JP2023551744A - Ｃｄ３０及びｃｄ３に結合する抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＣＤ３及びＣＤ３０に結合する多重特異性抗体に関する。本発明は、本発明の抗体を含む薬学的組成物、抗体をコードする核酸、抗体を産生する宿主細胞、抗体を産生する方法、及び特にがん療法のための、抗体の使用を更に提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、ＣＤ３０及びＣＤ３に結合する多重特異性抗体に関する。本発明は、抗体を含む薬学的組成物、抗体をコードする核酸、抗体を産生する宿主細胞、抗体を産生する方法、及び特にがん療法のための、抗体の使用を更に提供する。
Ｋｉ－１又はＴＮＦＲＳＦ８としても知られる、ＣＤ３０は、１２０ｋＤの膜貫通糖タンパク質受容体であり、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７６：９５９－９６２）。ＣＤ３０は、その細胞外ドメインに６つのシステインリッチ反復を有するシングルパスＩ型膜タンパク質である（Ｄｕｒｋｏｐ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：４２１－４２７）。加えて、可溶性形態のＣＤ３０（ｓＣＤ３０）が、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）（Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８；１１１：５３２－５）を含む、炎症性疾患、及びＣＤ３０陽性血液悪性腫瘍（Ｊｏｓｉｍｏｖｉｃ－Ａｌａｓｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ）を有する患者の血清中で検出されている。ｓＣＤ３０は、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７及びＡＤＡＭ１０などの細胞膜係留性メタロプロテイナーゼによるＣＤ３０の細胞外部分の切断産物を表す（Ｎａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２００５、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ，２００４）。
正常組織では、ＣＤ３０発現は、主に活性化Ｔ及びＢリンパ球のサブセットに制限される（Ｂｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４４２－９、Ｓｈａｎｅｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２１４７－５３）。ＣＤ３０発現は、様々なリンパ系腫瘍において検出されている。古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）は、高いＣＤ３０発現レベルを示す。特に、ｃＨＬに典型的に見られる、Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（ＲＳ）細胞の大部分は、ＣＤ３０に対して陽性である（Ｆｒｉｚｚｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｅｍｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｐａｔｈｏｌ．９：２９１－２９６）。
例えば、ＣＤ３０標的化抗体－薬物複合体ブレンツキシマブベドチン（ＢＶ、ＳＧＮ－３５）は、ｃＨＬ、ＡＬＣＬ、及びＣＴＣＬなどのがんを治療する際に使用されているか又は使用することが推奨されている（Ｙｏｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ２０；３０（１８）：２１８３－９、Ｐｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１７ Ｄｅｃ ２１；１３０（２５）：２７０９－２７１７、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｍａｌｉｇ Ｒｅｐ．２０２０ Ｆｅｂ；１５（１）：９－１９）。四価二重特異性ＣＤ３０×ＣＤ１６Ａ抗体ＡＦＭ１３は、ｃＨＬ及びＣＤ３０陽性リンパ腫のためのＮＫ細胞媒介性免疫療法として開発されている（Ｒｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１５ Ｊｕｎ ２５；１２５（２６）：４０２４－３１）。
更に、ＣＤ３０標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ｃＨＬ及びＣＤ３０陽性リンパ腫のために開発されている。他のＣＤ３０抗体は、ＷＯ２００３０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＵＳ８２５７７０６（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＵＳ２０１０／０２３９５７１（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＷＯ２００７／０４０６５３（米国政府及び保健）、及びＷＯ２０１６／０１７７８４６（Ａｆｆｉｍｅｄ）に記載されている。
Ｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５４：８２０－８２７）は、ＣＤ３０モノクローナル抗体ＨＲＳ－３産生ハイブリドーマ細胞とＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ－３産生ハイブリドーマ細胞との融合（ハイブリッドハイブリドーマ技術）によって生成されたＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体ＯＫＴ－３／ＨＲＳ－３を記載する。
ＷＯ２００８／１１９５６７は、ＣＤ３０及びＣＤ３種間特異的二重特異性一本鎖分子の生成及び特徴分析を記載している。
ＵＳ２０２０／００９５３３０は、２つの抗ＣＤ３０クローン（８Ｄ１０及び１０Ｃ２と名付けられた）の抗ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ－３）への化学的ヘテロ抱合に起因するＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体を記載している。
しかしながら、これらのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のいずれも、臨床環境で試験されていない。
したがって、改善されたＣＤ３０標的化がん療法の必要性がある。有効性があり、安全で、良好な製造可能性を有し、かつ／又は長い貯蔵寿命を有するＣＤ３０標的化化合物の必要性がある。
本発明は、ヒト及びカニクイザルＣＤ３０及びＣＤ３に結合するＴ細胞誘導抗体に関する。本発明者らは、いくつかのＣＤ３０結合抗体が、二価（モノクローナル）フォーマットでＣＤ３０発現細胞に良好に結合するが、一価ＣＤ３０結合を有する二重特異性フォーマットで強く低減した結合及び細胞傷害性を示すことを見出した。強力な一価ＣＤ３０結合及び優れた腫瘍細胞殺滅を有する二重特異性抗体が特定された。更に、優れた安定性及び溶解性のために、薬学的製品への開発に好適である、機能的に不活性なＦｃバックボーンを有する二重特異性抗体が特定された。
一態様において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体をコードする、核酸構築物、又は核酸構築物の組み合わせに関する。
更なる態様において、本発明は、本発明による核酸構築物を含む発現ベクター又は送達ビヒクルに関する。
更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体を産生することができる組換え宿主細胞に関し、宿主細胞は、本発明による多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸構築物を含む。
更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物に関する。
更なる態様において、本発明は、例えば、がんの治療において、医薬としての使用のための、本発明による多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物に関する。
より更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体を産生するための方法に関する。
定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間以上、少なくとも約４８時間以上、少なくとも約３、４、５、６、７日以上などの、重要な期間、又は任意の他の関連する機能的に定義された期間（抗原に結合する抗体と関連した生理学的応答を誘導、促進、増強、及び／若しくは調節するのに十分な時間、並びに／又は抗体が内在化されるのに十分な時間など）の半減期を有する、典型的な生理学的及び／又は腫瘍特異的条件下で、抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子のフラグメント、又はそれらのいずれかの誘導体を指すことを意図している。抗体は、抗原と相互作用することができる結合領域（又は両方とも同じ意味を有する、本明細書において使用され得る結合領域）、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含む結合領域などを含む。抗体は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の成分、例えば、Ｃ１ｑ、補体活性化の古典的経路における第１の成分を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る抗体（Ａｂ）の定常領域を含み得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約４時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間以上、少なくとも約４８時間以上、少なくとも約３、４、５、６、７日以上などの、重要な期間、又は任意の他の関連する機能的に定義された期間（抗原に結合する抗体と関連した生理学的応答を誘導、促進、増強、及び／若しくは調節するのに十分な時間、並びに／又は抗体が内在化されるのに十分な時間など）の半減期を有する、典型的な生理学的及び／又は腫瘍特異的条件下で、抗原に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子のフラグメント、又はそれらのいずれかの誘導体を指すことを意図している。抗体は、抗原と相互作用することができる結合領域（又は両方とも同じ意味を有する、本明細書において使用され得る結合領域）、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含む結合領域などを含む。抗体は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の成分、例えば、Ｃ１ｑ、補体活性化の古典的経路における第１の成分を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る抗体（Ａｂ）の定常領域を含み得る。
本発明の文脈において、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗体様ポリペプチド、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、並びに酵素的切断、ペプチド合成、及び組換えＤＮＡ技術などの、任意の既知の技法によって提供される抗原（抗原結合フラグメント）に特異的に結合する能力を保持する「抗体フラグメント」又は「そのフラグメント」を含む。「抗体」という用語は、二重、三重、若しくは多重特異性抗体、及び／又は更なる修飾を有する抗体、例えば、抗体－薬物複合体及び／又はＩｇＧ Ｆｃドメインに修飾を有する抗体を含む。本明細書における本開示が別途限定されない限り、本発明に従って定義される抗体は、任意のアイソタイプを保有するか、又はアイソタイプを有さない（例えば、ｓｃＦｖ抗体）ことができる。
抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。「抗体」という用語内に包含される結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂ’若しくはＦａｂフラグメント、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）、及び重鎖定常領域ドメイン１（ＣＨ１）ドメインからなる一価フラグメント、又はＷＯ２００７／０５９７８２に記載される一価抗体、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれるＨｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ－．２００３ Ｎｏｖ；２１（１１）：４８４－９０、ｄＡｂフラグメントＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４５４６（１９８９）、（ｖｉ）ラクダ科動物又はナノボディＲｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５（１）：１１１－２４、並びに（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を使用して、それらが、ＶＬ及びＶＨ領域が一価分子（一本鎖抗体又は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成するために対合する単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって結合され得、例えば、Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ；５（１）：１１１－２４及びＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３４２６（１９８８）を参照されたい。そのような一本鎖抗体は、別段に記載されない限り、又は文脈によって明確に示されない限り、抗体という用語内に包含される。そのようなフラグメントは、一般に、抗体の意味内に含まれるが、それらは、集合的に、及び各々独立して、本発明の独自の特徴であり、異なる生物学的特性及び有用性を示す。本発明の文脈におけるこれらの及び他の有用な抗体フラグメントは、本明細書において更に論じられる。
最終産物として、又は例えば、二重特異性抗体を制御されたＦａｂ－アーム交換（ｃＦＥＡ）を通して生成するための中間体としてのいずれかの、抗体は、異なるインビトロ又はエクスビボ発現又は産生システムにおいて産生され、それらから、例えば、組換え修飾宿主細胞から、抗体をコードする核酸配列のインビトロ転写及び／又は翻訳を支持する細胞抽出物を使用するハイブリドーマ又はシステムから収集され得る。
本明細書で使用される「免疫グロブリン重鎖」又は「免疫グロブリンの重鎖」という用語は、免疫グロブリンの重鎖のうちの１つを指すことが意図されている。重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び免疫グロブリンのアイソタイプを定義する重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略される）からなる。ＩｇＧの重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成される。本明細書で使用される「免疫グロブリン」という用語は、典型的には、２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）低分子量鎖、及び１対の重（Ｈ）鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指すことが意図され、４つは全てジスルフィド結合によって潜在的に相互接続される。免疫グロブリンの構造は、十分に特徴付けられている（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。免疫グロブリンの構造内では、２つの重鎖は、いわゆる「ヒンジ領域」におけるジスルフィド結合を介して相互接続されている。重鎖と同等に、各軽鎖は、典型的には、いくつかの領域、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、典型的には、１つのドメイン、ＣＬで構成される。更に、ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される、超可変性の領域（又は配列及び／若しくは構造的に定義されたループの形態において超可変性であり得る超可変領域）に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
本明細書で使用されるとき、「半分子」、「Ｆａｂ－アーム」、及び「アーム」という用語は、１つの重鎖－軽鎖対を指す。二重特異性抗体が、第１の抗体「に由来する」半分子抗体、及び第２の抗体「に由来する」半分子抗体を含むと記載されるとき、「～に由来する」という用語は、二重特異性抗体が、任意の既知の方法によって、当該第１及び第２の抗体の各々からの当該半分子を、得られる二重特異性抗体に組換えることによって生成されたことを示す。この文脈において、「組換えること」は、任意の特定の組換え方法によって限定されることを意図するものではなく、よって、例えば、半分子交換によって組換えること、並びに核酸レベルで、及び／又は同じ細胞における２つの半分子の共発現を通して組換えることを含む、本明細書に記載される二重特異性抗体を産生するための方法のうちの全てを含む。
「第１」及び「第２」という用語は、抗体又はそのドメイン若しくは領域の文脈で本明細書において使用されるとき、単に参照しやすいように意図されており、特定の相対位置などを示すことは意図されない。
本明細書で使用される「抗原結合領域」又は「結合領域」という用語は、抗原に結合することができる抗体の領域を指す。抗原は、ポリペプチド、タンパク質、多糖、又はそれらの組み合わせなどの、任意の分子であり得る。抗原は、例えば、細胞、細菌、又はビリオン上に提示され得る。「抗原」及び「標的」という用語は、文脈によって矛盾しない限り、本発明の文脈において交換可能に使用され得る。「抗原結合領域」及び「抗原結合部位」という用語は、文脈によって矛盾しない限り、本発明の文脈において交換可能に使用され得る。
本明細書で使用される「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の平衡解離定数を指し、ｋｄをｋａで割ることによって得られる。ＫＤはまた、「結合親和性」と称される。
本明細書で使用される「ｋｄ」（ｓｅｃ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。当該値は、ｋｏｆｆ値又はオフレートとも称される。
本明細書で使用される「ｋａ」（Ｍ－１ｘｓｅｃ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度定数を指す。当該値は、ｋｏｎ値又はオンレートとも称される。
本明細書で使用される「結合」という用語は、抗体の、所定の抗原又は標的への、典型的には、抗体をリガンドとして、抗原を分析物として使用するバイオレイヤー干渉法によって決定されるとき、１Ｅ－６Ｍ以下、例えば、５Ｅ－７Ｍ以下、１Ｅ－７Ｍ以下、例えば、５Ｅ－８Ｍ以下、例えば、１Ｅ－８Ｍ以下、例えば、５Ｅ－９Ｍ以下、例えば、１Ｅ－９Ｍ以下、例えば、１Ｅ－１０Ｍ以下、又は例えば、１Ｅ－１１Ｍ以下のＫＤに対応する結合親和性での結合を指し、所定の抗原に、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）又は密接に関連する抗原への結合についてのその親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば、少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低い、例えば、少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性で結合する。
本明細書で使用される「ＣＤ３０」という用語は、ＴＮＦＲＳＦ８（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８）としても知られる、ヒト分化抗原群３０タンパク質を指す。ＣＤ３０は、様々な種において見出され、よって、「ＣＤ３０」という用語は、文脈によって矛盾しない限り、ヒトＣＤ３０に限定されない場合がある。ヒトＣＤ３０の配列は、配列番号３９に記載されている。
本明細書で使用される「ＣＤ３」という用語は、Ｔ細胞共受容体タンパク質複合体の一部であり、４つの異なる鎖で構成されるヒト分化抗原群３タンパク質を指す。ＣＤ３は、様々な種において見出され、よって、「ＣＤ３」という用語は、文脈によって矛盾しない限り、ヒトＣＤ３に限定されない場合がある。哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖（ヒトＣＤ３γ鎖ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０９６９３、又はカニクイザルＣＤ３γ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ９５ＬＩ７）、ＣＤ３δ（デルタ）鎖（ヒトＣＤ３δ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０４２３４、又はカニクイザルＣＤ３δ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ９５ＬＩ８）、２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖（ヒトＣＤ３ε：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ０７７６６、このうち本明細書における配列は配列番号４２として組み込まれ、カニクイザルＣＤ３ε ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ９５ＬＩ５、又はアカゲザルＣＤ３ε ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｇ７ＮＣＢ９）、及びＣＤ３ζ鎖（ゼータ）鎖（ヒトＣＤ３ζ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｐ２０９６３、カニクイザルＣＤ３ζ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｎｏ Ｑ０９ＴＫ０）を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子と会合し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＴＣＲ及びＣＤ３分子は、一緒に、ＴＣＲ複合体を含む。
「抗体結合領域」という用語は、抗体が結合するエピトープを含む、抗原の領域を指す。抗体結合領域は、バイオレイヤー干渉法を使用したエピトープビニングによって、アラニンスキャンによって、又はドメインシャッフルアッセイ（抗原の領域が別の種の領域と交換される抗原構築物を使用し、抗体が依然として抗原に結合するかどうかを決定する）によって決定され得る。抗体との相互作用に関与する抗体結合領域内のアミノ酸は、水素／重水素交換質量分析によって及び／又はその抗原に結合した抗体の結晶学によって決定され得る。
「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に結合した抗原決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸、糖側鎖、又はそれらの組み合わせなどの分子の表面群化からなり、通常、特異的三次元構造特徴、及び特異的電荷特徴を有する。立体構造及び非立体構造エピトープは、前者への結合は、タンパク質又はその多量体の三次元構造を破壊する変性溶媒又は他の薬剤の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、抗体が抗原に結合しているときに効果的にブロック又はカバーされるアミノ酸残基を含み得る。
「モノクローナル抗体」、「モノクローナルＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」、「ｍＡｂ」などの用語は、本明細書で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を指し、典型的には、特定のエピトープについて単一の結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、典型的には、例えば、ハイブリドーマ、安定細胞株などのような、ユニークな親細胞の全てのクローンである同一の細胞によって作製され得る。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック又はトランス染色体非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生され得る。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトＢ細胞又は形質細胞に由来し得る。モノクローナル抗体はまた、組換え修飾された宿主細胞、又は抗体をコードする核酸配列のインビトロ転写及び／若しくは翻訳を支持する細胞抽出物を使用するシステムから産生され得る。
本明細書で使用される「アイソタイプ」という用語は、免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、若しくはＩｇＭ）、又は重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＩｇＧ１ｍ（ｚａ）及びＩｇＧ１ｍ（ｆ）などの、それらの任意のアロタイプを指す。更に、各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）又はラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。
「全長抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、１対の重鎖及び軽鎖、又は２対の重鎖及び軽鎖を含み、各対が、そのアイソタイプの野生型抗体の重鎖－軽鎖対に通常見られるような重鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインを含む、抗体（例えば、親抗体又はバリアント抗体）を指す。よって、例えば、全長ＩｇＧ１抗体は、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジ、ＶＬ、及びＣＬドメインを含有する。全長バリアント抗体において、重鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインは、特に、全長親又は野生型抗体と比較されるとき、抗体の機能的特性を修飾及び／又は改善するアミノ酸置換を含有し得る。本発明による全長抗体は、（ｉ）ＣＤＲ配列を、完全な重鎖及び軽鎖配列を含む１つ以上の好適なベクターにクローニングするステップと、（ｉｉ）好適な発現系において重鎖及び軽鎖配列を有する得られた好適なベクターを発現するステップと、を含む方法によって産生され得る。ＣＤＲ配列又は完全可変領域配列のいずれかから開始するとき、全長抗体を産生することは、当業者の知識の範囲内である。よって、当業者は、本発明による全長抗体を生成する方法を知っている。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト可変ドメインに対する高レベルの配列相同性を含有するように修飾されたヒト抗体定常ドメイン及び非ヒト可変ドメインを含有する、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒に抗原結合部位を形成する、非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）の、相同ヒトアクセプターフレームワーク領域（ＦＲ）上への移植によって達成することができる（とりわけ、ＷＯ９２／２２６５３及びＥＰ０６２９２４０を参照されたい）。親抗体の結合親和性及び特異性を完全に再構成するために、親抗体（すなわち、非ヒト抗体）からのフレームワーク残基のいくつかでのヒトフレームワーク残基のいくつかの置換（逆変異）が必要とされ得る。構造的相同性モデリングは、抗体の結合特性にとって重要なフレームワーク領域におけるアミノ酸残基を特定するために役立ち得る。よって、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に非ヒトアミノ酸配列への１つ以上のアミノ酸逆変異を任意に含むヒトフレームワーク領域、及び完全ヒト定常領域を含み得る。任意に、必ずしも逆変異ではない、追加のアミノ酸修飾は、特に有用な親和性及び生化学的特性などの、好ましい特徴を有するヒト化抗体を得るために、例えば、脱アミド化を回避及び／又は製造を改善する修飾を含むために適用され得る。更に、ＣＤＲ及び／又はフレームワーク領域は、例えば、親和性成熟手順を介して、抗原に対する親和性を改善するように修飾され得る。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含むことを意図していない。本発明のヒトモノクローナル抗体は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法を含む、様々な技法によって産生することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を産生するための他の技法、例えば、ヒト抗体遺伝子のライブラリーを使用するＢリンパ球又はファージディスプレイ技法のウイルス又はがん原性形質転換を用いることができる。ヒトモノクローナル抗体は、ＨＣｏ１２マウス（例えば、ＷＯ０３／０５９２８２を参照されたい）などのような、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を担持するトランスジェニック又はトランス染色体マウスを用いて生成することができる。
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体の２つの重鎖ポリペプチドのＮ末端からＣ末端への方向で、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含む領域を指す。Ｆｃポリペプチドは、典型的には、グリコシル化される。抗体のＦｃ領域は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）及び補体系の成分を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。Ｆｃ領域は、典型的には、ＦｃＲｎ及びタンパク質Ａにも結合する。
本明細書で使用される、「…位のアミノ酸に対応するアミノ酸」などの語句は、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるアミノ酸位置番号を指す。他の免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸位置は、ヒトＩｇＧ１とのアラインメントによって見出され得る。別段の記載がない限り、又は文脈によって矛盾しない限り、定常領域配列のアミノ酸は、本明細書では、ＥＵ－インデックスのナンバリングに従って番号付けされる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９に記載される）。よって、別の配列におけるアミノ酸又はセグメント「に対応する」１つの配列におけるアミノ酸又はセグメントは、他のアミノ酸又はセグメントと、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、又は類似物などの標準配列アラインメントプログラムを、典型的にはデフォルト設定で使用してアラインし、ヒトＩｇＧ１重鎖に対して少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有するものである。当該技術分野では、配列又は配列中のセグメントをアラインし、それによって、本発明によるアミノ酸位置に対する配列における対応する位置を決定する方法は、周知であると考えられている。
本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ６６２，６８０，６８９（１９９１）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸２１６－２３０に対応する。しかしながら、ヒンジ領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ＣＨ１領域」又は「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ１領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１領域は、Ｋａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸１１８～２１５に対応する。しかしながら、ＣＨ１領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ＣＨ２領域」又は「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、Ｋａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸２３１～３４０に対応する。しかしながら、ＣＨ２領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであり得る。
本明細書で使用される「ＣＨ３領域」又は「ＣＨ３ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ３領域を指す。よって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、Ｋａｂａｔ（同上）に記載されるＥｕナンバリングに従ってアミノ酸３４１～４４７に対応する。しかしながら、ＣＨ３領域はまた、本明細書に記載される他のサブタイプのいずれかであり得る。
本明細書で使用される、「Ｆｃ媒介性エフェクター機能」という用語は、Ｆｃ媒介性エフェクター機能がポリペプチド又は抗体のＦｃ領域に起因する、ポリペプチド又は抗体を細胞膜上のその標的又は抗原に結合させた結果である機能を指すことが意図される。Ｆｃ媒介性エフェクター機能の例としては、（ｉ）Ｃ１ｑ結合、（ｉｉ）補体活性化、（ｉｉｉ）補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣ）、（ｉｖ）抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、（ｖ）Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃｇＲ）結合、（ｖｉ）抗体依存的、ＦｃγＲ媒介性抗原架橋、（ｖｉｉ）抗体依存的細胞食作用（ＡＤＣＰ）、（ｖｉｉｉ）補体依存的細胞傷害性（ＣＤＣＣ）、（ｉｘ）補体増強性細胞傷害性、（ｘ）抗体によって媒介されるオプソニン化抗体の補体受容体への結合、（ｘｉ）オプソニン化、及び（ｘｉｉ）（ｉ）～（ｘｉ）のいずれかの組み合わせが挙げられる。
本明細書で使用される、「不活性（ｉｎｅｒｔｎｅｓｓ）」、「不活性（ｉｎｅｒｔ）」、又は「非活性化」という用語は、任意のＦｃγＲに結合することができないか、若しくは任意のＦｃγＲに結合し、ＦｃγＲのＦｃ媒介性架橋を誘導し、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰなどのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能を誘導し、個々の抗体の２つのＦｃ領域を介して標的抗原のＦｃγＲ媒介性架橋を誘導する最小限の能力を有し、かつ／又はＣ１ｑに結合し、ＣＤＣ及びＣＤＣＣなどの補体媒介性エフェクター機能を誘導することができないＦｃ領域を指す。抗体のＦｃ領域の不活性は、単一特異性又は二重特異性フォーマットで抗体を使用して試験され得る。
「一価抗体」という用語は、本発明の文脈において、１つの抗原結合ドメイン（例えば、１つのＦａｂアーム）のみを有する、抗原と相互作用することができる抗体分子を指す。二重特異性などの、多重特異性抗体の文脈では、「一価抗体結合」は、多重特異性抗体の、１つの抗原結合ドメイン（例えば、１つのＦａｂアーム）のみを有する１つの抗原への結合を指す。
本発明の文脈における「単一特異性抗体」という用語は、１つの抗原、１つのエピトープのみに対する結合特異性を有する抗体を指す。抗体は、単一特異性、一価抗体（すなわち、１つの抗原結合領域のみを保有する）、単一特異性、二価抗体（例えば、２つの同一の抗原結合領域を有する抗体）、又は単一特異性、多価抗体（例えば、３つ以上の同一の抗原結合領域を有する抗体）であり得る。
「多重特異性抗体」という用語は、２つ以上の異なるエピトープに結合する２つ以上の抗原結合ドメインを有する抗体を指す。「二重特異性抗体」という用語は、異なるエピトープに結合する２つの抗原結合ドメイン、例えば、ＶＨ及びＶＬ領域の２つの非同一対、２つの非同一Ｆａｂアーム、又は非同一ＣＤＲ領域を有する２つのＦａｂアームを有する抗体を指す。本発明の文脈において、二重特異性及び多重特異性抗体は、それぞれ、２つ以上の異なるエピトープについての特異性を有する。そのようなエピトープは、同じ又は異なる抗原又は標的上にあり得る。エピトープが異なる抗原上にある場合、そのような抗原は、細胞外マトリックス又はベシクル及び可溶性タンパク質などの同じ細胞又は異なる細胞、細胞型、又は構造上にあり得る。よって、多重特異性及び二重特異性抗体は、複数の抗原、例えば、２つの異なる細胞を架橋することができる場合がある。
「二価抗体」という用語は、２つの抗原結合領域を有する抗体を指し、当該抗原結合領域は、同一であり、同じエピトープに結合し得るか、又はそれらは、非同一であり、同じ若しくは異なる抗原上にあり得る異なるエピトープに結合し得る。したがって、二価抗体は、単一特異性抗体又は二重特異性抗体であり得る。
本明細書では、「アミノ酸」及び「アミノ酸残基」という用語は、互換的に使用され得、限定的に理解されるものではない。アミノ酸は、各アミノ酸に特異的な側鎖（Ｒ基）とともに、アミン（－ＮＨ２）及びカルボキシル（－ＣＯＯＨ）官能基を含有する有機化合物である。本発明の文脈において、アミノ酸は、構造及び化学的特徴分析に基づいて分類され得る。よって、アミノ酸のクラスは、以下の表の一方又は両方において反映され得る：
