KR20230098243A - 신장 섬유증 치료를 위한 표적으로서의 nkd2 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만성 신장 질환, 특히 진행성 만성 신장 질환 및 신장 섬유증의 발병에 있어서 네이키드 큐티클 상동체 2 (Nkd2) 유전자로부터 유래된 단백질의 역할의 확인에 관한 것이다. 본 발명은 특히 nkd2 단백질과 결합하는 화합물을 확인하는 방법, 및 Nkd2-상호작용 화합물을 스크리닝하고 확인하기 위한 Nkd2의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물, 특히 NKD2 단백질과 결합하고/거나 이를 억제하는 활성 물질을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다 (도 1a).

Description

신장 섬유증 치료를 위한 표적으로서의 NKD2

본 발명은 만성 신장 질환, 특히 진행성 만성 신장 질환 및 신장 섬유증의 발병에 있어서 네이키드 큐티클 상동체 2 (Nkd2) 단백질의 역할에 관한 것이다. 본 발명은 특히 Nkd2 단백질과 결합하는 화합물을 확인하는 방법, 및 Nkd2-상호작용 화합물을 스크리닝하고 확인하기 위한 Nkd2의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물, 특히 Nkd2 단백질과 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

만성 신장 질환 (CKD)은 세계 인구의 10% 초과에 이환되며 그의 유병률이 증가하고 있다. 손상의 초기 유형과는 별개로, 신장 손상의 최종 공통 경로는 신장 섬유증이다. 신장 섬유증은 만성 신장 질환 진행의 특징이지만, 현재 항섬유증 요법은 존재하지 않는다. 신장 섬유증의 정도는 CKD에서의 신장 기능 상실 및 임상 결과와 서로 떼어 놓을 수 없는 관계이므로, 신장 섬유증은 CKD에서의 주요 치료 표적으로 간주된다. 신장 섬유증 치료를 위해 승인된 치료법이 존재하지 않은데, 이는 주로 인간 신장에서 세포 기원, 기능적 이질성 및 흉터-생산 세포의 조절이 불분명하고 이러한 분야에서 계속해서 주요 논쟁거리가 되기 때문이다 (Duffield 2014; Falke et al. 2015). 유일한 치료 옵션은 지속적인 신장 대체 요법 (투석)과 신장 이식이다. 두 옵션 모두 환자의 개인적 불편감이 높다는 것과 연관이 있으며 또한 국가 의료 시스템에 대한 높은 경제적 부담을 나타낸다. 따라서, 새로운 치료 접근법이 고도로 요망된다.

신장 섬유증은 장기 부전을 유발하는 기능적 실질을 파괴하고 대체하는 세포외 매트릭스의 과도한 침착으로 정의된다. 신장의 조직학적 구조는 3개의 주요 구획으로 나눌 수 있으며, 모두 섬유증, 구체적으로 사구체에서의 사구체 경화증, 세뇨관간질의 간질 섬유증 및 혈관계에서의 동맥 경화증 및 혈관주위 섬유증으로 불리는 섬유증에 의해 영향을 받을 수 있다 (Djudjai and Boor 2019).

신장 섬유증은 콜라겐-1과 같은 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질의 높은 발현, 분비 및 축적을 특징으로 한다. 근섬유모세포는 신장 섬유증 동안 ECM의 주요 공급원을 나타내며, 이들의 세포 기원은 계속해서 논란이 되고 있다 (Duffield 2014; Friedman et al. 2013; Kriz et al. 2011; Kramann and DiRocco 2013). 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 맵핑을 통해 복잡한 조직 및 질환 프로세스의 세포 이질성을 분석할 수 있으며, 또한 질환-매개 세포 집단 및 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있다 (Ramachandran et al. 2019; Dobie and Henderson 2019). 과거에, 인간 조직에서의 다양한 염색 접근 방식에 의해 확장된 마우스에서의 유전적 운명 추적 데이터는 광범위한 상이한 세포 유형, 예컨대 상피, 내피, 순환 조혈 세포 뿐만 아니라 상주 중간엽 세포가 섬유증에 기여한다고 시사하였다 (Duffield 2014; Friedman et al. 2013; Kramann and DiRocco 2013).

따라서, 본 발명의 근본적인 문제는 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 작용제, 화합물 및 조성물 뿐만 아니라 상기 작용제, 화합물 및 조성물을 확인하기 위한 방법 및 수단을 제공하는 것이다.

본 발명은 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 작용제, 화합물 및 조성물을 확인하기 위한, 특히 진행성 만성 신장 질환 및 신장 섬유증의 치료에 사용하기 위한 고도로 유효한 작용제, 화합물 및 조성물을 확인하기 위한 방법 및 수단을 제공한다.

본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질이 신장 섬유증에 관여하는 말기 분화된 근섬유모세포에서 생산되지만, 혈관주위세포 및 섬유모세포에 대한 마커 단백질 및 소량의 세포외 매트릭스 단백질만을 발현하는 세포에서는 생산되지 않는다는 것을 발견하였다. Nkd2-발현 세포는 섬유증 유발성 신호 변환 경로의 활성을 증가시키는 것으로 추가로 밝혀졌다. 본 발명자들은 추가로 섬유증의 감소가 Nkd2 유전자의 결실 또는 Nkd2 발현의 녹다운에 의해 달성될 수 있다는 것을 발견하였고, 따라서 상기 유전자가 세포외 매트릭스 및 섬유증의 생산과 관련이 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 처음으로, Nkd2를 새로운 표적으로 규명하여 소분자 작용제 (Smol), 펩티드 또는 생물제제를 사용하여 Nkd2 유전자 발현 및/또는 NKD2 단백질 활성을 억제하는 치료제 개발을 위한 새로운 치료적 접근 방식을 확인하였다.

종래 기술의 관점에서, 따라서 본 발명의 하나의 목적은 주어진 세포에 의한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 발현 및/또는 분비를 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 추가 목적은 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질, 또는 그의 단편과 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제의 확인을 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 추가 목적은 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2), 또는 그의 단편과 결합하는 작용제의 확인을 위해, 네이키드 큐티클 상동체 2, 또는 그의 단편, 또는 NKD2 단백질, 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 사용하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 추가 목적은 상기 기재된 발견에 기초하여, 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 작용제, 특히 진행성 만성 신장 질환 및/또는 신장 섬유증의 치료에 사용하기 위한 작용제를 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 추가 목적은 상기 기재된 발견에 기초하여, 상기 작용제를 포함하는 제약 조성물, 및 이러한 제약 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이들 및 추가 목적은 본 발명의 독립항에 따른 방법 및 수단으로 충족된다. 종속항은 구체적 실시양태에 관한 것이다.

본 발명 및 그의 특색의 일반적인 장점은 하기에 상세히 논의될 것이다.

도 1. a. 네프론 구조의 개략도와 상이한 니치에 있는 세포 유형. b . 15개의 인간 신장으로부터의 51,849개의 MME- (CD10-) 단일 세포 전사체의 UMAP 임베딩. 컬러는 상피 세포 (n=9,280), 내피 세포 (n=29,814), 면역 세포 (n=9,616), 중간엽 세포 (n=3,115) 및 신경 세포 (슈반 세포, n=24)의 5가지 주요 세포 유형을 지칭한다. 약어에 대한 정보는 1d를 참조한다. c . 단일 세포 클러스터링 결과의 상관관계 네트워크 표현. 노드는 세포 클러스터를 나타낸다. 에지 (라인 연결)는 클러스터 간의 상관관계를 나타낸다. 네트워크 레이아웃은 ggraph R 패키지 (https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/index. html)에 구현된 강제 지시 레이아웃을 사용하여 결정되었다. d . 각각의 세포 유형/상태 클러스터에서 상위 10개 특이적 유전자의 스케일링된 유전자 발현. 클러스터당 유전자 순위는 genesorteR을 사용하여 수득되었다. 세포 클러스터 표지는 세포 유형/상태를 29개의 표준 세포 유형 (B 세포 (B): n=3,101, T 세포 (T): n=484, 자연 살해 세포 (NK): n=740, 형질 세포 (P): n=167, 비만 세포 (Mast): n=142, 수지상 세포 (DC): n=841, 단핵구 (Mono): n=1,111, 대식세포 1 (Mac1): n=1,476, 대식세포 2 (Mac2): n=615, 대식세포 3 (Mac3): n=939, 세동맥 내피 (Art1): n=901, 사구체 모세혈관 (GC): n=4377, 정맥 내피 (Ven): n=2724, 림프 내피 (lEn): n=509, 곧은 혈관 1 (VR1): n=5,355, 곧은 혈관 2 (VR2): n=2,023, 곧은 혈관 3 (VR3): n=3,051, 곧은 혈관 4 (VR4): n=726, 곧은 혈관 5 (VR5): n=3,271, 곧은 혈관 6 (VR6): n=4,378, 손상된 내피 세포 (iEn): n=2,499, 혈관 평활근 세포 (VSMC): n=426, 혈관주위세포 1 (Pe1): n=455, 혈관주위세포 2 (Pe2): n=188, 섬유모세포 1 (Fib1): n=761, 섬유모세포 2 (Fib2): n=208, 섬유모세포 3 (Fib3): n=246, 근섬유모세포 1a (MF1a): n=525, 근섬유모세포 1b (MF1b): n=306, 근위 세뇨관 (PT): n=917, 손상된 근위 세뇨관 (iPT): n=909, 하행 얇은 사지 (DTL: n=806, 연결 세뇨관 (CNT): n=662, 치밀 반점 세포 (Mdc): n=869, 두꺼운 상행 사지 2 (TAL2): n=692, 두꺼운 상행 사지 3 (TAL3): n=315, 두꺼운 상행 사지 4 (TAL4): n=390, 삽입 세포 3 (IC3): n=62, 삽입 세포 4 (IC4): n=78, 삽입 세포 5 (IC5): n=33, 삽입 세포 6 (IC6): n=39, 삽입 세포 7 (IC7): n=40, 삽입 세포 9 (IC9): n=72, 삽입 세포 A (IC-A): n=754, 삽입 세포 B (IC-B), n=316, 요로상피 세포 (Ure): n=246, 족세포 (Pod): n=44, 슈반 세포: n=24)으로 그룹화한 것을 지칭한다. 세포 클러스터는 열에 있고, 유전자는 행에 있다. 각각의 열은 클러스터에 있는 모든 세포의 평균 발현이다. 도 1d_1에는 과다발현되는 유전자의 발현이 묘사되어 있다. 도 1d_2에는 더 낮은 수준에서 과소발현/발현되는 유전자의 발현이 묘사된다. e . 환자 임상 파라미터에 따른 단일 세포의 계층화 (CKD=만성 신장 질환, eGFR=추정 사구체 여과율). f . 환자 임상 파라미터에 따라 계층화된 31,875개의 CD10+ (CD10+) 단일 세포 전사체의 UMAP 임베딩. g . 무작위 주파수 모델과 비교한 건강한 및 CKD 상피 세포에서 세포 주기 단계 지정 주파수의 로그 배수 변화. 양수는 증강을 나타내고 음수는 고갈을 나타낸다. h . CD10+ 세포에 대한 KEGG 경로 증강. i . 만성 신장 질환 환자로부터의 세포는 ECM 발현이 높은 세포 (ECM=세포외 매트릭스, CD10- 세포)가 풍부하다. j . CD10- 세포에서의 건강한/CKD 및 주요 세포 유형에 따라 계층화된 세포의 ECM 점수의 바이올린 플롯. eGFR 카테고리 차이의 P-값: 중간엽 (p<0.001), 면역 (p<0.001), 상피 (p<0.001), 내피 (p<0.001). k . 주요 세포 유형 및 건강한/CKD에 의해 계층화된, 중간엽으로서 확인된 세포에 대한 세포 ECM 점수의 바이올린 플롯. eGFR 카테고리 차이의 P-값: Fib1 (0.0001), Fib2 (n.s.), Fib3 (n.s.), MF1a (n.s.), MF1b (n.s.), Pe1 (n.s.), Pe2 (n.s.), SMC (n.s.). l . 중간엽 세포 유형 및 임상 파라미터당 세포의 수. m . 13개의 인간 신장 (n=2,689)으로부터의 섬유모세포/혈관주위세포/근섬유모세포의 UMAP 임베딩. 상이한 세포 유형은 점선으로 구분된다. 실선은 슬링샷으로 예측한 계통 트리를 지칭한다. n . 도 b의 UMAP에 표시된 선택된 유전자의 발현. o . 혈관주위세포, 섬유모세포 및 근섬유모세포의 확산 맵 임베딩 및 동일한 임베딩에서의 Col1a1 발현.
도 2. a. 8개의 인간 신장으로부터의 37,800개의 PDGFRb+ 단일 세포 전사체의 UMAP 임베딩. 4가지 주요 세포 유형은 점선으로 구분된다: 상피 세포 (n=461), 내피 세포 (n=2,341), 면역 세포 (n=20,838), 중간엽 세포 (n=25,385). 단일 세포 전사체의 감독되지 않은 클러스터링에 의해 세포 유형/상태가 확인되었다 (방법 참조): 섬유모세포 1 (Fib1), 섬유모세포 2 (Fib2), 섬유모세포 3 (Fib3), 혈관주위세포 (Pe), 혈관 평활근 세포 (VSMC), 혈관간 세포 (Mesa), 근섬유모세포 1 (MF1), 근섬유모세포 2 (MF2), 근섬유모세포 3 (MF3), 혈관간 세포 (Mesa), 대식세포 1 (MC1), 대식세포 2 (MC2), 수지상 세포 (DC), 세동맥 내피 세포 (Art), 사구체 내피 세포 (GC), 곧은 혈관 (VR), 손상된 내피 (iEn), 근위 세뇨관 (PT), 손상된 근위 세뇨관 (iPT), 삽입 세포 (IC), 집합 관 주 세포 (PC), 두꺼운 상행 사지 (TAL). b . 환자 임상 파라미터에 따른 단일 세포의 계층화 (CKD=만성 신장 질환, eGFR=추정 사구체 여과율). c . 도 a로부터 UMAP로서 표시된 선택된 유전자의 발현. d . 각각의 세포 유형/상태 클러스터에서 상위 10개 유전자의 스케일링된 유전자 발현. 세포 클러스터당 유전자 순위는 genesorteR에 의해 결정되었다. 세포 클러스터 표지는 a. 및 b.에서 강조 표시된 세포 클러스터를 지칭한다. 세포는 열에 있고 (각각 100개의 세포/열), 유전자는 행에 있다. 도 2d_1에는 과다발현되는 유전자의 발현이 묘사되어 있다. 도 2d_2에는 더 낮은 수준에서 과소발현/발현되는 유전자의 발현이 묘사된다. e . PDGFRb+ 섬유모세포/근섬유모세포/혈관주위세포 (n=23,883)의 확산 맵 임베딩 및 동일한 임베딩에서 선택된 유전자의 발현. 라인은 슬링샷에 의해 예측된 3개의 계통 (계통 L1, L2 및 L3)에 상응한다. f . n=35 인간 신장에서 Meg3, Notch3, Postn에 대한 다중화 RNA-계내 혼성화의 대표적인 영상. 스케일 바 좌측 10 μm, 우측 25 μm. 상단에서 하단으로: Meg3, Notch, Postn 및 Dapi / Postn의 단독 검출 / Postn + Notch-3 / Postn + Meg3 / Postln + DAPI에 대한 RNA 계내 혼성화 영상. Meg3/Notch3 이중 양성 세포의 정량화. g . 좌측 상단: 계통 1 (혈관주위세포에서 근섬유모세포로, e 참조)에 대한 의사 시간 축을 따른 과다발현에 대한 유전자 발현 역학. 세포 (열)는 의사 시간 축을 따라 정렬되었고, 의사 시간과 상관관계가 있는 유전자 (행)는 의사 시간을 따라 선택되고 플롯되었다 (방법 참조). 각각의 10개의 세포가 하나의 열에서 평균화되었다. 유전자는 의사 시간 발현 패턴을 나타내는 7개의 그룹으로 그룹화되었다. 선택된 예시적 유전자가 표시된다. 좌측 하단: 좌측 상단에 따른 영상이지만, 낮은 수준에서의 과소발현/발현이 묘사된다. 우측 상단: 의사 시간에 따른 각각의 2000개 세포의 퍼센트로서 의사 시간에 따른 세포 주기 단계. 우측 하단: 의사 시간에 따른 PID 신호전달 경로 증강 분석.
도 3. a. 모의 수술과 비교한 UUO (일측성 요관 폐색) 마우스 신장 모델에서 PDGFRbCreER-tdTomato의 운명 추적 실험 설계 (상단) 및 시각화 (하단). 상단: PDGFRb-tdtom 및 DAPI의 검출; 중간: PDGFRb-tdtom의 검출; 하단: DAPI의 검출. b . UUO 수술 후 PDGFRbCreER;tdTomato 신장에서 Col1a1 계내 혼성화의 대표적인 영상. 상단에서 하단으로: PDGFRb-tdtom + Col1 + DAPI의 검출 / Col1의 검출 / PDGFRb-tdtom + Col1의 검출 / Col1 + DAPI의 검출. c . UUO 수술 후 제10일에 tdTomato를 공동 발현하는 Col1a1-mRNA 발현 세포의 백분율 (n = 3). d . 시간 경과에 따른 UUO 실험 설계. UUO는 PDGRb-eGFP 마우스에서 수행되었으며 마우스 신장으로부터의 eGFP 양성 단일 세포는 UUO 유도 후 제0일, 제2일 및 제10일에 단리되었고 Smart-Seq v2를 사용하여 검정되었다. e . d에 묘사된 시간 경과 UUO 실험에서 수집된 세포의 UMAP 임베딩. 세포 유형은 감독되지 않은 클러스터링에 의해 확인되었다 (방법 참조) (두정 상피 세포 (PECs): n=68, 매트릭스 생산 세포 (MP): n=76, 손상된 평활근 세포 1 (iSMCs1): n=112, 손상된 평활근 세포 2 (iSMCs2): n=77, 손상된 평활근 세포 3 (iSMCs3): n=76, 혈관간 세포 (Mesa): n=74, 혈관주위세포 1 (Pe1): n=113, 레닌 생산 평활근 세포 (rSMC): n=101, 평활근 세포 1 (SMC1): n=172, 혈관주위세포 2 (Pe2): n=83). f . 시점당 각각의 세포 유형에서 발생하는 세포의 퍼센트. 각각의 열의 합계는 100이다. g . 모든 10개의 세포 클러스터에서 선택된 유전자의 발현. h . e로부터의 UMAP 임베딩에서 선택된 유전자의 발현. i . PDGFRbCreER;tdTomato 양성 세포 (화살표)의 서브세트에서 Pdgfra 발현을 나타내는 모의 및 UUO (제10일) 마우스 신장에서의 면역-형광 (IF) 염색. 좌측에서 우측으로: PDGFRbCreERtdTomato + PDGFRa + DAPI의 검출 / PDGFRbCreERtdTomato의 검출 / PDGFRa의 검출 / DAPI의 검출. j . PDGFRa/PDGFRb 이중-양성 세포에서 Col1a1 발현의 공동-국재화를 보여주는 RNA 계내 혼성화. Col1a1/PDFGRa/PDFRb 삼중-양성 세포 (화살표)는 신장 간질에서만 발생한다. 상단에서 하단으로: PDGFRa + Col1a1 + PDGFRb + DAPI의 검출 / PDGFR-a의 검출 / PDGFRa + Col1a1의 검출 / PDGFRa + PDGFRb의 검출 / PDGFRa + DAPI의 검출. k . 좌측: PDGFRa 및 PDGFRb 발현에 따라 계층화된 CD10 음성 세포 (도 1b-c)에서의 Col1a1 발현 및 ECM 점수. 우측: 상기 기재된 바와 같이 계층화된, 동일한 데이터 세트에서 Col1a1 양성 및 음성 세포의 퍼센트. Col1a1 음성 세포는 PDGFRa/b 이중-음성 세포에서 검출 가능한 반면, Col1a1 양성 세포는 PDGFRa/b 이중-양성 세포에서 주로 발생한다. 그룹 비교: (다른 유전자) vs. (a/b): p<0.001, (a-) vs. (a/b): p<0.001, (b) vs. (a/b): p<0.001, (다른 유전자) vs. (a): p<0.001, (b) vs. (a): p<0.001, (다른 유전자) vs. (b): p<0.001. 본페로니(Bonferroni)는 윌콕슨(Wilcoxon) 순위 합계 시험을 기반으로 p-값을 보정하였다. l . 62명의 환자에 대한 IF/TA-Score의 분포 및 62개의 신장의 핵 대조염색 (DAPI)이 있는 PDGFRa, PDGFRb 및 Col1a1 프로브를 사용한 다중화 RNA 계내 혼성화에 의해 염색된 삼색 염색된 인간 신장 조직 마이크로어레이 (TMA)의 대표적인 영상 (좌측), 동일한 데이터 세트에서 PDGFRa/PDGFRb 검출에 의해 계층화된 계내 혼성화 데이터에서의 평균 스케일링된 Col1a1 발현 (중간) 및 상기와 같이 계층화된 동일한 데이터 세트에서 Col1a1 양성 및 음성 세포의 퍼센트 (우측). 그룹 비교: (a/b) vs. (col1α1): p<0.001, (a/b) vs. (b): p<0.001, (a/-) vs. (a): p<0.001. 본페로니는 윌콕슨 순위 합계 시험을 기반으로 p-값을 보정하였다. 스케일 바: 1000 μm, b 10 μm, i+j 50 μm, k 10 μm. 상단에서 하단으로 다중화 RNA 계내 혼성화: Col1a1 + PDGFRa + PDGFRb + DAPI의 검출 / Col1a1의 검출 / Col1 + PDGFRa의 검출 / Col1a1 + PDGFRb/Nachweis col1 + DAPI의 검출.
도 4. a. UUO 실험 계획. UUO는 PDGRb-eGFP 마우스에서 수행되었다. eGFP+/PDGFRb+ 단일 세포를 마우스 신장으로부터 단리하고 UUO (각각 n=5) 후 제0일 및 제10일에 10x 게노믹스 drop-seq를 사용하여 검정하였다. b . 모의 수술과 비교하여 UUO 수술 후 제10일에 PDGFRa, PDGFRb 및 PDGFRa/b 발현 세포의 유동 세포계수 정량화. *p<0.05; **p<0.01 사후 본페로니 보정을 사용한 일원 분산 분석 시험. c. 좌측: UUO 실험에서 단리된 세포의 UMAP 임베딩 (a에 묘사됨). (n=7,245). 4가지 주요 세포 클러스터를 확인할 수 있었다 [상피 세포 (n=223), 내피 세포 (n=370), 면역 세포 (n=199), 중간엽 세포 (n=6,633)]. 단일 세포 전사체의 감독되지 않은 클러스터링에 의해 수득된 10가지 세포 유형을 구별할 수 있었다. 섬유모세포 1 (Fib1), 근섬유모세포 1 (MF1), 근섬유모세포 2 (MF2), 근섬유모세포 3 (MF3), 내피 세포 (EC), 손상된 근위 세뇨관 세포 (iPT), 공지되지 않은 중간엽 세포 (uM), 대식세포/단핵구 (MC). 우측: 모의 또는 UUO 마우스에서 각각의 세포 클러스터에 있는 세포의 퍼센트. d . 각각의 세포 클러스터에서 선택된 유전자의 발현 (c에 표시). e . c로부터의 UMAP 임베딩에 시각화된 세포외 매트릭스 점수 (ECM 점수)의 영상. f . 상이한 세포 클러스터에서 Col15a1 발현의 바이올린 플롯. 중간엽 세포만 표시된다. g . 상이한 세포 클러스터에서 콜라겐 점수의 바이올린 플롯. 중간엽 세포만 표시된다. 콜라겐 점수는 문헌 [Naba et al.]에 의해 제공된 바와 같은 코어 콜라겐 유전자의 평균 발현이다. h . n=34 인간 신장에서 PDGFRa, PDGFRb 및 Meg3에 대한 다중화 RNA 계내 혼성화의 대표적인 영상. Meg3은 PDGFRa 및 PDGFRb와 함께 국재화된다. 상단에서 하단으로: Meg3 + PDGFRa + PDGFRb + DAPI의 검출 / Meg3의 검출 / Meg3 + PDGFRa의 검출 / Meg3 + PDGFRb의 검출 / Meg3 + DAPI의 검출. i . RNA 계내 혼성화로부터 정량화된, PDGFRa/b 이중-양성 세포 중 Meg3-양성 세포의 퍼센트. j . 섬유모세포 및 근섬유모세포의 UMAP (좌측) 및 확산 맵 (우측) 임베딩 (n=6,557). 세포 클러스터는 c에 표시된다. 흑색 선은 슬링샷에 의해 예측된 계통 트리를 나타낸다. 하단: 동일한 UMAP 임베딩에서 시각화된 선택 유전자의 발현. k . 동일한 중간엽 세포 클러스터에서 신호전달 경로 증강.
도 5. a. 도 4c로부터의 UMAP 임베딩에서 시각화된 Nkd2의 발현 (마우스 Pdgfra/b 이중-양성 세포). b . Pdgfra 및 Nkd2 발현에 의해 계층화된, a.와 동일한 데이터 세트에서 Col1a1 양성 및 음성 세포의 퍼센트. Col1a1 음성 세포는 대부분 PDGFRa/Nkd2 이중-음성 세포에서 발생하는 반면, Col1a1 양성 세포는 가장 자주 PDGFRa/Nkd2 이중-양성 세포이기도 하다. c . 도 2a-c에 묘사된 인간 PDGFRb- 세포에서의 Nkd2 발현과 상관관계가 있는 (도 5c_1) 또는 상관관계가 없는 (도 5c_2) 것으로 확인된 유전자의 스케일링된 유전자 발현. d . n=36 인간 신장에서 PDGFRa, PDGFRb 및 NKD2의 다중화 RNA 계내 혼성화의 대표적인 영상. 상단에서 하단으로: NKD2 + PDGFRa + PDGFRb + DAPI의 검출 / NKD2의 검출 / NKD2 + PDGFRa의 검출 / NKD2 + PDGFRb의 검출 / NKD2 + DAPI의 검출. e . 신병리학자에 의해 맹검으로 점수를 매긴 간질 섬유증이 낮거나 높은 환자로부터의 RNA 계내 혼성화로부터 정량화된, PDGFRa/PDGFRb 이중-양성 세포 중 NKD2+ 세포의 퍼센트. f . 렌티바이러스 Nkd2 과다발현의 웨스턴 블롯 검증. HA 태그는 외인성 과다발현 단백질에 부착된다. g. 전환 성장 인자 베타 (TGFb) 또는 비히클 (PBS)로 처리된 인간 불멸화 PDGFRb+ 세포에서 Nkd2 과다발현 후 qPCR에 의해 정량화된 Col1a1, 피브로넥틴 (Fn) 및 Acta2 (aSMA)의 발현. h . 비-표적화 gRNA 클론 (NTG)과 비교하여 다중 단일 세포 클론 (1,2,3)에서 웨스턴 블롯에 의한 Nkd2 녹아웃의 검증. Nkd2 단백질 발현은 큰 삽입으로 인해 클론 2에서 완전히 결실된 반면, 클론 1, 3은 더 작은 인델 돌연변이로 인해 감소된 Nkd2 단백질 발현만을 나타냈다. i . g에 묘사된 동일한 클론에서 Nkd2 녹아웃 후 RNA qPCR에 의한 Col1a1, 피브로넥틴 (Fn) 및 Acta2의 발현. j. Nkd2-교란된 PDGFRb- 신장 세포에서 ECM 유전자의 GSEA (유전자 세트 증강 분석). NKD2 단백질이 여전히 검출되는 클론 1+3에서 "얕음"이 검출되었다. 클론 2에서 "깊음"이 검출되었다. k . PDGFRb+ NKD2-KO 클론 및 과다발현에서 PID 신호전달 경로의 강도에서의 변형 (up는 지시된 조건 하에서 상향 조절된 유전자를 나타내고, down은 하향 조절된 유전자를 나타낸다). l . 인간 iPSC 유래 신장 오가노이드에서 PDGFRa, PDGFRb 및 NKD2의 다중화 RNA 계내 혼성화의 대표적인 영상. 상단에서 하단으로: Nkd2 + PDGFRa + Col1a1 + DAPI의 검출 / Nkd2의 검출 / Nkd2 + PDGFRa의 검출 / Nkd2 + Col1a1의 검출 / Nkd2 + DAPI의 검출. m . 신장 오가노이드에서 NKD2의 형광 강도의 정량화. n . iPSC 유래 신장 오가노이드에서 Col1a1의 면역형광 염색 (흑색). o . 신장 오가노이드에서의 콜라겐 함량의 정량화. ##p<0.01, ####p<0.0001 일원 분산 분석 후 본페로니의 사후 시험 (vs. 대조군 NTG). *P < 0.05, **p< 0.01 및 ***p < 0.001, ****p <0.0001 t 시험 (e+m) 또는 일원 분산 분석 후 본페로니의 사후 시험 (g, i vs. TGFb NTG)). 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. 스케일 바: c 10 μm, l+n 50 μm.

