DE102022132156A1

DE102022132156A1 - ADAMTS12 als Zielmolekül zur Behandlung chronischer Niereninsuffizienz und Nierenfibrose

Info

Publication number: DE102022132156A1
Application number: DE102022132156.8A
Authority: DE
Inventors: Rafael Kramann; Konrad Hoeft; Lars Leonhard Koch
Original assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2022-12-05
Filing date: 2022-12-05
Publication date: 2024-06-06
Also published as: WO2024121113A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Rolle des ADAMTS12-Proteins (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12-Protein) bei der Entwicklung von chronischen Nierenerkrankungen, insbesondere von progressiven chronischen Nierenerkrankungen und Nierenfibrosen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an das ADAMTS12-Protein binden, und auf die Verwendung von ADAMTS12-Protein zum Screening und zur Identifizierung von ADAMTS12-interagierenden und ADAMTS12-inhibierenden Verbindungen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Nierenerkrankungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Wirkstoffe umfassen, die an das ADAMTS12-Protein binden und/oder dieses hemmen.

Description

Technischer Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Rolle des ADAMTS12-Proteins (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12-Protein) bei der Entwicklung von chronischen Nieren- und Herzerkrankungen, insbesondere von progressiver chronischer Niereninsuffizienz und Nierenfibrose bzw. Herzinsuffizienz und kardialer Fibrose. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an das ADAMTS12-Protein binden und/oder es inhibieren, und die Verwendung von ADAMTS12-Protein zum Screening und zur Identifizierung von ADAMTS12-interagierenden und ADAMTS12-inhibierenden Verbindungen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Nierenerkrankungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Wirkstoffe umfassen, die an das ADAMTS12-Protein binden und/oder dieses hemmen.
Hintergrund und Stand der Technik
Eine Fibrose ist definiert als die pathologische Ablagerung von extrazellulärem Bindegewebe (extrazellulärer Matrix, EZM), welche mit einer Verdrängung von gesundem Gewebe und einem Organfunktionsverlust einhergeht. Während die initiale Ablagerung von EZM wichtig ist, um nach einer Organschädigung die Gewebeintegrität zu erhalten, führt die unkontrollierte Ablagerung von EZM zu einer Verdrängung von gesundem Gewebe und einem Organfunktionsverlust. Unabhängig von der initialen Schädigung stellt die Fibrose dabei organübergreifend das gemeinsame Endstadium fast aller chronischen Erkrankungen dar. Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass eine Fibrose daher für bis zu 45% aller Todesfälle in Industrieländern verantwortlich ist (Henderson et al., 2020). Aufgrund der alternden Bevölkerung wird die Prävalenz einer Fibrose auch in den nächsten Jahrzehnten weiter zunehmen.
Weltweit nimmt die Anzahl der Patienten, die unter einer chronischen Niereninsuffizienz (CKD = chronic kidney disease) leiden, zu, und aktuelle Daten zeigen, dass in westlichen Ländern bis zu 10% der Bevölkerung im Laufe ihres Lebens an einer CKD erkranken (Jha et al., 2013). Aufgrund des steigenden durchschnittlichen Lebensalters und der zunehmenden Prävalenz von Hypertonie und Diabetes ist davon auszugehen, dass die Häufigkeit der CKD auch in Zukunft steigen wird. Dabei kommt es mit abnehmender Nierenfunktion zu einer deutlich erhöhten Morbidität und Mortalität. Im Endstadium der CKD sind die Dialyse und Nierentransplantation die einzigen Therapieoptionen. Aufgrund der langen Wartezeiten auf gespendete Nieren werden die meisten dieser Patienten dialysiert. Eine Dialysetherapie ist jedoch mit einer hohen Mortalität (5-Jahres-Überleben nach neu eingetretener Dialysepflichtigkeit ca. 50%, Naylor et al., 2019), zahlreichen Ko-Morbiditäten und einer erheblichen Einschränkung der Lebensqualität (3x pro Woche, 4-6 Stunden Dialysetherapie) verbunden. Außerdem stellen die hohen Kosten der Dialyse eine enorme ökonomische Belastung für das Gesundheitssystem dar (Cm und F, 2017). Daher sind neuartige Therapieansätze erforderlich.
Das Ausmaß der Nierenfibrose ist untrennbar mit dem Verlust der Nierenfunktion und dem klinischen Verlauf der CKD verbunden. Die Nierenfibrose ist durch eine hohe Expression, Sekretion und Akkumulation von extrazellulären Matrix (ECM)-Proteinen wie Kollagen-1 gekennzeichnet.
Myofibroblasten, welche nach einer Organschädigung expandieren, sind die Hauptproduzenten der extrazellulären Matrix und nehmen damit eine Schlüsselrolle in der Entstehung der Fibrose ein (Henderson et al., 2020; Kuppe et al., 2021). Während lange Zeit die Herkunft dieser Myofibroblasten unklar war, konnte inzwischen eine perivaskuläre Zellpopulation identifiziert werden, die durch die Expression des Transkriptionsfaktors Gli1 gekennzeichnet ist und aus welcher 50% der Myofibroblasten hervorgehen (Kramann et al., 2015a). Welche Signale zu einer Aktivierung, Expansion und Myofibroblasten-Differenzierung dieser Gli1-Fibroblasten führt, ist allerdings noch unklar.
Die histologische Struktur der Niere kann in drei Hauptkompartimente unterteilt werden, die alle von Fibrose betroffen sein können, speziell bezeichnet als Glomerulosklerose in den Glomeruli, interstitielle Fibrose im Tubulointerstitium und Arteriosklerose und perivaskuläre Fibrose in der Vaskulatur (Djudjai und Boor 2019).
Die Inhibition der Fibrose kann in Tiermodellen die Progression einer chronischen Niereninsuffizienz verhindern und die Nierenfunktion erhalten (Kramann et al., 2015a, 2015b). Aktuell gibt es jedoch keine zugelassene Therapie der Nierenfibrose. Aufgrund der zunehmenden Prävalenz der chronischen Niereninsuffizienz ist daher die Entwicklung von Medikamenten zur Therapie der Fibrose von essentieller Bedeutung.
Somit besteht eine der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe in der Bereitstellung von Verfahren und Mitteln zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen, sowie von den genannten Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen.
In der vorliegenden Anmeldung wird die Identifizierung eines neuen molekularen Zielmoleküls („Targets“) für die Therapie der Nierenfibrose offenbart. Auf Grundlage einer Identifizierung und Isolierung der Gli1-exprimierenden Fibroblasten nach Induktion einer Nierenfibrose aus einer Maus, und einer Analyse der Gesamt-RNA, d.h. der Expression aller Gene, die von besagten aktivierten Fibroblasten exprimiert wurden, mittels eines Microarray konnten die Erfinder überraschenderweise das Protein „A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12“ (ADAMTS12) als neues molekulares Target identifizieren. ADAMTS12 gehört zu der Familie der ADAMTS-Metalloproteasen und degradiert das extrazelluläre Matrixprotein Thrombospondin 5 (Wei et al., 2014). Die Erfinder konnten erstmalig zeigen, dass die Metalloprotease ADAMTS12 ein essentieller Mediator der Fibrose ist, und dass der Knockout (KO) von ADAMTS12 die Ausbildung von Fibrose nach Nieren- und Herzschädigung inhibiert.
Die ADAMTS („A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs“)-Proteine gehören zur Metzincin-Protease-Superfamilie, die nach einem konservierten Methionin-Rest nahe dem aktiven Zentrum der Zn-Ionen-abhängigen Metalloproteinasen benannt sind (Kelwick et al. 2015). Mindestens 19 verschiedene ADAMTS-Proteine wurden bisher in Säugetier-Genomen identifiziert. Die ADAMTS-Proteine sind sezernierte, extrazelluläre Zink-Matrix Metalloproteinasen mit einem einheitlichen, geordneten modularen Aufbau. Die ADAMTS-Proteine werden zunächst als inaktive Prä-Proenzyme exprimiert, deren Strukturen ein Signalpeptid, eine Pro-Region variabler Länge, eine katalytische Metalloproteinase-Domäne, eine Disintegrin-ähnliche Domäne, einen zentralen Thrombospondin Typ-1-ähnlichen (TSP) Sequenz-Repeat, eine Cystein-reiche Domäne, eine Spacer-Region, und eine variable Anzahl von weiteren C-terminalen TSP-Repeats enthält (5) (Kelwick et al. 2015; Lin et al. 2009).
Das ADAMTS12-Gen enthält insgesamt 24 Exons, die ein extrazelluläres Protein von 1594 Aminosäuren codieren (Mohamedi et al. 2021). Als Substrate von ADAMTS12 wurden Aggrecan, COMP (cartilage oligomeric matrix protein) und alpha2M (Alpha 2-Macroglobulin) identifiziert. Eine Rolle von ADAMTS12-Protein wurde bisher bei der Chondrogenese, Knorpel-Entwicklung und der Gonaden-Differenzierung beschrieben, sowie bei pädiatrischem Schlaganfall, Schizophrenie, Tumorgenese und Arthritis (Lin et al. 2009; Wei et al. 2014; Mohamedi et al. 2021; Witten et al. 2020).
Die vorliegende Anmeldung offenbart ADAMTS12 als Zielmolekül und damit neuen therapeutischen Ansatz für die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung von Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz und Nierenfibrose.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Mittel zur Identifizierung von Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von chronischer Niereninsuffizienz bereit, insbesondere zur Identifizierung von hochwirksamen Wirkstoffen, Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und Nierenfibrose.
In Anbetracht des Standes der Technik war es daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine bestimmte Zelle bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Verringerung der Expression, Differenzierung und Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix durch (Myo)Fibroblasten bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs bereitzustellen, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet und/oder dieses hemmt.
Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung einer Nukleinsäure, die für das ADAMTS12-Protein, oder ein Fragment davon, codiert, oder das ADAMTS12-Protein selbst, oder ein Fragment davon, für die Identifizierung eines Wirkstoffs, der an ADAMTS12, oder ein Fragment davon, bindet, bereitzustellen.
Es war eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wirkstoffe zur Verwendung bei der Behandlung von chronischen Nierenerkrankungen bereitzustellen, insbesondere zur Verwendung bei der Behandlung von fortschreitender chronischer Nierenerkrankung und/oder Nierenfibrose, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die diese Mittel enthalten, und von Verfahren zur Herstellung solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen, basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen.
Die beschriebenen und weitere technischen Aufgaben werden durch die Vorrichtungen bzw. Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen der aktuellen Erfindung gelöst. Die abhängigen Ansprüche beschreiben bevorzugte Ausführungsformen. Wertebereiche, die durch numerische Werte begrenzt sind, sollen stets die besagten Grenzwerte beinhalten.
Die Erfindung und allgemeine vorteilhafte Ausgestaltungen werden im Folgenden näher erläutert.
Beschreibung der Zeichnungen

