JP2024513203A - ポリペプチドの発現を増加させるための構築物および方法 - Google Patents

ポリペプチドの発現を増加させるための構築物および方法 Download PDF

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ダトラ，マヒマ
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バイオロジカル イー リミテッド
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Abstract

本発明は、タンパク質発現の分野に関する。本発明は、組換えタンパク質の増加した発現のための発現構築物および方法を提供する。より詳細には、本発明は、組換え宿主細胞におけるＬｉｒａペプチドの強化された発現のための構築物および方法を提供する。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２１年３月３１日出願のインド仮特許出願第２０２１４１０１４７４１号に対する優先権の利益を主張し、該出願の内容全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
本発明は、タンパク質発現の分野に関する。より具体的には、本発明は、組換えポリペプチドおよびタンパク質の発現を増加させるための構築物および方法に関する。
ペプチド治療薬は、１９２０年代のインスリン療法の出現以来、医療実務において目立った役割を果たしてきた。現在、６０種類を超える承認されたペプチド薬が市場に出ており、この数は著しく増加することが予期される。
商業的に有用なタンパク質およびペプチドは、合成的に生成されても、または天然供給源から単離されてもよい。しかしながら、これらの方法は、多くの場合に、高価であり、時間がかかり、かつ限定された生産能力により特徴付けられる。タンパク質およびペプチド生成の好ましい方法は、目的のタンパク質またはペプチドを過剰発現するように遺伝子操作された、組換え的に構築された生物の発酵を介する。
しかしながら、ペプチドの組換え発現は、費用効率の高い生産手段となるために克服すべき多数の障害を有する。障害は、通常、組換えタンパク質の低い発現レベルまたは細胞内に含まれるタンパク質分解酵素による発現されたポリペプチドの破壊に関連する。
短いペプチドは、宿主細胞プロテアーゼによる細胞環境中での分解を受けやすいので、組換え的に生産するのが困難である。よって、単離される生成物は、異なるアミノ酸鎖長を有する所望のポリペプチドの分子種の不均一な混合物であり得る。
加えて、目的のタンパク質またはペプチドの性質によっては、精製が困難であり、乏しい収量をもたらす場合がある。上記の課題を克服するために、小さなペプチドは、大きな融合タグに融合させることにより発現されている。さらに、現行の方法は、融合タンパク質を発現させるために大きな融合タグを用い、これが目的のペプチドの潜在的な収量を減少させる。このことは、目的のタンパク質またはペプチドのサイズが小さい状況では、問題がある。
そのような状況では、目的のペプチドの収量を最大化するために、小型の融合タグを用いることが有利である。しかし、多くの場合、小さなタグは、大きなタグほどうまく機能することは稀である。
これらの課題は、過去には、キャリアポリペプチドへと融合した所望のポリペプチドを含む融合タンパク質を生成することにより対処されてきた。細胞中での融合タンパク質としての所望のポリペプチドの発現は、多くの場合、所望のポリペプチドを分解酵素から保護し、かつ融合タンパク質が高収量で精製されることを可能にするであろう。続いて、融合タンパク質が、キャリアポリペプチドから所望のポリペプチドを切断するために処理され、所望のポリペプチドが単離される。
米国特許第７５７２８８４号は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるリラグルチドの前駆体である組換えＬｉｒａペプチドを調製するための方法を開示する。
米国特許第７６６２９１３号は、不溶性融合ペプチドを生成するために用いられるシスタチンに基づくペプチドタグの使用を開示する。
米国特許第８７９６４３１号は、封入体パートナーとしてケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）を用いる、ＧＬＰ１を含むペプチドの効率的生成のための方法およびプロセスを開示する。
国際公開第２００３／１０００２１号Ａ１は、異種タンパク質に機能的に連結されたプロモーター、翻訳開始配列、封入体融合パートナーおよび切断可能リンカーを含む異種ペプチド／タンパク質の生成増加のための発現カセットを開示する。
国際公開第２０１７／０２１８１９号Ａ１は、ユビキチン融合構築物としての原核細胞における所望のタンパク質またはペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドの発現による、ペプチドもしくはタンパク質またはその誘導体の調製のためのプロセスを開示する。
インド特許出願公開第２０１７４１０２４７６３号Ａは、酵母細胞におけるシグナルペプチドのオリゴヌクレオチド配列に機能的に連結されているＬｉｒａペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドの発現によるリラグルチドの調製のためのプロセスを開示する。
Ｙａｎｇ Ｌｉｕら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ ３６、１６７５～１６８０（２０１４））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、融合連結部中のエンテロキナーゼ切断部位を有する２３ｋＤａのグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タグを用いる機能的ＧＬＰ－１ペプチドの発現および精製のための戦略を説明する。
Ｚｈａｏら（Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １５、１３６（２０１６））は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における切断可能自己凝集性タグの組換え発現およびＧＬＰ１を含む中型～大型ペプチドのインテイン媒介切断を研究する。
Ｚｈａｏら（Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ １８、９１（２０１９））は、組換え酵素生成を強化するための発現タグとしての自己集合性両親媒性ペプチド（ＳＡＰ）の使用を研究する。
Ｋｉら（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２０ Ｍａｒ；１０４（６）：２４１１～２４２５）は、大腸菌における異種タンパク質の発現を増加させる融合タグの詳細な総説を提供する。
グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）は、プログルカゴンペプチドの組織特異的翻訳後プロセシングから誘導される３１アミノ酸長のペプチドホルモンである。ＧＬＰ－１は、食物摂取時に、腸内分泌Ｌ細胞および脳幹中の孤束核内の一部のニューロンにより産生および分泌される。リラグルチドは、インスリン分泌を刺激する内因性代謝ホルモンＧＬＰ－１と同じ受容体に結合する、長期作用性グルカゴン様ペプチド－１受容体アゴニストとして用いられるヒトインクレチン（代謝ホルモン）であるグルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）の誘導体である。したがって、宿主において組換えタンパク質の発現を増加させるための新規発現戦略に対する必要性が存在する。本発明の発明者らは、数倍まで組換え治療用ペプチドの発現を強化するための努力の中で、組換えタンパク質の高収量生産を可能にする発現構築物を考え付いた。
高収量で目的のタンパク質を生成するための発現カセットを提供することが、本発明の主な目的である。
本発明の別の目的は、目的のタンパク質の発現を増加するための方法を提供することである。
本発明は、ｌｉｒａペプチドなどの生物学的に活性なペプチドの増加した発現および効率的生産のための発現構築物、ベクターおよび組換え宿主細胞を提供する。
実施形態では、本発明は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）切断可能ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、目的のタンパク質の発現のための発現カセットを提供し、このとき、発現カセットの前記ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに機能的に連結される。
