DE102020128677A1 - Ein neues Target zur Behandlung der Nierenfibrose - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft die Identifizierung der Rolle des vom Naked Cuticle Homolog 2 (Nkd2)-Gen abgeleiteten Proteins bei der Entwicklung von chronischen Nierenerkrankungen, insbesondere von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und Nierenfibrose. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an das nkd2-Protein binden, und die Verwendung von Nkd2 zum Screening und zur Identifizierung von Nkd2-interagierenden Verbindungen. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Nierenerkrankungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Wirkstoffe umfassen, die an das NKD2-Protein (Fig. 1a) binden und/oder es hemmen.

Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Rolle des Nkd2-Proteins (Naked Cuticle Homolog 2) bei der Entwicklung von chronischen Nierenerkrankungen, insbesondere von progressiven chronischen Nierenerkrankungen und Nierenfibrosen. Die vorliegende Erfindung betrtifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an das Nkd2-Protein binden, und auf die Verwendung von Nkd2 zum Screening und zur Identifizierung von Nkd2-interagierenden Verbindungen. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Nierenerkrankungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Wirkstoffe umfassen, die an das Nkd2-Protein binden und/oder dieses hemmen.
  • Hintergrund
  • Chronische Nierenerkrankungen (CKD) betreffen mehr als 10 % der Weltbevölkerung, und ihre Prävalenz nimmt zu. Unabhängig von der anfänglichen Art der Schädigung ist der letzte gemeinsame Verlauf einer Nierenschädigung die Nierenfibrose. Die Nierenfibrose ist das Kennzeichen für das Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung, jedoch gibt es derzeit keine antifibrotischen Therapien. Das Ausmaß der Nierenfibrose ist untrennbar mit dem Verlust der Nierenfunktion und dem klinischen Verlauf der CKD verbunden, weshalb die Nierenfibrose als wichtiges therapeutisches Ziel bei CKD angesehen wird. Für die Behandlung der Nierenfibrose gibt es keine zugelassenen Therapien, was vor allem daran liegt, dass der zelluläre Ursprung, die funktionelle Heterogenität und die Regulierung der narbenbildenden Zellen in der humanen Niere nach wie vor unklar sind und eine große Quelle der Diskussion auf diesem Gebiet darstellen (Duffield 2014; Falke et al. 2015). Die einzigen Behandlungsmöglichkeiten sind die kontinuierliche Nierenersatztherapie (Dialyse) und die Nierentransplantation. Beide Optionen sind mit hohen persönlichen Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden und stellen auch eine hohe wirtschaftliche Belastung für die nationalen Gesundheitssysteme dar. Daher sind neuartige Therapieansätze sehr wünschenswert.
  • Nierenfibrose ist definiert durch eine übermäßige Ablagerung von extrazellulärer Matrix, die das funktionelle Parenchym stört und ersetzt, was zu Organversagen führt. Die histologische Struktur der Niere kann in drei Hauptkompartimente unterteilt werden, die alle von Fibrose betroffen sein können, speziell bezeichnet als Glomerulosklerose in den Glomeruli, interstitielle Fibrose im Tubulointerstitium und Arteriosklerose und perivaskuläre Fibrose in der Vaskulatur (Djudjai und Boor 2019).
  • Die Nierenfibrose ist durch eine hohe Expression, Sekretion und Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM)-Proteinen wie Kollagen-1 gekennzeichnet. Myofibroblasten stellen die Hauptquelle der ECM während der Nierenfibrose dar, wobei ihre zelluläre Herkunft weiterhin umstritten ist (Duffield 2014; Friedman et al 2013; Kriz et al 2011; Kramann und DiRocco 2013). Die Sequenzierung und Kartierung von Einzelzell-RNA ermöglicht die Zerlegung der zellulären Heterogenität komplexer Gewebe und Krankheitsprozesse und liefert neue Erkenntnisse über krankheitsvermittelnde Zellpopulationen und Mechanismen (Ramachandran et al 2019; Dobie und Henderson 2019). In der Vergangenheit hatten genetische Fate-Tracing-Daten in Mäusen, die durch verschiedene Färbeansätze in humanem Gewebe erweitert wurden, nahegelegt, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen wie epitheliale, endotheliale, zirkulierende hämatopoetische Zellen sowie residente mesenchymale Zellen zur Fibrose beitragen (Duffield 2014; Friedman et al 2013; Kramann und DiRocco 2013).
  • Somit besteht die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe in der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen, sowie die genannten Wirkstoffe, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Mittel zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen bereit, insbesondere zur Identifizierung von hochwirksamen Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und Nierenfibrose.
  • Wie hierin offenbart, fanden die Erfinder heraus, dass das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein in terminal differenzierten Myofibroblasten produziert wird, die an der Nierenfibrose beteiligt sind, aber nicht in Zellen, die Markerproteine für Perizyten und Fibroblasten und nur geringe Mengen an extrazellulärem Matrixprotein exprimieren. Es wurde weiterhin festgestellt, dass Nkd2-exprimierende Zellen eine erhöhte Aktivität von pro-fibrotischen Signaltransduktionswegen aufweisen. Die Erfinder fanden weiter heraus, dass eine Reduktion der Fibrose durch Deletion des Nkd2-Gens oder Knock-down der Nkd2-Expression erreicht werden kann, wodurch das Gen als relevant für die Produktion von extrazellulärer Matrix und Fibrose identifiziert wurde. Damit haben die Erfinder erstmals Nkd2 als neues Target und damit einen neuen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung von Therapeutika identifiziert, die die Nkd2-Genexpression und/oder die NKD2-Proteinaktivität unter Verwendung von niedermolekularen Wirkstoffen (Smols), Peptiden oder Biologika hemmen.
  • In Anbetracht des Standes der Technik war es daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine bestimmte Zelle bereitzustellen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs bereitzustellen, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein oder ein Fragment davon bindet und/oder dieses hemmt.
  • Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung einer Nukleinsäure, die für das Naked Cuticle Homolog 2, oder ein Fragment davon, oder das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) Protein, oder ein Fragment davon, kodiert, für die Identifizierung eines Wirkstoffs, das an NKD2, oder ein Fragment davon, bindet, bereitzustellen.
  • Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wirkstoffe zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen bereitzustellen, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Mittel enthalten, und von Verfahren zur Herstellung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen.
  • Diese und weitere Aufgaben werden mit Verfahren und Mitteln gemäß den unabhängigen Ansprüchen der vorliegenden Erfindung erfüllt. Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf bestimmte Ausführungsformen.
  • Die Erfindung und allgemeine vorteilhafte Ausgestaltungen werden im Folgenden näher erläutert.
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • . a. Schematische Darstellung der Nephronstruktur und der zugehörigen Zelltypen, b. UMAP umfasst 51.849 MME- (CD10-) Einzelzelltranskriptome von 15 humanen Nieren. Es konnten fünf Haupt-Zelltypen unterschieden werden (jeweils durch gestrichelte Linien gekennzeichnet): epitheliale (n=9.280), endotheliale (n=29.814), Immun-(n=9.616), mesenchymale (n=3.115) und neuronale (Schwannzellen, n=24) Zellen. Erläuterung der Abkürzungen siehe 1d. c. Darstellung des Wechselwirkungsnetzwerks zwischen den einzelnen Einzelzellclustern. Die Knotenpunkte repräsentieren die Zellcluster. Wechselwirkungen zwischen den Zellclustern werden durch Linien dargestellt. Die Erstellung und Darstellung des Wechselwirkungsnetzwerkes wurde erstellt unter Verwendung der ggraph R package Software (https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/index. html). d. Skalierte Darstellung der Genexpression der Top 10 spezifischen Gene in jedem Zelltyp/Zellcluster. Das Genranking pro Cluster wurde mittels genesorteR erstellt. In den jeweiligen Zellclustern werden Gruppen von ähnlichen Zellen bzw. verwandte Zellen in 29 klassische (canonikale) Zelltypen eingeteilt (B Zellen (B): n=3.101, T Zellen (T): n=484, Natürliche Killerzellen (NK): n=740, Plasmazellen (P): n=167, Mastzellen (Mast): n=142, Dendritische Zellen (DC): n=841, Monozyten (Mono): n=1.111, Makrophagen 1 (Mac1): n=1.476, Makrophagen 2 (Mac2): n=615, Makrophagen 3 (Mac3): n=939, Arteriolares Endothelium (Art1): n=901, glomeruläre Kapillaren (GC): n=4.377, venöses Endothelium (Ven): n=2.724, Lymph Endothelium (1En): n=509, Vasa Recta 1 (VR1): n=5.355, Vasa Recta 2 (VR2): n=2.023, Vasa Recta 3 (VR3): n=3.051, Vasa Recta 4 (VR4): n=726, Vasa Recta 5 (VR5): n=3.271, Vasa Recta 6 (VR6): n=4.378, entzündete endotheliale Zellen (iEn): n=2.499, Vaskuläre glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC): n=426, Perizyten 1 (Pe1): n=455, Perizyten 2 (Pe2): n=188, Fibroblasten 1(Fib1): n=761, Fibroblasten 2 (Fib2): n=208, Fibroblasten 3(Fib3): n=246, Myofibroblasten 1a (MF1a): n=525, Myofibroblasten 1b (MF1b): n=306, proximale Tubuluszellen (PT): n=917, entzündete proximale Tubuluszellen (iPT): n=909, absteigender Ast der Henle-Schleife (DTL: n=806, Sammelrohre (CNT): n=662, Macula Densa Zellen (Mdc): n=869, aufsteigender Ast der Henle-Schleife 2 (TAL2): n=692, dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife 3 (TAL3): n=315, dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife (TAL4): n=390, interkalierende Zellen 3 (IC3): n=62, interkalierende Zellen 4 (IC4): n=78, interkalierende Zellen 5 (IC5): n=33, interkalierende Zellen 6 (IC6): n=39, interkalierende Zellen 7 (IC7): n=40, interkalierende Zellen 9 (IC9): n=72, interkalierende Zellen A (IC-A): n=754, interkalierende Zellen B (IC-B), n=316, Urothelzellen (Ure): n=246, Podozyten (Pod): n=44, Schwannzellen: n=24). Zellcluster sind in den Spalten und Gene als Reihen dargestellt. Jede Spalte enthält die durchschnittliche Expression aller Zellen innerhalb eines Clusters. e. Stratifizierung der einzelnen Zellen entsprechend der klinischen Parameter der Patienten CKD= chronische Nierenerkrankung, eGFR= berechnete glomeruläre Filtrationsrate). f. UMAP Darstellung von 31.875 CD10+ (CD10+) Einzelzell-Transkriptomen stratifiziert entsprechend den klinischen Parametern der Patienten. g. Log-fache Veränderung des Zellkyklus-Stadiums in epithelialen Zellen aus gesunden Probanden und Patienten mit CKD in Relation dargestellt zu einem Modell mit zufälliger Verteilung. Positive Zahlen repräsentieren Verstärkung, negative Zahlen repräsentieren Depletion. h. Aktivierung des KEGG Signalwegs in CD10+ Zellen, i. Zellen von Patienten mit einer chronischen Nierenerkrankung zeigen häufiger eine erhöhte ECM Expression (EZM=Extrazelluläre Matrix, CD10- Zellen). j. Violinen Blot Darstellung des EZM Score stratifiziert entsprechend des Zelltyps sowie der Unterscheidung Gesund/CKD in CD10- Zellen. P-Werte der Unterschiede in den eGFR Kategorien: Mesenchymale Zellen (p<0,001), Immunzellen (p<0,001), epitheliale Zellen (p<0,001), endotheliale Zellen (p<0,001). k. Violinen Blot Darstellung des EZM Scores für mesenchymale Zellen stratifiziert entsprechend des Zelltyps und der Unterscheidung gesund/CKD. P-Werte der Unterschied in den eGFR Kategorien: Fib1 (0,0001), Fib2 (n.s.), Fib3 (n.s.), MF1a (n.s.), MF1b (n.s.), Pe1 (n.s.), Pe2 (n.s.), SMC (n.s.) 1. Anzahl der Zellen pro mesenchymalen Zelltyp und klinischen Parameter, m. UMAP Darstellung von Fibroblasten/Perizyten/Myofibroblasten aus 13 humanen Nieren (n=2.689). Die unterschiedlichen Zelltypen sind durch gestrichelte Linien voneinander getrennt. Durchgehende Linie verdeutlicht einen Abstammungsbaum (lineage tree) entsprechend der Vorhersage durch slingshot. n. Expression von ausgewählten Genen dargestellt in der UMAP aus Teilabbildung b. o. Darstellung von Perizyten, Fibroblasten und Myofibroblasten und der Expression von Col1a1 als Diffusionskarte.
  • . a. UMAP Darstellung von 37.800 PDGFRb+ Einzelzell-Transkriptomen aus 8 humanen Nieren. Die 4 größten Zellcluster sind durch gestrichelte Linien voneinander getrennt: epitheliale Zellen (n=461), endotheliale Zellen (n=2.341), Immunzellen (n=20.838), mesenchymale Zellen (n=25.385). Zelltypen wurden durch geblindete Clustering Analysen der Einzelzell-Transkriptome identifiziert (siehe Methoden): Fibroblasten 1 (Fib1), Fibroblasten 2 (Fib2), Fibroblasten 3 (Fib3), Perizyten (Pe), vaskuläre glatte Gefäßmuskelzellen (VSMCs), Mesangialzellen (Mesa), Myofibroblasten 1 (MF1), Myofibroblasten 2 (MF2), Myofibroblasten 3 (MF3), Mesangialzellen (Mesa), Makrophagen 1 (MC1), Makrophagen 2 (MC2), dendritische Zellen (DC), arterioläre endotheliale Zellen (Art), glomeruläre endotheliale Zellen (GC), vasa recta (VR), entzündetes Endothelium (iEn), proximale Tubuluszellen (PT), entzündete proximale Tubuluszellen (iPT), interkalierende Zellen (IC), Sammelrohr principal Zellen (PC), dicker aufsteigender Teil der Henle Schleife (TAL) b. Stratifizierung von einzelnen Zellen entsprechend der klinischen Parameter der Patienten (CKD = chronische Nierenerkrankungen, eGFR = kalkulierte glomeruläre Filtrationsrate). c. Expression von ausgewählten Genen dargestellt als UMAP aus Teilabbildung a. d. Skalierte Genexpression der TOP10 Gene in jedem Zellcluster. Gen Ranking pro Zellcluster wurde erstellt mittels genesorteR. Markierung der Zellcluster entspricht den Zellclustern aus Teilabbildungen a und b. Dargestellt werden die Zellen in den Spalten (jeweils 100 Zellen/Spalte) und die Gene in den Reihen. In werden Expressionen von Genen dargestellt, die überexprimiert werden. In werden Gene mit einer depletierten/verminderten Genexpression dargestellt. e. Darstellung einer Diffusionskarte von PDGFRb+ Fibroblasten (FIb)/Myofibroblasten (MF)/Pericyten (Pe) (n=23.883) und der Expression von ausgewählten Genen. Linien verdeutlichen den 3 Abstammunslinien (lineage L1, L2 and L3) entsprechend der Vorhersage durch Slingshot. f. Repräsentative Abbildung einer multiplex RNA-in-situ Hybridisierung für Meg3, Notch3, Postn in n=35 humanen Nieren. Maßstableiste links 10 µm, rechts 25 µm. Von oben nach unten: Darstellung RNA in situ Hybridisierung Meg3, Notch, Postn und Dapi/ nur Nachweis von Postn/Postn plus Notch-3/Postn plus Meg3/Postln plus DAPI. Quantifizierung von Meg3/Notch3 doppelt positiven Zellen, g. Oben links: Genexpression Dynamik für eine Überexpression über eine Pseudozeitachse für Lineage 1 (Perizyten zu Myofibroblasten, siehe e.). Zellen (in Spalten) wurden entlang der Pseudozeitachse angeordnet. Gene (in Reihen), die mit der Pseudozeit korrelieren, wurden ausgewählt und entlang der Pseudozeit geblottet (siehe Methoden). Jede Spalte enthält den Mittelwert von 10 Zellen. Gene wurden in 7 Gruppen entsprechend ihrer Pseudozeit Expressionsmuster zusammengefasst. Ausgewählte Beispiel-Gene sind aufgeführt. Unten links: Darstellung entsprechend oben links jedoch werden verminderte Genexpressionen dargestellt. Oben rechts: Zellzyklusphasen als Prozent von jeweils 2000 Zellen werden in Abhängigkeit der Pseudozeit. Unten rechts: Verstärkung der PID Signalkaskade in Abhängigkeit der Pseudozeit.
  • . a. Oben: Design des Zellverfolgungsexperiments (fate tracing experiment). Unten: Darstellung der PDGFRbCreER-tdTomato positiven Zellen in der Maus Niere im Modell der UUO (unilateralen Ureter Obstruktion) und in der Kontroll-operierten Maus (SHAM). Oben: Nachweis von PDGFRß-tdtom und DAPI; Mitte: Nachweis von PDGFRß-tdtom; Unten: Nachweis von DAPI b. Repräsentative Abbildung einer Collal in-situ Hybridisierung von einer PDGFRbCreER;tdTomato Niere nach UUO Operation. Von oben nach unten: Nachweis von PDGFRß-tdtom + Col1 + DAPI/ Nachweis von Col1/ Nachweis von PDGFRß-tdtom + Col1/ Nachweis von Col1 + DAPI c. Prozentsatz an Collal-mRNA exprimierenden Zellen, die tdTomato ko-exprimieren, am Tag10 nach UUO Induktion (n = 3). d. Design des UUO Experiments im Zeitverlauf. Die UUO wurde in PDGRb-eGFP Mäusen induziert und eGFP positive Einzelzellen aus den Mausnieren an den Tagen 0, 2 und 10 nach UUO Induktion isoliert und mittels Smart-Seq v2 analysiert. e. UMAP Darstellung der isolierten Zellen aus dem UUO Zeitverlauf Experiment (siehe d). Zelltypen wurden durch geblindetes Clustering (siehe Methoden) identifiziert (parietale epitheliale Zellen (PECs): n=68, Matrix produzierende Zellen (MP): n=76, entzündete smooth muscle Zellen 1 (iSMCs1): n=112, entzündete smooth muscle Zellen 2 (iSMCs2): n=77, entzündete smooth muscle Zellen 3 (iSMCs3): n=76, Mesangialzellen (Mesa): n=74, Perizyten 1 (Pe1): n=113, Renin produzierende smooth muscle Zellen (rSMC): n=101, smooth muscle Zellen 1 (SMC1): n=172, Perizyten 2 (Pe2): n=83). f. Prozent an Zelltypen die zu den angegebenen Zeitpunkten nachgewiesen werden konnten. Jede Spalte präsentiert 100 Zellen, g. Expression von ausgewählten Genen in allen 10 Zellclustern. h. Expression von ausgewählten Genen dargestellt in der UMAP aus Teilabbildung e. i. Immuno-fluoreszenz (IF) Färbung von Kontroll-operierten (SHAM) und UUO (Tag10) Mausnieren zeigt eine Pdgfra Expression in einer Subpopulation von PDGFRbCreER;tdTomato positiven Zellen (Pfeile). Von links nach rechts: Darstellung PDGFRbCreERtdTomato + PDGFRa + DAPI/ Darstellung PDGFRbCreERtdTomato/ Darstellung PDGFRa/Darstellung DAPI j. RNA in-situ Hybridisierung zeigt eine Ko-Lokalisation der Collal Expression in PDGFRa/PDGFRb doppelt-positiven Zellen. Col1a1/PDFGRa/PDFRb Triple-positive Zellen (Pfeile) sind vereinzelt im Interstitium der Niere nachweisbar. Von oben nach unten: Darstellung PDGFRa + Collal + PDGFRb + DAPI/ Darstellung PDGFR-a/ Darstellung PDGFR-a + Col1a1/ Darstellung PDGFR-a + PDGFRb/ Darstellung PDGFR-a + DAPI k. Links: Collal Expression und ECM Score in CD10 negativen Zellen ( ) stratifiziert entsprechend der PDGFRa und PDGFRb Expression. Rechts: Prozent von Collal positiven und negative Zellen im gleichen Datensatz, stratifiziert wie oben beschrieben. Collal negative Zellen sind nachweisbar in PDGFRa/b doppelt-negativen Zellen, während Collal positive Zellen überwiegend in PDGFRalb doppelt-positiven Zellen vorkommen. Gruppenvergleich: (andere Gene) vs. (a/b): p<0,001, (a-) vs. (a/b): p<0,001, (b) vs. (a/b): p<0,001, (andere Gene) vs. (a): p<0,001, (b) vs. (a): p<0,001, (andere Gene) vs. (b):p<0,001. Bonferroni korrigierte p-Werte basierend auf Wilcoxon rank sum Test. 1. Verteilung des IF/TA-Score von 62 Patienten und repräsentative Abbildung eines Trichrome-gefärbten humanen Nierengewebe Arrays (TMA) gefärbt mittels einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung mit PDGFRa,PDGFRb and Collal Sonden und einer Zellkernfärbung (DAPI) von 62 Nieren (links), durchschnittliche Collal Epression in den in-situ Hybridisierungsdaten stratifiziert aufgrund der Detektion von PDGFRa/PDGFRb im gleichen Datensatz (Mitte) und Prozent von Collal positiven und negativen Zellen im gelichen Datensatz (Stratifizierung siehe oben) (rechts). Gruppenstatisitik: (a/b) vs. (col1α1): p<0,001, (a/b) vs. (b): p<0,001, (a/-) vs. (a): p<0,001. Bonferroni korrigierte p-Werte basierend auf Wilcoxon rank sum Test. Maßstableiste: in a 1000 µm, in b 10 µm, in i+j 50 µm, in k 10 µm. Multiplex RNA in situ Hybridisierung von oben nach unten: Nachweis Collal + PDGFRa + PDGFRb + DAPI/ Nachweis Col1a1/ Nachweis Coll + PDGFRa/ Nachweis Collal + PDGFRb/Nachweis coll + DAPI.
