WO2022090434A1 - Nkd2 als target zur behandlung von nierenfibrose - Google Patents

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WO2022090434A1
WO2022090434A1 PCT/EP2021/080068 EP2021080068W WO2022090434A1 WO 2022090434 A1 WO2022090434 A1 WO 2022090434A1 EP 2021080068 W EP2021080068 W EP 2021080068W WO 2022090434 A1 WO2022090434 A1 WO 2022090434A1
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cell
antibody
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Rafael Johannes Thomas KRAMANN
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Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (Rwth) Aachen
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Definitions

  • NKD2 AS A TARGET FOR THE TREATMENT OF KIDNEY FIBROSIS
  • the present invention relates to the role of the Nkd2 protein (Naked Cuticle Homolog 2) in the development of chronic kidney disease, in particular progressive chronic kidney disease and kidney fibrosis.
  • the present invention relates to methods for identifying compounds that bind to the Nkd2 protein and to the use of Nkd2 to screen and identify Nkd2-interacting compounds.
  • the invention further relates to pharmaceutical compositions for use in the treatment of kidney disease, in particular pharmaceutical compositions comprising agents which bind to and/or inhibit Nkd2 protein.
  • Chronic kidney disease affects more than 10% of the world's population and its prevalence is increasing. Regardless of the initial type of damage, the final common course of kidney damage is renal fibrosis. Renal fibrosis is the hallmark of chronic kidney disease progression, but antifibrotic therapies are currently lacking. The extent of renal fibrosis is inextricably linked to the loss of renal function and the clinical course of CKD, which is why renal fibrosis is considered an important therapeutic target in CKD.
  • There are no approved therapies for the treatment of renal fibrosis mainly because the cellular origin, the functional heterogeneity and the regulation of the scar-forming cells in the human kidney are still unclear and a large Provide the source of the discussion in this area (Duffield 2014; Falke et al. 2015).
  • the only treatment options are continuous kidney replacement therapy (dialysis) and kidney transplantation. Both options are associated with high personal inconveniences for the patient and also represent a high economic burden for the national health systems. Therefore, novel therapeutic approaches are very desirable.
  • Renal fibrosis is defined by excessive deposition of extracellular matrix that disrupts and replaces the functional parenchyma, leading to organ failure.
  • the histological structure of the kidney can be divided into three main compartments, all of which can be affected by fibrosis, specifically termed glomerulosclerosis in the glomeruli, interstitial fibrosis in the tubulointerstitium, and atherosclerosis and perivascular fibrosis in the vasculature (Djudjai and Boor 2019).
  • Renal fibrosis is characterized by high expression, secretion, and accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins such as collagen-1.
  • ECM extracellular matrix
  • Myofibroblasts represent the main source of ECM during renal fibrosis, although their cellular origin remains controversial (Duffield 2014; Friedman et al 2013; Kriz et al 2011; Kramann and DiRocco 2013). Sequencing and mapping of single-cell RNA enables the dissection of the cellular heterogeneity of complex tissues and disease processes and provides new insights into disease-mediating cell populations and mechanisms (Ramachandran et al 2019; Dobie and Henderson 2019).
  • the object on which the present invention is based is to provide methods and means for identifying active substances, compounds and compositions, and the said active substances, compounds and compositions for use in the treatment of chronic kidney diseases.
  • the present invention provides methods and means for identifying drugs, compounds and compositions for use in the treatment of chronic kidney disease, particularly for identifying potent drugs, compounds and compositions for use in the treatment of progressive chronic kidney disease and renal fibrosis.
  • the inventors found that the naked cuticle homolog 2 (NKD2) protein is produced in terminally differentiated myofibroblasts involved in renal fibrosis, but not in cells expressing marker proteins for pericytes and fibroblasts and only at low levels express extracellular matrix protein. It was also found that Nkd2-expressing cells have an increased activity of pro-fibrotic signal transduction pathways. The inventors further found that a reduction in fibrosis can be achieved by deleting the Nkd2 gene or knocking down Nkd2 expression, thereby identifying the gene as relevant to extracellular matrix production and fibrosis.
  • Nkd2 naked cuticle homolog 2
  • Nkd2 as a new target and thus a new therapeutic approach for the development of therapeutics that inhibit Nkd2 gene expression and/or NKD2 protein activity using small molecular weight drugs (Smols), peptides or biologicals.
  • Smols small molecular weight drugs
  • ECM extracellular matrix
  • a further object of the present invention was to provide a method for identifying an active substance which binds to and/or inhibits the Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) protein or a fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide pharmaceutical compositions containing these agents and processes for preparing such pharmaceutical compositions based on the findings described above.
  • FIG. 1 Schematic representation of the nephron structure and the associated cell types
  • neuronal nal cells
  • the creation and representation of the interaction network was made using the ggraph R package software (https://cran.r-proiect.org/web/packages/ggraph/index.html), i. Scaled representation of the gene expression of the top 10 specific genes in each cell type/cell cluster.
  • the gene ranking per cluster was created using genesortR.
  • Cell clusters are shown in columns and genes as rows. Each column contains the average expression of all cells within a cluster.
  • Figure ld_l shows expressions of genes that are overexpressed.
  • Figure ld_2 shows genes with a depleted/reduced gene expression, e.
  • CKD chronic kidney disease
  • eGFR calculated glomerular filtration rate
  • f UMAP representation of 31,875 CD 10+ (CD 10+) single cell transcriptomes stratified according to the clinical parameters of the patients, g. Log-fold change in cell cycle stage in epithelial cells from healthy subjects and patients with CKD plotted against a random distribution model. Positive numbers represent gain, negative numbers represent depletion, h.
  • ECM extracellular matrix, CD 10 cells
  • j Violin blot representation of the ECM score stratified according to the cell type and the distinction between healthy and CKD in CD10 cells. P-values of differences in the eGFR categories: mesenchymal cells (p ⁇ 0.001), immune cells (p ⁇ 0.001), epithelial cells (p ⁇ 0.001), endothelial cells (p ⁇ 0.001).
  • k Violin blot representation of the ECM score for mesenchymal cells stratified according to the cell type and the distinction between healthy and CKD.
  • fibroblast 1 (Fibl), fibroblast 2 (Fib2), fibroblast 3 (Fib3), pericytes (Pe), vascular smooth muscle cells (VSMCs), mesangial cells (mesa) , myofibroblast 1 (MF1), myofibroblast 2 (MF2), myofibroblast 3 (MF3), mesangial cells (mesa), macrophage 1 (MCI), macrophage 2 (MC2), dendritic cells (DC), arteriolar endothelial cells (art), glomerular endothelial cells (GC), vasa recta (VR), inflamed endothelium (iEn), proximal tubular cells (PT), inflamed proximal tubular cells (iPT), intercalating cells (IC), collecting duct principal cells (PC), thick ascending portion of loop of Henle (TAL) b.
  • fibroblast 1 (Fibl), fibroblast 2 (Fib2), fibroblast 3 (Fib3), pericytes (P
  • Top left Gene expression dynamics for overexpression over a pseudo timeline for lineage 1 (pericytes to myofibroblasts, see e.). Cells (in columns) were arranged along the pseudo-time axis. Genes (in rows) that correlate with pseudotime were selected and blotted along the pseudotime (see Methods). Each column contains the mean of 10 cells. Genes were grouped into 7 groups according to their pseudo-time expression pattern. Selected example genes are listed. Bottom left: Representation corresponding to top left, however, reduced gene expressions are shown. Top right: Cell cycle phases as a percentage of each 2000 cells are shown as a function of pseudotime. Bottom right: amplification of the PID signal cascade depending on the pseudo time.
  • FIG. 3 a. Top: Fate tracing experiment design. Bottom: Representation of the PDGFRbCreER-tdTomato positive cells in the mouse kidney in the model of UUO (unilateral ureteral obstruction) and in the control operated mouse (SHAM). Above: detection of PDGFRß-tdtom and DAPI; middle: detection of PDGFRß-tdtom; Bottom: Evidence of DAPI b. Representative image of a Collal in-situ hybridization of a PDGFRbCreER;tdTomato kidney after UUO surgery.
  • RNA in situ hybridization shows co-localization of Coll aI expression in PDGFRa/PDGFRb double positive cells.
  • Collal/PDFGRa/PDFRb triple-positive cells (arrows) are sporadically detectable in the interstitium of the kidney.
  • Left Collal expression and ECM score in CD 10 negative cells ( Figure Ib-c) stratified according to PDGFRa and PDGFRb expression.
  • TMA trichrome-stained human kidney tissue array
  • DAPI nuclear staining
  • fibroblast 1 Fibl
  • myofibroblast 1 MF1
  • myofibroblast 2 MF2
  • myofibroblast 3 MF3
  • endothelial cells EC
  • inflamed proximal tubular cells iPT
  • undetermined mesenchymal cells uM
  • macrophages/monocytes MC
  • Figure 5 a. Expression of Nkd2 shown as UMAP from Figure 4c. (murine Pdgfra/b double positive cells), b. Percent of Collal positive and negative cells (data see a) stratified according to Pdgfra and Nkd2 expression. Collal-negative cells are mostly PDGFRa/Nkd2 double-negative cells, while Collal-positive cells are mostly also PDGFRa/Nkd2 double-positive. c. Scaled gene expression of genes whose expression correlates positively (Figure 5c_l) or negatively (Figure 5c_2) to Nkd2 expression in human PDGFRb cells, shown in Figure 2 ac. d.
  • a HA tag was attached to the exogenously overexpressed protein, g. Expression of Collal, Fibronectin (Fn) and Acta2 (aSMA) quantified by qPCR after Nkd2 overexpression in human immortalized PDGFRb+ cells treated with transforming growth factor beta (TGFb) or vehicle (PBS), h. Verification of the Nkd2 knock-out using Western blot analysis in multiple single cell clones (1,2,3) compared to non-targeting gRNA clones (NTG). The Nkd2 protein expression is completely deleted in clone 2 due to a large insert, while in clones l and 3 only reduced Nkd2 protein expression is caused by smaller indel j.
  • GSEA Gene set enrichment analysis of ECM genes in Nkd2-dysregulated PDGFRb kidney cells. "Shallow” was detected in clones 1+3, in which the NKD2 protein is still detectable. "Severe” was detected in clone 2, k. Change in the strength of the PID signaling cascade in PDGFRb+ NKD2-KO clones and overexpression (up means increased regulation of the genes under the indicated condition and down means down-regulated genes) 1. Representative image of a multiplex RNA in situ hybridization of PDGFRa, PDGFRb and NKD2 in human iPSC-derived kidney organoids.
  • the present invention relates to a method for reducing the expression and/or secretion of extracellular matrix (ECM) proteins by a given cell, the method comprising at least one step selected from the group consisting of
  • nkd2 gene knock-down can be achieved, for example, by nkd2 gene knock-down, knock-out, conditional gene knock-out, gene modification, RNA interference, siRNA and/or antisense RNA.
  • antisense molecules such as antisense oligonucleotides, antisense conjugates or catalytic nucleic acid molecules such as ribozymes. Such molecules can be produced in the cell using expression vectors or introduced into the cell from the outside.
  • the antisense oligonucleotides can be chemically modified in order to increase their stability and/or binding affinity.
  • the chemical modification of the backbone chemistry of antisense oligonucleotides for example, by phosphorothioates, phosphorodithioates. Phosphoroamidites, alkyl phosphotriesters or boranophosphates have been described in the prior art (e.g. WO00/49034A1).
  • NKD2 protein in the cell can be achieved, for example, by proteases or other proteolytic molecules. These can be synthesized heterologously in the cell by means of expression vectors or synthesized to an increased extent in the cell by increasing the homologous gene expression of protease-encoding genes or introduced into the cell from the outside. Inhibition or reduction of NKD2 protein activity can be achieved using an agent that binds to the Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) protein.
  • Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) protein an agent that binds to the Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) protein.
  • the given cell is a kidney cell, more preferably a kidney myofibroblast cell, most preferably a terminally differentiated kidney myofibroblast cell.
  • the NKD2 protein has been shown to be a WNT antagonist.
  • the naked cuticle (NKD) family includes the Drosophila naked cuticle and its two vertebrate orthologues, the naked cuticle homologs 1 (NKD1) and 2 (NKD2).
  • the Nkd2 gene locus is located on chromosome 5p 15.3. Loss of heterozygosity has been found to be common in these regions in various tumor types, including breast cancer.
  • Both NKD1 and NKD2 have been reported to antagonize canonical Wnt signaling by interacting with Disheveled via their EF hand-like motifs (Hu et al 2006).
  • NKD2 has been shown to bind to Disheveled via its TGFa binding region (Li et al. 2004).
  • Human NKD1 and 2 are only 40% identical to each other, while they are about 70% identical to their respective murine orthologues.
  • NKD2 The C-terminus of NKD2 is highly disordered, while the N-terminus of NKD2 contains most of the functional domain, which includes myristoylation, an EF hand motif, a disheveled binding region, and a vesicle recognition and membrane targeting motif (Li et al 2004; Rousset et al 2001; Zeng et al 2000). NKD2 is thought to function as a switch protein through its diverse functional motifs (Hu et al 2006). The promoter region of NKD2 is hypermethylated in glioblastoma cells.
  • Nkd2 was found to be exclusively expressed in terminally differentiated PDGFRa+/PDGFRb+ myofibroblasts, which express high levels of the extracellular matrix protein collagen-1. This and other matrix proteins are produced by myofibroblasts, which predominantly arise through differentiation from fibroblasts and pericytes. More than 40% of all collagen-1-producing cells have been shown to be Nkd2/PDGFRa+. Cells expressing marker proteins for pericytes and fibroblasts and secreting only low levels of matrix proteins lack Nkd2 expression.
  • Nkd2- expressing myofibroblasts demonstrated an increased activity of pro-fibrotic signal transduction pathways such as TGF, Wnt and TNF signal transduction pathways.
  • pro-fibrotic signal transduction pathways such as TGF, Wnt and TNF signal transduction pathways.
  • Nkd2 overexpression and depletion experiments it was shown that Nkd2 is relevant for the production of extracellular matrix proteins. Lentiviral overexpression of Nkd2 in human fibroblasts resulted in increased expression of pro-fibrotic matrix proteins such as collagen-1 and fibronectin after stimulation by the pro-fibrotic factor TGF-. It could be shown that the CRISPR/Cas9-mediated knockout of Nkd2 leads to a significant reduction in the expression of collagen-1, fibronectin and ACTA2. Knock-down of Nkd2 using siRNA in organoids covering all compartments of the human kidney in which fibrotic changes were induced by stimulation with IL1-13 resulted in reduced collagen-1 expression and fibrosis.
  • the NKD2 protein may be mammalian, non-primate, primate, and particularly human NKD2 protein or a fragment thereof.
  • the present invention relates to a method for identifying an active substance which binds to the Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) protein or a fragment thereof.
  • the method can include at least the following steps
  • the agent to be screened and identified according to the present invention is an NKD2 inhibitor or antagonist.
  • the drug according to the present invention can be selected from the group consisting of a low molecular weight compound, a peptide and a biologic.
  • the term “low molecular weight compound”, “small molecule”("smol") or “chemical drug” refers to an organic compound with a low molecular weight ( ⁇ 1,000 daltons), often with a size of the order of 1 nm.
  • Many drugs are small molecules. Such small molecules can regulate a biological process. Small molecules may be able to inhibit a specific function of a protein.
  • the term “small molecule” specifically refers to molecules that bind to specific biological macromolecules and act as an effector by altering the activity or function of a target.
  • acetylsalicylic acid (ASA) is considered a low molecular weight compound, measuring 180 daltons and made up of 21 atoms. Such small molecules often have little ability to elicit an immune response and remain relatively stable over time.
  • biological is preferably an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, or an antigen-binding derivative thereof, or an antibody-like protein, or an aptamer.
  • the agent is a member of a compound library.
  • the compound library can e.g. B. include low molecular weight compounds, peptides or biological compounds.
  • (combinatorial) compound library refers to collections of chemical compounds, small molecules, peptides, or macromolecules such as proteins, in which several different combinations of related chemical, peptide, or biological species are included that are used together in a particular screen -assays or identification steps can be used.
  • the present invention relates to the use of a nucleic acid which encodes the naked cuticle homolog 2 or a fragment thereof or the Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) protein or a fragment thereof, in a method for identifying an agent that binds to NKD2 or a fragment thereof, as described above.
  • the present invention relates to an antibody or an antigen-binding fragment or derivative thereof or an antibody-like protein which specifically binds to the NKD2 protein.
  • the antibody or antigen-binding fragment or derivative thereof or antibody-like protein inhibits NKD2 activity, i.e. acts as an inhibitor or antagonist of NKD2.
  • antibody refers to a protein composed of one or more polypeptide chains encoded by immunoglobulin genes or fragments of immunoglobulin genes or cDNAs derived from them. These immunoglobulin genes include the constant region light chain kappa, lambda and heavy chain alpha, delta, epsilon, gamma and mu genes, as well as any of the many different variable region genes.
  • the basic structural unit of immunoglobulin is usually a tetramer composed of two identical pairs of polypeptide chains, the light chains (L, with a molecular weight of about 25 kDa) and heavy chains (H, with a molecular weight of about 50- 70 kDa).
  • Each heavy chain consists of a heavy chain variable region (abbreviated as VH or VH) and a heavy chain constant region (abbreviated as CH or CH).
  • the heavy chain constant region consists of three domains, namely CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain contains a light chain variable region (abbreviated as VL or VL) and a light chain constant region (abbreviated as CL or CL).
  • VH and VL regions can be further subdivided into regions of hypervariability, also termed complementarity determining regions (CDR), interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR).
  • CDR complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • Each VH and VL region consists of three CDRs and four FRs arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the order FR1, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 are.
  • the heavy and light chain variable regions form a binding domain that interacts with an antigen.
  • the CDRs are most important for the binding of the antibody or the antigen-binding part of it.
  • the FRs can be replaced with other sequences as long as the three-dimensional structure required for binding of the antigen is preserved. Structural changes in the construct usually lead to a loss of sufficient binding to the antigen.
  • antigen-binding portion of antibody refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to the antigen in its native form.
  • antigen-binding portions of the antibody include an Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CHI domains, an F(ab')2 fragment, a bivalent fragment consisting of two Fab comprises fragments linked by a disulfide bond at the hinge region, an Fd fragment consisting of the VH and CHI domains, an Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, and a dAb fragment consisting of a VH domain and an isolated complementarity determining region (CDR).
  • CDR complementarity determining region
  • the antibody, antibody fragment or antibody derivative thereof according to the present invention may be a monoclonal antibody.
  • the antibody can be of the isotype IgA, IgD, IgE, IgG or IgM.
  • mAb monoclonal antibody
  • mAb refers to an antibody composition having a homogeneous antibody population, i.e. a homogeneous population consisting of whole immunoglobulin or a fragment or derivative thereof.
  • a homogeneous antibody population i.e. a homogeneous population consisting of whole immunoglobulin or a fragment or derivative thereof.
  • Such an antibody is particularly preferably selected from the group consisting of IgG, IgD, IgE, IgA and/or IgM, or a fragment or derivative thereof.
  • fragment refers to fragments of such an antibody that retain target binding capacities, e.g. B. a CDR (complementarity determining region), a hypervariable region, a variable domain (Fv), an IgG heavy chain (consisting of VH, CHI, hinge, CH2 and CH3 regions), an IgG light chain (consisting of VL and CL regions) and/or a Fab and /or F(ab)2.
  • CDR complementarity determining region
  • Fv variable domain
  • IgG heavy chain consististing of VH, CHI, hinge, CH2 and CH3 regions
  • IgG light chain consististing of VL and CL regions
  • derivative refers to protein constructs that are structurally different from, but still share some structural relationship with, the current antibody concept, e.g. B. scFv, Fab and / or F (ab) 2, as well as to bi-, tri- or higher specific antibody constructs. All of these elements are explained below.
  • antibody derivatives known to those skilled in the art are diabodies, camelid antibodies, domain antibodies, bivalent homodimers with two chains consisting of scFvs, IgAs (two IgG structures linked by a J chain and a secretory component), shark Antibodies, antibodies consisting of New World primate framework plus non-New World primate CDR, dimerized constructs comprising CH3+VL+VH, other framework protein formats comprising CDRs, and antibody conjugates.
  • antibody-like protein refers to a protein that has been engineered (e.g., by mutagenesis of Ig loops) to specifically bind to a target molecule.
  • an antibody-like protein comprises at least one variable peptide loop linked to a protein backbone at both ends. This dual structural constraint increases the binding affinity of the antibody-like protein to a level comparable to that of an antibody.
  • the length of the variable peptide loop typically consists of 10 to 20 amino acids.
  • the scaffold protein can be any protein with good solubility properties.
  • the scaffold protein is a small globular protein.
  • Antibody-like proteins include, without limitation, affibodies, anticalins, and designed ankyrin proteins and affilin proteins.
  • Antibody-like proteins can be derived from large libraries of mutants, e.g. B. by panning from large phage display libraries, and can be isolated in analogy to regular antibodies. Also, antibody-like binding proteins can be obtained by combinatorial mutagenesis of surface-exposed residues in globular proteins.
  • Fab refers to an IgG fragment comprising the antigen-binding region, which fragment is composed of a constant and a variable domain from each heavy and light chain of the antibody.
  • F(ab)2 refers to an IgG fragment consisting of two Fab fragments linked by disulfide bonds.
  • scFv refers to a single chain variable fragment that is a fusion of the variable regions of immunoglobulin heavy and light chains joined by a short linker, usually serine (S) and/or glycine (G) residues included. This chimeric molecule retains the specificity of the original immunoglobulin despite the removal of the constant regions and the introduction of a linker peptide.
  • Modified antibody formats are e.g. B. bi- or trispecific antibody constructs, antibody-based fusion proteins, immunoconjugates and the like.
  • IgG, scFv, Fab and/or F(ab)2 are antibody formats well known to those skilled in the art. Appropriate activation techniques can be found in relevant textbooks.
  • the antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding derivative thereof is a murine, chimeric, humanized or human antibody or antigen-binding fragment or antigen-binding derivative thereof.
  • Mouse-derived monoclonal antibodies can cause undesirable immunological side effects because they contain a protein from another species that can elicit antibodies.
  • antibody humanization and maturation methods have been developed to generate antibody molecules with minimal immunogenicity for human application, while ideally retaining the specificity and affinity of the parent non-human antibody.
  • the framework regions of a mouse mAb are replaced by corresponding human framework regions (so-called CDR grafting).
  • WO200907861 discloses the generation of humanized forms of mouse antibodies by linking the CDR regions of non-human antibodies to human constant regions using recombinant DNA technology.
  • US6548640 to Medical Research Council describes CDR transplantation techniques and US5859205 to Celltech describes the production of humanised antibodies.
  • humanized antibody refers to an antibody, fragment or derivative thereof in which at least part of the constant regions and/or the framework regions and optionally part of the CDR regions of the antibody are derived from human immunoglobulin sequences or adapted to it.
  • the present invention relates to an active ingredient obtained by the identification method described above.
  • the active ingredient has the ability to specifically bind to the protein Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2).
  • the active substance binds specifically with a high or particularly high affinity and/or avidity to the NKD2 protein or a fragment thereof.
  • the drug when bound to NKD2, reduces or inhibits NKD2 activity.
  • the term "specifically bind" as used herein means that the drug has a dissociation constant KD to the NKD2 protein molecule or epitope thereof of at most about 100M.
  • the KD is about 100M or lower, about 50M or lower, about 30M or lower, about 20M or lower, about 10M or lower, about 5M or lower, about 1M or lower, about 900 nM or lower, about 800 nM or lower, about 700 nM or lower, about 600 nM or lower, about 500 nM or lower, about 400 nM or lower, about 300 nM or lower, about 200 nM or lower, about 100 nM or lower, about 90 nM or lower, about 80 nM or lower, about 70 nM or lower, about 60 nM or lower, about 50 nM or lower, about 40 nM or lower, about 30 nM or lower, about 20 nM or lower, or about 10 nM or lower, about 1 nM or lower, about 900 p
  • the active ingredient may be for use in the treatment of chronic kidney disease, particularly where the chronic kidney disease is progressive chronic kidney disease and/or renal fibrosis.
  • the active agent may be a low molecular weight compound (smol), a peptide or a biologic, preferably the biologic is an antibody, a fragment thereof or a derivative thereof, or an antibody-like protein or an aptamer.
  • smol low molecular weight compound
  • peptide a peptide or a biologic
  • the biologic is an antibody, a fragment thereof or a derivative thereof, or an antibody-like protein or an aptamer.
  • the low-molecular compound according to the present invention can, in addition to other chemical backbones, substituents, groups or residues, for example, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aryl, alkylene, arylene, amino, halogen, carboxylate derivative, cycloalkyl -, carbonyl derivative, heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroarylene, sulfonate, sulfate, phosphonate, phosphate, phosphine, phosphine oxide groups.
  • substituents, groups or residues for example, alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, aryl, alkylene, arylene, amino, halogen, carboxylate derivative, cycloalkyl -, carbonyl derivative, heterocycloalkyl, heteroaryl, heteroarylene, sulfonate, sulfate, phosphonate, phosphate, phosphine,
  • the present invention relates to the use of an active substance which binds to the protein naked cuticle homolog 2 (NKD2) and/or inhibits this in a method for treating chronic kidney disease, the chronic kidney disease preferably being progressive is chronic kidney disease and/or renal fibrosis.
  • the drug when bound to NKD2, inhibits NKD2 activity.
  • the present invention relates to a method of treating or preventing chronic kidney disease, the method comprising administering an agent that binds to and/or inhibits Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) protein in a therapeutically effective amount or dose includes a human or animal subject.
  • NBD2 Naked Cuticle Homolog 2
  • the term "effective amount” means a dose or an amount effective in dosages and for periods of time necessary to achieve a desired to achieve result. Effective amounts may vary depending on such factors as the disease state, the patient's age, sex and/or weight, the pharmaceutical formulation, the type of disease being treated, and the like, but can nonetheless be routinely determined by one skilled in the art.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody or antigen-binding fragment or derivative thereof or antibody-like protein as described above, or the active ingredient as described above, and optionally one or more pharmaceutically acceptable excipients includes.
  • the excipients can be selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable buffers, surfactants, diluents, carriers, excipients, fillers, binders, lubricants, glidants, disintegrants, adsorbents and/or preservatives.
  • the present invention relates to a method for the production of a pharmaceutical composition, comprising
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a combination of (i) the antibody or antigen-binding fragment or derivative thereof or antibody-like protein as described above, or the active ingredient which binds to naked cuticle homolog 2 (NKD2 ) protein as described above or the pharmaceutical composition as described above and (ii) one or more other therapeutically active compounds.
  • NBD2 naked cuticle homolog 2
  • the pharmaceutical composition may comprise one or more pharmaceutically acceptable buffers, surfactants, diluents, carriers, excipients, fillers, binders, lubricants, disinfectants, adsorbents and/or preservatives.
  • Said pharmaceutical composition can be administered in the form of powder, tablet, pill, capsule or bead.
  • the pharmaceutical formulation may be ready for administration, while in lyophilized form the formulation may be converted to a liquid form, e.g. B. by adding water for injections containing a preservative such.
  • benzyl alcohol antioxidants such as vitamin A, vitamin E, vitamin C, retinyl palmitate and selenium, the amino acids cysteine and methionine, citric acid and sodium citrate, synthetic preservatives such as the parabens methylparaben and propylparaben may or may not contain.
  • the pharmaceutical formulation may also contain one or more stabilizers, e.g. B. an amino acid, a sugar polyol, a disaccharide and / or a polysaccharide can be.
  • the pharmaceutical formulation may further contain one or more surfactants, one or more isotonizing agents and/or one or more metal ion chelating agents and/or one or more preservatives.
  • the pharmaceutical formulation as described herein may be suitable for at least oral, parenteral, intravenous, intramuscular or subcutaneous administration.
  • the conjugate according to the present invention may be provided in a depot formulation, allowing for sustained release of the active ingredient over a period of time.
  • a primary packaging such. a pre-filled syringe or pen, vial or infusion bag, comprising the formulation according to the preceding aspect of the invention.
  • the pre-filled syringe or pen may contain the formulation either in freeze-dried form (which then needs to be reconstituted with e.g. water for injections before administration) or in aqueous form.
  • the syringe or pen is often a disposable, single-use item and can have a volume of between 0.1 and 20 ml.
  • the syringe or pen can also be a reusable syringe or a multi-dose pen.
  • the present invention relates to a therapeutic kit comprising:
  • Kidney tissue was harvested from normal and tumor regions by the surgeon. Tissue was frozen on dry ice or placed in prechilled University of Wisconsin solution (#BTLBUW, Bridge to Life Ltd., Columbia, U.S.) and transported to our laboratory on ice. The tissues were cut into approx. 0.5-1mm3 pieces and then transferred to a C-tube (Miltenyi Biotec) and processed on a gentle-MACS (Miltenyi Biotec) with the spleen 4 program. The tissue was then digested for 30 min at 37°C with shaking at 300 RPM in a digestion solution containing 25 pg/ml Liberase TL (Roche) and 50 pg/ml DNase (Sigma) in RPMI (Gibco).
