JP2024508823A - 治療目的のための新規のウイルス粒子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、Sセグメントが、LCMV株WEに由来する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、LCMV株クローン13に由来するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、ウイルス粒子に関する。本発明はまた、関連する宿主細胞、そのようなウイルス粒子を製造する方法、そのようなウイルス粒子を含む薬学的組成物、およびそのようなウイルス粒子の医学的使用に関する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2021年2月26日に出願された欧州特許出願EP 21159746.3の優先権の恩典を主張し、この内容は全ての目的について参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本出願は、2021年2月26日に出願された欧州特許出願EP 21159746.3の優先権の恩典を主張し、この内容は全ての目的について参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、Sセグメントが、LCMV株WEに由来する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、LCMV株クローン13に由来するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、ウイルス粒子に関する。本発明はまた、関連する宿主細胞、そのようなウイルス粒子を製造する方法、そのようなウイルス粒子を含む薬学的組成物、およびそのようなウイルス粒子の医学的使用に関する。
本発明は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、Sセグメントが、LCMV株WEに由来する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、LCMV株クローン13に由来するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、ウイルス粒子に関する。本発明はまた、関連する宿主細胞、そのようなウイルス粒子を製造する方法、そのようなウイルス粒子を含む薬学的組成物、およびそのようなウイルス粒子の医学的使用に関する。
背景
LCMVはマンマレナウイルス属に属し、マウスおよび他の齧歯動物から遍在的に単離することができる(Radoshitzky et al. (2020) in D. M. Knipe and P. M. Howley (eds.), Fields Virology（非特許文献1）)。子宮内感染は、ウイルス量が非常に高い可能性があるが、臨床症状はなく、子孫の持続性感染をもたらす(Radoshitzky et al. (2020) in D. M. Knipe and P. M. Howley (eds.), Fields Virology（非特許文献1）)。生ウイルスは尿、唾液、鼻汁および糞を介して感染動物から生涯にわたって排出され、曝露されたナイーブな齧歯動物の症候性感染を引き起こす。
LCMVはマンマレナウイルス属に属し、マウスおよび他の齧歯動物から遍在的に単離することができる(Radoshitzky et al. (2020) in D. M. Knipe and P. M. Howley (eds.), Fields Virology（非特許文献1）)。子宮内感染は、ウイルス量が非常に高い可能性があるが、臨床症状はなく、子孫の持続性感染をもたらす(Radoshitzky et al. (2020) in D. M. Knipe and P. M. Howley (eds.), Fields Virology（非特許文献1）)。生ウイルスは尿、唾液、鼻汁および糞を介して感染動物から生涯にわたって排出され、曝露されたナイーブな齧歯動物の症候性感染を引き起こす。
ヒトは、感染した齧歯動物もしくは感染した齧歯動物からの分泌物との密接な接触によって、固形臓器移植によって、または垂直経胎盤伝播によって、LCMVに感染する。固形臓器移植以外のヒトからヒトへの水平伝播は報告されていない。免疫系が損なわれていない人における出生後の感染は、しばしば無症候性であるか、または微熱性疾患を引き起こす。軽度で可逆的な神経学的症状はめったに観察されない。妊娠中の感染は、流産、重度のCNS、または眼球奇形のリスクを高める。神経学的後遺症としては、痙性四肢不全麻痺、精神遅滞、痙攣、および視力障害が挙げられる。免疫抑制臓器レシピエントでは、LCMV感染は致命的となる可能性があるが、これまでに20症例未満が報告されている。
LCMV株は4つの異なる系列に分けられており、最も一般的に使用される実験室株アームストロングおよびWEを系列Iにグループ化する(Radoshitzky et al. (2020) in D. M. Knipe and P. M. Howley (eds.), Fields Virology（非特許文献1）)。これらの実験室株は健康なヒトについて低病原性能を有するが、感受性動物において実質的な疾患および死を引き起こし得る。2つの株およびそれらに由来する派生株によって感受性動物において引き起こされる臨床症状に沿って、内臓向性として分類されるWE株とは対照的に、アームストロング株は神経向性として分類される。
LCMVゲノムは、S(スモール)およびL(ラージ)と名付けられた2つのマイナス鎖RNAセグメントからなる。Sセグメントは表面糖タンパク質(GP)およびヌクレオカプシドタンパク質(NP)をコードし、一方、Lセグメントはウイルスポリメラーゼ(LP)およびZタンパク質をコードする(Radoshitzky et al. (2020) in D. M. Knipe and P. M. Howley (eds.), Fields Virology（非特許文献1）)。
あるLCMV WE株派生株が固形腫瘍処置のための有効な作用物質として記載された(WO 2016/166285 A1（特許文献1）、WO 2020/053324 A1（特許文献2）)。しかし、LCMV株WEはデフォルトでバイオセーフティレベル(BSL)3分類を有し、BSL 3条件下でのそのような株の製造および適用は事実上不可能であるため、そのような製品の使用ができない。
したがって、LCMV株WEと比較して同等のまたはさらに改善された抗腫瘍特性を有しながら、より高いレベルの弱毒化を有するウイルスを提供するという、満たされていない必要性がある。したがって、治療に有用な追加のおよび／または改善されたウイルスを提供することが本発明の目的である。
Radoshitzky et al. (2020) in D. M. Knipe and P. M. Howley (eds.), Fields Virology
本発明は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、糖タンパク質が、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、ウイルス粒子に関する。
本発明はまた、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、Lタンパク質が、SEQ ID NO:40の線形ポリペプチド配列に対応する1079位にLys以外のアミノ酸残基を含む、ウイルス粒子に関する。
本発明はまた、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6と少なくとも97%の配列同一性を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:38と少なくとも90%の配列同一性を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、ウイルス粒子に関する。
本発明はまた、本発明のウイルス粒子中に含まれるようなLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含む宿主細胞に関する。
本発明はまた、(a)本発明のウイルス粒子中に含まれるような、糖タンパク質をコードするORF、Lタンパク質をコードするORF、核タンパク質をコードするORF、およびZタンパク質をコードするORF；ならびに／または(b)本発明のウイルス粒子中に含まれるようなLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメント、のcDNAを含む宿主細胞に関する。
本発明はまた、ウイルス粒子形成に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を含む、本発明のウイルス粒子を製造する方法に関する。
本発明はまた、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子を含む薬学的組成物であって、Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、薬学的組成物に関する。
本発明はまた、療法における、特にがんの処置における使用のための、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、ウイルス粒子に関する。
詳細な説明
本出願の発明者らは、WE株の病原性は、Lセグメント上に位置する要素によって一貫して決定され得、一方、WEおよび他のLCMV株のSセグメントは病原性に寄与していないと考える。そのため、WE株のLセグメントを、アームストロング株、クローン13株、およびそれらの派生株などの別のLCMV株の対応するセグメントによって置き換えることは、NHPおよび他の感受性動物における肝病原性を含む元の病原性プロファイルをもはや示さない再集合された実験室株をもたらすと考えられる。
本出願の発明者らは、WE株の病原性は、Lセグメント上に位置する要素によって一貫して決定され得、一方、WEおよび他のLCMV株のSセグメントは病原性に寄与していないと考える。そのため、WE株のLセグメントを、アームストロング株、クローン13株、およびそれらの派生株などの別のLCMV株の対応するセグメントによって置き換えることは、NHPおよび他の感受性動物における肝病原性を含む元の病原性プロファイルをもはや示さない再集合された実験室株をもたらすと考えられる。
本出願の発明者らは、次いで、驚くべきことに、病原性に寄与しないと考えられるLCMV WE株またはその派生株のSセグメントの要素と、病原性に寄与しないと考えられる株クローン13もしくはアームストロングまたはその派生株のLセグメントの要素とを含むウイルス株は、特に腫瘍処置において、LCMV WE株と比較して改善された特性を有することを見出した。そのようなウイルス株は、NHP、齧歯動物またはモルモットにおいて肝疾患を含むLCMV特異的疾患を誘発することがもはやできないと考えられる(Riviere et al. (1985) Journal of virology, 55: 704-09; Riviere et al. (1986) Med Microbiol Immunol, 175: 191-2; Baccala et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA, 111: 8925-30; Oldstone et al. (2018) Proceedings of the National Academy of Sciences, 115: E7814)。
ナイーブで感受性の齧歯動物を用いて本出願の発明者らによって行われた研究は、本発明に従う再集合ウイルスが、肝病原性を含むLCMV WE株と比較して減少した病原特性を有し得ることを実際に実証する(実施例16、17、18、19、および35)。これらの結果は、本発明のウイルス粒子は、肝病因および神経向性を含む野生型LCMV株について記載される病原特性が低下しているため、製造および臨床試験中に安全に取り扱うことができるウイルスベースの製品をもたらし得ることを確認する(実施例10、21、24)。
異なる起源の細胞におけるその著しく低下した複製能(最大＞100倍)の下で(実施例8および9)、本発明のウイルス粒子は、ナイーブ動物においてインビボ病原性サイトカインを誘導する大幅に低下した可能性を示し得、同時に、誘導される臓器病原性のいかなる徴候も欠如し得る(実施例12～17)。特に、WE株由来Sセグメント要素およびクローン13株由来Lセグメント要素を含むウイルス粒子のみが、実施例8において減弱された複製を示し、しかし、クローン13株由来Sセグメント要素およびWE株由来Lセグメント要素を含むウイルス粒子は示さず、これは、WEおよびクローン13株の病原性がそれぞれそのLまたはSセグメントによって決定されるという仮説を支持する。
ウイルス誘発性病態の素因を示すFVBマウス系統(Schnell et al. (2012) PLoS Pathog, 8: e1003073)は、LCMVに感染すると血小板減少症および肝細胞壊死を含む出血熱様疾患に屈する。重要なことに、FVBマウスにおける疾患は、マカクザルにおけるLCMV疾患およびアルゼンチン出血熱の臨床徴候を模倣する(Schnell et al. (2012) PLoS Pathog, 8: e1003073)。しかしながら、LCMV株WE、クローン13、およびアームストロングとは対照的に、本発明のウイルス粒子による感染は、実施例14～17において、動物の体重の減少も肝臓病態または出血熱様疾患のいかなる他の徴候ももたらさなかった。
臨床開発のための本発明のウイルス粒子の重要かつ驚くべき特徴は、WE株について記載されているように、それらが弱毒化されているにもかかわらず、それらが強力な抗腫瘍効果を保持または増強さえしていることである(Kalkavan et al. (2017) Nat Commun, 8: 14447)。本発明のウイルス粒子は、その腫瘍向性を増大させるためにさらなる改変を備えていてもよい(実施例21～23)。そのような改変は、GPの181および/または185位での変異、特にArg 185→Trpおよび/またはIle 181→Metを含み得る。実際、そのようなウイルス粒子は、マウス腫瘍モデルにおいて強い抗腫瘍効果を示し得るが(実施例25)、それが由来するWE-クローン13株の弱毒化表現型を有し得る(実施例34および38)。LCMVの病原性は、主に免疫系の抗ウイルス機能によって指示され、感染臓器におけるウイルス複製の強度と相関すると報告された(Lang et al. (2010) Cell Physiol Biochem, 26: 263-72)。このような改変されたウイルス粒子は、WE株と比較して、より強い初期LCMV指向性T細胞応答、主な抗ウイルス免疫エフェクター機構をもたらし得、その臓器分布は既に感染初期に制御されている(実施例35)。
以前の刊行物において、LCMVは、過度のかつ調節解除された自然(Th1および炎症性サイトカイン)および適応(CD8 T細胞)免疫応答に起因して臓器損傷(例えば、肝臓)を誘導することができると記載された(Lang et al. (2010) Cell Physiol Biochem, 26: 263-72; Schnell et al. (2012) PLoS Pathog, 8: e1003073; Oldstone et al. (2018) Proceedings of the National Academy of Sciences, 115: E7814)。本出願の発明者らは、驚くべきことに、野生型LCMV株であるアームストロング、クローン13およびWEと同様のサイトカイン応答パターンが観察されたが、本発明のウイルス粒子についての免疫応答の強度は実質的により低い可能性があることを見出した。この観察は、感染初期の高いサイトカインレベルがそれぞれの動物モデルにおける臓器損傷と関連していたIFN-αにとって特に重要である(Schnell et al. (2012) PLoS Pathog, 8: e1003073)。本発明のウイルス粒子は、対照的に、特に感染初期に実質的により低いIFN-αおよびIFN-γレベルを誘導し得(実施例12および13)、これはIFN媒介有害効果についての著しく低い可能性を強く指摘している(Baccala et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA, 111: 8925-30)。加えて、炎症性サイトカインIL-6およびTNF-α、ならびにIL-10もまた、感染時の異なる時点(1日目および3日目)で実質的に減少し得、これはウイルス制御の増強を示す(Lang et al. (2010) Cell Physiol Biochem, 26: 263-72; Schnell et al. (2012) PLoS Pathog, 8: e1003073)。
