作用因子（ＰＶＲ、ＣＤ２４４、ＴＮＦＳＦ４、ＩＣＯＳＬＧ、ＣＤ８６）への結合が見られた（図３３Ｂ）。ＢＣＭＡ形質導入Ｔ細胞では、ＢＣＭＡトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞への結合が見られ（図３３Ｃ）、９０６－００９ＣＡＲ－Ｔ細胞では、クローディン３トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞への結合が見られた（図３３Ｄ）。

原形質膜タンパク質アレイ：一次スクリーニング
ＩｍａｇｅＱｕａｎｔで蛍光を解析することによって合計２８のヒットが特定された。染色強度は微弱から強の範囲であった。

原形質膜タンパク質アレイ：確認スクリーニング
これら２８ヒットのスポッティングパターンを図３４Ａに示す。非形質導入Ｔ細胞では既知のＴ細胞相互作用因子への結合がみられた。ＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞では、ＢＣＭＡ発現ＨＥＫ細胞との１つの特異的相互作用が強い強度で確認された。クローディン３発現ＨＥＫ細胞では、９０６－００９ＣＡＲ－Ｔ細胞に対する１つのＣＡＲ特異的相互作用が確認された（図３４Ｄおよび表１１）。ＳＬＣ６Ａ６発現ＨＥＫ細胞では、確認スクリーニングで、９０６－００９ＣＡＲ－Ｔ細胞との微弱強度の結合が一貫性なく見られたが、一次スクリーニングでは見られなかった（データは示されていない）。

ＣＡＲ－Ｔ細胞を、４０７０のヒトタンパク質のライブラリーを過剰発現するヒトＨＥＫ２９３に対する結合についてスクリーニングした結果、非形質導入Ｔ細胞は、多くの既知のＴ細胞相互作用因子との結合を示した。陽性対照として用いたＢＣＭＡＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＢＣＭＡとの単一の強い特異的相互作用を示した。９０６－００９ＣＡＲ－Ｔ細胞は、クローディン３発現ＨＥＫ細胞と弱い強度の結合を示した。

実施例１０：ｉｎｖｉｖｏ試験におけるサイトカインピーク
ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性、機能および持続性をリプログラミングする合成抗原受容体である。ＣＡＲは一般に、Ｔ細胞活性化ドメイン（ＣＤ３複合体のζ鎖および共刺激ドメイン）、一般にＣＤ２８または４－１ＢＢに融合されたＳｃＦｖまたはｓｄＡｂから構成される。特異的リガンドとの会合は、ＣＡＲ武装化Ｔ細胞の活性化を促進し、標的腫瘍細胞の殺傷を増強する(June and Sadelain 2018）。最近１０年間で、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ療法は、血液腫瘍で高い成功を収め、固形腫瘍の治療の可能性を示す免疫療法の有望な分野となってきた(Jackson, Rafiq, and Brentjens 2016; Fuca et al., 2020)。

ＣＬＤＮ３は、上皮細胞間の密着結合（ＴＪ）の形成に重要な内在性膜タンパク質ファミリーに属す(Itallie and Anderson 2004)。正常な組織構造の破壊は癌の特徴であり、ＣＬＤＮ３の変化した発現は、大腸癌、乳癌、膵臓癌および卵巣癌などのアンメットニーズの高い癌を含む様々な上皮癌の発症に関係付けられている(Singh, Sharma, and Dhawan 2010)）。ＣＬＤＮ３は、腫瘍ではＴＪの外側に不適切に局在しているが、健常組織では局在していないことが報告されており(Corsini et al., 2018)、このメカニズムにより、ＣＬＤＮ３は、それが密着結合に隠れている正常細胞を温存しながら、腫瘍細胞を選択的に殺傷するためのＣＡＲ－Ｔ細胞の標的となる。

「ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９」は、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインを伴うヒト化ｓｃＦｖから構成される、ＣＬＤＮ３抗原を特異的に標的とするヒト化ＣＡＲＴである。「９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ」は、ヒトおよびマウスの両ＣＬＤＮ３に同等の親和性を有するｓｃＦｖＣＡＲ－Ｔ対照である。「ＣＤ２０－ＣＤ１９」は、ＣＤ２０アブレーション成分を有する非ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ対照である。

炎症（すなわち、サイトカイン放出の増加）による組織損傷は、密着結合の喪失によりＣＬＤＮ３が健常組織上に露出し、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞が接近しやすくなるため、潜在的な安全性リスクをもたらす可能性がある。本研究の第一の目的は、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ／腫瘍細胞の会合によって誘導されるサイトカイン分泌の潜在的増加が、密着結合の潜在的破壊によって健常組織に毒性をもたらし得るかどうかを評価することであった。この方向性に向けて、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与したＣＤＸマウスモデルからの血清サンプルを用いて、ｅｘｖｉｖｏでサイトカイン放出を測定するためにいくつかの時点を選択した。これらの時点は、確実にサイトカイン分泌のピークが同定でき、その後、サイトカイン分泌のピーク時に正常組織を評価できるように選択した。以下のサイトカイン：ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－αの経時的検出には、ＭＳＤマルチプレックスアッセイを用いた。個々のエンドポイントで、正常組織と腫瘍の組織病理学的評価を行った。

材料および方法
ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ／腫瘍細胞の会合によって誘導されるサイトカイン分泌の増加が密着結合の潜在的破壊のために健常組織に毒性をもたらし得るかどうかを評価するために、ＨＴ－２９Ｌｕｃヒト大腸癌モデルを使用した。ＨＴ２９－Ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスに、腫瘍が平均腫瘍体積３２０ｍｍ^３に達した際にＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞（ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ）または非標的化対照ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ２０－ＣＤ１９）を投与した。サイトカイン分泌プロファイルの経時的変化を調べた。これとともに腫瘍および器官（肺、肝臓、脾臓、心臓、結腸、腎臓、卵巣、脳、眼、視神経）の組織病理学的評価を行った。具体的には、以下を試験評価項目とした：ａ）Ｔ細胞投与後３、４、５、７および１４日目の血清サンプル中の、ＭＳＤによって測定されたサイトカイン放出（ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α）、ならびにｂ）Ｔ細胞投与後３、４、７および１４日目の腫瘍および器官（肺、肝臓、脾臓、心臓、結腸、腎臓、卵巣、脳）、ならびに、Ｔ細胞投与後１４日目の眼および視神経の組織病理学的評価。「Ｔ細胞投与５日後」の時点は、早期時点（３日目、４日目）、７日目（過去のｉｎｖｉｖｏ有効性試験でかつて選択）および後期時点（１４日目）の中間として、血液／血清の採取にのみ含んだ。

ＮＯＤＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウスの調達
９６匹の雌８～９週齢ＮＳＧマウスは、英国のＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒから入手した。

腫瘍細胞の接種（試験０日目）
試験開始前に、ＨＴ２９－Ｌｕｃ細胞の上清（３×２００μＬ）を、マウス／ラット病原体の包括的ＰＣＲパネル（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）に関する検査および無菌検査のために提出した。総てのサンプルが陰性判定であった。ＨＴ２９－Ｌｕｃ細胞は、マウスに接種する前に、５％ＣＯ_２、３７℃のインキュベーターにてＭｃＣｏｙ’ｓ、１０％ＦＢＳ培地で２週間、規模拡大を行った。接種前に、ＨＴ２９－Ｌｕｃ細胞を採取し、上清（３×２００μＬ）を、細胞の病原体非存在確認のために、マウス／ラット病原体検査（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）および無菌検査用に回収した。回収したＨＴ２９－Ｌｕｃ細胞を計数し、氷上で、予冷ＰＢＳ：マトリゲル（１：１）に、終濃度がマウス１匹あたり１００μＬ中０．５×１０^６細胞となるように再懸濁させた。合計９５匹のマウスについて、必要な細胞数は以下の通りであった：９５×０．５×１０^６細胞（細胞量／マウス）×２（シリンジデッドボリューム）＝９．５×１０^７細胞。したがって、合計１０×１０^７細胞を２０ｍＬの予冷ＰＢＳ：マトリゲル（１：１）に再懸濁させた。細胞は氷上で維持し、ＩＶＳＤ（８Ｆ、動物用ユニット）に移し、各ＮＳＧマウスの右側腹部に細胞を皮下（ｓ／ｃ）接種した。

Ｔ細胞の投与（試験２３日目）
形質導入後１２日目、Ｔ細胞の凍結前に、ＣＡＲＴ細胞（ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲおよびＣＤ２０－ＣＤ１９）からの上清（３×２００μＬ）を、マウス／ラット病原体の包括的ＰＣＲパネル（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）に関する検査および無菌検査のために提出した。総てのサンプルが陰性判定であった。総ての細胞を形質導入後１２日目に凍結させ、凍結状態（－１５０℃）で維持した。Ｔ細胞投与に必要なバイアル数を予め算出し、以下に記載するように、同日に細胞をＴ細胞投与用に解凍した。

Ｔ細胞投与の当日、ＣＡＲＴ細胞（ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲおよびＣＤ２０－ＣＤ１９）を水浴（３７℃）中で解凍し、冷ＴｅｘＭＡＣＳ培地が入った５０ｍＬのチューブに移し、ピペットで穏やかに吸排出して解凍過程を続けた。冷ＴｅｘＭＡＣＳを各チューブに加えて、最終体積を５０ｍＬとした。細胞を室温にて３００ｘｇで１０分間遠心分離した後、細胞ペレットを冷ＴｅｘＭＡＣＳに再懸濁させた。細胞を室温にて３００ｘｇで１０分間遠心分離した後、温ＴｅｘＭＡＣＳに再懸濁させ、計数した。次に、細胞を室温にて３００ｘｇで１０分間遠心分離し、予冷ＰＢＳに、マウス１匹当たり１００μＬ中に終濃度１×１０^７細胞となるように再懸濁させた。細胞は氷上で維持し、ＨＴ２９－Ｌｕｃ腫瘍担持ＮＳＧマウスに静脈（ｉ．ｖ）注射するためにＩＶＳＤから動物ユニット（８Ｆ）に移した。詳細な計算は以下の通りであった：
・ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９：引き渡し：５．５×１０^８細胞
・９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ：引き渡し：６．４７×１０^８細胞
・ＣＤ２０－ＣＤ１９：引き渡し：６．４×１０^８細胞

研究デザイン
図３９は研究デザインを示す。簡単に述べれば、雌ＮＳＧマウスに試験０日目（ＳＤ０）に、ＨＴ－２９Ｌｕｃを接種した。ＳＤ２３に、マウスにＣＡＲＴ細胞を投与した（腫瘍が約３２０ｍｍ^３に達した際）。血液サンプルは、ＳＤ５、ＳＤ２６、ＳＤ２７、ＳＤ２８、ＳＤ３０およびＳＤ３７に採取した。組織および腫瘍は、ＳＤ２６、ＳＤ２７、ＳＤ３０およびＳＤ３７に採取した。

堅牢な研究デザインの考慮事項
英国ＳＲＦ、試験統計学者、堅牢な試験デザインガイドラインに従い、無作為化と盲検化戦略は以下の通りであった：
無作為化：
動物は到着時に無作為化した。さらに、Ｔ細胞投与の前に、試験統計学者（ＪａｃｋＥｕｅｓｄｅｎ）と相談後、腫瘍体積のばらつきに基づき、正式な無作為化計画に従って動物を治療群に割り付けた。腫瘍が平均体積約３２０ｍｍ^３に達した際に、動物は腫瘍体積のばらつきに従って無作為化した（無作為化決定のための時間を考慮して、Ｔ細胞投与の１日前の腫瘍測定に基づく）。具体的には、各ケージについて平均ｌｏｇ１０腫瘍体積を算出し、ケージを腫瘍体積「低」（全体の中央値以下）または腫瘍体積「高」（全体の中央値より高い）の２ブロックに分けた。ＪＭＰｖ１４を用いて、２つの治療因子（日および治療）を含む無作為化完全ブロック計画を実施した。無作為化は１２倍の全群（異なる治療および異なるエンドポイント／採血／腫瘍採取）に対して実施した。さらに、ｅｘｖｉｖｏＭＳＤ測定も無作為化の対象とした。
盲検化：
試験担当者は試験中盲検化されていた。特に、細胞の投与量と治療はＩＶＳＤに対して盲検化され、科学者は投与用のＴ細胞の調製を補助した。また、ＭＳＤおよび組織病理学的測定も盲検化した。

腫瘍細胞の接種（試験０日目）
ｓ／ｃ腫瘍移植はクラスＩＩの無菌キャビネット内で行った。使用する器具は総て使用前に滅菌した。動物はチャンバー内でイソフルラン－酸素混合物により短時間麻酔し、フェイスコーンに移した。右側腹部を剃毛した後、アルコール布で拭いた。細胞をＰＢＳに再懸濁させた後、氷上でマトリゲルとよく混合した（１：１のＰＢＳ／細胞：マトリゲル）。マウス１匹あたり、細胞を含んだマトリゲルとＰＢＳ溶液の総量１００μＬをｓ／ｃ注射した。動物は回復エリアに移動し、完全に回復するまで監視した後、ホームケージに戻し、監視した。

Ｔ細胞の投与（試験２３日目）
腫瘍が平均体積３２０ｍｍ^３に達した際に、ＣＡＲＴ細胞を尾静脈注射によりマウス１匹当たり１×１０^７細胞の用量で投与した。静脈内（ｉ．ｖ．）投与の療法は、クラスＩＩ無菌キャビネットで行った。

腫瘍測定、試験プランおよび個々のエンドポイント
総てのマウスで腫瘍サイズをノギス測定により測定し、週に３回記録した。総てのマウスの体重を試験の２１日前（マウス配送７日目）から開始して測定した。試験１６日前の体重測定後、その後の測定は総て２日間隔で記録した。腫瘍体積は以下に示すようにエクセルで算出した：
腫瘍体積＝腫瘍長＊（腫瘍幅＾２）＊０．５
本試験では、個々のエンドポイント（Ｔ細胞投与後３、４、７および１４日目）が設定された。

採血
低体重のためマウス＃４３（エンドポイント「３日目」、群：９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ）を除き、総てのマウスからの血液サンプルは、試験５日目（Ｔ細胞投与の２３日前）に採取した。その後の採血は、上記のように正式な無作為化計画に基づきケージＩＤに応じたマウスに、試験２６、２７、２８、３０および３７日目（それぞれＴ細胞投与後３、４、５、７および１４日目）に行った。注目すべきは、総ての時点において総てのＣＡＲＴ群から血液サンプルが採取されたことである。マウス１匹あたり約１００μＬの血液を、１サンプルあたり５μＬの損失血液を追加して採取した。血清サンプルについては、全血をＳｅｒｕｍＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブに採取し、室温（ＲＴ）で最低３０分間凝固させた。血液が凝固したら、１４８４０×ｇで３分間遠心分離し、血清をマイクロチューブに移した。血清はＭＳＤアッセイに使用するまで－８０℃で凍結した。ライセンスによると、２８回転日以内にマウス１匹あたり採取される最大血液量はマウスの体重の１０％である。

血清サイトカインアッセイＭＳＤ
１０プレックスプレートを用いたＭＳＤアッセイを製造者の指示に従って行った。

試薬およびサンプル調製：
凍結マウス血清サンプル、市販のマウス血清およびＶ－ＰＬＥＸ希釈剤を解凍し、室温で平衡化した。アッセイキャリブレーターは製造者の指示に従って再構成した。総ての試薬と抗体は、実験中に使用しない時は氷上で維持した。

キャリブレーターおよびサンプルの希釈：
ＭＳＤキットに付属のキャリブレーター１を１ｍＬの希釈液２に再懸濁させ、３回転倒させ、室温で１５分間平衡化した後、短いパルスで短時間、ボルテックスで撹拌した。サイトカイン標準検量線を作成するための連続希釈では、３００μＬの再構成キャリブレーター１溶液を新しいエッペンドルフチューブに移すことにより、最高のキャリブレーター１濃度を作成した。次に、１００μＬの最高のキャリブレーターを３００μＬの希釈液２に移し、ボルテックスでよく混合することにより、次のキャリブレーター希釈液を作製した。この４倍連続希釈をさらに５回行い、７種類のキャリブレーターを作製した。８本目のバイアルには希釈液２のみを入れた。回収を確認するため、追加の検量線セット（血清標準）として市販のマウス血清を含み、検量線希釈液は、上記（４倍連続希釈）と同様に、２０％の市販のマウス血清を含む希釈液２で調製した。最終バイアル（８本目）は、希釈液２に２０％のマウス血清のみを含んだ。サンプル希釈については、総てのマウス血清サンプルは、２５μＬの血清を１００μＬの希釈液２に加え（５分の１希釈）、適切に混合することにより調製した。検出抗体溶液の調製については、ＭＳＤは各検出抗体を５０倍の原液として別々に提供した。作用溶液は１倍とした。次に、検出抗体溶液は使用直前に検出し、各抗体６０μＬ（合計１０）を合わせ、２．４０ｍＬの希釈液３に加えた。リードバッファーの調製については、ＭＳＤはリードバッファーＴを４倍の原液として提供した。作用溶液は２倍とした。プレート１枚あたり、１０ｍＬのリードバッファーＴ（４倍）と１０ｍＬの脱イオン水を合わせる。

アッセイプロトコール：
プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄した。５０μＬのキャリブレーターまたは調製血清サンプルをプレートレイアウトに従って各ウェルに加えた。次に、プレートを室温で、７５０ｒｐｍで振盪しながら２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄した後、検出抗体溶液（２５μＬ／ウェル）を加え、プレートを室温で、７５０ｒｐｍで振盪しながら２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、１５０μＬの２倍リードバッファーＴを各ウェルに加えた後、プレートをすぐにＭＳＤＳｅｃｔｏｒ６００イメージャーで読み取った。

腫瘍成長
腫瘍体積データ（ｍｍ^３）は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍでプロットした。一元配置分散分析をテューキーの多重比較検定とともに用いて、個々の時点のＣＡＲＴ群を比較した。二元配置分散分析をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較とともに用いて、エンドポイント「Ｔ細胞投与後１４日目」についてＣＡＲＴ群を経時的に比較した。

血清サイトカインアッセイ
ＭＳＤの生データは、Ｒバージョン３．６．１のｌｍｅ４パッケージに実装された線形混合モデルを用いて、研究統計学者によって分析された。各サイトカインは別々にモデル化された。全データセットはｅＬＮＢ：Ｎ７４７６６－９に見出すことができる。サイトカイン放出をｌｏｇ１０に変換し、均等分散性を確保した。ＣＡＲＴ群と時間（およびそれらの相互作用）には固定効果を用いた。時間は自由度４（ＡＩＣにより決定）の自然スプラインを用いてモデル化した。プレートとマウスにはランダムな切片を用い、各マウスにはランダムな勾配を用いた。構成要素／時点間の限界平均値を比較するために線形対比を用い、定量下限値未満の値を扱うために１，０００回の反復による多重置換を用い、適切な自由度補正を行った(Barnard and Rubin, 1999)。

