JP2024512905A - 新規のｐｄ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位 - Google Patents
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Abstract
本開示は、参照ＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有する新規のＰＤ－１結合ドメインを含む、多重特異性結合部位に関連する。そのような多重特異性結合部位は、参照ＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ヒトＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を、さらに提供する。本開示は、具体的には新規のＰＤ－１結合ドメインとＬＡＧ－３結合ドメインとを含む多重特異性結合部位に関連する。また、疾患を、具体的には癌などの抑制された免疫系に関連する疾患を、本開示の多重特異性結合部位を用いて治療するための方法も、提供される。本開示はさらに、新規のＰＤ－１結合ドメインとＬＡＧ－３結合ドメインとをコードする核酸を含む、ベクターおよび細胞に関連する。【選択図】 なし
Description
本開示は、抗体の分野に関連する。具体的には、異常細胞（ａｂｅｒｒａｎｔ ｃｅｌｌｓ）が関わる疾患の治療のための、治療用抗体の分野に関連する。さらに具体的には、ヒトＰＤ－１に結合する新規の結合ドメインを含む、多重特異性結合部位に関連する。
癌は、その疾患の治療において多くの進歩がなされ、癌に至る分子事象についての知識が増加したにもかかわらず、依然として世界における主要な死因である。従来、癌の創薬のほとんどは、細胞に不可欠な機能を阻害し、分裂中の細胞を死滅させる薬剤に焦点を当ててきた。しかしながら、進行癌の場合、患者が治療により生命を脅かす副作用に苦しむほどまで、どんなに積極的に適用しても、化学療法によって完全治癒することはほとんどない。ほとんどの場合、患者の腫瘍は増殖を止めるか、または一時的に縮小する（寛解と呼ばれる）が、再び、時にはより急速に増殖を開始し（再発と呼ばれる）、ますます治療が困難になる。過去数年間、癌の医薬品開発の焦点は、広範な細胞毒性化学療法から、毒性のより少ない標的細胞増殖抑制療法へと移ってきた。標的療法による進行癌の治療は、白血病および他のいくつかの癌で臨床的に検証されている。しかしながら、大多数の癌腫において、標的アプローチは、大多数の患者で癌を完全に消滅させるのに十分な効果がないことが、依然として証明されている。
癌の標的化は、例えば、癌が生存および／または増殖のために依存するシグナル伝達タンパク質に向ける小分子；腫瘍特異性タンパク質を用いたワクチン；腫瘍細胞を積極的に死滅させる免疫細胞を用いた細胞療法、および、細胞傷害性分子を腫瘍へ標的とし、シグナル伝達を妨げる抗体、および／またはホストの免疫系を腫瘍細胞へ（再度）向ける抗体、などを含む、様々な異なる方法を使用して達成されてきた。
治療用抗体の開発中のクラスは、二重特異性抗体であり、それは異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する、２つの異なる結合サイトを含む。二重特異性抗体は、いくつかの応用のために設計されうる。第一に、二重特異性抗体は、単一特異性抗体よりも高い組織特異性を与えうる。いくつかの腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞によって（過剰）発現されるだけでなく、正常で健康な細胞上にも発現される。特定のタイプの癌に関わる２つの異なる腫瘍関連抗原に向けられる二重特異性抗体は、抗体を腫瘍サイトへ特異的に標的とすることができ、そこで抗体は腫瘍細胞の死滅を誘導し、それにより抗原の一方のみを発現する非腫瘍細胞への結合を防ぎ、その結果、オフサイト毒性を減少させる。他の作用機序には、例えば免疫細胞の腫瘍細胞へのエンゲージメント、および腫瘍増殖のために必要な２つのシグナル伝達経路の破壊などを含む。
例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、およびＴＩＭ－３のような免疫チェックポイントタンパク質は、抗体療法の興味深い標的である。現在までに、ＰＤ－１を標的とする多くの単一特異性抗体が、ＰＤ－１標的結合ドメインを含むある二重特異性抗体と同様に、報告されている。しかしながら、これらの二重特異性抗体の各々は、効果的な治療薬の生産において独自の課題を有する。従って、新規の効果的なＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体の開発が、依然として必要とされている。
本開示の目的のひとつは、ヒト疾患の治療のための、具体的には癌の治療のための新たな医薬品を提供することである。この目的は、新規の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位の提供によって、具体的には新規の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインと抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインとを含む二重特異性抗体によって、満たされる。
ある実施形態において、本開示は、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位であって、
参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
ある実施形態において、本開示はまた、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載されたＰＤ－１結合ドメインとヒトＬＡＧ－３に結合する結合ドメインとを含む、多重特異性抗体をさらに提供する。
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載された多重特異性結合部位の有効量を含む、医薬組成物をさらに提供する。
ある実施形態において、本開示はまた、疾患の治療、例えば抑制された免疫系に関連する疾患または癌の治療に使用するための、本明細書に記載された多重特異性結合部位、および本明細書に記載された医薬組成物を提供する。
ある実施形態において、本開示は、疾患を治療するための方法であって、
本明細書に記載された、多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法を提供する。
本明細書に記載された、多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法を提供する。
ある実施形態において、本開示は、癌を治療するための方法であって、
本明細書に記載された、多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法を提供する。
本明細書に記載された、多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法を提供する。
ある実施形態において、本開示は、
本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書に記載された抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
ベクターをさらに提供する。
本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書に記載された抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
ベクターをさらに提供する。
ある実施形態において、本開示は、
本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書に記載された抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
細胞をさらに提供する。
本明細書に記載された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書に記載された抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
細胞をさらに提供する。
本開示は、本明細書に記載された多重特異性結合部位を産生する細胞を、さらに提供する。
ある実施形態において、本開示は、本明細書に記載された多重特異性結合部位を産生する方法、およびそれらのバリアントを産生する方法を提供する。
本開示は、いくつかの抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、配列番号１～８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、およびそのような抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位を記載する。
プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）は、受容体のＣＤ２８ファミリーに属する細胞表面受容体であり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現する。ＰＤ－１は現在、２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に結合することが知られている。ＰＤ－１は、免疫チェックポイントとして機能し、Ｔ細胞の活性化を阻害することによって免疫系をダウンレギュレーションさせる際に重要な役割を果たし、その結果、自己免疫を減少させ、自己寛容を促進する。ＰＤ－１の阻害効果は、リンパ節の抗原特異性Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラム細胞死）を促進すると同時に、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを減少させるという、二重のメカニズムを通じて達成されると考えられている。ＰＤ－１はまた、ＰＤＣＤ１；プログラム細胞死１；全身性エリテマトーデス感受性２；タンパク質ＰＤ－１；ＨＰＤ－１；ＰＤ１；プログラム細胞死１タンパク質；ＣＤ２７９抗原；ＣＤ２７９；ＨＰＤ－Ｌ；ＨＳＬＥ１；ＳＬＥＢ２；およびＰＤ－１などの、多くの異なる別名でも知られている。ＰＤ－１の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：８７６０；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５１３３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９；ＯＭＩＭ：６００２４４；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５１１６である。ＰＤ－１の活性を阻害する新しいクラスの薬剤、ＰＤ－１阻害剤は、腫瘍を攻撃する免疫系を活性化し、それゆえある種の癌の治療に一定の成功を収めている。
ＬＡＧ－３は、リンパ球活性化３；リンパ球活性化遺伝子３；ＣＤ２２３抗原；タンパク質ＦＤＣ；ＣＤ２２３；ＬＡＧ－３；またはＦＤＣなどの、多くの異なる名称で知られている。ＬＡＧ－３の外部ＩＤは：ＨＧＮＣ：６４７６；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３９０２；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００８９６９２；ＯＭＩＭ：１５３３３７；およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１８６２７である。ＬＡＧ－３は、ＣＤ４と密接な関係がある。ＬＡＧ－３は、ヒト１２番染色体（１２ｐ１３．３２）上に、ＣＤ４遺伝子に隣接して位置しており、その配列は、ＣＤ４と約２０％同一である。ＬＡＧ－３タンパク質は、ＣＤ４よりも高い親和性で、主要組織適合遺伝子複合体２（ＭＨＣクラスＩＩ）の非正則領域（ｎｏｎｈｏｌｏｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）に結合する。ＬＡＧ－３は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）およびアレルギー性Ｔ細胞の両方で協調的にアップレギュレーションする、様々な免疫チェックポイント受容体の１つである。ＬＡＧ－３は、Ｔ細胞の増殖、活性化および恒常性を、逆方向に制御しうる。
ある実施形態において、多重特異性結合部位の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、少なくとも重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域は、本明細書でさらに説明されるように、任意の適切な軽鎖可変領域でありうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である。そのような軽鎖はまた、当該技術分野では「一般的な軽鎖」とも呼ばれる。
ある実施形態において、本開示は、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
ある実施形態において、本開示は、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを、具体的には単一の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む、多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
前記多重特異性結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインが、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有するかどうかを決定するには、両方の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの結合親和性を、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定することにより行うことができる。従って、ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または多重特異性結合部位の結合親和性、および、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または参照抗ヒトＰＤ－１抗体の結合親和性は、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定される。ある実施形態において、アッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）のバイオセンサーシステム、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）などの、結合親和性を測定するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するアッセイである（Friguet B et al. (1985) J. Immunol Methods; 77(2): 305-319、およびHanel C et al. (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-184参照）。本明細書で提供される、ＰＤ－１結合ドメインの、または多重特異性結合部位の結合親和性値は、実施例４に記載された方法で得られる。
簡単に言うと、実施例４は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置を使用して２５℃で、ＳＰＲを行うことを記載する。抗ヒトＦｃ抗体は、ＳシリーズセンサーチップＣＭ５のフローセル上にアミンカップリングを介して固定化され、固定化レベルは～９０００ＲＵである。抗ＰＤ－１抗体の所望の捕捉レベル（１００～１５０ＲＵ）は、予め決められた濃度の抗ＰＤ－１抗体を、各チャンネルのアクティブフローセルを通して１０μＬ／分の流速で６０秒間流すことにより、達成される。ＰＤ－１の３倍連続希釈濃度シリーズ（合計７濃度、最高３００ｎＭ）およびランニングバッファは、２４０秒間（結合時間）注入され、すぐに４８０秒間（解離時間）４５μＬ／分の流速でランニングバッファが続く。３０μＬ／分の流速で３Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間注入し、表面が再生される。結合キネティクス（ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）および親和性パラメータは、１対１結合モデルへのデータのグローバルフィッティングから得られる。
好ましくは、ＳＰＲはＩｇＧフォーマットで抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて行われ、ＰＤ－１との１価相互作用の結合親和性を測定する。
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは多重特異性結合部位は、本明細書に記載される、例えば実施例４に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対して少なくとも１０倍高い結合親和性を有する。ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは多重特異性結合部位は、本明細書に記載される、例えば実施例４に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対して１０～５０倍、１０～４０倍、１０～３０倍、または１０～２０倍高い結合親和性を有する。ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは多重特異性結合部位は、本明細書に記載される、例えば実施例４に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対して１０倍高い結合親和性を有する。
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは多重特異性結合部位は、本明細書に記載される、例えば実施例４に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、約０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には約０．３～０．８ｎＭの範囲の、より具体的には約０．３８～０．７８ｎＭの範囲の、ヒトＰＤ－１に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは多重特異性結合部位は、本明細書に記載される、例えば実施例４に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には０．３～０．８ｎＭの範囲の、より具体的には０．３８～０．７８ｎＭの範囲の、ヒトＰＤ－１に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、結合親和性は、ＰＤ－１との１価相互作用の結合親和性である。
ある実施形態において、結合親和性は、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの両方を用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで測定される。ある実施形態において、結合親和性は、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの両方を用いて、２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットで測定される。ある実施形態において、結合親和性は、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットで、および参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで、測定される。２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットは、例えば、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、または参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメイン、および無関係な標的と結合する結合ドメインを含みうる。
ある実施形態において、本開示はまた、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを、具体的には単一の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む、多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
ある実施形態において、本開示はまた、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを、具体的には単一の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む、多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
前記多重特異性結合部位は、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、少なくとも同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位を提供する。
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインまたは多重特異性結合部位が、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を与えるかどうかを決定するには、両方の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの効力を、または多重特異性結合部位と参照抗体との効力を、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定することにより行うことができる。従って、ある実施形態において、多重特異性結合部位の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの、または多重特異性結合部位の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力、および参照抗ヒトＰＤ－１結合抗体の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力は、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定される。ある実施形態において、アッセイは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイまたはＰＤ－１／ＬＡＧ－３レポーターアッセイである。本明細書で提供される、ＰＤ－１結合ドメインの、または多重特異性結合部位の効力データは、実施例２に記載されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイを用いて、および実施例５に記載されるＰＤ－１／ＬＡＧ－３レポーターアッセイを用いて得られる。
簡単に言うと、実施例２に記載されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイは、ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１と、抗原非依存的にコグネートＴＣＲを活性化するように設計された改変細胞表面タンパク質とを発現する、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である）、およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ヒトＰＤ－１と、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターとを発現する）を使用して、行われる。ＰＤ－Ｌ１細胞またはＰＢＳを含むアッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、一晩インキュベートされる。インキュベート後、ウェルは空にされ、試験および対照ＩｇＧが連続希釈で加えられ、１０μｇ／ｍｌから始めて、６段階４倍滴定を行う。ＩｇＧ無しの対照であるベース対照もまた、調製される。活性が直接比較される必要のあるＩｇＧは、同じプレート上でインキュベートされる。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞が加えられ、アッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、６時間インキュベートされる。６時間のインキュベートに続き、プレートは室温で１０分間放置され、ルシフェラーゼ活性が測定される。