본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 기재된 디바이스의 특정한 구성요소 부분 또는 기재된 방법의 처리 단계에 제한되지 않으며 이러한 디바이스 및 방법은 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정한 실시양태를 설명하기 위한 목적일 뿐 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및/또는 복수의 지시 대상물을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 또한 숫자 값으로 구분되는 파라미터 범위가 제공되는 경우, 이러한 범위는 이러한 제한 값을 포함하는 것으로 간주된다는 점을 이해해야 한다.

본원에 개시된 실시양태는 서로 관련되지 않는 개별 실시양태로서 이해되도록 의도되지 않는다는 것이 또한 이해되어야 한다. 하나의 실시양태에서 논의된 특색은 본원에 제시된 다른 실시양태와 연계해서 또한 개시되는 것을 의미한다. 하나의 경우에, 특이적 특색이 하나의 실시양태에 개시되지 않고 또 다른 실시양태에 개시된다면, 통상의 기술자는 반드시 상기 특색이 상기 다른 실시양태에 개시되는 것을 의미하지 않는다는 것을 의미하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 통상의 기술자는 다른 실시양태에 대해서도 상기 특색을 개시하는 것이 본 출원의 요지이지만, 단지 명료함을 목적으로 하고 본 명세서를 관리 가능한 분량으로 유지하기 위해 이것이 수행해지지 않았다는 것을 이해할 것이다.

또한, 본원에 언급된 선행 기술 문서의 내용이 참조로 포함된다. 이것은 특히, 표준 또는 일상적인 방법을 개시하는 선행 기술 문서를 나타낸다. 그러한 경우에, 참조로 포함된다는 것은 주로 충분한 가능하게 하는 개시를 제공하고 긴 반복을 피하기 위한 목적을 갖는다.

본 발명의 제1 측면에 따르면, 본 발명은 주어진 세포에 의한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 발현 및/또는 분비를 감소시키는 방법에 관한 것이며, 이러한 방법은 하기 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단계를 포함한다:

(i) 상기 세포에서 nkd2 유전자 발현을 억제하거나 또는 감소시키는 단계,

(ii) 상기 세포에서 NKD2 단백질의 분해를 촉진시키는 단계, 및/또는

(iii) 상기 세포에서 NKD2 단백질 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 단계.

nkd2 유전자 발현의 상기 억제 또는 감소는, 예를 들어 nkd2 유전자 녹다운, 녹아웃, 조건부 유전자 녹아웃, 유전자 변경, RNA 간섭, siRNA 및/또는 안티센스 RNA에 의해 달성될 수 있다. nkd2 유전자 발현의 억제 또는 감소는, 예를 들어 안티센스 분자, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스 접합체, 또는 촉매 핵산 분자, 예컨대 리보자임에 의해 달성될 수 있다. 이러한 분자는 발현 벡터에 의해 세포 내에서 생산될 수 있거나, 또는 세포 외부로부터 도입될 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 안정성 및/또는 결합 친화성을 증가시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미다이트, 알킬-포스포트리에스테르 또는 보라노포스페이트에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 백본 화학의 화학적 변형은 선행 기술 (예를 들어, WO00/49034A1)에 기재되어 있다.

상기 세포에서 상기 NKD2 단백질의 분해 촉진은, 예를 들어, 프로테아제 또는 다른 단백질 분해 분자에 의해 달성될 수 있다. 이러한 프로테아제 또는 단백질 분해 분자는 세포 내에서 발현 벡터에 의해 이종 합성될 수 있거나, 또는 세포 내에서 프로테아제를 코딩하는 유전자의 상동 유전자 발현을 증가시켜 세포 내에서 증가된 양으로 합성될 수 있거나, 또는 세포 외부로부터 세포 내로 도입될 수 있다.

NKD2 단백질 활성의 상기 억제 또는 감소는 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하는 작용제의 사용에 의해 달성될 수 있다.

바람직하게는, 상기 주어진 세포는 신장 세포, 보다 바람직하게는 신장 근섬유모세포, 가장 바람직하게는 말기 분화된 신장 근섬유모세포이다.

NKD2 단백질은 WNT 길항제인 것으로 나타났다. 네이키드 큐티클 (NKD) 패밀리는 드로소필라(Drosophila) 네이키드 큐티클 및 그의 2가지 척추동물 오르토로그인 네이키드 큐티클 상동체 1 (NKD1) 및 2 (NKD2)를 포함한다. Nkd2 유전자좌는 염색체 5p15.3에 위치한다. 이형 접합성의 상실은 유방암을 포함한 상이한 유형의 종양의 이러한 영역에서 자주 발견되었다. NKD1과 NKD2 둘 다는 EF-핸드-유사 모티프를 통해 디셰벌드(Dishevelled)와 상호작용함으로써 표준 Wnt 신호전달을 길항하는 것으로 보고되었다 (Hu et al. 2006). 또한, NKD2는 TGFα 결합 영역을 통해 디셰벌드와 결합하는 것으로 입증되었다 (Li et al. 2004). 인간 NKD1과 2는 서로 40%만 동일하며 마우스에서 각각의 오르토로그와 대략 70% 동일하다.

NKD2의 C-말단은 고도로 무질서한 반면, NKD2의 N-말단 영역은 미리스토일화, EF-핸드 모티프, 디셰벌드 결합 영역, 및 소포 인식 및 막 표적화 모티프를 포함하는 대부분의 기능적 도메인을 함유한다 (Li et al. 2004; Rousset et al. 2001; Zeng et al. 2000). NKD2는 몇 가지 기능적 모티프를 통해 스위치 단백질로서 기능하는 것으로 시사되었다 (Hu et al. 2006). NKD2의 프로모터 영역은 교모세포종 세포에서 과메틸화되어 있다.

본원에 기재된 바와 같이, 본 출원의 발명자들은 NKD2를 신장 섬유증 치료를 위한 치료 표적으로서 확인하였다. Nkd2는 말기 분화된 PDGFRa+/PDGFRb+ 근섬유모세포에서 독점적으로 발현되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 세포외 매트릭스 단백질 콜라겐-1의 높은 발현 수준을 나타낸다. 이것과 다른 매트릭스 단백질은 주로 섬유모세포와 혈관주위세포로부터의 분화에 의해 발생하는 근섬유모세포에 의해 생산된다. 모든 콜라겐-1 생산 세포의 40% 초과가 Nkd2/PDGFRa+인 것으로 나타났다. 혈관주위세포 및 섬유모세포에 대한 마커 단백질을 발현하고 낮은 수준의 매트릭스 단백질만을 분비하는 세포는 Nkd2 발현이 결여된다. 또한, Nkd2를 발현하는 근섬유모세포에서는 섬유증 유발성 신호 변환 경로, 예컨대 TGF-β-, Wnt- 및 TNFα 신호 변환 경로의 활성 증가가 검출되었다. Nkd2 과다발현 및 고갈 실험에서는, 각각 Nkd2가 세포외 매트릭스 단백질의 생산과 관련이 있는 것으로 입증되었다. 인간 섬유모세포에서의 Nkd2의 렌티바이러스 과다발현은 섬유증 유발성 인자 TGF-β에 의한 자극 후 콜라겐-1 및 피브로넥틴과 같은 섬유증 유발성 매트릭스 단백질의 발현을 증가시켰다. Nkd2의 CRISPR/Cas9-매개 녹아웃은 콜라겐-1, 피브로넥틴 및 ACTA2의 발현을 상당히 감소시키는 것으로 나타났다. IL1-13으로의 자극에 의해 섬유증 변화가 유도된 인간 신장의 모든 구획을 포함하는 오가노이드에서 siRNA에 의한 Nkd2의 녹다운은 감소된 콜라겐-1 발현 및 섬유증을 초래하는 것으로 나타났다.

상기 NKD2 단백질은 포유동물, 비-영장류, 영장류, 및 특히 인간 NKD2 단백질, 그의 단편일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질, 또는 그의 단편과 결합하는 작용제의 확인을 위한 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 적어도 하기 단계를 포함할 수 있다:

(i) NKD2 단백질, 또는 그의 단편을 제공하는 단계,

(ii) NKD2 단백질, 또는 그의 단편에 대한 결합에 관하여 스크리닝될 적어도 하나의 작용제를 부가하는 단계, 및

(iii) NKD2 단백질, 또는 그의 단편과 결합된 적어도 하나의 작용제를 확인하는 단계.

바람직하게는, 본 발명에 따라 스크리닝되고 확인되는 상기 작용제는 NKD2 억제제 또는 길항제이다.

본 발명에 따른 상기 작용제는 소분자 화합물, 펩티드, 및 생물제제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 맥락에서 용어 "소분자 화합물", "소분자" ("smol") 또는 "화학 약물"은 종종 크기가 1 nm 정도인 저분자량 (< 1,000 달톤) 유기 화합물에 관한 것이다. 많은 약물은 소분자이다. 이러한 소분자는 생물학적 프로세스를 조절할 수 있다. 소분자는 단백질의 특이적 기능을 억제할 수 있다. 약리학 분야에서 용어 "소분자"는 특히 특이적 생물학적 거대분자와 결합하고 이펙터로서 작용하여 표적의 활성 또는 기능을 변경시키는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 아세틸살리실산 (ASA)은 180 달톤으로 측정되고 21개의 원자를 포함하는 소분자 약물로 간주된다. 이러한 소분자 화합물은 종종 면역 반응을 개시할 수 있는 능력이 거의 없으며 시간이 지나도 비교적 안정적으로 유지된다.

본 발명에 따른 상기 "생물제제", "생물학적 약물", "생물학적 치료제" 또는 "생물제약"은 바람직하게는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 압타머이다.

NKD2 단백질, 또는 그의 단편과 결합하는 작용제의 확인을 위한 상기 방법의 바람직한 실시양태에서, 상기 작용제는 화합물 라이브러리의 구성원이다.

상기 화합물 라이브러리는, 예를 들어, 소분자 화합물, 펩티드, 또는 생물학적 화합물을 각각 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "(조합) 화합물 라이브러리"는 특정한 스크리닝 검정 또는 확인 단계에서 함께 사용될 수 있는, 관련 화학물질, 펩티드 또는 생물학적 종의 여러 상이한 조합이 포함된 화학적 화합물, 소분자, 펩티드 또는 거대분자, 예컨대 단백질의 컬렉션에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은, 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2), 또는 그의 단편과 결합하는 작용제의 확인을 위한 방법에서의 네이키드 큐티클 상동체 2, 또는 그의 단편, 또는 NKD2 단백질, 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 NKD2 단백질과 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질은 NKD2 활성을 억제하는데, 즉 NKD2의 억제제 또는 길항제로서 작용한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 이뮤노글로불린 유전자 또는 이뮤노글로불린 유전자의 단편 또는 그로부터 유래된 cDNA에 의해 코딩된 하나 이상의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 단백질을 지칭한다. 상기 이뮤노글로불린 유전자는 경쇄 카파, 람다 및 중쇄 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤 불변 영역 유전자 뿐만 아니라 많은 상이한 가변 영역 유전자 중 임의의 것을 포함한다.

기본 이뮤노글로불린 (항체) 구조 단위는 통상적으로 경쇄 (L, 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 중쇄 (H, 약 50-70 kDa의 분자량을 가짐)인 두 개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 구성된 사량체이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH 또는 V_H로 약칭)과 중쇄 불변 영역 (CH 또는 C_H로 약칭)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL 또는 V_L로 약칭) 및 경쇄 불변 영역 (CL 또는 C_L로 약칭)을 함유한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 더 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)이라고도 하는, 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL 영역은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 형성한다.

CDR은 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 결합에 가장 중요하다. FR은 항원 결합에 필요한 3차원 구조가 유지된다면, 다른 서열로 대체될 수 있다. 구축물의 구조적 변화는 대부분 항원에 대한 충분한 결합력의 상실을 초래한다.

(모노클로날) 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어는 천연 형태로 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 부분의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편, F(ab')₂ 단편, 힌지 영역에서 디술피드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편, VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편, 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, 및 VH 도메인 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 이루어지는 dAb 단편을 포함한다.