結果
ＳＤ０に、雌ＮＳＧマウスに大腸癌細胞株ＨＴ－２９Ｌｕｃ（０．５×１０６細胞／マウス）を接種した。腫瘍が約３２０ｍｍ３に達した際（ＳＤ２３）に、マウスにＣＡＲＴ細胞（ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲまたはＣＤ２０－ＣＤ１９）；（１×１０^７細胞／マウス）を投与した。低体重のためマウス＃４３（エンドポイント「３日目」、群：９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ）を除き、総てのマウスからＳＤ５（Ｔ細胞投与の２３日前）に血清サンプルを得た。次に、Ｔ細胞投与後の以下の日数：３、４、５、７および１４日（それぞれＳＤ２６、ＳＤ２７、ＳＤ２８、ＳＤ３０およびＳＤ３７）に、対応するケージ(無作為化計画に基づく)から血清サンプルを採取した。３、４、７および１４日の時点がエンドポイントであり、その後の血清単離のための採血は、安楽死前に使用した。エンドポイント「１４日目」のマウスは、「５日目」時点の採血にも使用した。総ての個々のエンドポイントについて、腫瘍および組織（肺、肝臓、脾臓、心臓、結腸、腎臓、卵巣、脳）を採取し、組織病理学的評価のために提出した。エンドポイント「１４日目」には、具体的には、眼および視神経も同様に採取した。

ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲまたはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与したＣＤＸマウスモデルにおける経時的なサイトカイン放出
正式な無作為化計画に従って、ＭＳＤ１０プレックスアッセイを用いて、全時点の全マウスからの血清サンプルを、その後３ラウンド測定した。ラウンドごとのばらつきを回避し、堅牢な試験デザイン原則を遵守するため、ＭＳＤアッセイ用の無作為化プレートレイアウトには、総ての時点からのサンプルを含んだ。ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α分泌に関するいくつかの重要な観察結果（図３５）を以下に要約する。
ＩＦＮγ：
・９０２＿００７－ＬＮＧＦＲは、３日、４日、５日および７日の時点でＣＤ２０－ＣＤ１９対照群に比べてベースラインから有意に異なった（総てに関してｐ＜０．０００１）（図３５Ａ～図３５Ｂ）。
・ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、３日、４日、５日および７日の時点でＣＤ２０－ＣＤ１９対照群に比べてベースラインから有意に異なった（総てに関してｐ＜０．０００１）（図３５Ａ～図３５Ｂ）。
・３日、４日、５日および７日の時点に比べて９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ群の１４日目には統計的に有意な低下があった（３日目と１４日目のｐ＝０．００７９以外、総てに関してｐ＜０．０００１）（図３５Ａ～図３５Ｂ）。
・３日、４日、５日および７日の時点に比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９群の１４日目には統計的に有意な低下があった（総てに関してｐ＜０．０００１）（図３５Ａ～図３５Ｂ）。
・９０２＿００７－ＬＮＧＦＲおよびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９群は異なる動態を有すると思われ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９群には３日目から、より初期からの増加傾向が見られる（図３５Ａ）。
・７日目に、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ群およびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９群の両方に分泌「ピーク」が観察できる（図３５Ｂ）。

ＩＬ－２：
・９０２＿００７－ＬＮＧＦＲは、４日（ｐ＝０．０３３１）および５日の時点（ｐ＝０．００９８）でＣＤ２０－ＣＤ１９対照群に比べてベースラインから有意に異なった（図３５Ｃ～図３５Ｄ）。
・ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、４日（ｐ＝０．００２２）および５日の時点（ｐ＝０．００３１）でＣＤ２０－ＣＤ１９対照群に比べてベースラインから有意に異なった（図３５Ｃ～図３５Ｄ）。
・４日（ｐ＝０．５８２）および５日の時点（ｐ＝０．８８６２）に比べて９０２＿００７－ＬＮＧＦＲの１４日目には統計的に有意な低下はなかった（図３５Ｃ～図３５Ｄ）。
・４日（ｐ＝０．０９６３）および５日の時点（ｐ＝０．０５１８）に比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の１４日目には統計的に有意な低下はなかった（図３５Ｃ～図３５Ｄ）。

ＴＮＦ－α
・９０２＿００７－ＬＮＧＦＲは、４日（ｐ＝０．０３７７）、５日（ｐ＝０．００９４）および７日（ｐ＝０．０２９１）の時点でＣＤ２０－ＣＤ１９対照群に比べてベースラインから有意に異なった（図３５Ｅ～図３５Ｆ）。
・ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、３日（ｐ＝０．００３）、４日（ｐ＜０．０００１）、５日（ｐ＜０．０００１）および７日（ｐ＝０．０１２６）の時点でＣＤ２０－ＣＤ１９対照群に比べてベースラインから有意に異なった（図３５Ｅ～図３５Ｆ）。
・７日目に比べて９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ群の１４日目には統計的に有意な低下があった（ｐ＝０．０３１７）（図３５Ｅ～図３５Ｆ）。
・３日目（ｐ＝０．００１１）、４日目（ｐ＜０．０００１）、５日目（ｐ＜０．０００１）および７日目（ｐ＝０．０００２）に比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９群の１４日目では統計的に有意な低下があった（図３５Ｅ～図３５Ｆ）。

全体として、Ｔ細胞投与後に総てのサイトカインに関してＣＤ２０－ＣＤ１９対照群に比べて９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ群およびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９群の両方でサイトカイン分泌の増加が見られた（図３６）。総てのサイトカインについて、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の１４日目にサイトカイン分泌の低下が見られることは特筆に値する（図３６）。

ＣＤＸマウスモデルにおける腫瘍成長に対する９０２＿００７－ＬＮＧＦＲおよびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の影響
本研究で使用する前に、両ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞（９０２＿００７－ＬＮＧＦＲまたはＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９）をｉｎｖｉｔｒｏでＱＣ検査した。簡単に述べれば、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲまたはＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の機能活性をＭＳＤにより測定されるサイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－α）放出により評価した。具体的には、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ細胞、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９細胞、ＣＤ２０－ＣＤ１９細胞または非形質導入（「ＵＴ」）細胞をＨＴ－２９Ｌｕｃ細胞を含む大腸癌細胞株パネルと約２２時間共培養した。このパネルは、ＣＬＤＮ３標的（ＨＴ－２９Ｌｕｃ、ＲＫＯＫＯヒトＣＬＤＮ３）を発現する癌細胞株およびＣＬＤＮ３発現が低い／存在しないＲＫＯＫＯ細胞株を含むように選択した。全体として、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞はｉｎｖｉｖｏの前にＱＣを無事通過し、予想通り、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞はＣＬＤＮ３発現大腸腫瘍細胞に応答してＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦ－αを分泌することが示された。

機能評価は、マウスＣＬＤＮ３に対する９０２＿００７－ＬＮＧＦＲとＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の交差反応性を示した。９０２＿００７－ＬＮＧＦＲおよびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、ヒトＣＬＤＮ３に対して同等レベルの細胞傷害性を示した（同等の速度で低下する細胞面積により示される）。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９もまたマウスＣＬＤＮ３標的細胞に応答してサイトカインを分泌し、マウスＣＬＤＮ３細胞株を部分的に殺傷した（対照に比べての細胞面積の減少およびアッセイの終了時の画像における生細胞と死細胞の混合物により示される）。マウスＣＬＤＮ３に対するＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の殺傷応答は、マウスＣＬＤＮ３に対する９０２＿００７－ＬＮＧＦＲの応答よりも有意に低かった。マウスＣＬＤＮ３とヒトＣＬＤＮ３に対する９０２＿００７－ＬＮＧＦＲの応答を比較した場合、マウスＣＬＤＮ３と９０２＿００７－ＬＮＧＦＲの共培養における死細胞面積のパーセンテージは低かった。

エンドポイント「１４日目」のマウス群の腫瘍成長速度を評価した（図３７）。ＳＤ３５（Ｔ細胞投与１２日後）に、ＣＤ２０－ＣＤ１９を投与したマウスに比べてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９を投与したマウスで腫瘍体積の統計的に有意な減少が見られ（ｐ＜０．０１）、効果はエンドポイント（ＳＤ３７；Ｔ細胞投与１４日後）まで延長された（ｐ＜０．０００１）。当然のことながら、このような比較を可能とするために、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびＣＤ２０－ＣＤ１９の形質導入効率（Ｔ．Ｅ．）は、マウスに投与する前の６３％に対して正規化した。全体として、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、劇的な腫瘍体積の減少を示す強力な抗腫瘍効果を有した。

他方、ＳＤ３３に始まる９０２＿００７－ＬＮＧＦＲによる腫瘍成長抑制傾向があったが、他のＣＡＲＴ群と比較した場合に統計的に有意な差はなかった（図３７）。このことは、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲはｉｎｖｉｖｏで積極的に腫瘍成長を抑制し、サイトカイン分泌プロファイルを考慮すると、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲはこの腫瘍モデルにおいて有効であったと思われる。９０２＿００７－ＬＮＧＦＲは、他のＣＡＲ分子と比較してＴ．Ｅ．が低かったことに注目すべきである。具体的には、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ細胞はＣＤ２０－ＣＤ１９およびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９と比較してＴ．Ｅ．がほぼ半分であった。９０２＿００７－ＬＮＧＦＲはマウスに投与する前に正規化されていなかった。したがって、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲと他のＣＡＲＴ群との間の腫瘍成長の影響の違いに関して、仮定または結論を下すことはできない。注目すべきは、本試験は、標準的な有効性試験ではなく、定義されたエンドポイントがあるため、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞で処置した腫瘍の腫瘍成長動態を比較または評価することを目的としていなかったことである。

最後に、エンドポイント「４日目」または「７日目」において、ＣＤ２０－ＣＤ１９を投与したマウスとＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９または９０２＿００７－ＬＮＧＦＲを投与したマウスでは、腫瘍体積に統計学的に有意な差がなかったことを述べておく（図３８）。

９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９またはＣＤ２０－ＣＤ１９を投与したＣＤＸマウスモデルにおける毒性評価
９０２＿００７－ＬＮＧＦＲまたはＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の毒性を、ＨＴ－２９Ｌｕｃヒト大腸癌のＮＳＧマウスモデルで２週間にわたって調べた。腫瘍を含む選択組織を顕微鏡により調べた。組織病理学的評価は、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞が腫瘍に強固に会合した後、血液循環中に放出される可能性のある高循環レベルの炎症誘発性サイトカインが、おそらくは正常組織の上皮の密着結合を破壊してＣＬＤＮ３の露出に至ることにより、その後のｏｎ－ｔａｒｇｅｔ－ｏｆｆ－ｔｕｍｏｕｒ毒性を誘導する可能性があるかどうかを決定することを目的とした調査の一部であった。

９０２＿００７－ＬＮＧＦＲもＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９も、マウスＣＬＤＮ３を発現する正常な非炎症（固有炎症も誘導炎症もない）組織、すなわち、肺、肝臓、脾臓、心臓、結腸、腎臓、卵巣および脳で毒性を生じず、蓄積もされなかった。しかしながら、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ産物は両方とも、ヒトＣＬＤＮ３陽性大腸癌腫瘍をアブレーションした。

腫瘍組織におけるＣＬＤＮ３の不適切な局在により、この標的は選択的腫瘍細胞殺傷のためのＣＡＲＴ細胞療法にとって接近可能となる。他方、炎症（すなわち、サイトカイン放出の増加）による組織損傷は、健常組織におけるＣＬＤＮ３の露出または／および密着結合の喪失をもたらし、それはＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞にとって接近可能となるために潜在的リスクを有する。ＴＪおよび上皮透過性に及ぼすＩＦＮγおよびＴＮＦ－αなどの炎症誘発性サイトカインの影響は記載されている(Coyne et al., 2002; Prasad et al., 2005; Capaldo and Nusrat 2009)。

ＣＬＤＮ３が局在することが知られている正常組織にＣＡＲＴ細胞関連の影響はないことが、ＮＳＧマウスを用いた以前のｉｎｖｉｖｏ試験で報告された。このような所見は有望であるが、ヒトの臨床的安全性に関しては決定的なものではない。したがって、強固な腫瘍会合の後、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞によって高レベルの炎症誘発性サイトカインが血液循環中に放出されるかどうかを評価するために、ｉｎｖｉｖｏでの調査が必要であった。さらに、このようなサイトカイン分泌が、正常組織の上皮の密着結合を破壊してＣＬＤＮ３の露出に至ることによって、その後のｏｎ－ｔａｒｇｅｔ－ｏｆｆ－ｔｕｍｏｕｒ毒性を誘導する可能性があるかどうかを評価した。ＨＴ－２９Ｌｕｃ腫瘍モデルとＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞（様々な構築物）を用いたこれまでのｉｎｖｉｖｏ有効性試験では、Ｔ細胞投与前（ベースライン）とＴ細胞投与７日後のサイトカイン分泌を評価した。非標的対照ＣＡＲＴ細胞を投与したマウスと比較して、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞を投与したマウスでは、ベースラインと比較してＴ細胞投与７日後にＩＦＮγ分泌の増加が報告された。それにもかかわらず、Ｔ細胞投与７日後にＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞を投与したマウスでは、非標的対照ＣＡＲＴ細胞を投与したマウスに比べて、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－２の分泌がベースラインと比較して最小または無視できる程度であることが観察された。このような所見は、ｉｎｖｉｖｏにおけるＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞の有効性に関する重要な証拠となったが、サイトカインの分泌動態については未解明であった。また、正常組織と腫瘍の組織病理学的評価は、前述の研究ではエンドポイントでのみ行われた。同様に、潜在的なｏｎ－ｔａｒｇｅｔ－ｏｆｆ－ｔｕｍｏｕｒ毒性を評価するための「窓」が、これらの研究のエンドポイントまでに完了した組織の回復の速さのために見逃された可能性もある。そこで、サイトカイン分泌のピークに近い時点で毒性を評価することにした。このため、サイトカイン分泌の動態と、サイトカイン分泌が上昇した状態でのＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ／腫瘍細胞の会合効果の結果としての潜在的毒性の両方を、高頻度の時点で調査した。

この方向に向けて、ＨＴ－２９Ｌｕｃ腫瘍を担持するＮＳＧマウスの確立された腫瘍に、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞（ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９もしくは９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ）または非標的対照ＣＡＲＴ細胞（ＣＤ２０－ＣＤ１９）を投与した。注目すべきは、Ｔ細胞の用量はこれまでのｉｎｖｉｖｏ有効性試験と同じままであるということである。高いサイトカイン分泌レベルを誘発するためにｉｎｖｉｖｏモデルを「引き伸ばす」ために、Ｔ細胞投与時の腫瘍体積は以前のｉｎｖｉｖｏ有効性試験と比較して大きくした。ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ群はいずれもＩＦＮγの分泌「ピーク」を示した。より早い時点（３日目、４日目または５日目）と７日目の間に統計学的に有意な差はないが、分泌「ピーク」はここでは厳密には定義されていない。３日目、４日目、５日目および７日目の時点と比較して、１４日目にＩＦＮγ分泌が統計学的に有意に低下したことは注目に値する。さらに、７日目は、１４日目に低下する前にＩＦＮγ分泌レベルが有意に高くなる最後の時点と見ることができる。このことを考慮すると、ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞投与後７日目に、ＩＦＮγ放出がｉｎｖｉｖｏにおいて系として最大レベルに達し、「ピーク到達」したことが示唆される。投与後７日目は、再発または難治性のマントル細胞リンパ腫患者における抗ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞療法であるＫＴＥ－Ｘ１９の分泌「ピーク」であることも報告されている(Wang et al., 2020)。

注目すべきは、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９のＩＦＮγ分泌レベルが早い時点（３日目）から上昇し、７日目までそのようなプロファイルを維持していたことである。しかしながら、Ｔ細胞投与７日後の腫瘍成長に対する影響は、総てのＣＡＲＴ群間で差がなかった。対照的に、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は投与１２日後にｉｎｖｉｖｏでの腫瘍体積を有意に減少させた。このことは、ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ／腫瘍細胞の会合後のサイトカイン分泌が、ｉｎｖｉｖｏでの腫瘍成長抑制に先行することを示唆している。

重要なことは、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９と９０２＿００７－ＬＮＧＦＲは、本試験において、マウスＣＬＤＮ３を発現する正常な非炎症（固有炎症も誘導炎症もない）組織、すなわち、肺、肝臓、脾臓、心臓、結腸、腎臓、卵巣および脳において毒性も蓄積も示さなかったことである。

組織病理学的結果は、ノギスによる腫瘍成長測定から得られた結論を補完するものであり、ノギス測定は組織病理学的検査と比較して感度がやや低く、腫瘍はアブレーションの際にすぐには崩壊しないため開始が遅い可能性があることは言及に値する。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は腫瘍の成長を効率的に抑制し、これはＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９がヒトＣＬＤＮ３陽性大腸癌腫瘍をアブレーションしたことを示した組織病理学的結果と一致していた。しかしながら、組織病理学的結果から、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲは腫瘍成長を抑制する効力／能力を有していたと結論づけることができたが、ノギス測定（本研究の主要目的ではない）からこれを明らかにするには、本研究は早すぎる時期に終了した。９０２＿００７－ＬＮＧＦＲは、ＣＤ２０－ＣＤ１９およびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９と比較して、今回のｉｎｖｉｖｏ試験でＴ．Ｅ．がほぼ半分であったことが強調されるべきである。したがって、９０２＿００７－ＬＮＧＦＲが腫瘍成長に影響を与えるには、もう少し時間が必要である。

結論として、本研究は、ｉｎｖｉｖｏにおけるＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９または９０２＿００７－ＬＮＧＦＲ／腫瘍細胞の会合によって誘導されるサイトカイン分泌の増加は、マウスＣＬＤＮ３を発現する正常な非炎症（固有炎症も誘導炎症もない）組織において毒性も蓄積も引き起こさないことを示した。

実施例１１：ｉｎｖｉｖｏ研究におけるアブレーション
ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性、機能および持続性をリプログラミングする合成抗原受容体である。「ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９」は、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインおよび４－１ＢＢ共刺激ドメインとともにヒト化ｓｃＦｖから構成されるＣＬＤＮ３抗原を特異的に標的とするヒト化ＣＡＲ－Ｔ細胞である。

ＣＬＤＮ３は、腫瘍では密着結合（ＴＪ）の外側に不適切に局在するが、健常組織では局在しないことが報告されており(Corsini et al., 2018)、この機構により、ＣＬＤＮ３は、密着結合に隠れている正常細胞を温存しながら腫瘍細胞を選択的に殺傷するＣＡＲ－Ｔ細胞の標的となり得る。しかしながら、ＣＬＤＮ３はｏｎ－ｔａｒｇｅｔｏｆｆ－ｔｕｍｏｕｒ毒性のリスクを伴う可能性がある。この潜在的リスクを抑制するため、長期的に不適切に活性化されたＣＡＲＴ細胞の標的化された枯渇を可能とする「アブレーション技術」が検討されている。これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ２０共発現と抗ＣＤ２０抗体の適用によって達成される。

本研究の目的は、抗ＣＤ２０ｍＡｂであるリツキシマブの投与により、ｉｎｖｉｖｏでＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９（ＣＤ２０共発現ＣＡＲ）Ｔ細胞がアブレーションされる原理の証明を提供することであった。ｍＡｂ投与後のＣＡＲＴ細胞の存在は、ｄｄＰＣＲ、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）により、血液および組織（脾臓、骨髄、肺および肝臓）において調査された。