簡単に言うと、実施例５に記載されるＰＤ－１／ＬＡＧ－３レポーターアッセイは、ＰＤ－Ｌ１ Ｒａｊｉ細胞と、Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１およびＬＡＧ－３エフェクター細胞とを使用して、行われる。６～３００μｇ／ｍｌの間で開始し、２～１０の間の希釈倍率（最終アッセイ濃度は２０～１００μｇ／ｍｌの間で開始する）である、６倍連続希釈の試験および対照ＩｇＧ２５μｌが、２５μｌのＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１およびＬＡＧ－３エフェクター細胞またはＰＢＳを含むアッセイプレートに、加えられる。活性が直接比較される必要のあるＩｇＧは、同じアッセイプレート上でインキュベートされる。同じ体積のＰＤ－Ｌ１ Ｒａｊｉ細胞懸濁液が、同じ体積のＳＥＤ溶液（１００ｎｇ／ｍｌのブドウ球菌エンテロトキシンＤ）と混合され、２５μｌのＲａｊｉ／ＳＥＤ混合物が、アッセイプレートに加えられる。アッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、６時間インキュベートされる。６時間のインキュベートの後、アッセイプレートは室温で１０分間放置され、ルシフェラーゼ活性が測定される。
好ましくは、本開示の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、同じ濃度で、好ましくは両方とも２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで使用される。
ある実施形態において、ＰＤ－１－リガンド阻害活性における同等の効力とは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力の５倍の範囲内の効力であり、参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力から５、４、３、および２倍の、好ましくは３倍の、偏差を含む。
ある実施形態において、ＰＤ－１－リガンド阻害活性におけるより高い効力とは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力よりも、５、４、３、または２倍、好ましくは３倍高い効力である。ある実施形態において、ＰＤ－１－リガンド阻害活性における少なくとも同等の、またはそれ以上の効力とは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力よりも、１．１～２．０倍、好ましくは１．２～１．８倍または１．２～１．６倍、より好ましくは１．２～１．４倍高い効力である。
参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、ニボルマブアナログ抗体のＰＤ－１結合ドメインであり、好ましくは比較の対象となる多重特異性結合部位の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインと同じ産生方法を使用して、産生される。参照抗ヒトＰＤ－１結合抗体は、ニボルマブアナログ抗体であり、好ましくは比較の対象となる多重特異性結合部位と同じ産生方法を使用して、産生される。ニボルマブアナログ抗体は、ニボルマブと同じ重鎖可変領域配列（配列番号２０）を有する。ニボルマブアナログ抗体は、ニボルマブと同じ軽鎖可変領域配列（配列番号２１）を有する。
ある実施形態において、多重特異性結合部位の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、配列番号１～８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のうちの１つの、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。
ＣＤＲ配列は、以下を含む様々な方法を使用して定義されうるが、これらに限定されない：Ｋａｂａｔナンバリングスキーム（Kabat et al., J. Biol. Chem.252:6609-6616 (1977)；および／またはKabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)）、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキーム（Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)；Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989；および／またはAl-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997)）、ＨｏｎｅｇｇｅｒとＰｌｕｃｋｔｈｕｎのナンバリングシステム（Honegger and Pluckthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)）、ＭａｃＣａｌｌｕｍのナンバリングシステム（MacCallum et al., J. Mol. Biol.262:732-745 (1996)；および／またはAbhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)）、Ｌｅｆｒａｎｃのナンバリングシステム（Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003)；および／またはHonegger and Pluckthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)）、またはＩＭＧＴに従う（Giudicelli et al., Nucleic Acids Res. 25: 206-21 1 (1997)で議論される）。
これらのナンバリングスキームの各々は、重鎖または軽鎖可変領域のアミノ酸残基が抗原結合に寄与すると予測されることに基づいて、ＣＤＲを定義する。従って、ＣＤＲを同定する各方法は、本開示の結合ドメインのＣＤＲを同定するために使用されうる。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、またはＩＭＧＴに従う。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従う。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａに従う。ある実施形態において、本開示の結合ドメインの重鎖ＣＤＲは、ＩＭＧＴに従う。
ある実施形態において、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、重鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
および
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む。
前記重鎖可変領域は、
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；
および
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む。
Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲは、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
ある実施形態において、多重特異性結合部位の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域は、以下を含み：
－それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
－それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
ある実施形態において、多重特異性結合部位の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域は、以下を含む：
－それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。
－それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－それぞれ、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
－それぞれ、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインはまた、ＰＤ－１結合ドメインバリアントをも含み、ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、１つまたは２つのＨＣＤＲのみが、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。
例えば、アミノ酸バリエーションを導入するための適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第１、第２、および／または第４アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第３、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１３、第１４、および／または第１６アミノ酸；および／または、ＨＣＤＲ３の第６および／または第１３アミノ酸を含むが、それらに限定されない。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ配列は、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
ある実施形態において、本開示は従ってまた、以下を含む抗ヒトＰＤ－１結合ドメインをも提供する：
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｓを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｔ、またはＨであってもよく；
Ｘ２は、Ｙ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、またはＤであってもよく；
Ｘ３は、Ｗ、またはＹであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＹＩＸ１ＹＳＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｘ８ＫＸ９を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｖ、またはＩであってもよく；
Ｘ２は、Ｓ、またはＧであってもよく；
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、Ｌ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、またはＮであってもよく；
Ｘ５は、Ｆ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ６は、Ｎ、またはＳであってもよく；
Ｘ７は、ＳまたはＡであってもよく；
Ｘ８は、ＦまたはＬであってもよく；
Ｘ９は、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、またはＮであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＧＧＹＴＧＸ１ＧＧＤＷＦＤＸ２を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｈ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、またはＳであってもよい。
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｓを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、Ｔ、またはＨであってもよく；
Ｘ２は、Ｙ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、またはＤであってもよく；
Ｘ３は、Ｗ、またはＹであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＹＩＸ１ＹＳＧＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｘ８ＫＸ９を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｖ、またはＩであってもよく；
Ｘ２は、Ｓ、またはＧであってもよく；
Ｘ３は、Ｔ、Ｙ、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｗ、Ｌ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、またはＮであってもよく；
Ｘ５は、Ｆ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ６は、Ｎ、またはＳであってもよく；
Ｘ７は、ＳまたはＡであってもよく；
Ｘ８は、ＦまたはＬであってもよく；
Ｘ９は、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｒ、またはＮであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＧＧＹＴＧＸ１ＧＧＤＷＦＤＸ２を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｙ、Ｈ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｑ、Ｈ、またはＳであってもよい。
アミノ酸バリエーションを導入するための他の適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第２、第３、第４、および／または第５アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第３、第４、第５、第６、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、および／または第１７アミノ酸；および／または、ＨＣＤＲ３の第１、第２、第６、第７、第９、第１０、第１４、第１５、第１６および／または第１８アミノ酸を含むが、それらに限定されない。Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ配列は、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
ある実施形態において、本開示は従ってまた、以下を含む抗ヒトＰＤ－１結合ドメインをも提供する：
－アミノ酸配列ＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、またはＹであってもよく；
Ｘ２は、Ｔ、Ａ、またはＶであってもよく；
Ｘ３は、Ｍ、Ｌ、またはＶであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、またはＴであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＷＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｎ、またはＤであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｓ、またはＴであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、またはＤであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｌ、またはＥであってもよく；
Ｘ６は、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｈ、またはＦであってもよく；
Ｘ７は、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ８は、Ｙ、Ｆ、またはＨであってもよく；
Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＦであってもよく；
Ｘ１０は、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ１１は、Ｄ、Ａ、Ｇ、またはＳであってもよく；
Ｘ１２は、Ｆ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ１３は、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｇであってもよく；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｎ、Ｅ、またはＤであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＧＹＣＸ３Ｘ４ＤＸ５ＣＹＰＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＤＸ９を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｉ、Ｓ、またはＶであってもよく；
Ｘ２は、Ｌ、Ｑ、またはＮであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、またはＤであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、またはＥであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、またはＩであってもよく；
Ｘ６は、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、Ｗ、Ａ、またはＬであってもよく；
Ｘ７は、Ｉ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、またはＩであってもよく；
Ｘ９は、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＬであってもよい。
－アミノ酸配列ＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４を有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｆ、またはＹであってもよく；
Ｘ２は、Ｔ、Ａ、またはＶであってもよく；
Ｘ３は、Ｍ、Ｌ、またはＶであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、Ｈ、Ｎ、Ｖ、またはＴであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＷＩＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、Ｎ、またはＤであってもよく；
Ｘ２は、Ｐ、Ｓ、またはＴであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、またはＱであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、またはＤであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｌ、またはＥであってもよく；
Ｘ６は、Ｐ、Ｙ、Ａ、Ｈ、またはＦであってもよく；
Ｘ７は、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ８は、Ｙ、Ｆ、またはＨであってもよく；
Ｘ９は、Ａ、Ｇ、Ｖ、またはＦであってもよく；
Ｘ１０は、Ｑ、Ｒ、Ｎ、Ｌ、Ｔ、またはＳであってもよく；
Ｘ１１は、Ｄ、Ａ、Ｇ、またはＳであってもよく；
Ｘ１２は、Ｆ、Ｖ、またはＡであってもよく；
Ｘ１３は、Ｔ、Ｋ、Ｈ、Ｇであってもよく；
Ｘ１４は、Ｇ、Ｎ、Ｅ、またはＤであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列Ｘ１Ｘ２ＧＹＣＸ３Ｘ４ＤＸ５ＣＹＰＮＸ６Ｘ７Ｘ８ＤＸ９を有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、Ｉ、Ｓ、またはＶであってもよく；
Ｘ２は、Ｌ、Ｑ、またはＮであってもよく；
Ｘ３は、Ｎ、Ｇ、Ｓ、またはＤであってもよく；
Ｘ４は、Ｔ、Ｓ、Ｐ、Ｎ、またはＥであってもよく；
Ｘ５は、Ｎ、またはＩであってもよく；
Ｘ６は、Ｗ、Ｇ、Ｑ、Ｈ、Ｗ、Ａ、またはＬであってもよく；
Ｘ７は、Ｉ、Ｖ、またはＬであってもよく；
Ｘ８は、Ｆ、Ｌ、またはＩであってもよく；
Ｘ９は、Ｙ、Ｓ、Ｎ、Ｉ、Ｒ、Ｈ、Ｖ、Ｔ、Ｋ、Ａ、またはＬであってもよい。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位の抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号１～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する
重鎖可変領域を含む。
配列番号１～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する
重鎖可変領域を含む。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインはまた、ＰＤ－１結合ドメインバリアントをも含み、これは、上記で言及されたＨＣＤＲにおけるバリエーションに加えて、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインバリアントは、ＣＤＲ領域におけるバリエーションを含まないが、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。そのようなバリアントは、本明細書で開示される配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有し、ＰＤ－１結合特異性を保持することが期待される。従って、ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、以下を含む：
－配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３９に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４０に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４１に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４４に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４５に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４６に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４７に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号５１に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５２に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５３に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号５４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号５７に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５８に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５９に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