全体として、本発明のウイルス粒子は、それらの抗腫瘍効力を保持しまたは増強さえするが、大幅に弱毒化された表現型を示し得、さらにより強力なインビボ弱毒化免疫表現型を示し得る。
したがって、本発明は、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子に関する。Sセグメントは、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、Lセグメントは、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
Sセグメントはまた、核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み得る。核タンパク質は、SEQ ID NO:6と少なくとも97%の配列同一性を有し得る。
Lセグメントはまた、Lセグメントを含み得る。Lセグメントは、SEQ ID NO:38と少なくとも90%の配列同一性を有する、Zタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくはアレナウイルス粒子、より好ましくはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)粒子である。
野生型アレナウイルスゲノムセグメントおよびORFは、当技術分野において公知である。特に、アレナウイルスゲノムはSセグメントおよびLセグメントからなる。Sセグメントは、GPおよびNPをコードするORFを運ぶ。Lセグメントは、Lタンパク質およびZタンパク質をコードする。両方のセグメントには、それぞれの5’および3’UTRが隣接している。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは、野生型アレナウイルスのゲノムセグメントに対応するゲノムセグメントを含む。これは、SセグメントがGPおよびNPをコードするORFを運び、LセグメントがLタンパク質およびZタンパク質をコードすることを意味する。Sセグメントでは、糖タンパク質をコードするORFは5’非翻訳領域(UTR)の制御下にあり、核タンパク質は3’UTRの制御下にある。Lセグメントでは、Lタンパク質をコードするORFは3’UTRの制御下にあり、Zタンパク質をコードするORFは5’UTRの制御下にある。したがって、本開示のウイルス粒子の遺伝子は、好ましくはそれらの天然位置に位置する。したがって、本発明のウイルス粒子は、好ましくは二分節ゲノムを有する。本発明のウイルス粒子のゲノムは、好ましくは、本明細書に記載されるような1つのLセグメントおよび1つのSセグメントからなる。LCMV Sセグメントの例示的な例は、SEQ ID NO:1、11、21、および31に示される。LCMV Lセグメントの例示的な例は、SEQ ID NO:2、12、22、および32に示される。
LCMVのいくつかの株は本開示の一部である。本明細書で使用される場合、LCMV「WE」、「株WE」、「WE株」などは、SEQ ID NO:1および2に示されるようなゲノムセグメントを有するLCMVを指す。本明細書で使用される場合、LCMV「P52」、「P52-WE」、「株P52」、「P52株」などは、SEQ ID NO:11および12に示されるようなゲノムセグメントを有する、WE株の変異株/派生株を指す。本明細書で使用される場合、LCMV「アームストロング」、「株アームストロング」、「アームストロング株」などは、SEQ ID NO:21および22に示されるようなゲノムセグメントを有する、LCMV株アームストロング53bを指す。本明細書で使用される場合、LCMV「クローン13」、「Cl13、「株クローン13」、「クローン13株」などは、SEQ ID NO:31および32に示されるようなゲノムセグメントを有するLCMVを指す。
用語「糖タンパク質」、「GP」、および「Gタンパク質」は、互換的に使用され、受容体結合および膜融合を媒介すると考えられるLCMV由来糖タンパク質を指す。糖タンパク質の例示的な例は、SEQ ID NO:4、14、24、および34に示される。糖タンパク質をコードする遺伝子の例示的な例は、SEQ ID NO:3、13、23、および33に示される。
用語「Lタンパク質」、および「LP」は、互換的に使用され、LCMV由来RNAポリメラーゼLを指す。Lタンパク質の例示的な例は、SEQ ID NO:10、20、30、および40に示される。Lタンパク質をコードする遺伝子の例示的な例は、SEQ ID NO:9、19、29、および39に示される。
用語「核タンパク質」、「Nタンパク質」、および「NP」は、互換的に使用され、LCMV由来核タンパク質を指す。核タンパク質の例示的な例は、SEQ ID NO:6、16、26、および36に示される。核タンパク質をコードする遺伝子の例示的な例は、SEQ ID NO:5、15、25、および35に示される。
用語「Zタンパク質」または「ZP」は、互換的に使用され、LCMV由来スモールRINGフィンガータンパク質Zを指す。Zタンパク質の例示的な例は、SEQ ID NO:8、18、28、および38に示される。Zタンパク質をコードする遺伝子の例示的な例は、SEQ ID NO:7、17、27、および37に示される。
本発明のウイルス粒子は糖タンパク質を含み、ここで、糖タンパク質は、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含み得る。例えば、糖タンパク質は、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して181および/または185位に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含み得る。しかし、糖タンパク質がSEQ ID NO:4と比較して両方の位置に変異を含むことが好ましい。これらの位置における好ましい変異は、Arg 185→TrpおよびIle 181→Metより選択される。したがって、ウイルス粒子は、いずれか一方または好ましくは両方の変異を有することができる。
理論に束縛されることを望むものではないが、糖タンパク質における1つまたは2つの上述の変異の存在は、他の変異、特にLCMVの他の遺伝子またはタンパク質における他の変異の存在とは無関係に、LCMVの機能(例えば、抗腫瘍活性)を改善することができると考えられる。
本発明のウイルス粒子はLタンパク質を含み、ここで、Lタンパク質は、SEQ ID NO:40の線形ポリペプチド配列に対応する1079位にLys以外のアミノ酸残基を含み得る。この位置でのアミノ酸残基は、好ましくは非塩基性アミノ酸残基、より好ましくは中性親水性アミノ酸残基、さらにより好ましくはAsnまたはGln、最も好ましくはGlnである。
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、修飾、合成、または希少アミノ酸が所望に応じて使用され得るが、典型的には、アラニン(AlaまたはA)；アルギニン(ArgまたはR)；アスパラギン(AsnまたはN)；アスパラギン酸(AspまたはD)；システイン(CysまたはC)；グルタミン(GlnまたはQ);グルタミン酸(GluまたはE)；グリシン(GlyまたはG)；ヒスチジン(HisまたはH)；イソロイシン(IleまたはI)；ロイシン(LeuまたはL)；リジン(LysまたはK)；メチオニン(MetまたはM)；フェニルアラニン(PheまたはF)；プロリン(ProまたはP)；セリン(SerまたはS)；スレオニン(ThrまたはT)；トリプトファン(TrpまたはW)；チロシン(TyrまたはY)；およびバリン(ValまたはV)からなる群より選択されるアミノ酸などの、その技術分野で認識される定義を有するアミノ酸を指す。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：(1)疎水性：メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；(2)中性親水性：システイン、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン；(3)酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；(4)塩基性：ヒスチジン、リジン、アルギニン；(5)鎖配向に影響を与える残基：グリシン、プロリン；および(6)芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。いくつかの態様において、置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴い得る。
本発明のウイルス粒子はSセグメントおよびLセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、好ましくは、LCMV株WEまたはその変異株に由来し、かつここで、Lセグメントは、好ましくは、LCMV株クローン13またはその変異株に由来する。
Lセグメントの変異体は、元のLセグメントの配列と少なくとも約83%、好ましくは少なくとも約84%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有し得る。
本明細書に開示されるウイルス粒子は、SEQ ID NO:21または31に記載の配列と少なくとも約83%、好ましくは少なくとも約84%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有するかもしくは好ましくは同一である配列を含むかまたは好ましくはその配列からなるLセグメントを有し得る。
Sセグメントの変異体は、元のSセグメントの配列と少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有し得る。
本明細書に開示されるウイルス粒子は、SEQ ID NO:1または11に記載の配列と少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有するかもしくは好ましくは同一である配列を含むかまたは好ましくはその配列からなるSセグメントを有し得る。
LCMVを含む本発明のウイルス粒子は、好ましくは、SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6と少なくとも97%の配列同一性を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:38と少なくとも90%の配列同一性を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
本明細書に開示される糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:4または14に記載の配列と少なくとも約98%、好ましくは少なくとも約98.5%、好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列をコードし得る。
本明細書に開示される糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:3または13に記載の配列と少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列を含み得る。
本明細書に開示されるLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:30または40に記載の配列と少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列をコードし得る。
本明細書に開示されるLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:29または39に記載の配列と、少なくとも約83%、好ましくは少なくとも約84%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有し得るか、または好ましくは同一である。
本明細書に開示される核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:6または16のいずれかに記載の配列と少なくとも約98%、好ましくは少なくとも約98.5%、好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列をコードし得る。
本明細書に開示される核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:5または15に記載の配列と、少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有し得るか、または好ましくは同一である。
本明細書に開示されるZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:28または38に記載の配列と少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列をコードし得る。
本明細書に開示されるZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、SEQ ID NO:27または37に記載の配列と、少なくとも約84%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有し得るか、または同一である。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4または14（SEQ ID NO:14が好ましい）と少なくとも98.5%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6または16（SEQ ID NO:16が好ましい）と少なくとも98.5%の配列同一性を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:30または40（SEQ ID NO:40が好ましい）と少なくとも95%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:28または38（SEQ ID NO:38が好ましい）と少なくとも95%の配列同一性を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4または14（SEQ ID NO:14が好ましい）と少なくとも98%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6または16（SEQ ID NO:16が好ましい）と少なくとも98%の配列同一性を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:30または40（SEQ ID NO:40が好ましい）と少なくとも98%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:28または38（SEQ ID NO:38が好ましい）と少なくとも98%の配列同一性を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4または14（SEQ ID NO:14が好ましい）と少なくとも99%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6または16（SEQ ID NO:16が好ましい）と少なくとも99%の配列同一性を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:30または40（SEQ ID NO:40が好ましい）と少なくとも99%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:28または38（SEQ ID NO:38が好ましい）と少なくとも99%の配列同一性を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4または14（SEQ ID NO:14が好ましい）に記載の配列を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6または16（SEQ ID NO:16が好ましい）に記載の配列を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:30または40（SEQ ID NO:40が好ましい）に記載の配列を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:28または38（SEQ ID NO:38が好ましい）に記載の配列を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4に記載の配列を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6に記載の配列を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:40に記載の配列を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:38に記載の配列を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:14に記載の配列を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:16に記載の配列を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:40に記載の配列を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:38に記載の配列を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4に記載の配列を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6に記載の配列を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:30に記載の配列を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:28に記載の配列を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