リツキシマブ（リツキサン、本報告ではＲＴＸと略記）はマウス－ヒトキメラ抗ＣＤ２０ｍＡｂであり、Ｂ細胞リンパ腫の治療薬としてＦＤＡに承認されている。ヒトにおけるＲＴＸの作用機序（ＭｏＡ）は、主にマクロファージとナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を介する(Marshall et al., 2017)。マウスでは、骨髄腫、特にマクロファージによって媒介されると考えられているが、他の報告ではＮＫ細胞の不可欠な影響が示されている（Marshall et al., 2017による総説およびその中の参考文献, Uchida 2004, Shiokawa et al., 2010）。本研究では、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞を欠くＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス系統を用いた。しかしながら、この系統はマウスマクロファージを介した貪食細胞エフェクター機能を保持しており、ヒトＩＬ３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＳＣＦをトランスジェニック的に発現させ、マウスマクロファージの存在を増加させることが示された(Nicolini et al., 2004)。さらに、ＮＫ細胞および単球を含むヒトＰＢＭＣ（ｈＰＢＭＣ）をこれらのマウスに注射した。このシステムは、ＲＴＸの抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）機構の使用を容易にする。補体系を介した直接的な細胞死と補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）は、マウスの設定においてＲＴＸＭｏＡにはむしろ無視できるものであり、後者は設定によって有利にも不利にもなると主張された(Marshall et al., 2017)。使用されたマウスモデルは原理証明に適していることがわかったが、どのマウスモデルでもそうであるように、患者への翻訳可能性には限界がある。本研究では、以下のパラメーターを評価した：
１）最終血液サンプルにおいてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞の数を評価するためのフローサイトメトリー分析。
２）試験経過（試験前、２４時間後、７２時間後および終了時）の血液ならびに終了時点の組織（骨髄、肝臓、肺、脾臓）におけるＤＮＡへのＨＩＶベクターの組込みを測定することで、マウスの血液中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞の存在を評価するためのｄｄＰＣＲ解析。
４）最終時点の組織（骨髄、肝臓、肺、脾臓）における、ＣＤ３＋Ｔ細胞の一般的な会合および分布、ＲＴＸ標的細胞としてのＣＤ２０発現を、およびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ベクターＲＮＡ発現としてのＷＰＲＥ－０４を同定するため免疫組織化学的（ＩＨＣ）およびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）解析。
５）最終血液での血清ＲＴＸ濃度を評価するための生体分析。これは、ＲＴＸの適用の奏功を確認し、このモデル内でＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞のアブレーションがなかった場合の潜在的な説明として最終レベルを評価するためである。免疫不全マウス株はｍＡｂクリアランスがより高いことが報告されているため、これは特に関連性がある(Oldham et al., 2020)。
６）最終時点でのこの新しいＮＳＧ－ＳＧＭ３マウス系統の正常な健康組織に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の潜在的な毒性をさらに理解するための、組織（心臓、結腸、腎臓、脳、卵巣、肺、肝臓、脾臓）の組織病理学的分析。

具体的な主張はしていないが、本研究は、この種の研究で受け入れられている科学的慣行に従って実施した。

材料および方法
マウス系統：
ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊｌＴｇ（ＣＭＶＩＬ３，ＣＳＦ２，ＫＩＴＬＧ）１Ｅａｖ／ＭｌｏｙＳｚＪ（略号：ＮＳＧ－ＳＧＭ３）、１０～１２週齢雌。入荷時、マウスを１０日間馴化させた。

無作為化：
マウスは試験開始前に体重を測定し、体重に基づいて処置群（Ａ～Ｄ）および最終サンプル採取日に無作為に割り付けた。

サンプルサイズは、統計学者の推奨に基づき、各群１０匹、１ケージ５匹で２ケージとした。

試験日前目：
同じドナーからのｈＰＢＭＣおよびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴｅｘＭＡＣＳ培地中で解凍し、計数し、１：１の割合で混合し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、投与のために無菌ＰＢＳで調製した。Ｔ細胞用量はＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞を用いた以前のｉｎｖｉｖｏ有効性試験に基づき、ｈＰＢＭＣ用量は所内試験に基づいた。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９構築物の形質導入効率（ＴＥ）は、注射前に３７．８％と測定され、３２．４％のＣＤ２０＋細胞が検出された（Ｎ７４５４６－５）。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞産物のベクターコピー数（ＶＣＮ）は、１細胞あたり０．９３コピーであった。上記の表１２のレジメンに従い、１×１０^７のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞または１×１０^７のｈＰＢＭＣまたは１×１０^７のＴ細胞＋１×１０^７のｈＰＢＭＣを２００μＬのＰＢＳ中、マウスに尾静脈を介して（ｉ．ｖ．）注射した。細胞懸濁液は、細胞がシリンジ内で沈殿しないように、処置の間、穏やかに撹拌した。残った細胞は、ＴＥ、ＣＤ２０発現を確認し、細胞組成を評価するため、フローサイトメトリー分析に使用した。

試験０日目：
最終抗体濃度を朝に新たに調製し、上記表１２のレジメンに従い、１００μＬ中マウス１匹当たり２５０μｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）経路で投与した。ＲＴＸ用量は、文献(Bonifant et al., 2016 and Valton et al., 2018)および当該分野の専門家の助言に基づいた。アイソタイプ対照として、抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ｍＡｂシナジスを使用した。これは、ＲＳＶ疾患のリスクが高い小児における呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による入院を要する重篤な下気道疾患の予防治療薬としてＦＤＡに承認されている。シナジス用量はＲＴＸ用量に基づき、マウスモデルでは以前、毒性が報告されることなく同等以上の用量が使用されていた(Mejias et al., 2004)。ビヒクル対照として５％ブドウ糖を使用した。

サンプル採取：
サンプル採取時点は、文献および専門家の推奨に基づく(Tasian et al., 2017, Bonifant et al., 2016, Valton et al., 2018, 当該分野の専門家とのコミュニケーション）。生存中に、ｍＡｂ投与前（ｐｒｅ－ｍＡｂ）のＤ０と、ｍＡｂまたはアイソタイプまたはビヒクルの投与後２４時間および７２時間に、ＰＣＲ分析のために各マウスから６５μＬの血液を採取した。採血のため、動物を無菌移送容器に入れ、尾の出血前に約１０分間、周囲温度３９℃の加温キャビネットで加温した。最終のサンプル採取は、実行可能性と高いサンプル品質を確保するために、２つの最終日（それぞれ、ｍＡｂ後７日と８日）にずらした。各最終サンプル採取日に、各群５匹のマウスを人道的に殺し、サンプルを採取した。１日１群あたり犠死させるマウスは、上述のように試験開始前に無作為化した。

各マウスをイソフルランで深麻酔し、フローサイトメトリー、ＰＣＲおよび血清ＲＴＸ濃度アッセイのために心臓穿刺で最終血液を採取した。マウスは頚椎脱臼により安楽死させ、心臓摘出による循環停止で死亡を確認した。一部の特筆される場合では、最終採血中に血液が固化した。このため、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９および無ｍＡｂ対照群では、１匹のマウスの血清サンプルが得られなかった。

その後、ＰＣＲおよび組織検査のために、骨髄、脾臓、肝臓および肺を採取した。さらに、マウス系統の一般的組織病理学的評価のために、心臓、結腸、腎臓、脳および卵巣を採取した。

盲検化：
主要および二次評価項目の評価と解析は完全に盲検化した。本研究における主要評価項目および二次評価項目は、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびＣＤ２０細胞の検出のためのｄｄＰＣＲ、フローサイトメトリー、およびＩＨＣ、ＩＳＨであった。三次評価項目は、ＲＴＸ濃度と一般的な病理組織学的評価であった。

フローサイトメトリー分析
接種前接種物のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびヒトＰＢＭＣ組成の特性評価
抗体染色用９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレートに１～２×１０^５細胞／ウェルを加えた。まず、プレートを５分間遠心分離（３００×ｇ）してサンプルを洗浄し、上清を廃棄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。遠心分離を繰り返し、上清を破棄した。次に、サンプルを１００μＬのＦｃブロッカーに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。その後、１００μＬのＦＡＣＳバッファーを加えてサンプルを洗浄し、次いで５分間遠心分離して上清を廃棄した。次に、サンプルを１００μＬの抗ｆ（ａｂ’）２－ビオチンで染色し、暗所４℃で３０分間インキュベートした。この後、２回の洗浄（まず１００μＬのＦＡＣＳバッファーを加え、５分間遠心分離し、上清を廃棄する）を行い、次に、２００μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄を繰り返した。次に、サンプルを１００μＬの抗体カクテル（ｈＰＢＭＣ特異抗体およびストレプトアビジン－ＡＰＣ二次抗体を含む）で染色し、暗所４℃で３０分間インキュベートした。上記のようにさらに２回洗浄を行った後、サンプルを、ＤＡＰＩを含む１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。暗所、室温で１０分間インキュベートした後、ＢＤＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡＸ－２０フローサイトメーターでサンプルを取得した。

補正対照の調製：
補正対照はＵＬＴＲＡＣＯＭＰＥＢＥＡＤＳを用いて調製した。簡単に説明すると、ＵＬＴＲＡＣＯＭＰＥＢＥＡＤＳを９６ウェルＶ底プレートのウェルに１滴加え、原液濃度の各抗体コンジュゲートを０．５μＬ加えた。抗ｆ（ａｂ’２）－ビオチン＋ストレプトアビジン－ＡＰＣ補正対照では、０．５μＬの各試薬をビーズに加えた。ＤＡＰ補正対照では、１００μＬの細胞をプレーティングし、原液濃度の０．５μＬのＤＡＰＩを加えた。室温、暗所で１５分間インキュベートした後、ＢＤＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡＸ－２０で補正対照を取得し、補正マトリックスを算出した後に血液サンプルを取得した。

マウス最終血液におけるＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびヒトＰＢＭＣの特性評価および計数（フローサイトメトリー）
ＲＢＣの溶解：
ＲＢＣ溶解液は、製造者の仕様書に従って調製した。マウス全血を受け取った際に、ＥＤＴＡを含むバキュテイナーから１０ｍＬのＲＢＣ溶解液を含む１５ｍＬファルコンチューブにマウス１匹あたり約４００μＬの血液を移した。サンプルを短時間ボルテックスで撹拌した後に、室温で１０分間インキュベートした。その後、サンプルを７分間遠心分離（３００×ｇ）し、上清を注意深く除去した。次に、サンプルをさらに１～５ｍＬのＲＢＣ溶解液に再懸濁させ、さらに５分間インキュベートして、残存するＲＢＣを溶解した。この後、５ｍＬのＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ＋２％ＦＢＳ（ＨＩ）＋０．０５％アジ化ナトリウム＋２ｍＭＥＤＴＡ）を加えた後、サンプルを５分間遠心分離した。上清を除去した後、サンプルを残りの上清に再懸濁させ（約１００～２００ｍＬがチューブに残る）、次いで、抗体染色のため９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレートに移した。

抗体染色：
抗体染色の準備として、まずプレートを５分間遠心分離（３００×ｇ）してサンプルを洗浄し、上清を廃棄し、２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。遠心分離を繰り返し、上清を廃棄した。次に、サンプルを１００μＬのＦｃブロッカーに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。その後、１００μＬのＦＡＣＳバッファーを加えてサンプルを洗浄した後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。次に、サンプルを１００μＬの抗ｆ（ａｂ’）２－ビオチンで染色し、暗所４℃で３０分間インキュベートした。この後、２回の洗浄（まず１００μＬのＦＡＣＳバッファーを加え、５分間遠心分離し、上清を廃棄する）を行い、次に、２００μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄を繰り返した。次に、サンプルを１００μＬの抗体カクテル（ｈＰＢＭＣ特異抗体およびストレプトアビジン－ＡＰＣ二次抗体を含む）で染色し、暗所４℃で３０分間インキュベートした。上記のようにさらに２回洗浄を行った後、サンプルを、ＤＡＰＩを含む１００～２００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。さらに、１０μＬのＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴビーズを各サンプルに加えた。暗所、室温で１０分間インキュベートした後、ＢＤＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡＸ－２０フローサイトメーターでサンプルを取得した。

ｄｄＰＣＲでのマウス血液からのＤＮＡ抽出によるマウス血液および組織におけるＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞の測定
ＱＩＡａｍｐＤＮＡＭｉｃｒｏキットを用い、製造者の指示に従ってマウスの血液からＤＮＡを抽出した。簡単に説明すると、６５μＬの血液サンプルに３５μＬのバッファーＡＴＬを加えて全量を１００μＬとし、そこに１０μＬのプロテイナーゼＫと１００μＬのバッファーＡＬを加えた。サンプルをボルテックスで十分に混合し、５６℃で１０分間振盪しながらインキュベートした。サンプルを短時間遠心分離して蓋から液滴を回収し、５０μＬのエタノールを加えた。サンプルを十分にボルテックスで撹拌し、室温で３分間インキュベートした。溶解液全体をＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅカラムに移し、蓋を閉めてカラムを６０００ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。５００μＬのバッファーＡＷ２を加え、サンプルを６０００×ｇで１分間遠心分離し、フロースルーを廃棄した。その後、カラムを２０，０００×ｇで３分間遠心分離し、メンブレンを完全に乾燥させた。ＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅカラムを清浄な１．５ｍｌのマイクロ遠沈管に入れ、２０μＬのヌクレアーゼフリーの水をメンブレンに加え、室温で１０分間インキュベートした。２０，０００×ｇで１分間遠心分離してＤＮＡを溶出させた。ＤＮＡ濃度はＮａｎｏｄｒｏｐ２０００を用いて測定した。

マウス組織からのＤＮＡの抽出
マウスの臓器（肝臓、肺および脾臓）を２ｍＬのエッペンドルフセーフロックチューブに採取し、ＴＥバッファーとステンレス鋼ビーズ（直径５ｍｍ）１個を加えた。骨髄ペレットをＴＥバッファーに再懸濁させ、２ｍＬエッペンドルフセーフロックチューブに移し、ステンレスビーズ（直径５ｍｍ）１個を加えた。チューブをＴＩＳＳＵＥＬＹＳＥＲアダプターに入れ、１５Ｈｚで２０秒間ホモジナイズした。このホモジナイズ工程を、目に見える塊がなくなるまで繰り返した。骨髄サンプルの場合、２サンプルでさらに２０秒間のホモジナイズが必要であった。その他の臓器については、ホモジナイズを３回繰り返し、合計ホモジナイズ時間は８０秒となった。ホモジナイズしたサンプルからＰＲＯＭＥＧＡＭＡＸＷＥＬＬＲＳＣＴｉｓｓｕｅＤＮＡキットを用いて、製造者の指示に従ってＤＮＡを抽出した。カートリッジをデッキトレイに入れ、ホモジナイズしたサンプルをカートリッジのウェル１に加えた。プランジャーをカートリッジのウェル８に入れ、１００μＬの溶出バッファーが入った空の溶出チューブをラックの溶出チューブエリアに置き、測定を開始した。ＤＮＡ濃度はＮＡＮＯＤＲＯＰ２０００を用いて測定した。

ｄｄＰＣＲ
抽出したＤＮＡを、ＭｌｕＩを用いて断片化し、９６ウェルプレートに調製したｄｄＰＣＲに適した断片を作製した。血液サンプルの場合には、５００ｎｇのＤＮＡを２０μＬの反応物で断片化し、組織サンプルの場合には、１μｇのＤＮＡを４０μＬの反応物で断片化した。反応物は下表に記載されるように調製し、３７℃で１５分間、続いて８０℃で５分間インキュベートした。５０ｎｇのＭｌｕＩ断片化ＤＮＡと終濃度の１倍のプローブ用ｄｄＰＣＲスーパーミックスを含む２２μＬのｄｄＰＣＲ反応物を調製した。プライマーは終濃度９００ｎＭで使用し、プローブはＣＤＫＮ１Ａでは終濃度１２５ｎＭ、ＨＩＶでは終濃度２５０ｎＭで使用した。２２μＬの反応物のうち、２０μＬを液滴生成に使用した。サンプルは二反復で測定した。プレートはＰＸ１ＰＣＲプレートシーラーを用いて１８０℃で５秒間シールし、反応混合物を短時間ボルテックス撹拌し、遠心分離した。液滴は、サンプルをナノリットルサイズの液滴に分割するＱＸ２００Ａｕｔｏ液滴発生装置を使用して生成し、それぞれの液滴は個々の反応物として機能する。液滴生成後、ＰＸ１ＰＣＲプレートシーラーを用いて１８０℃で５秒間プレートをシールした。プレートをＰＣＲサーモサイクラーに挿入し、９５℃で１０分間インキュベートした後、９５℃で３０秒間、６０℃で１分間の４０サイクルを行った。酵素を９８℃で１０分間不活性化し、プレートを４℃に冷却した後、液滴を読み取った。液滴は液滴リーダーで読み取り、チャンネル１でＨＩＶ（ＦＡＭ）を測定し、チャンネル２でＣＤＫＮ１Ａ（ＶＩＣ）を測定した。

血清リツキシマブ濃度
マウス血清サンプルのリツキシマブは、サンプル希釈（ＭＲＤ１０に対して１、最大回収希釈液）、抗イディオタイプ（ＩＤ）キャプチャーおよび抗ヒト抗体検出に基づく有効なＧｙｒｏｌａｂイムノアッセイ法を用いて分析した。定量下限（ＬＬＱ）は血清１μＬアリコートを用いて０．３μｇ／ｍＬであった。定量上限（ＨＬＱ）は１００μｇ／ｍＬであった。３つの異なる分析物濃度で調製され、試験サンプルとともに保存されたリツキシマブを含む品質管理サンプル（ＱＣ）は、サンプルの各バッチで、別々に調製された検量線標準物質に対して分析した。分析が許容されるには、ＱＣの全結果の３分の１以下、および各濃度レベルの結果の２分の１以下が理論濃度から２５％を超えて逸脱しないことであった。該当する分析実施は、事前に定義された測定の許容基準を総て満たしていた。つまり、ビオチン化抗リツキシマブをＲｅｘｘｉｐＡに、およびＡｌｅｘａ標識抗ヒトＩｇＧをＲｅｘｘｉｐＦに希釈した。マウス血清中の作用溶液を調製した。作用溶液を３８４ＬＤＶプレートのＳｔｏｃｋ＿Ｓｏｌｕｔｉｏｎに添加した。対照ウェルには対照マトリックスを添加した。血清サンプルをＳｔｏｃｋ＿Ｓｏｌｕｔｉｏｎ３８４ＬＤＶプレートに添加し、１，５００×ｇで５分間遠心した。ＬＡＢＣＹＴＥＥＣＨＯ５２５を用いてキャリブレーターと品質対照をＰＣＲプレートに添加した。キャプチャー抗体、検出抗体および洗浄バッファーをＰＣＲプレートに加え、プレートを３，０００×ｇで５分間遠心分離した。最後に、プレートをシールし、ＧＹＲＯＬＡＢＸＰＡＮＤで測定した。

結果
本研究で使用したＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞産物は、凍結前の初期評価で３７．８％のＴＥを示した。この細胞バッチに対し、ｉｎｖｉｖｏ試験の開始に先立ち、ｉｎｖｉｔｒｏで細胞がアブレーションされ得ることを確認するために、ＡＤＣＣおよびＣＤＣアッセイを行った。