  • the samples were processed again on a gentle-MACS (Miltenyi Biotec) with the same program.
  • the resulting suspension was passed through a 70 pm cell strainer (Falcon), washed with 45 ml cold PBS and centrifuged at 500 g for 5 minutes at 4°C. Cells were counted with a trypan blue stained hemocytometer. Live single cells were enriched for fibroblasts by FACS sorting and gating for DAPI-negative cells with further enrichment of epithelial cells by CDIO staining or PDGFRß staining, on average it took 5-6 hours from obtaining biopsies to preparing the single cell suspensions.
  • PDGFRßCreERt2 ie B6-Cg-Gt(Pdgfrß-cre/ERT2)6096Rha/J, JAX Stock #029684
  • Rosa26tdTomato ie B6-Cg-Gt(ROSA)26Sorttm(CAG-tdTomato)Hze/J JAX Stock #007909
  • the offspring were genotyped by PCR according to the Jackson Laboratories protocol.
  • Pdgfrb-BAC-eGFP reporter mice were developed by N. Heintz (The Rockefeller University) for the GENSAT project. All mice were genotyped by PCR.
  • mice were kept under specific pathogen-free conditions accommodated at the University of Edinburgh or the RWTH Aachen. UUO was performed as previously described.2 Briefly, after a flank incision, the left ureter was ligated with two 7.0 ties (Ethicon) at the level of the inferior pole. The mice were sacrificed on day 10 after surgery. The animal testing protocols have been approved by LANUV-NRW, Germany and by the UK Home Office Regulations. All animal testing was performed in accordance with their guidelines. Male PDGFRbeGFP mice born within 10 days and aged between 9 and 11 weeks at the time of surgery were used for SMART-Seq2 and sacrificed as indicated.
  • PDGFRbCreER;tdTomato mice (8 weeks old, 2 males/3 females) received tamoxifen three times by gavage (10 mg po) followed by a 21-day washout period, and then underwent UUO surgery or sham surgery (as above) and sacrificed 10 days after surgery.
  • mice were perfused via the left heart with 20 ml of 0.9% NaCl to remove residual blood from the vasculature.
  • the kidneys were surgically removed, cut into small slices and placed in a 15 ml tube (Falcon) on ice-cold PBS with 1% FCS.
  • Falcon 15 ml tube
  • FCS 1% FCS
  • Cells were labeled with the following monoclonal direct fluorochrome conjugated antibodies: anti-CD10 human (clone HI 10a, biolegend), anti-PDGFRb mouse (clone PR7212, R&D), anti-PDGFRalpha mouse (clone APA5, biolegend), anti- CD31 mouse (clone Megl3.3, biolegend), anti-CD45 mouse (clone 30 F11).
  • anti-CD10 human clone HI 10a, biolegend
  • anti-PDGFRb mouse clone PR7212, R&D
  • anti-PDGFRalpha mouse clone APA5, biolegend
  • anti- CD31 mouse clone Megl3.3, biolegend
  • anti-CD45 mouse clone 30 F11
  • the cells were pre-incubated with Fc block (TruStainFx human, TruStainFx mouse clone 91, biolegend) and then incubated with the above-mentioned antibodies for 30 minutes on ice, diluted in 2% FBS/PBS, protected from light.
  • Goat anti-mouse Dyelight 405 (poly24091, biolegend) was used as a secondary antibody for staining with human anti-PDGFRb. All compensations were made at the time of recording performed using single color stains and negative stains and fluorescence minus one controls.
  • the cells were sorted in semi-purity mode with the SONY SH800 sorter (Sony Biotechnology; 100 um nozzle sorting chip Sony) aiming for an efficiency of >80%.
  • SONY SH800 sorter Spin-Propane Sorter
  • FACS Aria II device Becton Dickinson, Basel, Switzerland.
  • single cells were processed by SciLifeLab - Eukaryotic Single cell Genomic Facility (Karolinska Institute). Before shipping, the single cells were sorted into wells of a 384-well plate with prepared lysis buffer. The libraries were sequenced on an Illumina HiSeq 4500. The single cell solution of cells and primary human kidney cells were run in parallel on a Chromium Single Cell Chip kit and the libraries were processed using Chromium Single Cell 3' Library Kit V2 and i7 Multiplex Kit (PN-120236, PN-120237, PN-120262, lOx Genomics) according to the manufacturer's protocol. The quality of the library was determined using the DL 000 ScreenTape on the 2200 TapeStation System (Agilent Technologies). Sequencing was performed on an Illumina Novaseq platform with Sl and S2 flow cells (Ilumina).
  • PAS-stained sections of the kidneys were collocatedly analyzed and evaluated by an experienced nephropathologist. All sections were examined for specific renal disease, but no evidence of specific glomerular or tubulointerstitial or vascular disease was noted apart from age-related changes or hypertensive nephropathy. The extent of interstitial fibrosis and tubular atrophy were assessed as two separate parameters in % of cortical area affected. The extent of global glomerulosclerosis was estimated as % of global sclerotic glomeruli out of all glomeruli. The extent of arteriosclerosis, i. H.
  • the fibroelastic thickening of the intima compared to the thickness of the media was rated on a scale of 0 to 3, where 0 - none, 1 - mild ( ⁇ 50%), 2 - moderate (51-100%) and 3 - severe ( >100% thickened intima compared to media).
  • Kidney tissue was fixed in 4% formalin for 2 hours at RT and frozen in OCT overnight after dehydration in 30% sucrose. Using 5-10 ⁇ m cryosections, slides were blocked in 5% donkey serum, followed by a 1 hour incubation of the primary antibody, washing 3 times for 5 minutes in PBS, and then incubating the secondary antibodies for 45 minutes. After DAPI (4',6*-'diamidino-2-phenylindole) staining (Roche, 1:10,000), slides were mounted with ProLong Gold (Invitrogen, #P10144).
  • anti-mouse PDGFRa AF1062, 1:100, R&D
  • anti-CD10 human clone HI10a, 1:100, biolegend
  • anti-HNF4a clone C11F12, 1:100, cell signalling
  • Pan -Cytokeratin type I/II Invitrogen, Ref. MA1-82041
  • Dachl Sigma, HPA012672
  • Collal Abeam, ab34710), ERG (abeam, ab92513), AF488 donkey anti-goat (1:100, Jackson Immuno Research ), AF647 donkey anti-rabbit (1:200, Jackson Immuno Research).
  • Images were acquired with a Nikon AIR confocal microscope using 40X and 60X objectives (Nikon). The raw data was processed with Nikon software or ImageJ.
  • Paraffin-embedded, formalin-fixed kidney samples from 98 non-tumorous human kidney samples from the Biobank Eschweiler/Aachen were selected on the basis of a previously performed PAS staining. Regions were randomly selected per sample and a 2 mm nucleus was harvested from each kidney sample using the TMArrayerTM (Pathology Devices, Beecher Instruments, Riverside, USA). Each core was placed in a recipient block in a 2 mm grid covering approximately 2.5 cm 2 and 5 micron thick sections were cut and processed using standard histological techniques.
  • In situ hybridization was performed using formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples and the RNAScope Multiplex Detection KIT V2 (RNAScope, #323100) following the manufacturer's protocol with minor modifications.
  • the antigen retrieval was carried out for 22 min at 96°C instead of 15 min at 99°C in a water bath. 3-5 drops of the pretreatment-1 solution were incubated for 10 minutes at RT after performing the antigen retrieval. The washing steps were performed three times for 5 minutes.
  • RNAscope assay Hs-PDGFRß #548991-C1, Hs-PDGFRa #604481-C3, Hs-Collal #401891, Hs-COL1A1 #401891-C2, Hs-MEG3 #400821, Hs-NKD2 #581951-C2 (targeting 236-1694 of NM 033120.
  • PDGFRb+ cells were isolated from the healthy human renal cortex of a nephrectomy specimen (71 year old male patient) by preparing a single cell suspension (as described above) followed by MACS separation (Miltenyi biotec, autoMACS Pro Separator, # 130-092- 545, autoMACS Columns #130-021-101 For the isolation, the single cell suspension was stained in two steps, first using a specific PDGFRb antibody (R&D # MAB 1263 antibody, dilution 1:100) and then a second incubation step with an anti- Mouse IgG1 MicroBeads solution (Miltenyi, #130-047-102,) After MACS, the cells were cultured in DMEM media (Thermo Fisher # 31885) containing 10% FCS and 1% penicillin/streptomycin for 14 days and immortalized with SV40LT and HTERT as follows Retroviral particles were prepared by transient transfection of HEK293T cells with TransIT-LT (Minis) Two types
  • Retroviral particles were concentrated 100x with the Retro-X concentrator (Clontech) 48 hours after transfection. The cell transduction took place by incubating the target cells with serial dilutions of the retroviral supernatants (1:1 mixture of the concentrated particles with SV40-LT or hTERT) for 48 h. The infected PDGFRb+ cells were then selected 72 hours after the transfection for 7 days with 2 ⁇ g/ml puromycin. Cultivation of human induced pluripotent stem cells (iPSC) derived kidney organoids
  • Human iPSC-15 clone 0001 was obtained from the Stem Cell Facility at Radboud University Center, Nijmegen, The Netherlands. Human iPSC were grown on Geltrex-coated plates in E8 medium (Life Technologies). At 70-80% confluence, the iPSC were separated with 0.5 mM EDTA and the cell aggregates were reseeded by splitting in a 1:3 ratio. Human iPSC were generated using a modified protocol based on Takasato et al. (Nature, 2015) and seeded at a density of 18,000 cells per cm2 on Geltrex-coated plates (Greiner).
  • the NKD2 siRNA knockdown was performed according to the manufacturer's protocol (DharmaFECT transfection reagent and NKD2-specific smartpool siRNA, both Horizon Discovery).
  • the transfection master mix and scrambled controls were prepared in Essential 6 medium (Gibco) and added to the organoids. After an initial incubation of 24 hours, the transfection master mixes were refreshed and IL-1 ⁇ (Sigma-Aldrich) was added at a concentration of 100 ng/ml to induce fibrosis.
  • the IL-1 ⁇ challenge along with the transfection master mix boost was repeated every 24 h for two subsequent days. 96 hours after the start of transfection, the organoids were harvested and prepared for paraffin sections. Fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence staining were performed as described above.
  • FISH Fluorescence in situ hybridization
  • TGFb 100-21-10UG, Peprotech
  • TGFb 100-21-10UG, Peprotech
  • T-5224 (c-Fos/AP-1 Inhibitor, Cayman Chemicals, #22904) was dissolved in DMSO and stored at -80°C. DMSO was always added in equal proportions to the control wells.
  • the WST-1 assay using PDGFRb cells was performed in 96 wells as recommended by the manufacturer (Roche Applied Science). Briefly, 1x10 A 4 PDGFRb cells were seeded into each well of 96-well plates and the cells were treated with T-5224 or vehicle (DMSO) at the indicated concentrations in triplicate. Cells were incubated for 2h with the WST-1 reagent before being harvested at the times indicated. The absorption was measured both at 450 nm and at 650 nm (as a reference). sgRNA:CRISPR-Cas9 vector construction, virus production and transduction
  • the NKD2-specific guide RNA forward 5'-CACCGACTCCAGTGCGATGTCGG -3'; reverse 5'-AAACCCGAGACATCGCACTGGAGTC -3' was cloned into pL-CRISPR.EFS.GFP (Addgene #57818) by BsmBI restriction digestion. Lentiviral particles were produced by transient co-transfection of HEK293T cells with the lentiviral transfer plasmid, the packaging plasmid psPAX2 (Addgene #12260) and the VSVG packaging plasmid pMD2.G (Addgene #12259) using TransIT-LT (Minis).
  • Viral supernatants were collected 48-72 hours after transfection, clarified by centrifugation, supplemented with 10% FCS and Polybrene (Sigma-Aldrich, final concentration of 8 ⁇ g/ml) and 0.45 ⁇ m filtered (Millipore; SLHP033RS).
  • FCS and Polybrene Sigma-Aldrich, final concentration of 8 ⁇ g/ml
  • eGFP expressing cells were individually sorted into 96 well plates.
  • the expanded colonies were screened for mutations using a mismatch detection assay: gDNA spanning the CRISPR target site was PCR amplified and analyzed by T7EI digestion (T7 endonuclease, NEB M0302S).
  • the PCR product was transfected into the pCRTM 4Blunt-TOPO vector (Thermo Scientific K287520) subcloned. At least 6 colonies per CRISPR clone were grown and sent for Sanger sequencing (clone C2: 30 colonies were sequenced). A western blot was performed to demonstrate complete knockout of NKD2.
  • Western blots were performed according to standard protocols. Briefly, cell lysates were prepared with RIPA buffer and protease inhibitor cocktail (Roche). The protein concentrations of the lysates were quantified using the BCA assay (#23225, Pierce, ThermoScientific). Protein lysates were heated for 5 min at 95°C in 4x SDS sample loading buffer (BioRad) and loaded into 10% SDS-Page gels.
  • the human NKD2 cDNA was amplified by PCR using the primer sequences 5'-atggggaaactgcagtcgaag-3' and 5'-ctaggacgggtggaagtggt-3'. Restriction sites and N-terminal IxHA tag were introduced into the PCR product with the primers 5'-cactcgaggccaccatgtacccatacgatgttccagattacgctgggaaactgcagtcgaag -3' and 5'-acggaattcctaggacgggtggaagtg-3'.
  • pMIG was a gift from William Hahn (Addgene plasmid #9044; http://n2t.net/addgene:9044; RRID:Addgene_9044).
  • pUMVC packaging plasmid pUMVC
  • pMD2.G pseudotyping plasmid pMD2.G
  • Viral supernatants were collected 48-72 hours post-transfection, clarified by centrifugation, supplemented with 10% FCS and Polybrene (Sigma-Aldrich, final concentration of 8 pg/ml) and 0.45 ⁇ m filtered (Millipore; SLHP033RS). The cell transduction took place by incubating the PDGFß cells with viral supernatants for 48 h. eGFP expressing cells were individually sorted.
  • sequencing libraries were prepared using the KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase (Kapa Biosystems) according to the manufacturer's protocol.
  • the sequencing libraries were quantified using quantitative PCR (New England Biolabs, Ipswich, USA), pooled equimolarly, the final pool normalized to 1.4 nM and denatured with 0.2 N NaOH and neutralized with 400 nM Tris pH 8.0 prior to sequencing.
  • Final sequencing was performed on a NextSeq platform (Illumina) according to manufacturer's protocols (Illumina, CA, USA).
  • PDGFRa/b pos cells were FACS-sorted as described above from freshly isolated UUO kidneys, washed twice with cold PBS and centrifuged at 500g for 5 minutes. The cell pellets were then lysed in 50 ⁇ l ice-cold lysis buffer (10mM Tris-HCl, pH7.5; 10mM NaCl, 3mM MgC12, 0.08% NP40 substitute [74385, Sigma], 0.01% digitonin [G9441, Promega]) and immediately centrifuged at 500g for 9 minutes.
  • the pellets were resuspended in 50 ⁇ l of a transposase reaction mix containing 25 ⁇ l 2xTD buffer (20mM Tris-HCl, pH7.6, 10mM MgCl2, 20% DMF), 0.5 ⁇ l Tagment DNA enzyme 1 [15027865, Illumina] and 24.5 ⁇ l nuclease-free water.
  • the transposition reaction was incubated at 37°C for 30 min at 350 rpm in a thermoshaker.
  • the transposed DNA was then cleaned using a MinElute Reaction Cleanup Kit (28204, Qiagen) and eluted in 15 ⁇ l of nuclease-free water.
  • Transposed DNA was amplified by PCR (14 cycles total) using NEB Next 2x Master Mix (M0541S; New England Biolabs) with custom Nextera PCR primers.
  • the first PCR was performed with 50pl volume and 6 cycles using NEB Next 2x master mix and 1.25pM custom primers; the second RT-PCR was in 15 ⁇ l volume for 20 cycles using 5 ⁇ l (10%) of the pre-amplified mix plus 0.125
  • the amplified DNA library was purified with the MinElute PCR Purification Kit (28004, Qiagen) and eluted in 20 ⁇ l of 10 mM Tris-HCl (pH 8).
  • the quality of the library was visualized using the Agilent DL 000 ScreenTape on the 2200 TapeStation System (Agilent Technologies).
  • the ATAC-seq libraries were loaded onto the Illumina NextSeq 500 for 75-bp paired-end sequencing.
  • the initial single-cell transcriptome data were processed at the Eukaryotic Single-Cell Genomics Facility at the Science for Life Laboratory in Sweden.
  • the reads obtained were mapped to the mmlO build of the mouse genome (concatenated with transcripts for eGFP and the ERCC spike-in set) to obtain a count for each endogenous gene, spike-in and eGFP transcript per cell.
  • Ribosomal RNA genes, ribosomal proteins and ribosomal pseudo-genes were filtered out.
  • We found that cells lacking alignments that mapped to either eGFP or PDGFRb were clustered into a single cluster after unsupervised cell clustering (see below). Therefore, we decided to remove these cells and performed all analysis and clustering without considering these cells (17 cells).
  • the Fastq files were processed with Alevin and Salmon (Alevin parameter -1 ISR, Salmon version 0.13.1) using gene code v29 human transcriptome and gene code vM20 mouse transcriptome as reference transcriptomes.
  • the Alevin parameter "Expected Cells" was set equal to three times the number of cells estimated by the Knie method applied to the read counts per cell barcodes distribution. Therefore, the UMI count matrix generated by Alevin produced a large number of putative cells that we were later able to filter (see next section).
  • RNA genes (0-1% average of detected RNA content per cell) and mitochondrial-encoded genes (0-80% average of detected RNA content per cell) from the main gene expression matrix. Mitochondrially encoded genes were removed to avoid introducing unwanted variations between cells solely from changes in mitochondrial content could depend.
  • the loglO(total UMI counts per cell) distribution from the count matrix generated by Alevin typically showed a bimodal distribution, so loglO(total UMI counts per cell) were calculated using the R package mclust v5.4.3 clustered into two clusters with modelNames set to "E". Cells belonging to the cluster with the higher counts were retained.
  • cells were filtered based on mitochondrial RNA content and preference for highly expressed genes as follows: (1) Cells were analyzed using a two-component bivariate Gaussian mixture scaled to loglO(total UMI counts per cell) and percent of mitochondrial UMI learned per cell were clustered into two clusters. Clustering was performed using the R package Mclust with modelNames set to "EU”. Cells that fell into the cluster with cells with higher mitochondrial content were excluded. This filtering step was only performed for libraries that showed a clear bimodal distribution of mitochondrial content (only three 10x libraries in this study). (2) The total number of UMIs per cell should correlate with the total number of unique genes recognized.
  • Mitochondria-based filtering was not performed for CD10+ libraries because a high number of mitochondrial reads is expected from proximal tubular epithelial cell libraries. Note that not all filtering steps were performed for all libraries, as this depends on the quality of each library and the distribution of UMI cell genes.
  • the experimental strategy involved obtaining separate libraries from CD 10+ and CD 10- cell fractions, which served to mitigate the class imbalance at the level of cell type coverage by the 1Ox Chromium protocol.
  • Step 1 After quality control and cell filtering (see above), the cells in each 10x library were clustered separately and each cell cluster was assigned to one of 6 main cell types: CD 10+ epithelial, CD 10- epithelial, immune, endothelial, mesenchymal and neuronal cells.
  • Step 2 For each of the 6 major cell types, cells from all 10x libraries were integrated together. Inter-cell variability caused by engineering was corrected and cells were clustered using unsupervised graphene clustering. This process resulted in 6 separate maps for endothelial cells, CD 10+ epithelial cells, CD 10- epithelial cells, mesenchymal cells, immune cells and nerve cells. Each map consists of cells from multiple 10x libraries.
  • Step 3 We integrated 3 single-cell maps for: (1) CD10+ cells (proximal tubule/ Figure 1), (2) CD 10— cells (proximal tubule-depleted/ Figure 1), and (3) PDGFRb+ cells (mesenchymal/ Figure 2) by combining the single-cell expression (UMI counts) and clustering information from all major cell-type single maps of each data set from step 2. All diagrams in the manuscript are then reproducible from these 3 integrated maps.
  • variable genes were determined using the Scran R package's decomposeVar function, after calling the trendVar function on the ERCC transcripts6. Genes with an FDR ⁇ 0.01 and a biological component of variance > 1 were retained as highly variable genes. With these variable genes, we followed the same clustering approach as described for the lOx Chromium data, but we performed only 2 clustering iterations and did not vary the number of nearest neighbors.
  • the script used to analyze the mouse Smart-Seq2 data is available here: https://github.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/blob/master/make_intergrated_maps/mouse PDGFRBpositive.r .
  • a per-cluster gene ranking was generated using the sortGenes function in the R package genesorteR with the binarizeMethod set to "adaptiveMedian” (Smart-Seq2 data) or to "naive” (10x data).
  • Smart-Seq2 data Smart-Seq2 data
  • naive 10x data 10x data.
  • a cell cluster can represent either a true cell type or another cell state.
  • Integrated full-map UMAP projections ( Figures 1, 2, 3, 4, 5) were generated using the UMAP Python package (https://github.com/lmcinnes/umap) on the reduced corrected dimensions returned by fastMNN were generated with min dist set to 0.6 and the number of neighbors set to the square root of the number of cells.
  • Local UMAP projections ( Figure 1, Figure 4) were generated by setting min dist to 1 as these parameters tend to result in more geometrically accurate embeddings (see https://umap-leam.readthedocs.io/en/latest/) .
  • Diffusion maps were created using the Destiny R package (https://github.com/theislab/destiny), also using the fastMNN was used as input and the number of neighbors was set to the square root of the number of cells.
  • the R package Slingshot was used for inference of family trees and inference of pseudo-time cell orders based on the UMAP/Diffusion Map projection.
  • Cell clustering (Step 2 of the integration strategy, see above) was used as the input cell cluster. Starting and ending clusters were chosen based on reasonable expectation given our prior knowledge, as described in Street et al. discussed and recommended (e.g. myofibroblast is the end cluster in a pericyte/fibroblast/myofibroblast map).
  • Genes whose expression varied with cell order were defined as those whose normalized expression correlated with cell order, quantified by Spearman's correlation coefficient at a Bonferroni-Hochberg-corrected p-value cutoff of 0.001.
  • Gene clusters and expression heatmaps (e.g. Fig. 2f-top) were generated by arranging the cells along the pseudo-time predicted by SlingShot and using the genesortR function plotMarkerHeat. This function clusters genes using the k-means algorithm, and we have set the plot and clustering to average every 10 cells along pseudo-time. Pathway enrichment and cell cycle analyzes were calculated by clustering all 2000 cells along pseudotime.
  • KEGG pathway and PID pathway downloaded from MSigDB 327,28 in November 2019 as ".gmt" files.
  • Pathway enrichment analysis was performed with the clusterProfiler R package using the top 100 genes for each cell cluster/cell group as defined by the sortGenes function from the genesortR package. The enricher function was used, setting minGSSize to 10 and maxGSize to 200. The top 5 terms by q-value for each cell cluster/group were plotted as heatmaps of -loglO(q-value).
  • the Gene Ontology Biological Process analysis was performed for the top 200 genes using the same method. The enricher function was used with minGSSize set to 100 and maxGSize set to 500.
  • Scaled gene expression heatmaps as shown in Figure 2d were generated using the plotMarkerHeat and plotTopMarkerHeat functions in the R package genesorteR.
  • the heatmaps for the proportion of cells expressed, as shown in Figure 3d, were generated using the plotBinaryHeat function from the genesortR R package.
  • Heatmaps, the log2 -fold-changes and Feature enrichments as shown in Figure 5j,k were created using the ComplexHeatmap R package (v. 2.4.2).
  • STAR version 2.7.0e was used to map ATAC-Seq reads to the mmlO genome assembly, keeping only uniquely mapped pairs (settings: alignEndsType EndToEnd, alignlntronMax 1, alignMatesGapMax 2000, alignEndsProtrude 100 ConcordantPair, outFilterMultimapNmax 1, outFilterScoreMinOverLread 0.9, outFilterMatchNminOverLread 0.9).
  • JAMM version 1.0.7rev5
  • ATAC-Seq Signal Bigwig files were generated using the JAMM SignalGenerator pipeline (settings: -f 38,38 -n depth).
  • each open chromatin ATAC-Seq peak was assigned to a gene corresponding to the closest annotated transcription start site using the bedtools closest function, using 100 kb as the maximum possible assignment distance.
  • ATAC-Seq peak ranking per scRNA-Seq cluster was determined by ranking peaks according to the ranking of their associated gene in the single-cell RNA-Seq cluster.
  • the top 2000 ATAC-Seq peaks for each scRNA-Seq cluster were selected and XXmotif was used for de novo motif search for each scRNA-Seq cluster and each open chromatin region separately (settings: — revcomp — merge- motif threshold MEDIUM).
  • the resulting network was drawn as an undirected network (since the regulators are not known beforehand) using the ggraph package (https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/index.html) and labeled with the Louvain Algorithm implemented in igraph package clustered in 4 modules.
  • CellPhoneDB (v.2.1.1) was used to estimate cell-cell interactions between the cell types found in the human CDIO fraction. Version 2.0.0 of the database and normalized gene expression were used as input, with default parameters (10% of cells expressing the ligand/receptor). Interactions with a p-value ⁇ 0.05 were considered significant. Only ligand-receptor interactions where only and at least one partner of the interacting pair was a receptor were considered based on the annotation from the database, discarding receptor-receptor and other interactions without a clear receptor.
  • Ligand-receptor interactions from signaling pathways involved in renal fibrosis were identified using membership from the KEGG database for Hedgehog, Notch, TGFb and WNT signaling and the REACTOME database for EGFR signaling from MSigDB 3 and manual curation for PDGF signaling.
  • Gene expression was quantified at the transcriptional level using Salmon vl.1.0 with the parameters — validatMappings and — gcBias turned on for the human gene code v29 transcriptome.
  • the transcript-level counts were aggregated to gene-level counts with the import in the R package tximport, with countsFromAbundance set to "lengthScaledTPM”.
  • the R-package Limma (v.3.44.1) was used to test for differential gene expression between Nkd2-disrupted human kidneys PDGFRb+ compared to their control after Voom transformation by empirical Bayesian method.
  • Example 2 Single cell atlas of human chronic kidney disease
  • Cell cycle analysis of the CD10+ proximal tubular cell clusters showed an increased Cyclization in CKD, likely reflecting an epithelial repair response (Fig. lg)
  • Fig. lh Fatty acid metabolism has been described as one of the major dysregulated pathways in human and mouse kidneys, causing tubular dedifferentiation and fibrosis (Kang et al. 2015).
  • Example 3 Origin of extracellular matrix in human chronic kidney disease
  • ECM extracellular matrix
  • ECM epithelial mesenchymal transition
  • Example 4 Different pericyte and fibroblast subpopulations are the main source of myofibroblasts in human renal fibrosis
  • Pseudo-time trajectory and diffusion map analyzes of the major ECM-expressing cellular subtypes from the PDGFRb+ populations revealed three Major sources of myofibroblasts in human kidneys: 1) Notch3+/RGS5+/PDGFRa- pericytes, 2) Meg3+/PDGFRa+ fibroblasts, and 3) Colecl I+/CXCL12+ fibroblasts (Fig. 2e).
  • the diffusion mapping locates the non-CKD cells primarily within the low ECM-expressing pericytes and fibroblast populations, suggesting a potential differentiation pathway from low-ECM, non-CKD mesenchymal cells (pericytes and fibroblasts) to high-ECM CKD myofibroblasts (Fig. 2e).
  • TGFb signaling was predominant in lineage 2 pseudotime analysis (Figure 2g).
  • Myofibroblast 1 which probably represents fully differentiated myofibroblasts, expressed high levels of TGFb ligands and lower levels of TGFb receptors.
  • the opposite was observed for fibroblast 1, suggesting a mechanism by which myofibroblasts can promote fibroblast differentiation.
  • API activator protein 1
  • Postn osteoglycin
  • API acts as a suppressor could work.
  • ligand-receptor analyzes Efremova et al. 2020 to clarify which cell types interact with the main ECM-expressing mesenchymal cells (fibroblasts, pericytes and myofibroblasts). While we observed that the fewest signals originated from healthy proximal tubular epithelium, injured proximal tubular epithelium was among the top signaling partners of the mesenchyme, consistent with tubular-interstitial signaling as a hallmark of renal fibrosis (Venkatachalam et al 2015).
  • Example 5 Dual-positive PDGFRa+/PDGFRb+ mesenchymal cells represent the majority of ECM-expressing cells in human and mouse renal fibrosis
  • Example 6 PDGFRa+/PDGFRb+ cells are heterogeneous and contain different fibroblast cell stages
  • UMAP embedding of PDGFRa+/PDGFRb+ cells revealed four major, distinct populations corresponding to mesenchyme (fibroblasts and myofibroblasts), epithelial, endothelial, and immune cells (Fig. 4c-d). All of these cell types have previously been discussed as possible cellular origins of renal fibrosis (Duffield et al 2014; Wang et al 2017; Kramann et al 2018). Notably, we could not detect undifferentiated pericytes in these PDGFRa+/PDGFRb+ data, since human and mouse pericytes are PDGFRa- (Fig. 2e, 3g).