あるアミノ酸の別のアミノ酸への置換は、保存的置換又は非保存的置換として分類され得る。本発明の文脈において、「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、類似の構造及び／又は化学的特徴を有する別のアミノ酸での置換であり、１つのアミノ酸残基の、上記２つの表のいずれかで定義される同じクラスの別のアミノ酸残基についてのそのような置換：例えば、保存的置換は、両方とも脂肪族、分岐疎水性であるため、ロイシンのイソロイシンでの置換であり得る。同様に、保存的置換の一例は、両方とも小さい負荷電残基であるため、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換である。
本発明の文脈において、抗体における置換は、元のアミノ酸－位置の数－置換アミノ酸として示される。
アミノ酸について周知の命名法を参照すると、任意のアミノ酸残基を示すために、コード「Ｘａａ」又は「Ｘ」を含む、３文字コード、又は１文字コードが使用される。よって、Ｘａａ又はＸは、典型的には、２０の天然に存在するアミノ酸のいずれかを表し得る。本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、以下のアミノ酸残基：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、及びシステインのうちのいずれか１つを指す。
したがって、「Ｋ４０９Ｒ」又は「Ｌｙｓ４０９Ａｒｇ」という表記は、抗体がアミノ酸位置４０９にあるリジンのアルギニンでの置換を含むことを意味する。所与の位置におけるアミノ酸の、任意の他のアミノ酸への置換は、元のアミノ酸－位置、又は例えば、「Ｋ４０９」と称される。元のアミノ酸及び／又は置換されたアミノ酸が２つ以上であるが、全てではないアミノ酸を含み得る修飾について、２つ以上のアミノ酸は、「，」又は「／」によって分離され得る。例えば、４０９位のリジンの、アルギニン、アラニン又はフェニルアラニンでの置換は、「Ｌｙｓ４０９Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ」又は「Ｌｙｓ４０９Ａｒｇ／Ａｌａ／Ｐｈｅ」又は「Ｋ４０９Ｒ、Ａ、Ｆ」又は「Ｋ４０９Ｒ／Ａ／Ｆ」又は「Ｋ４０９～Ｒ、Ａ、若しくはＦ」である。そのような呼称は、本発明の文脈において交換可能に使用され得るが、同じ意味及び目的を有し得る。
更に、「置換」という用語は、任意の１個若しくは他の１９個の天然アミノ酸への、又は非天然アミノ酸などの他のアミノ酸への置換を包含する。例えば、４０９位のアミノ酸Ｋの置換は、以下の置換の各々を含む：４０９Ａ、４０９Ｃ、４０９Ｄ、４０９Ｅ、４０９Ｆ、４０９Ｇ、４０９Ｈ、４０９１、４０９Ｌ、４０９Ｍ、４０９Ｎ、４０９Ｑ、４０９Ｒ、４０９Ｓ、４０９Ｔ、４０９Ｖ、４０９Ｗ、４０９Ｐ、及び４０９Ｙ。これらの置換はまた、Ｋ４０９Ａ、Ｋ４０９Ｃなど、又はＫ４０９Ａ、Ｃなど、又はＫ４０９Ａ／Ｃ／などと称され得る。同じことが本明細書で言及される各全ての位置への類推によって当てはまり、本明細書ではそのような置換のいずれか１つを特異的に含む。
本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、発現ベクターなどの核酸が導入された細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫も含み得ることが意図されることが理解されるべきである。特定の修飾は、変異又は環境の影響のいずれかによって後続世代で発生し得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではない場合があるが、依然として本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞（すなわち、組換えタンパク質の産生に使用される宿主細胞）としては、例えば、トランスフェクトーマ、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、及びリンパ球性細胞、並びにＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、並びに植物細胞及び真菌などの他の真核生物宿主が挙げられる。
本明細書で使用される「トランスフェクトーマ」という用語は、抗体又は標的抗原を発現する組換え真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む、真菌を含む。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、参照配列の長さにかけて、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラム、好ましくはバージョン５．０．０以降で実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定される。使用されるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ延長ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）と標識されたＮｅｅｄｌｅの出力は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントのギャップの総数）。
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメントのギャップの総数）。
類似の残基の保持はまた又は代替的に、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準設定ＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップ＝１１、及び延長ギャップ＝１を使用してＮＣＢＩを通して利用可能なＢＬＡＳＴ ２．２．８）の使用によって決定されるように、類似性スコアによって測定され得る。好適なバリアントは、典型的には、親又は参照配列に対して少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％以上（例えば、約９９％）などの、少なくとも約４５％の類似性を示す。
本発明の更なる態様及び実施形態
上記のように、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
上記のように、第１の態様において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む多重特異性抗体に関する。
一実施形態において、配列番号９におけるＸは、Ｈである。別の実施形態において、配列番号９におけるＸはＧである。
一実施形態において、第１の重鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。別の実施形態において、第１の軽鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。一実施形態において、第２の重鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。別の実施形態において、第２の軽鎖可変領域は、ヒト又はヒト化である。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域は、ヒトである。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域は、ヒト化である。別の実施形態において、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒトである。別の実施形態において、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒト化である。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域は、ヒトであり、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒトである。別の実施形態において、第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域は、ヒトであり、第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域は、ヒト化である。
当業者に周知であるように、抗体の各抗原結合領域は、一般に、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、可変領域の各々は、それぞれ、３つのＣＤＲ配列、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、それぞれ、４つのフレームワーク配列、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４を含み得る。この構造は、好ましくは、本発明による抗体にも見出される。一実施形態において、当該４つのフレームワーク配列のうちの１つ、２つ、３つ、又は全ては、ヒトフレームワーク配列である。
上記のように、本発明による多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３０に結合することができる抗原結合領域を含み、その配列は、配列番号３９に記載される。特に、本発明による抗体は、ヒトＣＤ３０に結合することができる当該抗原結合領域が、細胞、より好ましくは腫瘍細胞に発現されるＣＤ３０分子などの、ヒトＣＤ３０の細胞外ドメインに結合することができる、抗体である。
記載されるように、抗体は、それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含む、ＣＤ３０結合領域を含む。
ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域は、当該技術分野で既知の方法を使用して、可変重鎖及び軽鎖領域から特定することができる。当該可変重鎖及び軽鎖領域からのＣＤＲ領域は、ＩＭＧＴに従ってアノテーションされている（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２－１３６（１９９９）、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７（１），５５－７７（２００３）を参照されたい）。
一実施形態において、ＣＤ３０に結合する抗原結合領域は、
・配列番号１３の配列、又は配列番号１３の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第１の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１４の配列、又は配列番号１４の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第１の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
・配列番号１３の配列、又は配列番号１３の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第１の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１４の配列、又は配列番号１４の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第１の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３０に結合する抗原結合領域の重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、配列は、配列番号１３と比較されるとき、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３０に結合する抗原結合領域の軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、配列は、配列番号１４と比較されるとき、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
更なる実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号１３に記載される配列を含み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載される配列を含む。
ヒトＣＤ３０に結合することができるそのような抗原結合領域は、とりわけ、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ０３０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）に記載されている。
本発明による当該抗体は、ヒトＣＤ３０に結合する抗原結合領域間の平衡解離定数ＫＤで結合し得、ヒトＣＤ３０は、０．１～２０ｎＭの範囲内、例えば、１．５～２ｎＭの範囲（一価結合）などの、０．５～５ｎＭの範囲内である。当該結合親和性は、バイオレイヤー干渉法によって決定することができる。
一実施形態において、本発明の抗体はまた、カニクイザルＣＤ３０（配列番号４０）に結合することができる。
上記のように、本発明による多重特異性抗体は、ヒトＣＤ３に結合することができる抗原結合領域を含む。更に、本発明は、配列番号２２に特定されるヒトＣＤ３ε（イプシロン）などの、ヒトＣＤ３ε（イプシロン）に結合することができる本発明による抗体を提供する。そのような抗原結合領域は、初代ヒトＴ細胞などの、Ｔ細胞上に提示されるように、ヒトＣＤ３ε（イプシロン）に結合することができる。
記載されるように、抗体は、それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域を含む。
一実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合領域は、
・配列番号１５の配列、又は配列番号１５の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第２の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１６の配列、又は配列番号１６の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第２の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
・配列番号１５の配列、又は配列番号１５の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第２の）重鎖可変領域（ＶＨ）と、
・配列番号１６の配列、又は配列番号１６の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む（第２の）軽鎖可変領域（ＶＬ）と、
を含む。
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３に結合する抗原結合領域の重鎖可変（ＶＨ）領域を含み、配列は、配列番号１５と比較されるとき、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
更なる実施形態において、本発明による抗体は、本明細書で定義されるＣＤ３に結合する抗原結合領域の軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、配列は、配列番号１６と比較されるとき、合計で、最大１、２、３、４、又は５つのアミノ酸置換を含む。
更なる実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番号１５に記載される配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載される配列を含む。一実施形態において、配列番号１５におけるＸは、Ｈである。別の実施形態において、配列番号１５におけるＸは、Ｇである。
ヒトＣＤ３に結合することができるそのような抗原結合領域は、とりわけ、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／００１０８５（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されている。本明細書のバリアント、例えば、ＸがＧである、配列番号９に記載されるＶＨ ＣＤＲ３領域を含み、ＸがＨである、親抗体よりも低いヒトＣＤ３結合についての親和性を有する、バリアントは、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／００９４４２（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例２に記載されている。
本発明による当該抗体は、ヒトＣＤ３に結合する抗原結合領域間の平衡解離定数ＫＤで結合し得、ヒトＣＤ３は、５～３０ｎＭ、例えば、１０～２０ｎＭ（一価結合の場合）の範囲内である。
一実施形態において、本発明の抗体はまた、カニクイザルＣＤ３（配列番号４３）に結合することができる。
更なる実施形態において、多重特異性抗体は、
（ｉ）配列番号１３に記載される配列を含む第１の重鎖可変領域と、配列番号１４に記載される配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）配列番号１５に記載される配列を含む第２の重鎖可変領域と、配列番号１６に記載される配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む。
（ｉ）配列番号１３に記載される配列を含む第１の重鎖可変領域と、配列番号１４に記載される配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）配列番号１５に記載される配列を含む第２の重鎖可変領域と、配列番号１６に記載される配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む。
抗体フォーマット
本発明の多重特異性抗体は、２つ以上の特異性、例えば、２つ又は３つ以上の特異性を有し得る。更に、多重特異性抗体は、ＣＤ３及び／又はＣＤ３０について抗原結合領域の２つ以上のコピーを有し得る。例えば、一実施形態において、抗体は、ＣＤ３に結合することができる２つの抗原結合領域、例えば、ＣＤ３に結合する２つの同一の結合領域を有する。例えば、別の実施形態において、抗体は、ＣＤ３０に結合する２つの抗原結合領域、例えば、ＣＤ３０に結合する２つの同一の結合領域を有する。追加の抗原結合領域は、例えば、定常領域に共有結合したｓｃＦｖの形態で存在し得る。
本発明の多重特異性抗体は、２つ以上の特異性、例えば、２つ又は３つ以上の特異性を有し得る。更に、多重特異性抗体は、ＣＤ３及び／又はＣＤ３０について抗原結合領域の２つ以上のコピーを有し得る。例えば、一実施形態において、抗体は、ＣＤ３に結合することができる２つの抗原結合領域、例えば、ＣＤ３に結合する２つの同一の結合領域を有する。例えば、別の実施形態において、抗体は、ＣＤ３０に結合する２つの抗原結合領域、例えば、ＣＤ３０に結合する２つの同一の結合領域を有する。追加の抗原結合領域は、例えば、定常領域に共有結合したｓｃＦｖの形態で存在し得る。
好ましい実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体の多くの異なるフォーマット及び使用が当該技術分野で既知であり、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ，２０１５ Ｊｕｌ；２０（７）：８３８－４７及び；ＭＡｂｓ，２０１２ Ｍａｒ－Ａｐｒ；４（２）：１８２－９７によって、並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．２０１９ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １８（８）５８５－６０８によって概説された。本発明による二重特異性抗体は、それを産生する任意の特定の二重特異性フォーマット又は方法に限定されない場合がある。
本発明で使用され得る二重特異性抗体分子の例は、（ｉ）異なる抗原結合領域を含む２つのアームを有する単一抗体、（ｉｉ）例えば、追加のペプチドリンカーによってタンデムに結合した２つのｓｃＦｖを介して、２つの異なる標的に特異性を有する一本鎖抗体、（ｉｉｉ）各軽鎖及び重鎖が短いペプチド結合を通してタンデムに２つの可変ドメインを含む二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ－Ｉｇ）（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ－Ｉ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））、（ｉｖ）化学的に結合した二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント、（ｖ）標的抗原の各々について２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合体である、Ｔａｎｄａｂ、（ｖｉ）多価分子をもたらすｓｃＦｖのダイアボディとの組み合わせである、フレキシボディ、（ｖｉｉ）Ｆａｂに適用されるとき、異なるＦａｂフラグメントに結合した２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質をもたらすことができる、プロテインキナーゼＡにおける「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック」分子、（ｖｉｉｉ）例えば、ヒトＦａｂアームの両方の末端に融合した２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子、並びに（ｉｘ）ダイアボディを含む。
異なるクラスの二重特異性抗体の更なる例としては、これらに限定されないが、（ｉ）ヘテロ二量体化を強制する相補的ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、（ｉｉ）分子の２つ側面が各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部を含有する、組換えＩｇＧ様二重標的化分子、（ｉｉｉ）全長ＩｇＧ抗体が、追加のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合している、ＩｇＧ融合分子、（ｉｖ）一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合している、Ｆｃ融合分子、（ｖ）異なるＦａｂフラグメントが、一緒に融合している、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合している、Ｆａｂ融合分子、並びに（ｖｉ）異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が、互いに又は重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、若しくはその一部に融合した別のタンパク質若しくは担体分子に融合している、ｓｃＦｖ及びダイアボディベースの重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が挙げられる。
相補的ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子の例としては、これらに限定されないが、トリオマブ／クアドローマ分子（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ、ＷＯ２０１１／０６９１０４）、いわゆるノブ－イントゥ－ホール分子（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＷＯ９８／５０４３１）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ、ＷＯ２０１１／１１７３２９）、及び静電適合分子（Ａｍｇｅｎ、ＥＰ１８７０４５９及びＷＯ２００９／０８９００４、Ｃｈｕｇａｉ、ＵＳ２０１０／００１５５１３３、Ｏｎｃｏｍｅｄ、ＷＯ２０１０／１２９３０４）、ＬＵＺ－Ｙ分子（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７（５２）：４３３３１－９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３９７８６９．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １）、ＤＩＧ－ボディ及びＰＩＧ－ボディ分子（Ｐｈａｒｍａｂｃｉｎｅ、ＷＯ２０１０／１３４６６６、ＷＯ２０１４／０８１２０２）、鎖交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）分子（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ、ＷＯ２００７／１１０２０５）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ分子（Ｍｅｒｕｓ、ＷＯ２０１３／１５７９５３）、ＦｃΔＡｄｐ分子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、ＷＯ２０１０／１５７９２）、二重特異性ＩｇＧ１及びＩｇＧ２分子（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ、ＷＯ１１／１４３５４５）、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ足場分子（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ、ＷＯ２０１２／０５８７６８）、ｍＡｂ－Ｆｖ分子（Ｘｅｎｃｏｒ、ＷＯ２０１１０２８９５２）、二価二重特異性抗体（ＷＯ２００９／０８０２５４）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ、ＷＯ２０１１／１３１７４６）が挙げられる。
組換えＩｇＧ様二重標的化分子の例としては、限定されないが、二重標的化（ＤＴ）－Ｉｇ分子（ＷＯ２００９／０５８３８３）、ツーインワン抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３，１６１０－１６１４．）、架橋Ｍａｂ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ、ＷＯ２００８／００３１１６）、Ｚｙｂｏｄｙ分子（Ｚｙｎｇｅｎｉａ、ＬａＦｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１３ Ｍａｒ－Ａｐｒ；５（２）：２０８－１８）、共通の軽鎖でのアプローチ（Ｃｒｕｃｅｌｌ／Ｍｅｒｕｓ、ＵＳ７，２６２，０２８）、カッパ／ラムダボディ（商標）分子（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ、ＷＯ２０１２／０２３０５３）、及びＣｏｖＸ－ボディ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ、Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ，Ｖ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ ２００７．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７，５０１－５０６．）が挙げられる。
ＩｇＧ融合分子の例としては、これらに限定されないが、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ分子（Ａｂｂｏｔｔ、ＵＳ７，６１２，１８１）、二重ドメインダブルヘッド抗体（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ、ＷＯ２０１０／０２２６９２３）、ＩｇＧ様二重特異性分子（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（２）：１９１－８）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｏｃｔ ３０；３９３（３）：６７２－９２）、及びＢｓＡｂ分子（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＷＯ２０１０／１１１６２５）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ分子（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ、ＵＳ００／７９５１９１８）、ｓｃＦｖ融合分子（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｓｃＦｖ融合分子（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｄａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、ＣＮ／１０２２５０２４６）、並びにＴｖＡｂ分子（Ｒｏｃｈｅ、ＷＯ２０１２／０２５５２５、ＷＯ２０１２／０２５５３０）が挙げられる。
Ｆｃ融合分子の例としては、これらに限定されないが、ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合体（Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．１９９７ Ｓｅｐ；４２（６）：１１７９－８８）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ、Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．ＡＡＣＲ １００ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２００９（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃５４６５）、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ、ＷＯ２０１０／１１１６２５）、二重親和性再標的化技術（ＦｃベースＤＡＲＴ）分子（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、ＷＯ２００８／１５７３７９、ＷＯ２０１０／０８０５３８）、及び二重（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂ分子（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
Ｆａｂ融合二重特異性抗体の例としては、これらに限定されないが、Ｆ（ａｂ）２分子（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ、Ｄｅｏ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ Ｆｅｂ １５；１６０（４）：１６７７－８６．）、二重作用又はＢｉｓ－Ｆａｂ分子（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｂｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３，１６１０－１６１４．）、ドック－アンド－ロック（ＤＮＬ）分子（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ、ＷＯ２００３／０７４５６９、ＷＯ２００５／００４８０９）、二価二重特異性分子（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ，Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｄｅｃ １５；１６５（１２）：７０５０－７．）、及びＦａｂ－Ｆｖ分子（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、ＷＯ ２００９／０４０５６２ Ａｌ）が挙げられる。
ｓｃＦｖ－、ダイアボディ－ベース、及びドメイン抗体の例としては、これらに限定されないが、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ、ＷＯ２００５／０６１５４７）、タンデムダイアボディ分子（ＴａｎｄＡｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ａｐｒ；１７（４）：３５７－６６．）、ＤＡＲＴ分子（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ、ＷＯ２００８／１５７３７９、ＷＯ２０１０／０８０５３８）、一本鎖ダイアボディ分子（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ａｐｒ ３；４２５（３）：４７９－８４）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンｓｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＷＯ２０１０／０５９３１５）、及びＣＯＭＢＯＤＹ分子（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ａｕｇ；８８（６）：６６７－７５．）、二重標的化ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ、Ｈｍｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１０）、並びに二重標的化重鎖単一ドメイン抗体が挙げられる。
一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、制御されたＦａｂ－アーム交換（ＷＯ２０１１／１３１７４６（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されるなど）を介して得られたダイアボディ、クロスボディ、又は二重特異性抗体である。
一実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ、ＷＯ２０１１／１３１７４６）である。
本発明の二重特異性などの、多重特異性抗体は、任意のアイソタイプであり得る。例示的なアイソタイプとしては、これらに限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４アイソタイプのいずれかが挙げられる。好ましくは、抗体は、例に示されるように、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであるように選択され得る。ヒト軽鎖定常領域、カッパ若しくはラムダのいずれか、又は両方、例えば、配列番号５３及び５４に記載される配列が使用され得る。例えば、一実施形態において、ＣＤ３０結合に関与する軽鎖は、カッパ定常領域を含み、ＣＤ３結合に関与する軽鎖は、ラムダ定常領域を含む。一実施形態において、本発明の抗体の両方の重鎖は、ＩｇＧ１アイソタイプである。一実施形態において、二重特異性抗体の２つの重鎖は、それぞれ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４アイソタイプである。好ましくは、二重特異性抗体は、例に示されるように、ヒトＩｇＧ１アイソタイプであるように選択され得る。任意に、好ましくは、選択されたアイソタイプの重鎖及びそのＦｃ領域配列は、好ましくはヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３領域において、二重特異性抗体の生成を可能にするように、かつ／又は不活性を導入するように修飾され得る。
一実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含む。
一実施形態において、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含まれ、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含まれる。
第１及び第２のＦｃポリペプチドは、各々、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、若しくはＩｇＡアイソタイプ、又は混合アイソタイプなどの、任意のヒトアイソタイプを含む、任意のアイソタイプであり得る。好ましくは、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプ、又は混合アイソタイプである。一実施形態において、当該Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
更なる実施形態において、多重特異性抗体は、本明細書で定義される全長抗体である。
本発明による抗体は、抗体を不活性、又は非活性化抗体にするＦｃ領域における修飾を含み得る。したがって、本明細書に開示される抗体において、一方又は両方の重鎖は、抗体が、当該修飾を含まないことを除いて、同一である抗体と比較してより低い程度でＦｃ媒介性エフェクター機能を誘導するように修飾され得る。Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、Ｔ細胞上でのＦｃ媒介性ＣＤ６９発現（すなわち、例えば、ＷＯ２０１５／００１０８５に記載される、ＣＤ３抗体媒介性、Ｆｃγ受容体依存的ＣＤ３架橋の結果としてのＣＤ６９発現）を決定することによって、Ｆｃγ受容体に結合することによって、Ｃ１ｑに結合することによって、又はＦｃγＲのＦｃ媒介性架橋の誘導によって測定され得る。特に、重鎖定常配列は、Ｆｃ媒介性ＣＤ６９発現が、野生型（非修飾）抗体と比較されるとき、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％低減するように修飾され得、当該Ｆｃ媒介性ＣＤ６９発現は、ＰＢＭＣベースの機能アッセイにおいて、例えば、ＷＯ２０１５／００１０８５の実施例３に記載されるフローサイトメトリーによって決定される。重鎖及び軽鎖定常配列の修飾はまた、当該抗体へのＣ１ｑの低減した結合をもたらし得る。非修飾抗体と比較して、低減は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％であり得、Ｃ１ｑ結合は、ＥＬＩＳＡによって決定され得る。更に、Ｆｃ領域は、当該抗体が、例えば、曲線の線形部分において、非修飾抗体と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又は１００％低減したＦｃ媒介性Ｔ細胞増殖を媒介するように修飾され得、当該Ｔ細胞増殖は、ＰＢＭＣベースの機能アッセイにおいて測定される。
