JP2024073042A - 電気泳動の移動度を改変する修飾基質を用いた遺伝子検出 - Google Patents
電気泳動の移動度を改変する修飾基質を用いた遺伝子検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024073042A JP2024073042A JP2022184029A JP2022184029A JP2024073042A JP 2024073042 A JP2024073042 A JP 2024073042A JP 2022184029 A JP2022184029 A JP 2022184029A JP 2022184029 A JP2022184029 A JP 2022184029A JP 2024073042 A JP2024073042 A JP 2024073042A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- base extension
- extension reaction
- capillary electrophoresis
- fluorescent dye
- substrate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 239000000758 substrate Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 56
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 42
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 41
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 38
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000037230 mobility Effects 0.000 claims description 34
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 19
- 108091029845 Aminoallyl nucleotide Proteins 0.000 claims description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 5
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N tetraethylene glycol Chemical compound OCCOCCOCCOCCO UWHCKJMYHZGTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical class C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 2
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 2
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 2-(3-amino-6-iminoxanthen-9-yl)benzoic acid;hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O JNGRENQDBKMCCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC(OC)=C(O)C(Cl)=C1OC1=C2C=C(OC)C(O)=C1Cl IDLISIVVYLGCKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- FNEZBBILNYNQGC-UHFFFAOYSA-N methyl 2-(3,6-diamino-9h-xanthen-9-yl)benzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(N)C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 FNEZBBILNYNQGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】既存の蛍光標識1塩基伸長反応法の変異検出を高感度化するための方法及び手段を提供すること。【解決手段】蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質の存在下において、標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う工程、前記1塩基伸長反応の反応産物をキャピラリー電気泳動に供する工程、前記蛍光色素のシグナルに基づいて前記1塩基伸長反応によって取り込まれた基質の種類を判別し、前記キャピラリー電気泳動の移動度に基づいて前記標的遺伝子を同定する工程を含む1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出方法において、前記基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含むことを特徴とする方法。【選択図】なし
Description
本発明は、遺伝子を検出するための方法、試薬及びキットに関する。具体的には、本発明は、1塩基伸長反応による遺伝子検出のための方法、試薬及びキットに関する。
ゲノムには多様な個体差が存在しており、それらゲノム配列の違いは疾患や薬剤応答の指標として有用なバイオマーカとなることがある。
ゲノム変異の検出方法は主として、PCRによる検出、シーケンサを用いた塩基配列解析、1塩基伸長反応解析法（特許文献１）が用いられている。