－配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号３７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号３８に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号３９に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４０に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４１に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４４に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４５に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４６に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号４７に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号４８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号４９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号５１に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５２に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５３に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号５４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－配列番号８に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号５７に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号５８に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号５９に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、軽鎖可変領域を含む。適切な軽鎖可変領域の例は、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域であり、それぞれ配列番号６０、配列番号６１、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有し、ここで前記ＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、適切な軽鎖可変領域は、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域であり、それぞれ配列番号６０、配列番号６１、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する。ある実施形態において、そのような軽鎖可変領域は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含んでもよい。これらのＬＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域を含む、軽鎖または軽鎖可変領域は、当該技術分野においてＶＫ１－３９／ＪＫ１と呼ばれる軽鎖である。これは一般的な軽鎖である。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、この軽鎖可変領域は、配列番号６０に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号６１に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号６２に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
本開示による「一般的な軽鎖」という用語は、複数の異なる重鎖、すなわち異なる抗原またはエピトープ結合特異性を有する重鎖と、対合可能である軽鎖を指す。一般的な軽鎖は、例えば二重特異性抗体の作製において特に有用であり、両方の結合ドメインが同じ軽鎖を含む場合、抗体産生はより効率的になる。「一般的な軽鎖」という用語は、同一であるか、またはアミノ酸配列にいくつかの差異を有するが、全長抗体の結合特異性に影響を与えない軽鎖を包含する。例えば保存的なアミノ酸変化、すなわち重鎖と対合したときに結合特異性に寄与しないか部分的にしか寄与しない領域のアミノ酸の変化などを、導入し試験することにより、同一ではないが機能的には同等である軽鎖を調製または見出すことは、本明細書で使用される一般的な軽鎖の定義の範囲内で、例えば可能である。
上記で言及されたＬＣＤＲおよび／または軽鎖可変領域を含む一般的な軽鎖とは別に、当該技術分野で知られる他の一般的な軽鎖が使用されうる。そのような一般的な軽鎖の例には、以下を含むが、これらに限定されない：
ＶＫ１－３９／ＪＫ５は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－１５／ＪＫ１は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－２０／ＪＫ１は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
および
ＶＬ３－２１／ＪＬ３は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。
ＶＫ１－３９／ＪＫ５は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－１５／ＪＫ１は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
ＶＫ３－２０／ＪＫ１は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む；
および
ＶＬ３－２１／ＪＬ３は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含む。ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲは、その中で太字および下線で示される。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域の、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、軽鎖可変領域を含み、ここでＬＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ある実施形態において、軽鎖は、配列番号６６に示されるアミノ酸配列を有する、またはこれに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、軽鎖可変領域を含む。
ＶＫ１－３９は、免疫グロブリン可変カッパ１－３９遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変１－３９；ＩＧＫＶ１３９；ＩＧＫＶ１－３９；ＩｇＶκ１－３９としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５７４０；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９３０；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４２３７１である。ＶＫ１－３９の好ましいアミノ酸配列は、配列番号６７として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。２つの好ましい結合配列は、ＶＫ１－３９／ＪＫ１およびＶＫ１－３９／ＪＫ５として示され；別名は、ＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ１＊０１またはＩｇＶκ１－３９＊０１／ＩＧＪκ５＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。これらの名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
ＶＫ３－１５は、免疫グロブリン可変カッパ３－１５遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－１５；ＩＧＫＶ３１５；ＩＧＫＶ３－１５；ＩｇＶκ３－１５としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５８１６；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１３；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２４４４３７である。ＶＫ３－１５の好ましいアミノ酸配列は、配列番号６８として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。好ましい結合配列は、ＶＫ３－１５／ＪＫ１として示され；別名は、Ｖκ３－１５＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
ＶＫ３－２０は、免疫グロブリン可変カッパ３－２０遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンカッパ可変３－２０；ＩＧＫＶ３２０；ＩＧＫＶ３－２０；ＩｇＶκ３－２０としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５８１７；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８９１２；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２３９９５１である。ＶＫ３－２０の好ましいアミノ酸配列は、配列番号６９として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。好ましい結合配列は、ＶＫ３－２０／ＪＫ１として示され；別名は、ＩｇＶκ３－２０＊０１／ＩＧＪκ１＊０１である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
ＶＬ３－２１は、免疫グロブリン可変ラムダ３－２１遺伝子の略である。この遺伝子はまた、免疫グロブリンラムダ可変３－２１；ＩＧＬＶ３２１；ＩＧＬＶ３－２１；ＩｇＶλ３－２１としても知られる。この遺伝子の外部ＩＤは、ＨＧＮＣ：５９０５；Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２８７９６；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１１６６２．２である。ＶＬ３－２１の好ましいアミノ酸配列は、配列番号７０として与えられる。これは、Ｖ領域の配列である。Ｖ領域は、５つのＪ領域のうちの１つと結合しうる。好ましい結合配列は、ＶＬ３－２１／ＪＬ３として示され；別名は、ＩｇＶλ３－２１／ＩＧＪλ３である（ＩＭＧＴデータベース（ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に従った命名法）。この名称は典型的なものであり、遺伝子セグメントのアレルバリアントを包含する。
さらに、当該技術分野において利用可能なＰＤ－１抗体の任意の軽鎖可変領域が、使用されうるか、または、本発明のＰＤ－１結合ドメインと対合したとき抗原結合活性を示すことによる、例えば抗体ディスプレイライブラリなどから容易に入手されうる任意の他の軽鎖可変領域が、使用されうる。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＰＤ－１結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含みうる。任意のＣＨ１ドメイン、具体的にはヒトＣＨ１ドメインが、使用されうる。適切なＣＨ１ドメインの例は、配列番号２９として提供されるアミノ酸配列によって提供される。任意のＣＬドメイン、具体的にはヒトＣＬが、使用されうる。適切なＣＬドメインの例は、配列番号７１として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
「結合部位」とは、タンパク質性分子を指し、例えば以下のような、当該技術分野において利用可能なすべての抗体フォーマットを含む：完全長ＩｇＧ抗体、免疫複合体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、ＢｉＴＥ、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体（ＶＨＨおよびＶＨなど）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ－ジッパー、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ＤＡＲＴ分子、ＴａｎｄＡｂ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）′２、Ｆ（ａｂ）′２－ｓｃＦｖ２、およびイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）。
一実施形態において、多重特異性結合部位は、多重特異性抗体である。本開示に記載された多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる標的またはエピトープに対して特異性を有する、少なくとも２つの結合ドメインを含む、任意の抗体フォーマットの抗体である。ある実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。ある実施形態において、本開示の多重特異性抗体は、Ｆｃ領域またはその一部をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ＩｇＧ１抗体である。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、免疫エフェクター細胞上に発現する細胞表面部位に結合する、結合ドメインをさらに含む。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、本明細書に記載されるＰＤ－１結合ドメインと、抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインとを含む。適切な抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
－配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ＨＣＤＲは、本明細書で提供される配列リスト中の参照される配列番号中で、太字および下線で示される。
－配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。ＨＣＤＲは、本明細書で提供される配列リスト中の参照される配列番号中で、太字および下線で示される。
ある実施形態において、抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含む：
－配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。
－配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
－配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）。
ある実施形態において、本開示のＬＡＧ－３結合ドメインは、ＬＡＧ－３結合ドメインバリアントを含み、ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい。このようなバリアントは、ＬＡＧ－３結合特異性を保持することが期待される。
例えば、アミノ酸バリエーションを導入するための適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第２、および／または第３アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第３、第７、第１０、第１３、および／または第１６アミノ酸；および／または、ＨＣＤＲ３の第１アミノ酸を含むが、それらに限定されない。Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ配列は、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
ある実施形態において、抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、以下を含む：
－アミノ酸配列ＳＸ１Ｘ２ＷＳを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、ＹまたはＦであってもよく；
Ｘ２は、ＹまたはＳであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＹＩＸ１ＹＳＧＸ２ＴＮＸ３ＮＰＸ４ＬＫＸ５を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、ＹまたはＤであってもよく；
Ｘ２は、Ｓ、またはＴであってもよく；
Ｘ３は、ＹまたはＦであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、またはＦであってもよく；
Ｘ５は、ＳまたはＩであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列Ｘ１ＬＬＹＫＷＮＹＶＥＧＦＤＩを有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、ＤまたはＨであってもよい。
－アミノ酸配列ＳＸ１Ｘ２ＷＳを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、ＹまたはＦであってもよく；
Ｘ２は、ＹまたはＳであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＹＩＸ１ＹＳＧＸ２ＴＮＸ３ＮＰＸ４ＬＫＸ５を有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、ＹまたはＤであってもよく；
Ｘ２は、Ｓ、またはＴであってもよく；
Ｘ３は、ＹまたはＦであってもよく；
Ｘ４は、Ｓ、またはＦであってもよく；
Ｘ５は、ＳまたはＩであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列Ｘ１ＬＬＹＫＷＮＹＶＥＧＦＤＩを有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、ＤまたはＨであってもよい。
例えば、アミノ酸バリエーションを導入するための適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第１、第３、および／または第４アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第７、第１０、および／または第１２アミノ酸；および／または、ＨＣＤＲ３の第３アミノ酸を含むが、それらに限定されない。Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ配列は、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
ある実施形態において、抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、以下を含む：
－アミノ酸配列Ｘ１ＹＸ２Ｘ３Ｈを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｓ、Ｎ、またはＲであってもよく；
Ｘ２は、ＧまたはＤであってもよく；
Ｘ３は、Ｍ、ＴまたはＩであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＸ１ＮＫＸ２ＹＸ３ＤＳＶＫＧを有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、ＳまたはＮであってもよく；
Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、またはＨであってもよく；
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、またはＶであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＥＲＸ１ＷＤＶＦＤＩを有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、ＧまたはＤであってもよい。
－アミノ酸配列Ｘ１ＹＸ２Ｘ３Ｈを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、Ｓ、Ｎ、またはＲであってもよく；
Ｘ２は、ＧまたはＤであってもよく；
Ｘ３は、Ｍ、ＴまたはＩであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＶＩＳＹＤＧＸ１ＮＫＸ２ＹＸ３ＤＳＶＫＧを有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、ＳまたはＮであってもよく；
Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、またはＨであってもよく；
Ｘ３は、Ａ、Ｅ、またはＶであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＥＲＸ１ＷＤＶＦＤＩを有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、ＧまたはＤであってもよい。
例えば、アミノ酸バリエーションを導入するための適切な位置には、ＨＣＤＲ１の第１、および／または第３アミノ酸；ＨＣＤＲ２の第５、および／または第８アミノ酸；および／または、ＨＣＤＲ３の第３アミノ酸を含むが、それらに限定されない。Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ配列は、本明細書で提供される配列リスト中で、太字および下線で示される。
ある実施形態において、抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、以下を含む：
－アミノ酸配列Ｘ１ＹＸ２ＭＨを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、ＳまたはＮであってもよく；
Ｘ２は、ＧまたはＡであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＶＩＳＹＸ１ＧＳＸ２ＫＹＹＡＤＳＶＫＧを有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、ＤまたはＨであってもよく；
Ｘ２は、ＮまたはＤであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＤＧＤＮＷＤＸ１ＦＤＩを有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、ＶまたはＡであってもよい。
－アミノ酸配列Ｘ１ＹＸ２ＭＨを有するＨＣＤＲ１であって、
Ｘ１は、ＳまたはＮであってもよく；
Ｘ２は、ＧまたはＡであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＶＩＳＹＸ１ＧＳＸ２ＫＹＹＡＤＳＶＫＧを有するＨＣＤＲ２であって、
Ｘ１は、ＤまたはＨであってもよく；
Ｘ２は、ＮまたはＤであってもよい；
および／または
－アミノ酸配列ＤＧＤＮＷＤＸ１ＦＤＩを有するＨＣＤＲ３であって、
Ｘ１は、ＶまたはＡであってもよい。
ある実施形態において、本開示の抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、
配列番号１１～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する
重鎖可変領域を含む。
配列番号１１～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する
重鎖可変領域を含む。
