JP2024512739A - ｍＲＮＡヌクレオチドキャップの精製及びリサイクル - Google Patents

Abstract

本開示は、ｍＲＮＡの調製物からのヌクレオチドメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）キャップの精製及びリサイクルに関し、これは、過剰なヌクレオチドｍＲＮＡキャップをｍＲＮＡ合成から単離し、精製することを含む。

Description

本開示は、ｍＲＮＡの調製物からのヌクレオチドメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）キャップの精製及びリサイクルに関し、これは、過剰なヌクレオチドｍＲＮＡキャップをｍＲＮＡ合成から単離し、精製することを含む。

ｍＲＮＡを効率的に生成することができる治療薬の分野に大きな関心が集まっている。例えば、様々な疾患または状態の処置または予防のために、ｍＲＮＡを脂質ナノ粒子にカプセル化し、対象に送達することができる。５－プライムキャップ（５’キャップ）が転写の過程において転写物の最初のヌクレオチドに付加され、このｍＲＮＡキャッピングのプロセスは転写物を分解から保護する際に重要である。ｍＲＮＡ生成コストは、比較的高い可能性があり、これは、部分的にヌクレオチドｍＲＮＡキャップを調製するコストによるものである。さらに、ｍＲＮＡの生成は、一般に過剰なヌクレオチドｍＲＮＡキャップを使用する必要がある。ｍＲＮＡの生成に利用される過剰なヌクレオチドキャップを再捕捉し、リサイクルすることが可能である必要が依然としてあり、これによりｍＲＮＡ作製プロセス全体が特に大規模生成においてさらに経済的になるであろう。本出願は、これらの必要性に対処する。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップまたはその塩をｍＲＮＡ調製物からリサイクルする方法が本明細書で提供される。一態様では、方法は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩、及び１つ以上の夾雑物を含む１つ以上の混合物を回収し、混ぜ合わせることと、
混ぜ合わされた混合物から夾雑物を除去することと
を含む。

一態様では、本明細書で提供される方法は、混ぜ合わされた混合物から夾雑物を除去することを含み、これは、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることを含んでもよい。

一態様では、夾雑物の除去は、第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることをさらに含んでもよい。

一態様では、夾雑物の除去は、第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることをさらに含んでもよい。

一態様では、夾雑物の除去は、第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることをさらに含む。

一態様では、夾雑物の除去は、第４の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することをさらに含んでもよい。

一態様において、混ぜ合わされた混合物からの夾雑物の除去は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることと、
第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることと、
第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることと、
第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることと
を含む。

一態様では、混ぜ合わされた混合物からの夾雑物の除去は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることと、
第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることと、
第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることと、
第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることと、
第４の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することと
を含んでもよい。

一態様では、本明細書に記載の方法によって調製されるｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、約９０％超の純度を有する。

本発明の各制限は、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の各制限は、本発明の各態様に含まれ得ることが予期される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるまたは図面に例示される構成の詳細にも構成要素の配置にも限定されるものではない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実践するまたは行うことができる。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明を目的としており、限定的なものと見なされるべきではない。

化合物Ａに関するリサイクル精製プロセスの例示的な概略図を示す。

化合物Ａに関する別のリサイクル精製プロセスの例示的な概略図を示す。

インビトロ転写調製物から回収されたｍＲＮＡヌクレオチドキャップを含む混合物のＬＣＭＳ及びリサイクルされた化合物ＡのＬＣＭＳを示す。

リサイクルされた化合物ＡのＮ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）塩のＨ^１ＮＭＲ、及びリサイクルされた化合物ＡのＮＨ_４ ^＋塩のＨ^１ＮＭＲを示す。

化合物Ｇに関するリサイクル精製プロセスの例示的な概略図を示す。

５０％の開始純度で２ｋＤａフィルターを用いたタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を使用したろ過後のリサイクルされた化合物Ｇを含む保持液のＬＣＭＳ及びアニオン交換クロマトグラフィー後のリサイクルされた化合物Ｇを含むプールされた画分のＬＣＭＳを示す。

イオン交換クロマトグラフィーシステムの例示的な概略図を示す。

別のリサイクル精製の例示的な概略図を示す。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップまたはその塩をリサイクルする方法が本明細書で提供される。ｍＲＮＡは、５’及び３’非翻訳領域（５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ）が隣接するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ポリアデノシン一リン酸尾部（ポリＡ）及び逆位Ｎ７－メチルグアノシン含有キャップ構造からなる。キャップ構造は、全ての真核生物ｍＲＮＡの重要な特徴である。これは、真核生物の開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）によりリボソーム複合体によって認識される。５’キャップ末端がないｍＲＮＡは、翻訳機構によって認識されず、標的タンパク質を産生することができない（例えば、Ｃ．Ａｉｔｋｅｎ，ｅｔ ａｌ．“Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１６，ｎｏ．６，５６８－５７６，２０１２を参照）。転写プロセスの過程で産生された粗製ｍＲＮＡ（「一次転写物」）は５’－三リン酸で終わり、これは、酵素ＲＮＡ－トリホスファターゼの作用によってそれぞれの５’－二リン酸に変換される。その後、グアニリルトランスフェラーゼが末端逆位グアノシン一リン酸を５’－末端に結合し、Ｎ７ＭＴａｓｅが関係する末端逆位グアノシンのＮ７－メチル化によりキャッピングプロセスが完了する。

内因性ｍＲＮＡ分子は５’末端キャップが可能であり、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生じる。次に、この５’－グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成することができる。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端より前の転写ヌクレオチドのリボース糖はまた、任意に２’－Ｏ－メチル化されていてもよい。

複数の別個の５’－キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子として働くポリヌクレオチドなどの、核酸分子の５’－キャップを生成することができる。キャップ類似体は、化学構造が天然の（すなわち、内因性、野生型または生理学的）５’－キャップとは異なるが、キャップの機能を保持する。キャップ類似体は、化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成することができる。

例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基で連結された２つのグアニンを含み、一方のグアニンはＮ７メチル基及び３’－Ｏ－メチル基を含む（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ^７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは同等に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと指定することができる）。他方の未修飾グアニンの３’－Ｏ原子は、キャッピングされたポリヌクレオチドの５’－末端ヌクレオチドに連結される。Ｎ７－及び３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャッピングされたポリヌクレオチドの末端部分をもたらす。

別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これはＡＲＣＡに類似しているが、グアノシン上に２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ^７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。別の例示的なキャップは、ｍ^７Ｇ－ｐｐｐ－Ｇｍ－Ａ（すなわち、Ｎ７，グアノシン－５’－三リン酸－２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－アデノシン）である。

キャップは、内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８５１９１１０号に記載されているキャップなどのボラノホスフェート基またはホスホロセレノアート基により異なるホスフェート位置で修飾されてもよい。

いくつかの実施形態では、キャップは、当該技術分野において既知及び／または本明細書に記載のキャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換形態である。キャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換形態の非限定例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ^３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、内容全体が参照によって本明細書に組み込まれるＫｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載の様々なキャップ類似体及びキャップ類似体を合成する方法を参照）。キャップ類似体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体であってもよい。

５’末端キャップとしては、内因性キャップまたはキャップ類似体を挙げることができる。５’末端キャップは、グアニン類似体を含んでもよい。有用なグアニン類似体としては、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが挙げられるが、これらに限定されない。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップの他の例は、ＵＳ２０１９０２１１３６８、ＵＳ１０５６３１９５、ＵＳ１０４２８１０６、またはＵＳ１０５７０３８８に記載されており、それぞれが参照によって本明細書に組み込まれる。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、一般にｍＲＮＡの調製に過剰に使用される。本明細書に記載の方法は、未使用のヌクレオチドキャップを含む、例えば、ｍＲＮＡ調製物から混合物を回収し、混ぜ合わせ、夾雑物を除去して、精製されたヌクレオチドキャップを得る手順を提供する。本明細書に記載のリサイクル方法は、効率的で、ヌクレオチドキャップを高収率で、例えば、約８０％超再捕捉することができる。場合によっては、収率が９０％を超えることもある。リサイクルされたヌクレオチドの純度は、９０％超、９８％超、または約９９％超である場合がある。場合によっては、リサイクルされたｍＲＮＡヌクレオチドの純度は、９９．５％超である。さらに、本明細書に記載のリサイクルされたｍＲＮＡヌクレオチドキャップを使用して生成されるｍＲＮＡは、新規の合成により調製されたヌクレオチドキャップを有するｍＲＮＡと実質的に同じ完全性（例えば、同様のパーセントの尾部及びキャップ）を有する。

本明細書で提供されるｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩をリサイクルする方法は、
ｍＲＮＡ調製物からのｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩、及び１つ以上の夾雑物を含む１つ以上の混合物を回収し、混ぜ合わせることと、
混ぜ合わされた混合物から夾雑物を除去することと
を含む。

本明細書で開示される方法は、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップまたはその塩をリサイクルすることを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ａである。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ｂである。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ｃであり、式中、Ｒは、アルキル（例えば、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル）である。いくつかの実施形態にでは、Ｒは、メチル基（例えば、Ｃ_１アルキル）である。いくつかの実施形態では、Ｒは、エチル基（例えば、Ｃ_２アルキル）である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、
３個のカチオンを有する化合物Ｄ塩、または
３個のカチオンを有する化合物Ｅ塩である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ｆであり、式中、
Ｂ_１、Ｂ_２、及びＢ_３は、独立して、天然、修飾、または非天然ヌクレオシドベースであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３及びＲ_４は、独立して、ＯＨまたはＯ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３はＯ－メチルであり、Ｒ_４はＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ_３及びＲ_４は、Ｏ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_４は、Ｏ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１はＯＨであり、Ｒ_２はＯＨであり、Ｒ_３はＯ－メチルであり、Ｒ_４はＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１はＯＨであり、Ｒ_２はＯＨであり、Ｒ_３はＯ－メチルであり、Ｒ_４はＯ－メチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_２のうちの少なくとも１つはＯ－メチルであり、Ｒ_３はＯ－メチルであり、Ｒ_４はＯＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_２のうちの少なくとも１つはＯ－メチルであり、Ｒ_３はＯ－メチルであり、Ｒ_４はＯ－メチルである。