  • Non-mesenchymal cells expressed significantly less PDGFRb, PDGFRa, ECM and collagen than mesenchymal cells (Fig. 4d-e), supporting the observation in our human data that non-mesenchymal cells contribute to the scar formation process to a small extent (Fig. 1,2 ).
  • the computationally derived doublet scores do not indicate that these matrix-expressing non-mesenchymal cell populations are likely doublets.
  • fibroblast 1 characterized by Scara5 and Meg3 expression
  • myofibroblast consisting of different myofibroblast subpopulations Fig. 4c- d.
  • myofibroblasts 1 correspond to the terminally differentiated myofibroblasts with the highest ECM expression, preceded in the pseudodifferentiation time by myofibroblasts 2 (Ogn+), while fibroblasts 1 appear as a "progenitor" population of non-activated fibroblasts (Fig. 2e) .
  • the fibroblast 1 cells in the PDGFRa+/PDGFRb+ data can be distinguished from the myofibroblasts by three main features: First, Coll5al, a myofibroblast-specific collagen in mice (Fig. 3g), was expressed at a lower level in the fibroblast 1 than in the myofibroblast cluster (Fig. 4f). Second, although Meg3 is also expressed in a fraction of the proximal tubular cells and glomerular endothelium, it was only detected in fibroblasts 1 within the mesenchymal populations (Fig. 4d). We confirmed the presence of a Meg3+ PDGFRa+/PDGFRb+ mesenchymal subpopulation in human kidneys by in situ hybridization (Fig. 4h-i), suggesting the presence of a fibroblast 1-like subpopulation in human kidneys suggests. Third, the fibroblast 1 cells are Scara5+ but Frzb-, again showing that they are distinct from myofibroblasts.
  • fibroblast 1 was generated as a distinct fibroblast population.
  • This analysis suggested fibroblast 1 (Meg3+, Scara5+) and myofibroblast 2 (Coll4al+, Ogn+) as early states, myofibroblast 3a as intermediate states, and myofibroblast la (Nrp3+, Nkd2+), 1b (Grem2+), and 3b (Frzb+) as terminal states ( Fig. 4j).
  • fibroblast 1 and myofibroblast 2 are the main source of myofibroblasts in mouse renal fibrosis.
  • Myofibroblasts 2 (Ogn+/Coll4al+) could exist in healthy mouse kidneys or arise as an intermediate state through differentiation of pericytes into myofibroblasts (Fig. 2e, human data).
  • the expression of angiotensin receptor 1 (AGTRla) is enriched in myofibroblasts 2 and could indicate their pericyte origin (Fig. 4j).
  • myofibroblasts 1 Pdgfrb+/Pdgfra+/Postn+ high ECM-expressing myofibroblasts (referred to as myofibroblasts 1 in this manuscript) derived from Pdgfrb+/Pdgfra-/Notch3+ pericytes, Pdgfrb+/Pdgfra+/ Scara5+ fibroblasts (fibroblast 1) and Pdgfrb+/Pdgfra+/Cxcll2+ fibroblasts (fibroblast 2) arise.
  • Pericytes potentially differentiate into myofibroblasts 1 via an intermediate ECM-expressing Pdgfrb+/Pdgfra+/Ogn+/Coll4al+ state (myofibroblasts 2).
  • Example 7 Different fibroblast and myofibroblast states are distinguished by specific transcription factor regulatory programs
  • Myofibroblasts la differed from myofibroblasts 1b and showed an accumulation of ATF.
  • Myofibroblasts 2 and 3b showed accumulation of the orphan receptor NRF4A1, previously reported to be an important regulator of TGFb signaling and fibrosis (Palumbo-Zerr et al 2015).
  • Fibroblasts 1 showed enrichment of AP-1 (JunZFos) motifs ( Figure 4k), consistent with their putative role described in our human data. RNA expression of these factors selected by ATAC-Seq is consistent with the enrichment of sequence motifs ( Figure 4k) and highlights divergent transcriptional regulation between fibroblast 1, myofibroblast 2, and other myofibroblast populations.
  • fibroblast 1 and myofibroblasts are distinct populations with different enriched signaling pathways ( Figure 41). Therefore, fibroblast 1 and myofibroblast subtypes are likely distinct ECM-expressing mesenchymal cell types harboring specific transcription factor regulatory programs.
  • Nkd2 is required for collagen expression in human kidney PDGFRb+ cells and is a potential therapeutic target in renal fibrosis
  • scRNA-seq data we generated could be used to identify potential therapeutic targets in human renal fibrosis.
  • Nkd2 is specifically expressed in Pdgfra+/Pdgfrb+ terminally differentiated mouse myofibroblasts (Fig. 5a), such that Nkd2/PDGFRa dual-positive cells accounted for >40% of all Collal+ cells (Fig. 5b).
  • NKD2 is a marker for myofibroblasts with high ECM content, with its expression positively correlating with Postn and ECM expression and anticorrelating with genes associated with pericytes and fibroblasts (Fig. 5c). Furthermore, NKD2+ myofibroblasts were associated with increased TGFb, Wnt, and TNFa pathway activity compared to NKD2 cells.
  • TMA human kidney tissue microarray
  • a subpopulation of human PDGFRa/PDGFRb expressing cells also expresses Nkd2 (Fig. 5d-e).
  • the abundance of PDGFRa/PDGFRb/Nkd2 co-expressing cells was higher in patients with more severe interstitial fibrosis (Fig. 5e).
  • Nkd2 has been documented as a Wnt signaling pathway and TNFa modulator (Zhao et al 2015; Hu and Li 2010; Hu et al 2010; Li et al 2004).
  • we used our human PDGFRb+ data to predict a gene regulatory network focused on genes correlated with Nkd2 using the GRNboost2 framework.
  • the resulting network was organized into 4 gene regulatory modules, including ribosomal proteins (module 1), genes associated with ECM expression (module 2), genes associated with pericytes (module 3), and genes associated with non-activated fibroblasts connections (module 4).
  • this gene cluster contains various Wnt modulators and effectors such as Kif26b, Lefl, and Wnt4 in addition to Nkd2.
  • Nkd2 is placed with ECM genes and is linked to Etvl and Lamp5, and indirectly through Lamp5 to Coll al. This analysis suggests a possible mechanism by which Nkd2 is regulated by Etvl (a member of the Ets factor family) and acts by affecting paracrine signaling through Lamp5.
  • Nkd2 Lentiviral overexpression of Nkd2 in our human PDGFRb cell line resulted in increased expression of key pro-fibrotic ECM molecules such as collal and fibronectin in response to TGFb (Fig. 5f-g).
  • the CRISPR/Cas9 knockout of Nkd2 resulted in a significant reduction in the expression of collal, fibronectin and ACTA2 in the presence or absence of TGFb (Fig. 5h-i).
  • RNA-seq from cells overexpressing Nkd2 showed upregulation of ECM regulators and ECM glycoproteins, while RNA-seq from Nkd2 knockout clones showed loss of ECM regulators, ECM glycoproteins and collagens (Fig. 5j) .
  • iPSC induced pluripotent stem cell
  • Example 9 Screening for drugs that bind to and/or inhibit NDK2 protein
  • Screening experiments allow for the identification and validation of small molecule therapeutic compounds, peptides and/or biologics that bind to and/or inhibit the activity of the NKD2 protein.
  • DNA-encoded substance libraries are generated and screened as described (Kunig et al. 2018).
  • recombinant NKD2 protein or fragments thereof which carry a His tag are expressed in E. coli, insect cells or mammalian cells.
  • the purified NKD2 protein is incubated with the compound library and isolated by immunoprecipitation.
  • Compounds bound to the NKD2 protein are identified by Sanger sequencing of DNA barcodes.
  • the identified compounds are then tested for their effect on the function of NKD2, the Differentiation of myofibroblast cells, the expression and secretion of matrix proteins such as collagen 1, and the development of renal fibrosis were tested.
  • experimental mouse in vivo models of renal fibrosis are used.
  • a human cell-based in vitro fluorochrome reporter system will be established, for example monitoring the expression of the eGFP-NKD2 Fusion protein or a luciferase-based reporter system is used to screen compound libraries in 384- to 1,536-well assays for the identification of compounds that reduce eGFP fluorescence or luciferase levels as a readout.
  • the expression of these human NKD2 fusion reporter constructs in said cells can, for. B. by transfection and selection via resistance gene cassettes or by viral transduction.
  • VCAM-1 on activated endothelium interacts with the leukocyte integrin VLA-4 at a site distinct from the VLA-4/fibronectin binding site.
  • Proximal tubular cells contain a phenotypically distinct, scattered cell population involved in tubular regeneration. J Pathol. 229, 645-659 (2013).
  • Wilson PC et al. The Single Cell Transcriptomic Landscape of Early Human Diabetic Nephropathy. doi:10.1101/645424. Wu, H. et al. Single-Cell Transcriptomics of a Human Kidney Allograft Biopsy Specimen Defines a Diverse Inflammatory Response. J.Am. society nephrol. (2016) doi:10.1681/ASN.2018020125.

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Abstract

Die vorliegende Anmeldung betrifft die Identifizierung der Rolle des vom Naked Cuticle Homolog 2 (Nkd2)-Gen abgeleiteten Proteins bei der Entwicklung von chronischen Nierenerkrankungen, insbesondere von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und Nierenfibrose. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an das nkd2-Protein binden, und die Verwendung von Nkd2 zum Screening und zur Identifizierung von Nkd2-interagierenden Verbindungen. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Nierenerkrankungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Wirkstoffe umfassen, die an das NKD2-Protein (Fig. 1a) binden und/oder es hemmen.

Description

NKD2 ALS TARGET ZUR BEHANDLUNG VON NIERENFIBROSE
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Rolle des Nkd2-Proteins (Naked Cuticle Homolog 2) bei der Entwicklung von chronischen Nierenerkrankungen, insbesondere von progressiven chronischen Nierenerkrankungen und Nierenfibrosen. Die vorliegende Erfindung betrtifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an das Nkd2-Protein binden, und auf die Verwendung von Nkd2 zum Screening und zur Identifizierung von Nkd2-interagierenden Verbindungen. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Nierenerkrankungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Wirkstoffe umfassen, die an das Nkd2 -Protein binden und/oder dieses hemmen.
Hintergrund
Chronische Nierenerkrankungen (CKD) betreffen mehr als 10 % der Weltbevölkerung, und ihre Prävalenz nimmt zu. Unabhängig von der anfänglichen Art der Schädigung ist der letzte gemeinsame Verlauf einer Nierenschädigung die Nierenfibrose. Die Nierenfibrose ist das Kennzeichen für das Fortschreiten der chronischen Nierenerkrankung, jedoch gibt es derzeit keine antifibrotischen Therapien. Das Ausmaß der Nierenfibrose ist untrennbar mit dem Verlust der Nierenfunktion und dem klinischen Verlauf der CKD verbunden, weshalb die Nierenfibrose als wichtiges therapeutisches Ziel bei CKD angesehen wird. Für die Behandlung der Nierenfibrose gibt es keine zugelassenen Therapien, was vor allem daran liegt, dass der zelluläre Ursprung, die funktionelle Heterogenität und die Regulierung der narbenbildenden Zellen in der humanen Niere nach wie vor unklar sind und eine große Quelle der Diskussion auf diesem Gebiet darstellen (Duffield 2014; Falke et al. 2015). Die einzigen Behandlungsmöglichkeiten sind die kontinuierliche Nierenersatztherapie (Dialyse) und die Nierentransplantation. Beide Optionen sind mit hohen persönlichen Unannehmlichkeiten für den Patienten verbunden und stellen auch eine hohe wirtschaftliche Belastung für die nationalen Gesundheitssysteme dar. Daher sind neuartige Therapieansätze sehr wünschenswert.
Nierenfibrose ist definiert durch eine übermäßige Ablagerung von extrazellulärer Matrix, die das funktionelle Parenchym stört und ersetzt, was zu Organversagen führt. Die histologische Struktur der Niere kann in drei Hauptkompartimente unterteilt werden, die alle von Fibrose betroffen sein können, speziell bezeichnet als Glomerulosklerose in den Glomeruli, interstitielle Fibrose im Tubulointerstitium und Arteriosklerose und perivaskuläre Fibrose in der Vaskulatur (Djudjai und Boor 2019).
Die Nierenfibrose ist durch eine hohe Expression, Sekretion und Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM)-Proteinen wie Kollagen- 1 gekennzeichnet. Myofibroblasten stellen die Hauptquelle der ECM während der Nierenfibrose dar, wobei ihre zelluläre Herkunft weiterhin umstritten ist (Duffield 2014; Friedman et al 2013; Kriz et al 2011; Kramann und DiRocco 2013). Die Sequenzierung und Kartierung von Einzelzell-RNA ermöglicht die Zerlegung der zellulären Heterogenität komplexer Gewebe und Krankheitsprozesse und liefert neue Erkenntnisse über krankheitsvermittelnde Zellpopulationen und Mechanismen (Ramachandran et al 2019; Dobie und Henderson 2019). In der Vergangenheit hatten genetische Fate-Tracing-Daten in Mäusen, die durch verschiedene Färbeansätze in humanem Gewebe erweitert wurden, nahegelegt, dass eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen wie epitheliale, endotheliale, zirkulierende hämatopoetische Zellen sowie residente mesenchymale Zellen zur Fibrose beitragen (Duffield 2014; Friedman et al 2013; Kramann und DiRocco 2013).
Somit besteht die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe in der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen, sowie die genannten Wirkstoffe, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Mittel zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen bereit, insbesondere zur Identifizierung von hochwirksamen Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und Nierenfibrose.
Wie hierin offenbart, fanden die Erfinder heraus, dass das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein in terminal differenzierten Myofibroblasten produziert wird, die an der Nierenfibrose beteiligt sind, aber nicht in Zellen, die Markerproteine für Perizyten und Fibroblasten und nur geringe Mengen an extrazellulärem Matrixprotein exprimieren. Es wurde weiterhin festgestellt, dass Nkd2-exprimierende Zellen eine erhöhte Aktivität von pro- fibrotischen Signaltransduktionswegen aufweisen. Die Erfinder fanden weiter heraus, dass eine Reduktion der Fibrose durch Deletion des Nkd2-Gens oder Knock-down der Nkd2- Expression erreicht werden kann, wodurch das Gen als relevant für die Produktion von extrazellulärer Matrix und Fibrose identifiziert wurde. Damit haben die Erfinder erstmals Nkd2 als neues Target und damit einen neuen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung von Therapeutika identifiziert, die die Nkd2-Genexpression und/oder die NKD2- Proteinaktivität unter Verwendung von niedermolekularen Wirkstoffen (Smols), Peptiden oder Biologika hemmen.
In Anbetracht des Standes der Technik war es daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine bestimmte Zelle bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs bereitzustellen, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein oder ein Fragment davon bindet und/oder dieses hemmt.
Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung einer Nukleinsäure, die für das Naked Cuticle Homolog 2, oder ein Fragment davon, oder das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) Protein, oder ein Fragment davon, kodiert, für die Identifizierung eines Wirkstoffs, das an NKD2, oder ein Fragment davon, bindet, bereitzustellen.
Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wirkstoffe zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen bereitzustellen, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Mittel enthalten, und von Verfahren zur Herstellung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen.
Diese und weitere Aufgaben werden mit Verfahren und Mitteln gemäß den unabhängigen Ansprüchen der vorliegenden Erfindung erfüllt. Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf bestimmte Ausführungsformen.
Die Erfindung und allgemeine vorteilhafte Ausgestaltungen werden im Folgenden näher erläutert.
Beschreibung der Zeichnungen
Abbildung 1. a. Schematische Darstellung der Nephronstruktur und der zugehörigen Zelltypen, b. UMAP umfasst 51.849 MME- (CD10-) Einzelzelltranskriptome von 15 humanen Nieren. Es konnten fünf Haupt-Zelltypen unterschieden werden (jeweils durch gestrichelte Linien gekennzeichnet): epitheliale (n=9.280), endotheliale (n=29.814), Immun- (n=9.616), mesenchymale (n=3.115) und neuronale (Schwannzellen, n=24) Zellen. Erläuterung der Abkürzungen siehe Id. c. Darstellung des Wechselwirkungsnetzwerks zwischen den einzelnen Einzelzellclustem. Die Knotenpunkte repräsentieren die Zellcluster. Wechselwirkungen zwischen den Zellclustem werden durch Linien dargestellt. Die Erstellung und Darstellung des Wechselwirkungsnetzwerkes wurde erstellt unter Verwendung der ggraph R package Software (https://cran.r- proiect.org/web/packages/ggraph/index. html), d. Skalierte Darstellung der Genexpression der Top 10 spezifischen Gene in jedem Zelltyp/Zellcluster. Das Genranking pro Cluster wurde mittels genesorteR erstellt. In den jeweiligen Zellclustem werden Gruppen von ähnlichen Zellen bzw. verwandte Zellen in 29 klassische (canonikale) Zelltypen eingeteilt (B Zellen (B): n=3.101, T Zellen (T): n=484, Natürliche Killerzellen (NK): n=740, Plasmazellen (P): n=167, Mastzellen (Mast): n=142, Dendritische Zellen (DC): n=841, Monozyten (Mono): n=l.lll, Makrophagen 1 (Macl): n= 1.476, Makrophagen 2 (Mac2): n=615, Makrophagen 3 (Mac3): n=939, Arteriolares Endothelium (Artl): n=901, glomeruläre Kapillaren (GC): n=4.377, venöses Endothelium (Ven): n=2.724, Lymph Endothelium (lEn): n=509, Vasa Recta 1 (VR1): n=5.355, Vasa Recta 2 (VR2): n=2.023, Vasa Recta 3 (VR3): n=3.051, Vasa Recta 4 (VR4): n=726, Vasa Recta 5 (VR5): n=3.271, Vasa Recta 6 (VR6): n=4.378, entzündete endotheliale Zellen (iEn): n=2.499, Vaskuläre glatte Gefäßmuskelzellen (VSMC): n=426, Perizyten 1 (Pel): n=455, Perizyten 2 (Pe2): n=188, Fibroblasten l(Fibl): n=761, Fibroblasten 2 (Fib2): n=208, Fibroblasten 3(Fib3): n=246, Myofibroblasten la (MFla): n=525, Myofibroblasten 1b (MFlb): n=306, proximale Tubuluszellen (PT): n=917, entzündete proximale Tubuluszellen (iPT): n=909, absteigender Ast der Henle-Schleife (DTL: n=806, Sammelrohre (CNT): n=662, Macula Densa Zellen (Mdc): n=869, aufsteigender Ast der Henle-Schleife 2 (TAL2): n=692, dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife 3 (TAL3): n=315, dicker aufsteigender Ast der Henle Schleife (TAL4): n=390, interkalierende Zellen 3 (IC3): n=62, interkalierende Zellen 4 (IC4): n=78, interkalierende Zellen 5 (IC5): n=33, interkalierende Zellen 6 (IC6): n=39, interkalierende Zellen 7 (IC7): n=40, interkalierende Zellen 9 (IC9): n=72, interkalierende Zellen A (IC-A): n=754, interkalierende Zellen B (IC-B), n=316, Urothelzellen (Ure): n=246, Podozyten (Pod): n=44, Schwannzellen: n=24). Zellcluster sind in den Spalten und Gene als Reihen dargestellt. Jede Spalte enthält die durchschnittliche Expression aller Zellen innerhalb eines Clusters. In Abbildung ld_l werden Expressionen von Genen dargestellt, die überexprimiert werden. In Abbildung ld_2 werden Gene mit einer depletierten/verminderten Genexpression dargestellt, e. Stratifizierung der einzelnen Zellen entsprechend der klinischen Parameter der Patienten CKD= chronische Nierenerkrankung, eGFR= berechnete glomeruläre Filtrationsrate), f. UMAP Darstellung von 31.875 CD 10+ (CD 10+) Einzelzell-Transkriptomen stratifiziert entsprechend den klinischen Parametern der Patienten, g. Log-fache Veränderung des Zellkyklus-Stadiums in epithelialen Zellen aus gesunden Probanden und Patienten mit CKD in Relation dargestellt zu einem Modell mit zufälliger Verteilung. Positive Zahlen repräsentieren Verstärkung, negative Zahlen repräsentieren Depletion, h. Aktivierung des KEGG Signalwegs in CD 10+ Zellen, i. Zellen von Patienten mit einer chronischen Nierenerkrankung zeigen häufiger eine erhöhte ECM Expression (EZM=Extrazelluläre Matrix, CD 10- Zellen), j. Violinen Blot Darstellung des EZM Score stratifiziert entsprechend des Zelltyps sowie der Unterscheidung Gesund/CKD in CD 10- Zellen. P-Werte der Unterschiede in den eGFR Kategorien: Mesenchymale Zellen (p<0,001), hnmunzellen (p<0,001), epitheliale Zellen (p<0,001), endotheliale Zellen (p<0,001). k. Violinen Blot Darstellung des EZM Scores fur mesenchymale Zellen stratifiziert entsprechend des Zelltyps und der Unterscheidung gesund/CKD. P-Werte der Unterschied in den eGFR Kategorien: Fibl (0,0001), Fib2 (n.s.), Fib3 (n.s.), MFla (n.s.), MFlb (n.s.), Pel (n.s.), Pe2 (n.s.), SMC (n.s.) 1. Anzahl der Zellen pro mesenchymalen Zelltyp und klinischen Parameter, m. UMAP Darstellung von Fibroblasten/Perizyten/Myofibroblasten aus 13 humanen Nieren (n=2.689). Die unterschiedlichen Zelltypen sind durch gestrichelte Linien voneinander getrennt. Durchgehende Linie verdeutlicht einen Abstammungsbaum (lineage tree) entsprechend der Vorhersage durch slingshot, n. Expression von ausgewählten Genen dargestellt in der UMAP aus Teilabbildung b. o. Darstellung von Perizyten, Fibroblasten und Myofibroblasten und der Expression von Collal als Diffusionskarte.
Abbildung 2. a. UMAP Darstellung von 37.800 PDGFRb+ Einzelzell-Transkriptomen aus 8 humanen Nieren. Die 4 größten Zellcluster sind durch gestrichelte Linien voneinander getrennt: epitheliale Zellen (n=461), endotheliale Zellen (n=2.341), Immunzellen (n=20.838), mesenchymale Zellen (n=25.385). Zelltypen wurden durch geblindete Clustering Analysen der Einzelzell-Transkriptome identifiziert (siehe Methoden): Fibroblasten 1 (Fibl), Fibroblasten 2 (Fib2), Fibroblasten 3 (Fib3), Perizyten (Pe), vaskuläre glatte Gefäßmuskelzellen (VSMCs), Mesangialzellen (Mesa), Myofibroblasten 1 (MF1), Myofibroblasten 2 (MF2), Myofibroblasten 3 (MF3), Mesangialzellen (Mesa), Makrophagen 1 (MCI), Makrophagen 2 (MC2), dendritische Zellen (DC), arterioläre endotheliale Zellen (Art), glomeruläre endotheliale Zellen (GC), vasa recta (VR), entzündetes Endothelium (iEn), proximale Tubuluszellen (PT), entzündete proximale Tubuluszellen (iPT), interkalierende Zellen (IC), Sammelrohr principal Zellen (PC), dicker aufsteigender Teil der Henle Schleife (TAL) b. Stratifizierung von einzelnen Zellen entsprechend der klinischen Parameter der Patienten (CKD = chronische Nierenerkrankungen, eGFR = kalkulierte glomeruläre Filtrationsrate), c. Expression von ausgewählten Genen dargestellt als UMAP aus Teilabbildung a. d. Skalierte Genexpression der TOP10 Gene in jedem Zellcluster. Gen Ranking pro Zellcluster wurde erstellt mittels genesorteR. Markierung der Zellcluster entspricht den Zellclustem aus Teilabbildungen a und b. Dargestellt werden die Zellen in den Spalten (jeweils 100 Zellen/Spalte) und die Gene in den Reihen. In Abbildung 2d_l werden Expressionen von Genen dargestellt, die überexprimiert werden. In Abbildung 2d_2 werden Gene mit einer depletierten/verminderten Genexpression dargestellt, e. Darstellung einer Diffusionskarte von PDGFRb+ Fibroblasten (FIb)/Myofibroblasten (MF)ZPericyten (Pe) (n=23.883) und der Expression von ausgewählten Genen. Linien verdeutlichen den 3 Abstammunslinien (lineage LI, L2 and L3) entsprechend der Vorhersage durch Slingshot, f. Repräsentative Abbildung einer multiplex RNA-in-situ Hybridisierung für Meg3, Notch3, Postn in n=35 humanen Nieren. Maßstableiste links 10 m, rechts 25 pm. Von oben nach unten: Darstellung RNA in situ Hybridisierung Meg3, Notch, Postn und Dapi/ nur Nachweis von Postn/Postn plus Notch-3/Postn plus Meg3/Postln plus DAPI. Quantifizierung von Meg3/Notch3 doppelt positiven Zellen, g. Oben links: Genexpression Dynamik für eine Überexpression über eine Pseudozeitachse für Lineage 1 (Perizyten zu Myofibroblasten, siehe e.). Zellen (in Spalten) wurden entlang der Pseudozeitachse angeordnet. Gene (in Reihen), die mit der Pseudozeit korrelieren, wurden ausgewählt und entlang der Pseudozeit geblottet (siehe Methoden). Jede Spalte enthält den Mittelwert von 10 Zellen. Gene wurden in 7 Gruppen entsprechend ihrer Pseudozeit Expressionsmuster zusammengefasst. Ausgewählte Beispiel-Gene sind aufgeführt. Unten links: Darstellung entsprechend oben links jedoch werden verminderte Genexpressionen dargestellt. Oben rechts: Zellzyklusphasen als Prozent von jeweils 2000 Zellen werden in Abhängigkeit der Pseudozeit. Unten rechts: Verstärkung der PID Signalkaskade in Abhängigkeit der Pseudozeit.
