JP2023549706A - 腎線維症の治療標的としてのＮｋｄ２ - Google Patents

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Abstract

本願発明は、慢性腎臓病、特に進行性慢性腎臓病および腎線維症の発症におけるネイキッドキューティクルホモログ２（Ｎｋｄ２）遺伝子由来タンパク質の役割の解明に関する。本発明は、特に、Ｎｋｄ２タンパク質に結合する化合物を同定する方法、およびＮｋｄ２相互作用化合物のスクリーニングおよび同定のためのＮｋｄ２の使用に関する。本発明は、さらに、腎臓病の治療に使用するための医薬組成物、特に、ＮＫＤ２タンパク質に結合および／または阻害する薬剤を含む医薬組成物に関する。（図１ａ）

Description

本発明は、慢性腎臓病、特に進行性慢性腎臓病および腎線維症の発症におけるネイキッドキューティクルホモログ２（Ｎｋｄ２：ｎａｋｅｄ ｃｕｔｉｃｌｅ ｈｏｍｏｌｏｇ ２）タンパク質の役割に関する。本発明は、特に、Ｎｋｄ２タンパク質に結合する化合物を同定する方法、およびＮｋｄ２相互作用化合物のスクリーニングおよび同定のためのＮｋｄ２の使用に関する。本発明は、さらに、腎臓病の治療に使用するための医薬組成物、特に、Ｎｋｄ２タンパク質に結合および／または阻害する薬剤を含む医薬組成物に関する。
慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、世界人口の１０％以上が罹患しており、その有病率は増加傾向にある。最初の傷害の種類とは無関係に、腎臓傷害の最終的な共通経路は腎線維症である。腎臓の線維化は慢性腎臓病の進行の特徴であるが、現在、抗線維化療法は存在しない。 腎臓線維化の程度は、腎臓の機能低下やＣＫＤの臨床転帰と密接に関連しており、腎線維症はＣＫＤの重要な治療標的と考えられている。腎線維症の治療法として承認された治療薬は存在しない。これは、ヒト腎臓における瘢痕形成細胞の細胞起源、機能的不均一性、および制御が不明なままであり、この分野における主要な議論の種となり続けていることが大きな理由である （Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ２０１４； Ｆａｌｋｅ ｅｔ ａｌ．２０１５）。治療法は、継続的な腎代替療法（透析）と腎臓移植しかない。この２つの選択肢は、患者にとって大きな不便を伴うとともに、国の医療制度にとっても大きな経済的負担となる。そのため、新規の治療アプローチが強く望まれている。
腎線維症は、細胞外マトリックスの過剰な沈着によって定義され、機能的な柔組織を破壊して置き換えることで、臓器不全に至らせる。腎臓の組織構造は大きく３つの区画に分けられ、そのすべてが線維化の影響を受ける可能性があり、具体的には糸球体では糸球体硬化症、尿細管間質では間質性線維症、血管系では動脈硬化と血管周囲線維症と呼ばれる（Ｄｊｕｄｊａｉ ａｎｄ Ｂｏｏｒ ２０１９）。
腎線維症は、コラーゲン－１のような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の高発現、分泌、蓄積を特徴とする。筋線維芽細胞は、腎線維症におけるＥＣＭの主要な供給源であり、その細胞起源については議論が続いている（Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ２０１４； Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０１３； Ｋｒｉｚ ｅｔ ａｌ ２０１１； Ｋｒａｍａｎｎ ａｎｄ ＤｉＲｏｃｃｏ ２０１３）。単一細胞ＲＮＡ配列決定とマッピングにより、複雑な組織や疾患プロセスの細胞不均一性を解剖し、疾患を媒介する細胞集団やメカニズムに関する新規の洞察を生み出すことができる（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ ２０１９； Ｄｏｂｉｅ ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ２０１９）。過去に、マウスにおける遺伝的運命追跡データは、ヒト組織における様々な染色アプローチによって拡張され、上皮、内皮、循環造血細胞だけでなく、常在間葉系細胞などの幅広い異なるタイプの細胞が線維化に関与することを示唆していた（Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ２０１４； Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ ２０１３； Ｋｒａｍａｎｎ ａｎｄ ＤｉＲｏｃｃｏ ２０１３）。
したがって、本発明の根底にある問題は、慢性腎臓病の治療に使用するための薬剤、化合物および組成物、ならびに前記薬剤、化合物および組成物を特定するための方法および手段を提供することである。
本発明は、慢性腎臓病の治療に使用するための薬剤、化合物および組成物を同定するための方法および手段、特に、進行性慢性腎臓病および腎線維症の治療に使用するための非常に有効な薬剤、化合物および組成物を同定するための方法を提供する。
本明細書に開示されているように、本発明者らは、腎臓の線維化に関与する終末分化した筋線維芽細胞ではネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質が生成されるが、周皮細胞や線維芽細胞のマーカータンパク質や少量の細胞外マトリックスタンパク質のみを発現している細胞では生成されないことを見出した。さらに、Ｎｋｄ２発現細胞は、線維化促進シグナル伝達経路の活性が上昇していることが判明した。さらに本発明者らは、Ｎｋｄ２遺伝子の欠失またはＮｋｄ２発現のノックダウンにより線維化の抑制が達成できることを見出し、当該遺伝子が細胞外マトリックスの生成および線維化に関連することを明らかにした。そこで、本発明者らは、Ｎｋｄ２を新たな標的として同定し、低分子薬剤（Ｓｍｏｌｓ）、ペプチドまたは生物学的製剤を用いて、Ｎｋｄ２遺伝子発現および／またはＮＫＤ２タンパク質活性を阻害する治療薬を開発するための新しい治療アプローチを初めて見出した。
そこで、先行技術に鑑み、本発明は、所定の細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の発現及び／又は分泌を低減する方法を提供することを一つの目的とする。
本発明は、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質、またはその断片に結合および／または阻害する薬剤を同定する方法を提供することを、さらに一つの目的とした。
本発明のさらなる目的の一つは、ＮＫＤ２またはその断片に結合する薬剤の同定に、ネイキッドキューティクルホモログ２またはその断片、あるいはネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質またはその断片をコードする核酸を用いる方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、上記の知見に基づき、慢性腎臓病の治療に使用するための薬剤、特に進行性の慢性腎臓病および／または腎線維症の治療に使用するための薬剤を提供することであった。
本発明は、上記の知見に基づき、前記薬剤を含有する医薬組成物、及びその製造方法を提供することを更なる目的の一つとした。
これらおよび他の目的は、本発明の独立した請求項に記載の方法および手段によって達成される。従属請求項は、具体的な実施形態に関連する。
本発明及びその特徴の一般的な利点を以下に詳細に説明する。
ａ．ネフロン構造と異なるニッチに存在する細胞タイプの模式図。ｂ．１５のヒト腎臓から採取した５１，８４９個のＭＭＥ－（ＣＤ１０－）単一細胞トランスクリプトームのＵＭＡＰ埋め込み。色は、上皮（ｎ＝９，２８０）、内皮（ｎ＝２９，８１４）、免疫（ｎ＝９，６１６）、間葉系（ｎ＝３，１１５）、神経（シュワン細胞、ｎ＝２４）の５種類の主要な細胞タイプを示している。略語については、１ｄを参照。ｃ．単一細胞のクラスタリング結果の相関ネットワーク。ノードは細胞クラスターを表す。エッジ（線のつながり）は、クラスター間の相関を表す。ネットワークレイアウトは、ｇｇｒａｐｈ Ｒパッケージ（https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/index. html）に実装されたｆｏｒｃｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌａｙｏｕｔを用いて決定した。ｄ．各細胞タイプ／状態クラスターにおける上位１０の特定遺伝子の発現をスケールしたもの。クラスターごとの遺伝子ランキングは、ｇｅｎｅｓｏｒｔｅＲを用いて求めた。細胞クラスターのラベルは、細胞タイプ／状態を２９の基準となる細胞タイプのグループ分けを指す （Ｂ細胞（Ｂ）：ｎ＝３，１０１、Ｔ細胞（Ｔ）：ｎ＝４８４、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）：ｎ＝７４０、血漿細胞（Ｐ）：ｎ＝１６７、マスト細胞（Ｍａｓｔ）：ｎ＝１４２、樹状細胞（ＤＣ）：ｎ＝８４１、単球（Ｍｏｎｏ）：ｎ＝１，１１１、マクロファージ１（Ｍａｃ１）：ｎ＝１，４７６、マクロファージ２（Ｍａｃ２）：ｎ＝６１５、マクロファージ３（Ｍａｃ３）：ｎ＝９３９、動脈管内皮（Ａｒｔ１）：ｎ＝９０１、糸球体毛細血管（ＧＣ）：ｎ＝４３７７、静脈内皮（Ｖｅｎ）：ｎ＝２７２４、リンパ内皮（ｌＥｎ）：ｎ＝５０９、直腸管１（ＶＲ１）：ｎ＝５３５５、直腸管２（ＶＲ２）：ｎ＝２，０２３、直腸管３（ＶＲ３）：ｎ＝３，０５１、直腸管４（ＶＲ４）：ｎ＝７２６、直腸管５（ＶＲ５）：ｎ＝３，２７１、直腸管６（ＶＲ６）：ｎ＝４，３７８、損傷した内皮細胞（ｉＥｎ）：ｎ＝２，４９９、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）：ｎ＝４２６、周皮細胞１（Ｐｅ１）：ｎ＝４５５、周皮細胞２（Ｐｅ２）：ｎ＝１８８、線維芽細胞１（Ｆｉｂ１）：ｎ＝７６１、線維芽細胞２（Ｆｉｂ２）：ｎ＝２０８、線維芽細胞３（Ｆｉｂ３）：ｎ＝２４６、 筋線維芽細胞１ａ（ＭＦ１ａ）：ｎ＝５２５、筋線維芽細胞１ｂ（ＭＦ１ｂ）：ｎ＝３０６、近位尿細管（ＰＴ）：ｎ＝９１７、損傷近位尿細管（ｉＰＴ）：ｎ＝９０９、下行細脚（ＤＴＬ）：ｎ＝８０６、連結管（ＣＮＴ）：ｎ＝６６２、黄斑変性細胞（Ｍｄｃ）：ｎ＝８６９、太い上行脚２（ＴＡＬ２）：ｎ＝６９２、太い上行脚３（ＴＡＬ３）：ｎ＝３１５。太い上行脚４（ＴＡＬ４）：ｎ＝３９０、間在細胞３（ＩＣ３）：ｎ＝６２、間在細胞４（ＩＣ４）：ｎ＝７８、間在細胞５（ＩＣ５）：ｎ＝３３、間在細胞６（ＩＣ６）：ｎ＝３９、間在細胞７（ＩＣ７）ｎ＝４０、間在細胞９（ＩＣ９）：ｎ＝７２、間在細胞Ａ（ＩＣ－Ａ）：ｎ＝７５４、間在細胞Ｂ（ＩＣ－Ｂ）：ｎ＝３１６、尿路上皮細胞（Ｕｒｅ）：ｎ＝２４６、ポドサイト（Ｐｏｄ）：ｎ＝４４、シュワン細胞：ｎ＝２４）。細胞クラスターは列、遺伝子は行に示す。各列は、クラスター内の全細胞の平均発現量である。図１ｄ＿１には、過剰発現している遺伝子の発現が描かれている。図１ｄ＿２には、発現量が少ない／発現している遺伝子の発現が描かれている。ｅ．患者の臨床パラメータ（ＣＫＤ＝慢性腎臓病、ｅＧＦＲ＝推算糸球体濾過量）に応じた単一細胞の層別化。ｆ．患者の臨床パラメータに応じて層別化した３１，８７５のＣＤ１０＋（ＣＤ１０＋）単一細胞のトランスクリプトームのＵＭＡＰ埋め込み。ｇ．健常な上皮細胞とＣＫＤ上皮細胞における細胞周期ステージ割り当て頻度のランダムモデルに対するｌｏｇ倍率変化。正の数値はエンリッチメント、負の数値はディプリーションを表す。ｈ．ＣＤ１０＋細胞のＫＥＧＧ経路のエンリッチメント。ｉ．慢性腎臓病患者の細胞は、ＥＣＭを高発現する細胞（ＥＣＭ＝細胞外マトリックス、ＣＤ１０－細胞）に富む。ＣＤ１０－細胞における主要な細胞タイプと健常／ＣＫＤによって階層化された細胞のＥＣＭスコアのバイオリンプロット。ｅＧＦＲカテゴリーにおける差のＰ値：間葉系（ｐ＜０．００１）、免疫（ｐ＜０．００１）、上皮（ｐ＜０．００１）、内皮（ｐ＜０．００１）。ｋ．間葉系と判定された細胞のＥＣＭスコアのバイオリンプロット（主要な細胞タイプ別、健常者／ＣＫＤ別に層別化）。ｅＧＦＲカテゴリーにおける差のＰ値：Ｆｉｂ１（０．０００１）、Ｆｉｂ２（ｎ．ｓ．）、Ｆｉｂ３（ｎ．ｓ．）、ＭＦ１ａ（ｎ．ｓ．）、ＭＦ１ｂ（ｎ．ｓ．）、Ｐｅ１（ｎ．ｓ．）、Ｐｅ２（ｎ．ｓ．）、ＳＭＣ（ｎ．ｓ．）。ｌ．間葉系細胞の種類と臨床パラメータごとの細胞数。ｍ．１３のヒト腎臓の線維芽細胞／周皮細胞／筋線維芽細胞のＵＭＡＰ埋め込み（ｎ＝２，６８９）。異なる細胞タイプは破線で区切られている。連続線は、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔで予測される系統樹を指す。ｎ．図ｂのＵＭＡＰに示した選択した遺伝子の発現を示す。ｏ．周皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞の拡散マップ埋め込みと、同埋め込み上のＣｏｌ１ａ１の発現を示したもの。 ａ．８つのヒト腎臓から採取した３７，８００個のＰＤＧＦＲｂ＋単一細胞トランスクリプトームのＵＭＡＰ埋め込み。上皮細胞（ｎ＝４６１）、内皮細胞（ｎ＝２，３４１）、免疫細胞（ｎ＝２０，８３８）、間葉系細胞（ｎ＝２５，３８５）の４種類の主要な細胞を破線で区切っている。細胞タイプ／状態は、単一細胞トランスクリプトームの教師なしクラスタリングにより同定した（「方法」参照）：線維芽細胞１（Ｆｉｂ１）、線維芽細胞２（Ｆｉｂ２）、線維芽細胞３（Ｆｉｂ３）、周皮細胞（Ｐｅ）、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣｓ）、メサンギウム細胞（Ｍｅｓａ）、筋線維芽細胞１（ＭＦ１）、筋線維芽細胞２（ＭＦ２）、筋線維芽細胞３（ＭＦ３）、メサンギウム細胞（ＭＥＳＡ）、マクロファージ１（ＭＣ１）、マクロファージ２（ＭＣ２）、樹状細胞（ＤＣ）、動脈管内皮細胞（Ａｒｔ）、糸球体内皮細胞（ＧＣ）、直腸管（ＶＲ）、損傷内皮（ｉＥｎ）、近位尿細管（ＰＴ）、損傷近位尿細管（ｉＰＴ）、層間細胞（ＩＣ）、収集管主細胞（ＰＣ）、太い上行脚（ＴＡＬ） ｂ．患者の臨床パラメータ（ＣＫＤ＝慢性腎臓病、ｅＧＦＲ＝推算糸球体濾過量）による単一細胞の層別化。ｃ．図ａからＵＭＡＰで示した選択した遺伝子の発現量。ｄ．各細胞タイプ／状態クラスターにおける上位１０遺伝子のスケールされた遺伝子発現。細胞クラスターごとの遺伝子ランキングはｇｅｎｅｓｏｒｔｅＲで決定した。細胞クラスターのラベルは、ａとｂでハイライトした細胞クラスターを指す。細胞は列（各１００細胞／列）、遺伝子は行。図２ｄ＿１では、過剰発現している遺伝子の発現が描かれている。図２ｄ＿２では、発現量が少ない／発現している遺伝子の発現が描かれている。ｅ．ＰＤＧＦＲｂ＋線維芽細胞／筋線維芽細胞／周皮細胞（ｎ＝２３，８８３）の拡散マップ埋め込みと同埋め込み上での選択遺伝子の発現。線はＳｌｉｎｇｓｈｏｔで予測された３つの系統（系統Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に対応する。ｆ．ｎ＝３５のヒト腎臓におけるＭｅｇ３、Ｎｏｔｃｈ３、ＰｏｓｔｎのマルチプレックスＲＮＡ－ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの代表画像。スケールバー左１０μｍ、右２５μｍ。上から順に：Ｍｅｇ３、Ｎｏｔｃｈ、Ｐｏｓｔｎ、Ｄａｐｉ／Ｐｏｓｔｎの検出のみ／Ｐｏｓｔｎ ＋Ｎｏｔｃｈ－３／Ｐｏｓｔｎ＋Ｍｅｇ３／Ｐｏｓｔｌｎ＋ＤＡＰＩのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの画像。Ｍｅｇ３／Ｎｏｔｃｈ３二重陽性細胞の定量化。ｇ．左上：系統１（周皮細胞から筋線維芽細胞、ｅ参照）の擬似時間軸に沿った過剰発現の遺伝子発現ダイナミクス。細胞（列）は擬似時間軸に沿って並べられ、擬似時間と相関のある遺伝子（行）は選択され、擬似時間に沿ってプロットされた（方法参照）。各１０個の細胞を１列で平均化した。遺伝子は、擬似時間発現パターンを示す７つのグループに分類された。選択された例示遺伝子が示されている。左下：左上に準じた画像であるが、低レベルでの過小発現／発現が描かれている。右上：擬似時間に沿った細胞周期ステージを、擬似時間に沿った各２０００個の細胞に対する割合で示す。右下：ＰＩＤシグナル経路のエンリッチメント解析を疑似時間に沿って行った。 ａ．偽手術と比較したＵＵＯ（片側尿管閉塞）マウス腎臓モデルにおけるＰＤＧＦＲｂＣｒｅＥＲ－ｔｄＴｏｍａｔｏのフェイトトレーシング実験デザイン（上）と可視化（下）。上：ＰＤＧＦＲｂ－ｔｄｔｏｍとＤＡＰＩの検出；中：ＰＤＧＦＲｂ－ｔｄｔｏｍの検出；下：ＤＡＰＩの検出。ｂ．ＵＵＯ手術後のＰＤＧＦＲｂＣｒｅＥＲ；ｔｄＴｏｍａｔｏ腎臓におけるＣｏｌ１ａ１ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの代表画像。上から下へ：ＰＤＧＦＲｂ－ｔｄｔｏｍ＋Ｃｏｌ１＋ＤＡＰＩの検出／Ｃｏｌ１の検出／ＰＤＧＦＲｂ－ｔｄｔｏｍ＋Ｃｏｌ１の検出／Ｃｏｌ１＋ＤＡＰＩの検出。ｃ．ＵＵＯ手術後１０日目のｔｄＴｏｍａｔｏを共発現するＣｏｌ１ａ１－ｍＲＮＡ発現細胞の割合（ｎ＝３）。ｄ．タイムコースのＵＵＯ実験デザイン。ＰＤＧＲｂ－ｅＧＦＰマウスでＵＵＯを行い、ＵＵＯ誘導後０、２、１０日目にマウス腎臓からｅＧＦＰ陽性単一細胞を分離し、Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ ｖ２を用いてアッセイした。ｅ．ｄのタイムコースＵＵＯ実験で採取した細胞のＵＭＡＰ埋め込み。教師なしクラスタリングにより細胞タイプを特定した（「方法」参照） （頭頂上皮細胞（ＰＥＣ）：ｎ＝６８、マトリックス産生細胞（ＭＰ）：ｎ＝７６、損傷平滑筋細胞１（ｉＳＭＣｓ１）：ｎ＝１１２、損傷平滑筋細胞２（ｉＳＭＣｓ２）：ｎ＝７７、損傷平滑筋細胞３（ｉＳＭＣｓ３）：ｎ＝７６、メサンギウム細胞（Ｍｅｓａ）：ｎ＝７４、周皮細胞１（Ｐｅ１）：ｎ＝１１３、レニン産生平滑筋細胞（ｒＳＭＣ）：ｎ＝１０１、平滑筋細胞１（ＳＭＣ１）：ｎ＝１７２、周皮細胞２（Ｐｅ２）：ｎ＝８３）。ｆ．タイムポイントごとに各細胞タイプに発生する細胞の割合。各列の合計が１００になる。ｇ．１０個の細胞クラスターすべてにおける選択した遺伝子の発現量。ｈ．ｅから選択した遺伝子のＵＭＡＰ埋め込み上での発現。ｉ．ＰＤＧＦＲｂＣｒｅＥＲ；ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞のサブセットにおけるＰｄｇｆｒａの発現を示す、偽手術マウスおよびＵＵＯ（１０日目）マウスの腎臓の免疫蛍光（ＩＦ）染色（矢印）。左から順に：ＰＤＧＦＲｂＣｒｅＥＲｔｄＴｏｍａｔｏ＋ＰＤＧＦＲａ＋ＤＡＰＩの検出／ＰＤＧＦＲｂＣｒｅＥＲｔｄＴｏｍａｔｏの検出／ＰＤＧＦＲａの検出／ＤＡＰＩの検出。ｊ．ＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂ二重陽性細胞におけるＣｏｌ１ａ１発現の共局在を示すＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。Ｃｏｌ１ａ１／ＰＤＦＧＲａ／ＰＤＦＲｂ三重陽性細胞（矢印）は、腎臓の間質のみに存在する。上から下へ：ＰＤＧＦＲａ＋Ｃｏｌ１ａ１＋ＰＤＧＦＲｂ＋ＤＡＰＩの検出／ＰＤＧＦＲ－ａの検出／ＰＤＧＦＲａ＋Ｃｏｌ１ａ１の検出／ＰＤＧＦＲａ＋ＰＤＧＦＲｂの検出／ＰＤＧＦＲａ＋ＤＡＰＩの検出。ｋ．左：ＰＤＧＦＲａおよびＰＤＧＦＲｂの発現量に応じて層別化したＣＤ１０陰性細胞（図１ｂ－ｃ）におけるＣｏｌ１ａ１発現量とＥＣＭスコア。右：上記のように層別化した、同一データセットにおけるＣｏｌ１ａ１陽性細胞および陰性細胞のパーセンテージ。Ｃｏｌ１ａ１陰性細胞はＰＤＧＦＲａ／ｂ二重陰性細胞で検出され、Ｃｏｌ１ａ１陽性細胞はＰＤＧＦＲａ／ｂ二重陽性細胞で優位に生じる。グループ比較：（他の遺伝子）対（ａ／ｂ）：ｐ＜０．００１、（ａ－）対（ａ／ｂ）：ｐ＜０．００１、（ｂ）対（ａ／ｂ）：ｐ＜０．００１、（他の遺伝子）対（ａ）：ｐ＜０．００１、（ａ）対（ｂ）：ｐ＜０．００１、（他の遺伝子）対（ｂ）：ｐ＜０．００１．ウィルコクソン順位和検定に基づくボンフェローニ補正ｐ値。 ｌ．６２人の患者のＩＦ／ＴＡスコアの分布と、６２の腎臓のＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、Ｃｏｌ１ａ１プローブと核カウンターステイン（ＤＡＰＩ）を用いた多重ＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで染色したトリクロム染色ヒト腎臓組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の代表画像（左）、同じデータセットのＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂ検出値で層別化したｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションデータにおける平均スケールＣｏｌ１ａ１発現量（中段）、上記のように層別化した、同一データセットにおけるＣｏｌ１ａ１陽性細胞および陰性細胞のパーセンテージ（右）。グループ比較：（ａ／ｂ）対（ｃｏｌ１α１）：ｐ＜０．００１、（ａ／ｂ）対（ｂ）：ｐ＜０．００１、（ａ／－）対（ａ）：ｐ＜０．００１。ウィルコクソン順位和検定に基づくボンフェローニ補正ｐ値。スケールバー：ａは１０００μｍ、ｂは１０μｍ、ｉ＋ｊは５０μｍ、ｋは１０μｍ。上から順にＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション：Ｃｏｌ１ａ１＋ＰＤＧＦＲａ＋ＰＤＧＦＲｂ＋ＤＡＰＩの検出／ Ｃｏｌ１ａ１の検出／Ｃｏｌ１＋ＰＤＧＦＲａの検出／Ｃｏｌ１ａ１＋ＰＤＧＦＲｂの検出／ｃｏｌ１＋ＤＡＰＩの検出。 ａ．ＵＵＯ実験のスキーム。ＰＤＧＲｂ－ｅＧＦＰマウスでＵＵＯを実施した。 ｅＧＦＰ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋の単一細胞をマウス腎臓から分離し、ＵＵＯ後０日目と１０日目に１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄｒｏｐ－ｓｅｑを用いてアッセイした（各ｎ＝５）。ｂ．ＵＵＯ手術後１０日目のＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、ＰＤＧＦＲａ／ｂ発現細胞のフローサイトメトリー定量化を偽手術と比較した。＊ｐ＜０．０５； ＊＊ｐ＜０．０１ 一元配置分散分析検定およびポストホック・ボンフェローニ補正により算出。