본 발명에 따른 항체, 또는 그의 항체 단편 또는 항체 유도체는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 이소형일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체 (mAb)"는 동종 항체 집단, 즉 전체 이뮤노글로불린, 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 동종 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭할 것이다. 특히 바람직하게는, 이러한 항체는 IgG, IgD, IgE, IgA 및/또는 IgM, 또는 그의 단편 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단편"은 표적 결합 능력을 보유하는 이러한 항체의 단편, 예를 들어, CDR (상보성 결정 영역), 초가변 영역, 가변 도메인 (Fv), IgG 중쇄 (VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 이루어짐), IgG 경쇄 (VL 및 CL 영역으로 이루어짐), 및/또는 Fab 및/또는 F(ab)₂를 지칭할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "유도체"는 통상적인 항체 개념과 구조적으로 상이하지만 여전히 일부 구조적 관계를 갖는 단백질 구축물, 예를 들어, scFv, Fab 및/또는 F(ab)₂ 뿐만 아니라 바이-, 트리- 또는 그보다 고 차수의 특이적 항체 구축물을 지칭할 것이다. 이들 항목 모두가 하기에 설명되어 있다.

통상의 기술자에게 공지된 다른 항체 유도체는 디아바디, 낙타과 항체, 도메인 항체, scFv로 이루어진 2개의 쇄를 갖는 2가 동종이량체, IgA (J 쇄과 분비 구성요소로 연결된 2개의 IgG 구조), 상어 항체, 신세계 영장류 프레임워크 플러스 비-신세계 영장류 CDR로 이루어진 항체, CH3+VL+VH를 포함하는 이량체화 구축물, CDR을 포함하는 다른 스캐폴드 단백질 형식, 및 항체 접합체이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체-유사 단백질"은 표적 분자와 특이적으로 결합하도록 조작된 (예를 들어, Ig 루프의 돌연변이유발에 의함) 단백질을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 항체-유사 단백질은 단백질 스캐폴드에 양 말단이 부착된 적어도 하나의 가변 펩티드 루프를 포함한다. 이러한 이중 구조적 제한은 항체-유사 단백질의 결합 친화도를 항체와 비슷한 수준으로 크게 증가시킨다. 가변 펩티드 루프의 길이는 전형적으로 10개 내지 20개의 아미노산으로 이루어진다. 스캐폴드 단백질은 우수한 용해도 특성을 갖는 임의의 단백질일 수 있다. 바람직하게는, 스캐폴드 단백질은 작은 구형 단백질이다. 항체-유사 단백질은 어피바디, 안티칼린, 및 설계된 안키린 단백질 및 아필린 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체-유사 단백질은, 예를 들어, 대형 파지 디스플레이 라이브러리로부터 패닝함으로써 돌연변이체의 대형 라이브러리로부터 유래될 수 있으며, 일반 항체와 유사하게 단리될 수 있다. 또한, 항체-유사 결합 단백질은 구형 단백질 내의 표면-노출 잔기의 조합 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "Fab"는 항원 결합 영역을 포함하는 IgG 단편에 관한 것이며, 상기 단편은 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄로부터의 하나의 불변 도메인 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "F(ab)₂"는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 Fab 단편으로 이루어진 IgG 단편에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "scFv"는 통상적으로 세린 (S) 및/또는 글리신 (G) 잔기를 포함하는 짧은 링커와 함께 연결된, 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 융합인 단일 쇄 가변 단편에 관한 것이다. 이러한 키메라 분자는 불변 영역을 제거하고 링커 펩티드를 도입했음에도 불구하고 원래의 이뮤노글로불린의 특이성을 유지한다.

변형된 항체 형식은, 예를 들어, 이중 또는 삼중특이적 항체 구축물, 항체-기반 융합 단백질, 면역접합체 등이다.

IgG, scFv, Fab 및/또는 F(ab)₂는 통상의 기술자에게 널리 공지된 항체 형식이다. 관련 활성화 기술은 각각의 교과서로부터 이용 가능하다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 항원-결합 유도체는 각각, 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항원-결합 유도체이다.

마우스로부터 유래된 모노클로날 항체 (mAb)는 항체를 유도할 수 있는 또 다른 종으로부터의 단백질을 함유하고 있다는 사실로 인해 원하지 않는 면역학적 부작용을 일으킬 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 항체 인간화 및 성숙 방법은 인간에게 적용될 때 최소한의 면역원성을 갖는 항체 분자를 생성하면서도 이상적으로는 여전히 비-인간 모 항체의 특이성과 친화성을 유지하도록 설계되었다. 이러한 방법을 사용하면, 예를 들어 마우스 mAb의 프레임워크 영역이 상응하는 인간 프레임워크 영역으로 대체된다 (소위 CDR 이식). WO200907861은 재조합 DNA 기술에 의해 비-인간 항체의 CDR 영역을 인간 불변 영역에 연결함으로써 인간화 형태의 마우스 항체의 생성을 개시한다. 메디칼 리서치 카운실(Medical Research Council)에 의한 US6548640은 CDR 이식 기술을 설명하고 셀테크(Celltech)에 의한 US5859205는 인간화 항체의 생산을 설명한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "인간화 항체"는 항체의 불변 영역 및/또는 프레임워크 영역의 적어도 일부분, 및 임의로 CDR 영역의 일부분이 인간 이뮤노글로불린 서열로부터 유래되거나 이에 조정되는 항체, 그의 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 확인 방법에 의해 수득된 작용제에 관한 것이다.

상기 작용제는 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 상기 작용제는 NKD2 단백질 또는 그의 단편에 대한 높은 또는 특히 높은 친화성 및/또는 결합력으로 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 작용제는, NKD2와 결합될 때, NKD2 활성을 감소시키거나 억제한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "특이적으로 결합하다"는 상기 작용제가 많으면 약 100 μM의 NKD2 단백질 분자 또는 그의 에피토프에 대한 해리 상수 K_D를 갖는다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, K_D는 약 100 μM 이하, 약 50 μM 이하, 약 30 μM 이하, 약 20 μM 이하, 약 10 μM 이하, 약 5 μM 이하, 약 1 μM 이하, 약 900 nM 이하, 약 800 nM 이하, 약 700 nM 이하, 약 600 nM 이하, 약 500 nM 이하, 약 400 nM 이하, 약 300 nM 이하, 약 200 nM 이하, 약 100 nM 이하, 약 90 nM 이하, 약 80 nM 이하, 약 70 nM 이하, 약 60 nM 이하, 약 50 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 30 nM 이하, 약 20 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하, 약 1 nM 이하, 약 900 pM 이하, 약 800 pM 이하, 약 700 pM 이하, 약 600 pM 이하, 약 500 pM 이하, 약 400 pM 이하, 약 300 pM 이하, 약 200 pM 이하, 약 100 pM 이하, 약 90 pM 이하, 약 80 pM 이하, 약 70 pM 이하, 약 60 pM 이하, 약 50 pM 이하, 약 40 pM 이하, 약 30 pM 이하, 약 20 pM 이하, 또는 약 10 pM 이하, 또는 약 1 pM 이하이다.

상기 작용제는 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위해 제공될 수 있으며, 특히 여기서 상기 만성 신장 질환은 진행성 만성 신장 질환 및/또는 신장 섬유증이다.

상기 작용제는 소분자 화합물 (smol), 펩티드, 또는 생물제제일 수 있으며, 바람직하게는 여기서 상기 생물제제는 항체, 또는 그의 단편 또는 그의 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 압타머이다.

본 발명에 따른 소분자 화합물은 다른 화학적 백본 중에서, 치환기, 기 또는 잔기, 예를 들어 알킬-, 알케닐-, 알키닐-, 알콕시-, 아릴-, 알킬렌-, 아릴렌-, 아미노-, 할로겐-, 카르복실레이트 유도체-, 시클로알킬-, 카르보닐 유도체-, 헤테로시클로알킬-, 헤테로아릴-, 헤테로아릴렌-, 술포네이트-, 술페이트-, 포스포네이트-, 포스페이트-, 포스핀-, 포스핀옥시드 기를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 만성 신장 질환을 치료하는 방법에서의 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제의 용도로서, 바람직하게는 여기서 만성 신장 질환은 진행성 만성 신장 질환 및/또는 신장 섬유증인 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 작용제는, NKD2와 결합될 때, NKD2 활성을 억제한다.

본 발명은 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제를 치료상 유효한 양 또는 용량으로 인간 또는 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 신장 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안 유효한 용량 또는 양을 의미한다. 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및/또는 체중, 제약 제형, 치료 중인 질환의 하위유형 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 상기 기재된 바와 같은 작용제, 및 임의로 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 부형제는 제약상 허용되는 완충제, 계면활성제, 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제, 및/또는 보존제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법에 관한 것이다:

(i) 상기 기재된 같은 NKD2 단백질, 또는 그의 단편과 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제의 확인을 위한 방법, 및 또한

(ii) 이와 같이 확인된 작용제를 제약상 허용되는 담체와 혼합하는 것.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 (i) 상기 기재된 바와 같은 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 상기 기재된 바와 같은 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하는 작용제, 또는 상기 기재된 바와 같은 제약 조성물, 및 (ii) 하나 이상의 추가의 치료상 활성 화합물의 조합을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

상기 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 완충제, 계면활성제, 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다.

상기 제약 조성물은 분말, 정제, 환제, 캡슐 또는 펄의 형태로 투여될 수 있다. 수성 형태에서, 상기 제약 제형은 투여를 위해 준비될 수 있는 반면, 동결건조된 형태에서 상기 제형은 보존제, 예컨대 예를 들어, 벤질 알콜 (이에 제한되지 않음), 항산화제, 예컨대 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 레티닐 팔미테이트 및 셀레니움, 아미노산 시스테인 및 메티오닌, 시트르산 및 시트르산 나트륨, 합성 보존제, 예컨대 파라벤 메틸 파라벤 및 프로파일 파라벤을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 주사용 수의 부가에 의해 투여 전에 액체 형태로 전달될 수 있다.

상기 제약 제형은, 예를 들어, 아미노산, 당 폴리올, 디사카라이드 및/또는 폴리사카라이드일 수 있는 하나 이상의 안정제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제약 제형은 하나 이상의 계면활성제, 하나 이상의 등장화제 및/또는 하나 이상의 금속 이온 킬레이트제, 및/또는 하나 이상의 보존제를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 제약 제형은 적어도 경구, 비경구, 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 적합할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 상기 접합체는 특정 기간에 걸쳐 활성제의 지속 방출을 가능하게 하는 데포 제형으로 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 1차 패키징, 예컨대 미리 충전된 시린지 또는 펜, 바이알, 또는 주입 백이 제공되며, 이는 본 발명의 이전 측면에 따른 상기 제형을 포함한다.

미리 충전된 시린지 또는 펜은 제형을 동결건조 형태 (투여 전에, 예를 들어 주사용 수로 가용화해야 함), 또는 수성 형태로 함유할 수 있다. 상기 시린지 또는 펜은 종종 일회용 제품이며, 0.1 내지 20 ml의 용적을 가질 수 있다. 그러나, 시린지 또는 펜은 다회-사용 또는 다중-용량 시린지 또는 펜일 수도 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는 부분들의 치료 키트에 관한 것이다:

(i) 상기 기재된 바와 같은 제약 조성물,

(ii) 조성물을 투여하기 위한 디바이스, 및

(iii) 임의로, 사용 설명서.

서열

표 1: 인간 NKD2 아미노산 서열

실시예

본 발명이 도면 및 전술한 설명에서 상세하게 예시 및 설명되었지만, 이러한 예시 및 설명은 제한적이지 않고 예시적이거나 모범적인 것으로 간주되어야 하며; 본 발명은 개시된 실시양태에 제한되지 않는다. 개시된 실시양태에 대한 다른 변동은 도면, 개시내용 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 청구된 발명을 실시함에 있어서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되고 영향을 받을 수 있다. 청구범위에서 단어 "포함하는"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 단수 형태는 복수를 배제하지 않는다. 특정 수단이 상호 상이한 종속항에 인용되어 있다는 단순한 사실이 이들 수단의 조합이 유리하게 사용될 수 없다는 것을 나타내지는 않는다. 청구범위의 임의의 참조 기호는 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본원에 개시된 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 표시되며; 본원에 개시된 모든 핵산 서열은 5'->3'으로 표시된다.

실시예 1: 재료 및 방법

인간 조직 프로세싱

신장 조직은 정상 및 종양 영역으로부터 외과의에 의해 샘플링되었다. 조직을 드라이아이스에서 급속 냉동하거나 미리 냉각된 위스콘신 대학교 용액 [#BTLBUW, 브릿지 투 라이프 리미티드 (Bridge to Life Ltd.; 미국 콜롬비아)]에 놓아두고 얼음 상에서 본 발명자들의 실험실로 이송하였다. 조직을 대략 0.5-1 mm3 조각으로 슬라이스한 다음 C-튜브 [밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec)]로 옮기고 프로그램 비장 4를 사용하여 부드러운 MACS (밀테니이 바이오텍)에서 프로세싱하였다. 그런 다음 조직을 RPMI [깁코(Gibco)] 중 25 μg/ml 리베라제 TL [로슈(Roche)] 및 50 μg/ml DNase [시그마(Sigma)]를 함유하는 소화 용액에서 300 RPM으로 진탕시키면서 37℃에서 30분 동안 소화시켰다. 인큐베이션 후, 샘플을 동일한 프로그램을 사용하여 부드러운 MACS (밀테니이 바이오텍)에서 다시 프로세싱하였다. 그 결과로 생성된 현탁액을 70 μm 세포 여과기 [팔콘(Falcon)]에 통과시키고, 45 ml의 차가운 PBS로 세척하고, 4℃에서 500 g로 5분 동안 원심분리하였다. 트리판 블루 염색으로 혈구계산기를 사용하여 세포를 계수하였다. 살아 있는 단일 세포는 CD10 염색 또는 섬유모세포에 대한 PDGFRß 염색에 의한 상피 세포의 추가 증강과 함께 DAPI 음성 세포에 대한 FACS 분류 및 게이팅에 의해 증강되었다. 평균적으로 생검을 수득하고 단일 세포 현탁액을 생성하는 데 5-6시간이 걸렸다.

마우스

PDGFRßCreERt2 (즉 B6-Cg-Gt(Pdgfrß-cre/ERT2)6096Rha/J, JAX 스톡 #029684) 및 Rosa26tdTomato (즉 B6-Cg-Gt(ROSA)26Sorttm(CAG-tdTomato)Hze/J JAX 스톡 # 007909)는 잭슨 래보러토리 (Jackson Laboratories; 미국 메인주 바 하버)로부터 구입하였다. 자손은 잭슨 래보러토리로부터의 프로토콜에 따라 PCR에 의해 유전자형을 분석하였다. Pdgfrb-BAC-eGFP 리포터 마우스는 GENSAT 프로젝트를 위해 엔. 하인츠 (N. Heintz; 록펠러 대학교)에 의해 개발하였다. 모든 마우스의 유전형 분석은 PCR에 의해 수행되었다. 마우스는 에딘버러 대학교 또는 RWTH 아헨에서 특이적 병원균이 없는 조건 하에 수용되었다. UUO는 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다.² 간단히 언급하면, 옆구리 절개 후, 좌측 요관을 2개의 7.0 타이 [에티콘(Ethicon)]로 아래쪽 기둥 높이에서 묶었다. 마우스는 수술 후 제10일에 희생시켰다. 동물 실험 프로토콜은 독일 LANUV-NRW와 영국 내무부 규정에 의해 승인되었다. 모든 동물 실험은 가이드라인에 따라 수행되었다. 서로 10일 이내에 출생하였고, 수술 시점에 9주 내지 11주령인 PDGFRbeGFP 수컷 마우스가 SMART-Seq2를 위해 사용되었으며, 지시된 바와 같이 희생시켰다. 유도성 운명 추적용 PDGFRbCreER;tdTomato 마우스 (8주령, 수컷 2마리 / 암컷 3마리)는 위관영양 (10 mg p.o.)을 통해 타목시펜을 3회 투여한 후 21일의 휴약 기간을 거친 다음 UUO 수술 또는 모의 (상기와 같음)를 받고 수술 후 10일에 희생되었다.

마우스에서의 단일 세포 단리

안락사시킨 마우스를 좌측 심장을 통해 0.9% NaCl 20 ml로 관류시켜 혈관계로부터 혈액 잔류물을 제거하였다. 신장을 외과적으로 제거하고, 작은 슬라이스로 커팅하며, 1% FCS를 함유하는 빙냉 PBS 상의 15 ml 튜브 (팔콘)에 놓아두었다. 단일 신장 세포를 단리하기 위해, 인간 단일 세포 단리를 위해 상기 기재된 바와 같이 효소적 및 기계적 파괴의 조합을 사용하였다. 전반적으로 생육력은 이러한 방법을 사용하여 80% 초과였다.

FACS

세포는 하기와 같은 모노클로날, 직접 형광색소 접합된 항체로 표지되었다: 항-CD10 인간 [클론 HI10a, 바이오레젠드(biolegend)], 항 PDGFRb 마우스 (클론 PR7212, R&D), 항-PDGFR알파 마우스 (클론 APA5, 바이오레젠드), 항-CD31 마우스 (클론 Meg13.3, 바이오레젠드), 항-CD45 마우스 (클론 30_F11). 단리된 세포를 1x107개 세포/ml의 최종 농도로 얼음 상의 1% PBS-FBS에 재현탁시켰다. 세포를 Fc-블록 (TruStainFx 인간, TruStainFx 마우스 클론 91, 바이오레젠드)과 미리 인큐베이션한 다음, 2% FBS/PBS에서 1:100으로 희석된 빛으로부터 보호된 얼음 상에서 30분 동안 상기 항체와 함께 인큐베이션하였다. 인간 항-PDGFRb 염색을 위해, 염소 항-마우스 다이라이트(Dyelight) 405 (poly24091, 바이오레젠드)를 2차 항체로서 사용하였다. 모든 보상은 단일 컬러 염색 및 음성 염색 및 형광 마이너스 1 대조군을 사용하여 획득 당시에 수행되었다. 세포는 SONY SH800 분류기 (소니 바이오테크놀로지(Sony Biotechnology); 100 um 노즐 분류 칩 소니)를 사용하여 >80% 효율을 목표로 하는 반-순도 모드로 분류되었다. SMART-Seq용 플레이트 기반 분류의 경우, FACS 아리아 II 기계 [벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson; 스위스 바젤)]에서 세포 분류를 수행하였다.

Smart- Seq2 및 10X 게노믹스 3' sc-RNA- Seq (V2 및 V3)을 포함한 단일 세포 검정

Smart-Seq2의 경우 단일 세포를 사이라이프랩(SciLifeLab) - 진핵 단일 세포 게놈 시설 (카롤린스카 연구소)에 의해 프로세싱되었다. 배송 전에 단일 세포를 미리 준비된 용해 완충액을 함유하는 384-웰 플레이트의 웰로 분류하였다. 라이브러리는 일루미나(Illumina) HiSeq 4500에서 시퀀싱되었다. 세포 및 1차 인간 신장 세포의 단일 세포 용액은 크로뮴 단일 세포 칩 키트에서 병렬로 실행되었고 라이브러리는 제조업체의 프로토콜에 따라 크로뮴 단일 세포 3' 라이브러리 키트 V2 및 i7 다중화 키트 (PN-120236, PN-120237, PN-120262, 10x 게노믹스)를 사용하여 수행되었다. 라이브러리 품질은 2200 테이프스테이션 시스템 [애질런트 테크놀로지(Agilent Technologies)]에서 D1000 스크린테이프를 사용하여 결정되었다. 시퀀싱은 S1 및 S2 플로우 세포 (일루미나)을 사용하여 일루미나 Novaseq 플랫폼에서 수행되었다.

인간 신장 섬유증 평가

PAS로 염색된 신장 절편을 숙련된 신장 병리학자가 맹검 방식으로 분석하고 점수를 매겼다. 모든 절편은 특이적 신장 질환에 대해 스크리닝했지만, 연령 관련 변화 또는 고혈압성 신증을 제외하고 특이적 사구체 세뇨관간질 또는 혈관 질환의 징후는 관찰되지 않았다. 간질 섬유증 및 세뇨관 위축의 정도는 영향을 받는 피질 영역의 %로서 2가지 별도의 파라미터로서 평가되었다. 전체 사구체 경화증의 정도는 모든 사구체로부터 전체 경화성 사구체의 %로서 추정되었다. 동맥경화증의 정도, 즉 중막의 두께와 비교한 내막의 섬유탄성 비후는 0 - 없음, 1 - 경도 (< 50%), 2 - 중등도 (51-100%) 및 3 - 중증 (매질과 비교하여 >100% 두꺼운 내막)으로 0 - 3의 점수를 매겼다.