好ましいウイルス粒子はLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:14に記載の配列を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:16に記載の配列を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:30に記載の配列を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:28に記載の配列を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
本開示のウイルス粒子は、好ましくは、異種ORFを含まない。本文脈における「異種ORF」は、LCMV以外の生物由来のORFおよび／または人工もしくは合成タンパク質をコードするORFを指す。
「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、広くDNAまたはRNAを指し得る。DNAとRNAは、とりわけそれらの核酸塩基に違いがある。DNAではアデニンの相補塩基はチミンであるが、RNAではウラシルである。簡略化のため、本明細書全体で、アデニンに対応する塩基を「t」とし、これは文脈に応じてチミン（DNAの場合）またはウラシル（RNAの場合）を指すことができる。
「をコードしている」または「をコードする」という用語は、本明細書で核酸の文脈で使用される場合、その核酸にコードされる特定のアミノ酸配列へと翻訳され得る配列を有する核酸に関する。核酸配列は、コード鎖の配列を包含し得、かつコード鎖に対して相補的な鎖の配列も包含し得る。
本明細書に開示される配列に関する「配列同一性パーセント(％)」は、最大の配列同一性パーセントが取得できるように必要に応じて配列を揃えたりギャップを導入したりした後の、かつ保存的置換を配列同一性の一部とはみなさない、候補配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドが、参照配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドと対として同一であるパーセンテージ、と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野におけるあらゆる方法、たとえばBLAST、ALIGN、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの一般公開されているコンピューターソフトウェアを用いて、実現することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたり最大限のアラインメントを実現するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、アラインメント測定用の適切なパラメーターを決定することができる。このことは、本明細書に開示されるヌクレオチド配列にも当てはまる。配列同一性の決定にあたり、ウラシル（たとえばRNAの場合）は、チミン（たとえばDNAの場合）と同じと考えてよい。
用語「弱毒化」は、本明細書で使用される場合、所与の宿主(細胞)内で複製するウイルスの能力の低下、健康な臓器における複製能の低下、および／またはサイトカインを誘導する能力の低下に関する。本発明のウイルス粒子は、好ましくは弱毒化されている。
用語「感染性の」は、本明細書で使用される場合、所与の宿主細胞に感染する、すなわち、侵入するウイルスの能力に関する。本発明のウイルス粒子は好ましくは感染性である。
用語「複製コンピテント」は、ウイルスが、感染細胞においてその遺伝物質を増幅および発現する能力を有し、かつ、遺伝子操作されていない正常細胞においてさらなる子孫を産生することができることを意味する。特に、複製コンピテントウイルスは、複製可能であるためにウイルス遺伝子を発現するように操作された宿主細胞を必要としない。本発明のウイルス粒子は、好ましくは複製コンピテントである。
用語「病原性の」は、本明細書で使用される場合、疾患を引き起こす、すなわち、生物に害を及ぼすウイルスの能力を指す。
本発明のウイルス粒子は、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、少なくとも同程度のまたはさらにより大幅な、腫瘍の成長の減少を促進することができ得る。特に、ウイルス粒子は、好ましくは実施例1に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、コールド腫瘍の成長のより大幅な減少を促進することができ得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例3に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、少なくとも同程度に強いまたはさらにより強い、適応免疫活性化を誘導することができ得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例4に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、少なくとも同程度の、ウォーム腫瘍の成長の減少を促進することができ得る。
本明細書で使用される場合、「ホット」または「ウォーム」腫瘍は、互換的に使用され、T細胞炎症性表現型を有する腫瘍に関する。そのような腫瘍は炎症の徴候を示し、これは、腫瘍が、がん細胞と戦うために既にT細胞によって浸潤されていることを意味する。典型的にホット腫瘍であるがんの例には、黒色腫、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、および非小細胞肺がんが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「コールド腫瘍」は、低いT細胞浸潤を有するか、またはT細胞で浸潤されていない、非T細胞炎症性表現型を有する腫瘍に関する。T細胞が不足しているため、そのような腫瘍において免疫療法薬で免疫応答を誘発することは困難である。典型的にはコールド腫瘍であるがんの例には、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、および膠芽腫が挙げられる。ホット腫瘍とコールド腫瘍の差異は、Gajewski et al. (2017) Adv Exp Med Biol. 1036:19-31およびMaleki Vareki (2018) Journal for ImmunoTherapy of Cancer 6:157に詳細に記載されている。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例12に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WE、アームストロング、クローン13、ならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、(好ましくは全身)投与時に、減少したレベルのインターフェロンを誘導することができ得る。インターフェロンは、好ましくは、IFN-αおよびIFN-βからなる群より選択される。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例13に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WE、アームストロング、クローン13、ならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、より低い濃度の1つまたは複数のTh1および炎症性のサイトカインを誘導することができ得る。サイトカインは、好ましくは、IL-6、IL-10、TNFα、およびIFNγからなる群より選択される。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例13に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WE、アームストロング、クローン13、ならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、より低い濃度の1つまたは複数のTh1および炎症性のサイトカインを誘導することができ得る。サイトカインは、好ましくは、IL-6、IL-10、TNFα、およびIFNγからなる群より選択される。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例14に本質的に記載されるようなアッセイにおいてFVB/Nマウスにおいて測定されるように、LCMV株WEと比較して、マウスにおける病原性がより低くあり得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例18に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、マウスにおける低下した程度の肝臓病態を誘導することができ得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例15に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、マウスにおける低下した程度の血小板減少症を誘導することができ得るか、またはマウス（例えばFVB/Nマウス）における検出限界以下の血小板減少症を誘導することができ得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例24に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、健康な細胞（例えばニューロン細胞）における低下した複製を示し得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例24に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEと比較して、腫瘍細胞における増加した複製を示し得る。
本発明のウイルス粒子は、好ましくは実施例35に本質的に記載されるようなアッセイにおいて測定されるように、LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、健康な臓器における低下した複製を示し得る。
本発明はまた、本発明のウイルス粒子について記載されるようなLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含む宿主細胞に関する。
本発明はまた、本発明のウイルス粒子について記載されるような糖タンパク質をコードするORF、本発明のウイルス粒子について記載されるようなLタンパク質をコードするORF、本発明のウイルス粒子について記載されるような核タンパク質をコードするORF、および本発明のウイルス粒子について記載されるようなZタンパク質をコードするORFのcDNAを含む宿主細胞に関する。
本発明はまた、本発明のウイルス粒子について記載されるようなLCMV SセグメントおよびLCMV LセグメントのcDNAを含む宿主細胞に関する。
cDNAの生成のための技術は、分子生物学ならびにDNA操作および生成の日常的かつ従来の技術である。当業者に公知の任意のクローニング技術を使用することができる。このような技術は周知であり、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)などの実験室マニュアルにおいて当業者に利用可能である。
本明細書に記載されるcDNAはプラスミドに組み込むことができる。本明細書に記載されるcDNAは、DNA発現ベクターの一部であり得るか、またはDNA発現ベクターに組み込まれ得、任意で宿主細胞に導入され得る。本明細書に記載されるcDNAまたはcDNAを含むプラスミドもしくはベクターは、好ましくはプロモーターを含む。プロモーターの具体例としては、RNAポリメラーゼIプロモーター、RNAポリメラーゼIIプロモーター、RNAポリメラーゼIIIプロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーターまたはT3プロモーターが挙げられる。
宿主細胞は、ウイルス粒子のクローニング、発現、増殖、または産生に適した任意の宿主細胞であり得る。宿主細胞は、大腸菌（Escherichia coli）(E.coli)または枯草菌（Bacillus subtilis）などの原核生物、または出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、SF9またはHigh5昆虫細胞などの真核生物、不死化哺乳動物細胞株(例えば、HEK細胞、BHK細胞、HeLa細胞またはCHO細胞)、または初代哺乳動物細胞であり得る。好ましい宿主細胞としては、HEK細胞、特にHEK293細胞、例えばHEK293T (CVCL_0063)またはFreeStyle 293-F (CVCL_D603)が挙げられる。FreeStyle 293-F細胞は、例えば、Thermo Fisher Scientific Inc. (カタログ番号12338026)から市販されている。好ましい宿主細胞としては、BHK-21細胞(CVCL_1914)などのBHK細胞も挙げられる。好ましい宿主細胞としては、WHO Vero RCB 10-87細胞(ATCC CCL 81)も挙げられる。
本発明はまた、本発明のウイルス粒子を製造する方法に関する。方法は、ウイルス粒子形成に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程を含む。
ウイルス粒子を製造する方法は、本明細書に記載されるcDNAを宿主細胞中へ導入する工程をさらに含み得る。ウイルス粒子を製造する方法はまた、ウイルス粒子の回収および／または精製を含み得る。そのような回収および／または精製方法は、当業者に周知である。
本発明はまた、本明細書に開示されるウイルス粒子を含む薬学的組成物に関する。ウイルス粒子は、好ましくは、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含み得る。担体は、水、生理食塩水、緩衝水溶液、細胞培養培地、および前述の担体のうちの少なくとも2つの組み合わせからなる群より選択され得る。