マウスへの接種と並行して、接種細胞をフローサイトメトリーで細胞組成、ＴＥおよびＣＤ２０発現を評価した（図４２Ａ～４２Ｃ）。この解析から、ｈＰＢＭＣ中の細胞の大部分（５１％）はＴ細胞であり、次いで単球（２１％）およびＢ細胞（２１％）で、ＮＫ細胞はごく一部だけ（４％）であることが示された。予想通り、Ｔ細胞単独では９９％のＣＤ３＋Ｔ細胞純度が確認された。両方を投与した群のｈＰＢＭＣとＴ細胞の混合物は１：１の混合比を示し、７４％のＴ細胞、次いで１１％の単球、１１％のＢ細胞、わずか２％のＮＫ細胞であった。接種当日（解凍後）には３５％のＴＥが検出され（Ｔ細胞のみを投与したＢ群では３３＋２％のＦ（ａｂ’）２＋）、一方、Ｔ細胞の３８％がＣＤ２０＋であった。ＰＢＭＣとＴ細胞の混合物では、Ｂ細胞も存在するため、ＣＤ２０＋Ｆ（ａｂ’）２－細胞のパーセンテージは、Ｔ細胞接種に比べてやや高かった。ｈＰＢＭＣ単独では、Ｂ細胞に占めるＣＤ２０＋Ｆ（ａｂ’）２－細胞は１３％であった。

ｍＡｂ処置７日または８日後のマウス最終血液中のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９総数およびｈＰＢＭＣ組成（フローサイトメトリー）
ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９はｆ（ａｂ’）２抗体を介して検出された。平均２，２９３個のｆ（ａｂ’）２陽性細胞（９５％ＣＩ：１，４８４～３，５４４）が、殺処分日のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９および無ｍＡｂ対照マウスの約４００μＬの血液から回収された（図４３Ａ～４３Ｂ、表１２～１３）。これは、平均１３５個のｆ（ａｂ’）２陽性細胞（９５％ＣＩ：８７～２１０）が回収された無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスで観察された値の平均１７倍であり、このアッセイで観察されたバックグラウンドｆ（ａｂ’）２検出（Ｔ細胞への抗ｆ（ａｂ）２’結合）のレベルを反映している。無ｍＡｂ対照マウスおよび無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスは、それぞれ本試験における血中ｆ（ａｂ’）２総数の陽性対照群と陰性対照群であった。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂ処置マウスでは、ｆ（ａｂ’）２総数は、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ対照マウスと比較して、ｍＡｂ処置７日および８日後に有意に減少した。ｍＡｂ処置マウスの血液には平均４１３個（９５％ＣＩ：２６７～６３９）のｆ（ａｂ’）２陽性細胞が検出されたのに対し、アイソタイプｍＡｂ対照マウスでは２，５２７個（９５％ＣＩ：１，６３５～３，９０６）であった。さらに、ｆ（ａｂ’）２総数は、同じ用量のＴ細胞を投与したアイソタイプｍＡｂ対照マウスから回収されたものと無ｍＡｂ対照マウスから回収されたものの間に差はなかった。ｆ（ａｂ’）２総数はアイソタイプｍＡｂ対照マウスと比較してｍＡｂ処置マウスでは有意に減少したが、ｆ（ａｂ’）２総数は依然として無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスの場合よりも高かった（ｐ値＜０．００１）。Ｆ（ａｂ’）２総数は、平均１８．６倍（平均２，３９２の差）であったアイソタイプｍＡｂ対照マウスとは対照的に、ｍＡｂ処置マウスでは無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照の平均３倍（平均２７８の差）であった。したがって、このことは、絶対的総数に基づき、ｍＡｂ処置７日および８日後のマウスにおいて、ｆ（ａｂ’）陽性細胞の完全ではないが有意なアブレーションを示す。

回収されたｆ（ａｂ’）２総数では、マウス間でかなりのばらつきが見られた。このことは、総Ｔ細胞数を含む、マウスで回収されたヒト細胞全体の数にも反映された（図４３Ｃ）。無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスでは、接種レジメンのため、平均してＴ細胞総数は無ｍＡｂ対照マウスまたはアイソタイプｍＡｂ対照マウスよりも少なかった。さらに、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞を含まない無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスにおいても、マウスで回収されたＴ細胞総数と回収されたｆ（ａｂ’）２総数の間に正の相関が見られた。このため、ｆ（ａｂ’）２総数も、これを考慮するために各マウス内で回収されたＴ細胞総数の割合として考えた（図４３Ｄ）。無ｍＡｂ対照マウスでは、ｆ（ａｂ’）２陽性のＴ細胞の割合は、殺処分の日に平均０．３４（９５％ＣＩ：０．３２～０．３７）であった。これは、注射時に観察されたものと比べて変化しなかった（図４３Ａ）。対照的に、無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスでは、ｆ（ａｂ’）２陽性のＴ細胞の割合は平均０．０４９（９５％ＣＩ：０．０４３～０．０５５）と有意に低かった。これは、このアッセイで観察されたｆ（ａｂ’）２検出のバックグラウンドレベルを反映している。同様に、ｍＡｂ処置マウスでは、ｆ（ａｂ’）２陽性のＴ細胞の割合も平均０．０５５（９５％ＣＩ：０．０４７～０．０５９）と低く、これは、アイソタイプｍＡ対照マウスにおけるｆ（ａｂ’）２陽性細胞の割合である平均０．２６（９５％ＣＩ：０．２４～０．２８）よりも有意に低かった（ｐ値＞０．０００１）。しかしながら、最も重要なことは、ｍＡｂ処置マウスにおけるｆ（ａｂ’）２陽性のＴ細胞の割合が、無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスと同等であったことである（ｐ値０．３５）。したがって、このことは、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９であったＴ細胞の割合に基づいて、ｍＡｂ処置７日および８日後のマウスの血中におけるＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞の高効率なアブレーションを示す。

Ｔ細胞内のｆ（ａｂ’）２陽性細胞の割合は、アイソタイプｍＡｂ対照マウスでは、無Ａｂ対照マウスに比べて減少が見られたが（それぞれ０．２６対０．３４）、ｆ（ａｂ’）２の絶対数は同等であった。さらに、殺処分時にアイソタイプｍＡｂ対照マウスで見られたｆ（ａｂ’）２の割合は、注射時に見られた割合と変わらなかった。Ｔ細胞内のｆ（ａｂ’）２の割合に見られた違いは、使用された接種物の組成によるものであり、ｈＰＢＭＣを追加していない無ｍＡｂ対照マウスに比べ、アイソタイプｍＡｂ対照マウスでは（ｈＰＢＭＣによって寄与された）非形質導入Ｔ細胞をより多く含んでいた。前述したように、Ｔ細胞内のｆ（ａｂ’）２陽性細胞の割合は、接種前と最終血液で比較すると、無ｍＡｂ対照マウスおよびアイソタイプｍＡｂ対照マウスで同等に保たれていた。さらに、殺処分時の血中のＣＡＲとＣＤ２０を共発現するＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の割合は細胞接種時と同等であったことから、ｆ（ａｂ’）２上のＣＤ２０の発現も維持されていた（図４４）。

ｆ（ａｂ’）２総数に加えて、マウス血中のｈＰＢＭＣ組成も殺処分時に評価した。総てのｈＰＢＭＣとＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９細胞を代表する、マウスで回収されたｈＣＤ４５＋細胞のうち、殺処分時の大部分はＴ細胞であった（データは示されていない）。平均して、Ｔ細胞はアイソタイプｍＡｂ対照マウスでは全ｈＣＤ４５＋細胞の９８．４４％を占め、無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスでは９４．６９％を占めた。これは、注射時（Ｔ細胞は、アイソタイプｍＡｂ対照マウスおよび無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスでそれぞれｈＣＤ４５＋細胞の７４．０３％、５１．３％を占めた）よりも有意に高かった（図４２Ａ～４２Ｃ）。マウスの血中にはいくらかのＢ細胞、ＮＫ細胞および単球が検出可能であったが、一般に検出感度レベルに満たなかった。

要約すると、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞は、フローサイトメトリー（ｆ（ａｂ’）２）によって検出されたように、ｍＡｂ処置７日および８日後のマウス血中で効率的にアブレーションされた。

ｄｄＰＣＲを用いたマウスサンプルにおけるＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の検出
経時的マウス血液
ｍＡｂ投与前の血中のＨＩＶコピー数は、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９を投与した全群間で同等であった（図４５Ａ）。予想通り、無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９群ではＨＩＶコピーが検出可能なレベルでなく、大部分の値がゼロであったため、ＨＩＶコピーの解析から除外した。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９を投与した総ての群について、測定されたＨＩＶコピーには各群内でかなりのばらつきがあった。試験の最終時点では、マウスはｍＡｂ投与７日と８日後のサンプル採取日に分割した。この両最終日のＨＩＶコピーに有意差はなかった。試験全体を通して、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９を投与した全群でＨＩＶ総コピー数の着実な減少が見られ、それはｍＡｂ投与７２時間後および最終時点までに最も顕著となる。ｍＡｂ投与後、ｍＡｂ処置群ではアイソタイプｍＡｂ群と比較して、ｍＡｂ投与２４時間後までにＨＩＶコピーの有意な減少が見られた（ｐ＜０．０００１、図４５Ｂ）。これは、ｍＡｂ処置群におけるＨＩＶコピーの８５．１１％の減少に相当した。ＨＩＶコピーの減少はまた、ｍＡｂ投与７２時間後および最終時点でも見られ、７０．４４％および６１．５６％の減少率が見られた。

ｍＡｂ処置７日または８日後のマウス組織
血液サンプルと同様に、無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照群は、値の大多数がゼロであったため、ＨＩＶコピーの解析から除外した。試験の最終時点で、マウスは２つの殺処分日（ｍＡｂ投与７日後と８日後）に分けられた。殺処分日は組織で測定されたＨＩＶコピーに有意な影響を与えた（Ｆ検定、ｐ＝０．００１）ため、この項目を統計解析モデルに含めた。試験した４つの組織（骨髄、肝臓、肺および脾臓）の総てで、アイソタイプｍＡｂ処置群と比較してｍＡｂ処置群のＨＩＶコピーに有意な減少がみられた（ｐ＜０．０００１、図４６Ａ～４６Ｂ）。アイソタイプｍＡｂ群に比べてｍＡｂ群でＨＩＶコピーに、骨髄で９５．７５％、肝臓で８８．０５％、肺で９５．７５％、脾臓で９８．６６％の低下が見られた。また、アイソタイプｍＡｂ対照群と比較した場合、無ｍＡｂ対照群で測定されたＨＩＶコピー数に有意差が認められ、それは骨髄、肝臓、肺および脾臓で見られた（ｐ＜０．０００１）。

組織学
腹腔内投与７／８日後に、ＲＴＸがＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９を、特に脾臓だけでなく肝臓および肺でも７０～９８％（９５％信頼区間３０～１００％）アブレーションしたという強い証拠が得られた。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９は、炎症を起こしていない正常なマウス組織では毒性を生じなかったが、このことはこの薬剤候補の潜在的ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ－ｏｆｆ－ｔｕｍｏｕｒ毒性ハザードを定義する助けとなる。

血清リツキシマブ濃度
総てのリツキシマブ処置マウスについて、最終血液の血清リツキシマブ濃度（μｇ／ｍＬ）を測定した（表１７）。無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照群では１８．０３８～３９．８６２μｇ／ｍＬの濃度範囲を示し、平均２８．６７２μｇ／ｍＬであった。ｍＡｂ群は、１８．６５７～３８．６４６μｇ／ｍＬの範囲を示し、平均２７．３７２μｇ／ｍＬであった。

免疫不全マウス系統におけるｈＰＢＭＣの生着に関する以前の報告(Schultz et al., 2012)と同様に、細胞注入８～９日後（ｍＡｂ投与後Ｄ７／８日）の血中ではＴ細胞が細胞の大半を占め、Ｂ細胞または骨髄細胞の生着はわずかであった（データは示されていない）。さらに、Ｔ細胞は血液と組織にも検出でき（図４３Ａ～４３Ｄ、４４、４５Ａ～４５Ｂ、および４６Ａ～４６Ｂ）、これは、注入６～７日後の他の研究(Valton et al., 2018, King et al., 2008, Bonifant et al., 2016, Tasian et al., 2014)で従前に示されたとおりである。

フローサイトメトリーで測定したマウス血中の絶対ｆ（ａｂ’）２総数は、ｍＡｂ処置後のＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９のアブレーションを示した。ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９細胞を接種していなくても、血中のＴ細胞全体が多いマウスはｆ（ａｂ’）２総数も多いことが観察されたため、絶対ｆ（ａｂ’）２総数はＴ細胞全体の生着率を説明するものではなかった。無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスに接種した総Ｔ細胞はｍＡｂマウスに比べて少なかったことから、このことは、無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスおよびｍＡｂマウス間でｆ（ａｂ’）２総数を比較する際に特に重要であった。同様に、血中で観察されたＴ細胞総数のマウス間のばらつきを考慮することも重要であった。このため、ｆ（ａｂ’）２総数をＴ細胞総数に対して評価し、そうすることでマウス間だけでなく、より重要な処置群間でもマウスの血中のｆ（ａｂ’）２総数をより正確に比較することができた。

無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスでは、フローサイトメトリーによりｆ（ａｂ’）２がバックグラウンドで検出される場合があった。これは、抗Ｆ（ａｂ’）２染色が観察されたＴ細胞のわずかな割合に基づくものであった。ｆ（ａｂ’）２のバックグラウンド検出はある部分、アッセイ開発作業と、各実験日に実施した既知数の参照対照に基づいて予想され、１，０００細胞未満ではｆ（ａｂ’）２検出の感度が低下することが示された（データは示されていない）。しかしながら、総てのＰＢＭＣ集団の検出感度も１，０００カウント未満で低下したため、これはｆ（ａｂ’）２陽性細胞に限ったことではない（データは示されていない）。この結果、フローサイトメトリーにより１，０００カウント未満のマウスの血中の正確なｆ（ａｂ’）２総数を決定することはできず、この中には、総てのＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂマウス、ならびに無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスが含まれた。にもかかわらず、ｍＡｂマウス（ＲＴＸで処置）の血中では、ｆ（ａｂ’）２総数はバックグラウンド（無ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９対照マウスの血中のｆ（ａｂ’）２総数）以上には検出されず、したがって、これはｍＡｂで処置したマウスの血中ではＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞の高効率のアブレーションを示したことを示すことができた。

さらに、アイソタイプｍＡｂ対照マウスならびに無ｍＡｂ対照マウスでは、最終血液中に存在するＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＣＡＲおよびＣＤ２０の発現を接種前と同等のレベルで保持していることが認められた。このことは、形質導入細胞はｉｎｖｉｖｏで細胞表面にＣＤ２０とＣＡＲの両方の発現を維持していたことを示している。

本試験の重要なエンドポイントは、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびｍＡｂ群とＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９およびアイソタイプｍＡｂ群の血中および組織中のＨＩＶコピーを比較することであり、そのため、ｍＡｂおよびアイソタイプ処置群を比較するために減少率を算出した。本試験では、ｄｄＰＣＲを用いることで、アイソタイプｍＡｂ対照群と比較した場合、ｍＡｂ群では血中で８５．１１％、組織中で９８．６６％までＨＩＶコピーが効率的に減少することが示された。血中のＨＩＶ数を比較すると、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９を移植した全群で、経時的にＨＩＶ総数が着実に減少していた。これは、本試験のｍＡｂ投与７２時間後および最終時点までに最も顕著であった。したがって、２つの群（ｍＡｂ群とアイソタイプｍＡｂ対照群）のパーセンテージ差は経時的に減少した（ｍＡｂ２４時間後では８５．１１％、最終時点では６１．５６％）。これにより、パーセンテージ変化のデータは、ｍＡｂ処置療群におけるＨＩＶコピー総数とともに解釈されるべきであり、本試験の最終時点までＨＩＶコピーの持続的減少が示される。

試験の最終時点（ｍＡｂ７／８日後）で骨髄、肝臓、肺および脾臓を採取し、アイソタイプｍＡｂを投与した総ての組織でＨＩＶコピーが検出可能であった。このことから組織におけるＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の存在が確認され、血液から組織へのＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の再分布が示唆され、このことが、以降の試験時点において血中で測定されたＨＩＶコピーの減少に一部寄与している可能性がある。総ての供試組織において、アイソタイプｍＡｂ処置群と比較してｍＡｂ群ではＨＩＶコピーの強い有意な減少が見られた。このことは、ｍＡｂ処置群においてＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９Ｔ細胞のアブレーションが成功したことをさらに裏付けている。

このデータを解釈する際に留意すべき点は、血液または組織で測定されたＨＩＶ（または試験内で対照として用いられたヒト参照遺伝子ＣＤＫＮ１Ａ、ここでは報告していない）のコピーからＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９の細胞数を正確に定量することはできないということである。理論的には、ＰＣＲ反応で測定された遺伝子のコピー数から細胞数を評価することができる。しかしながら、この場合、抽出手順中に総てのＤＮＡが完全に回収され、ＰＣＲで完全に増幅されることが前提となる。さらに、サンプル間で細胞総数を比較するためには、総てのサンプルでＤＮＡの抽出効率が等しいことが前提となる。既知数のＣＡＲ－Ｔ細胞を血液に混ぜて試験し抽出する予備実験では、スパイク細胞と比較してＤＮＡコピーの回収率は低く、サンプル間でのＤＮＡの総収量にばらつきがあることが判明した。これは、総てのＰＣＲ反応に同量のＤＮＡを添加することにより、サンプル間で正規化した。したがって、ＰＣＲは細胞総数を評価するための正確な定量法と見なすべきではなく、代わりにＨＩＶコピー数が結論に用いられる。

ＲＴＸの適用が成功したことを確認し、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞のアブレーションがない場合の最終レベルを評価するために、最終血液の血清サンプル中のＲＴＸ濃度を測定した。その結果、ＲＴＸ処置群の総てのマウスにＲＴＸが投与され、最終サンプル採取時に１０μｇ／ｍＬを超えるレベルを呈することが確認された。免疫不全マウス系統はより高いｍＡｂクリアランスを示すことが報告されているため、これは特に関連性が高い(Oldham et al., 2020)。

要約すると、本試験は、ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９ＣＡＲ－Ｔ細胞が、与えられたマウスモデルにおいて、１回のＲＴＸ投与で効率的にアブレーションされ得ることを示す。血中でのアブレーション（２４時間以内）が実証され、臨床の場では血液に比べてアクセスしにくく、ＲＴＸ効率が低い組織でのアブレーション(EMA, 2005)を実証することができた。

実施例１２：肺癌における効果
非小細胞肺癌は、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法によって満たされる可能性のある患者のアンメットニーズが高い。本研究の目的は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株に対するＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞の効力を調べることであった。「９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ」は、「ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９」ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞と同じｓｃＦｖ、ヒンジ、シグナル伝達部位、および共刺激性ドメインを含むが、ＣＤ２０ドメインを含まず、ＬＮＧＦＲタグを含む。

