JP2023550353A - リセドロン酸亜鉛アルミニウムを含有するアジュバント、およびその用途 - Google Patents

Abstract

リセドロン酸亜鉛アルミニウムを含有するアジュバント、上記アジュバントおよび免疫原を含む免疫原性組成物、ならびに上記アジュバントおよび上記免疫原性組成物の使用。

Description

技術分野
本出願は、バイオ医薬品の技術分野に関する。具体的には、本出願は、リセドロン酸亜鉛アルミニウムを含有するアジュバント、上記アジュバントおよび免疫原を含む免疫原性組成物、ならびに上記アジュバントおよび上記免疫原性組成物の使用に関する。

背景技術
アジュバントは、免疫原に特異的または非特異的に結合し、生物を刺激および誘導して長期的かつ効果的な特異的免疫応答を生み出すことができる物質または混合物である。アジュバントの免疫生物学的効果には、免疫原の投与量の削減、抗原の免疫原性の増強、および免疫応答のタイプの変更が含まれる。ヒトワクチン用に現在承認されているアジュバントとして、アルミニウムアジュバント、ＭＦ５９、ＡＳ０４、ＡＳ０１_Ｂ、ＣｐＧ１０１８などが挙げられ、ＡＳ０３、ＲＣ－５２９、Ａｄｖａｘ、Ｍａｔｒｉｘ－Ｍなどを含むいくつかの新たなアジュバントが臨床試験中である。アルミニウムアジュバントは、ヒトワクチン用に承認された最初のアジュバントである。アルミニウムアジュバントは、９０年近く使用されており、最も広く使用されている、安全で効果的なアジュバントとして認識されている。しかしながら、研究されるワクチンの種類の増加に伴い、アルミニウムアジュバントがＴｈ２免疫優性応答の誘導を刺激して、Ｔｈ１免疫応答の誘導に対しては限られた効果を有し、それはまた、治療用ワクチン、例えば水痘帯状疱疹ウイルスワクチン、Ｂ型肝炎治療用ワクチンおよび腫瘍ワクチンなどにおけるアルミニウムアジュバントの用途を制限することが分かっている。さらに、多くの新たなワクチンアジュバントと比較して、アルミニウムアジュバントの活性は弱く、ウイルス様粒子抗原以外の最も遺伝子操作された抗原に対するその免疫増強効果は理想的ではなく、その結果、非多量体化タンパク質抗原ワクチンにおけるその用途が制限されている。

アルミニウム含有アジュバント系は、アルミニウムアジュバントおよび他のアジュバント成分または提示系（例えば、ＭＰＬ、ＣＰＧ、ＱＳ２１およびリポソームなど）に基づいて形成されたアジュバント系を指し、それは、比較的均衡の取れたＴｈ１およびＴｈ２免疫応答を誘導することができる。現在、販売が認可されているか、または臨床試験に入っているアルミニウム含有アジュバント系がいくつか存在する（ＮＰＪ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１８、１０巻；３号：５１頁．）。例えば、ＡＳ０４は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（ＧＳＫ）によって開発されており、このアジュバント系は、ＴＬＲ－４（Ｔｏｌｌ様受容体４）アゴニスト：３－Ｏ－デアシル－４’－モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）が添加されたアルミニウムアジュバントに基づいている。そのグルコサミンリン酸化のため、アゴニストは、Ａｌ^３＋と高い親和性を有し、アルミニウムアジュバントによって吸着され、複合アジュバントを形成し、これが、抗原特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるγ－インターフェロン（インターフェロン－γ、ＩＦＮ－γ）の発現を改善することができる（ＩＦＮ－γは、Ｔ細胞応答の重要な指標の１つである）。現在、ＡＳ０４は、Ｂ型肝炎ワクチン（Ｆｅｎｄｒｉｘ、２００５年に販売が認可されている）およびＨＰＶ１６／１８二価子宮頸がんワクチン（Ｃｅｒｖａｒｉｘ、２００７年に販売が認可されている）において首尾よく使用されている。アルミニウムアジュバント単独の使用と比較して、ＡＳ０４は、ＨＰＶ１６／１８二価子宮頸がんワクチン（Ｃｅｒｖａｒｉｘ）の中和抗体力価を著しく増加させ、免疫防御の有効期間を延長することができ、ワクチンが、１回または２回、免疫化するのに使用される場合に、３回の免疫化によって提供されるのと類似した防御効果を生み出すことができる。ＴＬＲ－９の受容体アゴニストであるＣｐＧは、アルミニウムアジュバントと組み合わせたマラリアワクチンおよび鉤虫ワクチン用のアジュバントとして臨床試験に入っている。

アルミニウムアジュバントの、抗原への吸着は、その免疫増強効果をもたらす要因の１つである。リガンド交換は、アジュバントと抗原との間の最も強い相互作用であり、それは、抗原のリン酸基と水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムの水酸基との間のリガンド交換によって生じる。これは、２００１年に発明者Ｚｈａｏによって提唱されたアルミニウムアジュバント表面の「親リン性（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）」の概念である（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１、２９５巻（１号）：７６～８１頁）。リン酸基およびアルミニウムアジュバントの吸着によって形成される新たなタイプの複合アジュバントとしての上述のＡＳ０４、ＭＰＬは、臨床現場でよく使用されている。

ビスホスホネート（ＢＰ）薬は、中心骨格としてＰ－Ｃ－Ｐを有する人工的に合成されたピロリン酸類似体の一種である。有機ビスホスホネートとして、それらは、そこに含有されているリン酸基に起因してカルシウム、アルミニウム、亜鉛、マグネシウムなどのイオンに対して高い親和性を有し、したがって、骨疾患およびカルシウム代謝疾患、例えば骨粗鬆症、変形性骨炎および高カルシウム血症、ならびに悪性腫瘍の骨転移によって引き起こされる骨の疼痛の治療に使用されている。同時に、臨床研究により、多発性骨髄腫、乳がん、腎臓がん、前立腺がんなどの補助治療においてビスホスホネート薬を使用すると、患者における骨関連疾患の発生率、がんの再発率を低減することができ、患者の生存期間および臨床転帰を改善することができることが示されている。さらに、ビスホスホネートは、そのプラスの免疫調節効果に起因してアジュバント活性を示し、ワクチン製剤における免疫増強物質としてビスホスホネートを使用する特許発明も報告されている（中国特許：ＣＮ１０３７６８５９５Ｂ号；米国特許：ＵＳ２０１７０２８１７５９Ａ１号；中国特許：ＣＮ１０８２８９９０２Ａ号）。強力な粘膜刺激作用を有するビスホスホネート薬は通常、臨床現場では経口または静脈内投与されるのに対して、ワクチンの使用では、免疫化は通常、筋内注射によって実施される。さらに、ビスホスホネートは、潜在的な副作用があり、依然としてさらなる改善が必要である。

コロナウイルス（ＣｏＶ）は、オルトコロナウイルス亜科（Ｏｒｔｈｏｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ニドウイルス目（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）に属する、エンベロープ型の非分節一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスであり、α、β、γおよびδの４属に分けられている。これまでに、７つのコロナウイルスが、ヒトに感染することが分かっており、その中には、季節性流行性コロナウイルスとして、α属の２２９ＥおよびＮＬ６３、β属のＯＣ４３およびＨＫＵ１、および流行性コロナウイルス：重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）が含まれる。現在、コロナウイルスが、脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、ネコ、イヌ、ミンク、モルモット、ハムスター、アカゲザル、および鳥類に感染する可能性があることが知られている。同時に、オランダのウイルス学者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がヒトからミンクに伝染されて、その後ヒトに戻る可能性があることを確認しており、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の動物からヒトへの伝染連鎖を裏付けている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、強力な伝染力および病原性を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の現在の世界的なパンデミックは、人々の生活、健康、安全および社会活動に大きな脅威をもたらし、巨額の経済的損失を引き起こし、ワクチンは、ウイルスの感染を制御および防止する最も効果的な手段である。

コロナウイルススパイクタンパク質（Ｓタンパク質）は、Ｓ１およびＳ２のタンパク質サブユニットの２つの部分からなるＩ型膜貫通タンパク質であり、これは、宿主細胞表面受容体への結合および細胞膜の融合を媒介して、ウイルスが標的細胞に侵入することを可能にする。スパイクタンパク質に対する抗体が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる肺炎の免疫予防および治療において重要な役割を果たし得ることを複数の証拠が示しており、したがって、スパイクタンパク質は現在、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する組換えタンパク質ワクチンの開発および設計の重要な標的となっている。研究により、急性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、長期持続的中和抗体応答を弱める可能性があるが、依然としてウイルス特異的メモリーＴ細胞を通じて免疫記憶を達成することが分かっており（Ｃｅｌｌ、２０２０、１８３巻（１号）：１３～１５頁）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の防止におけるＴ細胞応答の重要性を示している。組換えＤＮＡ技術によって調製されたサブユニットタンパク質ワクチンは、優れた安全性を有し、マルチショットの追加免疫を達成することができるが、その免疫原性は弱い。同時に、世界保健機関（ＷＨＯ）は、２０１９年コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）ワクチンの目標製品特性を、２０２０年４月に策定した。流行が発生した場合、ワクチンは、迅速に効果を発揮して、２週間以内に防御を提供し、１回用量で基礎免疫を獲得し、２回用量を超えず、持続性の観点から少なくとも６カ月の防御を提供しなくてはならない。

したがって、当該技術分野では依然として、ワクチン（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン）の有効性を改善するために新しいアジュバントを開発する必要性がする。

本発明の内容
本出願の発明者らは、徹底した研究の後、ワクチンアジュバントまたは薬物送達担体などとして使用することができ、また抗原の免疫原性を効果的に改善するのに使用することができる、リセドロン酸亜鉛アルミニウムを含有する新たなタイプのアジュバントを開発した。

特に、驚くべきことに、本出願のアジュバントが免疫原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質）と組み合わせて使用されると、それは、様々な動物、例えばＢａｌｂ／ｃマウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスターおよびカニクイザルにおいて高レベルの機能的抗体ならびに均衡の取れた細胞性免疫応答および液性免疫応答を効果的に刺激または誘導することができることが分かった。したがって、本出願のアジュバントは、ワクチン（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ワクチン）の創薬可能性（ｄｒｕｇｇａｂｉｌｉｔｙ）を改善することができる。

さらに、本出願のアジュバントがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせて使用されると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を効果的に防止することができることも分かった。例えば、本出願のアジュバントおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を含有するワクチンは、動物（例えば、ミンク）の上気道および下気道におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を効果的に防止または低減させ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が動物（例えば、ミンク）の肺に感染して損傷を与えるのを防ぐことができる。

アジュバント
１つの態様では、本出願は、１：１～１６：１（例えば、２：１～１６：１）の範囲の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比、および１：１～５０：１（例えば、５：１～５０：１）の範囲の亜鉛：アルミニウムモル比を有する、リセドロン酸亜鉛アルミニウムを含むアジュバント（本明細書中では、リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントとも称される）を提供する。

ある特定の実施形態では、リセドロン酸亜鉛アルミニウムは、粒子の形態で存在する。ある特定の実施形態では、リセドロン酸亜鉛アルミニウムは、ナノ粒子または微粒子の形態で存在する。いくつかの実施形態では、粒子は、０．０１μｍ～１００μｍ、例えば、０．０１μｍ～６０μｍ、０．０１μｍ～５０μｍ、０．１μｍ～６０μｍ、０．１μｍ～３０μｍ、０．４μｍ～３０μｍ、０．４μｍ～２０μｍの粒子径を有する。

いくつかの実施形態では、アジュバントは、１：１～２：１、２：１～４：１、４：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１４：１、または１４：１～１６：１の範囲の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１４：１、または少なくとも１５：１の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、１６：１以下、１４：１以下、１２：１以下、１０：１以下、８：１以下、７：１以下、６：１以下、５：１以下、４：１以下、３：１以下、または２：１以下の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有する。

ある特定の実施形態では、アジュバントは、１：１、２：１、４：１、４．５：１、６：１、８：１、１０：１、１２：１、１４：１または１６：１の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、４：１または４．５：１の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有する。

ある特定の実施形態では、アジュバントは、１：１～２：１、２：１～３：１、３：１～４：１、４：１～５：１、５：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１５：１、１５：１～２０：１、２０：１～３０：１、３０：１～４０：１、または４０：１～５０：１の範囲の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、または少なくとも４０：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、５０：１以下、４０：１以下、３０：１以下、２０：１以下、１５：１以下、１２：１以下、１０：１以下、８：１以下、６：１以下、５：１以下、４：１以下、３：１以下、または２：１以下の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。

いくつかの実施形態では、アジュバントは、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１２：１、１０：１、８：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、１０：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。

ある特定の実施形態では、アジュバントは、２：１～８：１、例えば、２：１～４：１、４：１～６：１、または６：１～８：１の範囲の亜鉛：リセドロン酸モル比を有し、亜鉛：アルミニウムモル濃度比は、２：１～５０：１の範囲（例えば、５：１～２０：１の範囲）、例えば、２：１～３：１、３：１～４：１、４：１～５：１、５：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１５：１、または１５：１～２０：１である。

ある特定の実施形態では、アジュバントは、４：１の亜鉛：リセドロン酸モル比および１０：１の亜鉛：アルミニウムモル比を有する。

ある特定の実施形態では、アジュバントは、４．５：１の亜鉛：リセドロン酸モル比および１０：１の亜鉛：アルミニウムモル比を有する。

ある特定の実施形態では、アジュバントは、５．０～８．０、例えば、５．０～７．０、５．０～５．５、５．５～６．０、６．０～６．５、６．５～７．０、７．０～７．５、または７．５～８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、７．０～７．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、５．５～６．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、アジュバントは、５．８～６．３のｐＨを有する。

ある特定の実施形態では、アジュバントは、３．０～８．０、例えば４．０～８．０、３．０～４．０、４．０～５．０、５．０～６．０、６．０～７．０、または７．０～８．０のゼロ電荷点を有する。いくつかの実施形態では、アジュバントは、４．０～６．０のゼロ電荷点を有する。

本出願のアジュバントは、免疫原（例えば、タンパク質）に対して良好な吸着率を有する。ある特定の実施形態では、本発明のアジュバントは、免疫原（例えば、タンパク質）に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の吸着率を有する。

免疫原性組成物
理論によって限定されることなく、本発明のアジュバントは、様々な免疫原と組み合わせて使用して、免疫原の免疫原性を増強することができる。かかる免疫原は、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分などを含むが、これらに限定されない。

したがって、１つの態様では、本出願は、免疫原および上述するようなアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、免疫原は、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分などを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、免疫原は、ウイルス、細菌、および真菌などの病原体に由来する。

ある特定の実施形態では、免疫原は、タンパク質またはその免疫原性断片、例えばウイルス、細菌、または真菌などの病原体に由来するタンパク質またはその免疫原性断片である。ある特定の実施形態では、ウイルスは、呼吸器系ウイルス（例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１ウイルス、ロタウイルス）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を含むが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、免疫原は、コロナウイルスタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、オルトコロナウイルス亜科αウイルス（例えば、２２９ＥおよびＮＬ６３）、オルトコロナウイルス亜科βウイルス（例えば、ＯＣ４３およびＨＫＵ１）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質またはその免疫原性断片、例えばＳタンパク質またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、水痘帯状疱疹ウイルスタンパク質またはその免疫原性断片、例えば水痘帯状疱疹ウイルスのｇＥタンパク質またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、インフルエンザウイルスタンパク質またはその免疫原性断片、例えばインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、ロタウイルスタンパク質またはその免疫原性断片、例えばロタウイルスのＶＰ４タンパク質またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、薬学的に許容可能な補助材料、例えば賦形剤、防腐剤、抗菌剤、緩衝液および／またはさらなる免疫アジュバントをさらに含む。ある特定の実施形態では、さらなる免疫アジュバントは、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・プミルス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｕｍｉｌｕｓ）、リポ多糖、サイトカイン、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、第２の免疫原をさらに含む。ある特定の実施形態では、第２の免疫原は、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分などを含むが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチンである。
アジュバントを調製する方法
１つの態様では、本出願は、下記の工程：
１）亜鉛イオンおよびアルミニウムイオンを含有する可溶性塩溶液を供給する工程と；
２）工程（１）の可溶性塩溶液を、アルカリ性リセドロン酸溶液と混合して、アジュバントを得る工程と
を含む、上述するようなアジュバントを調製する方法を提供する。

いくつかの実施形態では、上記方法は、工程（２）で得られるアジュバントを滅菌する工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、アジュバントは、フィルター滅菌または高温および高圧滅菌によって滅菌される。ある特定の実施形態では、アジュバントは、１２１℃で少なくとも１５分（例えば、少なくとも３０分、例えば３０～６０分）間の滅菌によって滅菌される。

ある特定の実施形態では、可溶性塩溶液は、１：１～５０：１の範囲の（例えば、５：１～５０：１の範囲の）亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、亜鉛：アルミニウムモル濃度比は、１：１～２：１、２：１～３：１、３：１～４：１、４：１～５：１、５：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１５：１、１５：１～２０：１、２０：１～３０：１、３０：１～４０：１、または４０：１～５０：１の範囲である。ある特定の実施形態では、亜鉛：アルミニウムモル濃度比は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも３０：１、または少なくとも４０：１である。ある特定の実施形態では、亜鉛：アルミニウムモル濃度比は、５０：１以下、４０：１以下、３０：１以下、２０：１以下、１５：１以下、１２：１以下、１０：１以下、８：１以下、６：１以下、５：１以下、４：１以下、３：１以下、または２：１以下である。

ある特定の実施形態では、可溶性塩溶液は、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１２：１、１０：１、８：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、または１：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。ある特定の実施形態では、可溶性塩溶液は、１０：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有する。

ある特定の実施形態では、工程（２）において、可溶性塩溶液は、１：１～１６：１の範囲の（例えば、２：１～１６：１の範囲の）亜鉛：リセドロン酸モル濃度比のアルカリ性リセドロン酸溶液と混合される。いくつかの実施形態では、亜鉛：リセドロン酸モル濃度比は、１：１～２：１、２：１～４：１、４：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１４：１または１４：１～１６：１の範囲である。ある特定の実施形態では、亜鉛：リセドロン酸モル濃度比は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１４：１、または少なくとも１５：１である。ある特定の実施形態では、亜鉛：リセドロン酸モル濃度比は、１６：１以下、１４：１以下、１２：１以下、１０：１以下、８：１以下、７：１以下、６：１以下、５：１以下、４：１以下、３：１以下、または２：１以下である。