ある実施形態において、本開示のＬＡＧ－３結合ドメインはまた、ＬＡＧ－３結合ドメインバリアントをも含み、これは、ＨＣＤＲにおけるバリエーションに加えて、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。ある実施形態において、本開示のＬＡＧ－３結合ドメインバリアントは、ＣＤＲ領域におけるバリエーションを含まないが、フレームワーク領域における１または複数のバリエーションを含む。そのようなバリアントは、本明細書で開示される配列に対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有し、ＬＡＧ－３結合特異性を保持することが期待される。従って、ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位のＬＡＧ－３結合ドメインは、以下を含む：
－配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号７４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号７５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号７６に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号７７に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号７８に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号７９に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８２に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８３に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８４に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８５に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８８に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８９に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号９０に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号９１に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号９２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号９３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号９４に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
－配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号７４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号７５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号７６に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号７７に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号７８に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号７９に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８０に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８１に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８２に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８３に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８４に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８５に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８６に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号８７に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号８８に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
－配列番号１６に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号８９に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号９０に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号９１に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
または
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域；
この重鎖可変領域は、配列番号９２に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列；配列番号９３に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列；および配列番号９４に示されるアミノ酸配列のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
ある実施形態において、本開示のＬＡＧ－３結合ドメインは、軽鎖可変領域をさらに含む。適切な軽鎖可変領域の例は、本明細書に記載される軽鎖可変領域であり、例えば、本開示のＰＤ－１結合ドメインについて本明細書に記載される軽鎖可変領域である。当該技術分野において利用可能なＬＡＧ－３抗体の軽鎖可変領域が、使用されうるか、または、本開示のＬＡＧ－３結合ドメインと対合したとき抗原結合活性を示すことによる、例えば抗体ディスプレイライブラリなどから容易に入手されうる任意の他の軽鎖可変領域が、使用されうる。好ましくは、本開示のＬＡＧ－３結合ドメインは、ＶＫ１－３９／ＪＫ１、ＶＫ１－３９／ＪＫ５、ＶＫ３－１５／ＪＫ１、ＶＫ３－２０／ＪＫ１、またはＶＬ３－２１／ＪＬ３軽鎖可変領域を含む。
ある実施形態において、本開示の抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含みうる。任意のＣＨ１ドメイン、具体的にはヒトＣＨ１ドメインが、使用されうる。適切なＣＨ１ドメインの例は、配列番号２９として提供されるアミノ酸配列によって提供される。任意のＣＬドメイン、具体的にはヒトＣＬが、使用されうる。適切なＣＬドメインの例は、配列番号７１として提供されるアミノ酸配列によって提供される。
ある実施形態において、本明細書に開示されるＰＤ－１結合ドメインは、本開示の多重特異性結合部位を産生するために、本明細書に開示される任意のＬＡＧ－３結合ドメインと結合されうる。本開示は従ってまた、表１に示されるように、多重特異性結合部位ＰＢ１～ＰＢ３５をも提供する。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン；
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含む：
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、以下を含み：
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
－配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、
および
－配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む、本開示のＬＡＧ－３結合ドメイン；
ここでＰＤ－１結合ドメインおよびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域、および配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域を含む、参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有する。
ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体が、参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有するかどうかを決定するには、両抗体の結合親和性を、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定することにより行うことができる。従って、ある実施形態において、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体の結合親和性、および参照抗ヒトＰＤ－１抗体の結合親和性は、同じタイプのアッセイで、同じアッセイ条件を使用して、測定される。ある実施形態において、アッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）のバイオセンサーシステム、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）などの、結合親和性を測定するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用するアッセイである（Friguet B et al. (1985) J. Immunol Methods; 77(2): 305-319、およびHanel C et al. (2005) Anal Biochem; 339(1): 182-184参照）。本明細書で提供される、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体の結合親和性値は、実施例１２に記載された方法で得られる。
簡単に言うと、実施例１２は、ＢＩＡｃｏｒｅ－Ｔ２００装置上でＳＰＲを使用して、ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、二重特異性ＩｇＧフォーマットで結合親和性を決定することを記載する。使用される単量体組換え抗原は、以下の通りである：ヒトＬＡＧ－３（ｈｕＬＡＧ－３－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１６４９８－Ｈ０８Ｈ）、カニクイザルＬＡＧ－３（ｃｙＬＡＧ－３－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０８４１－Ｃ０８Ｈ）、ヒトＰＤ－１（ｈｕＰＤ－１－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，カタログ番号１０３７７－Ｈ０８Ｈ）、およびカニクイザルＰＤ－１（ｃｙＰＤ－１－Ｈｉｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５０９－ＰＤ）。ＣＭ５センサーチップの４つのフローチャンネル上へのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃの固定化は、１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０に希釈された４０μｇ／ｍｌの抗体を使用して、アミンカップリングにより行われた。以下の条件が使用される：活性化時間４２０秒、不活性化時間４２０秒、不活性化バッファ：１ＭエタノールアミンｐＨ８．５。固定化密度は、９１５８～９４２８ＲＵの範囲である。試験および対照抗体は、ＣＭ５センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体により、３０μｌ／分の流速で６０秒間捕捉される。捕捉抗体濃度は、ＰＤ－１親和性決定には２０ｎＭ、ＬＡＧ－３親和性決定には１０ｎＭである。この後、流速３０μｌ／分のバッファで、６０秒の安定化時間が続く。抗原の５段階２倍連続希釈液が、捕捉抗体を含むフローセルと参照フローセル（捕捉抗体無し）との両方に、３０μｌ／分で６０秒間注入される。抗原濃度は、ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１には８０ｎＭ～２．５ｎＭ、ヒトＬＡＧ－３およびカニクイザルＬＡＧ－３には４０～１．２５ｎＭである。バッファ効果に対するバックグラウンド補正は、バッファのみの注入により行われ、バックグラウンド除去のために、参照フローセルが使用される。抗体－抗原相互作用に続き、３０μｌ／分で３００秒のオフレート洗浄（ｏｆｆ－ｒａｔｅ ｗａｓｈ）が行われる。サイクル間の再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の注入を、３０μｌ／分で１５μｌずつ２回使用して行われ、その後９０μｌ／分で９０秒の安定化ステップが続く。ＰＤ－１親和性決定には、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファが使用され、一方ＬＡＧ－３には、ＨＢＳ－ＥＰ＋は、最終濃度５００ｍＭ ＮａＣｌまでＮａＣｌが加えられた。結果は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析される。未処理のＲＵシグナルは、ブランク減算され（捕捉抗体無しのチャンネルで）、バッファ効果に対してバックグラウンド補正される（２回目の注入で抗原の代わりにバッファを使用し、捕捉抗体による実行を減算する）。１：１結合ラングミュアフィッティングが、試料曲線の組に適用され、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅの同時フィッティングオプションを使用して、結合率（ｋａ）、解離率（ｋｄ）、および親和性（ＫＤ）を計算する。
ある実施形態において、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１抗体よりも、ヒトＰＤ－１に対して少なくとも１０倍高い結合親和性を有する。ある実施形態において、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載されるＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して１０～５０倍、好ましくは１０～４０倍、１０～３０倍、または１０～２０倍高い結合親和性を有する。ある実施形態において、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して１０倍高い結合親和性を有する。
参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、ニボルマブアナログ抗体であり、好ましくは比較の対象となるＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体と同じ産生方法を使用して、産生される。ニボルマブアナログ抗体は、ニボルマブと同じ重鎖可変領域配列（配列番号２０）を有する。ニボルマブアナログ抗体は、ニボルマブと同じ軽鎖可変領域配列（配列番号２１）を有する。
ある実施形態において、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、約０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には約０．２～０．４ｎＭの範囲の、より具体的には約０．３２～０．３４ｎＭの範囲の、ヒトＰＤ－１に対する結合親和性を有する。
ある実施形態において、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、ＳＰＲによって測定されるように、０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には０．２～０．４ｎＭの範囲の、より具体的には０．３２～０．３４ｎＭの範囲の、ヒトＰＤ－１に対する結合親和性を有する。
ある実施形態において、結合親和性は、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体を用いて、２価の二重特異性フォーマットで、および参照抗ヒトＰＤ－１抗体を用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで、測定される。
ヒトＰＤ－１に対する結合親和性は従って、２価の二重特異性ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の１価の結合親和性を表す。
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、２価の二重特異性抗体フォーマットで、約０．４～３．０ｎＭの範囲の、カニクイザルＰＤ－１に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、２価の二重特異性抗体フォーマットで、０．４～３．０ｎＭの範囲の、カニクイザルＰＤ－１に対する結合親和性を有する。カニクイザルＰＤ－１に対する結合親和性は従って、２価の二重特異性ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の１価の結合親和性を表す。
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、２価の二重特異性抗体フォーマットで、約１～２ｎＭの範囲の、ヒトＬＡＧ－３に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、２価の二重特異性抗体フォーマットで、１～２ｎＭの範囲の、ヒトＬＡＧ－３に対する結合親和性を有する。ヒトＬＡＧ－３に対する結合親和性は従って、２価の二重特異性ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の１価の結合親和性を表す。
ある実施形態において、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、２価の二重特異性抗体フォーマットで、約０．２～０．４ｎＭの範囲の、カニクイザルＬＡＧ－３に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、本開示のＰＤ－１×ＬＡＧ－３多重特異性抗体は、本明細書に記載される、例えば実施例１２に記載される、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、２価の二重特異性抗体フォーマットで、０．２～０．４ｎＭの範囲の、カニクイザルＬＡＧ－３に対する結合親和性を有する。カニクイザルＰＤ－１に対する結合親和性は従って、２価の二重特異性ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の１価の結合親和性を表す。
ある実施形態において、本開示の多重特異性結合部位は、ヒトＰＤ－１への結合に対して１価であり、多重特異性結合部位が、本開示のＰＤ－１結合ドメインを１つだけ含むことを意味する。ある実施形態において、ＰＤ－１への結合に対して１価の本開示の多重特異性結合部位は、同等の濃度で、当該技術分野で記載されるＰＤ－１への結合に対して、２価の単一特異性結合部位および／または少なくとも２価の多重特異性結合部位と比較して、同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１に対する結合親和性を有する。ある実施形態において、そのような２価の単一特異性結合部位は、本明細書に記載されるニボルマブアナログ抗体である。ある実施形態において、ＰＤ－１への結合に対して１価の本開示の多重特異性結合部位は、同等の濃度で、参照多重特異性結合部位よりも高い効力を有する。ある実施形態において、そのような参照多重特異性結合部位は、本明細書に記載されるニボルマブアナログ抗体である。
ある実施形態において、本明細書でさらに提供されるのは、本開示の多重特異性結合部位を産生するために有用な、ベクターである。ある実施形態において、そのような発現ベクターは、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書に記載される抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む。ある実施形態において、本開示のベクターは、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示のベクターは、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書に記載される一般的な軽鎖可変領域でありうる。
ある実施形態において、本開示はまた、本明細書に記載される抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列と、本明細書に記載される抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、細胞を提供する。ある実施形態において、本開示の細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、本開示の細胞は、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含みうる。ある実施形態において、軽鎖可変領域は、本明細書に記載される一般的な軽鎖可変領域でありうる。
ある実施形態において、本開示はまた、本明細書に記載される多重特異性結合部位を産生する、細胞を提供する。ある実施形態において、そのような細胞は、本開示のベクターで形質転換された、組換え細胞でありうる。
ある実施形態において、本明細書でさらに提供されるのは、本開示の多重特異性結合部位のバリアントを産生するための方法であり、前記方法は、以下の各ステップを含む：
－本明細書に記載されるＰＤ－１重鎖可変領域および／またはＬＡＧ－３重鎖可変領域の配列バリアントを、作製するステップ；
および
－本明細書に記載される配列バリアント（複数可）および軽鎖可変領域を、細胞内で発現させるステップ。
－本明細書に記載されるＰＤ－１重鎖可変領域および／またはＬＡＧ－３重鎖可変領域の配列バリアントを、作製するステップ；
および
－本明細書に記載される配列バリアント（複数可）および軽鎖可変領域を、細胞内で発現させるステップ。
配列バリアントを作製する方法は、当該技術分野でよく知られている。配列バリアントの作製にはランダムアプローチ、または標的アプローチを取ることができ、例えば、結合親和性を増減させると思われるバリエーションを導入することを目的としうる。抗体結合ドメインを親和性成熟させるための通常の方法は、当該技術分野で広く知られており、例えばTabasinezhad M. et al. Immunol Lett. 2019; 212: 106-113参照。また、結合ドメイン、またはそのような結合ドメインを含む部位を大規模に産生することを視野に入れ、発展性リスクを軽減するバリエーションを導入することも目的としうる。結合特異性の喪失を引き起こさず、および／または結合親和性に影響しないと思われるバリエーションが、導入されうる。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域内のアミノ酸残基が、例えば保存的アミノ酸残基で、結合特異性および／または親和性を失うことなく、または実質的に失うことなく置換されうるかどうかは、当該技術分野でよく知られた方法により決定されうる。実験例には、例えば以下を含むが、これらに限定されない：アラニンスキャニング（Cunningham BC, Wells JA. Science. 1989; 244(4908): 1081-5）および深層変異スキャニング（Araya CL, Fowler DM. Trends Biotechnol. 2011; 29(9): 435-42）。例えばSruthi CK, Prakash M. PLoS One. 2020; 15(1): e0227621、Choi Y. et al. PLoS One. 2012; 7(10): e46688、およびMunro D, Singh M. Bioinformatics. 2020; 36(22-23): 5322－9に記載されるような、アミノ酸バリエーションの効果を予測できる計算手法もまた、開発されている。
ある実施形態において、本明細書でさらに提供されるのは、任意のバリアント多重特異性結合部位、任意のバリアント多重特異性結合部位を含む医薬組成物；前記バリアント多重特異性結合部位のいずれかのバリアント結合ドメインをコードする核酸；前記核酸を含むベクターおよび細胞；および、癌の治療のための前記バリアント多重特異性結合部位または医薬組成物の使用である。
［医薬組成物および方法］