まず、様々なＮＳＣＬＣ細胞株についてＣＬＤＮ３の発現を調べ、細胞株のパネルを選択した。その後、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞（「９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ」）のＮＳＣＬＣ細胞株に対する応答を調べるために機能実験を行った。機能実験に使用した細胞株パネルは、様々なＣＬＤＮ３の発現レベル（ｍＲＮＡおよびタンパク質）、対象疾患のサブタイプ（扁平上皮癌または腺癌）、転移および原発の病理学的特徴を網羅するように選択した。活性化と細胞傷害性は、ＮＳＣＬＣ細胞株に対する９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの機能的応答の指標として使用し、活性化因子（ＩＦＮγおよびグランザイムＢ）およびアネキシンＶの発現をそれぞれ定量することによってｉｎｖｉｔｒｏで調べた。

ＣＬＤＮ３を発現する総てのＮＳＣＬＣ細胞株は９０６－００９＿ＬＮＧＦＲを活性化し、ＵＴ（「非形質導入」）Ｔ細胞およびＣＤ１９ＭＢＣＡＲ－Ｔ細胞（「ＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲ」）と比較してＩＦＮγおよびグランザイムＢの分泌の増加をもたらした。ＣＬＤＮ３を発現するＮＳＣＬＣに応答した強力な細胞傷害性も見られた。ＣＬＤＮ３の発現レベルが最も低かった２つの細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１６５０およびＣｏｌｏ３２０ＤＭ）を除く総ての細胞株で完全な殺傷が見られた。これはグランザイムＢのレベルと相関しており、完全な殺傷が見られた総ての共培養でグランザイムＢのレベルは１９９８ｐｇ／ｍＬを超えた（３名のドナーの平均）。ＮＣＩ－Ｈ１６５０およびＣｏｌｏ３２０ＤＭの共培養では、ごく部分的にドナー特異的な殺傷が見られたに過ぎず、グランザイムＢの定量レベルははるかに低かった。

完全に殺傷された細胞株のうち、最低のＣＬＤＮ３ｍＲＮＡ発現細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１６５１）および最高のＣＬＤＮ３発現細胞株（ＨＴ－２９）の両方（９．５５および９３．９３（ＦＰＫＭ）、ＣＬＤＮ３に対して０．００４および０．１３）は、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによって同レベルのＩＦＮγ分泌（それぞれ４０，５３４ｐｇ／ｍＬおよび３１，１３８ｐｇ／ｍＬ）を誘導することができ、低レベルのＣＬＤＮ３が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲを活性化できることが示唆された。活性化されたＴ細胞は、ＣＤ１９およびＵＴを上回るレベルのグランザイムＢも分泌しており、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲのＮＳＣＬＣ細胞株に対する細胞傷害活性を間接的に示唆している。

全体として、本研究のデータは、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの活性化および細胞傷害性応答が、高レベルから低レベルまでのＣＬＤＮ３を発現しているＮＳＣＬＣ細胞株によって誘導されることを示している。フローサイトメトリーによる検出限界の細胞株でも強い応答が誘導され、ＣＡＲの感受性が示された。疾患サブタイプ解析および病理学的判定により、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞は、疾患サブタイプ（扁平上皮癌または腺癌）および病理学的判定（転移または原発）に関係なく、ＣＬＤＮ３を発現するＮＳＣＬＣ細胞株に応答することが示された。要約すると、この報告は、ＮＳＣＬＣがＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞の適切な患者集団であり得るというｉｎｖｉｔｒｏ証拠を提供するものである。

材料および方法
本研究の目的は、ＮＳＣＬＣ細胞株における堅牢なＣＬＤＮ３発現とＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞による機能的応答を確認することにより、ＮＳＣＬＣ患者がＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞で治療できるかどうかを理解することであった。

まずＲＮＡＳｅｑデータを用いて、３つの主要な疾患亜集団からＣＬＤＮ３のレベルが多様な細胞株を選択した。その後、ＣＬＤＮ３タンパク質およびＣＬＤＮ３ｍＲＮＡの発現をそれぞれフローサイトメトリーおよびｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。収集したデータに基づいて、高レベルから低レベルまでの標的発現を示す様々な細胞株を、機能実験に使用するために選択した。ＮＳＣＬＣ患者集団の多様性を考慮し、細胞株は２つの最も一般的なサブタイプ（腺癌および扁平上皮癌）、転移および原発の両方の病理判定から選択した。

９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的応答は、活性化因子の分泌（グランザイムＢおよびＩＦＮγ）および殺傷（アネキシンＶの発現により確認）という２つの重要な評価項目を用いて評価した。Ｔ細胞の活性化および標的細胞の死滅の組合せは細胞傷害性応答を確認するものであり、活性化因子のレベル単独は、細胞傷害性応答を示すため、または濃度が低い場合には応答の低下を示唆するために使用することができる。ＣＬＤＮ３発現もまた、標的細胞プレーティング当日の標的発現に対する応答を比較するために評価した。ＣＲＣはＦＴｉＨ試験における主要な適応症であるため、以前の有効性アッセイで使用された多数のＣＲＣ細胞株が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲのベンチマークとしてパネルに含まれた。特定の主張を行うものではないが、本試験は、この種の試験において受け入れられている科学的慣行に従って実施した。

細胞株の培養
細胞株は、１０％ＦＢＳおよび１％ＧＬＵＴＡＭＡＸを添加したＲＰＭＩを用いて、共培養の１～２週間前に解凍した。細胞は３～４日ごとに分割し、共培養のために播種する日に、ＴｒｙｐｌＥを用いて細胞を回収し、ＮＵＣＬＥＯＣＯＵＮＴＥＲ２０２で計数した。

Ｔ細胞の解凍
ドナーＰＲ１９Ｋ１３３９００、ＰＲ１９Ｃ１３３９０４およびＰＲ１９Ｗ１３３９１６由来の９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ、ＣＤ１９ＭＢ（ＣＤ１９ＣＡＲ陰性対照、「ＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲ」）、およびＵＴ（非形質導入）Ｔ細胞（生産は２０２１Ｎ４６７３１４に記載）を共培養当日に解凍した。Ｔ細胞を手で解凍し、１０ｍＬの冷ＴＥＸＭＡＣＳに再懸濁させた。細胞を３００×ｇで１０分間回転沈降させ（室温）、冷ＴＥＸＭＡＣＳに再懸濁させた。細胞懸濁液をもう一度３００×ｇで２０分間回転させ、５ｍＬの冷ＴＥＸＭＡＣＳに再懸濁させた。その後、細胞をＮＵＣＬＥＯＣＯＵＮＴＥＲ２０２で計数し、さらなるアッセイのために分注した。

ｑＰＣＲ
ＲＮＡの抽出：
ＲＮＡは、ＰｒｏｍｅｇａＭａｘｗｅｌｌＲＳＣＳＩＭＰＬＹＲＮＡＣｅｌｌｓＫｉｔを用い、製造者のプロトコールに従って細胞株ペレットから抽出した。簡単に述べると、細胞ペレットを、チオグリセロールを含む２００μＬのホモジナイズ溶液に再懸濁させた。次に、ホモジナイズした細胞を、２００μＬの溶解バッファーを加えて溶解した。その後、溶解した細胞をＭａｘｗｅｌｌカートリッジのウェル１に加え、再構成した５μＬのＤＮＡｓｅ１をウェル５に加えた。プランジャーをウェル８に加え、カートリッジをＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ４８装置で作動させた。ＲＮＡは５０μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出させ、ｃＤＮＡ合成まで－８０℃で保存した。ｃＤＮＡの合成：ＲＮＡはＮａｎｏｄｒｏｐ２０００を用いて測定した。次に、４μＬのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＶＶＩＬＯ（商標）マスターミックスおよび１サンプルあたり１μｇのＲＮＡを用い、製造者のプロトコールに従ってＲＮＡを逆転写した。４サンプルについて、１μｇのＲＮＡと４μＬのＮｏＲＴマスターミックスを含むＮｏＲＴ対照を作成した。Ｃ１０００ＴＯＵＣＨＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを用い、反応物を２５℃で１０分間、次いで５０℃で１０分間、その後８５℃で５分間インキュベートした。ＲＴ－ｑＰＣＲ：ＲＴ－ｑＰＣＲは、ヒトＣＬＤＮ３ならびに内在性参照遺伝子であるアクチンＢ（ＡＣＴＢ）およびユビキチンＣ（ＵＢＣ）に対して、ＴＡＱＭＡＮＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓを用いてｃＤＮＡに対して行った。つまり、サンプルのｃＤＮＡはあらかじめヌクレアーゼフリー水で１／５に希釈されていた。１／５で７点のｇＤＮＡ連続希釈液を作製した。各ＰＣＲ反応は、５μＬのＴＡＱＭＡＮＦａｓｔＡｄｖａｎｃｅｄマスターミックス、０．５μＬのＴＡＱＭＡＮＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙ、２．５μＬのヌクレアーゼフリー水、および２μＬのｃＤＮＡ／ｇＤＮＡ（上記で調製したもの）を混合することにより、製造者のプロトコールに従って設定した。ＰＣＲはＭＩＣＲＯＡＭＰＯｐｔｉｃａｌ３８４－ＷｅｌｌＲｅａｃｔｉｏｎＰｌａｔｅｓでＱＵＡＮＴＳＴＵＤＩＯ６ＦｌｅｘＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いて行った。

最初の実施でｇＤＮＡが混入したため、失敗の原因を特定するためのＩＰ０８およびＵＢＣを使用したトラブルシューティングを実施した。ＩＶＶＩＬＯＮｏＲＴマスターミックスの混入が失敗の原因であったため、新しいＩＶＶＩＬＯｃＤＮＡ合成キットで上記の方法を繰り返した。

フローサイトメトリー
ＣＬＤＮ３の発現を決定するために、標的細胞株をフローサイトメトリーで分析した。細胞懸濁液をＦＡＣＳバッファー（Ｄ－ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、４０μＬのＨｕｍａｎＴＲＵＳＴＡＩＮＦＣＸＦｃブッロカーに再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。次に、細胞を４０μＬの２倍ＰＥクローディン－３抗体またはＰＥＲＥＡＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（作用濃度５μｇ／ｍＬ）で染色し、暗所、室温で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ溶液（Ｄ－ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬＤＡＰＩ）に再懸濁させた。細胞はすぐにＣＹＴＯＦＬＥＸフローサイトメーターを用いて分析した。

サイトカイン検出のための共培養設定
標的細胞株は、Ｔ細胞との共培養の前日に剥離し、計数した。細胞を洗浄し、３００×ｇで遠心分離し、各実験に適した密度で培地に再懸濁させた。２．５×１０^４の細胞を９６ウェルプレートに播種した。次に翌日、新たに解凍して均一化したＴ細胞を１：１のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞、「エフェクター」は形質導入ＣＡＲ－Ｔ細胞）の比率でプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ_２で共培養した。各共培養条件は３反復で行った。２４時間後にプレートを遠心分離し、上清を回収し、サイトカイン分泌を定量するために－８０℃で保存した。

ヒトＩＦＮγサイトカインＵ－ＰｌｅｘＭＳＤアッセイ
２枚のサイトカインＵ－Ｐｌｅｘプレートを用いたＭＳＤアッセイを、製造者の指示に従って行った。

プレートの作製
リンカー：抗体を３：２比で加えることにより、ビオチン化抗体をリンカーに（ＩＦＮγはリンカー１に、グランザイムＢはリンカー１０に）結合させた。この混合物をボルテックスで撹拌し、室温で３０分間インキュベートした。リンカー：抗体：停止液が３：２：２になるように停止液を加え、この混合物をボルテックスで撹拌した後、室温で３０分間インキュベートした。リンカー結合抗体を合わせ、ストップ液で１／１０に希釈し、コーティング液を作製した。コーティング溶液をボルテックスで撹拌し、各ウェルに５０μＬずつ加えてプレートをコーティングした。プレートをシールし、振盪しながら室温で１時間インキュベートした。

試薬およびサンプル調製
凍結サンプルと希釈液３および２を解凍し、室温に平衡化した。次に、サンプルプレートを２０００×ｇで３分間回転させた。アッセイキャリブレーター１を２５０μＬの希釈液２で再構成し、室温で３０分間インキュベートし、アッセイキャリブレーター２３を氷上で解凍した。

キャリブレーターおよびサンプルの希釈
サイトカイン標準品検量線を作成用の連続希釈のため、最初の標準品は、キャリブレーター１およびキャリブレーター２３を希釈液２で１／１０に希釈することにより作製した。次に、標準品２～７を４倍の連続希釈で作製した。サンプルも希釈液２で希釈し、標準曲線の上下に合わせた。

アッセイプロトコール
プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄バッファー（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、５０μＬのキャリブレーターまたは希釈上清サンプルをプレーティングした。プレートを室温で少なくとも７５０ｒｐｍで振盪しながら２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄した後、５０μＬの検出抗体溶液を各ウェルに添加した（希釈液３で１／１００に希釈したＩＦＮγとグランザイムＢに対する抗体）。プレートを室温で少なくとも７５０ｒｐｍで振盪しながら１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄バッファーで３回洗浄した。次に、１５０μＬのＭＳＤＧＯＬＤリードバッファーを各ウェルに加えた後、すぐにＭＳＤＳｅｃｔｏｒ６００Ｉｍａｇｅｒでプレートを読み取った。

ＩＮＣＵＣＹＴＥに基づく殺傷アッセイ
プレートのコーティング
ＮＵＮＣＬＯＮＤｅｌｔａＳｕｒｆａｃｅ９６ウェルプレートの各ウェルに、５０μＬの０．０１％ポリ－Ｌ－オルニチンを加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを１５０μＬのＰＢＳで３回洗浄し、バイオセーフティキャビネット内で１時間風乾した。

標的細胞のプレーティング
標的細胞株は、上記のように剥離および計数し、５０μＬ容量の共培養培地（フェノールフリーＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１％ピルビン酸ナトリウム＋１％ＮＥＡＡ）中に、１５，０００または２５，０００細胞／ウェルを播種するのに適切な濃度で再懸濁させた。播種密度は各細胞株について個々に決定した。プレートは３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。

Ｔ細胞のプレーティング
翌日、標的細胞を含むプレートに、５０μＬのアポトーシス用アネキシンＶ色素（総ウェル体積１５０μＬ中で共培養培地に終濃度が１：５００となるように希釈）を加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートするとともに、Ｔ細胞を準備した。上記のように準備したＴ細胞を、５０μＬの共培養培地で１：１の標的細胞：Ｔ細胞比となるような適当な濃度で再懸濁させた。次に、プレートをＩＮＣＵＣＹＴＥＳＸ５に移し、実験中、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。

画像収集
画像は、ＩｎｃｕＣｙｔｅＳＸ５をＡｄｈｅｒｅｎｔＣｅｌｌ－ｂｙ－ＣｅｌｌＳｃａｎタイプで用いて倍率１０倍で取得した。データはＰｈａｓｅａｎｄＮＩＲチャネルで取得した。１ウェルにつき４画像を７日間、３時間間隔で取得した。

結果
ＮＳＣＬＣ細胞株によるＣＬＤＮ３発現
２４のＮＳＣＬＣ細胞株ならびに陽性（ＨＴ－２９）および陰性（ＲＫＯＫＯ）ＣＲＣ対照におけるＣＬＤＮ３ｍＲＮＡおよびタンパク質発現を評価した。細胞株を６週間培養し、３回の異なるフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲ実験についサンプルを採取した（図４７Ａ～４７Ｂおよび表１８）。

フローサイトメトリー分析により決定した場合、ＮＳＣＬＣ細胞株の大多数（１６）は、均質なＣＬＤＮ３陽性集団から構成され、種々の細胞株の細胞表面のＣＬＤＮ３の種々のレベルを反映するＭＦＩ幅があった（正規化ＭＦＩ１．２（ＲＫＯＫＯ）～７３８（ＨＴ－２９））。残りの細胞株のうち、８株はＣＬＤＮ３に対して部分陽性であったが、これは明瞭な集団ではなく、蛍光の集団シフトに基づくものであり、１株はＣＬＤＮ３陰性であった（ＮＣＩ－Ｈ１７０３）。ＮＣＩ－Ｈ１６５０のようないくつかの異常値はあったが、タンパク質レベルの増加はほとんどがｍＲＮＡの増加を反映していた。

発現データに基づいて、ＮＳＣＬＣのＣＬＤＮ３発現細胞株に対する機能的応答を示すことを目的として、病理判定（転移または原発の両方）および２つの主要な疾患サブセット（腺癌および扁平上皮）から独立した発現レベルの範囲で、様々な細胞株が選択された（表１９）。低レベルの標的発現および高レベルの標的発現に対する９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの応答を調べるために、広範囲のＣＬＤＮ３発現レベル（相対ＣＬＤＮ３および膜結合ＣＬＤＮ３集団の割合％に基づく）を有する１２の細胞株のパネルが選択された。部分陽性集団を有する３つの細胞株、ならびに低い相対ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡ、膜結合ＣＬＤＮ３集団の０％、およびＲＫＯＫＯ（陰性対照として使用されたＣＬＤＮ３ＫＯ細胞株）と同様の正規化ＭＦＩに基づいて陰性と評価されるＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７０３が選択された（表１８）。

本願で特性評価がなされたいくつかのＣＲＣ細胞株もまた、本研究に含まれた。以下の細胞株が選択された：ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡの発現が極めて低いＣＲＣ細胞株（Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ）、およびＣＬＤＮ３発現レベルが中程度および高いＣＬＤＮ３発現ＮＳＣＬＣ細胞株に匹敵する３つの追加細胞株（ＤＬＤ１、ＨＣＴ１５およびＨＴ－２９）である。細胞株に対するＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞の応答を研究した多くのデータがすでに存在しており、本研究ではこれらのＣＲＣ細胞株をベンチマークとして用いた。

標的細胞におけるＣＬＤＮ３発現は、共培養の播種日（Ｔ細胞添加の前日）に再確認した。ＣＬＤＮ３タンパク質の発現レベル（図４７Ｂおよび表１８の正規化ＭＦＩとして分析）については、実験間で差異が認められた。特に、最初の細胞株スクリーニング段階において、ＮＣＩ－Ｈ１６５０は、ＲＫＯＫＯよりも高い正規化ＣＬＤＮ３ＭＦＩを有する部分陽性低ＣＬＤＮ３集団（３５％、ｎ＝３）を含むことが一貫して示された（２．７対１．４、ｎ＝３）。機能実験のために標的細胞を播種した日、ＮＣＩ－Ｈ１６５０はＲＫＯＫＯで観察されたバックグラウンド未満のＣＬＤＮ３レベル（正規化ＭＦＩ１．５５対１．８）を発現し、ＣＬＤＮ３陽性はわずか２．２８％であった（図５４Ａ～５４Ｊ）。注目すべきは、ＮＣＩ－Ｈ１６５０が３５％ＣＬＤＮ３陽性であることを示した実験において、ＮＣＩ－Ｈ１６５０は一貫してＮＣＩ－Ｈ１７０３未満の相対的ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡレベルを有していたことである（表１８）。

ＮＳＣＬＣ細胞株による９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの活性化
ＮＳＣＬＣ細胞株に対する９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの有効性を調べるために、２４時間の９０６－００９＿ＬＮＧＦＲおよび標的細胞共培養後に、活性化因子ＩＦＮγおよびグランザイムＢを定量した。このデータを３名のドナーの平均として図４９Ａ～４９Ｂに表す。