  • . a. Schematische Darstellung des UUO Experiments. UUO wurde durchgeführt in PDGRb-eGFP Mäusen. eGFP+/PDGFRb+ Einzelzellen wurden aus den murinen Nieren isoliert und mit Hilfe des 10x Genomics drop-seq zu den Zeitpunkten Tag 0 and 10 nach UUO analysiert (jeweils n=5). b. Flow cytometrische Quantifizierung von PDGFRa, PDGFRb und PDGFRalb exprimierenden Zellen am Tag 10 nach UUO Induktion im Vergleich zu Kontroll-operierten Tieren. *p<0.05; **p<0.01 im einseitigen ANOVA Test mit post-hoc Bonferroni Korrektur. c. Links: Die UMAP umfasst Zellen, die im UUO Experiment (siehe a) isoliert wurden (n=7.245). Es konnten 4 große Zellcluster identifiziert werden (epitheliale (n=223), endotheliale (n=370), Immun- (n=199), mesenchymale (n=6.633) Zellen. Durch verblindete Cluster Analyse der Einzelzell-Transkriptome (siehe Methoden) konnten 10 Zelltypen unterschieden werden. Fibroblasten 1 (Fib1), Myofibroblasten 1 (MF1), Myofibroblasten 2 (MF2), Myofibroblasten 3 (MF3), endotheliale Zellen (EC), entzündete proximale Tubuluszellen (iPT), nicht bestimmte mesenchymale Zellen (uM), Makrophagen/Monozyten (MC). Rechts: Prozentualer Anteil der Zellen pro Cluster in der UUO oder Kontroll-operierten Mäusen, d. Expression von ausgewählten Genen in den verschiedenen Zell-Clustern (Abkürzungen siehe c). e. Darstellung des Extrazellulären Matrix Score (ECM Score) in Form des UMAP aus Teilabbildung c. f. Die Expression von Col15a1 in den verschiedenen Zellclustern dargestellt als Violinen Blot. Es werden nur mesenchymale Zellen gezeigt, g. Darstellung des Kollagen Scores in den verschiedenen Zellclustern als Violinen Blot. Es werden nur mesenchymale Zellen gezeigt. Der Kollagen Score ist die durchschnittliche Expression der Kern-Kollagene wie von Nabe et al. publiziert. h. Representative Abbildung einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung zum Nachweis von PDGFRa, PDGFRb und Meg3 in n=34 humanen Nieren. Meg3 ko-localisiert mit PDGFRa und PDGFRb. Von oben nach unten: Darstellung Meg3 + PDGFRa + PDGFRb + DAPI/ Darstellung Meg3/ Darstellung Meg3 + PDGFRa/ Dastellung Meg3 + PDGFRb/Darstellung Meg3 + DAPI i. Prozent von Meg3 positiven-Zellen an PDGFRalb doppelt-positiven Zellen; quantifiziert mittels RNA in-situ Hybridisierung. j. Darstellung von Fibroblasten und Myofibroblasten (n = 6.557) in Form einer UMAP (links) und Diffusionkarte (rechts). Zellclustern entsprechen Teilabbildung c. Die schwarzen durchgezogenen Linien verdeutlichen die Abstammungen (lineage tree) entsprechend der Berechnung durch Slingshot. Unten: Expression von ausgewählten Genen dargestellt auf einer analogen UMAP. k. Signalweg Enrichment in denselben mesenchymalen Zellclustern.
  • . a. Expression von Nkd2 dargestellt als UMAP aus . (murine Pdgfralb doppelt-positive Zellen). b. Prozent von Collal positiven und negative Zellen (Daten siehe a) stratifiziert entsprechend der Pdgfra and Nkd2 Expression. Collal negative Zellen sind zumeist PDGFRa/Nkd2 doppelt-negative Zellen, während Collal positive Zellen zumeist auch PDGFRa/Nkd2 doppelt-positiv sind. c. Skalierte Genexpression von Genen, deren Expression positiv- ( ) oder negativ-( ) korreliert zur Nkd2 Expression in humanen PDGFRb- Zellen, dargestellt in Abbildung 2 a-c. d. Repräsentative Abbildung einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung von PDGFRa, PDGFRb und NKD2 in n=36 humanen Nieren. Von oben nach unten: Darstellung NKD2 + PDGFRa + PDGFRb + DAPI/ Darstellung NKD2/Darstellung NKD2 + PDGFRa/Darstellung NKD2 + PDGFRb/Darstellung NKD2 + DAPI e. Prozent NKD2+ Zellen von PDGFRa/PDGFRb doppelt-positiven Zellen, quantifiziert aus einer RNA in-situ Hybridisierung von Patienten mit einer schwachen oder starken interstitiellen Fibrose (geblindet scored durch einen Nephropathologen) f. Western blot Verifikation einer lentiviralen Nkd2 Überexpression. Ein HA-tag wurde dem exogen überexprimierten Protein angehängt. g. Expression von Col1a1, Fibronectin (Fn) and Acta2 (aSMA) quantifiziert durch qPCR nach Nkd2 Überexpression in humanen immortalisierten PDGFRb+ Zellen, die mit transforming growth factor beta (TGFb) oder vehicle (PBS) behandelt wurden. h. Verifikation des Nkd2 knock-outs mittels Western-blot Analyse in multiplen Einzelzellklonen (1,2,3) im Vergleich zu non targeting gRNA Klonen (NTG). Die Nkd2 Proteinexpression ist in Klon 2 aufgrund einer großen Insertion komplett deletiert, während in den Klonen 1 und 3 nur eine reduzierte Nkd2 Proteinexpression durch kleinere indel j. GSEA (Gene set enrichment analysis) von ECM Genen in Nkd2-dysregulierten PDGFRb-Nierenzellen. „Shallow“ wurde nachgewiesen in den Klonen 1+3, in denen das NKD2 Protein weiterhin nachweisbar ist. „Severe“ wurde in Klon 2 nachgewiesen. k. Veränderung der Stärke der PID Signalkaskade in PDGFRb+ NKD2-KO Klonen und Überexpression (up bedeutet verstärkte Regulation der Gene unter den indizierten Kondition und down bedeutet verringert regulierte Gene) 1. Repräsentative Abbildung einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung von PDGFRa, PDGFRb und NKD2 in humanen iPSC-abstammenden Nieren-Organoiden. Von oben nach unten: Nachweis von Nkd2 + PDGFRa + Col1a1 + DAPI/ Nachweis von Nkd2/ Nachweis von Nkd2 + PDGFRa/ Nachweis von Nkd2 + Col1a1/ Nachweis von Nkd2 + DAPI m. Quantifizierung der Fluoreszenz Intensität von NKD2 in Nieren Organoiden. n. Immunofluoreszenz Färbung von Collal (schwarz) in iPSC-abstammenden Nieren-Organoiden. o. Quantifizierung des Kollagengehalts in NierenOrganoiden. ##p<0.01, ####p<0.0001 1 way ANOVA followed by Bonferroni' post-hoc test (vs. control NTG). *P < 0.05, **p< 0.01, and ***p < 0.001, ****p <0.0001 in t Test (e+m) oder 1-seitigen ANOVA mit anschließenden Bonferroni' post-hoc Test (g, i vs. TGFb NTG)). Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standartabweichung. Maßstableiste: in c 10 µm, in 1+n 50 µm.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Bevor die Erfindung im Detail beschrieben wird, ist es zu verstehen, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen Bestandteile der beschriebenen Geräte oder Prozessschritte der beschriebenen Methoden beschränkt ist, da solche Geräte und Methoden variieren können. Es ist auch zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie nur zur Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht als Einschränkung gedacht ist. Es ist zu beachten, dass die in der Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendeten Singularformen „ein“, „eine“ und „die“ Singular- und/oder Pluralreferenzen einschließen, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Falls Parameterbereiche angegeben werden, die durch numerische Werte begrenzt sind, wird davon ausgegangen, dass die Bereiche diese Begrenzungswerte einschließen.
  • Es ist ferner zu verstehen, dass die hier offengelegten Ausführungsformen nicht als einzelne Ausführungsformen zu verstehen sind, die sich nicht aufeinander beziehen würden. Merkmale, die im Zusammenhang mit einer Ausführungsform diskutiert werden, sollen auch im Zusammenhang mit anderen hier gezeigten Ausführungsformen offenbart werden. Wenn in einem Fall ein bestimmtes Merkmal nicht mit einer Ausführungsform, sondern mit einer anderen offenbart wird, würde der Fachmann verstehen, dass dies nicht unbedingt bedeutet, dass dieses Merkmal nicht mit der anderen Ausführungsform offenbart werden soll. Der Fachmann wird verstehen, dass es der Sinn dieser Anmeldung ist, dieses Merkmal auch für die andere Ausführungsform zu offenbaren, dass dies aber aus Gründen der Klarheit und um die Spezifikation in einem überschaubaren Umfang zu halten, nicht getan wurde.
  • Ferner wird der Inhalt der hierin genannten Dokumente des Standes der Technik durch Bezugnahme einbezogen. Dies gilt insbesondere für Dokumente des Standes der Technik, die Standard- oder Routineverfahren offenbaren. In diesem Fall hat die Einbeziehung durch Bezugnahme vor allem den Zweck, eine ausreichende Offenbarung zu ermöglichen und langwierige Wiederholungen zu vermeiden.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine gegebene Zelle, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    • (i) Hemmen oder Reduzieren der nkd2-Genexpression in der Zelle
    • (ii) Fördern des Abbaus des NKD2-Proteins in der Zelle, und/oder
    • (iii) Hemmen oder Reduzieren der NKD2-Proteinaktivität in der Zelle.
  • Die Hemmung oder Reduzierung der nkd2-Genexpression kann beispielsweise durch nkd2-Gen-Knock-down, Knock-out, konditionalen Gen-Knock-out, Genveränderung, RNA-Interferenz, siRNA und/oder Antisense-RNA erreicht werden.
  • Die Hemmung oder Reduzierung der NKD2-Proteinaktivität kann durch Verwendung eines Wirkstoffs erreicht werden, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet.
  • Vorzugsweise ist die gegebene Zelle eine Nierenzelle, mehr bevorzugt eine Nieren-Myofibroblastenzelle, am meisten bevorzugt eine terminal differenzierte Nieren-Myofibroblastenzelle.
  • Das NKD2-Protein hat sich als WNT-Antagonist erwiesen. Die Naked Cuticle (NKD)-Familie umfasst die nackte Kutikula von Drosophila und ihre beiden Vertebraten-Orthologe, das Naked Cuticle Homolog 1 (NKD1) und 2 (NKD2). Der Nkd2-Genlokus befindet sich auf dem Chromosom 5p15.3. Ein Verlust der Heterozygotie wurde in diesen Regionen bei verschiedenen Tumorarten, einschließlich Brustkrebs, häufig gefunden. Es wurde berichtet, dass sowohl NKD1 als auch NKD2 die kanonische Wnt-Signalisierung antagonisieren, indem sie über ihre EF-Hand-ähnlichen Motive mit Dishevelled interagieren (Hu et al 2006). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass NKD2 über seine TGFa-Bindungsregion an Dishevelled bindet (Li et al. 2004). Humanes NKD1 und 2 sind nur zu 40 % identisch zueinander, während sie zu ihren jeweiligen Orthologen in der Maus zu etwa 70 % identisch sind.
  • Der C-Terminus von NKD2 ist hochgradig ungeordnet, während der N-Terminus von NKD2 den größten Teil der funktionellen Domäne enthält, die Myristoylierung, ein EF-Hand-Motiv, eine Dishevelled-Bindungsregion und ein Vesikelerkennungs- und Membrantargeting-Motiv umfasst (Li et al 2004; Rousset et al 2001; Zeng et al 2000). Es wird angenommen, dass NKD2 durch seine verschiedenen funktionellen Motive als Schalterprotein fungiert (Hu et al 2006). Die Promotorregion von NKD2 ist in Glioblastomzellen hypermethyliert.
  • Wie hierin beschrieben, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung NKD2 als therapeutisches Ziel für die Behandlung von Nierenfibrose identifiziert. Es wurde festgestellt, dass Nkd2 ausschließlich in terminal differenzierten PDGFRa+/PDGFRb+ Myofibroblasten exprimiert wird, die hohe Expressionswerte des extrazellulären Matrixproteins Kollagen-1 aufweisen. Dieses und andere Matrixproteine werden von Myofibroblasten produziert, die überwiegend durch Differenzierung aus Fibroblasten und Perizyten entstehen. Mehr als 40 % aller Kollagen-1-produzierenden Zellen sind nachweislich Nkd2/PDGFRa+. Zellen, die Markerproteine für Perizyten und Fibroblasten exprimieren und nur geringe Mengen an Matrixproteinen sezernieren, fehlt die Nkd2-Expression. Darüber hinaus wurde in Nkd2-exprimierenden Myofibroblasten eine erhöhte Aktivität von pro-fibrotischen Signaltransduktionswegen, wie TGF-, Wnt- und TNF-Signaltransduktionswegen, nachgewiesen. In Nkd2-Überexpressions- bzw. Depletionsexperimenten wurde gezeigt, dass Nkd2 für die Produktion von extrazellulären Matrixproteinen relevant ist. Lentivirale Überexpression von Nkd2 in humanen Fibroblasten führte zu einer erhöhten Expression von pro-fibrotischen Matrixproteinen wie Kollagen-1 und Fibronektin nach Stimulation durch den pro-fibrotischen Faktor TGF-. Es konnte gezeigt werden, dass der CRISPR/Cas9-vermittelte Knockout von Nkd2 zu einer signifikanten Reduktion der Expression von Kollagen-1, Fibronektin und ACTA2 führt. Knock-down von Nkd2 mittels siRNA in Organoiden, die alle Kompartimente der humanen Niere umfassen, in denen durch Stimulation mit IL1-13 fibrotische Veränderungen induziert worden waren, führte nachweislich zu einer reduzierten Kollagen-1-Expression und Fibrose.
  • Bei dem NKD2-Protein kann es sich um ein Säugetier-, Nicht-Primaten-, Primaten- und insbesondere um ein humanes NKD2-Protein oder ein Fragment davon handeln.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) Protein oder ein Fragment davon bindet.
  • Das Verfahren kann mindestens die folgenden Schritte umfassen
    • (i) Bereitstellen des NKD2-Proteins oder eines Fragments davon,
    • (ii) Zugabe von mindestens einem Wirkstoff, der auf Bindung an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon untersucht werden soll, und
    • (iii) Identifizieren des mindestens einem Wirkstoff, der an das NKD2-Protein oder das Fragment davon gebunden hat.
  • Vorzugsweise ist der zu screenende und zu identifizierende Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung ein NKD2-Inhibitor oder -Antagonist.
  • Der Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus der Gruppe bestehend aus einer niedermolekularen Verbindung, einem Peptid und einem Biologikum ausgewählt werden.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „niedermolekulare Verbindung“, „kleines Molekül“ („smol“) oder „chemisches Arzneimittel“ auf eine organische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (< 1.000 Dalton), oft mit einer Größe in der Größenordnung von 1 nm. Viele Medikamente sind kleine Moleküle. Solche kleinen Moleküle können einen biologischen Prozess regulieren. Kleine Moleküle können in der Lage sein, eine spezifische Funktion eines Proteins zu hemmen. Im Bereich der Pharmakologie bezieht sich der Begriff „kleines Molekül“ insbesondere auf Moleküle, die an spezifische biologische Makromoleküle binden und als Effektor wirken, indem sie die Aktivität oder Funktion eines Ziels verändern. Zum Beispiel gilt Acetylsalicylsäure (ASS) als niedermolekulare Verbindung, die 180 Dalton misst und aus 21 Atomen besteht. Solche niedermolekularen Verbindungen haben oft nur eine geringe Fähigkeit, eine Immunreaktion auszulösen und bleiben über die Zeit relativ stabil.
  • Das „Biologikum“, „biologische Arzneimittel“, „biologische Therapeutikum“ oder „Biopharmazeutikum“ gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon oder ein antigenbindendes Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein oder ein Aptamer.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon bindet, ist der Wirkstoff Mitglied einer Verbindungsbibliothek.
  • Die Verbindungsbibliothek kann z. B. niedermolekulare Verbindungen, Peptide bzw. biologische Verbindungen umfassen.
  • Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „(kombinatorische) Verbindungsbibliothek“ auf Sammlungen von chemischen Verbindungen, kleinen Molekülen, Peptiden oder Makromolekülen wie Proteinen, in denen mehrere verschiedene Kombinationen verwandter chemischer, peptidischer oder biologischer Spezies enthalten sind, die zusammen in bestimmten Screening-Assays oder Identifizierungsschritten verwendet werden können.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für das Naked Cuticle Homolog 2 oder ein Fragment davon oder das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein oder ein Fragment davon kodiert, in einem Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an NKD2 oder ein Fragment davon bindet, wie oben beschrieben.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment oder Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein, das spezifisch an das NKD2-Protein bindet.
  • Vorzugsweise hemmt der Antikörper oder das antigenbindende Fragment oder Derivat davon oder das antikörperähnliche Protein die NKD2-Aktivität, d.h. wirkt als Inhibitor oder Antagonist von NKD2.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Antikörper“ auf ein Protein, das aus einer oder mehreren Polypeptidketten besteht, die von Immunglobulin-Genen oder Fragmenten von Immunglobulin-Genen oder von diesen abgeleiteten cDNAs kodiert werden. Zu diesen Immunglobulin-Genen gehören die Gene der leichten Kette kappa, lambda und der schweren Kette alpha, delta, epsilon, gamma und mu der konstanten Region sowie jedes der vielen verschiedenen Gene der variablen Region.
  • Die grundlegende Struktureinheit des Immunglobulins (Antikörpers) ist normalerweise ein Tetramer, das aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten besteht, den leichten Ketten (L, mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa) und den schweren Ketten (H, mit einem Molekulargewicht von etwa 50-70 kDa). Jede schwere Kette besteht aus einer variablen Region der schweren Kette (abgekürzt als VH oder VH) und einer konstanten Region der schweren Kette (abgekürzt als CH oder CH). Die konstante Region der schweren Kette besteht aus drei Domänen, nämlich CH1, CH2 und CH3. Jede leichte Kette enthält eine variable Region der leichten Kette (abgekürzt als VL oder VL) und eine konstante Region der leichten Kette (abgekürzt als CL oder CL). Die VH- und VL-Regionen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, die auch als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) bezeichnet werden, durchsetzt mit Regionen, die eher konserviert sind und als Framework-Regionen (FR) bezeichnet werden. Jede VH- und VL-Region besteht aus drei CDRs und vier FRs, die vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der Reihenfolge FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 angeordnet sind. Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten bilden eine Bindungsdomäne, die mit einem Antigen interagiert.
  • Die CDRs sind am wichtigsten für die Bindung des Antikörpers bzw. des antigenbindenden Teils davon. Die FRs können durch andere Sequenzen ersetzt werden, sofern die dreidimensionale Struktur, die für die Bindung des Antigens erforderlich ist, erhalten bleibt. Strukturelle Veränderungen des Konstrukts führen meist zu einem Verlust der ausreichenden Bindung an das Antigen.
