JP2024508699A - シクロ－ｌ－フェニルアラニル－ｌ－プロリンジペプチドを含む筋線維形成の促進または破骨細胞の分化抑制メカニズムによるサルコペニアまたは骨粗鬆症の治療用組成物 - Google Patents
シクロ－ｌ－フェニルアラニル－ｌ－プロリンジペプチドを含む筋線維形成の促進または破骨細胞の分化抑制メカニズムによるサルコペニアまたは骨粗鬆症の治療用組成物 Download PDFInfo
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Abstract
本発明はシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含むサルコペニアまたは骨粗鬆症の予防または治療用組成物に関するものである。本発明によるシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含むサルコペニアまたは骨粗鬆症の予防または治療用組成物は、骨密度の減少と関連する破骨細胞の分化を低下させ、筋線維の形成を促進することによって筋肉量を増加させて骨粗鬆症を予防または治療することができる。
Description
本発明は筋肉の減少と骨密度の減少による骨粗鬆症治療用組成物に関し、より詳細には、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む筋線維形成の促進または破骨細胞の分化抑制メカニズムによる骨粗鬆症治療用組成物に関する。
身体が老化するにつれて、体内脂肪が増加し、固形分と水分が減少し、特に骨中のカルシウムが消失して骨の質量が減少し、これにより骨密度が低くなる。また、軟骨組織が薄くなり、弾力が弱くなって関節炎を引き起こしたり、随意筋の容積が減少して運動能力が低下したりする。
身体の構造的な変化の中でも特に運動能力の減少と骨密度の減少は、老年の日常的な挙動を不便にするだけでなく、骨折の危険性を著しく高める要因となる。
股関節骨折とは股関節の周囲の骨折を意味し、主に重度の骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）を有する７０歳以上の高齢者で発生する。主要な原因は転倒であり、それに寄与する原因は様々であるが、筋力の弱化と骨密度の減少が主な原因として挙げられる。
人口の高齢化に伴い、骨粗鬆症と老人性サルコペニアへの関心が高まっているが、有意な解決策はまだ見つかっていない。具体的には、骨粗鬆症治療剤としてはホルモン剤、ビスホスホネート、ＲＡＮＫＬ抗体、ＰＴＨペプチドが使用されているが、使用対象および使用期間に制限があり、副作用が報告されている。また、付随的に従来の薬物は服用時の順応度が低いため、使用感の良い薬剤に対する臨床的ニーズが存在することも報告されている。また、筋肉量を増加させるために筋肉を減少させるミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）とアクチビン受容体（ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をターゲットとして生物学的製剤の薬物が開発されているが、比較的低い効能と副作用の問題が報告されている。
環状ジペプチド（ｃｙｃｌｉｃ ｄｉ－ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＤＰ）は二つのα－アミノ酸の間のペプチド結合により作られる一種のジペプチドである。一つのペプチド結合により作られた一般的なジペプチドと比較して、環状ジペプチドは二つのペプチド結合を有するため環構造を形成する。
このような小さい分子は物理化学的反応により生成されるか、微生物発酵の過程で副産物として得られる物質である。構成アミノ酸によって多様な類型の環状ジペプチドがあるが、共通する特徴が存在する。ペプチド結合は物理的および化学的反応に安定性を付与し、環構造は疎水性を帯びるようにして細胞内への浸透を促進することができる。
本発明者は哺乳類に対するｃＦＰの生理的影響を理解するためにｃＦＰの経口投与がマウスの筋骨格系に及ぼす影響を調査するために鋭意努力した結果、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドのサルコペニアの予防または治療、骨粗鬆症の予防または治療と関連する新たな用途を確認して本発明を完成するに至った。
本発明の一実施例による骨粗鬆症治療用組成物は、骨密度の減少と関連する破骨細胞の分化を低下させることによって骨粗鬆症を予防または治療することを目的とする。
本発明の他の実施例による骨粗鬆症治療用組成物は、筋線維の形成を促進することによってサルコペニアを予防または治療することを目的とする。
本発明の目的は上記に制限されるものではなく、言及されていないまた他の目的は以下の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解されるものである。
前記技術的課題を解決するための本発明の一態様によるサルコペニアまたは骨粗鬆症の予防または治療用組成物は、下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む。
ここで、組成物は薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含み得る。
本発明の他の態様による筋芽細胞の分化促進および／または破骨細胞の形成抑制のための組成物はシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む。
本発明のまた他の態様による医薬部外品組成物は、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む。