いくつかの実施形態では、Ｂ_１、Ｂ_２、及びＢ_３は、天然ヌクレオシド塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂ_１、Ｂ_２、及びＢ_３のうちの少なくとも１つは、修飾または非天然塩基である。いくつかの実施形態では、Ｂ_１、Ｂ_２、及びＢ_３のうちの少なくとも１つは、Ｎ６－メチルアデニンである。いくつかの実施形態では、Ｂ_１は、アデニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。いくつかの実施形態では、Ｂ_１はアデニンであり、Ｂ_２はウラシルであり、Ｂ_３はアデニンである。いくつかの実施形態では、Ｒ_１及びＲ_２はＯＨであり、Ｒ_３及びＲ_４はＯ－メチルであり、Ｂ_１はアデニンであり、Ｂ_２はウラシルであり、Ｂ_３はアデニンである。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ｇである。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ａまたは

化合物Ｇである。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ａ塩である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、

化合物Ｇ塩である。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、メチル化グアノシン及びリン酸基に結合した２または３つのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、塩である。例えば、ヌクレオチドキャップのリン酸基またはその他の酸の位置の１つ以上のプロトンは、脱プロトン化され、アニオン性ヌクレオチドキャップを生成することができる。いくつかの実施形態では、アニオン性ヌクレオチドキャップのカチオンは、アルカリ金属イオン（例えば、Ｌｉ^＋、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃｓ^＋など）である。いくつかの実施形態では、カチオンは、Ｎａ^＋である。いくつかの実施形態では、アニオン性ヌクレオチドキャップのカチオンは、第一級、第二級、第三級アンモニウム、または第四級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態では、カチオンは、第一級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態においては、カチオンは、アンモニウムである。いくつかの実施形態では、カチオンは、アルキル第一級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態においては、アルキル第一級アンモニウムカチオンは、Ｒ_１Ｈ_３Ｎであり、式中、Ｒ_１は、Ｃ_１～８アルキルである。いくつかの実施形態においては、アルキル第一級アンモニウムカチオンは、メチルアンモニウムである。いくつかの実施形態では、カチオンは、第二級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態では、カチオンは、アルキル第二級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態では、アルキル第二級アンモニウムカチオンは、（Ｒ_１）_２Ｈ_２Ｎであり、式中、各Ｒ_１は、独立して、Ｃ_１～８アルキルである。いくつかの実施形態では、アルキル第二級アンモニウムカチオンは、ジメチルアンモニウムまたはメチルエチルアンモニウムである。いくつかの実施形態では、カチオンは、第三級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態では、カチオンは、アルキル第三級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態では、アルキル第三級アンモニウムカチオンは、（Ｒ_１）_３ＨＮであり、式中、各Ｒ_１は、独立して、Ｃ_１～８アルキルである。いくつかの実施形態では、アルキル第三級アンモニウムカチオンは、ジメチルオクチルアンモニウム、ジメチルヘキシルアンモニウムまたはトリエチルアンモニウムである。いくつかの実施形態では、カチオンは、第四級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態では、カチオンは、アルキル第四級アンモニウムカチオンである。いくつかの実施形態では、アルキル第三級アンモニウムカチオンは、（Ｒ_１）_４Ｎであり、式中、各Ｒ_１は、独立して、Ｃ_１～８アルキルである。いくつかの実施形態では、アルキル第四級アンモニウムカチオンは、テトラメチルアンモニウム、トリメチルエチルアンモニウム、またはトリメチルヘキシルアンモニウムである。

アニオン性ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、１、２、３、４つ以上の負電荷を有してもよい。いくつかの実施形態では、アニオン性ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、１つの負電荷を有する。いくつかの実施形態では、アニオン性ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、２つの負電荷を有する。いくつかの実施形態では、アニオン性ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、３つの負電荷を有する。いくつかの実施形態では、アニオン性ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、４つの負電荷を有する。アニオン性ｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、整数に限定されない平均負電荷を有してもよく、例えば、平均負電荷は、２と半分、３と半分、及び４と半分などであってもよい。化合物Ａの塩としては、ナトリウム塩（Ｎａ^＋）、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）塩、ジメチルヘキシルアンモニウム（ＤＭＨＡ）塩、及び第一級アンモニウム（ＮＨ_４ ^＋）塩を挙げることができる。化合物Ｇの塩としては、ナトリウム塩（Ｎａ^＋）、ＤＭＯＡ塩、ジメチルヘキシルアンモニウム（ＤＭＨＡ）塩、及び第一級アンモニウム（ＮＨ_４ ^＋）塩を挙げることができる。

回収され、混ぜ合わされる１つ以上の混合物は、ｍＲＮＡ調製物からのものであってもよい。例えば、ｍＲＮＡ調製物は、インビトロ転写調製物である。いくつかの実施形態では、夾雑物は、タンパク質、巨大分子、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、副生成物、未使用の試薬、塩、または溶媒を含む。

本明細書で提供される方法は、混ぜ合わされた混合物から夾雑物を除去することを含み、これは、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることを含んでもよい。夾雑物の除去は、第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、夾雑物の除去は、第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、夾雑物の除去は、第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることをさらに含む。夾雑物の除去は、第４の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、第４の混合物のｐＨを調節することは任意である。例えば、混ぜ合わされた混合物からの夾雑物の除去は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることと、
第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることと、
第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることと、
第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることと
を含む。

混ぜ合わされた混合物からの夾雑物の除去は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることと、
第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることと、
第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることと、
第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることと、
第４の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することと
を含んでもよい。

混ぜ合わされた混合物からの夾雑物の除去は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることと、
第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることと、
第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることと、
第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることと、
第４の混合物をろ過し、その濃度を調節することと
を含んでもよい。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることは、様々な条件で行うことができる。例えば、巨大分子及びタンパク質の除去は、ろ過を含んでもよい。ろ過は、圧力駆動型膜分離であってもよい。いくつかの実施形態では、ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、ろ過システムは、カセットフィルター、スパイラル巻きフィルター、ホローファイバーフィルター、チューブラーフィルター、または平板フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、カセットフィルター、またはスパイラル巻きフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルホン膜、親水性ポリエーテルスルホン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、及びポリエチレン膜から選択されるフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約１ｋＤａから約１００ｋＤａ、約３ｋＤａから約５０ｋＤａ、約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約１５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約５ｋＤａまたは約１０ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物のｐＨは、ろ過前に調節されてもよい。例えば、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物のｐＨは、約５．５から約７．０に調節されてもよい。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．０から約６．５に調節される。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物のｐＨは、約８．０以下に調節されてもよい。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約４．０から約８．０に調節される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０に調節される。

巨大分子の除去は、ＲＮＡまたはｐＤＮＡを除去することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、除去される巨大分子はＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、除去される巨大分子はｍＲＮＡである。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物からの巨大分子及びタンパク質の除去は、約２時間から約６時間の間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることは、約４時間で行われる。

夾雑物の除去は、第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることをさらに含んでもよい。濃縮し、脱塩することは、様々な条件下で行うことができる。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、減圧下で濃縮される。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、高温で濃縮される。いくつかの実施形態では、脱塩することは、ろ過を含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、圧力駆動型膜分離である。いくつかの実施形態では、ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、ろ過は、カセットフィルター、スパイラル巻きフィルター、ホローファイバーフィルター、チューブラーフィルター、または平板フィルターを含む。いくつかの実施形態では、第１の混合物を脱塩するために使用されるろ過は、カセットフィルターまたはスパイラル巻きフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルホン膜、親水性ポリエーテルスルホン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、及びポリエチレン膜から選択されるフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約５０Ｄａから約５ｋＤａ、約１００Ｄａから約２ｋＤａ、または２５０Ｄａから約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約３００Ｄａからまたは約５００Ｄａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約６００Ｄａからまたは約８００Ｄａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。

第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることは、約１時間から約１０時間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、濃縮し、脱塩することは、約３時間から約６時間で行われる。

夾雑物の除去は、第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることをさらに含んでもよい。ＮＴＰを除去し、イオン交換することは、様々な条件下で行うことができる。例えば、ＮＴＰを除去することは、第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含んでもよい。イオン交換することは、第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含んでもよい。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムは、アニオン交換システムである。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、水、水溶液、または緩衝水溶液を含む移動相を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ＮａＣｌの水溶液、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液、またはＫＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮａＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮＨ_４Ｃｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約０．５Ｍから約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約１．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、強塩基または弱塩基を含む固定相を含む。いくつかの実施形態では、固定相は、アクリル／ジビニルベンゼン、スチレン／ジビニルベンゼン、ヒドロキシル化メタクリルポリマー、または架橋ポリメタクリラートを含む。いくつかの実施形態では、固定相は、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ポリアミン、第三級アミン、第四級アミン、ジメチルエタノールアミン、またはトリメチルベンジルアンモニウムを含む官能基を含む。いくつかの実施形態では、官能基は、第四級アミンを含む。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約５０ｍＬ／分から約１０Ｌ／分、６５ｍＬ／分から約８Ｌ／分、７５ｍＬ／分から約６Ｌ／分、約８５ｍＬ／分から約１Ｌ／分、または約１００ｍＬ／分から約８００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１１０ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、または約６００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約４００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１０Ｌ／分超である。

いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、またはＮａ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、固定相は、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（３０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、またはＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱを含む。ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（３０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、及びＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱは、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃから購入することができる。いくつかの実施形態では、回収基準は、吸光度単位（ＡＵ）に基づく。いくつかの実施形態では、回収基準は、約１００から約５００ｍＡＵ、約２００から約４００ｍＡＵ、約２５０から約３５０ｍＡＵ、または約３００ｍＡＵである。いくつかの実施形態では、移動相は、ＫＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＫＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍ、約０．２５Ｍから約２．０Ｍ、約０．５Ｍから約２．０Ｍ、約０．８Ｍから約１．５Ｍ、または約１．０Ｍの濃度を有する。

いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムは、Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７ ^２－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^２－、またはＣｌ^－を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、及びＮａ^＋から選択されるカチオンならびにＣ_６Ｈ_８Ｏ_７ ^２－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^２－、及びＣｌ^－から選択されるアニオンを含む水溶液を含む。

ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約１時間から約１０時間または約４時間から約９時間の間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約９時間で行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約５時間から約２０時間、約５時間から約１５時間、または６時間から約１０時間の間で行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約８時間で行われる。

夾雑物の除去は、第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることをさらに含んでもよい。濃縮し、脱塩することは、様々な条件下で行うことができる。いくつかの実施形態では、第３の混合物は、減圧下で濃縮される。いくつかの実施形態では、第３の混合物は、高温で濃縮される。いくつかの実施形態では、第３の混合物を脱塩することは、ろ過を含む。いくつかの実施形態では、第３の混合物の脱塩は、第３の混合物をクロマトグラフィーシステムに通すことを含む。いくつかの実施形態では、第３の混合物の脱塩は、第３の混合物をクロマトグラフィーに通すこと及びろ過を含む。

第３の混合物を脱塩するために使用されるクロマトグラフィーシステムは、例えば、逆相クロマトグラフィーであってもよい。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、シリカベース、ペプチドベース、またはポリマーベースを含む固定相を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）またはＣ１８樹脂を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、Ｃ１８樹脂を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、アセトニトリルと適合する。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、極性溶媒を含む移動相を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、アンモニウム塩緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、アルキルアンモニウム塩緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ジメチルヘキシルアンモニウム（ＤＭＨＡ）緩衝液、ＤＭＯＡ緩衝液、またはトリエチルアンモニウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ＤＭＯＡ緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相のＤＭＯＡ緩衝液は、約５ｍＭから約１５ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相のＤＭＯＡ緩衝液は、約１０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ジオール、アルコール、ハロゲン化アルキル、エーテル、ニトリル、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ジオール、ニトリル、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ヘキシレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、アセトニトリルを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、塩交換を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、Ｎａ^＋をＮ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）に交換することを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約５０ｍＬ／分から約１０Ｌ／分、６５ｍＬ／分から約８Ｌ／分、７５ｍＬ／分から約６Ｌ／分、約８５ｍＬ／分から約１Ｌ／分、または約１００ｍＬ／分から約８００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１７５ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、または約６００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１７５ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１０Ｌ／分超である。

第３の混合物を脱塩するために使用されるろ過は、例えば、圧力駆動型膜分離であってもよい。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、カセットフィルター、スパイラル巻きフィルター、ホローファイバーフィルター、チューブラーフィルター、または平板フィルターを含む。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、カセットフィルター、またはスパイラル巻きフィルターを含む。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、セルロースベースの膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルホン膜、親水性ポリエーテルスルホン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、またはポリエチレン膜を含むフィルターを含む。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約５０Ｄａから約５ｋＤａ、約１００Ｄａから約２ｋＤａ、または２５０Ｄａから約１ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約３００Ｄａから約５００Ｄａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約６００Ｄａから約８００Ｄａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。

第３の混合物をクロマトグラフィーシステムに通すことは、約２時間から約１０時間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、第３の混合物をクロマトグラフィーシステムに通すことは、約６時間で行われる。第３の混合物のろ過は、約２時間から約１０時間の間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、第３の混合物のろ過は、約３時間から約６時間の間で行われる。

夾雑物の除去は、第４の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することをさらに含んでもよい。第４の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することは、様々な条件下で行うことができる。例えば、第４の混合物のろ過は、第４の混合物をポリビニリデンフィルター、ポリエチレンフィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリテトラフルオロエチレンフィルター、セルロースエステルフィルター、またはポリエーテルスルホンフィルターに通してろ過することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第４の混合物のろ過は、約０．１μｍから約１μｍのサイズを有するフィルターを使用することを含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物のろ過は、約０．２μｍのサイズを有するフィルターを使用することを含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物のろ過は、約０．４５μｍのサイズを有するフィルターを使用することを含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、約１０００ｍＭから約５ｍＭ、約５００ｍＭから約１０ｍＭ、約２５０ｍＭから約４０ｍＭ、または約１５０ｍＭから約５０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、約１５０ｍＭから約７５ｍＭまたは約１２５ｍＭから約８５ｍＭである。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、約１００ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、約７５ｍＭから約２５ｍＭまたは約６０ｍＭから約４０ｍＭである。いくつかの実施形態では、第４の混合物は、約５０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、塩基性溶液で調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、ＨＣｌＯ、またはＣａＣＯ_３を含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ及び水を含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約１％ｗ／ｖから約８％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約３．５％ｗ／ｖから４．５％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物のｐＨは、約５．５から約６．９に調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物のｐＨは、約６．０から約６．５に調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物のｐＨは、約６．３に調節される。

いくつかの実施形態では、第４の混合物のｐＨは、約５．３から約７．３に調節される。

あるいは、混ぜ合わされた混合物からの夾雑物の除去は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、巨大分子及びタンパク質を除去し、混合物をイオン交換して、第１の混合物を得ることと、
第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることと、
第２の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、ろ過して、第３の混合物を得ることと、
第３の混合物をイオン交換して、第４の混合物を得ることと、
第４の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、濃縮し、ろ過して、第５の混合物を得ることと、
第５の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することと
を含んでもよい。

代替的な方法では、夾雑物の除去は、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、巨大分子、及びタンパク質を除去し、混合物からイオン交換して、第１の混合物を得ることを含んでもよい。ＮＴＰ、巨大分子、及びタンパク質を除去し、イオン交換することは、様々な条件下で行うことができる。例えば、ＮＴＰ、巨大分子、及びタンパク質を除去することは、混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含んでもよい。イオン交換することは、第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含んでもよい。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムは、アニオン交換システムである。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、水、水溶液、または緩衝水溶液を含む移動相を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ＮａＣｌの水溶液、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液、またはＫＣｌ水溶液を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮａＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮＨ_４Ｃｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約０．５Ｍから約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約１．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、強塩基または弱塩基を含む固定相を含む。いくつかの実施形態では、固定相は、アクリル／ジビニルベンゼン、スチレン／ジビニルベンゼン、ヒドロキシル化メタクリルポリマー、または架橋ポリメタクリラートを含む。いくつかの実施形態では、固定相は、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ポリアミン、第三級アミン、第四級アミン、ジメチルエタノールアミン、またはトリメチルベンジルアンモニウムを含む官能基を含む。いくつかの実施形態では、官能基は、第四級アミンを含む。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約５０ｍＬ／分から約１０Ｌ／分、６５ｍＬ／分から約８Ｌ／分、７５ｍＬ／分から約６Ｌ／分、約８５ｍＬ／分から約１Ｌ／分、または約１００ｍＬ／分から約８００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１１０ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、または約６００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１１０ｍＬ／分である。

いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、またはＮａ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、固定相は、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（３０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、またはＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱを含む。いくつかの実施形態では、回収基準は、吸光度単位（ＡＵ）に基づく。いくつかの実施形態では、回収基準は、約１００から約５００ｍＡＵ、約２００から約４００ｍＡＵ、約２５０から約３５０ｍＡＵ、または約３００ｍＡＵである。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＫＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＫＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍ、約０．２５Ｍから約２．０Ｍ、約０．５Ｍから約２．０Ｍ、約０．８Ｍから約１．５Ｍ、または約１．０Ｍの濃度を有する。

いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムは、Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７ ^２－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^２－、またはＣｌ^－を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、及びＮａ^＋から選択されるカチオンならびにＣ_６Ｈ_８Ｏ_７ ^２－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^２－、及びＣｌ^－から選択されるアニオンを含む水溶液を含む。

代替的な方法では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、巨大分子、及びタンパク質を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約１時間から約１０時間または約４時間から約９時間の間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、巨大分子、及びタンパク質を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約９時間で行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、巨大分子、及びタンパク質を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約５時間から約２０時間、約５時間から約１５時間、または６時間から約１０時間の間で行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、巨大分子、及びタンパク質を除去し、第２の混合物をイオン交換して、第３の混合物を得ることは、約８時間で行われる。

代替的な方法では、夾雑物の除去は、第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることをさらに含んでもよい。濃縮し、脱塩することは、様々な条件下で行うことができる。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、減圧下で濃縮される。いくつかの実施形態では、第１の混合物は、高温で濃縮される。いくつかの実施形態では、第１の混合物の脱塩は、第１の混合物をクロマトグラフィーシステムに通すことを含む。いくつかの実施形態では、第１の混合物を脱塩するために使用されるクロマトグラフィーシステムは、逆相クロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、シリカベース、ペプチドベース、またはポリマーベースを含む固定相を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）またはＣ１８樹脂を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、Ｃ１８樹脂を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの固定相は、アセトニトリルと適合する。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーは、極性溶媒を含む移動相を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、アルキルアンモニウム塩緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ジメチルヘキシルアンモニウム（ＤＭＨＡ）緩衝液、ＤＭＯＡ緩衝液、またはトリエチルアンモニウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ＤＭＯＡ緩衝液である。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相のＤＭＯＡ緩衝液は、約５ｍＭから約１５ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相のＤＭＯＡ緩衝液は、約１０ｍＭの濃度を有する。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ジオール、アルコール、ハロゲン化アルキル、エーテル、ニトリル、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ジオール、ニトリル、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、ヘキシレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、逆相クロマトグラフィーの移動相は、アセトニトリルを含む。

第３の混合物をクロマトグラフィーシステムに通すことは、約２時間から約１０時間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、第３の混合物をクロマトグラフィーシステムに通すことは、約６時間で行われる。