  • Der Begriff „antigenbindender Teil“ des (monoklonalen) Antikörpers bezieht sich auf ein oder mehrere Fragmente eines Antikörpers, die die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an das Antigen in seiner nativen Form beibehalten. Beispiele für antigenbindende Teile des Antikörpers umfassen ein Fab-Fragment, ein monovalentes Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CHI-Domänen besteht, ein F(ab')2-Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Scharnierregion verbunden sind, ein Fd-Fragment, bestehend aus der VH- und CHI-Domäne, ein Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers, und ein dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne und einer isolierten komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) besteht.
  • Der Antikörper, das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein monoklonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann vom Isotyp IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM sein.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „monoklonaler Antikörper (mAb)“ auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation, d.h. einer homogenen Population, die aus einem ganzen Immunglobulin oder einem Fragment oder Derivat davon besteht. Besonders bevorzugt ist ein solcher Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgG, IgD, IgE, IgA und/oder IgM, oder ein Fragment oder Derivat davon.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Fragment“ auf Fragmente eines solchen Antikörpers, die Zielbindungskapazitäten beibehalten, z. B. eine CDR (komplementaritätsbestimmende Region), eine hypervariable Region, eine variable Domäne (Fv), eine schwere IgG-Kette (bestehend aus VH-, CHI-, Scharnier-, CH2- und CH3-Regionen), eine leichte IgG-Kette (bestehend aus VL- und CL-Regionen) und/oder eine Fab und/oder F(ab)2.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Derivat“ auf Proteinkonstrukte, die sich strukturell von dem gängigen Antikörperkonzept unterscheiden, aber dennoch eine gewisse strukturelle Verwandtschaft zu diesem aufweisen, z. B. scFv, Fab und/oder F(ab)2, sowie auf bi-, tri- oder höher spezifische Antikörperkonstrukte. Alle diese Elemente werden im Folgenden erläutert.
  • Weitere dem Fachmann bekannte Antikörperderivate sind Diabodies, Camelid-Antikörper, Domain-Antikörper, bivalente Homodimere mit zwei Ketten, die aus scFvs bestehen, IgAs (zwei IgG-Strukturen, die durch eine J-Kette und eine sekretorische Komponente verbunden sind), Hai-Antikörper, Antikörper, die aus Neuwelt-Primaten-Gerüst plus Nicht-Neuwelt-Primaten-CDR bestehen, dimerisierte Konstrukte, die CH3+VL+VH umfassen, andere Gerüstproteinformate, die CDRs umfassen, und Antikörperkonjugate.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „antikörperähnliches Protein“ auf ein Protein, das (z. B. durch Mutagenese von Ig-Schleifen) so verändert wurde, dass es spezifisch an ein Zielmolekül bindet. Typischerweise umfasst ein solches antikörperähnliches Protein mindestens eine variable Peptidschleife, die an beiden Enden an ein Proteingerüst gebunden ist. Diese doppelte strukturelle Einschränkung erhöht die Bindungsaffinität des antikörperähnlichen Proteins auf ein Niveau, das mit dem eines Antikörpers vergleichbar ist. Die Länge der variablen Peptidschleife besteht typischerweise aus 10 bis 20 Aminosäuren. Das Gerüstprotein kann jedes Protein mit guten Löslichkeitseigenschaften sein. Vorzugsweise ist das Gerüstprotein ein kleines globuläres Protein. Antikörperähnliche Proteine umfassen ohne Einschränkung Affibodies, Anticalins und designte Ankyrin-Proteine und Affilin-Proteine. Antikörperähnliche Proteine können aus großen Bibliotheken von Mutanten abgeleitet werden, z. B. durch Panning aus großen Phage-Display-Bibliotheken, und können in Analogie zu regulären Antikörpern isoliert werden. Auch können antikörperähnliche Bindungsproteine durch kombinatorische Mutagenese von oberflächenexponierten Resten in globulären Proteinen erhalten werden.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Fab“ auf ein IgG-Fragment, das die Antigenbindungsregion umfasst, wobei das Fragment aus einer konstanten und einer variablen Domäne von jeder schweren und leichten Kette des Antikörpers zusammengesetzt ist.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „F(ab)2“ auf ein IgG-Fragment, das aus zwei Fab-Fragmenten besteht, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind.
  • Der hier verwendete Begriff „scFv“ bezieht sich auf ein variables Einzelkettenfragment, das eine Fusion der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen ist, die durch einen kurzen Linker miteinander verbunden sind, der üblicherweise Serin- (S) und/oder Glycin- (G) Reste umfasst. Dieses chimäre Molekül behält die Spezifität des ursprünglichen Immunglobulins bei, trotz der Entfernung der konstanten Regionen und der Einführung eines Linker-Peptids.
  • Modifizierte Antikörperformate sind z. B. bi- oder trispezifische Antikörperkonstrukte, antikörperbasierte Fusionsproteine, Immunkonjugate und ähnliches.
  • IgG, scFv, Fab und/oder F(ab)2 sind Antikörperformate, die dem Fachmann gut bekannt sind. Entsprechende Aktivierungstechniken sind in entsprechenden Lehrbüchern zu finden.
  • Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment davon oder das antigenbindende Derivat davon ein muriner, ein chimärer, ein humanisierter oder ein humaner Antikörper bzw. ein antigenbindendes Fragment oder ein antigenbindendes Derivat davon.
  • Monoklonale Antikörper (mAb), die von der Maus stammen, können unerwünschte immunologische Nebenwirkungen verursachen, da sie ein Protein einer anderen Spezies enthalten, das Antikörper auslösen kann. Um dieses Problem zu überwinden, wurden Methoden zur Humanisierung und Reifung von Antikörpern entwickelt, um Antikörpermoleküle mit minimaler Immunogenität bei Anwendung am Menschen zu erzeugen, während die Spezifität und Affinität des nicht-humanen Elternantikörpers im Idealfall erhalten bleibt. Bei diesen Methoden werden z. B. die Gerüstregionen eines MausmAbs durch entsprechende humane Gerüstregionen ersetzt (sog. CDR-Grafting). WO200907861 offenbart die Erzeugung humanisierter Formen von Maus-Antikörpern durch Verknüpfung der CDR-Regionen nicht-humaner Antikörper mit humanen konstanten Regionen mittels rekombinanter DNA-Technologie. US6548640 von Medical Research Council beschreibt CDR-Transplantationstechniken, und US5859205 von Celltech beschreibt die Herstellung humanisierter Antikörper.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „humanisierter Antikörper“ auf einen Antikörper, ein Fragment oder ein Derivat davon, bei dem mindestens ein Teil der konstanten Regionen und/oder der Gerüstregionen und optional ein Teil der CDR-Regionen des Antikörpers von humanen Immunglobulinsequenzen abgeleitet oder an diese angepasst ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, der durch das oben beschriebene Identifikationsverfahren erhalten wird.
  • Der Wirkstoff hat die Fähigkeit, spezifisch an das Protein Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Wirkstoff spezifisch mit einer hohen oder besonders hohen Affinität und/oder Avidität an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon. In einer bevorzugten Ausführungsform reduziert oder hemmt der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2-Aktivität.
  • Der Begriff „spezifisch binden“, wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass der Wirkstoff eine Dissoziationskonstante KD zum NKD2-Proteinmolekül oder Epitop davon von höchstens etwa 100 M aufweist. In einer Ausführungsform ist die KD etwa 100 M oder niedriger, etwa 50 M oder niedriger, etwa 30 M oder niedriger, etwa 20 M oder niedriger, etwa 10 M oder niedriger, etwa 5 M oder niedriger, etwa 1 M oder niedriger, etwa 900 nM oder niedriger, etwa 800 nM oder niedriger, etwa 700 nM oder niedriger, etwa 600 nM oder niedriger, etwa 500 nM oder niedriger, etwa 400 nM oder niedriger, etwa 300 nM oder niedriger, etwa 200 nM oder niedriger, etwa 100 nM oder niedriger, etwa 90 nM oder niedriger, etwa 80 nM oder niedriger, etwa 70 nM oder niedriger, etwa 60 nM oder niedriger, etwa 50 nM oder niedriger, etwa 40 nM oder niedriger, etwa 30 nM oder niedriger, etwa 20 nM oder niedriger, oder etwa 10 nM oder niedriger, etwa 1 nM oder niedriger, etwa 900 pM oder niedriger, etwa 800 pM oder niedriger, etwa 700 pM oder niedriger, etwa 600 pM oder niedriger, etwa 500 pM oder niedriger, etwa 400 pM oder niedriger, etwa 300 pM oder niedriger, etwa 200 pM oder niedriger, etwa 100 pM oder niedriger, etwa 90 pM oder niedriger, etwa 80 pM oder niedriger, etwa 70 pM oder niedriger, etwa 60 pM oder niedriger, etwa 50 pM oder niedriger, etwa 40 pM oder niedriger, etwa 30 pM oder niedriger, etwa 20 pM oder niedriger oder etwa 10 pM oder niedriger oder etwa 1 pM oder niedriger.
  • Der Wirkstoff kann zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung dienen, insbesondere wobei die chronische Nierenerkrankung eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist.
  • Der Wirkstoff kann eine niedermolekulare Verbindung (smol), ein Peptid oder ein Biologikum sein, wobei das Biologikum vorzugsweise ein Antikörper, ein Fragment davon oder ein Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein oder ein Aptamer ist.
  • Die niedermolekulare Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann neben anderen chemischen Rückgraten, Substituenten, Gruppen oder Resten beispielsweise Alkyl-, Alkenyl, Alkinyl-, Alkoxy-, Aryl-, Alkylen-, Arylen-, Amino-, Halogen-, Carboxylatderivat-, Cycloalkyl-, Carbonylderivat-, Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylen-, Sulfonat-, Sulfat-, Phosphonat-, Phosphat-, Phosphin-, Phosphinoxidgruppen umfassen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Wirkstoffs, der an das Protein Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) bindet und/oder dieses hemmt, in einem Verfahren zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hemmt der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2-Aktivität.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet und/oder dieses hemmt, in einer therapeutisch wirksamen Menge oder Dosis an ein menschliches oder tierisches Subjekt umfasst.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „wirksame Menge“ eine Dosis oder eine Menge, die wirksam ist, in Dosierungen und für Zeiträume, die notwendig sind, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen. Wirksame Mengen können in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Krankheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht und/oder dem Gewicht des Patienten, der pharmazeutischen Formulierung, der Unterart der zu behandelnden Krankheit und dergleichen variieren, können aber dennoch von einem Fachmann routinemäßig bestimmt werden.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrtifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper oder das antigenbindende Fragment oder Derivat davon oder das antikörperähnliche Protein, wie oben beschrieben, oder den Wirkstoff, wie oben beschrieben, und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe umfasst. Vorzugsweise können die Hilfsstoffe aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus pharmazeutisch akzeptablen Puffern, Tensiden, Verdünnungsmitteln, Trägern, Hilfsstoffen, Füllstoffen, Bindemitteln, Schmiermitteln, Gleitmitteln, Sprengmitteln, Adsorbentien und/oder Konservierungsmitteln besteht.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend
    • (i) das Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon bindet und/oder dieses hemmt, wie oben beschrieben, und ferner
    • (ii) Mischen des identifizierten Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die eine Kombination aus (i) dem Antikörper oder antigenbindenden Fragment oder Derivat davon oder antikörperähnlichem Protein, wie oben beschrieben, oder dem Wirkstoff, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet, wie oben beschrieben, oder der pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, und (ii) einer oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Verbindungen umfasst.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Puffer, Tenside, Verdünnungsmittel, Träger, Exzipienten, Füllstoffe, Bindemittel, Gleitmittel, Desinfektionsmittel, Adsorptionsmittel und/oder Konservierungsmittel umfassen.
  • Die besagte pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln oder Perlen verabreicht werden. In wässriger Form kann die pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung bereit sein, während die Formulierung in lyophilisierter Form vor der Verabreichung in eine flüssige Form überführt werden kann, z. B. durch Zugabe von Wasser für Injektionszwecke, das ein Konservierungsmittel wie z. B., aber nicht beschränkt auf, Benzylalkohol, Antioxidantien wie Vitamin A, Vitamin E, Vitamin C, Retinylpalmitat und Selen, die Aminosäuren Cystein und Methionin, Zitronensäure und Natriumcitrat, synthetische Konservierungsmittel wie die Parabene Methylparaben und Propylparaben enthalten kann oder nicht.
  • Die pharmazeutische Formulierung kann ferner einen oder mehrere Stabilisatoren enthalten, die z. B. eine Aminosäure, ein Zuckerpolyol, ein Disaccharid und/oder ein Polysaccharid sein können. Die pharmazeutische Formulierung kann weiterhin ein oder mehrere Tenside, ein oder mehrere Isotonisierungsmittel und/oder einen oder mehrere Metallionenchelatoren und/oder ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten.
  • Die pharmazeutische Formulierung, wie hierin beschrieben, kann zumindest für eine orale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung geeignet sein. Alternativ kann das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Depotformulierung bereitgestellt werden, die die verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs über einen bestimmten Zeitraum ermöglicht.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Primärverpackung, wie z. B. eine vorgefüllte Spritze oder ein vorgefüllter Pen, ein Fläschchen oder ein Infusionsbeutel, bereitgestellt, die die Formulierung gemäß dem vorhergehenden Aspekt der Erfindung umfasst.
  • Die vorgefüllte Spritze oder der Pen kann die Formulierung entweder in gefriergetrockneter Form (die dann vor der Verabreichung z. B. mit Wasser für Injektionszwecke aufgelöst werden muss) oder in wässriger Form enthalten. Die Spritze oder der Pen ist häufig ein Einwegartikel zum einmaligen Gebrauch und kann ein Volumen zwischen 0,1 und 20 ml haben. Die Spritze oder der Pen kann jedoch auch eine Mehrwegspritze oder ein Mehrdosen-Pen sein.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein therapeutisches Kit, umfassend:
    • (i) die pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben,
    • (ii) eine Vorrichtung zur Verabreichung der Zusammensetzung, und
    • (iii) optional eine Gebrauchsanweisung.
  • Sequenzen
  • Tabelle 1: humane NKD2-Aminosäuresequenz
    SEQ ID Nr. Sequenz Beschreibung
    SEQ ID Nr. 1
    Figure DE102020128677A1_0001
    		 NKD2 Protein, human
  • Ausführungsbeispiele
  • Obwohl die Erfindung in den Zeichnungen und der vorstehenden Beschreibung detailliert dargestellt und beschrieben ist, sind diese Darstellungen und Beschreibungen als illustrativ oder beispielhaft und nicht einschränkend zu betrachten; die Erfindung ist nicht auf die offenbarten Ausführungsformen beschränkt. Die Erfindung ist nicht auf die offengelegten Ausführungsformen beschränkt. Andere Variationen der offengelegten Ausführungsformen können von Fachleuten bei der Ausführung der beanspruchten Erfindung aus einem Studium der Zeichnungen, der Offenbarung und der beigefügten Ansprüche verstanden und ausgeführt werden. In den Ansprüchen schließt das Wort „umfassend“ andere Elemente oder Schritte nicht aus, und der unbestimmte Artikel „ein“ oder „eine“ schließt eine Mehrzahl nicht aus. Die bloße Tatsache, dass bestimmte Maßnahmen in voneinander verschiedenen abhängigen Ansprüchen rezitiert werden, bedeutet nicht, dass eine Kombination dieser Maßnahmen nicht vorteilhaft eingesetzt werden kann. Etwaige Bezugszeichen in den Ansprüchen sind nicht als Einschränkung des Anwendungsbereichs zu verstehen.
  • Alle hier offengelegten Aminosäuresequenzen sind vom N-Terminus zum C-Terminus dargestellt; alle hier offengelegten Nukleinsäuresequenzen sind 5'->3' dargestellt.
  • Beispiel 1: Materialien und Methoden
  • Verarbeitung von humanem Gewebe
  • Nierengewebe wurde vom Chirurgen aus normalen und Tumorregionen entnommen. Das Gewebe wurde auf Trockeneis eingefroren oder in vorgekühlter University of Wisconsin-Lösung (#BTLBUW, Bridge to Life Ltd., Columbia, U.S.) eingelegt und auf Eis in unser Labor transportiert. Die Gewebe wurden in ca. 0,5-1mm3 große Stücke geschnitten und dann in ein C-Röhrchen (Miltenyi Biotec) überführt und auf einem gentle-MACS (Miltenyi Biotec) mit dem Programm spleen 4 verarbeitet. Das Gewebe wurde dann für 30 min bei 37°C unter Schütteln bei 300 RPM in einer Verdauungslösung mit 25µg/ml Liberase TL (Roche) und 50µg/ml DNase (Sigma) in RPMI (Gibco) verdaut. Nach der Inkubation wurden die Proben erneut auf einem gentle-MACS (Miltenyi Biotec) mit dem gleichen Programm bearbeitet. Die resultierende Suspension wurde durch ein 70µm-Zellsieb (Falcon) gegeben, mit 45 ml kaltem PBS gewaschen und 5 Minuten bei 500 g bei 4°C zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einem Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung gezählt. Lebende, einzelne Zellen wurden durch FACS-Sortierung und Gating auf DAPI-negative Zellen mit weiterer Anreicherung von Epithelzellen durch CD10-Färbung oder PDGFRß-Färbung für Fibroblasten angereichert. Im Durchschnitt dauerte es 5-6 Stunden von der Gewinnung der Biopsien bis zur Herstellung der Einzelzellsuspensionen.
  • Mäuse
  • PDGFRßCreERt2 (d. h. B6-Cg-Gt(Pdgfrß-cre/ERT2)6096Rha/J, JAX Stock #029684) und Rosa26tdTomato (d. h. B6-Cg-Gt(ROSA)26Sorttm(CAG-tdTomato)Hze/J JAX Stock # 007909) wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) erworben. Die Nachkommen wurden mittels PCR nach dem Protokoll der Jackson Laboratories genotypisiert. Pdgfrb-BAC-eGFP-Reportermäuse wurden von N. Heintz (The Rockefeller University) für das GENSAT-Projekt entwickelt. Die Genotypisierung aller Mäuse wurde mittels PCR durchgeführt. Die Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen an der University of Edinburgh oder der RWTH Aachen untergebracht. Die UUO wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.2 Kurz gesagt, nach einer Flankeninzision wurde der linke Ureter auf Höhe des unteren Pols mit zwei 7.0 Bändern (Ethicon) abgebunden. Die Mäuse wurden am Tag 10 nach der Operation geopfert. Die Tierversuchsprotokolle wurden vom LANUV-NRW, Deutschland und von den UK Home Office Regulations genehmigt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit deren Richtlinien durchgeführt. Für SMART-Seq2 wurden männliche PDGFRbeGFP-Mäuse verwendet, die innerhalb von 10 Tagen geboren und zum Zeitpunkt der Operation zwischen 9 und 11 Wochen alt waren und wie angegeben geopfert wurden. Für die induzierbare Schicksalsverfolgung erhielten PDGFRbCreER;tdTomato-Mäuse (8 Wochen alt, 2 männlich / 3 weiblich) dreimal Tamoxifen über die Magensonde (10mg p.o.), gefolgt von einer Washout-Periode von 21 Tagen, und wurden dann einer UUO-Operation oder Scheinoperation (wie oben) unterzogen und 10 Tage nach der Operation geopfert.
  • Einzelzellisolierung in Maus
  • Euthanisierte Mäuse wurden über das linke Herz mit 20 ml NaCl 0,9% perfundiert, um Blutreste aus dem Gefäßsystem zu entfernen. Die Nieren wurden chirurgisch entfernt, in kleine Scheiben geschnitten und in ein 15 ml Röhrchen (Falcon) auf eiskaltes PBS mit 1% FCS gelegt. Um einzelne Nierenzellen zu isolieren, wurde eine Kombination aus enzymatischem und mechanischem Aufschluss verwendet, wie oben für die Isolierung von humanen Einzelzellen beschrieben. Insgesamt lag die Lebensfähigkeit bei dieser Methode bei über 80%.