本発明のまた他の態様による筋肉増強および／または骨強化用健康機能性食品組成物は、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む。
本発明のまた他の態様による食用家畜の筋肉増強および／または骨強化のための飼料添加用組成物は、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む。
本発明のまた他の態様によれば、下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む筋線維形成促進用組成物が提供される。
本発明のまた他の態様によれば、下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含む破骨細胞分化抑制用組成物が提供される。
本発明において、「予防」という用語は、本発明による組成物の投与によるサルコペニアまたは骨粗鬆症の発病を抑制または遅延させるすべての行為をいう。
本発明において、「治療」という用語は、本発明による組成物の投与によるサルコペニアまたは骨粗鬆症の症状を抑制、軽減または緩和させるすべての行為をいう。
本発明の薬学的組成物は単一製剤として使用することもでき、公認されたサルコペニアまたは骨粗鬆症に対する治療効果を有すると知られている薬物をさらに含んで複合製剤として調製して使用することもできる。
本発明の薬学的組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含むものであり得る。
前記「薬学的に許容可能である」とは、生物体を著しく刺激せず、投与活性物質の生物学的活性および特性を阻害しないことを意味する。
前記担体は天然または非天然の担体であり得るが、剤形によって、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤のような多様な担体を使用して製剤化することができる。例えば、経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えばでん粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、単に賦形剤のほかにステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、流動パラフィン以外の各種賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としてはプロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレエートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としてはウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
前記薬学的組成物は錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤からなる群より選ばれるいずれか一つの剤形を有することができる。
また、本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含むことができる。
本発明において、「薬学的に有効な量」という用語は、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類および重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他医学分野における周知の要素によって決定することができる。
本発明の薬学的組成物は、単独治療剤として投与するか他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次または同時に投与することができる。さらに、単一または多重投与することができる。
前記要素をすべて考慮して副作用を引き起こさず、かつ最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、このような投与量は当業者であれば容易に決定することができる。
好ましくは本発明による薬学的組成物は、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを０．００１～１５００μｇ／ｍＬで含むことができ、より好ましくは０．００１～１０００μｇ／ｍＬで含むことができる。
他の実施様態として、本発明はシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを含むサルコペニアまたは骨粗鬆症の予防または改善用健康機能性食品組成物を提供する。
本発明において、「改善」という用語は、前記組成物を用いてサルコペニアまたは骨粗鬆症の疑いおよび発病個体の症状が好転するかまたは有益になるあらゆる行為をいう。
本発明の食品組成物は食品学的に許容可能な担体をさらに含むものであり得る。
前記食品組成物はサルコペニアまたは骨粗鬆症の抑制に役立つ機能を有することができる。
本発明の食品組成物は丸剤、粉末、顆粒、沈剤、錠剤、カプセル剤または液剤などの形態を含み、本発明のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドを添加できる食品の種類には特に制限はなく、例えば、各種飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがある。
前記食品組成物にはシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチド以外にもサルコペニアまたは骨粗鬆症の抑制活性を妨げない他の成分を追加することができ、その種類は特に制限されない。例えば、通常の食品のように様々な生薬抽出物、食品学的に許容可能な食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加の成分として含有することができる。