近年のゲノム科学の進展により、大規模な解析が可能な超並列シーケンサを利用したゲノム変異のパネル検査が利用可能となった。多数の遺伝子変異を同時に解析することにより、多くの疾患や治療法選択の判断を同時に可能となり、なかでも液体生検によるがん検診は今後大きな進展が期待されている。液体生検は血液を利用した検査であり、“侵襲性が低いこと”、“全身のがんを検査対象にできること”から新しいがん検診として研究が進められている（非特許文献１）。
一方、これらの液体生検を用いたがん検診技術の社会実装を想定するとその解析コストが課題である。超並列シーケンサを用いたがんパネル検査による治療法選択はすでに日本において保険適用がなされているが、56万円という高額な検査費用となっている（診療報酬算定、D006-19 がんゲノムプロファイリング検査）。高額ながん治療において有効な治療法を選択する場面であれば検査費用が高額であってもその利用が認められるが、検診という場面においては現実的な検査費用ではない。比較的高額な内視鏡やCTをもちいた大腸がん検診であっても日本国内の検査費用は数万円程度であることを考えると超並列シーケンサに代替する低コストな多変異検査技術の開発が液体生検によるがん検診の社会実装に必要である。
Cohen, J.D. et al., Science 第359巻第926-930頁 (2018)
Coutinho, A. et, al., PLOS ONE 第9巻第3号 e93292 (2014)
Dias-Santagata, D. et al., EMBO Molecular Medicine 第2巻第146-158頁 (2010)
蛍光標識1塩基伸長反応法は、電気泳動の移動度を遺伝子識別の指標とするため、使用するプライマー長の長さを調整したり、それらプライマーに移動度を変更する標識を行うことによって信号が検出される位置を変えることにより、複数の遺伝子を標的とした多項目同時検出が可能である。例えば、Coutinhoらの文献（非特許文献２）では26 plexの同時検出がなされ、Dias-Santagataらの文献（非特許文献３）では、5～8種類の変異を同時に検出し、この分析を8回行うことにより合計58種類の遺伝子検出が行われている。
この技術では信号の検出される位置は検出に使用するプライマーの移動度で規定されており、すなわち標的とする遺伝子を識別する指標となっている。また、プライマーによって規定された位置に観察される蛍光波長の種類が塩基の種類を判別する指標である。
1塩基伸長反応はプライマーに対して蛍光修飾された1塩基の取り込みを行う反応であり、反応後のDNA分子の鎖長はプライマーに1塩基加えた鎖長となっている。核酸の電気泳動における移動度を決定する主要因は鎖長であることから、1塩基伸長反応によって得られるDNA分子は野生型又は変異型のどちらであっても同じ鎖長である。
生殖細胞変異であればヘテロ型であっても野生型と変異型の存在比は1：1であり、同じ座標位置に2種の蛍光信号が重なっても容易にその存在を判定することが可能であった。一方、腫瘍組織で見られる体細胞変異では変異遺伝子の存在比率に変動が見られ、存在比の低い変異を検出する技術が求められている。このような高感度な変異検出において野生型に由来する大きな蛍光信号の座標位置から、同一座標で重なる微量の変異型に由来する小さな蛍光信号の有無を判定することは困難であった。
本発明は、既存の蛍光標識1塩基伸長反応法の変異検出を高感度化するための方法及び手段を提供することを目的とする。
課題解決方法の検討を行った結果、本発明者らは少なくとも1つの基質がヌクレオチドに蛍光色素と電気泳動の移動度を改変する化学修飾を有する1塩基伸長反応とすることで微量の変異検出能を改善する効果が得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
一態様において、本発明は、
蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質の存在下において、標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う工程、
前記1塩基伸長反応の反応産物をキャピラリー電気泳動に供する工程、
前記蛍光色素のシグナルに基づいて前記1塩基伸長反応によって取り込まれた基質の種類を判別し、前記キャピラリー電気泳動の移動度に基づいて前記標的遺伝子を同定する工程
を含む1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出方法において、
前記基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含むことを特徴とする方法に関する。
蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質の存在下において、標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う工程、
前記1塩基伸長反応の反応産物をキャピラリー電気泳動に供する工程、
前記蛍光色素のシグナルに基づいて前記1塩基伸長反応によって取り込まれた基質の種類を判別し、前記キャピラリー電気泳動の移動度に基づいて前記標的遺伝子を同定する工程
を含む1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出方法において、
前記基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含むことを特徴とする方法に関する。
別の態様において、本発明は、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子、蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質を含む、1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出に使用するための試薬に関する。
さらに別の態様において、本発明は、上記試薬を含む、遺伝子検出用キットに関する。