ある特定の実施形態では、亜鉛：リセドロン酸モル濃度比は、１：１、２：１、４：１、４．５：１、６：１、８：１、１０：１、１２：１、１４：１または１６：１である。ある特定の実施形態では、亜鉛：リセドロン酸モル濃度比は、４：１または４．５：１である。

ある特定の実施形態では、工程（２）において、可溶性塩溶液は、亜鉛イオン、アルミニウムイオンおよびリセドロン酸の共沈を可能にする様式でアルカリ性リセドロン酸溶液と混合される。いくつかの実施形態では、工程（２）において、アルカリ性リセドロン酸溶液は、亜鉛イオン、アルミニウムイオンおよびリセドロン酸の共沈を可能にするように可溶性塩溶液に滴下される。ある特定の実施形態では、工程（２）において、可溶性塩溶液をアルカリ性リセドロン酸溶液と混合するプロセス中、亜鉛イオン、アルミニウムイオンおよびリセドロン酸の共沈が起こり、リセドロン酸亜鉛アルミニウム粒子を生じる。ある特定の実施形態では、生じたリセドロン酸亜鉛アルミニウム粒子は、０．０１μｍ～１００μｍ、例えば０．０１μｍ～６０μｍ、０．０１μｍ～５０μｍ、０．１μｍ～６０μｍ、０．１μｍ～３０μｍ、０．４μｍ～３０μｍ、０．４μｍ～２０μｍの粒子径を有する。

いくつかの実施形態では、アルカリ性リセドロン酸溶液は、リセドロン酸および水酸化ナトリウムの溶液、リセドロン酸およびリン酸塩の溶液（例えば、リセドロン酸およびリン酸水素二ナトリウムの溶液、リセドロン酸およびリン酸二水素ナトリウムの溶液）、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アルカリ性リセドロン酸溶液は、リセドロン酸および水酸化ナトリウムの溶液またはリセドロン酸およびリン酸水素二ナトリウムの溶液である。

いくつかの実施形態では、工程（１）における可溶性塩溶液は、例えば、硫酸塩溶液、塩素酸塩溶液、酢酸塩溶液、またはそれらの任意の組合せから選択される。ある特定の実施形態では、可溶性塩溶液は、塩素酸塩溶液または酢酸塩溶液である。

アジュバントの使用
１つの態様では、本出願はさらに、免疫原性組成物の製造における、または免疫原を送達するための担体としての、または免疫原用の免疫促進物質としての、アジュバントの使用を提供する。１つの態様では、本出願はまた、免疫原の免疫原性を増強するためのアジュバントの使用を提供する。１つの態様では、本出願はまた、免疫原に対する対象の免疫応答を増強するためのアジュバントの使用を提供する。１つの態様では、本出願はまた、免疫原に対する対象の免疫応答を増強するための製剤の製造におけるアジュバントの使用を提供する。アジュバントおよび免疫原などに関する上記の様々な記述はまた同様に、これらの態様にも適用することができることを理解するのは容易である。

ある特定の実施形態では、免疫応答は、細胞性免疫応答および／または液性免疫応答である。ある特定の実施形態では、細胞性免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞免疫応答は、Ｔｈ１免疫応答および／またはＴｈ２免疫応答である。

免疫原性組成物を調製する方法／免疫原の免疫原性を増強する方法
１つの態様では、本出願はまた、アジュバントを、免疫原と混合する工程を含む、免疫原性組成物を調製する方法を提供する。１つの態様では、本出願は、免疫原を、アジュバントと混合する工程を含む、免疫原の免疫原性を増強する方法を提供する。本発明のアジュバントを様々な考え得る免疫原と組み合わせて使用して、免疫原の免疫原性を増強することができることを理解するのは容易である。したがって、アジュバント、免疫原などに関する上記の様々な記述はまた同様に、これらの態様にも適用することができる。

ある特定の実施形態では、免疫原は、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分などを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、免疫原は、ウイルス、細菌、および真菌などの病原体に由来する。

ある特定の実施形態では、免疫原は、タンパク質またはその免疫原性断片、例えばウイルス、細菌、または真菌などの病原体に由来するタンパク質またはその免疫原性断片である。ある特定の実施形態では、ウイルスは、呼吸器系ウイルス（例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１ウイルス、ロタウイルス）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を含むが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、免疫原は、コロナウイルスタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）またはその免疫原性断片である。いくつかの実施形態では、コロナウイルスは、オルトコロナウイルス亜科αウイルス（例えば、２２９ＥおよびＮＬ６３）、オルトコロナウイルス亜科βウイルス（例えば、ＯＣ４３およびＨＫＵ１）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質またはその免疫原性断片、例えばＳタンパク質またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、水痘帯状疱疹ウイルスのタンパク質またはその免疫原性断片、例えば水痘帯状疱疹ウイルスのｇＥタンパク質またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、インフルエンザウイルスのタンパク質またはその免疫原性断片、例えばインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、ロタウイルスのタンパク質またはその免疫原性断片、例えばロタウイルスのＶＰ４タンパク質またはその免疫原性断片である。

いくつかの実施形態では、上記方法は、薬学的に許容可能な補助材料を添加する工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、補助材料は、例えば、賦形剤、防腐剤、抗菌剤、緩衝液および／またはさらなる免疫アジュバントから選択される。ある特定の実施形態では、さらなる免疫アジュバントは、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・プミルス、リポ多糖、サイトカイン、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

ある特定の実施形態では、上記方法は、第２の免疫原を添加する工程をさらに含む。ある特定の実施形態では、第２の免疫原は、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分などを含むが、これらに限定されない。

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチンである。
免疫原性組成物の使用
１つの態様では、本出願は、対象における疾患を防止および／または治療するための薬剤の製造における免疫原性組成物の使用を提供し、疾患は、免疫原によって誘導される免疫応答によって防止または治療されるべき疾患である。

アジュバント、免疫原、免疫原性組成物などに関する上記の様々な記述はまた、この態様にも適用可能であることを理解するのは容易である。また、様々な免疫原が免疫原性組成物に含まれ得ること、したがって、調製された薬剤を使用して、様々な相当する疾患を防止または治療することができることが容易に理解されよう。例えば、免疫原性組成物が、病原体（例えば、ウイルス）に由来する免疫原を含む場合、本出願の免疫原性組成物を使用して、病原体感染（例えば、ウイルス感染）または病原体感染（例えば、ウイルス感染）に関連付けられる疾患を防止および／または治療するための薬剤を調製することができる。

ある特定の実施形態では、免疫原は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来し、疾患は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染またはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染関連疾患である。ある特定の実施形態では、免疫原は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）タンパク質（例えば、スパイクタンパク質）またはその免疫原性断片であり、疾患は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染またはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染関連疾患である。

いくつかの実施形態では、免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質（例えば、Ｓタンパク質）またはその免疫原性断片であり、疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染関連疾患（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９））である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、水痘帯状疱疹ウイルスに由来し、疾患は、水痘帯状疱疹ウイルス感染または水痘帯状疱疹ウイルス感染関連疾患である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、水痘帯状疱疹ウイルスタンパク質（例えば、ｇＥタンパク質）またはその免疫原性断片であり、疾患は、水痘帯状疱疹ウイルス感染関連疾患である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、インフルエンザウイルスに由来し、疾患は、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染関連疾患である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、インフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＨＡタンパク質）またはその免疫原性断片であり、疾患は、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染関連疾患である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、ロタウイルスに由来し、疾患は、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染関連疾患である。

ある特定の実施形態では、免疫原は、ロタウイルスタンパク質（例えば、ＶＰ４タンパク質）またはその免疫原性断片であり、疾患は、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染関連疾患である。

ある特定の実施形態では、対象は、動物、例えば鳥類または哺乳類である。ある特定の実施形態では、対象は、齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、霊長類、または鳥類である。ある特定の実施形態では、対象は、非ヒト対象である。ある特定の実施形態では、対象は、マウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスター、またはカニクイザルである。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

免疫応答を刺激／増強する方法
１つの態様では、本出願はまた、対象における免疫原に対する免疫応答を刺激または増強する方法を提供し、これは、対象に、有効量の免疫原および本発明のアジュバントを含む免疫原性組成物を投与する工程を含む。アジュバント、免疫原、免疫原性組成物、対象などの上記の様々な記述はまた同様に、この態様にも適用可能であることを理解するのは容易である。

ある特定の実施形態では、免疫応答は、細胞性免疫応答および／または液性免疫応答である。ある特定の実施形態では、細胞性免疫応答は、Ｔ細胞免疫応答である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞免疫応答は、Ｔｈ１免疫応答および／またはＴｈ２免疫応答である。

ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、筋内注射、皮下注射、皮内投与、鼻腔内投与、経口投与、経皮投与、または静脈内注射からなる群から選択される経路によって投与される。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、筋内注射によって投与される。

疾患の治療／防止方法
１つの態様では、本出願は、対象に、有効量の免疫原性組成物を投与する工程を含む、疾患を防止または治療する方法を提供し、ここで、疾患は、免疫原によって誘導される免疫応答によって防止または治療され得る疾患である。

アジュバント、免疫原、免疫原性組成物、対象などの上記の様々な記述はまた同様に、この態様にも適用可能であることを理解するのは容易である。また、様々な免疫原が免疫原性組成物に含まれ得ること、したがって、免疫原性組成物を使用して、様々な相当する疾患を防止または治療することができることが容易に理解されよう。例えば、免疫原性組成物が、病原体（例えば、ウイルス）に由来する免疫原を含有する場合、本出願の免疫原性組成物は、対象における病原体感染（例えば、ウイルス感染）または病原体感染（例えば、ウイルス感染）関連疾患を防止および／または治療するのに使用することができる。

いくつかの実施形態では、疾患は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染またはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染関連疾患である。したがって、かかる実施形態では、免疫原は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来する。ある特定の実施形態では、免疫原は、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）タンパク質（例えば、スパイクタンパク質）またはその免疫原性断片である。

いくつかの実施形態では、疾患は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染関連疾患、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）である。したがって、かかる実施形態では、免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する。ある特定の実施形態では、免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質（例えば、Ｓタンパク質）またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、疾患は、水痘帯状疱疹ウイルス感染または水痘帯状疱疹ウイルス感染関連疾患である。したがって、かかる実施形態では、免疫原は、水痘帯状疱疹ウイルスに由来する。ある特定の実施形態では、免疫原は、水痘帯状疱疹ウイルスタンパク質（例えば、ｇＥタンパク質）またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、疾患は、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染関連疾患である。したがって、かかる実施形態では、免疫原は、インフルエンザウイルスに由来する。ある特定の実施形態では、免疫原は、インフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＨＡタンパク質）またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、疾患は、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染関連疾患である。したがって、かかる実施形態では、免疫原は、ロタウイルスに由来する。ある特定の実施形態では、免疫原は、ロタウイルスタンパク質（例えば、ＶＰ４タンパク質）またはその免疫原性断片である。

ある特定の実施形態では、対象は、動物、例えば鳥類または哺乳類である。ある特定の実施形態では、対象は、齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、霊長類、または鳥類である。ある特定の実施形態では、対象は、非ヒト対象である。ある特定の実施形態では、対象は、マウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスター、またはカニクイザルである。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

本出願における関連用語の記述および説明
本出願において、別記しない限り、本明細書中で使用する科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。

本発明によれば、「Ｓタンパク質」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を指し、これは、Ｉ型膜貫通タンパク質に属し、Ｓ１およびＳ２のタンパク質サブユニットの２つの部分からなり、ウイルスが標的細胞に侵入することを可能にするように宿主細胞表面受容体への結合および細胞膜との融合を媒介する。野生型Ｓタンパク質のアミノ酸配列は、当業者に既知であり、その典型的なアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＱＨＤ４３４１６．１において見出すことができる。いくつかの実施形態では、野生型Ｓタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１に示す。

当業者は、例えば、フーリン切断部位を除去すること、タンパク質多量体化ドメインを増加させること（例えば、Ｔ４バクテリオファージフィブリチンタンパク質の三量体化ドメインを増加させること）、および／またはタグを付加して、所望の性能を獲得することによって、野生型Ｓタンパク質を修飾することができることを理解することは容易である。ある特定の実施形態では、修飾Ｓタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。

本明細書中で別記しない限り、または明らかに文脈に反しない限り、「Ｓタンパク質」という用語は、野生型Ｓタンパク質ならびに修飾Ｓタンパク質を網羅すると解釈される。

本発明によれば、「ｇＥタンパク質」は、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）のエンベロープ糖タンパク質である。野生型ｇＥタンパク質のアミノ酸配列は、当業者に既知であり、その典型的なアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＤＱ００８３５５．１において見出すことができる。いくつかの実施形態では、ｇＥタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。

本発明によれば、「ＨＡタンパク質」という用語は、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）を指し、これは、宿主細胞へのウイルス侵襲を媒介する重要なタンパク質であり、また抗インフルエンザウイルス中和抗体の主な標的でもある。インフルエンザウイルスの各サブタイプのＨＡタンパク質のアミノ酸配列は、当業者に周知されている。例えば、Ｂ型ビクトリア系統インフルエンザウイルスの典型的なアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＩＵ４６０８８において見出すことができる。ある特定の実施形態では、ＨＡタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。

本発明によれば、「ＶＰ４タンパク質」は、ロタウイルスの外層カプシドタンパク質である。ＶＰ４タンパク質は、生物を刺激して、中和抗体を産生することができる重要な中和抗原である。野生型ＶＰ４タンパク質のアミノ酸配列は、当業者に既知であり、その典型的なアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＫＰ７５２４７４またはＧｅｎＢａｎｋ：ＭＧ７２９８３２において見出すことができる。

本明細書中で別記しない限り、または明らかに文脈に反しない限り、本明細書中で記載するｇＥタンパク質、ＨＡタンパク質、およびＶＰ４タンパク質は、それらの相当する野生型タンパク質ならびにそれらの相当する修飾タンパク質を網羅すると解釈されるべきである。

本発明によれば、「アジュバント」という用語は、抗原とともにまたは事前に、対象に送達されると、抗原に対する対象の免疫応答を増強するか、または免疫応答のタイプを変更させることができる、非特異的免疫増強物質を指す。アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・プミルス、リポ多糖、サイトカインなどを含むがこれらに限定されない多くの種類のアジュバントが存在する。フロイントアジュバントは、動物実験で最も一般的に使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験で広く使用されている。

本発明によれば、「薬学的に許容可能な補助材料」という用語は、例えば、水または他の溶媒などの不活性希釈剤、可溶化剤および乳化剤、例えばエタノール、イソピロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブタンジオール、油（具体的には、綿実油、落花生油、コーン油、麦芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物であり得る。不活性希釈剤のほかに、経口組成物はまた、補助材料、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および防腐剤を含有してもよく、懸濁配合物はまた、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、結晶セルロース、メタ水素化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントならびにそれらの混合物を含有してもよく、これらの組成物はまた、補助材料、例えば湿潤剤、乳化剤および分散剤を含有してもよい。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを組成物に包含することもまた望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬品形態の持続的吸収は、吸収を遅延し得る物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの取り込みによって引き起こすことができる。

本明細書中で使用する場合、「免疫原性」という用語は、対象を刺激して、特異的抗体を形成するか、またはリンパ球を感作させる能力を指す。「免疫原性」という用語は、特異的免疫細胞を刺激し、免疫細胞を活性化、増殖および分化させ、最終的に免疫作用を有する物質、例えば抗体および感作リンパ球を産生するという抗原の特徴を指すだけでなく、対象を刺激し、対象の免疫系が抗体または感作Ｔリンパ球を産生する、対象における特異的免疫応答を誘導する、抗原の能力も指す。免疫原性は、抗原の最も重要な特性である。抗原が宿主において免疫応答を首尾よく誘導することができるかどうかは、抗原の性質、宿主の反応性、および免疫化方法の３つの要因に依存している。

本発明によれば、「免疫原性断片」という用語は、それが由来されたタンパク質の免疫原性を少なくとも部分的に保持するポリペプチド断片を指す。例えば、コロナウイルススパイクタンパク質（Ｓタンパク質）の免疫原性断片は、Ｓタンパク質の免疫原性を少なくとも部分的に保持するコロナウイルススパイクタンパク質の断片を指す。

本発明によれば、「さらなる免疫アジュバント」という用語は、安定剤；乳化剤；ｐＨ調整物質、例えば水酸化ナトリウム、塩酸など；リポソーム；ｉｓｃｏｍアジュバント；合成糖ペプチド、例えばムラミルジペプチド；増量剤、例えばデキストラン；カーボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）；細菌細胞壁、例えばマイコバクテリア細胞壁抽出物；それらの誘導体、例えばコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）；プロピオニバクテリウム・アクネ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ）；マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、例えばウシ型カルメットゲラン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）；ワクシニアまたは動物ポックスウイルスタンパク質；ウイルス成分粒子アジュバント、例えばオルビウイルス；コレラ毒素；Ｎ，Ｎ－ジオクタデシル－Ｎ’，Ｎ’－ジ－（２－ヒドロキシエチル）プロピレンジアミン（ピリジン）；モノホスホリルリピドＡ；臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム；それらの組成物および混合物を含むが、これらに限定されない。適切な安定剤の例として、スクロース、ゼラチン、ペプトン、消化タンパク質抽出物、例えばＮＺ－アミンまたはＮＺ－アミンＡＳが挙げられるが、これらに限定されない。乳化剤の例として、注射可能または鼻腔内ワクチン組成物において有用な鉱油、植物油、落花生油、および他の標準的で代謝可能な無毒性油が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用する場合、「対象」という用語は、任意の動物、例えば鳥類または哺乳類であり得る。ある特定の実施形態では、対象は、齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、霊長類、または鳥類である。ある特定の実施形態では、対象は、非ヒト対象である。ある特定の実施形態では、対象は、マウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスター、またはカニクイザルである。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。

本明細書中で使用する場合、「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる肺炎」および「ＣＯＶＩＤ－１９」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染によって引き起こされる肺炎を指し、ともに、同じ意味を有する。