Ｆｃ媒介性エフェクター機能を排除するために、アミノ酸置換、及びそれらの組み合わせが、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の定常重鎖領域に導入された、広範囲の異なる非活性化抗体フォーマットが開発されている（例えば、Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９ Ｄｅｃ；８（４）：５５、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０２０ Ｎｏｖ １７；９（４）：６４；２９（１０）：４５７－６６、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１－６０４）。
例えば、ＩｇＧ１アイソタイプ抗体において、修飾され得るアミノ酸位置の例としては、Ｌ２３４及びＬ２３５位が挙げられる。一実施形態において、第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＬ２３４及び／又はＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、置換は、好ましくは、それぞれ、Ｆ及びＥへの置換であり、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである。
アミノ酸位置Ｌ２３４及びＬ２３５の修飾に加えて、更なる位置が修飾され得ることが理解される。よって、更なる実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＲへの置換である。
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＲへの置換である。
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＡへの置換である。
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、置換は、好ましくはＡへの置換である。
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方は、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含む。
更なる実施形態において、第１のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである。
例えば、そのようなＦｃ領域置換を有する定常領域は、とりわけ、そのような置換を有さない、配列番号４４と比較することができる、配列番号４５、４６、４９、５０、５１、及び５２に提供される。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４５、４６、４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列を含む。
一実施形態において、本発明の多重特異性又は二重特異性抗体は、異なる第１及び第２のＣＨ３領域を含むＦｃ領域を含み、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強い。これらの相互作用及びそれらを達成することができる方法についての詳細は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ）に提供される。安定、ヘテロ二量体抗体は、例えば、ＣＨ３領域における少数のみの非対称的な変異を含有する２つのホモ二量体出発抗体に基づいて、ＷＯ２００８／１１９３５３及びＷＯ２０１１／１３１７４６に提供される、いわゆるＦａｂ－アーム交換によって高収率で得ることができる。
特定の実施形態において、本発明は、当該第１のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＫ４０９に対応する位置にあるアミノ酸が、Ｒであり、当該第２のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＦ４０５に対応する位置にあるアミノ酸が、Ｌであるか、又はその逆も同様である、抗体を提供する。
更なる実施形態において、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲであり、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬである。
したがって、一実施形態において、第１のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つは、置換されており、第２のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つは、置換されており、第１及び第２のＦｃポリペプチドにおける当該置換は、同じ位置にはなく、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである。例えば、そのようなＦｃ領域置換を有する定常領域は、とりわけ、そのような置換を有さない、配列番号４４と比較することができる、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５２に提供される。一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列を含む。
好ましくは、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸は、Ｌであり、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸は、Ｒであるか、又はその逆もまた同様である。
よって、一実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方は、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、及びＦ４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ｒ、及びＬへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５、及びＫ４０９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ａ、及びＲへの置換を含む。
別の実施形態において、第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方は、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、及びＫ４０９位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ｒ、及びＲへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５、及びＦ４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、Ａ、及びＬへの置換を含む。
更なる実施形態において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、を含み、
ここで、多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、そして、第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりであり、そして
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲであり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬである。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、を含み、
ここで、多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、そして、第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりであり、そして
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲであり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬである。
更なる実施形態において、本発明は、
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、を含む多重特異性抗体に関し、
ここで、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり、そして、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、そして、第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりであり、そして、
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲであり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬである。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、を含む多重特異性抗体に関し、
ここで、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり、そして、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、第１のＦｃポリペプチド及び第１の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含まれ、そしてここで、第２のＦｃポリペプチド及び第２の重鎖可変領域は、同じポリペプチド鎖内に含まれ、
ここで、第１のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、そして、第２のＦｃポリペプチドは、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、アミノ酸位置は、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりであり、そして、
ここで、第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲであり、そして
ここで、第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬである。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１７及び１９に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
更なる実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１７及び１９に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなり、当該抗体は、二重特異性抗体である。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号１７及び３５に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５５及び１９に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号５５及び３５に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる。
なお更なる実施形態において、本発明の抗体は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲである。より更なる実施形態において、本発明の抗体は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲである。
配列番号４４～５２及び５５に列挙される定常領域配列は、Ｃ末端リジン（Ｋ）を含まない。しかしながら、これらのＦｃ領域が由来するヒトにおいて見出される天然に存在する配列において、そのようなＣ末端リジンは、オープンリーディングフレームの一部として存在し得る。組換え抗体の細胞培養物産生中に、この末端リジンは、内因性カルボキシペプチダーゼによるタンパク質分解によって切断され得、同じ配列を有するがＣ末端リジンを欠く定常領域をもたらす。抗体の製造目的のために、この末端リジンをコードするＤＮＡは、抗体がリジンなしで産生されるように、配列から省略され得る。抗体をコードする配列からのＣ末端リジンの省略は、Ｃ末端リジンの存在に対して抗体の均質性を増加させ得る。末端リジンをコードするか、又はコードしない核酸配列から産生される抗体は、Ｃ末端リジンの処理の程度が、例えば、ＣＨＯベースの産生系で産生された抗体を使用するときに、典型的には高いため、配列において及び機能において実質的に同一である（Ｄｉｃｋ，Ｌ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２００８；１００：１１３２－１１４３）。したがって、本発明による抗体は、本明細書に列挙されるようなＣ末端リジンをコードすることなく又は有することなく生成することができることが理解される。よって、製造目的のために、Ｃ末端リジンを有することなく抗体を生成することができる。
代替の実施形態において、本発明による多重特異性抗体は、Ｆｃ領域を含む古典的な全長抗体ではない。例えば、一実施形態において、
（ｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、Ｆａｂであるか、
（ｉｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか、
（ｉｉｉ）ＣＤ３０結合領域は、Ｆａｂであり、ＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか、又は
（ｉｖ）ＣＤ３０結合領域は、ｓｃＦｖであり、ＣＤ３結合領域は、Ｆａｂである。
（ｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、Ｆａｂであるか、
（ｉｉ）ＣＤ３０結合領域及び／若しくはＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか、
（ｉｉｉ）ＣＤ３０結合領域は、Ｆａｂであり、ＣＤ３結合領域は、ｓｃＦｖであるか、又は
（ｉｖ）ＣＤ３０結合領域は、ｓｃＦｖであり、ＣＤ３結合領域は、Ｆａｂである。
結合、細胞傷害性、及びＴ細胞活性化
ヒトＣＤ３及びヒトＣＤ３０に結合することができる本明細書に記載される、二重特異性抗体などの、抗体は、ヒトＣＤ３０発現がん細胞にＴ細胞を有利に標的化し、それによって当該がん細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘導することができる。
ヒトＣＤ３及びヒトＣＤ３０に結合することができる本明細書に記載される、二重特異性抗体などの、抗体は、ヒトＣＤ３０発現がん細胞にＴ細胞を有利に標的化し、それによって当該がん細胞のＴ細胞媒介性殺滅を誘導することができる。
上述のように、好ましくは、本発明による抗体は、不活性であり、更に、抗体は、以下の特徴のうちの１つ以上を含む：
ａ）例えば、本明細書における実施例に記載される例について、フローサイトメトリーを使用して試験されるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＤＬ－４０細胞、ＫＡＲＰＡＳ－２９９細胞、Ｌ－８２細胞、ＳＲ－７８６細胞、Ｌ－５４０細胞、ＫＭ－Ｈ２細胞、Ｌ－１２３６細胞、ＪＶＭ－２細胞、ＨＨ細胞、ＮＣＥＢ－１細胞、及び／又はＨＤＬＭ－２細胞などの、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞に結合することができ、
ｂ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製されたＰＢＭＣ、ＡＤＣＣエフェクター細胞、又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用するとき、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞の濃度依存的細胞傷害性を媒介することができ、
ｃ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製されたＰＢＭＣ又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用するとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、Ｌ－４２８細胞、ＫＭ－Ｈ２細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－２細胞からなる群から選択される１つ以上のヒトＣＤ３０発現腫瘍細胞株の濃度依存的細胞傷害性を媒介することができ、
ｄ）例えば、本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞の存在下でインビトロでＴ細胞の増殖を誘導することができ、
ｅ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、Ｌ－４２８細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－２細胞からなる群から選択される１つ以上のＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株の存在下でインビトロでＴ細胞を活性化することができ、
ｆ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、サイトカイン及びグランザイムＢのＴ細胞によるインビトロでの用量依存的産生を誘導することができ、
ｇ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０が活性化されたＴ細胞の亜集団上で発現されても、Ｔ細胞のフラトリサイドをもたらさないことができ、かつ／あるいは
ｈ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ｓＣＤ３０の存在下でもＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することができる。
ａ）例えば、本明細書における実施例に記載される例について、フローサイトメトリーを使用して試験されるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＤＬ－４０細胞、ＫＡＲＰＡＳ－２９９細胞、Ｌ－８２細胞、ＳＲ－７８６細胞、Ｌ－５４０細胞、ＫＭ－Ｈ２細胞、Ｌ－１２３６細胞、ＪＶＭ－２細胞、ＨＨ細胞、ＮＣＥＢ－１細胞、及び／又はＨＤＬＭ－２細胞などの、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞に結合することができ、
ｂ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製されたＰＢＭＣ、ＡＤＣＣエフェクター細胞、又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用するとき、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞の濃度依存的細胞傷害性を媒介することができ、
ｃ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、例えば、精製されたＰＢＭＣ又はＴ細胞をエフェクター細胞として使用するとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、Ｌ－４２８細胞、ＫＭ－Ｈ２細胞、ＳＵＰ－Ｍ２細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－２細胞からなる群から選択される１つ以上のヒトＣＤ３０発現腫瘍細胞株の濃度依存的細胞傷害性を媒介することができ、
ｄ）例えば、本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞の存在下でインビトロでＴ細胞の増殖を誘導することができ、
ｅ）本明細書における実施例に記載されるようにアッセイされるとき、ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞、Ｌ－４２８細胞、ＫＩ－ＪＫ細胞、及びＨＤＬＭ－２細胞からなる群から選択される１つ以上のＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株の存在下でインビトロでＴ細胞を活性化することができ、
ｆ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、サイトカイン及びグランザイムＢのＴ細胞によるインビトロでの用量依存的産生を誘導することができ、
ｇ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ＣＤ３０が活性化されたＴ細胞の亜集団上で発現されても、Ｔ細胞のフラトリサイドをもたらさないことができ、かつ／あるいは
ｈ）本明細書における例に記載されるようにアッセイされるとき、ｓＣＤ３０の存在下でもＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することができる。
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、０．０２０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０２５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０３０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０３５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０４０μｇ／ｍｌ未満のような、０．０４５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０５０μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０濃度でＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する。
更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、９０％を超えるような、８５％を超えるなどの、８０％を超えるＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導する場合、最大の溶解を有する。
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、０．０３μｇ／ｍｌ未満のような、０．０３５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０４μｇ／ｍｌ未満のような、０．０４５μｇ／ｍｌ未満などの、０．０５μｇ／ｍｌ未満のＣＤ２５発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、０．０００７μｇ／ｍｌ未満のような、０．０００８μｇ／ｍｌ未満などの、０．０００９μｇ／ｍｌ未満のような、０．００１μｇ／ｍｌ未満などの、０．００５μｇ／ｍｌ未満のＣＤ２５発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、０．０００９μｇ／ｍｌ未満のような、０．００１μｇ／ｍｌ未満などの、０．００２μｇ／ｍｌ未満のような、０．００３μｇ／ｍｌ未満などの、０．００４μｇ／ｍｌ未満のＣＤ６９発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、０．００１５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００２０μｇ／ｍｌ未満などの、０．００２５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００３０μｇ／ｍｌ未満などの、０．００３５μｇ／ｍｌ未満のＣＤ６９発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。
一実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、０．００５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００６μｇ／ｍｌ未満などの、０．００７μｇ／ｍｌ未満のような、０．００８μｇ／ｍｌ未満などの、０．０１μｇ／ｍｌ未満のＰＤ－１発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ４＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。更なる実施形態において、本明細書に記載される抗体は、本明細書において実施例に記載されるように、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を使用し、フローサイトメトリーによって測定してアッセイされるとき、０．００３μｇ／ｍｌ未満のような、０．００４μｇ／ｍｌ未満などの、０．００５μｇ／ｍｌ未満のような、０．００６μｇ／ｍｌ未満などの、０．００７μｇ／ｍｌ未満のＰＤ－１発現のＥＣ５０濃度を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導する。
アッセイは、当業者に一般的に知られるように行われ得、任意に、４：１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比、及び／又は任意に、７２時間のインキュベーション期間を含み得る。アッセイは、例えば、腫瘍細胞、好ましくは、標識された腫瘍細胞、例えば、Ｌ－４２８腫瘍細胞を提供すること、本明細書に記載される抗体を、好ましくは段階希釈で添加すること、Ｔ細胞、好ましくは標識されたＴ細胞を、４：１のＥ：Ｔであるエフェクター対標的の比で提供し、７２時間インキュベートすること、任意に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ６９、及び／又はＰＤ－１などの関連パラメータについて染色すること、並びに最終的に、ＦＡＣＳのようなフローサイトメトリーを使用して細胞を分析することによって実施することができる。生きた細胞及び／又はＴ細胞増殖／活性化％は、当業者に公知の分析によって得られたデータから計算され得る。
本発明の抗体の産生
ハイブリッドハイブリドーマ及び化学的複合化方法（Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ（２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２６：６４９）などの従来の方法は、本発明の二重特異性抗体などの、多重特異性の調製に使用することができる。異なる重鎖及び軽鎖からなる、２つの抗体の宿主細胞における共発現は、所望の二重特異性抗体に加えて、可能な抗体産物の混合物をもたらし、これは次いで、例えば、親和性クロマトグラフィー又は類似の方法によって単離することができる。
ハイブリッドハイブリドーマ及び化学的複合化方法（Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ（２００５）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ ２６：６４９）などの従来の方法は、本発明の二重特異性抗体などの、多重特異性の調製に使用することができる。異なる重鎖及び軽鎖からなる、２つの抗体の宿主細胞における共発現は、所望の二重特異性抗体に加えて、可能な抗体産物の混合物をもたらし、これは次いで、例えば、親和性クロマトグラフィー又は類似の方法によって単離することができる。
前述のように、異なる抗体構築物の共発現時に、機能的二重特異性産物の形成を優先する戦略、例えば、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：２１９）によって記載される方法も使用することができる。異なる抗体を産生するラット及びマウスヒドリドーマの融合は、優先的な種制限重鎖／軽鎖対合のために、限られた数のヘテロ二量体タンパク質をもたらす。ホモ二量体に対してヘテロ二量体の形成を促進する別の戦略は、第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチド中の対応する空洞に隆起が導入され、ひいては隆起をこれら２つの重鎖の界面で空洞内に配置して、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体の形成を妨げる「ノブ－イントゥ－ホール」戦略である。「隆起」は、第１のポリペプチドの界面からより大きな側鎖で小さなアミノ酸側鎖を置き換えることによって構築される。隆起と同一又は類似のサイズの補正的「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖で置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作製される（米国特許第５，７３１，１６８号）。ＥＰ１８７０４５９（Ｃｈｕｇａｉ）及びＷＯ２００９／０８９００４（Ａｍｇｅｎ）は、宿主細胞における異なる抗体ドメインの共発現時にヘテロ二量体形成を優先するための他の戦略を記載する。これらの方法では、ホモ二量体形成が静電的に好ましくなく、ヘテロ二量体化が静電的に好ましいように、両方のＣＨ３ドメインにおいてＣＨ３－ＣＨ３界面を構成する１つ以上の残基が、荷電アミノ酸で置き換えられる。ＷＯ２００７／１１０２０５（Ｍｅｒｃｋ）は、ＩｇＡ及びＩｇＧ ＣＨ３ドメイン間の差異がヘテロ二量体化を促進するために利用される、更に別の戦略を記載する。
二重特異性抗体を産生するための別のインビトロ方法は、ＷＯ２００８／１１９３５３（Ｇｅｎｍａｂ）に記載されており、二重特異性抗体は、還元条件下でのインキュベーション時に、２つの単一特異性ＩｇＧ４又はＩｇＧ４様抗体間での「Ｆａｂアーム」又は「半分子」交換（重鎖及び結合した軽鎖の交換）によって形成される。得られる産物は、異なる配列を含み得る２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。
本発明の二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体を調製するための好ましい方法は、以下のステップを含む、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ）に記載される方法を含む：
ａ）Ｆｃ領域を含む第１の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含み；
ｂ）第２のＦｃ領域を含む第２の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含み、
ここで、第１の抗体が、ＣＤ３０抗体であり、そして、第２の抗体が、ＣＤ３抗体であるか、又はその逆もまた同様であり、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く；
ｃ）当該第１の抗体を当該第２の抗体と一緒に還元条件下でインキュベートし；そして
ｄ）当該二重特異性ＣＤ×ＣＤ３０抗体を得る。
ａ）Ｆｃ領域を含む第１の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含み；
ｂ）第２のＦｃ領域を含む第２の抗体を提供し、当該Ｆｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含み、
ここで、第１の抗体が、ＣＤ３０抗体であり、そして、第２の抗体が、ＣＤ３抗体であるか、又はその逆もまた同様であり、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く；
ｃ）当該第１の抗体を当該第２の抗体と一緒に還元条件下でインキュベートし；そして
ｄ）当該二重特異性ＣＤ×ＣＤ３０抗体を得る。
同様に、本発明は、本発明による多重特異性、例えば、二重特異性抗体を産生するための方法に関し、該方法は、
ａ）本明細書に記載されるＣＤ３０結合領域を含む第１のホモ二量体抗体と、本明細書に記載されるＣＤ３結合領域を含む第２のホモ二量体抗体と、を提供し、ここで、当該抗体が、Ｆｃ領域を含み、任意に本明細書に記載される更なる特徴を含み、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む本発明のヘテロ二量体多重特異性抗体を得る、
ことを含む。
ａ）本明細書に記載されるＣＤ３０結合領域を含む第１のホモ二量体抗体と、本明細書に記載されるＣＤ３結合領域を含む第２のホモ二量体抗体と、を提供し、ここで、当該抗体が、Ｆｃ領域を含み、任意に本明細書に記載される更なる特徴を含み、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む本発明のヘテロ二量体多重特異性抗体を得る、
ことを含む。
一実施形態において、当該第１の抗体は、当該第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートされ、得られるヘテロ二量体抗体における当該第１及び第２の抗体間のヘテロ二量体相互作用は、３７℃で２４時間後に０．５ｍＭのＧＳＨでＦａｂアーム交換が発生しないようなものである。
理論に限定されることなく、ステップｃ）において、親抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は、低減され、得られるシステインは、次いで、別の親抗体分子のシステイン残基と重鎖間ジスルフィド結合を形成することができる（元々は異なる特異性を有する）。この方法の一実施形態において、ステップｃ）における還元条件は、還元剤、例えば、以下からなる群から選択される還元剤の添加を含む：２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びβ－メルカプト－エタノール、好ましくは２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤。好ましい実施形態において、還元剤は、２－メルカプトエチルアミンである。更なる実施形態において、ステップｃ）は、例えば、還元剤の除去によって、例えば、脱塩によって、非還元性又は低還元性になる条件を復元することを含む。
更なる態様において、本発明は、以下を含む単一特異性抗体に関する；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
一実施形態において、第１の重鎖可変領域は、配列番号１３に記載される配列を含み、第１の軽鎖可変領域は、配列番号１４に記載される配列を含む。
更なる態様において、本発明は、以下を含む単一特異性抗体に関する；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域。
一実施形態において、配列番号９におけるＸは、Ｈである。別の実施形態において、配列番号９におけるＸは、Ｇである。一実施形態において、第２の重鎖可変領域は、配列番号１５に記載される配列を含み、第２の軽鎖可変領域は、配列番号１６に記載される配列を含む。
一実施形態において、上記の単一特異性抗体は、全長抗体である。好ましくは、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つは置換されており、好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸はＬであるか、又は、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸はＲである。
更なる態様において、本発明は、多重特異性抗体を産生するための方法に関し、該方法は、
ａ）本明細書における上記のような第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、及び、以下を含む第２の抗体、を提供するか；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ａへの置換と、を含むＦｃ領域、
又は
本明細書における上記のような第２の単一特異性ＣＤ３抗体、及び、以下を含む第１の抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む、ＣＤ３０結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域；
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであり、そして、第２のＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであるか、又はその逆もまた同様であり；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗体を得る、
ことを含む、方法。
ａ）本明細書における上記のような第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、及び、以下を含む第２の抗体、を提供するか；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ａへの置換と、を含むＦｃ領域、
又は
本明細書における上記のような第２の単一特異性ＣＤ３抗体、及び、以下を含む第１の抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む、ＣＤ３０結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域；
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであり、そして、第２のＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであるか、又はその逆もまた同様であり；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗体を得る、
ことを含む、方法。
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載される多重特異性抗体を産生するための方法に関し、該方法は、
ａ）本明細書に記載される第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、および、以下を含む第２の抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む、ＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであり、そして、第２のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬである；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗体を得る、