ｃ．左：ＵＵＯ実験で分離した細胞のＵＭＡＰ埋め込み（ａで示した）。（ｎ＝７，２４５）４つの主要な細胞クラスター（上皮細胞（ｎ＝２２３）、内皮細胞（ｎ＝３７０）、免疫細胞（ｎ＝１９９）、間葉系細胞（ｎ＝６，６３３））を特定することができた。単一細胞トランスクリプトームの教師なしクラスタリングによって得られた１０種類の細胞タイプを区別することができた。線維芽細胞１（Ｆｉｂ１）、筋線維芽細胞１（ＭＦ１）、筋線維芽細胞２（ＭＦ２）、筋線維芽細胞３（ＭＦ３）、内皮細胞（ＥＣ）、損傷近位尿細管細胞（ｉＰＴ）、不明の間葉系細胞（ｕＭ）、マクロファージ／単球（ＭＣ）。右：偽手術マウスとＵＵＯマウスの各細胞クラスターに含まれる細胞の割合。ｄ．各細胞クラスター（ｃで示した）における選択遺伝子の発現量。ｅ．ｃからのＵＭＡＰ埋め込み上に可視化された細胞外マトリックススコア（ＥＣＭスコア）の画像。 ｆ． 異なる細胞クラスターにおけるＣｏｌ１５ａ１発現のバイオリンプロット。間葉系細胞のみを示す。 ｇ．異なる細胞クラスターにおけるコラーゲンスコアのバイオリンプロット。間葉系細胞のみを示す。コラーゲンスコアは、Ｎａｂａらによって提供されたコアコラーゲン遺伝子の平均発現量である。 ｈ．ｎ＝３４のヒト腎臓におけるＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、Ｍｅｇ３のマルチプレックスＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの代表画像。Ｍｅｇ３はＰＤＧＦＲａおよびＰＤＧＦＲｂと共局在する。上から下へ：Ｍｅｇ３＋ＰＤＧＦＲａ＋ＰＤＧＦＲｂ＋ＤＡＰＩ／Ｍｅｇ３の検出／Ｍｅｇ３＋ＰＤＧＦＲａの検出／Ｍｅｇ３＋ＰＤＧＦＲｂの検出／Ｍｅｇ３＋ＤＡＰＩの検出。 ｉ．ＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションから定量化したＰＤＧＦＲａ／ｂ二重陽性細胞のうち、Ｍｅｇ３陽性細胞のパーセンテージ。 ｊ．線維芽細胞および筋線維芽細胞のＵＭＡＰ（左）と拡散マップ（右）の埋め込み（ｎ＝６，５５７）。ｃで示した細胞クラスター。黒線はＳｌｉｎｇｓｈｏｔで予測された系統樹を示す。下：同じＵＭＡＰ埋め込みで可視化された選択遺伝子の発現。 ｋ．同じ間葉系細胞クラスターでシグナル伝達経路がエンリッチメントされている。 ａ．図４ｃのＵＭＡＰ埋め込みで可視化されたＮｋｄ２の発現。（マウスＰｄｇｆｒａ／ｂ二重陽性細胞）。 ｂ．ａと同じデータセットにおいて、ＰｄｇｆｒａとＮｋｄ２の発現で層別化したＣｏｌ１ａ１陽性細胞および陰性細胞のパーセンテージ。Ｃｏｌ１ａ１陰性細胞はＰＤＧＦＲａ／Ｎｋｄ２二重陰性細胞に多く見られ、Ｃｏｌ１ａ１陽性細胞はＰＤＧＦＲａ／Ｎｋｄ２二重陽性細胞にも多く見られる。 ｃ．図２ａ－ｃに描かれた、ヒトＰＤＧＦＲｂ－細胞におけるＮｋｄ２発現と相関する（図５ｃ＿１）または反相関する（図５ｃ＿２）ことが確認された遺伝子のスケールされた遺伝子発現。 ｄ．ｎ＝３６のヒト腎臓におけるＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、ＮＫＤ２のマルチプレックスＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの代表画像。上から下へ：ＮＫＤ２＋ＰＤＧＦＲａ＋ＰＤＧＦＲｂ＋ＤＡＰＩの検出／ＮＫＤ２の検出／ＮＫＤ２＋ＰＤＧＦＲａの検出／ＮＫＤ２＋ＰＤＧＦＲｂの検出／ＮＫＤ２の検出＋ＤＡＰＩの検出。 ｅ．ＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂ二重陽性細胞のうち、ＮＫＤ２＋細胞のパーセンテージ。腎病理医が盲検で採点した間質性線維症の低い患者または高い患者のＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションから定量化した。ｆ．レンチウイルスによるＮｋｄ２過剰発現のウェスタンブロットによる検証。外来性の過剰発現タンパク質にＨＡタグが取り付けられている。 ｇ．トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦｂ）またはビヒクル（ＰＢＳ）で処理したヒト不死化ＰＤＧＦＲｂ＋細胞において、Ｎｋｄ２過剰発現後にｑＰＣＲで定量したＣｏｌ１ａ１、フィブロネクチン（Ｆｎ）、Ａｃｔａ２（ａＳＭＡ）の発現量。ｈ．複数の単一細胞クローン（１，２，３）において、非標的ｇＲＮＡクローン（ＮＴＧ）と比較して、ウェスタンブロットによるＮｋｄ２ノックアウトを検証したもの。クローン２では大きな挿入によりＮｋｄ２タンパク質の発現が完全に欠損しているが、クローン１、３ではより小さなｉｎｄｅｌ変異によりＮｋｄ２タンパク質の発現が低下しているだけであった。 ｉ．ｇに描かれたクローンにおけるＮｋｄ２ノックアウト後のＲＮＡ ｑＰＣＲによるＣｏｌ１ａ１、フィブロネクチン（Ｆｎ）、Ａｃｔａ２の発現量。 ｊ．Ｎｋｄ２－ｐｅｒｔｕｒｂｅｄのＰＤＧＦＲｂ－腎臓細胞におけるＥＣＭ遺伝子のＧＳＥＡ（Ｇｅｎｅ ｓｅｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）。「Ｓｈａｌｌｏｗ」は、ＮＫＤ２タンパク質がまだ検出されるクローン１＋３で検出された。「Ｓｅｖｅｒｅ」がクローン２で検出された。 ｋ．ＰＤＧＦＲｂ＋ＮＫＤ２－ＫＯクローンおよび過剰発現におけるＰＩＤシグナル伝達経路の強度の変化（ｕｐは指示した条件で発現が増加した遺伝子、ｄｏｗｎは発現が減少した遺伝子を示す。） ｌ．ヒトｉＰＳＣ由来腎臓オルガノイドにおけるＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、ＮＫＤ２のマルチプレックスＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションの代表画像。上から下へ：Ｎｋｄ２＋ＰＤＧＦＲａ＋Ｃｏｌ１ａ１＋ＤＡＰＩの検出／Ｎｋｄ２の検出／Ｎｋｄ２＋ＰＤＧＦＲａの検出／Ｎｋｄ２＋Ｃｏｌ１ａ１の検出／Ｎｋｄ２＋ＤＡＰＩの検出。ｍ．腎臓オルガノイドにおけるＮＫＤ２の蛍光強度を定量化した。 ｎ．ｉＰＳＣ由来腎臓オルガノイドにおけるＣｏｌ１ａ１（黒）の免疫蛍光染色。 ｏ．腎臓オルガノイドにおけるコラーゲン含量の定量化。 ＃＃ｐ＜０．０１， ＃＃＃＃ｐ＜０．０００１ 一元配置分散分析とボンフェローニポストホックテスト（対、対照ＮＴＧ）。 ｔ検定（ｅ＋ｍ）または一元配置分散分析とボンフェローニポストホックテスト（ｇ， ｉ ｖｓ． ＴＧＦｂ ＮＴＧ）による＊Ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，および＊＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。データは平均値±ＳＤを表す。スケールバー：ｃは１０μｍ、ｌ＋ｎは５０μｍ。
本発明を詳細に説明する前に、本発明は説明されたデバイスの特定の構成要素部分に限定されず、あるいはそのようなデバイスおよび方法は変化する可能性があるので、説明された方法のプロセス工程に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないことを理解されたい。明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、単数形および／または複数形の参照を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られるパラメータ範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの限界値を含むものとみなされることを理解されたい。
さらに、本明細書に開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されることを意味しないことを理解されたい。一実施形態で議論される特徴は、本明細書に示される他の実施形態に関連しても開示されることを意味する。１つの場合において、特定の特徴が１つの実施形態で開示されず、別の実施形態で開示される場合、当業者は、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることを意味しないことを必ずしも意味しないことを理解するのであろう。当業者であれば、他の実施形態についても前記特徴を開示することが本出願の主旨であるが、単に明瞭にするため、及び本明細書を管理可能な量に維持するために、これが行われていないことを理解されよう。
さらに、本明細書で参照される先行技術文献の内容は、参照により援用される。これは、特に、標準的または通常方法を開示する先行技術文献を指す。その場合、参照による援用は、主に、十分に実施可能な開示を提供し、長い繰り返しを回避する目的を有する。
本発明の第１の態様によれば、本発明は、所定の細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の発現および／または分泌を低減する方法に関し、この方法は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む。
（ｉ）前記細胞におけるｎｋｄ２遺伝子の発現を抑制または低減すること、
（ｉｉ）前記細胞におけるＮＫＤ２タンパク質の分解を促進すること、および／または
（ｉｉｉ）前記細胞におけるＮＫＤ２タンパク質の活性を阻害または低下させること。
ｎｋｄ２遺伝子発現の前記阻害または低減は、例えば、ｎｋｄ２遺伝子ノックダウン、ノックアウト、条件付き遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、ＲＮＡ干渉、ｓｉＲＮＡおよび／またはアンチセンスＲＮＡによって達成され得る。ｎｋｄ２遺伝子の発現の阻害または低減は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスコンジュゲートなどのアンチセンス分子、またはリボザイムなどの触媒核酸分子によって達成することができる。このような分子は、発現ベクターによって細胞内で生産することも、細胞の外から導入することも可能である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その安定性および／または結合親和性を高めるために、化学的に修飾することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの骨格化学の化学修飾、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステルまたはボランホスフェートによる修飾は、先行技術（例えば、ＷＯ００／４９０３４Ａ１）に記載されている。
前記細胞におけるＮＫＤ２タンパク質の前記分解促進は、例えば、プロテアーゼ等のタンパク質分解分子によって達成され得る。このようなプロテアーゼやタンパク質分解分子は、発現ベクターによって細胞内で異種合成することもできるし、細胞内でプロテアーゼをコードする遺伝子のホモログ遺伝子の発現量を増やすことによって細胞内で合成量を増やすこともできるし、細胞の外から細胞内に導入することもできる。
ＮＫＤ２タンパク質の活性の前記阻害または低減は、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合する薬剤の使用により達成することができる。
好ましくは、前記所定の細胞は腎臓細胞であり、より好ましくは腎臓筋線維芽細胞であり、最も好ましくは終末分化した腎臓筋線維芽細胞である。
ＮＫＤ２タンパク質は、ＷＮＴアンタゴニストであることが示されている。ネイキッドキューティクル（ＮＫＤ）ファミリーには、ショウジョウバエのネイキッドキューティクルと、その２つの脊椎動物のオルソログであるネイキッドキューティクルホモログ１（ＮＫＤ１）と２（ＮＫＤ２）が含まれる。Ｎｋｄ２遺伝子座は染色体５ｐ１５．３に位置している。乳がんを含む様々な種類の腫瘍において、これらの領域でヘテロ接合性の喪失が頻繁に見つかっている。ＮＫＤ１とＮＫＤ２はともに、ＥＦハンド様モチーフを介してＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄと相互作用することにより、正規のＷｎｔシグナルに拮抗することが報告されている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ ２００６）。さらに、ＮＫＤ２はＴＧＦα結合領域を通じてＤｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄと結合することが証明されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２００４）。ヒトのＮＫＤ１および２は、互いに４０％しか同一ではなく、マウスのそれぞれのオルソログとは約７０％の同一性がある。
ＮＫＤ２のＣ末端は高度に無秩序であるが、ＮＫＤ２のＮ末端領域は機能ドメインの大部分を含んでおり、ミリストイル化、ＥＦハンドモチーフ、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ結合領域、小胞認識および膜ターゲットモチーフを含む（Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２００４； Ｒｏｕｓｓｅｔ ｅｔ ａｌ ２００１； Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２０００）。ＮＫＤ２は、そのいくつかの機能的モチーフを通じて、スイッチタンパク質として機能することが示唆されている（Ｈｕ ｅｔ ａｌ ２００６）。神経膠芽腫細胞では、ＮＫＤ２のプロモーター領域がハイパーメチル化されている。
本明細書に記載されているように、本願の発明者らは、ＮＫＤ２を腎線維症の治療のための治療標的として特定した。Ｎｋｄ２は、細胞外マトリックスタンパク質コラーゲン－１の高い発現レベルを示す、終末分化したＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋筋線維芽細胞にのみ発現することが判明している。このようなマトリックスタンパク質は、主に線維芽細胞や周皮細胞から分化して生じる筋線維芽細胞によって生産される。コラーゲン－１産生細胞の４０％以上がＮｋｄ２／ＰＤＧＦＲａ＋であることが示されている。周皮細胞や線維芽細胞のマーカータンパク質を発現し、低レベルのマトリックスタンパク質を分泌する細胞は、Ｎｋｄ２の発現を欠いている。また、Ｎｋｄ２発現筋線維芽細胞では、ＴＧＦ－β－、Ｗｎｔ－、ＴＮＦαシグナル伝達経路などの線維化促進シグナル伝達経路の活性上昇が検出された。Ｎｋｄ２の過剰発現実験とディプリーション実験では、それぞれＮｋｄ２が細胞外マトリックスタンパク質の産生に関係していることが証明された。ヒト線維芽細胞でＮｋｄ２をレンチウイルスで過剰発現させると、線維芽細胞増殖促進因子ＴＧＦ－βの刺激により、コラーゲン－１やフィブロネクチンなどの線維芽細胞増殖促進因子マトリックスタンパク質の発現が増加した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＮｋｄ２のノックアウトにより、コラーゲン－１、フィブロネクチン、ＡＣＴＡ２の発現が有意に低下することを示すことができた。ＩＬ１－１３で刺激して線維化を誘導したヒト腎臓の全区画を含むオルガノイドにおいて、ｓｉＲＮＡを用いてＮｋｄ２をノックダウンすると、コラーゲン－１の発現が減少し、線維化が抑制されることが示された。
前記ＮＫＤ２タンパク質は、哺乳類、非霊長類、霊長類、特にヒトＮＫＤ２タンパク質、その断片であり得る。
本発明の別の態様によれば、本発明は、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合する薬剤、またはその断片を同定するための方法に関する。
前記方法は、少なくとも以下の工程を含むことができる。
（ｉ）ＮＫＤ２タンパク質またはその断片を提供すること、
（ｉｉ）ＮＫＤ２タンパク質またはその断片への結合についてスクリーニングされる少なくとも１つの薬剤を添加すること、および
（ｉｉｉ）ＮＫＤ２タンパク質またはその断片に結合した少なくとも１つの薬剤を同定すること。
好ましくは、本発明に従ってスクリーニングおよび同定される前記薬剤は、ＮＫＤ２阻害剤またはアンタゴニストである。
本発明による前記薬剤は、低分子化合物、ペプチド、および生物学的製剤からなる群から選択され得る。
本発明では、用語「低分子化合物」、「低分子」（「ｓｍｏｌ」）または「化学薬品」は、低分子量（＜１，０００ダルトン）の有機化合物、しばしば１ｎｍのオーダーのサイズを有するものに関連する。多くの医薬品は低分子である。このような低分子は、生物学的プロセスを制御している可能性がある。低分子化合物は、タンパク質の特定の機能を阻害することができる可能性がある。薬理学の分野では、特に「低分子」という用語は、特定の生体高分子に結合してエフェクターとして作用し、標的の活性や機能を変化させる分子を指す。例えば、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）は、１８０ダルトン、２１個の原子で構成される低分子医薬品とされている。このような低分子化合物は、免疫反応を起こす能力が低く、時間が経っても比較的安定していることが多い。
本発明による前記「生物学的製剤」、「生物学的医薬品」、「生物学的治療薬」または「バイオ医薬品」は、好ましくは、抗体、またはその抗原結合断片、またはその抗原結合誘導体、または抗体様タンパク質、またはアプタマーである。
ＮＫＤ２タンパク質又はその断片に結合する薬剤の同定方法の好ましい実施形態では、前記薬剤は、化合物ライブラリのメンバーである。
前記化合物ライブラリは、例えば、それぞれ低分子化合物、ペプチド、または生物学的化合物から構成され得る。
本発明では、「（コンビナトリアル）化合物ライブラリー」という用語は、化学化合物、低分子、ペプチドまたはタンパク質などの高分子のコレクションに関するもので、関連する化学種、ペプチドまたは生物学的製剤種の複数の異なる組み合わせが含まれ、特定のスクリーニングアッセイまたは同定ステップで一緒に使用できるものである。
本発明の別の態様によれば、本発明は、上記のようなＮＫＤ２またはその断片に結合する薬剤の同定方法における、ネイキッドキューティクルホモログ２またはその断片、あるいはネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質またはその断片をコードする核酸の使用に関する。
本発明の別の態様によれば、本発明は、ＮＫＤ２タンパク質に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質に関する。
好ましくは、前記抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質は、ＮＫＤ２活性を阻害する、すなわち、ＮＫＤ２の阻害剤またはアンタゴニストとして作用する。
本明細書中で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片またはそれに由来するｃＤＮＡによってコードされる１つ以上のポリペプチド鎖からなるタンパク質を意味する。前記免疫グロブリン遺伝子には、軽鎖カッパ、ラムダおよび重鎖アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミュー定常領域遺伝子ならびに多くの様々な可変領域遺伝子のいずれかが含まれる。
基本的な免疫グロブリン（抗体）構造ユニットは通常、軽鎖（Ｌ、分子量約２５ｋＤａ）と重鎖（Ｈ、分子量約５０～７０ｋＤａ）の２本の同一なポリペプチド鎖対からなる四量体である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨまたはＶHと略す）と重鎖定常領域（ＣＨまたはＣHと略す）で構成されている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３からなる。それぞれの軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬまたはＶ Lと略す）と軽鎖定常領域（ＣＬまたはＣ Lと略す）が含まれている。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに超可変性の領域に細分化することができ、これらはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の間に挿入された相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各ＶＨおよびＶＬ領域は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順にアミノ末端からカルボキシ末端に配列する３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを形成している。
ＣＤＲは、抗体またはその抗原結合部分の結合にとって最も重要である。ＦＲは、抗原の結合に必要な三次元構造が保持されていれば、他の配列に置き換えることができる。構築物の構造変化は、抗原への十分な結合の損失につながることが最も多い。
（モノクローナル）抗体の用語「抗原結合部分」とは、そのネイティブ型において抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を意味する。抗体の抗原結合部分の例としては、Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片）、Ｆ（ａｂ´）2断片（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより結合した２つのＦａｂ断片を含む２価の断片）、ＶＨとＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体のシングルアームのＶＬとＶＨドメインからなるＦｖ断片、ＶＨドメインと孤立した相補性決定領域（ＣＤＲ）からなるｄＡｂ断片が挙げられる。
本発明による抗体またはその抗体断片もしくは抗体誘導体は、モノクローナル抗体であり得る。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭアイソタイプであり得る。
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」とは、均質な抗体集団を有する抗体組成物、すなわち、全免疫グロブリンまたはその断片もしくは誘導体からなる均質な集団を意味する。特に好ましい、そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ、またはそれらの断片または誘導体からなる群より選択される。