０．００１ｄＣＴを超える（最高のＣＬＤＮ３を発現する細胞株ＨＴ－２９、０．１３ｄＣＴまで）相対ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡ発現を有する総ての細胞株は、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し、対照レベル（ＵＴ／ＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲ共培養）を超える堅牢なＩＦＮγおよびグランザイムＢ分泌をもたらした。２つの細胞株（１つはＣＲＣ、１つはＮＳＣＬＣ）を除く総ての細胞株では、８００ｐｇ／ｍＬを超えるレベルのグランザイムＢが存在した。グランザイムＢのレベルが低い両細胞株は、ＩＦＮγの分泌量も低く、ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡの発現量は０．００１を下回り、ＣＬＤＮ３タンパク質の発現量はバックグラウンドレベルであることが示された。

共培養には、以前の効力アッセイで使用されたＣＬＤＮ３が同等レベル（低、中、高）のＣＲＣ細胞株が含まれた。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲがＣＲＣ細胞株に応答して分泌したＩＦＮγおよびグランザイムＢのレベルは、ＮＳＣＬＣ細胞株に対する応答よりも高くはなかった。最高レベルのＣＬＤＮ３ｍＲＮＡを有するＣＲＣ細胞株であるＨＴ－２９は、最高のＣＬＤＮ３ｍＲＮＡを発現するＮＳＣＬＣ細胞株ＨＣＣ０８２７（ＩＦＮγ ６５，４１５ｐｇ／ＭＬ、およびグランザイムＢ３，６７８ｐｇ／ｍＬ）と同等レベルのＩＦＮγおよびグランザイムＢ（３１，１３９ｐｇ／ｍＬおよび４，３５７ｐｇ／ｍＬ）を示した（表２３）。

これらの９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの応答は、標的発現細胞に特異的である。ＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲによる、ＵＴレベルを超えるＩＦＮγおよびグランザイムＢの分泌はなく、ＣＬＤＮ３陰性細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７０３およびＲＫＯＫＯに応答した９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによるこれらの因子の分泌はなかった。

発現と応答の間の関係
図３に示したデータは、低レベルのＣＬＤＮ３が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによる有意な活性化応答を誘導できることを示している（ＩＦＮγとグランザイムＢの分泌により定量）。どのレベルのＣＬＤＮ３ｍＲＮＡで活性化応答がピークに達し、プラトーに達するかを理解するために、発現と応答の関係をモデル化した（図５０Ａ～５０Ｂ）。次にこの曲線を用いて、ＣＬＤＮ３発現の特定レベルにおけるＣＤ１９ＭＢに対する倍率変化を評価した（表２０および表２１）。

これらのモデルから、低レベルのＣＬＤＮ３で、活性化因子の統計的に有意な増加が予想されることが示唆される。相対ＣＬＤＮ３が０．０００３７であっても、ＩＦＮγで１０．３７、グランザイムＢで３．６３の有意な倍率変化（対ＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲ）が評価された。モデルで使用した最高のＣＬＤＮ３ｍＲＮＡレベルは０．０９９（ＨＣＣ０８２７ＮＳＣＬＣ）細胞株であった。極めて低レベルのＣＬＤＮ３を示した細胞株はわずかであったため、発現レベルが低いＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲに対する倍率変化を評価する統計的検出力は低かったが、それでも９０６－００９＿ＬＮＧＦＲがＮＳＣＬＣ細胞株による低レベルのＣＬＤＮ３発現に反応することは明らかである。

図５０Ａの曲線に基づくと、相対ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡ発現が０．０２程度でＩＦＮγ濃度がプラトーとなった。相対ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡが０．０３の時、評価ＩＦＮγ分泌倍率変化はＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲの１４５９４倍であり、ＮＳＣＬＣ細胞株に対する強力な活性化応答を示した。図４Ｂに基づくと、グランザイムＢ応答はより低いＣＬＤＮ３発現レベル、すなわち相対ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡ０．００５前後の相対ＣＬＤＮ３発現でプラトーに達した。

ＮＳＣＬＣ細胞株において標的細胞死の誘導における９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの効力
この研究は、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲが様々なＮＳＣＬＣ標的細胞において細胞死を誘導する能力を評価することを目的とした。アポトーシス細胞死の間、ホスファチジルセリンは外部に放出され、これはアネキシンＶ染色によって可視化することができる。この研究で標的細胞死を評価するために、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲと標的細胞を共培養している間、アネキシンＶ染色を定量した。アネキシンＶ染色の総面積を位相画像とともに解釈し、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとの共培養後の標的細胞の存在を評価した。

９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによって誘導された標的細胞の完全な死滅は、試験したＮＳＣＬＣ細胞株のいくつかで観察され、これはアネキシンＶ発現細胞のクラスターが存在し、目に見えるアネキシンＶ陰性の標的細胞が存在しないことによって決定された（ＣＲＣ細胞株については図５１、ＮＳＣＬＣ細胞株については図５２）。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとの共培養で標的細胞の死滅が観察された場合、これは短期間（ＣＡＲ－Ｔ細胞添加後最大４日）で起こった。ＣＬＤＮ３発現陰性のＮＣＩ－Ｈ１７０３細胞株では、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとの共培養中に標的細胞の死滅は観察されなかった。

低レベルのＣＬＤＮ３を発現する細胞株における９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの標的細胞死誘導能を評価するために、ＣＲＣ細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭおよびＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１６５０を９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとともに培養した。両細胞株で、標的細胞の部分的な死滅が観察され、これは、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ共培養では、ＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲ共培養と比較してアネキシンＶ染色が増加し、標的細胞の数または完全性が減少することとして定義された（図５３Ａ～５３Ｂ）。ＣＲＣ細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭでは、アネキシンＶ染色の増加と標的細胞数の減少を伴った殺傷は、試験した３名のドナーのうち１名のみで観察された。ＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１６５０では、試験した３名総てのドナーで、アネキシンＶ染色が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ共培養でＣＤ１９＿ＬＮＧＦＲ共培養より早く増加したが、標的細胞の完全性の低下が見られたのは、試験した３名のドナーのうち２名だけであった。

本研究は、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞が扁平上皮癌および腺癌の両ＮＳＣＬＣサブタイプに由来する様々なＣＬＤＮ３発現ＮＳＣＬＣ細胞株に対して標的細胞死を誘導する能力を示した（表２２および図５１、５２および５３Ａ～５３Ｂ）。

ＣＬＤＮ３ＣＡＲＴ細胞療法から利益を得る可能性のある適応症を拡大するためには、対象疾患に由来する様々な細胞株に対して堅牢な機能的応答があることを示すことが重要である。本研究では、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲをＮＳＣＬＣ細胞株と共培養し、ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞がＮＳＣＬＣの治療薬として使用可能であるという証拠があるかどうかを判定することでこれを示すことを目的とした。そこで、この研究では、ＣＬＤＮ３レベルの異なる扁平上皮癌および腺癌のサブタイプ、転移および原発の病理判定から細胞株パネルを選択した。

フローサイトメトリーによるＣＬＤＮ３タンパク質の検出には限界があるという証拠がある。第一に、部分陽性細胞株では明瞭なＣＬＤＮ３陽性集団と陰性集団は観察されず、陰性対照と比較して蛍光がシフトするだけである（図５４Ａ、５４Ｃ、５４Ｅ、５４Ｇ、５４Ｉ）。第二に、機能実験当日に行われたフローサイトメトリーに基づき、ＣＬＤＮ３が部分的にしか陽性でないいくつかの細胞株（ＤＬＤ１－３６％、ＮＣＩ－Ｈ１６５１－７５％）は１００％死滅した。

本試験のデータは、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの様々なＮＳＣＬＣ細胞株に対する効力を示している。ＣＬＤＮ３ＦＰＫＭが５．８２を超える総ての細胞株で、標的細胞の完全な殺傷が観察された（残存する総ての標的細胞によるアネキシンＶの発現）（表２３）。これらの条件の総てにおいて、８００ｐｇ／ｍＬを超えるグランザイムＢの分泌も認められた。グランザイムＢの最低レベル（同等の実験において完全な殺傷が明らかであった）は、ドナーＰＲ１９Ｗ１３３９１６の９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとのＮＣＩ－Ｈ５２０共培養で観察された（９６９ｐｇ／ｍＬ）。このことは、このレベルのグランザイムＢが、総ての標的細胞においてアポトーシスに至る応答を示していることを示唆している。したがって、このレベルを超えるグランザイムＢを有する総ての細胞株は（グランザイムＢを介したＴ細胞の殺傷を本質的に回避できない限り）９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによって殺傷される可能性がある。標的細胞との共培養後、９６９ｐｇ／ｍＬを超えるグランザイムＢのレベルは、適応症、疾患のサブタイプおよび病理判定とは無関係に観察され、したがって、おそらく相対ＣＬＤＮ３のレベルに関連している。

ＩＦＮγ／グランザイムＢとＣＬＤＮ３発現の間の関係もまた、本研究で収集されたデータを用いて、ＣＬＤＮ３のレベルの変化において予想される活性化因子のレベルをモデル化した。注目すべき重要な点は、低レベルのＣＬＤＮ３発現で活性化応答がピークに達することである；（ＩＦＮγに対しては約０．０２相対ＣＬＤＮ３、グランザイムＢに対しては約０．００５相対ＣＬＤＮ３）。低レベルのＣＬＤＮ３ｍＲＮＡでグランザイムＢ分泌が頭打ちになることは完全な殺傷と相関し、グランザイムＢ分泌のこの明確なパターンが殺傷を示していることをさらに示唆している。

細胞株パネルに含まれた４つのＣＬＤＮ３陽性ＣＲＣ細胞株は、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによって同等レベルのＩＦＮγおよびグランザイムＢ分泌を誘導した。ＨＴ－２９（最高ＣＬＤＮ３発現ＮＳＣＬＣ細胞株ＨＣＣ０８２７での相対ＣＬＤＮ３の０．０９９に対し、０．１２の相対ＣＬＤＮ３を発現）は、より高いレベルのＩＦＮγは分泌されず（６５，４１４ｐｇ／ｍＬに対して３１，１３８ｐｇ／ｍＬ）、同等レベルのグランザイムＢを分泌した（３，６７８ｐｇ／ｍＬに対して４，３５７ｐｇ／ｍＬ）ことから、ＣＬＤＮ３陽性細胞では抗原のレベルに関わらず、最高の活性化レベルに達していたことが示された。ＣＬＤＮ３の発現レベル（ｍＲＮＡおよびタンパク質）が最も低いＮＳＣＬＣ細胞株およびＣＲＣ細胞株の両方で、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲによるＩＦＮγ分泌も比較的低かった。全体として、ＮＳＣＬＣ細胞株は、同等の発現レベルのＣＲＣ細胞株によって誘導される応答と同程度に堅牢なｉｎｖｉｔｒｏ活性化応答を誘導できることを示している。

９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞とＮＣＩ－Ｈ１６５０の共培養では、ベースラインレベルのＣＬＤＮ３（０．００３６相対ＣＬＤＮ３および０．６１ＦＰＫＭ）にもかかわらず、ＩＦＮγ／グランザイムＢの上方制御が見られた。機能実験からの発現データに基づくと、ＮＣＩ－Ｈ１６５０によるＣＬＤＮ３タンパク質の発現は、ベースラインレベル、１．５正規化ＣＬＤＮ３発現よりも高くなかった。しかしながら、いくつかの共培養で明らかな活性化応答（２，５２５ｐｇ／ｍＬのＩＦＮγおよび２２０ｐｇ／ｍＬのグランザイムＢ）と部分的な殺傷が見られた。結果に示されるように、ＮＣＩ－Ｈ１６５０は以前、相対ＣＬＤＮ３が低いにもかかわらず、陰性細胞株よりも一貫して高いＣＬＤＮ３タンパク質を示しており、この細胞株ではｍＲＮＡがタンパク質発現を示すものではないことを示唆している。実験間の不一致は、使用した抗体の検出下限に近づくにつれてフローサイトメトリーアッセイの信頼性が低下したためである可能性がある。また、Ｔ細胞は標的細胞プレーティングの１６時間後にプレーティングされるため、データは共培養時のＣＬＤＮ３発現を代表していない可能性もある。したがって、この細胞株は、活性化応答と最小限のアネキシンＶ発現を誘導するのに十分な、本研究で用いたフロー抗体では検出されない低レベルのＣＬＤＮ３を発現している可能性がある。

ＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ－Ｈ１６５０の部分的殺傷応答は、標的細胞の増殖抑制と部分的アポトーシス（アネキシンＶ発現により確認）の減少により特徴付けられた。これは、完全に死滅した細胞株（グランザイムＢが９６９ｐｇ／ｍＬ以上）と比較して、グランザイムＢの分泌の減少（２２０ｐｇ／ｍＬ）と相関していた。この部分的殺傷応答は、フローサイトメトリーによる検出限界ではＣＬＤＮ３タンパク発現が低いが、ＮＣＩ－Ｈ１７０３よりもＣＬＤＮ３ｍＲＮＡが高いＣＲＣ細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭと同様であった。部分的殺傷は１名のドナー（ＩＦＮγとグランザイムＢ濃度が最も高い）で観察され、細胞株の増殖が続いた。このことから、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞の応答低下は、適応症に依存しないことが示唆された。

要約すると、ＮＳＣＬＣ細胞株は堅牢な活性化応答（ＣＤ１９に対する有意なグランザイムＢおよびＩＦＮγの分泌は、０．０００３７相対ＣＬＤＮ３という低レベルで評価された）および強力な殺傷応答（相対ＣＬＤＮ３が０．００３８を超える細胞株では１００％の細胞死）を誘導した。活性化と殺傷は、病理判定および疾患サブセットとは無関係に、低レベルのＣＬＤＮ３で観察された。ＣＲＣとＮＳＣＬＣ細胞株でＣＬＤＮ３の発現レベルが同等であった場合、同様の活性化と殺傷応答が見られた。これらのＣＲＣ細胞株については、ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞の有効性を示す広範なデータセットがすでに存在しており、ＮＳＣＬＣとベンチマークに対する同様の応答は、このデータセットをさらに検証するものである。２つの重要なＮＳＣＬＣサブセット（腺癌および扁平上皮癌）のＮＳＣＬＣ細胞株で標的細胞死が誘導され、このことは、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞は、異なる疾患サブタイプに由来する様々なＮＳＣＬＣ細胞株に対して有効であることが示された。

また、ＣＬＤＮ３の発現と活性化因子の分泌との間に、ＩＦＮγとグランザイムＢで異なる関係が見られた。これらの活性化因子のレベルは、ＣＬＤＮ３の発現レベルが低いとき（実験当日、それぞれＣＬＤＮ３相対値０．０２ｄＣＴおよび０．００５ｄＣＴ）にピークを示し、この適応症における９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＬＤＮ３発現細胞株に対する感受性を示した。相対ＣＬＤＮ３ｍＲＮＡが０．０００８以下では、限定的な活性化と細胞傷害性応答も観察され、そこでは部分的な殺傷のみが誘導され、より低レベルのＩＦＮγおよびグランザイムＢが検出された。

全体として、ＣＬＤＮ３を高レベルおよび低レベルで発現する様々なＮＳＣＬＣ細胞株が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し、標的細胞死につながることが確認され、ＮＳＣＬＣがこの療法の対象適応症となり得ることが示唆された。

実施例１３：ＣＬＤＮ３エピトープマッピング
本研究では、ＣＬＤＮ３ＣＡＲエピトープの評価に９０６－００９＿ＬＮＧＦＲを使用した。「９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ」は、「ＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９」ＣＬＤＮ３ＣＡＲ－Ｔ細胞と同じｓｃＦｖ、ヒンジ、シグナル伝達部分、および共刺激ドメインを含むが、ＣＤ２０ドメインは含まず、ＬＮＧＦＲタグを含む。ＣＬＤＮ３結合エレメントは変わらず、２つの分子は同等の機能を有することが証明されている。野生型残基をアラニンで置換した種々のＣＬＤＮ３変異体を発現するツールＲＫＯ標的細胞を作製した。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの活性化は、変異体を発現するＲＫＯ標的細胞株との共培養後のＩＦＮγ放出によって評価した。さらに、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲのｓｃＦｖを含んでなるモノクローナル抗体型の９０６－ｍＡｂをフローサイトメトリーに用いて、細胞株への結合を評価した。

９０６－００９＿ＬＮＧＦＲのエピトープを同定するために、ｉｎｓｉｌｉｃｏタンパク質構造解析を行い、残基表面の接近性を予測した。このデータを用いて、野生型の候補残基をアラニンで置換した種々の変異型ＣＬＤＮ３を発現するツールＲＫＯＣＬＤＮ３標的細胞を作製した。変異はＣＬＤＮ３の細胞外ループ１と２（ＥＣＬ－１およびＥＣＬ－２）の両方にわたって生じた。

エピトープは、フローサイトメトリーを用いてＲＫＯＫＯ標的細胞への９０６－ｍＡｂの結合を測定することにより決定した。ＣＡＲＴの活性化は、３名の健常ドナーから産生された９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとＲＫＯＫＯ標的細胞との共培養後のＩＦＮγ分泌によって評価した。変異が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲのエピトープ内に存在する場合、ＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３野生型（ＷＴ）細胞と比較して、結合および活性化の低下、したがって９０６－ｍＡｂおよびＩＦＮγシグナルの低下が予想される。

９０６－ｍＡｂの結合は、Ｎ３８ＡおよびＥ１５３Ａ変異標的細胞では、ＷＴＣＬＤＮ３を発現するＲＫＯ細胞と比較して有意に減少した。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲをこれらの変異体と共培養すると、ＷＴＣＬＤＮ３を発現するＲＫＯ細胞と比較して、２４時間後のＩＦＮγ放出も有意に減少した。このデータは、アミノ酸Ｎ３８およびＥ１５３が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの結合と活性化に重要であり、したがって、ＣＡＲ結合エピトープの一部であることを示唆している。データはまた、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲエピトープが非線状であり、ＣＬＤＮ３タンパク質の細胞外ループ１（Ｎ３８）および細胞外ループ２（Ｅ１５３）の両方にわたっていることを示している（例えば、配列番号１３を参照）。

材料および方法
タンパク質構造解析
細胞株作製のためのＣＬＤＮ３変異を選択するために、タンパク質構造解析を実施した。タンパク質配列は、ＣＣＧ（ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐｕｔｉｎｇＧｒｏｕｐ）ＭＯＥ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）２０１８．０１または２０１９．０１０１で、手動または自動ＭＯＥＡｌｉｇｎ機能を用いてアラインした。タンパク質結晶構造は、ＣＣＧＭＯＥ２０１８．０１を用いて互いに重ね合わせた。構造中の非クローディン鎖を削除し、複数のクローディン鎖が存在する場合は、重ね合わせる前に別個のタグに分離した。残基表面の接近性は、ＣＣＧＭＯＥ２０１８．０１または２０１９．０１０１のＲｅｓｉｄｕｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ機能を使用して計算した。複数の異なる重ね合わせ構造が使用された場合、出力はＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌで分析した。ＣＣＧＭＯＥで生成された自動配列アライメントを使用して、関連する表面接近性データとともに、Ｅｘｃｅｌでタンパク質配列を手動でアラインした。平均「ＡＳＡ（Ａ＾２）」［表面接近可能な面積］および「Ｅｘｐｏｓｕｒｅ（％）」［Ｇｌｙ－Ｘ－Ｇｌｙトリペプチド内の残基に対する表面接近性パーセンテージ］の平均値は関連する構造間で平均をとり、露出（＞３６％）または部分的露出（＞９％）のいずれかの注釈をつけた。タンパク質の相同性モデリングは、ＣＣＧＭＯＥ２０１９．０１０１ＨｏｍｏｌｏｇｙＭｏｄｅｌ関数をデフォルトパラメーターで用いて行った。