本発明で使用された「食品補助添加剤」という用語は、食品に補助的に添加できる構成要素を意味し、各剤形の健康機能食品を製造する際に添加されるものとして当業者が適宜選択して使用することができる。食品補助添加剤の例としては、各種栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および充填剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などが含まれるが、本発明の食品補助添加剤の種類は前記例によって制限されるものではない。
前記天然炭水化物の例は、ブドウ糖、果糖などの単糖類；マルトース、スクロースなどの二糖類；およびデキストリン、シクロデキストリンなどの多糖類と、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えばレバウディオサイドＡ）、グリチルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用することができる。
前記食品組成物は健康機能性食品の製造のために使用されるか、健康機能性食品に含まれ得る。
本発明で使用された「健康機能性食品」という用語は、人体に有用な機能性を有する原料や成分を使用して錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状およびピルなどの形態で製造および加工した食品をいう。ここで機能性とは人体の構造および機能に対する栄養素を調節するか生理学的作用などのような保健用途に有用な効果が得られることを意味する。本発明の健康機能性食品は当業界で通常用いられる方法により製造することができ、前記製造の際には当業界で通常添加する原料および成分を添加して製造することができる。また、一般の薬品とは異なり、食品を原料としているため薬品を長期服用時に発生しうる副作用などがない長所があり、携帯性にも優れる。
本発明の実施例による組成物を健康機能食品に配合して使用する場合、前記組成物をそのまま添加するか他の健康機能食品または健康機能食品成分と共に使用することができ、通常の方法に従って適切に使用することができる。有効成分の混合量は使用目的（予防、健康または治療的処置）に応じて適切に決定することができる。
一般に、食品の製造時に本発明のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドは、原料組成物中の０．１～１重量％、好ましくは０．５～１重量％の量で添加することができる。しかし、健康および衛生を目的とするかまたは健康調節を目的として長期間摂取する場合には、前記使用量を前記範囲以下にしてもよい。
前記食品の種類には特に制限はない。前記物質を添加できる食品の例としては肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味の健康機能性食品をすべて含む。
本発明の実施例による組成物を含むことができる健康機能食品の種類には特に制限はなく、具体的な例としては肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料およびビタミン複合剤などがあり、通常の意味の健康機能食品をすべて含み得、動物のための飼料として用いられる食品を含むことができる。
また、本発明の健康機能食品組成物が飲料の形態で使用される場合は、通常の飲料のように様々な甘味剤、香味剤または天然炭水化物などを追加の成分として含有することができる。前記天然炭水化物はブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールのような糖アルコールであり得る。前記天然炭水化物の比率は、これに制限されないが、本発明の実施例による組成物１００ｍｌ当たり、好ましくは約０．０１～０．０４ｇ、より好ましくは０．０２～０．０３ｇであり得る。前記甘味剤はソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤およびサッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤であり得る。
前記以外に、本発明の健康機能食品組成物は、前記種々の栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に天然果汁、果実飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。
また他の様態として、本発明は有効量のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドをサルコペニアまたは骨粗鬆症の発病可能性があるかまたはサルコペニアまたは骨粗鬆症に罹患している個体に投与する段階を含む、サルコペニアまたは骨粗鬆症の治療方法を提供する。
本発明において、前記個体はサルコペニアまたは骨粗鬆症が発病しているか発病する可能性があるヒトを含むすべての動物を意味し、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩をサルコペニアまたは骨粗鬆症が疑われる個体に投与することによって、個体を効率的に治療することができる。
具体的には、前記個体はサルコペニアまたは骨粗鬆症の治療が必要な個体であって、サルコペニアまたは骨粗鬆症の治療を目的とする個体であれば特に限定されず、いかなる個体にも適用が可能である。例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどのような非ヒト動物、ヒト、鳥類および魚類など任意の個体に適用することができる。