本明細書中で使用される「断片」という言葉は、標的結合能を保持するこのような抗体の断片、例えば、ＣＤＲ （相補性決定領域）、超可変領域、可変ドメイン（Ｆｖ）、ＩｇＧ重鎖（ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる）、ＩｇＧ軽鎖（ＶＬおよびＣＬ領域からなる）、および／またはＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2を指す。
本明細書中で使用される「誘導体」という用語は、構造的には異なるが、依然としていくつかの構造的関連性を有するタンパク質構築物、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2、ならびに二重特異性、三重特異性またはより高い特異性の抗体構築物を指す。これらの項目はすべて以下に説明する。
当業者に知られている他の抗体誘導体は、ダイアボディ、ラクダ抗体、ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓの２つの鎖からなる二価ホモ二量体、ＩｇＡｓ （２つのＩｇＧ構造がＪ鎖と分泌成分によって連結されている）、サメ抗体、新世界霊長類フレームワークと非新世界霊長類ＣＤＲからなる抗体、ＣＨ３＋ＶＬ＋ＶＨを含む二量体構築物、ＣＤＲを含む他の足場タンパク質形式および抗体コンジュゲートである。
本明細書で使用する場合、「抗体様タンパク質」という用語は、標的分子に特異的に結合するように（例えば、Ｉｇループの変異誘発によって）改変されたタンパク質を意味する。典型的には、このような抗体様タンパク質は、タンパク質足場に両端が取り付けられた少なくとも１つの可変ペプチドループを含む。この二重構造束縛は、抗体様タンパク質の結合親和性を、抗体のものに匹敵するレベルまで大きく増加させる。可変ペプチドループの長さは、通常１０～２０アミノ酸で構成されている。足場タンパク質は、良好な溶解性を有する任意のタンパク質であってもよい。好ましくは、足場タンパク質は、小球状タンパク質である。抗体様タンパク質には、限定されないが、アフィボディ、アンチカリン、および設計されたアンキリンタンパク質、およびアフィリンタンパク質が含まれる。抗体様タンパク質は、例えば大規模なファージディスプレイライブラリーからのパンニングによって、変異体の大規模なライブラリーから得ることができ、通常の抗体と同様に単離することができる。また、球状タンパク質の表面露出残基のコンビナトリアル変異誘発により、抗体様結合タンパク質を得ることができる。
本明細書中で使用される、用語「Ｆａｂ」は、抗原結合領域を含むＩｇＧ断片に関するものであり、前記断片は、抗体の各々の重鎖および軽鎖からの１つの定常および１つの可変ドメインで構成される
本明細書中で使用される、「Ｆ（ａｂ）2」という言葉は、ジスルフィド結合によって互いに結合した２つのＦａｂ断片からなるＩｇＧ断片に関する。
本明細書中で使用される「ｓｃＦｖ」という言葉は、単鎖可変領域フラグメントが、通常セリン（Ｓ）および／またはグリシン（Ｇ）残基を含む短いリンカーと共に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体であることに関する。このキメラ分子は、定常領域を除去し、リンカーペプチドを導入するにもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。
改変された抗体フォーマットは、例えば、二重または三重特異性抗体構築物、抗体ベースの融合タンパク質、免疫コンジュゲートなどである。
ＩｇＧ， ｓｃＦｖ， Ｆａｂおよび／またはＦ（ａｂ）2は当業者によく知られた抗体フォーマットである。関連する有効化技術は、それぞれの教科書から入手することができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、前記抗体、またはその抗原結合断片もしくは抗原結合誘導体は、それぞれ、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体、またはその抗原結合断片もしくは抗原結合誘導体である。
マウス由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、抗体を誘発する可能性のある別種由来のタンパク質を含むため、望ましくない免疫学的副作用を引き起こす可能性がある。この問題を克服するために、抗体のヒト化及び成熟化方法は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を理想的には依然として保持しながら、ヒトに適用した場合に最小限の免疫原性を有する抗体分子を生成するように設計されている。これらの方法を用いて、例えば、マウスＭＡｂフレームワーク領域を対応するヒトフレームワーク領域に置き換える（いわゆるＣＤＲ移植）。ＷＯ２００９０７８６１は、組換えＤＮＡ技術によって、非ヒト抗体のＣＤＲ領域をヒト定常領域に結びつけることによって、マウス抗体のヒト化形態の作製を開示する。Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃｉｌによるＵＳ６５４８６４０にはＣＤＲ移植技術が記載されており、ＣｅｌｌｔｅｃｈによるＵＳ５８５９２０５にはヒト化抗体の産生が記載されている。
本明細書中で使用される「ヒト化抗体」という言葉は、抗体、断片またはその誘導体に関するものであり、この用語は、抗体の定常領域および／またはフレームワーク領域の少なくとも一部、および任意にＣＤＲ領域の一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来するか、またはヒト免疫グロブリン配列に調整される。
本発明の別の態様によれば、本発明は、上記のような同定方法によって得られる薬剤に関する。
前記薬剤は、ネイキッドキューティクルホモログネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質と特異的に結合する能力を有する。好ましい実施形態において、前記薬剤は、ＮＫＤ２タンパク質またはその断片と、高いまたは特に高い親和性および／またはアビディティで特異的に結合する。好ましい実施形態において、前記薬剤は、ＮＫＤ２に結合すると、ＮＫＤ２活性を低下または阻害する。
本明細書で使用する「特異的に結合する」という用語は、前記薬剤が、せいぜい約１００μＭのＮＫＤ２タンパク質分子又はそのエピトープに対する解離定数ＫＤを有することを意味する。実施形態において、ＫＤは、約１００μＭ以下、約５０μＭ以下、約３０μＭ以下、約２０μＭ以下、約１０μＭ以下、約５μＭ以下、約１μＭ以下、約９００ｎＭ以下、約８００ｎＭ以下、約７００ｎＭ以下、約６００ｎＭ以下、約５００ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約９０ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約７０ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約９００ｐＭ以下、約８００ｐＭ以下、約７００ｐＭ以下、約６００ｐＭ以下、約５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下です、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、または約１ｐＭ以下である。
前記薬剤は、慢性腎臓病、特に前記慢性腎臓病が進行性慢性腎臓病および／または腎線維症の治療における使用に供することができる。
前記薬剤は、低分子化合物（ｓｍｏｌ）、ペプチド、または生物学的製剤であり得、好ましくは、前記生物学的製剤が抗体、またはその断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質、またはアプタマーである。
本発明による低分子化合物は、他の化学的バックボーン、置換基、基または残基の中でも、例えば、アルキル－、アルケニル－、アルキニル－、アルコキシ－、アリール－、アルキレン－、アリーレン基、アミノ基、ハロゲン基、カルボキシレート誘導体基、シクロアルキル基、カルボニル誘導体基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアリーレン基、スルホン酸基、硫酸基、ホスホン酸基、ホスフィン基、ホスフィノキサイド基を含み得る。
本発明の別の態様によれば、本発明は、慢性腎臓病の治療方法において、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合および／または阻害する薬剤の使用に関し、好ましくは、慢性腎臓病が進行性慢性腎臓病および／または腎線維症である。好ましい実施形態において、前記薬剤は、ＮＫＤ２に結合したとき、ＮＫＤ２活性を阻害する。
本発明は、慢性腎臓病を治療または予防する方法に関し、この方法は、治療的有効量または用量で、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合および／または阻害する薬剤を、ヒトまたは動物の対象に投与することを含む。
本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、所望の結果を得るために必要な用量および期間において、有効な用量または量を意味する。有効量は、対象の疾患状態、年齢、性別および／または体重、医薬製剤、治療される疾患のサブタイプなどの要因に応じて変化し得るが、それでも当業者により日常的に決定することができる。
本発明の別の態様によれば、本発明は、上記の抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質、または上記の薬剤、および任意に１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記賦形剤は、薬学的に許容される緩衝剤、界面活性剤、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、吸着剤、および／または防腐剤からなる群から選択され得る。
本発明の別の態様によれば、本発明は、医薬組成物の製造方法に関するものであり、以下を含む。
（ｉ）上記のＮＫＤ２タンパク質またはその断片に結合および／または阻害する薬剤を同定する方法、およびさらに
（ｉｉ）同定された薬剤を、薬学的に許容される担体と混合する。
本発明の別の態様によれば、本発明は、（ｉ）上述の抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質、または上述のネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合する薬剤、または上述の医薬組成物、および（ｉｉ）１以上のさらなる治療的活性化合物の組み合わせを含む組成物に関する。
前記医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、界面活性剤、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、滑沢剤、崩壊剤、吸着剤、および／または防腐剤を含むことができる。
前記医薬組成物は、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、またはパールの形態で投与され得る。水性形態では、前記医薬製剤は投与準備済みであり得るが、一方、凍結乾燥形態では、前記製剤は、投与前に、例えば、例えば、これに限定されないが、ベンジルアルコールのような防腐剤、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、パルミチン酸レチニル、セレニウムなどの抗酸化物質、アミノ酸のシステインとメチオニン、クエン酸とクエン酸ナトリウム、パラベンのメチルパラベンとプロピルパラベンのような合成防腐剤を含んでいても含んでいなくてもよい注射用水の添加によって液体形態に移すことができる。
前記医薬製剤は、１つ以上の界面活性剤、１つ以上の等張化剤、および／または１つ以上の金属イオンキレート剤、および／または１つ以上の防腐剤をさらに含むことができる。
本明細書に記載される医薬製剤は、少なくとも経口、非経口、静脈内、筋肉内または皮下投与に適している。あるいは、本発明による前記コンジュゲートは、一定期間にわたる活性な薬剤の持続的放出を可能にするデポ剤で提供されてもよい。
本発明のさらに別の態様では、充填済み注射器もしくはペン、バイアル、または注入バッグのような一次包装が提供され、これは、本発明の以前の態様による前記製剤を含む。
充填済み注射器またはペンは、凍結乾燥形態（次いで、投与前に、例えば注射用水で溶解されなければならない）、または水性形態のいずれかで製剤を含有していてもよい。前記注射器またはペンは、単回使用のみのディスポーザブルの物品であることが多く、容量が０．１～２０ｍｌの場合がある。しかしながら、注射器またはペンは、多回使用または多回投与注射器またはペンでもよい。
本発明の別の態様によれば、本発明は、以下を含む部品の治療キットに関する：
（ｉ）上記の医薬組成物、
（ｉｉ）該組成物を投与するための装置、および
（ｉｉｉ）任意選択的に、使用説明書。
配列
［実施例］
本発明は図面および前記の説明において詳細に図示および説明されてきたが、そのような図示および説明は例示または例示的であり、限定的ではないと考えられるべきであり、本発明は開示された実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲の研究から、請求される発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、他の要素又はステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」又は「ａｎ（１つの）」は複数形を除外するものではない。特定の手段が相互に異なる従属請求項に列挙されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲のどの引用符号も、範囲を限定すると解釈するべきではない。
本明細書に開示される全てのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端まで示される；本明細書に開示される全ての核酸配列は、５´－＞３´で示される。
実施例１
材料及び方法
ヒト組織加工
腎臓の組織は、正常部位と腫瘍部位から外科医によって採取された。組織はドライアイス上でスナップ冷凍するか、あらかじめ冷やしたウィスコンシン大学溶液（＃ＢＴＬＢＵＷ， Ｂｒｉｄｇｅ ｔｏ Ｌｉｆｅ Ｌｔｄ．， Ｃｏｌｕｍｂｉａ， Ｕ．Ｓ．）に入れ、氷上で当研究室に運んだ。組織は約０．５－１ｍｍ３にスライスした後、Ｃ－ｔｕｂｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に移し、プログラムｓｐｌｅｅｎ ４を用いてｇｅｎｔｌｅ－ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）上で処理した。その後、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中に２５μｇ／ｍｌ Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ）と５０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を含む消化液中で３００ＲＰＭで撹拌しながら、３７℃で３０分間組織を消化させた。インキュベーション後、サンプルをｇｅｎｔｌｅ－ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で同じプログラムを使って再度処理した。得られた懸濁液を７０μｍの細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）に通し、４５ｍｌの冷ＰＢＳで洗浄した後、４℃で５００ｇ、５分間遠心分離を行った。トリパンブルー染色を行い、血球計数器を用いて細胞をカウントした。ＣＤ１０染色や線維芽細胞のＰＤＧＦＲβ染色により上皮細胞をさらに濃縮し、ＦＡＣＳソートとＤＡＰＩ陰性細胞へのゲーティングにより、生きた単一細胞を濃縮した。生検の採取から単細胞懸濁液の作製まで、平均５～６時間であった。
マウス
ＰＤＧＦＲβＣｒｅＥＲｔ２（すなわち、Ｂ６－Ｃｇ－Ｇｔ（Ｐｄｇｆｒβ－ｃｒｅ／ＥＲＴ２）６０９６Ｒｈａ／Ｊ、ＪＡＸ Ｓｔｏｃｋ ＃０２９６８４）およびＲｏｓａ２６ｔｄＴｏｍａｔｏ（すなわち、Ｂ６－Ｃｇ－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｔｍ（ＣＡＧ－ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ ＪＡＸ Ｓｔｏｃｋ ＃００７９０９）はＪａｃｋｓｏｎ研究所（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ， ＭＥ， ＵＳＡ）から購入した。子孫はＪａｃｋｓｏｎ研究所のプロトコールに従い、ＰＣＲで遺伝子型を決定した。Ｐｄｇｆｒｂ－ＢＡＣ－ｅＧＦＰレポーターマウスは、Ｎ． Ｈｅｉｎｔｚ （Ｔｈｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）がＧＥＮＳＡＴプロジェクトで開発した。全マウスのジェノタイピングはＰＣＲで実施した。マウスは、エジンバラ大学またはＲＷＴＨアーヘンにおいて、特定の病原体を含まない条件下で飼育された。ＵＵＯは既報の通り実施した。２ 簡単に説明すると、脇腹を切開した後、左尿管を７．０タイ（Ｅｔｈｉｃｏｎ社製）２本で下極の高さで締めた。マウスは手術後１０日目に犠牲となった。動物実験プロトコルは、ドイツのＬＡＮＵＶ－ＮＲＷおよび英国内務省規則により承認された。すべての動物実験は、そのガイドラインに従って実施された。ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ２用のＰＤＧＦＲｂｅＧＦＰ雄マウスは、生後１０日以内、手術時９～１１週齢のものを使用し、記載通りに犠牲とした。ＰＤＧＦＲｂＣｒｅＥＲ；ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（８週齢、雄２匹／雌３匹）にタモキシフェンを３回経口投与（１０ｍｇ ｐ．ｏ．）し、２１日間の洗浄期間を経て、ＵＵＯ手術または偽手術（上記同様）を行い、手術後１０日で犠牲とした。
マウスでの単一細胞分離
安楽死させたマウスを２０ｍｌ ＮａＣｌ ０．９％で左心臓から灌流し、血管系から血液残渣を除去した。腎臓を外科的に摘出し、小切片にし、１５ｍｌチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に入れ、１％ＦＣＳを含む氷冷したＰＢＳ上に置いた。腎臓の単一細胞を分離するために、酵素的および機械的破壊の組み合わせは、ヒト単一細胞の分離について上述したように使用した。この方法では、全体として８０％以上の生存率が得られた。
ＦＡＣＳ
細胞は以下のモノクローナル直接蛍光色素結合抗体で標識した：抗ＣＤ１０ヒト（クローンＨＩ１０ａ、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＰＤＧＦＲｂマウス（クローンＰＲ７２１２、Ｒ＆Ｄ）、抗ＰＤＧＦＲαマウス（クローンＡＰＡ５、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ３１マウス（クローンＭｅｇ１３．３、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５マウス（クローン３０＿Ｆ１１）。分離した細胞を氷上で１％ＰＢＳ－ＦＢＳに再懸濁し、最終濃度を１ｘ１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとした。細胞をＦｃ－Ｂｌｏｃｋ（ＴｒｕＳｔａｉｎＦｘ ｈｕｍａｎ， ＴｒｕＳｔａｉｎＦｘ ｍｏｕｓｅ Ｃｌｏｎｅ ９１， ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でプレインキュベートし、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで１：１００に希釈した上記抗体と遮光して３０分間インキュベートした。ヒト抗ＰＤＧＦＲｂ染色には、ヤギ抗マウスＤｙｅｌｉｇｈｔ ４０５ （ｐｏｌｙ２４０９１， ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を二次抗体として使用した。すべての補正は、単色染色と陰性染色、蛍光マイナス１コントロールを使用して、撮影時に実施した。ＳＯＮＹ ＳＨ８００ ソーター（Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； １００ ｕｍノズルソーティングチップＳｏｎｙ）を用いて、８０％以上の効率を目標にセミピュアモードで細胞をソーティングした。ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑのためのプレートベースのソーティングでは、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ機（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で細胞ソーティングを行った。
Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２ および １０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３´ ｓｃ－ＲＮＡ－Ｓｅｑ （Ｖ２ および Ｖ３） を含む単一細胞アッセイ。
Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２では、ＳｃｉＬｉｆｅＬａｂ － Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｆａｃｉｌｉｔｙ （Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で単一細胞を処理した。出荷前に、あらかじめ用意した溶解バッファーが入った３８４ウェルプレートのウェルに単一細胞をソートした。ライブラリーはＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４５００でシーケンシングした。細胞とプライマリーヒト腎臓細胞の単一細胞溶液をＣｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔ上で並行して実行し、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３´ ｌｉｂｒａｒｙ ｋｉｔ Ｖ２およびｉ７ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｋｉｔ（ＰＮ－１２０２３６， ＰＮ－１２０２３７， ＰＮ－１２０２６２， １０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてメーカーのプロトコルに従ってライブラリを実行した。ライブラリーの品質は、２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＤ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅを使用して判定した。シーケンスは、Ｓ１およびＳ２フローセル（イルミナ）を用いて、イルミナＮｏｖａｓｅｑプラットフォームで実施した。
ヒト腎臓の線維化評価
腎臓のＰＡＳ染色切片は、経験豊富な腎臓病理医が盲検で分析し、採点した。全切片で腎臓病のスクリーニングを行ったが、加齢による変化や高血圧性腎症を除き、尿細管間質性疾患や血管性疾患の特異な糸球体の兆候は認められなかった。間質性線維症と尿細管萎縮症の程度は、影響を受けた皮質面積の割合として２つの別々のパラメータとして評価した。全糸球体硬化症の程度は、全糸球体から全糸球体硬化した糸球体の割合で推定した。動脈硬化の程度、すなわち中膜の厚さに比べた内膜の線維弾性的な肥厚は、０～３のスコアで評価され、０はなし、１は軽度（５０％未満）、２は中程度（５１～１００％）、３は重度（１００％以上中膜に比べ肥厚）でした。
コラーゲンＩおよびＩＩＩの免疫組織化学のために、ホルマリン固定およびパラフィン包埋した腎臓組織のｕｍ切片を、キシレン（３×５分）でのインキュベーションによりパラフィンを除去し、その後濃度の低いエタノール（１００％エタノール３×２分、９５％エタノール２×２分、７０％エタノール１×２分）で再水和して間接免疫ペプチド処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性を蒸留水中３ ％ Ｈ2Ｏ2で室温１０分間ブロックし、洗浄（ＰＢＳで２回）した後、１ ％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中の一次抗体 ［Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ） Ｃａｔ Ｎｏ １３１０－０１； Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩＩ （Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ） Ｃａｔ Ｎｏ １３３０－０１］ と湿潤庫で室温１時間インキュベートした。その後、スライドをＰＢＳで５分間２回洗浄し、ビオチン化２次抗体を添加した（３０分）。アビジン－ビオチン複合体を加え、３０分間インキュベートした後、ＤＡＢ溶液で３７℃、１０分間インキュベートした。Ｈ2Ｏで洗浄して反応を停止し、スライドをメチルグリーンで４分間カウンターステインした。最後に、スライドを昇順のエタノールとキシレンで脱水した。ホールスライドスキャナー（ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ＨＴ， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ， Ｈａｍａｍａｔｓｕ， Ｊａｐａｎ）を用いて、免疫組織化学的に染色されたスライドの完全デジタル化画像をさらに処理し、閲覧ソフトウェアＮＤＰ．ｖｉｅｗ （Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ， Ｈａｍａｍａｔｓｕ， Ｊａｐａｎ） および ＩｍａｇｅＪ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ） で解析した。腎臓皮質における陽性染色面積の割合を盲検法で分析した。
抗体・免疫蛍光染色について
腎臓の組織は４％ホルマリンで２時間、ＲＴで固定し、３０％スクロースで一晩脱水した後、ＯＣＴで凍結した。５－１０μｍの凍結切片を用い、スライドを５％ロバ血清でブロックし、一次抗体を１時間インキュベートした後、ＰＢＳで５分間３回洗浄し、その後二次抗体を４５分間インキュベートした。ＤＡＰＩ （４´，６´－´ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ） 染色 （Ｒｏｃｈｅ， １：１０．０００） の後、スライドは ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＃Ｐ１０１４４） でマウントした。以下の抗体を使用した：抗マウスＰＤＧＦＲａ（ＡＦ１０６２、１：１００、Ｒ＆Ｄ）、抗ＣＤ１０ヒト（クローンＨＩ１０ａ、１：１００、ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＨＮＦ４ａ（クローンＣ１１Ｆ１２、１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、パン－サイトケラチンＴｙｐｅＩ／ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｒｅｆ．ＭＡ１－８２０４１）、Ｄａｃｈ１（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ０１２６７２）、Ｃｏｌ１ａ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ３４７１０）、ＥＲＧ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９２５１３）、ＡＦ４８８ ロバ抗ヤギ（１：１００， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）， ＡＦ６４７ ロバ抗ウサギ（１：２００， Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
共焦点撮像
画像は、Ｎｉｋｏｎ Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡を用い、４０Ｘおよび６０Ｘ対物レンズを使用して取得した（Ｎｉｋｏｎ）。生画像データは、Ｎｉｋｏｎ ＳｏｆｔｗａｒｅまたはＩｍａｇｅＪを使用して処理した。
ヒト腎臓組織マイクロアレイ
Ｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ／Ａａｃｈｅｎバイオバンクの９８の非腫瘍性ヒト腎臓サンプルからパラフィン包埋、ホルマリン固定された腎臓標本を、以前に行われたＰＡＳ染色に基づいて選択した。サンプルごとにエリアをランダムに選択し、ＴＭＡｒｒａｙｅｒＴＭ（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｂｅｅｃｈｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ， ＵＳＡ）を用いて各腎臓サンプルから２ｍｍのコアを１つ採取した。各コアは、約２．５平方ｃｍをカバーする２ｍｍ間隔のグリッドでレシピエントブロックに配列され、５ミクロン厚の切片が標準的な組織学的手法で切断・処理された。
ＲＮＡ ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ホルマリン固定パラフィン包埋組織サンプルとＲＮＡＳｃｏｐｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＫＩＴ Ｖ２ （ＲＮＡＳｃｏｐｅ， ＃３２３１００）を用いて、製造元のプロトコルに若干の修正を加えながらｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。抗原回収は、水浴中で９９℃１５分の代わりに９６℃２２分で行った。抗原回収を行った後、前処理１液３～５滴をＲＴで１０分間インキュベートした。洗浄工程は５分×３回行った。ＲＮＡｓｃｏｐｅアッセイには、以下のプローブを使用した：Ｈｓ－ＰＤＧＦＲβ ＃５４８９９１－Ｃ１、Ｈｓ－ＰＤＧＦＲａ ＃６０４４８１－Ｃ３、Ｈｓ－Ｃｏｌ１ａ１ ＃４０１８９１、Ｈｓ－ＣＯＬ１Ａ１ ＃４０１８９１－Ｃ２、Ｈｓ－ＭＧ３ ＃４００８２１、 Ｈｓ－ＮＫＤ２ ＃５８１９５１－Ｃ２ （ＮＭ＿０３３１２０．３の２３６－１６９４を標的とする）、Ｈｓ－Ｐｏｓｔｎ ＃４０９１８１－Ｃ２および４０９１８１－Ｃ３、Ｈｓ－Ｐｅｃａｍ１ ＃４８７３８１－Ｃ２、Ｈｓ－Ｃｌ１９ ＃４７４３６１－Ｃ３、Ｈｓ－Ｃｌ２１ ＃４７４３７１－Ｃ２、Ｈｓ－Ｎｏｔｃｈ３ ＃５５８９９１－Ｃ２、Ｍｍ－Ｃｏｌ１ａ１ ＃３１９３７１、Ｍｍ－ＰＤＧＦＲａ ＃４８０６６１－Ｃ２、Ｍｍ－ＰＤＧＦＲｂ ＃４１１３８１－Ｃ３．
画像定量化 － ＩＳＨ画像解析
系統的ランダムサンプリングにより、１枚の画像につき少なくとも３つの代表的な尿細管間質領域をサブサンプルとして抽出した。次に、Ｆｉｊｉ （Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｄｒｅｓｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ） の細胞カウントツールを用いて、すべての蛍光ドット（転写物）に手動で注釈をつけた。その後、隣接する核を識別するための分水嶺（限界：０．１～０．４）、不完全なオブジェクトのエッジ検出、オブジェクトサイズの選択（限界：１２～１８０μｍ2）に基づく自社製ツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｌａｂ．ｃｏｍ／ｍｋｌａｕｓ／ｓｅｇｍｅｎｔ＿ｃｅｌｌｓ＿ｒｅｇｉｓｔｅｒ＿ｍａｒｋｅｒ）を用いて単一核を単離した。その後、個々のドットの総数を、分離した核ごとにリトライした（ｒｅｔｒｉｅｄ）。腎臓の形態は複雑で、細胞密度が高いため、核以外の転写物の起源を特定することができないため、核の外に位置するドットはこの解析には含まれなかった。ＰＤＧＦＲａ／ｂ細胞のＭｅｇ３およびＮＫＤ２解析は、核をセグメント化した後、ＱＰａｔｈを使用して画像を解析し、イメージングチャンネルあたり１ポジ以上のスポットに基づき細胞をカウントした。Ｃｏｌ１ａ１－ＩＦ定量化またはＮＫＤ２－ＩＳＨ定量化のために、画像をＲＧＢチャンネルで分割し、ＩｍａｇｅＪを用いて画像ごとに統合蛍光密度を決定した。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
細胞ペレットを採取し、ＰＢＳで洗浄した後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造元の指示書に従ってＲＮＡを抽出した。２００ ｎｇ 全ＲＮＡ を Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） で逆転写した。 ｑＲＴ－ＰＣＲは、ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ）とＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ Ｃ１０００ Ｔｏｕｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒで実施した。サイクリング条件は、９５℃３分、その後９５℃１５秒、６０℃１分を４０サイクル、その後９５℃１０秒を１サイクルとした。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。データの解析は２－ＣＴ法で行った。使用したプライマーは、表２に示すとおりである。
ＲＴ－ＰＣＲプライマー配列一覧（ヒト）
ヒトＰＤＧＦＲｂ＋細胞株の作製
ＰＤＧＦＲｂ＋細胞は、腎摘出標本（７１歳男性患者）の健康なヒト腎臓皮質から、単一細胞懸濁液の生成（上記の通り）後、ＭＡＣＳ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ， ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ， ＃ １３０－０９２－５４５， ａｕｔｏＭＡＣＳ Ｃｏｌｕｍｎｓ ＃１３０－０２１－１０１） により分離した。単離のために、単一細胞懸濁液は、最初に特異的ＰＤＧＦＲｂ抗体（Ｒ＆Ｄ＃ＭＡＢ１２６３抗体、希釈度１：１００）を用いて２段階で染色し、次にＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１－ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ， ＃１３０－０４７－１０２，） でインキュベーションした。ＭＡＣＳに続き、１０％ＦＣＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃ ３１８８５）で１４日間培養し、ＳＶ４０ＬＴとＨＴＥＲＴを用いて以下のように不死化させた。レトロウイルス粒子は、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ（Ｍｉｒｕｓ社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性のトランスフェクションを行うことで製造した。プラスミドｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏ－ＳＶ４０－ＬＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１３９７０）またはｘｌｏｘ－ｄＮＧＦＲ－ＴＥＲＴ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃６９８０５）を、パッケージングプラスミドｐＵＭＶＣ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃８４４９）と偽タイプ化プラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２５９）と組み合わせて共導入して２種類の両方向性粒子（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）が作られた。レトロウイルス粒子はトランスフェクション後４８時間後にＲｅｔｒｏ－Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて１００倍に濃縮した。細胞導入は、レトロウイルス上清の連続希釈液（ＳＶ４０－ＬＴまたはむしろｈＴＥＲＴを含む濃縮粒子の１：１混合）と標的細胞を４８時間インキュベートすることによって行われた。その後、感染したＰＤＧＦＲｂ＋細胞を、トランスフェクション後７２時間に２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで７日間選択した。
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の腎臓オルガノイドの培養
Ｈｕｍａｎ ｉＰＳＣ－１５ ｃｌｏｎｅ ０００１は、Ｒａｄｂｏｕｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｎｉｊｍｅｇｅｎ， Ｔｈｅ ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓのＳｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙから受け取った。ヒトｉＰＳ細胞は、Ｅ８培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＧｅｌｔｒｅｘコートプレート上で培養した。７０－８０％コンフルエントになったところで、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いてｉＰＳＣを剥離し、細胞凝集体を１：３に分割して再播種した。 Ｔａｋａｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ， ２０１５）に基づき修正したプロトコルでヒトｉＰＳＣを分化させ、ゲルトレックスコートプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１ｃｍ２あたり１８，０００個の密度で播種した。中間中胚葉への分化は、ＣＨＩＲ９９０２１（６μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）をＥ６培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３日および５日間使用した後に、ＦＧＦ ９（２００ｎｇ／ｍｌ、ＲＤ ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヘパリン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をＥ６で７日まで補充して開始された。分化７日後、細胞凝集体（オルガノイドあたり３０万細胞、３日目と５日目のＣＨＩＲ分化細胞の混合）をＣｏｓｔａｒトランスウェルインサート上で培養し、Ｅ６分化培地を用いて自己組織化腎臓形成を刺激した。７＋１８日目に腎臓オルガノイドを、以下に述べるようにｓｉＲＮＡノックダウン実験に使用した。
ヒトｉＰＳＣ由来腎臓オルガノイドにおけるＮＫＤ２のｓｉＲＮＡノックダウン
ＮＫＤ２ ｓｉＲＮＡノックダウンは、メーカープロトコールに従って実施した（ＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬、ＮＫＤ２特異的スマートプールｓｉＲＮＡ、いずれもＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。トランスフェクションマスターミックスとスクランブルコントロールはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地（Ｇｉｂｃｏ）で調製し、オルガノイドに添加した。２４時間の初期インキュベーション後、トランスフェクションマスターミックスをリフレッシュし、ＩＬ－１β（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、線維化を誘導した。ＩＬ－１βの投与とトランスフェクションマスターミックスのリフレッシュは、２４時間ごとに２日間繰り返した。トランスフェクション開始９６時間後、オルガノイドを採取し、パラフィン切片に処理した。蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および免疫蛍光染色は、上記のように実施した。
ＴＧＦｂ－処理実験
０．５％ＦＣＳ含有培地で２４時間血清飢餓を行った後、７５％コンフルエントのＰＤＧＦＲｂ細胞にＰＢＳ中１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦｂ（１００－２１－１０ＵＧ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を２４時間添加した。Ｔ－５２２４を用いた阻害剤実験では、ＴＧＦｂを添加する１時間前に阻害剤（またはビヒクル）を培養ウェルに添加した。すべての実験は３回行った。
ＡＰ－１阻害剤投与
Ｔ－５２２４（ｃ－Ｆｏｓ／ＡＰ－１ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ＃２２９０４）はＤＭＳＯに溶解し、－８０℃で保存した。コントロールウェルには常に同じ割合でＤＭＳＯを添加した。
細胞増殖（ＷＳＴ－１アッセイ）
ＰＤＧＦＲｂ－細胞を用いたＷＳＴ－１アッセイは、製造元（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）の推奨に従い、９６ウェルで実施した。簡単に言うと、１×１０＾４ ＰＤＧＦＲｂ細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、その細胞をＴ－５２２４またはビヒクル（ＤＭＳＯ）で３連で指示濃度で処理した。細胞をＷＳＴ－１試薬で２時間インキュベートした後、指示された時点で採取した。４５０ｎｍと６５０ｎｍ（基準）の両方の吸光度を測定した。
ｓｇＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベクター構築、ウイルス作製、トランスダクション
ＮＫＤ２特異的ガイドＲＮＡ（フォワード ５′－ＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＣＧＡＴＧＴＣＴＣＧＧ －３′； リバース ５′－ ＡＡＡＣＣＣＧＡＧＡＣＡＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣ －３′）はＢｓｍＢＩ制限消化を使用してｐＬ－ＣＲＩＳＰＲ．ＥＦＳ．ＧＦＰ （Ａｄｄｇｅｎｅ ＃５７８１８）へクローニングした。レンチウイルス粒子は、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ（Ｍｉｒｕｓ）を用いて、レンチウイルス導入プラスミド、パッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２６０）およびＶＳＶＧパッケージングプラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１２２５９）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性共トランスフェクトすることにより製造した。ウイルス上清はトランスフェクションの４８～７２時間後に採取し、遠心分離で清澄化し、１０％ＦＣＳとＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度８μｇ／ｍｌ）を添加し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ； ＳＬＨＰ０３３ＲＳ）でろ過した。細胞導入は、ＰＤＧＦＲβ細胞をウイルス上清と４８時間インキュベートすることで行った。ｅＧＦＰ発現細胞は、９６ウェルプレートに単一細胞ソートした。拡大したコロニーをミスマッチ検出アッセイで変異を評価した：ＣＲＩＳＰＲ標的部位にまたがるｇＤＮＡをＰＣＲ増幅し、Ｔ７ＥＩ消化（Ｔ７ Ｅｎｄｏｃｎｕｃｌｅａｓｅ， ＮＥＢ Ｍ０３０２Ｓ）で解析した。増殖したクローン内の両アレルの特異的な変異事象を調べるため、ＰＣＲ産物をｐＣＲTM ４Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ２８７５２０）にサブクローニングした。ＣＲＩＳＰＲクローンあたり最低６個のコロニーを増殖させ、サンガー配列決定に回した（クローンＣ２：３０コロニーをシークエンス済み）。ウェスタンブロットを行い、ＮＫＤ２の完全ノックアウトを証明した。