1: Microarray von Gli1-Fibroblasten nach Unilateraler Ureter-Obstruktion (UUO). (A) Aufbau des Experiments. (B) „Hallmark Gene Set Enrichment“ Analyse (GSEA) basierend auf den differentiell exprimierten Genen in Gli1-Fibroblasten nach UUO. (C) Darstellung der „Top 25“ hochregulierten Gene in Gli1-Fibroblasten nach UUO geordnet nach T-Werten. (D) Repräsentative Bilder einer In-Situ-Hybridisierung (ISH) für Pdgfrb- und Adamts12-Transkripte in murinen Nieren zu verschiedenen Zeitpunkten nach Ischämie-Reperfusion (IRI). (E) Quantifizierung der Adamts12 ISH-Expression. (F) Quantifizierung der Pdgfrb ISH-Expression. (G) Quantifizierung der Adamts12 ISH-Expression in Pdgfrb positiven Zellen. **p<0,01, ***p<0,001.
2: Der genetische Verlust von Adamts12 schützt vor Fibrose. (A-G) Adamts12^-/- oder WT Mäuse erhielten eine Unilaterale Ureter Obstruktion (UUO) oder Schein-Operation (Sham). 10 Tage nach OP wurden die Mäuse getötet, und die Nieren entnommen. (A) Adamts12 RT-qPCR. (B) Kollagen 1 RT-qPCR (Col 1a1). (C) Fibronektin (Fn1) RT-qPCR. (D) PDGFRb Immunfluoreszenzfärbung (IF). (E) Quantifizierung der IF PDGFRb Expression. (F) Immunhistochemische (IHC) Färbung von Kollagen 1 (Col 1). (G) Quantifizierung der IHC Kollagen 1 Expression. (H-I) Adamts12^-/- oder WT Mäuse erhielten eine Myokardinfarkt-Operation (MI) oder Schein-Operation (Sham). (H) Echokardiographisch gemessene linksventrikuläre Ejektionsfraktion (LV-EF) in WT und Adamts12^-/- Mäusen nach Myokardinfarkt (MI) oder Sham-Operation. (I) Fibrose, gemessen in Serienschnitten von Picrosirius-Rot Färbungen, in WT und Adamts12^-/- Mäusen nach Myokardinfarkt oder Sham-Operation. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,001.
3: ADAMTS12 CRISPR-Cas9 KO in humanen renalen PDGFRb-positiven Fibroblasten. (A-B) ADAMTS12 bzw. COL1A1 RT-qPCR in Kontroll- (Non-Targeting gRNA) und ADAMTS12 CRISPR-KO (ADAMTS12-KO) humanen renalen PDGFRb Fibroblasten nach Stimulation mit Vehikel (Vehicle) oder TGFb. (C) Migrations-Analyse von Kontroll- (Non-Targeting gRNA) und ADAMTS12 CRISPR-KO (ADAMTS12-KO) humanen renalen PDGFRb Fibroblasten nach Stimulation mit Vehikel (Vehicle) oder TGFb. (D) Western-Blot für das HA-Epitop, Tubulin, und eGFP in humanen renalen PDGFRb Fibroblasten mit ADAMTS12 CRISPR-KO (KO) und leerem Expressionsplasmid pMIG (ohne Insertion einer protein-codierenden Nucleotidsequenz), ADAMTS12 CRISPR-KO und Überexpression des HA-„getaggten“ ADAMTS12 mittels pMIG Expressionsplasmid (WT), und Überexpression von katalytisch inaktivem, HA-„getaggtem“ ADAMTS12 Protein mittels pMIG Expressionsplasmid (Mut). (E) Migrations-Analyse von humanen renalen PDGFRb Fibroblasten mit ADAMTS12 CRISPR-KO (ADAMTS12-KO) und leerem Expressionsplasmid pMIG (ohne Insertion einer protein-codierenden Nucleotidsequenz), ADAMTS12 CRISPR-KO und Überexpression des HA-„getaggten“ ADAMTS12 Proteins (ADAMTS12-KO mit WT), und Überexpression des katalytisch-inaktiven, HA-„getaggten“ ADAMTS12 Proteins (Mut).
4: ADAMTS12-Expression in humanen Nieren. (A) ADAMTS12-Expression in CD10-negativen, Interstitium-angereicherten Niereneinzelzellen (nach Depletion von proximalen Tubuluszellen), die aus 15 humanen Nieren mittels FACS isoliert wurden. (B) ADAMTS12-Expression in PDGFRb-positiven Einzelzellen, welche aus acht humanen Nieren mittels FACS isoliert wurden. (C) Repräsentatives Bild der ISH für PDGFRB, COLI Al und ADAMTS12 in 43 humanen Nieren. (D) Quantifizierung der ISH. Darstellung des Anteils ADAMTS12-positiver Zellen, welche ebenfalls PDGFRB-positiv sind. (E) Korrelation der ADAMTS12- und PDGFRB-ISH Expression in humanem Nierengewebe. (F) Korrelation der ADAMTS12- und COL1A1-ISH Expression in humanem Nierengewebe.
5: Domänen-Struktur und Organisation des ADAMTS12-Proteins. Der N-Terminus von ADAMTS12 besteht aus einem Signal-Peptid, einer Prodomäne und einer Metalloproteinase-Domäne. Der C-Terminus von ADAMTS12 umfasst eine Disintegrin-ähnliche Domäne, den ersten Thrombospondin-Typ 1 Repeat (TSP1), eine Cys-reiche Domäne, und 7 weitere TSP1-Repeats, die von zwei Spacer-Domänen getrennt werden. Die zweite Spacer-Domäne ist eine Mucin-ähnliche Domäne (aus Wei et al. 2014).

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Bevor die Erfindung im Detail beschrieben wird, wird darauf hingewiesen, dass diese Erfindung nicht begrenzt ist auf bestimmte Bestandteile der beschriebenen Vorrichtungen oder beschriebenen Schritte der Verfahren, da diese Verfahren bzw. Vorrichtungen variieren können. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die verwendete Terminologie hierfür nur zum Zweck für bestimmte beschriebene Ausführungsformen benutzt wird, und nicht absichtlich begrenzt ist.
Es soll angemerkt werden, dass in der Beschreibung und in den anhängenden Ansprüchen die einfache Form wie „ein/eine“ oder „der/die/das“ einen singulären und/oder pluralen Gegenstand beinhaltet, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes vorschreibt. Für den Fall, dass ein Parameterbereich angegeben wurde, zählen die begrenzenden Zahlenwerte als Grenzwerte zum offenbarten bzw. beanspruchten Zahlenbereich dazu.
Es ist ferner zu beachten, dass die hier offenbarten Ausführungsformen nicht als einzelne Ausführungsformen zu verstehen sind, die sich nicht aufeinander beziehen würden. Merkmale, die im Zusammenhang mit einer Ausführungsform diskutiert werden, sollen auch im Zusammenhang mit anderen hier gezeigten Ausführungsformen als offenbart gelten. Wenn in einem Fall ein bestimmtes Merkmal nicht mit einer Ausführungsform, sondern mit einer anderen offenbart wird, wird der Fachmann verstehen, dass dies nicht unbedingt bedeutet, dass dieses Merkmal nicht mit der anderen Ausführungsform offenbart werden soll. Der Fachmann wird verstehen, dass es dem Prinzip dieser Anmeldung entspricht, das betreffende Merkmal auch für die andere Ausführungsform zu offenbaren, dass dies aber aus Gründen der Klarheit und um die Spezifikation in einem überschaubaren Umfang zu halten, nicht getan wurde.
Ferner wird der Inhalt der hierin genannten Dokumente des Standes der Technik durch Bezugnahme einbezogen. Dies gilt insbesondere für Dokumente des Standes der Technik, die Standard- oder Routineverfahren offenbaren. In diesem Fall hat die Einbeziehung durch Bezugnahme vor allem den Zweck, eine ausreichende Offenbarung zu ermöglichen und langwierige Wiederholungen zu vermeiden.
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine gegebene Zelle, und/oder zur Hemmung der Migration von Fibroblasten, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(i) Hemmen oder Reduzieren der ADAMTS12-Genexpression in der Zelle,
(ii) Hemmen oder Reduzieren der ADAMTS12-Aktivität,
(iii) Hemmen oder Reduzieren der ADAMTS12-Proteaseaktivität, und/oder
(iv) Fördern des Abbaus des ADAMTS12-Proteins.

Die Hemmung oder Reduzierung der ADAMTS12-Genexpression kann beispielsweise einen ADAMTS12-Gen-„Knock-down“, einen „Knock-out“, einen konditionalen „Gen-Knockout“, eine Genveränderung oder Mutation, eine RNA-Interferenz, siRNA und/oder Antisense-RNA umfassen.
Die Hemmung oder Reduzierung der ADAMTS12-Protein-Aktivität kann die Verwendung eines Wirkstoffs umfassen, der an das ADAMTS12-Protein (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12-Protein) bindet und/oder seine Aktivität hemmt oder reduziert.
Vorzugsweise ist die besagte Zelle eine Nierenzelle oder eine kardiale Zelle, vorzugsweise eine Nierenfibroblastenzelle oder eine kardiale Fibroblastenzelle, eine Nierenmyofibroblastenzelle oder eine kardiale Myofibroblastenzelle, oder eine Nieren-Perizyte oder kardiale Perizyte; am meisten bevorzugt eine Nierenfibroblastenzelle oder eine kardiale Fibroblastenzelle.
Bei dem ADAMTS12-Protein kann es sich um ein Säugetier-, Nicht-Primaten-, Primaten- und insbesondere um ein humanes ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon handeln.
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12-Protein) oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert.
Das Verfahren umfasst mindestens die folgenden Schritte:

(i) Bereitstellen des ADAMTS12-Proteins oder eines Fragments davon,
(ii) Zugabe von mindestens einem Wirkstoff, der auf Bindung an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon untersucht werden soll, und
(iii) Identifizierung des mindestens einen Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon gebunden hat.

