JP2023542295A - Ｇｌｐ１ペプチド模倣薬を含む抗体薬物複合体及びその使用 - Google Patents

Ｇｌｐ１ペプチド模倣薬を含む抗体薬物複合体及びその使用 Download PDF

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オカモト，ハルカ
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Abstract

【解決手段】例えば、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）を標的化するために有用であるタンパク質薬物複合体及びその組成物が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ペプチド模倣ペイロード及びリンカーペイロード、並びにこれらを作製する方法が提供される。より詳細には、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体及びＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードを含むＧＬＰ１ペプチド模倣薬、抗体薬物複合体及び組成物並びにＧＬＰ１Ｒ関連症状を治療する方法が提供される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６３／０７７，９８３号の優先権を主張するものであり、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその開示内容全体を援用する。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有しており、これは参照としてその全体が本明細書に組み込まれている。２０２１年９月８日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称は２５０２９８＿０００２５０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは６，０７２バイトである。
本開示は、タンパク質薬物複合体（例えば、抗体薬物複合体）、医薬組成物及びそれを用いて疾患を治療する方法に関する。ペプチド模倣ペイロード及びリンカーペイロード、並びにこれらを作製する方法もまた提供される。より詳細には、本開示は、ＧＬＰ１ペプチド模倣薬を含むタンパク質薬物複合体（例えば、抗体薬物複合体）及びそれを用いてＧＬＰ１Ｒ関連症状を治療する方法に関する。
糖尿病は、異常なグルコース代謝の慢性疾患である。世界で４億２５００万人の人々が糖尿病に罹患していると推定されている。世界的な糖尿病薬としては、インスリン、ＤＰＰ－４阻害剤、グルカゴン様ペプチド１受容体（ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ １ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＬＰ１Ｒ）アゴニストが挙げられるが、大部分の患者は高血糖症及び心血管危険因子を管理するという併用治療の目的を達成していない。
グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）の受容体であり、膵臓β細胞で発現される。ＧＬＰ１Ｒは脳でも発現し、食欲、記憶及び学習の制御で機能する。ＧＬＰ１Ｒは、Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）のセクレチンファミリー（クラスＢ）のメンバーである。そのリガンドであるＧＬＰ１への結合時、ＧＬＰ１Ｒは細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ、ｃＡＭＰ）レベルを上昇させるＧａｓ Ｇタンパク質を介して下流のシグナル伝達カスケードを開始させ、遺伝子の転写調節を引き起こす（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ２０１１年）。ＧＬＰ１Ｒの活性化によってインスリン合成とインスリン放出の増加がもたらされる。
ＧＬＰ１Ｒ及びＧＬＰ１は、肥満及び２型糖尿病の高度に検証された標的である。市販のＧＬＰ１Ｒアゴニストはインスリンの分泌を増加させ、それによって血糖値を低下させるが、これには毎週の又はさらに頻繁な投与が必要となる。
したがって、当該技術分野では、持続時間がより長く安全性がさらに良好であるＧＬＰ１Ｒアゴニストが必要とされている。ある特定の実施形態では、本開示はこのニーズに合致しており、他の利点を提供する。
前述の説明は、当該技術分野が直面している課題の性質のより良好な理解を単に提供するために提示されており、いかなる方法であっても先行技術に対する承認として解釈されるべきではなく、かつ本明細書における援用は、かかる援用が本願に対して「先行技術」を構成するという承認として解釈されるべきではない。
本開示の種々の非限定的な態様及び実施形態が以下に記載される。
一態様では、式（Ａ）
ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）、
の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
ＢＡは、抗体又はその抗原結合断片であり、
Ｌは、非切断型リンカーであり、
Ｐは、
からなる群から選択される構造を有するペイロードであって、
式中、
はペイロードがＬに結合する箇所であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、結合、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨであって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、結合、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨから選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択され、
Ａｒは、
から選択され、
Ｘ９は、－ＮＨ２、
から選択され、
ｍは、１～４の整数である、ペイロードである、化合物又は薬学的に許容されるその塩。
別の態様では、式（Ｉ）
ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）、
の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
ＢＡは、抗体又はその抗原結合断片であり、
Ｌは、非切断型リンカーであり、
Ｐは、
からなる群から選択される構造を有するペイロードであって、
式中、
はペイロードがＬに結合する箇所であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、ペイロードである、化合物又は薬学的に許容されるその塩が本明細書に提供される。
本明細書に記載の化合物のいくつかの実施形態では、ＢＡはグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ標的抗体は、ＧＬＰ１Ｒアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ標的抗体は、５Ａ１０、９Ａ１０、ＡＢ９４３３－Ｉ、ｈ３８Ｃ２、ＰＡ５－１１１８３４、ＮＬＳ１２０５、ＭＡＢ２８１４、ＥＰＲ２１８１９又はグルタズマブである。
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、ＢＡの一方又は両方の重鎖に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、ＢＡの一方又は両方の重鎖可変ドメインに結合している。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、ＢＡの一方又は両方の軽鎖に結合している。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、ＢＡの一方又は両方の軽鎖可変ドメインに結合している。
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、グルタミン残基を介してＢＡに結合する。いくつかの実施形態では、グルタミン残基は、ＢＡの一方又は両方の重鎖のＮ末端に導入される。いくつかの実施形態では、グルタミン残基は、ＢＡの一方又は両方の軽鎖のＮ末端に導入される。いくつかの実施形態では、グルタミン残基は、ＢＡのＣＨ２又はＣＨ３ドメイン中に天然に存在する。いくつかの実施形態では、グルタミン残基は、１つ以上のアミノ酸を修飾することでＢＡに導入される。いくつかの実施形態では、グルタミン残基はＱ２９５又はＮ２９７Ｑである。
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、リジン残基を介してＢＡに結合する。
いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片はグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。いくつかの実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は脱グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、抗原結合断片はＦａｂ断片である。
一実施形態では、ｍは１である。一実施形態では、ｍは２～４の整数である。一実施形態では、ｍは２である。
いくつかの実施形態では、２つ以上のＬ－ＰはＢＡに結合されている。いくつかの実施形態では、２つのＬ－ＰがＢＡに結合されている。
いくつかの実施形態では、リンカーＬは式（Ｌ’）
－Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）、
の構造であって、式中、Ｌａは、ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
Ｙは、トリアゾールを含む基であり、
Ｌｐは、存在しない、又はＰに共有結合された第２のリンカーであり、Ｌｐが存在しないときにはＹもまた存在しない、構造を有する。
いくつかの実施形態では、Ｙは、
からなる群から選択される構造であって、式中、Ｑは、Ｃ又はＮである、構造を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌｐは、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは２～３０個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは４～２４個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは４個のＥＧ単位、又は８個のＥＧ単位、又は１２個のＥＧ単位、又は２４個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは４個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは８個のＥＧ単位を含む。
いくつかの実施形態では、Ｙ－Ｌｐは、
又はそのトリアゾール位置異性体からなる群から選択される構造であって、
式中、ｐは１～３６の整数である、構造を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌｐは、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｌｐは１～１０個のグリシンを含む。いくつかの実施形態では、Ｌｐは１～６個のセリンを含む。いくつかの実施形態では、Ｌｐは１～１０個のグリシンと、１～６個のセリンと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｌｐは４個のグリシンと、１個のセリンと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｌｐは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）（配列番号１）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＧ４）（配列番号２）及びＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ－Ｇ４Ｓ）（配列番号３）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｌｐは、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む。いくつかの実施形態では、セリン残基は炭水化物基を含む。いくつかの実施形態では、セリン残基はグルコース基を含む。
いくつかの実施形態では、Ｌｐは、
からなる群から選択される構造であって、
式中、Ｙはトリアゾールを含む基であり、Ｐはペイロードであり、式中、ＲｃはＨ及びグルコースから選択され、ｇは１～１０の整数であり、ｓは０～４の整数である、構造を有する。
いくつかの実施形態では、Ｙ－Ｌｐは、
又はそのトリアゾール位置異性体からなる群から選択される構造を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌａは、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは４個のＥＧ単位、又は８個のＥＧ単位、又は１２個のＥＧ単位、又は２４個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは８個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは、
からなる群から選択される構造を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌａは、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは１～１０個のグリシンと、１～６個のセリンと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは４個のグリシンと、１個のセリンと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＧ４）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（Ｇ２Ｓ－Ｇ２Ｓ－Ｇ２）及びＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（Ｇ４Ｓ－Ｇ４）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｌａは、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは、
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｌａは－（ＣＨ２）２－２４－鎖を含む。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、Ｌａは、－（ＣＨ２）２－２４－鎖と、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む。Ｌａは、
からなる群から選択される。
本明細書に記載の化合物の種々の実施形態では、Ｐは構造
を有する。
いくつかの実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、ｎは１であり、Ｘ４はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、Ｘ７はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は
である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７は
であり、Ｘ８は－ＮＨ２である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ８はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は各発生時にＨであり、Ｘ７は
であり、Ｘ８はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７は
であり、Ｘ８は
である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７は
である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は
である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは０であり、Ｘ４はフェニルであり、Ｘ５は
である。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はフェニルであり、Ｘ５は
である。
本明細書に記載の化合物の種々の実施形態では、Ｐは構造
を有する。
いくつかの実施形態では、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は
である。
本明細書に記載の化合物の種々の実施形態では、Ｐは、
からなる群から選択される構造を有する。
本明細書に記載の化合物の種々の実施形態では、化合物の半減期は血漿中では７日間よりも長い。
本明細書に記載の化合物の種々の実施形態では、化合物はＧＬＰ１Ｒ以外のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合しない。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの化合物を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの化合物を含む医薬剤形が本明細書に提供される。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの化合物を用いて細胞の表面上のＧＬＰ１Ｒを選択的に標的化する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は膵臓細胞、脳細胞、心臓細胞、血管組織細胞、腎細胞、脂肪組織細胞、肝臓細胞又は筋細胞である。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの化合物の有効量、本明細書に記載の組成物の有効量又は本明細書に記載の剤形の有効量をその必要がある個体に投与することを含む、個体でＧＬＰ１Ｒ活性を増強する方法が本明細書に提供される。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの化合物の有効量、本明細書に記載の組成物の有効量又は本明細書に記載の剤形の有効量をその必要がある個体に投与することを含む、個体で血糖値を低下させる方法が本明細書に提供される。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの化合物の有効量、本明細書に記載の組成物の有効量又は本明細書に記載の剤形の有効量をその必要がある個体に投与することを含む、個体で体重を低下させる方法が本明細書に提供される。
別の態様では、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれかの化合物の有効量、本明細書に記載の組成物の有効量又は本明細書に記載の剤形の有効量をその必要がある個体に投与することを含む、個体でＧＬＰ１Ｒ関連症状を治療する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は２型糖尿病、肥満、肝疾患、冠動脈疾患又は腎疾患である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は２型糖尿病及び／又は肥満である。いくつかの実施形態では、
本明細書に記載の方法のうちのいずれかの種々の実施形態では、本開示の化合物、組成物又は剤形は、皮下に、静脈内に、皮内に、腹腔内に、又は筋肉内に投与される。別の態様では、式（Ａ）
ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）、
の構造を有する、本明細書に記載の化合物を作製する方法であって、方法は、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくともｍ個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、少なくともｍ当量の化合物Ｌ－Ｐとを接触させる工程と、
ｂ）作製された式（Ａ）の化合物を単離する工程と、を含む、方法が本明細書に提供される。
別の態様では、式（Ｉ）
ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）、
の構造を有する、本明細書に記載の化合物を作製する方法であって、方法は、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも１個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、化合物Ｌ－Ｐとを接触させる工程と、
ｂ）作製された式（Ｉ）の化合物を単離する工程と、を含む、方法が本明細書に提供される。
別の態様では、式（Ａ）
ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）、
の構造を有する請求項１に記載の化合物であって、式中、リンカーＬは、式（Ｌ’）
－Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）、の構造であって、
式中、Ｌａは、ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
Ｙは、トリアゾールを含む基であり、
Ｌｐは、Ｐに共有結合された第２のリンカーである、構造を有する、化合物を作製する方法であって、
方法が、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくともｍ個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、アジド又はアルキン部分を含む第１のリンカーＬａとを接触させる工程と、
ｂ）工程ａ）の生成物と、少なくともｍ当量の化合物Ｌｐ－Ｐとを接触させる工程であって、第２のリンカーＬｐはアジド又はアルキン部分を含み、Ｌａ及びＬｐは反応してトリアゾールを作製することが可能である、工程と、
ｃ）作製された式（Ａ）の化合物を単離する工程と、を含む、方法が本明細書に提供される。
別の態様では、式（Ｉ）
ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）、
の構造を有する本明細書に記載の化合物であって、式中、リンカーＬは、式（Ｌ’）
－Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）、の構造であって、
式中、Ｌａは、ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
Ｙは、トリアゾールを含む基であり、
Ｌｐは、Ｐに共有結合された第２のリンカーである、構造を有する、化合物を作製する方法であって、
方法が、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも１個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、アジド又はアルキン部分を含む第１のリンカーＬａとを接触させる工程と、
ｂ）工程ａ）の生成物と、化合物Ｌｐ－Ｐとを接触させる工程であって、第２のリンカーＬｐはアジド又はアルキン部分を含み、Ｌａ及びＬｐは反応してトリアゾールを作製することが可能である、工程と、
ｃ）作製された式（Ｉ）の化合物を単離する工程と、を含む、方法が本明細書に提供される。
別の態様では、式（Ｐ－ＩＢ）、式（Ｐ－ＩＩＢ）及び式（Ｐ－ＩＩＩＢ）
からなる群から選択される構造を有する化合物又は薬学的に許容されるであって、式中、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択され、
Ａｒは、
から選択され、
Ｘ９は、－ＮＨ２、
から選択され、
ｍは、１～４の整数である、化合物
又は薬学的に許容されるその塩が本明細書に提供される。
別の態様では、式（ＩＩ）
の構造を有する化合物であって、
式中、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－ＣＨ３から選択されるが、Ｘ３が－ＣＨ３といった条件では、ｎは１であり、少なくとも１個の発生においてＲａが－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
ｎは、０又は１であり、
ｍは、０～３の整数であり、
Ｒａは、各発生時に独立して－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、化合物並びに
薬学的に許容されるその塩が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、Ｐは、
からなる群から選択される構造を有する。
別の態様では、式（Ｃ）
の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
Ｌｐは、存在しない、又は
、カルバマート基、シクロデキストリン、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメント、－（ＣＨ２）２－２４－鎖、トリアゾール、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリンから選択される１つ以上のアミノ酸並びにそれらの組合せ、のうちの１つ以上を含むリンカーであり、
Ｑは、－ＮＨ２、－Ｎ３、
から選択され、式中、ＡがＣ又はＮである、部分であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択され、
Ａｒは、
から選択され、
Ｘ９は、－ＮＨ２、
から選択され、
ｍは、１～４の整数である、化合物又は薬学的に許容されるその塩が本明細書に提供される。
別の態様では、式（ＩＩＩ）
の構造を有する化合物であって、式中、
Ｌｐは、存在しない、又は
、カルバマート基、シクロデキストリン、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメント、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリンから選択される１つ以上のアミノ酸並びにそれらの組合せ、のうちの１つ以上を含むリンカーであり、
Ｑは、－Ｎ３、
から選択され、式中、ＡがＣ又はＮである、部分であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－ＣＨ３から選択されるが、Ｘ３が－ＣＨ３といった条件では、ｎは１であり、少なくとも１個の発生においてＲａが－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｒａは、各発生時に独立してＨ、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、化合物並びに
薬学的に許容されるその塩が本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、上記の化合物は、
から選択される構造又は薬学的に許容されるそれらの塩を有する。
別の態様では、抗体薬物複合体であって、
からなる群から選択される構造又は薬学的に許容されるその塩のペイロードに、必要に応じてリンカーを介して結合された抗原結合断片を含む、抗体薬物複合体が本明細書に提供される。
さらに別の態様では、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片と、構造：
とを有するペイロードであって、
式中、
は、抗体又はその抗原結合断片に直接的に、又はリンカーを介して、ペイロードが結合する箇所である、ペイロードを含む抗体薬物複合体が本明細書に提供される。
一実施形態では、ペイロードは、構造：
を有する。
さらに別の態様では、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片と、構造：
を有するリンカーペイロードであって、
式中、
は、抗体又はその抗原結合断片にリンカーペイロードが結合する箇所である、リンカーペイロードとを含む抗体薬物複合体が本明細書に提供される。
一実施形態では、リンカーペイロードは、構造：
を有する。
本開示のこれらの態様及びその他の態様は、添付の特許請求の範囲を含む本開示の以下の詳細な説明を読んだ後には当業者には明らかとなるであろう。
本特許又は本願のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。１つ以上のカラー図面を含む本特許又は本特許出願公開の写しは、請求及び必要な費用の支払いに応じて特許庁により提供される。
例示的な抗体結合薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｔｅｔｈｅｒｅｄ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＴＤＣ）のデザイン及びその作用機序の概略図を示す。 従来の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）のデザイン及びその作用機序の概略図を示す。 細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ、ＥＣＤ）に結合した抗体及び膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ、ＴＭＤ）に結合したペイロードを有する抗体結合薬物複合体のモデルを示す。 ＧＬＰ１（７～３６）アミド（配列番号４）の概略図を示す。配列上部の数字は、プログルカゴンプロペプチドのアミノ酸位置に対応している。青色の矢印は、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－４、ＤＰＰ－ＩＶ）切断部位を示す。赤色の矢印は、中性エンドペプチダーゼ（ｎｅｕｔｒａｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ、ＮＥＰ）切断部位を指す。破線の矢印は、１つ以上の未知のエンドプロテアーゼによる切断部位を指す。オレンジ色の残基は、置換されるとＧＬＰ１Ｒの結合とｃＡＭＰ産生を減少させるアミノ酸である。緑色の残基は、置換されるとＧＬＰ１Ｒの結合を減少させるアミノ酸である。 ＧＬＰ１に結合したＧＬＰ１Ｒの構造を示す（タンパク質データバンクＩＤ：３ＩＯＬ）。この構造への言及は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７、Ｃｈｅｐｕｒｎｙ ｅｔ ａｌ．ＪＢＣ ２０１９、Ｄｅ Ｇｒａａｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１６及びＭａｎａｎｄｈａｒ ａｎｄ Ａｈｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４に見出すことができ、これらそれぞれは、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている。 ＧＬＰ１ペプチド模倣薬であるペプチド５（配列番号５）の配列及び構造を示す。配列上部の数字は、プログルカゴンプロペプチドのアミノ酸位置に対応している。 テンプレートとしてペプチド５に結合したＧＬＰ１Ｒ（タンパク質データバンクＩＤ：５ＮＸ２）中にＧＬＰ１に結合したＧＬＰ１Ｒ（タンパク質データバンクＩＤ：３ＩＯＬ）を使用した、ＧＬＰ１Ｒと５ＮＸ２との構造との重ね合わせを示す。５ＮＸ２構造への言及は、Ｊａｚａｙｅｒｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ５４６，ｐａｇｅｓ ２５４－２５８（２０１７）に見出すことができ、これは本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている。 本開示のＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードを作製するための合成スキームを示す。樹脂上での固相ペプチド合成が確立されており、これは良好な収率で本開示のペイロードを効果的に産生した。体系的なＲ１／Ｒ２／Ｒ３修飾により、さらなるＧＬＰ１Ｒペプチド模倣ペイロードを産生した。 本開示のＧＬＰ１Ｒペプチド模倣ペイロードが、関連するＧＰＣＲバイオアッセイで活性化を示さなかったことを実証している。 本開示のＧＬＰ１Ｒペプチド模倣ペイロードが、関連するＧＰＣＲバイオアッセイで活性化を示さなかったことを実証している。 本開示のＧＬＰ１Ｒペプチド模倣ペイロードが、関連するＧＰＣＲバイオアッセイで活性化を示さなかったことを実証している。 本開示のＧＬＰ１Ｒペプチド模倣ペイロードが、関連するＧＰＣＲバイオアッセイで活性化を示さなかったことを実証している。 より短いリンカーのＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣが、コントロールＡＴＤＣ以上に大きな力価を示したことを示す。 より短いリンカーのＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣが、コントロールＡＴＤＣ以上に大きな力価を示したことを示す。 主要なリンカーペイロードが、インビトロでの心毒性及び潜在的変異原性のない最適なインビトロＡＤＭＥプロファイルを示し、そのＡＴＤＣが血漿中で非常に安定した状態であることを示す。 リンカーペイロードを本開示の抗体に結合させるための２つの方法を示す。 抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣ薬物負荷プロファイルの代表的な疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＣ）グラフを示す。ＨＩＣは、ＡＴＤＣを選別するために結合能力のスクリーニングに使用された。このスクリーニングは、低い結合収率、低いＤＡＲ、高い凝集及び不十分なＢｉａｃｏｒｅ結合を示している。 抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣによるＣＲＥ依存性ルシフェラーゼレポーター活性を示す。抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣは、アイソタイプコントロールＡＴＤＣよりも良好なインビトロ力価を示した。非結合ｍＡｂは、ｈＧＬＰ１Ｒ細胞を活性化しなかった（図示せず）。ＡＴＤＣは、グルカゴン様ペプチド２受容体（Ｇｌｕｃａｇｏｎ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＬＰ２Ｒ）、グルカゴン受容体（ｇｌｕｃａｇｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＣＧＲ）又は胃抑制ポリペプチド受容体（ｇａｓｔｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＩＰＲ）を活性化しなかった（図示せず）。 非結合抗ＧＬＰ１Ｒ抗体の存在下での抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣによる、サイクリックＡＭＰ応答配列（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ、ＣＲＥ）依存性ルシフェラーゼレポーター活性を示す。これは、１０ｎＭ未満の非結合抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ濃度が、抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣ活性に何ら影響を及ぼさなかったことを示す。１００ｎＭの非結合抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂは、抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣの力価を３．８倍減少させた。このアッセイは、最初に非結合抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂを加え、続いて直ちに抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣを加え、４時間のインキュベートさせることで実施された。 図１１Ａのグラフに対応するデータを示す。 本開示の例示的なＧＬＰ１Ｒ ＱタグｍＡｂ－ＧＬＰ１Ｒアゴニスト複合体の概略図を示す。 本開示に従ってＧＬＰ１ペプチド模倣薬を調製するための一般的な合成スキームを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ１及びＰ８の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２及びＰ９の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ１１、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６及びＰ１７の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ１０、Ｐ１２、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２５、Ｐ２６、Ｐ２７、Ｐ２８、Ｐ２９、Ｐ３０、Ｐ３１、Ｐ３６、Ｐ３７及びＰ３８の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ１０、Ｐ１２、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２５、Ｐ２６、Ｐ２７、Ｐ２８、Ｐ２９、Ｐ３０、Ｐ３１、Ｐ３６、Ｐ３７及びＰ３８の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２０及びＰ２１の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２２及びＰ２３の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２４の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ３２、Ｐ３３、Ｐ３４及びＰ３５の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ３９の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ４０の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ４１の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ４２の固相合成のためのシーケンスを示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１、ＬＰ２、ＬＰ３、ＬＰ４及びＬＰ５の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ６及びＬＰ７の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ８、ＬＰ９、ＬＰ１０及びＬＰ１１の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１２の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１３及びＬＰ１４の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１５及びＬＰ１８の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１７の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１８及びＬＰ２０の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１９の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２１の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２２の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２３の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２４の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２５の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２６の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２７及びＬＰ２８の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２９の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ３０の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ３１の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ３２の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ３３の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ３４の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ３５の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ３６、ＬＰ３７、ＬＰ３８、ＬＰ３９、ＬＰ４０及びＬＰ４１の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ４２の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ４３の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ４４の調製のための合成経路を示す。 本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ４５の調製のための合成経路を示す。 部位特異的抗体薬物複合体の調製のための一般的な二段階結合手順の概略図を示す。 部位特異的抗体薬物複合体の調製のための一般的な一段階結合手順の概略図を示す。 電気生理学的試験のためのコマンダ電圧プロトコールを示す。最初に、電圧を、リーク電流を差し引くために８０ｍｓにわたって－８０ｍＶの保持電位から－５０ｍＶへとステップし、続いて４８００ｍｓにわたって＋２０ｍＶへとステップしてｈＥＲＧチャネルを開いた。その後、電圧を５０００ｍｓにわたって－５０ｍＶへと戻し、「リバウンド」又はテール電流を引き起こした。これをデータ解析のために測定し、収集した。最終的に、電圧を保持電圧（－８０ｍＶ、１０００ｍｓ）に戻した。電圧コマンドプロトコールを２０秒ごとに繰り返し、試験中連続してこれを実施した（ビヒクルコントロール及び試験化合物）。 マウス、サル及びヒト血漿中で７日間、３７℃のインキュベーションでの抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡＢ２－ＬＰ１１のインビトロ安定性を示す。 肥満ＧＬＰ１Ｒヒト化マウスでの体重変化パーセントでのＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣの効果を示す。 肥満ＧＬＰ１Ｒヒト化マウスでの血糖値でのＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣの効果を示す。 本開示の例示的な実施形態に従ったＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣの概略図である。