ウェスタンブロット
ウェスタンブロットは標準プロトコールに従って実施した。簡単に言うと、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡバッファーによって細胞溶解液を調製した。ライセートのタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（＃２３２２５， Ｐｉｅｒｃｅ， ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化した。タンパク質溶解液を４ｘ ＳＤＳサンプルローディングバッファー（ＢｉｏＲａｄ）中で９５℃、５分間加熱し、１０％ＳＤＳ－Ｐａｇｅゲルにロードした。その後、サンプルをＰＶＤＦ膜に移し、ブロットを５％ Ｂｌｏｔｔｏ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中の一次抗体でプロービングした：（１：３０００ウサギ抗ヒトＮＫＤ２ポリクローナル抗体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＡ５－６１９７９）を２時間インキュベートし、洗浄後１時間二次抗体（１：５０００ホースラディッシュ・パーオキシダーゼ－ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で培養しＰｉｅｒｃｅTM ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＡおよびＢを用いて展開した。マウスモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＢ３００－３２０； １：１０００）に続き、ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をロードコントロールとして使用した。
レンチウイルスによるＮｋｄ２の過剰発現
ＮＫＤ２ベクターの構築と安定したＮＫＤ２発現細胞株の作製。ＮＫＤ２のヒトｃＤＮＡは、プライマー配列５´－ａｔｇｇｇｇａａａｃｔｇｃａｇｔｃｇａａｇ－３´と５´ ｃｔａｇｇａｃｇｇｇｔｇｇａａｇｔｇｇｔ－３´を用いてＰＣＲ増幅した。プライマー５´－ ｃａｃｔｃｇａｇｇｃｃａｃｃａｔｇｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｔｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｔｇｇｇａａａｃｔｇｃａｇｔｃｇａａｇ－３´ と５´－ ａｃｇｇａａｔｔｃｃｔａｇｇａｃｇｇｇｔｇｇａａｇｔｇ －３´ を用いてＰＣＲ産物に制限部位とＮ－末端の１ｘＨＡ－Ｔａｇが導入された。その後、ＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＭＩＧにクローニングした（ｐＭＩＧはＷｉｌｌｉａｍ Ｈａｈｎからの提供された（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ９０４４ ； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：９０４４ ； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿９０４４））。レトロウイルス粒子は、パッケージングプラスミドｐＵＭＶＣ（ｐＵＭＶＣはＢｏｂ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ （Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ８４４９）から提供された）およびｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇプラスミドｐＭＤ２．Ｇ （ｐＭＤ２．Ｇ は Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏ （Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ １２２５９； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：１２２５９ ； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿１２２５９） から提供された）と組み合わせて ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ （Ｍｉｒｕｓ）により一過性のトランスフェクションにより生産した。ウイルス上清はトランスフェクションの４８～７２時間後に採取し、遠心分離で清澄化し、１０％ＦＣＳとＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、最終濃度８μｇ／ｍｌ）を添加し、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ； ＳＬＨＰ０３３ＲＳ）でろ過した。細胞導入は、ＰＤＧＦβ細胞をウイルス上清と４８時間インキュベートすることで行った。 ｅＧＦＰ発現細胞は単一細胞ソートされた。
バルクＲＮＡシークエンス
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造者の指示書に従い抽出した。希釈した１ｎｇおよび１０ｎｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いたｒＲＮＡ除去ＲＮＡ－ｓｅｑでは、ＫＡＰＡ ＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ＲｉｂｏＥｒａｓｅ （Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） を用いて、製造者のプロトコルにしたがってシーケンスライブラリーを調製した。シーケンスライブラリーは、定量的ＰＣＲ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＵＳＡ）を用いて定量し、等モルプールし、最終プールは１，４ ｎＭに正規化し、０．２ Ｎ ＮａＯＨを用いて変性させ、シーケンス前に４００ｎＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０で中和した。最終的なシーケンスは、ＮｅｘｔＳｅｑプラットフォーム（ＩＩｌｕｍｉｎａ）を用いて、メーカーのプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ， ＣＡ， ＵＳＡ）に従って実施した。
ＡＴＡＣ－ｓｅｑの準備
５０００－７５００個のＰＤＧＦＲａ／ｂ ｐｏｓ細胞を、上記のように単離したばかりのＵＵＯ腎臓からＦＡＣＳ選別し、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、５００ｇで５分間遠心分離した。次に、細胞ペレットを５０μｌの氷冷溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ７．５； １０ｍＭ ＮａＣｌ， ３ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．０８％ ＮＰ４０ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ ［７４３８５， Ｓｉｇｍａ］， ０．０１％ Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ ［Ｇ９４４１， Ｐｒｏｍｅｇａ］ ）で溶解し、直ちに５００ｇで９分間遠沈した。ペレットを５０μｌのトランスポザーゼ反応ミックスに再懸濁し、２５μｌの２ｘＴＤバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ７．６， １０ｍＭ ＭｇＣｌ２， ２０％ ＤＭＦ）、 ０．５μｌ ｔａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ ｅｎｚｙｍｅ １ ［１５０２７８６５， Ｉｌｌｕｍｉｎａ］ および ２４．５μｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを加えた。サーモシェーカーで３７℃、３５０ｒｐｍで３０分間、トランスポジション反応をインキュベートした。その後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎｕｐ ｋｉｔ （２８２０４， Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトランスポーズＤＮＡを精製し、１５μｌのｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒで溶出した。ＮＥＢ Ｎｅｘｔ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Ｍ０５４１Ｓ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、カスタムＮｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ（合計１４サイクル）により、トランスポーズＤＮＡを増幅させた。最初のＰＣＲは、ＮＥＢ Ｎｅｘｔ ２ｘ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘと１．２５μＭカスタムプライマーを用いて５０μｌの容量で６サイクル行い、２回目のＲＴ－ＰＣＲは、５μｌ（１０％）の前増幅混合物と０．１２５μＭプライマーを用いて１５μｌ容量で２０サイクル行い、前述のように追加必要サイクルの数を決定した。増幅されたＤＮＡライブラリーはＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （２８００４， Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、２０μｌの１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ８）で溶出した。ライブラリーの品質は、２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＡｇｉｌｅｎｔ Ｄ１０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅで可視化した。ＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００にロードし、７５ｂｐペアエンドシーケンスを行った。
Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２データ処理
最初の単一細胞トランスクリプトームデータは、スウェーデン、ストックホルムのＳｃｉｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙで処理された。得られたリードをマウスゲノムのｍｍ１０ビルドにマッピングし（ｅＧＦＰおよびＥＲＣＣスパイクインセットの転写物と連結）、細胞あたりの各内在遺伝子、スパイクイン、ｅＧＦＰ転写物の数を算出した。リボソームＲＮＡ遺伝子、リボソームタンパク質、リボソーム偽遺伝子はフィルタリングで除外した。我々は、教師なし細胞クラスタリング（後述）の結果、ｅＧＦＰとＰＤＧＦＲｂのいずれにも割り当てられたアラインメントを特徴としない細胞が、単一のクラスターにまとまっていることに気づいた。そこで、それらの細胞を除去することを選択し、それらの細胞を考慮せずにすべての解析とクラスタリングを行った（１７細胞）。
１０ｘ 単一細胞ＲＮＡ－Ｓｅｑデータ処理
Ｆａｓｔｑファイルは、Ｇｅｎｃｏｄｅ ｖ２９ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅおよびＧｅｎｃｏｄｅ ｖＭ２０ ｍｏｕｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅを参照トランスクリプトームとして、ＡｌｅｖｉｎおよびＳａｌｍｏｎ（Ａｌｅｖｉｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ －ｌ ＩＳＲ， Ｓａｌｍｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ０．１３．１）を用いて処理した。Ａｌｅｖｉｎの期待値細胞パラメータは、細胞バーコードごとの読み取り回数分布に適用されるｋｎｅｅ－ｍｅｔｈｏｄに従って推定される細胞数の３倍に設定された。そのため、Ａｌｅｖｉｎが作成したＵＭＩカウントマトリックスには、後でフィルタリングできるような推定細胞が大量に含まれていた（次の段落参照）。
１０ｘ ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ細胞フィルタリング
リボソームＲＮＡ遺伝子（細胞あたりの検出ＲＮＡ量の平均０～１％）とミトコンドリアコード遺伝子（細胞あたりの検出ＲＮＡ量の平均０～８０％）をメイン遺伝子発現マトリックスから移動した。ミトコンドリア含有量の変化のみに依存する可能性のある細胞間の不要な変動を導入しないように、ミトコンドリアがコードする遺伝子は削除した。 Ａｌｅｖｉｎ（上記参照）が作成したカウントマトリックスからのｌｏｇ１０（ｔｏｔａｌ ＵＭＩ ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｃｅｌｌ）分布は、通常、二峰性分布を示したため、ｌｏｇ１０（ｔｏｔａｌ ＵＭＩ ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｃｅｌｌ）をｍｃｌｕｓｔ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖ５．４．３ でモデル名を「Ｅ」にして２クラスタに分類した。カウント数が多いクラスターに属する細胞を保持した次に、ミトコンドリアＲＮＡの含有量と高発現遺伝子への偏りから、以下のように細胞をフィルターにかけた：
（１） ｌｏｇ１０（細胞あたりのＵＭＩ総カウント）と細胞あたりのミトコンドリアＵＭＩのパーセントで学習した２成分を持つ二変量ガウス混合を用いて、細胞を２つのクラスターに分類した。クラスタリングは、ＲパッケージのＭｃｌｕｓｔでｍｏｄｅｌＮａｍｅｓを「ＥＩＩ」に設定して実施した。ミトコンドリア含有量の高いクラスターに該当する細胞は除外した。このフィルタリングは、ミトコンドリア含有量の明確な二峰性分布を示すライブラリ（本研究では３つの１０倍ライブラリのみ）に対してのみ行われた。
（２）細胞あたりのＵＭＩの総数は、ユニークな検出遺伝子の総数と相関している必要がある。この関係に従わない細胞（外れ値）は、ｌｏｇ１０（ｔｏｔａｌ ＵＭＩ ｃｏｕｎｔｓ）とｌｏｇ１０ ｔｏｔａｌ ｕｎｉｑｕｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｇｅｎｅｓの２変量ガウス混合モデルを用いて核をクラスタリングすることでフィルタリングし、ｍｃｌｕｓｔ Ｒパッケージでモデル名を「ＶＥＶ」「ＶＥＥ」と設定した。
（３） 上位５００遺伝子の総カウント数の割合が、全細胞の中央値偏差の絶対値の５倍以上である細胞を削除した。（４） 最後に、リボソームタンパク質と擬似遺伝子を主成分とする細胞を除外するため、リボソームタンパク質と擬似遺伝子の発現割合が他の細胞の絶対値中央値偏差の５以上である細胞を除外した。近位尿細管上皮細胞からのライブラリはミトコンドリアリード数が多いと予想されるため、ＣＤ１０＋ライブラリではミトコンドリアベースのフィルタリングは行わなかった。各ライブラリーの品質やＵＭＩ－ｃｅｌｌ－ｇｅｎｅの分布に依存するため、すべてのライブラリに対してすべてのフィルタリングステップを実行したわけではないことに注意する必要がある。
ヒト１０ｘ 単一細胞データ統合戦略
データを分析した結果、いくつかの点が明らかになった：（１）細胞タイプは、患者や状態（健康かＣＫＤか）を問わず、均等に存在することが保証されているわけではない。これは、１回の１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍの実行で捕捉される細胞の種類は、細胞のランダムサンプリングによって決定されるからである。（２） この分類は、分子データや制御されたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験ではなく、臨床パラメータに基づいているため、健常者とＣＫＤ患者の両方のサンプルは、健常状態と疾患状態の細胞で構成されている。健康な患者のサンプルと病気の患者のサンプルでは、主に健常細胞と疾患細胞の状態の割合が変化することが予想される。（３） 異なる患者のサンプルは、エシュバイル病院の手術スケジュールによって指示された異なる日に処理・準備された。そのため、技術的（バッチ的）な影響を実験側でコントロールすることはできなかった。（４）特定の細胞種が他の細胞種より有意に多く存在するため、クラス不均衡やデータセットのサイズ（細胞数）が、教師なしモジュール化ベースのグラフクラスタリング・アルゴリズムによるクラスタリング結果に影響する可能性があり、存在感の薄い細胞種の高解像度細胞クラスタを発見できる可能性がある。
実験戦略では、ＣＤ１０＋とＣＤ１０－の細胞分画から別々のライブラリを取得し、１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプロトコルによる細胞タイプの捕捉頻度レベルでのクラスの不均衡を緩和するように設計されている。上記の点をさらに緩和するために、（１）細胞タイプ間の関係に関するグローバルな情報はそのままに、ローカルレベルでデータをクラスター化すること、（２）細胞タイプの違いや疾患による細胞タイプの状態の違いといった重要な違いはそのままに、サンプル間の技術的（バッチ）差異の可能性を補正することを目指している。そのために、以下のステップで戦略を立てた：
ステップ１．品質管理および細胞フィルター（上記参照）の後、各１０ｘライブラリーの細胞を別々にクラスター化し、各細胞クラスターを６つの主要な細胞タイプのいずれかに割り当てた：ＣＤ１０＋上皮細胞、ＣＤ１０－上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞、間葉系細胞、神経細胞。
ステップ２．６つの主要な細胞タイプのそれぞれについて、すべての１０ｘライブラリの細胞を一緒に統合した。技術的な理由による細胞間のばらつきを補正し、教師なしグラフクラスタリングを用いて細胞をクラスタ化した。このプロセスにより、内皮、ＣＤ１０＋上皮、ＣＤ１０－上皮、間葉系、免疫、神経の６つのマップに分けられた。各マップは、複数の１０ｘライブラリの細胞で構成されている。
ステップ３．以下のの３つの単一細胞マップを統合した：（１） ＣＤ１０＋細胞（近位尿細管／図１）、（２） ＣＤ１０－細胞（近位尿細管枯渇／図１）、（３） ＰＤＧＦＲｂ＋細胞（間葉系／図２）を、ステップ２の各データセットの全ての主要細胞タイプ個別マップから単一細胞の発現（ＵＭＩカウント）とクラスタリング情報を組み合わせることにより算出。以後、本明細書のプロットはすべてこの３つの統合マップから再現される。
この手法により、局所的なクラスタリングと技術的なばらつきの除去を実現し、ばらつきの大きい細胞群のサイズに関わらず、高解像度で細胞状態の発見を可能にした。最小のクラスターは２４細胞、最大のクラスターは５３５５細胞で構成されている。「高レベルのクラスタリングに続いてサブクラスタリングを行う」アプローチと比較して、本アプローチは、データ駆動型の不偏的な方法で高解像度のクラスタを生成し、どのクラスタをサブクラスタリングするかという問題を完全に回避している。なお、Ｚｅｉｓｅｌらは、やや類似したデータ統合のアプローチをとっている。
全体として、このアプローチは生物学的な情報に基づいたものであり、ほぼすべての細胞クラスターが複数の患者／ライブラリーの細胞を含むように、細胞クラスター化の際に起こりうる技術的影響を補正することができた。一方で、病気の細胞状態（例えば、損傷近位尿細管細胞）、（筋）線維芽細胞の状態の違い、ＥＣＭ発現の違いといった患者間の興味深い違いは保存された。
マウス１０ｘ単一細胞データ統合戦略
マウスの１０ｘデータは、ヒトのデータについて説明したのと同じ方法で解析・統合した。統合地図の作成に使用したスクリプトは、こちらから参照することができる： https://raw.githubusercontent.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/master/make#intergrated#maps/mouse#PDGFRABpositive.r
マウスＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ２単一細胞データ統合戦略
単一細胞のプレートソーティングは、３つのタイムポイントからの細胞がすべてのプレートに等しく含まれるように行われたので、解析中にさらなるバッチ効果の緩和は行われなかった。可変遺伝子は、ＥＲＣＣ転写物に対してｔｒｅｎｄＶａｒ関数を実行した後、Ｓｃｒａｎ ＲパッケージのｄｅｃｏｍｐｏｓｅＶａｒ関数を用いて決定した６。ＦＤＲ値＜０．０１、生物学的分散成分＞１の遺伝子を高変動遺伝子として保持した。これらの可変遺伝子を用いて、１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍデータで説明したのと同じクラスタリングアプローチを行ったが、クラスタリングの反復は２回のみで、最近傍の数は変化させなかった。マウスＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ２データの解析に使用したスクリプトはこちらで参照することができる：
https://github.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/blob/master/make#intergrated#maps/mouse#PDGFRBpositive.r .