  • FACS
  • Die Zellen wurden mit den folgenden monoklonalen, direkt fluorochrom konjugierten Antikörpern markiert: anti-CD10 human (Klon HI10a, biolegend), anti-PDGFRb Maus (Klon PR7212, R&D), anti-PDGFRalpha Maus (Klon APA5, biolegend), anti-CD31 Maus (Klon Meg13.3, biolegend), anti-CD45 Maus (Klon 30_F11). Die isolierten Zellen wurden in 1% PBS-FBS auf Eis in einer Endkonzentration von 1x107 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden mit Fc-Block (TruStainFx human, TruStainFx Maus Klon 91, biolegend) vorinkubiert und anschließend mit den oben genannten Antikörpern für 30 Minuten auf Eis lichtgeschützt in 2% FBS/PBS verdünnt inkubiert. Für die Färbung mit humanem anti-PDGFRb wurde Ziege anti-Maus Dyelight 405 (poly24091, biolegend) als Sekundärantikörper verwendet. Alle Kompensationen wurden zum Zeitpunkt der Aufnahme unter Verwendung von Einzelfarbfärbungen und Negativfärbungen und Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen durchgeführt. Die Zellen wurden im Semi-Purity-Modus mit dem Ziel einer Effizienz von >80% mit dem SONY SH800 Sorter (Sony Biotechnology; 100 um Düse Sortierchip Sony) sortiert. Für die plattenbasierte Sortierung für SMART-Seq wurde die Zellsortierung mit einem FACS Aria II Gerät (Becton Dickinson, Basel, Schweiz) durchgeführt.
  • Einzelzell-Assays inkl. Smart-Seq2 und 10X Genomics 3' sc-RNA-Seq (V2 und V3)
  • Für Smart-Seq2 wurden Einzelzellen von SciLifeLab - Eukaryotic Single cell Genomic Facility (Karolinska Institut) prozessiert. Vor dem Versand wurden die Einzelzellen in Wells einer 384-Well-Platte mit vorbereiteten Lysepuffer sortiert. Die Bibliotheken wurden auf einem Illumina HiSeq 4500 sequenziert. Die Einzelzelllösung von Zellen und primären humanen Nierenzellen wurden parallel auf einem Chromium Single Cell Chip-Kit ausgeführt und die Bibliotheken wurden mit dem Chromium Single Cell 3'-Bibliotheks-Kit V2 und dem i7 Multiplex-Kit (PN-120236, PN-120237, PN-120262, 10x Genomics) entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Qualität der Bibliothek wurde mit dem D1000 ScreenTape auf dem 2200 TapeStation System (Agilent Technologies) bestimmt. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina Novaseq-Plattform mit S1- und S2-Fließzellen (Ilumina) durchgeführt.
  • Bewertung humaner Nierenfibrose
  • PAS-gefärbte Schnitte der Nieren wurden von einem erfahrenen Nephropathologen verblindet analysiert und ausgewertet. Alle Schnitte wurden auf spezifische Nierenerkrankungen untersucht, jedoch wurden keine Hinweise auf spezifische glomeruläre oder tubulointerstitielle oder vaskuläre Erkrankungen, abgesehen von altersbedingten Veränderungen oder hypertensiver Nephropathie, festgestellt. Das Ausmaß der interstitiellen Fibrose und der tubulären Atrophie wurden als zwei separate Parameter in % der betroffenen Kortikalisfläche bewertet. Das Ausmaß der globalen Glomerulosklerose wurde als % der global sklerotischen Glomeruli von allen Glomeruli geschätzt. Das Ausmaß der Arteriosklerose, d. h. die fibroelastische Verdickung der Intima im Vergleich zur Dicke der Media, wurde auf einer Skala von 0 bis 3 bewertet, wobei 0 - nicht, 1 - leicht (< 50%), 2 - mittel (51-100%) und 3 - schwer (>100% verdickte Intima im Vergleich zur Media).
  • Für die Immunhistochemie von Kollagen I und III wurden um-Schnitte von in Formalin fixiertem und in Paraffin eingebettetem Nierengewebe für die indirekte Immunoperoxidase aufbereitet, indem das Paraffin durch Inkubation in Xylol (3x 5min) und anschließende Rehydrierung mit absteigender Konzentration von Ethanol (3×2 Minuten 100 % Ethanol, 2 x 2 Minuten 95 % Ethanol, 1 x 2 Minuten 70 % Ethanol) entfernt wurde. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3 % H2O2 in destilliertem Wasser für 10 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und gewaschen (2x in PBS). Anschließend erfolgte die Inkubation mit primären Antikörpern [Collagen I (Southern Biotech) Kat. 1310-01; Collagen III (Southern Biotech) Kat. 1330-01] in 1 % BSA/PBS bei Raumtemperatur für 1 Stunde in einer feuchten Kammer. Danach wurden die Objektträger zweimal für 5 Minuten in PBS gewaschen und biotinylierte Sekundärantikörper zugegeben (30 Minuten). Der Avidin-Biotin-Komplex wurde zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde für 10 Minuten bei 37 °C in DAB-Lösung inkubiert. Die Reaktion wurde durch Waschen in H2O gestoppt und die Objektträger wurden für 4 Minuten mit Methylgrün gegengefärbt. Schließlich wurden die Objektträger in aufsteigendem Ethanol und Xylol dehydriert. Mit einem Ganz-Objektträger-Scanner (NanoZoomer HT, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) wurden die vollständig digitalisierten Bilder der immunhistochemisch gefärbten Objektträger mit der Betrachtungssoftware NDP.view (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) und ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) weiterverarbeitet und analysiert. Der Prozentsatz der positiv gefärbten Fläche wurde in der Nierenrinde in verblindeter Weise analysiert.
  • Antikörper und Immunofluoreszenzfärbungen
  • Nierengewebe wurde für 2 Stunden bei RT in 4% Formalin fixiert und nach Dehydrierung in 30%iger Saccharose über Nacht in OCT eingefroren. Unter Verwendung von 5-10 µm Kryoschnitten wurden die Objektträger in 5%igem Eselserum geblockt, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation des primären Antikörpers, 3-maligem Waschen für 5 Minuten in PBS und anschließender Inkubation der sekundären Antikörper für 45 Minuten. Nach DAPI (4',6'-'Diamidino-2-Phenylindol)-Färbung (Roche, 1:10.000) wurden die Objektträger mit ProLong Gold (Invitrogen, #P10144) aufgezogen. Folgende Antikörper wurden verwendet: anti-mouse PDGFRa (AF1062, 1:100, R&D), anti-CD10 human (Klon HI10a, 1:100, biolegend), anti-HNF4a (Klon C11F12, 1:100, Cell Signalling), Pan-Cytokeratin TypI/II (Invitrogen, Ref. MAI-82041), Dach1 (Sigma, HPA012672), Collal (Abcam, ab34710), ERG (abcam, ab92513), AF488 Esel-Anti-Ziege (1:100, Jackson Immuno Research), AF647 Esel-Anti-Kaninchen (1:200, Jackson Immuno Research).
  • Konfokale Bildgebung
  • Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Nikon AIR unter Verwendung von 40X und 60X Objektiven (Nikon) aufgenommen. Die Rohdaten wurden mit Nikon Software oder ImageJ verarbeitet.
  • Mikroarray aus humanem Nierengewebe
  • Paraffin-eingebettete, formalin-fixierte Nierenproben von 98 nicht-tumorösen humanen Nierenproben der Biobank Eschweiler/Aachen wurden auf Basis einer zuvor durchgeführten PAS-Färbung ausgewählt. Pro Probe wurden zufällig Bereiche ausgewählt und aus jeder Nierenprobe wurde mit dem TMArrayerTM (Pathology Devices, Beecher Instruments, Westminster, USA) ein 2-mm-Kern entnommen. Jeder Kern wurde in einem Empfängerblock in einem 2 mm-Raster angeordnet, das etwa 2,5 cm2 abdeckte, und 5 Mikrometer dicke Schnitte wurden geschnitten und mit histologischen Standardtechniken bearbeitet.
  • RNA-In-situ-Hybridisierung
  • Die In-situ-Hybridisierung wurde mit formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben und dem RNAScope Multiplex Detection KIT V2 (RNAScope, #323100) nach dem Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Der Antigen-Retrieval wurde für 22 min bei 96°C anstelle von 15 min bei 99°C im Wasserbad durchgeführt. 3-5 Tropfen der Pretreatment-1-Lösung wurden nach der Durchführung des Antigen-Retrievals für 10 Minuten bei RT inkubiert. Die Waschschritte wurden dreimal 5 Minuten durchgeführt. Die folgenden Sonden wurden für den RNAscope-Assay verwendet: Hs-PDGFRß #548991-C1, Hs-PDGFRa #604481-C3, Hs-Col1a1 #401891, Hs-COL1A1 #401891-C2, Hs-MEG3 #400821, Hs-NKD2 #581951-C2 (targeting 236-1694 von NM_033120. 3), Hs-Postn #409181-C2 und 409181-C3, Hs-Pecam1 #487381-C2, Hs-Cc119 #474361-C3, Hs-Cc121 #474371-C2, Hs-Notch3 #558991-C2, Mm-Col1a1 #319371, Mm-PDGFRa #480661-C2, Mm-PDGFRb #411381-C3.
  • Bildquantifizierung - ISH-Bildanalyse
  • Es wurde eine systematische Zufallsauswahl getroffen, um mindestens 3 repräsentative tubulo-interstitielle Bereiche pro Bild auszuwählen. Anschließend wurde jeder fluoreszierende Punkt (Transkript) manuell mit dem Zellzählungstool von Fiji (Max-Planck-Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden, Deutschland) annotiert. Einzelne Kerne wurden dann mit einem selbst entwickelten Tool ( https://gitlab.com/mklaus/segment_cells_register_marker) isoliert, das auf Watershed (Grenzen: 0,1-0,4) zur Identifizierung benachbarter Kerne, Kantendetektion für unvollständige Objekte und Auswahl der Objektgröße (Grenzen: 12-180 µm2) basiert. Die Gesamtzahl der einzelnen Punkte wurde dann für jeden isolierten Nukleus neu berechnet. Punkte, die sich außerhalb von Kernen befanden, wurden nicht in diese Analyse einbezogen, da die Komplexität der Nierenmorphologie in Kombination mit der hohen zellulären Dichte uns daran hinderte, den Ursprung von nicht-kernigen Transkripten zu bestimmen. Für die Meg3- und NKD2-Analyse von PDGFRalb-Zellen wurden die Bilder mit QPath analysiert, nachdem die Kerne segmentiert und die Zellen auf der Basis von >1 pos. spot pro Bildgebungskanal gezählt wurden. Für die Col1a1-IF-Quantifizierung oder NKD2-ISH-Quantifizierung wurden die Bilder in RGB-Kanäle aufgeteilt und die integrierte Fluoreszenzdichte pro Bild mit ImageJ bestimmt.
  • Quantitative RT-PCR
  • Die Zellpellets wurden geerntet und mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (qiagen). 200 ng Gesamt-RNA wurden mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) revers transkribiert. Die qRT-PCR wurde mit dem iTaq Universal SYBR Green Supermix (Biorad) und dem Bio-Rad CFX96 Real Time System mit dem C1000 Touch Thermocycler durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren 95°C für 3 Minuten, dann 40 Zyklen von 95°C für 15 Sekunden und 60°C für 1 Minute, gefolgt von einem Zyklus von 95°C für 10 Sekunden. GAPDH wurde als Housekeeping-Gen verwendet. Die Daten wurden mit der 2-CT-Methode ausgewertet. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: Liste der RT-PCR-Primer-Sequenzen (human)
    Genes Forward primer Reverse primer
    Collagen type I alpha 1 5'-CCCAGCCACAAAGAGTCTACA 5'-ATTGGTGGGATGTCTTCGTCT
    fibronectin 1 5'-ACAAACACTAATGTTAATTGCCCA 5'-TC'GGGAATCTTC'TC'TGTCAGC
    actin alpha 2, smooth muscle 5'-ACTGCCTTGGTGTGTGACAA 5'-CACCATCACCCCCTGATGTC
    postn 5'-GGCTCATAGTCGTATCAGGGG 5'-GGTGCCCAAAATCTGTTGAAGG
    Nkd2 5'-CACGTCAGGAGGCCCAGTA 5'-TGTAGTTCTCAATCCCGGCG
    cFos 5'-GGAGAATCCGAAGGGAAAGGA 5'-AGTTGGTCTGTCTCCGCTTG
    Ogn 5'-CCATAATGCCCTGGAATCCGT 5'-CAATGCGGTCCCGGATGTAA
    GAPDH 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA 5'-TGGACTCCACGACGTACTCA
  • Generierung einer humanen PDGFRb+ Zelllinie
  • PDGFRb+-Zellen wurden aus der gesunden humanen Nierenrinde einer Nephrektomie-Probe (71 Jahre alter männlicher Patient) isoliert, indem eine Einzelzellsuspension (wie oben beschrieben) hergestellt und anschließend eine MACS-Separation (Miltenyi biotec, autoMACS Pro Separator, # 130-092-545, autoMACS Columns #130-021-101. Für die Isolierung wurde die Einzelzellsuspension in zwei Schritten gefärbt, wobei zuerst ein spezifischer PDGFRb-Antikörper (R&D # MAB1263 Antikörper, Verdünnung 1:100) und anschließend ein zweiter Inkubationsschritt mit einer Anti-Mouse IgG1-MicroBeads-Lösung (Miltenyi, #130-047-102,) durchgeführt wurde. Nach MACS wurden die Zellen in DMEM-Medien (Thermo Fisher # 31885) mit 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin für 14 Tage kultiviert und mit SV40LT und HTERT wie folgt immortalisiert. Retrovirale Partikel wurden durch transiente Transfektion von HEK293T-Zellen mit TransIT-LT (Mirus) hergestellt. Zwei Typen von amphotropen Partikeln wurden durch Co-Transfektion der Plasmide pBABE-puro-SV40-LT (Addgene #13970) oder xlox-dNGFR-TERT (Addgene #69805) in Kombination mit einem Verpackungsplasmid pUMVC (Addgene #8449) und einem pseudotypisierenden Plasmid pMD2.G (Addgene #12259) erzeugt. Retrovirale Partikel wurden mit dem Retro-X Konzentrator (Clontech) 48 Stunden nach der Transfektion 100x konzentriert. Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der Zielzellen mit seriellen Verdünnungen der retroviralen Überstände (1:1-Mischung der konzentrierten Partikel mit SV40-LT bzw. hTERT) für 48 h. Anschließend wurden die infizierten PDGFRb+-Zellen 72 h nach der Transfektion für 7 d mit 2 µg/ml Puromycin selektiert.
  • Kultivierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) abgeleiteter Nierenorganoide
  • Humaner iPSC-15-Klon 0001 wurde von der Stem Cell Facility des Radboud University Center, Nijmegen, Niederlande, erhalten. Humane iPSC wurden auf Geltrex-beschichteten Platten in E8-Medium (Life Technologies) gezüchtet. Bei 70-80% Konfluenz wurden die iPSC mit 0,5 mM EDTA abgetrennt und die Zellaggregate durch Teilung im Verhältnis 1:3 reseediert. Humane iPSC wurden mit einem modifizierten Protokoll in Anlehnung an Takasato et al. (Nature, 2015) differenziert und in einer Dichte von 18.000 Zellen pro cm2 auf geltrex-beschichteten Platten (Greiner) ausgesät. Die Differenzierung in Richtung intermediäres Mesoderm wurde mit CHIR99021 (6 µM, Tocris) in E6-Medium (Life Technologies) für 3 und 5 Tage initiiert, gefolgt von einer Supplementierung mit FGF 9 (200 ng/ml, RD Systems) und Heparin (1 µg/ml, Sigma Aldrich) in E6 bis Tag 7. Nach 7 Tagen Differenzierung wurden Zellaggregate (300.000 Zellen pro Organoid, Mischung aus 3 und 5 Tage CHIR-differenzierten Zellen) auf Costar-Transwell-Einsätzen kultiviert, um die selbstorganisierende Nephrogenese mit E6-Differenzierungsmedium zu stimulieren. Am Tag 7+18 wurden die Nierenorganoide für siRNA-Knockdown-Experimente wie unten beschrieben verwendet.
  • siRNA-Knockdown von NKD2 in humanen iPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden
  • Der NKD2 siRNA-Knockdown wurde entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt (DharmaFECT Transfektionsreagenz und NKD2-spezifische smartpool siRNA, beide Horizon Discovery). Der Transfektionsmaster-Mix und die Scrambled-Kontrollen wurden in Essential 6 Medium (Gibco) hergestellt und zu den Organoiden gegeben. Nach einer initialen Inkubation von 24 h wurden die Transfektionsmaster-Mixe aufgefrischt und IL-1β (Sigma-Aldrich) in einer Konzentration von 100 ng/ml zugegeben, um Fibrose zu induzieren. Die IL-1β-Exposition zusammen mit dem Auffrischen des Transfektions-Mastermixes wurde alle 24 h für zwei kommende Tage wiederholt. 96h nach Transfektionsbeginn wurden die Organoide geerntet und für Paraffinschnitte aufbereitet. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenzfärbung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
  • TGFb-Behandlungsexperimente
  • TGFb (100-21-10UG, Peprotech) in einer Konzentration von 10 ng/ml in PBS wurde nach einer 24-stündigen Serum-Starvation mit 0,5% FCS-haltigem Medium für 24 Stunden zu 75% konfluierenden PDGFRb-Zellen gegeben. Für Inhibitor-Experimente mit T-5224 wurde der Inhibitor (oder Vehikel) 1 Stunde vor Zugabe von TGFb in die Kulturvertiefungen gegeben. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
  • AP-1-Inhibitor-Behandlung
  • T-5224 (c-Fos/AP-1-Inhibitor, Cayman Chemicals, #22904) wurde in DMSO gelöst und bei - 80°C gelagert. DMSO wurde immer in den gleichen Anteilen zu den Kontrollvertiefungen gegeben.
  • Zellproliferation (WST-1-Assay)
  • Der WST-1-Assay mit PDGFRb-Zellen wurde in 96-Wells wie vom Hersteller (Roche Applied Science) empfohlen durchgeführt. Kurz gesagt wurden 1×10^4 PDGFRb-Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platten ausgesät und die Zellen wurden mit T-5224 oder Vehikel (DMSO) in den angegebenen Konzentrationen in dreifacher Ausführung behandelt. Die Zellen wurden für 2h mit dem WST-1-Reagenz inkubiert, bevor sie zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet wurden. Die Absorption wurde sowohl bei 450 nm als auch bei 650 nm (als Referenz) gemessen.
  • ssRNA:CRISPR-Cas9-Vektorkonstruktion, Virusproduktion und Transduktion
  • Die NKD2-spezifische guide RNA (vorwärts 5'-CACCGACTCCAGTGCGATGTCGG -3'; rückwärts 5'- AAACCCGAGACATCGCACTGGAGTC -3') wurden mittels BsmBI-Restriktionsverdau in pL-CRISPR.EFS.GFP (Addgene #57818) kloniert. Lentivirale Partikel wurden durch transiente Co-Transfektion von HEK293T-Zellen mit dem lentiviralen Transferplasmid, dem Verpackungsplasmid psPAX2 (Addgene #12260) und dem VSVG-Verpackungsplasmid pMD2.G (Addgene #12259) unter Verwendung von TransIT-LT (Mirus) hergestellt. Virale Überstände wurden 48-72 Stunden nach der Transfektion gesammelt, durch Zentrifugation geklärt, mit 10% FCS und Polybrene (Sigma-Aldrich, Endkonzentration von 8µg/ml) ergänzt und 0,45µm filtriert (Millipore; SLHP033RS). Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der PDGFRß-Zellen mit viralen Überständen für 48 h. eGFP-exprimierende Zellen wurden einzeln in 96-Well-Platten sortiert. Die expandierten Kolonien wurden mit einem Mismatch-Detection-Assay auf Mutationen untersucht: gDNA, die die CRISPR-Zielstelle überspannt, wurde PCR-amplifiziert und mittels T7EI-Verdau (T7-Endocnuclease, NEB M0302S) analysiert. Um spezifische Mutationsereignisse auf beiden Allelen innerhalb der gezüchteten Klone zu bestimmen, wurde das PCR-Produkt in den pCR™ 4Blunt-TOPO Vektor (Thermo Scientific K287520) subkloniert. Es wurden mindestens 6 Kolonien pro CRISPR-Klon gezüchtet und zur Sanger-Sequenzierung eingesandt (Klon C2: 30 Kolonien wurden sequenziert). Zum Nachweis des vollständigen Knockouts von NKD2 wurde ein Western Blot durchgeführt.