포르말린 고정 및 파라핀 포매 신장 조직의 um 절편에 대한 콜라겐 I 및 III 면역조직화학을 위해 크실렌에서에서 인큐베이션하여 (3x 5분) 파라핀을 제거하고 에탄올 농도를 낮추는 후속 재수화 (3 x 2분 100% 에탄올, 2 x 2분 95% 에탄올, 1 x 2분 70% 에탄올)를 통하여 간접 면역퍼옥시다제에 대해 프로세싱하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 실온에서 10분 동안 증류수 중 3% H2O2로 차단하고 세척 (PBS 중 2회)한 다음, 실온의 습한 방에서 1시간 동안 1% BSA/PBS 중 1차 항체 [콜라겐 I (서던 바이오텍(Southern Biotech)) Cat No. 1310-01; 콜라겐 III (서던 바이오텍) Cat No. 1330-01]와 함께 인큐베이션하였다. 그 후 슬라이드를 PBS에서 5분 동안 2회 세척하고 비오티닐화된 2차 항체를 부가하였다 (30분). 아비딘-비오틴 복합체를 부가하고 30분 동안 인큐베이션한 다음 DAB-용액에서 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. H2O에서 세척하여 반응을 중지하고 슬라이드를 메틸 그린으로 4분 동안 대조염색하였다. 마지막으로, 슬라이드를 상승적인 에탄올 및 크실렌에서 탈수시켰다. 전체 슬라이드 스캐너 [나노주머 HT(NanoZoomer HT), 하마마츠 포토닉스 (Hamamatsu Photonics; 일본 하마마츠)]를 사용하여, 면역조직화학적으로 염색된 슬라이드의 완전히 디지털화된 영상을 추가로 프로세싱하고 보기 소프트웨어 NDP.view (하마마츠 포토닉스; 일본 하마마츠) 및 ImageJ (국립 보건원; 미국 메릴랜드주 베데스다)를 사용하여 분석하였다. 맹검 방식으로 신장 피질에서 양성으로 염색된 영역의 백분율을 분석하였다.

항체 및 면역형광 염색

신장 조직을 실온에서 2시간 동안 4% 포르말린에 고정시키고 밤새 30% 수크로스에서 탈수 후 OCT에서 동결시켰다. 5-10 μm 저온 절편을 사용하여, 슬라이드를 5% 당나귀 혈청에서 차단한 다음 1차 항체를 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS에서 5분 동안 3회 세척한 다음 45분 동안 2차 항체를 인큐베이션하였다. DAPI (4',6'-'디아미디노-2-페닐인돌) 염색 (로슈, 1:10.000) 후, 슬라이드에 프로롱 골드(ProLong Gold) [인비트로젠(Invitrogen), #P10144]를 장착하였다. 하기 항체가 사용되었다: 항-마우스 PDGFRa (AF1062, 1:100, R&D), 항-CD10 인간 (클론 HI10a, 1:100, 바이오레젠드), 항-HNF4a [클론 C11F12, 1:100, 셀 시그널링(Cell Signalling)], 팬-시토케라틴 유형I/II (인비트로젠, Ref. MA1-82041), Dach1 (시그마, HPA012672), Col1a1 (압캠(Abcam), ab34710), ERG (압캠, ab92513), AF488 당나귀 항-염소 [1:100, 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research)], AF647 당나귀 항-토끼 (1:200, 잭슨 이뮤노 리서치).

공초점 영상화

40X 및 60X 대물렌즈 [닉콘(Nikon)]를 사용하는 닉콘 A1R 공초점 현미경을 사용하여 영상을 획득하였다. 미가공 영상화 데이터는 닉콘 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용하여 프로세싱되었다.

인간 신장 조직 마이크로어레이

에슈바일러/아헨 바이오뱅크의 98개 비-종양 인간 신장 샘플로부터의 파라핀 포매 포르말린 고정 신장 표본을 이전에 수행된 PAS 염색을 기반으로 선택하였다. 샘플당 영역을 무작위로 선택하고 TMArrayerTM [패톨로지 디바이시즈 (Pathology Devices), 비처 인스트루먼츠 (Beecher Instruments); 미국 웨스터민스터)]을 사용하여 각각의 신장 샘플로부터 하나의 2-mm 코어를 채취하였다. 각각의 코어는 대략 2.5 cm2를 포괄하는 2 mm 간격의 그리드에서 수용부위 블록으로 어레이되었고, 5-마이크로미터 두께의 절편은 표준 조직학적 기술을 사용하여 커팅 및 프로세싱되었다.

RNA 계내 혼성화

포르말린 고정 파라핀 포매된 조직 샘플 및 RNAScope 다중화 검출 키트 V2 (RNAScope, #323100)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 약간 변형하여 계내 혼성화를 수행하였다. 항원 검색은 수조 중 99℃에서 15분 대신 96℃에서 22분 동안 수행되었다. 항원 검색을 수행한 후 실온에서 10분 동안 전처리제 1 용액 3-5방울을 인큐베이션하였다. 세척 단계를 5분씩 3회 수행하였다. 하기 프로브가 RNAscope 검정에 사용되었다: Hs-PDGFRß #548991-C1, Hs-PDGFRa #604481-C3, Hs-Col1a1 #401891, Hs-COL1A1 #401891-C2, Hs-MEG3 #400821, Hs-NKD2 #581951-C2 (NM_033120.3의 236-1694를 표적으로 함), Hs-Postn #409181-C2 및 409181-C3, Hs-Pecam1 #487381-C2, Hs-Ccl19 #474361-C3, Hs-Ccl21 #474371-C2, Hs-Notch3 #558991-C2, Mm-Col1a1 #319371, Mm-PDGFRa #480661-C2, Mm-PDGFRb #411381-C3.

영상 정량화 - ISH 영상 분석

체계적인 무작위 샘플링을 적용하여 영상당 적어도 3개의 대표적인 세뇨관-간질 영역을 서브샘플링하였다. 그 다음, 피지(Fiji) (막스 플랑크 분자 세포 생물학 및 유전학 연구소; 독일 드레스덴)로부터의 세포 계수 도구를 사용하여 모든 형광 도트 (전사체)에 수동으로 주석부기하였다. 그런 다음 인접 핵을 확인하기 위해 유역 (한계: 0.1-0.4), 불완전한 개체에 대한 가장자리 검출 및 개체 크기 선택 (한계: 12-180 μm2)을 기반으로 한 사내 제작 도구 (https://gitlab.com/mklaus/segment_cells_register_marker)를 사용하여 단일 핵을 단리하였다. 개별 도트의 총 수는 모든 단리된 핵에 대해 재시도되었다. 높은 세포 밀도와 조합된 신장 형태의 복잡성으로 인해 본 발명자들은 비-핵 전사체의 기원을 결정할 수 없었기 때문에, 핵 외부에 위치한 도트는 이러한 분석에 포함되지 않았다. PDGFRa/b 세포의 Meg3 및 NKD2 분석을 위해, 핵을 분할하고 영상화 채널당 >1 pos. 스팟을 기준으로 세포를 계수한 후 QPath를 사용하여 영상을 분석하였다. Col1a1-IF 정량화 또는 NKD2-ISH 정량화를 위해, 영상을 RGB 채널로 분할하고 ImageJ를 사용하여 영상당 통합 형광 밀도를 결정하였다.

정량적 RT- PCR

세포 펠렛을 채취하고 PBS로 세척한 다음 RNeasy 미니 키트 [퀴아젠(qiagen)]을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA 추출을 수행하였다. 전체 RNA 200 ng을 고용량 cDNA 역전사 키트 [어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)]로 역전사하였다. qRT-PCR은 iTaq 유니버설 SYBR 그린 슈퍼믹스 [바이오래드(Biorad)] 및 C1000 터치 써멀 사이클러가 있는 바이오-래드 CFX96 실시간 시스템으로 수행되었다. 순환 조건은 95℃에서 3분 동안, 이어서 95℃에서 15초 동안 및 60℃에서 1분 동안의 40주기, 이어서 95℃에서 10초 동안의 1주기였다. GAPDH가 하우스키핑 유전자로서 사용되었다. 데이터는 2-CT 방법을 사용하여 분석되었다. 사용된 프라이머가 표 2에 열거되어 있다.

표 2: RT-PCR 프라이머 서열의 목록 (인간)

인간 PDGFRb + 세포주의 생성

PDGFRb+ 세포는 단일 세포 현탁액 (상기와 같음)을 생성한 다음 MACS 분리 (밀테니이 바이오텍, autoMACS Pro Separator, # 130-092-545, autoMACS Columns #130-021-101)에 의해 신장절제 표본 (71세 남성 환자)의 건강한 인간 신장 피질로부터 단리되었다. 단리를 위해 단일 세포 현탁액을 먼저 특이적 PDGFRb 항체 (R&D # MAB1263 항체, 희석 1:100)를 사용하여 2 단계로 염색한 다음 항-마우스 IgG1-마이크로비드 용액 (밀테니이, #130-047-102)으로 두 번째 인큐베이션 단계를 수행하였다. MACS 세포를 DMEM 배지 (써모 피셔(Thermo Fisher) # 31885)에서 배양한 후, 10% FCS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 14일 동안 부가하고 하기와 같이 SV40LT 및 HTERT를 사용하여 불멸화시켰다. 레트로바이러스 입자는 TransIT-LT [미루스(Mirus)]를 사용하여 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생산되었다. 2가지 유형의 양생 입자는 패키징 플라스미드 pUMVC (애드젠(Addgene) #8449) 및 위형화 플라스미드 pMD2.G (애드젠 #12259)와 조합하여 플라스미드 pBABE-puro-SV40-LT (애드젠 #13970) 또는 xlox-dNGFR-TERT (애드젠 #69805)의 공동 형질감염에 의해 생성되었다. 레트로바이러스 입자는 형질감염 후 48시간에 레트로-X 농축기 [클론테크(Clontech)]를 사용하여 100배 농축되었다. 48시간 동안 레트로바이러스 상청액 (SV40-LT 또는 오히려 hTERT를 함유하는 농축된 입자의 1:1 혼합물)의 연속 희석물과 함께 표적 세포를 인큐베이션함으로써 세포 형질도입을 수행하였다. 이어서, 감염된 PDGFRb+ 세포를 7일 동안 형질감염 후 72시간에 2 μg/ml 퓨로마이신으로 선별하였다.

인간 유도 다능성 줄기 세포 ( iPSC ) 유래 신장 오가노이드 배양

인간 iPSC-15 클론 0001은 랏바우트(Radboud) 대학 센터의 줄기 세포 시설 (네덜란드 네이메헌)로부터 받았다. 인간 iPSC는 E8 배지 [라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]를 사용하여 겔트렉스(Geltrex)-코팅된 플레이트에서 성장시켰다. 70-80% 합류 시, iPSC는 0.5 mM EDTA를 사용하여 분리되었고 세포 응집체는 1:3으로 분할함으로써 다시 시딩되었다. 인간 iPSC는 문헌 [Takasato et al. (Nature, 2015)]에 기반한 변형된 프로토콜을 사용하여 분화되었고 겔트렉스-코팅된 플레이트 [그라이너(Greiner)] 상에 cm2당 18,000개 세포의 밀도로 시딩되었다. E6 배지 (라이프 테크놀로지스)에서 3일 및 5일 동안 CHIR99021 [6 μM, 토크리스(Tocris)]을 사용하여 중간 중배엽으로의 분화를 시작한 후, 이어서 제7일까지 E6에서 FGF 9 (200 ng/ml, RD 시스템) 및 헤파린 [1 μg/ml, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)] 보충을 수행하였다. 분화 7일 후, 세포 집합체 (오가노이드당 300,000개 세포, 3일 및 5일 CHIR-분화 세포의 혼합물)를 코스타르 트랜스웰 삽입물에서 배양하여 E6 분화 배지를 사용하여 자기-조직화 신세포 생성을 자극하였다. 제7+18일에 신장 오가노이드를 하기 기재된 바와 같은 siRNA 녹다운 실험에 사용하였다.

인간 iPSC 유래 신장 오가노이드에서 NKD2의 siRNA 녹다운

NKD2 siRNA 녹다운은 제조업체 프로토콜 [DharmaFECT 형질감염 시약 및 NKD2-특이적 스마트풀 siRNA; 둘 다 호리즌 디스커버리(Horizon Discovery)]에 따라 수행되었다. 형질감염 마스터 믹스 및 스크램블된 대조군을 필수 6 배지 (깁코)에서 준비하고 오가노이드에 부가하였다. 24시간의 초기 인큐베이션 후, 형질감염 마스터 믹스를 리프레싱하고 IL-1β (시그마-알드리치)를 100 ng/ml의 농도로 부가하여 섬유증을 유발시켰다. IL-1β 노출은 형질감염 마스터 믹스의 리프레싱과 함께, 다가오는 2일 동안 24시간마다 반복되었다. 형질감염 개시 후 96시간에, 오가노이드를 채취하고 파라핀 절편화를 위해 프로세싱하였다. 형광 계내 혼성화 (FISH) 및 면역형광 염색을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.

TGFb - 처리 실험

PBS 중 10 ng/ml 농도의 TGFb [100-21-10UG; 페프로테크(Peprotech)]를 0.5% FCS 함유 배지로 24시간 혈청 고갈 후 24시간 동안 75% 융합성 PDGFRb 세포에 부가하였다. T-5224를 사용한 억제제 실험의 경우, TGFb를 부가하기 1시간 전에 억제제 (또는 비히클)를 배양 웰에 부가하였다. 모든 실험은 삼중으로 수행되었다.

AP-1 억제제 처리

T-5224 (c-Fos/AP-1 억제제; 케이맨 케미칼즈(Cayman Chemicals), #22904)를 DMSO에 용해시키고 -80℃에서 저장하였다. DMSO는 대조군 웰에 항상 동일한 비율로 부가되었다.

세포 증식 ( WST -1 검정)

PDGFRb-세포를 사용한 WST-1 검정은 제조업체 [로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)]에 의해 권장된 바와 같이 96-웰에서 수행되었다. 간단히 언급하면, 1x10^4개의 PDGFRb 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 시딩하고 세포를 표시된 농도로 T-5224 또는 비히클 (DMSO)로 삼중으로 처리하였다. 표시된 시점에서 채취하기 전에 세포를 2시간 동안 WST-1 시약과 함께 인큐베이션하였다. 450 nm 및 650 nm (참조) 흡광도 둘 다를 측정하였다.

sgRNA:CRISPR - Cas9 벡터 구축, 바이러스 생산 및 형질도입

NKD2-특이적 가이드 RNA (정방향 5'-CACCGACTCCAGTGCGATGTCTCGG-3'; 역방향 5'-AAACCCGAGACATCGCACTGGAGTC-3')는 BsmBI 제한 소화를 사용하여 pL-CRISPR.EFS.GFP (애드젠 #57818)에 클로닝되었다. 렌티바이러스 입자는 TransIT-LT (미루스)를 사용하여 렌티바이러스 전달 플라스미드, 패키징 플라스미드 psPAX2 (애드젠 #12260) 및 VSVG 패키징 플라스미드 pMD2.G (애드젠 #12259)로 HEK293T 세포의 일시적 공동 형질감염에 의해 생산되었다. 바이러스 상청액을 형질감염 후 48-72시간에 수집하고, 원심분리로 정화하고, 10% FCS 및 폴리브렌 (시그마-알드리치, 최종 농도 8 μg/ml)으로 보충하고 0.45 μm 여과시켰다 [밀리포어(Millipore); SLHP033RS]. PDGFRβ 세포를 바이러스 상청액과 함께 48시간 동안 인큐베이션하여 세포 형질도입을 수행하였다. eGFP 발현 세포는 96 웰 플레이트로 분류된 단일 세포였다. 확장된 콜로니를 미스매치 검출 검정으로 돌연변이에 대해 평가하였다: CRISPR 표적 부위 전역에 걸쳐 있는 gDNA를 PCR 증폭시키고 T7EI 소화 (T7 엔도뉴클레아제, NEB M0302S)에 의해 분석하였다. 성장한 클론 내의 두 대립유전자에 대한 특이적 돌연변이 이벤트를 결정하기 위해, PCR 산물을 pCR™ 4Blunt-TOPO 벡터 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) K287520)에 서브클로닝하였다. CRISPR-클론당 최소 6개의 콜로니를 성장시키고 생거 시퀀싱을 위해 보냈다 (클론 C2: 30개의 콜로니가 시퀀싱되었다). NKD2의 완전한 녹아웃을 입증하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다.

웨스턴 블롯

웨스턴 블롯은 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 간단히 언급하면, 세포 용해물은 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)과 함께 RIPA 완충액으로 준비되었다. 용해물의 단백질 농도는 BCA 검정 [#23225, 피어스(Pierce), 써모사이언티픽]을 사용하여 정량화되었다. 단백질 용해물을 4x SDS 샘플 로딩 완충액 (바이오래드) 중 95℃에서 5분 동안 가열하고 10% SDS-Page 겔에 로딩하였다. 그 후 샘플을 PVDF 막 위로 옮기고 블롯을 5% 블롯토 (써모 피셔): (1:3000 토끼 항-인간 NKD2 폴리클로날 항체, 인비트로젠 PA5-61979)에서 2시간 동안 1차 항체로 프로빙한 다음, 세척 후 1시간 동안 2차 항체 [1:5000 서양고추냉이-퍼옥시다제-HRP-접합된 항 토끼; 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories)]와 인큐베이션하고, 피어스™ ECL 웨스턴 블롯팅 기질 A 및 B를 사용하여 전개하였다. 마우스 모노클로날 항-GAPDH 항체 [노부스 바이오로지칼스(NovusBiologicals) NB300-320; 1:1000]에 이어 HRP 접합된 항 마우스 2차 항체 (벡터 래보러토리즈)를 로딩 대조군으로서 사용하였다.

Nkd2의 렌티바이러스 과다발현

NKD2 벡터 구축 및 안정한 NKD2 과다발현 세포주의 생성. NKD2의 인간 cDNA를 프라이머 서열 5'-atggggaaactgcagtcgaag-3' 및 5'-ctaggacgggtggaagtggt-3'을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 제한 부위 및 N-말단 1xHA-태그는 프라이머 5'-cactcgaggccaccatgtacccatacgatgttccagattacgctgggaaactgcagtcgaag-3' 및 5'-acggaattcctaggacgggtggaagtg-3'를 사용하여 PCR 산물에 도입되었다. 그 후, PCR 산물을 XhoI 및 EcoRI로 소화시키고 pMIG로 클로닝하였다 [pMIG는 윌리엄 한(William Hahn)으로부터의 선물이었다 (애드젠 플라스미드 # 9044; http://n2t.net/addgene:9044; RRID:Addgene_9044)]. 레트로바이러스 입자는 패키징 플라스미드 pUMVC [pUMVC는 밥 와인버그(Bob Weinberg)로부터의 선물이었다 (애드젠 플라스미드 # 8449)] 및 위형화 플라스미드 pMD2.G [pMD2.G는 디디에 트로노(Didier Trono)로부터의 선물이었다 (애드젠 플라스미드 #12259; http://n2t.net/addgene:12259; RRID:Addgene_12259)]와 조합하여 TransIT-LT (미루스)를 사용하여 일시적인 형질감염에 의해 생산되었다. 바이러스 상청액을 형질감염 후 48-72시간에 수집하고, 원심분리로 정화하고, 10% FCS 및 폴리브렌 (시그마-알드리치, 최종 농도 8 μg/ml)으로 보충하고 0.45 μm 여과시켰다 (밀리포어; SLHP033RS). PDGFβ 세포를 바이러스 상청액과 함께 48시간 동안 인큐베이션하여 세포 형질도입을 수행하였다. eGFP 발현 세포는 단일 세포 분류되었다.

벌크 RNA 시퀀싱

RNeasy 미니 키트 (퀴아젠)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출하였다. 1 ng 및 10 ng의 희석된 전체 RNA를 사용하는 rRNA-고갈된 RNA-seq의 경우, 제조업체의 프로토콜에 따라 RiboErase [카파 바이오시스템즈(Kapa Biosystems)]가 포함된 KAPA RNA 하이퍼프렙 키트를 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 준비하였다. 시퀀싱 라이브러리는 정량적 PCR [뉴잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs; 미국 입스위치)]을 사용하여 정량화되었고, 등몰로 풀링되었으며, 최종 풀은 1.4 nM으로 정규화되고 0.2 N NaOH를 사용하여 변성되었으며 시퀀싱 전에 400 nM Tris pH 8.0으로 중화되었다. 제조업체의 프로토콜 (일루미나; 미국 캘리포니아주)에 따라 NextSeq 플랫폼 (일루미나)에서 최종 시퀀싱을 수행하였다.