本発明で使用された「投与」という用語は、任意の適切な方法で個体に本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を導入することを意味し、本発明の実施例による投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与することができる。
本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の有効量は、薬学的に有効な量を意味する。
本発明において、「薬学的に有効な量」という用語は、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類および重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路および排出率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素およびその他医学分野における周知の要素によって決定することができる。
本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、単独治療剤として投与するか他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤と順次または同時に投与することができる。そして、単一または多重投与することができる。前記要素をすべて考慮して副作用を引き起こさず、かつ最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者であれば容易に決定することができる。
好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なり、適正な１日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で治療医によって決定されるが、一般に０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは０．０５～２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回ないし数回に分けて投与することができる。
投与の方式は、当業界の通常の方法であれば制限なく含む。例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内、髄腔内または脳血管内の注射によって投与されることができる。
本発明の一実施例による骨粗鬆症治療用組成物は、骨密度の減少と関連する破骨細胞の分化を低下させることによって骨粗鬆症を予防または治療することができる。
本発明の他の実施例による骨粗鬆症治療用組成物は、筋線維の形成を促進することによってサルコペニアを予防または治療することができる。
本発明の効果は上述したものに制限されず、言及されていないまた他の効果は以下の記載から本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者に明確に理解されるものである。
本発明の目的および効果、並びにそれらを達成するための技術的構成は、添付する図面と共に詳細に後述する実施例を参照すると明確になるであろう。本発明を説明するにあたり公知の機能または構成についての具体的な説明が本発明の要旨を不要に曖昧にすると判断される場合にはその詳細な説明を省略する。また、後述する用語は本発明における機能を考慮して定義された用語であり、これは使用者、運用者の意図または慣例などによって変わり得る。
しかし、本発明は、以下で開示する実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で実現することができる。本実施例は、単に本発明の開示を完全にし、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供するものであり、本発明は特許請求の範囲の範疇によってのみ定義される。したがって、その定義は本明細書全般の内容に基づいて行わなければならない。
筋肉の成長は個々の筋芽細胞間の結合による筋線維の形成に起因する。したがって、筋成長の向上は筋芽細胞の結合を誘導した環境で筋線維の形成程度により推定することができる。このために、対象の筋肉組織から筋芽細胞を分離および培養し、また、分離した筋芽細胞を用いて筋線維が形成されるかどうかを観察した。
次に、筋線維の形成の評価は筋線維を形成する筋芽細胞の数と形成された筋線維の厚さにより判断することができる。このために、先に筋線維染色により筋線維内の核を分別するために高倍率の光学顕微鏡を用いた。また、筋線維の厚さの測定を共に実施した。
破骨細胞の分化は個々の骨髄由来マクロファージの分化が進行するにつれて細胞間の結合により形成される。したがって、優先して骨髄由来マクロファージのみを分離および培養し、分離したマクロファージを用いて破骨細胞に分化させた。
次に、分化した破骨細胞の分化程度を把握するためにＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ：ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色法（ｓｔａｉｎ ａｓｓｙ）を用いた。マクロファージが破骨細胞に分化するとＴＲＡＰを生成し、これを染色することによって破骨細胞の分化程度を定量化することができる。また、破骨細胞の成熟程度を確認するためには破骨細胞を構成している細胞の個数を共に把握した。上記のように破骨細胞の分化程度は破骨細胞の核内個数とＴＲＡＰ染色（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色：ｔａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｔａｉｎ）の二つの指標を用いて分析した。