代替的な方法では、夾雑物の除去は、第２の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、ろ過して、第３の混合物を得ることをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の混合物は、減圧下で濃縮される。いくつかの実施形態では、第２の混合物は、高温で濃縮される。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、濃縮中に除去される。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、凍結乾燥することは、水及びＤＭＯＡを除去する。いくつかの実施形態では、再溶解することは、水性溶媒中で行われる。いくつかの実施形態では、再溶解することは、水中で行われる。いくつかの実施形態では、再溶解することは、約１００ｍＭから約３００ｍＭの溶液をもたらす。いくつかの実施形態では、再溶解することは、約１００ｍＭの溶液をもたらす。いくつかの実施形態では、第２の混合物は、ポリビニリデンフィルター、ポリエチレンフィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリテトラフルオロエチレンフィルター、セルロースエステルフィルター、またはポリエーテルスルホンフィルターに通される。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．１μｍから約１μｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．２μｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．４５μｍのサイズを有する。

第２の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、ろ過して、第３の混合物を得ることは、約３０時間から約４０時間の間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、第２の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、ろ過して、第３の混合物を得ることは、約３６時間で行われる。

代替的な方法では、夾雑物の除去は、第３の混合物をイオン交換して、第４の混合物を得ることをさらに含んでもよい。第３の混合物をイオン交換して、第４の混合物を得ることは、様々な条件下で行うことができる。例えば、イオン交換することは、第３の混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含む。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムは、アニオン交換システムである。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムの移動相は、水、水溶液、または緩衝水溶液を含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムの移動相は、ＮａＣｌの水溶液、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液、またはＫＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮａＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮＨ_４Ｃｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約０．５Ｍから約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約１．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、ＤＭＯＡをＮＨ_４ ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムの固定相は、強塩基または弱塩基を含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムの固定相は、アクリル／ジビニルベンゼン、スチレン／ジビニルベンゼン、ヒドロキシル化メタクリルポリマー、または架橋ポリメタクリラートを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムの固定相は、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ポリアミン、第三級アミン、第四級アミン、ジメチルエタノールアミン、またはトリメチルベンジルアンモニウムを含む官能基を有する。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムの固定相は、トリメチルベンジルアンモニウムを含む官能基を有する。

いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、またはＮａ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、固定相は、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（３０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、またはＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱを含む。いくつかの実施形態では、回収基準は、吸光度単位（ＡＵ）に基づく。いくつかの実施形態では、回収基準は、約１００から約５００ｍＡＵ、約２００から約４００ｍＡＵ、約２５０から約３５０ｍＡＵ、または約３００ｍＡＵである。いくつかの実施形態では、移動相は、ＫＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＫＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍ、約０．２５Ｍから約２．０Ｍ、約０．５Ｍから約２．０Ｍ、約０．８Ｍから約１．５Ｍ、または約１．０Ｍの濃度を有する。

いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムは、Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_７ ^２－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^２－、またはＣｌ^－を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、及びＮａ^＋から選択されるカチオンならびにＣ_６Ｈ_８Ｏ_７ ^２－、ＳＯ_４ ^２－、ＰＯ_４ ^２－、及びＣｌ^－から選択されるアニオンを含む水溶液を含む。

代替的な方法では、夾雑物の除去は、第４の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、濃縮し、ろ過して、第５の混合物を得ることをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、第２の混合物は、減圧下で濃縮される。いくつかの実施形態では、第２の混合物は、高温で濃縮される。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、濃縮中に除去される。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、アセトニトリルである。いくつかの実施形態では、凍結乾燥することは、水及びＤＭＯＡを除去する。いくつかの実施形態では、再溶解することは、水性溶媒中で行われる。いくつかの実施形態では、再溶解することは、水中で行われる。いくつかの実施形態では、再溶解することは、約１００ｍＭから約３００ｍＭの溶液をもたらす。いくつかの実施形態では、再溶解することは、約１００ｍＭの溶液をもたらす。いくつかの実施形態では、濃縮することは、第４の混合物を冷却し、第４の混合物を減圧下に置き、第４の混合物を加熱することを含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物は、ポリビニリデンフィルター、ポリエチレンフィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリテトラフルオロエチレンフィルター、セルロースエステルフィルター、またはポリエーテルスルホンフィルターに通される。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．１μｍから約１μｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．２μｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、フィルターは、約０．４５μｍのサイズを有する。

第２の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、濃縮し、ろ過して、第３の混合物を得ることは、約３０時間から約４０時間の間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、第２の混合物を濃縮し、凍結乾燥し、再溶解し、濃縮し、ろ過して、第３の混合物を得ることは、約３６時間で行われる。

代替的な方法では、夾雑物の除去は、第５の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することをさらに含んでもよい。第５の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することは、様々な条件下で行うことができる。例えば、第５の混合物のろ過は、第５の混合物をポリビニリデンフィルター、ポリエチレンフィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリテトラフルオロエチレンフィルター、セルロースエステルフィルター、またはポリエーテルスルホンフィルターに通してろ過することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、第５の混合物のろ過は、約０．１μｍから約１μｍのサイズを有するフィルターを使用することを含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物のろ過は、約０．２μｍのサイズを有するフィルターを使用することを含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物のろ過は、約０．４５μｍのサイズを有するフィルターを使用することを含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度は、約１０００ｍＭから約５ｍＭ、約５００ｍＭから約１０ｍＭ、または約２５０ｍＭから約４０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度は、約１００ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第５の混合物は、約５０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度は、塩基性溶液で調節される。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、ＨＣｌＯ、またはＣａＣＯ_３を含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ及び水を含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約１％ｗ／ｖから８％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約３．５％ｗ／ｖから４．５％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物のｐＨは、約５．５から約６．９に調節される。いくつかの実施形態では、第５の混合物のｐＨは、約６．０から約６．５に調節される。いくつかの実施形態では、第５の混合物のｐＨは、約６．３に調節される。

本明細書に記載のリサイクル方法は、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を、例えば、約８０％超の高純度で得ることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって調製されるヌクレオチドキャップ、またはその塩は、約９０％超の純度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって調製されるヌクレオチドキャップ、またはその塩は、約９５％超の純度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって調製されるヌクレオチドキャップ、またはその塩は、約９８％超の純度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって調製されるヌクレオチドキャップ、またはその塩は、約９９％超の純度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって調製されるヌクレオチドキャップ、またはその塩は、約９９．５％超の純度を有する。

本明細書に記載の方法は、合成反応混合物中（例えば、新規の調製）で調製されたｍＲＮＡヌクレオチドキャップの精製にも適用することができる。例えば、本明細書に記載のリサイクル方法は、ｍＲＮＡ調製物から得られた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去するプロセスを含んでもよい。ｍＲＮＡキャップを生成するための合成反応は、巨大分子及びタンパク質のような夾雑物を含まない場合もあるため、巨大分子及びタンパク質を除去するためのプロセスを行う必要がない。

あるいは、混ぜ合わされた混合物からの夾雑物の除去は、
ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子を除去し、濃度を調節して、第１の混合物を得ることと、
第１の混合物からタンパク質を除去して、第２の混合物を得ることと、
濃度を調節し、第２の混合物をろ過して、第３の混合物を得ることと、
第３の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第４の混合物を得ることと、
濃度を調節し、第４の混合物をろ過して、第５の混合物を得ることと
を含んでもよい。

第２の代替的な方法では、夾雑物の除去は、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子を除去し、濃度を調節して、第１の混合物を得ることを含んでもよい。ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物から巨大分子を除去して、第１の混合物を得ることは、様々な条件で行うことができる。例えば、巨大分子の除去は、ろ過を含んでもよい。ろ過は、圧力駆動型膜分離であってもよい。いくつかの実施形態では、ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、ろ過システムは、カセットフィルター、スパイラル巻きフィルター、ホローファイバーフィルター、チューブラーフィルター、または平板フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、カセットフィルター、またはスパイラル巻きフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルホン膜、親水性ポリエーテルスルホン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、及びポリエチレン膜から選択されるフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約１ｋＤａから約１００ｋＤａ、約１０ｋＤａから約７０ｋＤａ、約２０ｋＤａから約４０ｋＤａ、または約２５ｋＤａから約３５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約３０ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、巨大分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、濃度を調節することは、水溶液を添加することを含む。いくつかの実施形態では、水溶液は、酸性溶液である。いくつかの実施形態では、酸性溶液は、ギ酸溶液、酢酸溶液、またはトリクロロ酢酸溶液である。いくつかの実施形態では、酸性溶液は、酢酸溶液である。いくつかの実施形態では、水溶液は、約０．５Ｍから約３Ｍ、約０．６Ｍから約２Ｍ、約０．８Ｍから約１．５Ｍ、約０．８Ｍから約１．２Ｍ、または約１Ｍの酢酸濃度を有する。

第２の代替的な方法では、夾雑物の除去は、第１の混合物からタンパク質を除去して、第２の混合物を得ることをさらに含んでもよい。ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む混ぜ合わされた混合物からタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることは、様々な条件で行うことができる。例えば、タンパク質の除去は、ろ過を含んでもよい。ろ過は、圧力駆動型膜分離であってもよい。いくつかの実施形態では、ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、ろ過システムは、カセットフィルター、スパイラル巻きフィルター、ホローファイバーフィルター、チューブラーフィルター、または平板フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、カセットフィルター、またはスパイラル巻きフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルホン膜、親水性ポリエーテルスルホン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、及びポリエチレン膜から選択されるフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約１ｋＤａから約１００ｋＤａ、約３ｋＤａから約５０ｋＤａ、約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約１５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約１０ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。