本発明によれば、「有効量」という用語は、所望の効果を得るか、または少なくとも部分的に得るのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を防止するのに有効な量は、疾患（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）の発生を防止、停止、または遅延させるのに十分な量を指し、疾患を治療するのに有効量は、疾患および疾患を患う患者におけるその合併症の発生を治癒または少なくとも部分的に防止するのに十分な量を指す。かかる有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用に有効な量は、治療されるべき疾患の重篤性、患者自身の免疫系の全身状態、患者の一般条件、例えば年齢、体重および性別、薬物の投与様式、ならびに同時投与される他の療法などに依存する。

本発明の有益な効果
従来技術と比較して、本発明は、ワクチンアジュバントまたは薬物送達担体などとして使用することができ、また抗原の免疫原性を効果的に改善するのに使用することができるリセドロン酸亜鉛アルミニウムを含有するアジュバントを提供し、その効果は、アルミニウムアジュバントの効果よりも良好である。

特に、本出願のアジュバントが、免疫原（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質）と併用して使用されると、本出願のアジュバントは、様々な動物、例えばＢａｌｂ／ｃマウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスター、およびカニクイザルにおいて、高レベルの機能的抗体ならびに均衡の取れた細胞性免疫応答および液性免疫応答を刺激または誘導することができる。したがって、本出願のアジュバントは、ワクチン（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ワクチン）の創薬可能性を改善することができる。

光学顕微鏡および電子顕微鏡下での懸濁液の外観および粒子形態に関するアルミニウムアジュバント（Ａｌ００１）（図１Ａ）およびリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバント（ＦＨ００２Ｃ）（図１Ｂ）の写真を示す図である。 Ａｌ００１（図２Ａ）およびＦＨ００２Ｃ（図２Ｂ）の粒子径の測定結果を示す図である；ｎ＝３、平均値±ＳＤ。 種々のｐＨ値でのＡｌ００１およびＦＨ００２Ｃのゼータ電位の測定結果を示す図である；ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ。 電子顕微鏡下での懸濁液の外観および粒子形態に関する種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントの写真を示す図である。 電子顕微鏡下での懸濁液の外観および粒子形態に関する種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントの写真を示す図である。 電子顕微鏡下での懸濁液の外観および粒子形態に関する種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントの写真を示す図である。 電子顕微鏡下での懸濁液の外観および粒子形態に関する種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントの写真を示す図である。 電子顕微鏡下での懸濁液の外観および粒子形態に関する種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントの写真を示す図である。 電子顕微鏡下での懸濁液の外観および粒子形態に関する種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントの写真を示す図である。 アジュバントを有さない組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質および解離ワクチン製剤（組換えＳタンパク質と組み合わせたＦＨ００２Ｃ）の抗原性検出結果を示す図であり、ここでは、種々のタンパク質濃度でのＡＣＥ２受容体の特異的結合に基づくＥＬＩＳＡ検出結果を示す。 それぞれ種々の免疫原成分（組換えＳタンパク質１μｇ、組換えＳタンパク質１０μｇ、組換えＳタンパク質＋Ａｌ００１ １μｇ、組換えＳタンパク質＋Ａｌ００１ １０μｇ、組換えＳタンパク質＋ＦＨ００２Ｃ １μｇ、および組換えＳタンパク質＋ＦＨ００２Ｃ １０μｇ）で免疫化したマウス由来のマウス血清中の抗体結合力価および中和力価の検出結果を示す図である；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせた種々の比の亜鉛、アルミニウム、およびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントで免疫化したＢａｌｂ／Ｃマウスの特異的抗体結合力価の結果を示す図である；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ。注記：横座標は、亜鉛：アルミニウム：リセドロン酸のモル濃度比を表す。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したシリアンゴールデンハムスターの特異的抗体結合力価の結果を示す図である；^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝２２または１６、幾何平均±幾何平均ＳＤ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したカニクイザルの特異的抗体結合力価の結果を示す図である、ｎ＝２、幾何平均±幾何平均ＳＤ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したシリアンゴールデンハムスターの血清中和抗体力価の結果を示す図である、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝２２または１６、幾何平均±幾何平均ＳＤ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したカニクイザルの中和抗体力価の結果を示す図である、ｎ＝２、幾何平均±幾何平均ＳＤ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したシリアンゴールデンハムスターの血清ブロッキング力価の結果を示す図である、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝２２または１６、幾何平均±幾何平均ＳＤ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したカニクイザルの血清ブロッキング力価の結果を示す図である、ｎ＝２、幾何平均±幾何平均ＳＤ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの血清抗体アビディティを示す図である、ｎ＝４または５、平均値±ＳＥＭ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したシリアンゴールデンハムスターの血清抗体アビディティを示す図である、ｎ＝１６、平均値±ＳＥＭ。 組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスの血清抗体サブタイプを示す図である、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝４または５、平均値±ＳＥＭ。 酵素結合ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ法によって検出された組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスのＴ細胞応答の結果を示す図である。図１７Ａは、取り込み画像を示し、図１７Ｂは、取り込み画像の計数の結果を示す。^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝８、平均値±ＳＤ。 水痘帯状疱疹ウイルスｇＥタンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したＢａｌｂ／Ｃマウスの特異的抗体結合力価の結果を示す図である、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ。 インフルエンザウイルスＨＡタンパク質と組み合わせたＦＨ００２Ｃまたはフロイントアジュバントで免疫化したＢａｌｂ／Ｃマウスの特異的抗体結合力価の結果を示す図である、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；ｎ＝１０、平均値±ＳＥＭ。注記：「ビクトリア／ＷＴ」は、デグリコシラーゼ（Ｐｎガーゼ）で処理されていないビクトリア系統インフルエンザウイルスの野生型ＨＡタンパク質を意味し、「ビクトリア／Ｐｎガーゼ」は、Ｐｎガーゼで処理されたビクトリア系統インフルエンザウイルスの野生型ＨＡタンパク質を意味する。 ロタウイルスＶＰ４タンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したＢａｌｂ／Ｃマウスの中和抗体力価の結果を示す図である、ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ。 ロタウイルスＶＰ４タンパク質と組み合わせたＦＨ００２ＣまたはＡｌ００１で免疫化したモルモットの中和抗体力価の結果を示す図である、ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ。

配列情報
本出願において言及される配列は、以下の表で説明される。

本発明を実行するための特定のモデル
本発明は、本発明を説明する（本発明を限定するのではなく）と意図される下記実施例を参照して記載されているが、当業者は、下記図面および実施例が、本発明の範囲を限定するのではなく、単に本発明を説明するのに使用されることが理解されよう。添付の図面および好ましい実施形態の下記の詳細な説明から、本発明の様々な目的および利点が、当業者に明らかとなる。

調製実施例で使用される試薬は下記の通りであった。
Ｈｕｎａｎ Ｈｕａｔｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入したリセドロン酸ナトリウム（Ｃ_７Ｈ_１０ＮＮａＯ_７Ｐ_２）；
Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙから購入した無水塩化亜鉛（ＺｎＣｌ₂）；
Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙから購入した塩化アルミニウム六水和物（ＡｌＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）；
Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙから購入したリン酸水素二ナトリウム十二水和物（Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ）；
Ｘｉｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙから購入した水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）。

調製実施例１：リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバント（ＦＨ００２Ｃ）の調製
（１）溶液の調製：
Ｚｎ／Ａｌ／リセドロン酸モル濃度比１：０．１：０．２２に従って、（４７ｍＭ塩化亜鉛＋４．７ｍＭ塩化アルミニウム）溶液０．５Ｌを調製し、これを溶液Ａと定義し、（１０．３ｍＭリセドロン酸＋５５ｍＭ水酸化ナトリウム＋６３ｍＭリン酸水素二ナトリウム）溶液０．５Ｌを調製し、これを溶液Ｂと定義し、後の使用のために溶液Ａおよび溶液Ｂを、０．２２μｍフィルター膜に通して濾過した。

（２）リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントＦＨ００２Ｃ懸濁液の調製：
１：１の容積比の溶液Ａおよび溶液Ｂを用いた共沈によって、リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントを調製した。即ち、調製した溶液Ｂを、溶液Ｂが完全に添加されて懸濁液を形成するまで、容積比１：１で溶液Ａに滴下した。得られた懸濁液を１２１℃で６０分間、１回滅菌し、滅菌後の物理特性および化学特性、例えばｐＨ、粒子径および粒子形状を測定した。

調製実施例２：種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバント（ＦＨ００２Ｃ）の調製
（１）溶液の調製：
Ｚｎのモル濃度を１として用いて、設計されたＺｎ／Ａｌ／リセドロン酸モル濃度比は、１：０．０２：０．１、１：０．０２：０．１５、１：０．０２：０．２２、１：０．０２：０．３３、１：０．０２：０．５、１：０．０２：１および１：０．０５：０．１、１：０．０５：０．１５、１：０．０５：０．２２、１：０．０５：０．３３、１：０．０５：０．５、１：０．０５：１および１：０．１：０．１、１：０．１：０．１５、１：０．１：０．２２、１：０．１：０．３３、１：０．１：０．５、１：０．１：１および１：０．１５：０．１、１：０．１５：０．１５、１：０．１５：０．２２、１：０．１５：０．３３、１：０．１５：０．５、１：０．１５：１および１：０．２５：０．１、１：０．２５：０．１５、１：０．２５：０．２２、１：０．２５：０．３３、１：０．２５：０．５、１：０．２５：１および１：０．５：０．１、１：０．５：０．１５、１：０．５：０．２２、１：０．５：０．３３、１：０．５：０．５、１：０．５：１であり、それぞれ、（４７ｍＭ塩化亜鉛＋０．９４ｍＭ、２．３５ｍＭ、４．７ｍＭ、７．０５ｍＭ、１１．７５ｍＭ、または２３．５ｍＭ塩化アルミニウム）溶液０．５Ｌを調製し、これを溶液Ａと定義し、（４．７ｍＭ、７．０５ｍＭ、１０．３ｍＭ、１５．５１ｍＭ、２３．５ｍＭ、または４７ｍＭリセドロン酸塩＋３５ｍＭ～２５０ｍＭ水酸化ナトリウム＋６３ｍＭリン酸水素二ナトリウム）溶液０．５Ｌを調製し、これを溶液Ｂと定義し、後の使用のために溶液Ａおよび溶液Ｂを、０．２２μｍフィルター膜に通して濾過した。

２）懸濁液の調製：
１：１の容積比の溶液Ａおよび溶液Ｂを用いた共沈によって、リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントを調製した。即ち、調製した溶液Ｂを、溶液Ｂが完全に添加されて懸濁液を形成するまで、容積比１：１で溶液Ａに滴下した。得られた懸濁液を１２１℃で６０分間、１回滅菌した。

調製実施例３：アルミニウムアジュバントＡｌ００１の調製
リン酸／Ａｌモル濃度比０．１５：１に従って、１２４ｍＭ塩化アルミニウム溶液０．５Ｌを調製し、これを溶液Ａと定義し、１８．６ｍＭリン酸水素二ナトリウム溶液０．５Ｌを調製し、これを溶液Ｂと定義し、溶液Ｂは、１４０ｍＭ水酸化ナトリウムを含有し、後の使用のために０．２２μｍフィルター膜に通して濾過した。

アルミニウムアジュバントＡｌ００１懸濁液の調製プロセスは、ＦＨ００２Ｃ懸濁液の調製を参照し得る。

実施例１：リセドロン酸亜鉛アルミニウム（ＦＨ００２Ｃ）およびアルミニウムアジュバント（Ａｌ００１）の物理特性および化学特性の決定
得られたＦＨ００２Ｃ懸濁液（調製実施例１）およびＡｌ００１懸濁液（調製実施例３）を１２１℃で６０分間、１回滅菌し、滅菌後のそれらの物理特性および化学特性、例えばｐＨ、粒子径、粒子形状、およびゼロ電荷点を測定した。

（１）アジュバントの外観および粒子形態の観察
リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントＦＨ００２Ｃを１００ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液溶液で１倍希釈し、アルミニウムアジュバントＡｌ００１を生理食塩水で１倍希釈した後、Ｃｈｉｎａ ＨｕａｗｅｉのＭａｔｅ３０ ５Ｇ携帯電話カメラを用いて写真を撮り、それらのアジュバントの外観を記録し、一方で、Ｃｈｉｎａ ＭｏｔｉｃのＡＥ３１Ｅ倒立生物顕微鏡を使用して、それらの粒子形態を観察および撮影し、ここで接眼レンズおよび対物レンズの倍率は１０倍であった。

アルミニウムアジュバントＡｌ００１およびリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントＦＨ００２Ｃを、それぞれ、脱イオン水を用いて５０倍および１００倍希釈し、続いて、Ｊａｐａｎ ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓのＪＥＭ－２１００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察した。具体的な工程は下記の通りであった：アジュバント試料を、銅グリッド上に垂らして、１０分間吸収させて、残留液体を濾紙で拭き取った後、試料を透過型電子顕微鏡の試料チャンバに送り、形態を観察して、撮影した。

実験結果：図１に示すように、リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントＦＨ００２ＣおよびアルミニウムアジュバントＡｌ００１はともに、乳白色の懸濁液であり、光学顕微鏡下では、ともに非晶質クラスターであり、電子顕微鏡下では、ＦＨ００２Ｃは、不規則なシート様構造を示したのに対して、Ａｌ００１アジュバントは、透明の繊維状構造を示した。

（２）ｐＨ測定
試験試料を採取して、室温で少なくとも３０分間置き、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ酸度計を用いて測定した。

標準緩衝液溶液（ｐＨ７．００）、標準緩衝液溶液（ｐＨ４．０１）、および標準緩衝液溶液（ｐＨ１０．０１）を選択および使用して、取扱説明書に従って機器を較正した。

「モード（Ｍｏｄｅ）」（スイッチ）キーを押して、ｐＨモードとｍＶモードとの間を切り替えることができた。通常、モードは、溶液ｐＨ値を決定するｐＨモードに設定された。

「設定（ＳＥＴＵＰ）」キーを押して、ディスプレイが、「緩衝液をクリア（Ｃｌｅａｒ ｂｕｆｆｅｒ）」を表示し、「入力（ＥＮＴＥＲ）」キーを押して、これまでの較正データを確認して、クリアした。

「設定（ＳＥＴＵＰ）」キーは、ディスプレイが緩衝液溶液群「４．０１、７．００、１０．０１」を示すまで押し、続いて「入力（ＥＮＴＥＲ）」キーを押して確認した。

電極保存溶液から電極を取り出し、脱イオン水で十分にすすぎ、すすぎ後、表面水を濾紙で乾燥させた（注記：電極は拭き取るべきではない）。

値が安定して、「Ｓ」が現れるまで、電極を第１の緩衝液溶液（ｐＨ７．００）に浸漬させ、「標準化（ＳＴＡＮＤＡＲＤＩＺＥ）」キーを押して、機器を自動的に較正した。首尾よい較正後、「７．００」および電極スロープが表示される。

第１の緩衝液溶液から電極を取り出し、脱イオン水で十分にすすぎ、値が安定して、次に「Ｓ」が現れるまで、電極を第２の緩衝液溶液（ｐＨ４．０１）に浸漬させた。「標準化」キーを押して、機器を自動的に較正した。首尾よい較正後、「４．０１ ７．００」およびメッセージ「スロープ（Ｓｌｏｐｅ）」が表示され、「スロープ」は、測定した電極スロープ値を示し、これは、９０％～１０５％の範囲で許容可能であった。

理論値から比較的大きな逸脱が存在した場合、エラーメッセージ（Ｅｒｒ）が表示され、電極を洗うべきであり、上記工程は、較正に関して繰り返されるべきである。

上記操作を繰り返して、第３の点（ｐＨ１０．０１）の較正を完了した。
較正後、電極を脱イオン水で十分にすすぎ、続いて、穏やかにブロットして、濾紙で乾燥させた。試験溶液を十分に振盪して、ガラス電極を試験溶液に浸漬して、ｐＨ値が１分間以内に±０．０５を上回って変化しなかった場合に読み取りを行った。

試験溶液を振盪して、再度測定し、２つのｐＨ値間の差は、０．１を超えるべきではない。２つの読み取り値の平均値を試験溶液のｐＨ値とした。

実験結果：Ａｌ００１アジュバントのｐＨは、滅菌前は８．００～８．４０であり、滅菌後は６．５０～６．９０であった。ＦＨ００２ＣアジュバントのｐＨは、滅菌前は７．００～７．５０であり、滅菌後は５．８０～６．３０であった。

（３）粒子径の決定
Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ １３３２０レーザ粒子径試験装置をオンにして、予熱を１５分間実施した。

機器制御ソフトウェアおよび試料セルの閉鎖区画を開け、試料セルを試料タンクから取り出して、精製水１２ｍＬを添加した。

試料セルを試料ホルダーに置き、ドアを閉めた。
ＬＳ１３３２０ソフトウェアを開けた後、ポップアップウィンドウで「ＯＫ」をクリックして、機器のセルフテストを実施した。メニューバーの「実行（ｒｕｎ）」をクリックし、「光学モジュールを使用（Ｕｓｅ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｍｏｄｕｌｅ）」を選択して、検出モジュールを開けた。メニューバーの「制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）」をクリックし、「スターラーオン（ｓｔｉｒｒｅｒ ｏｎ）」を選択して、試料セルに内蔵された自動スターラーを起動した。「サイクルの開始（ｓｔａｒｔ ｃｙｃｌｅ）」をクリックし、「オフセットの測定（Ｍｅａｓｕｒｅ Ｏｆｆｓｅｔｓ）」、「位置合わせ（Ａｌｉｇｎ）」、「背景の測定（Ｍｅａｓｕｒｅ Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）」を順に選択し、最後に「開始（ｓｔａｒｔ）」をクリックし、ポップアップダイアログボックスの「ＯＫ」をクリックして、ブランク背景の較正を開始した。

試料セルを取り出し、一定量の標準試料（機器に付属されている）を添加して、「サイクルの開始」をクリックし、「ローディングの測定（Ｍｅａｓｕｒｅ Ｌｏａｄｉｎｇ）」、「試料情報の入力（Ｅｎｔｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｉｎｆｏ）」、「実行設定の入力（Ｅｎｔｅｒ ｒｕｎ ｓｅｔｔｉｎｇ）」、「実行の開始（ｓｔａｒｔ ｒｕｎｓ）」を順に選択し、最後に「開始」をクリックし、ポップアップダイアログボックスに標準試料名を入力し、ソフトウェアの「不明瞭性（Ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）」パラメータが８％～１２％の場合に「ＯＫ」をクリックして、標準試料を試験した。