クラスターアノテーション
ＢｉｎａｒｉｚｅＭｅｔｈｏｄを「ａｄａｐｔｉｖｅＭｅｄｉａｎ」（Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２ Ｄａｔａ）または「ｎａｉｖｅ」（１０ｘ Ｄａｔａ）に設定して、ｇｅｎｅｓｏｒｔｅＲ ＲパッケージのｓｏｒｔＧｅｎｅｓ関数を使用して、クラスターごとの遺伝子ランキングを作成した。その後、予備知識や文献の情報をもとに、高分解能の細胞クラスターを手作業でアノテーションした。ＣＤ１０－データでは５０クラスタ、ＣＤ１０＋データでは７クラスタ、ＰＤＧＦＲｂ＋ヒトデータでは２６クラスタ、マウスＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ２データでは１０クラスタ、マウスＰＤＧＦＲａ＋／ｂ＋データでは１０クラスタがそのようなクラスタであった。このような高分解能のレベル（レベル３）では、細胞群は、真正の細胞タイプか、異なる細胞状態を表すかのどちらかである。そこで、これらの高分解能の細胞クラスターを、アノテーションに基づき、標準的な細胞タイプにグループ分けした。その結果、ＣＤ１０－マップでは２９種類の細胞、ＣＤ１０＋マップでは１種類の細胞、ＰＤＧＦＲｂ＋マップでは１６種類の細胞、マウスＰＤＧＦＲａ＋／ｂ＋マップでは５種類の細胞、Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ２マウスＰＤＧＦＲｂ＋マップでは６種類の細胞が得られた。さらに、データの解釈を容易にするため、細胞クラスターを上皮、内皮、間葉、免疫、神経のいずれかに分類し、プロットや図の注釈をつけた。
ＵＭＡＰと拡散マップ
統合フルマップＵＭＡＰ投影（図１、２、３、４、５）は、ＵＭＡＰ Ｐｙｔｈｏｎパッケージ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｍｃｉｎｎｅｓ／ｕｍａｐ）を用いて、ｆａｓｔＭＮＮから返された縮小補正次元で、ｍｉｎ＿ｄｉｓｔを０．６、近隣の数を細胞数の平方根に設定して生成した。ローカルＵＭＡＰ投影（図１、図４）は、ｍｉｎ＿ｄｉｓｔを１に設定し、より幾何学的に正確な埋め込みを行う傾向があるため、このパラメータで作成した（ｈｔｔｐｓ：／／ｕｍａｐ－ｌｅａｒｎ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｉｏ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／ 参照）。拡散マップは、Ｄｅｓｔｉｎｙ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｈｅｉｓｌａｂ／ｄｅｓｔｉｎｙ）を用いて、ｆａｓｔＭＮＮから返された縮小次元を入力として使用し、近傍の数を細胞数の平方根に設定した。ＵＭＡＰと拡散マップの様々なランダム化シード、および拡散マップの様々な距離メトリクス（Ｄｅｓｔｉｎｙ Ｒパッケージマニュアルで推奨）をテストし、結果として得られる単一細胞投影に定性的な違いが生じないことを確認した。
系統樹・軌跡と擬似時間
ＵＭＡＰ／拡散マップ投影に基づく系統樹推論と擬似時間細胞順序推論には、Ｓｌｉｎｇｓｈｏｔ Ｒパッケージを使用した。細胞クラスタリング（統合戦略からのステップ２、上記参照）を入力細胞クラスタとして使用した。開始クラスターと終了クラスターは、Ｓｔｒｅｅｔ ｅｔ ａｌ．で議論され推奨されているように、我々の事前知識から合理的な予想に基づいて選択された（例えば、筋線維芽細胞は、周皮細胞／線維芽細胞／筋線維芽細胞マップの終了クラスターである）。
擬似時間に沿った遺伝子ダイナミクス
細胞順序によって発現が変化する遺伝子は、ボンフェローニ・ホッホベルグ補正ｐ値０．００１のカットオフで、スペアマン相関係数によって定量化された、細胞順序と相関する正規化発現と定義された。遺伝子クラスターと発現ヒートマップ（例えば、図２ｆ上）は、ＳｌｉｎｇＳｈｏｔで予測された仮時間に沿って細胞を並べ、ｇｅｎｅｓｏｒｔｅＲ関数ｐｌｏｔＭａｒｋｅｒＨｅａｔを使用して作成した。この関数はｋ－ｍｅａｎｓアルゴリズムを用いて遺伝子をクラスタリングするもので、プロットとクラスタリングは疑似時間に沿って１０細胞ごとに平均化するように設定している。パスウェイエンリッチメントと細胞周期解析は、擬似時間に沿って２０００細胞ごとにグループ分けして算出した。
パスウェイエンリッチメントと遺伝子オントロジー解析
単細胞データについては、ＭＳｉｇＤＢ ３２７，２８ から２０１９年１１月にダウンロードしたＫＥＧＧパスウェイおよびＰＩＤパスウェイデータを「．ｇｍｔ」ファイルとして使用した。パスウェイエンリッチメント解析は、ｇｅｎｅｓｏｒｔｅＲパッケージのｓｏｒｔＧｅｎｅｓ関数で定義された各細胞クラスター／グループの上位１００遺伝子を用いて、ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ Ｒパッケージを用いて実施した。エンリッチャ機能は、ｍｉｎＧＳＳｉｚｅを１０、ｍａｘＧＳｉｚｅを２００に設定して使用した。各細胞クラスター／グループのｑ値による上位５項を－ｌｏｇ１０（ｑ値のヒートマップとしてプロットした。上位２００遺伝子について、同様の方法でＧｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ解析を実施した。エンリッチャ機能は、ｍｉｎＧＳＳｉｚｅを１００、ｍａｘＧＳｉｚｅを５００に設定して使用した。ＮＫＤ２＋間葉系細胞とＮＫＤ２－間葉系細胞のパスウェイ活性を比較するために、ベンチマーク研究から推奨されているように、モデルから最も反応の良い上位５００遺伝子を用いて、ＰＲＯＧＥＮｙで１４パスウェイの活性を単一細胞ベースで推定した。
細胞周期解析
細胞周期解析は、Ｍａｃｏｓｋｏ ｅｔ ａｌ．で使用され、Ｐｏ－Ｙｕａｎ Ｔｕｎｇによるチュートリアル（https://jdblischak.github.io/singleCellSeq/analysis/cell-cycle.html, date: 06-07-2015）で説明されている方法に従い、入力として正規化遺伝子発現を用い、遺伝子相関値を ０．１ に設定した。Ｙａｎｇらから提供された細胞周期遺伝子セットを使用した。単一細胞の周期割り当てのエンリッチメント／ディプリーションを定量化するために（図１ｇ）、行と列の合計を一定に保ちながら真の周波数行列を１０００回無作為化して得られた平均周波数に対する、これらの周波数のｌｏｇ２倍率変化をプロットした。無作為化はＲパッケージのＶｅｇａｎ（https://CRAN.R-project.org/package=vegan）を用いて実施した。正の数は、偶然に予想されるものに対してエンリッチメントされていることを示し、負の数はディプリーションしていることを示す。
ＥＣＭおよびコラーゲンスコア
Ｎａｂａらに提供されたコアマトリソーム遺伝子の発現を、細胞周期解析に用いたのと同じ方法で正規化した遺伝子発現データに基づいてまとめた。
遺伝子発現ヒートマップ
図２ｄのようなスケール付き遺伝子発現ヒートマップは、ｇｅｎｅｓｏｒｔｅＲ ＲパッケージのｐｌｏｔＭａｒｋｅｒＨｅａｔおよびｐｌｏｔＴｏｐＭａｒｋｅｒＨｅａｔ関数を使用して作成した。図３ｄのような発現細胞の割合のヒートマップは、ｇｅｎｅｓｏｒｔｅＲ ＲパッケージのｐｌｏｔＢｉｎａｒｙＨｅａｔ関数を用いて作成した。図５ｊ，ｋのような特徴のｌｏｇ２倍率変化とエンリッチメントを示すヒートマップは、ＣｏｍｐｌｅｘＨｅａｔｍａｐ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ （ｖ．２．４．２） を用いて作成した。
ＡＴＡＣ－Ｓｅｑ解析
イルミナＴｎ５アダプター配列は、ＢＢｍａｐ ｓｕｉｔｅのｂｂｄｕｋコマンド（バージョン３８．３２、設定：ｔｒｉｍｑ＝１８、ｋ＝２０、ｍｉｎｋ＝５、ｈｄｉｓｔ＝２、ｈｄｉｓｔ２＝０）を用いてＡＴＡＣ－Ｓｅｑリードからトリミングした。ＳＴＡＲ（ｖｅｒｓｉｏｎ２．７．０ｅ）を用いて、ＡＴＡＣ－Ｓｅｑリードをｍｍ１０ゲノムアセンブリにマッピングし、一意にマッピングされたペアのみを保持した（設定：AlignEndsType EndToEnd, alignIntronMax 1, alignMatesGapMax 2000, alignEndsProtrude 100 ConcordantPair, outFilterMultimapNmax 1, outFilterScoreMinOverLread 0.9, outFilterMatchNminOverLread 0.9）。配列の重複を除去するために、ＰｉｃａｒｄのＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓコマンド（バージョン２．１８．２７）を使用した（設定：ｒｅｍｏｖｅ＿ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓ＝ＴＲＵＥ， ｈｔｔｐ：／／ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｉｃａｒｄ／）。次に、Ｓａｍｔｏｏｌｓ（バージョン１．３．１）３９を使用して、一致しないリードペアをＢＡＭファイルから削除した。 ｂｅｄｔｏｏｌｓ （ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１７．０） を用いてＢＡＭファイルをＢＥＤファイルに変換し、Ｔｎ５－ＤＮＡ接触部の立体障害４１を考慮し、各リードをリード５´－エンドから上流１５ｂｐ、下流２２ｂｐに鎖状に延長した４０。ＪＡＭＭ（バージョン１．０．７ｒｅｖ５）を用いて、最終的なＢＥＤファイルからオープン領域を特定し、２つのレプリケートを分けて、幅５０ｂｐ以上のピークを全リストに残し、さらに解析した（パラメータ：-r peak, -f 38,38, -e auto, -b 100)42。ATAC-Seq signal bigwig ファイルは、JAMM SignalGenerator pipeline (settings: -f 38,38 -n depth) を用いて作成した。
バルクＡＴＡＣ－ＳｅｑデータからｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑのクラスタリングに従ってＡＴＡＣ－Ｓｅｑシグナルをデコンボリューションするために、以下の戦略を行った。ＡＴＡＣ－Ｓｅｑシグナルをデコンボリューションするために、データ解析の３つの主要なステップがとられた：
１） 各オープンクロマチンのピーク（ＴＦがＤＮＡと結合すると予想される場所）は、まず特定の遺伝子に割り当てられた。
２） これらの遺伝子を、単細胞ＲＮＡ－Ｓｅｑデータセットにおける発現量に応じて、ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑクラスター（Ｆｉｂ、ＭＦ１／２など）ごとにランク付けした。
３） 上位２０００個のＡＴＡＣピークを使用して、濃縮された転写因子モチーフ配列を同定した。
より詳細には、各オープンクロマチンＡＴＡＣ－Ｓｅｑピークは、１００ｋｂを最大可能な割り当て距離として設定し、ｂｅｄｔｏｏｌｓ ｃｌｏｓｅｓｔ関数を使用して、最も近いアノテーション転写開始部位に従って遺伝子に割り当てられた。ｓｃＲＮＡ－ＳｅｑクラスターごとのＡＴＡＣ－Ｓｅｑピークランキングは、単細胞ＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターにおける割り当てられた遺伝子の順位に従ってピークをランク付けすることで得られた。各ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターの上位２０００個のＡＴＡＣ－Ｓｅｑピークを選択し、ＸＸモチーフを使用して、各ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターのオープンクロマチン領域を別々にｄｅ ｎｏｖｏモチーフ探索した（設定：--revcomp --merge-motif-threshold MEDIUM）。ＸＸモチーフで定義された出現率が５％以上のモチーフだけを、さらなる解析のために残しておいた。各単独細胞ＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターの上位２００遺伝子に割り当てられたピークにおいて、ＦＩＭＯ４４を用い、デフォルトパラメータ（ＭＥＭＥバージョン５．０．１）で４つのｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターからの全モチーフの出現率を定量化した。これにより、ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターにおけるモチーフの出現頻度マトリックスが作成された。ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターにおけるモチーフ出現のエンリッチメント／ディプリーションを定量化するために、行と列の合計を一定に保ちながら真の頻度行列を１０００回無作為化して得られた平均頻度に対するそれらの頻度のｌｏｇ２倍率変化をプロットする。無作為化はＲパッケージのＶｅｇａｎ（https://CRAN.R-project.org/package=vegan）を用いて実施した。正の数は、偶然に予想されるものに対してエンリッチメントされていることを示し、負の数はディプリーションしていることを示す（図４ｋ参照）。Ｉｒｆ８、Ｎｒｆ、Ｃｒｅｂ５／Ａｔｆ３、Ｅｌｆ／Ｅｔｓ、Ｋｌｆを選択し、さらに調査を行った。ＪＡＭＭが生成したｂｉｇｗｉｇファイルを入力として、ＤｅｅｐＴｏｏｌｓバージョン３．３．１を用いて、それらのモチーフを含む全ピークのシグナルをプロットした。同じｂｉｇｗｉｇファイルとモチーフの発生状況をＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒで可視化した。
その他の可視化・解析
遺伝子発現を定量化しないヒートマップは、ｇｐｌｏｔｓ Ｒパッケージのｈｅａｔｍａｐ２関数を用いて作成した(https://CRAN.R-project.org/package=gplots)。Ｖｉｏｌｉｎ Ｐｌｏｔはｖｉｏｐｌｏｔ Ｒパッケージ(https://CRAN.R-project.org/package=vioplot)を用いて作成した。
単一細胞シーケンスデータ以外で使用される定量化・統計解析
データは、凡例で特に指定がない場合、平均値±ＳＥＭで表示されている。２群間の比較は、無対称のｔ－ｔｅｓｔを用いて行った。複数グループの比較には、ボンフェローニの多重比較検定による一元配置分散分析、またはシダックの多重比較検定による二元配置分散分析が適用された。統計解析は、GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) を用いて行った。ｐ値が０．０５未満を有意と判断した。
遺伝子制御ネットワーク解析
遺伝子発現は遺伝子ごとにｌ１スケールされ、周皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞の単細胞に沿ってＮｋｄ２と他のすべての遺伝子との間でパールソン相関係数が計算された。上位１００個の相関遺伝子と上位１００個の反相関遺伝子を選択し、パスウェイエンリッチメント解析を行った。さらに、これらの２００の遺伝子の単一細胞での発現をＧＲＮｂｏｏｓｔ２＋ ｐｙｔｈｏｎパッケージの入力として使用し、遺伝子間の推定制御リンクを予測した。出力されたネットワークは、強度＜＝１０の接続を除去することでフィルタリングされた。得られたネットワークは、ｇｇｒａｐｈパッケージ(https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/ index.html)を用いて無向ネットワークとしてプロットし、ｉｇｒａｐｈパッケージで実装されているＬｏｕｖａｉｎアルゴリズムを用いて４つのモジュールにクラスタリングした。
単一細胞データから転写因子を予測する
遠位領域と近位領域の転写因子スコアを得るために、線維芽細胞、周皮細胞、筋線維芽細胞クラスターの上位２００個のマーカー遺伝子をＲＣｉｓＴａｒｇｅｔの入力遺伝子リストとして使用した。ＲＣｉｓＴａｒｇｅｔ Ｖｉｇｎｅｔｔｅに従い、デフォルトのパラメータで解析を実施した(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ RcisTarget/inst/doc/RcisTarget.html にて利用可能）．ＡＰ１発現を定量化するために、ＪｕｎとＦｏｓの全遺伝子を遺伝子セットとして使用し、ＥＣＭスコアと同じ方法を適用してＡＰ１スコアを求めた。ＡＰ１活性（推定標的遺伝子の発現量と定義）を定量化するため、Ｄｏｒｏｔｈｅａ ｒｅｇｕｌｏｎデータベースに従ってＡＰ１標的遺伝子を定義し、ＥＣＭスコアと同様の方法を適用して単一細胞ＡＰ１活性スコアを求めた。
マウスによる教師あり細胞分類
ヒトＰＤＧＦＲｂ＋データセットをリファレンスとして、マウスＰＤＧＦＲａ＋ｂ＋データセットの単一細胞をＣＨＥＴＡＨアルゴリズムでデフォルトパラメータで分類した。ヒトの遺伝子記号は、ｂｉｏｍａＲｔデータベースを用いてマウスの遺伝子記号に変換している。
ＣｅｌｌｐｈｏｎｅＤＢ解析
ＣｅｌｌＰｈｏｎｅＤＢ（ｖ．２．１．１）を用いて、データベースのバージョン２．０．０、正規化した遺伝子発現を入力とし、デフォルトパラメータ（リガンド／レセプターを発現する細胞の１０％）でヒトＣＤ１０－画分に見られる細胞タイプ間の細胞間相互作用を推定した。ｐ値＜０．０５の交互作用は有意とみなした。データベースからのアノテーションに基づき、相互作用ペアのうち唯一かつ少なくとも一方のパートナーが受容体であったリガンド－受容体相互作用のみを考慮し、受容体－受容体や受容体が明確でないその他の相互作用は除外している。腎臓の線維化に関与する経路からのリガンド・リセプター相互作用は、ヘッジホッグ、ノッチ、ＴＧＦｂ、ＷＮＴシグナルについてはＫＥＧＧデータベースから、ＥＧＦＲシグナルについてはＭＳｉｇＤＢ ３からＲＥＡＣＴＯＭＥデータベースからのメンバーシップを、ＰＤＧＦシグナルについてはマニュアルキュレーションを用いて選択した。
バルクＲＮＡ－Ｓｅｑデータ解析
Ｓａｌｍｏｎ ｖ１．１．０を用い、－－ｖａｌｉｄａｔＭａｐｐｉｎｇｓと－－ｇｃＢｉａｓパラメータをオンにした状態で、ヒトＧｅｎｃｏｄｅ ｖ２９トランスクリプトームに対して遺伝子発現を転写レベルで定量化した。トランスクリプトレベルのカウントは、ｔｘｉｍｐｏｒｔ Ｒパッケージのｉｍｐｏｒｔを使用して、ｃｏｕｎｔｓＦｒｏｍＡｂｕｎｄａｎｃｅを ”ｌｅｎｇｔｈＳｃａｌｅｄＴＰＭ ”に設定して、遺伝子レベルのカウントに集約した。Ｌｉｍｍａ Ｒパッケージ（ｖ．３．４４．１）を用いて、Ｎｋｄ２－ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ ｈｕｍａｎ ｋｉｄｎｅｙ ＰＤＧＦＲｂ＋とそのコントロールとの間の遺伝子発現の差異を、ｖｏｏｍ変換後の経験ベイズ法を用いて検定した。その結果、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ＮＫＤ２ノックアウトの３クローンのうち２クローンは主成分分析で一緒にグループ化し、浅い（ｓｈａｌｌｏｗ）表現型を示し、３クローンは独立してグループ化し、より重い（ｓｅｖｅｒｅ）表現型を示すことが分かった。そこで、最初の２つのクローンのノックアウトをグループ化し、独立した２つのノックアウト条件で統計的対比を行った。差次的発現遺伝子は、パスウェイおよび遺伝子オントロジー解析の統計検定によるｍｏｄｅｒａｔｅｄ ｔ－ｓｔａｔｉｓｔｉｃでランク付けした。Ｐ値はＢｅｎｊａｍｉｎｉ ＆ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて多重検定のために調整した。ＦＤＲ＜０．０５の遺伝子とパスウェイは有意とみなした。
また、パスウェイと遺伝子オントロジー解析には、ＫＥＧＧとＰＩＤパスウェイを用いたｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ Ｒパッケージを用い、Ｎｋｄ２－ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ細胞においてコントロールと比較して調整ｐ値が０．０１未満で、ノックアウト比較では絶対ｌｏｇ倍率変化が１以上（過剰発現比較では０以上）、最大２００遺伝子で調整ｐ値によりランク付けした遺伝子を使用した。表現型におけるＥＣＭ遺伝子のエンリッチメントを調べるために、ＧＳＥＡ－ｐｒｅａｎｋｅｄを用い、ＭａｔｒｉｓｏｍｅＤＢ遺伝子セットコレクションを用いて、ｆｇｓｅａ Ｒ ｐａｃｋａｇｅ （ｖ．１．１４．０）５４を使用した。
実施例２：ヒト慢性腎臓病の単一細胞アトラス