  • Western blot
  • Western Blots wurden nach Standardprotokollen durchgeführt. Kurz gesagt, wurden Zelllysate mit RIPA-Puffer und Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) hergestellt. Die Proteinkonzentrationen der Lysate wurden mittels BCA-Assay (#23225, Pierce, Thermo Scientific) quantifiziert. Die Proteinlysate wurden für 5 min bei 95°C in 4x SDS-Probenladepuffer (BioRad) erhitzt und in 10% SDS-Page-Gele geladen. Anschließend wurden die Proben auf PVDF-Membranen transferiert und die Blots mit primären Antikörpern in 5% Blotto (Thermo Fisher) sondiert: (1:3000 Kaninchen-Anti-Human-NKD2-polyklonaler Antikörper, Invitrogen PA5-61979) für 2 Stunden, gefolgt von einer Inkubation mit sekundärem Antikörper für 1 Stunde nach dem Waschen (1:5000 Meerrettich-Peroxidase-HRP-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper, Vector Laboratories) und entwickelt mit Pierce™ ECL Western Blotting Substrate A und B. Der monoklonale Anti-GAPDH-Antikörper von Maus (NovusBiologicals NB300-320; 1:1000), gefolgt von einem HRP-konjugierten sekundären Anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratories), wurde als Ladekontrolle verwendet.
  • Lentivirale Überexpression von Nkd2
  • Konstruktion des NKD2-Vektors und Generierung von stabilen NKD2-überexprimierenden Zelllinien. Die humane cDNA von NKD2 wurde mittels PCR unter Verwendung der Primersequenzen 5'- atggggaaactgcagtcgaag-3' und 5' ctaggacgggtggaagtggt-3' amplifiziert. Restriktionsstellen und N-terminaler 1xHA-Tag wurden mit den Primern 5'-cactcgaggccaccatgtacccatacgatgttccagattacgctgggaaactgcagtcgaag -3' und 5'-acggaattcctaggacgggtggaagtg-3' in das PCR-Produkt eingeführt. Anschließend wurde das PCR-Produkt mit XhoI und EcoRI verdaut und in pMIG kloniert (pMIG war ein Geschenk von William Hahn (Addgene plasmid # 9044 ; http://n2t.net/addgene:9044; RRID:Addgene_9044). Retrovirale Partikel wurden durch transiente Transfektion in Kombination mit dem Verpackungsplasmid pUMVC (pUMVC war ein Geschenk von Bob Weinberg (Addgene Plasmid # 8449)) und dem Pseudotypisierungsplasmid pMD2.G (pMD2.G war ein Geschenk von Didier Trono (Addgene Plasmid # 12259; http://n2t.net/addgene:12259 ; RRID:Addgene_12259)) unter Verwendung von TransIT-LT (Mirus) hergestellt. Virale Überstände wurden 48-72 Stunden nach der Transfektion gesammelt, durch Zentrifugation geklärt, mit 10% FCS und Polybrene (Sigma-Aldrich, Endkonzentration von 8µg/ml) ergänzt und 0,45µm gefiltert (Millipore; SLHP033RS). Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der PDGFß-Zellen mit viralen Überständen für 48 h. eGFP-exprimierende Zellen wurden einzeln sortiert.
  • Bulk-RNA-Sequenzierung
  • Die RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN) extrahiert. Für rRNA-depleted RNA-seq unter Verwendung von 1 und 10 ng verdünnter Gesamt-RNA wurden Sequenzierungsbibliotheken mit dem KAPA RNA HyperPrep Kit mit RiboErase (Kapa Biosystems) gemäß dem Herstellerprotokoll hergestellt. Die Sequenzierbibliotheken wurden mit quantitativer PCR (New England Biolabs, Ipswich, USA) quantifiziert, äquimolar gepoolt, der finale Pool auf 1,4 nM normalisiert und vor der Sequenzierung mit 0,2 N NaOH denaturiert und mit 400nM Tris pH 8,0 neutralisiert. Die finale Sequenzierung wurde auf einer NextSeq-Plattform (IIlumina) gemäß den Herstellerprotokollen durchgeführt (Illumina, CA, USA).
  • ATAC-seq-Präparation
  • 5000-7500 PDGFRalb pos-Zellen wurden wie oben beschrieben aus frisch isolierten UUO-Nieren FACS-sortiert, zweimal mit kaltem PBS gewaschen und für 5 Minuten bei 500g zentrifugiert. Die Zellpellets wurden dann in 50µl eiskaltem Lysepuffer (10mM Tris-HCl, pH7,5; 10mM NaCl, 3mM MgC12, 0,08% NP40-Ersatz [74385, Sigma], 0,01% Digitonin [G9441, Promega]) lysiert und sofort bei 500g für 9 Minuten zentrifugiert. Die Pellets wurden in 50µl eines Transposase-Reaktionsmixes resuspendiert, der 25µl 2xTD-Puffer (20mM Tris-HCl, pH7,6, 10mM MgC12, 20% DMF), 0,5 µl Tagment-DNA-Enzym 1 [15027865, Illumina] und 24,5µl nukleasefreies Wasser enthält. Die Transpositionsreaktion wurde bei 37°C für 30min bei 350 rpm im Thermoshaker inkubiert. Anschließend wurde die transponierte DNA mit einem MinElute Reaction Cleanup Kit (28204, Qiagen) gereinigt und in 15µl nukleasefreiem Wasser eluiert. Die transponierte DNA wurde mittels PCR (insgesamt 14 Zyklen) unter Verwendung des NEB Next 2x Master Mix (M0541S; New England Biolabs) mit kundenspezifischen Nextera PCR Primern amplifiziert. Die erste PCR wurde mit 50µl Volumen und 6 Zyklen unter Verwendung von NEB Next 2x Master mix und 1,25µM kundenspezifischen Primern durchgeführt; die zweite RT-PCR wurde mit 15µl Volumen für 20 Zyklen unter Verwendung von 5µl (10 %) der voramplifizierten Mischung plus 0,125µM Primer durchgeführt, um die Anzahl der zusätzlich benötigten Zyklen zu bestimmen, wie zuvor beschrieben. Die amplifizierte DNA-Bibliothek wurde mit dem MinElute PCR Purification Kit (28004, Qiagen) gereinigt und in 20µl 10 mM Tris-HCl (pH 8) eluiert. Die Qualität der Bibliothek wurde mit dem Agilent D1000 ScreenTape auf dem 2200 TapeStation System (Agilent Technologies) visualisiert. Die ATAC-seq-Bibliotheken wurden auf Illumina NextSeq 500 für die 75-bp paired-end Sequenzierung geladen.
  • Smart-Seq2-Datenverarbeitung
  • Die anfänglichen Einzelzell-Transkriptomdaten wurden in der Eukaryotic Single-Cell Genomics Facility im Science for Life Laboratory in Stockholm, Schweden, verarbeitet. Die erhaltenen Reads wurden auf den mm10-Build des Mausgenoms gemappt (konkateniert mit Transkripten für eGFP und dem ERCC-Spike-in-Set), um eine Zählung für jedes endogene Gen, Spike-in und eGFP-Transkript pro Zelle zu erhalten. Ribosomale RNA-Gene, ribosomale Proteine und ribosomale Pseudo-Gene wurden herausgefiltert. Wir stellten fest, dass Zellen, die keine Alignments aufwiesen, die entweder eGFP oder PDGFRb zugeordnet waren, nach dem unüberwachten Zellclustering (siehe unten) zu einem einzigen Cluster zusammengefasst wurden. Daher entschieden wir uns, diese Zellen zu entfernen und führten alle Analysen und das Clustering ohne Berücksichtigung dieser Zellen durch (17 Zellen).
  • 10x Einzelzell-RNA-Sea-Datenverarbeitung
  • Die Fastq-Dateien wurden mit Alevin und Salmon (Alevin-Parameter -1 ISR, Salmon Version 0.13.1) verarbeitet, wobei Gencode v29 humanes Transkriptom und Gencode vM20 Maus-Transkriptom als Referenztranskriptome verwendet wurden. Der Alevin-Parameter „Expected Cells“ wurde entsprechend der dreifachen Anzahl von Zellen gesetzt, die nach der Knie-Methode geschätzt wurde, die auf die Read-Counts pro Zell-Barcodes-Verteilung angewendet wurde. Daher produzierte die von Alevin erzeugte UMI-Zählmatrix eine große Anzahl von putativen Zellen, die wir später filtern konnten (siehe nächster Abschnitt).
  • 10x scRNA-Seq Zellfilterung
  • Wir haben ribosomale RNA-Gene (0-1% im Durchschnitt des detektierten RNA-Gehalts pro Zelle) und mitochondrial-kodierte Gene (0-80% im Durchschnitt des detektierten RNA-Gehalts pro Zelle) aus der Hauptgenexpressionsmatrix entfernt. Mitochondrial kodierte Gene wurden entfernt, um zu vermeiden, dass unerwünschte Variationen zwischen Zellen eingeführt werden, die ausschließlich von Änderungen des mitochondrialen Gehalts abhängen könnten. Die log10(Gesamt-UMI-Zählungen pro Zelle)-Verteilung aus der von Alevin (siehe oben) erzeugten Zählmatrix zeigte typischerweise eine bimodale Verteilung, daher wurden log10(Gesamt-UMI-Zählungen pro Zelle) mithilfe des R-Pakets mclust v5.4.3 mit der Einstellung modelNames auf „E“ in zwei Cluster geclustert. Zellen, die zu dem Cluster mit den höheren Zählungen gehören, wurden beibehalten. Dann wurden die Zellen auf der Grundlage des mitochondrialen RNA-Gehalts und der Vorliebe für hoch exprimierte Gene wie folgt gefiltert: (1) Zellen wurden mithilfe einer bivariaten Gauß-Mischung mit zwei Komponenten, die auf log10(Gesamt-UMI-Zählungen pro Zelle) und Prozent der mitochondrialen UMI pro Zelle gelernt wurden, in zwei Cluster geclustert. Das Clustering wurde mit dem R-Paket Mclust durchgeführt, wobei modelNames auf „EII“ gesetzt wurde. Zellen, die in den Cluster mit Zellen mit höherem Mitochondriengehalt fielen, wurden ausgeschlossen. Dieser Filterungsschritt wurde nur für Bibliotheken durchgeführt, die eine klare bimodale Verteilung des Mitochondriengehalts aufwiesen (nur drei 10x-Bibliotheken in dieser Studie). (2) Die Gesamtzahl der UMIs pro Zelle sollte mit der Gesamtzahl der einzigartigen erkannten Gene korrelieren. Zellen, die dieser Beziehung nicht folgen (Ausreißer), wurden gefiltert, indem die Kerne mithilfe eines bivariaten Gaußschen Mischungsmodells auf loglO(Gesamtzahl der UMIs) und log10 Gesamtzahl der eindeutig entdeckten Gene geclustert wurden, wobei das R-Paket mclust verwendet wurde und modelNames auf „VEV“, „VEE“ gesetzt wurde. (3) Zellen, deren prozentualer Anteil der Gesamtzählungen in den Top 500 Genen mehr als das 5-fache der absoluten Medianabweichung für alle Zellen darstellte, wurden entfernt. (4) Um schließlich Zellen auszuschließen, die hauptsächlich aus ribosomalen Proteinen und Pseudo-Genen bestehen, wurden Zellen entfernt, deren prozentualer Anteil an der Expression ribosomaler Proteine und Pseudo-Gene mehr als 5 absolute Medianabweichungen aller anderen Zellen darstellte. Mitochondrien-basierte Filterung wurde für CD10+-Bibliotheken nicht durchgeführt, da bei Bibliotheken aus proximalen Tubulusepithelzellen eine hohe Anzahl an mitochondrialen Reads zu erwarten ist. Beachten Sie, dass nicht alle Filterungsschritte für alle Bibliotheken durchgeführt wurden, da dies von der Qualität der einzelnen Bibliotheken und der Verteilung der UMI-Zell-Gene abhängt.
  • Human 10x Einzelzelldaten-Integrationsstrategie
  • Bei der ersten Analyse unserer Daten fielen uns mehrere Punkte auf: (1) Es ist nicht garantiert, dass die Zelltypen bei allen Patienten und unter allen Bedingungen (gesund oder CKD) gleichmäßig vertreten sind. Dies liegt daran, dass die Zelltypen, die in einem einzelnen 10x-Chromium-Lauf erfasst werden, durch eine Zufallsauswahl von Zellen bestimmt werden. (2) Sowohl gesunde als auch CKD-Patientenproben bestehen aus Zellen im gesunden und im Krankheitszustand, da diese Kategorisierung auf klinischen Parametern und nicht auf molekularen Daten oder einem kontrollierten In-vitro-Experiment beruht. Wir würden vor allem eine Veränderung des Anteils an gesunden und kranken Zellzuständen zwischen gesunden und kranken Patientenproben erwarten. (3) Die Proben von verschiedenen Patienten wurden an verschiedenen Tagen bearbeitet und vorbereitet, wie es der Operationsplan des Eschweiler Krankenhauses vorschreibt. Daher konnten mögliche technische (Chargen-)Effekte auf der experimentellen Seite nicht kontrolliert werden. (4) Die Fähigkeit, hochaufgelöste Zellcluster in unterrepräsentierten Zelltypen zu entdecken, könnte durch ein Klassenungleichgewicht beeinträchtigt werden, da bestimmte Zelltypen deutlich häufiger vorkommen können als andere, sowie durch die Größe des Datensatzes (Anzahl der Zellen), die die Clustering-Ergebnisse bei der Verwendung von unüberwachten modularitätsbasierten Graphen-Clustering-Algorithmen beeinflusst.
  • Die experimentelle Strategie beinhaltete die Gewinnung separater Bibliotheken aus CD10+ und CD10- Zellfraktionen, was dazu diente, das Klassenungleichgewicht auf der Ebene der Zelltyp-Erfassungshäufigkeit durch das 10x Chromium-Protokoll zu mildern. Um die oben diskutierten Punkte weiter abzuschwächen, zielten wir darauf ab, (1) die Daten auf lokaler Ebene zu clustern, während die globalen Informationen über die Beziehung zwischen den Zelltypen intakt blieben, und (2) mögliche technische (Chargen-)Unterschiede zwischen den Proben zu korrigieren, während wichtige Unterschiede, wie unterschiedliche Zelltypen oder unterschiedliche Zustände von Zelltypen aufgrund von Krankheiten, erhalten blieben. Um dies zu erreichen, verfolgten wir eine Strategie, die aus den folgenden Schritten besteht:
    • Schritt 1: Nach der Qualitätskontrolle und Zellfilterung (siehe oben) wurden die Zellen in jeder 10x-Bibliothek separat geclustert und jeder Zellcluster wurde einem von 6 Hauptzelltypen zugeordnet: CD10+ epitheliale, CD10- epitheliale, Immun-, endotheliale, mesenchymale und neuronale Zellen.
    • Schritt 2: Für jeden der 6 Hauptzelltypen wurden die Zellen aus allen 10x-Bibliotheken zusammen integriert. Die technisch bedingte Variabilität zwischen den Zellen wurde korrigiert und die Zellen wurden mithilfe von unüberwachtem Graphen-Clustering geclustert. Dieser Prozess führte zu 6 separaten Karten für Endothelzellen, CD10+ Epithelzellen, CD10-Epithelzellen, Mesenchymzellen, Immunzellen und Nervenzellen. Jede Karte besteht aus Zellen aus mehreren 10x-Bibliotheken.
    • Schritt 3: Wir integrierten 3 Einzelzellkarten für: (1) CD10+-Zellen (proximaler Tubulus / ), (2) CD10--Zellen (proximaler Tubulus-depletiert / ) und (3) PDGFRb+-Zellen (mesenchymal / ), indem wir die Einzelzellexpression (UMI-Zählungen) und die Clustering-Informationen aus allen Hauptzelltyp-Einzelkarten jedes Datensatzes aus Schritt 2 kombinierten. Alle Diagramme im Manuskript sind danach aus diesen 3 integrierten Karten reproduzierbar.
  • Dieser Ansatz ermöglichte eine lokale Clusterbildung und die Beseitigung der technischen Variabilität und erlaubte eine hochauflösende Entdeckung von Zellzuständen unabhängig von hochvariablen Zellclustergrößen. Der kleinste Cluster bestand aus 24 Zellen, während der größte Cluster aus 5355 Zellen bestand. Im Vergleich zu einem „high-level clustering followed by sub-clustering“-Ansatz produziert unser Ansatz hochaufgelöste Cluster in einer datengetriebenen, unvoreingenommenen Art und Weise und vermeidet dabei die Frage, welche Cluster überhaupt sub-geclustert werden sollen. Wir weisen darauf hin, dass Zeisel et al. einen etwas ähnlichen Ansatz zur Datenintegration verfolgten.
  • Insgesamt war dieser Ansatz biologisch informiert und ermöglichte es uns, potenzielle technische Effekte während der Zellclusterung zu korrigieren, so dass fast alle Zellcluster Zellen von mehr als einem Patienten/einer Bibliothek enthielten, während interessante Unterschiede zwischen den Patienten, wie z. B. erkrankte Zellzustände (z. B. verletzte Zellen des proximalen Tubulus), Unterschiede im (Myo)Fibroblastenzustand und Unterschiede in der ECM-Expression, erhalten blieben.
  • Maus 10x Einzelzelldaten-Integrationsstrategie
  • Maus-10x-Daten wurden auf die gleiche Weise analysiert und integriert, wie für humane Daten beschrieben. Das Skript, das zur Erstellung der integrierten Karte verwendet wurde, ist hier verfügbar:
    • https://raw.githubusercontent.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/master/make_intergrated_ maps/mouse_PDGFRABpositive.r
  • Strategie zur Integration von Maus-Smart-Seq2-Einzelzelldaten
  • Da die Einzelzellplattensortierung so durchgeführt wurde, dass Zellen von allen drei Zeitpunkten gleichmäßig in allen Platten vertreten waren, wurde bei der Analyse keine weitere Batch-Effekt-Minderung durchgeführt. Variable Gene wurden mit der Funktion decomposeVar des Scran R-Pakets bestimmt, nachdem die Funktion trendVar auf den ERCC-Transkripten6 ausgeführt wurde. Gene mit einem FDR-Wert < 0,01 und einer biologischen Varianzkomponente > 1 wurden als hochvariable Gene behalten. Mit diesen variablen Genen verfolgten wir den gleichen Clustering-Ansatz wie für die 10x Chromium-Daten beschrieben, aber wir führten nur 2 Clustering-Iterationen durch und variierten die Anzahl der nächsten Nachbarn nicht. Das für die Analyse der Maus-Smart-Seq2-Daten verwendete Skript ist hier verfügbar:
    • https://github.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/blob/master/make_intergrated_maps/mouse PDGFRBpositive.r.
  • Cluster-Beschriftung
  • Ein Gen-Ranking pro Cluster wurde mit der Funktion sortGenes im R-Paket genesorteR erstellt, wobei binarizeMethod auf „adaptiveMedian“ (Smart-Seq2-Daten) oder auf „naive“ (10x-Daten) gesetzt wurde. Anschließend haben wir unsere hochaufgelösten Zellcluster manuell annotiert, basierend auf Vorwissen und Informationen aus der Literatur. Es gab 50 solcher Cluster in den CD10- Daten, 7 Cluster in den CD10+ Daten, 26 Cluster in den PDGFRb+ Humandaten, 10 Cluster in den Maus Smart-Seq2 Daten und 10 Cluster in den Maus PDGFRa+/b+ Daten. Auf dieser hochaufgelösten Ebene (Ebene 3) kann ein Zellcluster entweder einen echten Zelltyp oder einen anderen Zellzustand repräsentieren. Daher haben wir auch diese hochaufgelösten Zellcluster in kanonische Zelltypen gruppiert, basierend auf unserer Annotation. Dies ergab 29 Zelltypen in der CD10- Karte, 1 Zelltyp in der CD10+ Karte, 16 Zelltypen in der PDGFRb+ Karte, 5 Zelltypen in der Maus PDGFRa+/b+ Karte und 6 Zelltypen in der Smart-Seq2 Maus PDGFRb+ Karte. Wir haben dann die Zellcluster entweder als epithelial, endothelial, mesenchymal, immun oder neuronal annotiert, um die Interpretation der Daten zu erleichtern.