ことを含む。
ａ）本明細書に記載される第１の単一特異性ＣＤ３０抗体、および、以下を含む第２の抗体、を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含む、ＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ａへの置換と、を含む、Ｆｃ領域、
ここで、第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、第１のＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであり、そして、第２のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬである；
ｂ）第１の抗体を第２の抗体と一緒に、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む多重特異性抗体を得る、
ことを含む。
本発明は、本明細書に記載される方法によって得られる多重特異性抗体に更に関する。
上記の方法において、ＣＤ３０及び／又はＣＤ３に結合することができる第１又は第２のホモ二量体抗体を提供するステップは、以下のステップを含み得る；
－１以上の当該抗体を産生するための発現ベクターを含有する細胞を提供するステップ、
－細胞を１以上の当該抗体を産生させるステップ、その後、
－１又は複数の当該抗体を得て、それによって１以上の当該抗体を提供するステップ。
－１以上の当該抗体を産生するための発現ベクターを含有する細胞を提供するステップ、
－細胞を１以上の当該抗体を産生させるステップ、その後、
－１又は複数の当該抗体を得て、それによって１以上の当該抗体を提供するステップ。
この方法の一実施形態において、当該第１及び／又は第２のホモ二量体抗体は、全長抗体である。
第１及び第２のホモ二量体抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない、任意のアイソタイプであり得る。この方法の一実施形態において、当該第１及び当該第２のホモ二量体抗体の両方のＦｃ領域は、ＩｇＧ１アイソタイプである。別の実施形態において、当該ホモ二量体抗体のＦｃ領域の一方は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、他方は、ＩｇＧ４アイソタイプである。後者の実施形態において、得られる二重特異性抗体は、ＩｇＧ１のＦｃ領域及びＩｇＧ４のＦｃ領域を含み、よって、エフェクター機能の活性化に関して興味深い中間体特性を有し得る。
更なる実施形態において、ホモ二量体出発抗体のうちの１つは、プロテインＡに結合しないように操作されており、よって産物をプロテインＡカラム上に通すことによってヘテロ二量体抗体をホモ二量体出発抗体から分離することを可能にし、フロースルーを除去し、ヘテロ二量体抗体をプロテインＡカラムから溶出させて、精製されたヘテロ二量体抗体組成物を得る。
上述のように、ホモ二量体出発抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列は、異なり得、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強い。これらの相互作用及びそれらを達成することができる方法についての詳細は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ）に提供される。
特に、安定な二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体は、それぞれ、ＣＤ３０及びＣＤ３に結合し、ＣＨ３領域に少数のみの、かなり保存的な非対称変異を含有する２つのホモ二量体出発抗体に基づいて、本発明の上記方法を使用して高収率で得ることができる。非対称変異は、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が非同一位置でアミノ酸置換を含有することを意味する。
本発明の多重特異性、例えば、二重特異性抗体はまた、単一細胞における第１及び第２のポリペプチドをコードする構築物の共発現によって得られ得る。
よって、更なる態様において、本発明は、本発明による多重特異性抗体をコードする核酸構築物、又は核酸構築物の組み合わせに関し、そのような核酸構築物を含む発現ベクター、又は発現ベクターの組み合わせに関する。
更に、本発明は、本発明による多重特異性抗体を産生することができる組換え宿主細胞に関し、宿主細胞は、本発明による多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸構築物を含む。
したがって、本発明はまた、本発明による多重特異性抗体を産生するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）抗体が産生される条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養することと、
（ｉｉ）産生された多重特異性抗体を培養物から単離することと、を含む。
（ｉ）抗体が産生される条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養することと、
（ｉｉ）産生された多重特異性抗体を培養物から単離することと、を含む。
一実施形態において、当該方法は、以下のステップを含む：
ａ）第１の抗体重鎖の第１のＦｃ領域及び第１の抗原結合領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸構築物を提供し、当該第１のＦｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含み、
ｂ）第２の抗体重鎖の第２のＦｃ領域及び第２の抗原結合領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸構築物を提供し、当該第２のＦｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含み、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、任意に、当該第１及び第２の核酸構築物が、当該第１及び第２の抗体の軽鎖配列をコードし；
ｃ）当該第１及び第２の核酸構築物を宿主細胞において共発現させ；そして
ｄ）当該ヘテロ二量体タンパク質を細胞培養物から得る。
ａ）第１の抗体重鎖の第１のＦｃ領域及び第１の抗原結合領域を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸構築物を提供し、当該第１のＦｃ領域が、第１のＣＨ３領域を含み、
ｂ）第２の抗体重鎖の第２のＦｃ領域及び第２の抗原結合領域を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸構築物を提供し、当該第２のＦｃ領域が、第２のＣＨ３領域を含み、
ここで、当該第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては当該第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、当該第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、任意に、当該第１及び第２の核酸構築物が、当該第１及び第２の抗体の軽鎖配列をコードし；
ｃ）当該第１及び第２の核酸構築物を宿主細胞において共発現させ；そして
ｄ）当該ヘテロ二量体タンパク質を細胞培養物から得る。
好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるコードされたアミノ酸は、第１のＣＨ３領域にあるＬであり、Ｋ４０９に対応する位置にあるコードされたアミノ酸は、第２のＣＨ３領域にあるＲであるか、又はその逆もまた同様である。
プロモーター、エンハンサーなどを含む、好適な発現ベクター、及び抗体の産生に好適な宿主細胞は、当該技術分野で周知である。宿主細胞の例としては、酵母、細菌、及び哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト、例えば、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞が挙げられる。
本明細書に定義される核酸、又は１つ以上の核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る。本明細書で定義される核酸、又は１つ以上の核酸は、哺乳動物細胞における発現における使用のためのものであり得る。したがって、更に、本発明は、本明細書で定義される、核酸又は核酸（複数）を含む、１以上の細胞を提供する。
本発明の文脈における核酸は、染色体、非染色体、及び合成核酸ベクター（好適な発現制御要素のセットを含む核酸配列）を含む、任意の好適なベクターであり得る、発現ベクターであり得る。そのようなベクターの例としては、ＳＶ４０の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミド及びファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、並びにウイルス核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態において、ＣＤ３０又はＣＤ３抗体コード核酸は、例えば、直鎖発現要素（例えば、Ｓｙｋｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７，３５５ ５９（１９９７）に記載される）、コンパクト核酸ベクター（例えば、ＵＳ６，０７７，８３５及び／又はＷＯ００／７００８７に記載される）、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ １９／１８、若しくはｐＵＣ １１８／１１９などのプラスミドベクター、「ミッジ」最小サイズの核酸ベクター（例えば、Ｓｃｈａｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３，７９３ ８００（２００１）に記載される）を含む、裸のＤＮＡ若しくはＲＮＡベクターに、又はＣａＰ０４沈澱構築物（例えば、ＷＯ２０００／４６１４７、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｈｅｆ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３，９５５１ ５５（１９８６）、Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １４，７２５（１９７８）、及びＣｏｒａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７，６０３（１９８１）に記載される）などの、沈澱核酸ベクター構築物として含まれる。そのような核酸ベクター及びその使用法は、当該技術分野で周知である（例えば、ＵＳ５，５８９，４６６及びＵＳ５，９７３，９７２を参照されたい）。
一実施形態において、ベクターは、細菌細胞におけるＣＤ３０抗体及び／又はＣＤ３抗体の発現に適している。そのようなベクターの例としては、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４，５５０３ ５５０９（１９８９）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）などのような発現ベクターが挙げられる。
発現ベクターはまた、又は代替的に、酵母系における発現に好適なベクターであり得る。酵母系における発現に好適な任意のベクターが使用され得る。好適なベクターとしては、例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性プロモーターを含むベクターが挙げられる（Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）、及びＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３，５１６ ５４４（１９８７）において概説される）。
核酸及び／又は発現ベクターはまた、分泌／局在化配列をコードする核酸配列を含み得、これは、新生ポリペプチド鎖などの、ポリペプチドを、細胞周辺腔又は細胞培養培地に標的化することができる。そのような配列は、当該技術分野で既知であり、分泌リーダー又はシグナルペプチドを含む。核酸及び／又は発現ベクターは、（二重特異性）抗体の成分が発現されるように、発現、すなわち、核酸の転写及び／又は翻訳を促進する任意の好適な要素を含み得る。核酸及び／又はベクターは、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、及び他の発現促進要素と会合する。そのような要素の例としては、強い発現プロモーター（例えば、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター／エンハンサー、並びにＲＳＶ、ＳＶ４０、ＳＬ３ ３、ＭＭＴＶ、及びＨＩＶ ＬＴＲプロモーター）、有効なポリ（Ａ）終結配列、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミド産物の複製起点、選択可能なマーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、及び／又は便利なクローニング部位（例えば、ポリリンカー）が挙げられる。核酸は、ＣＭＶ ＩＥなどの構成的プロモーターとは対照的に、誘導性プロモーターも含み得る。
組成物及び（医学的）使用
更に、本発明は、本明細書に定義される抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、そのような組成物は、薬学的組成物であり、すなわち、抗体は、薬学的に許容される担体に含まれる。
更に、本発明は、本明細書に定義される抗体を含む組成物を提供する。好ましくは、そのような組成物は、薬学的組成物であり、すなわち、抗体は、薬学的に許容される担体に含まれる。
薬学的組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されるものなどの従来の技法に従って製剤化され得る。本発明の薬学的組成物は、例えば、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０又はＴｗｅｅｎ－８０などの、非イオン性洗剤）、安定剤（例えば、糖又はタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、及び／又は薬学的組成物中の包含に好適な他の材料を含み得る。
薬学的組成物は、任意の好適な経路及びモードによって投与され得る。一実施形態において、薬学的組成物は、静脈内又は皮下注射又は注入によって投与される。
本発明による抗体、組成物、又は薬学的組成物は、好ましくは、医薬としての使用のためのものである。
本発明による抗体、組成物、又は薬学的組成物は、好ましくは、疾患の治療における使用のためのものである。
特に、本発明の二重特異性抗体は、様々な形態のがんの治療のために使用され得る。
一態様において、本発明は、対象においてがんを治療するための方法を提供し、その方法は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体の投与を含む。更なる実施形態において、本発明は、対象において、ＣＤ３０を発現する細胞を含む障害を治療するための方法を提供し、その方法は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体の投与を含む。
前述のように、本発明による方法及び使用において企図することができる好適な疾患は、がんである。当該がんは、最も好ましくは、ＣＤ３０の発現を特徴とする。がんにおけるＣＤ３０の発現は、ＰＣＲ、免疫染色、又はＦＡＣＳ分析などの、当該技術分野で既知の方法を使用して、すなわち、ＣＤ３０転写物及び／又はタンパク質の発現の検出をして、容易に決定することができる。ヒトＣＤ３０に結合することができる本明細書に記載される抗体は、例えば、免疫染色及び／又はＦＡＣＳ分析などにおいて使用され得る。
一態様において、本発明は、ホジキンリンパ腫又は未分化大細胞リンパ腫の治療における使用のための、本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学的組成物に関する。
更なる態様において、本発明は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における使用のための、本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学的組成物に関する。
一実施形態において、ホジキンリンパ腫は、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）である。
一実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）又はＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）である。更なる実施形態において、非ホジキンリンパ腫は、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）である。
更なる実施形態において、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫は、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）又は皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である。なお更なる実施形態において、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。なお更なる実施形態において、末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）は、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）である。
一実施形態において、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）は、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）である。
より更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、再発性及び難治性ホジキンリンパ腫である。更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、ＣＤ３０＋ホジキンリンパ腫である。なお更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、再発性及び難治性ＣＤ３０＋ホジキンリンパ腫である。より更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）は、再発性及び難治性ＣＤ３０＋古典的ホジキンリンパ腫である。
より更なる実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、再発性及び難治性非ホジキンリンパ腫である。更なる実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、ＣＤ３０＋非ホジキンリンパ腫である。なお更なる実施形態において、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、再発性及び難治性ＣＤ３０＋非ホジキンリンパ腫である。
更なる実施形態において、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における使用のための本発明による多重特異性抗体、組成物、又は薬学的組成物は、静脈内及び／又は皮下、好ましくは皮下投与されているか、又は投与された。
更なる実施形態において、がんと診断されている患者は、がん細胞におけるＣＤ３０発現の評価に供され得、ＣＤ３０が検出されるとき、これは低～高の範囲であり得、そのような患者は、本発明による抗体での治療に選択され得る。しかしながら、治療について患者を選択する際にそのような評価を含めることが必ずしも要件ではない場合がある。
本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ３０を発現する細胞を含む障害の診断及び治療を含む多数のインビトロ及びインビボ診断及び治療有用性を有する。例えば、抗体は、様々な障害を治療、予防、及び／又は診断するために、培養物中の細胞に、例えば、インビトロ若しくはエクスビボで、又は対象に、例えば、インビボで投与することができる。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト個体を含むことが意図される。
一態様において、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つに記載の多重特異性抗体を含む診断用組成物に関する。
一実施形態において、診断用組成物は、多重特異性抗体での治療から利益を得るであろう患者をスクリーニングし、選択するために使用されるコンパニオン診断薬である。
キット
本発明は、上記に開示される抗体を含むキットオブパーツ、例えば、コンパニオン診断薬としての／患者の集団内で、本明細書において上記で定義される抗体での治療に応答する傾向を有する患者を特定するための、又は患者の治療に使用されるときの当該抗体の有効性若しくは抗腫瘍活性を予想するための使用のためのキットであって、上記に定義される抗体と当該キットの使用説明書とを含む、キットを提供する。
本発明は、上記に開示される抗体を含むキットオブパーツ、例えば、コンパニオン診断薬としての／患者の集団内で、本明細書において上記で定義される抗体での治療に応答する傾向を有する患者を特定するための、又は患者の治療に使用されるときの当該抗体の有効性若しくは抗腫瘍活性を予想するための使用のためのキットであって、上記に定義される抗体と当該キットの使用説明書とを含む、キットを提供する。
一実施形態において、本発明は、多重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体を含む容器と、ＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞の架橋を検出するための１つ以上の試薬と、を含む、がんの診断のためのキットを提供する。試薬は、例えば、蛍光タグ、酵素タグ、又は他の検出可能なタグを含み得る。試薬はまた、酵素反応のための二次又は三次抗体又は試薬を含み得、酵素反応は、視覚化され得る産物を産生する。
更なる態様において、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる多重特異性抗体の投与時に、患者に由来する試料においてＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞間の架橋が生じるかを検出するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）試料を、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる多重特異性抗体と、当該二重特異性抗体とＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、そして、
（ｉｉ）複合体が形成されたかを分析する、
ことを含む。
（ｉ）試料を、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つによる多重特異性抗体と、当該二重特異性抗体とＣＤ３０発現細胞及びＣＤ３発現細胞との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させ、そして、
（ｉｉ）複合体が形成されたかを分析する、
ことを含む。
核酸構築物及び送達ビヒクルの送達
更なる態様において、本発明は、インビボ発現のための本発明の抗体をコードする核酸構築物の投与に関する。抗体をコードする核酸のインビボ発現のために、当該核酸は、典型的には、核酸が対象の細胞に入るために好適な形態で投与される。インビボ発現のための核酸を送達するための異なる方法が存在し、機械的手段及び化学的手段を含む方法の両方を含む。例えば、そのような方法は、エレクトロポレーション又は核酸を皮膚上に入れ墨することを含み得る（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５，１９８２－１９９３）。対象への核酸の投与に好適な他の方法は、好適な製剤中の核酸の投与を伴う。
更なる態様において、本発明は、インビボ発現のための本発明の抗体をコードする核酸構築物の投与に関する。抗体をコードする核酸のインビボ発現のために、当該核酸は、典型的には、核酸が対象の細胞に入るために好適な形態で投与される。インビボ発現のための核酸を送達するための異なる方法が存在し、機械的手段及び化学的手段を含む方法の両方を含む。例えば、そのような方法は、エレクトロポレーション又は核酸を皮膚上に入れ墨することを含み得る（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２５，１９８２－１９９３）。対象への核酸の投与に好適な他の方法は、好適な製剤中の核酸の投与を伴う。
よって、本発明はまた、本発明による核酸又は核酸の組み合わせを含む送達ビヒクルに関する。いくつかの実施形態において、当該送達ビヒクルは、脂質製剤であり得る。製剤の脂質は、粒子、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であり得る。本発明の核酸又は核酸の組み合わせは、当該粒子内、例えば、当該ＬＮＰ内にカプセル化され得る。インビボ発現のための対象への核酸の投与に好適な異なる脂質製剤は、当業者に周知である。例えば、当該脂質製剤は、典型的には、脂質、イオン化可能なアミノ脂質、ＰＥＧ脂質、コレステロール、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
治療抗体の発現のための対象への核酸の投与に好適な脂質製剤の調製のための様々な形態及び方法は、当該技術分野で周知である。そのような脂質製剤の例としては、ＵＳ２０１８／０１７０８６６（Ａｒｃｔｕｒｕｓ）、ＥＰ２３９１３４３（Ａｒｂｕｔｕｓ）、ＷＯ２０１８／００６０５２（Ｐｒｏｔｉｖａ）、ＷＯ２０１４／１５２７７４（Ｓｈｉｒｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＥＰ２９７２３６０（Ｔｒａｎｓｌａｔｅ Ｂｉｏ）、ＵＳ１０１９５１５６（Ｍｏｄｅｒｎａ）、及びＵＳ２０１９／００２２２４７（Ａｃｕｉｔａｓ）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、更なる態様において、本発明は、（ａ）医薬としての使用のための、好ましくはホジキンリンパ腫又は未分化大細胞リンパ腫の治療などの、がんの治療における使用のための、本発明による核酸構築物又は本発明による送達ビヒクルに関する。
本発明は、以下の例によって更に例示され、これは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１ ２－ＭＥＡ誘導Ｆａｂ－アーム交換によるＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の生成
以下の抗体を実施例に使用した：
以下の抗体を実施例に使用した：
ヒト化ＣＤ３抗体
ＷＯ２０１５／００１０８５（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例１に記載されるＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１である。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１は、本明細書において「ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３」と称される。
ＷＯ２０１７／００９４４２（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例２に記載されるＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇである。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇは、本明細書において「ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ」と称される。
ＷＯ２０１５／００１０８５（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例１に記載されるＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１である。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１は、本明細書において「ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３」と称される。
ＷＯ２０１７／００９４４２（Ｇｅｎｍａｂ）の実施例２に記載されるＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇである。ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１Ｌ１－Ｈ１０１Ｇは、本明細書において「ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ」と称される。
ＣＤ３０抗体
ＨｕＭａｂ ５Ｆ１１とも称される、ＭＤＸ－０６０は、ＷＯ２００３／０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）に開示されている。ｈＡＣ１０（又はＳＧＮ－３０）は、ＵＳ８２５７７０６及びＵＳ２０１００２３９５７１（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に開示されている。ＨＲＳ－３は、ＷＯ２０１６／０１７７８４６（Ａｆｆｉｍｅｄ）に開示されている。ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ１０５、Ｔ４０８、及びＴ２１５は、ＷＯ２００７／０４０６５３（米国政府及び保健）に開示されている。
ＨｕＭａｂ ５Ｆ１１とも称される、ＭＤＸ－０６０は、ＷＯ２００３／０５９２８２（Ｍｅｄａｒｅｘ）に開示されている。ｈＡＣ１０（又はＳＧＮ－３０）は、ＵＳ８２５７７０６及びＵＳ２０１００２３９５７１（Ｓｅａｔｔｌｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に開示されている。ＨＲＳ－３は、ＷＯ２０１６／０１７７８４６（Ａｆｆｉｍｅｄ）に開示されている。ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ１０５、Ｔ４０８、及びＴ２１５は、ＷＯ２００７／０４０６５３（米国政府及び保健）に開示されている。
抗体発現
抗体配列を、ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）にクローニングし、ＦｃドメインにおいてＦｃサイレンシング及び／又はＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術アミノ酸置換あり又はなしで、ＩｇＧ１、κ又はＩｇＧ１、λとして発現させた（下記を参照されたい）。全ての抗体を、本質的に製造業者によって記載されるように、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２５）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２７）において関連する重鎖及び軽鎖発現ベクターを共トランスフェクションすることによって、無血清条件下で産生した。
抗体配列を、ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳ）にクローニングし、ＦｃドメインにおいてＦｃサイレンシング及び／又はＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術アミノ酸置換あり又はなしで、ＩｇＧ１、κ又はＩｇＧ１、λとして発現させた（下記を参照されたい）。全ての抗体を、本質的に製造業者によって記載されるように、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２５）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２７）において関連する重鎖及び軽鎖発現ベクターを共トランスフェクションすることによって、無血清条件下で産生した。
二重特異性抗体の生成
二重特異性抗体を、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）プラットフォーム技術、すなわち、ＷＯ２０１１／１４７９８６、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ）並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３，１１０：５１４５－５０、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２０１３，５：９６２－９７３）に記載される２－ＭＥＡ誘導された制御されたＦａｂ－アーム交換（ｃＦＡＥ）を使用してインビトロで生成した。この方法によって二重特異性抗体の生成を可能にするために、ＣＨ３ドメインにおける単一変異を保有するＩｇＧ１分子を生成した：１つの親ＩｇＧ１抗体においては、Ｆ４０５Ｌ変異（すなわち、ＣＤ３抗体又は対照、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的、抗体）であり、他の親ＩｇＧ１抗体においては、Ｋ４０９Ｒ変異（すなわち、ＣＤ３０又は対照抗体）である。これらの変異に加えて、親ＩｇＧ１抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ受容体（Ｆｃガンマ受容体）及び／又は補体因子、例えば、Ｃ１ｑ：Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ、ＵＳ２０１５／０３３７０４９）若しくはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）と相互作用することができないＦｃドメインをもたらす置換を含んだ。
二重特異性抗体を、ＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）プラットフォーム技術、すなわち、ＷＯ２０１１／１４７９８６、ＷＯ２０１１／１３１７４６及びＷＯ２０１３／０６０８６７（Ｇｅｎｍａｂ）並びにＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１３，１１０：５１４５－５０、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２０１３，５：９６２－９７３）に記載される２－ＭＥＡ誘導された制御されたＦａｂ－アーム交換（ｃＦＡＥ）を使用してインビトロで生成した。この方法によって二重特異性抗体の生成を可能にするために、ＣＨ３ドメインにおける単一変異を保有するＩｇＧ１分子を生成した：１つの親ＩｇＧ１抗体においては、Ｆ４０５Ｌ変異（すなわち、ＣＤ３抗体又は対照、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的、抗体）であり、他の親ＩｇＧ１抗体においては、Ｋ４０９Ｒ変異（すなわち、ＣＤ３０又は対照抗体）である。これらの変異に加えて、親ＩｇＧ１抗体は、ＩｇＧ Ｆｃ受容体（Ｆｃガンマ受容体）及び／又は補体因子、例えば、Ｃ１ｑ：Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ（ＦＥＡ、ＵＳ２０１５／０３３７０４９）若しくはＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ（ＦＥＲ）と相互作用することができないＦｃドメインをもたらす置換を含んだ。
Ｆｃサイレンシング及びＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）技術変異の組み合わせは、以下のように称された。
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＦ４０５Ｌ：ＦＥＡＬ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＡＲ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＲＲ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＦ４０５Ｌ：ＦＥＡＬ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｄ２６５Ａ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＡＲ
Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３６Ｒ、及びＫ４０９Ｒ：ＦＥＲＲ
親抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列は、以下の配列番号で記載される：
二重特異性抗体を生成するために、２つの親抗体を等モル比でＰＢＳ緩衝液（リン酸塩緩衝生理食塩水、８．７ｍＭのＨＰＯ４
２－、１．８ｍＭのＨ２ＰＯ４
－、１６３．９ｍＭのＮａ＋、１４０．３ｍＭのＣｌ－、ｐＨ７．４）中で混合した。２－メルカプトエチルアミン－ＨＣｌ（２－ＭＥＡ）を７５ｍＭの最終濃度に加え、反応混合物を３１℃で５時間インキュベートした。２－ＭＥＡを、製造業者のプロトコルに従って１０ｋＤａの分子量カットオフＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒキャリッジ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＢＳ緩衝液中への透析によって除去した。試料を４℃で一晩保存して、ジスルフィド結合の再酸化及び無傷の二重特異性抗体の形成を可能にした。ｃＦＡＥの有効性は、Ｇｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（ＭＡｂｓ．２０１３ Ｎｏｖ １；５（６）：９６２－９７３．）によって記載されるエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）によって評価されるように、＞９５％であった。
非結合対照抗体ｂ１２