本開示は、いくつかの態様では、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）タンパク質に特異的に結合する抗体薬物複合体を提供する。上記背景技術の節に記載されるように、ＧＬＰ１Ｒ及びそのリガンドであるＧＬＰ１は、肥満及び２型糖尿病にとって高度に検証された標的である。しかしながら、２型糖尿病の治療にとって直接的なアゴニスト抗体は同定されていない。ＧＬＰ１Ｒ上でアゴニスト活性を有する単一ペプチドは、グルコース制御及び体重減少のための有効な治療薬であるが、一列に並んだペプチド抗体融合物はタンパク質分解に感受性がある。本開示のある特定の実施形態では、ＧＬＰ１Ｒの細胞外ドメインを特異的に標的とし、抗体又はその抗原結合断片と、ＧＬＰ１Ｒを機能的に活性化させるＧＬＰ１ペプチド模倣薬と、を組み合わせた抗体薬物複合体を産生した。ある特定の実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、同等又はより良好な体重減少及びグルコース減少力価並びにオフターゲットの副作用が最小限でありながら、より長い薬物持続時間を有する。
本開示の詳細な実施形態が本明細書に開示されているが、開示された実施形態は、種々の形態で具体化され得る本開示を単に例示したのみであるということを理解されたい。加えて、本開示の種々の実施形態に関連して与えられているそれぞれの実施例は例示ではあるが限定的ではないことを意図している。したがって、本明細書に開示される特定の構造的及び機能的詳細は、限定として解釈されるべきではなく、本開示を様々に利用することを当業者に教示するための代表的な基本原理としてのみ解釈されるべきである。
定義
特段規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び化学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特段文脈で明確に規定しない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される及び／又は本開示を読めば当業者に明らかとなるであろう種類の１つ以上の方法及び／又は工程を含む。
状態、障害又は症状を「治療する」又は「治療」といった用語は、（１）状態、障害若しくは症状に苦しんでいる、若しくはこれらに罹患しやすくなる可能性があるが、状態、障害若しくは症状の臨床症候若しくは無症候を未だ経験していない対象内で発生した状態、障害若しくは症状のうちの少なくとも１つの臨床症候若しくは無症候の発生及び／若しくは出現の見込みを予防、遅延若しくは減少させること、又は（２）状態、障害若しくは症状を阻害すること、すなわち疾患、若しくはその再発若しくは少なくとも１つのその臨床症候若しくは無症候の発生を抑止、減少若しくは遅延すること、又は（３）疾患の軽減、すなわち状態、障害若しくは症状、若しくは少なくとも１つの書の臨床症候若しくは無症候を退行させること、を含む。治療される対象への利益は、患者又は医師に対し、統計学的に有意であることか、少なくとも知覚できることのいずれかである。いくつかの実施形態では、治療は、疾患が間接的に影響を受けるような方法で細胞を切除する方法を含む。ある特定の実施形態では、治療は、治療（ｔｈｅｒａｐｙ）前の造血幹細胞移植前処置レジメンとして免疫細胞を枯渇させることを含む。
本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」又は「個体」又は「動物」は、ヒト、獣医学的動物（例えば、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタなど）及び疾患の実験動物モデル（例えば、マウス、ラットなど）を指す。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合、投与量又は量に適用される「有効な」といった用語は、その必要がある対象への投与時に所望の活性をもたらすのに十分な化合物又は医薬組成物の量を指す。活性成分の組合せが投与される場合、有効量の組合せは、個々に投与される場合には有効であった各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに留意されたい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢及び全身状態、治療されている症状の重症度、利用される特定の薬物、投与様式などに応じて対象によって異なる。
本開示の組成物に関連して使用される「薬学的に許容される塩」といった語句は、患者への投与に好適な任意の塩を指す。好適な塩としては、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６：１に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。塩の例としては、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、ピルビン酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、ケイ皮酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ｐトルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩などが含まれるが、これらに限定されない、酸由来、塩基由来、有機、無機、アミン及びアルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、本明細書に記載のペイロードは第３級アミンを含み、第３級アミン中の窒素原子は、ペイロードがリンカー又はリンカースペーサーに結合されている原子である。かかる例では、ペイロードの第３級アミンへの結合によって、リンカーペイロード分子中に第４級アミンが得られる。第４級アミンの正電荷は、対イオン（例えば、本明細書に記載のものなどのクロロ、ブロモ、ヨード又は任意の他の好適な荷電部分）によって均衡状態となる。
範囲は、「約」又は「およそ」１つの特定の値から、かつ／又は「約」又は「およそ」別の特定の値までとして本明細書に表すことができる。かかる範囲が表されるときには、別の実施形態は１つの特定の値から、かつ／又は他の特定の値までを含む。
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「を含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、少なくとも指定された化合物、要素、粒子又は方法の工程が組成物又は物質又は方法の中に存在しているが、他のこうした化合物、材料、粒子又は方法の工程が指定されたものと同一の機能を有する場合であったとしても、他の化合物、材料、粒子又は方法の工程の存在を排除するものではないことを意味している。
本開示の化合物は、本明細書に一般に記載されているものを含み、本明細書に開示されるクラス、サブクラス及び種によってさらに例示されている。本明細書で使用される場合、特段明記しない限り、以下の定義が適用されるものとする。本開示の目的のために、化学元素は、Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ｔａｂｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５ｔｈ Ｅｄに従って識別される。加えて、有機化学の一般原理は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ：１９９９，及び「Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｅｄ．：Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｂ．ａｎｄ Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：２００１に記載されている。
本明細書で使用される場合、「アルキル」といった用語は、当該技術分野においてはその通常の意味が与えられており、直鎖アルキル基、分岐鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基及びシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を含んでもよい。ある特定の実施形態では、直鎖又は分岐鎖アルキルは、主鎖中に約１～２０個の炭素原子（例えば、直鎖に関してはＣ１－Ｃ２０、分岐鎖に関してはＣ２－Ｃ２０）、あるいは約１～１０個の炭素原子、又は約１～６個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、シクロアルキル環は、その環構造中に約３～１０個の炭素原子を有し、かかる環が単環式又は二環式の環である。あるいは、環構造中に約５個、約６個又は約７個の炭素を有する。いくつかの実施形態では、アルキル基は低級アルキル基であってもよく、低級アルキル基は１～４個の炭素原子を含む（例えば、直鎖低級アルキルに関してはＣ１－Ｃ４）。
本明細書で使用される場合、「アルケニル」といった用語は、１つ以上の二重結合を有する、本明細書で使用されるアルキル基を指す。
本明細書で使用される場合、「アルキニル」といった用語は、１つ以上の三重結合を有する、本明細書で使用されるアルキル基を指す。
「ヘテロ原子」といった用語は、酸素、硫黄、窒素、リン又はケイ素（窒素、硫黄、リン又はケイ素の任意の酸化形態、任意の塩基性窒素の四級化形態、又は複素環の置換可能な窒素を含む）のうちの１つ以上を含む。
「ハロゲン」といった用語はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味し、「ハロゲン化物」といった用語は、ハロゲン基又は置換基、すなわち－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ又は－Ｉを指す。
本開示の「付加物」、例えば「ディールス・アルダー付加物」は、部分を作製するために採用された合成工程とは無関係である、例えばディールス・アルダー反応といった付加反応の生成物を含む任意の部分を包含する。
「共有結合」といった用語は、共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｂｏｎｄ）、すなわち２原子間の１つ以上の電子対の共有に関与する化学結合を意味する。共有結合は、σ結合、π結合、金属間結合、アゴスティック相互活用、曲がった結合及び三中心二電子結合を含むがこれらに限定されない、異なる相互作用を含んでもよい。第１の基が第２の基に「共有結合可能」であると言われる場合、これは、例えば触媒の使用によって、又は特定の反応条件下にて、直接的に又は間接的に、第１の基が第２の基と共有結合を形成可能であることを意味している。互いに共有結合可能である基の非限定的な例としては、例えばアミン及びカルボン酸（アミド結合を形成する）、ジエン及び求ジエン体（ディールス・アルダー反応による）、マレイミド及びチオール（チオマレイミドを形成する）並びにアジド及びアルキン（１，３－環化付加反応を介してトリアゾールを形成する）が挙げられる。
本明細書に記載されるように、本開示の化合物は、「必要に応じて置換された」部分を含有してもよい。一般には、「置換された」といった用語は、「必要に応じて」という用語が先行するしないにかかわらず、指定の部分のうちの１個以上の水素を好適な置換基で置き換えることを意味する。特段明記しない限り、「必要に応じて置換された」基は、基のそれぞれの置換可能位置に好適な置換基を有してもよく、任意の所与の構造内の２つ以上の位置が、特定の基から選択される２個以上の置換基で置換され得る場合には、置換基は全ての位置で同一又は異なっていてもよい。本開示によって想定される置換基の組合せは、安定した又は化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものが好ましい。
本明細書で使用される場合、「安定した」といった用語は、製造、検出、並びにある特定の実施形態ではその回収、精製及び本明細書に開示される目的のうちの１つ以上のための使用を可能にする状態に供された場合に、実質的に変性されない化合物を指す。
特段明記しない限り、本明細書に示されている構造は、構造の全ての異性体（例えば、鏡像異性体、ジアステレオ異性体及び幾何異性体（又は配座異性体））形態であって、例えば各不斉中心のＲ配置及びＳ配置、（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体並びに（Ｚ）及び（Ｅ）配座異性体を含むこともまた意味している。したがって、本発明の化合物の単一の立体化学異性体並びに鏡像異性体、ジアステレオ異性体及び幾何（又は配座）異性体の混合物は本開示の範囲内である。
特段明記しない限り、本明細書に示されている例えば環化付加反応、例えばアジド－アセチレン環化付加反応又はディールス・アルダー反応の生成物といった環状付加物は、全ての位置異性体、すなわち官能基又は置換基の位置のみが異なっている構造異性体を含む。一例として、以下の構造は、トリアゾ－ル環上の置換基の位置のみが異なっているトリアゾール位置異性体：
を表している。トリアゾール位置異性体は、以下の構造：
によって表されてもよい。
特段明記しない限り、本開示の化合物の全ての互変異性体形態は本開示の範囲内である。
加えて、特段明記しない限り、本明細書に示されている構造は、１つ以上の同位体濃縮原子の存在下でのみ異なる化合物を含むこともまた意味している。例えば、重水素又は三重水素による水素の置換又は１１Ｃ又は１３Ｃ又は１４Ｃ濃縮炭素による炭素の置換を除いた本発明の構造を有する化合物は、本開示の範囲内である。
１つ以上の方法の工程への言及は、明示的に識別されている追加工程又はこうした工程の間に存在する方法の工程の存在を排除するものではないこともまた理解されたい。同様に、デバイス又はシステム中の１つ以上の構成要素への言及は、明示的に識別されている追加の構成要素又はこうした構成要素の間に存在する構成要素の存在を排除するものではないこともまた理解されたい。
特段明記しない限り、本開示の化合物の全ての結晶形態及びその塩もまた、本開示の範囲内である。本開示の化合物は、限定するわけではないが、無水、水和、非溶媒和又は溶媒和状態の形態を含む、種々の非晶質形態及び結晶形態で単離されてもよい。例示的な水和物としては、半水和物、一水和物、二水和物などが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の化合物は無水状態又は非溶媒和状態である。「無水」は、化合物の結晶形態が結晶格子構造中に結合水を本質的に含有しない、すなわち化合物が結晶水和物を形成しないことを意味している。
本明細書で使用される場合、「結晶形態」は、結晶物質のある特定の格子構成を指すということを意味している。同一の物質の異なる結晶形態は、典型的には異なる結晶格子（例えば単位格子）を有するが、これが結晶形態のそれぞれの特性である異なる物理特性に寄与している。いくつかの例では、異なる格子構成は水又は溶媒の含有量が異なる。異なる結晶格子は、粉末Ｘ線回折（Ｘ－ｒａｙ ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＰＸＲＤ）などの固体状態特性評価法によって識別され得る。例えば、示差走査熱量測定（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＣ）、熱重量分析（ｔｈｅｒｍｏｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ、ＴＧＡ）、動的水蒸気吸着測定（ｄｙｎａｍｉｃ ｖａｐｏｒ ｓｏｒｐｔｉｏｎ、ＤＶＳ）、固体ＮＭＲなどの他の特性評価法は、結晶形態の識別かつ安定性及び溶媒含有量／含水量の決定にさらに役立つ。
物質の結晶形態としては、溶媒和（例えば、水和）形態と非溶媒和（例えば、無水）形態の両方が挙げられる。水和形態は、結晶格子内に水を含む結晶形態である。水和形態は、化学量論的な水和物であり得る。この場合、水はある特定の（例えば、半水和物、一水和物、二水和物などに関する）水／分子比で格子内に存在している。水和形態はまた、非化学量論的である可能性もある。この場合、含水量は可変であり、湿度などの外部条件に依存する。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は実質的に単離されている。「実質的に単離される」とは、特定の化合物が少なくとも部分的に不純物から単離されていることを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約２．５％未満、約１％未満又は約０．５％未満の不純物を含む。不純物は、例えば他の結晶形態及び他の物質を含む、実質的には単離された化合物ではないものを一般には含む。
ある特定の基、部分、置換基及び原子は、波線で示されている。波線は、１つ以上の結合と交差又はこれをキャップすることができる。波線は、基、部分、置換基又は原子が結合されている原子を示す。例えば、
として示されているプロピル基で置換されているフェニル基は、以下の構造：
を有する。
「ＧＬＰ１Ｒ」といった用語は、グルカゴン様ペプチド１受容体を指しており、組換えＧＬＰ１Ｒタンパク質又はその断片を含む。ＧＬＰ１Ｒは、４６３残基の配列である。Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１６６（１）：２７－４１（２０１１）。グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）は、栄養素の摂取後に腸管内分泌Ｌ細胞から放出された３１アミノ酸ペプチドホルモンである。ＧＬＰ１ＲへのＧＬＰ１の結合は、膵臓β細胞からのグルコース誘発性インスリン分泌を増強し、インスリン発現を増加し、β細胞のアポトーシスを阻害し、β細胞の新生を促進し、グルカゴン分泌を減少し、胃内容排出を遅延し、満腹を推進し、末梢グルコース消失を増加させる。
「ＧＬＰ１Ｒに結合する抗体」又は「抗ＧＬＰ１Ｒ抗体」といった語句は、ＧＬＰ１Ｒを特異的に認識する抗体及びその抗原結合断片を含む。