Abbildung 3. a. Oben: Design des Zellverfolgungsexperiments (fate tracing experiment). Unten: Darstellung der PDGFRbCreER-tdTomato positiven Zellen in der Maus Niere im Modell der UUO (unilateralen Ureter Obstruktion) und in der Kontroll-operierten Maus (SHAM). Oben: Nachweis von PDGFRß-tdtom und DAPI; Mitte: Nachweis von PDGFRß- tdtom; Unten: Nachweis von DAPI b. Repräsentative Abbildung einer Collal in-situ Hybridisierung von einer PDGFRbCreER;tdTomato Niere nach UUO Operation. Von oben nach unten: Nachweis von PDGFRß-tdtom + Coll + DAPI/ Nachweis von Coll/ Nachweis von PDGFRß-tdtom + Coll/ Nachweis von Coll + DAPI c. Prozentsatz an Collal-mRNA exprimierenden Zellen, die tdTomato ko-exprimieren, am Tag 10 nach UUO Induktion (n = 3). d. Design des UUO Experiments im Zeitverlauf. Die UUO wurde in PDGRb-eGFP Mäusen induziert und eGFP positive Einzelzellen aus den Mausnieren an den Tagen 0, 2 und 10 nach UUO Induktion isoliert und mittels Smart-Seq v2 analysiert, e. UMAP Darstellung der isolierten Zellen aus dem UUO Zeitverlauf Experiment (siehe d). Zelltypen wurden durch geblindetes Clustering (siehe Methoden) identifiziert (parietale epitheliale Zellen (PECs): n=68, Matrix produzierende Zellen (MP): n=76, entzündete smooth muscle Zellen 1 (iSMCsl): n=112, entzündete smooth muscle Zellen 2 (iSMCs2): n=77, entzündete smooth muscle Zellen 3 (iSMCs3): n=76, Mesangialzellen (Mesa): n=74, Perizyten 1 (Pel): n=113, Renin produzierende smooth muscle Zellen (rSMC): n=101, smooth muscle Zellen 1 (SMC1): n=172, Perizyten 2 (Pe2): n=83). f. Prozent an Zelltypen die zu den angegebenen Zeitpunkten nachgewiesen werden konnten. Jede Spalte präsentiert 100 Zellen, g. Expression von ausgewählten Genen in allen 10 Zellclustem. h. Expression von ausgewählten Genen dargestellt in der UMAP aus Teilabbildung e. i. Immuno-fluoreszenz (IF) Färbung von Kontroll-operierten (SHAM) und UUO (TaglO) Mausnieren zeigt eine Pdgfra Expression in einer Subpopulation von PDGFRbCreER;tdTomato positiven Zellen (Pfeile). Von links nach rechts: Darstellung PDGFRbCreERtdTomato + PDGFRa + DAPI/ Darstellung PDGFRbCreERtdTomato/ Darstellung PDGFRa/Darstellung DAPI j. RNA in-situ Hybridisierung zeigt eine Ko-Lokalisation der Coll al Expression in PDGFRa/PDGFRb doppelt-positiven Zellen. Collal/PDFGRa/PDFRb Triple-positive Zellen (Pfeile) sind vereinzelt im Interstitium der Niere nachweisbar. Von oben nach unten: Darstellung PDGFR- a + Collal + PDGFRb + DAPI/ Darstellung PDGFR-a/ Darstellung PDGFR-a + Collal/ Darstellung PDGFR-a + PDGFRb/ Darstellung PDGFR-a + DAPI k. Links: Collal Expression und ECM Score in CD 10 negativen Zellen (Abbildung Ib-c) stratifiziert entsprechend der PDGFRa und PDGFRb Expression. Rechts: Prozent von Collal positiven und negative Zellen im gleichen Datensatz, stratifiziert wie oben beschrieben. Collal negative Zellen sind nachweisbar in PDGFRa/b doppelt-negativen Zellen, während Collal positive Zellen überwiegend in PDGFRa/b doppelt-positiven Zellen vorkommen. Gruppenvergleich: (andere Gene) vs. (a/b): p<0,001, (a-) vs. (a/b): p<0,001, (b) vs. (a/b): p<0,001, (andere Gene) vs. (a): p<0,001, (b) vs. (a): p<0,001, (andere Gene) vs. (b):p<0,001. Bonferroni korrigierte p-Werte basierend auf Wilcoxon rank sum Test. 1. Verteilung des IF/TA-Score von 62 Patienten und repräsentative Abbildung eines Trichrome-gefarbten humanen Nierengewebe Arrays (TMA) gefärbt mittels einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung mit PDGFRa, PDGFRb and Collal Sonden und einer Zellkemfärbung (DAPI) von 62 Nieren (links), durchschnittliche Collal Epression in den in-situ Hybridisierungsdaten stratifiziert aufgrund der Detektion von PDGFRa/PDGFRb im gleichen Datensatz (Mitte) und Prozent von Collal positiven und negativen Zellen im geliehen Datensatz (Stratifizierung siehe oben) (rechts). Gruppenstatisitik: (a/b) vs. (collal): p<0,001, (a/b) vs. (b): p<0,001, (a/-) vs. (a): p<0,001. Bonferroni korrigierte p-Werte basierend auf Wilcoxon rank sum Test. Maßstableiste: in a 1000 pm, in b 10 pm, in i+j 50 pm, in k 10 pm. Multiplex RNA in situ Hybridisierung von oben nach unten: Nachweis Coll al + PDGFRa + PDGFRb + DAPI/ Nachweis Collal/ Nachweis Coll + PDGFRa/ Nachweis Collal + PDGFRb/Nachweis coli + DAPI
Abbildung 4. a. Schematische Darstellung des UUO Experiments. UUO wurde durchgefuhrt in PDGRb-eGFP Mäusen. eGFP+/PDGFRb+ Einzelzellen wurden aus den murinen Nieren isoliert und mit Hilfe des lOx Genomics drop-seq zu den Zeitpunkten Tag 0 and 10 nach UUO analysiert (jeweils n=5). b. Flow cytometrische Quantifizierung von PDGFRa, PDGFRb und PDGFRa/b exprimierenden Zellen am Tag 10 nach UUO Induktion im Vergleich zu Kontroll-operierten Tieren. *p<0.05; **p<0.01 im einseitigen ANOVA Test mit post-hoc Bonferroni Korrektur, c. Links: Die UMAP umfasst Zellen, die im UUO Experiment (siehe a) isoliert wurden (n=7.245). Es konnten 4 große Zellcluster identifiziert werden (epitheliale (n=223), endotheliale (n=370), Immun- (n=199), mesenchymale (n=6.633) Zellen. Durch verbündete Cluster Analyse der Einzelzell-Transkriptome (siehe Methoden) konnten 10 Zelltypen unterschieden werden. Fibroblasten 1 (Fibl), Myofibroblasten 1 (MF1), Myofibroblasten 2 (MF2), Myofibroblasten 3 (MF3), endotheliale Zellen (EC), entzündete proximale Tubuluszellen (iPT), nicht bestimmte mesenchymale Zellen (uM), Makrophagen/Monozyten (MC). Rechts: Prozentualer Anteil der Zellen pro Cluster in der UUO oder Kontroll-operierten Mäusen, d. Expression von ausgewählten Genen in den verschiedenen Zell-Clustem (Abkürzungen siehe c). e. Darstellung des Extrazellulären Matrix Score (ECM Score) in Form des UMAP aus Teilabbildung c. f. Die Expression von Coll5al in den verschiedenen Zellclustem dargestellt als Violinen Blot. Es werden nur mesenchymale Zellen gezeigt, g. Darstellung des Kollagen Scores in den verschiedenen Zellclustem als Violinen Blot. Es werden nur mesenchymale Zellen gezeigt. Der Kollagen Score ist die durchschnittliche Expression der Kem-Kollagene wie von Nabe et al. publiziert, h. Representative Abbildung einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung zum Nachweis von PDGFRa, PDGFRb und Meg3 in n=34 humanen Nieren. Meg3 ko-localisiert mit PDGFRa und PDGFRb. Von oben nach unten: Darstellung Meg3 + PDGFRa + PDGFRb + DAPI/ Darstellung Meg3/ Darstellung Meg3 + PDGFRa/ Dastellung Meg3 + PDGFRb/Darstellung Meg3 + DAPI i. Prozent von Meg3 positiven-Zellen an PDGFRa/b doppelt-positiven Zellen; quantifiziert mittels RNA in-situ Hybridisierung, j. Darstellung von Fibroblasten und Myofibroblasten (n = 6.557) in Form einer UMAP (links) und Diffusionkarte (rechts). Zellclustem entsprechen Teilabbildung c. Die schwarzen durchgezogenen Linien verdeutlichen die Abstammungen (lineage tree) entsprechend der Berechnung durch Slingshot. Unten: Expression von ausgewählten Genen dargestellt auf einer analogen UMAP. k. Signalweg Enrichment in denselben mesenchymalen Zellclustem.
Abbildung 5. a. Expression von Nkd2 dargestellt als UMAP aus Abbildung 4c. (murine Pdgfra/b doppelt-positive Zellen), b. Prozent von Collal positiven und negative Zellen (Daten siehe a) stratifiziert entsprechend der Pdgfra and Nkd2 Expression. Collal negative Zellen sind zumeist PDGFRa/Nkd2 doppelt-negative Zellen, während Collal positive Zellen zumeist auch PDGFRa/Nkd2 doppelt-positiv sind. c. Skalierte Genexpression von Genen, deren Expression positiv- (Abbildung 5c_l) oder negativ-(Abbildung 5c_2) korreliert zur Nkd2 Expression in humanen PDGFRb- Zellen, dargestellt in Abbildung Fig.2 a-c. d. Repräsentative Abbildung einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung von PDGFRa, PDGFRb und NKD2 in n=36 humanen Nieren. Von oben nach unten: Darstellung NKD2 + PDGFRa + PDGFRb + DAPI/ Darstellung NKD2/Darstellung NKD2 + PDGFRa/Darstellung NKD2 + PDGFRb/Darstellung NKD2 + DAPI e. Prozent NKD2+ Zellen von PDGFRa/PDGFRb doppelt-positiven Zellen, quantifiziert aus einer RNA in-situ Hybridisierung von Patienten mit einer schwachen oder starken interstitiellen Fibrose (geblindet scored durch einen Nephropathologen) f. Western blot Verifikation einer lentiviralen Nkd2 Überexpression. Ein HA-tag wurde dem exogen überexprimierten Protein angehängt, g. Expression von Collal, Fibronectin (Fn) and Acta2 (aSMA) quantifiziert durch qPCR nach Nkd2 Überexpression in humanen immortalisierten PDGFRb+ Zellen, die mit transforming growth factor beta (TGFb) oder vehicle (PBS) behandelt wurden, h. Verifikation des Nkd2 knock-outs mittels Western-blot Analyse in multiplen Einzelzellklonen (1,2,3) im Vergleich zu non targeting gRNA Klonen (NTG). Die Nkd2 Proteinexpression ist in Klon 2 aufgrund einer großen Insertion komplett deletiert, während in den Klonen lund 3 nur eine reduzierte Nkd2 Proteinexpression durch kleinere indel j. GSEA (Gene set enrichment analysis) von ECM Genen in Nkd2-dysregulierten PDGFRb- Nierenzellen. „Shallow“ wurde nachgewiesen in den Klonen 1+3, in denen das NKD2 Protein weiterhin nachweisbar ist. „Severe“ wurde in Klon 2 nachgewiesen, k. Veränderung der Stärke der PID Signalkaskade in PDGFRb+ NKD2-KO Klonen und Überexpression (up bedeutet verstärkte Regulation der Gene unter den indizierten Kondition und down bedeutet verringert regulierte Gene) 1. Repräsentative Abbildung einer multiplex RNA in-situ Hybridisierung von PDGFRa, PDGFRb und NKD2 in humanen iPSC-abstammenden Nieren- Organoiden. Von oben nach unten: Nachweis von Nkd2 + PDGFRa + Collal + DAPI/ Nachweis von Nkd2/ Nachweis von Nkd2 + PDGFRa/ Nachweis von Nkd2 + Collal/ Nachweis von Nkd2 + DAPI m. Quantifizierung der Fluoreszenz Intensität von NKD2 in Nieren Organoiden, n. Immunofluoreszenz Färbung von Collal (schwarz) in iPSC- abstammenden Nieren-Organoiden. o. Quantifizierung des Kollagengehalts in Nieren- Organoiden. ##p<0.01, ####p<0.0001 1 way ANOVA followed by Bonferroni’ post-hoc test (vs. control NTG). *P < 0.05, **p< 0.01, and ***p < 0.001, ****p <0.0001 in t Test (e+m) oder 1 -seifigen ANOVA mit anschließenden Bonferroni’ post-hoc Test (g, i vs. TGFb NTG)). Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standartabweichung. Maßstableiste: in c 10 |un, in 1+n 50 pm.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Bevor die Erfindung im Detail beschrieben wird, ist es zu verstehen, dass diese Erfindung nicht auf die besonderen Bestandteile der beschriebenen Geräte oder Prozessschritte der beschriebenen Methoden beschränkt ist, da solche Geräte und Methoden variieren können. Es ist auch zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie nur zur Beschreibung bestimmter Ausfiihrungsformen dient und nicht als Einschränkung gedacht ist. Es ist zu beachten, dass die in der Beschreibung und den angehängten Ansprüchen verwendeten Singularformen "ein", "eine" und "die" Singular- und/oder Pluralreferenzen einschließen, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Falls Parameterbereiche angegeben werden, die durch numerische Werte begrenzt sind, wird davon ausgegangen, dass die Bereiche diese Begrenzungswerte einschließen.
Es ist ferner zu verstehen, dass die hier offengelegten Ausfiihrungsformen nicht als einzelne Ausfiihrungsformen zu verstehen sind, die sich nicht aufeinander beziehen würden. Merkmale, die im Zusammenhang mit einer Ausfiihrungsform diskutiert werden, sollen auch im Zusammenhang mit anderen hier gezeigten Ausfiihrungsformen offenbart werden. Wenn in einem Fall ein bestimmtes Merkmal nicht mit einer Ausfiihrungsform, sondern mit einer anderen offenbart wird, würde der Fachmann verstehen, dass dies nicht unbedingt bedeutet, dass dieses Merkmal nicht mit der anderen Ausfiihrungsform offenbart werden soll. Der Fachmann wird verstehen, dass es der Sinn dieser Anmeldung ist, dieses Merkmal auch für die andere Ausfiihrungsform zu offenbaren, dass dies aber aus Gründen der Klarheit und um die Spezifikation in einem überschaubaren Umfang zu halten, nicht getan wurde. Ferner wird der Inhalt der hierin genannten Dokumente des Standes der Technik durch Bezugnahme einbezogen. Dies gilt insbesondere für Dokumente des Standes der Technik, die Standard- oder Routineverfahren offenbaren. In diesem Fall hat die Einbeziehung durch Bezugnahme vor allem den Zweck, eine ausreichende Offenbarung zu ermöglichen und langwierige Wiederholungen zu vermeiden.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine gegebene Zelle, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
(i) Hemmen oder Reduzieren der nkd2-Genexpression in der Zelle
(ii) Fördern des Abbaus des NKD2-Proteins in der Zelle, und/oder
(iii) Hemmen oder Reduzieren der NKD2-Proteinaktivität in der Zelle.
Die Hemmung oder Reduzierung der nkd2-Genexpression kann beispielsweise durch nkd2- Gen-Knock-down, Knock-out, konditionalen Gen-Knock-out, Genveränderung, RNA- Interferenz, siRNA und/oder Antisense-RNA erreicht werden. Die Hemmung oder Reduzierung der nkd2-Genexpression kann beispielsweise durch Antisense-Moleküle wie Antisense-Oligonukleotide, Antisense-Konjugate oder katalytische Nukleinsäure-Moleküle wie Ribozyme erreicht werden. Solche Moleküle können in der Zelle mit Hilfe von Expressionsvektoren hergestellt oder von außen in die Zelle eingeschleust werden.
Dabei können die Antisense-Oligonukleotide chemisch modifiziert werden, um ihre Stabilität und/oder Bindungsaffinität zu erhöhen. Die chemische Modifizierung der Rückgrat-Chemie von Antisense-Oligonukleotiden beispielsweise durch Phosphorothioate, Phosphorodithioate. Phosphoroamidite, Alkyl-Phosphotriester oder Boranophosphate wurde im Stand der Technik beschrieben (z.B. WO00/49034A1).
Die Förderung des Abbaus des NKD2-Proteins in der Zelle kann beispielsweise durch Proteasen oder andere proteolytische Moleküle erreicht werden. Diese können in der Zelle mittels Expressionsvektoren heterolog synthetisiert oder durch eine Steigerung der homologen Genexpression protease-codierender Gene in der Zelle vermehrt synthetisiert oder von außen in die Zelle eingeschleust werden. Die Hemmung oder Reduzierung der NKD2-Proteinaktivität kann durch Verwendung eines Wirkstoffs erreicht werden, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet.
Vorzugsweise ist die gegebene Zelle eine Nierenzelle, mehr bevorzugt eine Nieren- Myofibroblastenzelle, am meisten bevorzugt eine terminal differenzierte Nieren- Myofibroblastenzelle.
Das NKD2-Protein hat sich als WNT- Antagonist erwiesen. Die Naked Cuticle (NKD)- Familie umfasst die nackte Kutikula von Drosophila und ihre beiden Vertebraten-Orthologe, das Naked Cuticle Homolog 1 (NKD1) und 2 (NKD2). Der Nkd2-Genlokus befindet sich auf dem Chromosom 5p 15.3. Ein Verlust der Heterozygotie wurde in diesen Regionen bei verschiedenen Tumorarten, einschließlich Brustkrebs, häufig gefunden. Es wurde berichtet, dass sowohl NKD1 als auch NKD2 die kanonische Wnt-Signalisierung antagonisieren, indem sie über ihre EF-Hand-ähnlichen Motive mit Dishevelled interagieren (Hu et al 2006). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass NKD2 über seine TGFa-Bindungsregion an Dishevelled bindet (Li et al. 2004). Humanes NKD1 und 2 sind nur zu 40 % identisch zueinander, während sie zu ihren jeweiligen Orthologen in der Maus zu etwa 70 % identisch sind.
Der C-Terminus von NKD2 ist hochgradig ungeordnet, während der N-Terminus von NKD2 den größten Teil der funktionellen Domäne enthält, die Myristoylierung, ein EF-Hand-Motiv, eine Dishevelled-Bindungsregion und ein Vesikelerkennungs- und Membrantargeting-Motiv umfasst (Li et al 2004; Rousset et al 2001; Zeng et al 2000). Es wird angenommen, dass NKD2 durch seine verschiedenen funktionellen Motive als Schalterprotein fungiert (Hu et al 2006). Die Promotorregion von NKD2 ist in Glioblastomzellen hypermethyliert.
Wie hierin beschrieben, haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung NKD2 als therapeutisches Ziel für die Behandlung von Nierenfibrose identifiziert. Es wurde festgestellt, dass Nkd2 ausschließlich in terminal differenzierten PDGFRa+/PDGFRb+ Myofibroblasten exprimiert wird, die hohe Expressionswerte des extrazellulären Matrixproteins Kollagen- 1 aufweisen. Dieses und andere Matrixproteine werden von Myofibroblasten produziert, die überwiegend durch Differenzierung aus Fibroblasten und Perizyten entstehen. Mehr als 40 % aller Kollagen- 1 -produzierenden Zellen sind nachweislich Nkd2/PDGFRa+. Zellen, die Markerproteine für Perizyten und Fibroblasten exprimieren und nur geringe Mengen an Matrixproteinen sezemieren, fehlt die Nkd2-Expression. Darüber hinaus wurde in Nkd2- exprimierenden Myofibroblasten eine erhöhte Aktivität von pro-fibrotischen Signaltransduktionswegen, wie TGF-, Wnt- und TNF-Signaltransduktionswegen, nachgewiesen. In Nkd2-Überexpressions- bzw. Depletionsexperimenten wurde gezeigt, dass Nkd2 für die Produktion von extrazellulären Matrixproteinen relevant ist. Lentivirale Überexpression von Nkd2 in humanen Fibroblasten führte zu einer erhöhten Expression von pro-fibrotischen Matrixproteinen wie Kollagen-1 und Fibronektin nach Stimulation durch den pro-fibrotischen Faktor TGF-. Es konnte gezeigt werden, dass der CRISPR/Cas9-vermittelte Knockout von Nkd2 zu einer signifikanten Reduktion der Expression von Kollagen-1, Fibronektin und ACTA2 führt. Knock-down von Nkd2 mittels siRNA in Organoiden, die alle Kompartimente der humanen Niere umfassen, in denen durch Stimulation mit IL1-13 fibrotische Veränderungen induziert worden waren, führte nachweislich zu einer reduzierten Kollagen-1 -Expression und Fibrose.
Bei dem NKD2-Protein kann es sich um ein Säugetier-, Nicht-Primaten-, Primaten- und insbesondere um ein humanes NKD2-Protein oder ein Fragment davon handeln.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) Protein oder ein Fragment davon bindet.
Das Verfahren kann mindestens die folgenden Schritte umfassen
(i) Bereitstellen des NKD2-Proteins oder eines Fragments davon,
(ii) Zugabe von mindestens einem Wirkstoff, der auf Bindung an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon untersucht werden soll, und
(iii) Identifizieren des mindestens einem Wirkstoff, der an das NKD2-Protein oder das Fragment davon gebunden hat.
Vorzugsweise ist der zu screenende und zu identifizierende Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung ein NKD2-Inhibitor oder -Antagonist.
Der Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus der Gruppe bestehend aus einer niedermolekularen Verbindung, einem Peptid und einem Biologikum ausgewählt werden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "niedermolekulare Verbindung", "kleines Molekül" ("smol") oder "chemisches Arzneimittel" auf eine organische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (< 1.000 Dalton), oft mit einer Größe in der Größenordnung von 1 nm. Viele Medikamente sind kleine Moleküle. Solche kleinen Moleküle können einen biologischen Prozess regulieren. Kleine Moleküle können in der Lage sein, eine spezifische Funktion eines Proteins zu hemmen. Im Bereich der Pharmakologie bezieht sich der Begriff "kleines Molekül" insbesondere auf Moleküle, die an spezifische biologische Makromoleküle binden und als Effektor wirken, indem sie die Aktivität oder Funktion eines Ziels verändern. Zum Beispiel gilt Acetylsalicylsäure (ASS) als niedermolekulare Verbindung, die 180 Dalton misst und aus 21 Atomen besteht. Solche niedermolekularen Verbindungen haben oft nur eine geringe Fähigkeit, eine Immunreaktion auszulösen und bleiben über die Zeit relativ stabil.
Das "Biologikum", "biologische Arzneimittel", "biologische Therapeutikum" oder "Biopharmazeutikum" gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon oder ein antigenbindendes Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein oder ein Aptamer.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das NKD2 -Protein oder ein Fragment davon bindet, ist der Wirkstoff Mitglied einer V erbindungsbibliothek.
Die Verbindungsbibliothek kann z. B. niedermolekulare Verbindungen, Peptide bzw. biologische Verbindungen umfassen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "(kombinatorische) Verbindungsbibliothek" auf Sammlungen von chemischen Verbindungen, kleinen Molekülen, Peptiden oder Makromolekülen wie Proteinen, in denen mehrere verschiedene Kombinationen verwandter chemischer, peptidischer oder biologischer Spezies enthalten sind, die zusammen in bestimmten Screening-Assays oder Identifizierungsschritten verwendet werden können.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die für das Naked Cuticle Homolog 2 oder ein Fragment davon oder das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein oder ein Fragment davon kodiert, in einem Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an NKD2 oder ein Fragment davon bindet, wie oben beschrieben.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment oder Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein, das spezifisch an das NKD2-Protein bindet.
Vorzugsweise hemmt der Antikörper oder das antigenbindende Fragment oder Derivat davon oder das antikörperähnliche Protein die NKD2-Aktivität, d.h. wirkt als Inhibitor oder Antagonist von NKD2.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Antikörper" auf ein Protein, das aus einer oder mehreren Polypeptidketten besteht, die von Immunglobulin-Genen oder Fragmenten von Immunglobulin-Genen oder von diesen abgeleiteten cDNAs kodiert werden. Zu diesen Immunglobulin-Genen gehören die Gene der leichten Kette kappa, lambda und der schweren Kette alpha, delta, epsilon, gamma und mu der konstanten Region sowie jedes der vielen verschiedenen Gene der variablen Region.
Die grundlegende Struktureinheit des Immunglobulins (Antikörpers) ist normalerweise ein Tetramer, das aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten besteht, den leichten Ketten (L, mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa) und den schweren Ketten (H, mit einem Molekulargewicht von etwa 50-70 kDa). Jede schwere Kette besteht aus einer variablen Region der schweren Kette (abgekürzt als VH oder VH) und einer konstanten Region der schweren Kette (abgekürzt als CH oder CH). Die konstante Region der schweren Kette besteht aus drei Domänen, nämlich CHI, CH2 und CH3. Jede leichte Kette enthält eine variable Region der leichten Kette (abgekürzt als VL oder VL) und eine konstante Region der leichten Kette (abgekürzt als CL oder CL). Die VH- und VL-Regionen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, die auch als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) bezeichnet werden, durchsetzt mit Regionen, die eher konserviert sind und als Framework-Regionen (FR) bezeichnet werden. Jede VH- und VL-Region besteht aus drei CDRs und vier FRs, die vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der Reihenfolge FR1, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 angeordnet sind. Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten bilden eine Bindungsdomäne, die mit einem Antigen interagiert.
Die CDRs sind am wichtigsten für die Bindung des Antikörpers bzw. des antigenbindenden Teils davon. Die FRs können durch andere Sequenzen ersetzt werden, sofern die dreidimensionale Struktur, die für die Bindung des Antigens erforderlich ist, erhalten bleibt. Strukturelle Veränderungen des Konstrukts führen meist zu einem Verlust der ausreichenden Bindung an das Antigen.
Der Begriff "antigenbindender Teil" des (monoklonalen) Antikörpers bezieht sich auf ein oder mehrere Fragmente eines Antikörpers, die die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an das Antigen in seiner nativen Form beibehalten. Beispiele für antigenbindende Teile des Antikörpers umfassen ein Fab-Fragment, ein monovalentes Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CHI -Domänen besteht, ein F(ab')2-Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Schamierregion verbunden sind, ein Fd-Fragment, bestehend aus der VH- und CHl-Domäne, ein Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers, und ein dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne und einer isolierten komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) besteht.
Der Antikörper, das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein monoklonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann vom Isotyp IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "monoklonaler Antikörper (mAb)" auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation, d.h. einer homogenen Population, die aus einem ganzen Immunglobulin oder einem Fragment oder Derivat davon besteht. Besonders bevorzugt ist ein solcher Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgG, IgD, IgE, IgA und/oder IgM, oder ein Fragment oder Derivat davon.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Fragment" auf Fragmente eines solchen Antikörpers, die Zielbindungskapazitäten beibehalten, z. B. eine CDR (komplementaritätsbestimmende Region), eine hypervariable Region, eine variable Domäne (Fv), eine schwere IgG-Kette (bestehend aus VH-, CHI-, Scharnier-, CH2- und CH3- Regionen), eine leichte IgG-Kette (bestehend aus VL- und CL-Regionen) und/oder eine Fab und/oder F(ab)2.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Derivat" auf Proteinkonstrukte, die sich strukturell von dem gängigen Antikörperkonzept unterscheiden, aber dennoch eine gewisse strukturelle Verwandtschaft zu diesem aufweisen, z. B. scFv, Fab und/oder F(ab)2, sowie auf bi-, tri- oder höher spezifische Antikörperkonstrukte. Alle diese Elemente werden im Folgenden erläutert.
Weitere dem Fachmann bekannte Antikörperderivate sind Diabodies, Camelid-Antikörper, Domain-Antikörper, bivalente Homodimere mit zwei Ketten, die aus scFvs bestehen, IgAs (zwei IgG-Strukturen, die durch eine J-Kette und eine sekretorische Komponente verbunden sind), Hai-Antikörper, Antikörper, die aus Neuwelt-Primaten-Gerüst plus Nicht-Neuwelt- Primaten-CDR bestehen, dimerisierte Konstrukte, die CH3+VL+VH umfassen, andere Gerüstproteinformate, die CDRs umfassen, und Antikörperkonjugate.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "antikörperähnliches Protein" auf ein Protein, das (z. B. durch Mutagenese von Ig-Schleifen) so verändert wurde, dass es spezifisch an ein Zielmolekül bindet. Typischerweise umfasst ein solches antikörperähnliches Protein mindestens eine variable Peptidschleife, die an beiden Enden an ein Proteingerüst gebunden ist. Diese doppelte strukturelle Einschränkung erhöht die Bindungsaffinität des antikörperähnlichen Proteins auf ein Niveau, das mit dem eines Antikörpers vergleichbar ist. Die Länge der variablen Peptidschleife besteht typischerweise aus 10 bis 20 Aminosäuren. Das Gerüstprotein kann jedes Protein mit guten Löslichkeitseigenschaften sein. Vorzugsweise ist das Gerüstprotein ein kleines globuläres Protein. Antikörperähnliche Proteine umfassen ohne Einschränkung Affibodies, Anticalins und designte Ankyrin-Proteine und Affilin-Proteine. Antikörperähnliche Proteine können aus großen Bibliotheken von Mutanten abgeleitet werden, z. B. durch Panning aus großen Phage-Display-Bibliotheken, und können in Analogie zu regulären Antikörpern isoliert werden. Auch können antikörperähnliche Bindungsproteine durch kombinatorische Mutagenese von oberflächenexponierten Resten in globulären Proteinen erhalten werden. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Fab" auf ein IgG-Fragment, das die Antigenbindungsregion umfasst, wobei das Fragment aus einer konstanten und einer variablen Domäne von jeder schweren und leichten Kette des Antikörpers zusammengesetzt ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "F(ab)2" auf ein IgG-Fragment, das aus zwei Fab-Fragmenten besteht, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind.
Der hier verwendete Begriff "scFv" bezieht sich auf ein variables Einzelkettenfragment, das eine Fusion der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen ist, die durch einen kurzen Linker miteinander verbunden sind, der üblicherweise Serin- (S) und/oder Glycin- (G) Reste umfasst. Dieses chimäre Molekül behält die Spezifität des ursprünglichen Immunglobulins bei, trotz der Entfernung der konstanten Regionen und der Einführung eines Linker-Peptids.
Modifizierte Antikörperformate sind z. B. bi- oder trispezifische Antikörperkonstrukte, antikörperbasierte Fusionsproteine, Immunkonjugate und ähnliches.
IgG, scFv, Fab und/oder F(ab)2 sind Antikörperformate, die dem Fachmann gut bekannt sind. Entsprechende Aktivierungstechniken sind in entsprechenden Lehrbüchern zu finden.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment davon oder das antigenbindende Derivat davon ein muriner, ein chimärer, ein humanisierter oder ein humaner Antikörper bzw. ein antigenbindendes Fragment oder ein antigenbindendes Derivat davon.
Monoklonale Antikörper (mAb), die von der Maus stammen, können unerwünschte immunologische Nebenwirkungen verursachen, da sie ein Protein einer anderen Spezies enthalten, das Antikörper auslösen kann. Um dieses Problem zu überwinden, wurden Methoden zur Humanisierung und Reifung von Antikörpern entwickelt, um Antikörpermoleküle mit minimaler Immunogenität bei Anwendung am Menschen zu erzeugen, während die Spezifität und Affinität des nicht-humanen Eltemantikörpers im Idealfall erhalten bleibt. Bei diesen Methoden werden z. B. die Gerüstregionen eines Maus- mAbs durch entsprechende humane Gerüstregionen ersetzt (sog. CDR-Grafting). W0200907861 offenbart die Erzeugung humanisierter Formen von Maus-Antikörpern durch Verknüpfung der CDR-Regionen nicht-humaner Antikörper mit humanen konstanten Regionen mittels rekombinanter DNA-Technologie. US6548640 von Medical Research Council beschreibt CDR-Transplantationstechniken, und US5859205 von Celltech beschreibt die Herstellung humanisierter Antikörper.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "humanisierter Antikörper" auf einen Antikörper, ein Fragment oder ein Derivat davon, bei dem mindestens ein Teil der konstanten Regionen und/oder der Gerüstregionen und optional ein Teil der CDR-Regionen des Antikörpers von humanen Immunglobulinsequenzen abgeleitet oder an diese angepasst ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, der durch das oben beschriebene Identifikationsverfahren erhalten wird.