本発明はまた、療法における使用のための本明細書に開示されるウイルス粒子に関する。ウイルス粒子は、好ましくは、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。本明細書に開示されるウイルス粒子は、がんまたは腫瘍の処置における使用のためのものであり得る。
本発明はまた、医薬の製造のための開示されるウイルス粒子の使用に関する。ウイルス粒子は、好ましくは、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。医薬は、好ましくは、がんまたは腫瘍の処置のためのものである。
本発明はまた、本明細書に開示されるウイルス粒子を対象へ投与する工程を含む疾患を処置する方法に関する。対象は、好ましくは、その必要があるものである。ウイルス粒子は、好ましくは、有効量で投与される。ウイルス粒子は、好ましくは、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含み、ここで、Sセグメントは、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつここで、Lセグメントは、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。疾患は、好ましくは、がんまたは腫瘍である。
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。用語「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指すために本明細書において使用され、ほんのいくつかの例示的な例を挙げると、非限定的に、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物、例えば、マウス、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、ブタ、カニクイザルなどのサルなどが含まれる。好ましくは、本明細書における哺乳動物はヒトである。がんまたは腫瘍は、ヒトまたはマウスのがんまたは腫瘍であり得、ヒトのがんまたは腫瘍が好ましい。
「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1つまたは複数の投与で投与することができる。
がんまたは腫瘍は、本明細書に開示される任意のがんまたは腫瘍であり得る。一般に、がんまたは腫瘍は、癌腫、黒色腫、芽腫、リンパ腫および肉腫からなる群より選択され得る。
本開示の文脈における用語「癌腫」は、上皮起源の悪性新生物を意味すると理解されるべきである。癌腫は、好ましくは、肛門がん、気管支がん、肺がん、子宮内膜がん、胆嚢がん、膀胱がん、肝細胞がん、精巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、喉頭がん、食道がん、胃がん、乳がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん、中咽頭がん、前立腺がん、甲状腺がんおよび子宮頸がんからなる群より選択される。
本開示の文脈における用語「肉腫」は、中胚葉起源の悪性新生物を意味すると理解されるべきである。肉腫は、血管肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維性組織球腫、神経原性肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫からなる群より選択され得る。
本開示の文脈における用語「黒色腫」は、メラニン細胞起源の悪性新生物を意味すると理解されるべきである。
本開示の文脈における用語「リンパ腫」は、リンパ球起源の悪性新生物を意味すると理解されるべきである。
本開示の文脈における用語「芽腫」は、胚起源の悪性新生物を意味すると理解されるべきである。
処置されるがんまたは腫瘍はコールド腫瘍であり得る。好ましいコールド腫瘍としては、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、および膠芽腫が挙げられる。
処置されるがんまたは腫瘍はホット腫瘍であり得る。好ましいホット腫瘍としては、黒色腫、膀胱がん、腎臓がん、頭頸部がん、および非小細胞肺がんが挙げられる。
処置される好ましいがんまたは腫瘍としては、黒色腫、結腸がん、線維肉腫、膵臓がん、甲状腺がん、肺がん、腺がん、および消化管がんが挙げられる。
一般に、本明細書に開示されるウイルス粒子は、当業者に公知の任意の好適な経路を介して投与することができる。投与には、一般に、経腸投与および非経口投与が含まれる。非経口投与は、局所投与、例えば筋肉内、腹腔内、皮下、または腫瘍内投与を含むことができる。あるいは、非経口投与は、全身投与、特に、注射または注入によるなど、静脈内投与を含むことができる。
特に明示しない限り、一連の要素の前の「少なくとも」という用語は、その一連の要素の一つひとつを指すものと理解される。当業者であれば、ルーチンの実験を行うだけで、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの等価物を認識するか、確認することができよう。そのような等価物も本発明に包含されるものとする。
「および／または」という用語は、本明細書で用いる場合はいずれも、「および」、「または」、および「その用語が接続する要素のすべてのまたは任意のその他の組み合わせ」という意味を含む。
「約」または「およそ」という用語は、本明細書で使用される場合、所与の値または範囲の20％以内、好ましくは10％以内、より好ましくは5％以内を意味する。しかし具体的な数も含み、たとえば、約20は20も含む。
本明細書および特許請求の範囲の全体で、特に文脈が否定しない限り、単語「含む（comprise）」ならびに「含む（comprises）」および「含むこと（comprising）」などの変化形は、記述されている整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の包含を意味するが、その他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の排除を意味するものではない、と理解される。本明細書で使用する場合、「含むこと（comprising）」という用語は、「含有すること（containing）」もしくは「包含すること（including）」という用語と、または時には本明細書で使用する場合「有すること（having）」という用語と置き換えることができる。
本明細書で使用する場合、「からなる（consisting of）」は、請求項の要素に明記されていない要素、工程、または成分を排除する。本明細書で使用する場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、請求項の基本的および新規の特徴に大きな影響のない材料または工程を排除しない。
本明細書の各例では、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語はどれでも、ほかの2つの用語のどちらと差し替えてもよい。たとえば、「含む」という用語は「から本質的になる」および「からなる」の明示的な支持も提供するものであり、「から本質的になる」という用語は、「含む」および「からなる」の明示的な支持も提供するものであり、「からなる」という用語は「から本質的になる」および「含む」の明示的な支持も提供するものである。
マウス
抗腫瘍効果の分析を、C57BL/6バックグラウンドの野生型動物を用いることによって行った。LCMV誘発効果のインビボ分析のために、野生型マウス系統C57BL/6、BALB/cまたはFVB/Nを用いた。C57BL/6およびBALB/c系統は、LCMVによって引き起こされる致死感染に耐性がある。FVB/Nマウスは、LCMV株クローン13に感染後に出血熱様疾患を発症する高感受性マウス系統を表す。LCMV処置後、体形（habitus）を観察し、体重を測定した。
抗腫瘍効果の分析を、C57BL/6バックグラウンドの野生型動物を用いることによって行った。LCMV誘発効果のインビボ分析のために、野生型マウス系統C57BL/6、BALB/cまたはFVB/Nを用いた。C57BL/6およびBALB/c系統は、LCMVによって引き起こされる致死感染に耐性がある。FVB/Nマウスは、LCMV株クローン13に感染後に出血熱様疾患を発症する高感受性マウス系統を表す。LCMV処置後、体形（habitus）を観察し、体重を測定した。
細胞株
MC57G (CVCL_4985)は、堅牢なLCMV複製を示すマウス線維肉腫細胞株である。Tramp-C2はマウス前立腺細胞株(CVCL_3615)である。B16 (CVCL_F936)およびB16-F10 (B16F10, CVCL_0159)はマウス黒色腫細胞株である。B16-Ovaは、抗原としてオボアルブミンを発現するそれぞれのB16細胞株を表す。MC-38 (MC38, CVCL_B288)はマウス結腸腺がん細胞株である。JAWSIIはマウスの自然に不死化した細胞株であり、これは、GM-CSFでの処理によって樹状様細胞に分化させることができる(CVCL_3727)。511950は、継代が20回未満である遺伝子操作されたマウス原発性膵臓がん細胞株である(Mazur et al. (2015) Nature medicine 21(10): 1163-1171)。骨髄由来樹状細胞(BMDC)はGM-CSFの存在下でマウス骨髄から分化された。
MC57G (CVCL_4985)は、堅牢なLCMV複製を示すマウス線維肉腫細胞株である。Tramp-C2はマウス前立腺細胞株(CVCL_3615)である。B16 (CVCL_F936)およびB16-F10 (B16F10, CVCL_0159)はマウス黒色腫細胞株である。B16-Ovaは、抗原としてオボアルブミンを発現するそれぞれのB16細胞株を表す。MC-38 (MC38, CVCL_B288)はマウス結腸腺がん細胞株である。JAWSIIはマウスの自然に不死化した細胞株であり、これは、GM-CSFでの処理によって樹状様細胞に分化させることができる(CVCL_3727)。511950は、継代が20回未満である遺伝子操作されたマウス原発性膵臓がん細胞株である(Mazur et al. (2015) Nature medicine 21(10): 1163-1171)。骨髄由来樹状細胞(BMDC)はGM-CSFの存在下でマウス骨髄から分化された。
C643 (CVCL_5969)はヒト未分化甲状腺がん細胞株である。NCI-H1975 (H1975, CVCL_1511)はヒト肺腺がん細胞株である。A549はヒト腺がん細胞株(CVCL_0023)である。FTC133はヒト甲状腺がん細胞株(CVCL_1219)である。GIST-T1は胸水に由来するヒト消化管腫瘍細胞株である(CVCL_4976)。Hek293T (CVCL_0063)は、堅牢なLCMV複製を示すヒト胚性腎細胞株である。FreeStyle 293-F (CVCL_D603)は、Freestyle培地で増殖させた、Hek293細胞の派生株である。FreeStyle 293-F細胞は、LCMV産生に望ましい産生細胞株である。
UKE-Ma-Mel-51 (Mamel51, CVCL_A186)およびUKE-Ma-Mel-86a (Ma-Mel-86a, CVCL_A221)は、Klinik fur Dermatologie, UK EssenのDr. Paschen教授により提供されたリンパ節転移に由来するヒト原発性黒色腫細胞株である。初代ヒトニューロンを、HHU DusseldorfのDr. Gopalakrishnan教授により親切に提供されたヒト神経前駆細胞(NPC)から分化させた。SkMM(ヒト骨格筋筋芽細胞、Lonza CC-2580)は、ヒト初代骨格筋芽細胞である。筋管を、SkGM-2、ウマ血清、グルタミン、ゲンタマイシンおよびデキサメタゾンの存在下でSkMMから分化させた。分化は、抗ミオシン4 AK (eBioscience, Clone MF-20)による染色によって検証した。
BHK-21細胞は、自然発生的不死化線維芽細胞ハムスター細胞株(CVCL_1914)を表す。
ウイルス
LCMV株WEをZinkernagel教授(Experimental Immunology, Zurich, Switzerland)の研究室から入手し、2008年以来、L929細胞またはBHK-21細胞において増殖させている。
LCMV株WEをZinkernagel教授(Experimental Immunology, Zurich, Switzerland)の研究室から入手し、2008年以来、L929細胞またはBHK-21細胞において増殖させている。
LCMV株クローン13およびアームストロング53bを、それぞれ、Queens UniversityのS. BastaおよびUniversity of ZurichのR. M. Zinkernagelから入手した。LCMV再集合体WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)、P52-WE(L)およびCl13-WE(L)を、記載されたようにプラスミドから完全に一過性トランスフェクションによってレスキューした(Flatz et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(12): 4663-4668)。ウイルスは、LCMV株WEまたはWE由来P52のSセグメントとLCMV株クローン13またはWEのLセグメントからなる。ウイルスをBHK-21またはFreestyle 293F細胞において増殖させた。
組換えウイルスの作製
LCMV組換えおよび再集合ウイルスを完全にプラスミドから作製した。BHK-21細胞に、LCMV Sセグメント、Lセグメントをコードするプラスミド、ならびにLポリメラーゼおよび核タンパク質をコードするヘルパープラスミドを一過性にトランスフェクトした。LCMV再集合体WE-Cl13(L)は、WE Sセグメントおよびクローン13 Lセグメントプラスミドを用いて作製した。LCMV P52-Cl13(L)は、糖タンパク質に2つのコード変異、I181MおよびR185Wを有するLCMV P52 Sセグメントプラスミド、ならびにクローン13 Lセグメントプラスミドを用いてレスキューした。LCMV P52-WE(L)は、LCMV P52 SセグメントプラスミドおよびLCMV WE Lセグメントプラスミドを用いて作製した。Cl13-WE(L)は、LCMVクローン13 SセグメントプラスミドおよびWE Lセグメントプラスミドを用いて作製した。
LCMV組換えおよび再集合ウイルスを完全にプラスミドから作製した。BHK-21細胞に、LCMV Sセグメント、Lセグメントをコードするプラスミド、ならびにLポリメラーゼおよび核タンパク質をコードするヘルパープラスミドを一過性にトランスフェクトした。LCMV再集合体WE-Cl13(L)は、WE Sセグメントおよびクローン13 Lセグメントプラスミドを用いて作製した。LCMV P52-Cl13(L)は、糖タンパク質に2つのコード変異、I181MおよびR185Wを有するLCMV P52 Sセグメントプラスミド、ならびにクローン13 Lセグメントプラスミドを用いてレスキューした。LCMV P52-WE(L)は、LCMV P52 SセグメントプラスミドおよびLCMV WE Lセグメントプラスミドを用いて作製した。Cl13-WE(L)は、LCMVクローン13 SセグメントプラスミドおよびWE Lセグメントプラスミドを用いて作製した。
免疫蛍光によるエクスビボでの腫瘍組織におけるLCMV感染細胞および免疫細胞の浸潤の決定
免疫組織蛍光を、LCMV処置または対照処置された腫瘍担持マウスの腫瘍組織におけるLCMVおよび免疫細胞分布を検出するために使用した。腫瘍バイオプシーを7μmの厚さの切片に切断し、蛍光色素標識された抗LCMV-NP抗体(クローンVL4)、およびCD8に対する抗体(eBioscience)で染色し、蛍光顕微鏡(Keyence)で視覚化し、統合されたCCDカメラで撮影した。
免疫組織蛍光を、LCMV処置または対照処置された腫瘍担持マウスの腫瘍組織におけるLCMVおよび免疫細胞分布を検出するために使用した。腫瘍バイオプシーを7μmの厚さの切片に切断し、蛍光色素標識された抗LCMV-NP抗体(クローンVL4)、およびCD8に対する抗体(eBioscience)で染色し、蛍光顕微鏡(Keyence)で視覚化し、統合されたCCDカメラで撮影した。