ヒト腎臓のどの常在細胞が恒常性と慢性腎臓病の間に細胞外マトリックスを分泌するかを理解するために、我々はヒト腎臓の単一細胞マップを作成し、特に尿細管間質に焦点を当てた。腎皮質細胞の８０％以上は近位尿細管上皮細胞であるため、これまでの腎臓の単一細胞マップでは、他の腎臓細胞区画の重要な不均一性を覆い隠してしまう傾向があった。そこで、生きた（生存している）非近位尿細管上皮細胞（すなわち、膜メタロエンドペプチダーゼ（ＭＭＥ）としても知られるＣＤ１０陰性細胞）をエンリッチするソーティング戦略を選択したが、腎臓全体を偏りなくマッピングするために、生きたＣＤ１０＋近位尿細管上皮画分をソーティングすることもした。なお、ＣＤ１０は他の細胞種にも発現しているため、これは非排他的なソーティング戦略である。しかし、近位尿細管上皮細胞のエンリッチメント／ディプリーションを可能にする。高血圧に起因する腎硬化症の異なるステージのＣＫＤ患者（ｎ＝７； 推定糸球体濾過量、ｅＧＦＲ＞６０およびｎ＝６； ｅＧＦＲ＜６０）合計１３人のＣＤ１０＋およびＣＤ１０－画分の両方を、ｓｃＲＮＡｓｅｑに供した。１１名の患者（ｎ＝７ ｅＧＦＲ＞６０； ｎ＝４ ｅＧＦＲ＜６０，）から５３，６７２個のＣＤ１０－細胞をプロファイリングした。ｅＧＦＲ＜６０の患者では、間質性線維化と尿細管萎縮の増加が見られた。患者間のデータを統合するために、教師なしグラフベースのクラスタリング法（方法参照）を採用し、両方のｅＧＦＲグループで表される５０種類のＣＤ１０－細胞クラスター（図１ａ～ｄ）を特定した（図１ｅ）。我々のソーティングとデータ統合戦略により、シュワン細胞など、これまでの腎臓単一細胞マップに記載されていない希少な細胞タイプの同定を含め、腎臓間質における不均一性の全容を理解することができた（図１ａ－ｄ）。
合計３３，６９０個のＣＤ１０＋近位尿細管細胞がプロファイルされ（８人の患者（ｎ＝５；ｅＧＦＲ＞６０、ｎ＝３；ｅＧＦＲ＜６０）から）、７つのクラスターに分けられた（図１ｆ）。ＣＤ１０＋近位尿細管細胞クラスターの細胞周期解析では、ＣＫＤでは上皮の修復反応を反映していると考えられる細胞周期が増加していることが示された（図１ｇ）。ＣＤ１０＋細胞におけるＫＥＧＧパスウェイ解析と遺伝子オントロジーの用語は、ＣＫＤにおける他の様々な代謝異常経路の中で脂肪酸代謝の増加を示唆していた（図１ｈ）。脂肪酸代謝は、ヒトやマウスの腎臓において、尿細管脱分化や線維化を引き起こす重要な調節不全経路として報告されている（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１５）。
このように、ヒトの腎臓の恒常性とＣＫＤの高解像度マップを作成し、ヒトＣＫＤにおけるＥＣＭの細胞起源を調べることができるソート戦略を採用した。
実施例３：ヒト慢性腎臓病における細胞外マトリックスの起源
ヒト腎臓の線維化が進行する過程で、どの細胞タイプが細胞外マトリックス（ＥＣＭ）産生に寄与するかを理解するため、コラーゲン、糖タンパク質、プロテオグリカンなどのコアＥＣＭ分子の発現をまとめた単一細胞ＥＣＭ発現スコアを確立した。我々は、糖尿病性腎症患者３６名の公表データセット（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ ２０１９）でこのスコアを検証し、進行したＣＫＤでＥＣＭスコア値が上昇することを確認した。
ＥＣＭスコアは、ＣＫＤにおいて高ＥＣＭ発現細胞への明確なシフトを示した（図１ｉ）。次に、恒常性とＣＫＤにおける主要な細胞タイプのＥＣＭスコアを比較したところ、ＥＣＭ発現量が最も高い細胞として間葉系細胞を特定し、ＣＫＤではＥＣＭ発現量がさらに増加することを明らかにした。ＣＫＤでは、どの間葉系サブクラスターでもＥＣＭの発現が有意に増加することはなかったが、すべての線維芽細胞および筋線維芽細胞集団がＣＫＤで拡大し、間葉系で観察されるＥＣＭ遺伝子発現が全体的に増加することを説明している（図１ｋ－ｌ）。歴史的には、ＡＣＴＡ２が筋線維芽細胞マーカーとして使用されていた。しかし、ＥＣＭの発現は線維化の特徴であることから、筋線維芽細胞をほとんどのＥＣＭ遺伝子を発現する細胞と定義した。ＥＣＭの発現が増加するもう一つの重要なメカニズムは、個々の細胞の拡大以外に、細胞がＥＣＭを多く含む筋線維芽細胞へと分化することである。ヒトＣＫＤにおけるＥＣＭを発現する間葉系集団の不均一性と推定される分化過程をさらに調べるため、（筋）線維芽細胞と周皮細胞のＵｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）包埋を作成した（図１ ｍ－ｎ）。このＵＭＡＰの埋め込みは、教師なしグラフクラスタリングの結果（図１ｂ－ｃ）と一致し、これまであまり認識されていなかったヒト腎間充織（ヒト腎臓間葉系組織）の異質性を浮き彫りにした。筋線維芽細胞は、ペリオスチン（ｐｏｓｔｎ）を発現する細胞群として明確に確認された（図１ｎ）。拡散マッピングは、細胞同士が分化のような拡散プロセスによって関係すると仮定した次元削減手法である。この方法を用いて、筋線維芽細胞への推定分化機構を解明した。ＥＣＭの発現量が最も多い間葉系細胞を拡散マップ包埋したところ、筋線維芽細胞は周皮細胞や線維芽細胞から発生することが示唆された（図１ｏ）。
上皮細胞では、ＥＣＭ遺伝子のわずかなアップレギュレーションが観察され（図１ｊ）、長年腎臓学会で議論されてきた上皮間葉系移行（ＥＭＴ）の寄与が小さいことが示唆された。損傷近位尿細管上皮（ｉＰＴ）は、ＣＤ１０－上皮の中で最もＥＣＭ遺伝子の発現量が多く、様々な発現遺伝子やＧＯタームが通常の上皮との脱分化を示唆していた。ＣＤ１０＋画分（すべて選別された近位尿細管上皮）においても、ＣＫＤにおけるＥＣＭ発現のわずかな増加が観察された。なお、傷害を受けた細胞は、近位尿細管上皮ではＳｏｘ９、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、内皮ではＶＣＡＭ１、ＡＣＫＲ１など、傷害関連として報告されている遺伝子の発現によって定義した。
これらのデータから、ヒト腎臓の線維化に伴って生成されるＥＣＭの大部分は、複数の異なる間葉系細胞サブタイプに由来し、脱分化した尿細管上皮細胞からの寄与はごくわずかであることが示された。
実施例４：ヒト腎線維症における筋線維芽細胞の主要な供給源は、異なる周皮細胞と線維芽細胞のサブポピュレーションである
ＣＤ１０－ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータから、Ｃｏｌ１ａ１発現細胞の大部分はＰＤＧＦＲｂ＋であることが示された。そこで、８人のヒト腎臓（ｎ＝４；ｅＧＦＲ＞６０、ｎ＝４；ｅＧＦＲ＜６０）から３７，３８０個のＰＤＧＦＲｂ＋細胞を選別した。教師なしクラスタリングにより、間葉系細胞集団と一部の上皮系、内皮系、免疫系細胞が同定され（図２ａ－ｄ）、ＣＤ１０－集団との相関関係に従って注釈が付けられた。コラーゲン、およびＥＣＭ遺伝子全般の発現は、ＣＤ１０－データと一致して、周皮細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞のクラスターで優勢だった（図１ｊ－ｋ）。しかし、マクロファージ／単球、内皮、傷害上皮の集団の一部もコラーゲン１ａ１とＰＤＧＦＲｂを発現したが、間葉系細胞よりはるかに低いレベルだった（図２ａ－ｃ）。二重尤度スコアの計算予測では、内皮細胞や損傷上皮細胞では特に高いスコアは出なかったが、マクロファージ集団では若干スコアが上がった。ＬＴＡ＋ 近位尿細管、ＣＤ６８＋ マクロファージ、Ｐｅｃａｍ－１＋ 内皮細胞におけるＣｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡの発現をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）により確認した。これらのデータは、腎筋線維芽細胞プールへの非間葉系細胞の寄与に関する文献上の論争（Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ２０１４； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１７）をある程度説明できるかもしれない。なぜなら、これらの非間葉系細胞タイプでは、ＥＣＭ遺伝子発現の大部分が間葉系細胞由来であるのに、実にわずかなＥＣＭ遺伝子発現しか認められなかったからである。
ＰＤＧＦＲｂ＋集団からＥＣＭを発現する主要な細胞サブタイプの疑似時間軌跡と拡散マップ解析により、ヒト腎臓における筋線維芽細胞の３つの主要な供給源が示された：１）Ｎｏｔｃｈ３＋／ＲＧＳ５＋／ＰＤＧＦＲａ－周皮細胞、２）Ｍｅｇ３＋／ＰＤＧＦＲａ＋線維芽細胞、３）Ｃｏｌｅｃ１１＋／ＣＸＣＬ１２＋線維芽細胞（図２ｅ）。注目すべきは、拡散マッピングにより、非ＣＫＤ細胞は主に低ＥＣＭ発現の周皮細胞と線維芽細胞集団内に位置し、低ＥＣＭの非ＣＫＤ間葉系細胞（周皮細胞と線維芽細胞）から高ＥＣＭのＣＫＤ筋線維芽細胞へ分化する可能性を示している（図２ｅ）。これらの間葉系細胞のＵＭＡＰ埋め込みも、これらの結果と一致した。これは、腎臓の線維化において、ＥＣＭやＰｏｓｔｎを発現する筋線維芽細胞への分化と一致するものである。この予測された方向性をヒト腎臓のＩＳＨで検証したところ、腎臓の線維化でＰｏｓｔｎ発現細胞数が増加し（図２ｆ）、Ｍｅｇ３＋細胞数が減少していることが確認された。ＩＳＨを用いて、Ｎｏｔｃｈ３＋周皮細胞（系統１）とＭｅｇ３＋線維芽細胞（系統２）からなる拡散マップ解析の主要系統をさらに検証した（図２ｆ）。その結果、Ｍｅｇ３＋細胞とＮｏｔｃｈ３＋細胞の両方がＰｏｓｔｎを共発現し、筋線維芽細胞への分化が確認された（図２ｆ）。興味深いことに、拡散マップの中央には、Ｎｏｔｃｈ３／Ｍｅｇ３／Ｐｏｓｔｎを共発現する中間段階の細胞が観察され、分化する細胞を表していると思われる（図２ｆ）。次に、同定された間葉系サブポピュレーションが空間的にも異なるかどうかを評価した。線維芽細胞１（Ｍｅｇ３＋）、周皮細胞（Ｎｏｔｃｈ３＋）、線維芽細胞２（Ｃｘｃｌ１２＋）の明確な空間的局在は観察されなかったが、予想通り線維化領域に筋線維芽細胞１（Ｐｏｓｔｎ＋）が豊富に存在することが確認された。興味深いことに、ヒトの腎臓の線維化で増加する筋線維芽細胞３（Ｃｃｌ１９＋／Ｃｃｌ２１＋）は、糸球体周辺で明確なエンリッチメントを示した。
次に、周皮細胞から筋線維芽細胞への分化（系統１）の遺伝子発現プログラムを解析した（図２ｇ）。細胞周期解析では、分化過程と筋線維芽細胞集団の拡大の両方に一致する、深い変化が示された（図２ｇ）。周皮細胞から筋線維芽細胞への分化をよりよく理解するために、擬似時間に沿ってパスウェイのエンリッチメントを並べた。他の経路の中でも、初期（ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｗｎｔ、Ｍｙｃ、ＡＰ１）、中間（ＡＴＦ２、ＰＤＧＦＲａ、Ｍｙｃ）、後期（インテグリン、ＥＣＭ受容体相互作用、ＴＧＦｂ）シグナルが観察された（図２ｇ下）。
周皮細胞から筋線維芽細胞への分化と同様に、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化においても、細胞周期の停止とそれに続く増殖の増加が観察された（系統２および３）。擬似時間順に並べたパスウェイのエンリッチメントでは、初期のＡＰ１シグナル、炎症および免疫細胞相互作用パスウェイが強調され、次いでインテグリンシグナル、フォーカルアドヒージョンおよびＥＣＭ相互作用パスウェイが続く。
系統２の擬似時間解析では、ＴＧＦｂシグナルが優勢であった（図２ｇ）。完全に分化した筋線維芽細胞を表すと思われる筋線維芽細胞１は、ＴＧＦｂリガンドを高レベルで、ＴＧＦｂレセプターを低レベルで発現していた。しかし、線維芽細胞１ではその逆の結果が得られ、筋線維芽細胞が線維芽細胞の分化を促進するメカニズムがあることが示唆された。
上記の経路の多くは、インテグリン２７、またＡＰ１転写因子シグナル（Ｗｅｒｎｉｇ ｅｔ ａｌ ２０１７）を含む線維化の重要な制御因子であることが知られており、これらは、周皮細胞と線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化の両方の初期段階において一貫して非常に活性であることが観察された。線維芽細胞および筋線維芽細胞集団の転写制御をさらに理解するために、様々な間葉系集団のマーカー遺伝子のプロモーターおよび遠位領域において転写因子ＤＮＡ配列モチーフのエンリッチメント解析を行った。このことから、線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化において、ＡＰ－１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）が重要な制御を担っている可能性があることが明らかになった。ＡＰ１の役割を機能的に検証するため、レンチウイルスｈＴＥＲＴ， ＳＶ４０ＬＴ導入により、新規ヒトＰＤＧＦＲｂ＋腎臓細胞株を作製した。アクチベーター・プロテイン１（ＡＰ１）を薬理学的に阻害すると、増殖が著しく低下し、オステオグライシン（Ｏｇｎ）の発現が減少する一方、Ｐｏｓｔｎの発現は増加し、これらの細胞の筋線維芽細胞分化を示唆した。注目すべきは、ヒトＰＤＧＦＲｂのデータでは、Ｏｇｎは線維芽細胞１／３を、Ｐｏｓｔｎは筋線維芽細胞１をマークしたことである。これらの結果と一致して、ＡＰ１発現は、線維芽細胞および筋線維芽細胞の両方において、コラーゲン発現と負の相関がある。興味深いことに、ＡＰ１の推定標的遺伝子の発現は、筋線維芽細胞におけるコラーゲン発現と正の相関があり、ＡＰ１が抑制因子として働く可能性を示していた。また、どの細胞タイプが主要なＥＣＭ発現間葉系細胞（線維芽細胞、周皮細胞、筋線維芽細胞）と相互作用するかを解明するために、リガンド・レセプター解析（Ｅｆｒｅｍｏｖａ ｅｔ ａｌ ２０２０）を実施した。健康な近位尿細管上皮からのシグナル伝達が最も少ないことが観察された一方で、傷ついた近位尿細管上皮は、腎臓線維症の特徴である尿細管－間質シグナル伝達と一致して、間質へのシグナル伝達パートナーの上位に入っていた（Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ ２０１５）．ＴＧＦｂ、ＰＤＧＦＲａ／ｂ、Ｎｏｔｃｈ、ＥＧＦＲ、ＷＮＴシグナルなど、線維化のキープレイヤーであると言われている経路からの相互作用に注目した（Ｋｒａｍａｎｎ ａｎｄ ＤｉＲｏｃｃｏ ２０１３）。これらの経路の中で、傷ついた近位尿細管から間葉系線維化促進細胞へのＮｏｔｃｈ、ＴＧＦｂ、Ｗｎｔ、ＰＤＧＦａのシグナル伝達が観察された。
つまり、Ｎｏｔｃｈ３＋／ＰＤＧＦＲａ－周皮細胞、Ｍｅｇ３＋／ＰＤＧＦＲａ＋線維芽細胞、Ｃｏｌｅｃ１１＋／Ｃｘｃｌ１２＋線維芽細胞の３つの細胞ソースが、ＰＤＧＦＲｂによって特徴づけられ、その分化プロセスに光を当てている。
実施例５：ヒトおよびマウスの腎臓線維症において、二重陽性ＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋間葉系細胞がＥＣＭ発現細胞の大半を占める
我々は、マウスの遺伝的運命追跡を利用して、上記で紹介した知見をさらに掘り下げた。ＰＤＧＦＲｂＣｒｅＥＲ－ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにタモキシフェンをパルス投与し、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）手術を行い、１０日目に犠牲とした（図３ａ）。Ｃｏｌ１ａ１ ｍＲＮＡのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）により、マウス腎臓線維症における実質的に全てのＣｏｌ１ａ１発現細胞がＰＤＧＦＲｂ系列由来であることが確認された（図３ｂ－ｃ）。さらに、歴史的に使用されている筋線維芽細胞マーカーａＳＭＡ（ＡＣＴＡ２）の免疫染色により、ａＳＭＡを発現する細胞の大半がＰＤＧＦＲｂ系由来であることが確認された。次に、ＰＤＧＦＲｂ－ｅＧＦＰマウス（Ｐｉｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１４）を用いてＳｍａｒｔＳｅｑ２ベースのｓｃ－ＲＮＡ－ｓｅｑタイムコース研究を実施した（図３ｄ－ｅ）。ＵＵＯ後、平滑筋細胞と周皮細胞は経時的に存在量が減少するが、メサンギウム細胞とＣｏｌ１ａ１＋／ＰＤＧＦＲａ＋マトリックス産生細胞クラスターは経時的にかなり増加した（図３ｆ－ｇ参照）。ヒト腎臓のデータセット（図１，２）と同様に、主要なＥＣＭ発現細胞集団は、ＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂの二重発現と、デコリン（ＤＣＮ）およびペリオスチン（Ｐｏｓｔｎ）の発現によって定義されている（図３ｇ－ｈ）。さらに、周皮細胞と血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣｓ）は、若干のＥＣＭ発現を示したが、ＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂの二重集団に比べると有意に低いレベルであった。
マウスでの免疫染色とＩＳＨにより、Ｃｏｌ１ａ１発現細胞がＰＤＧＦＲａ＋とＰＤＧＦＲｂ－ｔｄＴｏｍａｔｏの二重陽性であることが確認された（図３－ｊ）。これは、ＰＤＧＦＲａ＋／ｂ＋発現細胞を選択するとＣｏｌ１ａ１＋細胞が濃縮されるというヒトＣＤ１０－データと一致し、ＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂ発現細胞がＥＣＭ発現の主要な供給源であることが確認された（図３ｋ）。我々は、６２人の患者の組織マイクロアレイにマルチプレックスＩＳＨを使用して、より大規模なヒトコホートでこの所見を確認した（図３ｌ）。マトリックス産生細胞と周皮細胞の拡散マップ埋め込みは、我々のヒトＰＤＧＦＲｂのデータとも一致し、周皮細胞（ＰＤＧＦＲｂ＋， ＰＤＧＦＲａ－， Ｎｏｔｃｈ３＋）が主要ＥＣＭ産生細胞（ＰＤＧＦＲｂ＋， ＰＤＧＦＲａ＋， Ｃｏｌ１ａ１＋， Ｐｏｓｔｎ＋）の起源の一つであることが示唆された。
このＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋二重陽性間葉系細胞は、線維芽細胞や筋線維芽細胞の集団を含み、周皮細胞由来の筋線維芽細胞は含むが非活性化周皮細胞（すなわちＥＣＭ遺伝子高発現を示さない周皮細胞）は含まない（図２ｅ）、ヒトおよびマウス腎臓線維症におけるＣｏｌ１ａ１発現細胞の大半を占めることが明らかにされた。
実施例６：ＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋細胞はヘテロジニアスであり、異なる線維芽細胞状態を含む

次に、線維芽細胞から筋線維芽細胞への移行に関するメカニズム的な洞察を得るため、またＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋集団の不均一性を解剖するために、ＰＤＧＦＲｂ－ｅＧＦＰマウスでＵＵＯ手術対偽手術を行い、その後ｅＧＦＰ／ＰＤＧＦＲａ二重陽性細胞のソーティングを行い、ＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋マウス腎細胞 ７，２４５ の二重陽性から ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ データを作成した（図４ａ）。急速に拡大する細胞集団と一致して、ＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋二重陽性細胞は傷害後に細胞数が約１４０倍増加し（図４ｂ）、我々のＳｍａｒｔ－Ｓｅｑ２データ（図３ｆ）と一致した。ＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋細胞のＵＭＡＰ包埋により、間充織（線維芽細胞および筋線維芽細胞）、上皮、内皮および免疫細胞に対応する４つの主要で異なる集団が発見された（図４ｃ－ｄ）。これらの細胞タイプはすべて、腎臓線維症の潜在的な細胞起源として以前に議論されている（Ｄｕｆｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ ２０１４； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１７； Ｋｒａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ２０１８）。注目すべきは、ヒトやマウスでは周皮細胞はＰＤＧＦＲａ－であるため、このＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋のデータでは未分化な周皮細胞は検出されなかったことである（図２ｅ、３ｇ）。非間葉系細胞は、間葉系細胞に比べてＰＤＧＦＲｂ、ＰＤＧＦＲａ、ＥＣＭ、コラーゲンレベルが著しく低く（図４ｄ－ｅ）、間葉系細胞以外の細胞は瘢痕形成過程への寄与が小さいという我々のヒトデータでの観察を支持する（図１、図２）。注目すべきは、ヒトのデータと同様に、計算で得られたダブレットスコアは、これらのマトリックスを発現する非間葉系細胞集団がダブレットである可能性が高いことを示唆しないことである。