ATAC - seq 준비

5000-7500개의 PDGFRa/b pos 세포를 상기 기재된 바와 같이 새로 단리된 UUO 신장으로부터 FACS 분류하고, 차가운 PBS로 2회 세척하고, 500 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 세포 펠릿을 50 μl 빙냉 용해 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.08% NP40 치환기 [74385, 시그마], 0.01% 디기토닌 [G9441, 프로메가(Promega)])에 용해시키고, 즉시 500 g에서 9분 동안 원심분리하였다. 펠릿은 25 μl 2xTD 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 20% DMF), 0.5 μl 태그먼트 DNA 효소 1 [15027865, 일루미나] 및 24.5 μl 뉴클레아제-무함유 물을 포함한 50 μl의 트랜스포사제 반응 혼합물에 재현탁되었다. 전위 반응물을 열진탕기에서 350 rpm으로 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 전위된 DNA를 민엘루트(MinElute) 반응 클린업 키트 (28204, 퀴아젠)를 사용하여 정제하고 15 μl 뉴클레아제-무함유 물에서 용출시켰다. 전위된 DNA는 맞춤형 넥스테라(Nextera) PCR 프라이머와 함께 NEB 넥스트 2x 마스터 믹스 (M0541S; 뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 사용하여 PCR (총 14주기)로 증폭시켰다. 첫 번째 PCR은 NEB 넥스트 2x 마스터 믹스 및 1.25 μM 맞춤형 프라이머를 사용하여 50 μl 용적 및 6주기로 수행되었으며; 두 번째 RT-PCR은 사전 증폭된 혼합물 5 μl (10%) 플러스 0.125 μM 프라이머를 사용하여 20주기 동안 15 μl 용적으로 수행하여, 이전에 기재된 바와 같이 필요한 부가의 주기 수를 결정하였다. 증폭된 DNA 라이브러리는 민엘루트 PCR 정제 키트 (28004, 퀴아젠)를 사용하여 정제하고 20 μl의 10 mM Tris-HCl (pH 8)에서 용출시켰다. 라이브러리의 품질은 2200 테이프스테이션 시스템 (애질런트 테크놀로지)의 애질런트 D1000 스크린테이프에 의해 시각화되었다. ATAC-seq 라이브러리는 75-bp 페어드 엔드 시퀀싱을 위해 일루미나 NextSeq 500에 로딩되었다.

Smart- Seq2 데이터 프로세싱

초기 단일 세포 전사체 데이터는 스웨덴 스톡홀름에 있는 생명 과학 연구소의 진핵 단일 세포 게놈학 시설에서 프로세싱되었다. 수득된 판독값은 마우스 게놈의 mm10 빌드 (eGFP 및 ERCC 스파이크인 세트에 대한 전사체와 연결됨)에 맵핑되어 각각의 내인성 유전자, 스파이크인 및 세포당 eGFP 전사체에 대한 카운트를 산출하였다. 리보솜 RNA 유전자, 리보솜 단백질 및 리보솜 슈도-유전자는 필터링되었다. 본 발명자들은 eGFP 또는 PDGFRb에 할당된 임의의 정렬을 특징으로 하지 않는 세포가 감독되지 않은 세포 클러스터링 (하기 참조) 후에 단일 클러스터로 클러스터링된다는 것을 인지하였다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 세포을 제거하기로 결정하였고, 그러한 세포 (17개 세포)를 고려하지 않고 모든 분석 및 클러스터링을 수행하였다.

10x 단일 세포 RNA- Seq 데이터 프로세싱

Fastq 파일은 젠코드(Gencode) v29 인간 전사체 및 젠코드 vM20 마우스 전사체를 참조 전사체로서 사용하여 알레빈(Alevin) 및 살몬 (알레빈 파라미터 -l ISR, 살몬 버전 0.13.1)을 사용하여 프로세싱되었다. 알레빈의 예측 세포 파라미터는 세포 바코드 분포당 판독값 카운트에 적용된 무릎-방식에 따라 추정된 세포 수의 3배에 따라 설정되었다. 따라서, 알레빈에 의해 생산한 UMI 카운트 매트릭스는 나중에 필터링할 수 있는 많은 수의 추정 세포를 생산하였다 (다음 단락 참조).

10x scRNA - Seq 세포 필터링

본 발명자들은 주요 유전자 발현 매트릭스로부터 리보솜 RNA 유전자 (세포당 검출된 RNA 함량의 평균 0-1%) 및 미토콘드리아로 코딩된 유전자 (세포당 검출된 RNA 함량의 평균 0-80%)를 이동시켰다. 미토콘드리아 함량의 변화에만 전적으로 의존할 수 있는 세포 간에 원치 않는 변이가 도입되는 것을 피하기 위해 미토콘드리아로 코딩된 유전자를 제거하였다. 알레빈에 의해 생산된 카운트 매트릭스로부터의 log10 (세포당 총 UMI 카운트) 분포 (상기 참조)는 전형적으로 이정점 분포를 보였으므로, log10 (세포당 총 UMI 카운트)은 모델명칭을 "E"로 설정한 mclust R 패키지 v5.4.3을 사용하여 2개의 클러스터로 클러스터링되었다. 더 높은 카운트를 가진 클러스터에 속하는 세포가 유지되었다. 그런 다음 세포는 하기와 같이 미토콘드리아 RNA 함량 및 고도로 발현된 유전자에 대한 편향을 기반으로 필터링되었다: (1) 세포는 log10 (세포당 총 UMI 카운트) 및 세포당 미토콘드리아 UMI의 퍼센트에서 학습된 2가지 구성요소가 있는 이변량 가우시안 혼합물을 사용하여 2개의 클러스터로 클러스터링되었다. 클러스터링은 모델명을 "EII"로 설정한 R 패키지 Mclust를 사용하여 수행되었다. 미토콘드리아 함량이 더 높은 세포가 있는 클러스터에 속하는 세포는 제외되었다. 이러한 필터링 단계는 미토콘드리아 함량의 명확한 이정점 분포를 보여주는 라이브러리에 대해서만 수행되었다 (이러한 연구에서는 3개의 10x 라이브러리만). (2) 세포당 UMI의 총 수는 고유하게 검출된 유전자의 총 수와 상관관계가 있어야 한다. 이러한 관계를 따르지 않는 세포 (아웃라이어)는 모델명을 "VEV","VEE"로 설정하는 mclust R 패키지를 사용하여 log10 (총 UMI 카운트) 및 log10 총 고유 검출 유전자에 대한 이변량 가우시안 혼합물 모델을 사용하여 핵을 클러스터링함으로써 필터링되었다. (3) 상위 500개 유전자의 총 카운트의 퍼센트가, 모든 세포에 대한 절대 중앙값 편차의 5배를 초과하여 나타난 세포를 제거하였다. (4) 마지막으로, 주로 리보솜 단백질과 슈도-유전자로 구성된 세포를 제외하기 위해, 본 발명자들은 리보솜 단백질과 슈도-유전자 발현의 퍼센트가 다른 모든 세포의 절대 중앙값 편차의 5배를 초과하여 나타낸 세포를 제거하였다. 미토콘드리아 기반 필터링은 근위 세뇨관 상피 세포로부터의 라이브러리가 많은 수의 미토콘드리아 판독값을 초래할 것으로 예상되기 때문에 CD10+ 라이브러리에 대해 수행되지 않았다. 각각의 라이브러리의 품질 및 UMI-세포-유전자 분포에 따라 달라지기 때문에, 모든 라이브러리에 대해 모든 필터링 단계가 수행된 것은 아니다.

인간 10x 단일 세포 데이터 통합 전략

본 발명자들의 데이터를 처음 분석할 때, 하기 몇 가지 사항에 주목하였다: (1) 세포 유형이 환자와 조건 (건강한 또는 CKD)에 걸쳐 동등하게 표시된다고 보장되지 않는다. 이는 임의의 단일 10x 크로뮴 실행에서 캡처된 세포 유형이 세포의 무작위 샘플링에 의해 결정되기 때문이다. (2) 건강한 환자 샘플과 CKD 환자 샘플 둘 다가 건강한 상태와 질환 상태의 세포로 이루어지는데, 이는 이러한 분류가 분자 데이터나 제어된 시험관내 실험이 아닌 임상 파라미터를 기반으로 하기 때문이다. 본 발명자들은 주로 건강한 환자 샘플과 병에 걸린 환자 샘플 간의 건강한 세포 상태와 질환 세포 상태의 비율 변화를 예상할 것이다. (3) 에슈바일러 병원의 수술 일정에 따라 지시된 바와 같이 상이한 날짜에 상이한 환자로부터의 샘플을 프로세싱하고 준비하였다. 따라서, 잠재적인 기술적 (일괄) 효과는 실험적 측면에서 제어할 수 없었다. (4) 과소 대표되는 세포 유형에서 고도로 분해된 세포 클러스터를 발견할 수 있는 능력은, 특정 세포 유형이 다른 세포 유형보다 훨씬 더 풍부할 수 있고 감독되지 않은 모듈성 기반 그래프 클러스터링 알고리즘을 사용하여 클러스터링 결과에 영향을 미치는 데이터 세트의 크기 (세포 수) 때문에 클래스 불균형의 영향을 받을 수 있다.

실험 전략은 CD10+ 및 CD10- 세포 분획으로부터 별도의 라이브러리를 수득하는 것을 수반하였으며, 이는 10x 크로뮴 프로토콜에 의해 세포 유형 포획 빈도 수준에서 클래스 불균형을 완화하도록 설계되었다. 상기 논의된 사항을 더 완화하기 위해, 본 발명자들은 (1) 세포 유형 간의 관계에 대한 포괄적 정보를 그대로 유지하면서 로컬 수준에서 데이터를 클러스터링 하는 것 및 (2) 질환으로 인한 상이한 세포 유형 또는 상이한 상태의 세포 유형과 같은 중요한 차이를 유지하면서 샘플 간의 잠재적인 기술적 (일괄) 차이를 보정하는 것을 목표로 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 하기 단계로 구성된 전략을 따랐다:

단계 1: 품질 관리 및 세포 필터링 (상기 참조) 후, 각각의 10x 라이브러리 내의 세포를 별도로 클러스터링하고 각각의 세포 클러스터를 6가지 주요 세포 유형 (CD10+ 상피, CD10- 상피, 면역, 내피, 중간엽 및 신경 세포) 중 하나로 할당하였다.

단계 2: 6가지 주요 세포 유형 각각에 대해, 모든 10x 라이브러리로부터의 세포가 함께 통합되었다. 기술적인 이유로 인한 세포 간의 변동성을 보정하고 감독되지 않은 그래프 클러스터링을 사용하여 세포을 클러스터링하였다. 이러한 프로세스는 6가지 별도의 내피, CD10+ 상피, CD10- 상피, 중간엽, 면역 및 신경 맵을 초래하였다. 각각의 맵은 다중 10x 라이브러리로부터의 세포로 구성되었다.

단계 3: 본 발명자들은 단일 세포 발현 (UMI 카운트)과 단계 2로부터의 각각의 데이터 세트의 모든 주요 세포 유형 개별 맵으로부터의 클러스터링 정보를 조합함으로써, 하기에 대한 3가지 단일 세포 맵을 통합하였다: (1) CD10+ 세포 (근위 세뇨관 / 도 1), (2) CD10- 세포 (근위 세뇨관-고갈 / 도 1), 및 (3) PDGFRb+ 세포 (중간엽 / 도 2). 원고의 모든 플롯은 그 이후 3개의 통합 맵으로부터 재현 가능하다.

이러한 접근 방식은 로컬 클러스터링 및 기술적 가변성 제거를 달성했으며, 고도로 가변적인 세포 클러스터 크기에 관계없이 세포 상태의 고해상도 검색을 허용하였다. 가장 작은 클러스터는 24개의 세포로 이루어진 반면, 가장 큰 클러스터는 5355개의 세포로 이루어졌다. "높은 수준의 클러스터링에 이은 서브-클러스터링" 접근 방식과 관련하여, 본 발명자들의 접근 방식은 데이터 중심의 편향되지 않은 방식으로 고도로 분해된 클러스터를 생산하는 동시에, 어떤 클러스터를 전적으로 서브클러스터로 만들지에 대한 질문을 피한다. 본 발명자들은 차이젤(Zeisel) 등이 다소 유사한 데이터 통합 접근 방식을 따랐다는 점에 주목한다.

전반적으로, 이러한 접근 방식은 생물학적으로 정보를 얻었으며, 환자 간의 흥미로운 차이, 예컨대 병에 걸린 세포 상태 (예를 들어 손상된 근위 세뇨관 세포) 간의 차이, (근)섬유모세포 상태에서의 차이 및 ECM 발현에서의 차이를 유지하면서, 거의 모든 세포 클러스터가 하나 초과의 환자/라이브러리로부터의 세포를 함유하도록 세포 클러스터링 동안 잠재적인 기술적 영향을 보정할 수 있었다.

마우스 10x 단일 세포 데이터 통합 전략

마우스 10x 데이터는 인간 데이터에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 분석 및 통합되었다. 통합된 맵을 생산하는 데 사용되는 스크립트는 https://raw.githubusercontent.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/master/make_intergrated_maps/mouse_PDGFRABpositive.r에서 이용 가능하다.

마우스 Smart- Seq2 단일 세포 데이터 통합 전략

3가지 시점 모두로부터의 세포가 모든 플레이트에 동일하게 표시되도록 단일 세포 플레이트 분류를 수행했기 때문에, 분석 동안 추가의 일괄적인 효과 완화가 수행되지 않았다. 가변 유전자는 ERCC 전사체에서 trendVar 기능을 실행한 후, Scran R 패키지 decomposeVar 기능을 사용하여 결정되었다⁶. FDR 값 < 0.01 및 생물학적 분산 구성요소 > 1인 유전자는 고도로 가변적인 유전자로서 유지되었다. 이러한 가변 유전자를 사용하여, 본 발명자들은 10x 크로뮴 데이터에 대해 기재된 바와 동일한 클러스터링 접근 방식을 따랐지만, 본 발명자들은 클러스터링 반복을 단 2번만 실행했으며 가장 가까운 이웃의 수는 변경하지 않았다. 마우스 Smart-Seq2 데이터 분석에 사용되는 스크립트는 에서 이용 가능하다:

https://github.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/blob/master/make_intergrated_maps/mouse_PDGFRBpositive.r.

클러스터 주석부기

클러스터당 유전자 순위는 2진화 방식을 "적응형 중앙값" (Smart-Seq2 데이터) 또는 "나이브" (10x 데이터)로 설정하는 genesorteR R 패키지의 sortGenes 기능을 사용하여 생산되었다. 그런 다음 본 발명자들은 문헌으로부터의 사전 지식과 정보를 기반으로 고도로 분해된 세포 클러스터에 수동으로 주석부기하였다. CD10- 데이터에는 50개의 클러스터, CD10+ 데이터에는 7개의 클러스터, PDGFRb+ 인간 데이터에는 26개의 클러스터, 마우스 Smart-Seq2 데이터에는 10개의 클러스터, 및 마우스 PDGFRa+/b+ 데이터에는 10개의 클러스터가 있었다. 고도로 분해된 수준 (수준 3)에서, 세포 클러스터는 진정한 세포 유형 또는 상이한 세포 상태를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 주석을 기반으로 고도로 분해된 세포 클러스터를 표준 세포 유형으로 그룹화하였다. 그 결과 CD10- 맵에서 29개 세포 유형, CD10+ 맵에서 1개 세포 유형, PDGFRb+ 맵에서 16개 세포 유형, 마우스 PDGFRa+/b+ 맵에서 5개 세포 유형 및 Smart-Seq2 마우스 PDGFRb+ 맵에서 6개 세포 유형이 생성되었다. 그런 다음 본 발명자들은 더 쉬운 데이터 해석을 가능하게 하기 위해 플롯 및 도면 주석에 대해 상피, 내피, 중간엽, 면역 또는 신경 세포로서 세포 클러스터에 추가로 주석부기하였다.

UMAP 및 확산 맵

min_dist를 0.6으로 설정하고 이웃 수를 세포 수의 제곱근으로 설정한 fastMNN으로부터 반환된 감소된 보정 차원에서 UMAP 피톤(Python) 패키지 (https://github.com/lmcinnes/umap)를 통해 통합 전체 맵 UMAP 투영도 (도 1, 2, 3, 4, 5)가 생성되었다. 로컬 UMAP 투영도 (도 1, 도 4)는 min_dist를 1로 설정하여 생산되는데, 이는 이러한 파라미터가 기하학적으로 더 정확한 임베딩을 생산하는 경향이 있기 때문이다 (https://umap-learn.readthedocs.io/en/latest/ 참조). 확산 맵은 Destiny R 패키지 (https://github.com/theislab/destiny)를 사용하여 생산되었으며 fastMNN으로부터 반환된 감소된 차원을 입력으로서 사용하고 이웃 수를 세포 수의 제곱근으로 설정하였다. 본 발명자들은 UMAP 및 확산 맵 및 다양한 확산 맵 거리 메트릭 (Destiny R 패키지 설명서에서 권장된 바와 같음)에 대한 다양한 무작위 시드를 시험했으며, 그 결과로 생성되는 단일 세포 투영도에서 정성적 차이가 발생하지 않는다는 것을 확인하였다.

계통 트리/궤도 및 의사 시간

슬링샷 R 패키지는 UMAP/확산 맵 투영도를 기반으로 한 계통 트리 추론 및 의사 시간 세포 순서 추론에 사용되었다. 세포 클러스터링 (통합 전략으로부터의 단계 2, 상기 참조)을 입력 세포 클러스터로서 사용하였다. 시작 및 종료 클러스터는 문헌 [Street et al.]에서 논의되고 권장된 바와 같이 본 발명자들의 사전 지식을 바탕으로 합리적인 기대치를 기반으로 선택되었다 (예를 들어, 근섬유모세포는 혈관주위세포/섬유모세포/근섬유모세포 맵의 말단 클러스터이다).

의사 시간에 따른 유전자 역학

세포 순서에 따라 발현이 달라지는 유전자는 정규화된 발현이 본페로니-호흐베르크(Hochberg) 보정 p-값 컷오프 0.001에서 스피어만 상관 계수로써 정량화된 바와 같은 세포 순서와 상관관계가 있는 유전자로서 정의되었다. 유전자 클러스터 및 발현 히트맵 (예를 들어, 도 2f-상단)은 슬링샷에 의해 예측된 의사 시간을 따라 세포를 정렬하고 genesorteR 기능 plotMarkerHeat를 사용하여 생산되었다. 이러한 기능은 k-평균 알고리즘을 사용하여 유전자를 클러스터링하고, 본 발명자들은 의사 시간을 따라 10개 세포마다 평균을 내도록 플롯 및 클러스터링을 설정한다. 경로 증강 및 세포 주기 분석은 의사 시간을 따라 2000개 세포마다 그룹화하여 계산되었다.

경로 증강 및 유전자 온톨로지 분석

단일 세포 데이터의 경우, 본 발명자들은 2019년 11월 MSigDB 327,28로부터 ".gmt" 파일로서 다운로드한 KEGG 경로 및 PID 경로 데이터를 사용하였다. 경로 증강 분석은 genesorteR 패키지로부터의 sortGenes 기능에 의해 정의된 바와 같이 각각의 세포 클러스터/그룹에 대한 상위 100개의 유전자를 사용하여 clusterProfiler R 패키지를 사용하여 수행되었다. minGSSize를 10으로 설정하고 maxGSize를 200으로 설정하여 증강기 기능을 사용하였다. 각각의 세포 클러스터/그룹에 대한 q-값별 상위 5개 항목은 -log10(q-값)의 히트맵으로서 플롯되었다. 유전자 온톨로지 생물학적 프로세스 분석은 상위 200개 유전자에 대해 동일한 방법으로 수행되었다. minGSSize를 100으로 설정하고 maxGSize를 500으로 설정하여 증강기 기능을 사용하였다. NKD2+ 및 NKD2- 중간엽 세포 간의 경로 활동을 비교하기 위해, 본 발명자들은 PROGENy를 사용하여, 벤치마크 연구로부터 권장하는 바와 같이 모델로부터 가장 반응이 빠른 상위 500개 유전자를 사용하여 단일 세포 기준으로 14개 경로의 활동을 추정하였다.