実験データの精度および信頼度を保証するために、測定の各開始の前に、ブランク背景および試験標準試料のサイズを較正する必要があった。

試料セルの閉鎖区画を開け、試料セルを取り出した。
試料セル中の標準試料を含有する水溶液を廃棄して、試料セルに脱イオン水を注ぎ、試料セルを３回洗浄した。

洗浄後、脱イオン水１２ｍＬを添加して、試料セルを試料タンクに置き、ドアを閉めた。

「サイクルの開始」をクリックし、「オフセットの測定」、「位置合わせ」、「背景の測定」を順に選択し、最後に「開始」をクリックし、ポップアップダイアログボックスの「ＯＫ」をクリックして、ブランク背景の較正を開始した。

試料セルを取り出し、一定量の試験試料を添加して、試料試験ドアを開け、試料セルを試料タンクに置き、ドアを閉めた。

「サイクルの開始」をクリックし、「試料情報の入力」、「実行設定の入力」、「実行の開始」を順に選択し、最後に「開始」をクリックし、ポップアップダイアログボックスに試料名を入力し、ソフトウェアの「不明瞭性」パラメータが８％～１２％の場合に「ＯＫ」をクリックして、測定した試料の粒子径を記録した；３回の反復測定を、それぞれアルミニウムアジュバントＡｌ００１およびリセドロン酸亜鉛アルミニウムＦＨ００２Ｃに関して実施した。

実験結果：図２に示すように、Ａｌ００１は単峰性の粒子分布を示し、そこではサイズは、０．４μｍ～６０μｍであり、主に１５μｍ～１６μｍに分布していた（図２Ａ）；リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントＦＨ００２Ｃは、二峰性の粒子分布を示し、そこではサイズは、０．４μｍ～２５μｍであり、主要ピークの粒子径は、およそ５．０μｍであった（図２Ｂ）。

（４）ＰＺＣ（ゼロ電荷点）の検出
検出用の機器：Ｎａｎｏｂｒｏｏｋ Ｏｍｎｉ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）
実験操作：電源を入れ、マルチアングル粒度および高感度ゼータ電位計を３０分間予熱した。

３６％～３８％塩酸および１０Ｍ ＮａＯＨを使用することによって、Ａｌ００１アジュバントを、ｐＨ６．５、７．０、７．５、８．０、８．５を有するように調整し、ＦＨ００２Ｃアジュバントを、ｐＨ３．０、４．０、５．０、６．０、７．０を有するように調整した。

電極の不動態化：アジュバント３ｍＬ～４ｍＬを試料管に入れた。電極を挿入した後、ＳＯＰにおいてサイクルを５０に設定し、機器を実行して、電極を不動態化した。

試料検出：電極を取り出し、続いて下端にて脱イオン水ですすぎ、相当する試料を添加し、ＳＯＰの「機器パラメータ（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）」をクリックし、「セルタイプ（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ）」の「角型ポリスチレンセル（ｓｑｕａｒｅ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎ ｃｅｌｌ）」を選択し、「電極アセンブリ（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ）」の「ＢＩ－ＳＲＥＬ（１２５０μＬ）」を選択し、続いて「詳細設定（ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｅｔｔｉｎｇｓ）」をクリックし、「平衡時間（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）」を１２０秒に設定し、「サイクル間遅延（ｉｎｔｅｒ－ｃｙｃｌｅ ｄｅｌａｙ）」を１秒に設定し、「時間依存性（ｔｉｍｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）」の「測定（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）」を３に設定し、「時間間隔（ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）」を０に設定し、「液体（ｌｉｑｕｉｄ）」をクリックして、ｐＨを各試料に相当するｐＨに設定し、「データ解析（Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」の「モデル（ｍｏｄｅｌ）」をクリックし、「スモルコフスキー（ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）」を選択し、最後に「保存（ｓａｖｅ）」をクリックし、「ＯＫ」をクリックし、パラメータの設定を完了した。

機器の実行：種々のｐＨ値を有するアジュバントを十分に振盪した後、２ｍＬをピペットで採取し、プラスチック試料タンクに順に移し、電極を挿入して、続いてそれを試料タンクに置き、機器を試料タンクに接続して、データを収集し、「開始」をクリックし、測定を開始した。続いて、次の試料試験を実施した。

データ処理：種々のｐＨ値での相当するゼータ電位を取得し、機器に付属されたソフトウェアを実行して、ＰＺＣ値を得て、次にＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８．０．２（製造業者：ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， ＬＬＣ）を使用して、略図を描画した。

実験結果：図３に示すように、アルミニウムアジュバントＡｌ００１のＰＺＣは、７．５２であり、リセドロン酸亜鉛－アルミニウムアジュバントＦＨ００２ＣのＰＺＣは、４．７５であった。

（５）ＦＨ００２ＣにおけるＺｎ／Ａｌ／リセドロン酸の沈殿率
実験方法：遊離上清中の亜鉛およびアルミニウムの含有量を、原子吸光度計（株式会社島津製作所、ＡＡ６３００Ｃ（Ｐ／Ｎ ２０６－５２４３０））によって検出し、リセドロン酸は、紫外分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＤＵ８００）によって検出した。詳細は下記の通りであった：
原子吸光度計を使用した炎光法による亜鉛元素含有量の決定：
標準曲線の作成：亜鉛単一元素標準溶液（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｎｏｎｆｅｒｒｏｕｓ Ｍｅｔａｌｓ、ＧＳＢ ０４－１７６１－２００４）を、０．２％硝酸で希釈し、０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬの亜鉛標準溶液を得た。

試験溶液の調製：濃度が標準曲線の範囲内になる（Ａｂｓ読み取り値が、０．２～０．８になる）まで、試料を０．２％硝酸溶液で希釈し、希釈の各工程の前に、ボルテックスミキサーを用いた振盪および混合を実施した。

ＷｉｚＡＡｒｄへのログイン：ＷｉｚｚＡＡｒｄアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開き、「操作（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）」欄の「測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）」アイコンをクリックし、「ログイン（Ｌｏｇｉｎ）ＩＤ」欄に「Ａｄｍｉｎ」を入力して、パスワードなしで＜ＯＫ＞をクリックした。

Ｗｉｚａｒｄ選択：「要素選択（Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」を選択し、＜ＯＫ＞をクリックした。

要素選択：「要素選択」ページの「要素の選択（Ｓｅｌｅｃｔ Ｅｌｅｍｅｎｔ）」オプションを選択し、「ローディングパラメータ（Ｌｏａｄｉｎｇ Ｐａｒａｍａｔｅｒｓ）」ページの「Ｚｎ」を選択し、［炎光連続（Ｆｌａｍｅ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）］測定方法を選択し、「ＡＳＣを使用（Ｕｓｅ ＡＳＣ）」オプションにチェックマークを付けず、［共通ランプ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｌａｍｐ）］を選択し、＜ＯＫ＞をクリックした。「較正曲線の設定（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｃｕｒｖｅ Ｓｅｔｔｉｎｇｓ）」および「パラメータの編集（Ｅｄｉｔ Ｐａｒａｍａｔｅｒｓ）」ページは特に設定せず、＜ＯＫ＞をクリックした。「未接続機器／パラメータの送信（Ｎｏｔ Ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ／Ｓｅｎｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）」ページで、＜接続／パラメータの送信（Ｃｏｎｎｅｃｔ／Ｓｅｎｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）＞をクリックした。

「機器の初期化（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｉｔｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）」ページで、黒鉛炉法のＡＳＣ検査およびＧＦＡ検査のオプションをチェックする必要はなく、「気体のチェック（Ｃｈｅｃｋ Ｇａｓ）」ダイアログボックスが表示され、＜Ｎｏ＞を選択し、「今、安全装置をチェックすることができるが、バーナー圧力モニターをチェックするか（Ｎｏｗ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｄｅｖｉｃｅ ｃａｎ ｂｅ ｃｈｅｃｋｅｄ，ｗｉｌｌ ｔｈｅ ｂｕｒｎｅｒ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｍｏｎｉｔｏｒ ｂｅ ｃｈｅｃｋｅｄ？）」のダイアログボックスが表示され、＜Ｙｅｓ＞を選択し、「空気を供給し、空気を供給した後、ＯＫボタンをクリックし、空気を排出してください（Ｐｌｅａｓｅ ｓｕｐｐｌｙ ａｉｒ，ｃｌｉｃｋ ｔｈｅ ＯＫ ｂｕｔｔｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ ａｉｒ，ａｉｒ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ）」のダイアログボックスが表示され、＜ＯＫ＞を選択し、「ＮＯ_２をチェック（Ｃｈｅｃｋ ＮＯ_２）」が表示され、＜Ｎｏ＞を選択し、「ＮＯ_２－Ｃ_２Ｈ_２は使用することができない（ＮＯ_２－Ｃ_２Ｈ_２ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｕｓｅｄ）」のダイアログボックスが表示され、＜ＯＫ＞を選択し、「廃液プローブを液面より上に上げる（Ｅｌｅｖａｔｅ ｔｈｅ ｗａｓｔｅ ｌｉｑｕｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｂｏｖｅ ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｌｅｖｅｌ）」と表示され、プロンプトに従って操作を実行して、逆火を防止するために廃液管から水が流れ出るまで、十分な超純水を廃液タンクに添加し、「廃液プローブを液面より下に移動する（Ｍｏｖｅ ｔｈｅ ｗａｓｔｅ ｌｉｑｕｉｄ ｐｒｏｂｅ ｂｅｌｏｗ ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ ｓｕｒｆａｃｅ）」が表示され、プロンプトに従って操作を実行し、廃液タンクの開口部を閉じた。全ての項目をチェックした後、＜ＯＫ＞をクリックした。

「炎光分析用機器検査リスト（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｌｉｓｔ ｆｏｒ Ｆｌａｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」ページの全ての項目をチェックして、チェックマークを付け、＜ＯＫ＞をクリックした。

「光学パラメータ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）」ページでは、波長を［２１３．８６ｎｍ］に設定し、スリット幅を［０．７］に設定し、照明方法を［発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）］に設定し、確実にＺｎ中空陰極ランプの実際の位置が設定位置と同じになるように［ランプ位置の設定（ｌａｍｐ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｅｔｔｉｎｇ）］を設定し、［照明（Ｌｉｇｈｔｉｎｇ）］を選択し、スクリーンの下部に「準備可（Ｒｅａｄｙ）」が表示されたら、＜ＯＫ＞をクリックした。

「スペクトルラインサーチ（Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｌｉｎｅ Ｓｅａｒｃｈ）」ページで、「スペクトルラインサーチ」および「ビームバランス（Ｂｅａｍ Ｂａｌａｎｃｅ）」がともに［ＯＫ］と表示されたら、［閉じる（Ｃｌｏｓｅ）］をクリックし、「光学パラメータ」ページに戻った後、＜次へ（Ｎｅｘｔ）＞をクリックした。「アトマイザー／気体流量設定（Ａｔｏｍｉｚｅｒ／Ｇａｓ Ｆｌｏｗ Ｓｅｔｔｉｎｇｓ）」ページでは何も変更せず、＜完了（Ｆｉｎｉｓｈ）＞をクリックした。

バーナー原点位置調整：［機器（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）］→［メンテナンス（Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）］→［バーナー原点位置調整（Ｂｕｒｎｅｒ Ｏｒｉｇｉｎ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）］を順に選択し、前後位置ノブとバーナー上のレンチを調整して、バーナーの位置を制御し、ＡＡ－６３００Ｃ標準カードを使用して、放射された光の位置を観察し、カード上の目盛を使用して、バーナースリット全体を通過する光が同じ水平線上になるようにした。調整後、Ａｂｓ値は安定になり、Ａｂｓ値が最大読み取りの半分になる（最大光強度の１／２がバーナーを通過することを保証する）ように、バーナーの垂直高さを、＜上に移動（ｍｏｖｅ ｕｐ）＞または＜下に移動（ｍｏｖｅ ｄｏｗｎ）＞をクリックして、最初は粗調整、次に微調整によってコンピューターを介して調整し、＜原点メモリ（Ｏｒｉｇｉｎ Ｍｅｍｏｒｙ）＞を選択し、現在のページを閉じて、安全カバーをバーナーの上に置いた。

メニューバーで［パラメータ（Ｐａｒａｍｅｔｅｒ）］→［パラメータの編集（Ｅｄｉｔ Ｐａｒａｍｅｔｅｒ）］→を選択し、照明方法を＜ＢＧＣ－Ｄ２＞に変更した。再度「ラインサーチ（Ｌｉｎｅ Ｓｅａｒｃｈ）」を実施し、「ラインサーチ」および「ビームバランス」がともに［ＯＫ］と表示されたら、＜閉じる＞をクリックした。

点火：Ｃ_２Ｈ_２がオンになり、圧力が要件を満たしていることを確認した後、ホストのＰＵＲＧＥキーおよびＩＧＮＩＴＥキーを、点火するまで同時に押した。

自動ゼロ調整：試料の正式な検出の前に、［自動ゼロ調整（ａｕｔｏ ｚｅｒｏ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）］を選択して、バーナー内の残留不純物を除去した。

ＭＲＴワークシート上に、ブランク群（ＢＬＫ）、標準物質（ＳＴＤ）、および試験されるべき試料（ＵＮＫ）を設定し、標準物質の理論濃度および試料名を入力し、アトマイザーから伸びた試料ローディング管を通して、試料を手動でロードした。各回の試料容積は、少なくとも１ｍＬであり、［開始］を選択して、検出を実施した。

データ処理：標準物質のＡｂｓおよび濃度に基づいてＥｘｃｅｌで散布図を作成し、傾向線を追加し、式および相関係数Ｒ^２を表示し、これにより、Ｒ^２≧９９％が示され、相関関係が良好であることが証明され、試料濃度を算出するのに使用することができた。

原子吸光度計を用いた黒鉛法によるアルミニウム元素含有量の決定：
標準曲線の作成：アルミニウム単一元素標準溶液（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｏｎｆｅｒｒｏｕｓ Ｍｅｔａｌｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ、ＧＮＭ－ＳＡｌ－００２－２０１３）を２％硝酸で希釈し、０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬのアルミニウム標準溶液を得た。

試験溶液の調製：濃度が標準曲線の範囲内になる（Ａｂｓ読み取り値が、０．２～０．８になる）まで、試料を０．２％で希釈した。

ＷｉｚＡＡｒｄへのログイン：ＷｉｚｚＡＡｒｄアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開き、「操作」欄の「測定」アイコンをクリックし、「ログインＩＤ」欄に「Ａｄｍｉｎ」を入力して、パスワードなしで＜ＯＫ＞をクリックした。Ｗｉｚａｒｄ選択：「要素選択」を選択し、＜ＯＫ＞をクリックした。

要素選択：「要素選択」ページの「要素の選択」オプションを選択し、「ローディングパラメータ」ページの「Ａｌ」を選択し、「ＡＳＣを使用」オプションにチェックマークを付け、［共通ライト］を選択し、＜次へ＞をクリックした。「較正曲線の設定」および「パラメータの編集」ページは特に設定を求められず、＜ＯＫ＞をクリックした。ＧＦＡ－ＥＸ７ｉの電源スイッチレンチ（ＨＥＡＴ）を入れて、「ホストへの接続／パラメータの送信（Ｃｏｎｎｅｃｔ ｔｏ Ｈｏｓｔ／Ｓｅｎｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）」ページで、＜接続／パラメータの送信＞をクリックした。ダイアログボックス「機器が接続されていないが、接続するか？（Ｔｈｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｉｓ ｎｏｔ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ，ｗｉｌｌ ｉｔ ｂｅ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ？）」が表示されたら、＜Ｙｅｓ＞をクリックした。

「機器の初期化」ページで、炎光法のＣ_２Ｈ_２値、バーナー、気体、炎光モニター、バーナー、および廃液プローブに関するオプションは、チェックする必要がなく、＜ＮＯ＞をクリックした。全ての項目をチェックした後、＜ＯＫ＞をクリックした。バイパス炎光分式：「炎光分析を実施するか？（Ｗｉｌｌ ｆｌａｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ？）」のダイアログボックスが表示されたら、＜ＮＯ＞をクリックした。

「光学パラメータ」タブページで、波長を［３９６．２ｎｍ］に設定し、スリット幅を［０．７ｎｍ］に設定し、照明方法を［発光］に設定し、確実にアルミニウムランプが設定位置になるように［ランプ位置の設定］を設定し、［照明］オプションにチェックマークを入れ、スクリーンの右下角に「準備可」と表示されたら、＜ＯＫ＞をクリックした。

「スペクトルラインサーチ」ページ：「スペクトルラインサーチ」および「ビームバランス」がともに［ＯＫ］と表示されたら、［閉じる］をクリックし、「光学パラメータ」ページに戻った後、＜次へ＞をクリックした。

「黒鉛炉プログラム（Ｇｒａｐｈｉｔｅ Ｆｕｒｎａｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍ）」ページで、「最大フェーズ数（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｐｈａｓｅ Ｎｕｍｂｅｒ）」に関して［７］、「サンプリングフェーズ数（Ｓａｍｐｌｉｎｇ Ｐｈａｓｅ Ｎｕｍｂｅｒ）」に関して［６］、および「黒鉛管タイプ（Ｇｒａｐｈｉｔｅ Ｔｕｂｅ Ｔｙｐｅ）」に関して［不明］を選択し、＜完了＞をクリックした。

黒鉛炉アトマイザー原点位置調整：［機器］、［メンテナンス］、［黒鉛炉原点位置調整（Ｇｒａｐｈｉｔｅ ｆｕｒｎａｃｅ ｏｒｉｇｉｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）］を順に選択し、アトマイザー位置の読み取りが安定になった後、Ａｂｓ読み取りがその最大に達するまで、手動前後位置ノブを使用することによって、黒鉛炉アトマイザーを移動し、読み取りがその最大値に達するまで、ＷｉｚＡＡｒｄソフトウェアを使用して、アトマイザーの上下位置を、最初は［高速（Ｆａｓｔ）］調整、次に［低速（Ｓｌｏｗ）］調整で調整し、＜原点の記憶（Ｏｒｉｇｉｎ Ｍｅｍｏｒｉｚａｔｉｏｎ）＞をクリックした。