第２の代替的な方法では、夾雑物の除去は、濃度を調節し、第２の混合物をろ過して、第３の混合物を得ることをさらに含んでもよい。濃度を調節し、ろ過することは、様々な条件下で行うことができる。いくつかの実施形態では、第２の混合物の濃度は、約１０００ｍＭから約５ｍＭ、約５００ｍＭから約１０ｍＭ、または約２５０ｍＭから約４０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第２の混合物の濃度は、約１００ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第２の混合物は、約５０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第２の混合物の濃度は、塩基性溶液で調節される。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、ＨＣｌＯ、またはＣａＣＯ_３を含む。いくつかの実施形態では、第５の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ及び水を含む。いくつかの実施形態では、第２の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約１％ｗ／ｖから約８％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、第２の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約３．５％ｗ／ｖから４．５％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、圧力駆動型膜分離であってもよい。いくつかの実施形態では、ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、ろ過システムは、カセットフィルター、スパイラル巻きフィルター、ホローファイバーフィルター、チューブラーフィルター、または平板フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、カセットフィルター、またはスパイラル巻きフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルホン膜、親水性ポリエーテルスルホン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、及びポリエチレン膜から選択されるフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約０．５ｋＤａから約３０ｋＤａ、約０．７ｋＤａから約２０ｋＤａ、約０．８ｋＤａから約１０ｋＤａ、または約１ｋＤａから約５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。

第２の代替的な方法では、夾雑物の除去は、第３の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第４の混合物を得ることをさらに含んでもよい。ＮＴＰを除去し、イオン交換することは、様々な条件下で行うことができる。例えば、ＮＴＰを除去することは、第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含んでもよい。イオン交換することは、第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含んでもよい。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムは、アニオン交換システムである。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、水、水溶液、または緩衝水溶液を含む移動相を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、ＮａＣｌの水溶液、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液、またはＫＣｌ水溶液を含む。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮａＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．２５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約０．５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．０Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの水溶液は、約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、移動相は、水及びＮＨ_４Ｃｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約０．５Ｍから約１．５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約１．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、移動相は、ＫＣｌの水溶液を含む。いくつかの実施形態では、ＫＣｌの水溶液は、約０．２０Ｍから約２．０Ｍ、約０．２５Ｍから約２．０Ｍ、約０．５Ｍから約２．０Ｍ、約０．８Ｍから約１．５Ｍ、または約１．０Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋、Ｋ^＋、またはＮａ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋に交換することを含む。いくつかの実施形態では、アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、強塩基または弱塩基を含む固定相を含む。いくつかの実施形態では、固定相は、アクリル／ジビニルベンゼン、スチレン／ジビニルベンゼン、ヒドロキシル化メタクリルポリマー、または架橋ポリメタクリラートを含む。いくつかの実施形態では、固定相は、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ポリアミン、第三級アミン、第四級アミン、ジメチルエタノールアミン、またはトリメチルベンジルアンモニウムを含む官能基を含む。いくつかの実施形態では、官能基は、第四級アミンを含む。いくつかの実施形態では、固定相は、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ（３０）、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、またはＰＯＲＯＳ（商標）ＸＱを含む。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約５０ｍＬ／分から約１０Ｌ／分、６５ｍＬ／分から約８Ｌ／分、７５ｍＬ／分から約６Ｌ／分、約８５ｍＬ／分から約１Ｌ／分、または約１００ｍＬ／分から約８００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１１０ｍＬ／分、約４００ｍＬ／分、または約６００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約４００ｍＬ／分である。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約１０Ｌ／分超である。いくつかの実施形態では、回収基準は、吸光度単位（ＡＵ）に基づく。いくつかの実施形態では、回収基準は、約１００から約５００ｍＡＵ、約２００から約４００ｍＡＵ、約２５０から約３５０ｍＡＵ、または約３００ｍＡＵである。

第２の代替的な方法では、夾雑物の除去は、濃度を調節し、第４の混合物をろ過して、第５の混合物を得ることをさらに含んでもよい。濃度を調節し、第４の混合物をろ過して、第５の混合物を得ることは、様々な条件下で行うことができる。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、約１０００ｍＭから約５ｍＭ、約５００ｍＭから約１０ｍＭ、または約２５０ｍＭから約４０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、約１００ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物は、約５０ｍＭに調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度は、塩基性溶液で調節される。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＮａＨＣＯ_３、Ｋ_２ＣＯ_３、ＫＨＣＯ_３、ＨＣｌＯ、またはＣａＣＯ_３を含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ及び水を含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約１％ｗ／ｖから約８％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、第４の混合物の濃度を調節するために使用される塩基性溶液は、水中の約３．５％ｗ／ｖから４．５％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、圧力駆動型膜分離であってもよい。いくつかの実施形態では、ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である。いくつかの実施形態では、ろ過システムは、カセットフィルター、スパイラル巻きフィルター、ホローファイバーフィルター、チューブラーフィルター、または平板フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、カセットフィルター、またはスパイラル巻きフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜、ポリアミド膜、ポリエーテルスルホン膜、親水性ポリエーテルスルホン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、及びポリエチレン膜から選択されるフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約０．５ｋＤａから約３０ｋＤａ、約０．７ｋＤａから約２０ｋＤａ、約０．８ｋＤａから約１０ｋＤａ、または約１ｋＤａから約５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。いくつかの実施形態では、ろ過は、約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む。

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップをリサイクルする方法は、約１日から約２０日の間、約２日から約１５日の間、約３日から約１０日の間、約５日から約１０日の間、約６日から約８日の間、または約７日間で行われてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップをリサイクルする方法は、約５０％から約１００％の回収率、約６０％から約１００％の回収率、約６５％から約１００％の回収率、約７０％から約１００％の回収率、約７０％から約９９％の回収率、または約７０から約８５％の回収率をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法から回収されるｍＲＮＡヌクレオチドキャップは、約７０％から約１００％、約８０％から約１００％、約８０％から約９９％、約８５％から約９９％、約９０％から約９９％、または約９５％から約９９％の純度を有する。

ｍＲＮＡヌクレオチドキャップと結合しているカチオンは、リサイクルプロセスの過程で変化することがある。例えば、リサイクルプロセスの間、リサイクルプロセス前にヌクレオチドキャップと結合しているカチオンは、Ｎａ^＋に交換されてもよく、それが、その後、ＤＭＯＡに交換され、次いで、それがＮＨ_４ ^＋に交換される。いくつかの実施形態では、リサイクルプロセスの間、リサイクルプロセス前にヌクレオチドキャップと結合しているカチオンは、Ｎａ^＋に交換され、それが、その後、ＤＭＨＡに交換され、次いで、それがＮＨ_４ ^＋に交換される。いくつかの実施形態では、リサイクルプロセスの間、リサイクルプロセス前にヌクレオチドキャップと結合しているカチオンは、ＮＨ_４ ^＋に交換され、それが、その後、ＤＭＯＡに交換され、次いで、それがＮＨ_４ ^＋に交換される。いくつかの実施形態では、リサイクルプロセスの間、リサイクルプロセス前にヌクレオチドキャップと結合しているカチオンは、ＮＨ_４ ^＋に交換され、それが、その後、ＤＭＨＡに交換され、次いで、それがＮＨ_４ ^＋に交換される。いくつかの実施形態では、リサイクルプロセスの間、リサイクルプロセス前にヌクレオチドキャップと結合しているカチオンは、ＮＨ_４ ^＋に交換され、カチオンＮＨ_４ ^＋は、リサイクルプロセスの間、同じままである。

いくつかの実施形態では、リサイクルプロセスは、
約１０ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含むタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を使用してろ過して、第１の混合物を得ることと、
約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含むＴＦＦを使用して第１の混合物をろ過して、第２の混合物を得ることと、
ヌクレオチドキャップと結合しているカチオンをＮａ^＋またはＮＨ_４ ^＋と交換することを含む、アニオン交換クロマトグラフィーを第２の混合物に対して実施して、第３の混合物を得ることと、
Ｎａ^＋またはＮＨ_４ ^＋をＤＭＯＡまたはＤＭＨＡに交換することを含む、逆相クロマトグラフィーを第３の混合物に対して実施して、第４の混合物を得ることと、
ＴＦＦを使用して第４の混合物をろ過して、第５の混合物を得ることであって、ろ過が緩衝液交換及びＤＭＯＡまたはＤＭＨＡをＮＨ_４ ^＋に交換することを含む、得ることと
を含む。

いくつかの実施形態では、リサイクルプロセスは、
約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含むタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を使用してろ過して、第１の混合物を得ることと、
ヌクレオチドキャップと結合しているカチオンをＮＨ_４ ^＋と交換することを含む、アニオン交換クロマトグラフィーを第１の混合物に対して実施して、第２の混合物を得ることと、
約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含むＴＦＦを使用して第２の混合物をろ過して、第３の混合物を得ることと
を含む。

本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語が最初に定義される。本出願で使用される場合、本明細書中に別途明示的に示されている場合を除き、次の用語の各々は、以下に記載する意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願全体を通して記載されている。

単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で表記される。数値範囲には、その範囲を画定する数が含まれる。値の範囲が列挙されている場合、その範囲の列挙された上限値と下限値の間に介在する各整数値、及びその各分数も、そのような値の間の各部分範囲とともに具体的に開示されていることを理解されたい。

ヌクレオチドは、広く認められている１文字の略号で表される。特段の記載がない限り、核酸は５’から３’の配向で左から右に示される。核酸塩基は、本明細書においてＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎに推奨される一般的に知られている１文字記号により言及される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。

アルキル：本明細書で使用される場合、単独でまたは他の用語と組み合わせて用いられる「アルキル」という用語は、直鎖または分岐であり得る飽和炭化水素基を指す。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１から１２個、１から８個、または１から６個の炭素原子を含む。アルキル部分の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチルのなどの化学基；２－メチル－１－ブチル、ｎ－ペンチル、３－ペンチル、ｎ－ヘキシル、１，２，２－トリメチルプロピル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなど高級同族体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルキル部分は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ－ヘキシル、または２，４，４－トリメチルペンチルである。いくつかの実施形態では、アルキル部分は、メチルである。