Der Wirkstoff hat die Fähigkeit, spezifisch an das Protein Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) zu binden. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform bindet der Wirkstoff spezifisch mit einer hohen oder besonders hohen Affinität und/oder Avidität an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform reduziert oder hemmt der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2- Aktivität.
Der Begriff "spezifisch binden", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass der Wirkstoff eine Dissoziationskonstante KD zum NKD2-Proteinmolekül oder Epitop davon von höchstens etwa 100 M aufweist. In einer Ausfuhrungsform ist die KD etwa 100 M oder niedriger, etwa 50 M oder niedriger, etwa 30 M oder niedriger, etwa 20 M oder niedriger, etwa 10 M oder niedriger, etwa 5 M oder niedriger, etwa 1 M oder niedriger, etwa 900 nM oder niedriger, etwa 800 nM oder niedriger, etwa 700 nM oder niedriger, etwa 600 nM oder niedriger, etwa 500 nM oder niedriger, etwa 400 nM oder niedriger, etwa 300 nM oder niedriger, etwa 200 nM oder niedriger, etwa 100 nM oder niedriger, etwa 90 nM oder niedriger, etwa 80 nM oder niedriger, etwa 70 nM oder niedriger, etwa 60 nM oder niedriger, etwa 50 nM oder niedriger, etwa 40 nM oder niedriger, etwa 30 nM oder niedriger, etwa 20 nM oder niedriger, oder etwa 10 nM oder niedriger, etwa 1 nM oder niedriger, etwa 900 pM oder niedriger, etwa 800 pM oder niedriger, etwa 700 pM oder niedriger, etwa 600 pM oder niedriger, etwa 500 pM oder niedriger, etwa 400 pM oder niedriger, etwa 300 pM oder niedriger, etwa 200 pM oder niedriger, etwa 100 pM oder niedriger, etwa 90 pM oder niedriger, etwa 80 pM oder niedriger, etwa 70 pM oder niedriger, etwa 60 pM oder niedriger, etwa 50 pM oder niedriger, etwa 40 pM oder niedriger, etwa 30 pM oder niedriger, etwa 20 pM oder niedriger oder etwa 10 pM oder niedriger oder etwa 1 pM oder niedriger.
Der Wirkstoff kann zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung dienen, insbesondere wobei die chronische Nierenerkrankung eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist.
Der Wirkstoff kann eine niedermolekulare Verbindung (smol), ein Peptid oder ein Biologikum sein, wobei das Biologikum vorzugsweise ein Antikörper, ein Fragment davon oder ein Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein oder ein Aptamer ist.
Die niedermolekulare Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann neben anderen chemischen Rückgraten, Substituenten, Gruppen oder Resten beispielsweise Alkyl-, Alkenyl- , Alkinyl-, Alkoxy-, Aryl-, Alkylen-, Arylen-, Amino-, Halogen-, Carboxylatderivat-, Cycloalkyl-, Carbonylderivat-, Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylen-, Sulfonat-, Sulfat-, Phosphonat-, Phosphat-, Phosphin-, Phosphinoxidgruppen umfassen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Wirkstoffs, der an das Protein Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) bindet und/oder dieses hemmt, in einem Verfahren zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hemmt der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2-Aktivität.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet und/oder dieses hemmt, in einer therapeutisch wirksamen Menge oder Dosis an ein menschliches oder tierisches Subjekt umfasst.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "wirksame Menge" eine Dosis oder eine Menge, die wirksam ist, in Dosierungen und für Zeiträume, die notwendig sind, um ein gewünschtes Ergebnis zu erzielen. Wirksame Mengen können in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Krankheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht und/oder dem Gewicht des Patienten, der pharmazeutischen Formulierung, der Unterart der zu behandelnden Krankheit und dergleichen variieren, können aber dennoch von einem Fachmann routinemäßig bestimmt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrtifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die den Antikörper oder das antigenbindende Fragment oder Derivat davon oder das antikörperähnliche Protein, wie oben beschrieben, oder den Wirkstoff, wie oben beschrieben, und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe umfasst. Vorzugsweise können die Hilfsstoffe aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus pharmazeutisch akzeptablen Puffern, Tensiden, Verdünnungsmitteln, Trägem, Hilfsstoffen, Füllstoffen, Bindemitteln, Schmiermitteln, Gleitmitteln, Sprengmitteln, Adsorbentien und/oder Konservierungsmitteln besteht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend
(i) das Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon bindet und/oder dieses hemmt, wie oben beschrieben, und ferner
(ii) Mischen des identifizierten Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die eine Kombination aus (i) dem Antikörper oder antigenbindenden Fragment oder Derivat davon oder antikörperähnlichem Protein, wie oben beschrieben, oder dem Wirkstoff, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet, wie oben beschrieben, oder der pharmazeutischen Zusammensetzung, wie oben beschrieben, und (ii) einer oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Verbindungen umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Puffer, Tenside, Verdünnungsmittel, Träger, Exzipienten, Füllstoffe, Bindemittel, Gleitmittel, Desinfektionsmittel, Adsorptionsmittel und/oder Konservierungsmittel umfassen. Die besagte pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln oder Perlen verabreicht werden. In wässriger Form kann die pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung bereit sein, während die Formulierung in lyophilisierter Form vor der Verabreichung in eine flüssige Form überfuhrt werden kann, z. B. durch Zugabe von Wasser für Injektionszwecke, das ein Konservierungsmittel wie z. B., aber nicht beschränkt auf, Benzylalkohol, Antioxidantien wie Vitamin A, Vitamin E, Vitamin C, Retinylpalmitat und Selen, die Aminosäuren Cystein und Methionin, Zitronensäure und Natriumcitrat, synthetische Konservierungsmittel wie die Parabene Methylparaben und Propylparaben enthalten kann oder nicht.
Die pharmazeutische Formulierung kann ferner einen oder mehrere Stabilisatoren enthalten, die z. B. eine Aminosäure, ein Zuckerpolyol, ein Disaccharid und/oder ein Polysaccharid sein können. Die pharmazeutische Formulierung kann weiterhin ein oder mehrere Tenside, ein oder mehrere Isotonisierungsmittel und/oder einen oder mehrere Metallionenchelatoren und/oder ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten.
Die pharmazeutische Formulierung, wie hierin beschrieben, kann zumindest für eine orale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung geeignet sein. Alternativ kann das Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Depotformulierung bereitgestellt werden, die die verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs über einen bestimmten Zeitraum ermöglicht.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Primärverpackung, wie z. B. eine vorgefüllte Spritze oder ein vorgefüllter Pen, ein Fläschchen oder ein Infusionsbeutel, bereitgestellt, die die Formulierung gemäß dem vorhergehenden Aspekt der Erfindung umfasst.
Die vorgefüllte Spritze oder der Pen kann die Formulierung entweder in gefriergetrockneter Form (die dann vor der Verabreichung z. B. mit Wasser für Injektionszwecke aufgelöst werden muss) oder in wässriger Form enthalten. Die Spritze oder der Pen ist häufig ein Einwegartikel zum einmaligen Gebrauch und kann ein Volumen zwischen 0,1 und 20 ml haben. Die Spritze oder der Pen kann jedoch auch eine Mehrwegspritze oder ein Mehrdosen- Pen sein. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein therapeutisches Kit, umfassend:
(i) die pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben,
(ii) eine Vorrichtung zur Verabreichung der Zusammensetzung, und
(iii) optional eine Gebrauchsanweisung.
Sequenzen
Tabelle 1: humane NKD2-Aminosäuresequenz
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Ausführungsbeispiele
Obwohl die Erfindung in den Zeichnungen und der vorstehenden Beschreibung detailliert dargestellt und beschrieben ist, sind diese Darstellungen und Beschreibungen als illustrativ oder beispielhaft und nicht einschränkend zu betrachten; die Erfindung ist nicht auf die offenbarten Ausfiihrungsformen beschränkt. Die Erfindung ist nicht auf die offengelegten Ausfiihrungsformen beschränkt. Andere Variationen der offengelegten Ausfiihrungsformen können von Fachleuten bei der Ausführung der beanspruchten Erfindung aus einem Studium der Zeichnungen, der Offenbarung und der beigefiigten Ansprüche verstanden und ausgeführt werden. In den Ansprüchen schließt das Wort "umfassend" andere Elemente oder Schritte nicht aus, und der unbestimmte Artikel "ein" oder "eine" schließt eine Mehrzahl nicht aus. Die bloße Tatsache, dass bestimmte Maßnahmen in voneinander verschiedenen abhängigen Ansprüchen rezitiert werden, bedeutet nicht, dass eine Kombination dieser Maßnahmen nicht vorteilhaft eingesetzt werden kann. Etwaige Bezugszeichen in den Ansprüchen sind nicht als Einschränkung des Anwendungsbereichs zu verstehen.
Alle hier offengelegten Aminosäuresequenzen sind vom N-Terminus zum C-Terminus dargestellt; alle hier offengelegten Nukleinsäuresequenzen sind 5'->3' dargestellt.
Beispiel 1: Materialien und Methoden
Verarbeitung von humanem Gewebe
Nierengewebe wurde vom Chirurgen aus normalen und Tumorregionen entnommen. Das Gewebe wurde auf Trockeneis eingefroren oder in vorgekühlter University of Wisconsin- Lösung (#BTLBUW, Bridge to Life Ltd., Columbia, U.S.) eingelegt und auf Eis in unser Labor transportiert. Die Gewebe wurden in ca. 0,5-lmm3 große Stücke geschnitten und dann in ein C-Röhrchen (Miltenyi Biotec) überführt und auf einem gentle-MACS (Miltenyi Biotec) mit dem Programm spleen 4 verarbeitet. Das Gewebe wurde dann für 30 min bei 37°C unter Schütteln bei 300 RPM in einer Verdauungslösung mit 25pg/ml Liberase TL (Roche) und 50pg/ml DNase (Sigma) in RPMI (Gibco) verdaut. Nach der Inkubation wurden die Proben erneut auf einem gentle-MACS (Miltenyi Biotec) mit dem gleichen Programm bearbeitet. Die resultierende Suspension wurde durch ein 70pm-Zellsieb (Falcon) gegeben, mit 45 ml kaltem PBS gewaschen und 5 Minuten bei 500 g bei 4°C zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einem Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung gezählt. Lebende, einzelne Zellen wurden durch FACS-Sortierung und Gating auf DAPI-negative Zellen mit weiterer Anreicherung von Epithelzellen durch CDIO-Färbung oder PDGFRß-Färbung für Fibroblasten angereichert, frn Durchschnitt dauerte es 5-6 Stunden von der Gewinnung der Biopsien bis zur Herstellung der Einzelzellsuspensionen.
Mäuse
PDGFRßCreERt2 (d. h. B6-Cg-Gt(Pdgfrß-cre/ERT2)6096Rha/J, JAX Stock #029684) und Rosa26tdTomato (d. h. B6-Cg-Gt(ROSA)26Sorttm(CAG-tdTomato)Hze/J JAX Stock # 007909) wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) erworben. Die Nachkommen wurden mittels PCR nach dem Protokoll der Jackson Laboratories genotypisiert. Pdgfrb-BAC-eGFP-Reportermäuse wurden von N. Heintz (The Rockefeller University) für das GENSAT-Projekt entwickelt. Die Genotypisierung aller Mäuse wurde mittels PCR durchgeführt. Die Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen an der University of Edinburgh oder der RWTH Aachen untergebracht. Die UUO wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt.2 Kurz gesagt, nach einer Flankeninzision wurde der linke Ureter auf Höhe des unteren Pols mit zwei 7.0 Bändern (Ethicon) abgebunden. Die Mäuse wurden am Tag 10 nach der Operation geopfert. Die Tierversuchsprotokolle wurden vom LANUV-NRW, Deutschland und von den UK Home Office Regulations genehmigt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit deren Richtlinien durchgeführt. Für SMART- Seq2 wurden männliche PDGFRbeGFP-Mäuse verwendet, die innerhalb von 10 Tagen geboren und zum Zeitpunkt der Operation zwischen 9 und 11 Wochen alt waren und wie angegeben geopfert wurden. Für die induzierbare Schicksalsverfolgung erhielten PDGFRbCreER;tdTomato-Mäuse (8 Wochen alt, 2 männlich / 3 weiblich) dreimal Tamoxifen über die Magensonde (10mg p.o.), gefolgt von einer Washout-Periode von 21 Tagen, und wurden dann einer UUO-Operation oder Scheinoperation (wie oben) unterzogen und 10 Tage nach der Operation geopfert.
Einzelzellisolierung in Maus
Euthanisierte Mäuse wurden über das linke Herz mit 20 ml NaCl 0,9% perfundiert, um Blutreste aus dem Gefäßsystem zu entfernen. Die Nieren wurden chirurgisch entfernt, in kleine Scheiben geschnitten und in ein 15 ml Röhrchen (Falcon) auf eiskaltes PBS mit 1% FCS gelegt. Um einzelne Nierenzellen zu isolieren, wurde eine Kombination aus enzymatischem und mechanischem Aufschluss verwendet, wie oben für die Isolierung von humanen Einzelzellen beschrieben. Insgesamt lag die Lebensfähigkeit bei dieser Methode bei über 80%.
FACS
Die Zellen wurden mit den folgenden monoklonalen, direkt fluorochrom konjugierten Antikörpern markiert: anti-CD10 human (Klon HI 10a, biolegend), anti-PDGFRb Maus (Klon PR7212, R&D), anti-PDGFRalpha Maus (Klon APA5, biolegend), anti-CD31 Maus (Klon Megl3.3, biolegend), anti-CD45 Maus (Klon 30 F11). Die isolierten Zellen wurden in 1% PBS-FBS auf Eis in einer Endkonzentration von 1x107 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden mit Fc-Block (TruStainFx human, TruStainFx Maus Klon 91, biolegend) vorinkubiert und anschließend mit den oben genannten Antikörpern für 30 Minuten auf Eis lichtgeschützt in 2% FBS/PBS verdünnt inkubiert. Für die Färbung mit humanem anti- PDGFRb wurde Ziege anti-Maus Dyelight 405 (poly24091, biolegend) als Sekundärantikörper verwendet. Alle Kompensationen wurden zum Zeitpunkt der Aufnahme unter Verwendung von Einzelfarbfärbungen und Negativfärbungen und Fluoreszenz-Minus- Eins-Kontrollen durchgeführt. Die Zellen wurden im Semi-Purity-Modus mit dem Ziel einer Effizienz von >80% mit dem SONY SH800 Sorter (Sony Biotechnology; 100 um Düse Sortierchip Sony) sortiert. Für die plattenbasierte Sortierung für SMART-Seq wurde die Zellsortierung mit einem FACS Aria II Gerät (Becton Dickinson, Basel, Schweiz) durchgefuhrt.
Einzelzell-Assavs inkl. Smart-Seq2 und IPX Genomics 3' sc-RNA-Seq (V2 und V3)
Für Smart-Seq2 wurden Einzelzellen von SciLifeLab - Eukaryotic Single cell Genomic Facility (Karolinska Institut) prozessiert. Vor dem Versand wurden die Einzelzellen in Wells einer 384-Well-Platte mit vorbereiteten Lysepuffer sortiert. Die Bibliotheken wurden auf einem Illumina HiSeq 4500 sequenziert. Die Einzelzelllösung von Zellen und primären humanen Nierenzellen wurden parallel auf einem Chromium Single Cell Chip-Kit ausgeführt und die Bibliotheken wurden mit dem Chromium Single Cell 3 '-Bibliotheks-Kit V2 und dem i7 Multiplex-Kit (PN-120236, PN-120237, PN-120262, lOx Genomics) entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Qualität der Bibliothek wurde mit dem Dl 000 ScreenTape auf dem 2200 TapeStation System (Agilent Technologies) bestimmt. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina Novaseq-Plattform mit Sl- und S2-Fließzellen (Ilumina) durchgeführt.
Bewertung humaner Nierenfibrose
PAS-gefärbte Schnitte der Nieren wurden von einem erfahrenen Nephropathologen verbündet analysiert und ausgewertet. Alle Schnitte wurden auf spezifische Nierenerkrankungen untersucht, jedoch wurden keine Hinweise auf spezifische glomeruläre oder tubulointerstitielle oder vaskuläre Erkrankungen, abgesehen von altersbedingten Veränderungen oder hypertensiver Nephropathie, festgestellt. Das Ausmaß der interstitiellen Fibrose und der tubulären Atrophie wurden als zwei separate Parameter in % der betroffenen Kortikalisfläche bewertet. Das Ausmaß der globalen Glomerulosklerose wurde als % der global sklerotischen Glomeruli von allen Glomeruli geschätzt. Das Ausmaß der Arteriosklerose, d. h. die fibroelastische Verdickung der Intima im Vergleich zur Dicke der Media, wurde auf einer Skala von 0 bis 3 bewertet, wobei 0 - nicht, 1 - leicht (< 50%), 2 - mittel (51-100%) und 3 - schwer (>100% verdickte Intima im Vergleich zur Media).
Für die Immunhistochemie von Kollagen I und III wurden um-Schnitte von in Formalin fixiertem und in Paraffin eingebettetem Nierengewebe für die indirekte Immunoperoxidase aufbereitet, indem das Paraffin durch Inkubation in Xylol (3x 5min) und anschließende Rehydrierung mit absteigender Konzentration von Ethanol (3 x 2 Minuten 100 % Ethanol, 2 x 2 Minuten 95 % Ethanol, 1 x 2 Minuten 70 % Ethanol) entfernt wurde. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3 % H2O2 in destilliertem Wasser für 10 Minuten bei Raumtemperatur blockiert und gewaschen (2x in PBS). Anschließend erfolgte die Inkubation mit primären Antikörpern [Collagen I (Southern Biotech) Kat. 1310-01; Collagen in (Southern Biotech) Kat. 1330-01] in 1 % BSA/PBS bei Raumtemperatur fur 1 Stunde in einer feuchten Kammer. Danach wurden die Objektträger zweimal für 5 Minuten in PBS gewaschen und biotinylierte Sekundärantikörper zugegeben (30 Minuten). Der Avidin- Biotin-Komplex wurde zugegeben und 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde für 10 Minuten bei 37 °C in DAB-Lösung inkubiert. Die Reaktion wurde durch Waschen in H2O gestoppt und die Objektträger wurden für 4 Minuten mit Methylgrün gegengefarbt. Schließlich wurden die Objektträger in aufsteigendem Ethanol und Xylol dehydriert. Mit einem Ganz-Objektträger-Scanner (NanoZoomer HT, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) wurden die vollständig digitalisierten Bilder der immunhistochemisch gefärbten Objektträger mit der Betrachtungssoftware NDP.view (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan) und ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) weiterverarbeitet und analysiert. Der Prozentsatz der positiv gefärbten Fläche wurde in der Nierenrinde in verbündeter Weise analysiert.
Antikörper und Immunofluoreszenzfärbungen
Nierengewebe wurde für 2 Stunden bei RT in 4% Formalin fixiert und nach Dehydrierung in 30%iger Saccharose über Nacht in OCT eingefroren. Unter Verwendung von 5-10 pm Kryoschnitten wurden die Objektträger in 5%igem Eselserum geblockt, gefolgt von einer 1- stündigen Inkubation des primären Antikörpers, 3-maligem Waschen für 5 Minuten in PBS und anschließender Inkubation der sekundären Antikörper für 45 Minuten. Nach DAPI (4’,6*- 'Diamidino-2-Phenylindol)-Färbung (Roche, 1:10.000) wurden die Objektträger mit ProLong Gold (Invitrogen, #P10144) aufgezogen. Folgende Antikörper wurden verwendet: anti-mouse PDGFRa (AF1062, 1:100, R&D), anti-CD10 human (Klon HIlOa, 1:100, biolegend), anti- HNF4a (Klon C11F12, 1:100, Cell Signalling), Pan-Cytokeratin TypI/II (Invitrogen, Ref. MA1-82041), Dachl (Sigma, HPA012672), Collal (Abeam, ab34710), ERG (abeam, ab92513), AF488 Esel- Anti-Ziege (1:100, Jackson Immuno Research), AF647 Esel-Anti- Kaninchen (1:200, Jackson Immuno Research). Konfokale Bildgebung
Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Nikon AIR unter Verwendung von 40X und 60X Objektiven (Nikon) aufgenommen. Die Rohdaten wurden mit Nikon Software oder ImageJ verarbeitet.
Mikroarrav aus humanem Nierengewebe
Paraffin-eingebettete, formalin-fixierte Nierenproben von 98 nicht-tumorösen humanen Nierenproben der Biobank Eschweiler/Aachen wurden auf Basis einer zuvor durchgeführten PAS-Färbung ausgewählt. Pro Probe wurden zufällig Bereiche ausgewählt und aus jeder Nierenprobe wurde mit dem TMArrayerTM (Pathology Devices, Beecher Instruments, Westminster, USA) ein 2-mm-Kem entnommen. Jeder Kem wurde in einem Empfängerblock in einem 2 mm-Raster angeordnet, das etwa 2,5 cm2 abdeckte, und 5 Mikrometer dicke Schnitte wurden geschnitten und mit histologischen Standardtechniken bearbeitet.
RNA-In-situ-Hybridisierung
Die In-situ-Hybridisierung wurde mit formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben und dem RNAScope Multiplex Detection KIT V2 (RNAScope, #323100) nach dem Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Der Antigen-Retrieval wurde für 22 min bei 96°C anstelle von 15 min bei 99°C im Wasserbad durchgeführt. 3-5 Tropfen der Pretreatment- 1 -Lösung wurden nach der Durchführung des Antigen-Retrievals für 10 Minuten bei RT inkubiert. Die Waschschritte wurden dreimal 5 Minuten durchgeführt. Die folgenden Sonden wurden für den RNAscope-Assay verwendet: Hs-PDGFRß #548991-C1, Hs-PDGFRa #604481-C3, Hs-Collal #401891, Hs-COL1A1 #401891-C2, Hs-MEG3 #400821, Hs-NKD2 #581951-C2 (targeting 236-1694 von NM 033120. 3), Hs-Postn #409181-C2 und 409181-C3, Hs-Pecaml #487381-C2, Hs-Ccll9 #474361-C3, Hs-Ccl21 #474371-C2, Hs-Notch3 #558991-C2, Mm-Collal #319371, Mm- PDGFRa #480661-C2, Mm-PDGFRb #411381-C3.
Bildquantifizierung - ISH-Bildanalvse
Es wurde eine systematische Zufallsauswahl getroffen, um mindestens 3 repräsentative tubulo-interstitielle Bereiche pro Bild auszuwählen. Anschließend wurde jeder fluoreszierende Punkt (Transkript) manuell mit dem Zellzählungstool von Fiji (Max-Planck- Institut für molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden, Deutschland) annotiert. Einzelne Kerne wurden dann mit einem selbst entwickelten Tool ( https://gitlab.com/mklaus/segment_cells_register_marker) isoliert, das auf Watershed (Grenzen: 0,1 -0,4) zur Identifizierung benachbarter Kerne, Kantendetektion für unvollständige Objekte und Auswahl der Objektgröße (Grenzen: 12-180 m2) basiert. Die Gesamtzahl der einzelnen Punkte wurde dann für jeden isolierten Nukleus neu berechnet. Punkte, die sich außerhalb von Kernen befanden, wurden nicht in diese Analyse einbezogen, da die Komplexität der Nierenmorphologie in Kombination mit der hohen zellulären Dichte uns daran hinderte, den Ursprung von nicht-kernigen Transkripten zu bestimmen. Für die Meg3- und NKD2-Analyse von PDGFRa/b-Zellen wurden die Bilder mit QPath analysiert, nachdem die Kerne segmentiert und die Zellen auf der Basis von >1 pos. spot pro Bildgebungskanal gezählt wurden. Für die Collal-IF-Quantifizierung oder NKD2-ISH- Quantifizierung wurden die Bilder in RGB-Kanäle aufgeteilt und die integrierte Fluoreszenzdichte pro Bild mit ImageJ bestimmt.
Quantitative RT-PCR
Die Zellpellets wurden geerntet und mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die RNA- Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (qiagen). 200 ng Gesamt-RNA wurden mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) revers transkribiert. Die qRT-PCR wurde mit dem iTaq Universal SYBR Green Supermix (Biorad) und dem Bio-Rad CFX96 Real Time System mit dem C1000 Touch Thermocycler durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren 95°C für 3 Minuten, dann 40 Zyklen von 95°C für 15 Sekunden und 60°C für 1 Minute, gefolgt von einem Zyklus von 95°C für 10 Sekunden. GAPDH wurde als Housekeeping-Gen verwendet. Die Daten wurden mit der 2-CT-Methode ausgewertet. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgefuhrt.
Tabelle 2: Liste der RT-PCR-Primer-Sequenzen (human)
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Generierung einer humanen PDGFRb+ Zelllinie
PDGFRb+-Zellen wurden aus der gesunden humanen Nierenrinde einer Nephrektomie-Probe (71 Jahre alter männlicher Patient) isoliert, indem eine Einzelzellsuspension (wie oben beschrieben) hergestellt und anschließend eine MACS-Separation (Miltenyi biotec, autoMACS Pro Separator, # 130-092-545, autoMACS Columns #130-021-101. Für die Isolierung wurde die Einzelzellsuspension in zwei Schritten gefärbt, wobei zuerst ein spezifischer PDGFRb-Antikörper (R&D # MAB 1263 Antikörper, Verdünnung 1:100) und anschließend ein zweiter Inkubationsschritt mit einer Anti-Mouse IgGl-MicroBeads-Lösung (Miltenyi, #130-047-102,) durchgefuhrt wurde. Nach MACS wurden die Zellen in DMEM- Medien (Thermo Fisher # 31885) mit 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin für 14 Tage kultiviert und mit SV40LT und HTERT wie folgt immortalisiert. Retrovirale Partikel wurden durch transiente Transfektion von HEK293T-Zellen mit TransIT-LT (Minis) hergestellt. Zwei Typen von amphotropen Partikeln wurden durch Co-Transfektion der Plasmide pBABE-puro-SV40-LT (Addgene #13970) oder xlox-dNGFR-TERT (Addgene #69805) in Kombination mit einem Verpackungsplasmid pUMVC (Addgene #8449) und einem pseudotypisierenden Plasmid pMD2.G (Addgene #12259) erzeugt. Retrovirale Partikel wurden mit dem Retro-X Konzentrator (Clontech) 48 Stunden nach der Transfektion lOOx konzentriert. Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der Zielzellen mit seriellen Verdünnungen der retro viralen Überstände (1:1 -Mischung der konzentrierten Partikel mit SV40-LT bzw. hTERT) für 48 h. Anschließend wurden die infizierten PDGFRb+-Zellen 72 h nach der Transfektion für 7 d mit 2 |ig/ml Puromycin selektiert. Kultivierung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC) abgeleiteter Nierenorganoide
Humaner iPSC-15-Klon 0001 wurde von der Stem Cell Facility des Radboud University Center, Nijmegen, Niederlande, erhalten. Humane iPSC wurden auf Geltrex-beschichteten Platten in E8-Medium (Life Technologies) gezüchtet. Bei 70-80% Konfluenz wurden die iPSC mit 0,5 mM EDTA abgetrennt und die Zellaggregate durch Teilung im Verhältnis 1:3 reseediert. Humane iPSC wurden mit einem modifizierten Protokoll in Anlehnung an Takasato et al. (Nature, 2015) differenziert und in einer Dichte von 18.000 Zellen pro cm2 auf geltrex-beschichteten Platten (Greiner) ausgesät. Die Differenzierung in Richtung intermediäres Mesoderm wurde mit CHIR99021 (6 pM, Tocris) in E6-Medium (Life Technologies) für 3 und 5 Tage initiiert, gefolgt von einer Supplementierung mit FGF 9 (200 ng/ml, RD Systems) und Heparin (1 pg/ml, Sigma Aldrich) in E6 bis Tag 7. Nach 7 Tagen Differenzierung wurden Zellaggregate (300.000 Zellen pro Organoid, Mischung aus 3 und 5 Tage CHIR-differenzierten Zellen) auf Costar-Transwell-Einsätzen kultiviert, um die selbstorganisierende Nephrogenese mit E6-Differenzierungsmedium zu stimulieren. Am Tag 7+18 wurden die Nierenorganoide für siRNA-Knockdown-Experimente wie unten beschrieben verwendet. siRNA-Knockdown von NKD2 in humanen iPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden
Der NKD2 siRNA-Knockdown wurde entsprechend dem Herstellerprotokoll durchgeführt (DharmaFECT Transfektionsreagenz und NKD2-spezifische smartpool siRNA, beide Horizon Discovery). Der Transfektionsmaster-Mix und die Scrambled-Kontrollen wurden in Essential 6 Medium (Gibco) hergestellt und zu den Organoiden gegeben. Nach einer initialen Inkubation von 24 h wurden die Transfektionsmaster-Mixe aufgefrischt und IL-lß (Sigma- Aldrich) in einer Konzentration von 100 ng/ml zugegeben, um Fibrose zu induzieren. Die IL- lß-Exposition zusammen mit dem Auffrischen des Transfektions-Mastermixes wurde alle 24 h für zwei kommende Tage wiederholt. 96h nach Transfektionsbeginn wurden die Organoide geerntet und für Paraffinschnitte aufbereitet. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenzfärbung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
TGFb-Behandlungsexperimente
TGFb (100-21-10UG, Peprotech) in einer Konzentration von 10 ng/ml in PBS wurde nach einer 24-stündigen Serum-Starvation mit 0,5% FCS-haltigem Medium für 24 Stunden zu 75% konfluierenden PDGFRb-Zellen gegeben. Für Inhibitor-Experimente mit T-5224 wurde der Inhibitor (oder Vehikel) 1 Stunde vor Zugabe von TGFb in die Kulturvertiefungen gegeben. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
AP-1 -Inhibitor-Behandlung
T-5224 (c-Fos/AP-1 -Inhibitor, Cayman Chemicals, #22904) wurde in DMSO gelöst und bei - 80°C gelagert. DMSO wurde immer in den gleichen Anteilen zu den Kontrollvertiefungen gegeben.