ＡＳＣノズル位置のチェック：メニューバーの［機器］→［黒鉛炉ノズル位置（Ｇｒａｐｈｉｔｅ Ｆｕｒｎａｃｅ Ｎｏｚｚｌｅ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）］を順に選択し、コンピュータープロンプトに従って、試料吸引ノズルをまず、ＡＳＣ回転板に移動し、次に黒鉛炉アトマイザーに移動した。ＷｉｚＡＡｒｄソフトウェアのプロンプトに従って、まずアームガイドスクリューを緩め、＜下へ移動（Ｍｏｖｅ Ｄｏｗｎ）＞をクリックして、試料吸引ノズルを下に移動し、黒鉛炉の注入口に近づいたら、ＡＳＣ作業台の注入位置調整ノブを調整して、試料吸引ノズルの位置を、それが注入口の中心になるまで前後左右に水平に調整した。＜上へ移動（Ｍｏｖｅ Ｕｐ）＞および＜下へ移動＞を使用して、試料ローディング位置を、最初に粗調整、次に微調整で調整し、ＡＳＣに装備された観察ミラーを使用して、注入口の試料吸引ノズルの位置を観察し、その位置は、試料吸引ノズルと注入口の底部との間の距離の１／３で最適化された。＜ＯＫ＞をクリックして、現在の位置を保存し、現在のページを閉じた。

ＡＳＣノズル位置の繰り返しチェック：ノブを締め、メニューバーの［機器］→［黒鉛炉ノズル位置］を順に選択し、試料吸引ノズルをアトマイザーに移動した後、［方向移動管（Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ Ｍｏｖｉｎｇ Ｔｕｂｅ）］を選択した。試料吸引ノズルが注入口の中心にあれば、調整する必要はなかった。試料吸引ノズルの位置が相殺された場合、それは注入口の中心に調整され、試料吸引ノズルが注入口の中心になるまで＜キャンセル（Ｃａｎｃｅｌ）＞を選択した。

メニューバーで、［パラメータ］→［パラメータの編集］→を選択し、照明方法を＜ＢＧＣ－Ｄ２＞に変更した。再度「ラインサーチ」を実施し、「ラインサーチ」および「ビームバランス」がともに［ＯＫ］と表示されたら、＜閉じる＞をクリックした。洗浄：試料を正式に試験する前に、＜洗浄（Ｃｌｅａｎｉｎｇ）＞を選択して、黒鉛管内の残留不純物を除去した。

ＭＲＴワークシート上に、ブランク群（ＢＬＫ）、標準物質（ＳＴＤ）、および試験されるべき試料（ＵＮＫ）の位置および試料容積（１０μＬ）を順に設定し、標準物質の理論濃度および試験されるべき試料の試料名を入力し、＜開始＞を選択して、検出を実行した。

結果の処理：標準物質のＡｂｓ値および理論濃度に従って、Ｅｘｃｅｌで散布図を作成し、傾向線を追加し、式および相関係数Ｒ^２を表示し、ここで、Ｒ^２≧９９％により、相関関係が良好であることが証明され、試料濃度を算出するのに使用することができた。

ＦＨ００２Ｃ上清のリセドロン酸含有量は、ＵＶ分光光度計によって決定した：
電源オンおよび予熱：機器の右後部の主電源スイッチを入れ、一般的な予熱を１０分～２０分間実施した。

要件に従ってオプション測定を実施：スクリーンの左上角の１行目のオプション欄の「固定波長（Ｆｉｘｅｄ Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）」（固定波長測定）を選択して、測定を実施した。

固定波長（固定波長測定）：「方法の編集（Ｅｄｉｔ Ｍｅｔｈｏｄ）」アイコンをクリックして、波長設定ページを表示し、「波長数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈｓ）」欄の「２６２ｎｍ波長」を選択し、設定後「ＯＫ」をクリックした。ブランク管の試料を清潔なキュベットにロードし、比色ラックに置き、「ＢＬＫ」アイコンをクリックして、ブランクを差し引いた後、試料を個々に添加し、「読み取り（Ｒｅａｄ）」をクリックした。

実験結果：得られた標準曲線に基づき、式：（各成分の総含有量－上清中の各成分の含有量）／各成分の総濃度^＊１００％、即ち、各成分の沈殿率に従って、ＦＨ００２Ｃの上清中の亜鉛イオン、アルミニウムイオンおよびリセドロン酸をそれぞれ算出した。算出により、リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントＦＨ００２Ｃでは、亜鉛の沈殿率は、９９．０％を超え、アルミニウムおよびリセドロン酸の沈殿率は、９９．９％を超えた（表２）。

（６）吸着率の決定
組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を、下記の通りに設計および調製した。簡潔に述べると、Ｔ４ファージフィブリチンタンパク質の三量体化ドメインを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型Ｓタンパク質（配列番号１）の完全長細胞外セグメントのＣ末端に融合させ、フーリン切断部位を除去して、６^＊ＨｉｓタグをＣ末端で融合して、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（組換えＳタンパク質、配列番号４）を設計した。組換えＳタンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣がん細胞（ＣＨＯ）発現系（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入、Ａ２９１３３）によって発現させ、９５％を超える純度を有する組換えＳタンパク質を得るようニッケル－アガロースカラム（Ｃｙｔｉｖａ、１７－５３１８－０３）によって精製した。精製した組換えＳタンパク質を、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２７）によって定量化した。組換えＳタンパク質を４００μｇ／ｍＬに希釈して、組換えＳタンパク質：アジュバント＝１：１（容積比）でＦＨ００２Ｃアジュバントと混合して、混合した試料製剤を振盪して、吸着のために４℃で静置させた。サンプリングを、各時点で個々に実施した。ウェルを振盪した後、５００μＬ／回のサンプリングを行い、取り出した試料を、１３，０００ｒｐｍ／分で５分間遠心分離し、次に上清を採取して、続いて後の使用のために試料上清を、予備実験の結果に従って相当する倍率で希釈した。

標準曲線の描画：組換えＳタンパク質ストック溶液を標準物質として使用し、勾配希釈に付して、試料希釈剤ＳＤ－１を希釈緩衝液として使用し、後の使用のために標準物質を、ＥＰ管で指定される一連の濃度に希釈した：５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬ、６．２５ｎｇ／ｍＬ、３．１２ｎｇ／ｍＬ、１．５６ｎｇ／ｍＬ。

実験手順：
（１）プレートのコーティング：１×ＣＢ９．６コーティング緩衝液を使用して、３６Ｈ６モノクローナル抗体（研究室で自製、３６Ｈ６モノクローナル抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質上のＲＢＤエピトープを認識し、ハイブリドーマ技術によって調製された抗体であり、当該方法は、Ｌｉら Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．２０２０を参照した）を１μｇ／ｍＬに希釈した後、１００μＬ／ウェルでポリスチレン９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩コーティングを実施した。

（２）ブロッキング：ウェル中のコーティング溶液を廃棄して、プレートをＰＢＳＴ洗浄溶液で１回洗浄し、遠心乾燥し、ブロッキング溶液－１、２００μＬ／ウェルを添加して、２５℃で４時間、ブロッキングを実施した。

（３）ウェル中のブロッキング溶液を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで１回洗浄して、遠心乾燥し、希釈した標準物質および試料上清を、相当する９６ウェルプレートに添加して、２５℃で１時間インキュベートした。

（４）酵素標識抗体（８５Ｆ７－ＨＲＰ）（研究室で自製）の添加：ウェル中の液体を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、遠心乾燥し、酵素標識抗体（８５Ｆ７－ＨＲＰ、酵素希釈溶液としてＥＤ－１１で１：５０００（Ｖ：Ｖ）希釈）を１００μＬ／ウェルで添加して、２５℃で１時間インキュベーションを実施した。

（５）発色：ウェル中の酵素標識抗体を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、遠心乾燥し、等容積の混合発色溶液ＡおよびＢ １００μＬ／ウェルを添加して、２５℃で１０分間反応を実施した。

（６）停止：２Ｍ硫酸停止溶液５０μＬ／ウェルを添加して、反応を停止させた。
（７）プレートの読み取り：検出二波長は、マイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで設定され、各反応ウェルのＯＤ値を測定した。

ＦＨ００２Ｃアジュバント吸着率の算出：希釈した試料ウェルのＯＤ読み取り値を標準曲線に導入して、試料ウェルの相当するタンパク質濃度を得た後、相当する希釈倍率をそれに乗じて、それにより、元の試料の上清のタンパク質濃度が得られた。アジュバント吸着率＝（元の試料の総タンパク質濃度－上清のタンパク質濃度）／元の試料の総タンパク質濃度^＊１００％。

実験結果を表３に示した。吸着率の計算式に従って、組換えＳタンパク質と組み合わせたＦＨ００２Ｃのワクチン製剤が３０時間吸着された場合、９５％を超えるアジュバント吸着率を達することができ、それを４℃で７０日間静置させた場合、ワクチン製剤のタンパク質吸着率は常に、９５％を上回っていた（９６．５％～９９．９％）。

実施例２：種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバント（ＦＨ００２Ｃ）の物理特性および化学特性の決定
得られたＦＨ００２Ｃ懸濁液（調製実施例２）およびＡｌ００１懸濁液（調製実施例３）を１２１℃で６０分間、１回滅菌し、それらの物理特性および化学特性、例えばｐＨ、吸着率、金属沈殿率、外観および粒子形態を決定した。

（１）ｐＨの決定
ｐＨの決定方法は、実施例１におけるｐＨ決定プロセスと同じであった。

実験結果：種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２ＣアジュバントのｐＨ値は、滅菌前は７．２０～７．９０であり、滅菌後は６．００～６．６０であった。

（２）吸着率の決定
ＢＳＡ標準物質に関する標準曲線の描画：１００ｍＭ ＮａＡｃを希釈緩衝液として使用し、ＢＳＡ標準物質（２ｍｇ／ｍＬ）を段階希釈して、２８０ｎｍでの吸光度を、ＵＶ分光光度計を用いて測定し、標準曲線を描画した。

ＢＳＡの調製：１００ｍＭ ＮａＡｃを希釈緩衝液として使用し、一定量のＢＳＡ試料を、ＥＰ管へ秤量して、最終濃度１ｍｇ／ｍＬに至るように希釈した。

ＢＳＡおよびアジュバントの混合：アジュバントを振盪した後、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ：アジュバント＝１：１（容積比）に従って混合を実施し、室温で１時間、吸着を実行して、その期間中に振盪を５回実施し、遠心分離（１３０００ｒｐｍ／分、３分）後、後の使用のために上清を採取した。

吸着率の決定：ＵＶ分光光度計を使用して、２８０ｎｍでの上清の吸光度値を直接測定し、その結果、読み取り値は、０．２～０．８であった。吸着率の算出：希釈した試料ウェルのＯＤ読み取り値を標準曲線に導入して、試料ウェルの相当するタンパク質濃度を得た後、相当する希釈倍率をそれに乗じて、元の試料の上清のタンパク質濃度が得られた。アジュバント吸着率＝（元の試料の総タンパク質濃度－上清のタンパク質濃度）／元の試料の総タンパク質濃度^＊１００％。

実験結果を表４に示した。吸着率の計算式に従って、種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントの吸着率は、３９％～９６％であった。標準物質を７５％として、７５％を超える吸着率を有するアジュバントを選択して、金属沈殿率を観察した。

（３）金属沈殿率の決定
混合金属元素の標準溶液の調製：１２ｍＬの遠心管中で、４つの金属単一元素を有する標準溶液を、５％硝酸で較正曲線の最高濃度点に希釈して、ＳＴＤ７溶液を得た。次に、それを１％硝酸で段階的に希釈して（塩酸６ｍＬを、これまでの標準ワーキング溶液６ｍＬに添加した）、順にＳＴＤ６溶液からＳＴＤ１溶液までを得て、確実に試料が完全にロードされるように、各混合標準溶液の最終容積は６ｍＬであった。

試験溶液（少なくとも４ｍＬ）の調製：試験試料を採取して、室温に平衡化させ、ボルテックスミキサーで完全に混合し、試験試料を正確にサンプリングし、５％硝酸溶液を用いて適切な倍率に希釈し（カルシウム、マグネシウムおよび亜鉛含有量の決定に関しては２００倍が推奨され、アルミニウム含有量の決定に関しては５０倍が推奨された）、十分に混合して、１時間静置させ、これを試験試料溶液とした。

ブランク対照溶液の調製：５％硝酸溶液をブランク対照とした。
測定：アルゴン気体瓶（空気圧約０．６ＭＰａを有するよう調整）を開いた。ブローイング気体による平衡化：ＩＣＰ－ＯＥＳ機器およびソフトウェアをオンにし、ソフトウェアインタフェースの「ダッシュボード（Ｄａｓｈｂｏａｒｄ）」の「パージ気体流入（Ｐｕｒｇｅ Ｇａｓ Ｆｌｏｗ）」を選択し、ドロップダウンオプションの「通常（Ｎｏｒｍａｌ）」モデルをクリックした。機器を少なくとも１時間この状態で平衡化させた。平衡化すると、ソフトウェアインタフェース上の「トーチ区画（Ｔｏｒｃｈ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）」、「プラズマ気体圧力（Ｐｌａｓｍａ Ｇａｓ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）」、「パージ気体圧力（Ｐｕｒｇｅ Ｇａｓ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ）」、「ドレイン流量（Ｄｒａｉｎ Ｆｌｏｗ）」、「排気流量（Ｅｘｈａｕｓｔ Ｆｌｏｗ）」および「オプティクス温度（Ｏｐｔｉｃｓ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」が観察され、緑色に変わるはずである。水タンクを開き、約２分間待機した後、機器のステータスバーの「検出器の水流量（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｗａｔｅｒ Ｆｌｏｗ）」および「検出器の温度（Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」が緑色に変わるはずである。機器のパイプラインを接続し、洗浄した：カテーテル入口を超純水の中に置き、カテーテルを蠕動ポンプに正確に接続して、選択インタフェースの「ポンプ速度（Ｐｕｍｐ Ｓｐｅｅｄ）」を５０に変更し、「適用（Ａｐｐｌｙ）」をクリックし、液体がカテーテル出口から正常に流出することができるかどうかを観察した。１分～２分間洗浄した後、点火を実行することができるようになった。点火：ソフトウェアインタフェースの「ダッシュボード（Ｄａｓｈｂｏａｒｄ）」を選択し、操作インタフェースの上部にある中央の青色アイコン「準備（Ｇｅｔ Ｒｅａｄｙ）」をクリックし、ポップアップウィンドウの「ＯＫ」をクリックし、約２分～５分間待機した後、点火が成功した。最初の点火が正常であると認識されなかった場合は、機器が完全に自動洗浄された後に再度、点火操作を実施した。ログの「炭素ライン（Ｃａｒｂｏｎ ｌｉｎｅ）」のｘ値およびｙ値が観察された。両方の絶対値はそれぞれ、１０未満であるべきである。ＬａｂＢｏｏｋの作成：右側のメニューバーの「ＬａｂＢｏｏｋｓ」をクリックし、行われるべき実験名を「名前（Ｎａｍｅ）」欄に入力し（実験日＋実験内容＋操作者）、「既存のＬａｂＢｏｏｋから新たなＬａｂＢｏｏｋを作成（Ｃｒｅａｔｅ ａ ｎｅｗ ＬａｂＢｏｏｋ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｘｓｉｔｉｎｇ ＬａｂＢｏｏｋ）」を選択し、「リセドロン酸ナトリウム－亜鉛－アルミニウムアジュバント方法テンプレート（Ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍ－Ｚｉｎｃ－Ａｌｍｉｎｕｍ ａｄｊｕｖａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ Ｔｅｍｐｌａｔｅ）」を開き、インタフェースの下部にある「ＬａｂＢｏｏｋの作成（Ｃｒｅａｔｅ ＬａｂＢｏｏｋ）」をクリックし、即ち、リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントテンプレートにおける現在の実験用のＬａｂＢｏｏｋが首尾よく作成された。パラメータ選択：新たに作成されたテンプレートインタフェースで、右側の「分析物（Ａｎａｌｙｔｅｓ）」欄を、測定されるべき元素およびそれらの検出波長、Ｚｎ（２１３．８５６ｎｍ）、Ａｌ（３９６．１５２ｎｍ）、Ｃａ（３９６．８４７ｎｍ）、Ｍｇ（２７９．５５３ｎｍ）に関してチェックした。「測定モード（Ｍｅａｓｕｒｅ Ｍｏｄｅｓ）」欄では、観測方向が「放射状（Ｒａｄｉａｌ）」であるかどうかをチェックした。試料ローディングシーケンスの作成：右の欄の「試料リスト（Ｓａｍｐｌｅ ｌｉｓｔ）」を選択し、試料情報およびローディング位置を、シーケンスに入力して保存し、左上角の緑色の三角形アイコン「開始」をクリックして、続いて左下角の緑色の三角形アイコンをクリックして、シーケンスの実行を開始した。各試料を測定する場合、カテーテルを遠心管に入れた。各注入を測定した後、カテーテルを洗浄するために「洗浄（ｗａｓｈ）」に入るべきであるとシステムに指示される前に、カテーテル上の残留液滴を無塵紙（または濾紙）で拭き取るべきである。カテーテルを「洗浄」から次の試料に移す場合、カテーテル上の液滴も同様に拭き取るべきである。結果の算出：混合標準溶液の濃度を横座標とし、対応するピーク面積を縦座標として４本の標準曲線を描画し、線形回帰方程式を作成した。希釈した試験試料溶液に相当する各単一元素のピーク面積を回帰方程式に代入し、希釈倍率を乗じて、試験試料溶液の金属元素濃度（ｐｐｍ）を得た。

実験結果：表６、表７および表８に示されるように、Ｚｎは、基本的に沈殿物中に存在し、ＭｇおよびＣａは、部分的に沈殿物中に存在し、一部は上清中に存在した。ＭｇおよびＣａの沈殿率の結果に従って、灰色を付した部分を選択し、アジュバントの外観および粒子形態を観察した。

（４）アジュバントの外観および粒子形態の観察
実施例１の検出プロセスを参照することによって、アジュバントの外観および粒子形態の観察を実施した。

実験結果：図４Ａ～図４Ｆに示すように、種々の比の亜鉛、アルミニウムおよびリセドロン酸を有するリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントは全て、様々な度合いの濁度を有する乳白色懸濁液であり、電子顕微鏡下では、それらのほとんどが、不規則なシート様構造を有し、それらのいくつかが、繊維状構造を有していた。