本発明により、高感度に標的遺伝子を検出するための方法及び試薬が提供される。特に微量にしか存在しない標的遺伝子を他の遺伝子と明確に区別して高感度に検出することが可能となる。よって、本発明は、遺伝子検出が望まれる分野において有用である。
前述した以外の課題、構成及び効果は，以下の実施の形態の説明により明らかにされる。
本発明は以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本発明の思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で、その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。
本明細書において単数形で表される構成要素は、特段文脈で明らかに示されない限り、複数形を含むものとする。
本発明は、1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動（CE）の組み合わせによる遺伝子検出において、電気泳動の移動度を改変する修飾分子を有する基質を用いた1塩基伸長反応を行う。具体的には、1塩基伸長反応によって取り込まれる4種のヌクレオチド基質において電気泳動におけるDNA分子の移動度を互いに分離することにより、微量な塩基に由来するシグナルの波形の検出感度を向上する。
したがって、一態様において、本発明は、1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出方法を提供し、該方法は、
蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質の存在下において、被検試料及び標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う工程、
前記1塩基伸長反応の反応産物をキャピラリー電気泳動に供する工程、
前記蛍光色素のシグナルに基づいて前記1塩基伸長反応によって取り込まれた基質の種類を判別し、前記キャピラリー電気泳動の移動度に基づいて前記標的遺伝子を同定する工程
を含み、
前記基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含む。
蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質の存在下において、被検試料及び標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う工程、
前記1塩基伸長反応の反応産物をキャピラリー電気泳動に供する工程、
前記蛍光色素のシグナルに基づいて前記1塩基伸長反応によって取り込まれた基質の種類を判別し、前記キャピラリー電気泳動の移動度に基づいて前記標的遺伝子を同定する工程
を含み、
前記基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含む。
本発明は、1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出方法に基づくものであり、このような遺伝子検出方法は、例えば非特許文献２及び３に記載のように当該技術分野で周知である。
1塩基伸長反応は、蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質の存在下において、被検試料及び標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて行われるが、本発明では、その基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含む。
被検試料は、標的遺伝子について検出しようとする試料であれば特に限定されるものではなく、デオキシリボ核酸（DNA）、例えばゲノムDNA、cDNA、及びリボ核酸（RNA）、例えばメッセンジャーRNA（mRNA）、並びにそれらの断片が含まれる。本発明においては、被検試料として、例えばセルフリーDNA（cfDNA、血中を遊離しているDNA）、循環腫瘍DNA（ctDNA）を使用することが好ましい。試料からの核酸の調製は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば、血液や細胞から標的核酸を調製する場合には、Proteinase Kのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Tween及びSDSといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞を溶解し、それに含まれる核酸、すなわちDNA及びRNAを溶出することができる。RNAを調製する場合には、上記の細胞溶解により溶出された核酸のうち、DNAをDNA分解酵素（DNase）により分解し、核酸としてRNAのみを含む試料が得られる。mRNAを調製する場合には、mRNAはポリA配列を含むことから、上記のように調製したRNA試料から、ポリT配列を含むDNAプローブを用いてmRNAのみを捕捉することができる。このような核酸の調製を行うために、多数のメーカーからキットが販売されており、目的とする核酸を簡便に精製することが可能である。
また、標的遺伝子に特異的なプライマーを準備する。標的に特異的なプライマーは、DNA又はRNAのいずれでもよく、被検試料及び標的遺伝子の種類、1塩基伸長反応に使用されるポリメラーゼの種類に応じて決定される。好ましくは、プライマーはDNAであり、被検試料としてDNA又はmRNAを鋳型とした1塩基伸長反応が行われる。