本明細書で使用される場合、「アゴニスト抗体」（又は「ＧＬＰ１Ｒ活性を増加若しくは増強する抗体」）は、ＧＬＰ１Ｒへの結合によって少なくとも１つのＧＬＰ１Ｒの生物学的活性の活性化をもたらす抗体を指すことを意図している。例えば、ＧＬＰ１Ｒのアゴニスト抗体は、細胞が哺乳動物の膵臓β細胞である場合、サイクリックＡＭＰの合成の増加をもたらすアデニル酸シクラーゼ経路の刺激を誘発し、インスリンを放出することができる。ＧＬＰ１Ｒのアゴニスト抗体はまた、その必要がある対象への投与時にグルコースレベルを減少させることができる。
本開示で使用される全てのアミノ酸の略語は、米国特許規則連邦規則法典第３７巻§１．８２２（Ｂ）（Ｊ）に規定されるように、米国特許商標庁によって承認されているものである。
「タンパク質」といった用語は、アミド結合を介して共有結合された約２０個を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸重合体を意味する。本明細書で使用される場合、「タンパク質」としては、生物学的薬物タンパク質、研究又は治療で使用される組換えタンパク質、ｔｒａｐタンパク質及び他のＦｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、ｓｃＦｖ融合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどが挙げられる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア株）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ誘導体）といった組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。
本明細書のタンパク質、ポリペプチド及びタンパク質断片に対する全ての言及は、非ヒト種であると特段明示的に指定しない限りはそれぞれのタンパク質、ポリペプチド又はタンパク質断片のヒトバージョンを指すことを意図している。したがって、「ＧＬＰ１Ｒ」という表現は、例えば「マウスＧＬＰ１Ｒ」、「サルＧＬＰ１Ｒ」など、特段非ヒト種であると指定しない限りはヒトＧＬＰ１Ｒを意味する。
抗体のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（「Ｋａｂａｔ」番号付与スキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付与スキーム）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付与スキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付与スキーム）；及びＨｏｎｅｇｇｅ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７－７０（「ＡＨｏ」番号付与スキーム）に記載されているものを含む、任意の公知の番号付与スキームを使用して番号付与され得る。特段指定しない限り、本明細書で使用される番号付与スキームは、Ｋａｂａｔ番号付与スキームである。ただし、番号付与スキームの選択は、差異が存在しない配列においてそれらを暗示しようとするものではなく、当業者は１つ以上の抗体のアミノ酸配列を調べることで配列位置を容易に確認することができる。特段記載しない限り、「ＥＵ番号付与スキーム」は、抗体重鎖定常領域内の残基を指す場合に一般には使用される（例えば、前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に報告されているものなど）。
「グルタミニル修飾抗体」といった用語は、グルタミン側鎖から本開示の第１級アミン化合物まで少なくとも１つの共有結合を有する抗体を指す。特定の実施形態では、第１級アミン化合物は、グルタミン側鎖上のアミド結合を介して結合される。ある特定の実施形態では、グルタミンは内因性グルタミンである。他の実施形態では、グルタミンはポリペプチド改変（例えば、ポリペプチド上でのアミノ酸の欠失、挿入、置換又は変異）によって反応性となった内因性グルタミンである。さらなる実施形態では、グルタミンは、アシル供与体グルタミン含有タグ（例えば、グルタミン含有ペプチドタグ、Ｑタグ又はＴＧａｓｅ認識タグ）で改変されたポリペプチドである。
「ＴＧａｓｅ認識タグ」といった用語は、受容体であるグルタミン残基を含むアミノ酸の配列であって、好適な条件下でポリペプチド配列へと導入（例えば、付加）される場合に、ＴＧａｓｅによって認識され、そのアミノ酸の配列内部のアミノ酸側鎖と反応パートナーとの間の反応によってＴＧａｓｅによる架橋を引き起こすアミノ酸の配列を指す。認識タグは、ＴＧａｓｅ認識タグを含むポリペプチド中に天然に存在しないペプチド配列であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＧａｓｅ認識タグは少なくとも１個のＧｌｎを含む。いくつかの実施形態では、ＴＧａｓｅ認識タグはアミノ酸配列ＸＸＱＸを含み、式中、Ｘは任意のアミノ酸（例えば、従来のアミノ酸であるＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ｈｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ若しくはＴｒｐ又は従来のものではないアミノ酸）である。いくつかの実施形態では、アシル供与体グルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号６）、ＬＬＱＧ（配列番号７）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号８）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号９）、ＧＬＬＱＧ（配列番号１０）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号１１）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号１２）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号１３）、ＧＬＬＱ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１５）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１６）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１７）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１８）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１９）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号２０）、ＳＬＬＱＧ（配列番号２１）、ＬＬＱＬＱ（配列番号２２）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号２３）及びＬＬＱＧＲ（配列番号２４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用される、国際公開第２０１２０５９８８２号を参照されたい。
「抗体」といった用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗原に特異的に結合する、又はこれと相互作用する、少なくとも１つの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子又は分子複合体を意味する。「抗体」といった用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶＨと略記する）と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。各重鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶＬと略記する）と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ、ＦＲ）と称される多くの保存領域が散在されている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域へとさらに細分化されることができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へとＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４といった順序で配置されている３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されている。異なる実施形態では、抗体のＦＲ（又はその抗原結合部分）は、ヒト生殖系列配列と同一であるか、又は天然に若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの対照解析に基づいて定義され得る。
「抗体」といった用語は、本明細書で使用される場合、完全抗体分子の抗原結合断片もまた含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などといった用語は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に取得可能である、合成の、又は遺伝子操作された任意のポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、抗体の可変ドメイン及び必要に応じて抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関与する、タンパク質消化又は組換え遺伝子操作技術などの任意の好適な標準技術を使用し、例えば完全抗体分子から誘導されることができる。かかるＤＮＡは公知であり、かつ／又は例えば商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、又は合成することができる。ＤＮＡは、化学的に又は分子生物学技術を使用することで配列決定及び操作し、例えば１つ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを好適な構成に配置するか、コドンを導入し、システイン残基を生成してアミノ酸を修飾、付加又は欠失させることができる。
抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））又は制限されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。例えばドメイン特異抗体、シングルドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ｓｍａｌｌ ｍｏｄｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＳＭＩＰ）及びサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の改変された分子もまた、本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」といった表現に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは、任意のサイズ又はアミノ酸組成のものであり得、一般には、１つ以上のフレームワーク配列に隣接している、又はインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインに関連するＶＨドメインを有する抗原結合断片では、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、任意の好適な配置で互いに対して位置づけられ得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ又はＶＬ－ＶＬ二量体を含有することができる。
あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体ＶＨドメイン又はＶＬドメインを含有することができる。
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有することができる。本明細書の抗体の抗原結合断片内で見出すことができる可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的で例示的な構成としては、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（Ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、及び（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが挙げられる。本明細書に列挙された例示的な構成のいずれかを含む、可変ドメイン及び定常ドメインのいずれかの構成では、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接結合され得るか、完全若しくは部分的ヒンジ又はリンカー領域によって結合され得る。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメイン間の可動性結合又は半可動性結合をもたらす少なくとも２個（例えば、５個、１０個、１５個、２０個、４０個、６０個以上）のアミノ酸からなり得る。
さらには、本明細書の抗体の抗原結合断片は、互いに非共有結合で会合した状態で、及び／又は１つ以上の単量体のＶＨ若しくはＶＬドメインを有する（例えば、ジスルフィド結合による）、本明細書に列挙されている可変及び定常ドメイン構成のうちのいずれかのホモ二量体若しくはヘテロ二量体（又は他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は単一特異性又は多特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多特異性抗原結合断片は、典型的には少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原又は同一の抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することが可能である。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能である日常的な技術を使用して、本明細書の抗体の抗原結合断片に関連する使用に適合され得る。
ある特定の実施形態では、例えば抗ＧＬＰ１Ｒ抗体といった本明細書の抗体はヒト抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」といった用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本明細書のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３にヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的変異原性によって、又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。ただし、本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」といった用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上へとグラフト化された抗体を含むことを意図していない。
抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される場合、「組換えヒト抗体」といった用語は、宿主細胞へとトランスフェクトされた組換え発現ベクター（以下でさらに説明される）を使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリー（以下でさらに説明される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に遺伝子導入される動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５）などの組換え手段によって調製、発現、生成若しくは単離される全てのヒト抗体、又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製、発現、生成若しくは単離された抗体を含むことを意図している。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する。ただしある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロでの変異原性（又は、ヒトＩｇ配列を遺伝子導入した動物を使用した場合には、インビボ体細胞性変異厳正）に供され、それによって組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、かつこれに関連していても、インビボでヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない場合がある。
ヒト抗体は、ヒンジの不均一性に関連する２つの形態で存在し得る。一形態では、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって共に保持されている、およそ１５０～１６０ｋＤａの安定した４本鎖構築物を含む。第２の形態では、二量体は鎖間ジスルフィド結合を介して結合されておらず、共有結合された軽鎖及び重鎖から構成された約７５～８０ｋＤａの分子（半抗体）が形成される。これらの形態は、アフィニティー精製後であったとしても分離するのが極めて困難であった。種々の無処置のＩｇＧアイソタイプでの第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域のアイソタイプに関連する構造的差異に起因するが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一アミノ酸置換は、第２の形態の出現を、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用することで典型的には観察されるレベルまで大幅に減少させることができる（Ａｎｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３０：１０５）。本明細書は、例えば製造に望ましい可能性があり、所望の抗体形態の収率を向上させることができる、ヒンジであるＣＨ２領域又はＣＨ３領域に１つ以上の変異を有する抗体を包含する。
本明細書の抗体は、単離抗体又は精製抗体であり得る。本明細書で使用される場合、「単離抗体」又は「精製抗体」は、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定かつ分離かつ／又は回収される抗体を意味する。例えば、生物のうちの少なくとも１つの成分から、又は抗体が天然に存在する、若しくは天然に産生される組織若しくは細胞から分離又は除去される抗体は、本明細書の目的のための「単離抗体」である。例えば、反応又は反応配列のうちの少なくとも１つの成分から精製された抗体は「精製抗体」であるか、又は抗体を精製することで生じる。単離抗体はまた、組換え細胞内のインサイチュでの抗体も含む。単離抗体は、少なくとも１つの精製工程又は単離工程に供された抗体である。ある特定の実施形態によれば、単離抗体又は精製抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的には含まないものであり得る。