特定の実施形態では、本発明は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する発現タグポリペプチド；および
ｃ）切断可能ペプチドリンカー
を含み、融合ポリペプチドを取得するために、目的のタンパク質のアミノ末端に融合した、融合ポリペプチドを提供する。
本発明は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）切断可能リンカーをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）配列番号１２に示される通りのアミノ酸配列を含むｌｉｒａペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチド
を含む、ｌｉｒａペプチドの発現のための発現カセットを提供し、このとき、発現カセットの前記ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに機能的に連結される。
実施形態では、本発明は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する発現タグポリペプチド；および
ｃ）切断可能リンカーペプチド
を含み、融合ポリペプチドを取得するために、配列番号１２のアミノ酸配列を含むｌｉｒａペプチドまたはその機能的変異体のアミノ末端に融合した、融合ポリペプチドを提供する。
本発明の実施形態では、目的のタンパク質の発現レベルは、少なくとも８５％増加する。
図１Ａ：Ｎ末端発現タグ融合体を含まない発現カセットの模式図である。図１Ｂ：Ｔ７リーダーと共にＮ末端発現タグ（ＬＰ２～ＬＰ１０）を含む発現カセットの模式図である。図１Ｃ：Ｔ７リーダーを伴わずにＮ末端発現タグ（ＬＰ２）を含む発現カセットの模式図である。図１Ｄ：Ｔ７リーダーを伴わずにＮ末端発現タグ（ＬＰ８）を含む発現カセットの模式図である。 図２Ａ：発現ベクターＬＰ１（いかなるＮ末端発現タグも含まない）の模式図である。 図２Ｂ：Ｔ７リーダーおよびＮ末端発現タグ（ＬＰ－２）を含む発現ベクターの模式図である。 図２Ｃ：Ｔ７リーダーを伴わずにＮ末端発現タグ（ＬＰ－２）を含む発現ベクターの模式図である。 図２Ｄ：Ｔ７リーダーおよびＮ末端発現タグ（ＬＰ－８）を含む発現ベクターの模式図である。 図２Ｅ：Ｔ７リーダーを伴わずにＮ末端発現タグ（ＬＰ－８）を含む発現ベクターの模式図である。 図３Ａ：Ｌｉｒａペプチドの発現に関して試験される、異なる発現タグ配列を含むクローンを示す図である。図３Ｂ：表は、各カセットの分子量および濃度測定分析に基づくレーン毎のタグ付きｌｉｒａペプチドのパーセンテージを表す。 図４Ａ：発現カセット中のＬＰ－２発現タグを含むＴ７リーダー配列の存在下および非存在下での比較ｌｉｒａペプチド発現を示す図である。 図４Ｂ：発現カセット中のＬＰ－２発現タグを含むＴ７リーダー配列の存在下および非存在下でのｌｉｒａペプチド発現に関する濃度測定分析を示す図である。 図４Ｃ：Ｔ７リーダーを伴わないペプチドと比較した場合の、Ｔ７リーダーを含むｌｉｒａペプチド（ＬＰ２）の発現におけるパーセンテージ増加を示す図である。 図５Ａ：発現カセット中のＬＰ－８発現タグを含むＴ７リーダー配列の存在下および非存在下での比較ｌｉｒａペプチド発現を示す図である。 図５Ｂ：発現カセット中のＬＰ－８発現タグを含むＴ７リーダー配列の存在下および非存在下でのｌｉｒａペプチド発現に関する濃度測定分析を示す図である。 図５Ｃ：Ｔ７リーダーを伴わないペプチドと比較した場合の、Ｔ７リーダーを含むｌｉｒａペプチド（ＬＰ８）の発現におけるパーセンテージ増加を示す図である。 図６Ａ：Ｎｉ－ＮＴＡクロマトグラフィーを用いるＮ末端融合体を含むＬｉｒａペプチドの精製を示す図である。 図６Ｂ：逆相クロマトグラフィーを用いるＬｉｒａペプチドの精製を示す図である。 図７：可溶性および不溶性画分中のＬｉｒａペプチド発現を示す図である。 図８：テリパラチドの発現に関して試験される、異なる発現タグ配列を含むクローンを示す図である。
配列表の説明
配列番号１（Ｔ７リーダー配列）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲ
配列番号２（発現タグＬＰ－２のアミノ酸配列）
ＧＳＧＱＧＱＡＱＹＬＡＡＳＬＶＶＦＴＮＹＳＧＤ
配列番号３（発現タグＬＰ－３のアミノ酸配列）
ＭＮＮＮＤＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＳＡ
配列番号４（発現タグＬＰ－４のアミノ酸配列）
ＭＶＬＴＫＫＫＬＱＤＬＶＲＥＶＡＰＮＥＱＬＤＥＤＶＥＥＭＬＬＱＩＡＤＤＦＩＥＳＶＶＴＡＡＣＱＬＡＲＨＲＫＳＳＴＬＥＶＫＤＶＱＬＨＬＥＲＱＷＮＭＷＩ
配列番号５（発現タグＬＰ－５のアミノ酸配列）
ＳＲＲＰＲＱＬＱＱＲＱ
配列番号６（発現タグＬＰ－６のアミノ酸配列）
ＳＥＥＰＥＱＬＱＱＥＱＳＲＲＰＲＱＬＱＱＲＱ
配列番号７（発現タグＬＰ－７のアミノ酸配列）
ＡＥＥＥＥＩＬＬＥＶＳＬＶＦＫＶＫＥＦＡＰＤＡＰＬＦＴＧＰＡＹ
配列番号８（発現タグＬＰ－８のアミノ酸配列）
ＳＡＧＤＬＫＦＶＫＶＶＡ
配列番号９（発現タグＬＰ－９のアミノ酸配列）
ＫＴＫＱＬＭＳＦＡＰＳＨＮ
配列番号１０（発現タグＬＰ－１０のアミノ酸配列）
ＭＨＴＰＥＨＩＴＡＶＶＱＲＦＶＡＡＬＮＡＧＤＬＤＧＩＶＡＬＦＡＤＤＡＴＶＥＤＰＶＧＳＥＰＲＳＧＴＡＡＩＲＥＦＹＡＮＳＬＫＬＰＬＡＶＥＬＴＱＥＶＲＡＶＡＮＥＡＡＦＡＦＴＶＳＦＥＹＱＧＲＫＴＶＶＡＰＩＤＨＦＲＦＮＧＡＧＫＶＶＳＩＲＡＬＦＧＥＫＮＩＨＡＣＱ
配列番号１１（ＴＥＶ切断部位のアミノ酸配列）
ＥＮＬＹＦＱ
配列番号１２（Ｌｉｒａペプチドのアミノ酸配列）
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号１３（発現カセットＬＰ１）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号１４（発現カセットＬＰ２）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ２＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＧＳＧＱＧＱＡＱＹＬＡＡＳＬＶＶＦＴＮＹＳＧＤＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号１５（発現カセットＬＰ３）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ３＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＭＮＮＮＤＬＦＱＡＳＲＲＲＦＬＡＱＬＧＧＬＴＶＡＧＭＬＧＰＳＬＬＴＰＲＲＡＳＡＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号１６（発現カセットＬＰ４）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ４＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＭＶＬＴＫＫＫＬＱＤＬＶＲＥＶＡＰＮＥＱＬＤＥＤＶＥＥＭＬＬＱＩＡＤＤＦＩＥＳＶＶＴＡＡＣＱＬＡＲＨＲＫＳＳＴＬＥＶＫＤＶＱＬＨＬＥＲＱＷＮＭＷＩＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号１７（発現カセットＬＰ５）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ５＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＳＲＲＰＲＱＬＱＱＲＱＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号１８（発現カセットＬＰ６）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ６＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＳＥＥＰＥＱＬＱＱＥＱＳＲＲＰＲＱＬＱＱＲＱＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号１９（発現カセットＬＰ７）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ７＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＡＥＥＥＥＩＬＬＥＶＳＬＶＦＫＶＫＥＦＡＰＤＡＰＬＦＴＧＰＡＹＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号２０（発現カセットＬＰ８）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ８＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＳＡＧＤＬＫＦＶＫＶＶＡＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号２１（発現カセットＬＰ９）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ９＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＫＴＫＱＬＭＳＦＡＰＳＨＮＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号２２（発現カセットＬＰ１０）Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ１０＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＨＨＨＨＨＨＭＨＴＰＥＨＩＴＡＶＶＱＲＦＶＡＡＬＮＡＧＤＬＤＧＩＶＡＬＦＡＤＤＡＴＶＥＤＰＶＧＳＥＰＲＳＧＴＡＡＩＲＥＦＹＡＮＳＬＫＬＰＬＡＶＥＬＴＱＥＶＲＡＶＡＮＥＡＡＦＡＦＴＶＳＦＥＹＱＧＲＫＴＶＶＡＰＩＤＨＦＲＦＮＧＡＧＫＶＶＳＩＲＡＬＦＧＥＫＮＩＨＡＣＱＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号２３（発現カセットＬＰ１１）Ｔ７リーダー＋６ＸＡｒｇ＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＲＲＲＲＲＲＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号２４（Ｔ７リーダーを含まない発現カセットＬＰ２）６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ２＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＨＨＨＨＨＨＧＳＧＱＧＱＡＱＹＬＡＡＳＬＶＶＦＴＮＹＳＧＤＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号２５（Ｔ７リーダーを含まない発現カセットＬＰ８）６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ８＋ＴＥＶ認識部位＋Ｌｉｒａペプチドからなる）
ＭＨＨＨＨＨＨＳＡＧＤＬＫＦＶＫＶＶＡＥＮＬＹＦＱＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ
配列番号２６（配列番号２－発現タグＬＰ－２をコードする核酸配列）
ＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴ
配列番号２７（配列番号３－発現タグＬＰ－３をコードする核酸配列）
ＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＡＣＣＴＧＴＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡ
配列番号２８（配列番号４－発現タグＬＰ－４をコードする核酸配列）
ＡＴＧＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＣＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＣＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＴ
配列番号２９（配列番号５－発現タグＬＰ－５をコードする核酸配列）
ＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＡ
配列番号３０（配列番号６－発現タグＬＰ－６をコードする核酸配列）
ＡＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡ
配列番号３１（配列番号７－発現タグＬＰ－７をコードする核酸配列）
ＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＡＴＡＴ
配列番号３２（配列番号８－発現タグＬＰ－８をコードする核酸配列）
ＴＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣ
配列番号３３（配列番号９－発現タグＬＰ－９をコードする核酸配列）
ＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＣＡＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＴ
配列番号３４（配列番号１０－発現タグＬＰ－１０をコードする核酸配列）
ＡＴＧＣＡＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＣＧＣＧＴＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＴＧＣＡＣＣＧＡＴＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＧＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＡ
配列番号３５（配列番号１３をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ１核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号３６（配列番号１４をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ２＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ２核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号３７（配列番号１５をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ３＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ３核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＣＡＡＣＧＡＣＣＴＧＴＴＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＧＣＡＧＧＴＡＴＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号３８（配列番号１６をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ４＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ４核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＣＣＧＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＧＧＣＡＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＴＧＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＣＧＴＣＡＧＴＧＧＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号３９（配列番号１７をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ５＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ５核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４０（配列番号１８をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ６＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ６核