約：本明細書及び特許請求の範囲全体を通して数値に関連して使用される「約」という用語は、当業者によく知られ、許容される精度の間隔を示す。そのような精度の間隔は、±１０％である。

化合物：本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は、描写された構造の全ての立体異性体及び同位体を含むことを意味する。本明細書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、化合物の任意の幾何異性体（例えば、シス異性体及びトランス異性体）、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本開示は、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびに鏡像異性体混合物及び立体異性体混合物、例えばラセミ体を含む、本明細書に記載の化合物のあらゆる全ての立体異性体を包含する。化合物の鏡像異性体混合物及び立体異性体混合物、ならびにそれらの成分である鏡像異性体または立体異性体にそれらを分割する手段は周知である。「同位体」とは、同じ原子番号を有するが、核中の中性子の数が異なるため、異なる質量数を有する原子を指す。例えば、水素の同位体には、トリチウム及び重水素が含まれる。さらに、本開示の化合物、塩、または複合体は、通常の方法によって、溶媒または水分子と組み合わせて調製して、溶媒和物及び水和物を生成することができる。

ジアステレオマー：本明細書で使用される場合、「ジアステレオマー」という用語は、互いの鏡像ではなく、かつ互いに重ね合わせることができない立体異性体を意味する。

鏡像異性体：本明細書で使用される場合、「鏡像異性体」という用語は、少なくとも８０％（すなわち、一方の鏡像異性体が少なくとも９０％、かつ他方の鏡像異性体が最大１０％）、少なくとも９０％、または少なくとも９８％の光学純度または鏡像異性体過剰率（当該技術分野の標準的方法により決定される）を有する、本開示の化合物の各々個々の光学活性形態を意味する。

ハロ：本明細書で使用される場合、単独でまたは他の用語と組み合わせて用いられる「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指す。

インビトロ：「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）の内部ではなく、人工的環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養物中、ペトリ皿内などで起こる事象を指す。

単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、それが関連する成分の少なくともいくつかから分離された物質または実体を指す（自然または実験環境であるかにかかわらず）。単離された物質（例えば、化合物）は、それらが単離された物質に関連して、様々なレベルの純度を有する可能性がある。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に関連した他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物、及びその塩は、実質的に単離されている。化合物及びそれらの塩を単離するための方法は、当該技術分野において定型化したものである。

実質的に単離された：「実質的に単離された」とは、化合物が、それが形成または検出された環境から実質的に分離されたことを意味する。部分的な分離は、例えば、本開示の化合物が濃縮された組成物を含む場合がある。実質的な分離は、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、少なくとも約９０重量％、少なくとも約９５重量％、少なくとも約９７重量％、または少なくとも約９９重量％の本開示の化合物、またはその塩を含む組成物を含む場合がある。

異性体：本明細書で使用される場合、「異性体」という用語は、本開示の化合物のいずれかの任意の互変異性体、立体異性体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを意味する。本開示の化合物は、１つ以上のキラル中心及び／または二重結合を有してもよく、したがって、立体異性体、例えば、二重結合異性体（すなわち、幾何Ｅ／Ｚ異性体）またはジアステレオマー（例えば、鏡像異性体（すなわち、（＋）もしくは（－））もしくはシス／トランス異性体）として存在し得ることが認識されている。本開示によれば、本明細書に描写される化学構造、したがって本開示の化合物は、対応する立体異性体の全て、すなわち、立体異性的に純粋な形態（例えば、幾何学的に純粋、鏡像異性的に純粋、またはジアステレオマー的に純粋）ならびに鏡像異性体混合物及び立体異性体混合物（例えば、ラセミ体）の両方を包含する。本開示の化合物の鏡像異性体混合物及び立体異性体混合物は、典型的には、キラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩複合体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化などの周知の方法によって、それらの成分である鏡像異性体または立体異性体に分割することができる。鏡像異性体及び立体異性体は、周知の不斉合成法によって、立体異性的にまたは鏡像異性的に純粋な中間体、試薬、及び触媒から得ることもできる。

薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という語句は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に見合ったヒト及び動物の組織との接触に使用するのに適した化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために用いられる。

薬学的に許容される塩：本開示は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基基を適切な有機酸と反応させることによって）修飾される、本開示の化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに無毒アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオン（限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが含まれる）が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩を含む。本開示の薬学的に許容される塩は、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から、従来の化学的方法によって合成され得る。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸形態または遊離塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはその２つの混合物中（一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が使用される）で、化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製され得る。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７^ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８，及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

薬学的に許容される溶媒和物：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、適切な溶媒の分子が結晶格子に導入されている本開示の化合物を意味する。適切な溶媒は、投与される投与量で生理学的に忍容性のあるものである。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。適切な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２－（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２－ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒の場合、溶媒和物は「水和物」と称される。

精製された：本明細書で使用される場合、「精製する」「精製された」、「精製」とは、望ましくない成分、汚染物質、混合物または不完全物から、実質的に純粋または清浄な状態にすることを意味する。

塩：「塩」という用語には、任意のアニオン性及びカチオン性錯体が含まれる。塩は、薬学的に許容される塩を含む場合がある。アニオンの非限定的な例としては、無機及び有機アニオン、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、シュウ酸（例えば、ヘミシュウ酸）、リン酸、ホスホン酸、リン酸水素、リン酸二水素、酸化物、炭酸、炭酸水素、硝酸、亜硝酸、窒化物、亜硫酸水素、硫化物、重硫酸、硫酸、チオ硫酸、硫酸水素、ホウ酸、ギ酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、アクリル酸、ポリアクリル酸、フマル酸、マレイン酸、イタコン酸、グリコール酸、グルコン酸、リンゴ酸、マンデル酸、チグリン酸、アスコルビン酸、サリチル酸、ポリメタクリル酸、過塩素酸、塩素酸、亜塩素酸、次亜塩素酸、臭素酸、次亜臭素酸、ヨウ素酸、アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸、ヒ酸、亜ヒ酸、クロム酸、二クロム酸、シアン化物、シアン酸、チオシアン酸、水酸化物、過酸化物、過マンガン酸、及びそれらの混合物が挙げられる。

立体異性体：本明細書で使用される場合、「立体異性体」という用語は、化合物が有し得る全ての可能な異なる異性体及び立体構造形態（例えば、本明細書に記載のいずれかの式の化合物）、特に、基本的分子構造の全ての可能な立体化学的及び立体構造的な異性体形態、全てのジアステレオマー、鏡像異性体、及び／または配座異性体を指す。本開示のいくつかの化合物は、異なる互変異性形態で存在することができ、後者は全て、本開示の範囲内に含まれる。

実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、対象となる特徴または特性の全てのまたはほぼ全ての範囲または程度を示す定性的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的特徴が、完全となること、及び／または完全へと進むこと、あるいは絶対的な結果を達成することまたは回避することは、たとえあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的特徴に内在する潜在的な完全性の欠如を捕捉するために本明細書で使用される。

本明細書に記載の方法は、当該技術分野で公知の任意の適切な方法に従って監視することができる。例えば、生成物の形成は、分光学的手段、例えば、核磁気共鳴分光法（例えば、^１Ｈもしくは^１３Ｃ）、赤外線分光法、または分光光度法（例えば、紫外－可視）によって；あるいはクロマトグラフィー、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣＭＳもしくはＬＣ－ＭＳ）、または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはその他の関連技術によって、監視することができる。

本明細書に記載の方法は、有機合成の当業者によって容易に選択され得る好適な溶媒中で実行され得る。適切な溶媒は、プロセスが行われる温度、例えば、溶媒の凍結温度から溶媒の沸騰温度の範囲であり得る温度において、成分（例えば、ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ）と実質的に反応しないものであり得る。所与のプロセスは、１つの溶媒または２つ以上の溶媒の混合物中で行うことができる。特定のステップに応じて、特定のステップに適した溶媒が選択可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、例えば、ロータリーエバポレータなどの減圧中で加熱することによって１つ以上の溶媒を除去することである。

本明細書に記載の溶媒の例は、有機溶媒、極性溶媒、水など、またはそれらの混合物であり得る。例えば、溶媒は、ハロゲン化溶媒であってもよく、ハロゲン化溶媒としては、四塩化炭素、ブロモジクロロメタン、ジブロモクロロメタン、ブロモホルム、クロロホルム、ブロモクロロメタン、ジブロモメタン、ブチルクロリド、ジクロロメタン、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、１，１，１－トリクロロエタン、１，１，２－トリクロロエタン、１，１－ジクロロエタン、２－クロロプロパン、α，α，α－トリフルオロトルエン、１，２－ジクロロエタン、１，２－ジブロモエタン、ヘキサフルオロベンゼン、１，２，４－トリクロロベンゼン、１，２－ジクロロベンゼン、クロロベンゼン、フルオロベンゼン、それらの混合物などを挙げることができる。

溶媒は、エーテル溶媒などの有機溶媒であってもよく、エーテル溶媒としては、ジメトキシメタン、テトラヒドロフラン、１，３－ジオキサン、１，４－ジオキサン、フラン、ジエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテル、アニソール、ｔ－ブチルメチルエーテル、それらの混合物などを挙げることができる。

溶媒は、炭化水素溶媒などの有機溶媒であってもよく、炭化水素溶媒としては、ベンゼン、シクロヘキサン、ペンタン、ヘキサン、トルエン、シクロヘプタン、メチルシクロヘキサン、ヘプタン（例えば、ｎ－ヘプタン）、エチルベンゼン、ｍ－、ｏ－、またはｐ－キシレン、オクタン、インダン、ノナン、ナフタレン、それらの混合物などを挙げることができる。

溶媒は、プロトン性溶媒または非プロトン性溶媒であり得る極性溶媒であってもよい。プロトン性溶媒の例としては、水、メタノール、エタノール、２－ニトロエタノール、２－フルオロエタノール、２，２，２－トリフルオロエタノール、エチレングリコール、１－プロパノール、２－プロパノール、２－メトキシエタノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉ－ブチルアルコール、ｔ－ブチルアルコール、２－エトキシエタノール、ジエチレングリコール、１－、２－、または３－ペンタノール、ネオペンチルアルコール、ｔ－ペンチルアルコール、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、フェノール、グリセロール、それらの混合物などを挙げることができる。