次に、本発明の実施例により、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリン（ｃＦＰ）の口腔内投与による筋肉重量の増加および骨量の増加を測定した。筋肉重量の測定は解剖学的筋肉分類に従ってマウスの筋肉を分離して重量を測定した。また、マウスの大腿骨に対する海綿骨分析は高解像度のマイクロＣＴ（ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏ－ＣＴ，ＳＭＸ－９０ＣＴ ｓｙｓｔｅｍ）を用いて行い、大腿骨の成長板を基準として１ｍｍ下部を分析の開始点とし、開始点から骨下方に１．５ｍｍまで分析した。それぞれの指標は次を意味する。骨体積／全体体積（ＢＶ／ＴＶ，％）、骨面積／骨体積（ＢＳ／ＢＶ、１／ｍｍ）、海綿骨の厚さ（Ｔｂ．Ｔｈ，ｍｍ）、海綿骨の単位面積当たりの数（Ｔｂ．Ｎ、１／ｍｍ）、海綿骨の間隙度（Ｔｂ．Ｓｐ，ｍｍ）。
以下では本発明の実施例について具体的に説明する。
実施例１：ｃＦＰ処理による筋芽細胞の分化
イ．筋芽細胞（Ｍｙｏｂｌａｓｔ）の準備
５週齢の雄ＣｒｌｊＯｒｉ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを犠牲にした後、後肢筋肉組織を得た。筋肉組織をメスで５分間細かく切り刻んだ。切り刻んだ筋肉溶液を３７℃で６０分間培養した後に１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた細胞を塩基性ＦＧＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）存在下に２０％熱不活性化されたウマ血清と５０ユニット／ｍＬのペニシリンを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ－１０培地にゼラチンコーティングをせずに１時間細胞培養皿に塗抹した。１時間後、浮遊細胞をゼラチンコーティングをせずに２次細胞培養皿に移して１時間培養した。この工程を繰り返した後に細胞をゼラチンコーティング皿に移した。培養された細胞は筋芽細胞として使用した。
５週齢の雄ＣｒｌｊＯｒｉ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを犠牲にした後、後肢筋肉組織を得た。筋肉組織をメスで５分間細かく切り刻んだ。切り刻んだ筋肉溶液を３７℃で６０分間培養した後に１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた細胞を塩基性ＦＧＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）存在下に２０％熱不活性化されたウマ血清と５０ユニット／ｍＬのペニシリンを含有するＨａｍ’ｓ Ｆ－１０培地にゼラチンコーティングをせずに１時間細胞培養皿に塗抹した。１時間後、浮遊細胞をゼラチンコーティングをせずに２次細胞培養皿に移して１時間培養した。この工程を繰り返した後に細胞をゼラチンコーティング皿に移した。培養された細胞は筋芽細胞として使用した。
ロ．筋芽細胞の分化およびＬＡＤＤ染色（筋線維形成実験）
筋肉組織から得た筋芽細胞を１０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で前処理された４８ウェル（ｗｅｌｌ）組織培養プレートにウェル当たり３×１０４個ずつ培養した。約２４時間培養した後に成長培養液を５％熱不活性化されたウマ血清および５０ユニット／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＥＭ融合培地で追加で培養した。培地は２日に一度交換した。培養後４８ウェルの細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄して７０％エタノールを用いて固定させた。エタノールが除去されてトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）とフクシン（Ｆｕｃｈｓｉｎ）を含むＬＡＤＤ染色試薬を用いて形成された筋線維を染色した。１分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後に染色された細胞は精製水でＬＡＤＤ染色溶液が水に浸出しなくなるまで蒸留水で洗浄した。洗浄後に細胞を室温で１０分間乾燥した。
筋肉組織から得た筋芽細胞を１０％マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で前処理された４８ウェル（ｗｅｌｌ）組織培養プレートにウェル当たり３×１０４個ずつ培養した。約２４時間培養した後に成長培養液を５％熱不活性化されたウマ血清および５０ユニット／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＥＭ融合培地で追加で培養した。培地は２日に一度交換した。培養後４８ウェルの細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄して７０％エタノールを用いて固定させた。エタノールが除去されてトルイジンブルー（Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ｂｌｕｅ）とフクシン（Ｆｕｃｈｓｉｎ）を含むＬＡＤＤ染色試薬を用いて形成された筋線維を染色した。１分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した後に染色された細胞は精製水でＬＡＤＤ染色溶液が水に浸出しなくなるまで蒸留水で洗浄した。洗浄後に細胞を室温で１０分間乾燥した。