Zeliproliferation (WST-l-Assav)
Der WST-1 -Assay mit PDGFRb-Zellen wurde in 96-Wells wie vom Hersteller (Roche Applied Science) empfohlen durchgeführt. Kurz gesagt wurden lxlOA4 PDGFRb-Zellen in jede Vertiefung der 96-Well-Platten ausgesät und die Zellen wurden mit T-5224 oder Vehikel (DMSO) in den angegebenen Konzentrationen in dreifacher Ausführung behandelt. Die Zellen wurden für 2h mit dem WST-l-Reagenz inkubiert, bevor sie zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet wurden. Die Absorption wurde sowohl bei 450 nm als auch bei 650 nm (als Referenz) gemessen. sgRNA:CRISPR-Cas9-Vektorkonstruktion, Virusproduktion und Transduktion
Die NKD2-spezifische guide RNA (vorwärts 5'-CACCGACTCCAGTGCGATGTCGG -3'; rückwärts 5'- AAACCCGAGACATCGCACTGGAGTC -3') wurden mittels BsmBI- Restriktionsverdau in pL-CRISPR.EFS.GFP (Addgene #57818) kloniert. Lentivirale Partikel wurden durch transiente Co-Transfektion von HEK293T-Zellen mit dem lentiviralen Transferplasmid, dem Verpackungsplasmid psPAX2 (Addgene #12260) und dem VSVG- Verpackungsplasmid pMD2.G (Addgene #12259) unter Verwendung von TransIT-LT (Minis) hergestellt. Virale Überstände wurden 48-72 Stunden nach der Transfektion gesammelt, durch Zentrifugation geklärt, mit 10% FCS und Polybrene (Sigma-Aldrich, Endkonzentration von 8|ig/ml) ergänzt und 0,45jim filtriert (Millipore; SLHP033RS). Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der PDGFRß-Zellen mit viralen Überständen für 48 h. eGFP-exprimierende Zellen wurden einzeln in 96-Well-Platten sortiert. Die expandierten Kolonien wurden mit einem Mismatch-Detection-Assay auf Mutationen untersucht: gDNA, die die CRISPR-Zielstelle überspannt, wurde PCR-amplifiziert und mittels T7EI-Verdau (T7-Endocnuclease, NEB M0302S) analysiert. Um spezifische Mutationsereignisse auf beiden Allelen innerhalb der gezüchteten Klone zu bestimmen, wurde das PCR-Produkt in den pCR™ 4Blunt-TOPO Vektor (Thermo Scientific K287520) subkloniert. Es wurden mindestens 6 Kolonien pro CRISPR-Klon gezüchtet und zur Sanger- Sequenzierung eingesandt (Klon C2: 30 Kolonien wurden sequenziert). Zum Nachweis des vollständigen Knockouts von NKD2 wurde ein Western Blot durchgeführt.
Western blot
Western Blots wurden nach Standardprotokollen durchgefuhrt. Kurz gesagt, wurden Zelllysate mit RIPA-Puffer und Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) hergestellt. Die Proteinkonzentrationen der Lysate wurden mittels BCA-Assay (#23225, Pierce, ThermoScientific) quantifiziert. Die Proteinlysate wurden für 5 min bei 95°C in 4x SDS- Probenladepuffer (BioRad) erhitzt und in 10% SDS-Page-Gele geladen. Anschließend wurden die Proben auf PVDF-Membranen transferiert und die Blots mit primären Antikörpern in 5% Blotto (Thermo Fisher) sondiert: (1:3000 Kaninchen-Anti-Human-NKD2- polyklonaler Antikörper, Invitrogen PA5-61979) für 2 Stunden, gefolgt von einer Inkubation mit sekundärem Antikörper für 1 Stunde nach dem Waschen (1:5000 Meerrettich- Peroxidase-HRP-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper, Vector Laboratories) und entwickelt mit Pierce™ ECL Western Blotting Substrate A und B. Der monoklonale Anti- GAPDH- Antikörper von Maus (NovusBiologicals NB300-320; 1:1000), gefolgt von einem HRP-konjugierten sekundären Anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratories), wurde als Ladekontrolle verwendet.
Lentivirale Überexpression von Nkd2
Konstruktion des NKD2-Vektors und Generierung von stabilen NKD2-überexprimierenden Zelllinien. Die humane cDNA von NKD2 wurde mittels PCR unter Verwendung der Primersequenzen 5'- atggggaaactgcagtcgaag-3' und 5' ctaggacgggtggaagtggt-3' amplifiziert. Restriktionsstellen und N-terminaler IxHA-Tag wurden mit den Primern 5'- cactcgaggccaccatgtacccatacgatgttccagattacgctgggaaactgcagtcgaag -3' und 5'- acggaattcctaggacgggtggaagtg-3' in das PCR-Produkt eingeführt. Anschließend wurde das PCR-Produkt mit Xhol und EcoRI verdaut und in pMIG kloniert (pMIG war ein Geschenk von William Hahn (Addgene plasmid # 9044 ; http://n2t.net/addgene:9044 ; RRID:Addgene_9044). Retrovirale Partikel wurden durch transiente Transfektion in Kombination mit dem Verpackungsplasmid pUMVC (pUMVC war ein Geschenk von Bob Weinberg (Addgene Plasmid # 8449)) und dem Pseudotypisierungsplasmid pMD2.G (pMD2.G war ein Geschenk von Didier Trono (Addgene Plasmid # 12259; http://n2t.net/addgene: 12259 ; RRID:Addgene_12259)) unter Verwendung von TransIT-LT (Minis) hergestellt. Virale Überstände wurden 48-72 Stunden nach der Transfektion gesammelt, durch Zentrifugation geklärt, mit 10% FCS und Polybrene (Sigma-Aldrich, Endkonzentration von 8pg/ml) ergänzt und 0,45|im gefiltert (Millipore; SLHP033RS). Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der PDGFß-Zellen mit viralen Überständen für 48 h. eGFP-exprimierende Zellen wurden einzeln sortiert.
Bulk-RNA-Sequenzierung
Die RNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (QIAGEN) extrahiert. Für rRNA-depleted RNA-seq unter Verwendung von 1 und 10 ng verdünnter Gesamt-RNA wurden Sequenzierungsbibliotheken mit dem KAPA RNA HyperPrep Kit mit RiboErase (Kapa Biosystems) gemäß dem Herstellerprotokoll hergestellt. Die Sequenzierbibliotheken wurden mit quantitativer PCR (New England Biolabs, Ipswich, USA) quantifiziert, äquimolar gepoolt, der finale Pool auf 1,4 nM normalisiert und vor der Sequenzierung mit 0,2 N NaOH denaturiert und mit 400nM Tris pH 8,0 neutralisiert. Die finale Sequenzierung wurde auf einer NextSeq-Plattform (Illumina) gemäß den Herstellerprotokollen durchgeführt (Illumina, CA, USA).
ATAC-seq-Präparation
5000-7500 PDGFRa/b pos-Zellen wurden wie oben beschrieben aus frisch isolierten UUO- Nieren FACS-sortiert, zweimal mit kaltem PBS gewaschen und für 5 Minuten bei 500g zentrifugiert. Die Zellpellets wurden dann in 50pl eiskaltem Lysepuffer (lOmM Tris-HCl, pH7,5; lOmM NaCl, 3mM MgC12, 0,08% NP40-Ersatz [74385, Sigma], 0,01% Digitonin [G9441, Promega]) lysiert und sofort bei 500g für 9 Minuten zentrifugiert. Die Pellets wurden in 50pl eines Transposase-Reaktionsmixes resuspendiert, der 25 pl 2xTD-Puffer (20mM Tris-HCl, pH7,6, lOmM MgC12, 20% DMF), 0,5 pl Tagment-DNA-Enzym 1 [15027865, Illumina] und 24,5pl nukleasefreies Wasser enthält. Die Transpositionsreaktion wurde bei 37°C für 30min bei 350 rpm im Thermoshaker inkubiert. Anschließend wurde die transponierte DNA mit einem MinElute Reaction Cleanup Kit (28204, Qiagen) gereinigt und in 15pl nukleasefreiem Wasser eluiert. Die transponierte DNA wurde mittels PCR (insgesamt 14 Zyklen) unter Verwendung des NEB Next 2x Master Mix (M0541S; New England Biolabs) mit kundenspezifischen Nextera PCR Primern amplifiziert. Die erste PCR wurde mit 50pl Volumen und 6 Zyklen unter Verwendung von NEB Next 2x Master mix und l,25pM kundenspezifischen Primern durchgeführt; die zweite RT-PCR wurde mit 15pl Volumen für 20 Zyklen unter Verwendung von 5pl (10 %) der voramplifizierten Mischung plus 0,125|xM Primer durchgeführt, um die Anzahl der zusätzlich benötigten Zyklen zu bestimmen, wie zuvor beschrieben. Die amplifizierte DNA-Bibliothek wurde mit dem MinElute PCR Purification Kit (28004, Qiagen) gereinigt und in 20pl 10 mM Tris-HCl (pH 8) eluiert. Die Qualität der Bibliothek wurde mit dem Agilent Dl 000 ScreenTape auf dem 2200 TapeStation System (Agilent Technologies) visualisiert. Die ATAC-seq-Bibliotheken wurden auf Illumina NextSeq 500 fur die 75-bp paired-end Sequenzierung geladen.
Smart-Seq2-Datenverarbeitung
Die anfänglichen Einzelzell-Transkriptomdaten wurden in der Eukaryotic Single-Cell Genomics Facility im Science for Life Laboratory in Stockholm, Schweden, verarbeitet. Die erhaltenen Reads wurden auf den mmlO-Build des Mausgenoms gemappt (konkateniert mit Transkripten für eGFP und dem ERCC-Spike-in-Set), um eine Zählung für jedes endogene Gen, Spike-in und eGFP-Transkript pro Zelle zu erhalten. Ribosomale RNA-Gene, ribosomale Proteine und ribosomale Pseudo-Gene wurden herausgefiltert. Wir stellten fest, dass Zellen, die keine Alignments aufwiesen, die entweder eGFP oder PDGFRb zugeordnet waren, nach dem unüberwachten Zellclustering (siehe unten) zu einem einzigen Cluster zusammengefasst wurden. Daher entschieden wir uns, diese Zellen zu entfernen und führten alle Analysen und das Clustering ohne Berücksichtigung dieser Zellen durch (17 Zellen).
IQx Einzelzell-RNA-Seq-Datenverarbeitung
Die Fastq-Dateien wurden mit Alevin und Salmon (Alevin-Parameter -1 ISR, Salmon Version 0.13.1) verarbeitet, wobei Gencode v29 humanes Transkriptom und Gencode vM20 Maus- Transkriptom als Referenztranskriptome verwendet wurden. Der Alevin-Parameter "Expected Cells" wurde entsprechend der dreifachen Anzahl von Zellen gesetzt, die nach der Knie-Methode geschätzt wurde, die auf die Read-Counts pro Zell-Barcodes-Verteilung angewendet wurde. Daher produzierte die von Alevin erzeugte UMI-Zählmatrix eine große Anzahl von putativen Zellen, die wir später filtern konnten (siehe nächster Abschnitt).
IQx scRNA-Seq Zellfilterung
Wir haben ribosomale RNA-Gene (0-1% im Durchschnitt des detektierten RNA-Gehalts pro Zelle) und mitochondrial-kodierte Gene (0-80% im Durchschnitt des detektierten RNA- Gehalts pro Zelle) aus der Hauptgenexpressionsmatrix entfernt. Mitochondrial kodierte Gene wurden entfernt, um zu vermeiden, dass unerwünschte Variationen zwischen Zellen eingeführt werden, die ausschließlich von Änderungen des mitochondrialen Gehalts abhängen könnten. Die loglO(Gesamt-UMI-Zählungen pro Zelle)-Verteilung aus der von Alevin (siehe oben) erzeugten Zähhnatrix zeigte typischerweise eine bimodale Verteilung, daher wurden loglO(Gesamt-UMI-Zählungen pro Zelle) mithilfe des R-Pakets mclust v5.4.3 mit der Einstellung modelNames auf "E" in zwei Cluster geclustert. Zellen, die zu dem Cluster mit den höheren Zählungen gehören, wurden beibehalten. Dann wurden die Zellen auf der Grundlage des mitochondrialen RNA-Gehalts und der Vorliebe für hoch exprimierte Gene wie folgt gefiltert: (1) Zellen wurden mithilfe einer bivariaten Gauß-Mischung mit zwei Komponenten, die auf loglO(Gesamt-UMI-Zählungen pro Zelle) und Prozent der mitochondrialen UMI pro Zelle gelernt wurden, in zwei Cluster geclustert. Das Clustering wurde mit dem R-Paket Mclust durchgeführt, wobei modelNames auf "EU" gesetzt wurde. Zellen, die in den Cluster mit Zellen mit höherem Mitochondriengehalt fielen, wurden ausgeschlossen. Dieser Filterungsschritt wurde nur für Bibliotheken durchgeführt, die eine klare bimodale Verteilung des Mitochondriengehalts aufwiesen (nur drei 10x-Bibliotheken in dieser Studie). (2) Die Gesamtzahl der UMIs pro Zelle sollte mit der Gesamtzahl der einzigartigen erkannten Gene korrelieren. Zellen, die dieser Beziehung nicht folgen (Ausreißer), wurden gefiltert, indem die Kerne mithilfe eines bivariaten Gaußschen Mischungsmodells auf loglO(Gesamtzahl der UMIs) und log 10 Gesamtzahl der eindeutig entdeckten Gene geclustert wurden, wobei das R-Paket mclust verwendet wurde und modelNames auf "VEV", "VEE" gesetzt wurde. (3) Zellen, deren prozentualer Anteil der Gesamtzählungen in den Top 500 Genen mehr als das 5-fache der absoluten Medianabweichung für alle Zellen darstellte, wurden entfernt. (4) Um schließlich Zellen auszuschließen, die hauptsächlich aus ribosomalen Proteinen und Pseudo-Genen bestehen, wurden Zellen entfernt, deren prozentualer Anteil an der Expression ribosomaler Proteine und Pseudo-Gene mehr als 5 absolute Medianabweichungen aller anderen Zellen darstellte. Mitochondrien-basierte Filterung wurde für CD10+-Bibliotheken nicht durchgeführt, da bei Bibliotheken aus proximalen Tubulusepithelzellen eine hohe Anzahl an mitochondrialen Reads zu erwarten ist. Beachten Sie, dass nicht alle Filterungsschritte für alle Bibliotheken durchgeführt wurden, da dies von der Qualität der einzelnen Bibliotheken und der Verteilung der UMI-Zell-Gene abhängt.
Human lOx Einzelzelldaten-Integrationsstrategie
Bei der ersten Analyse unserer Daten fielen uns mehrere Punkte auf: (1) Es ist nicht garantiert, dass die Zelltypen bei allen Patienten und unter allen Bedingungen (gesund oder CKD) gleichmäßig vertreten sind. Dies liegt daran, dass die Zelltypen, die in einem einzelnen 10x-Chromium-Lauf erfasst werden, durch eine Zufallsauswahl von Zellen bestimmt werden. (2) Sowohl gesunde als auch CKD-Patientenproben bestehen aus Zellen im gesunden und im Krankheitszustand, da diese Kategorisierung auf klinischen Parametern und nicht auf molekularen Daten oder einem kontrollierten In-vitro-Experiment beruht. Wir würden vor allem eine Veränderung des Anteils an gesunden und kranken Zellzuständen zwischen gesunden und kranken Patientenproben erwarten. (3) Die Proben von verschiedenen Patienten wurden an verschiedenen Tagen bearbeitet und vorbereitet, wie es der Operationsplan des Eschweiler Krankenhauses vorschreibt. Daher konnten mögliche technische (Chargen-)Effekte auf der experimentellen Seite nicht kontrolliert werden. (4) Die Fähigkeit, hochaufgelöste Zellcluster in unterrepräsentierten Zelltypen zu entdecken, könnte durch ein Klassenungleichgewicht beeinträchtigt werden, da bestimmte Zelltypen deutlich häufiger vorkommen können als andere, sowie durch die Größe des Datensatzes (Anzahl der Zellen), die die Clustering-Ergebnisse bei der Verwendung von unüberwachten modularitätsbasierten Graphen-Clustering-Algorithmen beeinflusst.
Die experimentelle Strategie beinhaltete die Gewinnung separater Bibliotheken aus CD 10+ und CD 10- Zellfraktionen, was dazu diente, das Klassenungleichgewicht auf der Ebene der Zelltyp-Erfassungshäufigkeit durch das lOx Chromium-Protokoll zu mildem. Um die oben diskutierten Punkte weiter abzuschwächen, zielten wir darauf ab, (1) die Daten auf lokaler Ebene zu clustem, während die globalen Informationen über die Beziehung zwischen den Zelltypen intakt blieben, und (2) mögliche technische (Chargen-)Unterschiede zwischen den Proben zu korrigieren, während wichtige Unterschiede, wie unterschiedliche Zelltypen oder unterschiedliche Zustände von Zelltypen aufgrund von Krankheiten, erhalten blieben. Um dies zu erreichen, verfolgten wir eine Strategie, die aus den folgenden Schritten besteht: Schritt 1: Nach der Qualitätskontrolle und Zellfilterung (siehe oben) wurden die Zellen in jeder 10x-Bibliothek separat geclustert und jeder Zellcluster wurde einem von 6 Hauptzelltypen zugeordnet: CD 10+ epitheliale, CD 10- epitheliale, Immun-, endotheliale, mesenchymale und neuronale Zellen.
Schritt 2: Für jeden der 6 Hauptzelltypen wurden die Zellen aus allen 10x-Bibliotheken zusammen integriert. Die technisch bedingte Variabilität zwischen den Zellen wurde korrigiert und die Zellen wurden mithilfe von unüberwachtem Graphen-Clustering geclustert. Dieser Prozess führte zu 6 separaten Karten für Endothelzellen, CD 10+ Epithelzellen, CD 10- Epithelzellen, Mesenchymzellen, Immunzellen und Nervenzellen. Jede Karte besteht aus Zellen aus mehreren 10x-Bibliotheken. Schritt 3: Wir integrierten 3 Einzelzellkarten fur: (1) CD10+-Zellen (proximaler Tubulus / Abbildung 1), (2) CD 10— Zellen (proximaler Tubulus-depletiert / Abbildung 1) und (3) PDGFRb+-Zellen (mesenchymal / Abbildung 2), indem wir die Einzelzellexpression (UMI- Zählungen) und die Clustering-Informationen aus allen Hauptzelltyp-Einzelkarten jedes Datensatzes aus Schritt 2 kombinierten. Alle Diagramme im Manuskript sind danach aus diesen 3 integrierten Karten reproduzierbar.
Dieser Ansatz ermöglichte eine lokale Clusterbildung und die Beseitigung der technischen Variabilität und erlaubte eine hochauflösende Entdeckung von Zellzuständen unabhängig von hochvariablen Zellclustergrößen. Der kleinste Cluster bestand aus 24 Zellen, während der größte Cluster aus 5355 Zellen bestand. Im Vergleich zu einem "high-level clustering followed by sub-clustering"-Ansatz produziert unser Ansatz hochaufgelöste Cluster in einer datengetriebenen, unvoreingenommenen Art und Weise und vermeidet dabei die Frage, welche Cluster überhaupt sub-geclustert werden sollen. Wir weisen darauf hin, dass Zeisel et al. einen etwas ähnlichen Ansatz zur Datenintegration verfolgten.
Insgesamt war dieser Ansatz biologisch informiert und ermöglichte es uns, potenzielle technische Effekte während der Zellclusterung zu korrigieren, so dass fast alle Zellcluster Zellen von mehr als einem Patienten/einer Bibliothek enthielten, während interessante Unterschiede zwischen den Patienten, wie z. B. erkrankte Zellzustände (z. B. verletzte Zellen des proximalen Tubulus), Unterschiede im (Myo)Fibroblastenzustand und Unterschiede in der ECM-Expression, erhalten blieben.
Maus lOx Einzelzelldaten-Integrationsstrategie
Maus-10x-Daten wurden auf die gleiche Weise analysiert und integriert, wie für humane Daten beschrieben. Das Skript, das zur Erstellung der integrierten Karte verwendet wurde, ist hier verfügbar: https://raw.githubusercontent.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/master/make_intergrated_ maps/mouse_PDGFRABpositive.r
Strategie zur Integration von Maus-Smart-Seq2-Einzelzelldaten
Da die Einzelzellplattensortierung so durchgeführt wurde, dass Zellen von allen drei Zeitpunkten gleichmäßig in allen Platten vertreten waren, wurde bei der Analyse keine weitere Batch-Effekt-Minderung durchgefuhrt. Variable Gene wurden mit der Funktion decomposeVar des Scran R-Pakets bestimmt, nachdem die Funktion trendVar auf den ERCC-Transkripten6 ausgeführt wurde. Gene mit einem FDR-Wert < 0,01 und einer biologischen Varianzkomponente > 1 wurden als hochvariable Gene behalten. Mit diesen variablen Genen verfolgten wir den gleichen Clustering-Ansatz wie für die lOx Chromium- Daten beschrieben, aber wir führten nur 2 Clustering-Iterationen durch und variierten die Anzahl der nächsten Nachbarn nicht. Das für die Analyse der Maus-Smart-Seq2-Daten verwendete Skript ist hier verfügbar: https://github.com/mahmoudibrahim/KidneyMap/blob/master/make_intergrated_maps/mouse PDGFRBpositive.r .
Cluster-Beschriftung
Ein Gen-Ranking pro Cluster wurde mit der Funktion sortGenes im R-Paket genesorteR erstellt, wobei binarizeMethod auf "adaptiveMedian" (Smart-Seq2 -Daten) oder auf "naive" (10x-Daten) gesetzt wurde. Anschließend haben wir unsere hochaufgelösten Zellcluster manuell annotiert, basierend auf Vorwissen und Informationen aus der Literatur. Es gab 50 solcher Cluster in den CD 10- Daten, 7 Cluster in den CD 10+ Daten, 26 Cluster in den PDGFRb+ Humandaten, 10 Cluster in den Maus Smart-Seq2 Daten und 10 Cluster in den Maus PDGFRa+/b+ Daten. Auf dieser hochaufgelösten Ebene (Ebene 3) kann ein Zellcluster entweder einen echten Zelltyp oder einen anderen Zellzustand repräsentieren. Daher haben wir auch diese hochaufgelösten Zellcluster in kanonische Zelltypen gruppiert, basierend auf unserer Annotation. Dies ergab 29 Zelltypen in der CD 10- Karte, 1 Zelltyp in der CD 10+ Karte, 16 Zelltypen in der PDGFRb+ Karte, 5 Zelltypen in der Maus PDGFRa+/b+ Karte und 6 Zelltypen in der Smart-Seq2 Maus PDGFRb+ Karte. Wir haben dann die Zellcluster entweder als epithelial, endothelial, mesenchymal, immun oder neuronal annotiert, um die Interpretation der Daten zu erleichtern.
UMAPs und Diffusionskarten
Integrierte Full-Map UMAP-Projektionen (Abbildung 1, 2, 3, 4, 5) wurden mit dem UMAP- Python-Paket (https://github.com/lmcinnes/umap) auf den reduzierten korrigierten Dimensionen, die von fastMNN zurückgegeben wurden, generiert, wobei min dist auf 0,6 und die Anzahl der Nachbarn auf die Quadratwurzel der Anzahl der Zellen gesetzt wurde. Lokale UMAP-Projektionen (Abbildung 1, Abbildung 4) wurden erzeugt, indem min dist auf 1 gesetzt wurde, da diese Parameter tendenziell zu geometrisch genaueren Einbettungen führen (siehe https://umap-leam.readthedocs.io/en/latest/). Diffusionskarten wurden mit dem Destiny R-Paket (https://github.com/theislab/destiny) erstellt, wobei ebenfalls die von fastMNN zurückgegebenen reduzierten Dimensionen als Eingabe verwendet wurden und die Anzahl der Nachbarn auf die Quadratwurzel der Anzahl der Zellen eingestellt wurde. Wir testeten verschiedene Randomisierungsseeds fur UMAP und Diffusion Map sowie verschiedene Diffusion Map-Distanzmetriken (wie im Handbuch des Destiny R-Pakets empfohlen) und bestätigten, dass bei den resultierenden Einzelzellprojektionen keine qualitativen Unterschiede auftreten.
Abstammungsbäume/Traiektorien und Pseudozeit
Das R-Paket Slingshot wurde für die Inferenz von Stammbäumen und die Inferenz von Pseudozeit-Zellordnungen auf Basis der UMAP/Diffusion Map-Projektion verwendet. Das Zellclustering (Schritt 2 der Integrationsstrategie, siehe oben) wurde als Eingabe-Zellcluster verwendet. Start- und Endcluster wurden auf der Grundlage einer vernünftigen Erwartung angesichts unseres Vorwissens gewählt, wie in Street et al. diskutiert und empfohlen (z. B. ist Myofibroblast der Endcluster in einer Perizyten/Fibroblasten/Myofibroblasten-Karte).
Geodynamik entlang der Pseudzeit
Gene, deren Expression mit der Zellordnung variierte, wurden als solche definiert, deren normalisierte Expression mit der Zellordnung korrelierte, quantifiziert durch den Spearman- Korrelationskoeffizienten bei einem Bonferroni-Hochberg-korrigierten p-Wert Cutoff von 0,001. Gencluster und Expressions-Heatmaps (z. B. Abb. 2f-top) wurden durch Anordnung der Zellen entlang der von SlingShot vorhergesagten Pseudozeit und unter Verwendung der genesorteR-Funktion plotMarkerHeat erstellt. Diese Funktion clustert Gene mit Hilfe des k- means Algorithmus, und wir haben den Plot und das Clustering so eingestellt, dass alle 10 Zellen entlang der Pseudozeit gemittelt werden. Die Signalweg-Anreicherung und die Zellzyklus-Analysen wurden berechnet, indem alle 2000 Zellen entlang der Pseudozeit gruppiert wurden.
Signalweg-Anreicherung und Gen Ontologie Analyse
Für die Einzelzelldaten verwendeten wir KEGG-Signalweg- und PID-Signalweg, die im November 2019 von MSigDB 327,28 als ",gmt"-Dateien heruntergeladen wurden. Die Signalweg-Anreicherungsanalyse wurde mit dem clusterProfiler R-Paket unter Verwendung der Top-100-Gene für jeden Zellcluster/jede Zellgruppe durchgeführt, wie durch die sortGenes-Funktion aus dem genesorteR-Paket definiert. Die enricher-Funktion wurde verwendet, wobei minGSSize auf 10 und maxGSize auf 200 gesetzt wurde. Die Top-5-Terme nach q-Wert für jedes Zellcluster/jede Gruppe wurden als Heatmaps von -loglO(q-Wert) aufgetragen. Die Gene Ontology Biological Process- Analyse wurde für die Top-200-Gene mit der gleichen Methode durchgeführt. Die Enricher-Funktion wurde verwendet, wobei minGSSize auf 100 und maxGSize auf 500 gesetzt wurde. Um die Aktivität der Signalwege zwischen NKD2+ und NKD2-Mesenchymzellen zu vergleichen, haben wir PROGENy verwendet, um die Aktivität von 14 Signalwegen auf Einzelzellbasis zu schätzen, wobei die Top 500 der am stärksten reagierenden Gene aus dem Modell verwendet wurden, wie es in einer Benchmark-Studie empfohlen wird.