実施例３：ＦＨ００２Ｃを含有する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質製剤の抗原性活性の決定（ＡＣＥ２受容体結合に基づく）
ＦＨ００２Ｃ（調製実施例１と同様に調製）および組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を、容積比１：１で混合して、ワクチン製剤を形成し、その抗原性を試験するために４℃で１週間置いた（完全吸着）。吸着されていない組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ストック溶液を、アジュバントが吸着および解離された後の抗原性の比較を実施するための対照として使用した。

タンパク質の抗原性は、ＡＣＥ２受容体結合に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏ相対効力試験によって検出された：
（１）抗体コーティング溶液：１×ＣＢ９．６緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３；３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）。

（２）洗浄溶液：ＰＢＳＴ、ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。
（３）ブロッキング溶液：ブロッキング溶液－１、ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。

（４）発色溶液Ａ：ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。
（５）発色溶液Ｂ：ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。

（６）停止溶液：ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。
実験手順：
（１）プレートのコーティング：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質抗体４５Ｃ３（研究室で自製）を、１×ＣＢ９．６コーティング緩衝液を用いて１μｇ／ｍＬに希釈して、１００μＬ／ウェルでポリスチレン９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩コーティングを実施した。

（２）ブロッキング：ウェル中のコーティング溶液を廃棄して、プレートをＰＢＳＴ洗浄溶液で１回洗浄し、遠心乾燥し、ブロッキング溶液を２００μＬ／ウェルで添加して、室温で４時間、ブロッキングを実施した。

（３）試料の調製：組換えＳタンパク質抗原ストック溶液（吸着前）、および組換えＳタンパク質ワクチン製剤の解離によって形成された抗原（製剤中の組換えＳタンパク質抗原の濃度は１００μｇ／ｍＬであり、アジュバントはＦＨ００２Ｃであった）。第１のウェル中の抗原濃度は４μｇ／ｍＬであった。ウェル中のブロッキング溶液を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで１回洗浄して、遠心乾燥し、試験されるべき試料を第１のウェルに２００μＬ／ウェルで添加して、試料希釈剤溶液１００μＬを各次のウェルに添加して、２倍段階希釈を実行して、２５℃で１時間インキュベーションを実施した。

（４）ＡＣＥ２－ｈＦｃ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１０１０８－Ｈ０２Ｈ）の添加：ウェル中の液体を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄して、遠心乾燥し、ＡＣＥ２－ｈＦｃ、１μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェルを添加して、２５℃で１時間、インキュベーション反応を実施した。

（５）酵素標識抗体（ＭＡＨ－ＨＲＰ）（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈから購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．：９０４２－０５）の添加：ウェル中の液体を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、遠心乾燥し、酵素標識抗体（ＭＡＨ－ＨＲＰ、Ｖ：Ｖ＝１：５０００）、１００μＬ／ウェルを添加して、２５℃で１時間インキュベーション反応を実施した。

（５）発色：ウェル中の酵素標識抗体を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、遠心乾燥させて、等容積の混合発色溶液ＡおよびＢ １００μＬ／ウェルを添加して、２５℃で１０分間、インキュベーション反応を実施した。

（６）停止：２Ｍ硫酸停止溶液５０μＬ／ウェルを添加して、反応を停止させた。
（７）プレートの読み取り：検出二波長を、マイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで設定することによって、各反応ウェルのＯＤ値を測定した。

実験結果を図５に示した。ＡＣＥ２受容体結合に基づく抗原性検出結果により、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ワクチン製剤と組み合わせたＦＨ００２Ｃが解離溶液で解離された後、その抗原性は、組換えＳタンパク質ストック溶液の抗原性に匹敵することが示され（ｒＥＣ_５０＝ＥＣ_５０、ストック溶液／ＥＣ_５０、解離後＝０．９）、ＦＨ００２Ｃを含有する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質ワクチン製剤は良好な安定性を有することが示された。

実施例４：リセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントを含有する組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の用量効果の相関関係に関する研究
調製実施例１に従って調製したＦＨ００２Ｃアジュバントおよび調製実施例３に従って調製したＡｌ００１アジュバントをアジュバントとして使用し、それぞれ、容積比１：１でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 組換えＳタンパク質と混合して、ワクチンを形成し、続いてこれらを、マウスに筋内注射し、血清中の特異的抗体結合力価および中和力価を検出した。具体的な方法は下記の通りであった：
実験動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｌａｃｋ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．：２０１７０００５０２４８０）、６週～８週、５匹／群、雌。

実験群分け：（１）低用量組換えＳタンパク質水溶液群（１μｇ）；（２）高用量組換えＳタンパク質水溶液群（１０μｇ）；（３）低用量組換えＳタンパク質＋Ａｌ００１群（１μｇ）；（４）高用量組換えＳタンパク質＋Ａｌ００１群（１０μｇ）；（５）低用量組換えＳタンパク質＋ＦＨ００２Ｃ群（１μｇ）；（６）高用量組換えＳタンパク質＋ＦＨ００２Ｃ群（１０μｇ）。

免疫化プロトコル：動物１匹当たり組換えＳタンパク質１μｇまたは１０μｇ、即ち、容積比１：１でアジュバントを組換えＳタンパク質と混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、マウス１匹当たり１００μＬで、マウスの後肢それぞれに５０μＬでマウスに筋内注射した。免疫化を０週目および３週目に実行し、即ち、免疫化群に従って動物に最初に免疫化した３週後に、血液試料を眼窩から収集して、血清中の特異的抗体力価を決定した。免疫化は、３週目に追加免疫した後、血液試料を眼窩から毎週収集し、血清中の特異的抗体結合力価をＥＬＩＳＡ法によって決定した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による抗体結合力価の検出：
（１）抗体コーティング溶液：１×ＣＢ９．６緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ_２ＣＯ_３；３５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３）。

（２）洗浄溶液：ＰＢＳＴ、ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。
（３）ブロッキング溶液：ブロッキング溶液－１、ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。

（４）発色溶液Ａ：ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。
（５）発色溶液Ｂ：ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。

（６）停止溶液：ＩＮＮＯＶＡＸ ＣｏｍｐａｎｙのＥＬＩＳＡキット。
実験手順：
（１）プレートのコーティング：抗原組換えＳタンパク質を、ＣＢ９．６コーティング緩衝液を用いて一定濃度に希釈して、１００μＬ／ウェルでポリスチレン９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩コーティングを実施した。

（２）ブロッキング：ウェル中のコーティング溶液を廃棄して、プレートをＰＢＳＴ洗浄溶液で１回洗浄し、遠心乾燥し、ブロッキング溶液２００μＬ／ウェルを添加して、室温で４時間、ブロッキングを実施した。

（３）一定希釈での血清の添加：ウェル中のブロッキング溶液を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで１回洗浄して、遠心乾燥し、試験されるべき血清２００μＬ／ウェルを第１のウェルに添加して、試料希釈剤１００μＬを各次のウェルに添加して、２倍段階希釈を実行して、２５℃で１時間インキュベーション反応を実施した。

（４）酵素標識抗体（ＧＡＭ－ＨＲＰ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１７０６５１６）の添加：ウェル中の血清希釈液を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、遠心乾燥し、酵素標識抗体（ＧＡＭ－ＨＲＰ、Ｖ：Ｖ＝１：５０００）、１００μＬ／ウェルを添加して、２５℃で１時間インキュベーション反応を実施した。

（５）発色：ウェル中の酵素標識抗体を廃棄して、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、遠心乾燥し、等容積の混合発色溶液ＡおよびＢ １００μＬ／ウェルを添加して、２５℃で１０分間、反応を実施した。

（６）停止：２Ｍ硫酸停止溶液５０μＬ／ウェルを添加して、反応を停止させた。
（７）プレートの読み取り：検出二波長を、マイクロプレートリーダー上で４５０ｎｍおよび６３０ｎｍで設定することによって、各反応ウェルのＯＤ値を測定した。

血清中の特異的抗体中和力価に関する検出方法は、Ｈ．Ｌ．Ｘｉｏｎｇら、Ｒｏｂｕｓｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂｅａｒｉｎｇ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＶＳＶ） ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ＡＣＥ２－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＢＨＫ２１ ｃｅｌｌｓ． Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ、１～３８頁（２０２０）を参照した。

実験結果を図６に示した：
マウスを１回のショットで免疫化した３週後、同じ免疫化用量下にて、ＦＨ００２Ｃアジュバント群におけるマウスの抗体力価は、水溶液群およびＡｌ００１アジュバント群における抗体力価よりも高く、アルミニウムアジュバント群の抗体力価よりも１～１．５桁分高く、迅速に効果を発揮する特性を有していた。免疫化の２回のショット後、ＦＨ００２Ｃアジュバントの液性免疫増強の利点は依然として明白であった。４週目に、低用量群において、ＦＨ００２Ｃアジュバント群の抗体力価は、アルミニウムアジュバント群の抗体力価よりも１．５桁分高く、水溶液群の抗体力価よりも３桁分高かった。高用量群において、ＦＨ００２Ｃアジュバント群およびＡｌ００１群の抗体レベルは同等であり、ともに、水溶液群の抗体レベルよりも２桁分高かった。５週および６週目に、高用量群および低用量群において、ＦＨ００２Ｃアジュバント群の抗体力価は依然として、Ａｌ００１群の抗体力価よりも（０．５～１桁分高い）、また水溶液群の抗体力価よりも（２．５～３桁分高い）有意に高かった。

１回のショット後、ＦＨ００２Ｃアジュバント群のマウスのみが、３週目に中和抗体を産生したのに対して、水溶液群およびＡｌ００１アジュバント群のマウスは、中和抗体を産生しなかった。免疫化の第２のショット後、４週目、５週目および第６週目に、高用量群であろうと低用量群であろうと、ＦＨ００２Ｃアジュバント群におけるマウスの中和力価は、Ａｌ００１アジュバント群における中和力価よりも（０．５～１．５桁分高い）、また水溶液群における中和力価よりも（１．５～２．５桁分高い）高かった。

実施例５：組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせた種々の比の亜鉛、アルミニウム、およびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントによって誘導された特異的抗体結合力価
調製したＦＨ００２Ｃ（調製方法に関しては調製実施例２を参照）をアジュバントとして使用し、容積比１：１で組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と混合して、ワクチンを形成し、続いてこれをＢａｌｂ／Ｃマウスに筋内注射して、産生された特異的抗体の力価を測定した。具体的な方法は下記の通りであった：
実験動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス、６週齢～７週齢、雌、各群中に５匹
免疫化プロトコル：マウス１匹当たり抗原１μｇ、即ち、マウス１匹当たり１００μＬ（左肢に半分および右肢に半分）。免疫化の２回のショットを、０週目および３週目に実行し、０週目から６週目に、週に１回眼窩血液を収集して、血清中の抗体力価の検出を実施した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、抗体結合力価を検出し、これを下記の通りに具体的に説明した：
ＥＬＩＳＡで使用した試薬は、実施例４を参照した。

実験手順：
（１）コーティングおよびブロッキング：組換えＳタンパク質を、ＣＢ９．６で１μｇ／ｍＬに希釈して、１００μＬ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、配置して、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（即ち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、２０％ＮＢＳを含有するＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して、続いて、３７℃で２時間インキュベートすることによって、ブロッキングを実施した。過剰な液体を除去した後、後の使用のためにそれを遠心乾燥した。

（２）血清の希釈：３００倍希釈した血清１００μＬを第１のウェルに添加して、続いて１０勾配で３倍希釈して、３７℃で１時間インキュベートした。

（３）酵素標識抗体の添加：プレートをＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した後、一定倍率で希釈したヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素標識抗体ＧＡＭ－ＨＲＰ（研究室で自製）１００μＬを添加して、３７℃で０．５時間インキュベートした。

（４）発色、停止、および読み取り。
実験結果：図７に示すように、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせた種々の比の亜鉛、アルミニウム、およびリセドロン酸を有するＦＨ００２Ｃアジュバントは全て、特異的結合抗体を誘導することができた。

実施例６：組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントによって誘導された特異的抗体結合力価
調製したＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）をアジュバントとして使用し、容積比１：１で組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と混合して、ワクチンを形成し、続いてシリアンゴールデンハムスター（本明細書中では「シリアンハムスター」とも称する）およびカニクイザルに筋内注射して、産生された特異的抗体力価を決定した。具体的な方法は下記の通りであった：
実験動物：シリアンゴールデンハムスター（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｌａｃｋ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）、６週～７週、ＦＨ００２Ｃ群に関しては２２匹／群、Ａｌ００１群に関しては１６匹／群、半分が雄で半分が雄。成体カニクイザル（Ｇｕａｎｇｘｉ Ｘｉｏｎｇｓｅｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）、２匹／群、半分が雄で半分が雄。

実験群分け：（１）組換えＳタンパク質＋Ａｌ００１；（２）組換えＳタンパク質＋ＦＨ００２Ｃ
シリアンゴールデンハムスターに関する免疫化プロトコル：動物１匹当たり抗原１０μｇ、即ち、容積比１：１でアジュバントを組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と個々に混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、動物１匹当たり２００μＬでシリアンゴールデンハムスターに筋内注射した。３回の免疫化ショットを、０週目、２週目および６週目に実行し、０週目から７週目に、血清中の抗体力価の検出用に、週に１回眼窩血液を収集した。

カニクイザルに関する免疫化プロトコル：サル１匹当たり抗原２０μｇ、即ち、容積比１：１でアジュバントを組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と個々に混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、動物１匹当たり５００μＬでカニクイザルに筋内注射した。２回の免疫化ショットを、０週目および２週目に実行し、０週目から６週目に、抗体結合力価の検出用に、週に１回血液を収集した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、抗体結合力価を検出し、これを下記の通りに具体的に説明した：
ＥＬＩＳＡで使用した試薬は、実施例４を参照した。

実験手順：
（１）コーティングおよびブロッキング：組換えＳタンパク質を、ＣＢ９．６で２μｇ／ｍＬに希釈して、１００μＬ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、配置して、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（即ち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、２０％ＮＢＳを含有するＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して、続いて、３７℃で２時間ブロッキングのためにインキュベートした。過剰な液体を除去した後、後の使用のためにそれを遠心乾燥した。

（２）血清の希釈：５０倍または１００倍希釈した血清１００μＬを各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。

（３）酵素標識抗体の添加：プレートをＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した後、一定倍率で希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＢＥＹＯＴＩＭＥ、Ａ０２０１）またはヤギ抗シリアンゴールデンハムスターＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ、ａｂ６８９２）１００μＬを添加して、３７℃で０．５時間インキュベートした。

（４）発色、停止、および読み取り。
実験結果：図８に示すように、シリアンゴールデンハムスターを１回のショットで免疫化した２週後、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、Ａｌ００１群の抗体力価よりも高く、即ち、アルミニウムアジュバント群の抗体力価の１５倍であり、ＦＨ００２Ｃは、迅速に効果を発揮する特性を有していた。免疫化の２回のショット後、液性免疫を増強するその利点は依然として明白であった。４週目に、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、アルミニウムアジュバント群の抗体力価の８倍であった。３回の注射後、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、７週目に対照群の抗体力価の１１倍であった。

カニクイザルの免疫化の２週後、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、Ａｌ００１群の抗体力価よりも高く、即ち、アルミニウムアジュバント群の抗体力価の６倍であり、ＦＨ００２Ｃは、迅速に効果を発揮する特性を有していた。免疫化の２回のショット後、４週目に、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、アルミニウムアジュバント群の抗体力価と同等であった（図９）。

実施例７：組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントによって誘導された中和抗体力価
実施例６に記載する実験手順を採用して、アジュバントＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）を、それぞれ組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせて、筋内注射によってシリアンゴールデンハムスターおよびカニクイザルを免疫化するのに使用し、血清中の中和抗体力価を検出した。シリアンゴールデンハムスターおよびカニクイザルに関する免疫化手順は、実施例６の免疫化手順と同じであった。

抗体中和力価は、偽ウイルス中和によって検出され（Ｈ．Ｌ．Ｘｉｏｎｇら、Ｒｏｂｕｓｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂｅａｒｉｎｇ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ （ＶＳＶ） ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ ａｎｄ ＡＣＥ２－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＢＨＫ２１ ｃｅｌｌｓ． Ｅｍｅｒｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ、１～３８頁（２０２０））、これを下記の通りに具体的に説明した：
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質を保有する水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）偽ウイルス（ｒＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株、ｇｅｎｅ ｂａｎｋ：ＱＨＤ４３４１６．１）を、組換えプラスミドｐＣＡＧ－ｎＣｏＶＳｄｅｌ１８およびＶＳＶｄＧ－ＥＧＦＰ－Ｇウイルス（Ａｄｄｇｅｎｅ、３１８４２）によってパッケージングした。ｈＡＣＥ２発現ＢＨＫ２１（ＢＨＫ２１－ｈＡＣＥ２）細胞を事前に２４時間９６ウェルプレートに播種した後、血清を１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、１００９９１４１）およびペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ、１５１４０１２２）を含有する高グルコースＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ６４２９）で５０倍希釈し、続いて、３倍段階希釈を実施した。希釈したｒＶＳＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＭＯＩ＝０．０５）を、希釈した血清と混合して、３７℃で１時間インキュベートした。そのすぐ直後に、混合物を、ＢＨＫ２１－ｈＡＣＥ２細胞でコーティングしたプレートに移し、続いて５％ＣＯ_２を含有するインキュベータ中で３７℃にて１２時間インキュベートした。Ｏｐｅｒａ ＰｈｅｎｉｘまたはＯｐｅｒｅｔｔａ ＣＬＳハイコンテント解析システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって蛍光画像データを取り込み、ウェル１つ当たりのＧＦＰ陽性細胞の計数を、Ｃｏｌｕｍｂｕｓシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって解析した。各プレートは、ウイルス対照として８つの無血清ウェルを含有していた。血清中和力価は、ＧＦＰ陽性細胞の数が陽性ウェルと比較して５０％低減することに相当する血清希釈倍率（ＩＤ_５０）と定義された。

実験結果：図１０に示すように、シリアンゴールデンハムスターを１回のショットで免疫化した２週後に、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、Ａｌ００１群の抗体力価よりも高く、即ち、アルミニウムアジュバント群の抗体力価の１．８倍であり、ＦＨ００２Ｃは、迅速に効果を発揮する特性を有していた。免疫化の２回のショット後、液性免疫を増強するその利点は依然として明白であった。４週目に、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、アルミニウムアジュバント群の抗体力価の２．６倍であった。３回のショット後、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、７週目に対照群の抗体力価の６．５倍であった。