プラーク形成アッセイによる上清または臓器中のLCMVの決定
LCMV複製能を分析するために、腫瘍および初代細胞を、24ウェルプレート(100.000細胞/ウェル)に播種し、示されるMOIでLCMVに感染させた。感染後24時間、48時間または72時間に上清を採取した。FreeStyle 293-F細胞によるLCMV産生の分析を、1mL当たり1.5x106細胞を播種しそしてMOI=0.001でLCMVに感染させることによって行った。感染から12、24、30、34、40、48、72および96時間後に上清を採取した。LCMV生体分布の分析を、感染した腫瘍担持動物および非腫瘍担持動物において行った。感染したマウスの臓器を解剖し、細胞培養培地中でホモジナイズした。上清を滴定し、MC57G細胞(100.000細胞/ウェル)上でインキュベートした。メチルセルロースオーバーレイを3～4間後に添加した。LCMV感染プラークを抗LCMV-NP抗体(クローンVL4)で染色した。プラークをカウントし、感染粒子を上清1mL当たりまたは臓器当たりのウイルス力価として決定した。
LCMV複製能を分析するために、腫瘍および初代細胞を、24ウェルプレート(100.000細胞/ウェル)に播種し、示されるMOIでLCMVに感染させた。感染後24時間、48時間または72時間に上清を採取した。FreeStyle 293-F細胞によるLCMV産生の分析を、1mL当たり1.5x106細胞を播種しそしてMOI=0.001でLCMVに感染させることによって行った。感染から12、24、30、34、40、48、72および96時間後に上清を採取した。LCMV生体分布の分析を、感染した腫瘍担持動物および非腫瘍担持動物において行った。感染したマウスの臓器を解剖し、細胞培養培地中でホモジナイズした。上清を滴定し、MC57G細胞(100.000細胞/ウェル)上でインキュベートした。メチルセルロースオーバーレイを3～4間後に添加した。LCMV感染プラークを抗LCMV-NP抗体(クローンVL4)で染色した。プラークをカウントし、感染粒子を上清1mL当たりまたは臓器当たりのウイルス力価として決定した。
フローサイトメトリーによるLCMV感染細胞の決定
腫瘍および初代細胞におけるLCMV感染性を分析するために、細胞を96ウェルプレートに播種し、MOI=0.1でLCMVに感染させるか、または未処理のままにし、氷上で1時間インキュベートした。1時間後、細胞を37℃へ移した。感染後20時間で、細胞を採取し、蛍光標識LCMV NP抗体(クローンVL4)を用いて細胞内LCMV染色を行った。細胞をフローサイトメトリー(LSR Fortessa, BD)によって分析し、結果をパーセントLCMV感染細胞または平均蛍光強度(MFI)として表示した。
腫瘍および初代細胞におけるLCMV感染性を分析するために、細胞を96ウェルプレートに播種し、MOI=0.1でLCMVに感染させるか、または未処理のままにし、氷上で1時間インキュベートした。1時間後、細胞を37℃へ移した。感染後20時間で、細胞を採取し、蛍光標識LCMV NP抗体(クローンVL4)を用いて細胞内LCMV染色を行った。細胞をフローサイトメトリー(LSR Fortessa, BD)によって分析し、結果をパーセントLCMV感染細胞または平均蛍光強度(MFI)として表示した。
フローサイトメトリーによるサイトカイン産生の決定
LCMVによる免疫活性化の強度を、血清中のサイトカインを測定することによって分析した。したがって、腫瘍有りまたは無しで、ナイーブなまたは感染したマウスの血清を、製造業者のプロトコル(BioLegend)に従ってLegendPlex分析によって分析した。
LCMVによる免疫活性化の強度を、血清中のサイトカインを測定することによって分析した。したがって、腫瘍有りまたは無しで、ナイーブなまたは感染したマウスの血清を、製造業者のプロトコル(BioLegend)に従ってLegendPlex分析によって分析した。
臨床化学
LCMVによる肝臓病態の誘導を、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を測定することによって決定した。LCMV感染後の様々な日にマウスから採血し、血清を抽出した。ALTおよびAST値の分析は、Zentrallabor, Universitatsklinkum EssenまたはZentralinstitut fur Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik, HHU Dusseldorfで実施された。
LCMVによる肝臓病態の誘導を、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)を測定することによって決定した。LCMV感染後の様々な日にマウスから採血し、血清を抽出した。ALTおよびAST値の分析は、Zentrallabor, Universitatsklinkum EssenまたはZentralinstitut fur Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik, HHU Dusseldorfで実施された。
フローサイトメトリーによる免疫細胞の分析
LCMV療法の効果を決定するために、免疫細胞をフローサイトメトリー(LSR Fortessa, BD)によって分析した。血小板をそれらの特定のサイズおよび粒度によって検出した。T細胞をCD8、CD4、CD3に対する特異的蛍光標識抗体(eBioscience)で染色した。LCMV特異的T細胞を、テトラマー染色(NIH, Tetramer Facility)を用いて染色した。
LCMV療法の効果を決定するために、免疫細胞をフローサイトメトリー(LSR Fortessa, BD)によって分析した。血小板をそれらの特定のサイズおよび粒度によって検出した。T細胞をCD8、CD4、CD3に対する特異的蛍光標識抗体(eBioscience)で染色した。LCMV特異的T細胞を、テトラマー染色(NIH, Tetramer Facility)を用いて染色した。
腫瘍成長および処置
LCMV療法の抗腫瘍効果を測定するために、C57BL/6マウス(6～12週齢)の右または左側腹部に1 x106腫瘍細胞(100μL中)を皮下注射した。目に見える腫瘍形成後、動物をLCMVまたは対照処置し、平均腫瘍体積を決定した。腫瘍量のエンドポイント分析は、腫瘍の総重量(gで)を測定することによって行った。
LCMV療法の抗腫瘍効果を測定するために、C57BL/6マウス(6～12週齢)の右または左側腹部に1 x106腫瘍細胞(100μL中)を皮下注射した。目に見える腫瘍形成後、動物をLCMVまたは対照処置し、平均腫瘍体積を決定した。腫瘍量のエンドポイント分析は、腫瘍の総重量(gで)を測定することによって行った。
統計解析
柱状図については、独立2標本スチューデントt検定を用いて平均値を比較した。腫瘍成長曲線は、二元配置分散分析およびSkidakの多重比較検定を用いて比較した。データはSEM±平均値として表示される。統計的有意水準をp＜0.05であると決定した。
柱状図については、独立2標本スチューデントt検定を用いて平均値を比較した。腫瘍成長曲線は、二元配置分散分析およびSkidakの多重比較検定を用いて比較した。データはSEM±平均値として表示される。統計的有意水準をp＜0.05であると決定した。
研究
実施例1
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。腫瘍成長を7日間にわたって測定した。腫瘍塊を完了(d7)時に採取した(図1)。
実施例1
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。腫瘍成長を7日間にわたって測定した。腫瘍塊を完了(d7)時に採取した(図1)。
これにより、LCMV WE-CL13(L)は、非免疫原性のコールドB16黒色腫腫瘍モデルにおいて野生型LCMV株WEと比較して増加した抗腫瘍効果を示すことが証明された。このモデルはコールド腫瘍の例である。
実施例2
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍常在性細胞傷害性CD8+ T細胞を、蛍光標識抗体(CD8 eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図2)。
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍常在性細胞傷害性CD8+ T細胞を、蛍光標識抗体(CD8 eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図2)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は腫瘍組織へのT細胞浸潤を増強することが証明された。
実施例3
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍常在性細胞傷害性、抗ウイルス性CD8+ GP33-テトラマー陽性T細胞を、感染後7日目にフローサイトメトリーによって分析した(図3)。
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍常在性細胞傷害性、抗ウイルス性CD8+ GP33-テトラマー陽性T細胞を、感染後7日目にフローサイトメトリーによって分析した(図3)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は野生型LCMV株WEよりも強い適応免疫活性化を誘導することが証明された。
実施例4
C57BL/6マウスをMC38結腸がん細胞で皮下処置した。腫瘍形成時にマウスを2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=4動物)。腫瘍成長を11日間観察した(図4)。
C57BL/6マウスをMC38結腸がん細胞で皮下処置した。腫瘍形成時にマウスを2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=4動物)。腫瘍成長を11日間観察した(図4)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は免疫原性のウォームMC38腫瘍モデルにおいて強い腫瘍成長阻害効果を示すことが証明された。これはウォーム腫瘍のモデルである。
実施例5
C57BL/6マウスをMC38結腸がん細胞で皮下処置した。腫瘍形成時にマウスを2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=4動物)。腫瘍組織を感染後11日目に解剖した。腫瘍浸潤T細胞(CD3+)を蛍光標識抗体(CD3, eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって測定した(実施例5)。
C57BL/6マウスをMC38結腸がん細胞で皮下処置した。腫瘍形成時にマウスを2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=4動物)。腫瘍組織を感染後11日目に解剖した。腫瘍浸潤T細胞(CD3+)を蛍光標識抗体(CD3, eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって測定した(実施例5)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は腫瘍への強いT細胞浸潤を誘導することが証明された。
実施例6
C57BL/6マウスをMC38細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=4動物)。腫瘍組織を感染後11日目に解剖した。腫瘍浸潤細胞傷害性T細胞(CD3+CD8+)を蛍光標識抗体(CD3, CD8, eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図6)。
C57BL/6マウスをMC38細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=4動物)。腫瘍組織を感染後11日目に解剖した。腫瘍浸潤細胞傷害性T細胞(CD3+CD8+)を蛍光標識抗体(CD3, CD8, eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図6)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は腫瘍への細胞傷害性T細胞浸潤を強力に増強することが証明された。
実施例7
C57BL/6マウスをMC38細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE (n=4)もしくはWE-Cl13(L) (n=3)に静脈内感染させたか、または対照処置した(n=4)。腫瘍組織を組織学的に分析した。腫瘍切片(7μm)をLCMV核タンパク質(LCMV NP、クローンVL4)およびCD8+ T細胞(CD8)について蛍光標識抗体で染色した(図7)。
C57BL/6マウスをMC38細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE (n=4)もしくはWE-Cl13(L) (n=3)に静脈内感染させたか、または対照処置した(n=4)。腫瘍組織を組織学的に分析した。腫瘍切片(7μm)をLCMV核タンパク質(LCMV NP、クローンVL4)およびCD8+ T細胞(CD8)について蛍光標識抗体で染色した(図7)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は、特定の局所ウイルス存在とは無関係に腫瘍への細胞傷害性T細胞浸潤を増強することが証明された。
実施例8
C643、H1975、Ma-Mel-51、SkMM、B16F10、MC57GおよびHEK293T細胞を播種し(100.000細胞/ウェル)、LCMV株WE、クローン13、WE-Cl13(L) (WE Sセグメント、クローン13 Lセグメント)およびクローン13-WE(L) (クローン13 Sセグメント、WE Lセグメント)にMOI=0.1で感染させた。細胞を20時間培養し、蛍光標識抗体(NP、クローンVL4)によってLCMV核タンパク質の存在について細胞内染色した。全細胞からの感染細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した(図8)。
C643、H1975、Ma-Mel-51、SkMM、B16F10、MC57GおよびHEK293T細胞を播種し(100.000細胞/ウェル)、LCMV株WE、クローン13、WE-Cl13(L) (WE Sセグメント、クローン13 Lセグメント)およびクローン13-WE(L) (クローン13 Sセグメント、WE Lセグメント)にMOI=0.1で感染させた。細胞を20時間培養し、蛍光標識抗体(NP、クローンVL4)によってLCMV核タンパク質の存在について細胞内染色した。全細胞からの感染細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した(図8)。
これにより、クローン13 Lセグメントは、全ての腫瘍細胞株におけるウイルスの弱毒化に関与しているが、産生細胞株HEK293の感染を大幅には減少させないことが証明された。
実施例9
C643、Ma-Mel-86a、Ma-Mel-51、511950、B16F10、Tramp-C2およびJAWSII細胞を播種し(100.000細胞/ウェル)、LCMV株WEおよびWE-Cl13(L)にMOI = 0.1で感染させた。感染後24および48時間に、上清を採取し、LCMVフォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(実施例9)。
C643、Ma-Mel-86a、Ma-Mel-51、511950、B16F10、Tramp-C2およびJAWSII細胞を播種し(100.000細胞/ウェル)、LCMV株WEおよびWE-Cl13(L)にMOI = 0.1で感染させた。感染後24および48時間に、上清を採取し、LCMVフォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(実施例9)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)複製能は腫瘍細胞および抗原提示細胞(JAWSII)において減弱されることが証明された。
実施例10