本明細書に開示される抗体は、抗体が誘導された対応する生殖系列配列と比較すると、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域での１つ以上のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。かかる変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列と、例えば公開されている抗体配列データベースから入手された生殖系列配列とを比較することで容易に確認することができる。本明細書は、本明細書に開示されたアミノ酸配列のうちのいずれかから誘導される抗体及びその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が誘導された生殖系列配列の対応する１つ以上の残基、又は別のヒト生殖系列配列の対応する１つ以上の残基、又は対応する１つ以上の生殖系列残基のアミノ酸の同義置換へと変異される（かかる配列変化は、本明細書では集合的に「生殖系列変異」と称される）。当業者は、所与の重鎖可変領域配列及び軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個体の生殖系列変異又はそれらの組合せを含む多数の抗体及び抗原結合断片を容易に産生させることができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン内のフレームワーク残基及び／又はＣＤＲ残基の全ては、抗体が誘導された元々の生殖系列配列に見出された残基に復帰突然変異する。他の実施形態では、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内若しくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される変異残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内に見出される変異残基のみといったある特定の残基のみが、元々の生殖系列配列に復帰突然変異する。他の実施形態では、１つ以上のフレームワーク残基及び／又はＣＤＲ残基のうちの１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が元々誘導された生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の１つ以上の対応する残基に変異する。
さらには、本明細書の抗体は、フレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組合せを含有することができる。例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異するが、一方で元々の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は維持されるか、異なる生殖系列配列の対応する残基に変異する。取得されると、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体及び抗原結合断片は、例えば結合特異性の改善、結合親和性の増大、拮抗性又は刺激性生物学的特性の改善又は増強（場合による）、免疫原性の減少、抗体薬物複合体の薬物抗体比（ｄｒｕｇ－ｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒａｔｉｏ、ＤＡＲ）の改善などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な様式で取得される抗体及び抗原結合断片は、本明細書の範囲内に包含される。
「グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体」といった用語は、トランスグルタミネーション反応を阻害することがあるグリコシル化配列を含まない、例えば１つ以上の重鎖上のＮ２９７に糖基を有さない抗体などの抗体を指す。特定の実施形態では、抗体重鎖はＮ２９７変異を有する。換言すると、抗体は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．により開示されるＥＵ番号付与スキームに従い、２９７位にアスパラギン残基をもはや有さないように変異される。特定の実施形態では、抗体重鎖はＮ２９７Ｑ変異又はＮ２９７Ｄ変異を有する。かかる抗体は、グリコシル化配列を除去若しくは無効にするための部位特異的突然変異誘発、又はいずれかのグリコシル化干渉部位若しくは他の干渉構造から離れた部位にグルタミン残基を挿入するための部位特異的突然変異誘発により調製され得る。かかる抗体はまた、天然源又は人工源から単離され得る。グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体はまた、Ｔ２９９若しくはＳ２９８Ｐ若しくは他の変異、又はグリコシル化の欠如によりもたらされた変異の組合せを含む抗体も含む。
「脱グリコシル化抗体」といった用語は、トランスグルタミナーゼ媒介性結合が促進するように糖基が除去された抗体を指す。糖としては、Ｎ結合型オリゴ糖が挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、脱グリコシル化はＮ２９７残基で行われる。いくつかの実施形態では、糖基の除去はＰＮＧａｓｅを介して酵素的に達成されるものを含むがこれに限定されない。
「エピトープ」といった用語は、パラトープとして公知である抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定因子を指す。単一抗原は２つ以上のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は抗原上の異なる領域に結合することができ、異なる生物学的効果を有することができる。エピトープは構造的又は線状であり得る。構造的エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されているアミノ酸により産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖の隣接するアミノ酸残基により産生される。ある特定の状況では、エピトープは抗原上に糖基、ホスホリル基又はスルホニル基の部分を含むことができる。
「結合タンパク質」又は「結合抗体」といった用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の化学部分に共有結合されているタンパク質又は抗体を指す。化学部分は、本開示のアミン化合物を含むことができる。本開示での使用に好適なリンカー（Ｌ）及びペイロード（Ｐ）が本明細書に詳細に説明される。特定の実施形態では、治療部分を含む結合抗体は抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であり、抗体ペイロード複合体又は抗体リンカーペイロード複合体とも称される。
「薬物抗体比」又は（ＤＡＲ）といった用語は、例えば本開示の結合剤に結合する薬物といった治療部分の平均数である。
「リンカー抗体比」又は（ＬＡＲ）（小文字でも記載される）といった用語は、いくつかの実施形態では、本開示の結合剤に結合される反応性第１級アミン化合物の平均数である。例えば抗体といったかかる結合剤は、例えば好適なアジド又はアルキンを含む第１級アミン化合物と結合され得る。得られた結合剤は、アジド又はアルキンで官能化されるが、これは１，３－環化付加反応を介し、対応するアジド又はアルキンを含む治療部分と後に反応することができる。
「薬学的に許容される量」といった語句は、その必要がある対象における少なくとも１つの健康問題による効果又は症候を治療、低減、緩和又は調節する上で有効又は十分な量を指す。例えば、抗体又は抗体薬物複合体の薬学的に許容される量は、本明細書に提供される抗体又は抗体薬物複合体を使用して生物学的標的を調節するために有効な量である。好適な薬学的に許容される量としては、本明細書に提供される抗体又は抗原薬物複合体の約０．００１％～最大約１０％、及び約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％又は約１０％などの間のいずれかの量が挙げられるが、これらに限定されない。
「反応ｐＨ」といった語句は、全ての反応成分又は反応物が添加された後の反応のｐＨを指す。
「実質的な同一性」又は「実質的に同一」といった用語は、核酸又はその断片について言及する際には、別の核酸（又はその相補的ストランド）を用いての適切なヌクレオチド挿入又は欠失と適切にアラインメントした場合、以下で説明されるＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐなど、任意の周知の配列同一性のアルゴリズムにより測定した際にヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子に対して実質的な同一性を有する核酸分子は、ある特定の例では、参照核酸分子によりコードされたポリペプチドと同一又は実質的に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
ポリペプチドに適用する場合、「実質的な類似性」又は「実質的に類似」といった用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴといったプログラムにより最適にアラインメントした場合に、２つのペプチド配列が少なくとも９５％の配列同一性、よりさらに好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有していることを意味している。好ましくは、同一ではない残基位置は、アミノ酸の同義置換によって異なるものとなる。「アミノ酸の同義置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されることである。一般には、アミノ酸の同義置換はタンパク質の機能的特性を実質的に変化させることがない。２つ以上のアミノ酸配列が同義置換により互いに異なる場合では、配列同一性パーセント又は類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上方調節することができる。こうした調節を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。類似の化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン、（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン、（３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン、（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン、（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン及びヒスチジン、（６）酸性側鎖：アスパルタート及びグルタマート並びに（７）硫黄含有側鎖：システイン及びメチオニン、が挙げられる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の同義置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタマート－アスパルタート及びアスパラギン－グルタミンである。
あるいは、同義置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５に開示されているＰＡＭ２５０ ｌｏｇ－尤度行列で正の値を有する任意の変化である。「適度な同義」置換は、ＰＡＭ２５０ ｌｏｇ－尤度行列で負以外の値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、配列同一性とも称されるが、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、アミノ酸の同義置換を含む種々の置換、欠失及び他の修飾に割り当てられた類似性の基準を使用して類似する配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、例えば生物のうちの異なる種からの相同ポリペプチドといった関連性が高いポリペプチド間の、又は野生型タンパク質とその変異タンパク質間の配列相同性又は配列同一性を決定するデフォルトパラメータとして使用され得るＧａｐ及びＢｅｓｔｆｉｔなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるデフォルトの又は推奨パラメータを使用するＦＡＳＴＡを使用して比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリと検索配列との間で最良に重複する領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（前出のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。異なる生物に由来する膨大な数の配列を含有するデータベースと本明細書の配列を比較する場合の別の特定のアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するコンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２を参照されたい。
タンパク質薬物複合体化合物
前述の目的又は他の目的によれば、本開示は、例えば抗体薬物複合体化合物といったタンパク質薬物複合体化合物並びにその前駆体及びその中間体、医薬組成物と、かかる治療の必要がある対象のある特定の疾患を治療するための方法と、を提供する。本開示によれば、本明細書に提供されるタンパク質薬物複合体化合物は、本明細書に記載の例えばＧＬＰ１ペプチド模倣薬といった治療部分と結合されている結合剤を含む。
一態様では、本開示は、非切断型リンカーを介して１つ以上のＧＬＰ１ペプチド模倣薬に結合される、本開示による結合剤を含む化合物（例えば、抗体又はその断片）を提供する。例示的な非限定的例としては、本明細書に記載の式（Ｉ）が挙げられる。本開示によるタンパク質薬物複合体の特定の実施形態では、結合剤は抗体（例えば、モノクローナル抗体）であり、「抗体薬物複合体」又はＡＤＣといった用語が必要に応じて使用される。
種々の実施形態では、本開示の抗体薬物複合体又はＡＤＣは、抗体結合薬物複合体又はＡＴＤＣである。ＡＴＤＣは抗体薬物複合体であり、薬物は非切断型リンカーによって抗体に結合されている。いくつかの実施形態では、本開示のＡＴＤＣの非切断型リンカーは、ＡＴＤＣが体内（例えば、ヒトの体）に投与された後に安定している。例えば、非切断型リンカーは、血漿（例えば、ヒト血漿）内で安定することができ、細胞表面への結合時に安定することができ、抗体がその標的抗原に結合する際及び／若しくはＧＬＰ１ペプチド模倣薬がＧＬＰ１Ｒに結合する際に安定することができる。いくつかの実施形態では、非切断型リンカーは、同一の生理学的条件下ではペイロード又は抗体のいずれかよりもインビボでは安定している。いくつかの実施形態では、本開示のＡＴＤＣはリソソームで分解されてペイロード、リンカーペイロード、及び／又はそのＡＴＤＣ代謝物／異化生成物を放出してもよく、これらはある特定の実施形態では、局所的又は全身的にＧＬＰ１Ｒ活性化にとって有効である。
いくつかの実施形態では、ＡＴＤＣは血漿中で安定し、リソソームで分解する。いくつかの実施形態では、ＡＴＤＣは血漿中で安定し、リソソームで分解しない。
一態様では、式（Ａ）
ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）、
の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
ＢＡは、抗体又はその抗原結合断片であり、
Ｌは、非切断型リンカーであり、
Ｐは、
からなる群から選択される構造を有するペイロードであって、
式中、
はペイロードがＬに結合する箇所であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、結合、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨであって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、結合、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨから選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択され、
Ａｒは、
から選択され、
Ｘ９は、－ＮＨ２、
から選択され、
ｍは、１～４の整数である、ペイロードである、化合物又は薬学的に許容されるその塩が本明細書に提供される。
一実施形態では、ｍは１である。一実施形態では、ｍは２～４の整数である。一実施形態では、ｍは２である。
一態様では、本開示は、式（Ｉ）
ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）、
の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
ＢＡは、抗体又はその抗原結合断片であり、
Ｌは、非切断型リンカーであり、
Ｐは、
からなる群から選択される構造を有するペイロードであって、
式中、
はペイロードがＬに結合する箇所であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、ペイロードである、化合物又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
リンカーＬ
一実施形態では、本開示によるリンカーＬは、非切断型リンカー、すなわち安定しており、抗体と薬物の間、例えばＧＬＰ１Ｒ標的抗体とＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰとの間に共有結合を提供するリンカーである。いくつかの実施形態では、本開示の非切断型リンカーＬは、ＡＴＤＣが体内（例えば、ヒトの体）に投与された後に安定している。例えば、リンカーＬは、血漿（例えば、ヒト血漿）内で安定することができ、細胞表面への結合時に安定することができ、抗体がその標的抗原に結合する際及び／若しくはＧＬＰ１ペプチド模倣薬がＧＬＰ１Ｒに結合する際に安定することができる。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、同一の生理学的条件下ではペイロード又は抗体のいずれかよりもインビボでは安定している。
一実施形態では、リンカーＬは式（Ｌ’）
－Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ （Ｌ’）、
の構造であって、式中、Ｌａは、抗体又はこその抗原結合断片に共有結合された第１のリンカーであり、
Ｙは、トリアゾール、ディールス・アルダー付加物、又はチオール－マレイミド付加物を含む基であり、
Ｌｐは、存在しない、又は本開示によるペイロードＰに共有結合された第２のリンカーであり、Ｌｐが存在しないときにはＹもまた存在しない、構造を有する。
一実施形態では、Ｙはトリアゾールを含む基である。
別の実施形態では、Ｙはディールス・アルダー付加物を含む基である。
一実施形態では、リンカーＬは式（Ｌ’）
－Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ （Ｌ’）、
の構造であって、式中、Ｌａは、抗体又はその抗原結合断片に共有結合された第１のリンカーであり、
Ｙは、トリアゾールを含む基であり、
Ｌｐは、存在しない、又は本開示によるペイロードＰに共有結合された第２のリンカーである、構造を有する。
一実施形態では、Ｌａは、Ｃ１－６アルキル、フェニル、－ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｕ－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｕ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｖ－、－（ＣＨ２）ｕ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｖ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、２個～４個のアミノ酸を含むペプチド単位、又はそれらの組合せを含み、これらのそれぞれが、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ２）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ２）－及びＣＯ２Ｈのうちの１つ以上で必要に応じて置換されてもよく、式中、下に付いているｕ及びｖが独立して１～８の整数である。
一実施形態では、Ｌａは、
であって、式中、ＲＡは、アルキン、アジド、テトラジン、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン、マレイミド、アミン、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、チオール、スルホン酸、トシラート、ハロゲン化物、シラン、シアノ基、炭水化物基、ビオチン基、脂質残留物を含む基であり、式中、下に付いているｘ、ｎ、ｐ及びｑは独立して０～１２の整数であるもの、並びにこれらの組合せからなる群から選択される。
一実施形態では、－Ｌａ－は、
からなる群から選択され、
式中、
は抗体及び／又はその抗原含有断片の残基（例えば、グルタミン残基）にアミノが結合する箇所である。
一実施形態では、－Ｌａ－は、
である。
別の実施形態では、－Ｌａ－は、
からなる群から選択され、
式中、
は抗体及び／又はその抗原含有断片の残基（例えば、グルタミン残基）にアミノが結合する箇所である。