Vorzugsweise ist der zu screenende und zu identifizierende Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung ein ADAMTS12-Inhibitor oder -Antagonist, ein die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmendes oder reduzierendes Agens.
Der Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann aus der Gruppe bestehend aus einer niedermolekularen Verbindung, einem natürlichen oder synthetischen Peptid oder Peptid-Derivat, und einem Biologikum oder biologischen Wirkstoff ausgewählt werden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „niedermolekulare Verbindung“, „kleines Molekül“ („smol“) oder „chemisches Arzneimittel“ auf eine organische Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (<10.000 Dalton, insbesondere < 1.000 Dalton), oft mit einer Größe in der Größenordnung von 1 nm. Viele Medikamente sind kleine Moleküle. Solche kleinen Moleküle können einen biologischen Prozess regulieren. Kleine Moleküle können in der Lage sein, eine spezifische Funktion eines Proteins zu hemmen. Im Bereich der Pharmakologie bezieht sich der Begriff „kleines Molekül“ insbesondere auf Moleküle, die an spezifische biologische Makromoleküle binden und als Effektor wirken, indem sie die Aktivität oder Funktion eines Ziels verändern. Zum Beispiel gilt Acetylsalicylsäure (ASS) als niedermolekulare Verbindung, die 180 Dalton misst und aus 21 Atomen besteht. Solche niedermolekularen Verbindungen haben oft nur eine geringe Fähigkeit, eine Immunreaktion auszulösen und bleiben über die Zeit relativ stabil.
Die niedermolekulare Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung kann neben anderen chemischen Rückgraten, Substituenten, Gruppen oder Resten beispielsweise Alkyl-, Alkenyl- , Alkinyl-, Alkoxy-, Aryl-, Alkylen-, Arylen-, Amino-, Halogen-, Carboxylatderivat-, Cycloalkyl-, Carbonylderivat-, Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylen-, Sulfonat-, Sulfat-, Phosphonat-, Phosphat-, Phosphin-, Phosphinoxidgruppen umfassen.
Das „Biologikum“, „biologische Arzneimittel“, „biologische Therapeutikum“, „Biopharmazeutikum“ oder der „biologische Wirkstoff” gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Antikörper, oder ein antigen-bindendes Fragment davon, oder ein antigen-bindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Molekül oder Protein, oder ein Aptamer, oder eine Nukleinsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, ist der Wirkstoff Mitglied einer „Bibliothek“ von Verbindungen.
Die „Bibliothek“ (Mischung) von Verbindungen kann z. B. niedermolekulare Verbindungen, natürliche oder synthetische Peptide oder Peptid-Derivate, bzw. Biologika oder biologische Wirkstoffe oder biologische Verbindungen umfassen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „(kombinatorische) Verbindungsbibliothek“ oder „Bibliothek von Verbindungen“ auf Sammlungen von jeweils chemischen Verbindungen, kleinen Molekülen, natürlichen oder synthetischen Peptiden oder Peptid-Derivaten, bzw. Makromolekülen wie Proteinen oder anderen Biologika, in denen jeweils eine große Anzahl verwandter chemischer, peptidischer bzw. biologischer Spezies von Molekülen enthalten sind, die zusammen in bestimmten Screening-Assays oder Identifizierungsschritten verwendet werden können.
Verfahren zur Herstellung von Molekülbibliotheken niedermolekularer chemischer Verbindungen („Compound Libraries“) und zur Hochdurchsatz-Prüfung („High-Throughput-Screening“) der Verbindungen auf Wechselwirkung mit dem Target-Molekül sind im Stand der Technik beschrieben (zum Beispiel, Volochnyuk et al. 2019). Diese Verfahren umfassen auch sog. „Fokus-Libraries“, hochgradig annotierte und vor-selektierte chemische Molekülbibliotheken (Wassermann et al. 2014), DNA-codierte Bibliotheken chemischer Verbindungen (Martin et al. 2020), und chemoinformatik-basierte virtuelle Molekülbibliotheken (Saldivar-Gonzalez et al. 2020). Die Verwendung sog. „Phage Display“-Technologien zur Identifizierung von geeigneten „Small-Molecule“-Wirkstoffen wurde beispielsweise beschrieben von Takakusagi et al., 2020. Zahlreiche andere Peptid- und Anti-körper-„Display“-Technologien wie „Bacterial Display“, „Yeast Surface Display“ und „Mammalian Surface Display“ sowie „Ribosome Display“ sind beschrieben in Valldorf et al., 2022.
Verfahren zur Herstellung von Molekülbibliotheken, deren Immobilisierung und deren Hochdurchsatz-Prüfung („High-Throughput-Screening“) von biologischen Molekülen, beispielsweise von Peptiden, Peptid-Derivaten, Proteinen, Antikörpern, antigen-bindenden Antikörper-Fragmenten, antigen-bindenden Antikörper-Derivaten, oder antikörper-ähnlichen Molekülen, sind im Stand der Technik ebenfalls beschrieben (für Peptid-Bibliotheken beispielsweise in Bozovicar und Bratkovic 2019; Schwaar et al. 2019; für Antikörper-Bibliotheken in Lin und Lerner 2021).
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins oder eines Fragments davon hemmt oder reduziert, ist das Biologikum ein Antikörper, ein antigen-bindendes Fragment davon, ein antigen-bindendes Derivat davon, ein antikörperähnliches Molekül oder Protein, ein Aptamer, oder eine Nukleinsäure.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins oder eines Fragments davon hemmt oder reduziert, ist das ADAMTS12-Protein an eine feste Phase gebunden oder liegt in Lösung vor.
Gemäß einem dritten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Nukleinsäure, die das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon kodiert, oder die Verwendung des ADAMTS12-Proteins oder eines Fragments davon, in einem Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins oder eines Fragments davon hemmt oder reduziert.
Zur Expression der ADAMTS12-Metalloproteinase oder eines Fragments davon wird eine Nukleinsäure, welche die ADAMTS12-Metalloproteinase oder ein Fragment davon kodiert, in einen geeigneten Expressionsvektor, z.B. ein geeignetes Expressionsplasmid, kloniert wie beschrieben (Green und Sambrook 2012). Das rekombinante Expressionsplasmid wird durch Transfektion in eine für die Expression von ADAMTS12 oder eines Fragments davon geeignete Zelle eingeschleust, die Zelle in Zellkultur mit einem geeigneten Zellkulturmedium propagiert, und das exprimierte Protein aus den Zellen und/oder dem Zellkulturmedium gereinigt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Transfektion“ auf jegliches Verfahren zum absichtlichen Einbringen einer fremden Nukleinsäure in eine eukaryontische Zelle. Für eine Transfektion in eukaryontische Zellen können verschiedene Arten von Nukleinsäuren verwendet werden, insbesondere Desoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), sowie kleine, nicht codierende RNAs wie siRNA, shRNA, und miRNA.
Hinsichtlich der Transfektion werden stabile und transiente Transfektion unterschieden. Bei der stabilen Transfektion wird durch Integration der in die Zelle eingeführten Nukleinsäure in das zelluläre Genom eine Langzeit-Expression des Transgens erreicht, während die transiente Transfektion, bei der die Expression des Transgens nur vorübergehend erfolgt, keine Integration der Nukleinsäure in das zelluläre Genom erfordert.
Die Auswahl der optimalen Transfektionsmethode hängt von verschiedenen Faktoren ab, insbesondere dem Typ und Ursprung der Ziel- bzw. Produktionszelle sowie der Art der eingeführten Nukleinsäure. Für die Einführung von fremder (modifizierter homologer und/ oder heterologer) Nukleinsäure, die das gewünschte Transgen codiert, in eukaryontische Zellen können physikalische, chemische und virale vector-basierte Transfektionsmethoden verwendet werden. Physikalische Transfektionsverfahren umfassen z.B. Elektroporation, Sonoporation, Magnetofektion, Microinjektion und biolistische Verfahren. Zu den chemischen Transfektionsverfahren zählen die Calciumphosphat-Methode, die Verwendung von Dendrimeren, kationischen Polymeren wie Diethylaminoethyl-dextran (DEAE-dextran), Nanopartikeln, nicht-liposomalen Nanopartikeln, und liposomaler Transfektion. Bei der Transfektion mittels viraler Vektoren (sog. „Transduktion“) kommen insbesondere genetisch modifizierte Retro- und Lentiviren, Adenoviren, und adeno-assoziierte Viren (AAV) zum Einsatz (Fus-Kujawa et al. 2021).
Gemäß einem vierten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, erhalten durch besagtes Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, bzw. erhalten durch eine der oben beschriebenen Ausführungsformen des besagten Verfahrens.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, und/oder den Abbau des ADAMTS12-Proteins fördert.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, der die Expression des ADAMTS12-Gens in einer Nierenzelle oder einer kardialen Zelle hemmt oder reduziert, vorzugsweise wobei die Nierenzelle eine Nierenfibroblastenzelle und/oder die kardiale Zelle eine kardiale Fibroblastenzelle ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff, wobei der Wirkstoff eine niedermolekulare Verbindung (smol), ein Peptid oder Peptid-Derivat, oder ein Biologikum ist, vorzugsweise wobei das Biologikum ein Antikörper oder ein antigen-bindendes Fragment davon, oder ein antigen-bindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, oder ein Aptamer oder eine Nukleinsäure ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der Wirkstoff spezifisch mit einer hohen oder besonders hohen Affinität und/oder Avidität an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon. In einer bevorzugten Ausführungsform reduziert oder hemmt der Wirkstoff, wenn er an ADAMTS12 gebunden ist, die ADAMTS12-Aktivität.
Der Begriff „spezifisch binden“, wie hier verwendet, bedeutet, dass der Wirkstoff eine Dissoziationskonstante KD bezüglich seiner Bindung an das ADAMTS12-Proteinmolekül oder ein Epitop davon von höchstens etwa 100 µM aufweist. In einer Ausführungsform ist die KD etwa 100 µM oder niedriger, etwa 50 µM oder niedriger, etwa 30 µM oder niedriger, etwa 20 µM oder niedriger, etwa 10 µM oder niedriger, etwa 5 µM oder niedriger, etwa 1 µM oder niedriger, etwa 900 nM oder niedriger, etwa 800 nM oder niedriger, etwa 700 nM oder niedriger, etwa 600 nM oder niedriger, etwa 500 nM oder niedriger, etwa 400 nM oder niedriger, etwa 300 nM oder niedriger, etwa 200 nM oder niedriger, etwa 100 nM oder niedriger, etwa 90 nM oder niedriger, etwa 80 nM oder niedriger, etwa 70 nM oder niedriger, etwa 60 nM oder niedriger, etwa 50 nM oder niedriger, etwa 40 nM oder niedriger, etwa 30 nM oder niedriger, etwa 20 nM oder niedriger, oder etwa 10 nM oder niedriger, etwa 1 nM oder niedriger, etwa 900 pM oder niedriger, etwa 800 pM oder niedriger, etwa 700 pM oder niedriger, etwa 600 pM oder niedriger, etwa 500 pM oder niedriger, etwa 400 pM oder niedriger, etwa 300 pM oder niedriger, etwa 200 pM oder niedriger, etwa 100 pM oder niedriger, etwa 90 pM oder niedriger, etwa 80 pM oder niedriger, etwa 70 pM oder niedriger, etwa 60 pM oder niedriger, etwa 50 pM oder niedriger, etwa 40 pM oder niedriger, etwa 30 pM oder niedriger, etwa 20 pM oder niedriger oder etwa 10 pM oder niedriger oder etwa 1 pM oder niedriger.
Gemäß einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper, oder ein antigen-bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, das spezifisch an das ADAMTS12-Protein bindet.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung besagten Antikörper, oder antigen-bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, wobei der Antikörper, oder das antigen-bindende Fragment oder Derivat davon, oder das antikörperähnliche Protein die ADAMTS12-Aktivität inhibiert, d.h. als Inhibitor oder Antagonist von ADAMTS12 wirkt.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Antikörper“ auf ein Protein, das aus einer oder mehreren Polypeptidketten besteht, die von Immunglobulin-Genen oder Fragmenten von Immunglobulin-Genen oder von diesen abgeleiteten cDNAs kodiert werden. Zu diesen Immunglobulin-Genen gehören die Gene der leichten Kette kappa, lambda und der schweren Kette alpha, delta, epsilon, gamma und mu der konstanten Region sowie jedes der vielen verschiedenen Gene der variablen Region.
Die grundlegende Struktureinheit des Immunglobulins (Antikörpers) ist normalerweise ein Tetramer, das aus zwei identischen Paaren von Polypeptidketten besteht, den leichten Ketten (L, mit einem Molekulargewicht von etwa 25 kDa) und den schweren Ketten (H, mit einem Molekulargewicht von etwa 50-70 kDa). Jede schwere Kette besteht aus einer variablen Region der schweren Kette (abgekürzt als VH oder V_H) und einer konstanten Region der schweren Kette (abgekürzt als CH oder C_H). Die konstante Region der schweren Kette besteht aus drei Domänen, nämlich CH1, CH2 und CH3. Jede leichte Kette enthält eine variable Region der leichten Kette (abgekürzt als VL oder V_L) und eine konstante Region der leichten Kette (abgekürzt als CL oder C_L). Die VH- und VL-Regionen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, die auch als komplementaritätsbestimmende Regionen (CDR) bezeichnet werden, durchsetzt mit Regionen, die eher konserviert sind und als Framework-Regionen (FR) bezeichnet werden. Jede VH- und VL-Region besteht aus drei CDRs und vier FRs, die vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der Reihenfolge FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 angeordnet sind. Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten bilden eine Bindungsdomäne, die mit einem Antigen interagiert.