ＣＬＤＮ３変異標的細胞株の作製
ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＳＩＧＭＡは、ＣＬＤＮ３ＷＴまたはＣＬＤＮ３一点アミノ酸変異体（本明細書では「ＲＫＯＫＯ標的細胞」と呼ぶ）およびＲＫＯＣＬＤＮ３ＫＯ細胞（本明細書では「ＲＫＯＫＯ」と呼ぶ）のＡＡＶＳ１遺伝子座におけるＧＦＰの発現を駆動するＥＦ１αプロモーターをコードする１５種類のカセットの標的組み込みを用いて、合計１５種類のモノクローナル細胞株を作製した。細胞は使用前に－１５０℃で保存した。

抗ＣＬＤＮ３９０６－ｍＡｂの作製
抗ＣＬＤＮ３９０６－ｍＡｂは実験Ｎ６５０２８－２７と同様に作製し、ＢＩＯＲＡＤ社で外部によりＰＥコンジュゲートを作製した。

９０６－００９＿ＬＮＧＦＲおよびＵＴ－Ｔ細胞の生産
Ｔ細胞は、前節で概説したように生産し、均一化した。簡単に述べると、ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞をヒト全血から単離し、形質導入し、拡大培養した。細胞は、凍結保存前に３０％の形質導入効率に均一化し、－１５０℃で保存した。

ＲＫＯＫＯ標的細胞株の培養
細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸおよび１％ピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ中で培養した。細胞は、共培養の設定と同じ日にフローサイトメトリーを用いて分析した。

共培養およびフローのためのＲＫＯＫＯ標的細胞株の準備
総ての細胞は、１０％ＦＢＳ、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸおよび１％ピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ中に播種した。陰性対照細胞株としてＲＫＯＫＯ細胞（ＣＬＤＮ３陰性、所内作製）を用い、陽性対照細胞株としてＳＩＧＭＡ社製のＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３ＷＴ細胞を用いた。Ｔ７５フラスコから培地を除去し、フラスコをＰＢＳで洗浄した後、フラスコあたり３ｍＬのｔｒｙｐＬＥを添加した。細胞を５分以上放置せず、フラスコを叩いて細胞をはずした。ＴｒｙｐｌＥを不活性化するために、フラスコあたり９ｍＬの培地を添加し、ＮＵＣＬＥＯＣＯＵＮＴＥＲＮＣ－２５０を用いて細胞の計数を行った。プレーティングに必要な細胞量をファルコンチューブに移し、４００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を終濃度が３×１０^５細胞／ｍＬになるようにプレーティング培地に最懸濁させた。細胞を９６ウェル平底プレートに１００μＬ中３×１０^４細胞／ウェルに３反復で播種し、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートするとともに、共培養のためのＴ細胞を準備した。フローサイトメトリー用に、１×１０^５細胞を９６ウェルＶ底プレートに２反復で播種した。

Ｔ細胞の解凍および標的細胞との共培養
Ｔ細胞（－１５０℃で保存）を３７℃に解凍し、１０ｍＬの加温したプレーティング培地に滴下した。細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、５ｍＬのプレーティング培地に再懸濁させた。細胞をＮＵＣＬＥＯＣＯＵＮＴＥＲＮＣ－２５０を用いて計数した。細胞を標的細胞の上に９×１０^４細胞／ウェルで播種し、標的細胞：形質導入Ｔ細胞の比率を１：１にした。共培養プレートを３７℃、５％ＣＯ_２で２４時間インキュベートした。

フローサイトメトリー
前節に記載したように、ＲＫＯＫＯ標的細胞をフローサイトメトリー用に播種した。ウェルにフローバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２ｍＭＥＤＴＡ＋０．０５％アジ化ナトリウム）を載せ、プレートを３００×ｇで５分間遠心分離した。軽く叩いて上清を除去し、細胞を１５０μＬのフローバッファーに再懸濁させた。プレートを３００×ｇで５分間遠心分離した。軽く叩いて上清を除去し、細胞を５０μＬのＩｇＧブロックに１：１００で再懸濁させ、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを上記のように２回洗浄した。フローバッファーで希釈した抗体（総て１：３００希釈）５０μＬ、またはフローバッファー単独（非染色対照）に細胞を再懸濁させた。細胞を室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを１５０μＬのフローバッファーで２回洗浄した。次に細胞を、生／死染色としてＤＡＰＩを１：２００の濃度で含む１００μＬのフローバッファーに再懸濁させた。すぐに細胞をＣＹＴＯＦＬＥＸＳに流した。細胞は１０，０００個の生細胞（全細胞＞単一細胞＞生細胞に基づく）を停止条件として、速い流速で取得した。

ＭＳＤ
共培養プレートを４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を９６ウェルＶ底プレートに移し、ＭＳＤ分析まで－８０℃で保存した。ＩＦＮγ ＭＳＤアッセイは、製造者の指示に従って実施した。上清を室温まで解凍し、希釈液２で適宜希釈した。Ｖ－ＰｌｅｘＭＳＤプレートは、プレート洗浄器を用いて１５０μＬのＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ（Ｓｏｄｅｘｏ）で３回洗浄した。ヒトＩＦＮγキャリブレーターを１０００μＬの希釈液２で再構成し、室温で１５分間平衡化し、短時間ボルテックスで撹拌した。希釈液２を用いて１：４連続希釈を行い、ブランクとして希釈液２のみを含む８点検量線を作製した。各プレートに５０μＬのキャリブレーターと関連サンプルを入れ、密封し、室温で２時間振盪しながらインキュベートした。前述のようにプレートを洗浄した。検出抗体を希釈剤３（１：５０）で希釈し、２５μＬを各ウェルに加えた。プレートを密封し、室温で振盪しながら２時間インキュベートした。前述のようにプレートを洗浄し、１５０μＬの２倍リードバッファーＴを各ウェルに加えた後、ＭＳＤＳｅｃｔｏｒ６００イメージャーで読み取った。

データ解析：フローサイトメトリー
フローサイトメトリーデータはＦＬＯＷＪＯを用いて解析し、さらにＭｉｃｒｏｓｏｆｔｅｘｃｅｌおよびＲＳｔｕｄｉｏで解析した。９０６－ｍＡｂの結合は、無染色の対照にゲートを設定したＰＥ陽性細胞として決定され、一方、ＧＦＰ発現は、ＧＦＰ陰性ＲＫＯＫＯ対照細胞株にゲートを設定したＦＩＴＣ陽性細胞として決定された。ゲートは全細胞＞単一細胞＞生細胞＞９０６－ｍＡｂ－ＰＥ陽性細胞内に設定した（図５５Ａ）。ＰＥ陽性細胞の％（生細胞の％）および蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の統計値をＦＬＯＷＪＯで計算し、さらなる解析のためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにエクスポートした。統計解析はＲバージョン３．６．３で行った。簡単に述べると、ＭＦＩをｌｏｇ１０変換し、細胞株の固定効果とプレートのランダム効果を持つ混合モデルを使用し、一方、親％は細胞株の固定効果とプレートのランダム効果を持つ混合モデルで、線形スケールで解析した。

データ解析：ＩＦＮγ放出のＭＳＤ解析
ＭＳＤデータはＭＳＤＷＯＲＫＢＥＮＣＨソフトウエアを用いて解析した。標準物質と未知物質を各ＭＳＤプレートの関連ウェルに割り当てた。キャリブレーターからの生シグナルは、ソフトウエアによって、１／ｙ^２重み付け関数を持つ４パラメーターロジスティックモデル（またはシグモイド用量反応）を用いて標準曲線を作成するために使用された。未知サンプルは相対標準曲線から補間し、定義された希釈係数を乗じて、ｐｇ／ｍＬを単位とするＩＦＮγの「計算濃度」を算出した。これらの値を統計解析と表示用のデータプロットのためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌにエクスポートした。サイトカイン放出はｌｏｇ_１０変換し、ＣＡＲ、細胞株、およびそれらの相互作用に関して固定効果を用いる混合モデルを使用した。プレートおよびドナーに関してランダム効果を使用した。

結果
変異株細胞株の作製の選択のためのタンパク質構造解析
どのアミノ酸をアラニンに変異させるかの優先順位を決定するために、ｉｎｓｉｌｉｃｏタンパク質構造解析を行った。アミノ酸の優先順位付けは、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ結合エピトープの一部となる可能性が最も高いアミノ酸を選択する目的で表面接近性予測に基づいた。解析は、その後の各タンパク質解析に情報を提供する助けとするために、予備的なｉｎｖｉｔｒｏ実験を用いて順次行った（データは示されていない）。

解析１
ヒトＣＬＤＮ４（ＰＤＢ５Ｂ２Ｇ）、マウスＣＬＤＮ１５（ＰＤＢ４Ｐ７９）およびマウスＣＬＤＮ１９（ＰＤＢ３Ｘ２９）のタンパク質結晶構造をＣＣＧＭＯＥ２０１８．０１でアラインして重ね合わせ、ＣＬＤＮ４鎖のみ、または全構造にわたって平均ＡＳＡと表面露出率を計算し、アラインしたＣＬＤＮ３タンパク質配列にマッピングした。表面接近性予測は、アラニンスキャニング変異誘発のためのＣＬＤＮ３残基を選択するために使用され、最初に［１］ＣＬＤＮ４鎖にわたって「露出」、［２］総ての構造にわたって追加の「露出」残基、［３］ＣＬＤＮ４鎖にわたって「部分的露出」、および［４］総ての構造にわたって追加の「部分的露出」残基に分類された。線状ペプチドスキャンにより、従前に、細胞外ループ２（ＥＣＬ２）がエピトープの一部である可能性が同定されたので、さらにこの情報を視覚的に用いて、アラニンスキャニング変異誘発のための「露出」残基の優先順位付けを以下に列挙するように行った。
１．空間的に関連のあるＥＣＬ２残基：Ｐｈｅ１４６、Ｔｙｒ１４７、Ｐｒｏ１４９、Ｌｅｕ１５０、Ｐｒｏ１５２およびＧｌｕ１５３
２．空間的に関連のあるＥＣＬ１ループ１残基：Ｉｌｅ３５、Ｇｌｙ３６、Ｓｅｒ３７、Ａｓｎ３８、Ｉｌｅ４０およびＴｈｒ４１
３．空間的に関連のあるＥＣＬ１ループ３残基：Ａｓｐ６７、Ｓｅｒ６８、Ｌｅｕ６９、Ｌｅｕ７０、Ａｌａ７１、Ｌｅｕ７２、Ｐｒｏ７３およびＧｌｎ７４
４．ＥＣＬ１ループ２および空間的に関連の薄い付加的ＥＣＬ１／２残基：Ｓｅｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ｇｌｙ５９、Ｇｌｎ６０、Ｍｅｔ６１、Ｇｌｎ６２、Ｃｙｓ６３、Ｌｙｓ６４、Ｖａｌ６５、Ｇｌｎ７７、Ａｌａ７８、Ａｓｎ１４０、Ａｒｇ１４４、Ｌｙｓ１５６およびＧｌｕ１５８

解析２
アラニンスキャニング変異誘発により、ＥＣＬ２内のＧｌｕ１５３残基がエピトープの一部である可能性が同定された。ヒトＣＬＤＮ３のホモロジーモデルは、ヒトＣＬＤＮ４（ＰＤＢ５Ｂ２Ｇ）を鋳型として用いて作製された。ＥＣＬ１の２つの表面露出の高い領域（残基３５～４２および５７～６１）について平均ＡＳＡと露出パーセントを計算し、アラニンスキャニング出力からのＥＣＬ２への近接性と組み合わせて、アラニンスキャニング変異誘発のためのこれらＥＣＬ１残基を、Ｓｅｒ３７、Ａｓｎ３８、Ｇｌｙ３６、Ｉｌｅ３５、Ｉｌｅ４０、Ｔｈｒ４１、Ｓｅｒ５７、Ｔｈｒ５８、Ｇｌｙ５９、Ｇｌｎ６０からＭｅｔ６１の順に優先順位付けするために用いた。

解析３
さらなるアラニンスキャニング変異誘発は、エピトープの一部である可能性のあるＥＣＬ１内の残基Ａｓｎ３８をさらに同定した。この情報をＣＣＧＭＯＥ２０１９．０１０１のＣＬＤＮ３ホモロジーモデルにマッピングし、以前の変異誘発データと組み合わせて、以下に示すように、さらなるアラニンスキャニング変異誘発のためのさらなる残基の視覚的選択のために使用した。
１．ＥＣＬ２：Ｐｈｅ１４６、Ｔｙｒ１４７およびＧｌｎ１５５
２．ＥＣＬ１：Ｇｌｎ４３、Ｉｌｅ４５、Ｇｌｎ５６、Ｌｅｕ７０およびＡｌａ７１

解析４
ヒトクローディン３、４、５、６、８、９および１７のタンパク質配列は、ＣＣＧＭＯＥ２０１９．０１０１で、手動でアラインした。ＣＬＤＮ４はＣＡＲ－ＴＩＦＮγアッセイで小さなシグナルを示すが、列挙された残りのクローディンはいずれもＩＦＮγシグナルを示さない。したがって、ＣＬＤＮ３と後者のクローディンファミリーメンバーの間で異なる残基だけの、観察されたシグナルの欠如の原因である可能性がある。ＣＬＤＮ３の細胞外ループ内で、（１）ＣＬＤＮ４と異なる残基、または（２）他のＣＬＤＮ配列（ＣＬＤＮ４以外）のいずれかと異なる残基を独立にＣＬＤＮ３のホモロジーモデルにマッピングした。しかしながら、これらの後者の残基を、ＣＡＲ－Ｔの結合／効力に効果を示す以前の変異の位置と組み合わせて、アラインメントおよび構造について分析したが、アラニン変異誘発のための明らかなさらなる残基位置を同定することはできなかった。

解析５
ＣＣＧＭＯＥ２０１９．０１０１を利用してＣＬＤＮ３ホモロジーモデルにマッピングされた総てのアラニンスキャニング変異誘発データのさらなる視覚的検査を用い、変異誘発のための３つの追加残基を選択した：Ａｌａ１５４、Ｐｈｅ３４およびＡｒｇ１５７。最終的なＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３変異細胞は、前節に記載したように、このタンパク質構造解析に基づいて作製した。

９０６－ｍＡｂおよび抗ｈＣＬＤＮ３結合のフローサイトメトリー分析
ＣＡＲＴ結合に対するＣＬＤＮ３変異の影響を評価するため、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ結合ドメインを含んでなるｓｃＦｖのモノクローナル抗体型（９０６－ｍＡｂとして知られる）のＲＫＯＫＯ標的細胞への結合をフローサイトメトリーにより評価した。解析のための細胞株には、ＣＬＤＮ３ノックアウトであるＲＫＯＫＯ（陰性対照として含まれる）、ＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３変異細胞（様々な一アミノ酸ＣＬＤＮ３変異を有する）、およびＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３ＷＴ細胞（陽性対照）が含まれた。ＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３変異細胞株は、前節で概説したように選択および作製した。

９０６－ｍＡｂは、ＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３ＷＴ細胞株および総てのＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３変異細胞株と結合（ＰＥ－ＭＦＩで表される）を示したが、Ｎ３８ＡおよびＥ１５３Ａ変異細胞株は例外で、これらはＷＴと比較して９０６－ｍＡｂ－ＰＥＭＦＩおよび９０６－ｍＡｂ－ＰＥ陽性集団％に有意な減少を示した（図５５Ｂ、５５Ｃ、５５Ｄ；表２４、２５）。予想通り、９０６－ｍＡｂはＲＫＯＫＯ陰性対照細胞株には結合しなかった。

ＧＦＰ発現はＲＫＯＫＯＣＬＤＮ３ＷＴ細胞株および変異細胞株で同等のままであり（図５５Ｂ）、９０６－ｍＡｂ結合の違いは、ＣＬＤＮ３タンパク質の総発現量の違いによるものではないことを示唆している。

これらのデータは、ＣＬＤＮ３タンパク質のＮ３８残基およびＥ１５３残基の変異が９０６－ｍＡｂの結合能を低下させることを示し、これらのアミノ酸が９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ結合エピトープに関与していることを示唆している。

９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとＲＫＯ標的細胞株の共培養後のＩＦＮγサイトカイン分泌
サイトカイン分泌は抗原の会合に対するＴ細胞応答の一部であり、ＩＦＮγ放出の検出を用いて、ＣＡＲＴの活性化に対するＣＬＤＮ３変異の影響を決定した。９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとＲＫＯＫＯ標的細胞を２４時間共培養した後、ＩＦＮγサイトカイン放出を測定した。予想通り、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとＲＫＯＫＯ細胞（ＣＬＤＮ３陰性）との共培養は、Ｔ細胞単独対照のレベルを上回るＩＦＮγを誘導しなかった（データは示されていない）。ＩＦＮγ分泌は、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲとＮ３８ＡおよびＥ１５３Ａ変異細胞株との共培養後にのみ、ＷＴと比較して有意に減少した（両変異体について倍率変化は０．０１倍、Ｐ＜０．００１）。データは、一致するドナーの非形質導入Ｔ細胞との共培養におけるＩＦＮγ分泌に対して正規化した（図５６；表２６）。Ｓ４２Ａ、Ｐ１５２ＡおよびＱ１５５Ａ変異細胞株との共培養は、ＷＴと比較してＩＦＮγ分泌にわずかではあるが有意な増加をもたらした（ｐ＜０．０５）（表２６）。しかしながら、これらの変異体の９０６－ｍＡｂ－ＰＥ陽性細胞集団％は、ＷＴ細胞と比較して有意な減少はなく、また、これらの変異細胞との共培養後にも９０６－００９＿ＬＮＧＦＲＩＦＮγの放出に有意な減少は見られなかったことから、ＭＦＩに関するこれらの観察が生物学的に関連しているとは考えにくい。これらのデータは、ＣＬＤＮ３（例えば、配列番号１３参照）タンパク質の残基Ｎ３８およびＥ１５３の変異が、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲが標的細胞によって活性化される能力の低下を引き起こすことを示唆している。

本研究の目的は、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの結合と活性化に必要なアミノ酸残基を決定することにより、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲエピトープを同定することであった。ツール細胞株は、ＣＬＤＮ３の両方の細胞外ループにわたって、単一アミノ酸をアラニンに変異させることによって作製した。フローサイトメトリーは、これらの変異のどれがＣＡＲ結合（９０６－００９＿ＬＮＧＦＲｓｃＦｖ結合ドメインのモノクローナル抗体型である９０６－ｍＡｂの結合により測定）を低下させるかを同定するために使用し、一方、変異細胞株とＣＡＲＴを共培養した後のＩＦＮγ分泌の評価は、変異がＣＡＲＴの活性化を低下させるかどうかを決定するために使用した。