カニクイザルの免疫化の２週後、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、Ａｌ００１群の抗体力価よりも高く、即ち、アルミニウムアジュバント群の抗体力価の２．６倍であった。免疫化の２回のショット後、ＦＨ００２Ｃ群の抗体力価は、４週目にアルミニウムアジュバント群の抗体力価の３．５倍であった（図１１）。

実施例８：組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントによって誘導された免疫血清の細胞ベースのスパイクブロッキング実験
実施例６に記載する免疫化手順を採用して、アジュバントＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）を、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせて、筋内注射によってシリアンゴールデンハムスターおよびカニクイザルを免疫化し、細胞ベースのスパイク血清ブロッキング実験（Ｙ．Ｚｈａｎｇら、Ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ ａｎｄ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｃｅｌｌ ｅｎｔｒｙ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ、（２０２０））を下記の通りに実施した：
ｈＡＣＥ２－ｍＲｕｂｙ３を発現する２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ－ＡＣＥ２ｉＲｂ３）を、事前に２４時間２×１０^４個／ウェルのポリ－Ｄ－リジンで前処理した９６ウェルプレート上に播種した。シリアンゴールデンハムスターおよびカニクイザルの血清を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いて２倍段階希釈で希釈した。最終プローブ濃度が２．５ｎＭになるように、ガミラス（Ｇａｍｉｌｌｕｓ）と融合させたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク三量体（ＳＴＧ）のプローブ１１μＬを、希釈した血清４４μＬと混合した。培養培地の半分を、２９３Ｔ－ＡＣＥ２ｉＲｂ３細胞を蒔いたウェルから除去して、混合物５０μＬをピペットで採取して、細胞に添加して、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートした。続いて、Ｏｐｅｒａ Ｐｈｅｎｉｘハイコンテント解析システムによって、共焦点モードで細胞画像を取り込んだ。

データ解析：画像データの定量解析にＣｏｌｕｍｂｕｓシステムを使用した。まず、２９３Ｔ－ＡＣＥ２ｉＲｂ３細胞は全て、核において局在化されたＨ２Ｂ融合ｉＲＦＰ６７０を発現するという原則に従って、近赤外チャネル（Ｅｘ：６４０／Ｅｍ：６７０）により、接種した細胞を全て見つけ出した。ｍＲｕｂｙ３と融合させたｈＡＣＥ２は膜上に位置するという原則に従って、細胞境界を赤色チャネル（Ｅｘ：５６１／Ｅｍ：５９０）で規定した。次に、細胞質領域におけるＳＴＧプローブチャネル（Ｅｘ：４８８／Ｅｍ：５２５）のＭＦＩを算出すること（ｃＭＦＩ、外側境界：２０％、内側境界：４５％）によって、阻害比率を得ることができた：［（ｃＭＦＩｐｃ－ｃＭＦＩｔｓｔ）／（ｃＭＦＩｐｃ－ｃＭＦＩｂｌｋ）］×１００％。ここで、ｃＭＦＩｔｓｔは、試験ウェルのｃＭＦＩ値を指し、ｃＭＦＩｐｃおよびｃＭＦＩｂｌｋは、それぞれプローブのみ（陽性対照）のウェルおよび細胞のみのウェルのｃＦＭＩ値を指した。血清ブロッキングレベルを、ＩＤ_５０で表した。

実験結果：図１２に示すように、シリアンゴールデンハムスターＦＨ００２Ｃ群の血清ブロッキング率は、Ａｌ００１群の血液ブロッキング率よりも高く、図１３に示すように、カニクイザルにおいて、２つのアジュバント群の血清ブロッキング率が同等であった。

実施例９：抗体親和性に対する、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントの効果
実施例６に記載する実験手順を採用して、アジュバントＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）を、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と混合して、筋内注射によってマウスおよびシリアンゴールデンハムスターを免疫化し、血清抗体親和性を検出した。シリアンゴールデンハムスターの免疫化手順は、実施例６と同じであるが、ＦＨ００２Ｃ群およびＡｌ００１群にはそれぞれ、１６匹の動物が含まれ、半分が雄で半分が雄であった。マウスの免疫化手順は下記の通りであった：
実験動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｌａｃｋ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）、６週～８週、４匹または５匹／群、雌。

実験群分け：（１）組換えＳタンパク質＋Ａｌ００１；（２）組換えＳタンパク質＋ＦＨ００２Ｃ。

マウスの免疫化プロトコル：動物１匹当たり抗原１μｇ、即ち、容積比１：１でアジュバントを組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と個々に混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、動物１匹当たり１５０μＬでＢａｌｂ／Ｃマウスに筋内注射した。免疫化の３回のショットを、０週目、２週目および４週目に実行し、０週目から６週目に、血清中の抗体親和性の検出用に、週に１回眼窩血液を収集した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、抗体親和性を検出し、これを下記の通りに詳細に説明した：
ＥＬＩＳＡで使用した試薬は、実施例４を参照した。

実験手順：
コーティングおよびブロッキング：精製した組換えＳタンパク質を、ＣＢ９．６で２μｇ／ｍＬに希釈して、続いてコーティングに使用して、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに添加し、配置して、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（即ち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、２０％ＮＢＳを含有するＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して、配置して、３７℃で２時間ブロッキングのためにインキュベートした。過剰な液体を除去した後、それを遠心乾燥した。

血清抗体親和性の検出：血清１００μＬを各ウェルに添加して、各試料に関して二重ウェル反復を実施して、３７℃で１時間インキュベーションを実施した。プレートをＰＢＳＴ緩衝液で１回洗浄した後、ＰＢＳ １００μＬを二重ウェル反復の一方のウェルに添加して、４Ｍ尿素（ＰＢＳ中で調製）１００μＬを他方のウェルに添加して、プレートを３７℃で２０分間静置し、続いて、ＰＢＳＴ緩衝液で４回洗浄した。次に、一定倍率で希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、ＳＡ００００１－１）またはヤギ抗シリアンハムスターＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ、ａｂ６８９２）を添加して、３７℃で０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した。発色用基質ミックス１００μＬを各ウェルに添加して、４５０ｎｍでの吸光度を、ＰＨＯＭＯマイクロプレートリーダーで読み取った。抗体アビディティを、抗体比、即ち、尿素処理群のＥＣ_５０対未処理群のＥＣ_５０の比で表すことができた。

実験結果：図１４および図１５に示すように、マウスモデルまたはシリアンゴールデンハムスターモデルにかかわらず、ＦＨ００２Ｃ群は、Ａｌ００１群よりも高比率の高親和性抗体を産生することができた。

実施例１０：マウスを組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントで免疫化することによる特異的抗体サブタイプの産生
調製したＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）をアジュバントとして使用し、容積比１：１で組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と混合して、ワクチンを形成し、続いてそれらをマウスに筋内注射した。免疫化手順は実施例９と同じであった。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、抗体サブタイプのレベルを検出し、これを下記の通りに詳細に説明した：
ＥＬＩＳＡで使用した試薬は、実施例４を参照した。

実験手順：
コーティングおよびブロッキング：精製した組換えＳタンパク質を、カーボネート緩衝液で２μｇ／ｍＬに希釈して、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに添加し、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（即ち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、２０％ＮＢＳを含有するＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して、３７℃で２時間ブロッキングのためにインキュベートした。過剰な液体を除去した後、それを遠心乾燥した。

血清抗体サブタイプレベルの検出：血清１００μＬを各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ１３２Ｐ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ１３３Ｐ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ２ｂ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＳＴＡＲ１３４Ｐ）１００μＬを添加して、３７℃で０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した。３倍希釈した発色用基質ミックス１００μＬを各ウェルに添加して、４５０ｎｍでの吸光度を、ＰＨＯＭＯマイクロプレートリーダーで読み取った。各プレートには、陰性対照として陰性血清の５つのウェルが含まれていた。

実験結果：図１６に示すように、アルミニウムアジュバント群と比較して、ＦＨ００２Ｃアジュバント群は、より高レベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂサブタイプ抗体を誘導することができ、ＩｇＧ１対ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの比は、アルミニウムアジュバント群の比よりも低く、それがＴｈ１免疫経路に対してある特定の刺激効果を有することを示した。

実施例１１：Ｔ細胞応答に対する、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と組み合わせたリセドロン酸亜鉛アルミニウムアジュバントの効果
調製したＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）をアジュバントとして使用し、容積比１：１で組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と混合して、ワクチンを形成し、続いてそれらをマウスに筋内注射して、誘導されたＴ細胞応答を測定した。具体的な方法は下記の通りであった：
実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６、６週～８週、８匹／群、雌。

実験群分け：（１）ブランク群；（２）組換えＳタンパク質＋Ａｌ００１；（３）組換えＳタンパク質＋ＦＨ００２Ｃ。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの免疫化プロトコル：動物１匹当たり抗原１０μｇ、即ち、容積比１：１でアジュバントを組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質と混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、動物１匹当たり１５０μＬで筋内注射した。免疫化の２回のショットを、０週目および３週目に実行し、Ｔ細胞免疫応答のアッセイのために４週目に屠殺した後、脾臓およびリンパ節を分離した。

酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を使用して、Ｔ細胞応答を検出した。

マウスの脾臓およびリンパ節を採取して、単一細胞懸濁液へと調製し、ウェル１つ当たり１０^６個の（脾臓）の細胞またはウェル１つ当たり４×１０^５個の（リンパ節）細胞でマウスＩＦＮ－γでコーティングしたＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＤＡＫＥＷＥＩ、２２１０００５）上に播種した。次に、それらを、ＰＢＳまたは１１個のアミノ酸重複を有する１５ユニットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓペプチドライブラリー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＲＰ３００２０）とともに２０時間、刺激および培養した。続いて、キットの説明書に従って、検出を実施した。画像の取り込みおよびスポットの計数は、ＣＴＬ－ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ５（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を使用して実施した。ＩＦＮ－γ分泌細胞の数は、スパイクペプチドライブラリーで刺激したウェルから、ＰＢＳで刺激したウェルを差し引くことによって算出した。

実験結果：図１７に示すように、ＦＨ００２Ｃ群およびＡｌ００１群におけるＩＦＮ－γを分泌する細胞の数は、それぞれ、脾臓では２８．９倍および５．８倍増し、リンパ節では１４．０倍および２．３倍増した。Ａｌ００１群と比較して、ＦＨ００２Ｃ群は、より高いレベルの誘導されたＴ細胞応答を示した。

実施例１２：水痘帯状疱疹ウイルスｇＥタンパク質（ＶＺＶ ｇＥ）と組み合わせたアルミニウムアジュバント（Ａｌ００１）およびＦＨ００２Ｃアジュバントによって誘導された特異的抗体結合力価
調製したＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）をアジュバントとして使用し、容積比１：１で水痘帯状疱疹ウイルスｇＥタンパク質（ＶＺＶ ｇＥ、配列番号２）と混合して、ワクチンを形成し、続いてそれらをＢａｌｂ／Ｃマウスに筋内注射し、産生された特異的抗体力価を検出した。ここで、ｇＥタンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）発現系（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗｅｉｄｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、ＥＣ１０６０）を使用した発現によって得られた。

具体的な方法は下記の通りであった：
実験動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス、６週齢～７週齢、各群において５匹、雌。

実験群分け：（１）ＶＺＶ ｇＥ＋Ａｌ００１；（２）ＶＺＶ ｇＥ＋ＦＨ００２Ｃ。
Ｂａｌｂ／Ｃマウスの免疫化プロトコル：マウス１匹当たり抗原５μｇ、即ち、容積比１：１でアジュバントを水痘帯状疱疹ウイルスｇＥタンパク質（ＶＺＶ ｇＥ）と混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、動物１匹当たり１００μＬでＢａｌｂ／Ｃマウスに筋内注射した。免疫化の２回ショットを、０週目、２週目、および４週目に実行し、０週目から４週目に、血清中の抗体力価の検出用に、週に１回眼窩血液を収集した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、抗体結合力価を検出し、これを下記の通りに詳細に説明した：
ＥＬＩＳＡで使用した試薬は、実施例４を参照した。

実験手順：
（１）コーティングおよびブロッキング：ＶＺＶ ｇＥを、ＰＢ７．４＋ＮａＣｌで１μｇ／ｍＬに希釈して、１００μＬ／ウェルで９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（即ち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、２０％ＮＢＳを含有するＰＢＳ ２００μＬを各ウェルに添加して、続いて、３７℃で２時間ブロッキングのためにインキュベートした。過剰な液体を除去した後、後の使用のためにそれを遠心乾燥した。

（２）血清の希釈：５０倍または１００倍希釈した血清１００μＬを各ウェルに添加して、２５℃で１時間インキュベートした。

（３）酵素標識抗体の添加：プレートをＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した後、酵素標識抗体（ＧＡＭ－ＨＲＰ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．：１７０６５１６）１００μＬを添加して、２５℃で１時間インキュベートした。

（４）発色、停止、および読み取り。
実験結果：図１８に示すように、免疫化の２回のショット後、ＦＨ００２Ｃアジュバント群の結合力価は、Ａｌ００１群の抗体力価よりも約１０倍、著しく高かった。

実施例１３：インフルエンザウイルスＨＡタンパク質と組み合わせたフロイントアジュバントおよびＦＨ００２Ｃアジュバントによって誘導された特異的抗体結合力価
市販のフロイントアジュバント（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨから購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｆ５８８１）、ＦＨ００２Ｃアジュバント（調製実施例１）を、容積比１：１で、脱グリコシル化酵素を用いてまたは用いずに処理したインフルエンザウイルスＨＡタンパク質（配列番号３）と混合して、ワクチンを形成し、続いてそれらをＢａｌｂ／Ｃマウスに皮下注射し、産生された特異的抗体力価を測定した。ここで、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入、１０３５９０１６）を使用した発現によって得られた。脱グリコシル化酵素は、ＮＥＢから購入し（Ｃａｔ．Ｎｏ．：Ｐ０７０５Ｓ）、脱グリコシル化酵素処理プロセスは、脱グリコシル化酵素の説明書に従って実行した。

具体的な方法は下記の通りであった：
実験動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｌａｃｋ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）、６週～７週、ＦＨ００２Ｃ群において１０匹／群、フロイントアジュバント群において１０匹／群。

実験群分け：（１）ＨＡ＋フロイントアジュバント；（２）ＨＡ＋ＦＨ００２Ｃ。
免疫化プロトコル：（１）動物１匹当たり抗原３０μｇ、即ち、容積比１：１でフロイントアジュバントをインフルエンザウイルスＨＡタンパク質と混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、動物１匹当たり３００μＬでＢａｌｂ／Ｃマウスに皮下注射した；（２）動物１匹当たり抗原３０μｇ、即ち、容積比１：１でＦＨ００２ＣをインフルエンザウイルスＨＡタンパク質と混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、動物１匹当たり２００μＬでＢａｌｂ／Ｃマウスに筋内注射した。免疫化の１４日後、血清中の抗体力価の検出用に、眼窩血液を収集した。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、抗体結合力価を検出し、これを下記の通りに詳細に説明した：
ＥＬＩＳＡで使用した試薬は、実施例４を参照した。

（１）コーティングおよびブロッキング：組換えＨＡタンパク質または超遠心分離したインフルエンザウイルスを、ＣＢ９．６で２μｇ／ｍＬに希釈するか、または１００μＬ／ウェルで９６ウェルマイクロタイタープレートに添加し、配置して、３７℃で２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（即ち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で１回洗浄し、市販のブロッキング溶液２００μＬを各ウェルに添加して、続いて、３７℃で２時間ブロッキングのためにインキュベートした。過剰な液体を除去した後、後の使用のためにそれを遠心乾燥した。

（２）血清の検出：種々の倍率で希釈した血清１００μＬを各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。

（３）酵素標識抗体の添加：プレートをＰＢＳＴ緩衝液で５回洗浄した後、５０００倍で希釈した酵素標識ヤギ抗マウス抗体ＧＡＭ－ＨＲＰ（研究室で自製）１００μＬを添加して、３７℃で０．５時間インキュベートした。

（４）発色、停止、および読み取り。
実験結果：図１９に示すように、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを１回のショットで免疫化した２週後、脱グリコシル化酵素を用いてまたは用いずに処理したインフルエンザウイルスＨＡタンパク質に関して、ＦＨ００２Ｃアジュバント群の抗体力価は全て、フロイントアジュバント群の抗体力価よりも高く、ＦＨ００２Ｃアジュバントは、迅速に効果を発揮する特性を有していた。

実施例１４：ロタウイルスＶＰ４タンパク質と組み合わせたアルミニウムアジュバント（Ａｌ００１）およびＦＨ００２Ｃアジュバントによって誘導された中和抗体力価
調製したＡｌ００１（調製実施例３）およびＦＨ００２Ｃ（調製実施例１）をアジュバントとして使用し、容積比１：１でロタウイルスＶＰ４タンパク質と混合して、ワクチンを形成し、続いて、産生された中和抗体力価を決定するために、それらをＢａｌｂ／Ｃマウスおよびモルモットに筋内注射した。ここで、ＶＰ４タンパク質は、大腸菌発現系（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｗｅｉｄｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、ＥＣ１０６０）によって発現された。

具体的な方法は下記の通りであった：
実験動物：Ｂａｌｂ／Ｃマウス、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｌａｃｋ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入、６週齢～８週齢；モルモット、４５０ｇ～５００ｇ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｏｎｇｌｉａｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｒｍから購入）。

マウス群：ＦＨ００２Ｃ群においてマウス５匹／群、Ａｌ００１群においてマウス５匹／群、動物は全て雌であった。

モルモット群：ＦＨ００２Ｃ群においてモルモット５匹／群、Ａｌ００１群においてモルモット５匹／群、動物は全て雌であった。

実験群分け：（１）ＶＰ４＋Ａｌ００１；（２）ＶＰ４＋ＦＨ００２Ｃ。
免疫化プロトコル：マウス免疫化に関して動物１匹当たり抗原１０μｇ、モルモット免疫化に関して動物１匹当たり抗原１０μｇ、即ち、容積比１：１でアジュバントをロタウイルスＶＰ４タンパク質と個々に混合することによって、ワクチンを形成し、続いて、マウスおよびモルモットの両方に関して動物１匹当たり２００μＬでマウスおよびモルモットに筋内注射した。免疫化の第１のショット前および免疫化の第３のショットの２週後に、中和抗体力価の検出用に、血液を収集し、血清を分離した。