Die CDRs sind am wichtigsten für die Bindung des Antikörpers bzw. des antigenbindenden Teils davon. Die FRs können durch andere Sequenzen ersetzt werden, sofern die dreidimensionale Struktur, die für die Bindung des Antigens erforderlich ist, erhalten bleibt.
Der Begriff „antigenbindender Teil“ des (monoklonalen) Antikörpers bezieht sich auf ein oder mehrere Fragmente eines Antikörpers, die die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an das Antigen in seiner nativen Form beibehalten. Beispiele für antigenbindende Teile des Antikörpers umfassen ein Fab-Fragment, ein monovalentes Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht, ein F(ab')2-Fragment, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfasst, die durch eine Disulfidbrücke an der Scharnierregion verbunden sind, ein Fd-Fragment, bestehend aus der VH- und CH1-Domäne, ein Fv-Fragment, bestehend aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers, und ein dAb-Fragment, das aus einer VH-Domäne und einer isolierten komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) besteht.
Der Antikörper, das Antikörperfragment oder das Antikörperderivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein monoklonaler Antikörper sein. Der Antikörper kann vom Isotyp IgA, IgD, IgE, IgG oder IgM sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „monoklonaler Antikörper (mAb)“ auf eine Antikörperzusammensetzung mit einer homogenen Antikörperpopulation, d.h. einer homogenen Population, die aus einem ganzen Immunglobulin oder einem Fragment oder Derivat davon besteht. Besonders bevorzugt ist ein solcher Antikörper ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IgG, IgD, IgE, IgA und/oder IgM, oder ein Fragment oder Derivat davon.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Fragment“ auf Fragmente eines solchen Antikörpers, die ihre Zielbindungskapazitäten beibehalten, z.B. eine CDR (komplementaritätsbestimmende Region), eine hypervariable Region, eine variable Domäne (Fv), eine schwere IgG-Kette (bestehend aus VH-, CH1-, Scharnier-, CH2- und CH3-Regionen), eine leichte IgG-Kette (bestehend aus VL- und CL-Regionen) und/oder eine Fab und/oder F(ab)2.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Derivat“ auf Proteinkonstrukte, die sich strukturell von dem gängigen Antikörperkonzept unterscheiden, aber dennoch eine gewisse strukturelle Verwandtschaft zu diesem aufweisen, z. B. scFv, Fab und/oder F(ab)2, sowie auf bi-, tri- oder höher-spezifische Antikörperkonstrukte. Alle diese Elemente werden im Folgenden erläutert.
Weitere dem Fachmann bekannte Antikörperderivate sind Diabodies, Camelid-Antikörper, Domain-Antikörper, bivalente Homodimere mit zwei Ketten, die aus scFvs bestehen, IgAs (zwei IgG-Strukturen, die durch eine J-Kette und eine sekretorische Komponente verbunden sind), Hai-Antikörper, Antikörper, die aus Neuwelt-Primaten-Gerüst plus Nicht-Neuwelt-Primaten-CDR bestehen, dimerisierte Konstrukte, die CH3+VL+VH umfassen, andere Gerüstproteinformate, die CDRs umfassen, und Antikörperkonjugate.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „antikörperähnliches Protein“ auf ein Protein, das (z. B. durch Mutagenese von Ig-Schleifen) so verändert wurde, dass es spezifisch an ein Zielmolekül bindet. Typischerweise umfasst ein solches antikörperähnliches Protein mindestens eine variable Peptidschleife, die an beiden Enden an ein Proteingerüst gebunden ist. Diese doppelte strukturelle Einschränkung erhöht die Bindungsaffinität des antikörperähnlichen Proteins auf ein Niveau, das mit dem eines Antikörpers vergleichbar ist. Die Länge der variablen Peptidschleife besteht typischerweise aus 10 bis 20 Aminosäuren. Das Gerüstprotein kann jedes Protein mit guten Löslichkeitseigenschaften sein. Vorzugsweise ist das Gerüstprotein ein kleines globuläres Protein. Antikörperähnliche Proteine umfassen ohne Einschränkung Affibodies, Anticaline und designte Ankyrin-Proteine und Affilin-Proteine. Antikörperähnliche Proteine können aus großen Bibliotheken von Mutanten abgeleitet werden, z. B. durch Panning aus großen Phage-Display-Bibliotheken, und können in Analogie zu regulären Antikörpern isoliert werden. Auch können antikörperähnliche Bindungsproteine durch kombinatorische Mutagenese von oberflächenexponierten Resten in globulären Proteinen erhalten werden. Antikörperähnliche Proteine wurden beschrieben beispielsweise in Binz et al. (2005) und Hosse et al. (2006).
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Fab“ auf ein IgG-Fragment, das die Antigenbindungsregion umfasst, wobei das Fragment aus einer konstanten und einer variablen Domäne jeweils der schweren und leichten Kette des Antikörpers zusammengesetzt ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „F(ab)2“ auf ein IgG-Fragment, das aus zwei Fab-Fragmenten besteht, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind.
Der hier verwendete Begriff „scFv“ bezieht sich auf ein variables Einzelkettenfragment, das eine Fusion der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten von Immunglobulinen ist, die durch einen kurzen Linker miteinander verbunden sind, der üblicherweise Serin- (S) und/oder Glycin- (G) Reste umfasst. Dieses chimäre Molekül behält die Spezifität des ursprünglichen Immunglobulins bei, trotz der Entfernung der konstanten Regionen und der Einführung eines Linker-Peptids.
Modifizierte Antikörperformate sind z. B. bi- oder trispezifische Antikörperkonstrukte, antikörperbasierte Fusionsproteine, Immunkonjugate und ähnliches.
IgG, scFv, Fab und/oder F(ab)2 sind Antikörperformate, die dem Fachmann gut bekannt sind. Detailierte Ausführungen und Techniken sind in entsprechenden Lehrbüchern zu finden.
Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Antikörper oder das antigenbindende Fragment davon oder das antigenbindende Derivat davon ein muriner, ein chimärer, ein humanisierter oder ein humaner Antikörper bzw. ein antigenbindendes Fragment oder ein antigenbindendes Derivat davon.
Monoklonale Antikörper (mAb), die von der Maus stammen, können unerwünschte immunologische Nebenwirkungen verursachen, da sie ein Protein einer anderen Spezies enthalten, das eine Immunantwort induzieren kann. Um dieses Problem zu überwinden, wurden Methoden zur Humanisierung und Reifung von Antikörpern entwickelt, um Antikörpermoleküle mit minimaler Immunogenität bei Anwendung am Menschen zu erzeugen, während die Spezifität und Affinität des nicht-humanen parentalen Antikörpers im Idealfall erhalten bleibt. Bei diesen Methoden werden z. B. die Gerüstregionen eines MausmAbs durch entsprechende humane Gerüstregionen ersetzt (sog. CDR-Grafting). WO200907861 offenbart die Erzeugung humanisierter Formen von Maus-Antikörpern durch Verknüpfung der CDR-Regionen nicht-humaner Antikörper mit humanen konstanten Regionen mittels rekombinanter DNA-Technologie. US6548640 beschreibt CDR-Transplantationstechniken, und US5859205 beschreibt die Herstellung humanisierter Antikörper.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „humanisierter Antikörper“ auf einen Antikörper, ein Fragment oder ein Derivat davon, bei dem mindestens ein Teil der konstanten Regionen und/oder der Gerüstregionen und optional ein Teil der CDR-Regionen des Antikörpers von humanen Immunglobulinsequenzen abgeleitet oder an diese angepasst ist.
Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff wie oben beschrieben oder einen Antikörper, ein antigen-bindendes Fragment oder ein antigenbindendes Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, wie oben beschrieben, zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung.
Dabei handelt es sich bei der chronischen Nierenerkrankung vorzugsweise um eine fortschreitende chronische Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose. Bei der Herzerkrankung handelt es sich vorzugsweise um eine Herzinsuffizienz, einen Herzinfarkt und/oder eine kardiale Fibrose.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Wirkstoff wie oben beschrieben, oder den Antikörper, das antigen-bindende Fragment oder antigen-bindende Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, wie oben beschrieben, und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, vorzugsweise wobei die chronische Nierenerkrankung eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung, eine Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose ist, und vorzugsweise wobei die Herzerkrankung eine Herzinsuffizienz und/oder kardiale Fibrose ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist/sind der/die besagte(n) pharmazeutisch verträgliche(n) Hilfsstoff(e) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pharmazeutisch verträglichen Puffern, Tensiden, Verdünnungsmitteln, Trägern, Hilfsstoffen, Füllstoffen, Bindemittel, Schmiermitteln, Gleitmitteln, Desinfektionsmitteln, Adsorptionsmitteln und/oder Konservierungsmitteln.
Die besagte pharmazeutische Zusammensetzung kann in Form von Pulver, Tabletten, Pillen, Kapseln oder Perlen verabreicht werden. In wässriger Form kann die pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung bereit sein, während die Formulierung in lyophilisierter Form vor der Verabreichung in eine flüssige Form überführt werden muss, z. B. durch Zugabe von Wasser für Injektionszwecke, das ein Konservierungsmittel wie z. B., aber nicht beschränkt auf, Benzylalkohol, Antioxidantien wie Vitamin A, Vitamin E, Vitamin C, Retinylpalmitat und Selen, die Aminosäuren Cystein und Methionin, Zitronensäure und Natriumcitrat, synthetische Konservierungsmittel wie die Parabene Methylparaben und Propylparaben enthalten kann oder nicht.
Die pharmazeutische Formulierung kann ferner einen oder mehrere Stabilisatoren enthalten, die z. B. eine Aminosäure, ein Zuckerpolyol, ein Disaccharid und/oder ein Polysaccharid sein können. Die pharmazeutische Formulierung kann weiterhin ein oder mehrere Tenside, ein oder mehrere Isotonisierungsmittel und/oder einen oder mehrere Metallionenchelatoren und/oder ein oder mehrere Konservierungsmittel enthalten.
Die pharmazeutische Formulierung, wie hierin beschrieben, kann zumindest für eine orale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung geeignet sein. Alternativ kann der Wirkstoff oder Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Depotformulierung bereitgestellt werden, die die verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs über einen bestimmten Zeitraum ermöglicht.
Weiterhin wird eine Primärverpackung, wie z. B. eine vorgefüllte Spritze oder ein vorgefüllter Pen, ein Fläschchen oder ein Infusionsbeutel, bereitgestellt, die die besagte pharmazeutische Formulierung gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfasst.
Die vorgefüllte Spritze oder der Pen kann die Formulierung entweder in gefriergetrockneter Form (die dann vor der Verabreichung z. B. mit Wasser für Injektionszwecke aufgelöst werden muss) oder in wässriger Form enthalten. Die Spritze oder der Pen ist häufig ein Einwegartikel zum einmaligen Gebrauch und kann ein Volumen zwischen 0,1 und 20 ml haben. Die Spritze oder der Pen kann jedoch auch eine Mehrwegspritze oder ein Mehrdosen-Pen sein.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein bindet, in einem Verfahren zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung, eine Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose ist, und/oder wobei die Herzerkrankung vorzugsweise eine Herzinsuffizienz und/oder kardiale Fibrose ist. Vorzugsweise hemmt der Wirkstoff, wenn er an ADAMTS12 gebunden ist, die ADAMTS12-Aktivität.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein bindet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose ist, und wobei die Herzerkrankung vorzugsweise eine Herzinsuffizienz und/oder kardiale Fibrose ist. Vorzugsweise hemmt der Wirkstoff, wenn er an ADAMTS12 gebunden ist, die ADAMTS12-Aktivität.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein bindet und/oder dieses hemmt, in einer therapeutisch wirksamen Dosis oder Menge an ein menschliches oder tierisches Subjekt umfasst.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „wirksame Dosis“ oder „wirksame Menge“ eine Dosis oder eine Menge des Wirkstoffs, die bezüglich der Dosierungen und Verabreichungs-Zeiträume notwendig ist, um bei einem Patienten das erwünschte therapeutische Ergebnis zu erzielen. Wirksame Mengen können in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Krankheitszustand, dem Alter, dem Geschlecht und/oder dem Gewicht des Patienten, der pharmazeutischen Formulierung, der Unterart der zu behandelnden Krankheit und dergleichen variieren, können aber dennoch von einem Fachmann routinemäßig bestimmt werden.
Gemäß einem siebten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffs gemäß dem Verfahren zur Identifizierung des besagten Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, wie oben beschrieben, ferner umfassend die Aufreinigung des besagten Wirkstoffs.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend

(i) das Verfahren zur Identifizierung des besagten Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, wie oben beschrieben, und ferner
(ii) das Mischen des identifizierten Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Gemäß einem achten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine Kombination aus

(i) dem Wirkstoff, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, wie oben beschrieben, oder dem Antikörper oder antigen-bindenden Fragment oder antigenbindenden Derivat davon oder dem antikörperähnlichen Protein wie oben beschrieben, oder der pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend den Wirkstoff wie oben beschrieben, oder den Antikörper, das antigen-bindende Fragment oder antigen-bindende Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, wie oben beschrieben, und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, und
(ii) einer oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Verbindungen.

Gemäß einem neunten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein therapeutisches Kit, umfassend:

(i) die pharmazeutische Zusammensetzung wie oben beschrieben,
(ii) eine Vorrichtung zur Verabreichung der besagten Zusammensetzung, und
(iii) optional eine Gebrauchsanweisung.

Sequenzen
Tabelle 1: Humanes ADAMTS12, Aminosäuresequenz (UniProt-ID: P58397-1)

SEQ ID No. Sequenz

SEQ ID No. 1
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die im Folgenden gezeigten und diskutierten Beispiele und Zeichnungen genauer erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Beispiele und Zeichnungen nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.
Die Erfindung ist nicht auf die offengelegten Ausführungsformen beschränkt. Andere Variationen der offengelegten Ausführungsformen können von Fachleuten bei der Ausführung der beanspruchten Erfindung aus einem Studium der Zeichnungen, der Offenbarung und der beigefügten Ansprüche verstanden und ausgeführt werden. In den Ansprüchen schließt das Wort „umfassend“ andere Elemente oder Schritte nicht aus, und der unbestimmte Artikel „ein“ oder „eine“ schließt eine Mehrzahl nicht aus. Die bloße Tatsache, dass bestimmte Maßnahmen in voneinander verschiedenen abhängigen Ansprüchen rezitiert werden, bedeutet nicht, dass eine Kombination dieser Maßnahmen nicht vorteilhaft eingesetzt werden kann. Etwaige Bezugszeichen in den Ansprüchen sind nicht als Einschränkung des Anwendungsbereichs zu verstehen.
Alle hier offengelegten Aminosäuresequenzen sind vom N-Terminus zum C-Terminus dargestellt; alle hier offengelegten Nukleinsäuresequenzen sind 5'->3' dargestellt.
Beispiel 1: Material und Methoden
Mäuse:
Gli1CreER^t2 (JAX Stock #007913) und Rosa26tdTomato (JAX Stock # 007909) wurden von Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA) erworben. Die Nachkommen wurden mittels PCR nach dem Protokoll der Jackson Laboratories genotypisiert. ADAMTS12-KO Mäuse wurden von C. Lopez-Otin entwickelt (El Hour et al., 2010). Die Genotypisierung aller Mäuse wurde mittels PCR durchgeführt. Die Mäuse wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen an der RWTH Aachen gehalten.
Behandlung der Mäuse:
Zur Unilateralen Ureter Obstruktion (UUO) wurde nach einer Flankeninzision der linke Ureter auf Höhe des unteren Pols mit zwei 7.0 Bändern (Ethicon) abgebunden. Zur Ischämie-Reperfusions-Operation (IRI) wurde nach einer Flankeninzision die Arteria renalis mit einer Aneurysmenklemme für 26 Minuten abgeklemmt. Für eine Schein-Operation (Sham) erfolgte eine isolierte Flankeninzision. Die Mäuse wurden an Tag 10 nach Unilateraler Ureter Operation bzw. Tag 28 nach Ischämie-Reperfusions-Operation getötet. Die Tierversuchsprotokolle wurden vom Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Deutschland) genehmigt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit deren Richtlinien durchgeführt. Für die induzierbare Schicksalsverfolgung erhielten Gli1CreER;tdTomato-Mäuse (8 Wochen alt) dreimal Tamoxifen per Gavage (10 mg p.o.). Die Gabe von Tamoxifen führt zur Translokation der Cre-Rekombinase in den Zellkern in Gli1-exprimierenden Zellen, welche die loxP DNA-Sequenzen schneidet. Durch Rekombination wird so ein Stop-Codon entfernt und das dahinterliegende Fluorophor tdTomato in Gli1-exprimierenden Zellen exprimiert. Somit kommt es zu einer genetischen Markierung von Gli1-positiven Zellen nach Gabe von Tamoxifen. 21 Tage nach Tamoxifen-Gabe erfolgte eine UUO oder Schein-Operation und 10 Tage nach der Operation wurden die Mäuse getötet. Getötete Mäuse wurden über das linke Herz mit 20 ml 0,9%-iger NaCl perfundiert, um Blutreste aus dem Gefäßsystem zu entfernen. Die Myokardinfarkt- und Myokardinfarkt-Schein-Operation erfolgten wie bereits zuvor beschrieben (Curaj et al., 2015). Zusammenfassend wurden Mäuse mit Isofluran (2-2,5 %) betäubt, intubiert und mit einem Maus-Beatmungsgerät (Harvard Apparatus, March, Deutschland) mit Sauerstoff beatmet. Zur Analgesie erfolgte eine Metamizol-Injektion subkutan (200 µg/g KG), zusätzlich zur lokalen Analgesie durch subkutane und interkostale Injektion von Bupivacain (2,5 µg/g KG). Nach einer linksseitigen Thorakotomie erfolgte entweder eine Myokardinfarkt-Scheinoperation (keine Intervention) oder eine Myokardinfarkt-Operation durch Ligatur des Ramus interventricularis anterior (RIVA) mit einer Seidennaht (0-7). Die Rippen, die Muskelschicht und der Hautschnitt wurden im Anschluss mit Prolene (0-6) genäht. Postoperativ erfolgte eine Analgesie über drei Tage mittels Metamizol im Trinkwasser (1,25 mg/ml in 1 % Saccharose).
Einzelzellisolierung und Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FA CS):
Die Nieren wurden chirurgisch entfernt, in kleine Scheiben geschnitten und in ein 15-ml Röhrchen (Falcon) auf eiskalte phosphat-gepufferte Salzlösung mit 1% fetalem Kälberserum (PBS mit 1% FBS) gelegt. Das Nierengewebe wurde dann in ein C-Röhrchen (Miltenyi Biotec) überführt und auf einem gentle-MACS (Miltenyi Biotec) mit dem Programm Spleen 4 verarbeitet. Das Gewebe wurde für 30 min bei 37°C unter Schütteln bei 300 RPM in einer Verdauungslösung mit 25 µg/ml Liberase TL (Roche) und 50 µg/ml DNase (Sigma) in RPMI (Gibco) verdaut. Nach der Inkubation wurden die Proben erneut auf einem gentle-MACS (Miltenyi Biotec) mit dem gleichen Programm bearbeitet. Die resultierende Suspension wurde durch ein 70 µm-Zellsieb (Falcon) gegeben, mit 45 ml kaltem PBS gewaschen und 5 Minuten bei 500 g bei 4°C zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einem Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung gezählt. Insgesamt lag die Lebensfähigkeit bei dieser Methode bei über 80%. Die isolierten Zellen wurden in PBS mit 1%FBS auf Eis in einer Endkonzentration von 1×10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Lebende, einzelne Zellen wurden durch FACS-Sortierung mit einem FACS Aria II Gerät (Becton Dickinson, Basel, Schweiz) und Gating auf Gli1-tdTomato positive, DAPI-negative Zellen isoliert. Im Durchschnitt dauerte es 5-6 Stunden von der Gewinnung der Biopsien bis zur Herstellung der Einzelzellsuspensionen.
Analyse der Affymetrix Microarray Daten:
Die Microarray-Genexpression wurde mittels dem R-Paket „affy“ für das Mausgenom „Mouse4302.db“ quantifiziert und mittels Robust-Multichip Average (RMA-) normalisiert. Das R-Paket Limma (v.3.44.1) wurde verwendet, um mit der Funktion RunLimma die differentielle Genexpression zwischen UUO und Schein-Operation (Sham) zu testen. Wenn Microarray-Proben mehrfach auf dasselbe Gen abgebildet wurden, wurden Duplikat-Gene entfernt. Differentiell exprimierte Gene wurden anhand ihres T-Werts aufgereiht. Für die Signalweg-Analyse wurde das R-Paket „fgsea“ mit den Hallmark-Signalwegen basierend auf allen differentiell exprimierten Genen verwendet.
RNA-In-situ-Hybridisierung:
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) wurde mit formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben und dem RNAScope Multiplex Detection KIT V2 (RNAScope, #323100) nach dem Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Das Antigen-Retrieval wurde für 30 min durchgeführt. 3-5 Tropfen der Pretreatment-1-Lösung wurden nach der Durchführung des Antigen-Retrievals für 10 Minuten bei RT inkubiert. Die Waschschritte wurden dreimal 5 Minuten durchgeführt. Die folgenden Sonden wurden für den RNAscope-Assay verwendet: Mm-Pdgfrb #411381-C3, Mm-Adamts12 #400531, Hs-PDGFRß #548991-C1, Hs-COL1A1 #401891-C2, HsADAMTS12 #509701-C3.
Konfokale Bildgebung:
Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop Nikon A1R unter Verwendung von 40X und 60X Objektiven (Nikon) aufgenommen. Die Rohdaten wurden mit Nikon Software oder ImageJ verarbeitet.
Bildquantifizierung - ISH-Bildanalyse:
Es wurde eine systematische Zufallsauswahl des Nieren-Cortex getroffen, um mindestens 7 repräsentative tubulo-interstitielle Bereiche pro Bild auszuwählen. Mit ImageJ wurden die Bilder in RGB-Kanäle aufgeteilt, der Hintergrund subtrahiert (Rolling-Ball-Radius: 10,0 Pixel) und fluoreszierende Punkte (Transkripte) gezählt. Zur Zellklassifizierung wurden von jeder Probe 3 repräsentative Z-Stacks (ein Z-Stack bezeichnet die Aufnahme von mehreren Bildern mittels Konfokal-Mikroskop, die in einem bestimmten Abstand zwischen der ersten und letzten Schärfeebene derselben Region aufgenommen werden) genommen. Die Z-Stacks wurden als sogenannte Z-Projekte überlagert und mit ImageJ in RGB-Kanäle aufgeteilt. Die Zellen wurden mit einem trainierten Algorithmus segmentiert und klassifiziert, der den Objektklassifizierungs-Workflow von ilastik (Berg et al., 2019) verwendet.
Quantitative RT-PCR:

Für die RNA-Extraktion aus kultivierten Zellen wurden die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit RNA-Easy Lysis Buffer lysiert. Für die RNA-Extraktion aus Nierengewebe wurde das Gewebe in ein Eppendorf-Tube mit 400µl RNA-Easy Lysis Buffer transferiert und mittels Mixer-Mill (2x 2 min, 20 Hz) aufgeschlossen. Anschließend erfolgte die RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem RNeasy Mini Kit (qiagen). 200 ng RNA wurden mit dem High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) revers transkribiert. Die qRT-PCR wurde mit dem iTaq Universal SYBR Green Supermix (Biorad) und dem Bio-Rad CFX96 Real Time System mit dem C1000 Touch Thermocycler durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren: 95 °C für 3 Minuten, dann 40 Zyklen von 95°C für 15 Sekunden und 60°C für 1 Minute, gefolgt von einem Zyklus von 95°C für 10 Sekunden. GAPDH wurde als Housekeeping-Gen verwendet. Die Daten wurden mit der 2-CT-Methode ausgewertet. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2: Liste der RT-PCR-Primer-Sequenzen (human)

Gen	Forwad and Reverse Primer
murine Gapdh	Fw 5'-AAGTGGTGATGGGCTTCCC-3' Rv 5'-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3'
murine Adamts12	Fw 5'-GTGTGGAACAGGTATCCG-3' Rv 5'-CAGAGCTCGACTGTTGGG-3'
murine Collal	Fw 5'-TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3' Rv 5'-GTTCGGGCTGATGTA-3'
murine Fn	Fw 5'-ATCTGGACCCCTCCT-3' Rv 5'-GCCCAGTGATTTCAG-3'
Human GAPDH	Fw 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3' Rv 5'-TGGACTCCACGACGTACTCA-3'
Human ADAMTS12	Fw 5'-GTGTGGAACAGGTATCCG-3' Rv 5'-CAGAGCTCGACTGTTGGG-3'
Human COL1A1	Fw 5'-CCCAGCCACAAAGAGTCTACA-3' Rv 5'-ATTGGTGGGATGTCTTCGTCT-3'