教師なしクラスタリングにより、このマウスＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋データセットにおける間葉系細胞内の２つの主要クラス（１）Ｓｃａｒａ５とＭｅｇ３発現で示される線維芽細胞１、（２）様々な筋線維芽細胞サブポピュレーションからなる筋線維芽細胞（図４ｃ－ｄ）が判明した。ヒトのデータでは、筋線維芽細胞１は、筋線維芽細胞２（Ｏｇｎ＋）に先行してＥＣＭ発現が最も高い終末分化筋線維芽細胞に相当し、線維芽細胞１は「前駆」非活性化線維芽細胞集団として現れた（図２ｅ）。実際、ＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋のデータでは、線維芽細胞１細胞と筋線維芽細胞は、３つの大きな特徴によって区別することができる：まず、マウスの筋線維芽細胞特異的なコラーゲンであるＣｏｌ１５ａ１（図３ｇ）は、筋線維芽細胞クラスターよりも線維芽細胞１において低いレベルで発現していた（図４ｆ）。次に、Ｍｅｇ３は近位尿細管細胞や糸球体内皮の一部にも発現しているが、間葉系集団の中ではＭｅｇ３は線維芽細胞１でのみ検出された（図４ｄ）。ヒト腎臓におけるＭｅｇ３＋ ＰＤＧＦＲａ＋／ＰＤＧＦＲｂ＋ 間葉系サブポピュレーションの存在をｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションで検証し（図４ｈ－ｉ）、ヒト腎臓における線維芽細胞１様サブポピュレーションの存在を示唆した。第三に、線維芽細胞１細胞はＳｃａｒａ５＋であるがＦｒｚｂ－であり、筋線維芽細胞とは異なることが再度示された。
線維芽細胞１を別個の線維芽細胞集団として確立した後、その系統関係を洞察するために、すべてのマウスＰｄｇｆｒａ＋／Ｐｄｇｆｒｂ＋間葉系細胞のＵＭＡＰおよび拡散マップエンベッド法を作成し、疑似時間解析を実施した（図４ｊ）。この解析から、線維芽細胞１（Ｍｅｇ３＋、Ｓｃａｒａ５＋）と筋線維芽細胞２（Ｃｏｌ１４ａ１＋、Ｏｇｎ＋）が初期状態、筋線維芽細胞３ａが中間状態、筋線維芽細胞１ａ（Ｎｒｐ３＋、Ｎｋｄ２＋）、１ｂ（Ｇｒｅｍ２＋）、３ｂ（Ｆｒｚｂ＋）が終期状態であることが示唆された（図４ｊ）。
これらのデータは、マウス腎臓の線維化において、線維芽細胞１および筋線維芽細胞２が筋線維芽細胞の主要な供給源であることを示唆している。筋線維芽細胞２（Ｏｇｎ＋／Ｃｏｌ１４ａ１＋）は、健康なマウスの腎臓に存在するかもしれないし、周皮細胞から筋線維芽細胞への分化による中間状態として生じるかもしれない（図２ｅ、ヒトデータ）。アンジオテンシン受容体１（ＡＧＴＲ１ａ）の発現は、筋線維芽細胞２において豊富であり、周皮細胞由来であることを示唆しているかもしれない（図４ｊ）。
タイムコースのＵＵＯデータを解析すると、Ｏｇｎ、Ｓｃａｒａ５、Ｐｃｏｌｃｅ２は恒常性で濃縮され、ネイキッドキューティクルホモログ２（Ｎｋｄ２）は損傷後に濃縮されることがわかった。このことから、腎臓の恒常性に存在する細胞として、線維芽細胞１（Ｍｅｇ３＋、Ｓｃａｒａ５＋）と筋線維芽細胞２（Ｏｇｎ＋）があることがさらに示唆された。さらに、マウスＰｄｇｆｒａ＋／Ｐｄｇｆｒｂ＋の単一細胞データを、我々のヒトＰｄｇｆｒｂ＋細胞を基準として教師付き分類した結果、線維芽細胞１と筋線維芽細胞が両種に共通する特徴であることが確認された。
全体として、ヒトとマウスのデータを総合すると、Ｐｄｇｆｒｂ＋／Ｐｄｇｆｒａ＋／Ｐｏｓｔｎ＋ ＥＣＭ高発現筋線維芽細胞（本明細書では筋線維芽細胞１と呼ぶ）がＰｄｇｆｒｂ＋／Ｐｄｇｆｒａ－／Ｎｏｔｃｈ３＋ 周皮細胞、Ｐｄｇｆｒｂ＋／Ｐｄｇｆｒａ＋／Ｓｃａｒａ５＋線維芽細胞（線維芽細胞１）およびＰｄｇｆｒｂ＋／Ｐｄｇｆｒａ＋／Ｃｘｃｌ１２＋線維芽細胞（線維芽細胞２）から発生するモデルが示唆された。周皮細胞は、ＥＣＭを発現するＰｄｇｆｒｂ＋／Ｐｄｇｆｒａ＋／Ｏｇｎ＋／Ｃｏｌ１４ａ１＋（筋線維芽細胞２）の中間状態を経て、筋線維芽細胞１へと潜在的に分化する。
実施例７：個別の線維芽細胞および筋線維芽細胞の状態は、特定の転写因子制御プログラムによって区別される
次に、本データで検出された線維芽細胞と筋線維芽細胞の状態が、本当に異なる細胞タイプであるかどうかを確認することを目的とした。異なる細胞タイプは、異なる遺伝子発現プロファイルと異なる転写因子制御プログラムの両方によって区別されるであろう（Ｇｅｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ ２０１２）。ＵＵＯ手術１０日後のＰｄｇｆｒａ＋／Ｐｄｇｆｒｂ＋マウス腎臓細胞からバルクＡＴＡＣ－Ｓｅｑ（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ ２０１３）データを作成し、ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑクラスターで特定したマーカー遺伝子へのＯＣＲ近接度に基づいてＡＴＡＣ－Ｓｅｑデータからオープンクロマチン領域（ＯＣＲ）シグニチャーをデコボレーションした。線維芽細胞１と筋線維芽細胞２は、いずれも互いに、また他の筋線維芽細胞集団とも異なるものであった。筋線維芽細胞１ａは筋線維芽細胞１ｂと区別され、ＡＴＦがエンリッチメントされているのが特徴である。筋線維芽細胞２および３ｂは、ＴＧＦｂシグナルと線維化の重要な制御因子として以前に報告されているオーファン受容体ＮＲＦ４Ａ１のエンリッチメントを示した（Ｐａｌｕｍｂｏ－Ｚｅｒｒ ｅｔ ａｌ ２０１５）。線維芽細胞１では、ＡＰ－１（Ｊｕｎ／Ｆｏｓ）モチーフがエンリッチメントされており（図４ｋ）、ヒトのデータから推定される役割と一致している。これらのＡＴＡＣ－Ｓｅｑで選択された因子のＲＮＡ発現は、配列モチーフのエンリッチメントと一致しており（図４ｋ）、線維芽細胞１、筋線維芽細胞２および他の筋線維芽細胞集団間の転写制御の分岐を強調している。さらに、Ｎｒｆ１、Ｉｒｆ８、Ｃｒｅｂ５など、腎臓の線維化に関連して過小評価されている可能性のある転写因子を強調する。ＡＴＡＣ－Ｓｅｑデータと一致するように、ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑデータに基づくシグナル伝達経路解析では、線維芽細胞１と筋線維芽細胞は異なる経路が濃縮された集団であることが示された（図４ｌ）。したがって、線維芽細胞１および筋線維芽細胞サブタイプは、特定の転写因子制御プログラムを保有する、異なるＥＣＭ発現の間葉系細胞タイプであると考えられる。
実施例８：Ｎｋｄ２はヒト腎臓ＰＤＧＦＲｂ＋細胞におけるコラーゲン発現に必要であり、腎線維症の治療標的となりうる
次に、今回作成したｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いて、ヒトの腎線維症における潜在的な治療標的を特定することができるかどうかを検討した。Ｎｋｄ２はマウスＰｄｇｆｒａ＋／Ｐｄｇｆｒｂ＋の終末分化した筋線維芽細胞に特異的に発現し（図５ａ）、Ｎｋｄ２／ＰＤＧＦＲａ二重陽性細胞は全ｃｏｌ１ａ１＋細胞の４０％以上を占めている（図５ｂ）。ヒトＰＤＧＦＲｂ＋細胞では、ＮＫＤ２は高ＥＣＭ筋線維芽細胞のマーカーであり、その発現はＰｏｓｔｎやＥＣＭ発現と正の相関があり、周皮細胞や線維芽細胞に関連する遺伝子と反相関がある（図５ｃ参照）。さらに、ＮＫＤ２＋筋線維芽細胞は、ＮＫＤ２－細胞と比較して、ＴＧＦｂ、Ｗｎｔ、ＴＮＦａ経路活性の上昇と関連していた。３６名の患者のヒト腎臓組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）でマルチプレックスＩＳＨによりＮＫＤ２発現を確認し、ヒトＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂ発現細胞の亜集団がＮｋｄ２も発現していることを確認した（図５ｄ－ｅ）。さらに、ＰＤＧＦＲａ／ＰＤＧＦＲｂ／Ｎｋｄ２共発現細胞の存在量は、間質性線維症がより顕著な患者においてより高かった（図５ｅ）。
Ｎｋｄ２は、Ｗｎｔ経路およびＴＮＦａモジュレーターとして記録されている（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ ２０１５； Ｈｕ ａｎｄ Ｌｉ ２０１０； Ｈｕ ｅｔ ａｌ ２０１０； Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２００４）。Ｎｋｄ２が腎線維症を制御するメカニズムを理解するために、我々のヒトＰＤＧＦＲｂ＋データを用いて、ＧＲＮｂｏｏｓｔ２フレームワークを用いて、Ｎｋｄ２と相関する遺伝子に焦点を当てた遺伝子制御ネットワークを予測した。その結果、リボソームタンパク質（モジュール１）、ＥＣＭ発現関連遺伝子（モジュール２）、周皮細胞関連遺伝子（モジュール３）、非活性化線維芽細胞関連遺伝子（モジュール４）という４つの遺伝子制御モジュールにクラスター化された。この遺伝子群には、Ｎｋｄ２以外にもＫｉｆ２６ｂ、Ｌｅｆ１、Ｗｎｔ４など様々なＷｎｔモジュレーターやエフェクターが含まれていることがわかった。Ｎｋｄ２はＥＣＭ遺伝子と配置され、Ｅｔｖ１とＬａｍｐ５、Ｌａｍｐ５を介して間接的にＣｏｌ１ａ１に接続されている。この解析から、Ｎｋｄ２がＥｔｖ１（Ｅｔｓ因子ファミリーの一員）によって制御され、Ｌａｍｐ５を介したパラ分泌シグナルに影響を与えることで作用するメカニズムの可能性が示唆された。
私たちのヒトＰＤＧＦＲｂ細胞株でＮｋｄ２をレンチウイルスで過剰発現させると、ＴＧＦｂに反応してｃｏｌ１ａ１やフィブロネクチンといった主要な線維化促進ＥＣＭ分子の発現が増加した（図５ｆ－ｇ）。重要なことは、Ｎｋｄ２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトにより、ＴＧＦｂの有無にかかわらず、ｃｏｌ１ａ１、フィブロネクチン、ＡＣＴＡ２の発現が著しく減少したことである（図５ｈ－ｉ）。Ｎｋｄ２を過剰発現させた細胞のＲＮＡ－ｓｅｑでは、ＥＣＭ制御因子とＥＣＭ糖タンパク質の発現量が増加したのに対し、Ｎｋｄ２ノックアウトクローンのＲＮＡ－ｓｅｑでは、ＥＣＭ制御因子、ＥＣＭ糖タンパク質、コラーゲンが消失したことが示された（図５ｊ）。パスウェイおよび遺伝子オントロジー解析により、ＥＣＭ発現プログラムにおけるＮｋｄ２の役割が示され、さらにＡＰ１およびインテグリンシグナル伝達経路との相互作用が示唆された（図５ｋ）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮｋｄ２をノックアウトすると、Ｗｎｔ受容体やリガンドの発現が大きく変化することが確認され、この経路に関与している可能性が示された。
Ｎｋｄ２を治療標的としてさらに検証するため、ヒト腎臓の主要な区画をすべて含む人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の腎臓オルガノイドを作成した。ＩＬ１ｂは、ｉＰＳＣ由来の腎臓オルガノイドにおいて線維化を誘導することがよく知られている（Ｌｅｍｏｓ ｅｔ ａｌ ２０１８）。重要なことは、ｓｉＲＮＡを介したＮｋｄ２のノックダウンにより、腎臓オルガノイドにおけるＩＬ１ｂ誘発性のＣｏｌ１ａ１発現が抑制されたことである（図５ｌ－ｏ）。これらのデータは、Ｎｋｄ２がヒトおよびマウスの腎線維症における筋線維芽細胞をマークし、腎筋線維芽細胞のコラーゲン発現に必要であることを確認し、したがって、腎線維症患者を治療するための有望な潜在的治療ターゲットとなる。
実施例９：ＮＤＫ２タンパク質に結合する薬剤および／または阻害する薬剤のスクリーニング
スクリーニング実験により、ＮＫＤ２タンパク質に結合し、その活性を阻害する低分子治療薬、ペプチド、生生物学的製剤を同定し、検証することができる。
ＤＮＡ－バーコード化化合物ライブラリは、記載されているように生成され、スクリーニングされる（Ｋｕｎｉｇ ｅｔ ａｌ． ２０１８）。この目的のために、Ｈｉｓタグを有する組換えＮＫＤ２タンパク質またはその断片を、大腸菌、昆虫細胞または哺乳動物細胞で発現させる。精製したＮＫＤ２タンパク質を化合物ライブラリとインキュベートし、免疫沈降法により単離する。ＮＫＤ２タンパク質に結合した化合物は、ＤＮＡバーコードのサンガー配列決定により同定される。その後、同定された化合物は、ＮＫＤ２の機能、筋線維芽細胞の分化、コラーゲン１などのマトリックスタンパク質の発現および分泌、腎線維症の発症に対する影響について試験される。そのために、腎線維症の実験用マウスのｉｎ－ｖｉｖｏモデルを採用する。
ｎｋｄ２発現に影響を及ぼす低分子治療化合物、ペプチドおよび／または生物学的製剤の同定および検証のために、ｅＧＦＰ ＮＫＤ２融合タンパク質発現またはルシフェラーゼベースのレポーターシステムなどを用いて、ｉｎ－ｖｉｔｒｏヒト細胞ベースの蛍光色素レポーターシステムを確立し、３８４から１，５３６ウェルフォーマットのアッセイで、ｅＧＦＰ蛍光またはルシフェラーゼ値を読み出しとして低減する化合物を特定するために、化合物ライブラリーのスクリーニングを行う。これらのヒトＮＫＤ２融合レポーター構築物の前記細胞における発現は、例えば、耐性遺伝子カセットを介したトランスフェクションおよび選択、またはウイルス導入により実施することができる。これらのアッセイには、例えば２９３Ｔ細胞のようなヒト細胞株だけでなく、確立されたヒト腎臓の筋線維芽細胞株も採用される。このスクリーニングと並行して、非特異的な毒性やアポトーシスの誘発によってレポーターの蛍光や活性に影響を及ぼす化合物を除外するために、細胞毒性アッセイが行われる。

Claims (29)

  1. 所与の細胞による細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の発現および／または分泌を低減する方法であって、以下からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む方法：
    （ｉ）前記細胞におけるｎｋｄ２遺伝子の発現を抑制または低減すること、
    （ｉｉ）前記細胞におけるＮＫＤ２タンパク質の分解を促進すること、および／または
    （ｉｉｉ）前記細胞におけるＮＫＤ２タンパク質の活性を阻害または低下させること。
  2. ｎｋｄ２遺伝子発現の阻害または低減が、ｎｋｄ２遺伝子ノックダウン、ノックアウト、条件付き遺伝子ノックアウト、遺伝子改変、ＲＮＡ干渉、ｓｉＲＮＡおよび／またはアンチセンスＲＮＡによって達成される、請求項１に記載の方法。
  3. ＮＫＤ２タンパク質活性の阻害または低減が、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合する薬剤の使用により達成される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞が、腎臓細胞、好ましくは腎臓筋線維芽細胞、最も好ましくは終末分化した腎臓筋線維芽細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質またはその断片に結合する薬剤を同定する方法。
  6. 以下のステップを少なくとも含む、請求項５に記載の方法：
    （ｉ）ＮＫＤ２タンパク質またはその断片を提供すること、
    （ｉｉ）ＮＫＤ２タンパク質またはその断片への結合についてスクリーニングされる少なくとも１つの薬剤を添加すること、および
    （ｉｉｉ）ＮＫＤ２タンパク質またはその断片に結合した少なくとも１つの薬剤を同定すること。
  7. 前記薬剤がＮＫＤ２阻害剤である、請求項５および６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記薬剤が、低分子化合物、ペプチド、および生物学的製剤からなる群から選択される、請求項５から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記生物学的製剤が、抗体、またはその抗原結合断片、またはその抗原結合誘導体、または抗体様タンパク質、またはアプタマーである、請求項８に記載の方法。
  10. ＮＫＤ２タンパク質が固相に結合しているか、または溶液中にある、請求項５から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記薬剤が化合物ライブラリのメンバーである、請求項６から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記化合物ライブラリが、それぞれ低分子化合物、ペプチド、または生物学的化合物を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項５から１２のいずれかに記載のＮＫＤ２又はその断片に結合する薬剤の同定方法における、ネイキッドキューティクルホモログ２又はその断片、又はネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質又はその断片をコードする核酸の使用。
  14. ＮＫＤ２タンパク質に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質。
  15. 前記抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質が、ＮＫＤ２活性を阻害する、請求項１４に記載の抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質。
  16. 請求項５から１２のいずれか１項に記載の方法により得られる薬剤。
  17. 慢性腎臓病の治療に使用するための、請求項１６に記載の薬剤。
  18. 慢性腎臓病の治療に使用される、ネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合する薬剤。
  19. 前記薬剤は、ＮＫＤ２に結合すると、ＮＫＤ２活性を阻害する、請求項１８に記載の薬剤。
  20. 前記慢性腎臓病が進行性慢性腎臓病および／または腎線維症である、請求項１６および１７のいずれかに記載の使用のための薬剤。
  21. 前記薬剤が、低分子化合物（ｓｍｏｌ）、ペプチド、または生物学的製剤であり、好ましくは、前記生物学的製剤が、抗体、またはその断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質、またはアプタマーである、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の薬剤。
  22. 慢性腎臓病の治療方法におけるネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合する薬剤の使用であって、好ましくは、慢性腎臓病が進行性慢性腎臓病および／または腎線維症である、使用。
  23. 前記薬剤が、ＮＫＤ２に結合したとき、ＮＫＤ２活性を阻害する、請求項２２に記載の薬剤の使用。
  24. 慢性腎臓病の治療または予防方法であって、ヒトまたは動物の対象に、治療上有効な量のネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合および／または阻害する薬剤を投与することを含む、方法。
  25. 請求項１４および１５のいずれかに記載の抗体、抗原結合断片もしくはその誘導体、または抗体様タンパク質、または請求項１６から２１のいずれか１項に記載の薬剤、および任意に１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
  26. 前記賦形剤が、薬学的に許容される緩衝剤、界面活性剤、希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、滑沢剤、崩壊剤、吸着剤、および／または防腐剤からなる群から選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
  27. 以下を含む、医薬組成物の製造方法。
    （ｉ）請求項５から１２のいずれか１項に記載の方法、さらに
    （ｉｉ）同定された薬剤を、薬学的に許容される担体と混合すること。
  28. ｉ）請求項１４および１５のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合断片もしくは誘導体、または抗体様タンパク質、または請求項１６から２１のいずれかに記載のネイキッドキューティクルホモログ２（ＮＫＤ２）タンパク質に結合する薬剤、または請求項２５および２６のいずれかに記載の医薬組成物と、（ｉｉ）１以上のさらなる治療的活性化合物の組み合わせを含む組成物。
  29. 以下を含む部品の治療キット：
    （ｉ） 請求項２５、２６又は２８のいずれか１項に記載の医薬組成物、
    （ｉｉ） 前記組成物を投与するための装置、および
    （ｉｉｉ） 任意選択的に使用説明書。
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