세포 주기 분석

세포 주기 분석은 문헌 [Macosko et al.]에서 사용되고 포위안 퉁(Po-Yuan Tung)에 의한 지도 시간에 설명된 방법에 따라, 정규화된 유전자 발현을 입력으로서 사용하고 유전자 상관 값을 0.1로 설정하여 수행되었다(https://jdblischak.github.io/singleCellSeq/analysis/cell-cycle.html, date: 06-07-2015). 본 발명자들은 문헌 [Yang et al.]에 제공된 세포 주기 유전자 세트를 사용하였다. 단일 세포 주기 할당의 증강/고갈을 정량화하기 위해 (도 1g), 본 발명자들은 행 및 열 합계를 일정하게 유지하면서 실제 빈도 매트릭스를 1000회 무작위 배정함으로써 수득된 평균 빈도와 비교한 그 빈도의 log2 배수 변화를 플롯한다. 무작위 배정은 R 패키지 Vegan (https://CRAN.R-project.org/package=vegan)을 사용하여 수행되었다. 양수는 우연히 예상되는 것에 비해 증강된다는 것을 나타내고, 음수는 고갈을 나타낸다.

ECM 및 콜라겐 점수

문헌 [Naba et al.]에 제공된 코어 매트리좀 유전자의 발현은 세포 주기 분석에 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 정규화된 유전자 발현 데이터를 기반으로 요약되었다.

유전자 발현 히트맵

도 2d에서와 같은 스케일링된 유전자 발현 히트맵은 genesorteR R 패키지 내의 plotMarkerHeat 및 plotTopMarkerHeat 기능을 사용하여 생산되었다. 도 3d와 같은 발현된 세포 히트맵의 분획은 genesorteR R 패키지로부터의 plotBinaryHeat 기능을 사용하여 생산되었다. 도 5j,k와 같은 특색의 log2-배수 변화 및 증강을 보여주는 히트맵은 ComplexHeatmap R 패키지 (v. 2.4.2)를 사용하여 생산되었다.

ATAC - Seq 분석

BBmap 제품군 (버전 38.32, 설정: trimq=18, k=20, mink=5, hdist=2, hdist2=0)의 bbduk 명령을 사용하여 ATAC-Seq 판독값으로부터 일루미나 Tn5 어댑터 서열을 트리밍하였다. STAR (버전 2.7.0e)는 ATAC-Seq 판독값을 고유하게 맵핑된 쌍만 유지하는 mm10 게놈 어셈블리에 맵핑하는 데 사용되었다 (설정: alignEndsType EndToEnd, alignIntronMax 1, alignMatesGapMax 2000, alignEndsProtrude 100 ConcordantPair, outFilterMultimapNmax 1, outFilterScoreMinOverLread 0.9, outFilterMatchNminOverLread 0.9). 피카르(Picard)의 MarkDuplicates 명령 (버전 2.18.27)을 사용하여 서열 중복을 제거하였다 (설정: remove_duplicates=TRUE, http://broadinstitute.github.io/picard/). 일치하지 않는 판독값 쌍은 Samtools (버전 1.3.1)³⁹를 사용하여 BAM 파일로부터 제거되었다. bedtools (버전 2.17.0)를 사용하여 BAM 파일을 BED 파일로 변환하고 Tn5-DNA 접촉의 입체 장애를 설명하기 위해⁴¹, 스트랜드 방식으로⁴⁰ 판독값 5' 말단으로부터 15 bp 상류 및 22 bp 하류로 각각의 판독값을 확장하였다. JAMM (버전 1.0.7rev5)은 최종 BED 파일로부터 열린 영역을 확인하는 데 사용되어 추가 분석을 위해 모든 목록에서 너비가 적어도 50 bp인 피크를 유지하면서 2개의 복제물을 분리하여 유지하였다 (파라미터: -r 피크, -f 38,38, -e 오토, -b 100)⁴². ATAC-Seq 신호 bigwig 파일은 JAMM SignalGenerator 파이프라인 (설정: -f 38,38 -n 깊이)을 사용하여 생산되었다.

scRNA-Seq 클러스터링에 따라 벌크 ATAC-Seq 데이터로부터 ATAC-Seq 신호를 분리하기 위해, 본 발명자들은 다음 전략을 따랐다. ATAC-Seq 신호를 분리하기 위해, 데이터 분석에서 3가지 주요 단계를 수행하였다: 1) 각각의 열린 염색질 피크 (TF가 DNA와 결합할 것으로 예상되는 곳)는 먼저 특이적 유전자에 할당되었다. 2) 이들 유전자는 단일 세포 RNA-Seq 데이터세트에서의 발현에 따라 scRNA-Seq 클러스터 (Fib, MF1/2 등)별로 순위가 매겨졌다. 3) 상위 2000개의 ATAC 피크를 사용하여 증강된 전사 인자 모티프 서열을 확인하였다.

보다 상세하게는, 각각의 열린 염색질 ATAC-Seq 피크는 bedtools closest 기능을 사용하여 가장 가까운 주석부기된 전사 시작 부위에 따라 유전자에 할당되었으며, 최대 가능한 할당 거리로서 100 kb를 설정하였다. scRNA-Seq 클러스터당 ATAC-Seq 피크 순위는 단일 세포 RNA-Seq 클러스터에서 할당된 유전자의 순위에 따라 피크의 순위를 지정함으로써 수득되었다. 각각의 scRNA-Seq 클러스터에 대한 상위 2000개의 ATAC-Seq 피크를 선택하고 XXmotif를 각각의 scRNA-Seq 클러스터 열린 염색질 영역에 대한 드 노보 모티프 찾기에 개별적으로 사용하였다 (설정: --revcomp --merge-motif-threshold MEDIUM). 본 발명자들은 추가 분석을 위해 XXmotif로 정의된 바와 같이, 발생률이 5% 초과인 모티프만 유지하였다. 각각의 단일 세포 RNA-Seq 클러스터 내의 상위 200개 유전자에 할당된 피크에서 디폴트 파라미터 (MEME 버전 5.0.1)와 함께 FIMO 44를 사용하여 모든 4개의 scRNA-Seq 클러스터로부터의 모든 모티프로부터 모티프 발생을 정량화하였다. 이것은 scRNA-Seq 클러스터에서 모티프 발생 빈도 매트릭스를 생산하였다. scRNA-Seq 클러스터에서의 모티프 발생의 증강/고갈을 정량화하기 위해, 본 발명자들은 행 및 열 합계를 일정하게 유지하면서 실제 빈도 매트릭스를 1000회 무작위 배정함으로써 수득된 평균 빈도와 비교한 그 빈도의 log2 배수 변화를 플롯한다. 무작위 배정은 R 패키지 Vegan (https://CRAN.R-project.org/package=vegan)을 사용하여 수행되었다. 양수는 우연히 예상되는 것에 비해 증강되는 것을 나타내고 음수는 고갈을 나타낸다 (주요 도 4k 참조). 본 발명자들은 추가 조사를 위해 Irf8, Nrf, Creb5/Atf3, Elf/Ets 및 Klf를 선택하였다. 본 발명자들은 JAMM에 의해 생성된 bigwig 파일을 입력으로서 사용하여, DeepTools 버전 3.3.1을 사용하여 그 모티프가 함유된 모든 피크로부터의 신호를 플롯하였다. 본 발명자들은 통합 게노믹스 뷰어에서 동일한 bigwig 파일 및 모티프 발생을 시각화하였다.

기타 시각화 / 분석

유전자 발현을 정량화하지 않는 히트맵은 gplots R 패키지 (https://CRAN.R-project.org/package=gplots)의 heatmap2 기능을 사용하여 생산되었다. 바이올린 플롯은 vioplot R 패키지 (https://CRAN.R-project.org/package=vioplot)를 사용하여 생산되었다.

단일 세포 시퀀싱 데이터 외부에서 사용된 정량화 및 통계 분석

범례에 달리 지정되지 않은 경우 데이터는 평균±SEM으로서 표시된다. 2개 그룹의 비교는 비-대응표본 t-시험을 사용하여 수행되었다. 다중 그룹 비교를 위해, 본페로니의 다중 비교 시험을 사용한 일원 분산 분석 또는 시다크(Sidak)의 다중 비교 시험을 사용한 이원 분산 분석을 적용하였다. 통계 분석은 그래프패드 프리즘 8 [그래프패드 소프트웨어 인크. (GraphPad Software Inc.; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)]을 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 p-값은 유의미한 것으로 간주되었다.

유전자 조절 네트워크 분석

유전자 발현은 유전자당 l1-스케일링되었고 Nkd2와 혈관주위세포, 섬유모세포 및 근섬유모세포 단일 세포를 따라 다른 모든 유전자 간의 피어슨 상관 계수가 계산되었다. 경로 증강 분석을 위해 상위 100개의 상관 및 상위 100개의 반-상관 유전자를 선택하였다. 추가로, 단일 세포를 따라 있는 200개 유전자의 발현은 GRNboost2+ 피톤 패키지에 대한 입력으로 사용되어 유전자 간의 추정되는 조절 링크를 예측하였다. 강도 <= 10인 연결을 제거함으로써 출력 네트워크를 필터링하였다. 그 결과로 생성된 네트워크는 ggraph 패키지 (https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/ index.html)를 사용하여 방향이 지정되지 않은 네트워크 (조절인자가 미리 공지되지 않았기 때문이다)로 플롯되었으며 igraph 패키지에 구현된 바와 같은 루뱅(Louvain) 알고리즘을 사용하여 4개의 모듈로 클러스터링되었다.

단일 세포 데이터로부터의 전사 인자 예측

원위 및 근위 영역에서 전사 인자 점수를 수득하기 위해, 본 발명자들은 섬유모세포, 혈관주위세포 및 근섬유모세포 세포 클러스터에 대한 상위 200개의 마커 유전자를 RCisTarget에 대한 입력 유전자 목록으로서 사용하였다. 본 발명자들은 RCisTarget Vignette에 따라 디폴트 파라미터로 분석을 수행하였다 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ RcisTarget/inst/doc/RcisTarget.html에서 이용 가능함). AP1 발현을 정량화하기 위해, 본 발명자들은 모든 Jun 및 Fos 유전자를 geneset로서 사용하였고 ECM 점수에 대해서와 동일한 방법을 적용하여 AP1 점수를 수득하였다. AP1 활성 (추정 표적 유전자의 발현으로서 정의됨)을 정량화하기 위해, 본 발명자들은 도로테아 레굴론(Dorothea regulon) 데이터베이스에 따라 AP1 표적 유전자를 정의하고 ECM 점수와 동일한 방법을 적용하여 단일 세포 AP1 활성 점수를 수득하였다.

마우스 감독 세포 분류

본 발명자들은 디폴트 파라미터와 함께 CHETAH 알고리즘을 사용하여 인간 PDGFRb+ 데이터세트를 참조로서 사용하여 마우스 PDGFRa+b+ 데이터세트에서 단일 세포를 분류하였다. 인간 유전자 기호는 biomaRt 데이터베이스를 사용하여 마우스 유전자 기호로 변환되었다.

CellphoneDB 분석

CellPhoneDB (v.2.1.1)는 데이터베이스 버전 2.0.0을 사용하여 인간 CD10- 분획에서 발견된 세포 유형 간의 세포-세포 상호작용을 추정하고 디폴트 파라미터를 사용하여 정규화된 유전자 발현을 입력으로 사용하였다 (리간드/수용체를 발현하는 세포의 10%). p-값이 <0.05인 상호작용은 유의미한 것으로 간주되었다. 본 발명자들은 데이터베이스로부터의 주석을 기반으로 하는 리간드-수용체 상호작용만을 고려하고, 상호작용하는 쌍 중 적어도 하나의 파트너만 수용체였으므로, 명확한 수용체가 없는 수용체-수용체 및 기타 상호 작용은 무시한다. Hedgehog, Notch, TGFb 및 WNT 신호전달에 대한 KEGG 데이터베이스로부터의 구성원, 및 MSigDB 3으로부터의 EGFR 신호전달에 대한 REACTOME 데이터베이스, 및 PDGF 신호전달에 대한 수동 큐레이션을 사용하여 신장 섬유증에 관여한 경로로부터의 리간드-수용체 상호작용을 선택하였다.

벌크 RNA- Seq 데이터 분석

--validatMappings 및 --gcBias 파라미터가 켜져 있는 살몬 v1.1.0을 사용하여 인간 젠코드 v29 전사체에 대한 전사체 수준에서 유전자 발현을 정량화하였다. 전사 수준 카운트는 countsFromAbundance를 "lengthScaledTPM"으로 설정하여 tximport R 패키지의 가져오기를 사용하여 유전자 수준 카운트로 집계되었다. Limma R 패키지 (v.3.44.1)를 사용하여 voom 변환 후 경험적 베이즈(Bayes) 방법을 사용하여 대조군과 비교 시 Nkd2-교란된 인간 신장 PDGFRb+ 간의 차등 유전자 발현을 시험하였다. 본 발명자들은 주요 구성요소 분석에서 CRISPR-Cas9 NKD2 녹아웃 그룹의 3개 클론 중 2개는 얕은 표현형을 나타내는 반면, 세 번째 클론은 독립적으로 그룹화되어 더 깊은 표현형을 나타냄을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은 2개의 첫 번째 클론 녹아웃을 그룹화하여 통계적 대조를 위해 2개의 독립적인 녹아웃 조건을 갖는다. 차등적으로 발현된 유전자는 경로 및 유전자 온톨로지 분석을 위한 통계적 시험로부터의 조정된 t-통계에 의해 순위가 매겨졌다. P-값은 벤자미니(Benjamini) & 호흐베르크 방법을 사용한 다중 시험에 대해 조정되었다. FDR < 0.05인 유전자 및 경로는 유의미한 것으로 간주되었다.

경로 및 유전자 온톨로지 분석을 위해, 본 발명자들은 또한 대조군과 비교 시 Nkd2-교란된 세포에서 조정된 p-값이 0.01 미만이고 이러한 조정된 p-값에 의해 순위가 매겨진 최대 200개의 유전자와의 녹아웃 비교를 위해 1 초과 (과다발현 비교를 위해서는 0 초과)의 절대 log 배수 변화를 갖는 유전자를 사용한 KEGG 및 PID 경로와 함께 clusterProfiler R 패키지를 사용하였다. 본 발명자들은 MatrisomeDB 유전자 세트 컬렉션과 함께 fgsea R 패키지 (v.1.14.0)⁵⁴를 사용하여 표현형에서 ECM 유전자의 증강을 시험하기 위해 GSEA 사전 순위를 사용하였다.

실시예 2: 인간 만성 신장 질환의 단일 세포 아틀라스

인간 신장에서의 상주 세포 유형이 항상성과 CKD 동안 세포외 매트릭스를 분비하는지 이해하기 위해, 본 발명자들은 세뇨관간질에 특히 초점을 맞춘 인간 신장의 단일 세포 맵을 생성하였다. 신장 피질 세포의 80% 초과가 근위 세뇨관 상피 세포이며, 이와 같이 신장의 이전 단일 세포 맵을 지배하는 경향이 있어, 다른 신장 세포 구획에서 잠재적으로 중요한 이질성을 마스킹한다. 따라서 본 발명자들은 살아 있는 (생육성) 비-근위 세뇨관 상피 세포 (즉, 막 메탈로-엔도펩티다제 - MME로서 공지되기도 한, CD10에 대해 음성인 세포)를 증강시키는 분류 전략을 선택했지만, 살아있는 CD10+ 근위 세뇨관 상피 분획을 분류하여 편향되지 않은 방식으로 전체 신장을 맵핑하였다. 참고로, 이것은 CD10이 일부 다른 세포 유형에 의해서도 발현되기 때문에 비독점적 분류 전략이다. 그러나, 이는 근위 세뇨관 상피 세포의 증강/고갈을 허용한다. 고혈압 유발 신경화증 (n=7; 추정 사구체 여과율, eGFR>60 및 n=6; eGFR<60)으로 인해 CKD의 상이한 병기를 가진 총 13명의 환자로부터의 CD10+ 및 CD10- 분획 모두 scRNAseq에 적용되었다. 본 발명자들은 11명의 환자로부터 53,672개의 CD10- 세포를 프로파일링하였다 (n=7 eGFR>60; n=4 eGFR<60). eGFR<60인 환자는 간질 섬유증과 세뇨관 위축이 증가하였다. 환자 전체의 데이터를 통합하기 위해, 본 발명자들은 감독되지 않은 그래프-기반 클러스터링 방법 (방법 참조)을 이용하고 eGFR 그룹 둘 다 (도 1e)에 표시된 50개의 상이한 CD10- 세포 클러스터 (도 1a-d)를 확인하였다. 본 발명자들의 분류 및 데이터 통합 전략을 통해 이전 신장 단일 세포 맵에서 설명되지 않은 슈반 세포와 같은 희귀 세포 유형의 확인을 포함하여 신장 간질에서의 전체 규모의 이질성을 평가할 수 있었다 (도 1a-d).

총 33,690개의 CD10+ 근위 세뇨관 세포가 8명의 환자로부터 프로파일링되었고 (n=5; eGFR>60 및 n=3; eGFR<60) 7개의 클러스터로 배열되었다 (도 1f). CD10+ 근위 세뇨관 세포 클러스터의 세포-주기 분석은 상피 복구 반응을 반영할 가능성이 있는 CKD에서의 순환 증가를 나타내었다 (도 1g). CD10+ 세포에서의 KEGG 경로 분석 및 유전자 온톨로지 항목은 CKD에서 다양한 다른 조절 장애 대사 경로 중에서 지방산 대사 증가를 시사하였다 (도 1h). 지방산 대사는 세뇨관 탈분화 및 섬유증을 유발하는 인간 및 마우스 신장에서의 주요 조절 장애 경로로서 보고되었다 (Kang et al. 2015).

따라서, 본 발명자들은 인간 CKD 동안 ECM의 세포 기원에 대한 후속 의문을 가능케 하기 위해 항상성과 CKD에서 인간 신장의 고해상도 맵을 생성하는 분류 전략을 이용하였다.

실시예 3: 인간 만성 신장 질환에서 세포외 매트릭스의 기원

인간 신장 섬유증이 진행되는 동안 어떤 세포 유형이 세포외 매트릭스 (ECM) 생산에 기여하는지 이해하기 위해, 본 발명자들은 콜라겐, 당단백질 및 프로테오글리칸을 포함한 모든 코어 ECM 분자의 발현을 요약하는 단일 세포 ECM 발현 점수를 확립하였다. 본 발명자들은 당뇨병성 신증 환자 36명의 공개된 데이터세트에서 이러한 점수를 검증하여 (문헌 [Fan et al. 2019]), 진행성 CKD에서 증가된 ECM 점수 값을 확인하였다.

ECM 점수는 CKD에서 높은 ECM 발현 세포로의 명확한 이동을 입증하였다 (도 1i). 그런 다음 본 발명자들은 항상성과 CKD의 주요 세포 유형의 ECM 점수를 비교하여, 중간엽 세포를 ECM 발현이 가장 높은 세포로서 확인하고 CKD에서 ECM 발현이 추가로 증가한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 CKD의 중간엽 서브클러스트 중 어떤 것에서도 ECM의 현저하게 증가된 발현을 관찰하지 못했지만, 모든 섬유모세포 및 근섬유모세포 집단은 CKD에서 확장되었는데, 이는 중간엽에서 관찰된 전반적으로 증가된 ECM 유전자 발현을 설명해준다 (도 1k-l). 역사적으로 ACTA2는 근섬유모세포 마커로서 사용되었다. 그러나, ECM 발현이 섬유증의 특징이기 때문에, 본 발명자들은 근섬유모세포를 대부분의 ECM 유전자를 발현하는 세포로서 정의하였다. 개별 세포의 확장 외에, 증가된 ECM 발현의 또 다른 중요한 메커니즘은 세포가 ECM 높은 근섬유모세포로 분화하는 것이다. 인간 CKD에서 ECM 발현 중간엽 집단의 이질성과 추정 분화 프로세스를 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 (근)섬유모세포와 혈관주위세포의 균일 다양체 근사화 및 투영 (UMAP) 임베딩을 생성하였다 (도 1m-n). 이러한 UMAP 임베딩은 본 발명자들의 감독되지 않은 그래프 클러스터링 결과 (도 1b-c)와 일치하며, 이전에 평가되지 않았던 인간 신장 중간엽의 이질성을 강조한다. 근섬유모세포는 페리오스틴 (postn) 발현 세포 클러스터로서 명확하게 확인되었다 (도 1n). 확산 맵핑은 세포가 분화-유사 확산 프로세스에 의해 서로 관련되어 있다고 가정하는 차원 감소 방법이다. 본 발명자들은 이러한 방법을 사용하여 근섬유모세포에 대한 추정 분화 메커니즘을 해명하였다. ECM 발현 수준이 가장 높은 중간엽 세포의 확산 맵 임베딩은 근섬유모세포가 혈관주위세포와 섬유모세포로부터 발생한다는 것을 시사하였다 (도 1o).