  • UMAPs und Diffusionskarten
  • Integrierte Full-Map UMAP-Projektionen ( , , , , ) wurden mit dem UMAP-Python-Paket (https://github.com/lmcinnes/umap) auf den reduzierten korrigierten Dimensionen, die von fastMNN zurückgegeben wurden, generiert, wobei min_dist auf 0,6 und die Anzahl der Nachbarn auf die Quadratwurzel der Anzahl der Zellen gesetzt wurde. Lokale UMAP-Projektionen ( , ) wurden erzeugt, indem min_dist auf 1 gesetzt wurde, da diese Parameter tendenziell zu geometrisch genaueren Einbettungen führen (siehe https://umap-learn.readthedocs.io/en/latest/). Diffusionskarten wurden mit dem Destiny R-Paket (https://github.com/theislab/destiny) erstellt, wobei ebenfalls die von fastMNN zurückgegebenen reduzierten Dimensionen als Eingabe verwendet wurden und die Anzahl der Nachbarn auf die Quadratwurzel der Anzahl der Zellen eingestellt wurde. Wir testeten verschiedene Randomisierungsseeds für UMAP und Diffusion Map sowie verschiedene Diffusion Map-Distanzmetriken (wie im Handbuch des Destiny R-Pakets empfohlen) und bestätigten, dass bei den resultierenden Einzelzellprojektionen keine qualitativen Unterschiede auftreten.
  • Abstammungsbäume/Trajektorien und Pseudozeit
  • Das R-Paket Slingshot wurde für die Inferenz von Stammbäumen und die Inferenz von Pseudozeit-Zellordnungen auf Basis der UMAP/Diffusion Map-Projektion verwendet. Das Zellclustering (Schritt 2 der Integrationsstrategie, siehe oben) wurde als Eingabe-Zellcluster verwendet. Start- und Endcluster wurden auf der Grundlage einer vernünftigen Erwartung angesichts unseres Vorwissens gewählt, wie in Street et al. diskutiert und empfohlen (z. B. ist Myofibroblast der Endcluster in einer Perizyten/Fibroblasten/Myofibroblasten-Karte).
  • Gendynamik entlang der Pseudzeit
  • Gene, deren Expression mit der Zellordnung variierte, wurden als solche definiert, deren normalisierte Expression mit der Zellordnung korrelierte, quantifiziert durch den Spearman-Korrelationskoeffizienten bei einem Bonferroni-Hochberg-korrigierten p-Wert Cutoff von 0,001. Gencluster und Expressions-Heatmaps (z. B. -top) wurden durch Anordnung der Zellen entlang der von SlingShot vorhergesagten Pseudozeit und unter Verwendung der genesorteR-Funktion plotMarkerHeat erstellt. Diese Funktion clustert Gene mit Hilfe des k-means Algorithmus, und wir haben den Plot und das Clustering so eingestellt, dass alle 10 Zellen entlang der Pseudozeit gemittelt werden. Die Signalweg-Anreicherung und die Zellzyklus-Analysen wurden berechnet, indem alle 2000 Zellen entlang der Pseudozeit gruppiert wurden.
  • Signalweg-Anreicherung und Gen Ontologie Analyse
  • Für die Einzelzelldaten verwendeten wir KEGG-Signalweg- und PID-Signalweg, die im November 2019 von MSigDB 327,28 als „.gmt“-Dateien heruntergeladen wurden. Die Signalweg-Anreicherungsanalyse wurde mit dem clusterProfiler R-Paket unter Verwendung der Top-100-Gene für jeden Zellcluster/jede Zellgruppe durchgeführt, wie durch die sortGenes-Funktion aus dem genesorteR-Paket definiert. Die enricher-Funktion wurde verwendet, wobei minGSSize auf 10 und maxGSize auf 200 gesetzt wurde. Die Top-5-Terme nach q-Wert für jedes Zellcluster/jede Gruppe wurden als Heatmaps von -log10(q-Wert) aufgetragen. Die Gene Ontology Biological Process-Analyse wurde für die Top-200-Gene mit der gleichen Methode durchgeführt. Die Enricher-Funktion wurde verwendet, wobei minGSSize auf 100 und maxGSize auf 500 gesetzt wurde. Um die Aktivität der Signalwege zwischen NKD2+ und NKD2-Mesenchymzellen zu vergleichen, haben wir PROGENy verwendet, um die Aktivität von 14 Signalwegen auf Einzelzellbasis zu schätzen, wobei die Top 500 der am stärksten reagierenden Gene aus dem Modell verwendet wurden, wie es in einer Benchmark-Studie empfohlen wird.
  • Zellzyklus-Analyse
  • Die Zellzyklusanalyse wurde nach der in Macosko et al. verwendeten und im Tutorial von Po-Yuan Tung (https://jdblischak.github.io/singleCellSeq/analysis/cell-cycle.html, Datum: 07.06.2015) erläuterten Methode durchgeführt, wobei die normalisierte Genexpression als Eingabe verwendet und der Genkorrelationswert auf 0,1 gesetzt wurde. Wir verwendeten Zellzyklus-Gensätze, die in von Yang et al. bereitgestellt wurden. Um die Anreicherung/Verarmung einzelner Zellzyklus-Zuordnungen zu quantifizieren ( , stellen wir die log2-Fold-Änderung dieser Häufigkeiten relativ zur durchschnittlichen Häufigkeit dar, die durch 1000-fache Randomisierung der wahren Häufigkeitsmatrix erhalten wurde, während die Zeilen- und Spaltensummen konstant gehalten wurden. Die Randomisierung wurde mit dem R-Paket Vegan (https://CRAN.R-project.org/package=vegan) durchgeführt. Positive Zahlen zeigen eine Anreicherung relativ zu dem an, was durch Zufall zu erwarten wäre, negative Zahlen zeigen eine Verarmung an.
  • ECM- und Kollagen-Score
  • Die Expression der Core-Matrisom-Gene aus Naba et al. wurde auf der Grundlage normalisierter Genexpressionsdaten zusammengefasst, wobei die gleiche Methode wie bei der Zellzyklusanalyse verwendet wurde.
  • Genexpressions-Heatmaps
  • Skalierte Genexpressions-Heatmaps wie in wurden mit den Funktionen plotMarkerHeat und plotTopMarkerHeat im R-Paket genesorteR erstellt. Die Heatmaps für den Anteil der exprimierten Zellen, wie in , wurden mit der Funktion plotBinaryHeat aus dem genesorteR R-Paket erstellt. Heatmaps, die log2-fold-changes und Anreicherungen von Merkmalen wie in zeigen, wurden mit dem ComplexHeatmap R-Paket (v. 2.4.2) erstellt.
  • ATAC-Seq-Analyse
  • Illumina Tn5-Adaptersequenzen wurden aus ATAC-Seq-Reads mit dem Befehl bbduk aus der BBmap-Suite (Version 38.32, Einstellungen: trimq=18, k=20, mink=5, hdist=2, hdist2=0) getrimmt. STAR (Version 2.7.0e) wurde verwendet, um ATAC-Seq-Reads auf die mm10-Genomassemblierung zu mappen, wobei nur eindeutig gemappte Paare beibehalten wurden (Einstellungen: alignEndsType EndToEnd, alignIntronMax 1, alignMatesGapMax 2000, alignEndsProtrude 100 ConcordantPair, outFilterMultimapNmax 1, outFilterScoreMinOverLread 0.9, outFilterMatchNminOverLread 0.9). Zum Entfernen von Sequenzduplikaten wurde der Picard-Befehl MarkDuplicates (Version 2.18.27) verwendet (Einstellungen: remove_duplicates=TRUE, http://broadinstitute.github.io/picard/). Nicht übereinstimmende Lesepaare wurden dann mit Samtools (Version 1.3.1) aus der BAM-Datei entfernt39. bedtools (Version 2.17.0) wurde verwendet, um BAM-Dateien in BED-Dateien zu konvertieren und jeden Read auf 15bp stromaufwärts und 22bp stromabwärts vom 5'-Ende des Reads zu verlängern, um die sterische Hinderung von Tn5-DNA-Kontakten zu berücksichtigen41. JAMM (Version 1.0.7rev5) wurde verwendet, um offene Regionen aus den endgültigen BED-Dateien zu identifizieren, wobei die beiden Replikate getrennt gehalten wurden und Peaks mit einer Breite von mindestens 50bp in der Gesamtliste für die weitere Analyse beibehalten wurden (Parameter: -r peak, -f 38,38, -e auto, -b 100)42. ATAC-Seq-Signal-Bigwig-Dateien wurden mit der JAMM SignalGenerator-Pipeline erzeugt (Einstellungen: -f 38,38 -n depth).
  • Um das ATAC-Seq-Signal aus den ATAC-Seq-Bigwig-Daten entsprechend dem scRNA-Seq-Clustering zu dekonvolutieren, verfolgten wir die folgende Strategie. Um das ATAC-Seq-Signal zu dekonvolutieren, wurden drei Hauptschritte in der Datenanalyse durchgeführt: 1) Jeder offene Chromatin-Peak (wo TFs erwartet werden, DNA zu binden) wurde zunächst einem bestimmten Gen zugeordnet. 2) Diese Gene wurden pro scRNA-Seq-Cluster (Fib, MF1/2 etc.) in Abhängigkeit von ihrer Expression im Einzelzell-RNA-Seq-Datensatz gereiht. 3) Die Top 2000 ATAC-Peaks wurden verwendet, um angereicherte Transkriptionsfaktor-Motivsequenzen zu identifizieren.
  • Im Detail wurde jeder Open-Chromatin-ATAC-Seq-Peak einem Gen entsprechend der nächstgelegenen annotierten Transkriptionsstartstelle mit Hilfe der bedtools closest-Funktion zugeordnet, wobei 100kb als maximal mögliche Zuordnungsdistanz festgelegt wurde. Das ATAC-Seq-Peak-Ranking pro scRNA-Seq-Cluster wurde durch das Ranking der Peaks entsprechend dem Ranking des ihnen zugeordneten Gens im Einzelzell-RNA-Seq-Cluster ermittelt. Die Top-2000-ATAC-Seq-Peaks für jeden scRNA-Seq-Cluster wurden ausgewählt und XXmotif wurde für die de-novo-Motivsuche für jeden scRNA-Seq-Cluster und jede offene Chromatinregion separat verwendet (Einstellungen: --revcomp --merge-motifthreshold MEDIUM). Wir behielten nur Motive, deren Vorkommen mehr als 5% betrug, wie von XXmotif definiert, für die weitere Analyse. Das Motiv-Vorkommen aller Motive aus allen 4 scRNA-Seq-Clustern wurde mit Hilfe von FIMO 44 mit Standardparametern (MEME Version 5.0.1) in den Peaks quantifiziert, die den Top 200 Genen in jedem Einzelzell-RNA-Seq-Cluster zugeordnet waren. Dies ergab eine Häufigkeitsmatrix des Motivvorkommens in scRNA-Seq-Clustern. Um die Anreicherung/Verarmung des Motiv-Vorkommens in scRNA-Seq-Clustern zu quantifizieren, stellen wir die log2-Fold-Änderung dieser Häufigkeiten relativ zur durchschnittlichen Häufigkeit dar, die durch 1000-fache Randomisierung der wahren Häufigkeitsmatrix erhalten wird, wobei die Zeilen- und Spaltensummen konstant bleiben. Die Randomisierung wurde mit dem R-Paket Vegan (https://CRAN.R-project.org/package=vegan) durchgeführt. Positive Zahlen zeigen eine Anreicherung relativ zu dem an, was durch Zufall zu erwarten wäre, negative Zahlen zeigen eine Verarmung an (siehe Hauptabbildung 4k). Wir wählten Irf8, Nrf,Creb5/Atf3, Elf/Ets und Klf für weitere Untersuchungen aus. Wir plotteten das Signal von allen Peaks, die diese Motive enthielten, mit DeepTools Version 3.3.1, wobei wir die von JAMM generierte Bigwig-Datei als Eingabe verwendeten. Wir visualisierten die gleiche Bigwig-Datei und das Auftreten der Motive im Integrative Genomics Viewer.
  • Andere Visualisierung / Analyse
  • Heatmaps, die die Genexpression nicht quantifizieren, wurden mit der heatmap2-Funktion im gplots R-Paket (https://CRAN.R-project.org/package=gplots) erstellt. Violinplots wurden mit dem vioplot R-Paket (https://CRAN.R-project.org/package=vioplot) erstellt.
  • Quantifizierung und statistische Analyse, die außerhalb der Einzelzellsequenzierungsdaten verwendet wurden
  • Die Daten werden als Mittelwert±SEM dargestellt, wenn in den Legenden nicht anders angegeben. Der Vergleich von zwei Gruppen wurde mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt. Für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA mit Bonferroni's multiplem Vergleichstest oder eine Zweiweg-ANOVA mit Sidak's multiplem Vergleichstest angewendet. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) durchgeführt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.
  • Genregulatorische Netzwerkanalyse
  • Die Genexpression wurde pro Gen 11-skaliert und der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen Nkd2 und allen anderen Genen entlang der Einzelzellen von Perizyten, Fibroblasten und Myofibroblasten berechnet. Die Top 100 korrelierenden und die Top 100 antikorrelierenden Gene wurden für die Analyse der Signalweg-Anreicherung ausgewählt. Weiterhin wurde die Expression dieser 200 Gene entlang einzelner Zellen als Eingabe für das GRNboost2+ Python-Paket verwendet, um mutmaßliche regulatorische Verbindungen zwischen Genen vorherzusagen. Das Ausgangsnetzwerk wurde gefiltert, indem Verbindungen mit einer Stärke <= 10 entfernt wurden. Das resultierende Netzwerk wurde als ungerichtetes Netzwerk (da die Regulatoren vorher nicht bekannt sind) mit dem ggraph-Paket (https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/ index.html) gezeichnet und mit dem Louvain-Algorithmus, der im igraph-Paket implementiert ist, in 4 Module geclustert.
  • Transkriptionsfaktor-Vorhersagen aus Einzelzelldaten
  • Um Transkriptionsfaktor-Scores in distalen und proximalen Regionen zu erhalten, verwendeten wir die Top 200 Markergene für Fibroblasten-, Perizyten- und Myofibroblasten-Zellcluster als Input-Genlisten für RCisTarget. Wir folgten der RCisTarget-Vignette, um die Analyse mit Standardparametern durchzuführen (verfügbar unter https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ RcisTarget/inst/doc/RcisTarget.html). Um die API-Expression zu quantifizieren, verwendeten wir alle Jun- und Fos-Gene als Geneset und wendeten die gleiche Methode an, um einen API-Score zu erhalten, wie wir es für den ECM-Score getan haben. Um die AP1-Aktivität zu quantifizieren (definiert als die Expression von mutmaßlichen Zielgenen), definierten wir API-Zielgene gemäß der Dorothea-Regulon-Datenbank und wendeten die gleiche Methode wie beim ECM-Score an, um einen API-Aktivitäts-Score für einzelne Zellen zu erhalten.
  • Überwachte Zellenklassifizierung in Maus
  • Wir klassifizierten einzelne Zellen im Maus-PDGFRa+b+-Datensatz unter Verwendung des humanen PDGFRb+-Datensatzes als Referenz unter Verwendung des CHETAH-Algorithmus mit Standardparametern. Humane Gensymbole wurden mithilfe der biomaRt-Datenbank in Maus-Gensymbole umgewandelt.
  • CellPhoneDB-Analyse
  • CellPhoneDB (v.2.1.1) wurde verwendet, um Zell-Zell-Interaktionen zwischen den Zelltypen, die in der humanen CD10-Fraktion gefunden wurden, abzuschätzen. Dabei wurde die Version 2.0.0 der Datenbank und die normalisierte Genexpression als Eingabe verwendet, mit Standardparametern (10% der Zellen, die den Liganden/Rezeptor exprimieren). Interaktionen mit einem p-Wert < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Es wurden nur Ligand-Rezeptor-Interaktionen basierend auf der Annotation aus der Datenbank berücksichtigt, bei denen nur und mindestens ein Partner des interagierenden Paares ein Rezeptor war, wodurch Rezeptor-Rezeptor- und andere Interaktionen ohne eindeutigen Rezeptor verworfen wurden. Ligand-Rezeptor-Interaktionen aus Signalwegen, die an der Nierenfibrose beteiligt sind, wurden unter Verwendung der Zugehörigkeit aus der KEGG-Datenbank für Hedgehog-, Notch-, TGFb- und WNT-Signalisierung und der REACTOME-Datenbank für EGFR-Signalisierung aus MSigDB 3 und manueller Kuration für PDGF-Signalisierung ausgewählt.
  • Analyse der Bulk-RNA-Seq-Daten
  • Die Genexpression wurde auf Transkriptionsebene unter Verwendung von Salmon v1.1.0 mit den eingeschalteten Parametern --validatMappings und --gcBias für das humane Gencode v29-Transkriptom quantifiziert. Die Zählungen auf Transkript-Ebene wurden mit dem Import im R-Paket tximport zu Zählungen auf Gen-Ebene aggregiert, wobei countsFromAbundance auf „lengthScaledTPM“ eingestellt wurde. Das R-Paket Limma (v.3.44.1) wurde verwendet, um mit der empirischen Bayes-Methode nach Voom-Transformation auf differentielle Genexpression zwischen Nkd2-gestörten menschlichen Nieren PDGFRb+ im Vergleich zu ihrer Kontrolle zu testen. Wir fanden heraus, dass zwei der drei Klone von CRISPR-Cas9 NKD2 Knock-Out in der Hauptkomponentenanalyse zusammen gruppiert waren und einen flachen Phänotyp aufwiesen, während der dritte Klon unabhängig gruppiert war und einen schwereren Phänotyp aufwies. Daher gruppierten wir die beiden ersten Klon-Knock-Outs, um zwei unabhängige Knock-Out-Bedingungen für die statistischen Kontraste zu haben. Differentiell exprimierte Gene wurden anhand der moderierten t-Statistik aus dem statistischen Test für die Pathway- und Gen-Ontology-Analyse gereiht. Die P-Werte wurden mit der Benjamini & Hochberg-Methode für multiple Tests angepasst. Gene und Signalwege mit FDR < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
  • Für die Signalweg- und Gen-Ontologie-Analyse verwendeten wir auch das R-Paket clusterProfiler mit KEGG- und PID-Signalwege unter Verwendung von Genen mit einem angepassten p-Wert von weniger als 0,01 in den Nkd2-gestörten Zellen im Vergleich zur Kontrolle und einer absoluten logarithmischen Fold-Änderung von mehr als 1 für den Knockout-Vergleich (mehr als 0 für den Überexpressions-Vergleich) mit einem Maximum von 200 Genen, geordnet nach dem angepassten p-Wert. Wir verwendeten GSEA-preranked, um auf eine Anreicherung von ECM-Genen in den Phänotypen zu testen, indem wir das fgsea R-Paket (v.1.14.0)54 mit der MatrisomeDB-Gensatzsammlung verwendeten.
  • Beispiel 2: Einzelzellatlas der humanen chronischen Nierenerkrankung
  • Um zu verstehen, welche residenten Zelltypen in der humanen Niere während der Homöostase und CKD extrazelluläre Matrix sezernieren, haben wir eine Einzelzellkarte der humanen Niere mit besonderem Fokus auf das Tubulointerstitium erstellt. Mehr als 80 % der Zellen der Nierenrinde sind Epithelzellen des proximalen Tubulus und haben als solche bisherige Einzelzellkarten der Niere dominiert, wodurch potenziell wichtige Heterogenitäten in anderen zellulären Kompartimenten der Niere überdeckt wurden. Wir haben daher eine Sortierstrategie gewählt, die lebende (lebensfähige), nicht-proximale Tubulusepithelzellen anreichert (d.h. Zellen, die negativ für CD10 sind, auch bekannt als Membran-Metallo-Endopeptidase - MME), aber auch die lebende, CD10+ proximale Tubulusepithelfraktion sortiert, um die gesamte Niere in einer unvoreingenommenen Weise zu kartieren. Es ist zu beachten, dass dies eine nicht-exklusive Sortierstrategie ist, da CD10 auch von einigen anderen Zelltypen exprimiert wird. Sie ermöglicht jedoch eine Anreicherung/Abreicherung der Epithelzellen des proximalen Tubulus. Sowohl CD10+ als auch CD10- Fraktionen von insgesamt 13 Patienten mit verschiedenen Stadien der CKD aufgrund von Hypertonieinduzierter Nephrosklerose (n=7; geschätzte glomeruläre Filtrationsrate, eGFR>60 und n=6; eGFR<60) wurden einer scRNAseq unterzogen. Wir profilierten 53.672 CD10-Zellen von 11 Patienten (n=7; eGFR>60; n=4; eGFR<60). Patienten mit eGFR<60 zeigten eine erhöhte interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie. Um die Daten über die Patienten hinweg zu integrieren, setzten wir ein unüberwachtes graphbasiertes Clustering-Verfahren ein (siehe Methoden) und identifizierten 50 verschiedene CD10-Zellcluster ( ), die in beiden eGFR-Gruppen vertreten waren ( . Unsere Sortier- und Datenintegrationsstrategien erlaubten es uns, das gesamte Ausmaß der Heterogenität im Niereninterstitium zu erfassen, einschließlich der Identifizierung seltener Zelltypen wie Schwann-Zellen, die in früheren Nieren-Einzelzellkarten nicht beschrieben wurden ( ).
  • Insgesamt wurden 33.690 CD10+ proximale Tubuluszellen profiliert (von 8 Patienten (n=5; eGFR>60 und n=3; eGFR<60) und in 7 Clustern angeordnet ( . Die Zellzyklusanalyse der CD10+ proximalen Tubuluszellcluster zeigte eine erhöhte Zyklisierung bei CKD, die wahrscheinlich eine epitheliale Reparaturreaktion widerspiegelt ( . Die Analyse der KEGG-Signalwege und der Gene Ontology-Terme in CD10+-Zellen deutet auf einen erhöhten Fettsäurestoffwechsel neben verschiedenen anderen dysregulierten Stoffwechselwegen bei CKD hin ( . Der Fettsäurestoffwechsel wurde als einer der wichtigsten dysregulierten Stoffwechselwege in humanen Nieren und Maus-Nieren beschrieben, der tubuläre Dedifferenzierung und Fibrose verursacht (Kang et al. 2015).
  • Daher setzten wir eine Sortierstrategie ein, die eine hochauflösende Karte humaner Nieren in Homöostase und CKD erzeugte, um die anschließende Untersuchung des zellulären Ursprungs der ECM während der humanen CKD zu ermöglichen.
  • Beispiel 3: Ursprung der extrazellulären Matrix bei humaner chronischer Nierenerkrankung
  • Um zu verstehen, welche Zelltypen zur Produktion der extrazellulären Matrix (ECM) während der Progression der humanen Nierenfibrose beitragen, etablierten wir einen Einzelzell-ECM-Expressions-Score, der die Expression aller Kern-ECM-Moleküle einschließlich Kollagenen, Glykoproteinen und Proteoglykanen zusammenfasst. Wir validierten diesen Score in einem veröffentlichten Datensatz von 36 Patienten mit diabetischer Nephropathie (Fan et al 2019) und bestätigten erhöhte ECM-Score-Werte bei fortgeschrittener CKD.
  • Die ECM-Scores zeigten eine deutliche Verschiebung hin zu hoch ECM-exprimierenden Zellen bei CKD ( ). Wir verglichen dann den ECM-Score der wichtigsten Zelltypen in der Homöostase und bei CKD und identifizierten mesenchymale Zellen als die Zellen mit der höchsten ECM-Expression und einem weiteren Anstieg der ECM-Expression bei CKD. Während wir in keinem der mesenchymalen Subcluster bei CKD eine signifikant erhöhte ECM-Expression beobachten konnten, expandierten alle Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen bei CKD, was die insgesamt erhöhte ECM-Genexpression im Mesenchym erklärt ( ). In der Vergangenheit wurde ACTA2 als Myofibroblasten-Marker verwendet. Da jedoch die ECM-Expression das Kennzeichen der Fibrose ist, haben wir Myofibroblasten als Zellen definiert, die die meisten ECM-Gene exprimieren. Neben der Expansion einzelner Zellen ist ein weiterer wichtiger Mechanismus der erhöhten ECM-Expression die Differenzierung von Zellen zu den ECM-reichen Myofibroblasten. Um die Heterogenität der ECM-exprimierenden mesenchymalen Populationen und mutmaßliche Differenzierungsprozesse bei der menschlichen CKD weiter zu untersuchen, haben wir eine Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)-Einbettung von (Myo)Fibroblasten und Perizyten erstellt ( ). Diese UMAP-Einbettung stimmte mit unseren Ergebnissen des unüberwachten Graphen-Clustering ( ) überein und unterstreicht die bisher unterschätzte Heterogenität des humanen Nierenmesenchyms.
  • Myofibroblasten wurden eindeutig als Periostin (postn) exprimierende Zellcluster identifiziert (Abb. In). Diffusion Mapping ist eine Methode zur Dimensionalitätsreduktion, die davon ausgeht, dass Zellen durch einen differenzierungsähnlichen Diffusionsprozess miteinander in Beziehung stehen. Wir verwendeten diese Methode, um putative Differenzierungsmechanismen zu Myofibroblasten zu entschlüsseln. Eine Diffusionskarteneinbettung von mesenchymalen Zellen mit den höchsten ECM-Expressionsniveaus legte nahe, dass Myofibroblasten aus Perizyten und Fibroblasten entstehen ( .
  • Wir beobachteten eine geringe Hochregulierung von ECM-Genen in Epithelzellen ( , was auf einen geringen Beitrag der epithelialen mesenchymalen Transition (EMT) hindeutet, die in der Nierengemeinschaft seit vielen Jahren diskutiert wird. Das verletzte proximale Tubulusepithel (iPT) zeigte die höchste Expression von ECM-Genen unter dem CD10-Epithel mit verschiedenen exprimierten Genen und GO-Begriffen, die auf eine Entdifferenzierung vom regulären Epithel hinweisen. In der CD10+ Fraktion (alle sortierten proximalen Tubulusepithelien) beobachteten wir ebenfalls einen leichten Anstieg der ECM-Expression bei CKD. Bemerkenswert ist, dass verletzte Zellen durch die Expression von Genen definiert wurden, die zuvor als verletzungsbedingt berichtet wurden, wie Sox9, CD24 und CD133 für proximales Tubulusepithel und VCAM1 und ACKR1 für Endothel.
  • Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass die überwiegende Mehrheit der ECM, die während der humanen Nierenfibrose gebildet wird, von mehreren verschiedenen mesenchymalen Zellsubtypen stammt, mit nur einem geringen Beitrag von dedifferenzierten tubulären Epithelzellen.
  • Beispiel 4: Unterschiedliche Perizyten- und Fibroblasten-Subpopulationen sind die Hauptquelle der Myofibroblasten in der humanen Nierenfibrose
  • Unsere CD10- scRNA-seq Daten zeigten, dass die große Mehrheit der Collal exprimierenden Zellen PDGFRb+ sind. Wir sortierten daher 37.380 PDGFRb+ Zellen aus 8 menschlichen Nieren (n=4; eGFR>60 und n=4; eGFR<60). Unüberwachtes Clustering identifizierte mesenchymale Zellpopulationen und einige Epithel-, Endothel- und Immunzellen ( ), die entsprechend ihrer Korrelation mit den CD10- Populationen annotiert wurden. Kollagen und die ECM-Genexpression im Allgemeinen waren in den Perizyten-, Fibroblasten- und Myofibroblasten-Clustern dominant, in Übereinstimmung mit unseren CD10- Daten ( ). Einige Makrophagen/Monozyten-, Endothel- und verletzte Epithelpopulationen exprimierten jedoch auch Kollagen1a1 und PDGFRb, jedoch auf viel niedrigerem Niveau als Mesenchymzellen ( ). Computergestützte Vorhersagen von Doublet-Likelihood-Scores zeigten keine besonders hohen Scores für Endothel- und verletzte Epithelzellen, jedoch war der Score für die Makrophagenpopulation leicht erhöht. Wir verifizierten die Collal mRNA-Expression in LTA+ proximalen Tubuli, CD68+ Makrophagen und Pecam-1+ Endothelzellen durch in situ Hybridisierung (ISH). Diese Daten können bis zu einem gewissen Grad die Kontroverse in der Literatur bezüglich der Beiträge von nicht-mesenchymalen Linien zum renalen Myofibroblasten-Pool erklären (Duffield 2014; Wang et al. 2017), da wir in der Tat eine geringe ECM-Genexpression in diesen nicht-mesenchymalen Zelltypen beobachteten, während die Mehrheit der ECM-Genexpression von mesenchymalen Zellen stammt.
  • Pseudozeit-Trajektorien- und Diffusionskarten-Analysen der wichtigsten ECM-exprimierenden zellulären Subtypen aus den PDGFRb+ Populationen zeigten drei Hauptquellen von Myofibroblasten in humanen Nieren: 1) Notch3+/RGS5+/PDGFRa-Perizyten, 2) Meg3+/PDGFRa+ Fibroblasten und 3) Colec11+/CXCL12+ Fibroblasten ( . Bemerkenswert ist, dass die Diffusionskartierung die Nicht-CKD-Zellen hauptsächlich innerhalb der niedrig ECM-exprimierenden Perizyten- und Fibroblastenpopulationen verortet, was auf einen potenziellen Differenzierungspfad von Niedrig-ECM, Nicht-CKD-Mesenchymzellen (Perizyten und Fibroblasten) zu Hoch-ECM-CKD-Myofibroblasten hinweist ( . Eine UMAP-Einbettung dieser mesenchymalen Zellen war ebenfalls konsistent mit diesen Ergebnissen. Dies ist konsistent mit einer Differenzierung zu Myofibroblasten, die ECM und Postn in der Nierenfibrose exprimieren. Wir verifizierten diese vorhergesagte Richtungsabhängigkeit mit ISH in menschlichen Nieren und bestätigten eine erhöhte Anzahl von Postn exprimierenden Zellen in der Nierenfibrose ( , während die Anzahl von Meg3+ Zellen abnahm. Mithilfe von ISH konnten wir die Hauptlinien in unserer Diffusionskartenanalyse weiter validieren, bestehend aus Notch3+ Perizyten (Linie 1) und Meg3+ Fibroblasten (Linie 2) ( . Wir beobachteten, dass sowohl Meg3+ als auch Notch3+ Zellen Postn koexprimieren, was auf eine Myofibroblasten-Differenzierung hinweist ( . Interessanterweise beobachteten wir auch eine wahrscheinliche Zwischenstufe von Notch3/Meg3/Postn ko-exprimierenden Zellen, die möglicherweise differenzierende Zellen im Zentrum der Diffusionskarte darstellen ( .
  • Wir haben dann untersucht, ob die identifizierten mesenchymalen Subpopulationen auch räumlich getrennt sind. Während wir keine eindeutige räumliche Lokalisation für Fibroblasten 1 (Meg3+), Perizyten (Notch3+) oder Fibroblasten 2 (Cxcl12+) feststellen konnten, beobachteten wir, wie erwartet, eine Anreicherung von Myofibroblasten 1 (Postn+) Zellen in Fibrosebereichen. Interessanterweise zeigten Myofibroblasten 3 (Ccl19+/Ccl21+), die bei humaner Nierenfibrose vermehrt auftreten, eine deutliche Anreicherung um Glomeruli.
  • Anschließend analysierten wir das Genexpressionsprogramm der Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten (Linie 1) ( . Die Zellzyklusanalyse zeigte tiefgreifende Veränderungen, die sowohl mit einem Differenzierungsprozess als auch mit einer Expansion der Myofibroblastenpopulation übereinstimmen ( . Um die Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten besser zu verstehen, ordneten wir die Anreicherung von Signalwegen entlang der Pseudozeit. Wir beobachteten frühe (kanonisches Wnt, Myc und AP1), intermediäre (ATF2, PDGFRa und Myc) und späte (Integrin, ECM-Rezeptor-Interaktion und TGFb) Signalwege neben anderen ( unten).
  • Ähnlich wie bei der Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten beobachteten wir eine Beendigung des Zellzyklus während der Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten, gefolgt von einer erhöhten Proliferation (Linien 2 und 3). Die Signalweg-Anreicherung, geordnet entlang der Pseudozeit, hob frühe AP1-Signaling, Entzündungs- und Immunzell-Interaktionssignalwege hervor, denen Integrin-Signaling, fokale Adhäsions- und ECM-Interaktionssignalwege folgten.
  • TGFb- Signaling war in der Pseudotime-Analyse der Linie 2 vorherrschend ( . Myofibroblasten 1, die wahrscheinlich vollständig differenzierte Myofibroblasten darstellen, exprimierten hohe Mengen an TGFb-Liganden und niedrigere Mengen an TGFb-Rezeptoren. Für Fibroblasten 1 wurde jedoch das Gegenteil beobachtet, was auf einen Mechanismus hindeutet, durch den Myofibroblasten die Differenzierung von Fibroblasten fördern können.
  • Viele der oben beschriebenen Signalwege sind als wichtige Regulatoren der Fibrose bekannt, einschließlich der Integrine27 und auch der AP1-Transkriptionsfaktor-Signaling (Wernig et al. 2017), von denen wir beobachteten, dass sie in den frühen Stadien sowohl der Perizytenals auch der Fibroblasten- zu Myofibroblasten-Differenzierung durchweg hoch aktiv waren.
  • Um die transkriptionelle Regulation von Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen besser zu verstehen, führten wir eine Anreicherungsanalyse von Transkriptionsfaktor-DNA-Sequenzmotiven in Promotoren und distalen Regionen von Markergenen in verschiedenen mesenchymalen Populationen durch. Dies unterstrich eine mögliche regulatorische Schlüsselrolle von AP-1 (Jun/Fos) bei der Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten. Um die Rolle von AP1 funktionell zu validieren, generierten wir eine neuartige humane PDGFRb+ Nierenzelllinie mittels lentiviraler hTERT, SV40LT Transduktion. Die pharmakologische Inhibition des Aktivator-Proteins 1 (AP1) führte zu einer signifikant verminderten Proliferation und einer verminderten Osteoglycin (Ogn)-Expression, während die Postn-Expression erhöht war, was auf eine Myofibroblasten-Differenzierung dieser Zellen hindeutet. Bemerkenswert ist, dass in den humanen PDGFRb-Daten Ogn 1/3 Fibroblasten markierte, während Postn Myofibroblasten 1 markierte. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen korreliert die API-Expression negativ mit der Kollagenexpression sowohl in Fibroblasten als auch in Myofibroblasten. Interessanterweise korrelierte die Expression der mutmaßlichen Zielgene von AP1 positiv mit der Kollagenexpression in Myofibroblasten, was darauf hinweist, dass AP1 als Suppressor wirken könnte. Wir führten auch Liganden-Rezeptor-Analysen durch (Efremova et al. 2020), um zu klären, welche Zelltypen mit den wichtigsten ECM-exprimierenden mesenchymalen Zellen (Fibroblasten, Perizyten und Myofibroblasten) interagieren. Während wir beobachteten, dass die wenigsten Signale vom gesunden proximalen Tubulusepithel stammten, gehörte das verletzte proximale Tubulusepithel zu den Top-Signalpartnern des Mesenchyms, was mit der tubulär-interstitiellen Signalübertragung als Kennzeichen der Nierenfibrose übereinstimmt (Venkatachalam et al 2015). Wir konzentrierten uns auf Interaktionen von Signalwegen, die als Schlüsselspieler bei der Fibrose beschrieben wurden, einschließlich TGFb, PDGFRalb, Notch, EGFR und WNT-Signaling (Kramann und DiRocco 2013). Innerhalb dieser Signalwege beobachteten wir Notch-, TGFb-, Wnt- und PDGFa-Signaling vom verletzten proximalen Tubulus in Richtung der mesenchymalen Fibrose treibenden Zellen.
  • Zusammengefasst deuten diese Daten auf drei zelluläre Hauptquellen von Myofibroblasten der humanen Niere hin, die alle durch PDGFRb markiert sind, nämlich Notch3+/PDGFRa-Perizyten, Meg3+/PDGFRa+ Fibroblasten und Colec11+/Cxcl12+ Fibroblasten, und werfen ein Licht auf ihre Differenzierungsprozesse.
  • Beispiel 5: Dual-positive PDGFRa+/PDGFRb+ mesenchymale Zellen stellen die Mehrheit der ECM-exprimierenden Zellen in der Nierenfibrose von Mensch und Maus dar
  • Um die oben vorgestellten Befunde weiter zu untersuchen, verwendeten wir genetisches fate tracing in Mäusen. PDGFRbCreER-tdTomato-Mäuse wurden mit Tamoxifen gepulst und einer unilateralen Ureterobstruktion (UUO) unterzogen und an Tag 10 geopfert ( . Die In-situ-Hybridisierung (ISH) für Collal-mRNA bestätigte, dass praktisch alle Collalexprimierenden Zellen in der Nierenfibrose der Maus aus der PDGFRb-Linie stammen ( ). Darüber hinaus bestätigte die Immunfärbung für den historisch verwendeten Myofibroblasten-Marker aSMA (ACTA2), dass die Mehrheit der aSMA-exprimierenden Zellen aus der PDGFRb-Linie stammt. Anschließend führten wir eine SmartSeq2-basierte scRNA-seq-Zeitverlaufsstudie in PDGFRb-eGFP-Mäusen durch (Picelli et al 2014) ( ). Während die Abundanz von glatten Muskelzellen und Perizyten nach UUO im Laufe der Zeit abnahm, nahmen Mesangialzellen und Col1a1+/PDGFRa+ matrixproduzierende Zellcluster im Laufe der Zeit deutlich zu ( ). Ähnlich wie in unseren humanen Nierendatensätzen ( , ) wurde die wichtigste ECM-exprimierende Zellpopulation durch die duale PDGFRa/PDGFRb-Expression und auch die Expression von Decorin (DCN) und Periostin (Postn) definiert ( ). Darüber hinaus zeigten Perizyten und vaskuläre glatte Muskelzellen (vSMCs) eine gewisse ECM-Expression, jedoch auf einem deutlich niedrigeren Niveau als die duale PDGFRa/PDGFRb-Population.
  • Immunfärbung und ISH in Mäusen bestätigten, dass Collal-exprimierende Zellen doppelt positiv für PDGFRa+ und PDGFRb-tdTomato sind ( ). Dies stimmt mit unseren humanen CD10-Daten überein, bei denen die Selektion auf PDGFRa+/b+ exprimierende Zellen zu einer Anreicherung mit Col1a1+ Zellen führte, was PDGFRa/PDGFRb exprimierende Zellen als Hauptquelle der ECM-Expression identifiziert ( . Wir bestätigten diesen Befund in einer größeren Humankohorte mittels Multiplex-ISH in Gewebe-Mikroarrays von 62 Patienten ( ). Die Diffusionskarteneinbettung von Matrix-produzierenden Zellen und Perizyten stimmte ebenfalls mit unseren humanen PDGFRb-Daten überein und legte nahe, dass Perizyten (PDGFRb+, PDGFRa-, Notch3+) einer der Ursprünge der wichtigsten ECM-produzierenden Zellen (PDGFRb+, PDGFRa+, Col1a1+, Postn+) sind.
  • Zusammengenommen zeigen unsere humanen Daten und Fate-Tracing-Experimente in Mäusen, dass PDGFRa+/PDGFRb+ dual-positive mesenchymale Zellen, die alle Fibroblasten- und Myofibroblasten-Populationen umfassen, einschließlich der von Perizyten abgeleiteten Myofibroblasten, aber nicht die nicht-aktivierten Perizyten (d. h. Perizyten, die keine hohe ECM-Genexpression aufweisen) ( , die Mehrheit der Collalexprimierenden Zellen sowohl in der humanen als auch in der Maus-Nierenfibrose darstellen.
  • Beispiel 6: PDGFRa+/PDGFRb+ Zellen sind heterogen und enthalten verschiedene Fibroblasten-Zellstadien
  • Um mechanistische Einblicke in den Übergang von Fibroblasten zu Myofibroblasten zu gewinnen und die Heterogenität der PDGFRa+/PDGFRb+-Population zu untersuchen, haben wir als nächstes scRNA-Seq-Daten von 7.245 doppelt positiven PDGFRa+/PDGFRb+-Mausnierenzellen generiert, indem wir eine UUO-Operation im Vergleich zu einer Scheinbehandlung in PDGFRb-eGFP-Mäusen durchgeführt haben, gefolgt von einer Sortierung der eGFP/PDGFRa-doppelpositiven Zellen ( . In Übereinstimmung mit einer schnell expandierenden Zellpopulation zeigten die PDGFRa+/PDGFRb+ doppeltpositiven Zellen einen ~140-fachen Anstieg der Zellzahlen nach der Verletzung ( , in Übereinstimmung mit unseren Smart-Seq2-Daten ( . Die UMAP-Einbettung von PDGFRa+/PDGFRb+ Zellen zeigte vier große, unterschiedliche Populationen, die dem Mesenchym (Fibroblasten und Myofibroblasten), Epithel-, Endothel- und Immunzellen entsprechen ( ). Alle diese Zelltypen wurden zuvor als möglicher zellulärer Ursprung der Nierenfibrose diskutiert (Duffield et al 2014; Wang et al 2017; Kramann et al 2018). Bemerkenswert ist, dass wir in diesen PDGFRa+/PDGFRb+ Daten keine undifferenzierten Perizyten nachweisen konnten, da Perizyten bei Menschen und Mäusen PDGFRa- sind ( , . Nicht-mesenchymale Zellen exprimierten deutlich weniger PDGFRb, PDGFRa, ECM und Kollagen als mesenchymale Zellen ( ), was die Beobachtung in unseren Humandaten unterstützt, dass nicht-mesenchymale Zellen in geringem Maße zum Narbenbildungsprozess beitragen ( , ). Bemerkenswert ist, dass, wie in den humanen Daten, die rechnerisch abgeleiteten Doubletten-Scores nicht darauf hindeuten, dass diese Matrix-exprimierenden nicht-mesenchymalen Zellpopulationen wahrscheinlich Doubletten sind.