本開示の多重特異性結合部位は、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物中で使用されて、疾患を、例えば抑制された免疫系に関連する疾患を、具体的には癌を効果的に治療しうる。治療には、多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物の、それを必要とする対象への投与を含む。
本開示の多重特異性結合部位は、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物中で使用されて、疾患を、例えば抑制された免疫系に関連する疾患を、具体的には癌を効果的に治療しうる。治療には、多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物の、それを必要とする対象への投与を含む。
ある実施形態において、本開示は、治療に使用するための、本明細書に記載される多重特異性結合部位、または医薬組成物を提供する。
ある実施形態において、本開示は、抑制された免疫系に関連する疾患の、具体的には癌の治療における使用のための、本明細書に記載される多重特異性結合部位、または医薬組成物を提供する。
ある実施形態において、本開示は、疾患を治療するための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載される多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む。
ある実施形態において、本開示は、抑制された免疫系に関連する疾患を、具体的には癌を治療するための方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載される多重特異性結合部位の有効量、または医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む。
本明細書で使用される「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、互換的に使用され、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物（例えば、癌を有するヒト患者などの、患者）を指す。
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患またはその症状を治癒または改善する目的で、対象に対して行われる任意のタイプの介入または過程、または、活性薬剤または活性薬剤の組合せを対象へ投与することを指す。これには、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候を逆転させ、緩和し、改善し、阻害しまたは減速させること、および、疾患に関連する症状、合併症、状態または生化学的兆候の、発症、進行、進展、重症化または再発を予防することを含む。
本明細書で使用される「有効な治療（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「肯定的な治療反応（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」とは、有益な効果を、疾患または障害の、例えば癌の、例えば少なくとも１の症状の改善を、生み出す治療を指す。有益な効果は、ベースラインに対する改善の形をとることができ、本方法に従った治療の開始前に行われた測定または観察に対する改善を含む。例えば、有益な効果は、疾患の臨床的または診断的症状の、または癌のマーカーの、減少または消失によって証明されるように、任意の臨床段階において、対象における癌の進行を遅らせ、安定化し、停止し、または逆転させる形をとることができる。有効な治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、循環腫瘍細胞の存在の減少、腫瘍の転移の減少または予防、腫瘍増殖の遅延または阻止、および／または、腫瘍の再発または再燃の予防または遅延でありうる。
「治療量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｍｏｕｎｔ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、所望の生物学的、治療的、および／または予防的結果を与える、薬剤または薬剤の組合せの量を指す。その結果は、疾患の１または複数の徴候、症状、または原因の、減少、改善、緩和（ｐａｌｌｉａｔｉｏｎ）、軽減、遅延、および／または緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）、または、生物学的システムの任意の他の所望の変化でありうる。いくつかの実施形態において、治療量は、腫瘍の進展を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、治療量は、腫瘍の再発を予防または遅延させるのに十分な量である。
薬剤または組成物の有効量は、以下のことをしうる：（ｉ）癌細胞の数を減少させる；（ｉｉ）腫瘍の大きさを減少させる；（ｉｉｉ）癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し、妨害し、ある程度遅らせ、および停止する；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する；（ｖ）腫瘍増殖を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延させる；および／または（ｖｉｉ）癌に関連する１または複数の症状をある程度除去する。
有効量は、治療される個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、および、個体における所望の反応を誘発する薬剤または薬剤の組合せの能力などの因子に従って、変化しうる。
有効量は、１または複数回投与で、投与されうる。
有効量はまた、薬剤または薬剤の組合せによる任意の毒性または有害な影響と、治療上有益な影響とのバランスをとる量をも含む。
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」という用語は、治療上の活性物質を指し、本開示の場合、本開示のＰＤ－１結合ドメイン、本開示の結合部位（例えば、抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位）、または本開示の医薬組成物を指す。
［一般用語］
本明細書で使用される「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用形は、その単語の後に続く項目が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）が、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。
本明細書で使用される「含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびその活用形は、その単語の後に続く項目が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）が、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する、非限定的な意味で使用される。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語の１または複数を指すために、本明細書で使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、１または複数の要素を意味する。
本明細書における特許文書または他の事項への言及は、その文書または事項が公知であったこと、またはそれが含む情報が請求項のいずれかの優先日における技術常識の一部であったことを認めるものとして、受け取られるべきではない。
本明細書中で引用されるすべての特許および参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
なお本明細書において、特に断りのない限り、抗体または抗体フラグメントの可変領域においてＣＤＲおよびフレームワークに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングに従って特定される（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991）参照）。定常領域におけるアミノ酸は、ＥＵナンバリングシステムに従って示される。
アクセッション番号は主に、標的を同定するさらなる方法を提供するために与えられ、結合するタンパク質の実際の配列は、例えばいくつかの癌などで起こるようなコード遺伝子における変異のために、変化しうる。抗原結合サイトは、いくつかの抗原陽性の免疫細胞または腫瘍細胞により発現されるものなど、抗原およびその様々なバリアントと結合する。
本明細書で遺伝子、タンパク質に対して言及がなされる場合、その言及は、好ましくは遺伝子またはタンパク質のヒト型に対してなされる。本明細書で遺伝子またはタンパク質に対して言及がなされる場合、その言及は、天然の遺伝子またはタンパク質に対して、および腫瘍、癌などで検出されうるような、好ましくはヒト腫瘍、癌などで検出されうるような、遺伝子またはタンパク質のバリアント型に対してなされる。
ＨＧＮＣとは、ＨＵＧＯ遺伝子命名法委員会（ＨＵＧＯ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の略である。略語に続く番号は、アクセッション番号であり、その番号で遺伝子および遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、ＨＧＮＣデータベースから検索できる。Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅは、アクセッション番号または遺伝子ＩＤを提供し、その番号で遺伝子または遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、ＮＣＢＩ（アメリカ国立生物工学情報センター、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースから検索できる。Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、アクセッション番号を提供し、その番号で遺伝子または遺伝子によりコードされるタンパク質に関する情報が、Ｅｎｓｅｍｂｌｅデータベースから入手できる。Ｅｎｓｅｍｂｌは、ＥＭＢＬ－ＥＢＩとＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの共同プロジェクトであり、選択された真核生物ゲノムについて、自動アノテーションを作成および維持するソフトウェアシステムを開発している。
［図面の簡単な説明］
図中において、２価の単一特異性抗体は、配列番号Ａのフォーマットで示され、配列番号Ａは、両結合ドメインの重鎖可変配列を指す。単一特異性抗体の各結合ドメインは、軽鎖を含む。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体の各結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。単一特異性抗体は、好ましくはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、ＩｇＧ１抗体である。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体は、ＩｇＧ１フォーマットでスクリーニングされ、ＰＤ－１結合重鎖は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含む。
図中において、２価の単一特異性抗体は、配列番号Ａのフォーマットで示され、配列番号Ａは、両結合ドメインの重鎖可変配列を指す。単一特異性抗体の各結合ドメインは、軽鎖を含む。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体の各結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。単一特異性抗体は、好ましくはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、ＩｇＧ１抗体である。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体は、ＩｇＧ１フォーマットでスクリーニングされ、ＰＤ－１結合重鎖は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号７２に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号７３に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含む。
２価の二重特異性抗体は、配列番号Ａ×配列番号Ｂのフォーマットで示され、配列番号ＡおよびＢの両方は、重鎖可変配列を指す。二重特異性抗体の各結合ドメインは、軽鎖を含む。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、単一特異性抗体の各結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、および配列番号７１に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。二重特異性抗体は、好ましくはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む、ＩｇＧ１抗体である。本開示を説明するために使用されるが、本開示を何ら限定することを意図するものではない実施例において、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１フォーマットでスクリーニングされ、ＰＤ－１結合重鎖は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含み；および、ＬＡＧ－３結合重鎖は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２、および配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ３を含む。
２価の単一特異性ニボルマブおよびレラトリマブアナログ抗体は、配列番号Ａ／配列番号Ｂのフォーマットで示され、配列番号Ａはそれぞれの重鎖配列を指し、配列番号Ｂはそれぞれの軽鎖配列を指す。２価の単一特異性ニボルマブアナログ抗体は、２つのＰＤ－１結合ドメインを含む。２価の単一特異性レラトリマブアナログ抗体は、２つのＬＡＧ－３結合ドメインを含む。ニボルマブおよびレラトリマブアナログの組合せは、配列番号Ａ／配列番号Ｂ＋配列番号Ｃ／配列番号Ｄのフォーマットで示され、配列番号Ａは、ニボルマブまたはレラトリマブアナログのいずれかの重鎖配列を指し、配列番号Ｂは、ニボルマブまたはレラトリマブアナログのいずれかの軽鎖配列を指し、および、配列番号Ｃは、他方の重鎖配列を指し、配列番号Ｄは、他方の軽鎖配列を指す。ニボルマブアナログ抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４フォーマットで使用され、各結合ドメインは軽鎖を含む。レラトリマブアナログ抗体は、ＩｇＧ１フォーマットで使用され、各結合ドメインは軽鎖を含む。
以下の実施例は、本開示を説明するが、本開示を何ら限定することを意図するものではない。
［実施例１ － 抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの作製］
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、例えばＷＯ２０１９／００９７２８に記載されるような、当該技術分野において知られる方法により入手されうる。一般的なＩＧＫＶ１－３９軽鎖を含むトランスジェニックマウス（ＭｅＭｏ（登録商標）マウス）をヒトＰＤ－１抗原部位で免疫化する（ＤＮＡ、タンパク質、および細胞ベースの抗原送達の様々な形の使用を含む）ことにより、重鎖可変領域の大きいパネルが得られた。配列番号９および配列番号１０の重鎖可変領域が、親和性成熟のために選択された。その結果、２０２の親和性成熟バリアントが得られ、そのうちのいくつかが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでのさらなる特性評価のために選択された。
抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、例えばＷＯ２０１９／００９７２８に記載されるような、当該技術分野において知られる方法により入手されうる。一般的なＩＧＫＶ１－３９軽鎖を含むトランスジェニックマウス（ＭｅＭｏ（登録商標）マウス）をヒトＰＤ－１抗原部位で免疫化する（ＤＮＡ、タンパク質、および細胞ベースの抗原送達の様々な形の使用を含む）ことにより、重鎖可変領域の大きいパネルが得られた。配列番号９および配列番号１０の重鎖可変領域が、親和性成熟のために選択された。その結果、２０２の親和性成熟バリアントが得られ、そのうちのいくつかが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでのさらなる特性評価のために選択された。
［実施例２ － ＰＤ－１ ＩｇＧの効力および二重特異性抗体（Ａｂｓ）産生のための選択］
ＩｇＧフォーマットでの親和性成熟ＰＤ－１重鎖可変領域が、それらの親ＩｇＧと少なくとも同程度の効力があることを確認するために、親和性成熟バリアントが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでスクリーニングされた。またアッセイには、親抗ＰＤ－１ ＩｇＧ、陽性対照として、ニボルマブの重鎖（配列番号１８）と軽鎖（配列番号２２）とを含む抗ＰＤ－１抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１ニボルマブアナログ１）、およびニボルマブの重鎖（配列番号１９）と軽鎖（配列番号２２）とを含む抗ＰＤ－１抗体（ＩｇＧ４ニボルマブアナログ２）、および、陰性対照として、配列番号２３を有する重鎖可変領域と配列番号２４を有する軽鎖可変領域とを含む抗ＲＳＶ－Ｇ抗体も含まれた。このカラムの最後の２ウェルは、ベースレベル対照としてＩｇＧ無しで残された。
ＩｇＧフォーマットでの親和性成熟ＰＤ－１重鎖可変領域が、それらの親ＩｇＧと少なくとも同程度の効力があることを確認するために、親和性成熟バリアントが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイでスクリーニングされた。またアッセイには、親抗ＰＤ－１ ＩｇＧ、陽性対照として、ニボルマブの重鎖（配列番号１８）と軽鎖（配列番号２２）とを含む抗ＰＤ－１抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１ニボルマブアナログ１）、およびニボルマブの重鎖（配列番号１９）と軽鎖（配列番号２２）とを含む抗ＰＤ－１抗体（ＩｇＧ４ニボルマブアナログ２）、および、陰性対照として、配列番号２３を有する重鎖可変領域と配列番号２４を有する軽鎖可変領域とを含む抗ＲＳＶ－Ｇ抗体も含まれた。このカラムの最後の２ウェルは、ベースレベル対照としてＩｇＧ無しで残された。
ＰＤ－１―ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイは、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１２５５）に従って行われ、以下の２つの細胞株を使用する―ＰＤ－Ｌ１ ａＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ヒトＰＤ－Ｌ１と、抗原非依存的にコグネートＴＣＲを活性化するように設計された改変細胞表面タンパク質とを発現する、ＣＨＯ－Ｋ１細胞である）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１０９Ａ）；および、ＰＤ－１エフェクター細胞：Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ヒトＰＤ－１と、ＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ－ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターとを発現する）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｊ１１５Ａ）。
１日目に、ＰＤ－Ｌ１細胞のための細胞回収培地が、室温で調製された：１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ２４４２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１７６５）中。必要な数のＰＤ－Ｌ１細胞バイアル（Ｊ１０９Ａ；試験される３２のＩｇＧにつき１バイアル）が冷凍庫から取り出され、３７℃で急速解凍され、細胞が５０ｍｌチューブに移された。細胞回収培地は、１４．５ｍｌ／バイアル、体積が毎分２倍になるように、ゆっくりと細胞に加えられた。ハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６８８）のウェルは、この細胞懸濁液で５０μｌ／ウェル、または５０μｌ ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１００１０）で満たされた。アッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、一晩インキュベートされた。
２日目に、２倍濃縮アッセイバッファが、室温で調製された：４％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ２４４２）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｐｒｏｍｅｇａ ｋｉｔまたはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１８７５）中。２倍濃縮の試験および対照ＩｇＧ溶液が、ＰＢＳ中に調製された。試験および対照ＩｇＧの連続希釈がまた、Ｕ底プレート（Ｎｕｎｃ、カタログ番号２６８１５２）中のＰＢＳ中で行われ、１０μｇ／ｍｌから始めて、６段階４倍滴定を行った。陽性および陰性対照ＩｇＧ連続希釈液は、別々のディープウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ、カタログ番号７８０２７０）上のＰＢＳ中に、調製された。ＩｇＧ無しの対照であるベース対照もまた、調製された。活性が直接比較される必要のあるＩｇＧは、プレート間の変動を避けるため、できるだけ同じプレート上でインキュベートされた。
アッセイプレートは、インキュベータから取り出され、空のウェルに移された。２０μｌのＩｇＧ溶液が、アッセイプレートに加えられ、同じピペットチップを用いて、最低濃度のＩｇＧから移し始めて、順に高濃度になるようにした。
必要な数のＰＤ－１エフェクター細胞（Ｊ１１５Ａ；試験される３２のＩｇＧにつき１バイアル）が冷凍庫から取り出され、３７℃で急速解凍され、上下にピペッティングすることにより静かに混合された。すべてのバイアルからの細胞が、５０ｍｌチューブに移された。２倍濃縮アッセイバッファ（細胞１バイアルあたり５．９ｍｌ）が、体積が毎分２倍になるように、ゆっくりと細胞に加えられた。２０μｌのエフェクター細胞懸濁液が、アッセイプレート上のウェルに加えられた。プレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、６時間インキュベートされた。６時間のインキュベートに続き、プレートは室温で１０分間プレインキュベートされた。
ルシフェラーゼ活性は、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７９４１）を使用して、測定された。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（遮光）は、一晩室温に平衡化され、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標） Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅと十分に混合された。４０μｌのＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼが、アッセイプレート上の各ウェルに加えられ、５～１０分後にＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｍｏｄｅｌ ２１０４－００４０Ａ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｍｏｄｅ）上で、発光が測定された。読み出しは、相対光単位（ＲＬＵ）値で得られた。対照活性に対する実験活性の比であるＦｏｌｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎが、ＩｇＧ－ＸのＲＬＵ値／ＩｇＧ無しのＲＬＵ値として、計算された。Ｆｏｌｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎは、対数ＩｇＧ濃度に対してプロットされ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、非線形回帰およびｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ．応答（３パラメータ）式を使用して、シグモイド曲線がフィッティングされた。