본 발명자들은 상피 세포에서 ECM 유전자의 약간의 상향 조절을 관찰했으며 (도 1j), 이는 수년 동안 신장 커뮤니티에서 논의된 상피 중간엽 전이 (EMT)의 작은 기여를 암시한다. 손상된 근위 세뇨관 상피 (iPT)는 다양하게 발현된 유전자 및 GO 항목을 갖는 CD10- 상피 중에서 ECM 유전자의 발현이 가장 높았다는 것을 나타내며, 이는 정규 상피로부터의 탈분화를 시사한다. CD10+ 분획 (모든 분류된 근위 세뇨관 상피)에서, 본 발명자들은 또한 CKD에서 ECM 발현이 약간 증가하는 것을 관찰하였다. 참고로, 손상된 세포는 이전에 손상-관련된 것으로 보고된 유전자, 예컨대 근위 세뇨관 상피의 경우 Sox9, CD24 및 CD133 및 내피의 경우 VCAM1 및 ACKR1의 발현에 의해 정의되었다.

요약하면, 이러한 데이터는 인간 신장 섬유증 동안 생성된 대부분의 ECM이 여러 상이한 중간엽 세포 하위유형으로부터 유래되고, 탈분화된 세뇨관 상피 세포로부터는 약간의 기여만 한다는 것을 나타낸다.

실시예 4: 별개의 혈관주위세포 및 섬유모세포 하위집단은 인간 신장 섬유증에서 근섬유모세포의 주요 공급원이다

본 발명자들의 CD10- scRNA-seq 데이터는 대부분의 Col1a1 발현 세포가 PDGFRb+임을 나타내었다. 따라서 본 발명자들은 8개의 인간 신장으로부터 37,380개의 PDGFRb+ 세포를 분류하였다 (n=4; eGFR>60 및 n=4; eGFR<60). 감독되지 않은 클러스터링은 중간엽 세포 집단과 일부 상피, 내피 및 면역 세포를 확인했으며 (도 2a-d), CD10- 집단과의 상관관계에 따라 주석부기되었다. 일반적으로 콜라겐 및 ECM 유전자 발현은 본 발명자들의 CD10- 데이터와 일치하여 혈관주위세포, 섬유모세포 및 근섬유모세포 클러스터에서 우세하였다 (도 1j-k). 그러나, 일부 대식세포/단핵구, 내피 및 손상된 상피 집단이 또한 collagen1a1 및 PDGFRb를 발현했지만, 중간엽 세포보다 훨씬 낮은 수준이었다 (도 2a-c). 더블렛-가능성 점수의 전산 예측은 내피 및 손상된 상피 세포에 대해 특별히 높은 점수를 나타내지 않았지만, 점수는 대식세포 집단에 대해 약간 증가하였다. 본 발명자들은 계내 혼성화 (ISH)를 통해 LTA+ 근위 세뇨관, CD68+ 대식세포 및 Pecam-1+ 내피 세포에서의 Col1a1 mRNA 발현을 검증하였다. ECM 유전자 발현의 대부분은 중간엽 세포 유래인 반면 본 발명자들은 이러한 비-중간엽 세포 유형에서 실제로 작은 ECM 유전자 발현을 관찰했기 때문에, 상기 데이터는 신장 근섬유모세포 풀 (문헌 [Duffield 2014; Wang et al. 2017])에 대한 비-중간엽 계통의 기여에 관한 문헌의 논쟁을 어느 정도 설명할 수 있다.

PDGFRb+ 집단으로부터의 주요 ECM 발현 세포 하위유형의 의사 시간 궤적 및 확산 맵 분석은 인간 신장에서 근섬유모세포의 3가지 주요 공급원: 1) Notch3+/RGS5+/PDGFRa- 혈관주위세포, 2) Meg3+/PDGFRa+ 섬유모세포 및 3) Colec11+/CXCL12+ 섬유모세포를 나타내었다 (도 2e). 참고로, 확산 맵핑은 비-CKD 세포를 주로 낮은 ECM 발현 혈관주위세포 및 섬유모세포 집단 내에 배치하며, 이는 낮은 ECM, 비-CKD 중간엽 세포 (혈관주위세포 및 섬유모세포)에서 높은 ECM CKD 근섬유모세포로의 잠재적인 분화 궤적을 나타낸다 (도 2e). 이러한 중간엽 세포의 UMAP 임베딩은 또한 이들 결과와 일치하였다. 이것은 신장 섬유증에서 ECM 및 Postn을 발현하는 근섬유모세포로의 분화와 일치한다. 본 발명자들은 인간 신장에서 ISH를 사용하여 이러한 예측된 방향성을 검증하여, Meg3+ 세포의 수가 감소하는 동안 신장 섬유증에서 Postn 발현 세포의 수가 증가했음을 확인하였다 (도 2f). ISH를 사용하여, 본 발명자들은 확산 맵 분석에서 Notch3+ 혈관주위세포 (계통 1) 및 Meg3+ 섬유모세포 (계통 2)로 이루어진 주요 계통을 추가로 검증하였다 (도 2f). 본 발명자들은 Meg3+ 및 Notch3+ 세포 둘 다가 Postn을 공동 발현하는 것을 관찰하였으며, 이는 근섬유모세포 분화를 나타낸다 (도 2f). 흥미롭게도, 본 발명자들은 또한 확산 맵의 중심에서 분화 세포를 나타낼 수 있는 Notch3/Meg3/Postn 공동 발현 세포의 중간 단계일 가능성이 있음을 관찰하였다 (도 2f). 그런 다음 본 발명자들은 확인된 중간엽 하위집단이 공간적으로 구별되는지 여부를 평가하였다. 본 발명자들은 섬유모세포 1 (Meg3+), 혈관주위세포 (Notch3+) 또는 섬유모세포 2 (Cxcl12+)에 대한 뚜렷한 공간적 국재화를 관찰하지 않았지만, 본 발명자들은 예상대로 섬유증 영역에서 증강된 근섬유모세포 1 (Postn+) 세포를 관찰하였다. 흥미롭게도, 인간 신장 섬유증에서 증가하는 근섬유모세포 3 (Ccl19+/Ccl21+)은 사구체 주위에서 뚜렷한 증강을 나타내었다.

그런 다음 본 발명자들은 혈관주위세포에서 근섬유모세포로의 분화 (계통 1)의 유전자 발현 프로그램을 분석하였다 (도 2g). 세포 주기 분석은 분화 프로세스 및 근섬유모세포 집단의 확장과 일치하는 심오한 변화를 명확하게 보여주었다 (도 2g). 혈관주위세포에서 근섬유모세포로의 분화를 더 잘 이해하기 위해, 본 발명자들은 의사 시간을 따라 경로 증강을 주문하였다. 본 발명자들은 다른 경로 중에서 초기 (정규 Wnt, Myc 및 AP1), 중간 (ATF2, PDGFRa 및 Myc) 및 후기 (인테그린, ECM 수용체 상호작용 및 TGFb) 신호전달을 관찰하였다 (도 2g 하단).

혈관주위세포에서 근섬유모세포로의 분화와 유사하게, 본 발명자들은 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 분화 동안 세포 주기 중단을 관찰하였고, 이어서 증식이 증가하였다 (계통 2 및 3). 의사 시간을 따라 정렬된 경로 증강은 초기 AP1 신호전달, 염증성 및 면역 세포 상호작용 경로를 강조했으며, 그 뒤에 인테그린 신호전달, 병소 부착 및 ECM 상호작용 경로가 뒤따랐다.

TGFb 신호전달은 계통 2의 의사 시간 분석에서 널리 퍼졌다 (도 2g). 완전히 분화된 근섬유모세포를 나타내는 것으로 보이는 근섬유모세포 1은 높은 수준의 TGFb 리간드와 더 낮은 수준의 TGFb 수용체를 발현하였다. 그러나, 섬유모세포 1에 대해서는 그 반대가 관찰되었으며, 이는 근섬유모세포가 섬유모세포의 분화를 촉진할 수 있는 메커니즘을 시사한다.

상기 기재된 많은 경로는 인테그린²⁷ 및 AP1 전사 인자 신호전달을 포함하여 섬유증의 중요한 조절인자로 공지되어 있으며 (문헌 [Wernig et al. 2017]), 본 발명자들이 관찰한 것은 혈관주위세포에서 근섬유모세포로의 분화 및 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 분화 둘 다의 초기 단계 동안 지속적으로 고도로 활성적이었다는 것이다. 섬유모세포 및 근섬유모세포 집단의 전사 조절을 더 이해하기 위해, 본 발명자들은 다양한 중간엽 집단에서 프로모터 및 마커 유전자의 원위 영역에서 전사 인자 DNA 서열 모티프 증강 분석을 수행하였다. 이는 섬유모세포에서 근섬유모세포로의 분화에서 AP-1 (Jun/Fos)의 잠재적 핵심 조절 역할을 더욱 강조하였다. AP1의 역할을 기능적으로 검증하기 위해, 본 발명자들은 렌티바이러스 hTERT, SV40LT 형질도입을 사용하여 새로운 인간 PDGFRb+ 신장 세포주를 생성하였다. 활성화제-단백질 1 (AP1)의 약리학적 억제는 증식을 현저하게 감소시키고 오스테오글리신 (Ogn) 발현을 감소시키는 반면, Postn 발현은 증가시켰는데, 이는 이들 세포의 근섬유모세포 분화를 시사한다. 참고로, 인간 PDGFRb 데이터에서 Ogn은 섬유모세포 1/3을 표시했고 Postn은 근섬유모세포 1을 표시하였다. 이러한 결과와 일치하게, AP1 발현은 섬유모세포 및 근섬유모세포 둘 다에서 콜라겐 발현과 음의 상관관계가 있다. 흥미롭게도, AP1의 추정 표적 유전자의 발현은 근섬유모세포에서의 콜라겐 발현과 양의 상관관계가 있었으며, 이는 AP1이 억제인자로서 작용할 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 리간드-수용체 분석 (문헌 [Efremova et al. 2020])을 수행하여 어떤 세포 유형이 주요 ECM 발현 중간엽 세포 (섬유모세포, 혈관주위세포 및 근섬유모세포)와 상호작용하는지 밝히는 데 도움을 주었다. 본 발명자들은 건강한 근위 세뇨관 상피로부터 신호가 가장 적게 전달되는 것을 관찰했지만, 손상된 근위 세뇨관 상피는 신장 섬유증의 특징인 세뇨관 간질 신호전달과 일치하는 중간엽의 상위 신호전달 파트너 중 하나였다 (Venkatachalam et al. 2015). 본 발명자들은 TGFb, PDGFRa/b, Notch, EGFR 및 WNT 신호전달을 포함하여 섬유증에서 핵심 역할을 하는 것으로 기재된 경로로부터의 상호작용에 중점을 두었다 (Kramann and DiRocco 2013). 이러한 경로 내에서 본 발명자들은 손상된 근위 세뇨관으로부터 중간엽 섬유증 구동 세포를 향한 Notch, TGFb, Wnt 및 PDGFa 신호전달을 관찰하였다.

요약하면, 이들 데이터는 모두 PDGFRb, 즉 Notch3+/PDGFRa- 혈관주위세포, Meg3+/PDGFRa+ 섬유모세포 및 Colec11+/Cxcl12+ 섬유모세포로써 표시되는 인간 신장 근섬유모세포의 3가지 주요 세포 공급원을 시사하고 이들의 분화 프로세스에 빛을 비춰준다.

실시예 5: 이중-양성 PDGFRa +/ PDGFRb + 중간엽 세포는 인간 및 마우스 신장 섬유증에서 대부분의 ECM-발현 세포를 나타낸다

본 발명자들은 상기 제시된 결과를 더 질문하기 위해 마우스에서 유전적 운명 추적을 사용하였다. PDGFRbCreER-tdTomato 마우스를 타목시펜으로 펄싱하고 일측성 요관 폐색 (UUO) 수술을 실시하고 제10일에 희생시켰다 (도 3a). Col1a1 mRNA에 대한 계내 혼성화 (ISH)는 마우스 신장 섬유증에서 거의 모든 Col1a1 발현 세포가 PDGFRb 계통 유래임을 확인하였다 (도 3b-c). 또한, 역사적으로 사용된 근섬유모세포 마커 aSMA (ACTA2)에 대한 면역염색은 대부분의 aSMA 발현 세포가 PDGFRb 계통 유래임을 확인하였다. 그런 다음 본 발명자들은 PDGFRb-eGFP 마우스에서 SmartSeq2 기반 sc-RNA-seq 시간 경과 연구를 수행하였다 (Picelli et al. 2014) (도 3d-e). 평활근 세포 및 혈관주위세포는 UUO 이후 시간이 지남에 따라 그 존재비가 감소하는 반면, 혈관간 세포 및 Col1a1+/PDGFRa+ 매트릭스 생산 세포 클러스터는 시간이 지남에 따라 상당히 증가하였다 (도 3f-g). 본 발명자들의 인간 신장 데이터세트 (도 1,2)와 유사하게, 주요 ECM-발현 세포 집단은 이중 PDGFRa/PDGFRb 발현과 또한 데코린 (DCN) 및 페리오스틴 (Postn)의 발현으로 정의되었다 (도 3g-h). 또한, 혈관주위세포 및 혈관 평활근 세포 (vSMC)는 약간의 ECM 발현을 나타냈지만, 이중 PDGFRa/PDGFRb 집단보다 현저히 더 낮은 수준이었다.

마우스에서의 면역염색 및 ISH는 Col1a1-발현 세포가 PDGFRa+ 및 PDGFRb-tdTomato에 대해 이중 양성임을 확인하였다 (도 3i-j). 이것은 PDGFRa+/b+ 발현 세포에 대한 선택이 Col1a1+ 세포에 대해 증강되어 PDGFRa/PDGFRb 발현 세포를 ECM 발현의 주요 공급원으로 확인하는 본 발명자들의 인간 CD10- 데이터와 일치한다 (도 3k). 본 발명자들은 62명의 환자의 조직 마이크로어레이에서 다중화 ISH를 사용하여 더 큰 인간 코호트에서 이러한 발견을 확인하였다 (도 3l). 매트릭스 생산 세포 및 혈관주위세포의 확산 맵 임베딩은 또한 본 발명자들의 인간 PDGFRb 데이터와 일치했으며, 혈관주위세포 (PDGFRb+, PDGFRa-, Notch3+)가 주요 ECM 생산 세포 (PDGFRb+, PDGFRa+, Col1a1+, Postn+)의 기원 중 하나임을 시사하였다.

취합해 보면, 본 발명자들의 인간 데이터 및 마우스에서의 운명 추적 실험은 혈관주위세포-유래 근섬유모세포를 포함하나 비-활성화된 혈관주위세포 (즉, 높은 ECM 유전자 발현을 나타내지 않는 혈관주위세포)를 포함하지 않는 (도 2e), 모든 섬유모세포 및 근섬유모세포 집단을 포함하는 PDGFRa+/PDGFRb+ 이중-양성 중간엽 세포가 인간 및 마우스 신장 섬유증 둘 다에서 Col1a1 발현 세포의 대부분을 나타낸다는 것을 명확하게 보여준다.

실시예 6: PDGFRa +/ PDGFRb + 세포는 이질적이고 상이한 섬유모세포 세포 상태를 함유한다

섬유모세포에서 근섬유모세포로의 전이에 대한 기계론적 통찰력을 얻고 PDGFRa+/PDGFRb+ 집단의 이질성을 분석하기 위해, 본 발명자들은 다음으로 PDGFRb-eGFP 마우스에서 UUO 수술 대 모의 수술을 수행하여 7,245개의 이중 양성 PDGFRa+/PDGFRb+ 마우스 신장 세포로부터 scRNA-Seq 데이터를 생성한 다음, eGFP/PDGFRa 이중 양성 세포를 분류하였다 (도 4a). 빠르게 확장하는 세포 집단과 일치하여, PDGFRa+/PDGFRb+ 이중 양성 세포는 본 발명자들의 Smart-Seq2 데이터 (도 3f)와 일치하여 손상 후 세포 수가 ~140배 증가한 것으로 나타났다 (도 4b). PDGFRa+/PDGFRb+ 세포의 UMAP 임베딩은 중간엽 세포 (섬유모세포 및 근섬유모세포), 상피 세포, 내피 세포 및 면역 세포에 상응하는 4가지 주요 별개의 집단을 밝혀냈다 (도 4c-d). 이러한 모든 세포 유형은 이전에 신장 섬유증의 잠재적인 세포 기원으로서 논의되었다 (Duffield et al. 2014; Wang et al. 2017; Kramann et al. 2018). 참고로, 본 발명자들은 이러한 PDGFRa+/PDGFRb+ 데이터에서 임의의 미분화 혈관주위세포를 검출하지 못하였는데, 이는 혈관주위세포가 인간과 마우스에서 PDGFRa-이기 때문이다 (도 2e, 3g). 비-중간엽 세포는 중간엽 세포보다 현저하게 더 낮은 PDGFRb, PDGFRa, ECM 및 콜라겐 수준을 발현하였으며 (도 4d-e), 이는 비-중간엽 세포가 흉터 형성 프로세스에 미미한 기여를 한다는 본 발명자들의 인간 데이터에서의 관찰 내용을 뒷받침해준다 (도 1, 2). 참고로, 인간 데이터에서와 같이, 계산적으로 유래된 더블렛 점수는 이러한 매트릭스를 발현하는 비-중간엽 세포 집단이 더블렛일 가능성이 있음을 시사하지 않는다.

감독되지 않은 클러스터링은 이러한 마우스 PDGFRa+/PDGFRb+ 데이터 세트 (1) Scara5 및 Meg3 발현으로써 표시된 섬유모세포 1 및 (2) 다양한 근섬유모세포 하위집단으로 이루어진 근섬유모세포에서 중간엽 세포 내의 2가지 주요 클래스를 밝혀냈다 (도 4c-d). 본 발명자들의 인간 데이터에서, 근섬유모세포 1은 근섬유모세포 2 (Ogn+)에 의한 분화 의사 시간에 앞서 가장 높은 ECM 발현을 갖는 말기 분화된 근섬유모세포에 상응하는 반면, 섬유모세포 1은 "전구" 비-활성화된 섬유모세포 집단으로 나타났다 (도 2e). 실제로, 섬유모세포 1 세포는 PDGFRa+/PDGFRb+ 데이터에서 하기 3가지 주요 특색에 의해 근섬유모세포와 구별될 수 있다: 첫째, 마우스에서 근섬유모세포 특이적 콜라겐인 Col15a1 (도 3g)은 근섬유모세포 클러스터보다 섬유모세포 1에서 더 낮은 수준으로 발현되었다 (도 4f). 둘째, Meg3은 근위 세뇨관 세포와 사구체 내피의 특정 분획에서도 발현되긴 하지만, Meg3은 중간엽 집단 내의 섬유모세포 1에서만 검출되었다 (도 4d). 본 발명자들은 계내 혼성화에 의해 인간 신장에서 Meg3+ PDGFRa+/PDGFRb+ 중간엽 하위집단의 존재를 검증했으며 (도 4h-i), 이는 인간 신장에서의 섬유모세포 1-유사 하위집단의 존재를 시사한다. 셋째, 섬유모세포 1 세포는 Scara5+이지만 Frzb-이며, 이는 이들이 근섬유모세포와 뚜렷이 구별된다는 것을 다시 명확하게 보여준다.

섬유모세포 1을 별개의 섬유모세포 집단으로서 확립한 후, 본 발명자들은 UMAP 및 확산 맵 임베딩을 생성하고 모든 마우스 Pdgfra+/Pdgfrb+ 중간엽 세포의 의사 시간 분석을 수행하여 계통 관계에 대한 통찰력을 획득하였다 (도 4j). 이러한 분석은 섬유모세포 1 (Meg3+, Scara5+)과 근섬유모세포 2 (Col14a1+, Ogn+)를 초기 상태로서, 근섬유모세포 3a를 중간 상태로서, 근섬유모세포 1a (Nrp3+, Nkd2+), 1b (Grem2+) 및 3b (Frzb+)를 말기 상태로서 제안하였다 (도 4j).

이러한 데이터는 섬유모세포 1과 근섬유모세포 2가 마우스 신장 섬유증에서 근섬유모세포의 주요 공급원임을 시사한다. 근섬유모세포 2 (Ogn+/Col14a1+)는 건강한 마우스 신장에 존재할 수 있거나 또는 혈관주위세포가 근섬유모세포로 분화되는 것으로 인해 중간 상태로서 발생할 수 있다 (도 2e, 인간 데이터). 안지오텐신 수용체 1 (AGTR1a) 발현은 근섬유모세포 2에서 증강되며 그들의 혈관주위세포 기원을 가리킬 수 있다 (도 4j).