プライマーは、標的遺伝子（又は標的領域）に特異的に結合する配列を有する、すなわち標的遺伝子（又は標的領域）に対して相補的な配列を有するように設計される。プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、10塩基以上が好ましく、さらに好ましくは15～50塩基であり、さらに好ましくは15～30塩基、例えば約20塩基である。また設計の際には、プライマーのGC含量とプライマーの融解温度（Tm）を確認することが好ましい。Tmとは、任意の核酸鎖の50％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となる被検試料とプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Tmの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。設計されたプライマーは、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。
本発明の方法では、上述した基質の存在下において、被検試料及び標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う。1塩基伸長反応は当技術分野で公知であり、典型的にはポリメラーゼを用いた1塩基伸長反応である。使用するポリメラーゼは、鋳型（被検試料）の種類及び使用するプライマーの種類によって選択される。例えば、DNA又はRNAを鋳型としたDNAプライマーを用いた1塩基伸長反応には、それぞれDNA依存性又はRNA依存性DNAポリメラーゼが使用される。
1塩基伸長反応は当該技術分野において広く知られており、例えば非特許文献３等に、サイクル反応により効率的に1塩基を伸長させる方法などが説明されている。
標的遺伝子が存在する場合には、この標的遺伝子に特異的なプライマーがハイブリダイゼーションし、プライマーの3'末端部分からポリメラーゼの合成反応によってヌクレオチドが基質として取り込まれる。この時、取り込まれるヌクレオチド（基質）として、例えばジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を用いることにより、合成反応は1塩基伸長のみで終了する。
本発明では、そのような基質として蛍光色素（標識）及びヌクレオチドを含む基質を使用し、使用する基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含む。蛍光色素（標識）は、基質が取り込まれたか否かを簡便に検出するため、又は取り込まれた塩基の種類を判定するために有用であり、当技術分野で公知の蛍光色素を使用することができる。蛍光色素としては、例えば限定されるものではないが、フルオレセン（FITC）、スルホローダミン（TR）、テトラメチルローダミン（TRITC）、カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、NED、5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM）、5'-ヘキサクロロフルオレセインCE-ホスホロアミダイト（HEX）、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン（JOE）、5'-テトラクロロフルオレセインCE-ホスホロアミダイト（TET）、ローダミン110（R110）、ローダミン6G（R6G）、VIC(登録商標)、ATTO系、Alexa Fluor(登録商標)系、Cy系など、また泳動サイズにずれを生じない蛍光色素として、dR110（carboxy-dichloro rhodamine 110）、dR6G（dihydro rhodamine 6G）、dTAMRA（Tetramethyl rhodamine）、dROX（carboxy-X-rhodamine）などが挙げられる。例えば塩基の種類を判定しようとする場合には、4種類の塩基と参照用（参照ラダーDNAから塩基長を検出補正するため）の5種類を識別するために、異なる波長で励起かつ検出される5種類の蛍光色素を組み合わせて使用することができる。このような蛍光色素の種類や導入方法等に関しては、特に限定されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。
キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子は、サイズにより移動度が改変するため、基質のサイズ（嵩）を変更する修飾分子であれば特に限定されるものではない。例えば、蛍光色素とヌクレオチドとを連結するリンカーをそのような修飾分子として使用することができる。リンカーもまた特に限定されるものではなく、例えば、実施例で使用したアミノアリル基、修飾されたヌクレオチド分子として市販若しくは受注合成されているAmino-Modifier C6、Amino Modifier C12、3' Amino Modifier、3' C3 Spacer、トリエチレングリコールスペーサー（triethylene glycol spacer）、TEG（tetra-ethlene glycol）修飾ヌクレオチド、PEG修飾ヌクレオチドなどを利用することができる。アミノアリル基等を修飾分子として使用する場合、修飾基を1～8個、好ましくは1～5個連結して使用することにより、基質のサイズを適宜調整してもよい。
標的遺伝子の有無は、この1塩基伸長反応が生じるか否かで判定することができ、標的遺伝子における特定の塩基は、1塩基伸長した部分に取り込まれた塩基の種類に基づいて判定することが可能となる。例えば、一塩基多型（SNP）の検出を目的とする場合には、そのSNPの上流部分に特異的に結合するプライマーを設計し、被検試料にプライマーをハイブリダイズさせ、異なる蛍光色素が結合されたヌクレオチドを基質として使用して1塩基伸長反応を行う。取り込まれた塩基の種類を蛍光色素に基づいて判定することにより、被検試料に含まれるSNPを検出することができる。
1塩基伸長反応後、得られた反応産物をキャピラリー電気泳動（CE）に供して解析する。CEは、導入された成分を荷電、大きさ及び形状などに基づく移動度の差異で分離する手法である。移動度に基づいて、標的遺伝子の種類（プライマーの種類に基づく）を同定することができる。また本方法では、移動度を改変する修飾分子を利用するため、蛍光色素のシグナルに基づいて標的遺伝子の有無又は標的遺伝子における特定の塩基の種類（1塩基伸長反応によって取り込まれた基質の種類に基づく）の判別の際にシグナルピークの重なりを排除することによって、より高精度に取り込まれた基質の種類を判別できる。このようにして、標的遺伝子を検出し、及び／又は標的遺伝子の塩基を決定することができる。