いくつかの実施形態では、Ｌａは、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは４個のＥＧ単位、又は８個のＥＧ単位、又は１２個のＥＧ単位、又は２４個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧセグメントは８個のＥＧ単位を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは、
からなる群から選択される構造を有する。
いくつかの実施形態では、Ｌａは、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは１～１０個のグリシンと、１～６個のセリンと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは４個のグリシンと、１個のセリンと、を含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）（配列番号１）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＧ４）（配列番号２）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（Ｇ２Ｓ－Ｇ２Ｓ－Ｇ２）及びＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（Ｇ４Ｓ－Ｇ４）（配列番号３）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｌａは、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む。いくつかの実施形態では、Ｌａは、
からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、Ｌａは－（ＣＨ２）２－２４－鎖を含む。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、Ｌａは、－（ＣＨ２）２－２４－鎖と、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む。Ｌａは、
からなる群から選択される。
一実施形態では、Ｙは、
からなる群から選択される構造であって、式中、Ｑは、Ｃ又はＮである、構造を有する。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを含む。
一実施形態では、ＰＥＧセグメントは２～３０個のＥＧ単位又は４～２４個のＥＧ単位を含む。一実施形態では、ＰＥＧセグメントは２個のＥＧ単位、又は４個のＥＧ単位、又は６個のＥＧ単位、又は８個のＥＧ単位、又は１０個のＥＧ単位、又は１２個のＥＧ単位、又は１４個のＥＧ単位、又は１６個のＥＧ単位、又は１８個のＥＧ単位、又は２０個のＥＧ単位、又は２２個のＥＧ単位、又は２４個のＥＧ単位を含む。
一実施形態では、ＰＥＧセグメントは４個のＥＧ単位を含む。一実施形態では、ＰＥＧセグメントは８個のＥＧ単位を含む。一実施形態では、ＰＥＧセグメントは１２個のＥＧ単位を含む。一実施形態では、ＰＥＧセグメントは２４個のＥＧ単位を含む。
一実施形態では、ＰＥＧセグメントは４～８個のＥＧ単位を含む。一実施形態では、ＰＥＧセグメントは４個のＥＧ単位又は８個のＥＧ単位を含む。
一実施形態では、Ｌａは３個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントを含む。
一実施形態では、Ｌｐは４個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントを含む。一実施形態では、Ｌｐは８個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントを含む。
一実施形態では、Ｙ－Ｌｐは、
からなる群から選択される構造であって、
式中、ｐは１～３６の整数である、構造を有する。
一実施形態では、Ｙ－Ｌｐは、
又はそのトリアゾール位置異性体からなる群から選択される構造であって、
式中、ｐは１～３６の整数である、構造を有する。
別の実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸を含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～１０個のグリシン、又は２個のグリシン、又は３個のグリシン、又は４個のグリシン、又は５個のグリシン、又は６個のグリシン、又は７個のグリシン、又は８個のグリシン、又は９個のグリシン、又は１０個のグリシンを含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～６個のセリン、又は１個のセリン、又は２個のセリン、又は３個のセリン、又は４個のセリン、又は５個のセリン、又は６個のセリンを含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～１０個のグリシンと、１～６個のセリンと、を含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、４個のグリシンと、１個のセリンと、を含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）（配列番号１）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＧ４）（配列番号２）及びＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ－Ｇ４Ｓ）（配列番号３）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、１個以上のセリン残基は例えばグルコース基などの炭水化物基を含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～１０個のグルタミン酸及び１～１０個のグリシンを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントとグリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、１～１０個のグリシンと、の組合せを含む。一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）（配列番号１）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＧ４）（配列番号２）及びＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ－Ｇ４Ｓ）（配列番号３）から選択される群との組合せを含む。
一実施形態では、リンカーＬ又は第１のリンカーＬａ又は第２のリンカーＬｐは、
からなる群から選択される構造であって、
式中、Ｙは、例えば上に示されるように、トリアゾールを含む基であり、Ｐはペイロードであり、式中、Ｒｃは水素（Ｈ）及びグルコースから選択され、ｇは１～１０の整数であり、ｓは０～４の整数である、構造を有する。
一実施形態では、Ｙ－Ｌｐは、
からなる群から選択される構造を有する。
一実施形態では、リンカーＬはシクロデキストリン部分を含む。
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、グルタミン残基を介して、抗体又はその抗原結合断片に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、リジン残基を介して、抗体又はその抗原結合断片に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、システイン残基を介して、抗体又はその抗原結合断片に結合される。
ペイロードＰ
一態様では、本開示によるペイロードＰは、式（Ｐ－ＩＢ）、式（Ｐ－ＩＩＢ）及び式（Ｐ－ＩＩＩＢ）
からなる群から選択される式の構造であって、式中、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択され、
Ａｒは、
から選択され、
Ｘ９は、－ＮＨ２、
から選択され、
ｍは、１～４の整数である、式の構造又は薬学的に許容されるその塩を有する。
一実施形態では、本開示によるペイロードＰは、式（ＩＩ）
の構造であって、
式中、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－ＣＨ３から選択されるが、Ｘ３が－ＣＨ３といった条件では、ｎは１であり、少なくとも１個の発生においてＲａが－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
ｎは、０又は１であり、
ｍは、０～３の整数であり、
Ｒａは、各発生時に独立して－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、構造並びに薬学的に許容されるその塩を有する。
一実施形態では、ペイロードＰは、
から選択される構造であって、式中、
がリンカーに結合する箇所を示す、構造を有する。
一実施形態では、ペイロードは、上に示す式（Ｐ－Ｉ）の構造であって、式中、
・Ｘ１は、Ｈであり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、ｎは１であり、Ｘ４はＨである、
・Ｘ１は、
であり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択される、
・Ｘ１は、
であり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである、
・Ｘ１は、
であり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は、各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、Ｘ７はＨである、
・Ｘ１は、
であり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は
である、
・Ｘ１は、
であり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は、各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７は
であり、Ｘ８は－ＮＨ２である、
・Ｘ１は、
であり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ８はＨである、
・Ｘ１は、
であり、Ｘ２は、
であり、Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は、各発生時にはＨであり、Ｘ７は
であり、Ｘ８はＨである、
・Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７は
であり、Ｘ８は
である、
・Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである、
・Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである、
・Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ６は各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７は
である、
・Ｘ１はＨであり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨである、
・Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は
である、
・Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは０であり、Ｘ４はフェニルであり、Ｘ５は
である
・Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎは１であり、Ｘ４はフェニルであり、Ｘ５は
である、構造を有する。
一実施形態では、ペイロードは、上に示す式（Ｐ－ＩＩ）の構造であって、式中、Ｘ１は
であり、Ｘ２は
であり、Ｘ３は－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、Ｘ４はＨであり、Ｘ５は
である、構造を有する。
一実施形態では、本開示によるペイロードＰは、
から選択される構造を有する。
一実施形態では、上記のペイロードは以下の特性：
いくつかの実施形態では、本開示のペイロードは、結合剤（例えば、抗体）との結合に適している。
リンカーペイロード（Ｌ－Ｐ）
一実施形態では、本開示は、上記のペイロードＰと、抗体又はその抗原結合断片に共有結合可能なリンカーと、を含む、反応性リンカーペイロードを提供する。
一実施形態では、本開示によるリンカーペイロードは、式（Ｃ）：
の構造であって、式中、
Ｌｐは、存在しない、又は
、カルバマート基、シクロデキストリン、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメント、－（ＣＨ２）２－２４－鎖、トリアゾール、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリンから選択される１つ以上のアミノ酸並びにそれらの組合せ、のうちの１つ以上を含むリンカーであり、
Ｑは、－ＮＨ２、－Ｎ３、
から選択され、式中、ＡがＣ又はＮである、部分であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択され、
Ａｒは、
から選択され、
Ｘ９は、－ＮＨ２、
から選択され、
ｍは、１～４の整数である、構造又は薬学的に許容されるその塩を有する。
一実施形態では、本開示によるリンカーペイロードは、式（ＩＩＩ）
の構造であって、式中、
Ｌｐは、存在しない、又は
、カルバマート基、シクロデキストリン、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメント、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリンから選択される１つ以上のアミノ酸並びにそれらの組合せ、のうちの１つ以上を含むリンカーであり、
Ｑは、－Ｎ３、
から選択され、式中、ＡはＣ又はＮである、部分であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－ＣＨ３から選択されるが、Ｘ３が－ＣＨ３といった条件では、ｎは１であり、少なくとも１個の発生においてＲａが－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２－、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｒａは、各発生時に独立してＨ、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、
構造並びに薬学的に許容されるその塩を有する。
一実施形態では、リンカーペイロードＬＰはシクロデキストリン部分を含む。いくつかの実施形態では、シクロデキストリン部分を含むリンカーペイロードＬＰはＧＬＰ１Ｒアゴニズム活性を呈する。
一実施形態では、本開示によるリンカーペイロードＬＰは、
、からなる群から選択される構造を有する。
一実施形態では、上記のリンカーペイロードは、以下の特性：
を有する。
結合剤
一実施形態では、本明細書に記載のタンパク質薬物複合体実施形態の有効性は、その結合パートナーに結合する結合剤の選択性に依存する。本開示の一実施形態では、結合剤は、いくらかの特異性を有した状態で所与の結合パートナーに結合可能な任意の分子である。一実施形態では、結合剤は哺乳動物内に存在し、相互作用によって治療的使用がもたらされ得る。代替的な実施形態では、結合剤はインビトロであり、その相互作用によって診断用途がもたらされ得る。いくつかの態様では、結合剤は細胞又は細胞集団に結合可能である。
本開示の好適な結合剤としては、結合パートナーに結合するタンパク質が挙げられる。好適な結合剤としては、抗体、リンホカイン、ホルモン、成長因子、ウイルス受容体、インターロイキン又は他の細胞結合若しくはペプチド結合分子若しくは物質が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、結合剤は抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリボディなど）から選択される。本明細書の抗体は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている、米国特許第６，５９６，５４１号及び米国特許出願公開第２０１２／００９６５７２号に記載の方法を使用してヒト化され得る。本開示のタンパク質薬物複合体化合物のある特定の実施形態では、ＢＡはヒト化モノクローナル抗体である。例えば、ＢＡはＧＬＰ１Ｒに結合するモノクローナル抗体であり得る。
本開示では、抗体は、当業者に好適であると考えられる任意の抗体であり得る。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の重鎖に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の重鎖可変ドメインに結合される。
いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の重鎖可変ドメインのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の両方の重鎖可変ドメインのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の軽鎖に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の軽鎖可変ドメインに結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の軽鎖可変ドメインのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の両方の軽鎖可変ドメインのＮ末端に結合される。
いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の重鎖可変ドメインのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の両方の重鎖可変ドメインのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の軽鎖に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の軽鎖可変ドメインに結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の一方又は両方の軽鎖可変ドメインのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、リンカー又はリンカーペイロードは、抗体又はその抗原結合断片の両方の軽鎖可変ドメインのＣ末端に結合される。
いくつかの実施形態では、抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖配列中に少なくとも１つのグルタミン残基を含む。ある特定の実施形態では、抗体は１つ以上のＧｌｎ２９５残基を含む。ある特定の実施形態では、抗体はそれぞれが１つのＧｌｎ２９５残基を有する２つの重鎖ポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、抗体は、重鎖２９５以外の部位に１つ以上のグルタミン残基を含む。かかる抗体は、１つ以上のグルタミン残基を含むように天然源から単離され得るか、遺伝子改変され得る。グルタミン残基を抗体ポリペプチド鎖に遺伝子操作するための技術は、当業者の技能の範囲内である。ある特定の実施形態では、グルタミン残基は抗体ポリペプチド鎖のＮ末端に導入される。一実施形態では、グルタミン残基は、抗体の一方又は両方の重鎖のＮ末端に導入される。一実施形態では、グルタミン残基は、抗体の両方の重鎖のＮ末端に導入される。別の実施形態では、グルタミン残基は、抗体の一方又は両方の軽鎖のＮ末端に導入される。一実施形態では、グルタミン残基は、抗体の両方の軽鎖のＮ末端に導入される。別の実施形態では、グルタミン残基は、抗体の一方又は両方の重鎖及び一方又は両方の軽鎖のＮ末端に導入される。