結果は図１に示される。すべての対照は、期待された活性を示し、異なるプレートにおいても一貫していた。親和性成熟バリアントは、それらの親ＩｇＧと少なくとも同程度の効力があり、ニボルマブアナログ１以上の効力があった。親和性成熟バリアントおよび親抗体のＥＣ５０値は、表２に示される。
３つの親和性成熟ＰＤ－１バリアントが、二重特異性抗体の作製のために選択され、ヒトＰＤ－１結合アームが、ヒトＬＡＧ－３結合アームと結合された。これら３つのＰＤ－１バリアントは、配列番号１；５；および６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、６つの異なる抗ヒトＬＡＧ－３結合アームと結合された。６つの抗ヒトＬＡＧ－３結合アームは、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、および１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。結果得られた１８個の二重特異性抗体は、ＦＡＣＳを使用してヒトＰＤ－１およびヒトＬＡＧ－３への結合について試験された。
［実施例３ － ＦＡＣＳ分析］
ヒトＬＡＧ－３またはアカゲザルＬＡＧ－３で安定的にトランスフェクトされた細胞株、または、ヒトＰＤ－１またはカニクイザルＰＤ－１で過渡的にトランスフェクトされた細胞株を使用して、二重特異性抗体の結合がＦＡＣＳにより分析された。この目的のために、２９３ＦＦ細胞が、ヒトＰＤ－１およびアカゲザルＰＤ－１をコードするｐＶＡＸ発現構築物で過渡的にトランスフェクトされ、２９３ＦＦ細胞が、ヒトＬＡＧ－３およびアカゲザルＬＡＧ－３をコードするｐＶＡＸ発現構築物で安定的にトランスフェクトされた。ＩｇＧ特異性結合は、５０ｕｇ／ｍｌから始まる８段階５倍希釈を使用して、ＦＡＣＳにより測定された。ヤギ抗ヒトＰＥが、二次検出抗体として使用された。染色していない細胞または二次検出抗体のみは、陰性アッセイ対照として含まれた。このアッセイでＰＤ－１およびＬＡＧ－３に結合すると知られている、配列番号１８を有する重鎖と配列番号２２を有する軽鎖とを含む２価の単一特異性ＰＤ－１抗体（ニボルマブアナログ１）、および配列番号２７を有する重鎖と配列番号２８を有する軽鎖とを含む２価の単一特異性ＬＡＧ－３抗体（２５Ｆ７／レラトリマブアナログ）が、それぞれ陽性対照として使用された。配列番号２３を有する重鎖可変領域と配列番号２４を有する軽鎖可変領域とを含む２価の単一特異性ＲＳＶ－Ｇ抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１アイソタイプ対照）が、陰性対照として使用された。
ヒトＬＡＧ－３またはアカゲザルＬＡＧ－３で安定的にトランスフェクトされた細胞株、または、ヒトＰＤ－１またはカニクイザルＰＤ－１で過渡的にトランスフェクトされた細胞株を使用して、二重特異性抗体の結合がＦＡＣＳにより分析された。この目的のために、２９３ＦＦ細胞が、ヒトＰＤ－１およびアカゲザルＰＤ－１をコードするｐＶＡＸ発現構築物で過渡的にトランスフェクトされ、２９３ＦＦ細胞が、ヒトＬＡＧ－３およびアカゲザルＬＡＧ－３をコードするｐＶＡＸ発現構築物で安定的にトランスフェクトされた。ＩｇＧ特異性結合は、５０ｕｇ／ｍｌから始まる８段階５倍希釈を使用して、ＦＡＣＳにより測定された。ヤギ抗ヒトＰＥが、二次検出抗体として使用された。染色していない細胞または二次検出抗体のみは、陰性アッセイ対照として含まれた。このアッセイでＰＤ－１およびＬＡＧ－３に結合すると知られている、配列番号１８を有する重鎖と配列番号２２を有する軽鎖とを含む２価の単一特異性ＰＤ－１抗体（ニボルマブアナログ１）、および配列番号２７を有する重鎖と配列番号２８を有する軽鎖とを含む２価の単一特異性ＬＡＧ－３抗体（２５Ｆ７／レラトリマブアナログ）が、それぞれ陽性対照として使用された。配列番号２３を有する重鎖可変領域と配列番号２４を有する軽鎖可変領域とを含む２価の単一特異性ＲＳＶ－Ｇ抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１アイソタイプ対照）が、陰性対照として使用された。
陽性および陰性対照は、予想通りの挙動を示した。すべての二重特異性抗体は、ヒトＬＡＧ－３およびアカゲザルＬＡＧ－３に結合した。すべての二重特異性抗体はまた、ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１に結合した。
［実施例４ － ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイ］
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイで、実施例２に記載されたプロトコルに従って、二重特異性抗体がスクリーニングされた。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイで、実施例２に記載されたプロトコルに従って、二重特異性抗体がスクリーニングされた。
二重特異性抗体は、最終濃度１００ｕｇ／ｍｌから始まる６段階６倍希釈され、２通りに試験された。ＩｇＧ希釈液は、ＰＢＳで調製された。陽性対照として、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号２２を有する軽鎖とを含む２価の単一特異性ＰＤ－１抗体（ＩｇＧ４ニボルマブアナログ３）の、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）から始まる６段階６倍滴定が、含まれた。ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体のアイソタイプ対照として、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号２４を有する軽鎖可変領域とを含む、ＲＳＶ－Ｇに結合する２価の単一特異性抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１アイソタイプ対照）の、１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）から始まる４段階６倍滴定が、使用された。アイソタイプカラムの最後の２ウェルは、ベースレベル対照としてＩｇＧ無しで残された。抗体は、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、６時間インキュベートされた。Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼが加えられ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で、発光が測定された。各抗体によって誘導されたＦｏｌｄ Ｉｄｕｃｔｉｏｎは、抗体を含まないウェル（ベース）に対する相対値として、計算された。
抗体がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸を阻害すれば、これによりＴＣＲシグナルの阻害が除去される。そしてＴＣＲシグナルは活性化し、遺伝子転写およびルシフェラーゼ活性を引き起こす。ルシフェラーゼ活性は、抗体結合および軸阻害と相関する。
結果は図２に示される。陽性および陰性対照は、予想通りの挙動を示した。すべての二重特異性抗体は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸の阻害を示す。
図３Ａは、３つの二重特異性抗体とＰＤ－１参照抗体ニボルマブアナログ３との間の、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける効力の比較を示す。配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を有するＰＤ－１結合ドメインを含む二重特異性抗体の効力は、参照ＰＤ－１抗体の効力と同様である。この二重特異性抗体は従って、ＰＤ－１への結合に対して２価である参照抗体と同様の効力を、単一のＰＤ－１結合ドメインで達成する。
２つのさらなる二重特異性抗体の効力もまた、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１レポーターアッセイで評価され、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖と配列番号２２を有する軽鎖とを含む２価の単一特異性ＰＤ－１抗体（ニボルマブアナログ４）と、比較された。アッセイは、各試料を３回ずつ繰り返して２回行われた。平均ＥＣ５０値は、図３Ｂに示される。
配列番号１、５、および６を有するＰＤ－１結合ドメインは、ＰＤ－１に対する結合親和性を決定するために、２価の単一特異性フォーマットでＳＰＲにより試験され、参照抗体ニボルマブのアナログと比較された。従来の研究は、これらのＰＤ－１結合ドメインのＰＤ－１に対する結合親和性は、２価の単一特異性フォーマットおよび二重特異性フォーマットで、同様であることを示していた。ニボルマブアナログの結合親和性は、２価の単一特異性フォーマットおよびＰＤ－１（ＰＤ－１×ＲＳＶ）に対して１価の二重特異性フォーマットで決定された。
ＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、２５℃で行われた。ＳＰＲランニングバッファ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％ｖ／ｖ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、ｐＨ７．４）は、１０倍ＨＢＳ－ＥＰ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から調製された。抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、ＳシリーズセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の全１６のフローセル上に、アミンカップリングを介して固定化された。固定化レベルは、すべてのフローセルで～９０００ＲＵである。抗ＰＤ－１抗体の所望の捕捉レベル（１００～１５０ＲＵ）は、適切な濃度の抗ＰＤ－１抗体を、各チャンネルのアクティブフローセルを通して１０μＬ／分の流速で６０秒間流すことにより、達成された。次に、ＰＤ－１ストック（Ｒ＆Ｄ ８９８６－ＰＤ）から調製されたＰＤ－１の３倍連続希釈濃度シリーズ（合計７濃度、最高３００ｎＭ）およびランニングバッファ（０濃度）は、２４０秒間（結合時間）注入され、すぐに４８０秒間（解離時間）４５μＬ／分の流速でランニングバッファが続いた。３０μＬ／分の流速で３Ｍ ＭｇＣｌ２を３０秒間注入し、表面が再生された。結合キネティクスおよび親和性パラメータは、１対１結合モデルへのデータのグローバルフィッティングから得られた。
結果は図４に示される。３つの二重特異性抗体のＰＤ－１結合ドメインは、両方の抗体フォーマットで、ニボルマブアナログよりも、ＰＤ－１に対して少なくとも１０倍高い結合親和性を有する。
［実施例５ － ＰＤ－１／ＬＡＧ－３レポーターアッセイ］
ＰＤ－Ｌ１ Ｒａｊｉ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９７８Ｂ０３）は、２百万細胞／ｍｌに達するように、細胞をアッセイ培地（１％ｈｉＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０２７０１０６）、ＲＰＭＩ１６４０（＋２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号５２４００）中、室温）に懸濁することにより、調製された。Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１およびＬＡＧ－３エフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９７８Ｂ０２）は、４百万細胞／ｍｌに達するように、細胞をアッセイ培地に懸濁することにより、調製された。３倍濃縮の試験および対照ＩｇＧ溶液は、ＰＢＳで調製され、すなわち、６～３００μｇ／ｍｌの間で開始し６倍連続希釈により、２～１０の間の希釈倍率であった（最終アッセイ濃度は２０～１００μｇ／ｍｌの間で開始）。
ＰＤ－Ｌ１ Ｒａｊｉ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９７８Ｂ０３）は、２百万細胞／ｍｌに達するように、細胞をアッセイ培地（１％ｈｉＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｉｂｃｏ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１０２７０１０６）、ＲＰＭＩ１６４０（＋２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号５２４００）中、室温）に懸濁することにより、調製された。Ｊｕｒｋａｔ ＰＤ－１およびＬＡＧ－３エフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９７８Ｂ０２）は、４百万細胞／ｍｌに達するように、細胞をアッセイ培地に懸濁することにより、調製された。３倍濃縮の試験および対照ＩｇＧ溶液は、ＰＢＳで調製され、すなわち、６～３００μｇ／ｍｌの間で開始し６倍連続希釈により、２～１０の間の希釈倍率であった（最終アッセイ濃度は２０～１００μｇ／ｍｌの間で開始）。
このアッセイは使用されるＦＢＳのバッチに非常に敏感でありうるため、アッセイを行う前にＦＢＳのバッチが検証されるべきである。
アッセイプレートは、２５μｌのＪｕｒｋａｔ ＰＤ－１およびＬＡＧ－３エフェクター細胞、またはＰＢＳで満たされた。２５μｌの試験および対照ＩｇＧ溶液が、加えられた。活性が直接比較される必要のあるＩｇＧは、プレート間変動（プレート効果）の影響を避けるため、できるだけ同じアッセイプレート上でインキュベートされるべきである。
同じ体積のＰＤ－Ｌ１ Ｒａｊｉ細胞懸濁液が、同じ体積のＳＥＤ溶液（１００ｎｇ／ｍｌのブドウ球菌エンテロトキシンＤ（Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＤ３０３）、アッセイ培地中）と混合された。２５μｌのＲａｊｉ／ＳＥＤ混合物が、アッセイプレートに加えられた。
アッセイプレートは、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９５％で、６時間インキュベートされた。
６時間のインキュベートの後、アッセイプレートは室温で１０分間放置された。７５μｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２５１０）がウェルに加えられ、５～１０分後にＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー上で、発光が測定された（発光プロトコルに従う；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｍｏｄｅｌ２１０４－００２０Ａ）。
各抗体によって誘導されたＦｏｌｄ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎは、ＩｇＧ無しのウェルに対する相対値として、計算された。
ＩｇＧは、陽性対照と、および２価の単一特異性ＰＤ－１抗体ニボルマブアナログ３と２価の単一特異性ＬＡＧ－３抗体２５Ｆ７／レラトリマブアナログとの組合せと、最高濃度５０μｇ／ｍｌ＋５０μｇ／ｍｌで、比較された。すべてのＩｇＧは、３回繰り返して試験された。
結果は図５に示される。陽性および陰性対照は、予想通りの挙動を示した。すべての二重特異性抗体は、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３参照抗体の組合せよりも、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３経路の阻害活性を引上げるのに、より効力があった。陽性対照に対する曲線下面積（ＡＵＣ）の割合およびＥＣ５０値は、表３に示される。
［実施例６ － ＳＥＢアッセイ］
ＩｇＧは、５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）から始まる６段階７倍希釈滴定で試験された。ＩｇＧ希釈液は、アッセイ培地で最終濃度の４倍に調製された。陽性対照として、２価の単一特異性ＰＤ－１抗体ニボルマブアナログ３と２価の単一特異性ＬＡＧ－３抗体２５Ｆ７／レラトリマブアナログとの組合せが、最高濃度２５μｇ／ｍｌ＋２５μｇ／ｍｌで、含まれた。すべてのＩｇＧは、３回繰り返して試験された。
ＩｇＧは、５０μｇ／ｍｌ（最終濃度）から始まる６段階７倍希釈滴定で試験された。ＩｇＧ希釈液は、アッセイ培地で最終濃度の４倍に調製された。陽性対照として、２価の単一特異性ＰＤ－１抗体ニボルマブアナログ３と２価の単一特異性ＬＡＧ－３抗体２５Ｆ７／レラトリマブアナログとの組合せが、最高濃度２５μｇ／ｍｌ＋２５μｇ／ｍｌで、含まれた。すべてのＩｇＧは、３回繰り返して試験された。
抗ＬＡＧ－３および抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧに反応すると知られている凍結保存ＰＢＭＣ約２０００００個が、二重特異性抗体および対照抗体、およびＳＥＢとともに、最終濃度２ｕｇ／ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９０％で、３日間インキュベートされた。３日後、上澄みが採取され、４倍に希釈され、ＬｕｍｉｎｅｘでＩＬ－２レベルが測定された。
アッセイは、２人のドナーからのＰＢＭＣを用いて行われた。１人のドナーからのデータが、図６に示される。陽性および陰性対照は、予想通りの挙動を示した。多くの二重特異性抗体は、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３参照抗体の組合せよりも効果的に、ＩＬ－２放出を誘導した。陽性対照に対する曲線下面積（ＡＵＣ）値の割合は、表３に示される。
［実施例７ － 抗原リコールアッセイ］
ＩｇＧは、１０μｇ／ｍｌ（最終濃度）から始まる６段階５倍希釈滴定で試験された。陽性対照として、２価の単一特異性ＰＤ－１抗体ニボルマブアナログ３と２価の単一特異性ＬＡＧ－３抗体２５Ｆ７／レラトリマブアナログとの組合せが、最高濃度５μｇ／ｍｌ＋５μｇ／ｍｌで、含まれた。陰性対照として、配列番号２３を有する重鎖可変領域と配列番号２４を有する軽鎖可変領域とを含むＲＳＶ－Ｇに対する抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１アイソタイプ対照）の、１０μｇ／ｍｌから始まる４段階５倍希釈が、使用された。陰性対照として、２ウェルがペプチドプール無しで残された。すべてのＩｇＧは、３回繰り返して試験された。
ＩｇＧは、１０μｇ／ｍｌ（最終濃度）から始まる６段階５倍希釈滴定で試験された。陽性対照として、２価の単一特異性ＰＤ－１抗体ニボルマブアナログ３と２価の単一特異性ＬＡＧ－３抗体２５Ｆ７／レラトリマブアナログとの組合せが、最高濃度５μｇ／ｍｌ＋５μｇ／ｍｌで、含まれた。陰性対照として、配列番号２３を有する重鎖可変領域と配列番号２４を有する軽鎖可変領域とを含むＲＳＶ－Ｇに対する抗体（Ｆｃ－ｓｉｌｅｎｃｅｄ ＩｇＧ１アイソタイプ対照）の、１０μｇ／ｍｌから始まる４段階５倍希釈が、使用された。陰性対照として、２ウェルがペプチドプール無しで残された。すべてのＩｇＧは、３回繰り返して試験された。
選択されたドナーからの一晩休ませたＰＢＭＣ約３０００００個が、ＩｇＧおよびＣＥＦＴ ＭＨＣ－ＩＩ ＣＤ４ペプチドとともに、最終濃度１ｕｇ／ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ２、相対湿度９０％で、６日間インキュベートされた。上澄みが採取され、ＬｕｍｉｎｅｘでＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αレベルが測定された。
結果は図７に示される。陽性および陰性対照は、予想通りの挙動を示した。多くの二重特異性抗体は、ＰＤ－１およびＬＡＧ－３参照抗体の組合せよりも効果的に、ＩＦＮ－γ放出を誘導した。ＴＮＦ－αの読み出し結果は、ＩＦＮ－ｙの結果と同様であった。陽性対照に対する曲線下面積（ＡＵＣ）値の割合は、表３に示される。
［実施例８ － インビボ試験］
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍を持つｈｕ－ＣＤ３４マウスにおいて、５つの二重特異性ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の有効性が、評価された。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍を持つｈｕ－ＣＤ３４マウスにおいて、５つの二重特異性ＰＤ－１×ＬＡＧ－３抗体の有効性が、評価された。
ヒト化ＣＤ３４＋ ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、１００μｌの無血清培地およびマトリゲルマトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に等体積で懸濁された合計３×１０６のＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞を、皮下接種された。腫瘍が約８０～１００ｍｍ３に達した時、マウスは、１群１０匹のマウスで８群に無作為に分けられ、１倍ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で以下が投与された：１）ＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）；２）ＩｇＧ４（１０ｍｇ／ｋｇ）；３）ペムブロリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）；４）レラトリマブアナログ（１０ｍｇ／ｋｇ）；５）ペムブロリズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋レラトリマブアナログ（１０ｍｇ／ｋｇ）；６）ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体１（１０ｍｇ／ｋｇ）；７）ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体２（１０ｍｇ／ｋｇ）；および８）ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体３（１０ｍｇ／ｋｇ）、および、別の実験において：９）ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体４（１０ｍｇ／ｋｇ）；および１０）ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体５（１０ｍｇ／ｋｇ）。
ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体１は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＰＤ－１）と、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＬＡＧ－３）とを含む。
ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体２は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＰＤ－１）と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＬＡＧ－３）とを含む。
ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体３は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＰＤ－１）と、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＬＡＧ－３）とを含む。
ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体４は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＰＤ－１）と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＬＡＧ－３）とを含む。
ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体５は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＰＤ－１）と、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＬＡＧ－３）とを含む。
二重特異性抗体の結合ドメインは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ１を含みうる。二重特異性抗体のＰＤ－１結合重鎖は、それぞれ配列番号３０と３１に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２とＣＨ３とを含みうる。二重特異性抗体のＬＡＧ－３結合重鎖は、それぞれ配列番号３２と３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＨ２とＣＨ３とを含みうる。ＰＤ－１およびＬＡＧ－３結合ドメインは、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含みうる。
動物は、５日ごとに２０日間（図８Ａ）、または５日ごとに３４日間（図８Ｂ）、腹腔内投与された。腫瘍は、ノギスを使用して計測され、式：ｌ（長さ）×ｗ２（幅）×１／２を使用して楕円体に同化することにより、腫瘍体積が計算された。有効性試験における統計的有意性は、一元配置分散分析（Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）により決定された。体重もまた、試験を通してモニターされた。腫瘍は、治療後に採取され、顕微解剖され、製造業者のガイドラインに従ってＴｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して消化され、その後フローサイトメトリー分析が行われた。
［フローサイトメトリー分析］
投与開始の２９日後にインビボ段階を終了した時点で、腫瘍細胞がフローサイトメトリー分析によって分析された。この目的のために、腫瘍が採取され、３ｍＬのＤＭＥＭ培地を含む１５ｍＬのＣチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）内に移された。フローサイトメトリー分析のための単一細胞懸濁液を得るために、腫瘍は顕微解剖され、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造業者の指示に従って、消化された。腫瘍細胞の分析は、生死細胞のためのＶｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ、および白血球マーカーとしてヒトＣＤ４５に対するフルオロクロム標識抗体を使用して、行われた。本試験のフローサイトメトリーパネルは、以下の通りである：
投与開始の２９日後にインビボ段階を終了した時点で、腫瘍細胞がフローサイトメトリー分析によって分析された。この目的のために、腫瘍が採取され、３ｍＬのＤＭＥＭ培地を含む１５ｍＬのＣチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）内に移された。フローサイトメトリー分析のための単一細胞懸濁液を得るために、腫瘍は顕微解剖され、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して製造業者の指示に従って、消化された。腫瘍細胞の分析は、生死細胞のためのＶｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ、および白血球マーカーとしてヒトＣＤ４５に対するフルオロクロム標識抗体を使用して、行われた。本試験のフローサイトメトリーパネルは、以下の通りである：
抗体カクテルを加える前に、試料は、ヒトおよびマウスＦｃ受容体に対して、１０分間室温で阻害された。生死染色は、抗体カクテルを加える前に、室温で１５分間行われた。カクテルを３０分間室温でインキュベートした後、試料は十分に洗浄され、２％ＰＦＡで固定された。細胞は、ＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｚｅｒおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して、実行および分析された。
［結果］
結果は図８に示される。すべての二重特異性抗体は、単剤または併用で、単一特異性抗体よりも高い有効性を示した（図８ＡおよびＢ）。投与２０日後、二重特異性抗体治療群において移植片対宿主病の徴候が増加したため、１つの試験は中止せねばならなかった（図８Ａ）。これは二重特異性抗体での治療により免疫活性が増加したためかもしれない。しかしながら、この現象は他の群には観察されなかった。
結果は図８に示される。すべての二重特異性抗体は、単剤または併用で、単一特異性抗体よりも高い有効性を示した（図８ＡおよびＢ）。投与２０日後、二重特異性抗体治療群において移植片対宿主病の徴候が増加したため、１つの試験は中止せねばならなかった（図８Ａ）。これは二重特異性抗体での治療により免疫活性が増加したためかもしれない。しかしながら、この現象は他の群には観察されなかった。
有効性試験の中止後、フローサイトメトリーによる免疫ＰＤ分析のために、腫瘍は解離された。前述のように、治療時のＴＩＬｓを評価するために、１４色のフローサイトメトリーパネルがデザインされ、実行された。ＴＩＬｓを評価したところ、評価された二重特異性抗体はすべて、腫瘍におけるＴｒｅｇであるヒトＴ細胞の割合の減少を示した（図８Ｃ）。さらに、評価された二重特異性抗体はすべて、腫瘍におけるＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比の増加を示した（図８Ｄ）。
［実施例１２ － 結合特性］
二重特異性抗体の結合親和性および同時結合は、ＳＰＲによって行われた。
二重特異性抗体の結合親和性および同時結合は、ＳＰＲによって行われた。
ヒトＰＤ－１、カニクイザルＰＤ－１、ヒトＬＡＧ－３、およびカニクイザルＬＡＧ－３に対する二重特異性抗体の結合親和性は、ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体フォーマットで決定され、参照抗体ニボルマブおよびレラトリマブのアナログと比較された。
結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ－Ｔ２００装置上でＳＰＲを使用して、ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、二重特異性ＩｇＧフォーマットで決定された。また２つのヒトタンパク質が、二重特異性抗体によって同時にエンゲージされうるかどうかも評価された。配列番号７を有する重鎖可変領域を含むＰＤ－１結合ドメイン、または配列番号８を有する重鎖可変領域を含むＰＤ－１結合ドメイン、および配列番号１７を有する重鎖可変領域を含むＬＡＧ－３結合ドメインを含む二重特異性抗体の、ヒトＰＤ－１、カニクイザルＰＤ－１、ヒトＬＡＧ－３、およびカニクイザルＬＡＧ－３に対する結合親和性が、決定された。二重特異性抗体の結合親和性は、参照抗体ニボルマブのアナログ（配列番号２１／配列番号２２）および参照抗体レラトリマブのアナログ（配列番号２７／配列番号２８）の結合親和性と、比較された。結合の陰性対照として、無関係な標的に対する抗体が使用された。
使用された単量体組換え抗原は、以下の通りであった：ヒトＬＡＧ－３（ｈｕＬＡＧ－３－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１６４９８－Ｈ０８Ｈ）、カニクイザルＬＡＧ－３（ｃｙＬＡＧ－３－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０８４１－Ｃ０８Ｈ）、ヒトＰＤ－１（ｈｕＰＤ－１－Ｈｉｓ、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号１０３７７－Ｈ０８Ｈ）、およびカニクイザルＰＤ－１（ｃｙＰＤ－１－Ｈｉｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５０９－ＰＤ）。
［固定化：］
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）の４つのフローチャンネル上への、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＪＩＲ、カタログ番号１０９－００５－０９８）の固定化は、１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０に希釈された４０μｇ／ｍｌの抗体を使用して、アミンカップリングにより行われた。以下の条件が使用された：活性化時間４２０秒、不活性化時間４２０秒、不活性化バッファ：１ＭエタノールアミンｐＨ８．５。９１５８～９４２８ＲＵの範囲である、高い固定化密度が達成された。
ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；カタログ番号ＢＲ－１００５－３０）の４つのフローチャンネル上への、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ＪＩＲ、カタログ番号１０９－００５－０９８）の固定化は、１０ｍＭ酢酸ｐＨ５．０に希釈された４０μｇ／ｍｌの抗体を使用して、アミンカップリングにより行われた。以下の条件が使用された：活性化時間４２０秒、不活性化時間４２０秒、不活性化バッファ：１ＭエタノールアミンｐＨ８．５。９１５８～９４２８ＲＵの範囲である、高い固定化密度が達成された。
［親和性決定：］
親和性決定のために、試験および対照抗体は、ＣＭ５センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体により、３０μｌ／分の流速で６０秒間、１つのフローセルのみで捕捉された。捕捉抗体濃度は、ＰＤ－１親和性決定には２０ｎＭ、ＬＡＧ－３親和性決定には１０ｎＭであった。この後、流速３０μｌ／分のバッファで、６０秒の安定化時間が続いた。抗原の５段階２倍連続希釈液が、捕捉抗体を含むフローセルと参照フローセル（捕捉抗体無し）との両方に、３０μｌ／分で６０秒間注入された。抗原濃度は、ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１には８０ｎＭ～２．５ｎＭ、ヒトＬＡＧ－３およびカニクイザルＬＡＧ－３には４０～１．２５ｎＭであった。バッファ効果に対するバックグラウンド補正は、バッファのみの注入により行われ、バックグラウンド除去のために、参照フローセルが使用された。
親和性決定のために、試験および対照抗体は、ＣＭ５センサーチップ上に固定化された抗ヒトＩｇＧ抗体により、３０μｌ／分の流速で６０秒間、１つのフローセルのみで捕捉された。捕捉抗体濃度は、ＰＤ－１親和性決定には２０ｎＭ、ＬＡＧ－３親和性決定には１０ｎＭであった。この後、流速３０μｌ／分のバッファで、６０秒の安定化時間が続いた。抗原の５段階２倍連続希釈液が、捕捉抗体を含むフローセルと参照フローセル（捕捉抗体無し）との両方に、３０μｌ／分で６０秒間注入された。抗原濃度は、ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１には８０ｎＭ～２．５ｎＭ、ヒトＬＡＧ－３およびカニクイザルＬＡＧ－３には４０～１．２５ｎＭであった。バッファ効果に対するバックグラウンド補正は、バッファのみの注入により行われ、バックグラウンド除去のために、参照フローセルが使用された。
抗体－抗原相互作用に続き、３０μｌ／分で３００秒のオフレート洗浄が行われた。サイクル間の再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の注入を、３０μｌ／分で１５μｌずつ２回使用して行われ、その後９０μｌ／分で９０秒の安定化ステップが続いた。全再生およびアッセイの一貫性を確認するために、アッセイの終了時に、試験されたすべての抗原について、試験されたすべての抗原濃度で、参照抗体の繰り返し実行が行われた。
ＰＤ－１親和性決定には、ＨＢＳ－ＥＰ＋バッファが使用され、一方ＬＡＧ－３には、非特異性結合を避けるために、ＨＢＳ－ＥＰ＋は、最終濃度５００ｍＭ ＮａＣｌまでＮａＣｌが加えられた。
結果は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅで分析された。未処理のＲＵシグナルは、ブランク減算され（捕捉抗体無しのチャンネルで）、バッファ効果に対してバックグラウンド補正された（２回目の注入で抗原の代わりにバッファを使用し、捕捉抗体による実行を減算した）。１：１結合ラングミュアフィッティングが、試料曲線の組に適用され、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅの同時フィッティングオプションを使用して、結合率（ｋａ）、解離率（ｋｄ）、および親和性（ＫＤ）を計算した。
捕捉された二重特異性および参照抗体は、それぞれの組換え抗原への結合を示した。陰性対照抗体への抗原の結合は、観察されなかった。
データの概要は図９に示される。ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体は、レラトリマブアナログよりも、ヒトＬＡＧ－３に対してより低い親和性を有し、ニボルマブアナログよりも、ヒトおよびカニクイザルＰＤ－１に対してより高い親和性を有する。ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体は、ヒトＰＤ－１およびヒトＬＡＧ－３へ同時に結合する。
［同時結合：］
二重特異性抗体のヒトＬＡＧ－３およびヒトＰＤ－１への同時結合は、親和性決定と同様のセットアップでアッセイされた。固定化された抗ヒトＩｇＧは、二重特異性抗体を捕捉するために使用された。陽性対照としてニボルマブアナログおよびレラトリマブアナログ参照抗体の混合物が含まれ、陰性対照として無関係な標的に対する抗体が含まれた。次に、抗原の１つが飽和濃度（ヒトＰＤ－１には８０ｎＭ、ヒトＬＡＧ－３には４０ｎＭ）で３００秒間注入され、すべての抗原結合サイトを占有させた。第２の抗原は、注入１で使用されたのと同じ濃度で、（すべての結合サイトが占有されたままであることを確認するために）単独または第１の抗原と併用して、順次注入された。ヒトＬＡＧ－３非特異性結合を防ぐために、全工程で高塩バッファが使用された。
二重特異性抗体のヒトＬＡＧ－３およびヒトＰＤ－１への同時結合は、親和性決定と同様のセットアップでアッセイされた。固定化された抗ヒトＩｇＧは、二重特異性抗体を捕捉するために使用された。陽性対照としてニボルマブアナログおよびレラトリマブアナログ参照抗体の混合物が含まれ、陰性対照として無関係な標的に対する抗体が含まれた。次に、抗原の１つが飽和濃度（ヒトＰＤ－１には８０ｎＭ、ヒトＬＡＧ－３には４０ｎＭ）で３００秒間注入され、すべての抗原結合サイトを占有させた。第２の抗原は、注入１で使用されたのと同じ濃度で、（すべての結合サイトが占有されたままであることを確認するために）単独または第１の抗原と併用して、順次注入された。ヒトＬＡＧ－３非特異性結合を防ぐために、全工程で高塩バッファが使用された。
データの概要は図９に示される。ＰＤ－１×ＬＡＧ－３二重特異性抗体は、ヒトＰＤ－１およびヒトＬＡＧ－３へ同時に結合する。
［配列表］
配列番号１－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号２－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号３－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号４－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号５－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号６－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号７－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号８－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号９－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１０－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１１－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔ ＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
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配列番号１２－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１３－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１４－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１５－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１６－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１７－重鎖可変領域－ＣＤＲはＫａｂａｔに従って太字および下線で示される
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配列番号１８－重鎖ニボルマブアナログ１
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配列番号１９－重鎖ニボルマブアナログ２
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配列番号２０－重鎖ニボルマブアナログ３
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配列番号２１－重鎖ニボルマブアナログ４
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配列番号２２－軽鎖ニボルマブ
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配列番号２３－重鎖可変領域陰性対照
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配列番号２４－軽鎖可変領域陰性対照
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配列番号２５－重鎖モタビズマブアナログ
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配列番号２６－軽鎖モタビズマブアナログ
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配列番号２７－重鎖レラトリマブアナログ
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配列番号２８－軽鎖レラトリマブアナログ
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配列番号２９－ＣＨ１
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配列番号３０－ＣＨ２
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配列番号３１－ＣＨ３
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配列番号３２－ＣＨ２
ＡＰＥＬＧＲＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
ＡＰＥＬＧＲＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
配列番号３３－ＣＨ３
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＫＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＫＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＫＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＫＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３４－ニボルマブアナログ重鎖可変領域
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＤＣＫＡＳＧＩＴＦＳＮＳＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＹＤＧＳＫＲＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＮＤＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号３５－ニボルマブアナログ軽鎖可変領域
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＳＳＮＷＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＦＤＦＷＳ
ＦＤＦＷＳ
配列番号３７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧ
ＹＩＹＹＳＧＳＷＳＬＮＰＳＦＫＧ
配列番号３８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
配列番号３９－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＦＥＦＷＳ
ＦＥＦＷＳ
配列番号４０－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＶＹＳＧＳＨＳＶＳＰＳＬＫＴ
ＹＩＶＹＳＧＳＨＳＶＳＰＳＬＫＴ
配列番号４１－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＨＧＧＤＷＦＤＴ
ＧＧＹＴＧＨＧＧＤＷＦＤＴ
配列番号４２－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＬＳ
ＲＦＡＬＳ
配列番号４３－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＤＦＴＧ
配列番号４４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮ
ＳＬＧＹＣＧＳＤＩＣＹＰＮＧＩＬＤＮ
配列番号４５－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＶＮ
ＲＦＡＶＮ
配列番号４６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＧＶＴＮ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＹＡＱＧＶＴＮ
配列番号４７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＳＳＤＩＣＹＰＮＬＩＦＤＮ
ＳＬＧＹＣＳＳＤＩＣＹＰＮＬＩＦＤＮ
配列番号４８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＬＨ
ＲＦＡＬＨ
配列番号４９－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
配列番号５０－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
配列番号５１－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＹＨＦＷＳ
ＹＨＦＷＳ
配列番号５２－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
配列番号５３－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
配列番号５４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＹＨＦＷＳ
ＹＨＦＷＳ