Immunofluoreszenzfärbungen inklusive Quantifizierung:
Unter Verwendung von 2-µm paraffin-eingebetteten, formalin-fixierten Nierenschnitten wurden die Objektträger in 10%-igem bovinem Serum geblockt, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation des primären Antikörpers, 3-maligem Waschen für 5 Minuten in PBS und anschließender Inkubation der sekundären Antikörper für 30 Minuten. Nach DAPI (4',6'- 'Diamidino-2-Phenylindol)-Färbung (Roche, 1:10.000) wurden die Objektträger mit ImmuMount (9990402, Epredia) aufgezogen. Pro Probe wurden 4 repräsentative Bilder des Nierencortex mit dem 40X-Objektiv eines Nikon A1R Konfokalmikroskops aufgenommen. Zur Quantifizierung wurden die Bilder in RGB-Kanäle aufgeteilt und mittels ImageJ fluoreszierende Areale quantifiziert. Folgende Antikörper wurden verwendet: anti-Maus PDGFRβ (ab32570, 1:100, Abcam), AF488 Esel anti-Kaninchen (711-545-152, 1:200, Jackson ImmunoResearch), AF647 Esel anti-Ratte (712-605-153, 1:200, Jackson ImmunoResearch).
Immunohistochemie inklusive Quantifizierung:
Nach Entparaffinisierung von 2µm Paraffinschnitten erfolgte zunächst ein Antigen-Retrieval mittels dreimaligem Erhitzen der Schnitte für 5 Minuuten in einer Antigen-Unmasking Solution (H-33000, Vector Laboratories). Im Anschluss erfolgte eine 3-minütige Inkubation mit 3%-igem Wasserstoffperoxid und anschließend eine Inkubation mit Avidin/Biotin (VEC-SP-2001, Vector Laboratories) über 10 Minuten, gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit dem primären Antikörper, dreimaligem Waschen in PBS und anschließender Inkubation mit dem sekundären Antikörper. Die Detektion erfolgte mit dem DAB-Substrat-Kit (SK-4100, Vector Laboratories). Zuletzt wurden die Schnitte mit Hämatoxylin gegengefärbt, dehydriert, und abgedeckt. Von jedem Schnitt wurden 7 repräsentative Bilder der Nierenrinde mit dem 40x-Objektiv eines Hellfeldmikroskops (BZ-9000, Keyence, IHC) aufgenommen. Folgende Antikörper wurden verwendet: Anti-Maus-Coll (1310-01, 1:100, Southern Biotech), biotinylierter Pferd Anti-Ziegen Antikörper (BA-9500, 1:300, Vector Laboratories).
Maus Echokardiographie:
Die linksventrikuläre Herzfunktion wurde mit einem Kleintier-Ultraschallgerät (Vevo 3100 und MX550D-Schallkopf, FUJIFILM Visualsonics, Toronto, Ontario, Kanada) zwei Tage vor sowie vier und acht Wochen nach Myokardinfarkt gemessen. Messungen der kurzen und langen Herzachsen, sowie des linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischen Volumens und der Herzfrequenz wurden im B-Mode (2D-Echtzeit) und im M-Mode mit einem 40-MHz-Schallkopf (MX550D) durchgeführt. Während des Verfahrens wurden die Mäuse mit 1-2% Isofluran anästhesiert. Alle Messungen wurden mit der VevoLab-Software ausgewertet.
Picrosirius-Rot Färbung und Quantifizierung:
Picro-Sirius-Rot-Färbungen wurden gemäß des mit dem Morphisto-Sirius-Rot-Färbe-Kit (13425, Morphisto) durchgeführt. Ganze Objektträger wurden mit dem Aperio Slide Scanner (Leica Biosystems) gescannt und fibrotische Areale, welche durch das Picrosirius-Kit rot gefärbt werden, mittels des Programms Aperio eSlide Manager quantifiziert.
Verarbeitung von humanem Gewebe:
Humanes Nierengewebe wurde aus normalen Regionen wie zuvor beschrieben (Kuppe et al., 2021) entnommen. Das Gewebe wurde auf Trockeneis eingefroren oder in vorgekühlter University of Wisconsin-Lösung (#BTLBUW, Bridge to Life Ltd., Columbia, U.S.) eingelegt und auf Eis ins Labor transportiert. Um einzelne Nierenzellen zu isolieren, wurde eine Kombination aus enzymatischem und mechanischem Aufschluss verwendet, wie oben für die Isolierung von Maus-Einzelzellen beschrieben.
FACS von humanem Gewebe:
Die isolierten Zellen wurden wie zuvor beschrieben (Kuppe et al., 2021) gefärbt und isoliert. Zusammenfassend wurden die isolierten Zellen in 1% PBS-FBS auf Eis in einer Endkonzentration von 1×10⁷ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden mit Fc-Block (TruStainFx human, TruStainFx Maus Klon 91, biolegend) vorinkubiert und anschließend mit dem anti-CD10 human Antikörper (Klon HI10a, biolegend) für 30 Minuten auf Eis lichtgeschützt in 2% FBS/PBS verdünnt inkubiert. Für die Färbung mit humanem anti-PDGFRb wurde Ziege anti-Maus Dyelight 405 (poly24091, biolegend) als Sekundärantikörper verwendet. Alle Kompensationen wurden zum Zeitpunkt der Aufnahme unter Verwendung von Einzelfarbfärbungen und Negativfärbungen und Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen durchgeführt. Einzelne Zellen wurden durch FACS-Sortierung und Gating auf DAPI-negative Zellen mit weiterer Anreicherung von Fibroblasten durch PDGFRß-Färbung angereichert. Die Zellen wurden im Semi-Purity-Modus mit dem Ziel einer Effizienz von >80% mit dem SONY SH800 Sorter (Sony Biotechnology; 100 um Düse Sortierchip Sony) sortiert.
10X Genomics 3' sc-RNA -Seq (V2 und V3) Einzelzell-Assays:
Die Einzelzell-Assays wurden wie zuvor beschrieben (Kuppe et al., 2021) durchgeführt. Zusammenfassend wurde eine Einzelzelllösung von primären humanen Nierenzellen auf einen Chromium Single Cell Chip-Kit geladen und die Bibliotheken wurden mit dem Chromium Single Cell 3'-Bibliotheks-Kit V2 und dem i7 Multiplex-Kit (PN-120236, PN-120237, PN-120262, 10x Genomics) entsprechend dem Herstellerprotokoll vearbeitet. Die Qualität der Bibliothek wurde mit dem D1000 ScreenTape auf dem 2200 TapeStation System (Agilent Technologies) bestimmt. Die Sequenzierung wurde auf einer Illumina Novaseq-Plattform mit S1- und S2-Fließzellen (Ilumina) durchgeführt.
Mikroarray aus humanem Nierengewebe:
Die Erstellung von paraffin-eingebetten Nieren-Mikroarrays erfolgte wie zuvor beschrieben (Kuppe et al., 2021). Zusammenfassend wurden Paraffin-eingebettete, formalin-fixierte Nierenproben von der Biomaterialbank Aachen auf Basis einer zuvor durchgeführten PAS-Färbung ausgewählt. Pro Probe wurden zufällig Bereiche ausgewählt und aus jeder Nierenprobe wurde mit dem TMArrayerTM (Pathology Devices, Beecher Instruments, Westminster, USA) ein 2-mm-Kern entnommen. Jeder Kern wurde in einem Empfängerblock in einem 2 mm-Raster angeordnet, das etwa 2,5 cm² abdeckte, und 5 Mikrometer dicke Schnitte wurden geschnitten und mit histologischen Standardtechniken bearbeitet.
Generierung einer humanen PDGFRb+ Zelllinie:
Für in-vitro Versuche wurde eine immortalisierte, renale humane PDGFRb-positive Zellinie verwendet. Die Generierung der Zelllinie wurde in vorherigen Arbeiten beschrieben (Kuppe et al., 2021).
TG Fb- Behandlungsexperimente:
TGFb (100-21-10UG, Peprotech) in einer Konzentration von 10 ng/ml in PBS wurde nach einer 24-stündigen Inkubation in Hunger-Medium (0,5% foetalaes Kälberserum-haltigem Medium) für 24 Stunden zu 75% konfluierenden PDGFRb-Zellen gegeben.
sgRNA:CPJSPR-Cas9- Vektorkonstruktion, Virusproduktion und Transduktion:
Die ADAMTS12-spezifische guide RNA
(vorwärts 5'-CACCGAACATCATAGATCACTCCGG-3;
rückwärts 5'-AAACCCGGAGTGATCTATGATGTTC-3)
wurden mittels BsmBI-Restriktionsverdau in das pL-CRISPR.EFS.GFP Plasmid (Addgene #57818) kloniert. Lentivirale Partikel wurden durch transiente Co-Transfektion von HEK293T-Zellen mit dem lentiviralen Transferplasmid, dem Verpackungsplasmid psPAX2 (Addgene #12260) und dem VSVG-Verpackungsplasmid pMD2.G (Addgene #12259) unter Verwendung von TransIT-LT (Mirus) hergestellt. Virale Überstände wurden 48-72 Stunden nach der Transfektion gesammelt, durch Zentrifugation geklärt, mit 10% FCS und Polybrene (Sigma-Aldrich, Endkonzentration von 8µg/ml) ergänzt und durch ein 0,45µm Sieb filtriert (Millipore; SLHP033RS). Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der PDGFRß-Zellen mit viralen Überständen für 48 h. eGFP-exprimierende Zellen wurden einzeln in 96-Well-Platten sortiert. Um Mutationsereignisse auf beiden Allelen innerhalb der gezüchteten Klone zu bestimmen, wurde das PCR-Produkt der ADAMTS12-Klone in den pCR™ 4Blunt-TOPO Vektor (Thermo Scientific K287520) subkloniert. Es wurden mindestens 6 Kolonien pro CRISPR-Klon gezüchtet und sequenziert (Klon C2: 30 Kolonien wurden sequenziert). Gleichzeitig erfolgte eine qPCR zur Bestätigung des Verlusts einer ADAMTS12 Genexpression.
Retrovirale Überexpression von ADAMTS12:
Die Konstruktion des ADAMTS12-Vektors und Generierung von stabilen ADAMTS12-überexprimierenden Zelllinien wurde durchgeführt wie folgt. Die humane cDNA von ADAMTS12 wurde durch Kombination zweier gBlock-Genfragmente (IDT) synthetisisert ([1] Xho-N-Terminus-EcoRI und [2] EcoRI-C-Terminus-1xHA-Tag-EcoRI) und im Zielvektor zu einer durchgehenden CDS mit C-terminalem 1xHA-Tag fusioniert. Für die Synthese des C-terminalen Fragmentes wurde wegen des hohen Complexity Scores eine Codonoptimierung vorgenommen. Beide gBlock-Genfragmente wurden zunächst Blunt End und unter Verwendung des StrataClone Blunt PCR Cloning Kits (#240207) in das pSC-B-amp/kan Plasmid ligiert und so die Vektoren (a) pSC_Adamts12_AA1-160 und (b) pSC_Adamts12_AA611-1595-HA generiert. Das N-terminale Fragment wurde via Restriktionsklonierung und Verwendung der Restriktionsenzyme XhoI und EcoRI aus dem pSC-Vektor in das pMIG-Backbone (Addgene Plasmid #9044) transferiert und das Plasmid pMIG-Adamtsl2_AAl-160 generiert. Im Anschluss erfolgte der Transfer des N-Terminus aus dem pSC-Vektor in das Zielplasmid via EcoRI-Restriktionsklonierung („in-frame“-Konierung). Die Integration der Mutation H465Q-E466A erfolgte unter Verwendung des Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (NEB; #E0554) und der Primer Mut-H465Q-466A-F: 5'-CACAATTGCCcaagcgCTAGGACACAG-3' und Mut-H465-E466A-R: 5'-AAAGCCAGAGGGAGTCCC-3`. Die integrierte CDS (sowohl WT- als auch MUT-ADAMTS12) wurde mittels Sequenzierung kontrolliert. Retrovirale Partikel wurden durch transiente Transfektion in Kombination mit dem Verpackungsplasmid pUMVC (Addgene Plasmid # 8449) und dem Pseudotypisierungsplasmid pMD2.G (Addgene Plasmid # 12259; http://n2t.net/addgene:12259 ; RRID:Addgene_12259) unter Verwendung von TransIT-LT (Mirus) hergestellt. Virale Überstände wurden 48-72 Stunden nach der Transfektion gesammelt, durch Zentrifugation geklärt, mit 10% FCS und Polybrene (Sigma-Aldrich, Endkonzentration von 8µg/ml) ergänzt und durch ein 0,45µm Sieb gefiltert (Millipore; SLHP033RS). Die Zelltransduktion erfolgte durch Inkubation der PDGFβ-Zellen mit viralen Überständen für 48 h. eGFP-exprimierende Zellen wurden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sortierung aufgereinigt.
Western Blot:
Zur Proteinisolation wurden Zellen mit RIPA-Puffer, welcher einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) enthielt, lysiert. Die Lysat-Proteinkonzentrationen wurden mittels Pierce BCA Protein Assay Kit (#23225, ThermoScientific) gemessen. Im Anschluss wurden gleiche konzentrations-adjustierte Proteinlysate für 5 min bei 95°C in SDS-Probenladepuffer (BioRad) denaturiert und auf 10% SDS-Page-Gele geladen. Nach Gelelektrophorese wurden die Proben auf eine PVDF-Membran transferiert und die Blots mit primären Antikörpern in 5% Blotto (Thermo Fisher) sondiert (1:2000 anti-HA-Epitop Tag (BioLegend #901533) für 2 Stunden, gefolgt von einer Inkubation mit sekundärem Antikörper für 1 Stunde nach dem Waschen (Meerrettich-Peroxidase-HRP-konjugierter Anti-Maus-Antikörper, Vector Laboratories) und entwickelt mit Pierce™ ECL Western Blotting Substrate A und B. Der monoklonale Anti-Tubulin-Antikörper und der anti-GFP Ziege Antikörper (Rockland #600-101-215, 1:2000), gefolgt von einem HRP-konjugierten sekundären Anti-Maus bzw. Anti-Ziege-Antikörper (Vector Laboratories), wurden als Ladekontrolle verwendet.
Migrations-Analysen:
Zellen wurden in eine mit Matrigel beschichte 96-Well-Platte (Boden flach, transparent, 89626, ibidi) ausgesäht. Nach 24 Stunden Inkubation mit Hungermedium (0,5% Foetales Kälberserum) wurden 50% konfluente Zellen mit 10 ng/ml TGFβ in CO2-unabhängigem Medium (18045054, Gibco) stimuliert. Nach 24 Stunden Stimulation wurde die Autofluoreszenz der Zellen alle 10 Minuten für 18-24 Stunden in einer 37°C-Kammer mit einem Nikon A1R Konfokalmikroskop aufgenommen. Für jeden Zeitpunkt erfolgte eine Zellsegmentierung mit dem Pixelklassifizierungs-Workflow von ilastik, welche anschließend als sog. „Prediction-Maps“ exportiert wurden. Die Prediction-Maps der verschiedenen Zeitpunkte wurden für jede Region im Anschluss aneinander ausgerichtet und integriert und die Zellkoordinaten sowie die mittlere Geschwindigkeit mit den ImageJ-Plugins StackReg und TrackMate berechnet. Die Geschwindigkeiten wurden nach der Länge der einzelnen Spuren gewichtet. Die Bewegung der Zelle wurden mit dem Paket ggplot2 in R berechnet und graphisch dargestellt. Die Darstellungen zeigen die repräsentativen Ergebnisse von insgesamt drei unabhängigen Experimenten.
Einzel-Zell RNA Analyse:
Die Einzel-Zell RNA Datenerhebung und Analyse inklusive Transkript-Alignment, Normalisierung, Skalierung, Dimensions-Reduktion und Zell-Annotation erfolgte wie beschrieben (Kuppe et al., 2021). Die Analyse der Genexpression von ADAMTS12 erfolgte mittels des Pakets Seurat in R.
Quantifizierung und statistische Analyse, die außerhalb der Einzelzell-Sequenzierungs-und Microarray-Daten verwendet wurden:

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, wenn in den Legenden nichts anderes angegeben wurde. Der Vergleich von zwei Gruppen wurde mit einem ungepaarten t-Test durchgeführt. Für den Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine Zweiweg-ANOVA mit Tukey`s multiplem Vergleichstest angewendet. Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) durchgeführt. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Beispiel 2: Überexpression des ADAMTS12-Gens in aktivierten Fibroblasten nach einer Nierenschädigung
Zur Identifikation neuer Signalwege, welche zu einer Aktivierung von Gli1-Fibroblasten führen könnten, wurden in Gli1-CreER^t2; R26tdTomato Mäusen den Transkriptionsfaktor Gli1 exprimierende Fibroblasten (Gli1-Fibroblasten) genetisch mit dem Fluorophor tdTomato durch die wiederholte Gabe von Tamoxifen markiert. 25 Tage nach Tamoxifen-Induktion erfolgte entweder eine unilaterale Ureter-Obstruktion (UUO) zur Induktion einer Nierenfibrose oder eine Sham-Operation als Kontrolle. 10 Tage nach der Operation wurden die Mäuse getötet, Gli1-Fibroblasten aus UUO- oder Kontroll-Nieren mittels FACS (Fluorescent activated cell sorting) isoliert, und das RNA-Transkriptom mittels eines Affymetrix-Microarray-Tests gemessen (1 A). Mittels Hauptkomponenten-Analyse (PCA) wurde validiert, dass sich aktivierte Gli1-Fibroblasten nach UUO klar von nichtaktivierten Gli1-Fibroblasten aus Kontroll-Nieren (Sham) unterscheiden. Daraufhin wurde eine „Gene Set Enrichment Analyse“ (GSEA) beruhend auf den „Hallmark Pathways“ durchgeführt (1 B). In der GSEA zeigten sich signifikant erhöhte „Normalised Enrichment-Scores“ (NES, Anreicherungswerte gegenüber Normalisierung) von proinflammatorischen Signalwegen (Inflammatorische Immunantwort, IL6-STAT3, TNFA via NFKB), Myofibroblasten-assoziierte Signalwege (Epithelial-Mesenchymale Transition, TGF-Beta Signalweg) sowie Proliferation (G2M-Checkpoint, Mitotische Spindel, E2F-Targets). Daraus ergab sich, dass Gli1-Fibroblasten nach UUO expandieren und zu Myofibroblasten differenzieren. In einer Genexpressionsanalyse zeigten sich passend hierzu proinflammatorische Gene sowie extrazelluläre Matrix-Gene am stärksten hochreguliert ( 1 C). Eines der am stärksten hochregulierten Gene (Top 6 geordnet nach T-Wert) in aktivierten Gli1-Fibroblasten war das ADAMTS12-Gen (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12).
ADAMTS12 gehört zur Familie der ADAMTS-Metalloproteasen; eine Funktion von ADAMTS12 in der Pathogenese der Fibrose war bisher nicht bekannt.
Zur Validierung dieser neuen Erkenntnisse wurde eine RNA-In-Situ-Hybridisierung für ADAMTS12 und den Fibroblasten-Marker PDGFRb nach Induktion einer Nierenfibrose mittels Ischämie-Reperfusions Schaden (IRI) durchgeführt (1 D). Eine ISH-Färbung zeigte, dass das Gen ADAMTS12 in Homöostase nur minimal exprimiert wird, und erst nach Nierenschädigung in PDGFRb-positiven Fibroblasten drastisch hochreguliert wird (1 EG).
Aus diesen Befunden ergab sich für die Erfinder überraschend, dass ADAMTS12 eines der am stärksten hochregulierten Gene in Gli1-Fibroblasten nach unilateraler Ureter-Obstruktion (UUO) darstellt.
Beispiel 3: Reduktion einer renalen und kardialen Fibrose in vivo durch „Knockout“ von ADAMTS12
Basierend auf den gewonnenen Microarray-Daten, wurde eine uni/-terale Ureter-Obstruktion (UUO) in Wildtyp- und ADAMTS12-Knockout (KO-)Mäusen (Adamts12^-/- durchgeführt. Mittels quantitativer Real-Time-PCR (RT-qPCR) wurden die Genexpressionen für ADAMTS12 und die extrazellulären Matrix (EZM)-Proteine Kollagen 1 (Collal) und Fibronektin (Fnl) bestimmt (2A-C). Der genetische KO von ADAMTS12 führte zu einem Verlust einer ADAMTS12-Expression auf RNA-Ebene (2 A). Darüber hinaus zeigte sich in ADAMTS12-Knockout (KO-)Mäusen eine signifikant reduzierte Genexpression von Kollagen 1 und Fibronektin nach UUO. Zur Validierung der RT-qPCR-Ergebnisse wurden Immunfluoreszenz-Färbungen für den Fibroblasten-Marker PDGFRb, sowie immunhistochemische Färbungen für das EZM-Protein Kollagen 1 durchgeführt (2 D, 2 F). Die Quantifizierung von PDGFRb zeigte eine stark reduzierte Expansion von PDGFRb-Fibroblasten in ADAMTS12-KO-Mäusen nach UUO (2 E). Weiterhin zeigte sich eine signifikant reduzierte Ablagerung von Kollagen 1 in ADAMTS]2-KO-Mäusen (2 G).
Um zu analysieren, ob diese Ergebnisse auf die Pathogenese einer chronischen Herzinsuffizienz und einer kardialen Fibrose übertragbar sind, wurden in Wildtyp- und ADAMTS12-KO Mäusen ein Myokardinfarkt (MI) mittels Ligatur der Herzkranzarterie Ramus Interventricularis ausgelöst. Auch hier bestätigte sich, dass der genetische Verlust von ADAMTS12 zu einer verbesserten linksventrikulären Ejektionsfraktion (LV-EF) und einer reduzierten Fibrose nach Myokardinfarkt führt (2 H, I).
Zusammenfassend wurde also überraschend festgestellt, dass der „Knockout“ von ADAMTS12 sowohl eine Nieren- als auch eine Herzfibrose nach Organschädigung reduziert, und im Falle des Herzinfarktes sogar zu einem reduzierten Funktionsverlust führt. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schliessen, dass ADAMTS12 eine Schlüsselrolle in der Aktivierung von Gli1-Fibroblasten spielt.
Beispiel 4: Reduktion der Myofibroblasten-Differenzierung und Migration von humanen Fibroblasten in vitro mittels CRISPR-CAS9-vermitteltem „Knockout“ von ADAMTS12
Anschließend, aufbauend auf den Ergebnissen in vivo (Beispiel 3, 2), wurde die Funktion der Metalloprotease ADAMTS12 in vitro daraufhin untersucht, ob ADAMTS12 essentiell für die Expansion und Myofibroblasten-Differenzierung von Fibroblasten sein könnte. Mittels CRISPR-Cas9 wurden Knockouts (KO) von ADAMTS12 in immortalisierten humanen renalen PDGFRb-positiven Fibroblasten induziert (3 A). Mittels Stimulation mit Transforming Growth Factor beta (TGFb) wurde zunächst die Kapazität zur Myofibroblasten-Differenzierung in ADAMTS12-KO- und WT- Fibroblasten untersucht. Hier konnte bestätigt werden, dass der KO von ADAMTS12 die Expression von Kollagen 1 (COL1A1) reduziert, was ein Marker für eine Myofibroblasten-Differenzierung ist (3A, 3B). Ein wichtiger Schritt in der Aktivierung von Fibroblasten ist die Expansion und Migration von Fibroblasten aus der perivaskulären Niche in das Interstitium. In einem zweiten Experiment wurden daher die Migration von WT- und ADAMTS12-KO-Fibroblasten mittels eines Konfokal-Mikroskops untersucht. Hiermit konnte nachgewiesen werden, dass der Verlust von ADAMTS12 signifikant die Migration von Fibroblasten nach TGFb-Stimulation reduzierte (3 C).
Um zu analysieren, ob der beobachtete Effekt von ADAMTS12 durch die Metalloproteinase-Domäne von ADAMTS12 vermittelt wird, wurden katalytisch aktives (Wildtyp, WT) oder inaktives (mutiertes, Mut.) ADAMTS12 mittels retroviraler Transduktion eines ADAMTS12-pMIG Expressionsvektors in immortalisierten humanen renalen PDGFRb-positiven Fibroblasten exprimiert, in welchen wie zuvor beschrieben ADAMTS12 mittels CRISPR-Cas9-Vektor „ausgeknockt“ worden war (3 D). Dabei führte die Überexpression von katalytisch aktivem ADAMTS12 (WT) zu einer verstärkten Migration von Fibroblasten nach Aktivierung, während die Überexpression von katalytisch inaktivem ADAMTS12 (Mut.) die Migration nicht beeinflusste (3 E). Diese Ergebnisse bestätigen, dass ADAMTS12 über die ADAMTS12 Metalloproteinase-Domäne eine Fibroblasten-Migration induziert.
Der KO von ADAMTS12 mittels CRISPR-Cas9 reduziert somit die Myofibroblasten-Differenzierung und Migration von humanen Fibroblasten in vitro. Katalytisch aktives ADAMTS12 induziert eine Fibroblasten-Migration humaner Fibroblasten in vitro.
Beispiel 5: Expression von ADAMTS in humanen Nieren durch spezifische Fibroblasten- und Myofibroblasten-Populationen
Im nächsten Schritt wurde die Expression von ADAMTS12 in humanen Nieren untersucht. In einem Datensatz aus 15 humanen Nieren (Kuppe et al., 2021), in welchem (zur Anreicherung von interstitiellen Zellen) CD10-negative Zellen einzelzell-sequenziert wurden, wurde die Expression von ADAMTS12 analysiert. Hierbei zeigte sich, dass ADAMTS12 spezifisch von Fibroblasten und Myofibroblasten, und zu geringem Anteil von Perizyten, exprimiert wird (4 A). Diese Ergebnisse konnten in einem zweiten Datensatz, in welchem PDGFRb-positive Zellen aus acht humanen Nieren einzelzell-sequenziert wurden, bestätigt werden (4 B). Die Einzelzelldaten zeigen, dass eine Subpopulation von Fibroblasten und Myofibroblasten ADAMTS12 exprimieren. Zur Validierung dieser Ergebnisse wurde zusätzlich eine In-Situ-Hybridisierung für ADAMTS12, PDGFRb und Kollagen 1 (COL1A1) in 43 humanen Nieren durchgeführt (4 C). Hierdurch konnte bestätigt werden, dass ADAMTS12 primär von PDGFRb-positiven Fibroblasten produziert wird (4 D), und dass die Expression von ADAMTS12 mit der Expression des Fibroblasten-Markers PDGFRb und des EZM-Proteins Kollagen 1 deutlich korrelierte (4 E, 4 F).
Beispiel 6: Screening auf Wirkstoffe, die an die Metalloporotease ADAMTS12 binden und/oder sie hemmen
Screening-Experimente ermöglichen die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die an das ADAMTS12-Protein binden und/oder dessen Aktivität hemmen.
Es werden DNA-verschlüsselte Substanzbibliotheken generiert und gescreent, wie beschrieben (Kunig et al. 2018). Weiterhin werden Phage Display-Technologien (Takakusagi et al. 2020), Zelloberflächen-Display oder Ribosom-Display-Technologien (Galan et al. 2016) und/oder kombinatorische Peptid-Bibliotheken (Bozovicar und Bratkovic 2019) verwendet. Dazu werden rekombinantes ADAMTS12-Protein oder Fragmente davon, die einen „Tag“ zur Markierung, Identifizierung oder Reinigung tragen können, z.B. einen Histag oder einen FLAG-tag, in bakteriellen Expressionssystemen wie L. coli, oder in Insektenzellen oder Säugetierzellen exprimiert.
Das gereinigte ADAMTS12-Protein wird mit der Substanzbibliothek inkubiert und durch Immunpräzipitation isoliert. Die an das ADAMTS12-Protein gebundenen Verbindungen werden z.B. durch Sanger-Sequenzierung der DNA-Barcodes identifiziert. Die identifizierten Agentien und Verbindungen werden anschliessend auf ihre Wirkung auf die Funktion von ADAMTS12, dessen Proteaseaktivität, die Migration von Fibroblasten, die Expression und Sekretion von Matrixproteinen, wie z.B. Kollagen 1 und Fibronektin, und die Entwicklung einer Nierenfibrose und/oder kardialen Fibrose getestet. Zu diesem Zweck werden experimentelle Maus-in-vivo-Modelle der Nierenfibrose bzw. der kardialen Fibrose eingesetzt.
Für die Identifizierung und Validierung von niedermolekularen therapeutischen Verbindungen, Peptiden und/oder Biologika, die eine Wirkung auf die ADAMTS12-Protease-Aktivität oder ihre Expression ausüben, wird ein in-vitro-Fluorochrom-Reportersystem auf Basis humaner Zellen etabliert, wobei beispielsweise die Expression des eGFP-ADAMTS12-Fusionsproteins oder ein Luciferase-basiertes Reportersystem verwendet wird, um Substanzbibliotheken in Assays mit 384 bis 1.536 Vertiefungen auf die Identifizierung von Verbindungen zu screenen, die die eGFP-Fluoreszenz oder den Luciferase-Spiegel als Readout reduzieren. Die Expression dieser humanen ADAMTS12-Fusionsreporterkonstrukte in den genannten Zellen kann z. B. durch Transfektion und Selektion über Resistenzgenkassetten oder durch virale Transduktion erfolgen. Für diese Assays werden humane Zelllinien wie z.B. 293T-Zellen, aber auch etablierte humane Nieren Fibroblasten-Zelllinien eingesetzt. Parallel zu diesem Screening werden Zytotoxizitätsassays durchgeführt, um Verbindungen auszuschliesen, die einen Effekt auf die Reporterfluoreszenz oder -aktivitat aufgrund von unspezifischer Toxizitat oder Auslösung von Apoptose ausüben.
Zusammenfassend konnte anhand der dargestellten experimentellen Daten und mittels eines Microarrays von Gli1-Fibroblasten ADAMTS12 als potentielles molekulares Target für die Therapie der Fibrose erstmals identifiziert werden. In vivo konnte erstmalig in einem UUO- und einem MI-Mausmodell gezeigt werden, dass der „Knockout“ von ADAMTS12 die Migration von Fibroblasten sowie eine Fibrose stark reduziert. In vitro senkte ein „Knockout“ von ADAMTS12 mittels CRISPR-Cas9 die Migration von humanen renalen PDGFRb-positiven Fibroblasten, während eine Überexpression von katalytisch aktivem, aber nicht von katalytisch inaktivem ADAMTS12 eine Migration verstärkte. Dies bestätigt, dass der beobachtete Effekt von ADAMTS12 durch die Metalloproteinase-Domäne von ADAMTS12 vermittelt wird.
In humanen Nieren ließ sich nachweisen, dass ADAMTS12 spezifisch von Fibroblasten, Myofibroblasten, und in geringem Ausmaß Perizyten, produziert wird. Weiterhin korrelierte die ADAMTS12-Expression mit der Expression des Fibroblasten-Markers PDGFRb und des Fibrose-Markers Kollagen 1.
Die Metalloprotease ADAMTS12 ist bisher kaum untersucht, und es gibt bislang keine Berichte über eine Beteiligung von ADAMTS12 an der Pathogenese der renalen oder kardialen Fibrose. Einige Studien konnten zeigen, dass ADAMTS12 ein negativer Regulator der Angiogenese ist (EI Hour et al., 2010), während andere Arbeitsgruppen berichteten, dass ADAMTS12 die Immunantwort moduliert und ein „Knockout“ von ADAMTS12 zu einer prolongierten proinflammatorischen Immunantwort führt (Moncada-Pazos et al., 2018; Paulissen et al., 2012).
Die Metalloprotease ADAMTS12 ist als molekulares Zielmolekül (Target) zur Therapie der Fibrose besonders attraktiv. ADAMTS12 wird in Homöostase kaum bis nicht exprimiert. Nach Induktion einer Nierenfibrose wird ADAMTS12 spezifisch in Fibroblasten, Perizyten und Myofibroblasten hochreguliert. Die zell-spezifische Expression von ADAMTS12 und seine geringe bis fehlende Expression in Homöostase legen nahe, dass eine Inhibition von ADAMTS12 mit wenig Nebenwirkungen assoziiert sein dürfte. Weiterhin bietet die Inhibition der Metalloproteinase ADAMTS12 aus biochemischer Sicht einen klaren Ansatzpunkt für die Entwicklung von Medikamenten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Claims