ＩｇＧ１－ｂ１２は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的抗体（Ｂａｒｂａｓ，ＣＦ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９３ Ａｐｒ ５；２３０（３）：８１２－２３）であり、それは、例のいくつかにおいて陰性、非結合対照抗体として使用される。重鎖の配列及び軽鎖の配列は、本明細書において、それぞれ、配列番号３６及び３７（ＦＥＡＬ）又はそれぞれ、配列番号３８及び３７（ＦＥＲＲ）として含まれる。
ＩｇＧ１－ｂ１２は、ＨＩＶ－１ ｇｐ１２０特異的抗体（Ｂａｒｂａｓ，ＣＦ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９３ Ａｐｒ ５；２３０（３）：８１２－２３）であり、それは、例のいくつかにおいて陰性、非結合対照抗体として使用される。重鎖の配列及び軽鎖の配列は、本明細書において、それぞれ、配列番号３６及び３７（ＦＥＡＬ）又はそれぞれ、配列番号３８及び３７（ＦＥＲＲ）として含まれる。
実施例２－ヒトホジキンリンパ腫（ＨＬ）、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、及びＴＬＬ細胞株におけるＣＤ３０発現
ＣＤ３０表面発現レベルを、定量的フローサイトメトリー（ヒトＩｇＧキャリブレーターキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）を使用して、ＨＬ、ＡＬＣＬ、及びＴＬＬ細胞株（表４）のパネルにおいて評価した。細胞（５×１０４細胞／ウェル）を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において５０μＬの染色緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ、画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ、ｎｏ．１０７３５０８６００１］及び０．０２％ＮａＮ３［Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ ｎｏ．１３４１２］で補足されたＰＢＳ［Ｌｏｎｚａ，ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１７－５１７Ｑ］）中の１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと４℃で３０分間インキュベートした。並行して、ヒトＩｇＧキャリブレーターキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＰ０１０）を、本質的に製造業者の指示に従って使用して標準曲線を生成した。ビーズ当たり十分に定義された数のヒトＩｇＧモノクローナル抗体を含む較正ビーズを、同じＲ－ＰＥ複合化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８、１：５００希釈）と４℃で光から保護して３０分間インキュベートした。細胞及びビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）でフローサイトメトリーによって分析した。ヒトＩｇＧキャリブレーターキットを使用して得られた標準曲線を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、細胞当たりの結合したＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ抗体（ＡＢＣ）の数を補間し、細胞表面上で発現したＣＤ３０分子の数の推定値を表した。
ＣＤ３０表面発現レベルを、定量的フローサイトメトリー（ヒトＩｇＧキャリブレーターキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）を使用して、ＨＬ、ＡＬＣＬ、及びＴＬＬ細胞株（表４）のパネルにおいて評価した。細胞（５×１０４細胞／ウェル）を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において５０μＬの染色緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ、画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ、ｎｏ．１０７３５０８６００１］及び０．０２％ＮａＮ３［Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ ｎｏ．１３４１２］で補足されたＰＢＳ［Ｌｏｎｚａ，ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１７－５１７Ｑ］）中の１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと４℃で３０分間インキュベートした。並行して、ヒトＩｇＧキャリブレーターキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＰ０１０）を、本質的に製造業者の指示に従って使用して標準曲線を生成した。ビーズ当たり十分に定義された数のヒトＩｇＧモノクローナル抗体を含む較正ビーズを、同じＲ－ＰＥ複合化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８、１：５００希釈）と４℃で光から保護して３０分間インキュベートした。細胞及びビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）でフローサイトメトリーによって分析した。ヒトＩｇＧキャリブレーターキットを使用して得られた標準曲線を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、細胞当たりの結合したＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ抗体（ＡＢＣ）の数を補間し、細胞表面上で発現したＣＤ３０分子の数の推定値を表した。
表４及び５は、定量下限（ＬＬＯＱ）を上回るＣＤ３０発現がＳＵＰ－Ｔ１を除く全ての細胞株において観察されたことを示す。
実施例３－未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）細胞などのヒトホジキンリンパ腫（ＨＬ）及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）へのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の、２つのＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ－１（ＡＬＣＬ、ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＡＣＣ ３５６）及びＨＤＬＭ－２（ＨＬ、ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＲＬ－２９６５）への結合をフローサイトメトリーによって分析した。
ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の、２つのＣＤ３０発現ヒト腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ－１（ＡＬＣＬ、ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＡＣＣ ３５６）及びＨＤＬＭ－２（ＨＬ、ＡＴＣＣ、ｃａｔ．ｎｏ．ＣＲＬ－２９６５）への結合をフローサイトメトリーによって分析した。
細胞（３ｘ１０４細胞／ウェル）を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において５０μＬの染色緩衝液中の抗体の段階希釈液（３倍希釈ステップで０．００４６～１０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分間インキュベートした。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を５０μＬの二次抗体と４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩衝液中で１：４００に希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用した。次に、細胞を染色緩衝液中で２回洗浄し、ＴＯ－ＰＲＯ－３ヨウ化物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５、１：８０００希釈）で補足された１００μＬの染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及びＴＯＰＲＯ－３染色の不在に基づいて、生きた細胞をゲーティングした。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して対数変換データの非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答、４パラメータ）によって分析した。
結果
図１は、ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（Ｃ）、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ＢｉｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ）の、ＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）及びＨＤＬＭ－２（右パネル）腫瘍細胞への用量応答結合曲線を示す。
図１は、ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（Ｃ）、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ＢｉｓＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ）の、ＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）及びＨＤＬＭ－２（右パネル）腫瘍細胞への用量応答結合曲線を示す。
１．１１μｇ／ｍＬの濃度で、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲは、単一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲの結合を比較したときに同様の結合を示した（図１Ｉ）。
対照的に、１．１１μｇ／ｍＬの濃度で、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲの結合は、単一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲの、ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＨＤＬＭ－２細胞への結合よりも低かった（図１Ｉ）。
全体的に、１．１１μｇ／ｍＬの濃度でのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲの結合は、同じ濃度でのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲの結合よりも高かった（図１Ｉ）。
これらの実験に含まれた陰性対照抗体ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲは、ＳＵ－ＤＨＬ－１及びＨＤＬＭ－２細胞への結合を示さず、ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＨＤＬＭ－２細胞のいずれもＣＤ３を発現しないことを示す。
結論として、ＣＤ３０抗体クローンＴ４０５、Ｔ４０８、及びＴ２１５は、二価フォーマットと比較して一価において低減した結合を示し、一方でクローンＭＤＸ０６０、ｈＡＣ１０、ＨＲＳ－３、及びＴ１０５は、一価及び二価フォーマットの両方で、ＣＤ３０発現腫瘍細胞への効率的な結合を示した。
図２は、（Ａ）ＨＤＬＭ－２（ＨＬ）、（Ｂ）Ｌ－４２８（ＨＬ）、（Ｃ）ＤＥＬ（ＡＬＣＬ）、及び（Ｄ）ＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの用量応答結合曲線を示す。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、単一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較されるとき、同様の最大結合を示した。陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの細胞株のいずれへの結合も示さず、これらの細胞が細胞表面上でＣＤ３を発現しないことを示した。これらのデータは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＥＲのＨＬ及びＡＬＣＬ細胞株への効率的な結合を確認した。
表６は、２つの独立した実験において評価される、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのＨＤＬＭ－２、Ｌ－４２８、ＤＥＬ、及びＫＩ－ＪＫ細胞への結合についてのＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０値は、０．０５～０．３０μｇ／ｍＬの範囲であった。
図８、９、及び１０は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＣＤ３０発現ＨＬ細胞株（図８）、ＡＬＣＬ細胞株（図９）、及びＮＨＬ細胞株（図１０）への用量応答結合曲線を示す。全ての細胞株において、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、一価対照抗体ＢｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較して同様の最大結合を示した。単一特異性、二価ＣＤ３０親抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、全ての細胞株への用量依存的結合を示したが、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲと比較してより低い最大結合を示した。陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの細胞株のいずれへの結合も示さず、これらの細胞が細胞表面上でＣＤ３を発現しないことを示した。これらのデータは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＬ細胞株、ＡＬＣＬ及びＣＴＣＬ細胞株などのＴ－ＮＨＬ、並びにＭＣＬ細胞株などのＢ－ＮＨＬへの効率的な結合を確認した。
表７は、２つ又は３つの独立した実験において評価される、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＨＬ、Ｔ－ＮＨＬ、及びＢ－ＮＨＬ細胞株への結合についてのＥＣ５０値を示す。ＥＣ５０値は、０．１２～０．３５μｇ／ｍＬの範囲であった。
実施例４－ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体によるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖の誘導
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用して、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。Ｔ細胞の供給源として、ＣＤ３陽性ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型（Ｃｌｅａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）又は精製されたＴ細胞（実施例５に記載される）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍細胞殺滅を評価した。
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用して、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。Ｔ細胞の供給源として、ＣＤ３陽性ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型（Ｃｌｅａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）又は精製されたＴ細胞（実施例５に記載される）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍細胞殺滅を評価した。
ＳＵ－ＤＨＬ－１（ＡＬＣＬ）、ＨｕＴ７８（ＡＬＣＬ）、ＨＤＬＭ－２（ＨＬ）、ＮＣＥＢ－１（ＭＣＬ）、又はＬ５４０（ＨＬ）細胞を、１０，０００細胞／ウェルの密度でポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）に播種した。エフェクター細胞を、０．５μＭのＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５４）で３７℃で２０分間標識し、腫瘍細胞にＥ：Ｔ比＝１０：１（ＡＤＣＣエフェクター細胞）又は７：１（精製Ｔ細胞）で添加した。二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０、ｂ１２ｘＣＤ３０、又はＣＤ３ｘｂ１２抗体、又は単一特異性二価ＣＤ３０抗体の段階希釈液を添加し（１０～０．０４１μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。いくつかの実験では、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのバリアントを、ＣＤ３についての親和性が低減した、Ｈ１０１Ｇ変異を含有するＣＤ３結合アームと使用した（ＷＯ２０１７／００９４４２、Ｇｅｎｍａｂ）。１００μＬの染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を、ＴＯ－ＰＲＯ－３ヨウ化物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５、１：４０００希釈）を含有する染色緩衝液に再懸濁し、ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）で分析した。
５μＭのスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｓ６９４２）で処理された腫瘍細胞試料の生存率を０％に設定し、未処理の腫瘍細胞試料の生存率を１００％に設定した。
「生存細胞パーセンテージ」を次のように計算した：
生存細胞％＝（［細胞数試料－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］／［細胞数未処理標的細胞－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］）×１００。ＣＦＳＥ陽性細胞を、Ｔ細胞増殖を評価するためのＴ細胞の絶対数の尺度として計数した。
生存細胞％＝（［細胞数試料－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］／［細胞数未処理標的細胞－細胞数スタウロスポリン処理標的細胞］）×１００。ＣＦＳＥ陽性細胞を、Ｔ細胞増殖を評価するためのＴ細胞の絶対数の尺度として計数した。
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答）によって分析した。
結果
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞又はＨＤＬＭ－２細胞を標的細胞として、ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞（Ｃｌｅａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）をエフェクター細胞として使用して、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株ＳＵ－ＤＨＬ－１細胞又はＨＤＬＭ－２細胞を標的細胞として、ＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞（Ｃｌｅａｎ Ｃｅｌｌｓ、Ｍｏｎｔａｉｇｕ、Ｆｒａｎｃｅ）をエフェクター細胞として使用して、インビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。
図３は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（Ｃ）、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ）が、ＳＵ－ＤＨＬ－１（左パネル）又はＨＤＬＭ－２（右パネル）細胞の用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性（生存細胞％の減少として示される）を誘導したことを示す。
単一特異性、二価ＣＤ３０抗体ＩｇＧ１－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（Ａ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（Ｂ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（Ｃ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ（Ｄ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（Ｅ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（Ｆ）、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（Ｇ）、及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（Ｈ）は、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導しなかった。対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲはまた、ＳＵ－ＤＨＬ－１又はＨＤＬＭ－２細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導しなかった。
加えて、ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、異なるＭＣＬ、ＡＬＣＬ、及びＨＬ細胞株を標的細胞として、並びに精製されたＴ細胞又はＡＤＣＣエフェクター細胞ＩＶ型細胞をエフェクター細胞として使用するインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。図４Ａ～Ｂは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによって誘導されたＳＵ－ＤＨＬ－１、ＨｕＴ７８、又はＮＣＥＢ－１細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性が、低減した親和性を有するＣＤ３結合アームを有するこの抗体のバリアント（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ）と比較してより強力であることを示す。ＨＤＬＭ－２細胞の同様の最大Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによって誘導された（図４Ｂ）。対照として含まれた、二価、単一特異性抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ又はＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＲとのインキュベーションは、これらの細胞株において細胞傷害性を誘導しなかった。Ｌ５４０細胞の強力な同様のＴ細胞媒介性細胞傷害性は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによって試験された最も低い濃度（０．０１４μｇ／ｍＬ、図４Ｃ）で誘導された。対照抗体ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はＩｇＧ１－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、Ｌ５４０細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導しなかった。
結論として、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、様々なＣＤ３０発現ＭＣＬ、ＡＬＣＬ、及びＨＬ腫瘍細胞株の強力な殺滅を誘導した。ＣＤ３アームのＶＨ ＣＤＲ３の１０１位にＨを含有するＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、１０１位にＧを含有するより低親和性のＣＤ３アームを有するバリアントと比較して、ＣＤ３０発現ＭＣＬ及びＡＬＣＬ腫瘍細胞を殺滅することにおいてより強力である。
標的細胞としてＨＤＬＭ－２細胞（左パネル）又はＮＣＥＢ－１細胞（右パネル）を使用する細胞傷害性アッセイでは、ＣＦＳＥ陽性細胞の数を絶対Ｔ細胞数の尺度として評価した。図４Ｄは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲによって誘導されたＨＤＬＭ－２及びＮＣＥＢ－１細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性（図４Ｂを参照されたい）が、Ｔ細胞数における用量依存的増加と関連していたことを示す。一般的には、同様のＴ細胞数は、このアッセイにおいてｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ又はｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲとのインキュベーション後に計数した。１μｇ／ｍＬよりも高い濃度でｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲとインキュベートされたＮＣＥＢ－１細胞との共培養物において、低減したＴ細胞数が観察された。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬは、これらの実験においてＴ細胞数に影響を及ぼさなかった。
結論として、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、様々なＣＤ３０発現ＡＬＣＬ、ＨＬ及びＭＣＬ腫瘍細胞株の存在下で、Ｔ細胞増殖を誘導した。
実施例５－Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞において発現されたヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＣＤ３０へのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体の結合
ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０で一過性トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞の形質膜への二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体及び単一特異性、二価ＣＤ３０抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析した。
ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０で一過性トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３細胞の形質膜への二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体及び単一特異性、二価ＣＤ３０抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析した。
ＨＥＫ－２９３Ｆ又はＨＥＫ－２９３細胞におけるヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＣＤ３０の一過性発現
様々な全長ＣＤ３０バリアントの発現のための以下のコドン最適化された構築物を生成した：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３０（ｈｕＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２８９０８）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３０（ｍｆＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＷ０７）（配列番号４０）、及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＣＤ３０（ｍｍＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ１Ｄ５ＲＫ０３）（配列番号４１）。構築物は、クローニングに好適な制限部位及び最適なＫｏｚａｋ（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ １９９９；２３４（２）：１８７－２０８）を含有した。全長ヒトＣＤ３０、カニクイザル、及びアカゲザルＣＤ３０コドン最適化構築物を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングし、本質的に製造業者によって記載されるようにＥｘｐｉ２９３Ｆ発現プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２７）を使用して発現させた。実験の別のセットでは、全長ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０構築物をＨＥＫ－２９３細胞において発現させた。
様々な全長ＣＤ３０バリアントの発現のための以下のコドン最適化された構築物を生成した：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＣＤ３０（ｈｕＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２８９０８）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３０（ｍｆＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ２Ｋ５ＶＷ０７）（配列番号４０）、及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＣＤ３０（ｍｍＣＤ３０、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ１Ｄ５ＲＫ０３）（配列番号４１）。構築物は、クローニングに好適な制限部位及び最適なＫｏｚａｋ（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ）配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ １９９９；２３４（２）：１８７－２０８）を含有した。全長ヒトＣＤ３０、カニクイザル、及びアカゲザルＣＤ３０コドン最適化構築物を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローニングし、本質的に製造業者によって記載されるようにＥｘｐｉ２９３Ｆ発現プラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ１４５２７）を使用して発現させた。実験の別のセットでは、全長ヒトＣＤ３０又はカニクイザルＣＤ３０構築物をＨＥＫ－２９３細胞において発現させた。
Ｅｘｐｉ２９３細胞において発現されたヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＣＤ３０へのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において、１００μＬ染色緩衝液中の抗体（３倍希釈ステップで０．００５～１０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分間インキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩衝液中で１：４００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、０．４％ＥＤＴＡを含む３０μＬの染色緩衝液に再懸濁し、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）で分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ、ｃａｔ．ｎｏ．６５０１８０）において、１００μＬ染色緩衝液中の抗体（３倍希釈ステップで０．００５～１０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分間インキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩衝液中で１：４００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、０．４％ＥＤＴＡを含む３０μＬの染色緩衝液に再懸濁し、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）で分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
ＨＥＫ２９３細胞において発現されたヒト、カニクイザル、又はアカゲザルＣＤ３０へのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．１６３３２０）において、５０μＬ染色緩衝液中の抗体（４倍希釈ステップで０．０００２～５０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分間インキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩衝液中で１：２００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、１：１０，０００に希釈された０．４％ＥＤＴＡ及びＴｏＰｒｏ－３生存性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５）を含む３０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。細胞を、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）上で分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
細胞（３×１０４細胞／ウェル）をポリスチレン９６ウェル丸底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．１６３３２０）において、５０μＬ染色緩衝液中の抗体（４倍希釈ステップで０．０００２～５０μｇ／ｍＬの範囲）と４℃で３０分間インキュベートした。実験は技術的重複で行った。染色緩衝液中で２回洗浄した後、細胞を、５０μＬの二次抗体中で４℃で３０分間インキュベートした。二次抗体として、染色緩衝液中で１：２００で希釈されたＲ－ＰＥ複合化ヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用した。細胞を、染色緩衝液中で２回洗浄し、１：１０，０００に希釈された０．４％ＥＤＴＡ及びＴｏＰｒｏ－３生存性マーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５）を含む３０μＬの染色緩衝液に再懸濁した。細胞を、ｉＱｕｅ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）上で分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９．０．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して非線形回帰（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
ヒトＴ細胞又はカニクイザルＰＢＭＣへのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体の結合
カニクイザルＰＢＭＣ（Ｔｅｂｕ－Ｂｉｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．ＰＢＭＣＭＦＡ－１０）又は精製されたヒトＴ細胞を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレートに播種した。Ｔ細胞は、ヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞（３×１０４細胞／ウェル）を、３０分間４℃で５０μＬの染色緩衝液中の抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲの段階希釈（３倍希釈ステップで０．０００１～１０μｇ／ｍＬの範囲）とインキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を３０分間４℃で５０μＬの二次Ｒ－ＰＥ複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体中でインキュベートした（１：４００希釈）。染色緩衝液中で２回洗浄した後、Ｔ細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ３（１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、クローン１０Ｄ１２、ＡＰＣに複合化）、ＣＤ４（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＯＫＴ４、ＡＰＣ－Ｃｙ７に複合化）、ＣＤ８（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＡＦ７００に複合化）、並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＡＢ２４３９、ＦＩＴＣに複合化）、ＣＤ２５（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＢＣ９６、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＡＥＨ１２．２Ｈ７、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