上述したように、塩基識別用の蛍光色素に加えて電気泳動の移動度を改変する修飾分子を加えたヌクレオチドを1塩基伸長反応の基質とすることにより、反応によって得られたDNA分子の電気泳動移動度が取り込まれる塩基の種類によって異なる値となり、つまり電気泳動装置によって観察される蛍光信号の座標位置が塩基の種類によって異なる効果により野生型と変異型の蛍光信号波長のピーク位置分離を行うことによって、変異型信号の検出を高感度化できる。
さらなる態様において、本発明は、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子、蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質を含む、1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出に使用するための試薬を提供する。
基質は、上述した通りであり、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子（例えば、ヌクレオチドと蛍光色素とを連結するリンカー）、蛍光色素及びヌクレオチドを含む。一実施形態では、修飾分子としてアミノアリル基を使用することができる。
上記試薬は、複数のヌクレオチドに対応する複数の基質を含んでもよく、かかる場合、それぞれの基質が、異なる種類のヌクレオチドがキャピラリー電気泳動の移動度により区別可能なように、修飾分子を含む。
別の態様において、本発明は、上記試薬を含む、遺伝子検出用キットを提供する。本キットは、試薬として、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子、蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質を少なくとも含む。
本キットは、上記試薬に加えて、反応液を構成するバッファー、酵素類（ポリメラーゼ、逆転写酵素など）、校正用の標準試料などを含んでもよい。基質又は試薬をキットとして提供することにより、遺伝子検出をより迅速かつ簡便に行うことが可能となる。
［実施例１］
本実施例では、蛍光色素を結合させたヌクレオチド基質、及び蛍光色素をリンカー（アミノアリル基）を介して結合させたヌクレオチド基質を使用して1塩基伸長反応後のキャピラリー電気泳動による移動度を調べた。
本実施例では、蛍光色素を結合させたヌクレオチド基質、及び蛍光色素をリンカー（アミノアリル基）を介して結合させたヌクレオチド基質を使用して1塩基伸長反応後のキャピラリー電気泳動による移動度を調べた。
ヌクレオチド基質として、アデニン検出用にdR6G修飾ddATP、チミン検出用に以下の表1に記載の修飾を施したdUTPを混合して用いた。表1中、「X」はアミノアリル基であり、「XX」はアミノアリル基が2つ存在していることを示している。実験番号2ではチミン検出用基質として2つのアミノアリル基を持つdUTP-XX-Texas redを使用し、実験番号4ではチミン検出用基質として2つのアミノアリル基を持つdUTP-XX-Cy3を使用した。実験番号3と実験番号4で使用したdUTP-Cy3とdUTP-XX-Cy3の構造を図1に示した。
52merのオリゴヌクレオチド（EGFR L858：CAAGCTATTTAGGTGACACTATAGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC）をプライマーとし、野生型遺伝子としてチミン（T）、変異型遺伝子としてウラシル（U）の塩基を検出するために2種の鋳型DNA分子（ヒト由来）を10：1の比率で混合し1塩基伸長反応を行った。野生型及び変異型それぞれの鋳型DNA分子と得られる反応産物の配列を表2に示す（検出する1塩基伸長塩基を太字で表記している）。1塩基伸長反応は、1μLの10×Therminator buffer (NEB)、0.5μLのTherminator (NEB)、1μLのヌクレオチド基質（10μM）、1μLの鋳型DNA（100 pmol/uL）、1μLの光架橋プライマー、5.5μLのD.W.を混合組成とし、サーマルライクラーを用いた（96℃，10秒）→（50℃，5秒）→（60℃，30秒）の熱サイクルを40回繰り返すことによって行った。反応後の試料溶液をアルカリフォスファターゼ（TAKARA）にて精製処理を行った後、CEシーケンサであるDS3000（日立ハイテク）を用いて分析した。ヌクレオチド基質として、チミンに対応するアデニン検出用にdR6G修飾ddATP、ウラシルに対応するチミン検出用に表1に記載の修飾を施したdUTPを混合して用いた。
検出された蛍光信号データを図２に示した。
断片長のサイズの目安である2つのサイズマーカ―（200、201）に挟まれた領域に1塩基伸長反応産物に由来する信号を示す波形が観察された。実験1では観察された波形は1つ（202）であった。反応時には変異型として10分の1量のアデニン鋳型を加えているが、実験1の標識組み合わせでは判別が困難である。
断片長のサイズの目安である2つのサイズマーカ―（200、201）に挟まれた領域に1塩基伸長反応産物に由来する信号を示す波形が観察された。実験1では観察された波形は1つ（202）であった。反応時には変異型として10分の1量のアデニン鋳型を加えているが、実験1の標識組み合わせでは判別が困難である。
一方、同じ蛍光色素のTexas red標識に加え2分子のアミノアリル基を修飾したヌクレオチドを用いた実験2では、野生型の塩基を示す波形（203）と変異型の塩基を示す波形（204）が完全に異なる座標位置に検出され、明確な区別により感度の良い検出が可能となった。