非プロトン性溶媒の例としては、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、１，３－ジメチル－３，４，５，６－テトラヒドロ－２（１Ｈ）－ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、１，３－ジメチル－２－イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ホルムアミド、Ｎ－メチルアセトアミド、Ｎ－メチルホルムアミド、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、プロピオニトリル、ギ酸エチル、酢酸メチル、ヘキサクロロアセトン、アセトン、エチルメチルケトン、酢酸エチル、スルホラン、Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピオンアミド、テトラメチル尿素、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ヘキサメチルホスホルアミド、それらの混合物などを挙げることができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物、及びその塩は、水及び溶媒（例えば、水和物及び溶媒和物）などの他の物質と共に見出され得る。

本明細書に記載の方法は、当業者によって容易に決定され得る適切な温度で行うことができる。温度は、例えば、成分及び溶媒の融点及び沸点によって決まることになる。「高温」は、室温（約２２℃）より上の温度を指す。本明細書で使用される場合、「周囲温度」及び「室温」または「ｒｔ」という表現は、当該技術分野で理解されており、一般に、方法が行われる部屋の温度に近い、例えば、約２０℃から約３０℃の温度である温度、例えば、反応温度を指す。

本発明は、特定の実施例によってより詳細に記載される。以下の実施例は、例証目的で提示されるにすぎず、決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。当業者は、本質的に同じ結果をもたらすように変更または修正され得る、様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。

節及び表見出しは限定することを意図しない。

実施例１
化合物Ａのリサイクルプロセス
インビトロ転写プロセスからの未使用／未反応の化合物Ａを含む混合物の夾雑物を除去するために、これらの混合物を混ぜ合わせ、一連の精製プロセスに供する。インビトロ転写調製物から回収されたｍＲＮＡヌクレオチドキャップを含む混合物の全ての材料をＮａ^＋塩に変換し、前記混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）及び他の夾雑物をアニオン交換クロマトグラフィーにより除去した。溶液をＣ１８カラムまたは逆相ポリマーに通して、ＤＭＯＡ^＋塩に変換し、ポリッシング精製した。得られた溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮して、アセトニトリルを除去し、凍結乾燥して、水及び過剰なＤＭＯＡを除去し、水中で再溶解し、ろ過した。溶液をイオン交換樹脂に通して、ＤＭＯＡ対イオンをＮＨ_４に交換した。溶液を、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮し、凍結乾燥し、水中で２００ｍＭに再溶解した。溶液を凍結及び解凍し、次いでろ過した。溶液の濃度をおよそ１００ｍＭに調節し、ｐＨを６．３に調節し、濃度を１００ｍＭに調節し、溶液を、０．２μｍフィルターを使用してろ過して、精製された化合物Ａ（５７．７ｇ、６６％－小さなランの合計）を得た。記載のプロセスの概略図を図１に示す。図３は、インビトロ転写から回収された溶液及び精製された化合物ＡのＬＣＭＳを示す。

実施例２
化合物Ａの代替的リサイクルプロセス
化合物Ａを含む混合物から夾雑物を除去するための別のプロセスは、以下の通りである。インビトロ転写調製物から回収されたｍＲＮＡヌクレオチドキャップを含む混合物のｐＨを６．０から６．５に調節した。得られた溶液を、以下のパラメータで、５ｋＤａフィルターを用いたタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を使用して室温でろ過して、タンパク質及び巨大分子を除去した。
０．２％／ｐＨ３～４、＜２５℃の過酢酸再循環、２０分（＜１０Ｌ）において使用前に膜を無菌化
フィルターサイズ＝２５１９ １３平方フィート
緩衝液の種類＝ＩＶＴフィード／水
緩衝液体積＝５０～２００Ｌ
供給流量＝１０～１２Ｌ／分
透過流束範囲＝０．７５～１Ｌ
ＴＭＰ範囲＝約６０ｐｓｉｇ
ＤＶ数＝１～３

保持液を、以下のパラメータで、３００～５００Ｄａフィルターを用いたＴＦＦを使用して室温でろ過した。
０．２％／ｐＨ３～４、＜２５℃の過酢酸再循環、２０分（＜１０Ｌ）において使用前に膜を無菌化
フィルターサイズ＝２５１９，１３平方フィート
緩衝液＝水
緩衝液体積＝７０～２２０Ｌ
供給流量＝１０～１２Ｌ／分
透過流束範囲＝１００～３５０ｍＬ／分
ＴＭＰ範囲＝＜１５０ｐｓｉｇ
初期濃縮係数＝５×
ＤＶ数＝１～３

透過液を化合物Ａの減少に関してＬＣＭＳにより監視した。保持液を濃縮した後、以下のパラメータで、紫外検出（＜５ｂａｒ）を伴い室温で低圧アニオン交換クロマトグラフィーシステムに通して、ＮＴＰを除去した。
標準的な使用前無菌化
ＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔクロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィーカラム
通水倍率＝１０Ｌ以下
サイクル数＝１以上
樹脂の種類＝ＳｕｐｅｒＱ（登録商標）
移動相Ａ＝水
移動相Ｂ＝１．５Ｍ ＮａＣｌ
緩衝液体積Ａ＝１００Ｌ
緩衝液体積Ｂ＝５０Ｌ
流量＝０．４ＬＰＭ
画分捕集体積＝１Ｌ
画分総数／サイクル＝４０
操作段階：
１ｃｖ 水
２ｃｖ ５％ １．５Ｍ ＮａＣｌ
３ｃｖ ７．５％ １．５Ｍ ＮａＣｌ
５．５ｃｖ １１．５％ １．５Ｍ ＮａＣｌ
０．５ｃｖ １５％ １．５Ｍ ＮａＣｌ
１ｃｖ １００％ １．５Ｍ ＮａＣｌ
２ｃｖ 水

ＬＣＭＳによるＩＰＣ画分分析を使用して、プール化及び画分拒絶を報告した。プールされた画分を、以下のパラメータで、紫外検出（＜７ｂａｒ）を伴い室温で中圧アセトニトリル適合クロマトグラフィーシステムに通した。
標準的な使用前無菌化
クロマトグラフィーカラム
スチレンジビニルベンゼン（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ ２×８００ｇ Ａｔｏｌｌ－Ｘ（登録商標））
サイクル数＝１以上
樹脂の種類＝（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ Ａｔｏｌｌ Ｘ（登録商標））スチレンジビニルベンゼン
移動相Ａ＝１０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
移動相Ｂ＝アセトニトリル
緩衝液体積Ａ＝４０Ｌ
緩衝液体積Ｂ＝２０Ｌ
流量＝０．１７５ＬＰＭ
画分捕集体積＝６０ｍＬ
画分総数／サイクル＝１２０～２００
操作段階：
１．５ＣＶ ０％ ＡＣＮ、１００％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
１．５ＣＶ ５％ ＡＣＮ、９５％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
１．５ＣＶ １０％ ＡＣＮ、９０％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
１．５ＣＶ １５％ ＡＣＮ、８５％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
１．０ＣＶ ２０％ ＡＣＮ、８０％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
４．０ＣＶ ２２％ ＡＣＮ、７８％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
０．５ＣＶ ２５％ ＡＣＮ、７５％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
０．５ＣＶ ３０％ ＡＣＮ、７０％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
１．０ＣＶ １００％ ＡＣＮ、０％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ
１．５ＣＶ ０％ ＡＣＮ、１００％ １０ｍＭ ＤＭＯＡＢ

化合物Ａは、約２０％のアセトニトリル中に溶出し、このカラムを、１００％のアセトニトリルを使用して再生した。ＬＣＭＳによるＩＰＣ画分分析を使用して、プール化及び画分拒絶を報告した。プールされた画分を、減圧下、３０℃で濃縮して、アセトニトリル及び一部のＤＭＯＡＢを除去した。得られた混合物を、以下のパラメータで、３００～５００Ｄａフィルターを用いたＴＦＦを使用して室温でろ過して、ＤＭＯＡイオンをＮＨ_４イオンに交換し、脱塩した。
０．２％／ｐＨ３～４、＜２５℃の過酢酸再循環、２０分（＜１０Ｌ）において使用前に膜を無菌化
フィルターサイズ＝２５１９ １３平方フィート
緩衝液＝４００ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ
緩衝液体積＝５０Ｌ
供給流量＝１０～１２Ｌ／分
透過流束範囲＝２００～４００ｍＬ／分
ＴＭＰ範囲＝＜１５０ｐｓｉｇ
初期濃縮係数＝２～３×
ｗ／４００ｍＭ ＮＨ_４Ｃｌ ｐＨ＝６．３を用いたＤＶ数＝８
ｗ／Ｈ_２Ｏを用いたＤＶ数＝５

塩交換の完了を、Ｈ^１ ＮＭＲにより監視した。図４は、イオン交換前後の化合物Ａの^１Ｈ ＮＭＲを示す。保持液を０．２μｍまたは０．４５μｍフィルターに通した後、減圧下、３０℃で＞１００ｍＭに濃縮して、過剰なＮＨ_４を除去した。溶液の濃度をおよそ１００ｍＭに調節し、水中の４％ＮＨ_４ＯＨを使用してｐＨを６．３に調節し、濃度を１００ｍＭに調節し、溶液を、０．２μｍフィルターを使用してろ過して、精製された化合物Ａ（９９．５１％の純度、約８０％の回収率）を得た。記載のプロセスの概略図を図２に示す。