カニクイザルＰＢＭＣ（Ｔｅｂｕ－Ｂｉｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．ＰＢＭＣＭＦＡ－１０）又は精製されたヒトＴ細胞を、ポリスチレン９６ウェル丸底プレートに播種した。Ｔ細胞は、ヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に由来し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。細胞（３×１０４細胞／ウェル）を、３０分間４℃で５０μＬの染色緩衝液中の抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲの段階希釈（３倍希釈ステップで０．０００１～１０μｇ／ｍＬの範囲）とインキュベートした。染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を３０分間４℃で５０μＬの二次Ｒ－ＰＥ複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体中でインキュベートした（１：４００希釈）。染色緩衝液中で２回洗浄した後、Ｔ細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ３（１：１００、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ、クローン１０Ｄ１２、ＡＰＣに複合化）、ＣＤ４（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＯＫＴ４、ＡＰＣ－Ｃｙ７に複合化）、ＣＤ８（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＡＦ７００に複合化）、並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＡＢ２４３９、ＦＩＴＣに複合化）、ＣＤ２５（１：５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＢＣ９６、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：５０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＡＥＨ１２．２Ｈ７、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、１００μＬの染色緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
結果
ＣＤ３０標的化二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、野生型Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（図５Ａ）への結合を示さなかったが、ｈｕＣＤ３０（図５Ｂ）又はｍｆＣＤ３０（図５Ｃ）でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への用量依存的結合を示した。これらの二重特異性抗体の結合は、単一特異性、二価ＣＤ３０抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲの結合と同等であった。予想どおり、陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲは、野生型又はｈｕＣＤ３０若しくはｍｆＣＤ３０トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を示さなかった。同様に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、ｈｕＣＤ３０（図１１Ａ）又はｍｆＣＤ３０（図１１Ｂ）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への用量依存的結合を示し、陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲは、ｈｕＣＤ３０－又はｍｆＣＤ３０－トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合を示さなかった。これは、ＣＤ３０標的化抗体ＭＤＸ０６０が、ＨＥＫ細胞において発現されるヒト及びカニクイザルＣＤ３０の両方に、二価及び一価フォーマットで効率的に結合することを示す。
ＣＤ３０標的化二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－Ｈ１０１Ｇ－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、野生型Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（図５Ａ）への結合を示さなかったが、ｈｕＣＤ３０（図５Ｂ）又はｍｆＣＤ３０（図５Ｃ）でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への用量依存的結合を示した。これらの二重特異性抗体の結合は、単一特異性、二価ＣＤ３０抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲの結合と同等であった。予想どおり、陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲは、野生型又はｈｕＣＤ３０若しくはｍｆＣＤ３０トランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を示さなかった。同様に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、ｈｕＣＤ３０（図１１Ａ）又はｍｆＣＤ３０（図１１Ｂ）でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への用量依存的結合を示し、陰性対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲは、ｈｕＣＤ３０－又はｍｆＣＤ３０－トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合を示さなかった。これは、ＣＤ３０標的化抗体ＭＤＸ０６０が、ＨＥＫ細胞において発現されるヒト及びカニクイザルＣＤ３０の両方に、二価及び一価フォーマットで効率的に結合することを示す。
図５Ｄは、ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ及び対照二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲが、初代ヒト及びカニクイザルＴ細胞に効率的に結合したことを示す。これは、これらのＣＤ３標的化二重特異性抗体が、Ｔ細胞上で内因的に発現されるヒト及びカニクイザルＣＤ３の両方に効率的に結合することを示す。ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０二価、親抗体は、ヒト又はカニクイザルＴ細胞に結合せず、ＣＤ３０がこれらの細胞上で発現されなかったことを示した。
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体及び単一特異性親ＣＤ３０抗体のパネルの、ｈｕＣＤ３０又はｍｍＣＤ３０でトランスフェクトされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞への結合を、フローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ（図６Ａ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ（図６Ｂ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ（図６Ｃ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ（図６Ｅ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ（図６Ｆ）、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ（図６Ｇ）、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ（図６Ｈ）は、ｈｕＣＤ３０又はｍｍＣＤ３０を発現する細胞への等しい結合を示した。同様に、親、単一特異性ＣＤ３０抗体クローンは、ｈｕＣＤ３０又はｍｍＣＤ３０を発現する細胞に等しい結合を示した。対照的に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ及び親、単一特異性ＣＤ３０抗体ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ＿ＦＥＡＲは、ｈｕＣＤ３０への結合を示したが、ｍｍＣＤ３０への結合は示さなかった（図６Ｄ）。
実施例６－ＤＳＦ分析による単一特異性及び二重特異性非活性化抗体バリアントの立体構造安定性の評価
定常重鎖領域に非活性化変異を保有する二価単一特異性ＣＤ３０、ＣＤ３、及び二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体バリアントのタンパク質安定性特徴を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用して評価した。
定常重鎖領域に非活性化変異を保有する二価単一特異性ＣＤ３０、ＣＤ３、及び二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０ ＩｇＧ１抗体バリアントのタンパク質安定性特徴を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を使用して評価した。
ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、及びＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの試料を、約１ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ ｐＨ７．４で製剤化した。
立体構造安定性を評価するために、ＤＳＦを、ＩｇＧの展開時に露出した疎水性領域への外因性染料Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ（ＤＭＳＯ中の５０００倍濃縮物、Ｃａｔ ＃ Ｓ５６９２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の結合によって引き起こされる蛍光強度の変化を検出することができるｉＱ５多色リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において行った。Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅを、ｐＨ７．４のＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で３２０倍に希釈した。熱融解曲線は、分析されたＩｇＧの制御された段階的な熱変性の間に増加する蛍光を測定することから導出することができる。したがって、５μＬの抗体溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）の重複試料を、ｉＱ ９６ウェルＰＣＲプレートにおいてｐＨ７．４のＰＢＳ中の２０μＬの希釈されたＳｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅに添加した。蛍光は、増分当たり０．５℃の段階的増分及び１５秒の持続時間と全てのウェルの蛍光を記録するのに必要な時間で、２５℃～９５℃の範囲の増加する温度で記録した。データを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ３．０を使用して分析し、融点を、ソフトウェアによって蛍光対温度グラフから決定した。
結果
図７及び表８は、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの融解温度（Ｔｍ）が６９．０℃であることを示し、これは、ｐＨ７．４（６４．５℃）でのＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのＴｍよりも高い。これは、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲよりも高い立体構造安定性を有することを示し、ＦＥＲバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０が、ＦＥＡバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０よりも高い立体構造安定性を有することを示す。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの融解温度は、６４．５℃であることが決定され、これは、２つの親抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ（６２．５℃）及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ（６９．０℃）について決定されたＴｍの間である。
図７及び表８は、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの融解温度（Ｔｍ）が６９．０℃であることを示し、これは、ｐＨ７．４（６４．５℃）でのＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲのＴｍよりも高い。これは、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲよりも高い立体構造安定性を有することを示し、ＦＥＲバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０が、ＦＥＡバックボーンを含むＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０よりも高い立体構造安定性を有することを示す。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの融解温度は、６４．５℃であることが決定され、これは、２つの親抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ（６２．５℃）及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ（６９．０℃）について決定されたＴｍの間である。
実施例７－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのＴ細胞及び腫瘍細胞への同時結合
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの腫瘍細胞及びナイーブＴ細胞への同時結合を研究した。
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの腫瘍細胞及びナイーブＴ細胞への同時結合を研究した。
健常ドナーから単離された凍結Ｔ細胞を解凍し、０．２５ｍＭのＣｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ ｎｏ．Ｃ３４５５７Ａ）で３７℃で１５分間標識した。Ｌ－４２８腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（ＡＰＣ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃａｔ ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ）で３７℃で１５分間標識し、Ｔ細胞に１：１のＥ：Ｔ比で添加した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液を添加し（６ｘ１０－５～１０μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、細胞を４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、生存性マーカー７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ ５５９９２５）を添加し（１００倍最終希釈液）、細胞をＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析した。
結果
図１２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、腫瘍細胞のＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ媒介性架橋（同時結合）の尺度としてＣＤ３＋ＣＤ３０＋二重陽性事象（フローサイトメトリー染色においてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞）の形成を誘導することを示す。二重陽性事象の増加は、抗体濃度依存的であり、ベル形状の曲線を示した。対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬとインキュベートされた試料、又は抗体なしでインキュベートされた試料において、腫瘍細胞及びＴ細胞の架橋の増加は観察されなかった（Ａ）。図１２Ｂは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞のパーセンテージによって検出される、腫瘍細胞及びナイーブＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの同時結合を示す（Ｂ）。
図１２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、腫瘍細胞のＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ媒介性架橋（同時結合）の尺度としてＣＤ３＋ＣＤ３０＋二重陽性事象（フローサイトメトリー染色においてＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞）の形成を誘導することを示す。二重陽性事象の増加は、抗体濃度依存的であり、ベル形状の曲線を示した。対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１ｂ１２ＦＥＡＬｘＣＤ３０ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、若しくはＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬとインキュベートされた試料、又は抗体なしでインキュベートされた試料において、腫瘍細胞及びＴ細胞の架橋の増加は観察されなかった（Ａ）。図１２Ｂは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ及びＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔの両方を発現する細胞のパーセンテージによって検出される、腫瘍細胞及びナイーブＴ細胞へのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの同時結合を示す（Ｂ）。
これらのデータは、ｂｓＧｌｈｕＣＤ３ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、ＣＤ３０＋腫瘍細胞及びＣＤ３＋Ｔ細胞を同時に結合及び架橋することができることを示す。
実施例８－ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体によるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞活性化の誘導
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のパネルによるＫａｒｐａｓ－２９９腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性及び関連するＴ細胞活性化を評価した。以下の抗体を評価した：ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ。
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のパネルによるＫａｒｐａｓ－２９９腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性及び関連するＴ細胞活性化を評価した。以下の抗体を評価した：ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘ ＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ。
Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５７Ａ、最終濃度５μＭ）で１５分間３７℃で標識した。並行して、Ｋａｒｐａｓ－２９９腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に播種した。二重特異性ＣＤ３ｘＣＤ３０抗体の段階希釈液（１，０００～０．０５１ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）を添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートした。Ｔ細胞を、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを７２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＦＩＴＣに複合化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ－１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線形回帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
結果
図１３Ａ及びＢは、全てのＣＤ３×ＣＤ３０抗体が、Ｋａｒｐａｓ－２９９細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することを示す。ＣＤ３０クローンＭＤＸ０６０（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ）を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体は、試験された全ての他のクローンと比較して、Ｋａｒｐａｓ－２９９細胞を殺滅することにおいてより効果的であった。実際には、ＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０クローンＨＲＳ－３、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ１０５、Ｔ４０５、Ｔ４０８、又はＴ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ａ）よりも有意に低いＩＣ５０値を示した。更に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、ＣＤ３０クローンｈＡＣ１０、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ４０８、又はＴ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ｂ）と比較してより高い最大殺滅を誘導した。図１３Ｃ及びＤは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲが、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ｃ）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｄ）におけるＴ細胞活性化の尺度として、ＣＤ２５の発現を誘導することに、他のＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体のいずれかよりも有効（低いＥＣ５０値）であることを示す。ＰＤ－１（図１３Ｅ及びＦ）及びＣＤ６９（データ図示せず）の発現について同様の結果が観察された。ＦＥＡＲ又はＦＥＲＲ変異を含む２つのＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体間で、Ｔ細胞媒介性殺滅又はＴ細胞活性化における差は観察されなかった。
図１３Ａ及びＢは、全てのＣＤ３×ＣＤ３０抗体が、Ｋａｒｐａｓ－２９９細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することを示す。ＣＤ３０クローンＭＤＸ０６０（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲ）を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体は、試験された全ての他のクローンと比較して、Ｋａｒｐａｓ－２９９細胞を殺滅することにおいてより効果的であった。実際には、ＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体は、ＣＤ３０クローンＨＲＳ－３、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ１０５、Ｔ４０５、Ｔ４０８、又はＴ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨＲＳ－３－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ１０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ａ）よりも有意に低いＩＣ５０値を示した。更に、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲは、ＣＤ３０クローンｈＡＣ１０、ＨｅＦｉ－Ｉ、Ｔ４０５、Ｔ４０８、又はＴ２１５を使用して生成されたＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体（ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ｈＡＣ１０－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＨｅＦｉ－Ｉ－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０５－ＦＥＡＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ４０８－ＦＥＡＲ、及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－Ｔ２１５－ＦＥＡＲ、図１３Ｂ）と比較してより高い最大殺滅を誘導した。図１３Ｃ及びＤは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＡＲが、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１３Ｃ）又はＣＤ８＋Ｔ細胞（図１３Ｄ）におけるＴ細胞活性化の尺度として、ＣＤ２５の発現を誘導することに、他のＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体のいずれかよりも有効（低いＥＣ５０値）であることを示す。ＰＤ－１（図１３Ｅ及びＦ）及びＣＤ６９（データ図示せず）の発現について同様の結果が観察された。ＦＥＡＲ又はＦＥＲＲ変異を含む２つのＭＤＸ０６０ベースのＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体間で、Ｔ細胞媒介性殺滅又はＴ細胞活性化における差は観察されなかった。
二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３ｘＣＤ３０－ＭＸ０６０はまた、試験された他のパネルＣＤ３ｘＣＤ３０二重特異性抗体と比較して、Ｌ－４２８細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することにより有効であった（データ図示せず）。
これらの実験において使用されたＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のパネルによって誘導されたＴ細胞媒介性細胞傷害性の平均ＩＣ５０濃度及び最大溶解パーセント、並びにＴ細胞活性化（ＣＤ２５発現）のＥＣ５０濃度を表９に要約する。
結論として、これらのデータは、ｂｓＧ１ｈｕＣＤ３×ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０が、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することに評価された他のＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体のいずれかよりも有効であったことを実証した。
実施例９－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性、Ｔ細胞増殖、及びＴ細胞活性化の誘導
腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性並びにｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる関連するＴ細胞増殖及び活性化を、ＨＬ及びＡＬＣＬ細胞株において評価した。Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５７Ａ、最終濃度５μＭ）で１５分間３７℃で標識した。並行して、腫瘍細胞Ｌ－４２８、ＫＩ－ＪＫ、ＫＭ－Ｈ２、又はＳＵＰ－Ｍ２を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に播種した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液を添加し（１，０００～０．０５１ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、プレートをＲＴで１５分間インキュベートした。Ｔ細胞を、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを７２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３４５７７２、ＦＩＴＣに複合化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ－１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性並びにｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる関連するＴ細胞増殖及び活性化を、ＨＬ及びＡＬＣＬ細胞株において評価した。Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。Ｔ細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５５７Ａ、最終濃度５μＭ）で１５分間３７℃で標識した。並行して、腫瘍細胞Ｌ－４２８、ＫＩ－ＪＫ、ＫＭ－Ｈ２、又はＳＵＰ－Ｍ２を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に播種した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液を添加し（１，０００～０．０５１ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）、プレートをＲＴで１５分間インキュベートした。Ｔ細胞を、４：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを７２時間３７℃でインキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３４５７７２、ＦＩＴＣに複合化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ－１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
生きた標的細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して計算した：－生きた標的細胞％＝（各条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数／いずれの抗体も加えることなく標的細胞及びＴ細胞のみを含む条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数）×１００。
Ｔ細胞増殖を、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞を希釈されたＣｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ染色でゲーティングすることによって評価した。増殖指数を、ＦｌｏｗＪｏの増殖モデリングツールを使用して計算した。生成ピークを自動的に適合させ、増殖指数値を以下の式に従って計算した：
増殖指数＝細胞の総量／培養の開始時の細胞の量＝（Ｇ０＋Ｇ１＋Ｇ２＋Ｇ３＋Ｇ４＋Ｇ５＋Ｇ６）／（Ｇ０＋Ｇ１：２＋Ｇ２：４＋Ｇ３：８＋Ｇ４：１６＋Ｇ５：３２＋Ｇ６：６４）。Ｇｎ＝生成ｎピークにおける細胞数（ｎ＝０～６）。
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線形回帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
結果
図１４は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、インビトロでＬ－４２８（ＨＬ）、ＫＭ－Ｈ２（ＨＬ）、ＳＵＰ－Ｍ２（ＡＬＣＬ）、及びＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞株において用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示す。Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるＴ細胞媒介性細胞傷害性の平均ＩＣ５０濃度を表１０に要約する。対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬとインキュベートされた細胞において、又は抗体なしでインキュベートされた試料において、細胞傷害性は観察されなかった。
図１４は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、インビトロでＬ－４２８（ＨＬ）、ＫＭ－Ｈ２（ＨＬ）、ＳＵＰ－Ｍ２（ＡＬＣＬ）、及びＫＩ－ＪＫ（ＡＬＣＬ）細胞株において用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示す。Ｌ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるＴ細胞媒介性細胞傷害性の平均ＩＣ５０濃度を表１０に要約する。対照抗体ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬとインキュベートされた細胞において、又は抗体なしでインキュベートされた試料において、細胞傷害性は観察されなかった。
図１５、１６、１７、及び１８は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されたＬ－４２８及びＫＩ－ＪＫ細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖（図１５）並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（図１６）、ＣＤ２５（図１７）、及びＰＤ－１（図１８）の発現と関連していたことを示す。これらの実験におけるｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるＴ細胞増殖及び活性化の平均ＥＣ５０濃度を表１０に要約する。
したがって、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、インビトロでＨＬ及びＡＬＣＬ細胞株における用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害を誘導し、これは、Ｔ細胞増殖及び活性化と関連していた。
実施例１０－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのサイトカイン産生の誘導
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるサイトカイン及びグランザイムＢ産生は、実施例９に記載されるように、Ｌ－４２８標的細胞及び健常なドナーＴ細胞を用いたインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害性実験中に収集された上清において評価した。上清は、－２０℃で保存し、分析のために解凍した。１４の異なるサイトカイン（ＣＤ４０、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＰＤＬ－１、ＴＮＦα）及びグランザイムＢの濃度を、Ｒ＆Ｄシステムによってカスタムメイドのビーズベースの多重免疫アッセイ（ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して測定した。