図１はｃＦＰ処理濃度による筋芽細胞の筋線維形成の促進結果を示すグラフである。図１を参照すると、ｃＦＰで処理された筋芽細胞の培養培地はビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）が処理された筋芽細胞に比べて筋芽細胞の融合を促進したことがわかる（（Ａ）ＬＡＤＤ染色で染色された筋管（ｍｙｏｔｕｂｅ）。スケールバー＝１００μｍ。；（Ｂ）ビヒクルおよび濃度別ｃＦＰ処理による筋管直径と筋管の核数。ＡＮＯＶＡ－Ｔｕｋｅｙテストが行われた）。
実施例２：ｃＦＰの処理による破骨細胞形成実験
イ．μＣＴ分析
マウス大腿骨を高解像度μＣＴ（ＳＭＸ－９０ＣＴシステム；Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で分析した。μＣＴのスキャンイメージはＶＧ Ｓｔｕｄｉｏ ＭＡＸ １．２．１プログラム（Ｖｏｌｕｍｅ Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により再構成された。それぞれの３次元イメージはＴＲＩ／３Ｄ－ＶＩＥ（ＲＡＴＯＣ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて骨体積、皮質骨体積、骨梁数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）および骨梁間隙（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を測定するために分析した。３ＤイメージはＣＴボリュームプログラム（バージョン１．１１，ＳｋｙＳｃａｎ）から得た。
マウス大腿骨を高解像度μＣＴ（ＳＭＸ－９０ＣＴシステム；Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で分析した。μＣＴのスキャンイメージはＶＧ Ｓｔｕｄｉｏ ＭＡＸ １．２．１プログラム（Ｖｏｌｕｍｅ Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により再構成された。それぞれの３次元イメージはＴＲＩ／３Ｄ－ＶＩＥ（ＲＡＴＯＣ Ｓｙｓｔｅｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて骨体積、皮質骨体積、骨梁数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）および骨梁間隙（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を測定するために分析した。３ＤイメージはＣＴボリュームプログラム（バージョン１．１１，ＳｋｙＳｃａｎ）から得た。
ロ．骨髄由来マクロファージ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＢＭＭ）の準備
５週齢の雄ＣｒｌｊＯｒｉ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを犠牲にした後、マウスから大腿骨と脛骨を採取した。骨髄細胞は大腿骨と脛骨から骨髄を洗浄して得た。非付着性骨髄細胞をα－ＭＥＭと共に３日間Ｍ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）で追加培養して骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を生成した。
５週齢の雄ＣｒｌｊＯｒｉ：ＣＤ１（ＩＣＲ）マウスを犠牲にした後、マウスから大腿骨と脛骨を採取した。骨髄細胞は大腿骨と脛骨から骨髄を洗浄して得た。非付着性骨髄細胞をα－ＭＥＭと共に３日間Ｍ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）で追加培養して骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）を生成した。
ハ．破骨細胞分化およびＴａｒｔｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＲＡＰ）染色
破骨細胞を生成するために、ＢＭＭ（４×１０４細胞／ウェル）をＭ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）およびＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下に１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０ユニット／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含有するα－ＭＥＭ完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）で４日間４８ウェルプレートで培養した。培地は毎３日ごとに交換した。多核細胞（ＭＮＣ）は４日目に観察された。細胞を１０％ホルマリン溶液に２０分間固定して０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１分間透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）させた。ＰＢＳで２回洗浄した後にシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のＬｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて製造元のマニュアルに従って細胞を染色した。細胞内の核の個数が５個以上である破骨細胞を基準としてウェル当たりの分化した破骨細胞の数を把握して分化程度を評価した。