リサイクルされた化合物Ａ及び新規の化合物Ａの純度を表１に示す。新規とは、化合物Ａの合成から得られた反応混合物から精製された化合物Ａを指す。

実施例３
化合物Ｇのリサイクルプロセス
インビトロ転写プロセスから未使用／未反応の化合物Ｇを含む混合物の夾雑物を除去するために、これらの混合物を混ぜ合わせ、一連の精製プロセスに供する。インビトロ転写調製物から回収されたｍＲＮＡヌクレオチドキャップを含む混合物を、１０ｋＤａフィルターを用いたカセットＴＦＦを使用してろ過して、巨大分子及びタンパク質を除去した。得られた混合物を、２ｋＤａフィルターを用いたカセットＴＦＦを使用して濃縮し、脱塩した。得られた溶液のＬＣＭＳを図６に示す。得られた溶液を、ＳｕｐｅｒＱ樹脂を使用したアニオン交換クロマトグラフィーにかけて、反応不純物を除去し、ＮＨ_４ ^＋に塩交換した（緩衝液ＮＨ_４Ｃｌ）。プロセス時間は２日であった。１日目にカラムを準備し、４時間無菌化した。２日目に８時間にわたり精製を行い、続いて画分を確認し、画分をプールした。プールした画分のＬＣＭＳを図６に示す。得られた溶液を、２ｋＤａフィルターを用いたカセットＴＦＦを使用して濃縮し、脱塩した。得られた溶液を０．４５μｍフィルターに通し、最終濃度に対するバッチサイズに基づいて必要に応じてロータリーエバポレーターにより濃縮した。溶液の濃度をおよそ５０ｍＭに調節し、水中の４％ＮＨ_４ＯＨを使用してｐＨを６．３に調節し、濃度を５０ｍＭに調節し、溶液を、０．２μｍフィルターを使用してろ過した（約９０～９５％の純度、約８０～８５％の回収率）。いくつかの例では、純度は９５％を超えた。いくつかの例では、溶液の濃度を１０ｎＭ未満に調節し、ｐＨ調節は必要なかった。記載のプロセスの概略図を図５に示す。

当業者であれば、通例の実験を使用するだけで、本明細書に記載される本開示による具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、またはそれを確認することができるであろう。本開示の範囲は、前述の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されるものである。

加えて、先行技術に該当する本開示の任意の特定の実施形態が、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。そのような実施形態は、当業者に公知であると見なされるので、本明細書にその除外が明示的に記載されていない場合であっても除外され得る。本開示の組成物のいずれの特定の実施形態も、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、あらゆる理由により、任意の１つ以上の請求項から除外することができる。

全ての引用文献、例えば、参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリ、及び本明細書に引用される技術は、引用に明示的に記載されていなくても、参照により本出願に組み込まれる。引用元及び本出願の記述が相反する場合、本出願の記述を優先するものとする。

Claims (59)

1. ｍＲＮＡヌクレオチドキャップまたはその塩をｍＲＮＡ調製物からリサイクルする方法であって、
   前記ヌクレオチドｍＲＮＡキャップ、またはその塩、及び１つ以上の夾雑物を含む１つ以上の混合物を回収し、混ぜ合わせることと、
   前記混ぜ合わされた混合物から前記夾雑物を除去することと
   を含む、前記方法。
2. 前記ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、
   

   

   化合物Ａまたは
   

   

   化合物Ｇである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、
   

   

   化合物Ａ塩である、請求項１に記載の方法。
4. 前記ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩は、
   

   

   化合物Ｇ塩である、請求項１に記載の方法。
5. 前記カチオンは、アンモニウムである、請求項３または４に記載の方法。
6. 前記カチオンは、ジメチルオクチルアンモニウム、ジメチルヘキシルアンモニウムまたはトリエチルアンモニウムである、請求項３または４に記載の方法。
7. 前記除去することは、
   前記ｍＲＮＡヌクレオチドキャップ、またはその塩を含む前記混ぜ合わされた混合物から巨大分子及びタンパク質を除去して、第１の混合物を得ることを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記巨大分子及びタンパク質を除去することは、ろ過を含む、請求項７に記載の方法。
9. 巨大分子及びタンパク質を除去するために使用される前記ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である、請求項８に記載の方法。
10. 巨大分子及びタンパク質を除去するために使用される前記ろ過は、カセットフィルターまたはスパイラル巻きフィルターを含む、請求項８または９に記載の方法。
11. 巨大分子及びタンパク質を除去するために使用される前記ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 巨大分子及びタンパク質を除去するために使用される前記ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
13. 巨大分子及びタンパク質を除去するために使用される前記ろ過は、約５ｋＤａから約１５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. ｐＨは、約６．０から約６．５に調節される、請求項７～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記除去することは、
    前記第１の混合物を濃縮し、脱塩して、第２の混合物を得ることをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記脱塩することは、ろ過を含む、請求項１５に記載の方法。
17. 前記第１の混合物を脱塩するために使用される前記ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記第１の混合物を脱塩するために使用される前記ろ過は、カセットフィルターまたはスパイラル巻きフィルターを含む、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記第１の混合物を脱塩するために使用される前記ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記第１の混合物を脱塩するために使用される前記ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記第１の混合物を脱塩するために使用される前記ろ過は、約５０Ｄａから約５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記第１の混合物を脱塩するために使用される前記ろ過は、約２ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記除去することは、
    前記第２の混合物からヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を除去し、イオン交換して、第３の混合物を得ることをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
24. ＮＴＰの前記除去は、前記第２の混合物をイオン交換クロマトグラフィーシステムに通すことを含む、請求項２３に記載の方法。
25. 前記イオン交換クロマトグラフィーシステムは、アニオン交換システムである、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 前記アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、水、水溶液、または緩衝水溶液を含む移動相を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記移動相は、水及びＮａＣｌの水溶液を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 前記ＮａＣｌの水溶液は、約０．２５Ｍから約２．０Ｍの濃度を有する、請求項２７に記載の方法。
29. 前記移動相は、水及びＮＨ_４Ｃｌの水溶液を含む、請求項２５または２６に記載の方法。
30. 前記ＮＨ_４Ｃｌの水溶液は、約０．５Ｍから約１．５Ｍの濃度を有する、請求項２９に記載の方法。
31. 前記アニオン交換クロマトグラフィーは、Ｎ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）をＮＨ_４ ^＋に交換することを含む、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記アニオン交換クロマトグラフィーシステムは、強塩基または弱塩基を含む固定相を含む、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記固定相は、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ポリアミン、第三級アミン、第四級アミン、ジメチルエタノールアミン、またはトリメチルベンジルアンモニウムを含む官能基を含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記イオン交換クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約５０ｍＬ／分から約１０Ｌ／分である、請求項２４～３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 前記除去することは、
    前記第３の混合物を濃縮し、脱塩して、第４の混合物を得ることをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記第３の混合物の前記脱塩は、前記第３の混合物をクロマトグラフィーシステムもしくはろ過、またはそれらの組み合わせに通すことを含む、請求項３５に記載の方法。
37. 前記第３の混合物を脱塩するために使用される前記クロマトグラフィーシステムは、逆相クロマトグラフィーである、請求項３６に記載の方法。
38. 前記逆相クロマトグラフィーは、ポリ（スチレンジビニルベンゼン）またはＣ１８樹脂を含む固定相を含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記逆相クロマトグラフィーは、ＤＭＯＡ緩衝液を含む移動相を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
40. 前記逆相クロマトグラフィーの前記移動相の前記ＤＭＯＡ緩衝液は、約５ｍＭから約１５ｍＭの濃度を有する、請求項３９に記載の方法。
41. 前記逆相クロマトグラフィーは、アセトニトリルを含む移動相を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
42. 前記逆相クロマトグラフィーは、塩交換をさらに含む、請求項３７～４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記逆相クロマトグラフィーは、Ｎａ^＋をＮ，Ｎ－ジメチルオクチルアンモニウム（ＤＭＯＡ）に交換することを含む、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記逆相クロマトグラフィーシステムのポンプ流量は、約５０ｍＬ／分から約１０Ｌ／分である、請求項３７～４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記第３の混合物の前記ろ過は、タンジェンシャルフローろ過である、請求項３６に記載の方法。
46. 前記第３の混合物の前記ろ過は、カセットフィルターまたはスパイラル巻きフィルターを含む、請求項３６または４５に記載の方法。
47. 前記第３の混合物の前記ろ過は、セルロースベースの膜フィルターを含む、請求項３６、４５及び４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記第３の混合物の前記ろ過は、ポリアミド薄膜複合フィルターを含む、請求項３６、４５及び４６のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記第３混合物の前記ろ過は、約５０Ｄａから約５ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを含む、請求項３６及び４５～４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 前記除去することは、
    前記第４の混合物をろ過し、その濃度及びｐＨを調節することをさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記第４の混合物をポリビニリデンフィルター、ポリエチレンフィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリテトラフルオロエチレンフィルター、セルロースエステルフィルター、またはポリエーテルスルホンフィルターに通してろ過することを含む、請求項５０に記載の方法。
52. 前記第４の混合物の前記ろ過は、約０．１μｍから約１μｍのサイズを有するフィルターを使用することを含む、請求項５０または５１に記載の方法。
53. 前記第４の混合物の前記濃度は、約１０００ｍＭから約２５ｍＭに調節される、請求項５０に記載の方法。
54. 前記第４の混合物の前記濃度は、約１００ｍＭに調節される、請求項５０に記載の方法。
55. 前記第４の混合物の前記濃度は、約５０ｍＭに調節される、請求項５０に記載の方法。
56. 前記第４の混合物の前記濃度は、塩基性溶液で調節される、請求項５０及び５３～５５のいずれか１項に記載の方法。
57. 前記第４の混合物の前記濃度を調節するために使用される前記塩基性溶液は、ＮＨ_４ＯＨ及び水を含む、請求項５６に記載の方法。
58. 前記第４の混合物の前記濃度を調節するために使用される前記塩基性溶液は、水中の約３．５％ｗ／ｖから４．５％ｗ／ｖのＮＨ_４ＯＨを含む、請求項５６に記載の方法。
59. 前記第４の混合物の前記ｐＨは、約５．３から約７．３に調節される、請求項５０及び５３～５８のいずれか１項に記載の方法。

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