Verfahren zur Verringerung der Expression und/oder Sekretion von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) durch eine gegebene Zelle, und/oder zur Hemmung der Migration von Fibroblasten, wobei das Verfahren mindestens einen Schritt umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) Hemmen oder Reduzieren der ADAMTS12-Genexpression in der Zelle, (ii) Hemmen oder Reduzieren der ADAMTS12-Aktivität, (iii) Hemmen oder Reduzieren der ADAMTS12-Proteaseaktivität, und/oder (iv) Fördern des Abbaus des ADAMTS12-Proteins.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung oder Reduzierung der ADAMTS12-Genexpression einen ADAMTS12-Gen-Knock-down, Knock-out, konditionalen Gen-Knockout, Genveränderung, RNA-Interferenz, siRNA und/oder Antisense-RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Hemmung oder Reduzierung der ADAMTS12-Aktivität die Verwendung eines Wirkstoffs umfasst, der an das ADAMTS12-Protein (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12-Protein) bindet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagte Zelle eine Nierenzelle oder eine kardiale Zelle ist, vorzugsweise eine Nierenfibroblastenzelle oder eine kardiale Fibroblastenzelle, eine Nierenmyofibroblastenzelle oder eine kardiale Myofibroblastenzelle, oder eine Nieren-Perizyte oder kardiale Perizyte; am meisten bevorzugt eine Nierenfibroblastenzelle oder eine kardiale Fibroblastenzelle.
Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12-Protein) oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert.
Verfahren nach Anspruch 5, umfassend mindestens die folgenden Schritte: (i) Bereitstellen des ADAMTS12-Proteins oder eines Fragments davon, (ii) Zugabe von mindestens einem Wirkstoff, der auf Bindung an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon untersucht werden soll, und (iii) Identifizierung des mindestens einen Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon gebunden hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 und 6, wobei der Wirkstoff ein ADAMTS12-Inhibitor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei der Wirkstoff Mitglied einer Bibliothek von Verbindungen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer niedermolekularen Verbindung, einem Peptid und einem Biologikum.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Biologikum ein Antikörper, ein antigenbindendes Fragment davon, ein antigenbindendes Derivat davon, ein antikörperähnliches Molekül oder ein Aptamer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei das ADAMTS12-Protein an eine feste Phase gebunden ist oder in Lösung vorliegt.
Verwendung einer Nukleinsäure, die das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon kodiert, oder des ADAMTS12-Proteins oder eines Fragments davon, in einem Verfahren zur Identifizierung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein oder ein Fragment davon bindet, nach einem der Ansprüche 5 bis 11.
Wirkstoff, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11.
Wirkstoff, der die Expression des ADAMTS12-Gens in einer Nierenzelle oder einer kardialen Zelle hemmt oder reduziert, vorzugsweise wobei die Nierenzelle eine Nierenfibroblastenzelle und/oder die kardiale Zelle eine kardiale Fibroblastenzelle ist.
Wirkstoff, der an das ADAMTS12-Protein (A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin motifs 12-Protein) oder ein Fragment davon bindet, und/oder die Aktivität des ADAMTS12-Proteins, oder eines Fragments davon, hemmt oder reduziert, und/oder den Abbau des ADAMTS12-Proteins fördert.
Wirkstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Wirkstoff eine niedermolekulare Verbindung (smol), ein Peptid oder ein Biologikum ist, vorzugsweise wobei das Biologikum ein Antikörper oder ein Fragment davon, ein Derivat davon, ein antikörperähnliches Protein, oder ein Aptamer ist.
Antikörper, oder antigen-bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, das spezifisch an das ADAMTS12-Protein bindet.
Antikörper, oder antigen-bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, nach Anspruch 17, wobei der Antikörper, oder das antigenbindende Fragment oder Derivat davon, oder das antikörperähnliche Protein, die ADAMTS12-Aktivität inhibiert.
Wirkstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder Antikörper, antigen-bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, nach einem der Ansprüche 17 und 18, zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung.
Wirkstoff oder Antikörper, antigen-bindendes Fragment oder antigen-bindendes Derivat davon, oder antikörperähnliches Protein, zur Verwendung nach Anspruch 19, wobei die chronische Nierenerkrankung eine fortschreitende chronische Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose ist, und/oder wobei die Herzerkrankung eine Herzinsuffizienz und/oder kardiale Fibrose ist.
Verwendung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein bindet, in einem Verfahren zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung, eine Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose ist, und wobei die Herzerkrankung vorzugsweise eine Herzinsuffizienz und/oder kardiale Fibrose ist.
Verwendung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein bindet, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, wobei die chronische Nierenerkrankung vorzugsweise eine fortschreitende chronische Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose ist, und wobei die Herzerkrankung vorzugsweise eine Herzinsuffizienz und/oder kardiale Fibrose ist.
Verwendung eines Wirkstoffs nach einem der Ansprüche 21 und 22, wobei der Wirkstoff, wenn er an ADAMTS12 gebunden ist, die ADAMTS12-Aktivität hemmt.
Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Wirkstoffs, der an das ADAMTS12-Protein bindet und/oder dieses hemmt, in einer therapeutisch wirksamen Dosis an ein menschliches oder tierisches Subjekt umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffs gemäß eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 5 bis 11, ferner umfassend die Aufreinigung des Wirkstoffs.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend den Wirkstoff nach einem der Ansprüche 13 bis 16 oder den Antikörper, das antigen-bindende Fragment oder antigen-bindende Derivat davon, oder ein antikörperähnliches Protein, nach einem der Ansprüche 17 und 18, und einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, zur Verwendung bei der Behandlung einer chronischen Nierenerkrankung und/oder einer Herzerkrankung, vorzugsweise wobei die chronische Nierenerkrankung eine fortschreitende chronische Nierenerkrankung, eine Niereninsuffizienz und/oder Nierenfibrose ist, und vorzugsweise wobei die Herzerkrankung eine Herzinsuffizienz und/oder kardiale Fibrose ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei die Hilfsstoffe ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus pharmazeutisch verträglichen Puffern, Tensiden, Verdünnungsmitteln, Trägern, Hilfsstoffen, Füllstoffen, Bindemittel, Schmiermitteln, Gleitmitteln, Desinfektionsmitteln, Adsorptionsmitteln und/oder Konservierungsmitteln.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend (i) das Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, und ferner (ii) Mischen des identifizierten Wirkstoffs mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Zusammensetzung, umfassend eine Kombination aus (i) dem Wirkstoff, der an das ADAMTS12-Protein bindet, nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dem Antikörper oder antigen-bindenden Fragment oder antigen-bindenden Derivat davon oder dem antikörperähnlichen Protein nach einem der Ansprüche 17 und 18, oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26 und 27, und (ii) einer oder mehreren weiteren therapeutisch aktiven Verbindungen.
Therapeutisches Kit, umfassend: (i) die pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 26, 27 oder 29, (ii) eine Vorrichtung zur Verabreichung der Zusammensetzung, und (iii) optional eine Gebrauchsanweisung.