試験した変異のうち、ＣＬＤＮ３のアミノ酸残基Ｎ３８およびＥ１５３の変異のみが９０６－ｍＡｂの結合の有意な減少をもたらした。これらの変異はまた、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲの活性化にももっぱら有意な減少を引き起こした。これらのデータを総合すると、Ｎ３８残基とＥ１５３残基は９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ（およびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９）結合エピトープの一部であり、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ標的の結合とその後の活性化に重要であることが示唆される。これらのデータはまた、ＣＡＲエピトープがＣＬＤＮ３タンパク質のＥＣＬ－１（Ｎ３８）およびＥＣＬ－２（Ｅ１５３）の両方にわたる非線状で不連続なものであることを示している。

全体として、本研究のデータは、Ｎ３８残基とＥ１５３残基が変異している場合、９０６－００９＿ＬＮＧＦＲ（およびＳＯ－ＣＤ２０－９０６＿００９）の活性化と結合の両方が減少することを示し、これらのアミノ酸がＣＬＤＮ３ＣＡＲエピトープにおいて重要であるという強い証拠を示している。

本明細書で本発明の好ましい実施形態を示し、説明してきたが、このような実施形態は例示のためにのみ提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者が想起するであろう。本発明を実施する上で本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替が採用され得ることが理解されるべきである。

配列表
配列番号１：９０６ＣＤＲＨ１
ＮＹＷＶＨ

配列番号２：９０６ＣＤＲＨ２
ＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮ

配列番号３：９０６ＣＤＲＨ３
ＧＶＭＶＰＬＤＹ

配列番号４：９０６ＣＤＲＬ１
ＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡ

配列番号５：９０６ＣＤＲＬ２
ＹＴＳＴＬＱＰ

配列番号６：９０６ＣＤＲＬ３
ＬＱＹＥＴＬＹＳ

配列番号７：９０６ＶＨ
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

配列番号８：９０６ＶＬ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

配列番号９：グリシン－セリンリンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ

配列番号１０：ＣＤ８リーダー配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ

配列番号１１：９０６ｓｃＦｖ（ＶＬ－ＶＨ配向）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

配列番号１２：９０６＿００９全長ＣＡＲ配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号１３：ヒトクローディン－３
ＭＳＭＧＬＥＩＴＧＴＡＬＡＶＬＧＷＬＧＴＩＶＣＣＡＬＰＭＷＲＶＳＡＦＩＧＳＮＩＩＴＳＱＮＩＷＥＧＬＷＭＮＣＶＶＱＳＴＧＱＭＱＣＫＶＹＤＳＬＬＡＬＰＱＤＬＱＡＡＲＡＬＩＶＶＡＩＬＬＡＡＦＧＬＬＶＡＬＶＧＡＱＣＴＮＣＶＱＤＤＴＡＫＡＫＩＴＩＶＡＧＶＬＦＬＬＡＡＬＬＴＬＶＰＶＳＷＳＡＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡＧＬＹＶＧＷＡＡＡＡＬＱＬＬＧＧＡＬＬＣＣＳＣＰＰＲＥＫＫＹＴＡＴＫＶＶＹＳＡＰＲＳＴＧＰＧＡＳＬＧＴＧＹＤＲＫＤＹＶ

配列番号１４：ヒトクローディン－３ＥＣＬ２
ＷＳＡＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡＧＬＹ

配列番号１５：ＰＶＶＰエピトープ
ＰＶＶＰ

配列番号１６：９０６ｓｃＦｖをコードする核酸配列（ＶＬ－ＶＨ配向）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＧＧＴＡＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＡＧＡＣＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＡＧＧＧＣＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＡＧＣＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＧＧＡＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＣ

配列番号１７：９０６＿００９全長ＣＡＲ配列をコードする核酸配列
ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＣＴＡＴＣＧＣＴＡＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＣＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＡＣＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＡＴＡＴＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＴＴＴＡＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＧＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＴＣＡＴＴＡＧＣＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＣＧＧＡＡＧＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＡＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＣＴＣＣＧＧＣＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＣＴＣＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＴＧＣＧＡＧＣＣＣＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＴＣＣＴＣＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＣＧＣＣＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＣＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＣＣＧＡＧＡＣＣＡＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＡＧＧＡＧＴＣＴＡＧＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＡＡＡＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＣＣＣＡＡＴＧＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣＡＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＣＣＣＣＴＣＴＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＴＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＡＧＣＣＴＡＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＧＣＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＣＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＴＴＧＣＣＴＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＴＧＴＡＧＧＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＡＴＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＴＧＴＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＣＧＧＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＣＣＴＴＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＣＣＡＧＡＣＣＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＣＴＣＣＣＧＣＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＧＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＴＧＡ

配列番号１８：９０６ｓｃＦｖ（ＶＨ－ＶＬ配向）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ

配列番号１９：ＣＤ８膜貫通ドメイン
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ

配列番号２０：４－１ＢＢ共刺激ドメイン
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ

配列番号２１：ＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達ドメイン
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号２２：ヒトＣＤ２０
ＭＴＴＰＲＮＳＶＮＧＴＦＰＡＥＰＭＫＧＰＩＡＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳＬＶＧＰＴＱＳＦＦＭＲＥＳＫＴＬＧＡＶＱＩＭＮＧＬＦＨＩＡＬＧＧＬＬＭＩＰＡＧＩＹＡＰＩＣＶＴＶＷＹＰＬＷＧＧＩＭＹＩＩＳＧＳＬＬＡＡＴＥＫＮＳＲＫＣＬＶＫＧＫＭＩＭＮＳＬＳＬＦＡＡＩＳＧＭＩＬＳＩＭＤＩＬＮＩＫＩＳＨＦＬＫＭＥＳＬＮＦＩＲＡＨＴＰＹＩＮＩＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳＬＦＬＧＩＬＳＶＭＬＩＦＡＦＦＱＥＬＶＩＡＧＩＶＥＮＥＷＫＲＴＣＳＲＰＫＳＮＩＶＬＬＳＡＥＥＫＫＥＱＴＩＥＩＫＥＥＶＶＧＬＴＥＴＳＳＱＰＫＮＥＥＤＩＥＩＩＰＩＱＥＥＥＥＥＥＴＥＴＮＦＰＥＰＰＱＤＱＥＳＳＰＩＥＮＤＳＳＰ

配列番号２３：Ｐ２Ａ切断部位
ＧＳＲＡＫＲＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ

配列番号２４：ｈＣＤ２０および９０６＿００９ＣＡＲ配列を含むポリペプチド
ＭＴＴＰＲＮＳＶＮＧＴＦＰＡＥＰＭＫＧＰＩＡＭＱＳＧＰＫＰＬＦＲＲＭＳＳＬＶＧＰＴＱＳＦＦＭＲＥＳＫＴＬＧＡＶＱＩＭＮＧＬＦＨＩＡＬＧＧＬＬＭＩＰＡＧＩＹＡＰＩＣＶＴＶＷＹＰＬＷＧＧＩＭＹＩＩＳＧＳＬＬＡＡＴＥＫＮＳＲＫＣＬＶＫＧＫＭＩＭＮＳＬＳＬＦＡＡＩＳＧＭＩＬＳＩＭＤＩＬＮＩＫＩＳＨＦＬＫＭＥＳＬＮＦＩＲＡＨＴＰＹＩＮＩＹＮＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳＬＦＬＧＩＬＳＶＭＬＩＦＡＦＦＱＥＬＶＩＡＧＩＶＥＮＥＷＫＲＴＣＳＲＰＫＳＮＩＶＬＬＳＡＥＥＫＫＥＱＴＩＥＩＫＥＥＶＶＧＬＴＥＴＳＳＱＰＫＮＥＥＤＩＥＩＩＰＩＱＥＥＥＥＥＥＴＥＴＮＦＰＥＰＰＱＤＱＥＳＳＰＩＥＮＤＳＳＰＧＳＲＡＫＲＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号２５：９０６＿００４全長ＣＡＲ配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号２６：ヒトクローディン－３ＥＣＬ１
ＲＶＳＡＦＩＧＳＮＩＩＴＳＱＮＩＷＥＧＬＷＭＮＣＶＶＱＳＴＧＱＭＱＣＫＶＹＤＳＬＬＡＬＰＱＤＬＱＡＡＲ

配列番号２７：９０６＿００７全長ＣＡＲ配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号２８：９０６＿０１０全長ＣＡＲ配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号２９：９０６＿００２全長ＣＡＲ配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号３０：９０６＿００５全長ＣＡＲ配列
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号３１：スペーサーＬ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ

配列番号３２：スペーサーＳ
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ

配列番号３３：スペーサーＸＳ
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ

配列番号３４：ＣＤ８リーダー配列を含まない９０６＿００９全長ＣＡＲ配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号３５：ＣＤ８リーダー配列を含まない９０６＿００４全長ＣＡＲ配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号３６：ＣＤ８リーダー配列を含まない９０６＿００７全長ＣＡＲ配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号３７：ＣＤ８リーダー配列を含まない９０６＿０１０全長ＣＡＲ配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号３８：ＣＤ８リーダー配列を含まない９０６＿００２全長ＣＡＲ配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

配列番号３９：ＣＤ８リーダー配列を含まない９０６＿００５全長ＣＡＲ配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＷＶＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＲＩＥＰＮＳＳＧＳＱＹＮＥＫＦＫＮＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＭＶＰＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＩＮＲＹＩＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＹＴＳＴＬＱＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＹＥＴＬＹＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＳＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ

Claims

以下のドメイン：
ａ）配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列；配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列；配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列を含んでなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなるクローディン－３結合ドメインを含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなるポリペプチドを含んでなるキメラ抗原受容体。
前記細胞外ドメインが、配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）配列；配列番号５の軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）配列；配列番号６の軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）配列を含んでなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでなるクローディン－３結合ドメインをさらに含んでなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
前記ＶＬが前記ＶＨのＮ末端に位置するか、または前記ＶＨが前記ＶＬのＮ末端に位置する、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
前記ＶＬおよび前記ＶＨがペプチド結合を介して互いに直接融合しているか、またはペプチドリンカーを介して互いに連結している、請求項２または３に記載のキメラ抗原受容体。
前記抗原結合ドメインが、ＣａｍｅｌＩｇ、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記ＶＨが、配列番号７と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ／あるいは、前記ＶＬが、配列番号８と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号８に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記ＶＨが配列番号７のアミノ酸配列を含んでなり、かつ／あるいは、前記ＶＬが配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記細胞外ドメインが、配列番号１１と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１１に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、前記細胞外ドメインが、配列番号１８と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１８に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のα鎖またはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する、請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記膜貫通ドメインがＣＤ８αに由来する、請求項９に記載のキメラ抗原受容体。
前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂからなる群から選択される細胞内シグナル伝達分子に由来する、あるいは、前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含んでなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
以下のドメイン：
ａ）配列番号１のＣＤＲＨ１配列；配列番号２のＣＤＲＨ２配列；配列番号３のＣＤＲＨ３配列；配列番号４のＣＤＲＬ１配列；配列番号５のＣＤＲＬ２配列；および配列番号６のＣＤＲＬ３配列を含んでなるクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）ＣＤ８αに由来する膜貫通ドメイン；
ｃ）ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来する共刺激ドメイン；および
ｄ）ＣＤ３ζに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなる、キメラ抗原受容体。
前記キメラ抗原受容体が、配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなる、あるいは、前記キメラ抗原受容体が、配列番号１２、３４、３５、３６、３７、３８または３９のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
結合をめぐって請求項１～１５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体と競合するキメラ抗原受容体。
請求項１～１６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含んでなる、操作された免疫エフェクター細胞。
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される、請求項１７に記載の免疫エフェクター細胞。
アブレーションエレメントをさらに含んでなる、請求項１７または１８に記載の免疫エフェクター細胞。
前記アブレーションエレメントが、トランケート型ヒトＥＧＦＲポリペプチドおよびＣＤ２０からなる群から選択されるポリペプチドに由来する、あるいは、前記アブレーションエレメントがＣＤ２０である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
請求項１～１６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド。
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ－Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択される、請求項２２に記載のベクター。
請求項１７～２０のいずれか一項に記載の操作された免疫エフェクター細胞、請求項２１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２２もしくは２３に記載のベクターと、薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
それを必要とする患者において癌を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項２４に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
前記癌が固形癌、上皮癌、大腸癌、膵臓癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または前立腺癌である、請求項２５に記載の方法。
前記癌が大腸癌である、請求項２６に記載の方法。
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１～１８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９もしくは２０に記載の操作されたエフェクター細胞、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２もしくは２３に記載のベクターまたは請求項２４に記載の医薬組成物の使用。
療法における使用のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９もしくは２０に記載の操作されたエフェクター細胞、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２もしくは２３に記載のベクターまたは請求項２４に記載の医薬組成物。
癌の治療における使用のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１９もしくは２０に記載の操作されたエフェクター細胞、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２もしくは２３に記載のベクターまたは請求項２４に記載の医薬組成物。
配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列；配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列；配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列を含んでなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなるクローディン－３結合タンパク質。
配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）配列；配列番号５の軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）配列；配列番号６の軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）配列を含んでなる軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含んでなる、請求項３１に記載のクローディン－３結合タンパク質。
前記クローディン－３結合タンパク質が、モノクローナル抗体、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ＣａｍｅｌＩｇ、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される、請求項３１または３２に記載のクローディン－３結合タンパク質。
前記ＶＬが前記ＶＨのＮ末端に位置するか、または前記ＶＨが前記ＶＬのＮ末端に位置し、かつ／あるいは、前記ＶＬおよび前記ＶＨがペプチド結合を介して互いに直接融合しているか、またはペプチドリンカーを介して互いに連結している、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質。
前記ＶＨが、配列番号７と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ／あるいは、前記ＶＬが、配列番号８と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号８に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなり；あるいは、
前記ＶＨが配列番号７のアミノ酸配列を含んでなり、かつ／あるいは、前記ＶＬが配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３１～３４のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質。
前記クローディン－３結合タンパク質が、配列番号１１と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１１に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなり、あるいは、前記細胞外ドメインが、配列番号１８と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１８に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３１～３５のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質。
請求項３１～３６のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ－Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択される、請求項３８に記載のベクター。
請求項３１～３６のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質、請求項３７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３８もしくは３９に記載のベクターと、薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
それを必要とする患者において癌を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項４０に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
前記癌が固形癌である、請求項４１に記載の方法。
前記癌が大腸癌、上皮癌、膵臓癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または前立腺癌である、請求項４１または４２に記載の方法。
前記癌が大腸癌である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
癌の治療のための医薬の製造における、請求項３１～３６のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質、請求項３７に記載のポリヌクレオチド、請求項３８もしくは３９に記載のベクターまたは請求項４０に記載の医薬組成物の使用。
療法における使用のための、請求項３１～３６のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質、請求項３７に記載のポリヌクレオチド、請求項３８もしくは３９に記載のベクターまたは請求項４０に記載の医薬組成物。
癌の治療における使用のための、請求項３１～３６のいずれか一項に記載のクローディン－３結合タンパク質、請求項３７に記載のポリヌクレオチド、請求項３８もしくは３９に記載のベクターまたは請求項４０に記載の医薬組成物。
ヒトクローディン－３の、配列番号１３のＮ３８およびＥ１５３を少なくとも含んでなる不連続エピトープに結合する単離されたクローディン－３結合タンパク質。
前記単離されたクローディン－３結合タンパク質がキメラまたはヒト化型である、請求項４８に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質。
前記単離されたクローディン－３結合タンパク質が、モノクローナル抗体、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ、ＣａｍｅｌＩｇ、ＩｇＮＡＲ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’２フラグメント、Ｆ（ａｂ）’３フラグメント、Ｆｖ、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）およびシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される、請求項４８または４９に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質。
前記単離されたクローディン－３結合タンパク質が、配列番号１の重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）配列；配列番号２の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）配列；配列番号３の重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）配列を含んでなる重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなり、かつ／あるいは、前記単離されたクローディン－３結合タンパク質が、配列番号４の軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）配列；配列番号５の軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）配列；配列番号６の軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）配列を含んでなる軽鎖可変領域（ＶＬ）を含んでなる、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質。
前記ＶＨが、配列番号７と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号７に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ／あるいは、前記ＶＬが、配列番号８と少なくとも９０％もしくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号８に対して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、挿入もしくは欠失を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質。
以下のドメイン：
ａ）請求項４８～５２のいずれか一項に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質を含んでなる細胞外ドメイン；
ｂ）膜貫通ドメイン；および
ｃ）１以上の細胞内シグナル伝達ドメイン
を含んでなるポリペプチドを含んでなるキメラ抗原受容体。
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のα鎖またはβ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）およびＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する、請求項５３に記載のキメラ抗原受容体。
前記膜貫通ドメインがＣＤ８αに由来する、請求項５３または５４に記載のキメラ抗原受容体。
前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ７９ａおよびＣＤ７９ｂからなる群から選択される細胞内シグナル伝達分子に由来する、請求項５３～５５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記１以上の細胞内シグナル伝達ドメインがＣＤ３ζである、請求項５６に記載のキメラ抗原受容体。
共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含んでなる、請求項５３～５７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＲＩＭおよびＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する、請求項５８に記載のキメラ抗原受容体。
前記共刺激シグナル伝達ドメインがＣＤ１３７（４－１ＢＢ）である、請求項５８または５９に記載のキメラ抗原受容体。
請求項５３～６０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含んでなる操作された免疫エフェクター細胞。
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される、請求項６１に記載の免疫エフェクター細胞。
アブレーションエレメントをさらに含んでなる、請求項６１または６２に記載の免疫エフェクター細胞。
前記アブレーションエレメントが、トランケート型ヒトＥＧＦＲポリペプチドおよびＣＤ２０からなる群から選択されるポリペプチドに由来する、あるいは、前記アブレーションエレメントがＣＤ２０である、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の免疫エフェクター細胞。
請求項４８～５２のいずれか一項に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質または請求項６１～６４のいずれか一項に記載の操作された免疫エフェクター細胞と、薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
それを必要とする患者において癌を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項６５に記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、前記方法。
前記癌が固形癌、上皮癌、大腸癌、膵臓癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）または前立腺癌である、請求項６６に記載の方法。
前記癌が大腸癌である、請求項６７に記載の方法。
癌の治療のための医薬の製造における、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質、請求項５３～６１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６３もしくは６４に記載の操作されたエフェクター細胞または請求項６５に記載の医薬組成物の使用。
療法における使用のための、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質、請求項５３～６１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６３もしくは６４に記載の操作されたエフェクター細胞または請求項６５に記載の医薬組成物。
癌の治療における使用のための、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の単離されたクローディン－３結合タンパク質、請求項５３～６１のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項６３もしくは６４に記載の操作されたエフェクター細胞または請求項６５に記載の医薬組成物。