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４１（配列番号１９をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ７＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ７核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＣＡＣＣＧＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣＴＧＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４２（配列番号２０をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ８＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ８核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４３（配列番号２１をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ９＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ９核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＣＡＣＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４４（配列番号２２をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ１０＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ１０核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＡＴＧＣＡＴＡＣＡＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＴＴＧＴＴＣＡＧＣＧＴＴＴＴＧＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＴＧＴＴＧＣＡＣＴＧＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＴＴＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＣＧＣＧＴＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＡＧＣＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＡＡＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＧＣＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＴＴＴＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＴＧＣＡＣＣＧＡＴＴＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＣＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＧＣＡＴＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＴＴＴＧＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４５（配列番号２３をコードする発現カセット－Ｔ７リーダー＋６ＸＡｒｇ＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＬＰ１１核酸配列）
ＡＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＧＧＴＣＡＧＣＡＧＡＴＧＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４６（配列番号２４をコードする発現カセット－６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ２＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＴ７リーダー不含ＬＰ２核酸配列）
ＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＡＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＡＣＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４７（配列番号２５をコードする発現カセット－６ＸＨｉｓ＋発現タグＬＰ８＋ＴＥＶ認識部位＋ＬｉｒａペプチドからなるＴ７リーダー不含ＬＰ８核酸配列）
ＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＧＴＴＧＣＣＧＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡ
配列番号４８（Ｌｉｒａペプチドをコードするコドン最適化型核酸配列）
ＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＴＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＧＴ
配列番号４９（テリパラチドのアミノ酸配列）
ＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ
配列番号５０（テリパラチドをコードするコドン最適化型核酸配列）
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定義
別途定義されない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語は、方法が属する技術分野の当業者により通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものに類似または同等ないずれかのベクター、宿主細胞、方法、および組成物もまた、ベクター、宿主細胞、方法、および組成物の実践または試験において用いることができるが、代表的な例示が本明細書中に記載される。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの介在する値、および範囲内のいずれかの他の明記される値またはその明記される介在する値は、方法および組成物により包含されることが理解される。これらの比較的小さな範囲の上限および下限は、独立して、比較的小さな範囲に含められることができ、かつ明記される範囲中のいずれかの具体的に除外された限界に応じて、これもまた方法および組成物により包含される。明記される範囲が一方または両方の限界を含む場合、それらの含められる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、方法および組成物中に含められる。
明確性のために、別個の実施形態の文脈で記載される方法の一部の特徴はまた、単一の実施形態において組み合わせ中で提供される場合もあることが理解される。逆に、簡潔性のために、単一の実施形態の文脈で記載される方法および組成物の様々な特徴はまた、別個にまたはいずれかの好適な下位組み合わせにおいて提供される場合もある。本明細書中または添付の特許請求の範囲中で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明らかに指示しない限り、複数の指示物を含むことが注記される。特許請求の範囲は、いずれかの任意的な要素を除外するために起草される場合があることがさらに注記される。したがって、この記述は、請求項の要素の記載または「負」の制限の使用に関連して、「単に」、「のみ」等などの排他的用語を使用する際の先行詞として機能することが意図される。
本開示を読んだ際に当業者には明らかなように、本明細書中に記載および例示される個別の実施形態のそれぞれは、本発明の方法の範囲または精神から逸脱することなく、他の実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に分離するか、またはそれらと組み合わせることができる別個の構成要素および特徴を有する。いずれかの列挙される方法は、列挙される事象の順序で、または論理的に可能であるいずれかの他の順序で、行うことができる。