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されるサイトカイン及びグランザイムＢ産生は、実施例９に記載されるように、Ｌ－４２８標的細胞及び健常なドナーＴ細胞を用いたインビトロＴ細胞媒介性細胞傷害性実験中に収集された上清において評価した。上清は、－２０℃で保存し、分析のために解凍した。１４の異なるサイトカイン（ＣＤ４０、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＰＤＬ－１、ＴＮＦα）及びグランザイムＢの濃度を、Ｒ＆Ｄシステムによってカスタムメイドのビーズベースの多重免疫アッセイ（ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して測定した。
結果
増加した濃度は、主にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＬ－４２８細胞及びＴ細胞の共培養物からの上清中のグランザイムＢ並びにサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ－１３、及びＴＮＦα（＞２０００ｐｇ／ｍＬ）について観察された。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較されるとき、ＣＤ４０、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ６、及びＩＰ－１０サイトカイン濃度について中程度の増加が観察された。ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、及びＰＤＬ１のレベルは、対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較して調節されなかった（図１９）。
増加した濃度は、主にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＬ－４２８細胞及びＴ細胞の共培養物からの上清中のグランザイムＢ並びにサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ－１３、及びＴＮＦα（＞２０００ｐｇ／ｍＬ）について観察された。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較されるとき、ＣＤ４０、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ６、及びＩＰ－１０サイトカイン濃度について中程度の増加が観察された。ＩＬ－８、ＭＣＰ－１、及びＰＤＬ１のレベルは、対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬと比較して調節されなかった（図１９）。
よって、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞活性化は、サイトカイン及びグランザイムＢの用量依存的産生と関連していた。
実施例１１－変動するエフェクター対標的比で精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用したｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性の誘導
二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の最適なエフェクター対標的細胞比を決定するために、インビトロ細胞傷害性アッセイを、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を標的細胞として、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として変動するエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で使用して行った。
二重特異性抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の最適なエフェクター対標的細胞比を決定するために、インビトロ細胞傷害性アッセイを、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を標的細胞として、精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として変動するエフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で使用して行った。
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を、Ｔ細胞が１：１、２：１、４：１、又は８：１の変動するエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比で腫瘍細胞に添加されたことを除いて、本質的に実施例９に記載されるように評価した。
結果
図２０Ａは、用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって全てのＥ：Ｔ比で誘導され、最大の腫瘍細胞殺滅（２０％未満の生存腫瘍細胞）が４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察されたことを示す。これに沿って、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、全てのＥ：Ｔ細胞比で、最も顕著には４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察された（図２０Ｂ－Ｃ）。試験されたＥ：Ｔ比のいずれでも、対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲによって特異的なＴ細胞媒介性細胞傷害性又はＴ細胞増殖は誘導されなかった。
図２０Ａは、用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって全てのＥ：Ｔ比で誘導され、最大の腫瘍細胞殺滅（２０％未満の生存腫瘍細胞）が４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察されたことを示す。これに沿って、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、全てのＥ：Ｔ細胞比で、最も顕著には４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で観察された（図２０Ｂ－Ｃ）。試験されたＥ：Ｔ比のいずれでも、対照抗体ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＦＥＲＲによって特異的なＴ細胞媒介性細胞傷害性又はＴ細胞増殖は誘導されなかった。
併せると、これらのデータは、インビトロでのＬ－４２８腫瘍細胞のｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性が、４：１及び８：１のＥ：Ｔ比で最も効果的であったことを示す。
実施例１２－ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるインビトロでのＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖の動態
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の動態を評価するために、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を標的細胞として精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用して、変動するインキュベーション期間でインビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。
ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅の動態を評価するために、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株Ｌ－４２８を標的細胞として精製されたＴ細胞をエフェクター細胞として使用して、変動するインキュベーション期間でインビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は、腫瘍細胞細胞傷害性及びＴ細胞増殖が２４時間、４８時間及び７２時間後に評価されたことを除いて、本質的に実施例９に記載されるように評価した。
結果
図２１は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、４８時間及び７２時間後に用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したが、２４時間後に有意なＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかったことを示す。用量依存的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、７２時間後にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されたが、２４時間又は４８時間後にＴ細胞増殖は観察されなかった（図２１Ｂ及びＣ）。
図２１は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、４８時間及び７２時間後に用量依存的Ｔ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したが、２４時間後に有意なＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかったことを示す。用量依存的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖は、７２時間後にｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによって誘導されたが、２４時間又は４８時間後にＴ細胞増殖は観察されなかった（図２１Ｂ及びＣ）。
併せると、これらのデータは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが時間依存的な方法で腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性及びＴ細胞増殖を誘導したことを示す。
実施例１３－インビトロでのｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性とのＣＤ３０発現レベルの相関
８つのＣＤ３０発現腫瘍細胞株のｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性殺滅を、実施例９に記載されるインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて、４：１のＥ：Ｔ比を使用して決定した。以下の細胞株を使用した：Ｌ－４２８、ＫＭ－Ｈ２、ＤＥＬ、ＫＩ－ＪＫ、ＫＡＲＰＡＳ－２９９、ＳＵＰ－Ｍ２、ＮＣＥＢ－１及びＪＶＭ－２。これらの腫瘍細胞株について、ＣＤ３０発現レベルを、実施例２で詳述される定量的フローサイトメトリーによって評価した。
８つのＣＤ３０発現腫瘍細胞株のｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性殺滅を、実施例９に記載されるインビトロ細胞傷害性アッセイにおいて、４：１のＥ：Ｔ比を使用して決定した。以下の細胞株を使用した：Ｌ－４２８、ＫＭ－Ｈ２、ＤＥＬ、ＫＩ－ＪＫ、ＫＡＲＰＡＳ－２９９、ＳＵＰ－Ｍ２、ＮＣＥＢ－１及びＪＶＭ－２。これらの腫瘍細胞株について、ＣＤ３０発現レベルを、実施例２で詳述される定量的フローサイトメトリーによって評価した。
結果
図２２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、６８％～９８％の最大標的細胞殺滅でインビトロで全ての細胞株においてＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示す。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる最大Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅は、ＣＤ３０発現のレベルと有意に相関していた（図２２Ａ）。
図２２は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、６８％～９８％の最大標的細胞殺滅でインビトロで全ての細胞株においてＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示す。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる最大Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞殺滅は、ＣＤ３０発現のレベルと有意に相関していた（図２２Ａ）。
図２２Ｂでは、各細胞株についてｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下でのＴ細胞媒介性殺滅のＥＣ５０を、ＣＤ３０発現レベルに対してプロットし、陰性であるが有意ではない傾向を示す。
よって、これらのデータは、インビトロでのＣＤ３０発現レベルとｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性最大Ｔ細胞媒介性細胞傷害性との間の正の相関を示す。
実施例１４－ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによる活性化されたＴ細胞のフラトリサイド
活性化されたＣＤ３０＋Ｔ細胞のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞フラトリサイドをインビトロで評価した。
活性化されたＣＤ３０＋Ｔ細胞のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞フラトリサイドをインビトロで評価した。
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）を、１００μＬのＰＢＳ中１μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１６－００３７－８５）の溶液でコーティングした。プレートを３７℃で４時間インキュベートした。抗体溶液を除去した後、１００μＬのＰＢＳでウェルを洗浄した。Ｔ細胞は、健常なヒトドナーバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得られ、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１５０６１）を製造業者の指示に従って使用して単離した。精製されたＴ細胞を、１０％の鉄を含む熱不活性化ドナーウシ血清（ＤＢＳＩ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ．２０７３１－０３０）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＥ１７－６０３Ｅ）で補足された、Ｔ細胞培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＲＰＭＩ］－１６４０培地）に２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、１００μＬのＴ細胞懸濁液（２００，０００個のＴ細胞を含有する）を、抗ＣＤ３コーティングされたプレートの各ウェルに添加した。更に、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．１６－０２８９－８５）及び０．０５μｇ／ｍＬのＩＬ－１５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ．ｎｏ．ＰＨＣ９１５１）で補足された１００μＬのＴ細胞培養培地を各ウェルに添加した。次いで、Ｔ細胞を３７℃で９６時間インキュベートした。
９６時間後、Ｔ細胞を収集し、２×１０６細胞／ｍＬの濃度でＴ細胞培地に再懸濁させた。フローサイトメトリー分析を行って、ＣＤ３０及びＴ細胞活性化マーカーの発現を測定した。簡潔には、細胞のアリコートをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染色緩衝液）で洗浄し、５０μＬの１０００倍希釈ＦＶＳ５１０生存性色素（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５６４４０６）で染色し、１５分間室温でインキュベートした。次いで、細胞を染色緩衝液で洗浄し、ＣＤ３０（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３３３９０６、ＰＥに複合化）、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５０６、ＦＩＴＣに複合化）、ＣＤ８（１：１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３０１０２８、ＡＦ７００に複合化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１０９１０、ＡＰＣに複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９２４、ＢＶ６０５に複合化）について染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃で３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを処理した。
ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが活性化されたＴ細胞のフラトリサイドを誘導することができるかを評価するために、刺激されたＴ細胞を、２００，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。その後、５０μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又は、対照抗体、すなわち、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、若しくはＩｇＧ１－ｂ１２を、各ウェルに添加した（Ｔ細胞培地中での３倍希釈ステップにおける０．００３～３．３μｇ／ｍＬの範囲の最終濃度）。プレートを３７℃で４８時間インキュベートした。
染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、ＦＶＳ５１０生存性染料で染色し、結果としてＴ細胞マーカーＣＤ４及びＣＤ８、並びにＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＣＤ２７９／ＰＤ１について染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してフローサイトメトリー分析を行い、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。
用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して生成した。
結果
図２３は、細胞マーカーＣＤ２５（Ｔ細胞活性化）（Ａ）及びＣＤ３０（Ｂ）が、インキュベーションの７２時間後にそれぞれ５４～６３％及び２１～２７％のＴ細胞において発現したことを示す。ＣＤ２５及びＣＤ３０の発現は、９６時間のインキュベーション後に更に誘導された（ＣＤ２５：８０～８３％及びＣＤ３０：２７～３３％）。図２３Ｃは、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又はＩｇＧ１－ｂ１２の増加する用量が、活性化されたＴ細胞の低減した生存率と関連していなかったことを示す。
図２３は、細胞マーカーＣＤ２５（Ｔ細胞活性化）（Ａ）及びＣＤ３０（Ｂ）が、インキュベーションの７２時間後にそれぞれ５４～６３％及び２１～２７％のＴ細胞において発現したことを示す。ＣＤ２５及びＣＤ３０の発現は、９６時間のインキュベーション後に更に誘導された（ＣＤ２５：８０～８３％及びＣＤ３０：２７～３３％）。図２３Ｃは、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘｂ１２－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又はＩｇＧ１－ｂ１２の増加する用量が、活性化されたＴ細胞の低減した生存率と関連していなかったことを示す。
したがって、活性化されたＴ細胞の亜集団上でのＣＤ３０発現は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲとのインキュベーション時にＴ細胞のフラトリサイドをもたらさなかった。
実施例１５－ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの抗腫瘍活性でのｓＣＤ３０の干渉
細胞表面ＣＤ３０の脱落及び可溶性ＣＤ３０（ｓＣＤ３０）の生成を、１７の異なる血液学的ＣＤ３０＋腫瘍細胞株において評価した。
細胞表面ＣＤ３０の脱落及び可溶性ＣＤ３０（ｓＣＤ３０）の生成を、１７の異なる血液学的ＣＤ３０＋腫瘍細胞株において評価した。
新鮮な培地中に細胞を播種してから３日後に細胞培養物から収集された２５μＬの未希釈上清中のｓＣＤ３０の濃度を、「ヒトｓＣＤ３０ ＥＬＩＳＡキット」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＭＳ２４０）を製造業者の指示に従って使用して、ヒトＣＤ３０の定量的検出のためのＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
結果
図２４Ａは、細胞培養上清中のｓＣＤ３０の濃度を示す。示されるように、変動する濃度のｓＣＤ３０が異なる細胞株由来の細胞培養上清中で検出された。図２４Ｂは、細胞培養上清中のｓＣＤ３０の濃度が実施例２に前述された定量的フローサイトメトリー（ヒトＩｇＧキャリブレーターキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）によって測定される場合、ＣＤ３０膜発現レベルと有意に相関したことを示す。
図２４Ａは、細胞培養上清中のｓＣＤ３０の濃度を示す。示されるように、変動する濃度のｓＣＤ３０が異なる細胞株由来の細胞培養上清中で検出された。図２４Ｂは、細胞培養上清中のｓＣＤ３０の濃度が実施例２に前述された定量的フローサイトメトリー（ヒトＩｇＧキャリブレーターキット、Ｂｉｏｃｙｔｅｘ、ｃａｔ ｎｏ．ＣＰ０１０）によって測定される場合、ＣＤ３０膜発現レベルと有意に相関したことを示す。
ｓＣＤ３０が強力なＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ誘導性Ｔ細胞媒介性細胞傷害性をブロックすることができるかを評価するために、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲによるＴ細胞媒介性細胞傷害性を、ＤＥＬ腫瘍細胞（ＡＬＣＬ）において評価し、これは上清（１２９ｎｇ／ｍＬ）において高レベルのｓＣＤ３０を示した。Ｔ細胞媒介性細胞傷害性アッセイを、前述のように行った（実施例８）。図２４Ｃは、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲがこの細胞株において強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導したことを示し、８６％の最大腫瘍細胞殺滅は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、ｓＣＤ３０の存在下でインビトロで強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を依然として誘導することができたことを示す。
よって、ｓＣＤ３０濃度は、細胞型間で変動し、細胞表面上のＣＤ３０発現のレベルと相関した。更に、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、ｓＣＤ３０の存在下でインビトロでの強力なＴ細胞媒介性細胞傷害性を依然として誘導することができた。
実施例１６－患者由来の末梢血単核Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用したｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲのエクスビボ細胞傷害性
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、初代患者由来Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用してエクスビボ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。Ｔ細胞の供給源として、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、表１１）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍細胞殺滅を評価した。
ＣＤ３×ＣＤ３０二重特異性抗体を、ＣＤ３０陽性腫瘍細胞株を標的細胞として、初代患者由来Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用してエクスビボ細胞傷害性アッセイにおいて試験した。Ｔ細胞の供給源として、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、表１１）を使用して、ＣＤ３依存的腫瘍細胞殺滅を評価した。
Ｌ－４２８腫瘍細胞を、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｃ３４５６４Ａ、最終濃度２μＭ）で１５分間３７℃で標識した。標識後、５倍の体積の氷冷ＤＢＳＩを室温で５分間インキュベートした。細胞をペレット化し、培地に再懸濁し、腫瘍細胞を５０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ－ｂｉｏ－ｏｎｅ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．６５５１８０）に播種した。ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及び対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬの段階希釈液（１，０００～０．０５１ｎｇ／ｍＬの範囲の最終濃度、３倍希釈液）を添加し、プレートを室温で１５分間インキュベートした。ＰＢＭＣを解凍し、計数し、培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＢＳ／１％ペニシリン－ストレプトマイシン／１％グルタミン酸塩）に再懸濁した後、８：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で腫瘍細胞に添加し、プレートを３７℃で７２時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０２％アジド（染色緩衝液）で２回洗浄した後、細胞を染色して、ＣＤ３（Ｔ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．４８－００３７）、ＣＤ１４（単球／マクロファージ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．３０１８３４）、ＣＤ１９（Ｂ細胞、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．３０２２４６）、ＣＤ１６（単球／マクロファージ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５５６６１８）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５６４８４９）、及びＣＤ６６ｂ（顆粒球、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３０５１１６）を使用した異なる細胞集団を区別した。細胞を、Ｔ細胞マーカーＣＤ４（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３００５２１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅに複合化）、ＣＤ８（１：１００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．３４５７７２、ＦＩＴＣに複合化）、及びＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３１０９３４、ＢＶ６５０に複合化）、ＣＤ２５（１：１００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．２５－０２５９－４２、ＰＥ－Ｃｙ７に複合化）、及びＣＤ２７９／ＰＤ１（１：５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．３２９９３０、ＢＶ６０５に複合化）について更に染色した。Ｕｌｔｒａｃｏｍｐビーズ（５μＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．０１－２２２２－４２）での単一染色試料を含め、フローサイトメーターの補正調整に使用した。４℃での３０分のインキュベーション後、プレートを染色緩衝液で２回洗浄し、細胞を７－ＡＡＤ（染色緩衝液中で１：１００に希釈）で４℃で１０分間染色した。ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを処理した。用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ７．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した非線形回帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して生成した。
生きた標的細胞のパーセンテージを、以下の式を使用して計算した：－生きた標的細胞％＝（各条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数／いずれの抗体も加えることなく標的細胞及びＴ細胞のみを含む条件における生きた、単一Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ＦａｒＲｅｄ標識細胞の絶対数）×１００。
結果
図２５Ａは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、健常な対照ドナー並びに異なるＨＬ及びＮＨＬ患者ドナーの両方に由来するＴ細胞によって媒介される７２時間後のＬ－４２８腫瘍細胞の用量依存的細胞傷害性を誘導したことを示す。細胞傷害性は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＰＤ－１の上方調節によって例示されるＴ細胞活性化及び増殖と関連していた（図２５Ｂ－Ｄ）。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬについて、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかった。ドナーＥ（ＡＭＬ）について、Ｌ－４２８腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されず、これはＰＢＭＣ試料内のＴ細胞の低頻度に起因し得る（表１１）。
図２５Ａは、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが、健常な対照ドナー並びに異なるＨＬ及びＮＨＬ患者ドナーの両方に由来するＴ細胞によって媒介される７２時間後のＬ－４２８腫瘍細胞の用量依存的細胞傷害性を誘導したことを示す。細胞傷害性は、ＣＤ６９、ＣＤ２５、及びＰＤ－１の上方調節によって例示されるＴ細胞活性化及び増殖と関連していた（図２５Ｂ－Ｄ）。対照抗体ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＡＬについて、Ｔ細胞媒介性細胞傷害性は観察されなかった。ドナーＥ（ＡＭＬ）について、Ｌ－４２８腫瘍細胞のＴ細胞媒介性細胞傷害性は観察されず、これはＰＢＭＣ試料内のＴ細胞の低頻度に起因し得る（表１１）。
併せて、これらのデータは、ＨＬ及びＮＨＬ患者からの末梢血Ｔ細胞が、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの存在下で腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性細胞傷害性を誘導することができることを例示する。
実施例１７－ＳＣＩＤマウスにおけるＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの薬物動態特性の評価
１１～１２週齢、雌の腫瘍を含まないＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨａｎ（登録商標）Ｈｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウス、Ｅｎｖｉｇｏ）（群当たり３匹のマウス）に、１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）又は１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの単回用量を静脈内（ＩＶ）注射した。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲがマウスタンパク質と交差反応しないため、実験は、標的媒介性クリアランスの不在下で抗体クリアランスを研究するように設定した。
１１～１２週齢、雌の腫瘍を含まないＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ－１７／ＩｃｒＨａｎ（登録商標）Ｈｓｄ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウス、Ｅｎｖｉｇｏ）（群当たり３匹のマウス）に、１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ（０．５ｍｇ／ｋｇ）又は１００μｇ（５ｍｇ／ｋｇ）のＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの単回用量を静脈内（ＩＶ）注射した。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲがマウスタンパク質と交差反応しないため、実験は、標的媒介性クリアランスの不在下で抗体クリアランスを研究するように設定した。
４０μＬの血液試料を、抗体投与の１０分、４～６時間、２４時間、２日、７日、１４日及び２１日後に、経頬静脈穿刺又は伏在静脈穿刺から収集した。血液を、Ｋ２－ＥＤＴＡ含有バイアル（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ ＣＢ３００、ｃａｔ．Ｎｏ．１６．４４４．１００）に収集し、１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿上清を、標識されたエッペンドルフバイアルに移し、血漿ＩｇＧ濃度決定まで－８０℃で保存した。
ヒトＩｇＧ濃度は、総ヒトＩｇＧ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。２μｇ／ｍＬの濃度で一晩４℃で９６ウェルＭｉｃｒｏｌｏｎ ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎ）にコーティングされた１００μＬのＰＢＳ（ＢｉｏＴｒａｄｉｎｇ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｋ６５４Ｆ５００ＰＰ）中のマウス抗ヒトＩｇＧ－カッパクローンＭＨ１６（ＣＬＢ Ｓａｎｑｕｉｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｍ１２６８）を捕捉抗体として使用した。プレートをＰＢＳＡ（０．２％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含むＰＢＳ）で室温（ＲＴ）で１時間ブロックした後、試料を添加し、ＰＢＳＡ中で段階希釈し、プレートシェーカー上で１時間ＲＴでインキュベートした。プレートを、３００μＬのＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で補足されたＰＢＳ）で３回洗浄し、その後ヤギ抗ヒトＩｇＧ免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｗｅｓｔ Ｇｒａｃｅ、ＰＡ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－０３５－０９８、０．２％のＢＳＡで補足されたＰＢＳＴ中の１：１０．０００）を用いて室温で１時間インキュベートした。光から保護された２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンズチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１１１１２４２２００１及び１１１１２５９７００１）とのインキュベーション前、プレートを３００μＬのＰＢＳＴで３回洗浄した。１００μＬの２％シュウ酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．３３５０６）を添加することによって反応を停止させ、室温で１０分間インキュベートした。吸光度は、ＥＬｘ８０８吸光度マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で４０５ｎｍで測定した。
参照抗体ヒトＩｇＧ１λ（純粋なタンパク質３０Ｃ、ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＰ０７８）から標準曲線を生成して（濃度範囲：１ｍｇ／ｍＬ［３μＬ］）、ＰＢＳＴＡ中の３倍希釈液で更に希釈した。注射された材料を用いて第２の標準曲線を生成し、１ｍｇ／ｍＬ（３．６μＬの抗体）の濃度で５ｍｇ／ｋｇの用量から調製し、ＰＢＳＴＡ中の３倍希釈液に更に希釈した。
結果
参照標準から、較正曲線を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの４パラメータロジスティックフィット曲線を使用して未知の補間によって計算した。血漿試料中のヒトＩｇＧ１濃度を、プロットされた較正曲線の方程式から計算し（図２６Ａ）、曲線下面積（ＡＵＣ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。血液サンプリングの最終日（２１日目）までのＩｇＧクリアランスを、式Ｄ＊１．０００／ＡＵＣによって決定し、式中、Ｄは、注射の用量（１ｍｇ／ｋｇ）である（図２６Ｂ）。