同様に実験3と実験4としてdUTP-Cy3、アミノアリル修飾を持つdUTP-XX-Cy3の波形比較を行った。どちらの実験区でも実験2と同じ座標位置に微量の変異型を示す波形（204）が観察された。Cy3修飾ヌクレオチドを標識に用いた実験3では野生型に由来する波形（205）が204より短い位置にみられ、アミノアリル修飾を持つdUTP-XX-Cy3を標識に用いた実験4では野生型に由来する波形（206）が204より長い位置にみられた。
これらの結果から本実験に用いたヌクレオチドへの修飾は電気泳動の移動度を改変する効果を持ち、その効果によって同じ鎖長のDNA分子の蛍光信号の出現位置を改変することが確かめられた。
［実施例２］
塩基変異解析にて要求される4種の塩基の識別は従来技術では4つの塩基に異なる波長の蛍光色素で標識することが必須であった。一方、本発明による移動度を改変する修飾により4種の塩基の波形の座標位置を塩基への修飾によって改変できるため、例えば以下の表3に示したような組み合わせによって用いる蛍光色素の種類を減らすことが可能である。
塩基変異解析にて要求される4種の塩基の識別は従来技術では4つの塩基に異なる波長の蛍光色素で標識することが必須であった。一方、本発明による移動度を改変する修飾により4種の塩基の波形の座標位置を塩基への修飾によって改変できるため、例えば以下の表3に示したような組み合わせによって用いる蛍光色素の種類を減らすことが可能である。
本実施例ではアミノアリル基修飾を施したヌクレオチドを用いて電気泳動における移動度改変の効果を示した。ヌクレオチドは多様な修飾が可能な分子であり、DNA合成企業においてAmino-Modifier C6やTEG（tetra-ethlene glycol）といった修飾の合成サービスが行われている。電気泳動の移動度に及ぼす影響は修飾分子に依存するため、4種の塩基の波形出現位置を分離するヌクレオチド修飾の組み合わせを設定することが可能である。これらの組み合わせにおいて4種の塩基に施す蛍光色素修飾は従来どおり4種を4色の蛍光色素に一対一対応の組み合わせにすることも可能であるし、1色の蛍光色素としてより簡便な光学検出装置にて検出可能な反応組成とすることも可能となる。
100 ヌクレオチドの分子構造
101 蛍光色素Cy3の分子構造
102 アミノアリル基x2（リンカー）の分子構造
200、201 サイズマーカ―の波形
202 野生型由来のdUTP-Texas Redと変異型由来のddATP-dR6Gの2つのピークが重なった波形
203 野生型由来のdUTP-XX-Texas Red波形
204 変異型由来のddATP-dR6G波形
205 野生型由来のdUTP-Cy3波形
206 野生型由来のdUTP-XX-Cy3波形
101 蛍光色素Cy3の分子構造
102 アミノアリル基x2（リンカー）の分子構造
200、201 サイズマーカ―の波形
202 野生型由来のdUTP-Texas Redと変異型由来のddATP-dR6Gの2つのピークが重なった波形
203 野生型由来のdUTP-XX-Texas Red波形
204 変異型由来のddATP-dR6G波形
205 野生型由来のdUTP-Cy3波形
206 野生型由来のdUTP-XX-Cy3波形
Claims (11)
- 蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質の存在下において、標的遺伝子に特異的なプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う工程、
前記1塩基伸長反応の反応産物をキャピラリー電気泳動に供する工程、
前記蛍光色素のシグナルに基づいて前記1塩基伸長反応によって取り込まれた基質の種類を判別し、前記キャピラリー電気泳動の移動度に基づいて前記標的遺伝子を同定する工程
を含む1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出方法において、
前記基質の少なくとも1つが、キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子をさらに含むことを特徴とする方法。 - 前記修飾分子が、前記ヌクレオチドと前記蛍光色素とを連結するリンカーである、請求項１に記載の方法。
- 前記修飾分子が、アミノアリル基である、請求項１に記載の方法。
- 前記基質が、異なる種類のヌクレオチドがキャピラリー電気泳動の移動度により区別可能なように、前記修飾分子を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記標的遺伝子が2種以上であり、その標的遺伝子の種類に応じて異なる長さのプライマーを用いて1塩基伸長反応を行う、請求項１に記載の方法。
- キャピラリー電気泳動の移動度を改変する修飾分子、蛍光色素及びヌクレオチドを含む基質を含む、1塩基伸長反応とキャピラリー電気泳動の組み合わせによる遺伝子検出に使用するための試薬。
- 前記修飾分子が、前記ヌクレオチドと前記蛍光色素とを連結するリンカーである、請求項６に記載の試薬。
- 前記修飾分子が、アミノアリル基である、請求項６に記載の試薬。
- 複数のヌクレオチドに対応する複数の基質を含み、それぞれの基質が、異なる種類のヌクレオチドがキャピラリー電気泳動の移動度により区別可能なように、前記修飾分子を含む、請求項６に記載の試薬。
- 請求項６に記載の試薬を含む、遺伝子検出用キット。
- ポリメラーゼをさらに含む、請求項１０に記載のキット。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022184029A JP2024073042A (ja) | 2022-11-17 | 2022-11-17 | 電気泳動の移動度を改変する修飾基質を用いた遺伝子検出 |