配列番号５５－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
ＹＩＶＹＳＧＳＹＮＶＮＰＳＬＫＴ
配列番号５６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
ＧＧＹＴＧＹＧＧＤＷＦＤＰ
配列番号５７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＲＦＡＬＨ
ＲＦＡＬＨ
配列番号５８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
ＷＩＤＰＮＴＧＴＰＴＦＡＱＧＶＴＧ
配列番号５９－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
ＳＬＧＹＣＤＳＤＩＣＹＰＮＷＩＦＤＮ
配列番号６０－ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲ１
ＱＳＩＳＳＹ
ＱＳＩＳＳＹ
配列番号６１－ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲ２
ＡＡＳ
ＡＡＳ
配列番号６２－ＩＭＧＴに従ったＬＣＤＲ３
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ
ＱＱＳＹＳＴＰＰＴ
配列番号６３－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ
配列番号６４－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号６５－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号６６－軽鎖可変領域－ＣＤＲはＩＭＧＴに従って太字および下線で示される
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
配列番号６７－Ｖ領域
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ
配列番号６８－Ｖ領域
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰ
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰ
配列番号６９－Ｖ領域
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰ
配列番号７０－Ｖ領域
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨ
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＥＴＡＲＩＴＣＧＧＤＮＩＧＲＫＳＶＹＷＹＱＱＫＳＧＱＡＰＶＬＶＩＹＹＤＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷＤＧＳＳＤＨ
配列番号７１－軽鎖定常領域
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７２－ＣＨ２
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
配列番号７３－ＣＨ３
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号７４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＳＹＳＷＳ
ＳＹＳＷＳ
配列番号７５－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＹＩＤＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ
ＹＩＤＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ
配列番号７６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＤＬＬＹＫＷＮＹＶＥＧＦＤＩ
ＤＬＬＹＫＷＮＹＶＥＧＦＤＩ
配列番号７７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＳＹＤＴＨ
ＳＹＤＴＨ
配列番号７８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号７９－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＥＲＧＷＤＶＦＤＩ
ＥＲＧＷＤＶＦＤＩ
配列番号８０－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＳＹＧＭＨ
ＳＹＧＭＨ
配列番号８１－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＶＩＳＹＨＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＩＳＹＨＧＳＤＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
配列番号８２－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＤＧＤＮＷＤＶＦＤＩ
ＤＧＤＮＷＤＶＦＤＩ
配列番号８３－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＴＮＡＬＮ
ＴＮＡＬＮ
配列番号８４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＮＴＨＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＩＧ
ＷＩＮＴＨＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＩＧ
配列番号８５－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＥＰＮＷＧＶＹＦＤＹ
ＥＰＮＷＧＶＹＦＤＹ
配列番号８６－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＳＹＧＩＳ
ＳＹＧＩＳ
配列番号８７－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＳＡＹＳＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
ＷＩＳＡＹＳＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
配列番号８８－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＤＧＳＧＷＤＤＦＤＹ
ＤＧＳＧＷＤＤＦＤＹ
配列番号８９－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＳＹＧＩＳ
ＳＹＧＩＳ
配列番号９０－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＳＡＹＳＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
ＷＩＳＡＹＳＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＧ
配列番号９１－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＧＳＩＬＡＡＱＭＷＧＤＩ
ＧＳＩＬＡＡＱＭＷＧＤＩ
配列番号９２－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ１
ＴＮＡＬＮ
ＴＮＡＬＮ
配列番号９３－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ２
ＷＩＮＴＨＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＩＧ
ＷＩＮＴＨＴＧＮＰＴＹＡＱＧＦＩＧ
配列番号９４－Ｋａｂａｔに従ったＨＣＤＲ３
ＥＰＮＷＧＶＹＦＤＹ
ＥＰＮＷＧＶＹＦＤＹ
Claims (44)
- 抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対してより高い結合親和性を有し、
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位。 - 抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、参照抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を与え、
前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する２つの重鎖可変領域
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する２つの軽鎖可変領域
を含む、
多重特異性結合部位。 - 請求項１または２に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、少なくとも重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
および
前記軽鎖可変領域は、好ましくは、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である
多重特異性結合部位。 - 請求項１または３に記載された多重特異性結合部位であって、
前記結合親和性は、表面プラズモン共鳴により測定される
多重特異性結合部位。 - 請求項１～４のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して少なくとも１０倍高い結合親和性を有する
多重特異性結合部位。 - 請求項１～４のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインよりも、ヒトＰＤ－１に対して１０倍高い結合親和性を有する
多重特異性結合部位。 - 請求項１～６のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、ヒトＰＤ－１に対して、約０．１～１．０ｎＭの範囲の、具体的には約０．３～０．８ｎＭの範囲の、より具体的には約０．３８～０．７８ｎＭの範囲の結合親和性を有する
多重特異性結合部位。 - 請求項１、および３～７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記結合親和性は、前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインおよび前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの両方を用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで測定される
多重特異性結合部位。 - 請求項１、および３～７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記結合親和性は、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の二重特異性ＩｇＧフォーマットで
および
前記参照抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを用いて、２価の単一特異性ＩｇＧフォーマットで
測定される
多重特異性結合部位。 - 請求項２、３、または５～９のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ここでＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１／ＬＡＧ－３レポーターアッセイで測定される
多重特異性結合部位。 - 請求項２、３、または５～１０のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
ここでＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する同等の効力とは、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力の５倍の範囲内の効力であり、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力から５、４、３、および２倍の偏差を含む
多重特異性結合部位。 - 請求項１～１１のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記重鎖可変領域は、以下を含み：
ａ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｇ）それぞれ、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｈ）それぞれ、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい；
多重特異性結合部位。 - 請求項１～１２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、
配列番号１～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する
重鎖可変領域を含む
多重特異性結合部位。 - 請求項３～１３のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含む
多重特異性結合部位。 - 抗ヒトＰＤ－１結合ドメインを含む多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、重鎖可変領域を含み、
前記重鎖可変領域は、
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、
および
配列番号１～８からなる群からのアミノ酸配列を有する重鎖可変領域からの重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
を含む
多重特異性結合部位。 - 請求項１５に記載された多重特異性結合部位であって、
前記重鎖可変領域は、以下を含み：
ａ）それぞれ、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）それぞれ、配列番号３９、配列番号４０、および配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）それぞれ、配列番号４２、配列番号４３、および配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）それぞれ、配列番号４５、配列番号４６、および配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）それぞれ、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）それぞれ、配列番号５１、配列番号５２、および配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｇ）それぞれ、配列番号５４、配列番号５５、および配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｈ）それぞれ、配列番号５７、配列番号５８、および配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有する、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい；
多重特異性結合部位。 - 請求項１５または１６に記載された多重特異性結合部位であって、
前記多重特異性結合部位は、
配列番号１～８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、
重鎖可変領域を含む
多重特異性結合部位。 - 請求項１５～１７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含む
多重特異性結合部位。 - 請求項１～１８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
免疫エフェクター細胞上に発現する細胞表面部位に結合する、結合ドメインをさらに含む
多重特異性結合部位。 - 請求項１～１９のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインをさらに含む
多重特異性結合部位。 - 請求項２０に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、以下を含む重鎖可変領域を含み：
ａ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｂ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｃ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｄ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｅ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ｆ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
または
ｇ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域の、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；
ここで前記ＨＣＤＲの各々は、多くとも３つ、２つ、または１つのアミノ酸置換を含んでもよい；
多重特異性結合部位。 - 請求項２０または２１に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、
配列番号１１～１７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、
または
これらに対して少なくとも８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、または最も好ましくは９５％の配列同一性を有する、
重鎖可変領域を含む
多重特異性結合部位。 - 請求項２０～２２のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、軽鎖可変領域を、好ましくは異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の軽鎖可変領域を、具体的には前記抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの軽鎖可変領域と同じ軽鎖可変領域を、さらに含む
多重特異性結合部位。 - 請求項２０～２３のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインは、ＣＨ１およびＣＬ領域をさらに含む
多重特異性結合部位。 - 請求項１５～２４のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記結合部位は、２価の単一特異性抗ヒトＰＤ－１抗体と比較して、同等の、またはそれ以上の、ＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力を有し、
前記２価の単一特異性抗ヒトＰＤ－１抗体は、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、
および
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域
を含む、２つの結合ドメインを含む
多重特異性結合部位。 - 請求項２５に記載された多重特異性結合部位であって、
ここでＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１／ＬＡＧ－３レポーターアッセイで測定される
多重特異性結合部位。 - 請求項２５または２６に記載された多重特異性結合部位であって、
ここでＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する同等の効力とは、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する効力の５倍の範囲内の効力であり、前記参照抗ヒトＰＤ－１抗体のＰＤ－１へのリガンド結合を阻害する前記効力から５～２倍の、好ましくは５、４、３、または２倍の偏差を含む
多重特異性結合部位。 - 請求項１～２７のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位であって、
前記結合部位は、ヒトＰＤ－１への結合に対して１価である
多重特異性結合部位。 - 請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位の有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 治療に使用するための、請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または請求項２９に記載された医薬組成物。
- 抑制された免疫系に関連する疾患の治療に使用するための、請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または請求項２９に記載された医薬組成物。
- 癌の治療に使用するための、請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位、または請求項２９に記載された医薬組成物。
- 疾患を治療するための方法であって、
請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位の有効量、または請求項２９に記載された医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法。 - 抑制された免疫系に関連する疾患を治療するための方法であって、
請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位の有効量、または請求項２９に記載された医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法。 - 癌を治療するための方法であって、
請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位の有効量、または請求項２９に記載された医薬組成物を、それを必要とする個体へ投与するステップを含む
方法。 - 請求項１～２８のいずれか一項に規定された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする核酸配列と、請求項２１または２２に規定された抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
ベクター。 - 請求項３６に記載されたベクターであって、
前記ベクターは、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含む
ベクター。 - 請求項３６または３７に記載されたベクターであって、
前記ベクターは、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む
ベクター。 - 請求項３８に記載されたベクターであって、
前記軽鎖可変領域は、異なるエピトープ特異性を有する複数の重鎖と対合可能である軽鎖の、軽鎖可変領域である
ベクター。 - 請求項１～２８のいずれか一項に規定された抗ヒトＰＤ－１結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする核酸配列と、請求項２１または２２に規定された抗ヒトＬＡＧ－３結合ドメインの前記重鎖可変領域をコードする核酸配列とを含む、
細胞。 - 請求項４０に記載された細胞であって、
前記細胞は、ＣＨ１領域、および、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域をコードする核酸配列をさらに含む
細胞。 - 請求項４０または４１に記載された細胞であって、
前記細胞は、軽鎖可変領域、および好ましくはＣＬ領域をコードする、少なくとも１の核酸配列をさらに含む
細胞。 - 請求項１～２８のいずれか一項に記載された多重特異性結合部位を産生する、細胞。
- 請求項４３に記載された細胞であって、
前記細胞は、組換え細胞であり、請求項３６～３９のいずれか一項に記載されたベクターで形質転換された
細胞。
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