用語「宿主細胞」は、発現構築物の対象に対するレシピエントであり得るか、またはレシピエントであった個別の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含む。好ましい宿主細胞は、温血生物の腸管下部内で一般的に見出されるエシェリキア属のグラム陰性通性嫌気性桿状大腸菌（ｃｏｌｉｆｏｒｍ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である、Ｅ．ｃｏｌｉとしても知られる大腸菌ならびにコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
用語「組換え株」または「組換え宿主細胞」とは、本発明の発現構築物またはベクターを用いてトランスフェクションまたは形質転換されている宿主細胞を意味する。
用語「発現」とは、コード配列によりコードされる生成物の生物学的産生を意味する。大多数の場合に、コード配列を含むＤＮＡ配列が転写されて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。続いて、メッセンジャーＲＮＡが翻訳されて、関連する生物学的活性を有するポリペプチド産物を形成する。また、発現のプロセスは、イントロンを除去するためのスプライシングなどの転写のＲＮＡ産物に対するさらなるプロセシングステップ、および／またはポリペプチド産物の翻訳後プロセシングを含むことができる。
用語「発現ベクター」または「発現構築物」とは、宿主への形質転換後に、挿入された核酸配列の発現を可能にするために設計されたいずれかのベクター、プラスミドまたはビヒクルを意味する。
用語「カセット」または「発現カセット」とは、特異的制限部位で核酸またはポリヌクレオチドへと挿入することができるＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡのセグメントは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。「カセット」または「発現カセット」はまた、宿主細胞における目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの強化された発現を可能にするエレメントも含むことができる。これらのエレメントとしては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが挙げられる。
用語「プロモーター」とは、遺伝子の転写が始まる箇所を規定するＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位の直接的上流または５’末端に位置する。ＲＮＡポリメラーゼおよび必須の転写因子がプロモーター配列に結合し、転写を開始する。プロモーターは、構成的または誘導性プロモーターのいずれかであり得る。構成的プロモーターは、その発現が通常は環境要因または発生的要因により調節されない、それに付随する遺伝子の継続的転写を可能にするプロモーターである。構成的プロモーターは、誘導因子不含条件下で遺伝子発現を駆動し、多くの場合、一般的に用いられる誘導性プロモーターよりも良好な特性を示すので、構成的プロモーターは、遺伝子操作において非常に有用なツールである。誘導性プロモーターは、生物または非生物および化学的または物理的要因の存在または非存在により誘導されるプロモーターである。誘導性プロモーターは、それに機能的に連結された遺伝子の発現を、生物の発生または成長の一部の段階で、または特定の組織もしくは細胞で、オンまたはオフにすることができるので、遺伝子操作において非常に強力なツールである。
用語「機能的に連結された」とは、一方の機能が他方により影響される、単一核酸断片上の核酸配列同士の会合を意味する。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能である（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。
用語「発現タグ」とは、本明細書中で用いる場合、目的のタンパク質に連結することができ、かつ目的の組換えタンパク質の溶解度、安定性および／または発現を支援すると考えられるいずれかのペプチドまたはポリペプチドを意味する。
「切断可能リンカーペプチド」とは、切断認識配列を有するペプチド配列を意味する。切断可能ペプチドリンカーは、酵素的または化学的切断剤により切断されることができる。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で相互に交換可能に用いられて、ペプチド結合または修飾型ペプチド結合により互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を意味する。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学ミメティクスであるアミノ酸ポリマーに対して、ならびに修飾型残基を含む天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに対して適用される。「ポリペプチド」とは、一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、およびタンパク質と広く称される比較的長い鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。同様に、「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む少なくとも２つの共有結合されたアミノ酸を意味する。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチドミメティクス構造から構成されることができる。つまり、「アミノ酸」、または「ペプチド残基」とは、本明細書中で用いる場合、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸の両方を意味する。「アミノ酸」としては、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基が挙げられる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置のいずれかであり得る。
本発明は、ｌｉｒａペプチドなどの生物学的に活性なペプチドの発現の増加および効率的生産のための、発現構築物、ベクターおよび組換え宿主細胞を提供する。
本発明に従って生成されるペプチドは、短い融合タグを用いることを理由として、先行技術のプロセスに従って生成されるペプチドよりも効率的に生成されることができる。現行の方法は、融合タンパク質の発現に対して大型の融合タグを用い、これが目的の所望のペプチドの潜在的収量を減少させる。このことは、所望のペプチドが３１アミノ酸であるｌｉｒａペプチドのように小さい状況では、特に問題がある。そのような状況では、収量を最大化するために、最小の考えられる融合タグを用いることが有利である。
本発明は、目的のタンパク質をコードする核酸がＮ末端でＴ７リーダーペプチドおよび発現タグに機能的に融合している発現構築物を提供することにより、宿主細胞において目的のタンパク質の高収量を達成するための多次元アプローチを考慮する。
実施形態では、発現カセットは、目的のタンパク質をコードする核酸を含む。
重要な実施形態では、発現カセットはまた、目的のタンパク質のＮ末端に融合したＴ７リーダーペプチド、発現タグおよび切断可能リンカーを含む融合ポリペプチドをコードすることもできる。
実施形態では、発現カセットはまた、目的のタンパク質のＮ末端に融合したＴ７リーダーペプチド、ポリヒスチジンタグ、発現タグおよび切断可能リンカーを含む融合ポリペプチドをコードすることもできる。
目的のタンパク質は、好ましくは、生物活性ポリペプチドである。より好ましくは、これは、ヒトまたは動物における疾患を治療するために有用である治療用タンパク質を含む。
本発明の実施形態では、目的のタンパク質の発現レベルは、少なくとも８５％増加する。
別の実施形態では、目的のタンパク質は、１００アミノ酸未満である治療用ペプチドを含む。好ましい実施形態では、目的のペプチドとしては、限定するものではないが、Ｌｉｒａペプチド、テリパラチド、エキセナチド、リキシセナチド、テデュグルチド、またはセマグルチドなどのペプチドが挙げられる。
発現タグとは、目的のタンパク質に連結することができ、かつ目的の組換えタンパク質の溶解度、安定性および／または発現を支援すると考えられるいずれかのペプチドまたはポリペプチドを意味する。