| PCT/JP2023/037584 WO2024106109A1 (ja) | 2022-11-17 | 2023-10-17 | 電気泳動の移動度を改変する修飾基質を用いた遺伝子検出 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022184029A JP2024073042A (ja) | 2022-11-17 | 2022-11-17 | 電気泳動の移動度を改変する修飾基質を用いた遺伝子検出 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2024073042A true JP2024073042A (ja) | 2024-05-29 |
Family
ID=91084196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022184029A Pending JP2024073042A (ja) | 2022-11-17 | 2022-11-17 | 電気泳動の移動度を改変する修飾基質を用いた遺伝子検出 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2024073042A (ja) |
| WO (1) | WO2024106109A1 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20210139976A1 (en) * | 2018-03-15 | 2021-05-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Nucleotide analogues and use thereof for nucleic acid sequencing and analysis |
-
2022
- 2022-11-17 JP JP2022184029A patent/JP2024073042A/ja active Pending
-
2023
- 2023-10-17 WO PCT/JP2023/037584 patent/WO2024106109A1/ja unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024106109A1 (ja) | 2024-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9938573B2 (en) | Methods and kits for nucleic acid sequencing | |
| CN111032881B (zh) | 核酸的精确和大规模平行定量 | |
| US11274341B2 (en) | Assay methods using DNA binding proteins | |
| ES2688458T3 (es) | Recuento varietal de ácidos nucleicos para obtener información del número de copias genómicas | |
| ES2829295T3 (es) | Detección de alto rendimiento de marcadores moleculares basados en AFLP y secuenciación de alto rendimiento | |
| KR102592367B1 (ko) | 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법 | |
| JP2020501554A (ja) | 短いｄｎａ断片を連結することによる一分子シーケンスのスループットを増加する方法 | |
| KR20100063050A (ko) | 디지털 ｐｃｒ에 의한 다양한 길이의 핵산의 분석 | |
| WO2019144582A1 (zh) | 用于检测基因突变和已知、未知基因融合类型的高通量测序靶向捕获目标区域的探针和方法 | |
| JP3844996B2 (ja) | 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法 | |
| CN110541033B (zh) | Egfr基因突变检测用组合物及检测方法 | |
| JP2020536525A (ja) | プローブ及びこれをハイスループットシーケンシングに適用するターゲット領域の濃縮方法 | |
| CN106520917A (zh) | 一种基因的大片段缺失/重复检测的方法 | |
| CN114341638A (zh) | 用于邻近连接的方法和组合物 | |
| JP2008259453A (ja) | 核酸の検出方法 | |
| CN109563540A (zh) | 用于在染色体上原位杂交的dna探针 | |
| KR101358416B1 (ko) | 리가제 반응과 절단효소 증폭반응을 이용한 표적 유전자 또는 이의 돌연변이 검출방법 | |
| JP5239853B2 (ja) | 変異遺伝子の検出方法 | |
| CN106319079B (zh) | 一种检测22q11.2拷贝数缺失的方法 | |
| Cannon et al. | A dual-mode single-molecule fluorescence assay for the detection of expanded CGG repeats in Fragile X syndrome | |
| CN111349691B (zh) | Egfr基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN113774141B (zh) | 一种用于双位点顺反式突变检测的引物、探针组合物及其应用 | |
| WO2024106109A1 (ja) | 電気泳動の移動度を改変する修飾基質を用いた遺伝子検出 | |
| KR20200129600A (ko) | 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 유전형 판별용 PNA 프로브 및 이를 이용한 헬리코박터 파일로리 유전형 판별방법 | |
| CN112813200B (zh) | 核酸极短pcr扩增的方法、检测方法及应用 |