酵素結合イムノスポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を使用して、中和抗体力価を検出し、これを下記の通りに詳細に説明した：
（１）９６ウェル細胞プレート上でのＭＡ１０４細胞の播種：細胞をトリプシン溶液で消化した後、１０％ＦＢＳを含有する細胞培養培地とともにピペットで採取することによって、細胞を懸濁させた後、細胞計数プレートを使用して、計数を実行し、２５，０００個の細胞／ｍＬへの希釈のために培養培地を添加し、続いて、それを１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに均一に添加して、ＣＯ_２濃度５％で３７℃にて２０時間インキュベートした。

（２）ウイルスの消化処理：２．５μｇ／μＬのトリプシン４μＬを、ロタウイルス溶液１ｍＬに添加して、十分に混合して、処理用に配置した；処理後、ウイルスを、１μｇ／ｍＬのトリプシンを含有する無血清ＤＭＥＭ培養培地で一定の力価に希釈した。

（３）血清補体の不活性化処理：血清試料１０μＬを採取して、１．５ｍＬのＥＰ管に入れた後、５６℃で３０分間加熱処理した。処理後、血清試料を、１μｇ／ｍｌのトリプシンを含有するＤＭＥＭで希釈し、検出に関して二重ウェル反復を実施した。

（４）血清－ウイルス反応：（２）のウイルス１００μＬを、（３）の血清１００μＬと混合して、中和反応を３７℃で１時間実施した。

（５）細胞培養培地の交換：（１）の細胞上清を除去して、（１）中のＭＡ１０４細胞を、１μｇ／ｍＬのトリプシンを含有する無血清ＤＭＥＭ培地で５分間すすぎ、洗浄を３回繰り返した。

（６）感染：最後のすすぎ後、すすぎ用培地を除去して、（４）の中和反応混合物を細胞に添加して、ＣＯ_２濃度５％で３７℃にて１４時間インキュベートした。

（７）細胞固定：（６）の細胞上清を、細胞損傷を回避するように穏やかに遠心乾燥し、続いて細胞を、１００μＬ／ウェルで０．１％グルタルアルデヒドを含有するＰＢＳ溶液で固定し、固定は、室温で１時間実施し、そこで、固定は、光を回避するように暗所条件下で実施されるべきであり、これにより、グルタルアルデヒドの光分解が固定作用に影響を及ぼすのを防止し得る。

（８）細胞透過性：（７）のグルタルアルデヒド固定化溶液を除去して、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有するＰＢＳ溶液１００μＬを添加して、室温で３０分間透過性処理を実施した。

（９）酸化：（８）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００透過性溶液を除去した後、ＰＢＳ溶液中の３％Ｈ_２Ｏ_２ １００μＬを添加して、室温で１５分間処理を実施した。

（１０）洗浄：酸化溶液を除去し、細胞をＰＢＳＴ洗浄溶液で５回、各５分ですすいだ。

（１１）酵素標識抗体反応：すすぎ溶液を遠心乾燥によって除去した後、ＨＲＰ標識ＶＰ６抗体（研究室で自製、モノクローナル抗体は、ＶＰ６を認識する抗体であり、ハイブリドーマ技術によって調製され、当該方法は、Ｌｉら Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．２０２０を参照した）を、希釈比１：５０００で、予め調製した酵素標識抗体反応溶液（酵素希釈剤、ＥＤ－１３）で希釈し、細胞に添加し、３７℃で１時間反応を実施した。

（１２）洗浄：酵素標識抗体反応溶液を除去し、細胞をＰＢＳＴ洗浄溶液で５回、各５分ですすいだ。

（１３）発色：すすぎ用溶液を遠心乾燥した後、その場で調製したＴＭＢ発色溶液を１００μＬ／ウェルで添加して、室温で１５分間、実験結果に影響を及ぼし得る光との発色用溶液の反応を回避するように暗所にて反応させた。

（１４）プレートの読み取り：発色溶液を遠心乾燥し、ＥＬＩＳＰＯＴプレートリーダーを使用して、上記の９６ウェルプレートを読み取り、計数した。

実験結果：図２０および図２１に示すように、マウスおよびモルモットはともに、免疫化の３回のショット後に中和抗体を産生することができ、ＦＨ００２Ｃ群における中和抗体力価は、Ａｌ００１群の中和抗体力価よりも高かった。それらの中でも、マウスにおいて、ＦＨ００２Ｃアジュバント群の血清中和力価は、Ａｌ００１アジュバント群の血清中和力価よりも約１６倍高かった（図２０）のに対して、モルモットにおいて、ＦＨ００２Ｃアジュバント群の血清中和力価は、Ａｌ００１群の血清中和力価よりも約４倍高かった（図２１）。

本発明の特定の実施形態を詳細に説明してきたが、公開された全ての教示に従って、詳細に対して様々な修正および変更を行うことができ、これらの変更は全て、本発明の保護範囲内にあることを、当業者には理解されよう。本発明の全範囲は、併記の特許請求の範囲およびその任意の等価物によって付与される。

Claims (9)

1. リセドロン酸亜鉛アルミニウムを含むアジュバントであって、前記アジュバントが、１：１～１６：１の範囲の（例えば、２：１～１６：１の範囲の）亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有し、１：１～５０：１の範囲の（例えば、５：１～５０：１の範囲の）亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、粒子の形態で存在し、好ましくは、前記粒子が、０．０１μｍ～１００μｍ、例えば、０．０１μｍ～６０μｍ、０．０１μｍ～５０μｍ、０．１μｍ～６０μｍ、０．１μｍ～３０μｍ、０．４μｍ～３０μｍ、０．４μｍ～２０μｍの粒子径を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、１：１～２：１、２：１～４：１、４：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１４：１、または１４：１～１６：１の範囲の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有し、好ましくは、前記アジュバントが、４：１または４．５：１の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、１：１～２：１、２：１～３：１、３：１～４：１、４：１～５：１、５：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１５：１、１５：１～２０：１、２０：１～３０：１、３０：１～４０：１、または４０：１～５０：１の範囲の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有し、好ましくは、前記アジュバントが、１０：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、２：１～８：１、例えば、２：１～４：１、４：１～６：１、または６：１～８：１の範囲の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比、および２：１～５０：１の範囲の（例えば、５：１～２０：１の範囲の）、例えば、２：１～３：１、３：１～４：１、４：１～５：１、５：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１５：１、または１５：１～２０：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、４：１の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比、および１０：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、４．５：１の亜鉛：リセドロン酸モル濃度比、および１０：１の亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、５．０～８．０、例えば、５．０～７．０、５．０～５．５、５．５～６．０、６．０～６．５、６．５～７．０、７．０～７．５、または７．５～８．０のｐＨを有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、３．０～８．０、例えば４．０～８．０、３．０～４．０、４．０～５．０、５．０～６．０、６．０～７．０、または７．０～８．０のゼロ電荷点を有し；
   好ましくは、前記アジュバントが、免疫原（例えば、タンパク質）に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の吸着率を有する、アジュバント。
2. 下記の工程：
   １）亜鉛イオンおよびアルミニウムイオンを含有する可溶性塩溶液を供給する工程と；
   ２）工程（１）の前記可溶性塩溶液を、アルカリ性リセドロン酸溶液と混合して、アジュバントを得る工程と
   を含む、請求項１に記載のアジュバントを調製する方法であって、
   好ましくは、前記方法が、工程（２）で得られる前記アジュバントを滅菌する工程をさらに含み、好ましくは、前記アジュバントが、フィルター滅菌または高温および高圧滅菌によって滅菌され、例えば、アジュバントが、１２１℃で少なくとも１５分（例えば、少なくとも３０分、例えば３０～６０分）間滅菌され；
   好ましくは、前記可溶性塩溶液が、１：１～５０：１の範囲の（例えば、５：１～５０：１の範囲の）亜鉛：アルミニウムモル濃度比を有し、好ましくは、前記亜鉛：アルミニウムモル濃度比が、１：１～２：１、２：１～３：１、３：１～４：１、４：１～５：１、５：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１５：１、１５：１～２０：１、２０：１～３０：１、３０：１～４０：１、または４０：１～５０：１の範囲であり；
   好ましくは、工程（２）において、前記可溶性塩溶液が、１：１～１６：１の範囲の（例えば、２：１～１６：１の範囲の）亜鉛：リセドロン酸モル濃度比の前記アルカリ性リセドロン酸溶液と混合され、好ましくは、前記亜鉛：リセドロン酸モル濃度比が、１：１～２：１、２：１～４：１、４：１～６：１、６：１～８：１、８：１～１０：１、１０：１～１２：１、１２：１～１４：１または１４：１～１６：１の範囲であり；
   好ましくは、工程（２）において、前記可溶性塩溶液が、亜鉛イオン、アルミニウムイオンおよびリセドロン酸が共沈されるような様式で前記アルカリ性リセドロン酸溶液と混合され；
   好ましくは、亜鉛イオン、アルミニウムイオンおよびリセドロン酸が、リセドロン酸亜鉛アルミニウム粒子を得るように共沈の様式で沈殿され；
   好ましくは、工程（２）において、前記アルカリ性リセドロン酸溶液が、亜鉛イオン、アルミニウムイオンおよびリセドロン酸が共沈されるように、前記可溶性塩溶液に滴下され；
   好ましくは、前記アルカリ性リセドロン酸溶液が、リセドロン酸および水酸化ナトリウムの溶液、リセドロン酸およびリン酸塩の溶液（例えば、リセドロン酸およびリン酸水素二ナトリウムの溶液、リセドロン酸およびリン酸二水素ナトリウムの溶液）、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択され；
   好ましくは、工程（１）における前記可溶性塩溶液が、例えば、硫酸塩溶液、塩素酸塩溶液、酢酸塩溶液、またはそれらの任意の組合せ、好ましくは塩素酸塩溶液または酢酸塩溶液からなる群から選択される、方法。
3. 免疫原および請求項１に記載のアジュバントを含む免疫原性組成物であって、
   好ましくは、前記免疫原が、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分からなる群から選択され；
   好ましくは、前記免疫原が、ウイルス、細菌、真菌などの病原体に由来し；
   好ましくは、前記免疫原が、タンパク質またはその免疫原性断片であり、好ましくは、前記免疫原が、ウイルス、細菌、真菌などの病原体に由来するタンパク質またはその免疫原性断片であり、好ましくは、前記ウイルスが、呼吸器系ウイルス（例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ライノウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、エンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１ウイルス、ロタウイルス）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）からなる群から選択され、好ましくは、前記免疫原が、コロナウイルスタンパク質またはその免疫原性断片、例えばコロナウイルススパイクタンパク質またはその免疫原性断片であり；
   好ましくは、前記コロナウイルスが、オルトコロナウイルス亜科αウイルス（例えば、２２９ＥおよびＮＬ６３）、オルトコロナウイルス亜科βウイルス（例えば、ＯＣ４３およびＨＫＵ１）、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択され、好ましくは、前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からなる群から選択され、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり；
   好ましくは、前記免疫原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質またはその免疫原性断片、水痘帯状疱疹ウイルスｇＥタンパク質またはその免疫原性断片、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質またはその免疫原性断片、あるいはロタウイルスＶＰ４タンパク質またはその免疫原性断片であり；
   好ましくは、前記免疫原性組成物が、薬学的に許容可能な補助材料、例えば賦形剤、防腐剤、抗菌剤、緩衝液および／またはさらなる免疫アジュバントをさらに含み、好ましくは、前記さらなる免疫アジュバントが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・プミルス、リポ多糖、サイトカイン、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択され；
   好ましくは、前記免疫原性組成物が、第２の免疫原をさらに含み、好ましくは、前記第２の免疫原が、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分を含むが、これらに限定されず；
   好ましくは、前記免疫原性組成物がワクチンである、免疫原性組成物。
4. 免疫原性組成物を調製するための、または免疫原を送達するための担体としての、または免疫原用の免疫促進物質としての、または免疫原の免疫原性を増強するための、または対象における免疫原に対する免疫応答を増強するための、または対象における免疫原に対する免疫応答を増強するための製剤を調製するための、請求項１に記載のアジュバントの使用であって、
   好ましくは、前記免疫原が、請求項３で定義される通りであり；
   好ましくは、前記免疫応答が、細胞性免疫応答および／または液性免疫応答であり、好ましくは、前記細胞性免疫応答が、Ｔ細胞免疫応答であり、好ましくは、前記Ｔ細胞免疫応答が、Ｔｈ１免疫応答および／またはＴｈ２免疫応答である、使用。
5. 請求項１に記載のアジュバントを、免疫原と混合する工程を含む、免疫原性組成物を調製する方法であって、
   好ましくは、前記免疫原が、請求項３で定義される通りであり；
   好ましくは、前記方法が、薬学的に許容可能な補助材料を添加する工程をさらに含み；
   好ましくは、前記補助材料が、例えば、賦形剤、防腐剤、抗菌剤、緩衝液および／またはさらなる免疫アジュバントであり、好ましくは、前記さらなる免疫アジュバントは、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントおよび不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・プミルス、リポ多糖、サイトカイン、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択され；
   好ましくは、前記方法が、第２の免疫原を添加する工程をさらに含み、好ましくは、前記第２の免疫原が、タンパク質、核酸、多糖、またはそれらの免疫原性部分を含むが、これらに限定されず；
   好ましくは、前記免疫原性組成物がワクチンである、方法。
6. 対象における疾患の防止および／または治療のための薬剤の製造における請求項３に記載の免疫原性組成物の使用であって、前記疾患が、免疫原によって誘導される免疫応答によって防止または治療され得る疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来し、前記疾患が、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染またはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）またはその免疫原性断片であり、前記疾患が、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染またはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質（例えば、Ｓタンパク質）またはその免疫原性断片であり、前記疾患が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染関連疾患（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９））であり；
   好ましくは、前記免疫原が、水痘帯状疱疹ウイルスに由来し、前記疾患が、水痘帯状疱疹ウイルス感染または水痘帯状疱疹ウイルス感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、水痘帯状疱疹ウイルスのタンパク質（例えば、ｇＥタンパク質）またはその免疫原性断片であり、前記疾患が、水痘帯状疱疹ウイルス感染または水痘帯状疱疹ウイルス感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、インフルエンザウイルスに由来し、前記疾患が、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、インフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＨＡタンパク質）またはその免疫原性断片であり、前記疾患が、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、ロタウイルスに由来し、前記疾患が、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記免疫原が、ロタウイルスタンパク質（例えば、ＶＰ４タンパク質）またはその免疫原性断片であり、前記疾患が、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染関連疾患であり；
   好ましくは、前記対象が、動物、例えば鳥類または哺乳類であり；
   好ましくは、前記対象が、齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、霊長類または鳥類であり；
   好ましくは、前記対象が、マウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスターまたはカニクイザルであり；
   好ましくは、前記対象がヒトである、使用。
7. 免疫原の免疫原性を改善する方法であって、前記免疫原を、請求項１に記載のアジュバントと混合する工程を含み、好ましくは、前記免疫原が、請求項３で定義される通りである、方法。
8. 対象における免疫原に対する免疫応答を刺激または増強する方法であって、前記対象に、有効量の前記免疫原および請求項１に記載のアジュバントを含有する免疫原性組成物を投与する工程を含み；
   好ましくは、前記免疫原が、請求項３で定義される通りであり；
   好ましくは、前記対象が、動物、例えば鳥類または哺乳類であり、好ましくは、前記対象が、齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、霊長類または鳥類であり、好ましくは、前記対象が、マウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスターまたはカニクイザルであり、好ましくは、前記対象がヒトであり；
   好ましくは、前記免疫応答が、細胞性免疫応答および／または液性免疫応答であり、好ましくは、前記細胞性免疫応答が、Ｔ細胞免疫応答であり、好ましくは、前記Ｔ細胞免疫応答が、Ｔｈ１免疫応答および／またはＴｈ２免疫応答であり；
   好ましくは、前記免疫原性組成物が、筋内注射、皮下注射、皮内投与、鼻腔内投与、経口投与、経皮または静脈内注射から選択される経路によって投与され；
   好ましくは、前記免疫原性組成物が、筋内注射によって投与される、方法。
9. 対象に、有効量の請求項３に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、疾患を防止または治療する方法であって、前記疾患が、前記免疫原によって誘導される免疫応答によって防止または治療されることが可能な疾患であり；
   好ましくは、前記疾患が、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染またはコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染関連疾患であり、前記免疫原が、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に由来し、例えば、前記免疫原が、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のタンパク質（例えば、スパイクタンパク質）またはその免疫原性断片であり；
   好ましくは、前記疾患が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染関連疾患、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる肺炎（ＣＯＶＩＤ－１９）であり、前記免疫原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来し、例えば、前記免疫原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２構造タンパク質（例えば、Ｓタンパク質）またはその免疫原性断片であり；
   好ましくは、前記疾患が、水痘帯状疱疹ウイルス感染または水痘帯状疱疹ウイルス感染関連疾患であり、前記免疫原が、水痘帯状疱疹ウイルスに由来し、例えば、前記免疫原が、水痘帯状疱疹ウイルスタンパク質（例えば、ｇＥタンパク質）またはその免疫原性断片であり；
   好ましくは、前記疾患が、インフルエンザウイルス感染またはインフルエンザウイルス感染関連疾患であり、前記免疫原が、インフルエンザウイルスに由来し、例えば、前記免疫原が、インフルエンザウイルスタンパク質（例えば、ＨＡタンパク質）またはその免疫原性断片であり；
   好ましくは、前記疾患が、ロタウイルス感染またはロタウイルス感染関連疾患であり、前記免疫原が、ロタウイルスに由来し、例えば、前記免疫原が、ロタウイルスタンパク質（例えば、ＶＰ４タンパク質）またはその免疫原性断片であり；
   好ましくは、前記対象が、動物、例えば鳥類または哺乳類であり、好ましくは、前記対象が、齧歯類、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、霊長類または鳥類であり、好ましくは、前記対象が、マウス、ミンク、モルモット、シリアンゴールデンハムスターまたはカニクイザルであり、好ましくは、前記対象がヒトである、方法。
   

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