破骨細胞を生成するために、ＢＭＭ（４×１０４細胞／ウェル）をＭ－ＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）およびＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下に１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５０ユニット／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含有するα－ＭＥＭ完全培地（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｍｅｄｉｕｍ）で４日間４８ウェルプレートで培養した。培地は毎３日ごとに交換した。多核細胞（ＭＮＣ）は４日目に観察された。細胞を１０％ホルマリン溶液に２０分間固定して０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１分間透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）させた。ＰＢＳで２回洗浄した後にシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）のＬｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて製造元のマニュアルに従って細胞を染色した。細胞内の核の個数が５個以上である破骨細胞を基準としてウェル当たりの分化した破骨細胞の数を把握して分化程度を評価した。
図２はｃＦＰ処理濃度による破骨細胞の分化抑制結果を示すグラフである。図２を参照すると、ｃＦＰの濃度に依存的に骨髄由来マクロファージの破骨細胞への分化が抑制されたことが確認された。
実施例３：ｃＦＰを口腔摂取した後の筋肉および海綿骨分析
イ．実験用マウスの準備
動物研究は動物研究のガイドラインに従って実施された。すべての実験手順はソウル大学校動物病院の動物管理委員会の承認を受けた。４週齢または６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスはオリエントバイオ社（ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ，城南，韓国）から購入して一定の温度（２２℃）と湿度（５５％）および１２時間周期で明暗が維持されるＳＰＦ動物施設に保管された。すべての動物に自由給餌システム（ｆｒｅｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）が提供された。経口胃管栄養（ｏｒａｌ ｇａｖａｇｅ）は２４時間ごとにｃＦＰをステンレス鋼材質の供給管を介して提供し、１回投与時に溶液１００μｌを経口投与した。代替手段としてｃＦＰは飲用水と混合して自由給水システムにより投与された。マウスは二酸化炭素安楽死室で犠牲にした。
動物研究は動物研究のガイドラインに従って実施された。すべての実験手順はソウル大学校動物病院の動物管理委員会の承認を受けた。４週齢または６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスはオリエントバイオ社（ＯｒｉｅｎｔＢｉｏ，城南，韓国）から購入して一定の温度（２２℃）と湿度（５５％）および１２時間周期で明暗が維持されるＳＰＦ動物施設に保管された。すべての動物に自由給餌システム（ｆｒｅｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｉｎｋｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）が提供された。経口胃管栄養（ｏｒａｌ ｇａｖａｇｅ）は２４時間ごとにｃＦＰをステンレス鋼材質の供給管を介して提供し、１回投与時に溶液１００μｌを経口投与した。代替手段としてｃＦＰは飲用水と混合して自由給水システムにより投与された。マウスは二酸化炭素安楽死室で犠牲にした。
ロ．筋肉採取および重量測定
ＣＯ２ガスを用いてマウスを安楽死させた後に筋肉の解剖学的分類に従って大胸筋（ｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ ｍａｊｏｒ ｍｕｓｃｌｅ）、大腿四頭筋（Ｑｕａｄｒｉｃｅｐｓ ｍｕｓｃｌｅ）、腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）を分離する。分離した筋肉はマイクロバランスを用いて重量を測定した。
ＣＯ２ガスを用いてマウスを安楽死させた後に筋肉の解剖学的分類に従って大胸筋（ｐｅｃｔｏｒａｌｉｓ ｍａｊｏｒ ｍｕｓｃｌｅ）、大腿四頭筋（Ｑｕａｄｒｉｃｅｐｓ ｍｕｓｃｌｅ）、腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ ｍｕｓｃｌｅ）を分離する。分離した筋肉はマイクロバランスを用いて重量を測定した。
ハ．大腿骨の海綿骨分析
安楽死させたマウスから分離した大腿骨をｍｉｃｒｏ－ＣＴ機械を用いて大腿骨の全体的な分析データを確保した。確保したデータのうちマウスの成長板の末端方向に１ｍｍを開始点として末端方向に１．５ｍｍを範囲に指定した後、海綿骨部分を再形成および分析して海綿骨の指標を得た。
安楽死させたマウスから分離した大腿骨をｍｉｃｒｏ－ＣＴ機械を用いて大腿骨の全体的な分析データを確保した。確保したデータのうちマウスの成長板の末端方向に１ｍｍを開始点として末端方向に１．５ｍｍを範囲に指定した後、海綿骨部分を再形成および分析して海綿骨の指標を得た。