初代ヒトニューロン、マウスMC57G細胞、ヒト肺腺がん細胞株A549およびヒト甲状腺がん細胞株FTC133を播種し(100.000細胞/ウェル)、MOI=0.1でLCMV WEおよびWE-Cl13(L)に感染させた。上清を48時間後に採取し、フォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(図10)。
初代ヒトニューロン、マウスMC57G細胞、ヒト肺腺がん細胞株A549およびヒト甲状腺がん細胞株FTC133を播種し(100.000細胞/ウェル)、MOI=0.1でLCMV WEおよびWE-Cl13(L)に感染させた。上清を48時間後に採取し、フォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(図10)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は、LCMV株WEと比較して、神経向性の欠如を示すが、同時に、マウス線維肉腫細胞株MC57Gなどの感受性腫瘍細胞における増強した複製、ならびにヒトがん細胞株A549およびFTC133における堅牢な複製を示すことが証明された。
実施例11
骨髄由来樹状細胞をLCMV株WEおよびWE-Cl13に感染させた。上清を採取し、市販のインターフェロンαELISAキットによってインターフェロンαタンパク質について分析した(図11)。
骨髄由来樹状細胞をLCMV株WEおよびWE-Cl13に感染させた。上清を採取し、市販のインターフェロンαELISAキットによってインターフェロンαタンパク質について分析した(図11)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は樹状細胞のインビトロ感染時にLCMV WEと同様のインターフェロン応答を誘導することが証明された。
実施例12
C57BL/6マウスを2x104 PFUのLCMV株アームストロング(Arm、n=3)、WE (n=3)、WE-Cl13(L) (n=3)もしくはクローン13 (Cl13、n=3)に静脈内感染させたか、または未処置のままにした(n=12)。血液を感染後1日目および3日目に採取した。IFNαおよびIFNβの血清サイトカイン濃度をLegendPlexアッセイ(BioLegend)によって分析した(図12)。
C57BL/6マウスを2x104 PFUのLCMV株アームストロング(Arm、n=3)、WE (n=3)、WE-Cl13(L) (n=3)もしくはクローン13 (Cl13、n=3)に静脈内感染させたか、または未処置のままにした(n=12)。血液を感染後1日目および3日目に採取した。IFNαおよびIFNβの血清サイトカイン濃度をLegendPlexアッセイ(BioLegend)によって分析した(図12)。
これにより、LCMV WE-Cl13(L)再集合体は全身投与時にマウスにおいて減少したレベルのインターフェロンを誘導することが証明された。
実施例13
C57BL/6マウスを2x104 PFUのLCMV株アームストロング(Arm、n=3)、WE (n=3)、WE-Cl13(L) (n=3)もしくはクローン13 (Cl13、n=3)に静脈内感染させたか、または未処置のままにした(n=12)。血液を感染後1日目および3日目に採取した。IL-6、Il-10、TNFαおよびIFNγの血清サイトカイン濃度をLegendPlexアッセイ(BioLegend)によって分析した(図13)。
C57BL/6マウスを2x104 PFUのLCMV株アームストロング(Arm、n=3)、WE (n=3)、WE-Cl13(L) (n=3)もしくはクローン13 (Cl13、n=3)に静脈内感染させたか、または未処置のままにした(n=12)。血液を感染後1日目および3日目に採取した。IL-6、Il-10、TNFαおよびIFNγの血清サイトカイン濃度をLegendPlexアッセイ(BioLegend)によって分析した(図13)。
これにより、LCMV株WE-CL13(L)はマウスにおいてより低い濃度のTh1および炎症性のサイトカインを誘導することが証明された。
実施例14
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (n=3)に静脈内感染させた。体重を14日間の期間にわたって測定した。体重を感染日の体重のパーセンテージとして分析した(図14)。
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (n=3)に静脈内感染させた。体重を14日間の期間にわたって測定した。体重を感染日の体重のパーセンテージとして分析した(図14)。
これにより、LCMV再集合体WE-Cl13(L)は、野生型LCMV株WEと比較して、高感受性マウス系統FVB/Nにおいて致死的な病態を誘発しないことが証明された。
実施例15
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (N=3)に静脈内感染させた。マウスから3日目、6日目および9日目に採血した。血小板（platelet）（血小板（thrombocyte））をフローサイトメトリーによって全血中で測定した。血液1マイクロリットル当たりの血小板の総数を分析した(図15)。
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (N=3)に静脈内感染させた。マウスから3日目、6日目および9日目に採血した。血小板（platelet）（血小板（thrombocyte））をフローサイトメトリーによって全血中で測定した。血液1マイクロリットル当たりの血小板の総数を分析した(図15)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は、高感受性FVB/Nおよび他のマウス系統において血小板減少症を誘導しないことが示された。
実施例16
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (N=3)に静脈内感染させた。マウスから3日目、6日目、9日目および14日目に採血した。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の血清レベルを分析した(図16)。
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (N=3)に静脈内感染させた。マウスから3日目、6日目、9日目および14日目に採血した。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の血清レベルを分析した(図16)。
これにより、LCMV WE-Cl13(L)は、高感受性FVB/Nおよび他のマウス系統において肝臓病態を誘導しないことが示された。
実施例17
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (N=3)に静脈内感染させた。マウスから3日目、6日目、9日目および14日目に採血した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の血清レベルを分析した(図17)。
野生型C57BL/6もしくはBALB/cマウスまたは高感受性マウス系統FVB/Nを2x106 PFUのLCMV株WE、Cl13 (クローン13)、Arm (アームストロング)またはWE-Cl13(L) (N=3)に静脈内感染させた。マウスから3日目、6日目、9日目および14日目に採血した。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の血清レベルを分析した(図17)。
これにより、LCMV WE-Cl13(L)は、高感受性FVB/Nおよび他のマウス系統において肝臓病態を誘導しないことが示された。
実施例18
B16黒色腫腫瘍細胞をC57BL/6マウスに皮下注射した。マウスを2x104 PFUのLCMV株WE (n=4)またはWE-Cl13(L) (n=5)で処置したか、または対照処置した(n=6)。血液を感染後7日目に採取し、肝臓病態の指標としてのALTおよびASTの血清レベルを分析した(図18)。
B16黒色腫腫瘍細胞をC57BL/6マウスに皮下注射した。マウスを2x104 PFUのLCMV株WE (n=4)またはWE-Cl13(L) (n=5)で処置したか、または対照処置した(n=6)。血液を感染後7日目に採取し、肝臓病態の指標としてのALTおよびASTの血清レベルを分析した(図18)。
これにより、LCMV株WE-CL13(L)は、腫瘍におけるLCMV複製の存在下での全身投与後に肝臓病態を誘導しないことが証明された。
実施例19
OVA発現B16腫瘍細胞を、C57BL/6マウスに皮下注射した。マウスを2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=5)。マウスを処置後7日目に犠牲にし、脾臓、肝臓、肺、腎臓および脳をフォーカス形成アッセイによって複製LCMV粒子について分析した(図19)。
OVA発現B16腫瘍細胞を、C57BL/6マウスに皮下注射した。マウスを2x104 PFUのLCMV株WEまたはWE-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=5)。マウスを処置後7日目に犠牲にし、脾臓、肝臓、肺、腎臓および脳をフォーカス形成アッセイによって複製LCMV粒子について分析した(図19)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は健康な臓器において有意に減少した複製を示すことが示された。
実施例20
マウスMC38腫瘍細胞をC57BL/6マウスに皮下移植した。マウスを静脈内注射によって2x104 PFUのLCMV株WE (n=4)またはWE-Cl13(L) (n=4)で処置したか、または対照処置した。腫瘍組織を感染後11日目にフォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(図20)。
マウスMC38腫瘍細胞をC57BL/6マウスに皮下移植した。マウスを静脈内注射によって2x104 PFUのLCMV株WE (n=4)またはWE-Cl13(L) (n=4)で処置したか、または対照処置した。腫瘍組織を感染後11日目にフォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(図20)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)は腫瘍組織においてLCMV株WEに等しく複製することが証明された。
実施例21
初代ヒトニューロン、肺腺がん細胞株H1975、消化管がん細胞株GIST-T1、初代黒色腫細胞株Ma-Mel-86a、マウス線維肉腫MC57Gおよび初代黒色腫細胞株Ma-Mel-51を播種し(100.00細胞/ウェル)、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)に感染させた。20時間後、細胞をLCMV核タンパク質(NP、クローンVL4)について細胞内染色した。LCMV感染細胞(LCMV NP+)のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した(図21)。
初代ヒトニューロン、肺腺がん細胞株H1975、消化管がん細胞株GIST-T1、初代黒色腫細胞株Ma-Mel-86a、マウス線維肉腫MC57Gおよび初代黒色腫細胞株Ma-Mel-51を播種し(100.00細胞/ウェル)、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)に感染させた。20時間後、細胞をLCMV核タンパク質(NP、クローンVL4)について細胞内染色した。LCMV感染細胞(LCMV NP+)のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した(図21)。
これにより、LCMV再集合体LCMV WE-Cl13(L)およびLCMV P52-Cl13(L)はヒトニューロンにおいて複製しないが、LCMV株P52-Cl13(L)はヒトおよびマウス腫瘍細胞において増加した感染性および複製を示すことが証明された。
実施例22
初代ヒトニューロン、肺腺がん細胞株H1975、消化管がん細胞株GIST-T1、初代黒色腫細胞株Ma-Mel-86a、マウス線維肉腫MC57Gおよび初代黒色腫細胞株Ma-Mel-51を播種し(100.00細胞/ウェル)、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)に感染させた。20時間後、細胞をLCMV核タンパク質(NP、クローンVL4)について細胞内染色した。LCMV感染細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーによって分析し、細胞における複製能を調べた(図22)。
初代ヒトニューロン、肺腺がん細胞株H1975、消化管がん細胞株GIST-T1、初代黒色腫細胞株Ma-Mel-86a、マウス線維肉腫MC57Gおよび初代黒色腫細胞株Ma-Mel-51を播種し(100.00細胞/ウェル)、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)に感染させた。20時間後、細胞をLCMV核タンパク質(NP、クローンVL4)について細胞内染色した。LCMV感染細胞の蛍光強度をフローサイトメトリーによって分析し、細胞における複製能を調べた(図22)。
これにより、LCMV株P52-Cl13(L)はヒトおよびマウス腫瘍細胞において増強された複製を示すことが証明された。
実施例23
分化したヒト筋芽細胞、ヒト骨格筋筋芽細胞(SkMM)、肺腺がん細胞株A549およびマウス線維肉腫細胞株MC57Gを播種し(100.000細胞/ウェル)、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)、I181M-Cl13(L)またはR185W-Cl13(L)に感染させた。20時間後、細胞をLCMV核タンパク質(NP、クローンVL4)について細胞内染色した。LCMV感染細胞(LCMV NP+)のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した(図23)。
分化したヒト筋芽細胞、ヒト骨格筋筋芽細胞(SkMM)、肺腺がん細胞株A549およびマウス線維肉腫細胞株MC57Gを播種し(100.000細胞/ウェル)、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)、I181M-Cl13(L)またはR185W-Cl13(L)に感染させた。20時間後、細胞をLCMV核タンパク質(NP、クローンVL4)について細胞内染色した。LCMV感染細胞(LCMV NP+)のパーセンテージをフローサイトメトリーによって分析した(図23)。
これにより、181位および185位におけるLCMV糖タンパク質中の変異は、ヒトおよびマウスがん細胞における複製および感染性を増強するが、健康なヒト筋細胞に対する向性を増加させないことが示された。
実施例24
初代ヒトニューロンおよびマウス線維肉腫MC57G細胞をそれらのLCMV複製能について試験した。1ウェル当たり100.000細胞を播種し、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)に感染させた。上清を感染後48時間で採取した。ウイルス力価をフォーカス形成アッセイによって分析した(図24)。
初代ヒトニューロンおよびマウス線維肉腫MC57G細胞をそれらのLCMV複製能について試験した。1ウェル当たり100.000細胞を播種し、MOI=0.1のLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)に感染させた。上清を感染後48時間で採取した。ウイルス力価をフォーカス形成アッセイによって分析した(図24)。
これにより、再集合体LCMV株WE-Cl13(L)およびP52-Cl13(L)は、健康なヒトニューロンに対して向性を示さないが、野生型LCMV株WEと比較してマウスがん細胞において増強された複製を示すことが証明された。
実施例25
C57BL/6マウスをマウス黒色腫B16細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。腫瘍成長を7日間にわたって測定した。腫瘍量を完了(d7)時に測定した(図25)。
C57BL/6マウスをマウス黒色腫B16細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。腫瘍成長を7日間にわたって測定した。腫瘍量を完了(d7)時に測定した(図25)。