  • Unüberwachtes Clustering ergab zwei Hauptklassen innerhalb der mesenchymalen Zellen in diesem Maus-PDGFRa+/PDGFRb+-Datensatz (1) Fibroblasten 1, gekennzeichnet durch Scara5- und Meg3-Expression, und (2) Myofibroblasten, bestehend aus verschiedenen Myofibroblasten-Subpopulationen ( ). In unseren Humandaten entsprechen die Myofibroblasten 1 den terminal differenzierten Myofibroblasten mit der höchsten ECM-Expression, denen in der Pseudodifferenzierungszeit die Myofibroblasten 2 (Ogn+) vorausgehen, während die Fibroblasten 1 als eine „Progenitor“-Population nicht aktivierter Fibroblasten erscheinen ( . Tatsächlich lassen sich die Fibroblasten 1-Zellen in den PDGFRa+/PDGFRb+-Daten durch drei Hauptmerkmale von den Myofibroblasten unterscheiden: Erstens wurde Col15a1, ein Myofibroblasten-spezifisches Kollagen in Mäusen ( , in den Fibroblasten 1 in geringerer Konzentration exprimiert als in den Myofibroblasten-Clustern ( . Zweitens wurde Meg3, obwohl es auch in einer Fraktion der proximalen tubulären Zellen und des glomerulären Endothels exprimiert wird, nur in Fibroblasten 1 innerhalb der mesenchymalen Populationen nachgewiesen ( ). Wir bestätigten das Vorhandensein einer Meg3+ PDGFRa+/PDGFRb+ mesenchymalen Subpopulation in humanen Nieren durch In-situ-Hybridisierung ( ), was auf das Vorhandensein einer Fibroblasten 1 ähnlichen Subpopulation in menschlichen Nieren hindeutet. Drittens sind die Fibroblasten 1 Zellen Scara5+ aber Frzb-, was wiederum zeigt, dass sie sich von Myofibroblasten unterscheiden.
  • Nachdem wir Fibroblasten 1 als eine eigenständige Fibroblastenpopulation etabliert hatten, generierten wir UMAP- und Diffusionskarteneinbettungen und führten Pseudozeitanalysen aller Pdgfra+/Pdgfrb+ mesenchymalen Zellen der Maus durch, um einen Einblick in ihre Abstammungsbeziehungen zu erhalten ( . Diese Analyse schlug Fibroblast 1 (Meg3+, Scara5+) und Myofibroblast 2 (Col14a1+, Ogn+) als frühe Zustände, Myofibroblast 3a als Zwischenzustand und Myofibroblast 1a (Nrp3+, Nkd2+), 1b (Grem2+) und 3b (Frzb+) als terminale Zustände vor ( .
  • Diese Daten legen nahe, dass Fibroblasten 1 und Myofibroblasten 2 die Hauptquelle der Myofibroblasten in der Nierenfibrose der Maus sind. Myofibroblasten 2 (Ogn+/Col14a1+) könnten in gesunden Mäusenieren existieren oder als Zwischenzustand durch Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten entstehen ( , humane Daten). Die Expression von Angiotensin-Rezeptor 1 (AGTR1a) ist in Myofibroblasten 2 angereichert und könnte auf deren Perizytenursprung hinweisen ( .
  • Die Analyse der Zeitverlaufs-UUO-Daten zeigt, dass Ogn, Scara5 und Pcolce2 in der Homöostase angereichert sind, während das Naked Cuticle Homolog 2 (Nkd2) nach Verletzungen angereichert ist. Dies deutet weiter auf Fibroblasten 1 (Meg3+, Scara5+) und Myofibroblasten 2 (Ogn+) als Zellen in der Nierenhomöostase hin. Darüber hinaus bestätigt die überwachte Klassifizierung der Pdgfra+/Pdgfrb+ Einzelzelldaten der Maus unter Verwendung unserer humanen Pdgfrb+ Zellen als Referenz die eindeutige Identität von Fibroblasten 1 und Myofibroblasten als gemeinsames Merkmal in beiden Spezies.
  • Insgesamt deuten unsere kombinierten und umfassenden Daten von Mensch und Maus auf ein Modell hin, in dem Pdgfrb+/Pdgfra+/Postn+ hoch-ECM exprimierende Myofibroblasten (in diesem Manuskript als Myofibroblasten 1 bezeichnet) aus Pdgfrb+/Pdgfra-/Notch3+ Perizyten, Pdgfrb+/Pdgfra+/Scara5+ Fibroblasten (Fibroblasten 1) und Pdgfrb+/Pdgfra+/Cxcl12+ Fibroblasten (Fibroblasten 2) entstehen. Perizyten differenzieren potentiell über einen intermediären ECM-exprimierenden Pdgfrb+/Pdgfra+/Ogn+/Coll4al+ Zustand (Myofibroblasten 2) in Myofibroblasten 1.
  • Beispiel 7: Unterschiedliche Fibroblasten- und Myofibroblasten-Zustände werden durch spezifische Transkriptionsfaktor-Regulationsprogramme unterschieden
  • Als nächstes versuchten wir herauszufinden, ob die in unseren Daten entdeckten Fibroblasten- und Myofibroblasten-Zellzustände wirklich unterschiedliche Zelltypen darstellen. Unterschiedliche Zelltypen würden sich sowohl durch unterschiedliche Genexpressionsprofile als auch durch unterschiedliche Transkriptionsfaktor-Regulationsprogramme unterscheiden (Gerstein et al. 2012). Wir generierten Bulk-ATAC-Seq-Daten (Buenrostro et al 2013) von Pdgfra+/Pdgfrb+-Mausnierenzellen 10 Tage nach der UUO-Operation und dekonvolutierten die Signaturen der offenen Chromatinregion (OCR) aus den ATAC-Seq-Daten basierend auf der OCR-Nähe zu Markergenen, die in den scRNA-Seq-Clustern identifiziert wurden. Fibroblasten 1 und Myofibroblasten 2 waren sowohl voneinander als auch von anderen Myofibroblasten-Populationen unterschieden. Myofibroblasten 1a unterschieden sich von Myofibroblasten 1b und wiesen eine Anreicherung von ATF auf. Myofibroblasten 2 und 3b zeigten eine Anreicherung des Orphan-Rezeptors NRF4A1, der zuvor als wichtiger Regulator von TGFb-Signalen und Fibrose berichtet wurde (Palumbo-Zerr et al 2015). Fibroblasten 1 zeigten eine Anreicherung von AP-1 (Jun/Fos)-Motiven ( , was mit ihrer putativen Rolle übereinstimmt, die in unseren humanen Daten beschrieben wurde. Die RNA-Expression dieser durch ATAC-Seq ausgewählten Faktoren steht im Einklang mit der Anreicherung von Sequenzmotiven ( und unterstreicht die divergierende Transkriptionsregulation zwischen Fibroblasten 1, Myofibroblasten 2 und anderen Myofibroblastenpopulationen. Außerdem heben wir Transkriptionsfaktoren hervor, die in Bezug auf die Nierenfibrose möglicherweise unterschätzt werden, darunter Nrfl, Irf8 und Creb5. Übereinstimmend mit unseren ATAC-Seq-Daten zeigte die Analyse der Signalwege auf Basis unserer scRNA-Seq-Daten, dass Fibroblasten 1 und Myofibroblasten unterschiedliche Populationen mit verschiedenen angereicherten Signalwegen sind ( ). Daher sind Fibroblasten 1 und Myofibroblasten-Subtypen wahrscheinlich unterschiedliche ECM-exprimierende mesenchymale Zelltypen, die spezifische Transkriptionsfaktor-Regulationsprogramme beherbergen.
  • Beispiel 8: Nkd2 wird für die Kollagenexpression in PDGFRb+ Zellen der humanen Niere benötigt und ist ein potenzielles therapeutisches Ziel bei Nierenfibrose
  • Als nächstes fragten wir, ob die von uns generierten scRNA-seq-Daten zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Targets bei humaner Nierenfibrose verwendet werden können. Nkd2 wird spezifisch in Pdgfra+/Pdgfrb+ terminal differenzierten Myofibroblasten der Maus exprimiert ( , so dass Nkd2/PDGFRa dual-positive Zellen >40% aller Col1a1+ Zellen ausmachten ( . In humanen PDGFRb+ Zellen ist NKD2 ein Marker für Myofibroblasten mit hohem ECM-Gehalt, wobei seine Expression positiv mit der Postn- und ECM-Expression korreliert und antikorreliert mit Genen, die mit Perizyten und Fibroblasten assoziiert sind ( ). Darüber hinaus waren NKD2+ Myofibroblasten mit einer erhöhten TGFb-, Wnt- und TNFa-Signalweg-Aktivität im Vergleich zu NKD2- Zellen assoziiert. Wir verifizierten die NKD2-Expression mittels Multiplex-ISH in einem humanen Nierengewebe-Microarray (TMA) von 36 Patienten und bestätigten, dass eine Subpopulation von humanen PDGFRa/PDGFRb exprimierenden Zellen auch Nkd2 exprimiert ( ). Darüber hinaus war die Abundanz von PDGFRa/PDGFRb/Nkd2 koexprimierenden Zellen bei Patienten mit ausgeprägterer interstitieller Fibrose höher ( .
  • Nkd2 wurde als Wnt-Signalweg- und TNFa-Modulator dokumentiert (Zhao et al 2015; Hu und Li 2010; Hu et al 2010; Li et al 2004). Um die Mechanismen zu verstehen, durch die Nkd2 die Nierenfibrose reguliert, haben wir unsere humanen PDGFRb+ Daten verwendet, um ein genregulatorisches Netzwerk vorherzusagen, das sich auf Gene konzentriert, die mit Nkd2 korreliert sind, unter Verwendung des GRNboost2 Frameworks. Das resultierende Netzwerk gliederte sich in 4 genregulatorische Module, darunter ribosomale Proteine (Modul 1), Gene, die mit der ECM-Expression zusammenhängen (Modul 2), Gene, die mit Perizyten zusammenhängen (Modul 3) und Gene, die mit nicht aktivierten Fibroblasten zusammenhängen (Modul 4). Bemerkenswert ist, dass dieser Gencluster neben Nkd2 auch verschiedene Wnt-Modulatoren und Effektoren wie Kif26b, Lef1 und Wnt4 enthält. Nkd2 ist mit ECM-Genen platziert und steht in Verbindung mit Etv1 und Lamp5, sowie indirekt über Lamp5 mit Collal. Diese Analyse deutet auf einen möglichen Mechanismus hin, durch den Nkd2 durch Etv1 (ein Mitglied der Ets-Faktor-Familie) reguliert wird und durch Beeinflussung der parakrinen Signalübertragung durch Lamp5 wirkt.
  • Die lentivirale Überexpression von Nkd2 in unserer humanen PDGFRb-Zelllinie führte zu einer erhöhten Expression von wichtigen pro-fibrotischen ECM-Molekülen wie col1a1 und Fibronektin als Reaktion auf TGFb ( ). Wichtig ist, dass der CRISPR/Cas9-Knockout von Nkd2 zu einer deutlichen Reduktion der Expression von col1a1, Fibronektin und ACTA2 in Gegenwart oder Abwesenheit von TGFb führte ( ). RNA-seq von Zellen, die Nkd2 überexprimierten, zeigte eine Hochregulierung von ECM-Regulatoren und ECM-Glykoproteinen, während RNA-seq von Nkd2-Knockout-Klonen einen Verlust von ECM-Regulatoren, ECM-Glykoproteinen und Kollagenen anzeigte ( . Pathway- und Gene Ontology-Analysen zeigten eine Rolle für Nkd2 in ECM-Expressionsprogrammen und legten ein weiteres Zusammenspiel mit AP1- und Integrin-Signalwegen nahe ( . Wir beobachteten außerdem starke Veränderungen in der Expression von Wnt-Rezeptoren und - Liganden nach Nkd2-Knockout in vitro, was seine mögliche Beteiligung an diesem Signalweg bestätigt.
  • Um Nkd2 als therapeutisches Target weiter zu validieren, generierten wir aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Nierenorganoide, die alle wichtigen Kompartimente der humanen Niere enthalten. Es ist bekannt, dass ILlb in iPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden Fibrose induziert (Lemos et al 2018). Wichtig ist, dass der siRNAvermittelte Knockdown von Nkd2 die ILlb-induzierte Collal-Expression in den Nierenorganoiden hemmte ( ). Diese Daten bestätigen, dass Nkd2 Myofibroblasten in der Nierenfibrose von Mensch und Maus markiert, für die Kollagenexpression der renalen Myofibroblasten erforderlich ist und daher ein vielversprechendes potenzielles therapeutisches Ziel zur Behandlung von Patienten mit Nierenfibrose darstellt.
  • Beispiel 9: Screening auf Wirkstoffe, die an das NDK2-Protein binden und/oder es hemmen
  • Screening-Experimente ermöglichen die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die an das NKD2-Protein binden und/oder dessen Aktivität hemmen.
  • Es werden DNA-verschlüsselte Substanzbibliotheken generiert und gescreent, wie beschrieben (Kunig et al. 2018). Dazu werden rekombinantes NKD2-Protein oder Fragmente davon, die einen His-Tag tragen, in E. coli, Insektenzellen oder Säugetierzellen exprimiert. Das gereinigte NKD2-Protein wird mit der Substanzbibliothek inkubiert und durch Immunpräzipitation isoliert. Die an das NKD2-Protein gebundenen Verbindungen werden durch Sanger-Sequenzierung der DNA-Barcodes identifiziert. Die identifizierten Verbindungen werden anschließend auf ihre Wirkung auf die Funktion von NKD2, die Differenzierung von Myofibroblastenzellen, die Expression und Sekretion von Matrixproteinen, wie z.B. Kollagen 1, und die Entwicklung einer Nierenfibrose getestet. Zu diesem Zweck werden experimentelle Maus-in-vivo-Modelle der Nierenfibrose eingesetzt.
  • Für die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die eine Wirkung auf die nkd2-Expression ausüben, wird ein in-vitro-Fluorochrom-Reportersystem auf Basis humaner Zellen etabliert, wobei beispielsweise die Expression des eGFP-NKD2-Fusionsproteins oder ein Luciferasebasiertes Reportersystem verwendet wird, um Substanzbibliotheken in Assays mit 384 bis 1.536 Vertiefungen auf die Identifizierung von Verbindungen zu screenen, die die eGFP-Fluoreszenz oder den Luciferase-Spiegel als Readout reduzieren. Die Expression dieser humanen NKD2-Fusionsreporterkonstrukte in den genannten Zellen kann z. B. durch Transfektion und Selektion über Resistenzgenkassetten oder durch virale Transduktion erfolgen. Für diese Assays werden humane Zelllinien wie z.B. 293T-Zellen, aber auch etablierte humane Nieren-Myofibroblasten-Zelllinien eingesetzt. Parallel zu diesem Screening werden Zytotoxizitätsassays durchgeführt, um Verbindungen auszuschließen, die einen Effekt auf die Reporterfluoreszenz oder -aktivität aufgrund von unspezifischer Toxizität oder Auslösung von Apoptose ausüben.
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  • Zitierte Patentliteratur
    • WO 200907861 [0059]
    • US 6548640 [0059]
    • US 5859205 [0059]

Claims (29)

  1. Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine gegebene Zelle, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) Hemmen oder Reduzieren der nkd2-Genexpression in der Zelle, (ii) Fördern des Abbaus des NKD2-Proteins in der Zelle, und/oder (iii) Hemmen oder Reduzieren der NKD2-Proteinaktivität in der Zelle.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung oder Reduzierung der nkd2-Genexpression durch nkd2-Gen-Knock-down, Knock-out, konditionalen Gen-Knock-out, Genveränderung, RNA-Interferenz, siRNA und/oder Antisense-RNA erreicht wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung oder Reduzierung der NKD2-Proteinaktivität durch Verwendung eines Wirkstoffs erreicht wird, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagte Zelle eine Nierenzelle ist, vorzugsweise eine Nierenmyofibroblastenzelle, am meisten bevorzugt eine terminal differenzierte Nierenmyofibroblastenzelle.
  5. Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) Protein oder ein Fragment davon bindet.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, das mindestens die folgenden Schritte umfasst (i) Bereitstellen des NKD2-Proteins oder eines Fragments davon, (ii) Zugabe von mindestens einem Wirkstoff, der auf Bindung an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon untersucht werden soll, und (iii) Identifizierung des mindestens einem Wirkstoff, der an das NKD2-Protein oder das Fragment davon gebunden hat.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, wobei der Wirkstoff ein NKD2-Inhibitor ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer niedermolekularen Verbindung, einem Peptid und einem Biologikum.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Biologikum ein Antikörper, ein antigenbindendes Fragment davon, ein antigenbindendes Derivat davon, ein antikörperähnliches Protein oder ein Aptamer ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei das NKD2-Protein an eine feste Phase gebunden ist oder in Lösung vorliegt.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei der Wirkstoff Mitglied einer Verbindungsbibliothek ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Verbindungsbibliothek niedermolekulare Verbindungen, Peptide oder biologische Verbindungen umfasst.
  13. Verwendung einer Nukleinsäure, die für das Naked Cuticle Homolog 2 oder ein Fragment davon oder das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein oder ein Fragment davon kodiert, in einem Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an NKD2 oder ein Fragment davon bindet, nach einem der Ansprüche 5 bis 12.
  14. Antikörper oder antigenbindendes Fragment oder Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, das spezifisch an das NKD2-Protein bindet.
  15. Antikörper, oder antigenbindendes Fragment oder Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, nach Anspruch 14, wobei der Antikörper, oder das antigenbindende Fragment oder Derivat davon, oder das antikörperähnliche Protein, die NKD2-Aktivität inhibiert.
  16. Wirkstoff, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12.
  17. Wirkstoff nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung.
  18. Wirkstoff, der an das Protein Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) bindet, zur Verwendung bei der Behandlung von chronischer Nierenerkrankung.
  19. Wirkstoff nach Anspruch 18, wobei der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2-Aktivität hemmt.
  20. Wirkstoff zur Verwendung nach einem der Ansprüche 16 und 17, wobei die chronische Nierenerkrankung eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist.
  21. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei der Wirkstoff eine niedermolekulare Verbindung (smol), ein Peptid oder ein Biologikum ist, wobei das Biologikum vorzugsweise ein Antikörper oder ein Fragment davon, oder ein Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, oder ein Aptamer ist.
  22. Verwendung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet, in einem Verfahren zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist.
  23. Verwendung eines Wirkstoffs nach Anspruch 22, wobei der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2-Aktivität hemmt.
  24. Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet und/oder dieses hemmt, in einer therapeutisch wirksamen Dosis an ein menschliches oder tierisches Subjekt umfasst.
  25. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment oder Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein nach einem der Ansprüche 14 und 15 oder der Wirkstoff nach einem der Ansprüche 16 bis 21 und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe.
  26. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die Hilfsstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus pharmazeutisch verträglichen Puffern, Tensiden, Verdünnungsmitteln, Trägern, Hilfsstoffen, Füllstoffen, Bindemittel, Schmiermitteln, Gleitmitteln, Desinfektionsmitteln, Adsorptionsmitteln und/oder Konservierungsmitteln.
  27. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend (i) das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, und ferner (ii) Mischen des identifizierten Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
  28. Zusammensetzung, umfassend eine Kombination aus (i) dem Antikörper oder antigenbindenden Fragment oder Derivat davon oder antikörperähnlichem Protein nach einem der Ansprüche 14 und 15 oder dem Wirkstoff, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet, nach einem der Ansprüche 16 bis 21 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25 und 26, und (ii) einer oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Verbindungen.
  29. Therapeutisches Kit, umfassend: (i) die pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25, 26 oder 28, (ii) eine Vorrichtung zur Verabreichung der Zusammensetzung, und (iii) optional eine Gebrauchsanweisung.
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