ある特定の実施形態では、グルタミン残基は抗体ポリペプチド鎖のＣ末端に導入される。一実施形態では、グルタミン残基は、抗体の一方又は両方の重鎖のＣ末端に導入される。一実施形態では、グルタミン残基は、抗体の両方の重鎖のＣ末端に導入される。別の実施形態では、グルタミン残基は、抗体の一方又は両方の軽鎖のＣ末端に導入される。一実施形態では、グルタミン残基は、抗体の両方の軽鎖のＣ末端に導入される。別の実施形態では、グルタミン残基は、抗体の一方又は両方の重鎖及び一方又は両方の軽鎖のＣ末端に導入される。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＴＧａｓｅ認識タグを含むように修飾されている。好適なＴＧａｓｅ認識タグは、本明細書に記載のものを含む。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、一方又は両方の抗体軽鎖のＮ末端にＱタグを含むように修飾されている。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、両方の抗体軽鎖のＮ末端にＱタグを含むように修飾されている。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、一方又は両方の抗体重鎖のＮ末端にＱタグを含むように修飾されている。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、両方の抗体重鎖のＮ末端にＱタグを含むように修飾されている。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、一方又は両方の抗体軽鎖のＣ末端にＱタグを含むように修飾されている。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、両方の抗体軽鎖のＣ末端にＱタグを含むように修飾されている。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、一方又は両方の抗体重鎖のＣ末端にＱタグを含むように修飾されている。ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、両方の抗体重鎖のＣ末端にＱタグを含むように修飾されている。
ある特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片はグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。ある特定の実施形態では、抗体抗原結合断片は脱グリコシル化されている。ある特定の実施形態では、抗体抗原結合断片はＦａｂ断片である。
抗体は、当業者に公知の任意の形態であり得る。ある特定の実施形態では、抗体は軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体はκ軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗体はλ軽鎖を含む。
ある特定の実施形態では、抗体は重鎖を含む。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＡである。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＤである。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＥである。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＧである。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＭである。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＧ１である。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＧ２である。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＧ３である。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＧ４である。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＡ１である。いくつかの態様では、重鎖はＩｇＡ２である。
いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片である。いくつかの態様では、抗体断片はＦｖ断片である。いくつかの態様では、抗体断片はＦａｂ断片である。いくつかの態様では、抗体断片はＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの態様では、抗体断片はＦａｂ’断片である。いくつかの態様では、抗体断片はｓｃＦｖ（ｓＦｖ）断片である。いくつかの態様では、抗体断片はｓｃＦｖ－Ｆｃ断片である。
いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。
抗体は、当業者に好適であると考えられる任意の抗原への結合特異性を有することができる。ある特定の実施形態では、抗原は膜貫通分子（例えば、受容体）又は成長因子である。例示的な抗原としては、ＧＬＰ１Ｒなどの分子が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書のいくつかの実施形態は、治療用途又は診断用途にとって標的特異的である。
いくつかの実施形態では、結合剤は抗グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、すなわち抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、結合剤は抗ＧＬＰ１Ｒアゴニスト抗体又はその抗原結合断片である。
いくつかの実施形態では、好適な抗ＧＬＰ１Ｒ抗体は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている米国特許出願公開番号２００６０２７５２８８号に開示されたものである。本開示による例示的な抗ＧＬＰ１Ｒ抗体は、５Ａ１０及び９Ａ１０を含む。
いくつかの実施形態では、好適な抗ＧＬＰ１Ｒ抗体としては、ＡＢ９４３３－Ｉ、ｈ３８Ｃ２、ＰＡ５－１１１８３４、ＮＬＳ１２０５、ＭＡＢ２８１４、ＥＰＲ２１８１９及びグルタズマブが挙げられるがこれらに限定されない。
本開示はまた、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はその一部分をコードする核酸分子も提供する。抗ＧＬＰ１Ｒ抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することが可能である組換え発現ベクターもまた、本開示の範囲内に含まれる。例えば、本開示は上述の核酸分子のうちのいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。かかるベクターが導入される宿主細胞、並びに抗体又は抗体断片の産生が可能である条件下で宿主細胞を培養することで抗体又はその一部分を産生し、産生した抗体及び抗体断片を回収する方法が、本開示の範囲内にさらに含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示は修飾グリコシル化パターンを有する抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を含む。いくつかの実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾が有用であり得る。これはすなわち、例えば抗体依存性細胞傷害作用（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）機能を増大させるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠いている抗体である（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の用途では、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を修飾するために行われ得る。
別の態様では、本開示は、ＧＬＰ１Ｒ及び薬学的に許容される担体に特異的に結合する組換えヒト抗体又はその断片を含む医薬組成物を提供する。関連する態様では、本開示は、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体と第２の治療薬との組合せである組成物を含む。一実施形態では、第２の治療薬は、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体と有利には組み合わせられる任意の薬剤である。本開示の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を含む、さらなる併用療法及び合剤は本明細書の他の箇所で開示されている。
別の態様では、本開示は、本開示の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を使用してＧＬＰ１Ｒを発現する細胞を標的化する治療方法を提供する。この治療方法は、本開示の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を含む医薬組成物の治療有効量を、その必要がある対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は膵臓細胞、脳細胞、心臓細胞、血管組織細胞、腎細胞、脂肪組織細胞、肝臓細胞又は筋細胞である。一実施形態では、細胞は膵臓細胞又は脳細胞である。
いくつかの場合では、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体（又はその抗原結合断片）は、細胞内でＧＬＰ１Ｒ活性を増強させるために使用され得る。
本開示は、ＧＬＰ１Ｒ発現細胞に関連する疾患又は障害（例えば、２型糖尿病及び／又は肥満）を治療するための薬物の製造における本開示の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体の使用もまた含む。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又は抗原結合断片を含む化合物に関する。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む化合物に関する。
さらに別の態様では、本開示は、例えばイメージング試薬などの診断用途のための単一特異性抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を提供する。
本開示は、ヒトＧＬＰ１Ｒへの結合について、本明細書に記載の抗体と競合する抗体又は抗原結合断片をさらに含む。
本開示は、本明細書に記載の抗体と同一のヒトＧＬＰ１Ｒ上のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片をさらに含む。
一態様では、本開示は、上記の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はその抗原結合断片及び治療薬（例えば、ＧＬＰ１ペプチド模倣薬）を含む抗体薬物複合体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片及びペイロードは、上に説明されるように、リンカーを介して共有結合される。種々の実施形態では、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又は抗原結合断片は、本明細書に記載の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又は断片のうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は血漿中で安定している。血漿安定性は、以下の実施例８．２又は実施例１０に記載のものなどのインビトロ又はインビボ血漿安定性アッセイを使用して決定されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、血漿中での半減期は、４日間よりも長い、５日間よりも長い、６日間よりも長い、７日間よりも長い、８日間よりも長い、９日間よりも長い、１０日間よりも長い、１１日間よりも長い、１２日間よりも長い、１３日間よりも長い、２週間よりも長い、３週間よりも長い、４週間よりも長い、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、５～１０日間、８～１２日間、１０～１５日間、１２～１８日間、１５～２０日間、２０～３０日間、１～２週間、２～３週間、３～４週間、４～６週間、５～８週間、６～１０週間、１～２ヶ月、１．５～３ヶ月、２～４ヶ月、２．５ヶ月～５ヶ月、３～６ヶ月又は４～６ヶ月間である。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、他のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）よりも少なくとも１０倍大きい親和性でＧＬＰ１Ｒに結合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、他のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）よりも少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍大きい親和性でＧＬＰ１Ｒに結合する。いくつかの実施形態では、かかる抗体薬物複合体は、ＧＬＰ１Ｒ以外でＧＰＣＲに対して本質的に検出不可能である結合を呈する。標的分子に対する抗体薬物複合体の結合は、ルシフェラーゼレポーターアッセイ、表面プラズモン共鳴法、酵素結合免疫吸着検定法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ解析又はウェスタンブロットアッセイなど、当該関連技術分野に利用可能である標準的な結合アッセイを使用して測定され得る。ＧＬＰ１Ｒ以外のＧＰＣＲの例としては、ＧＩＰＲ、ＧＬＰ２Ｒ及びＧＣＧＲが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、リンカーペイロードと結合した抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はその抗原結合断片を含み、リンカーペイロードは、軽鎖のＮ末端で抗体又はその抗原結合断片に結合される。一実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、リンカーペイロードと軽鎖のＮ末端で結合されている抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はその抗原結合断片を含み、ペイロードは以下の構造：
を有する。
ある特定の実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、２つのリンカーペイロードと結合した抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はその抗原結合断片を含み、各リンカーペイロードは、軽鎖のＮ末端で抗体又はその抗原結合断片に結合される。一実施形態では、本開示の抗体薬物複合体は、各抗体ごとに合計２つのリンカーペイロードのリンカーペイロードと軽鎖のＮ末端で結合されている抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はその抗原結合断片を含み、ペイロードは以下の構造：
を有する。
さらに別の態様では、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片と、構造：
を有するペイロードであって、
式中、
は、抗体又はその抗原結合断片に直接的に、又はリンカーを介して、ペイロードが結合する箇所である、ペイロードとを含む抗体薬物複合体が本明細書に提供される。
一実施形態では、ペイロードは、構造：
を有する。
さらに別の態様では、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片と、構造：
を有するリンカーペイロードであって、
式中、
は、抗体又はその抗原結合断片にリンカーペイロードが結合する箇所である、リンカーペイロードとを含む抗体薬物複合体が本明細書に提供される。
一実施形態では、リンカーペイロードは、構造：
を有する。
抗体結合
抗体又は抗原結合断片の残基に結合するための技術及びリンカーは、当該技術分野で公知である。本開示の状況で使用され得る例示的なアミノ酸結合は、例えば、リジン（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；米国特許出願第２０１０／０１２９３１４号；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２００８，１９：３５８－３６１；国際公開第２００５／０８９８０８号；米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許出願第２０１３／０１０１５４６号；及び米国特許出願第２０１２／０５８５５９２号を参照されたい）、システイン（例えば、米国特許出願第２００７／０２５８９８７号；国際公開第２０１３／０５５９９３号；国際公開第２０１３／０５５９９０号；国際公開第２０１３／０５３８７３号；国際公開第２０１３／０５３８７２号：国際公開第２０１１／１３０５９８号；米国特許出願第２０１３／０１０１５４６号；及び米国特許第７，７５０，１１６号を参照されたい）、セレノシステイン（例えば、国際公開第２００８／１２２０３９号；及びＨｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２００８，１０５：１２４５１－１２４５６を参照されたい）、ホルミルグリシン（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００７，３：３２１－３２２；Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，２０１３，１１０：４６－５１，及びＲａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１２，１０：１０５２－１０６７を参照されたい）、非天然アミノ酸（例えば、国際公開第２０１３／０６８８７４号及び国際公開第２０１２／１６６５５９号を参照されたい）並びに酸性アミノ酸（例えば、国際公開第２０１２／０５９８２号を参照されたい）である。リジン結合はまた、ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）を介して行うことができる。リンカーはまた、チオール間に炭素架橋を形成することで、切断型鎖間ジスルフィド結合のシステイン残基を含むシステイン残基に結合され得る（例えば、米国特許第９，９５１，１４１号及び米国特許第９，９５０，０７６号を参照されたい）。リンカーはまた、炭水化物への結合（例えば、米国特許出願第２００８／０３０５４９７号、国際公開第２０１４／０６５６６１号及びＲｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ＆Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１，１３：１２７－１３０を参照されたい）並びにジスルフィドリンカー（例えば、国際公開第２０１３／０８５９２５号、国際公開第２０１０／０１０３２４号、国際公開第２０１１／０１８６１１号及びＳｈａｕｎａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００６，２：３１２－３１３を参照されたい）を介して抗原結合タンパク質に結合され得る。部位特異的結合技術もまた、抗体又は抗原結合タンパク質の特定の残基への結合を指示するために利用され得る（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１６）３６（Ｓｕｐｐｌ １）：１００を参照されたい）。以下により詳細に説明される特定の実施形態では、部位特異的結合技術は、トランスグルタミナーゼを介したグルタミン結合を含む（例えば、Ｓｃｈｉｂｌｉ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒ Ｅｄ．２０１０，４９，９９９５を参照されたい）。
リジン及び／又はシステインにより、例えばマレイミド又はアミド結合を介して結合される、本開示によるペイロードは、本開示の範囲内に含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質薬物複合体は、二段階プロセスにより産生される。工程１は、例えばＮＨＳ－エステルリンカーといったリジンベースのリンカー結合であり、工程２は、ペイロード結合反応（例えば、１，３－環化付加反応）である。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質薬物複合体は、二段階プロセスにより産生される。工程１は、例えばマレイミドエステルリンカーといったシステインベースのリンカー結合であり、工程２は、ペイロード結合反応（例えば、１，３－環化付加反応）である。