Zellzyklus-Analyse
Die Zellzyklusanalyse wurde nach der in Macosko et al. verwendeten und im Tutorial von Po-Yuan Tung (https://jdblischak.github.io/singleCellSeq/analysis/cell-cycle.html, Datum: 07.06.2015) erläuterten Methode durchgeführt, wobei die normalisierte Genexpression als Eingabe verwendet und der Genkorrelationswert auf 0,1 gesetzt wurde. Wir verwendeten Zellzyklus-Gensätze, die in von Yang et al. bereitgestellt wurden. Um die Anreicherung/Verarmung einzelner Zellzyklus-Zuordnungen zu quantifizieren (Abbildung lg), stellen wir die Iog2-Fold-Änderung dieser Häufigkeiten relativ zur durchschnittlichen Häufigkeit dar, die durch 1000-fache Randomisierung der wahren Häufigkeitsmatrix erhalten wurde, während die Zeilen- und Spaltensummen konstant gehalten wurden. Die Randomisierung wurde mit dem R-Paket Vegan (https://CRAN.R- project.org/package=vegan) durchgeführt. Positive Zahlen zeigen eine Anreicherung relativ zu dem an, was durch Zufall zu erwarten wäre, negative Zahlen zeigen eine Verarmung an.
ECM- und Kollagen-Score
Die Expression der Core-Matrisom-Gene aus Naba et al. wurde auf der Grundlage normalisierter Genexpressionsdaten zusammengefasst, wobei die gleiche Methode wie bei der Zellzyklusanalyse verwendet wurde.
Genexpressions-Heatmaps
Skalierte Genexpressions-Heatmaps wie in Abbildung 2d wurden mit den Funktionen plotMarkerHeat und plotTopMarkerHeat im R-Paket genesorteR erstellt. Die Heatmaps für den Anteil der exprimierten Zellen, wie in Abbildung 3d, wurden mit der Funktion plotBinaryHeat aus dem genesorteR R-Paket erstellt. Heatmaps, die log2 -fold-changes und Anreicherungen von Merkmalen wie in Abbildung 5j,k zeigen, wurden mit dem ComplexHeatmap R-Paket (v. 2.4.2) erstellt.
ATAC-Seq-Analyse
Illumina Tn5-Adaptersequenzen wurden aus ATAC-Seq-Reads mit dem Befehl bbduk aus der BBmap-Suite (Version 38.32, Einstellungen: trimq=18, k=20, mink=5, hdist=2, hdist2=0) getrimmt. STAR (Version 2.7.0e) wurde verwendet, um ATAC-Seq-Reads auf die mmlO- Genomassemblierung zu mappen, wobei nur eindeutig gemappte Paare beibehalten wurden (Einstellungen: alignEndsType EndToEnd, alignlntronMax 1, alignMatesGapMax 2000, alignEndsProtrude 100 ConcordantPair, outFilterMultimapNmax 1, outFilterScoreMinOverLread 0.9, outFilterMatchNminOverLread 0.9). Zum Entfernen von Sequenzduplikaten wurde der Picard-Befehl MarkDuplicates (Version 2.18.27) verwendet (Einstellungen: remove_duplicates=TRUE, http://broadinstitute.github.io/picard/). Nicht übereinstimmende Lesepaare wurden dann mit Samtools (Version 1.3.1) aus der BAM-Datei entfemt39. bedtools (Version 2.17.0) wurde verwendet, um BAM-Dateien in BED-Dateien zu konvertieren und jeden Read auf 15bp stromaufwärts und 22bp stromabwärts vom 5'-Ende des Reads zu verlängern, um die sterische Hinderung von Tn5 -DNA-Kontakten zu berücksichtiget!. JAMM (Version 1.0.7rev5) wurde verwendet, um offene Regionen aus den endgültigen BED-Dateien zu identifizieren, wobei die beiden Replikate getrennt gehalten wurden und Peaks mit einer Breite von mindestens 50bp in der Gesamtliste für die weitere Analyse beibehalten wurden (Parameter: -r peak, -f 38,38, -e auto, -b 100)42. ATAC-Seq- Signal-Bigwig-Dateien wurden mit der JAMM SignalGenerator-Pipeline erzeugt (Einstellungen: -f 38,38 -n depth).
Um das ATAC-Seq-Signal aus den ATAC-Seq-Bigwig-Daten entsprechend dem scRNA- Seq-Clustering zu dekonvolutieren, verfolgten wir die folgende Strategie. Um das ATAC- Seq-Signal zu dekonvolutieren, wurden drei Hauptschritte in der Datenanalyse durchgeführt: 1) Jeder offene Chromatin-Peak (wo TFs erwartet werden, DNA zu binden) wurde zunächst einem bestimmten Gen zugeordnet. 2) Diese Gene wurden pro scRNA-Seq-Cluster (Fib, MF1/2 etc.) in Abhängigkeit von ihrer Expression im Einzelzell-RNA-Seq-Datensatz gereiht. 3) Die Top 2000 ATAC-Peaks wurden verwendet, um angereicherte Transkriptionsfaktor- Motivsequenzen zu identifizieren. Im Detail wurde jeder Open-Chromatin- ATAC-Seq-Peak einem Gen entsprechend der nächstgelegenen annotierten Transkriptionsstartstelle mit Hilfe der bedtools closest-Funktion zugeordnet, wobei lOOkb als maximal mögliche Zuordnungsdistanz festgelegt wurde. Das ATAC-Seq-Peak-Ranking pro scRNA-Seq-Cluster wurde durch das Ranking der Peaks entsprechend dem Ranking des ihnen zugeordneten Gens im Einzelzell-RNA-Seq-Cluster ermittelt. Die Top-2000-ATAC-Seq-Peaks für jeden scRNA-Seq-Cluster wurden ausgewählt und XXmotif wurde für die de-novo-Motivsuche für jeden scRNA-Seq-Cluster und jede offene Chromatinregion separat verwendet (Einstellungen: — revcomp — merge-motif- threshold MEDIUM). Wir behielten nur Motive, deren Vorkommen mehr als 5% betrug, wie von XXmotif definiert, für die weitere Analyse. Das Motiv-Vorkommen aller Motive aus allen 4 scRNA-Seq-Clustem wurde mit Hilfe von FIMO 44 mit Standardparametem (MEME Version 5.0.1) in den Peaks quantifiziert, die den Top 200 Genen in jedem Einzelzell-RNA- Seq-Cluster zugeordnet waren. Dies ergab eine Häufigkeitsmatrix des Motiworkommens in scRNA-Seq-Clustem. Um die Anreicherung/V erarmung des Motiv-Vorkommens in scRNA- Seq-Clustem zu quantifizieren, stellen wir die Iog2-Fold-Änderung dieser Häufigkeiten relativ zur durchschnittlichen Häufigkeit dar, die durch 1000-fache Randomisierung der wahren Häufigkeitsmatrix erhalten wird, wobei die Zeilen- und Spaltensummen konstant bleiben. Die Randomisierung wurde mit dem R-Paket Vegan (https://CRAN.R- project.org/package=vegan) durchgeführt. Positive Zahlen zeigen eine Anreicherung relativ zu dem an, was durch Zufall zu erwarten wäre, negative Zahlen zeigen eine Verarmung an (siehe Hauptabbildung 4k). Wir wählten Irf8, Nrf,Creb5/Atf3, Elf/Ets und Klf für weitere Untersuchungen aus. Wir plotteten das Signal von allen Peaks, die diese Motive enthielten, mit DeepTools Version 3.3.1, wobei wir die von JAMM generierte Bigwig-Datei als Eingabe verwendeten. Wir visualisierten die gleiche Bigwig-Datei und das Auftreten der Motive im Integrative Genomics Viewer.
Andere Visualisierung / Analyse
Heatmaps, die die Genexpression nicht quantifizieren, wurden mit der heatmap2-Funktion im gplots R-Paket (https://CRAN.R-project.org/package=gplots) erstellt. Violinplots wurden mit dem vioplot R-Paket (https://CRAN.R-project.org/package=vioplot) erstellt.
Quantifizierung und statistische Analyse, die außerhalb der Einzelzellsequenzierungsdaten verwendet wurden Die Daten werden als MittelwerttSEM dargestellt, wenn in den Legenden nicht anders angegeben. Der Vergleich von zwei Gruppen wurde mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt. Für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine Einweg-ANOVA mit Bonferroni's multiplem Vergleichstest oder eine Zweiweg-ANOVA mit Sidak's multiplem Vergleichstest angewendet. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) durchgefuhrt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Genregulatorische Netzwerkanalvse
Die Genexpression wurde pro Gen 11 -skaliert und der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen Nkd2 und allen anderen Genen entlang der Einzelzellen von Perizyten, Fibroblasten und Myofibroblasten berechnet. Die Top 100 korrelierenden und die Top 100 antikorrelierenden Gene wurden für die Analyse der Signalweg-Anreicherung ausgewählt. Weiterhin wurde die Expression dieser 200 Gene entlang einzelner Zellen als Eingabe für das GRNboost2+ Python-Paket verwendet, um mutmaßliche regulatorische Verbindungen zwischen Genen vorherzusagen. Das Ausgangsnetzwerk wurde gefiltert, indem Verbindungen mit einer Stärke <= 10 entfernt wurden. Das resultierende Netzwerk wurde als ungerichtetes Netzwerk (da die Regulatoren vorher nicht bekannt sind) mit dem ggraph-Paket (https://cran.r-project.org/web/packages/ggraph/ index.html) gezeichnet und mit dem Louvain- Algorithmus, der im igraph-Paket implementiert ist, in 4 Module geclustert.
Transkriptionsfaktor-Vorhersagen aus Einzelzelldaten
Um Transkriptionsfaktor-Scores in distalen und proximalen Regionen zu erhalten, verwendeten wir die Top 200 Markergene für Fibroblasten-, Perizyten- und Myofibroblasten- Zellcluster als Input-Genlisten für RCisTarget. Wir folgten der RCisTarget-Vignette, um die Analyse mit Standardparametem durchzuführen (verfügbar unter https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/ RcisTarget/inst/doc/RcisTarget.html). Um die API -Expression zu quantifizieren, verwendeten wir alle Jun- und Fos-Gene als Geneset und wendeten die gleiche Methode an, um einen APl-Score zu erhalten, wie wir es für den ECM-Score getan haben. Um die API- Aktivität zu quantifizieren (definiert als die Expression von mutmaßlichen Zielgenen), definierten wir API -Zielgene gemäß der Dorothea-Regulon-Datenbank und wendeten die gleiche Methode wie beim ECM-Score an, um einen APl-Aktivitäts-Score für einzelne Zellen zu erhalten. Überwachte Zellenklassifizierung in Maus
Wir klassifizierten einzelne Zellen im Maus-PDGFRa+b+-Datensatz unter Verwendung des humanen PDGFRb+-Datensatzes als Referenz unter Verwendung des CHETAH-Algorithmus mit Standardparametem. Humane Gensymbole wurden mithilfe der biomaRt-Datenbank in Maus-Gensymbole umgewandelt.
CellPhoneDB-Analyse
CellPhoneDB (v.2.1.1) wurde verwendet, um Zell-Zell-Interaktionen zwischen den Zelltypen, die in der humanen CDIO-Fraktion gefunden wurden, abzuschätzen. Dabei wurde die Version 2.0.0 der Datenbank und die normalisierte Genexpression als Eingabe verwendet, mit Standardparametem (10% der Zellen, die den Liganden/Rezeptor exprimieren). Interaktionen mit einem p-Wert < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Es wurden nur Ligand-Rezeptor-Interaktionen basierend auf der Annotation aus der Datenbank berücksichtigt, bei denen nur und mindestens ein Partner des interagierenden Paares ein Rezeptor war, wodurch Rezeptor-Rezeptor- und andere Interaktionen ohne eindeutigen Rezeptor verworfen wurden. Ligand-Rezeptor-Interaktionen aus Signalwegen, die an der Nierenfibrose beteiligt sind, wurden unter Verwendung der Zugehörigkeit aus der KEGG- Datenbank fur Hedgehog-, Notch-, TGFb- und WNT-Signalisierung und der REACTOME- Datenbank für EGFR-Signalisierung aus MSigDB 3 und manueller Kuration für PDGF- Signalisierung ausgewählt.
Analyse der Bulk-RNA-Seq-Daten
Die Genexpression wurde auf Transkriptionsebene unter Verwendung von Salmon vl.1.0 mit den eingeschalteten Parametern — validatMappings und — gcBias für das humane Gencode v29-Transkriptom quantifiziert. Die Zählungen auf Transkript-Ebene wurden mit dem Import im R-Paket tximport zu Zählungen auf Gen-Ebene aggregiert, wobei countsFromAbundance auf "lengthScaledTPM" eingestellt wurde. Das R-Paket Limma (v.3.44.1) wurde verwendet, um mit der empirischen Bayes-Methode nach Voom-Transformation auf differentielle Genexpression zwischen Nkd2-gestörten menschlichen Nieren PDGFRb+ im Vergleich zu ihrer Kontrolle zu testen. Wir fanden heraus, dass zwei der drei Klone von CRISPR-Cas9 NKD2 Knock-Out in der Hauptkomponentenanalyse zusammen gruppiert waren und einen flachen Phänotyp aufwiesen, während der dritte Klon unabhängig gruppiert war und einen schwereren Phänotyp aufwies. Daher gruppierten wir die beiden ersten Klon-Knock-Outs, um zwei unabhängige Knock-Out-Bedingungen für die statistischen Kontraste zu haben. Differentiell exprimierte Gene wurden anhand der moderierten t-Statistik aus dem statistischen Test fur die Pathway- und Gen-Ontology- Analyse gereiht. Die P-Werte wurden mit der Benjamini & Hochberg-Methode für multiple Tests angepasst. Gene und Signalwege mit FDR < 0,05 wurden als signifikant angesehen.
Für die Signalweg- und Gen-Ontologie-Analyse verwendeten wir auch das R-Paket clusterProfiler mit KEGG- und PID-Signalwege unter Verwendung von Genen mit einem angepassten p-Wert von weniger als 0,01 in den Nkd2-gestörten Zellen im Vergleich zur Kontrolle und einer absoluten logarithmischen Fold-Änderung von mehr als 1 für den Knockout-Vergleich (mehr als 0 für den Überexpressions-Vergleich) mit einem Maximum von 200 Genen, geordnet nach dem angepassten p-Wert. Wir verwendeten GSEA-preranked, um auf eine Anreicherung von ECM-Genen in den Phänotypen zu testen, indem wir das fgsea R-Paket (v.1.14.0)54 mit der MatrisomeDB-Gensatzsammlung verwendeten.
Beispiel 2: Einzelzellatlas der humanen chronischen Nierenerkrankung
Um zu verstehen, welche residenten Zelltypen in der humanen Niere während der Homöostase und CKD extrazelluläre Matrix sezemieren, haben wir eine Einzelzellkarte der humanen Niere mit besonderem Fokus auf das Tubulointerstitium erstellt. Mehr als 80 % der Zellen der Nierenrinde sind Epithelzellen des proximalen Tubulus und haben als solche bisherige Einzelzellkarten der Niere dominiert, wodurch potenziell wichtige Heterogenitäten in anderen zellulären Kompartimenten der Niere überdeckt wurden. Wir haben daher eine Sortierstrategie gewählt, die lebende (lebensfähige), nicht-proximale Tubulusepithelzellen anreichert (d.h. Zellen, die negativ für CD 10 sind, auch bekannt als Membran-Metallo- Endopeptidase - MME), aber auch die lebende, CD 10+ proximale Tubulusepithelfraktion sortiert, um die gesamte Niere in einer unvoreingenommenen Weise zu kartieren. Es ist zu beachten, dass dies eine nicht-exklusive Sortierstrategie ist, da CD 10 auch von einigen anderen Zelltypen exprimiert wird. Sie ermöglicht jedoch eine Anreicherung/Abreicherung der Epithelzellen des proximalen Tubulus. Sowohl CD 10+ als auch CD 10- Fraktionen von insgesamt 13 Patienten mit verschiedenen Stadien der CKD aufgrund von Hypertonieinduzierter Nephrosklerose (n=7; geschätzte glomeruläre Filtrationsrate, eGFR>60 und n=6; eGFR<60) wurden einer scRNAseq unterzogen. Wir profilierten 53.672 CD10-Zellen von 11 Patienten (n=7; eGFR>60; n=4; eGFR<60). Patienten mit eGFR<60 zeigten eine erhöhte interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie. Um die Daten über die Patienten hinweg zu integrieren, setzten wir ein unüberwachtes graphbasiertes Clustering-Verfahren ein (siehe Methoden) und identifizierten 50 verschiedene CDIO-Zellcluster (Abb. la-d), die in beiden eGFR-Gruppen vertreten waren (Abb. le). Unsere Sortier- und Datenintegrationsstrategien erlaubten es uns, das gesamte Ausmaß der Heterogenität im Niereninterstitium zu erfassen, einschließlich der Identifizierung seltener Zelltypen wie Schwann-Zellen, die in früheren Nieren-Einzelzellkarten nicht beschrieben wurden (Abb. la-d).
Insgesamt wurden 33.690 CD10+ proximale Tubuluszellen profiliert (von 8 Patienten (n=5; eGFR>60 und n=3; eGFR<60) und in 7 Clustern angeordnet (Abb. lf). Die Zellzyklusanalyse der CD 10+ proximalen Tubuluszellcluster zeigte eine erhöhte Zyklisierung bei CKD, die wahrscheinlich eine epitheliale Reparaturreaktion widerspiegelt (Abb. lg). Die Analyse der KEGG-Signalwege und der Gene Ontology-Terme in CD10+-Zellen deutet auf einen erhöhten Fettsäurestoffwechsel neben verschiedenen anderen dysregulierten Stoffwechselwegen bei CKD hin (Abb. lh). Der Fettsäurestoffwechsel wurde als einer der wichtigsten dysregulierten Stoffwechselwege in humanen Nieren und Maus-Nieren beschrieben, der tubuläre Dedifferenzierung und Fibrose verursacht (Kang et al. 2015).
Daher setzten wir eine Sortierstrategie ein, die eine hochauflösende Karte humaner Nieren in Homöostase und CKD erzeugte, um die anschließende Untersuchung des zellulären Ursprungs der ECM während der humanen CKD zu ermöglichen.
Beispiel 3: Ursprung der extrazellulären Matrix bei humaner chronischer Nierenerkrankung
Um zu verstehen, welche Zelltypen zur Produktion der extrazellulären Matrix (ECM) während der Progression der humanen Nierenfibrose beitragen, etablierten wir einen Einzelzell-ECM-Expressions-Score, der die Expression aller Kem-ECM-Moleküle einschließlich Kollagenen, Glykoproteinen und Proteoglykanen zusammenfasst. Wir validierten diesen Score in einem veröffentlichten Datensatz von 36 Patienten mit diabetischer Nephropathie (Fan et al 2019) und bestätigten erhöhte ECM-Score-Werte bei fortgeschrittener CKD. Die ECM-Scores zeigten eine deutliche Verschiebung hin zu hoch ECM-exprimierenden Zellen bei CKD (Abb. li). Wir verglichen dann den ECM-Score der wichtigsten Zelltypen in der Homöostase und bei CKD und identifizierten mesenchymale Zellen als die Zellen mit der höchsten ECM-Expression und einem weiteren Anstieg der ECM-Expression bei CKD. Während wir in keinem der mesenchymalen Subcluster bei CKD eine signifikant erhöhte ECM-Expression beobachten konnten, expandierten alle Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen bei CKD, was die insgesamt erhöhte ECM-Genexpression im Mesenchym erklärt (Abb. lk-1). In der Vergangenheit wurde ACTA2 als Myofibroblasten- Marker verwendet. Da jedoch die ECM-Expression das Kennzeichen der Fibrose ist, haben wir Myofibroblasten als Zellen definiert, die die meisten ECM-Gene exprimieren. Neben der Expansion einzelner Zellen ist ein weiterer wichtiger Mechanismus der erhöhten ECM- Expression die Differenzierung von Zellen zu den ECM-reichen Myofibroblasten. Um die Heterogenität der ECM-exprimierenden mesenchymalen Populationen und mutmaßliche Differenzierungsprozesse bei der menschlichen CKD weiter zu untersuchen, haben wir eine Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)-Einbettung von (Myo)Fibroblasten und Perizyten erstellt (Abb. 1 m-n). Diese UMAP-Einbettung stimmte mit unseren Ergebnissen des unüberwachten Graphen-Clustering (Abb. lb-c) überein und unterstreicht die bisher unterschätzte Heterogenität des humanen Nierenmesenchyms. Myofibroblasten wurden eindeutig als Periostin (postn) exprimierende Zellcluster identifiziert (Abb. In). Diffusion Mapping ist eine Methode zur Dimensionalitätsreduktion, die davon ausgeht, dass Zellen durch einen differenzierungsähnlichen Diffusionsprozess miteinander in Beziehung stehen. Wir verwendeten diese Methode, um putative Differenzierungsmechanismen zu Myofibroblasten zu entschlüsseln. Eine Diffusionskarteneinbettung von mesenchymalen Zellen mit den höchsten ECM- Expressionsniveaus legte nahe, dass Myofibroblasten aus Perizyten und Fibroblasten entstehen (Abb. Io).
Wir beobachteten eine geringe Hochregulierung von ECM-Genen in Epithelzellen (Abb. Ij), was auf einen geringen Beitrag der epithelialen mesenchymalen Transition (EMT) hindeutet, die in der Nierengemeinschaft seit vielen Jahren diskutiert wird. Das verletzte proximale Tubulusepithel (iPT) zeigte die höchste Expression von ECM-Genen unter dem CD 10- Epithel mit verschiedenen exprimierten Genen und GO-Begriffen, die auf eine Entdifferenzierung vom regulären Epithel hinweisen. In der CD 10+ Fraktion (alle sortierten proximalen Tubulusepithelien) beobachteten wir ebenfalls einen leichten Anstieg der ECM- Expression bei CKD. Bemerkenswert ist, dass verletzte Zellen durch die Expression von Genen definiert wurden, die zuvor als verletzungsbedingt berichtet wurden, wie Sox9, CD24 und CD 133 für proximales Tubulusepithel und VCAM1 und ACKR1 für Endothel.
Zusammenfassend deuten diese Daten daraufhin, dass die überwiegende Mehrheit der ECM, die während der humanen Nierenfibrose gebildet wird, von mehreren verschiedenen mesenchymalen Zellsubtypen stammt, mit nur einem geringen Beitrag von dedifferenzierten tubulären Epithelzellen.
Beispiel 4: Unterschiedliche Perizyten- und Fibroblasten-Subpopulationen sind die Hauptquelle der Myofibroblasten in der humanen Nierenfibrose
Unsere CD10- scRNA-seq Daten zeigten, dass die große Mehrheit der Collal exprimierenden Zellen PDGFRb+ sind. Wir sortierten daher 37.380 PDGFRb+ Zellen aus 8 menschlichen Nieren (n=4; eGFR>60 und n=4; eGFR<60). Unüberwachtes Clustering identifizierte mesenchymale Zellpopulationen und einige Epithel-, Endothel- und Immunzellen (Abb. 2a-d), die entsprechend ihrer Korrelation mit den CD 10- Populationen annotiert wurden. Kollagen und die ECM-Genexpression im Allgemeinen waren in den Perizyten-, Fibroblasten- und Myofibroblasten-Clustem dominant, in Übereinstimmung mit unseren CD 10- Daten (Abb. Ij-k). Einige Makrophagen/Monozyten-, Endothel- und verletzte Epithelpopulationen exprimierten jedoch auch Kollagenlai und PDGFRb, jedoch auf viel niedrigerem Niveau als Mesenchymzellen (Abb. 2a-c). Computergestützte Vorhersagen von Doublet-Likelihood-Scores zeigten keine besonders hohen Scores für Endothel- und verletzte Epithelzellen, jedoch war der Score für die Makrophagenpopulation leicht erhöht. Wir verifizierten die Collal mRNA-Expression in LTA+ proximalen Tubuli, CD68+ Makrophagen und Pecam-1+ Endothelzellen durch in situ Hybridisierung (ISH). Diese Daten können bis zu einem gewissen Grad die Kontroverse in der Literatur bezüglich der Beiträge von nicht-mesenchymalen Linien zum renalen Myofibroblasten-Pool erklären (Duffield 2014; Wang et al. 2017), da wir in der Tat eine geringe ECM-Genexpression in diesen nichtmesenchymalen Zelltypen beobachteten, während die Mehrheit der ECM-Genexpression von mesenchymalen Zellen stammt.
Pseudozeit-Trajektorien- und Diffusionskarten-Analysen der wichtigsten ECM- exprimierenden zellulären Subtypen aus den PDGFRb+ Populationen zeigten drei Hauptquellen von Myofibroblasten in humanen Nieren: 1) Notch3+/RGS5+/PDGFRa- Perizyten, 2) Meg3+/PDGFRa+ Fibroblasten und 3) Colecl l+/CXCL12+ Fibroblasten (Abb. 2e). Bemerkenswert ist, dass die Diffusionskartierung die Nicht-CKD-Zellen hauptsächlich innerhalb der niedrig ECM-exprimierenden Perizyten- und Fibroblastenpopulationen verortet, was auf einen potenziellen Differenzierungspfad von Niedrig-ECM, Nicht-CKD- Mesenchymzellen (Perizyten und Fibroblasten) zu Hoch-ECM-CKD-Myofibroblasten hinweist (Abb. 2e). Eine UMAP-Einbettung dieser mesenchymalen Zellen war ebenfalls konsistent mit diesen Ergebnissen. Dies ist konsistent mit einer Differenzierung zu Myofibroblasten, die ECM und Postn in der Nierenfibrose exprimieren. Wir verifizierten diese vorhergesagte Richtungsabhängigkeit mit ISH in menschlichen Nieren und bestätigten eine erhöhte Anzahl von Postn exprimierenden Zellen in der Nierenfibrose (Abb. 2f), während die Anzahl von Meg3+ Zellen abnahm. Mithilfe von ISH konnten wir die Hauptlinien in unserer Diffusionskartenanalyse weiter validieren, bestehend aus Notch3+ Perizyten (Linie 1) und Meg3+ Fibroblasten (Linie 2) (Abb. 2f). Wir beobachteten, dass sowohl Meg3+ als auch Notch3+ Zellen Postn koexprimieren, was auf eine Myofibroblasten- Differenzierung hinweist (Abb. 2f). Interessanterweise beobachteten wir auch eine wahrscheinliche Zwischenstufe von Notch3/Meg3/Postn ko-exprimierenden Zellen, die möglicherweise differenzierende Zellen im Zentrum der Diffusionskarte darstellen (Abb. 2f). Wir haben dann untersucht, ob die identifizierten mesenchymalen Subpopulationen auch räumlich getrennt sind. Während wir keine eindeutige räumliche Lokalisation für Fibroblasten 1 (Meg3+), Perizyten (Notch3+) oder Fibroblasten 2 (Cxcll2+) feststellen konnten, beobachteten wir, wie erwartet, eine Anreicherung von Myofibroblasten 1 (Postn+) Zellen in Fibrosebereichen. Interessanterweise zeigten Myofibroblasten 3 (Ccll9+/Ccl21+), die bei humaner Nierenfibrose vermehrt auftreten, eine deutliche Anreicherung um Glomeruli.
Anschließend analysierten wir das Genexpressionsprogramm der Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten (Linie 1) (Abb. 2g). Die Zellzyklusanalyse zeigte tiefgreifende Veränderungen, die sowohl mit einem Differenzierungsprozess als auch mit einer Expansion der Myofibroblastenpopulation übereinstimmen (Abb. 2g). Um die Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten besser zu verstehen, ordneten wir die Anreicherung von Signalwegen entlang der Pseudozeit. Wir beobachteten frühe (kanonisches Wnt, Myc und API), intermediäre (ATF2, PDGFRa und Myc) und späte (Integrin, ECM-Rezeptor- Interaktion und TGFb) Signalwege neben anderen (Abb. 2g unten). Ähnlich wie bei der Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten beobachteten wir eine Beendigung des Zellzyklus während der Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten, gefolgt von einer erhöhten Proliferation (Linien 2 und 3). Die Signalweg- Anreicherung, geordnet entlang der Pseudozeit, hob frühe API -Signaling, Entzündungs- und Immunzell-Interaktionssignalwege hervor, denen Integrin-Signaling, fokale Adhäsions- und ECM-Interaktionssignalwege folgten.
TGFb- Signaling war in der Pseudotime-Analyse der Linie 2 vorherrschend (Abbildung 2g). Myofibroblasten 1, die wahrscheinlich vollständig differenzierte Myofibroblasten darstellen, exprimierten hohe Mengen an TGFb-Liganden und niedrigere Mengen an TGFb-Rezeptoren. Für Fibroblasten 1 wurde jedoch das Gegenteil beobachtet, was auf einen Mechanismus hindeutet, durch den Myofibroblasten die Differenzierung von Fibroblasten fördern können.