これにより、LCMV株WE-CL13(L)およびP52-Cl13(L)は、野生型LCMV株WEと比較して増加した抗腫瘍効果を示すことが証明された。
実施例26
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍流入領域リンパ節常在性細胞傷害性CD8+ T細胞を蛍光標識抗CD8抗体(eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図26)。
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍流入領域リンパ節常在性細胞傷害性CD8+ T細胞を蛍光標識抗CD8抗体(eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図26)。
これにより、LCMV株WE-CL13(L)およびP52-Cl13(L)は腫瘍流入領域リンパ節における細胞傷害性T細胞蓄積を増強することが証明された。
実施例27
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍流入領域リンパ節常在性細胞傷害性、抗ウイルス性CD8+ GP33-テトラマー陽性T細胞を、感染後7日目に、蛍光標識抗体(eBioscience, NIH)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図27)。
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍流入領域リンパ節常在性細胞傷害性、抗ウイルス性CD8+ GP33-テトラマー陽性T細胞を、感染後7日目に、蛍光標識抗体(eBioscience, NIH)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図27)。
これにより、LCMV株P52-Cl13(L)は腫瘍流入領域リンパ節におけるウイルス特異的T細胞の蓄積を増加させることが証明された。
実施例28
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍常在性細胞傷害性CD8+ T細胞を蛍光標識抗CD8抗体(eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図28)。
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。腫瘍常在性細胞傷害性CD8+ T細胞を蛍光標識抗CD8抗体(eBioscience)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図28)。
これにより、LCMV株WE-CL13(L)およびP52-Cl13(L)は腫瘍における細胞傷害性T細胞蓄積を増強することが証明された。
実施例29
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。腫瘍流入領域リンパ節常在性細胞傷害性、抗ウイルス性CD8+ GP33-テトラマー陽性T細胞を、感染後7日目に、蛍光標識抗体(eBioscience, NIH)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図29)。
C57BL/6マウスをB16黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。腫瘍流入領域リンパ節常在性細胞傷害性、抗ウイルス性CD8+ GP33-テトラマー陽性T細胞を、感染後7日目に、蛍光標識抗体(eBioscience, NIH)によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図29)。
これにより、LCMV株P52-Cl13(L)による処置は、腫瘍組織における抗ウイルス性T細胞蓄積を強力に増強することが証明された。
実施例30
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍体積を感染後11日まで測定した(図30)。
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍体積を感染後11日まで測定した(図30)。
これによりLCMV株P52-Cl13(L)は強力な腫瘍成長阻害を誘導することが証明された。
実施例31
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍を11日目に解剖した。T細胞を蛍光抗CD3抗体(eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図31)。
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍を11日目に解剖した。T細胞を蛍光抗CD3抗体(eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図31)。
これにより、LCMV株P52-Cl13(L)は、LCMV株WE、WE-Cl13(L)および対照処置腫瘍と比較して、腫瘍組織における増強されたT細胞蓄積への明らかな傾向を示すことが証明された。
実施例32
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍を11日目に解剖した。ヘルパーT細胞を蛍光抗CD3および抗CD4抗体(eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図32)。
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍を11日目に解剖した。ヘルパーT細胞を蛍光抗CD3および抗CD4抗体(eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図32)。
これにより、LCMV株WE-Cl13(L)およびP52-Cl13(L)は、野生型LCMV株WEで処置されたまたは対照処置された腫瘍と比較して、腫瘍組織へのより強いヘルパーT細胞浸潤を誘導することが示された。
実施例33
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍を11日目に解剖した。細胞傷害性T細胞を蛍光抗CD3および抗CD8抗体(eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図33)。
C57BL/6マウスをマウスMC38結腸がん細胞で皮下処置した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)で静脈内処置したか、または対照処置した(n=4)。腫瘍を11日目に解剖した。細胞傷害性T細胞を蛍光抗CD3および抗CD8抗体(eBioscience)で染色し、フローサイトメトリーによって分析した(図33)。
これにより、LCMV株P52-Cl13(L)は対照処置と比較して腫瘍における細胞傷害性T細胞蓄積を増強することが証明された。
実施例34
C57BL/6マウスを1マウス当たり2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または未処置のままにした(n=3)。血液を感染後2日目および4日目に採取した。IFNα、TNFαおよびIFNγの血清サイトカインレベルをLegendPlexアッセイ(BioLegend)によって分析した(図34)。
C57BL/6マウスを1マウス当たり2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または未処置のままにした(n=3)。血液を感染後2日目および4日目に採取した。IFNα、TNFαおよびIFNγの血清サイトカインレベルをLegendPlexアッセイ(BioLegend)によって分析した(図34)。
これにより、LCMV再集合体株WE-Cl13(L)およびP52-Cl13(L)は、野生型LCMV株WEおよびクローン13と比較して低下した全身性サイトカインレベルを誘導することが証明された。
実施例35
C57BL/6マウスをB16-Ova黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。脾臓、肝臓、肺、腎臓、脳および腫瘍組織をフォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(図35)。
C57BL/6マウスをB16-Ova黒色腫細胞で皮下処置し、2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)もしくはP52-Cl13(L)に静脈内感染させたか、または対照処置した(1群当たりn=5動物)。マウスを感染後7日目に犠牲にした。脾臓、肝臓、肺、腎臓、脳および腫瘍組織をフォーカス形成アッセイによってLCMV複製について分析した(図35)。
これにより、LCMV再集合体P52-Cl13(L)は、腫瘍組織における測定可能な複製を同時に示すことによって、健康な臓器における減少した複製を示すことが示された。
実施例36
MC38腫瘍細胞をC57BL/6マウスに皮下移植した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)で静脈内処置した。感染後11日目に腫瘍を解剖し、LCMV複製をフォーカス形成アッセイによって分析した(図36)。
MC38腫瘍細胞をC57BL/6マウスに皮下移植した。目に見える腫瘍形成後、マウスを2x104 PFUのLCMV株WE、WE-Cl13(L)またはP52-Cl13(L)で静脈内処置した。感染後11日目に腫瘍を解剖し、LCMV複製をフォーカス形成アッセイによって分析した(図36)。
これにより、LCMV株P52-CL13(L)は、株WEおよびWE-Cl13(L)と比較してマウス腫瘍組織においてより短く持続することが証明された。
実施例37
FreeStyle 293-F懸濁細胞をMOI=0.001のLCMV株WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)またはP52-WE(L)に1mL当たりの1.5x106細胞の密度で感染させた。上清を感染後12、24、30、34、40、48、72および96時間で採取した。上清中のLCMV力価をフォーカス形成アッセイによって分析した(図37)。
FreeStyle 293-F懸濁細胞をMOI=0.001のLCMV株WE-Cl13(L)、P52-Cl13(L)またはP52-WE(L)に1mL当たりの1.5x106細胞の密度で感染させた。上清を感染後12、24、30、34、40、48、72および96時間で採取した。上清中のLCMV力価をフォーカス形成アッセイによって分析した(図37)。
これにより、FreeStyle 293-F細胞は、LCMV再集合体WE-CL13(L)およびP52-Cl13(L)の増強された複製を示し、LCMV再集合体の産生に理想的な産生細胞株を示すことが証明された。
本明細書に例示的に記載される態様は、本明細書に具体的に開示されない任意の要素または制限がなくても好適に実施され得る。したがって、本明細書で使用する用語および表現は、制限のためではなく記載のために用いられており、そうした用語および表現の使用には、表示されかつ記載されている特徴の等価物またはその一部を排除する意図はなく、特許請求の本発明の範囲内でさまざまな変更形態が可能であることが認められる。したがって、本態様を好ましい態様および任意の特徴により具体的に開示してきたが、その変更形態および変化形態が当業者により利用され得ること、ならびにそのような変更形態および変化形態は本発明の範囲内とみなされることを、理解すべきである。属の開示に含まれる下位または亜属の分類はいずれも本発明の一部を形成する。このことは、その属から任意の主題を除去する条件付きのまたはマイナスの限定を有する本発明の属の記載を含み、削除される材料が本明細書に明記されているかいないかには関係ない。加えて、特徴がマーカッシュ群の観点から記載される場合、当業者は、開示がマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からもそれによって記載されることを認識するであろう。
等価物：当業者であれば、ルーチンの実験を行うだけで、本明細書に記載される本発明の特定の態様の多くの等価物を認識するか、確認することができよう。そのような等価物も以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、および物質などに制限されないこと、したがって変化し得ることを理解されたい。本明細書で用いられる術語は、特定の態様を説明する目的しかなく、また本発明の範囲を制限するものではなく、該範囲は請求項によってのみ定められる。
本明細書の文面を通して引用されるあらゆる公報（特許、特許出願、科学論文、メーカー仕様書、取扱説明書その他をすべて含む）は、その全文が、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書では、何ら、本発明が先行発明によりそのような開示に先立つ資格がないと認めるものと解釈されない。参照により組み入れられる資料が本明細書に矛盾するか一致しない場合、そのような資料よりも本明細書が有効である。
さらなる態様は、以下の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
Claims (62)
- リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、該Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、該Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、該糖タンパク質が、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含む、前記ウイルス粒子。
- 前記糖タンパク質が、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して181および/または185位に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含み、ここで、前記糖タンパク質が、好ましくは、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較してArg 185→TrpおよびIle 181→Metより選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項1記載のウイルス粒子。
- Lタンパク質が、SEQ ID NO:40の線形ポリペプチド配列に対応する1079位にLys以外のアミノ酸残基、好ましくは非塩基性アミノ酸残基、好ましくは中性親水性アミノ酸残基、好ましくはAsnまたはGln、好ましくはGlnを含む、請求項1または2記載のウイルス粒子。
- リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、該Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、該Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、該Lタンパク質が、SEQ ID NO:40の線形ポリペプチド配列に対応する1079位にLys以外のアミノ酸残基を含む、前記ウイルス粒子。
- Lタンパク質が、SEQ ID NO:40の線形ポリペプチド配列に対応する1079位に非塩基性アミノ酸残基、好ましくは中性親水性アミノ酸残基、好ましくはAsnまたはGln、好ましくはGlnを含む、請求項4記載のウイルス粒子。
- 前記糖タンパク質が、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含み、ここで、前記糖タンパク質が、好ましくは、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して181および/または185位に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含み、ここで、前記糖タンパク質が、好ましくは、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較してArg 185→TrpおよびIle 181→Metより選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項4または5記載のウイルス粒子。