さらなる実施形態では、発現カセットは、配列番号２～１０に示される通りのアミノ酸配列を有する発現タグをコードする核酸配列を含む。好ましい実施形態では、発現カセットは、配列番号２（ＬＰ－２）または配列番号８（ＬＰ－８）に示される通りのアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、核酸配列は、コドン最適化として公知である、稀なコドンの代わりに宿主細胞における発現に対して好ましいコドンを含む。用語「コドン最適化型」とは、本明細書中で用いる場合、宿主生物に関して好ましいコドンへの、遺伝子または核酸分子のコード領域中のコドンの変更を意味する。
特定の実施形態では、核酸は、「コドン縮重」を示す場合がある。「コドン縮重」とは、構造的に異なるヌクレオチドと同じ機能を果たすかまたは同じ出力を得ることができるヌクレオチドを意味する。
一実施形態では、コドン最適化型発現タグは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示される通りのヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、コドン最適化型発現カセットは、発現タグ、ＨＩＳタグ、ＴＥＶ認識部位をコードする核酸、およびｌｉｒａペプチドをコードする核酸を含む。コドン最適化型発現カセットは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６に示される通りのヌクレオチド配列を含む。
実施形態では、発現カセットは、切断可能リンカーペプチドをコードするヌクレオチドを含む。好ましくは、発現カセットは、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼによって切断可能である切断可能リンカーペプチドをコードする。
好ましい実施形態では、発現カセットは、配列番号１１に示される通りのアミノ酸配列を有する改変型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードする。
実施形態では、本発明は、以下の機能的に連結された核酸配列：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）切断可能ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む、目的のタンパク質の高レベル発現のための発現カセットを提供し、このとき、発現カセットの前記ポリヌクレオチド配列は、プロモーターに機能的に連結される。
別の実施形態では、本発明は、以下の機能的に連結された核酸配列：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｃ）切断可能リンカーをコードするポリヌクレオチド；および
ｄ）配列番号１２に示される通りのアミノ酸配列を含むｌｉｒａペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチド
を含む、ｌｉｒａペプチドの発現のための発現カセットを提供する。
本発明の発現カセットは、プロモーターを含む。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得るであろう。当業者に公知の構成的または誘導性プロモーターを、本発明の１つまたは複数の実施形態における発現カセット中で用いることができる。
実施形態では、本発明は、目的のタンパク質を発現するための発現ベクターを提供し、このとき、発現ベクターは、少なくとも１コピーの上記の発現カセットを含む。
発現ベクターは、発現カセットの発現を調節するための調節配列、転写終結配列、選択可能マーカー、およびマルチクローニング部位をさらに含むことができる。ベクターはまた、コードされるポリペプチドの標的化された輸送のためのシグナル配列を追加的に含むこともできる。
実施形態では、本発明に対して好適なベクターとしては、限定するものではないが、ｐＤ４５１．ＳＲ、ｐＤ４３１．ＳＲ、ｐＥＴ２８、ｐＥＴ３６、ｐＧＥＸ、ｐＢＡＤ、ｐＱＥ９、ｐＲＳＥＴなどが挙げられる。
実施形態では、本発明は、上記の発現ベクターを含む組換え宿主を提供する。好適な宿主細胞としては、限定するものではないが、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクムおよび枯草菌が挙げられる。好ましい実施形態では、大腸菌が組換え宿主として用いられる。
実施形態では、組換え宿主細胞は大腸菌であり、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ａｌ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＤＨ５ｃｔ、Ｗ３１ １０、Ｂ８３４、ｏｒｉｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）、Ｔ７、ＥＲ２５６６およびＣ４３（ＤＥ３）から選択される菌株が挙げられる。
実施形態では、本発明の発現ベクターは、組換え宿主中で発現されて、融合ペプチドを生成する。
実施形態では、本発明は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する発現タグポリペプチド；および
ｃ）切断可能ペプチドリンカー
を含み、融合ポリペプチドを取得するために、目的のタンパク質のアミノ末端に融合した、融合ポリペプチドを提供する。
実施形態では、本発明は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチド；
ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する発現タグポリペプチド；および
ｃ）切断可能リンカーペプチド
を含み、融合ポリペプチドを取得するために、配列番号１２に示される通りのアミノ酸配列を含むｌｉｒａペプチドまたはその機能的変異体のアミノ末端に融合した、融合ポリペプチドを提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および配列番号２２に示される通りの融合ポリペプチドを提供する。
本発明はまた、目的のタンパク質の増加した産生のための方法も提供し、このとき、前記目的のタンパク質は、切断可能リンカーで融合タンパク質を切断することにより取得される。
実施形態では、本発明はまた、
ａ）
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ．配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉｉ．切断可能ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド；および
ｉｖ．目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む発現構築物を構築するステップ；
ｂ）発現ベクターへと発現構築物を挿入するステップ；
ｃ）発現ベクターを用いて組換え宿主を形質転換するステップ；
ｄ）融合タンパク質を発現させるために至適条件下で組換え宿主を生育させるステップであって、融合タンパク質は、目的のタンパク質のＮ末端に融合したＴ７リーダーポリペプチド、発現タグ、および切断可能ペプチドリンカーを含む、ステップ；
ｅ）細胞から融合タンパク質を単離するステップ；および
ｆ）切断可能リンカーペプチドで融合タンパク質を切断して、目的のタンパク質を取得するステップ
を含む、目的のタンパク質を生成するための方法も提供する。
実施形態では、本発明はまた、
ａ）
ｉ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉ．配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｉｉｉ．切断可能ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド；および
ｉｖ．配列番号１２のアミノ酸配列を含むｌｉｒａペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチド
を含む、発現構築物を構築するステップ；
ステップ；
ｂ）発現ベクターへと発現構築物を挿入するステップ；
ｃ）発現ベクターを用いて組換え宿主を形質転換するステップ；
ｄ）融合タンパク質を発現させるために至適条件下で組換え宿主を生育させるステップであって、融合タンパク質は、ｌｉｒａペプチドのＮ末端に融合したＴ７リーダーポリペプチド、発現タグ、および切断可能ペプチドリンカーを含む、ステップ；
ｅ）細胞から融合タンパク質を単離するステップ；および
ｆ）切断可能リンカーペプチドで融合タンパク質を切断して、ｌｉｒａペプチドを取得するステップ