図３は胃管栄養法によるｃＦＰの経口投与およびそれによるマウスの筋肉質量の増加を示すグラフであり、図４はｃＦＰを自由給水（ｆｒｅｅ ｄｒｉｎｋｉｎｇ）とした場合のマウスの大腿骨の海綿骨（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｆｅｍｕｒ）に対する効果を示すグラフである。
図３を参照すると、胃管栄養法によるｃＦＰの経口投与は対照群に比べてマウスの筋肉質量を増加させたことが確認された。また、図４を参照すると、ｃＦＰ投与グループのＢＶ／ＴＶ（骨体積／総骨体積：ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ／ｔｏｔａｌ ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ）、Ｔｂ．Ｔｈ（骨梁幅：ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、Ｔｂ．Ｎ（骨梁数：ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）の海綿骨指数は有意に高く、精製水を投与したグループのＢＳ／ＢＶ（骨表面積／海綿骨体積：ｂｏｎｅ ｓｕｒｆａｃｅ／ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ）、ＴＢ．Ｐｆ（海綿骨パターン因子：ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｆａｃｔｏｒ）およびＴｂ．Ｓｐ（骨梁間隙：ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）では低い海綿骨指数が確認された。
前記実施例をまとめると、シクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリンジペプチドは、サルコペニアまたは骨粗鬆症の原因になる筋肉の減少および破骨細胞の分化と関連して、口腔内投与により生体の筋肉の量を増加させ、破骨細胞の分化を低下させ得ることが確認された。
本明細書と図面には本発明の好ましい実施例について開示し、特定の用語が使用されたが、これは単に本発明の技術内容を容易に説明し、発明の理解を助けるための一般的な意味で使用されたものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本明細書に開示された実施例の他にも本発明の技術的思想に基づく他の変形例を実施できることは本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に自明である。
本発明はサルコペニアまたは骨粗鬆症の予防または治療に適用することができる。
Claims (7)
- 下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリン（Ｃｙｃｌｏ （Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ））ジペプチドを含むサルコペニアまたは骨粗鬆症の予防または治療用の組成物。
- 前記組成物は薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
- 下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリン（Ｃｙｃｌｏ （Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ））ジペプチドを含むサルコペニアまたは骨粗鬆症の予防または改善用の医薬部外品組成物。
- 下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリン（Ｃｙｃｌｏ （Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ））ジペプチドを含む筋肉増強および／または骨強化用の健康機能性食品組成物。
- 下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリン（Ｃｙｃｌｏ （Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ））ジペプチドを含む食用家畜の筋肉増強および／または骨強化のための飼料添加用の組成物。
- 有効量の下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリン（Ｃｙｃｌｏ （Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ））ジペプチドを、それを必要とする個体に投与する段階を含むサルコペニアまたは骨粗鬆症の治療方法。
- サルコペニアまたは骨粗鬆症の治療用医薬製造のための下記化学式のシクロ－Ｌ－フェニルアラニル－Ｌ－プロリン（Ｃｙｃｌｏ （Ｌ－ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ－Ｌ－ｐｒｏｌｉｎｅ））ジペプチドの使用。
Applications Claiming Priority (3)
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| PCT/KR2021/020154 WO2022173123A1 (ko) | 2021-02-09 | 2021-12-29 | 시클로엘페닐알라닐엘프롤린 디펩타이드를 포함하는 근섬유 형성의 촉진 또는 파골세포의 분화억제 기전을 통한 근감소증 또는 골다공증 치료용 조성물 |
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