- SセグメントがLCMV株WEまたはその変異株に由来し、かつ、LセグメントがLCMV株クローン13またはその変異株に由来する、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Sセグメントが、SEQ ID NO:6と少なくとも97%の配列同一性を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Lセグメントが、SEQ ID NO:38と少なくとも90%の配列同一性を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、該Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:6と少なくとも97%の配列同一性を有する核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、該Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、およびSEQ ID NO:38と少なくとも90%の配列同一性を有するZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記ウイルス粒子。
- 前記糖タンパク質が、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含み、ここで、前記糖タンパク質が、好ましくは、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較して181および/または185位に少なくとも1つの変異アミノ酸残基を含み、ここで、前記糖タンパク質が、好ましくは、SEQ ID NO:4に記載の糖タンパク質配列と比較してArg 185→TrpおよびIle 181→Metより選択される少なくとも1つの変異を含む、請求項10記載のウイルス粒子。
- Lタンパク質が、SEQ ID NO:40の線形ポリペプチド配列に対応する1079位にLys以外のアミノ酸残基、好ましくは非塩基性アミノ酸残基、好ましくは中性親水性アミノ酸残基、好ましくはAsnまたはGln、好ましくはGlnを含む、請求項10または11記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、腫瘍の成長のより大幅な減少を促進することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、コールド腫瘍の成長のより大幅な減少を促進することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、より強い適応免疫活性化を誘導することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、少なくとも同程度の、ウォーム腫瘍の成長の減少を促進することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WE、アームストロング、クローン13、ならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、全身投与時に、減少したレベルのインターフェロンを誘導することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WE、アームストロング、クローン13、ならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、より低い濃度の1つまたは複数のTh1および炎症性のサイトカインを誘導することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WE、アームストロング、クローン13、ならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、より低い濃度の1つまたは複数のTh1および炎症性のサイトカインを誘導することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEと比較して、マウスにおける病原性がより低い、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、マウスにおける低下した程度の肝臓病態を誘導することができる、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、ニューロン細胞における低下した複製を示す、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEと比較して、腫瘍細胞における増加した複製を示す、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV株WEならびに／または前記ウイルス粒子と同じSセグメントおよびSEQ ID NO:2に示されるLセグメントを含むウイルス粒子と比較して、健康な臓器における低下した複製を示す、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Sセグメントが、SEQ ID NO:4または14に記載の配列と少なくとも約98%、好ましくは少なくとも約98.5%、好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Sセグメントが、SEQ ID NO:3または13に記載の配列と少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列を含むオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Lセグメントが、SEQ ID NO:30または40に記載の配列と少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一であるLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Lセグメントが、SEQ ID NO:29または39に記載の配列と少なくとも約83%、好ましくは少なくとも約84%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列を含むオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Sセグメントが、核タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、該核タンパク質が、SEQ ID NO:6または16のいずれかに記載の配列と少なくとも約98%、好ましくは98.5%、好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Sセグメントが、SEQ ID NO:5または15に記載の配列と少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列を含むオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Lセグメントが、SEQ ID NO:28または38に記載の配列と少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一であるZタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Lセグメントが、SEQ ID NO:27または37に記載の配列と少なくとも約84%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性を有するかまたは同一である配列を含むオープンリーディングフレームを含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Sセグメントが、SEQ ID NO:1または11に記載の配列と少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Lセグメントが、SEQ ID NO:21または31に記載の配列と少なくとも約83%、好ましくは少なくとも約84%、好ましくは少なくとも約85%、好ましくは少なくとも約86%、好ましくは少なくとも約87%、好ましくは少なくとも約88%、好ましくは少なくとも約89%、好ましくは少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約91%、好ましくは少なくとも約92%、好ましくは少なくとも約93%、好ましくは少なくとも約94%、好ましくは少なくとも約95%、好ましくは少なくとも約96%、好ましくは少なくとも約97%、好ましくは少なくとも約98% 好ましくは少なくとも約99%、好ましくは少なくとも約99.1%、好ましくは少なくとも約99.2%、好ましくは少なくとも約99.3%、好ましくは少なくとも約99.4%、好ましくは少なくとも約99.5%、好ましくは少なくとも約99.6%、好ましくは少なくとも約99.7%の配列同一性、好ましくは少なくとも約99.7%、好ましくは少なくとも約99.8%、好ましくは少なくとも約99.9%の配列同一性を有するかまたは好ましくは同一である配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- 感染性である、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- 複製コンピテントである、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- 弱毒化されている、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- 糖タンパク質をコードするORFが5’非翻訳領域(UTR)の制御下にある、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Lタンパク質をコードするORFが3’非翻訳領域(UTR)の制御下にある、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- 核タンパク質をコードするORFが3’非翻訳領域(UTR)の制御下にある、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- Zタンパク質をコードするORFが5’非翻訳領域(UTR)の制御下にある、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- 二分節ゲノムを有する、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- アレナウイルス粒子である、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV粒子である、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- LCMV以外の生物由来のORFを含まない、前記請求項のいずれか一項記載のウイルス粒子。
- 前記請求項のいずれか一項に定義されるとおりのLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含む、宿主細胞。
- (a)請求項1～45のいずれか一項に定義されるとおりの糖タンパク質をコードするORF、請求項1～45のいずれか一項に定義されるとおりのLタンパク質をコードするORF、請求項1～45のいずれか一項に定義されるとおりの核タンパク質をコードするORF、および請求項1～45のいずれか一項に定義されるとおりのZタンパク質をコードするORF；ならびに／または
(b)請求項1～45のいずれか一項に定義されるとおりのLCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメント
のcDNAを含む、宿主細胞。 - HEK293細胞である、請求項46または47記載の宿主細胞。
- ウイルス粒子形成に適した条件下で請求項46～48のいずれか一項記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項1～45のいずれか一項記載のウイルス粒子を製造する方法。
- ウイルス粒子の回収および／または精製をさらに含む、請求項49記載の方法。
- LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子を含む薬学的組成物であって、該Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、該Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記薬学的組成物。
- ウイルス粒子が、請求項1～45のいずれか一項記載のウイルス粒子である、請求項51記載の薬学的組成物。
- 療法における使用のための、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子であって、該Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、該Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、前記ウイルス粒子。
- 請求項1～45のいずれか一項記載のウイルス粒子である、請求項53記載の使用のためのウイルス粒子。
- 前記使用が、がんの処置における使用である、請求項53または54記載の使用のためのウイルス粒子。
- 前記使用が、ヒト対象の処置における使用である、請求項53～55のいずれか一項記載の使用のためのウイルス粒子。
- 前記使用が、ヒトがんの処置における使用である、請求項53～56のいずれか一項記載の使用のためのウイルス粒子。
- 前記使用が、コールド腫瘍の処置における使用である、請求項53～57のいずれか一項記載の使用のためのウイルス粒子。
- 前記使用が、ホット腫瘍の処置における使用である、請求項53～58のいずれか一項記載の使用のためのウイルス粒子。
- 前記使用が、肛門がん、気管支がん、肺がん、子宮内膜がん、胆嚢がん、膀胱がん、肝細胞がん、精巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、結腸直腸がん、肝細胞がん、精巣がん、結腸がん、膀胱腫瘍、膀胱がん、膀胱腫瘍、肝細胞がん、肺がん、肺がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、直腸がん、喉頭がん、食道がん、胃がん、乳がん、腎臓がん、卵巣がん、膵臓がん、咽頭がん、中咽頭がん、前立腺がん、甲状腺がん、子宮頸がん、血管肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、悪性線維症組織球腫（malignant fibrosis histiocytoma）、リンパ腫、白血病、神経原性肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫からなる群より選択される腫瘍の処置における使用である、請求項53～59のいずれか一項記載の使用のためのウイルス粒子。
- 医薬の製造のための、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子の使用であって、該Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、該Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、該医薬が好ましくはがんの処置のための医薬である、前記使用。
- 疾患を処置する方法であって、
その必要がある対象へ、LCMV SセグメントおよびLCMV Lセグメントを含むウイルス粒子の有効量を投与する工程を含み、
該Sセグメントが、SEQ ID NO:4と少なくとも97%の配列同一性を有する糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、かつ、該Lセグメントが、SEQ ID NO:40と少なくとも90%の配列同一性を有するLタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、
ここで、該疾患が好ましくはがんである、
前記方法。
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