を含む、ｌｉｒａペプチドを生成するための方法も提供する。
リラグルチドは、ヒトＧＬＰ－１のアナログであり、かつＧＬＰ－１受容体アゴニストとして作用する。リラグルチドは、Ｃ－１６脂肪酸（パルミチン酸）をペプチド前駆体（配列番号１２に示される通りのｌｉｒａペプチド）の２６位の残余のリジン残基上のグルタミン酸スペーサーと連結させることにより作製される。
別の実施形態では、本発明は、
ａ）組換えベクター（発現構築物）の構築、
ｂ）大腸菌への発現構築物の形質転換、
ｃ）ペプチド発現に関するクローンの評価、
ｄ）タグ付きＬｉｒａペプチドの精製、
ｅ）Ｎ末端融合タグの切断およびＬｉｒａペプチドの精製
のステップを含む、Ｌｉｒａペプチドの生成のための方法を提供する。
本明細書中で用いられる標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、かつＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）に記載されている。
上記の開示は、本発明を広く記載する。より完全な理解を、以下の具体的実施例を参照することにより得ることができる。この実施例は、例示目的のみのために記載され、かつ本発明の範囲を限定することは意図されない。具体的な用語が本明細書中で利用されてきたが、そのような用語は、説明的な意味であることが意図され、限定の目的のためであることは意図されない。
本発明の様々な実施形態が、以下の実施例を通じてさらに規定される。以下の実施例は、本発明の例示の目的のためのものであり、かつ決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１：Ｌｉｒａペプチド発現プラスミド構築物
Ｎ末端融合体の組み合わせを含むｌｉｒａペプチドをコードするＤＮＡ（図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ）および（配列番号１３～２３）を、大腸菌に対してコドン最適化し、合成した。
大腸菌発現プラスミドｐＤ４５１．ＳＲを、線形化形態（ＳａｐＩ消化）でＡＴＵＭから入手した。異なるＮ末端融合体と組み合わせたｌｉｒａペプチドの合成ＤＮＡを、ＳａｐＩ制限酵素を用いて消化した。制限消化断片を、ｐＤ４５１．ＳＲ線形プラスミドとライゲーションし、大腸菌株へと形質転換した。ｌｉｒａペプチド発現カセットを含む得られたプラスミド（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄおよび図２Ｅ）を、ヌクレオチド配列決定により確認した。
コドン最適化型発現タグは、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４に示される通りのヌクレオチド配列を含む。
コドン最適化型発現カセットは、発現タグをコードする核酸、ＨＩＳタグ、ＴＥＶ認識部位およびｌｉｒａペプチドをコードする核酸を含む。コドン最適化型発現カセットは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７に示される通りのヌクレオチド配列を含む。
実施例２：大腸菌への形質転換およびペプチド発現
配列を確認したカセットＬＰ１～ＬＰ１１を含むプラスミドＤＮＡを、塩化カルシウム熱ショック形質転換法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換し、続いて、５０μｇ／ｍｌカナマイシン抗生物質を含有するＬＢ寒天上にプレーティングした。形質転換された大腸菌細胞を、振盪インキュベーター中で３７℃において一晩、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５ｍｌ ＬＢ培地中で培養し、続いて、１：１００比率で新規培地を用いて培養物を希釈し、ＯＤが約０．６に到達するまで増殖させた。
続いて、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、３７℃で４時間、振盪インキュベーター中でインキュベートした。培養細胞のＯＤを標準化し、その後、ペプチド発現分析のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした（図３Ａ）。ｌｉｒａペプチドの発現が、ＬＰ１（配列番号３５）、ＬＰ３（配列番号３７）、およびＬＰ１１（配列番号４５）を除くすべてのカセットに関して、ゲル上で観察された。
Ｉｍａｇｅ－Ｑｕａｎｔ８００ゲルドキュメンテーションシステムおよびＧＥからのそのソフトウェアを用いて、各レーンの総タンパク質間でのｌｉｒａペプチドバンド密度を定量化するために、ゲルを濃度測定分析に供した。
クローンの選択は、ｌｉｒａペプチド収量がより高くなることが予期されるように、発現タグの最小サイズおよびゲル上のｌｉｒａペプチドバンドのより高い密度に基づいた。
発現タグを含まないｌｉｒａペプチドはゲル上でのいかなる発現も示さなかったことが特定され、このことは、発現タグが、発現に対して必須であることを示す。それらの発現タグサイズが比較的小さく、かつｌｉｒａペプチドバンド密度が比較的高かったので、ＬＰ２およびＬＰ８クローンを、さらなる分析のために選択した（図３Ｂ）。
ＬＰ２およびＬＰ８クローンにおいてｌｉｒａペプチド発現に関するＴ７リーダーおよび発現タグの間での相乗効果があるか否かを特定するために、本発明者らは、Ｔ７リーダーを含まないＬＰ２およびＬＰ８カセットを構築および評価した（配列番号２４および２５）ならびに（図２Ｃおよび図２Ｅ）。
Ｔ７リーダーを含むＬＰ２およびＬＰ８のペプチド発現は、Ｔ７リーダーを含まないＬＰ２およびＬＰ８よりも少なくとも８５％パーセント高いことが特定された（図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃおよび図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ）。
実施例３：Ｎ末端融合体を含むＬｉｒａペプチドの精製
超音波破砕手順を用いて細胞を溶解させ、続いて溶解物を遠心分離し、その後、８Ｍ尿素中で不溶性ペレットを溶解させた。
サンプルをＮｉ－ＮＴＡマトリックスにロードし；Ｈｉｓタグ付きタンパク質は結合し、他のタンパク質はマトリックスを通過する。洗浄後、ｈｉｓタグ付きペプチドを、段階勾配によってイミダゾールを用いて溶出し、不純物からペプチドを分離した（図６Ａ）。
実施例４：Ｎ末端融合タグの除去およびＬｉｒａペプチドの精製
精製したタグ付きｌｉｒａペプチドをＴＥＶプロテアーゼに供し、Ｎ末端融合タグを切断した。続いて、サンプルを逆相カラムクロマトグラフィーにロードし、ｌｉｒａペプチドを精製した（図６Ｂ）。精製したｌｉｒａペプチドアミノ酸配列および完全な質量を、ＬＣ／ＭＳを用いて確認した。
実施例５：テリパラチドの発現
Ｔ７リーダーペプチド、ポリヒスチジンタグ、発現タグ（配列番号２６～３４）、および改変型ＴＥＶ切断可能リンカーを含むＮ末端融合体と組み合わせた、配列番号４９のアミノ酸配列を含むテリパラチドをコードするＤＮＡを、大腸菌に対してコドン最適化し、合成した。配列番号２６～３４の発現タグを含む発現構築物は、ＴＰ２～ＴＰ１０と命名される。発現構築物ＴＰ１はいかなる発現タグも含まず、発現構築物ＴＰ１１はＴ７リーダー＋６ＸＡｒｇ＋ＴＥＶ認識部位＋テリパラチドを含む。
大腸菌発現プラスミドｐＤ４５１．ＳＲを、線形化形態（ＳａｐＩ消化）でＡＴＵＭから入手した。異なるＮ末端融合体と組み合わせたテリパラチドの合成ＤＮＡを、ＳａｐＩ制限酵素を用いて消化した。制限消化断片を、ｐＤ４５１．ＳＲ線形プラスミドとライゲーションし、大腸菌株へと形質転換した。テリパラチド発現カセットを含む得られたプラスミドを、ヌクレオチド配列決定により確認した。
配列を確認したカセットＴＰ１～ＴＰ１１を含むプラスミドＤＮＡを、塩化カルシウム熱ショック形質転換法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へと形質転換し、続いて、５０μｇ／ｍｌカナマイシン抗生物質を含有するＬＢ寒天上にプレーティングした。形質転換された大腸菌細胞を、振盪インキュベーター中で３７℃において一晩、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５ｍｌ ＬＢ培地中で培養し、続いて、１：１００比率で新規培地を用いて培養物を希釈し、ＯＤが約０．６に到達するまで増殖させた。
続いて、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで添加し、３７℃で４時間、振盪インキュベーター中でインキュベートした。培養細胞のＯＤを標準化し、その後、ペプチド発現分析のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードした（図８）。未誘導（ＵＩ）サンプルを対照として用いた。テリパラチドの発現が、ＴＰ３を除くすべてのカセットに関して、ゲル上で観察された。