시간 경과에 따른 UUO 데이터의 분석은 Ogn, Scara5 및 Pcolce2가 항상성이 증강되었다는 것을 보여주는 반면, 네이키드 큐티클 상동체 2 (Nkd2)는 손상 후에 증강된다. 이는 섬유모세포 1 (Meg3+, Scara5+) 및 근섬유모세포 2 (Ogn+)가 신장 항상성에 존재하는 세포임을 시사한다. 또한, 본 발명자들의 인간 Pdgfrb+ 세포를 참조로서 사용하여 마우스 Pdgfra+/Pdgfrb+ 단일 세포 데이터의 감독된 분류는 섬유모세포 1과 근섬유모세포의 뚜렷한 정체성을 두 종 모두에서 공통적인 특색으로서 확인시켜 준다.

전반적으로, 본 발명자들의 종합적이고 포괄적인 인간 및 마우스 데이터는 Pdgfrb+/Pdgfra+/Postn+ 높은 ECM 발현 근섬유모세포 (본원 전체에서 근섬유모세포 1이라고 함)가 Pdgfrb+/Pdgfra-/Notch3+ 혈관주위세포, Pdgfrb+/Pdgfra+/Scara5+ 섬유모세포 (섬유모세포 1) 및 Pdgfrb+/Pdgfra+/Cxcl12+ 섬유모세포 (섬유모세포 2)로부터 발생하는 모델을 제안한다. 혈관주위세포는 중간 ECM 발현 Pdgfrb+/Pdgfra+/Ogn+/Col14a1+ (근섬유모세포 2) 상태를 통해 근섬유모세포 1로 잠재적으로 분화된다.

실시예 7: 뚜렷한 섬유모세포 및 근섬유모세포 세포 상태는 특이적 전사 인자 조절 프로그램에 의해 구별된다

다음으로, 본 발명자들은 본 발명자들의 데이터에서 검출된 섬유모세포 및 근섬유모세포 세포 상태가 진정으로 별개의 세포 유형을 나타내는지 여부를 확인하고자 하였다. 별개의 세포 유형은 별개의 유전자 발현 프로파일과 별개의 전사 인자 조절 프로그램 둘 다에 의해 구별될 것이다 (Gerstein et al. 2012). 본 발명자들은 UUO 수술 후 10일에 Pdgfra+/Pdgfrb+ 마우스 신장 세포로부터 벌크 ATAC-Seq (문헌 [Buenrostro et al. 2013]) 데이터를 생성하였고, scRNA-Seq 클러스터에서 확인된 마커 유전자에 대한 OCR 근접성을 기반으로 ATAC-Seq 데이터로부터 열린 염색질 영역 (OCR) 시그니처를 디컨볼루션하였다. 섬유모세포 1과 근섬유모세포 2는 서로 뚜렷이 구별되고 다른 근섬유모세포 집단과도 구별되었다. 근섬유모세포 1a는 근섬유모세포 1b와 뚜렷이 구별되었고 ATF의 증강을 특징으로 하였다. 근섬유모세포 2 및 3b는 이전에 TGFb 신호전달 및 섬유증의 중요한 조절인자로서 보고된 희귀 수용체 NRF4A1의 증강을 보여주었다 (Palumbo-Zerr et al. 2015). 섬유모세포 1은 AP-1 (Jun/Fos) 모티프의 증강 (도 4k)을 보여주었으며, 이는 본 발명자들의 인간 데이터에 설명된 추정 역할과 일치한다. 이러한 ATAC-Seq 선택 인자의 RNA 발현은 서열 모티프 증강 (도 4k)과 일치하며 섬유모세포 1, 근섬유모세포 2 및 다른 근섬유모세포 집단 간의 다양한 전사 조절을 강조한다. 본 발명자들은 Nrf1, Irf8 및 Creb5를 포함한 신장 섬유증과 관련하여 과소평가될 수 있는 전사 인자를 추가로 강조한다. 본 발명자들의 ATAC-Seq 데이터와 일치하는, scRNA-Seq 데이터를 기반으로 한 신호전달 경로 분석은 섬유모세포 1과 근섬유모세포가 상이한 증강 경로를 가진 별개의 집단임을 나타내었다 (도 4l). 따라서, 섬유모세포 1 및 근섬유모세포 하위유형은 특이적 전사 인자 조절 프로그램을 정착시킨, 별개의 ECM 발현 중간엽 세포 유형일 가능성이 높다.

실시예 8: Nkd2는 인간 신장 PDGFRb + 세포에서 콜라겐 발현에 필요하며 신장 섬유증에서 잠재적인 치료 표적이다

다음으로, 본 발명자들은 본 발명자들이 생성한 scRNA-seq 데이터가 인간 신장 섬유증에서 잠재적인 치료 표적을 확인하는 데 사용될 수 있었는지 여부를 물었다. Nkd2는 마우스 Pdgfra+/Pdgfrb+ 말기 분화된 근섬유모세포에서 특이적으로 발현되므로 (도 5a), Nkd2/PDGFRa 이중 양성 세포가 모든 Col1a1+ 세포의 >40%를 구성하였다 (도 5b). 인간 PDGFRb+ 세포에서, NKD2는 그것의 발현이 Postn 및 ECM 발현과 양의 상관관계가 있고 혈관주위세포 및 섬유모세포와 연관된 유전자와 상관관계가 없는 높은 ECM 근섬유모세포의 마커이다 (도 5c). 또한, NKD2+ 근섬유모세포는 NKD2- 세포와 비교하여 증가된 TGFb, Wnt 및 TNFa 경로 활성과 연관이 있었다. 본 발명자들은 36명의 환자의 인간 신장 조직 마이크로어레이 (TMA)에서 다중화 ISH로써 NKD2 발현을 검증하였으며, 이는 인간 PDGFRa/PDGFRb 발현 세포의 하위집단이 또한 Nkd2를 발현한다는 것을 확인시켜 주었다 (도 5d-e). 또한, PDGFRa/PDGFRb/Nkd2 공동 발현 세포의 존재비는 간질 섬유증이 더 두드러진 환자에서 더 높았다 (도 5e).

Nkd2는 Wnt 경로 및 TNFa 조정인자로서 문서화되었다 (Zhao et al. 2015; Hu and Li 2010; Hu et al. 2010; Li et al. 2004). Nkd2가 신장 섬유증을 조절하는 메커니즘을 이해하기 위해, 본 발명자들은 GRNboost2 프레임워크를 사용하여 Nkd2와 상관된 유전자에 초점을 맞춘 유전자 조절 네트워크를 예측하기 위해 본 발명자들의 인간 PDGFRb+ 데이터를 사용하였다. 그 결과로 생성된 네트워크는 리보솜 단백질 (모듈 1), ECM 발현과 관련된 유전자 (모듈 2), 혈관주위세포와 관련된 유전자 (모듈 3) 및 비-활성화된 섬유모세포와 관련된 유전자 (모듈 4)를 포함한 4개의 유전자 조절 모듈로 클러스터링되었다. 참고로, 이러한 유전자 클러스터는 Nkd2 외에도 다양한 Wnt 조정인자 및 이펙터, 예컨대 Kif26b, Lef1 및 Wnt4를 포함하였다. Nkd2는 ECM 유전자와 함께 배치되어 Etv1 및 Lamp5에 연결되고, Lamp5를 통해 Col1a1에 간접적으로 연결된다. 이러한 분석은 Nkd2가 Etv1 (Ets 인자 패밀리의 한 구성원)에 의해 조절되고 Lamp5를 통해 측분비 신호전달에 영향을 미침으로써 작용하는 잠재적인 메커니즘을 제시할 수 있다.

본 발명자들의 인간 PDGFRb 세포주에서의 Nkd2의 렌티바이러스 과다발현은 TGFb에 대한 반응으로 col1a1 및 피브로넥틴과 같은 핵심 섬유증 유발성 ECM 분자의 발현을 증가시켰다 (도 5f-g). 중요하게도, Nkd2의 CRISPR/Cas9 녹아웃은 TGFb의 존재 또는 부재 하에 col1a1, 피브로넥틴 및 ACTA2 발현의 현저한 감소를 초래하였다 (도 5h-i). Nkd2를 과다발현하는 세포로부터의 RNA-seq는 ECM 조절인자와 ECM 당단백질의 상향 조절을 입증한 반면, Nkd2 녹아웃 클론의 RNA-seq는 ECM 조절인자, ECM 당단백질 및 콜라겐의 손실을 나타냈다 (도 5j). 경로 및 유전자 온톨로지 분석은 ECM 발현 프로그램에서의 Nkd2의 역할을 입증했으며 AP1 및 인테그린 신호전달 경로와의 추가 상호작용을 제안하였다 (도 5k). 본 발명자들은 추가로 시험관내 Nkd2 녹아웃 후 Wnt 수용체와 리간드의 발현에서 강한 변화를 관찰하여, 이러한 경로에 잠재적인 관여를 확인하였다.

Nkd2를 치료 표적으로서 추가로 검증하기 위해, 본 발명자들은 인간 신장의 모든 주요 구획을 함유하는 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC) 유래 신장 오가노이드를 생성하였다. IL1b는 iPSC 유래 신장 오가노이드에서 섬유증을 유발하는 것으로 널리 확립되어 있다 (Lemos et al. 2018). 중요하게도, Nkd2의 siRNA 매개 녹다운은 신장 오가노이드에서 IL1b-유발된 Col1a1 발현을 억제하였다 (도 5l-o). 이러한 데이터는 Nkd2가 인간 및 마우스 신장 섬유증에서 근섬유모세포를 표시하고, 신장 근섬유모세포 콜라겐 발현에 필요하므로, 신장 섬유증 환자를 치료하기 위한 유망한 잠재적 치료 표적임을 확인시켜 준다.

실시예 9: NDK2 단백질과 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제에 대한 스크리닝

스크리닝 실험을 통해 NKD2 단백질과 결합하고/거나 그의 활성을 억제하는 소분자 치료 화합물, 펩티드 및/또는 생물제제를 확인하고 검증할 수 있다.

DNA-바코딩된 화합물 라이브러리는 기재된 바와 같이 생성되고 스크리닝된다 (Kunig et al. 2018). 이를 위해, His 태그를 수반하는 재조합 NKD2 단백질, 또는 그의 단편은 이. 콜라이(E. coli), 곤충 세포 또는 포유동물 세포에서 발현된다. 정제된 NKD2 단백질은 화합물 라이브러리와 함께 인큐베이션되고 면역 침전에 의해 단리된다. NKD2 단백질과 결합된 화합물은 DNA 바코드의 생거 시퀀싱을 통해 확인된다. 이와 같이 확인된 화합물은 이어서 NKD2의 기능, 근섬유모세포의 분화, 매트릭스 단백질, 예컨대 예를 들어 콜라겐 1의 발현 및 분비, 및 신장 섬유증의 발병에 대한 효과에 관하여 시험된다. 이를 위해, 신장 섬유증의 실험용 마우스 생체내 모델을 이용한다.

nkd2 발현에 영향을 미치는 소분자 치료 화합물, 펩티드 및/또는 생물제제의 확인 및 검증을 위해, 예를 들어 eGFP NKD2 융합 단백질 발현 또는 루시페라제 기반 리포터 시스템을 사용하여 시험관내 인간 세포 기반 형광색소 리포터 시스템이, 판독값으로서 eGFP 형광 또는 루시페라제 수준을 감소시키는 화합물을 확인하기 위해 384-웰 내지 1,536-웰 형식 검정에서 화합물 라이브러리를 스크리닝하기 위해 확립된다. 상기 세포에서 이러한 인간 NKD2 융합 리포터 구축물의 발현은, 예를 들어, 형질감염 및 내성 유전자 카세트를 통한 선택에 의해, 또는 바이러스 형질도입에 의해 수행될 수 있다. 이러한 검정을 위해, 예를 들어 293T 세포와 같은 인간 세포주 뿐만 아니라 확립된 인간 신장 근섬유모세포 세포주가 이용된다. 이러한 스크리닝과 병행하여, 비특이적 독성 또는 아폽토시스의 촉발로 인해 리포터 형광 또는 활성에 영향을 미치는 화합물을 배제하기 위해 세포독성 검정을 수행한다.

SEQUENCE LISTING <110> Rheinisch-Westf채lische Technische Hochschule (RWTH) Aachen <120> NKD2-Protein, human <130> RD42326 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 451 <212> PRT <213> NKD2-Protein, human <220> <223> NKD2-Protein, human <400> 1 Met Gly Lys Leu Gln Ser Lys His Ala Ala Ala Ala Arg Lys Arg Arg 1 5 10 15 Glu Ser Pro Glu Gly Asp Ser Phe Val Ala Ser Ala Tyr Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Lys Gly Ala Glu Glu Ala Glu Arg Arg Ala Arg Asp Lys Gln Glu 35 40 45 Leu Pro Asn Gly Asp Pro Lys Glu Gly Pro Phe Arg Glu Asp Gln Cys 50 55 60 Pro Leu Gln Val Ala Leu Pro Ala Glu Lys Ala Glu Gly Arg Glu His 65 70 75 80 Pro Gly Gln Leu Leu Ser Ala Asp Asp Gly Glu Arg Ala Ala Asn Arg 85 90 95 Glu Gly Pro Arg Gly Pro Gly Gly Gln Arg Leu Asn Ile Asp Ala Leu 100 105 110 Gln Cys Asp Val Ser Val Glu Glu Asp Asp Arg Gln Glu Trp Thr Phe 115 120 125 Thr Leu Tyr Asp Phe Asp Asn Cys Gly Lys Val Thr Arg Glu Asp Met 130 135 140 Ser Ser Leu Met His Thr Ile Tyr Glu Val Val Asp Ala Ser Val Asn 145 150 155 160 His Ser Ser Gly Ser Ser Lys Thr Leu Arg Val Lys Leu Thr Val Ser 165 170 175 Pro Glu Pro Ser Ser Lys Arg Lys Glu Gly Pro Pro Ala Gly Gln Asp 180 185 190 Arg Glu Pro Thr Arg Cys Arg Met Glu Gly Glu Leu Ala Glu Glu Pro 195 200 205 Arg Val Ala Asp Arg Arg Leu Ser Ala His Val Arg Arg Pro Ser Thr 210 215 220 Asp Pro Gln Pro Cys Ser Glu Arg Gly Pro Tyr Cys Val Asp Glu Asn 225 230 235 240 Thr Glu Arg Arg Asn His Tyr Leu Asp Leu Ala Gly Ile Glu Asn Tyr 245 250 255 Thr Ser Arg Phe Gly Pro Gly Ser Pro Pro Val Gln Ala Lys Gln Glu 260 265 270 Pro Gln Gly Arg Ala Ser His Leu Gln Ala Arg Ser Arg Ser Gln Glu 275 280 285 Pro Asp Thr His Ala Val His His Arg Arg Ser Gln Val Leu Val Glu 290 295 300 His Val Val Pro Ala Ser Glu Pro Ala Ala Arg Ala Leu Asp Thr Gln 305 310 315 320 Pro Arg Pro Lys Gly Pro Glu Lys Gln Phe Leu Lys Ser Pro Lys Gly 325 330 335 Ser Gly Lys Pro Pro Gly Val Pro Ala Ser Ser Lys Ser Gly Lys Ala 340 345 350 Phe Ser Tyr Tyr Leu Pro Ala Val Leu Pro Pro Gln Ala Pro Gln Asp 355 360 365 Gly His His Leu Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Gly His Lys Arg 370 375 380 Tyr Arg Gln Lys Gly Arg Glu Gly His Ser Pro Leu Lys Ala Pro His 385 390 395 400 Ala Gln Pro Ala Thr Val Glu His Glu Val Val Arg Asp Leu Pro Pro 405 410 415 Thr Pro Ala Gly Glu Gly Tyr Ala Val Pro Val Ile Gln Arg His Glu 420 425 430 His His His His His Glu His His His His His His His His His Phe 435 440 445 His Pro Ser 450

Claims (29)

1. 주어진 세포에 의한 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 발현 및/또는 분비를 감소시키는 방법으로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 단계를 포함하는 방법:
   (i) 상기 세포에서 nkd2 유전자 발현을 억제하거나 또는 감소시키는 단계,
   (ii) 상기 세포에서 NKD2 단백질의 분해를 촉진시키는 단계, 및/또는
   (iii) 상기 세포에서 NKD2 단백질 활성을 억제하거나 또는 감소시키는 단계.
2. 제1항에 있어서, nkd2 유전자 발현의 억제 또는 감소가 nkd2 유전자 녹다운, 녹아웃, 조건부 유전자 녹아웃, 유전자 변경, RNA 간섭, siRNA 및/또는 안티센스 RNA에 의해 달성되는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, NKD2 단백질 활성의 억제 또는 감소가 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하는 작용제의 사용에 의해 달성되는 것인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 신장 세포, 바람직하게는 신장 근섬유모세포, 가장 바람직하게는 말기 분화된 신장 근섬유모세포인 방법.
5. 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질, 또는 그의 단편과 결합하는 작용제의 확인을 위한 방법.
6. 제5항에 있어서, 적어도 하기 단계를 포함하는 방법:
   (i) NKD2 단백질, 또는 그의 단편을 제공하는 단계,
   (ii) NKD2 단백질, 또는 그의 단편에 대한 결합에 관하여 스크리닝될 적어도 하나의 작용제를 부가하는 단계, 및
   (iii) NKD2 단백질, 또는 그의 단편과 결합된 적어도 하나의 작용제를 확인하는 단계.
7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 작용제가 NKD2 억제제인 방법.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 소분자 화합물, 펩티드, 및 생물제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 생물제제가 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 항원-결합 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 압타머인 방법.
10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, NKD2 단백질이 고체 상에 결합되어 있거나 또는 용액 내에 있는 것인 방법.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 화합물 라이브러리의 구성원인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 화합물 라이브러리가 각각 소분자 화합물, 펩티드, 또는 생물학적 화합물을 포함하는 것인 방법.
13. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른, NKD2, 또는 그의 단편과 결합하는 작용제의 확인을 위한 방법에서의 네이키드 큐티클 상동체 2, 또는 그의 단편, 또는 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질, 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산의 용도.
14. NKD2 단백질과 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질.
15. 제14항에 있어서, 상기 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질이 NKD2 활성을 억제하는 것인 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질.
16. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 작용제.
17. 제16항에 있어서, 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한 작용제.
18. 만성 신장 질환의 치료에 사용하기 위한, 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하는 작용제.
19. 제18항에 있어서, 상기 작용제가, NKD2와 결합될 때, NKD2 활성을 억제하는 것인 작용제.
20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 만성 신장 질환이 진행성 만성 신장 질환 및/또는 신장 섬유증인 작용제.
21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제가 소분자 화합물 (smol), 펩티드, 또는 생물제제이며, 바람직하게는 여기서 상기 생물제제는 항체, 또는 그의 단편 또는 그의 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 압타머인 작용제.
22. 만성 신장 질환을 치료하는 방법에서의 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하는 작용제의 용도로서, 바람직하게는 여기서 만성 신장 질환은 진행성 만성 신장 질환 및/또는 신장 섬유증인 용도.
23. 제22항에 있어서, 상기 작용제가, NKD2와 결합될 때, NKD2 활성을 억제하는 것인 작용제의 용도.
24. 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하고/거나 이를 억제하는 작용제를 치료상 유효 용량으로 인간 또는 동물 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 만성 신장 질환을 치료하거나 또는 예방하는 방법.
25. 제14항 또는 제15항에 따른 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 작용제, 및 임의로 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
26. 제25항에 있어서, 상기 부형제가 제약상 허용되는 완충제, 계면활성제, 희석제, 담체, 부형제, 충전제, 결합제, 윤활제, 활택제, 붕해제, 흡착제, 및/또는 보존제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
27. 하기를 포함하는, 제약 조성물의 제조 방법:
    (i) 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법, 및 또한
    (ii) 확인된 작용제를 제약상 허용되는 담체와 혼합하는 것.
28. (i) 제14항 또는 제15항에 따른 항체, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 또는 항체-유사 단백질, 또는 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 네이키드 큐티클 상동체 2 (NKD2) 단백질과 결합하는 작용제, 또는 제25항 또는 제26항에 따른 제약 조성물, 및 (ii) 하나 이상의 추가의 치료상 활성 화합물의 조합을 포함하는 조성물.
29. 하기를 포함하는 부분들의 치료 키트:
    (i) 제25항, 제26항 및 제28항 중 어느 한 항에 따른 제약 조성물,
    (ii) 조성물을 투여하기 위한 디바이스, 및
    (iii) 임의로 사용 설명서.

Images