参照標準から、較正曲線を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌの４パラメータロジスティックフィット曲線を使用して未知の補間によって計算した。血漿試料中のヒトＩｇＧ１濃度を、プロットされた較正曲線の方程式から計算し（図２６Ａ）、曲線下面積（ＡＵＣ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。血液サンプリングの最終日（２１日目）までのＩｇＧクリアランスを、式Ｄ＊１．０００／ＡＵＣによって決定し、式中、Ｄは、注射の用量（１ｍｇ／ｋｇ）である（図２６Ｂ）。
ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲは、マウスタンパク質と交差反応せず、薬物動態特性は、よって、他の非結合野生型ヒトＩｇＧ１分子と同等であると予想されるであろう。全ての用量群について予想されたヒトＩｇＧ血漿濃度は、約１００μｇ／ｍＬ（約５ｍｇ／ｋｇ）、１０μｇ／ｍＬ（約０．５ｍｇ／ｋｇ）、又は１μｇ／ｍＬ（約０．０５ｍｇ／ｋｇ）であると計算された。全ての時点について、０．０５ｍｇ／ｋｇで処理された動物からの試料は測定可能ではなかった。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの血漿クリアランス率は、通常のヒトＩｇＧ１の予測された血漿クリアランス率と同等であった。平均最大ヒトＩｇＧ血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、通常のヒトＩｇＧ１の予測されたＣｍａｘと同等であった。
よって、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの薬物動態プロファイルは、標的結合の不在下で非腫瘍保有ＳＣＩＤマウスにおける通常のヒトＩｇＧ１について予測されるものと同等である。
実施例１８－ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合の評価
補体タンパク質Ｃ１ｑの、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又はＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが生成された親抗体、すなわち、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を、ＣＤ３又はＣＤ３０発現細胞のいずれかを用いて評価した。
補体タンパク質Ｃ１ｑの、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、又はＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲが生成された親抗体、すなわち、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を、ＣＤ３又はＣＤ３０発現細胞のいずれかを用いて評価した。
Ａ．ＣＤ３発現細胞に結合したＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合
補体タンパク質Ｃ１ｑの、ＣＤ３結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬへの結合を、刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて試験した。ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇは、ＣＤ５２抗体ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈに基づくＶＨ及びＶＬドメインを有し、細胞表面に結合したときにＣ１ｑに効率的に結合することが知られているＦｃ増強バックボーンを有する、陽性対照として含まれた。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｂ１２が含まれた。
補体タンパク質Ｃ１ｑの、ＣＤ３結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬへの結合を、刺激されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて試験した。ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇは、ＣＤ５２抗体ＣＡＭＰＡＴＨ－１Ｈに基づくＶＨ及びＶＬドメインを有し、細胞表面に結合したときにＣ１ｑに効率的に結合することが知られているＦｃ増強バックボーンを有する、陽性対照として含まれた。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｂ１２が含まれた。
ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞を、健常なボランティアから得られたバフィーコート（Ｓａｎｑｕｉｎ）から陰性選択によってＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ細胞濃縮カクテル（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．Ｎｏ．１５０２３Ｃ．２）を製造業者の指示に従って使用して精製（濃縮）した。精製されたＴ細胞を、１０％の鉄を含む熱不活性化ドナーウシ血清（ＤＢＳＩ、Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ．２０７３１－０３０）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＤＥ１７－６０３Ｅ）で補足された、Ｔ細胞培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ）を含むＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＲＰＭＩ］－１６４０培地）に再懸濁した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．Ｎｏ．１１１３２Ｄ）をＰＢＳで洗浄し、Ｔ細胞培地に再懸濁した。ビーズを、濃縮されたヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞に１：１比で添加し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。次に、磁石を使用してビーズを除去し、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、再度計数した。
ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬの、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞への結合は、ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ（３０μｇ／ｍＬ）、並びにＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用して、フローサイトメトリーによって確認された。
活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、丸底９６ウェルプレート（３０，０００細胞／ウェル）において播種し、ペレット化し、３０μＬのアッセイ培地（０．１％［ｗ／ｖ］のウシ血清アルブミン画分Ｖ（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ．ｎｏ．１０７３５０８６００１）及びペニシリン／ストレプトマイシンで補足された、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ及びＬ－グルタミンを含むＲＰＭＩ－１６４０）に再懸濁した。その後、５０μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬ、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇ、又はＩｇＧ１－ｂ１２（アッセイ培地中で３倍希釈ステップでの１．７ｘ１０－４－３０μｇ／ｍＬの最終濃度）を、ウェルの各々に添加し、３７℃で１５分間インキュベートして、抗体が細胞に結合することを可能にした。
Ｃ１ｑの供給源として、ヒト血清（２０μＬ／ウェル、Ｓａｎｑｕｉｎ、ロット２０Ｌ１５－０２）を２０％の最終濃度まで添加した。細胞を、氷上で４５分間インキュベートし、続いて、低温ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、５０μＬのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合化ウサギ抗ヒトＣ１ｑ（２０μｇ／ｍＬの最終濃度（ＤＡＫＯ、ｃａｔ ｎｏ．Ｆ０２５４）、ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：７５に希釈）と、アロフィコシアニン複合化マウス抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．５５５３６９、ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５０に希釈）の存在下又は不在下で、４℃で３０分間、暗所でインキュベートした。細胞を、低温ＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．０３６９０）、及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）生存性色素（１：５，０００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．ｎｏ．５６４９０７）で補足された２０μＬのＧＭＢ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。（ＤＡＰＩ排除によって特定される）生存細胞へのＣ１ｑ結合を、ｉＱｕｅ３スクリーナー（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でフローサイトメトリーによって分析した。データを、ｉＱｕｅソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ６．２［Ｒ３］、Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．６５２）を使用して分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
結果
図２７Ａは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇに対して観察されたが、Ｃ１ｑ結合が、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬに対して又は非結合対照抗体に対して観察されなかったことを示す。
図２７Ａは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ５２－Ｅ４３０Ｇに対して観察されたが、Ｃ１ｑ結合が、膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬに対して又は非結合対照抗体に対して観察されなかったことを示す。
Ｂ．ＣＤ３０発現細胞に結合したＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへのＣ１ｑ結合
補体タンパク質Ｃ１ｑのＣＤ３０結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を、ＮＣＥＢ－１マントル細胞リンパ腫細胞を使用して試験した。陽性対照として、ＩｇＧ１－７Ｄ８－Ｅ４３０Ｇ（抗ＣＤ２０）が含まれ、これは不活性変異を含まず、Ｃ１ｑへの結合能力を保持する。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲが含まれた。
補体タンパク質Ｃ１ｑのＣＤ３０結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ｈｕＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲへの結合を、ＮＣＥＢ－１マントル細胞リンパ腫細胞を使用して試験した。陽性対照として、ＩｇＧ１－７Ｄ８－Ｅ４３０Ｇ（抗ＣＤ２０）が含まれ、これは不活性変異を含まず、Ｃ１ｑへの結合能力を保持する。非結合陰性対照抗体として、ＩｇＧ１－ｂ１２－ＦＥＲＲが含まれた。
ＮＣＥＢ－１細胞を、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ、ｃａｔ，ｎｏ．１０７３５０８６００１）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．ｎｏ．１５１４０－１２２）を含有するアッセイ培地（ＲＰＭＩ－１６４０（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ｃａｔ．ｎｏ．ＢＥ１２－１１５Ｆ））中で２ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。腫瘍細胞（５０μＬ中１００，０００細胞）を、９６ウェル丸底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ、ｃａｔ ｎｏ．６５０１８０）に添加した。次に、３０μＬのＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ、ＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ又は対照抗体（アッセイ培地中で希釈された３倍希釈ステップでの５．６×１０－５－１０μｇ／ｍＬの最終濃度）を、ウェルの各々に添加し、３７℃で１５分間インキュベートして、抗体が細胞に結合することを可能にする。
細胞の半分（４０μＬの抗体を含有する細胞懸濁液）を、抗体結合を確認するために異なるプレートに播種した。ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ及びＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲの、ＮＣＥＢ－１細胞への結合は、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）複合化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５００に希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．１０９－１１６－０９８）を使用して、フローサイトメトリーによって確認された。
ヒト血清（１０μＬ／ウェル、Ｓａｎｑｕｉｎ、ロット２１Ｋ０４－０１）を、残りの４０μＬの細胞懸濁液（最終濃度の２０％）に添加し、４５分間氷上でインキュベートし、続いてＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、２５μＬのＦＩＴＣ複合化ウサギ抗Ｃ１ｑ抗体（２０μＬ／ｍＬの最終濃度（ＤＡＫＯ、ｃａｔ ｎｏ．Ｆ０２５４）、ＦＡＣＳ緩衝液中で希釈）と暗所で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を、低温ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＴＯ－ＰＲＯ（商標）－３生存性染料（１：５０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３６０５）で補足された３０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ｉＱｕｅ３ Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で測定した。データを、ｉＱｕｅソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＦｏｒｅＣｙｔ（登録商標）Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ Ｃｌｉｅｎｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ ６．２［Ｒ３］、Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．２．６５２）を使用して分析した。結合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰分析（可変勾配でのシグモイド用量応答）を使用して分析した。
結果
図２７Ｂは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｅ４３０Ｇに対して観察されたが、Ｃ１ｑ結合が膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲに対して、又は非結合対照抗体に対して観察されなかったことを示す。
図２７Ｂは、用量依存的Ｃ１ｑ結合が膜結合ＩｇＧ１－ＣＤ２０－Ｅ４３０Ｇに対して観察されたが、Ｃ１ｑ結合が膜結合ＢｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲ若しくはＩｇＧ１－ＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲに対して、又は非結合対照抗体に対して観察されなかったことを示す。
よって、これらの結果は、ｂｓＧ１－ｈｕＣＤ３－ＦＥＡＬｘＣＤ３０－ＭＤＸ０６０－ＦＥＲＲがＣ１ｑに結合しないことを実証し、機能的に不活性なバックボーンを確認した。
Claims (60)
- （ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
を含む多重特異性抗体。 - 前記第１の重鎖可変領域及び／又は前記第１の軽鎖可変領域が、ヒトである、請求項１に記載の多重特異性抗体。
- 前記第２の重鎖可変領域及び／又は前記第２の軽鎖可変領域が、ヒト化である、請求項１又は２に記載の多重特異性抗体。
- 配列番号９におけるＸが、Ｈである、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 配列番号９におけるＸが、Ｇである、請求項１～３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１の重鎖可変領域が、配列番号１３に記載される配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域が、配列番号１４に記載される配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第２の重鎖可変領域が、配列番号１５に記載される配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域が、配列番号１６に記載される配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記多重特異性抗体が、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、好ましくはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項９に記載の多重特異性抗体。
- 前記多重特異性抗体が、全長抗体である、請求項９又は１０に記載の多重特異性抗体。
- 不活性Ｆｃ領域を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＬ２３４及び／又はＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を含み、ここで、前記置換が、好ましくは、それぞれ、Ｆ及びＥへの置換であり、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換であり、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項１２又は１３に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換である、請求項１４に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ａへの置換であり、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項１２又は１３に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ａへの置換である、請求項１６に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドのうちの一方が、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、他方のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれ、前記第２のＦｃポリペプチド及び前記第２の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれる、請求項１８に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５Ｅ、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項１９に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つが置換されており、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つが置換されており、そしてここで、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドにおける前記置換が同じ位置にはなく、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、請求項９～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にある前記アミノ酸が、Ｌであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記アミノ酸が、Ｒであるか、又はその逆もまた同様である、請求項２１に記載の多重特異性抗体。
- 前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記アミノ酸がＲであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にある前記アミノ酸がＬである、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
- （ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、を含み、
ここで、前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体であり、第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域を含み、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチド及び前記第１の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれ、前記第２のＦｃポリペプチド及び前記第２の重鎖可変領域が、同じポリペプチド鎖内に含まれ、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＧ２３６位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＲへの置換を含み、そして、前記第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５位のアミノ酸に対応する前記アミノ酸の、Ｆ、Ｅ、及びＡへの置換を含み、そしてここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりであり、
ここで、前記第１のＦｃポリペプチドにおいて、Ｋ４０９に対応する位置にある前記アミノ酸が、Ｒであり、前記第２のＦｃポリペプチドにおいて、Ｆ４０５に対応する位置にある前記アミノ酸がＬである、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 配列番号１７及び１９に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- 配列番号１７及び１９に記載される重鎖配列、並びに配列番号１８及び２０に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなり、前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
- （ｉ）前記ＣＤ３０結合領域及び／若しくは前記ＣＤ３結合領域が、Ｆａｂであるか、
（ｉｉ）前記ＣＤ３０結合領域及び／若しくは前記ＣＤ３結合領域が、ｓｃＦｖであるか、
（ｉｉｉ）前記ＣＤ３０結合領域が、Ｆａｂであり、前記ＣＤ３結合領域が、ｓｃＦｖであるか、又は
（ｉｖ）前記ＣＤ３０結合領域が、ｓｃＦｖであり、前記ＣＤ３結合領域が、Ｆａｂである、請求項１～８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。 - 先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、核酸構築物、又は核酸構築物の組み合わせ。
- 請求項２８に記載の核酸構築物を含む、発現ベクター、又は発現ベクターの組み合わせ。
- 請求項２８に記載の核酸構築物を含む、送達ビヒクル。
- 前記送達ビヒクルが、粒子である、請求項３０に記載の送達ビヒクル。
- 前記粒子が、脂質ナノ粒子である、請求項３１に記載の送達ビヒクル。
- 前記脂質ナノ粒子が、脂質、イオン化可能なアミノ脂質、ＰＥＧ－脂質、コレステロール、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３２に記載の送達ビヒクル。
- 前記宿主細胞が、先行する請求項のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸構築物を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を産生することができる組換え宿主細胞。
- 前記組換え宿主細胞が、ＣＨＯ細胞である、請求項３４に記載の組換え宿主細胞。
- 請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
- 医薬としての使用のための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２８に記載の核酸構築物、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
- がんの治療における使用のための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２８に記載の核酸構築物、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
- ホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における使用のための、請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、請求項２８に記載の核酸構築物、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の送達ビヒクル、又は請求項３６に記載の薬学的組成物。
- 非ホジキンリンパ腫が、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）である、請求項３９に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物。
- Ｔ－ＮＨＬが、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）又は末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）である、請求項４０に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物。
- Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｔ－ＮＨＬ）が、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）である、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物。
- 非ホジキンリンパ腫が、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）である、請求項３９に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物。
- 前記多重特異性抗体、前記核酸構築物、前記送達ビヒクル、又は前記薬学的組成物が、静脈内及び／又は皮下、好ましくは皮下投与されている、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の使用のための、多重特異性抗体、核酸構築物、送達ビヒクル、又は薬学的組成物。
- 請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を産生するための方法であって、該方法は、
（ｉ）請求項３４又は３５に記載の組換え宿主細胞を、前記抗体が産生される条件下で培養することと、
（ｉｉ）産生された前記多重特異性抗体を培養物から単離することと、
を含む、方法。 - 請求項９～２６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を産生するための方法であって、該方法は；
ａ）請求項１に記載されるＣＤ３０結合領域を含む第１の抗体（ｉ）、及び請求項１に記載されるＣＤ３結合領域を含む第２の抗体（ｉｉ）を提供し、ここで、前記抗体が、請求項２～２６に記載される更なる特徴を任意に含有し、
ここで、前記第１及び第２の抗体が、Ｆｃ領域を含み、
ここで、前記第１及び第２の抗体の第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして、
ｃ）前記第１の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖及び第１の免疫グロブリン軽鎖と、前記第２の抗体の第２の免疫グロブリン重鎖及び第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む前記多重特異性抗体を得る；
ことを含む、方法。 - 請求項１～２７のいずれか一項に定義される抗体と、キットの使用説明書と、を含む、コンパニオン診断薬としての／患者の集団内で請求項１～２７のいずれか一項に定義される抗体での治療に応答する傾向を有する患者を特定するための使用のためのキットのような、キットオブパーツ。
- 請求項１～２７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を含む、診断用組成物。
- （ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第１の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域と、
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここて、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくは、Ｒへの置換であり、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域と、
を含む抗体。 - 前記第１の重鎖可変領域が配列番号１３に記載される配列を含み、前記第１の軽鎖可変領域が配列番号１４に記載される配列を含む、請求項４９に記載の抗体。
- 前記抗体が、配列番号１７に記載される重鎖配列及び配列番号１８に記載される軽鎖配列を含むか、又はそれらからなる、請求項４９又は５０に記載の抗体。
- （ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域と、
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換を含み、そしてここで、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＧ２３６位のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を更に含み、ここで、前記置換が、好ましくはＲへの置換であり、ここで、前記アミノ酸位置が、Ｅｕナンバリングによって定義されるとおりである、Ｆｃ領域と、
を含む抗体。 - 配列番号９におけるＸが、Ｈである、請求項５２に記載の抗体。
- 配列番号９におけるＸが、Ｇである、請求項５２に記載の抗体。
- 前記第２の重鎖可変領域が、配列番号１５に記載される配列を含み、前記第２の軽鎖可変領域が、配列番号１６に記載される配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、全長抗体である、請求項４９～５５のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＴ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｄ３９９、Ｆ４０５、Ｙ４０７、及びＫ４０９からなる群から選択される位置に対応する位置にあるアミノ酸のうちの少なくとも１つが置換されており、好ましくは、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであるか、又は、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲである、請求項４９～５６のいずれか一項に記載の抗体。
- 多重特異性抗体を産生するための方法であって、該方法は；
ａ）請求項４９～５１又は５５～５７のいずれか一項に記載される第１の抗体、並びに、以下を含む第２の軽鎖可変領域を提供するか；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、ここで、前記第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域；
又は
請求項５２～５７のいずれか一項に記載される第２の抗体、並びに、以下を含む第１の抗体を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号１、２、及び３に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号４、５、及び６に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３０結合領域、及び
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、前記第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域；
ここで、前記第１及び第２の抗体の前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、前記第１のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬであり、前記第２のＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸が、Ｒであるか、又はその逆もまた同様であり；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして、
ｃ）前記第１の抗体の前記第１の免疫グロブリン重鎖及び前記第１の免疫グロブリン軽鎖と、前記第２の抗体の前記第２の免疫グロブリン重鎖及び前記第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む前記多重特異性抗体を得る
ことを含む、方法。 - 請求項５８に記載の多重特異性抗体を産生するための方法であって、該方法は、
ａ）請求項４９～５１又は５５～５７のいずれか一項に記載される第１の抗体、並びに、以下を含む第２の抗体を提供し；
（ｉ）それぞれ、配列番号７、８、及び９に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号１０、１１、及び１２に記載されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む第２の軽鎖可変領域と、を含むＣＤ３結合領域、および
（ｉｉ）第１及び第２のＦｃポリペプチドからなるＦｃ領域であって、前記第１及び第２のポリペプチドが、それぞれ、Ｌ２３４及びＬ２３５位のアミノ酸に対応するアミノ酸の、Ｆ及びＥへの置換と、ヒトＩｇＧ１重鎖におけるＤ２６５位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＡへの置換と、を含むＦｃ領域、
ここで、前記第１及び第２の抗体の前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列が、異なり、ひいては前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強く、ここで、好ましくは、前記第１のＣＨ３領域において、Ｋ４０９に対応する位置にあるアミノ酸がＲであり、そして、前記第２のＣＨ３領域において、Ｆ４０５に対応する位置にあるアミノ酸がＬである；
ｂ）前記第１の抗体を前記第２の抗体と一緒に、前記ヒンジ領域における前記システインがジスルフィド結合異性化を受けることを可能にするために十分な還元条件下でインキュベートし；そして
ｃ）前記第１の抗体の前記第１の免疫グロブリン重鎖及び前記第１の免疫グロブリン軽鎖と、前記第２の抗体の前記第２の免疫グロブリン重鎖及び前記第２の免疫グロブリン軽鎖と、を含む、前記多重特異性抗体を得る、
ことを含む、方法。 - 請求項５８又は５９のいずれかに記載の方法によって得られる多重特異性抗体。
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