Viele der oben beschriebenen Signalwege sind als wichtige Regulatoren der Fibrose bekannt, einschließlich der Integrine27 und auch der APl-Transkriptionsfaktor-Signaling (Wemig et al. 2017), von denen wir beobachteten, dass sie in den frühen Stadien sowohl der Perizytenals auch der Fibroblasten- zu Myofibroblasten-Differenzierung durchweg hoch aktiv waren. Um die transkriptionelle Regulation von Fibroblasten- und Myofibroblastenpopulationen besser zu verstehen, führten wir eine Anreicherungsanalyse von Transkriptionsfaktor-DNA- Sequenzmotiven in Promotoren und distalen Regionen von Markergenen in verschiedenen mesenchymalen Populationen durch. Dies unterstrich eine mögliche regulatorische Schlüsselrolle von AP-1 (Jun/Fos) bei der Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten. Um die Rolle von API funktionell zu validieren, generierten wir eine neuartige humane PDGFRb+ Nierenzelllinie mittels lentiviraler hTERT, SV40LT Transduktion. Die pharmakologische Inhibition des Aktivator-Proteins 1 (API) führte zu einer signifikant verminderten Proliferation und einer verminderten Osteoglycin (Ogn)- Expression, während die Postn-Expression erhöht war, was auf eine Myofibroblasten- Differenzierung dieser Zellen hindeutet. Bemerkenswert ist, dass in den humanen PDGFRb- Daten Ogn 1/3 Fibroblasten markierte, während Postn Myofibroblasten 1 markierte. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen korreliert die API -Expression negativ mit der Kollagenexpression sowohl in Fibroblasten als auch in Myofibroblasten. Interessanterweise korrelierte die Expression der mutmaßlichen Zielgene von API positiv mit der Kollagenexpression in Myofibroblasten, was darauf hinweist, dass API als Suppressor wirken könnte. Wir führten auch Liganden-Rezeptor-Analysen durch (Efremova et al. 2020), um zu klären, welche Zelltypen mit den wichtigsten ECM-exprimierenden mesenchymalen Zellen (Fibroblasten, Perizyten und Myofibroblasten) interagieren. Während wir beobachteten, dass die wenigsten Signale vom gesunden proximalen Tubulusepithel stammten, gehörte das verletzte proximale Tubulusepithel zu den Top-Signalpartnem des Mesenchyms, was mit der tubulär-interstitiellen Signalübertragung als Kennzeichen der Nierenfibrose übereinstimmt (Venkatachalam et al 2015). Wir konzentrierten uns auf Interaktionen von Signalwegen, die als Schlüsselspieler bei der Fibrose beschrieben wurden, einschließlich TGFb, PDGFRa/b, Notch, EGFR und WNT-Signaling (Kramann und DiRocco 2013). Innerhalb dieser Signalwege beobachteten wir Notch-, TGFb-, Wnt- und PDGFa- Signaling vom verletzten proximalen Tubulus in Richtung der mesenchymalen Fibrose treibenden Zellen.
Zusammengefasst deuten diese Daten auf drei zelluläre Hauptquellen von Myofibroblasten der humanen Niere hin, die alle durch PDGFRb markiert sind, nämlich Notch3+/PDGFRa- Perizyten, Meg3+/PDGFRa+ Fibroblasten und Colecll+/Cxcll2+ Fibroblasten, und werfen ein Licht auf ihre Differenzierungsprozesse.
Beispiel 5: Dual-positive PDGFRa+/PDGFRb+ mesenchymale Zellen stellen die Mehrheit der ECM-exprimierenden Zellen in der Nierenfibrose von Mensch und Maus dar
Um die oben vorgestellten Befunde weiter zu untersuchen, verwendeten wir genetisches fate tracing in Mäusen. PDGFRbCreER-tdTomato-Mäuse wurden mit Tamoxifen gepulst und einer unilateralen Ureterobstruktion (UUO) unterzogen und an Tag 10 geopfert (Abb. 3a). Die In-situ-Hybridisierung (ISH) für Collal-mRNA bestätigte, dass praktisch alle Collal- exprimierenden Zellen in der Nierenfibrose der Maus aus der PDGFRb-Linie stammen (Abb. 3b-c). Darüber hinaus bestätigte die Immunfärbung für den historisch verwendeten Myofibroblasten-Marker aSMA (ACTA2), dass die Mehrheit der aSMA-exprimierenden Zellen aus der PDGFRb-Linie stammt. Anschließend führten wir eine SmartSeq2-basierte sc- RNA-seq-Zeitverlaufsstudie in PDGFRb-eGFP-Mäusen durch (Picelli et al 2014) (Abb. 3d- e). Während die Abundanz von glatten Muskelzellen und Perizyten nach UUO im Laufe der Zeit abnahm, nahmen Mesangialzellen und Collal+/PDGFRa+ matrixproduzierende Zellcluster im Laufe der Zeit deutlich zu (Abb. 3f-g). Ähnlich wie in unseren humanen Nierendatensätzen (Abb. 1,2) wurde die wichtigste ECM-exprimierende Zellpopulation durch die duale PDGFRa/PDGFRb-Expression und auch die Expression von Decorin (DCN) und Periostin (Postn) definiert (Abb. 3g-h). Darüber hinaus zeigten Perizyten und vaskuläre glatte Muskelzellen (vSMCs) eine gewisse ECM-Expression, jedoch auf einem deutlich niedrigeren Niveau als die duale PDGFRa/PDGFRb-Population.
Immunfarbung und ISH in Mäusen bestätigten, dass Collal-exprimierende Zellen doppelt positiv für PDGFRa+ und PDGFRb-tdTomato sind (Abb. 3i-j). Dies stimmt mit unseren humanen CDIO-Daten überein, bei denen die Selektion auf PDGFRa+/b+ exprimierende Zellen zu einer Anreicherung mit Collal+ Zellen führte, was PDGFRa/PDGFRb exprimierende Zellen als Hauptquelle der ECM-Expression identifiziert (Abb. 3k). Wir bestätigten diesen Befund in einer größeren Humankohorte mittels Multiplex-ISH in Gewebe-Mikroarrays von 62 Patienten (Abb. 31). Die Diffusionskarteneinbettung von Matrix-produzierenden Zellen und Perizyten stimmte ebenfalls mit unseren humanen PDGFRb-Daten überein und legte nahe, dass Perizyten (PDGFRb+, PDGFRa-, Notch3+) einer der Ursprünge der wichtigsten ECM-produzierenden Zellen (PDGFRb+, PDGFRa+, Collal+, Postn+) sind.
Zusammengenommen zeigen unsere humanen Daten und Fate-Tracing-Experimente in Mäusen, dass PDGFRa+/PDGFRb+ dual-positive mesenchymale Zellen, die alle Fibroblasten- und Myofibroblasten-Populationen umfassen, einschließlich der von Perizyten abgeleiteten Myofibroblasten, aber nicht die nicht-aktivierten Perizyten (d. h. Perizyten, die keine hohe ECM-Genexpression aufweisen) (Abb. 2e), die Mehrheit der Collal- exprimierenden Zellen sowohl in der humanen als auch in der Maus-Nierenfibrose darstellen.
Beispiel 6: PDGFRa+/PDGFRb+ Zellen sind heterogen und enthalten verschiedene Fibroblasten-Zellstadien
Um mechanistische Einblicke in den Übergang von Fibroblasten zu Myofibroblasten zu gewinnen und die Heterogenität der PDGFRa+/PDGFRb+-Population zu untersuchen, haben wir als nächstes scRNA-Seq-Daten von 7.245 doppelt positiven PDGFRa+/PDGFRb+- Mausnierenzellen generiert, indem wir eine UUO-Operation im Vergleich zu einer Scheinbehandlung in PDGFRb-eGFP-Mäusen durchgefuhrt haben, gefolgt von einer Sortierung der eGFP/PDGFRa-doppelpositiven Zellen (Abb. 4a). In Übereinstimmung mit einer schnell expandierenden Zellpopulation zeigten die PDGFRa+/PDGFRb+ doppeltpositiven Zellen einen ~140-fachen Anstieg der Zellzahlen nach der Verletzung (Abb. 4b), in Übereinstimmung mit unseren Smart-Seq2-Daten (Abb. 3f). Die UMAP-Einbettung von PDGFRa+/PDGFRb+ Zellen zeigte vier große, unterschiedliche Populationen, die dem Mesenchym (Fibroblasten und Myofibroblasten), Epithel-, Endothel- und Immunzellen entsprechen (Abb. 4c-d). Alle diese Zelltypen wurden zuvor als möglicher zellulärer Ursprung der Nierenfibrose diskutiert (Duffield et al 2014; Wang et al 2017; Kramann et al 2018). Bemerkenswert ist, dass wir in diesen PDGFRa+/PDGFRb+ Daten keine undifferenzierten Perizyten nachweisen konnten, da Perizyten bei Menschen und Mäusen PDGFRa- sind (Abb. 2e, 3g). Nicht-mesenchymale Zellen exprimierten deutlich weniger PDGFRb, PDGFRa, ECM und Kollagen als mesenchymale Zellen (Abb. 4d-e), was die Beobachtung in unseren Humandaten unterstützt, dass nicht-mesenchymale Zellen in geringem Maße zum Narbenbildungsprozess beitragen (Abb. 1,2). Bemerkenswert ist, dass, wie in den humanen Daten, die rechnerisch abgeleiteten Doubletten-Scores nicht darauf hindeuten, dass diese Matrix-exprimierenden nicht-mesenchymalen Zellpopulationen wahrscheinlich Doubletten sind.
Unüberwachtes Clustering ergab zwei Hauptklassen innerhalb der mesenchymalen Zellen in diesem Maus-PDGFRa+/PDGFRb+-Datensatz (1) Fibroblasten 1, gekennzeichnet durch Scara5- und Meg3 -Expression, und (2) Myofibroblasten, bestehend aus verschiedenen Myofibroblasten-Subpopulationen (Abb. 4c-d). In unseren Humandaten entsprechen die Myofibroblasten 1 den terminal differenzierten Myofibroblasten mit der höchsten ECM- Expression, denen in der Pseudodifferenzierungszeit die Myofibroblasten 2 (Ogn+) vorausgehen, während die Fibroblasten 1 als eine "Progenitor"-Population nicht aktivierter Fibroblasten erscheinen (Abb. 2e). Tatsächlich lassen sich die Fibroblasten 1-Zellen in den PDGFRa+/PDGFRb+-Daten durch drei Hauptmerkmale von den Myofibroblasten unterscheiden: Erstens wurde Coll5al, ein Myofibroblasten-spezifisches Kollagen in Mäusen (Abb. 3g), in den Fibroblasten 1 in geringerer Konzentration exprimiert als in den Myofibroblasten-Clustem (Abb. 4f). Zweitens wurde Meg3, obwohl es auch in einer Fraktion der proximalen tubulären Zellen und des glomerulären Endothels exprimiert wird, nur in Fibroblasten 1 innerhalb der mesenchymalen Populationen nachgewiesen (Abb. 4d). Wir bestätigten das Vorhandensein einer Meg3+ PDGFRa+/PDGFRb+ mesenchymalen Subpopulation in humanen Nieren durch In-situ-Hybridisierung (Abb. 4h-i), was auf das Vorhandensein einer Fibroblasten 1 ähnlichen Subpopulation in menschlichen Nieren hindeutet. Drittens sind die Fibroblasten 1 Zellen Scara5+ aber Frzb-, was wiederum zeigt, dass sie sich von Myofibroblasten unterscheiden.
Nachdem wir Fibroblasten 1 als eine eigenständige Fibroblastenpopulation etabliert hatten, generierten wir UMAP- und Diffusionskarteneinbettungen und führten Pseudozeitanalysen aller Pdgfra+/Pdgfrb+ mesenchymalen Zellen der Maus durch, um einen Einblick in ihre Abstammungsbeziehungen zu erhalten (Abb. 4j). Diese Analyse schlug Fibroblast 1 (Meg3+, Scara5+) und Myofibroblast 2 (Coll4al+, Ogn+) als frühe Zustände, Myofibroblast 3 a als Zwischenzustand und Myofibroblast la (Nrp3+, Nkd2+), 1b (Grem2+) und 3b (Frzb+) als terminale Zustände vor (Abb. 4j).
Diese Daten legen nahe, dass Fibroblasten 1 und Myofibroblasten 2 die Hauptquelle der Myofibroblasten in der Nierenfibrose der Maus sind. Myofibroblasten 2 (Ogn+/Coll4al+) könnten in gesunden Mäusenieren existieren oder als Zwischenzustand durch Differenzierung von Perizyten zu Myofibroblasten entstehen (Abb. 2e, humane Daten). Die Expression von Angiotensin-Rezeptor 1 (AGTRla) ist in Myofibroblasten 2 angereichert und könnte auf deren Perizytenursprung hinweisen (Abb. 4j).
Die Analyse der Zeitverlaufs-UUO-Daten zeigt, dass Ogn, Scara5 und Pcolce2 in der Homöostase angereichert sind, während das Naked Cuticle Homolog 2 (Nkd2) nach Verletzungen angereichert ist. Dies deutet weiter auf Fibroblasten 1 (Meg3+, Scara5+) und Myofibroblasten 2 (Ogn+) als Zellen in der Nierenhomöostase hin. Darüber hinaus bestätigt die überwachte Klassifizierung der Pdgfra+/Pdgfrb+ Einzelzelldaten der Maus unter Verwendung unserer humanen Pdgfrb+ Zellen als Referenz die eindeutige Identität von Fibroblasten 1 und Myofibroblasten als gemeinsames Merkmal in beiden Spezies.
Insgesamt deuten unsere kombinierten und umfassenden Daten von Mensch und Maus auf ein Modell hin, in dem Pdgfrb+/Pdgfra+/Postn+ hoch-ECM exprimierende Myofibroblasten (in diesem Manuskript als Myofibroblasten 1 bezeichnet) aus Pdgfrb+/Pdgfra-/Notch3+ Perizyten, Pdgfrb+/Pdgfra+/Scara5+ Fibroblasten (Fibroblasten 1) und Pdgfrb+/Pdgfra+/Cxcll2+ Fibroblasten (Fibroblasten 2) entstehen. Perizyten differenzieren potentiell über einen intermediären ECM-exprimierenden Pdgfrb+/Pdgfra+/Ogn+/Coll4al+ Zustand (Myofibroblasten 2) in Myofibroblasten 1. Beispiel 7: Unterschiedliche Fibroblasten- und Myofibroblasten-Zustände werden durch spezifische Transkriptionsfaktor-Regulationsprogramme unterschieden
Als nächstes versuchten wir herauszufinden, ob die in unseren Daten entdeckten Fibroblasten- und Myofibroblasten-Zellzustände wirklich unterschiedliche Zelltypen darstellen. Unterschiedliche Zelltypen würden sich sowohl durch unterschiedliche Genexpressionsprofile als auch durch unterschiedliche Transkriptionsfaktor- Regulationsprogramme unterscheiden (Gerstein et al. 2012). Wir generierten Bulk-ATAC- Seq-Daten (Buenrostro et al 2013) von Pdgfra+/Pdgfrb+-Mausnierenzellen 10 Tage nach der UUO-Operation und dekonvolutierten die Signaturen der offenen Chromatinregion (OCR) aus den ATAC-Seq-Daten basierend auf der OCR-Nähe zu Markergenen, die in den scRNA- Seq-Clustem identifiziert wurden. Fibroblasten 1 und Myofibroblasten 2 waren sowohl voneinander als auch von anderen Myofibroblasten-Populationen unterschieden. Myofibroblasten la unterschieden sich von Myofibroblasten 1b und wiesen eine Anreicherung von ATF auf. Myofibroblasten 2 und 3b zeigten eine Anreicherung des Orphan-Rezeptors NRF4A1, der zuvor als wichtiger Regulator von TGFb-Signalen und Fibrose berichtet wurde (Palumbo-Zerr et al 2015). Fibroblasten 1 zeigten eine Anreicherung von AP-1 (JunZFos)-Motiven (Abbildung 4k), was mit ihrer putativen Rolle übereinstimmt, die in unseren humanen Daten beschrieben wurde. Die RNA-Expression dieser durch ATAC- Seq ausgewählten Faktoren steht im Einklang mit der Anreicherung von Sequenzmotiven (Abbildung 4k) und unterstreicht die divergierende Transkriptionsregulation zwischen Fibroblasten 1, Myofibroblasten 2 und anderen Myofibroblastenpopulationen. Außerdem heben wir Transkriptionsfaktoren hervor, die in Bezug auf die Nierenfibrose möglicherweise unterschätzt werden, darunter Nrfl, Irf8 und Creb5. Übereinstimmend mit unseren ATAC- Seq-Daten zeigte die Analyse der Signalwege auf Basis unserer scRNA-Seq-Daten, dass Fibroblasten 1 und Myofibroblasten unterschiedliche Populationen mit verschiedenen angereicherten Signalwegen sind (Abbildung 41). Daher sind Fibroblasten 1 und Myofibroblasten-Subtypen wahrscheinlich unterschiedliche ECM-exprimierende mesenchymale Zelltypen, die spezifische Transkriptionsfaktor-Regulationsprogramme beherbergen.
Beispiel 8: Nkd2 wird für die Kollagenexpression in PDGFRb+ Zellen der humanen Niere benötigt und ist ein potenzielles therapeutisches Ziel bei Nierenfibrose Als nächstes fragten wir, ob die von uns generierten scRNA-seq-Daten zur Identifizierung potenzieller therapeutischer Targets bei humaner Nierenfibrose verwendet werden können. Nkd2 wird spezifisch in Pdgfra+/Pdgfrb+ terminal differenzierten Myofibroblasten der Maus exprimiert (Abb. 5a), so dass Nkd2/PDGFRa dual-positive Zellen >40% aller Collal+ Zellen ausmachten (Abb. 5b). In humanen PDGFRb+ Zellen ist NKD2 ein Marker für Myofibroblasten mit hohem ECM-Gehalt, wobei seine Expression positiv mit der Postn- und ECM-Expression korreliert und antikorreliert mit Genen, die mit Perizyten und Fibroblasten assoziiert sind (Abb. 5c). Darüber hinaus waren NKD2+ Myofibroblasten mit einer erhöhten TGFb-, Wnt- und TNFa-Signalweg- Aktivität im Vergleich zu NKD2- Zellen assoziiert. Wir verifizierten die NKD2-Expression mittels Multiplex-ISH in einem humanen Nierengewebe- Microarray (TMA) von 36 Patienten und bestätigten, dass eine Subpopulation von humanen PDGFRa/PDGFRb exprimierenden Zellen auch Nkd2 exprimiert (Abb. 5d-e). Darüber hinaus war die Abundanz von PDGFRa/PDGFRb/Nkd2 koexprimierenden Zellen bei Patienten mit ausgeprägterer interstitieller Fibrose höher (Abb. 5e).
Nkd2 wurde als Wnt-Signalweg- und TNFa-Modulator dokumentiert (Zhao et al 2015; Hu und Li 2010; Hu et al 2010; Li et al 2004). Um die Mechanismen zu verstehen, durch die Nkd2 die Nierenfibrose reguliert, haben wir unsere humanen PDGFRb+ Daten verwendet, um ein genregulatorisches Netzwerk vorherzusagen, das sich auf Gene konzentriert, die mit Nkd2 korreliert sind, unter Verwendung des GRNboost2 Frameworks. Das resultierende Netzwerk gliederte sich in 4 genregulatorische Module, darunter ribosomale Proteine (Modul 1), Gene, die mit der ECM-Expression Zusammenhängen (Modul 2), Gene, die mit Perizyten Zusammenhängen (Modul 3) und Gene, die mit nicht aktivierten Fibroblasten Zusammenhängen (Modul 4). Bemerkenswert ist, dass dieser Gencluster neben Nkd2 auch verschiedene Wnt-Modulatoren und Effektoren wie Kif26b, Lefl und Wnt4 enthält. Nkd2 ist mit ECM-Genen platziert und steht in Verbindung mit Etvl und Lamp5, sowie indirekt über Lamp5 mit Coll al. Diese Analyse deutet auf einen möglichen Mechanismus hin, durch den Nkd2 durch Etvl (ein Mitglied der Ets-Faktor-Familie) reguliert wird und durch Beeinflussung der parakrinen Signalübertragung durch Lamp5 wirkt.
Die lentivirale Überexpression von Nkd2 in unserer humanen PDGFRb-Zelllinie führte zu einer erhöhten Expression von wichtigen pro-fibrotischen ECM-Molekülen wie collal und Fibronektin als Reaktion auf TGFb (Abb. 5f-g). Wichtig ist, dass der CRISPR/Cas9- Knockout von Nkd2 zu einer deutlichen Reduktion der Expression von collal, Fibronektin und ACTA2 in Gegenwart oder Abwesenheit von TGFb führte (Abb. 5h-i). RNA-seq von Zellen, die Nkd2 überexprimierten, zeigte eine Hochregulierung von ECM-Regulatoren und ECM-Glykoproteinen, während RNA-seq von Nkd2-Knockout-Klonen einen Verlust von ECM-Regulatoren, ECM-Glykoproteinen und Kollagenen anzeigte (Abb. 5j). Pathway- und Gene Ontology-Analysen zeigten eine Rolle für Nkd2 in ECM-Expressionsprogrammen und legten ein weiteres Zusammenspiel mit API - und Integrin-Signalwegen nahe (Abb. 5k). Wir beobachteten außerdem starke Veränderungen in der Expression von Wnt-Rezeptoren und - Liganden nach Nkd2-Knockout in vitro, was seine mögliche Beteiligung an diesem Signalweg bestätigt.
Um Nkd2 als therapeutisches Target weiter zu validieren, generierten wir aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) abgeleitete Nierenorganoide, die alle wichtigen Kompartimente der humanen Niere enthalten. Es ist bekannt, dass ILlb in iPSC-abgeleiteten Nierenorganoiden Fibrose induziert (Lemos et al 2018). Wichtig ist, dass der siRNA- vermittelte Knockdown von Nkd2 die ILlb-induzierte Coll al -Expression in den Nierenorganoiden hemmte (Abb. 51-o). Diese Daten bestätigen, dass Nkd2 Myofibroblasten in der Nierenfibrose von Mensch und Maus markiert, für die Kollagenexpression der renalen Myofibroblasten erforderlich ist und daher ein vielversprechendes potenzielles therapeutisches Ziel zur Behandlung von Patienten mit Nierenfibrose darstellt.
Beispiel 9: Screening auf Wirkstoffe, die an das NDK2-Protein binden und/oder es hemmen
Screening-Experimente ermöglichen die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die an das NKD2-Protein binden und/oder dessen Aktivität hemmen.
Es werden DNA-verschlüsselte Substanzbibliotheken generiert und gescreent, wie beschrieben (Kunig et al. 2018). Dazu werden rekombinantes NKD2-Protein oder Fragmente davon, die einen His-Tag tragen, in E. coli, Insektenzellen oder Säugetierzellen exprimiert. Das gereinigte NKD2-Protein wird mit der Substanzbibliothek inkubiert und durch Immunpräzipitation isoliert. Die an das NKD2-Protein gebundenen Verbindungen werden durch Sanger-Sequenzierung der DNA-Barcodes identifiziert. Die identifizierten Verbindungen werden anschließend auf ihre Wirkung auf die Funktion von NKD2, die Differenzierung von Myofibroblastenzellen, die Expression und Sekretion von Matrixproteinen, wie z.B. Kollagen 1, und die Entwicklung einer Nierenfibrose getestet. Zu diesem Zweck werden experimentelle Maus-in-vivo-Modelle der Nierenfibrose eingesetzt.
Für die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die eine Wirkung auf die nkd2-Expression ausüben, wird ein in-vitro-Fluorochrom-Reportersystem auf Basis humaner Zellen etabliert, wobei beispielsweise die Expression des eGFP-NKD2-Fusionsproteins oder ein Luciferase- basiertes Reportersystem verwendet wird, um Substanzbibliotheken in Assays mit 384 bis 1.536 Vertiefungen auf die Identifizierung von Verbindungen zu screenen, die die eGFP- Fluoreszenz oder den Luciferase-Spiegel als Readout reduzieren. Die Expression dieser humanen NKD2-Fusionsreporterkonstrukte in den genannten Zellen kann z. B. durch Transfektion und Selektion über Resistenzgenkassetten oder durch virale Transduktion erfolgen. Für diese Assays werden humane Zelllinien wie z.B. 293T-Zellen, aber auch etablierte humane Nieren-Myofibroblasten-Zelllinien eingesetzt. Parallel zu diesem Screening werden Zytotoxizitätsassays durchgefuhrt, um Verbindungen auszuschließen, die einen Effekt auf die Reporterfluoreszenz oder -aktivität aufgrund von unspezifischer Toxizität oder Auslösung von Apoptose ausüben.
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Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine gegebene Zelle, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
(i) Hemmen oder Reduzieren der nkd2-Genexpression in der Zelle,
(ii) Fördern des Abbaus des NKD2-Proteins in der Zelle, und/oder
(iii) Hemmen oder Reduzieren der NKD2-Proteinaktivität in der Zelle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung oder Reduzierung der nkd2- Genexpression durch nkd2-Gen-Knock-down, Knock-out, konditionalen Gen-Knock- out, Genveränderung, RNA-Interferenz, siRNA und/oder Antisense-RNA erreicht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung oder Reduzierung der NKD2- Proteinaktivität durch Verwendung eines Wirkstoffs erreicht wird, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagte Zelle eine Nierenzelle ist, vorzugsweise eine Nierenmyofibroblastenzelle, am meisten bevorzugt eine terminal differenzierte Nierenmyofibroblastenzelle.
5. Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) Protein oder ein Fragment davon bindet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, das mindestens die folgenden Schritte umfasst
(i) Bereitstellen des NKD2-Proteins oder eines Fragments davon,
(ii) Zugabe von mindestens einem Wirkstoff, der auf Bindung an das NKD2-Protein oder ein Fragment davon untersucht werden soll, und
(iii) Identifizierung des mindestens einem Wirkstoff, der an das NKD2-Protein oder das Fragment davon gebunden hat.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, wobei der Wirkstoff ein NKD2- Inhibitor ist.
66 Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer niedermolekularen Verbindung, einem Peptid und einem Biologikum. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Biologikum ein Antikörper, ein antigenbindendes Fragment davon, ein antigenbindendes Derivat davon, ein antikörperähnliches Protein oder ein Aptamer ist. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, wobei das NKD2-Protein an eine feste Phase gebunden ist oder in Lösung vorliegt. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, wobei der Wirkstoff Mitglied einer Verbindungsbibliothek ist. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Verbindungsbibliothek niedermolekulare Verbindungen, Peptide oder biologische Verbindungen umfasst. Verwendung einer Nukleinsäure, die für das Naked Cuticle Homolog 2 oder ein Fragment davon oder das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein oder ein Fragment davon kodiert, in einem Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an NKD2 oder ein Fragment davon bindet, nach einem der Ansprüche 5 bis 12. Antikörper oder antigenbindendes Fragment oder Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, das spezifisch an das NKD2-Protein bindet. Antikörper, oder antigenbindendes Fragment oder Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, nach Anspruch 14, wobei der Antikörper, oder das antigenbindende Fragment oder Derivat davon, oder das antikörperähnliche Protein, die NKD2-Aktivität inhibiert. Wirkstoff, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12.
67 Wirkstoff nach Anspruch 16 zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung. Wirkstoff, der an das Protein Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2) bindet, zur Verwendung bei der Behandlung von chronischer Nierenerkrankung. Wirkstoff nach Anspruch 18, wobei der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2-Aktivität hemmt. Wirkstoff zur Verwendung nach einem der Ansprüche 16 und 17, wobei die chronische Nierenerkrankung eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist. Wirkstoff nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei der Wirkstoff eine niedermolekulare Verbindung (smol), ein Peptid oder ein Biologikum ist, wobei das Biologikum vorzugsweise ein Antikörper oder ein Fragment davon, oder ein Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, oder ein Aptamer ist. Verwendung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet, in einem Verfahren zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose ist. Verwendung eines Wirkstoffs nach Anspruch 22, wobei der Wirkstoff, wenn er an NKD2 gebunden ist, die NKD2-Aktivität hemmt. Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer chronischen Nierenerkrankung, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Wirkstoffs, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet und/oder dieses hemmt, in einer therapeutisch wirksamen Dosis an ein menschliches oder tierisches Subjekt umfasst. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment oder Derivat davon oder ein antikörperähnliches Protein nach einem der Ansprüche 14 und 15 oder den Wirkstoff nach einem der Ansprüche
68 16 bis 21 und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei die Hilfsstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus pharmazeutisch verträglichen Puffern, Tensiden, Verdünnungsmitteln, Trägem, Hilfsstoffen, Füllstoffen, Bindemittel, Schmiermitteln, Gleitmitteln, Desinfektionsmitteln, Adsorptionsmitteln und/oder Konservierungsmitteln. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend
(i) das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, und ferner
(ii) Mischen des identifizierten Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Zusammensetzung, umfassend eine Kombination aus (i) dem Antikörper oder antigenbindenden Fragment oder Derivat davon oder antikörperähnlichem Protein nach einem der Ansprüche 14 und 15 oder dem Wirkstoff, der an das Naked Cuticle Homolog 2 (NKD2)-Protein bindet, nach einem der Ansprüche 16 bis 21 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25 und 26, und (ii) einer oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Verbindungen. Therapeutisches Kit, umfassend:
(i) die pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 25, 26 oder 28,
(ii) eine Vorrichtung zur Verabreichung der Zusammensetzung, und
(iii) optional eine Gebrauchsanweisung.
69
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