本発明の利点
本研究において、ｌｉｒａペプチドの高い発現レベルが、Ｔ７リーダーと組み合わせたタグＬＰ－２（２３ＡＡ）およびタグＬＰ－８（１２ＡＡ）などの非常に短い融合タグを用いて達成された。融合タグは、封入体への凝集を誘導し、タンパク質の安定性を増加させ、宿主細胞分解酵素の作用からペプチドを保護し、また発現後精製に役立つであろう。可溶性および不溶性画分中のｌｉｒａペプチドの発現を示す図７は、融合ペプチドのうちの大多数が不溶性画分中で特定されたことを示す。本発明のタグは、ＧＳＴ（２６ｋＤａ）、チオレドキシンＴｒｘ（１２ｋＤａ）、ＭＢＰタグ（４２ｋＤａ）、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）１４ｋＤａ、およびＳＵＭＯ １４ｋＤａなどの一般的に用いられる融合タグと比較した場合に、非常にサイズが小さい。目的のペプチドの発現を改善するために最も短い考えられるペプチドタグを用いることにより、大きな融合タグを用いることの制限を克服するとともに収量を改善し、それにより製造コストを低減することができる。

Claims (25)

  1. ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｃ）切断可能ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド；および
    ｄ）目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    を含む、目的のタンパク質の発現のための発現カセットであって、
    発現カセットのポリヌクレオチド配列が、プロモーターに機能的に連結される、
    上記発現カセット。
  2. ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
  3. 切断可能リンカーが、配列番号１１に示される通りのアミノ酸配列を有する改変型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１に記載の発現カセット。
  4. 目的のタンパク質が、１００アミノ酸未満である治療用ペプチドを含む、請求項１に記載の発現カセット。
  5. 目的のタンパク質が、Ｌｉｒａペプチド、テリパラチド、エキセナチド、リキシセナチド、テデュグルチド、およびセマグルチドを含む群から選択される、請求項１に記載の発現カセット。
  6. 目的のタンパク質がＬｉｒａペプチドである、請求項１に記載の発現カセット。
  7. 目的のタンパク質の発現レベルが少なくとも８５％増加する、請求項１に記載の発現カセット。
  8. ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を含む発現タグポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
    ｃ）切断可能ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド；および
    ｄ）配列番号１２に示される通りのアミノ酸配列を含むｌｉｒａペプチドまたはその機能的変異体をコードするポリヌクレオチド
    を含む、ｌｉｒａペプチドの発現のための発現カセットであって、
    発現カセットのポリヌクレオチド配列が、プロモーターに機能的に連結される、
    上記発現カセット。
  9. 切断可能リンカーが、配列番号１１に示される通りのアミノ酸配列を有する改変型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む、請求項８に記載の発現カセット。
  10. 配列番号３６～４４に示される通りのポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の発現カセット。
  11. 目的のタンパク質の発現のための発現ベクターであって、少なくとも１コピーの請求項１～１０のいずれか一項からの発現カセットを含む、発現ベクター。
  12. 目的のタンパク質の発現における使用のための、請求項１に記載の発現カセットまたは請求項１１に記載の発現ベクター。
  13. 発現ベクターを含む、目的のタンパク質の強化された産生のための宿主細胞であって、
    該発現ベクターが、請求項１～１０からの発現カセットのうちのいずれか１つを含む、
    上記宿主細胞。
  14. 大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミクムおよび枯草菌を含む群から選択される、請求項１３に記載の宿主細胞。
  15. 大腸菌株が、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ Ａｌ、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＤＨ５ｃｔ、Ｗ３１ １０、Ｂ８３４、ｏｒｉｇａｍｉ、Ｒｏｓｅｔｔａ、ＮｏｖａＢｌｕｅ（ＤＥ３）、Ｌｅｍｏ２１（ＤＥ３）、Ｔ７、ＥＲ２５６６およびＣ４３（ＤＥ３）を含む群から選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。
  16. ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＴ７リーダーポリペプチド；
    ｂ）配列番号２～１０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する発現タグポリペプチド；および
    ｃ）切断可能ペプチドリンカー
    を含み、融合ポリペプチドを取得するために、目的のタンパク質のアミノ末端に融合した、融合ポリペプチド。
  17. ポリヒスチジンタグをさらに含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
  18. 切断可能リンカーが、配列番号１１に示される通りのアミノ酸配列を有する改変型ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
  19. 目的のタンパク質が、１００アミノ酸長未満である治療用ペプチドを含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
  20. 目的のタンパク質が、Ｌｉｒａペプチド、テリパラチド、エキセナチド、リキシセナチド、テデュグルチド、およびセマグルチドを含む群から選択される、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
  21. 目的のタンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列に示される通りのｌｉｒａペプチドまたはその機能的等価物である、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
  22. 配列番号１４～２２に示される通りのアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。
  23. 目的のタンパク質を生成するための方法であって、
    ａ）好ましい条件下で請求項１３～１５のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養して、請求項１６～２２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを取得するステップ；
    ｂ）ステップａ）から取得される融合ポリペプチドを単離するステップ；および
    ｃ）切断可能リンカーでステップｂ）から取得される融合ポリペプチドを切断して、目的のタンパク質を取得するステップ
    を含む、方法。
  24. 目的のタンパク質が、Ｌｉｒａペプチド、テリパラチド、エキセナチド、リキシセナチド、テデュグルチド、およびセマグルチドを含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 目的のタンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列に示される通りのｌｉｒａペプチドまたはその機能的等価物である、請求項２３に記載の方法。
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