いくつかの実施形態では、本開示のタンパク質薬物複合体は、二段階プロセスにより産生される。工程１は、トランスグルタミナーゼ介在部位特異性結合であり、工程２は、ペイロード結合反応（例えば、１，３－環化付加反応）である。
工程１：トランスグルタミナーゼ媒介性部位特異的結合
いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、抗体）は、公知の方法に従って修飾され、グルタミニル修飾タンパク質を提供する。抗体と第１級アミン化合物とを結合するための技術は、当該技術分野で公知である。部位特異的結合技術は、トランスグルタミナーゼを介したグルタミン結合を使用してグルタミンへの結合を指示するために本明細書で利用される（例えば、Ｓｃｈｉｂｌｉ，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒ Ｅｄ．２０１０，４９，９９９５を参照されたい）。
本開示の第１級アミンを含む化合物（例えば、リンカーＬａ）は、トランスグルタミナーゼベースの化学酵素的結合を介し、結合剤（例えば、タンパク質、例えば、抗体、例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体）の１つ以上のグルタミン残基に結合することができる（例えば、Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１４，２５，５６９－５７８及び国際公開第２０１７／１４７５４２号を参照されたい）。例えば、トランスグルタミナーゼの存在下では、抗体の１個以上のグルタミン残基は、第１級アミンリンカー化合物に結合され得る。簡潔には、いくつかの実施形態では、グルタミン残基（例えば、Ｇｌｎ２９５、すなわち、Ｑ２９５残基）を有する結合剤は、酵素であるトランスグルタミナーゼの存在下で第１級アミン含有リンカーＬａで処理される。ある特定の実施形態では、結合剤はグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。ある特定の実施形態では、結合剤は脱グリコシル化されている。
ある特定の実施形態では、結合剤（例えば、タンパク質、例えば、抗体）は少なくとも１つのポリペプチド鎖配列中に少なくとも１つのグルタミン残基を含む。ある特定の実施形態では、結合剤はそれぞれが１つのＧｌｎ２９５残基を有する２つの重鎖ポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、結合剤は、重鎖２９５以外の部位に１つ以上のグルタミン残基を含む。
いくつかの実施形態では、抗体などの結合剤は、無効な抗体機能又は結合を引き起こすことなく部位にグルタミン残基を挿入するために、部位特異的突然変異誘発によって調製され得る。例えば、本明細書に記載の１つ以上のＡｓｎ２９７Ｇｌｎ（Ｎ２９７Ｑ）変異を有する抗体が本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｇｌｎ２９５残基及び／又はＮ２９７Ｑ変異を有する抗体は、それらの可変領域に、１つ以上のさらなる天然に存在するグルタミン残基を含有する。これらは、トランスグルタミナーゼに接近可能であり得、それによってリンカー又はリンカーペイロードへの結合が可能である。例示的な天然に存在するグルタミン残基は、例えば軽鎖のＱ５５に見ることができる。かかる例では、トランスグルタミナーゼを介して結合される結合剤（例えば、抗体）は、予想されるＬＡＲ値よりも高いＬＡＲ値を有し得る（例えば、４超のＬＡＲ）。かかる任意の抗体は、天然源又は人工源から単離され得る。
工程２：ペイロード結合反応
ある特定の実施形態では、本開示によるリンカーＬａは、トランスグルタミネーション後にさらに反応可能である少なくとも１つの第１の反応基を含む。これらの実施形態では、グルタミニル修飾タンパク質（例えば、抗体）は、反応性ペイロード化合物Ｐ又は反応性リンカーペイロード化合物（例えば、本明細書に開示されるＬｐ－Ｐ）とさらに反応してタンパク質ペイロード複合体を形成可能である。より詳細には、反応性リンカーペイロード化合物Ｌｐ－Ｐは、リンカーＬａの第１の反応基と反応することが可能である第２の反応基を含むことができる。ある特定の実施形態では、本開示による第１の反応基又は第２の反応基は、１，３－環化付加反応を受けることが可能な部分を含む。ある特定の実施形態では、反応基はアジドである。ある特定の実施形態では、反応基はアルキン（例えば、末端アルキン又は内部に歪みを有するアルキン）を含む。本開示のある特定の実施形態では、反応基は結合剤及びトランスグルタミネーション反応条件に適合する。
本開示のある特定の実施形態では、リンカーＬａ分子は第１の反応基を含む。本開示のある特定の実施形態では、リンカーＬａ分子は２つ以上の反応基を含む。
ある特定の実施形態では、反応性リンカーペイロードＬｐ－Ｐは１つのペイロード分子（ｎ＝１）を含む。ある特定の他の実施形態では、反応性リンカーペイロードＬｐ－Ｐは、２つ以上のペイロード分子（ｎ≧２）を含む。
本開示のある特定の実施形態では、抗体あたり、薬物抗体比又はＤＡＲは、約１～約３０、又は約１～約２４、又は約１～約２０、又は約１～約１６、約１～約１２、約１～約１０、又は約１～約８、又は約１、２、３、４、５、６、７若しくは８つのペイロード分子である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは１～３０である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは１～１６である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは１～８である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは１～６である。ある特定の実施形態では、ＤＡＲは２～４である。いくつかの場合では、ＤＡＲは２～３である。ある特定の場合では、ＤＡＲは０．５～３．５である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは約１、又は約１．５、又は約２、又は約２．５、又は約３、又は約３．５である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは２である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは４である。いくつかの実施形態では、ＤＡＲは８である。
一態様では、本開示は、式（Ａ）
ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）、
の構造を有する化合物を作製する方法であって、方法は、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくともｍ個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、少なくともｍ当量の化合物Ｌ－Ｐとを接触させる工程と、
ｂ）作製された式（Ａ）の化合物を単離する工程と、を含む、方法を提供する。
一態様では、本開示は、式（Ａ）
ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）、
の構造を有する化合物であって、式中、リンカーＬは、式（Ｌ’）
－Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）、の構造であって、
式中、Ｌａは、ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
Ｙは、トリアゾールを含む基であり、
Ｌｐは、Ｐに共有結合された第２のリンカーである、構造を有する、化合物を作製する方法であって、
方法が、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくともｍ個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、アジド又はアルキン部分を含む第１のリンカーＬａとを接触させる工程と、
ｂ）工程ａ）の生成物と、少なくともｍ当量の化合物Ｌｐ－Ｐとを接触させる工程であって、第２のリンカーＬｐはアジド又はアルキン部分を含み、Ｌａ及びＬｐは反応してトリアゾールを作製することが可能である、工程と、
ｃ）作製された式（Ａ）の化合物を単離する工程と、を含む、方法を提供する。
一態様では、本開示は、式（Ｉ）
ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）、
の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩を作製する方法であって、方法が、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも１個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、化合物Ｌ－Ｐとを接触させる工程と、
ｂ）作製された式（Ｉ）の化合物を単離する工程と、を含む、方法を提供し、
式中、ＢＡは、抗体又はその抗原結合断片であり、
Ｌは、非切断型リンカーであり、
Ｐは、
からなる群から選択される構造を有するペイロードであって、
式中、
はペイロードがＬに結合する箇所であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、ペイロードである、
方法を提供する。
別の態様では、本開示は、式（Ｉ）
ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）、
による構造を有する化合物であって、式中、リンカーＬは、式（Ｌ’）
－Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）、の構造であって、
式中、Ｌａは、ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
Ｙは、トリアゾールを含む基、ディールス・アルダー付加物又はチオ－マレイミド付加物であり、
Ｌｐは、Ｐに共有結合された第２のリンカーである、構造を有する、化合物を作製する方法を提供し、
方法が、
ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも１個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、アジド又はアルキン部分を含む第１のリンカーＬａとを接触させる工程と、
ｂ）工程ａ）の生成物と、化合物Ｌｐ－Ｐとを接触させる工程であって、第２のリンカーＬｐはアジド又はアルキン部分を含み、Ｌａ及びＬｐは反応してトリアゾールを作製することが可能である、工程と、
ｃ）作製された式（Ｉ）の化合物を単離する工程と、を含み、
ＢＡ、Ｌ’及びＰは、上に定義されているとおりである。
一実施形態では、Ｙはトリアゾールを含む基である。
一実施形態では、グルタミン残基Ｇｌｎは、ＢＡのＣＨ２又はＣＨ３ドメイン中に天然に存在する。別の実施形態では、グルタミン残基Ｇｌｎは、１つ以上のアミノ酸を修飾することでＢＡに導入される。一実施形態では、ＧｌｎはＱ２９５又はＮ２９７Ｑである。
一実施形態では、トランスグルタミナーゼは、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。一実施形態では、トランスグルタミナーゼは、細菌性トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）である。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物を作製する上記方法のうちのいずれかで使用するための化合物Ｌ－Ｐは、
からなる群から選択される構造、又は薬学的に許容されるその塩を有する。
治療製剤及び投与
本開示は、本開示のタンパク質薬物複合体を含む医薬組成物を提供する。
一態様では、本開示は、約０．５～約３０．０の薬物抗体比（ＤＡＲ）を有する、本開示によるタンパク質薬物複合体の集団を含む組成物を提供する。
一実施形態では、組成物は、約１．０～約２．５のＤＡＲを有する。
一実施形態では、組成物は、約２のＤＡＲを有する。
一実施形態では、組成物は、約３．０～約４．５のＤＡＲを有する。
一実施形態では、組成物は、約４のＤＡＲを有する。
一実施形態では、組成物は、約６．５～約８．５のＤＡＲを有する。
一実施形態では、組成物は、約８のＤＡＲを有する。
本開示の組成物は、好適な担体、賦形剤及び輸送、送達、耐性などを改善させる他の薬剤とともに製剤化される。多数の適切な製剤は、全ての創薬化学者に公知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＮＡ複合体、無水吸収ペースト、水中油型エマルション及び油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル及びカーボワックスを含油する半固体混合物が挙げられる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」 ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１もまた参照されたい。
患者に投与されるタンパク質薬物複合体の投与量は、患者の年齢及びサイズ、標的となる疾患、症状、投与経路などによって変化し得る。好適な投与量は、体重又は体表面積に従って典型的には計算される。本開示のタンパク質薬物複合体が成人患者の治療目的のために使用される場合、約０．０１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０２～約７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３～約５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与量で本開示のタンパク質薬物複合体を標準的には静脈内投与することが有利であり得る。症状の重症度に応じて、治療頻度及び持続時間を調節することができる。タンパク質薬物複合体を投与するための有効な用量及びスケジュールは、経験的に決定されてもよく、例えば患者の進行は定期的な評価によってモニタリングされ、それに従って投与量は調節され得る。さらには、用量の種間スケーリングは、当該技術分野で周知の方法を使用して行われ得る（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｒｅｓ．８：１３５１）。
種々の送達系が公知であり、本開示の医薬組成物を投与するために使用され得る。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル封入、変異ウイルスを発現可能な組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２）などである。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、例えば注入又はボーラス注射といった任意の従来の経路によって、上皮又は皮膚粘膜の裏打ちを通した吸収（例えば、経口粘膜、直腸及び腸管粘膜など）によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与されてもよい。投与は全身又は局所であり得る。
本開示の医薬組成物は、標準的な針及びシリンジを用いて、皮下で又は静脈内で送達され得る。加えて、皮下送達に関しては、ペン型送達装置は、本開示の医薬組成物の送達に関する用途を容易に有する。かかるペン型送達装置は、再利用可能又は使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン型送達装置は、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを一般には利用する。カートリッジ内の医薬組成物のうちの全てが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは容易に廃棄することができ、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。ペン型送達装置は再利用することができる。使い捨て可能なペン型送達装置には、交換可能なカートリッジがない。逆に、使い捨て可能なペン型送達装置は、装置内の容器に保持されている医薬組成物で予め充填されている。容器の医薬組成物が空になると、装置全体が廃棄される。
多数の再利用可能なペン型及び自己注射送達装置は、本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される。例としては、ほんの数例だが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｅｒｇｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ，ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるがこれらに限定されない。本開示の医薬組成物の皮下送達に適用される使い捨て可能なペン型送達装置の例としては、ほんの数例だが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ－ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫＴＭ オートインジェクタ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴＴＭ（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）及びＨＵＭＩＲＡＴＭペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ ＩＬ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の状況では、医薬組成物は放出制御系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用されてもよい（前出のＬａｎｇｅｒ；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料が使用され得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），１９７４，ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい）。さらに別の実施形態では、放出制御系は、組成物の標的に近接して配置されることができ、したがって全身投与量のうちの一部のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８を参照されたい）。他の放出制御系は、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３による総説に説明されている。
注射用製剤は、静脈内、皮下、皮内及び筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含んでもよい。これらの注射用製剤は、公知の方法によって調製されてもよい。例えば、注射用製剤は、例えば注射に従来使用されている滅菌水性媒体又は油性媒体に、上記の抗体又はその塩を溶解、懸濁又は乳化させることによって調製されてもよい。注射用の水性媒体としては、例えば生理食塩水、グルコースを含有する等張液及び他の助剤などが存在しているが、これらはアルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。油性媒体としては例えばゴマ油、ダイズ油などが利用されるが、これらは安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用されてもよい。したがって、調製された注射液は、適切なアンプルに充填されることが好ましい。
有利には、上記の経口使用又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するように適した単位投与量の剤形に調製される。単位投与量のかかる剤形としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル、注射液（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される上述の抗体の量は、一般には、単位投与量の剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に注射形態では上述の抗体は約５～約１００ｍｇで含有され、他の剤形については約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
タンパク質薬物複合体、リンカーペイロード及びペイロードの治療的使用
別の態様では、本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、とりわけ、治療の必要がある疾患、障害又は症状の治療、予防及び／又は回復に有用である。
一態様では、本開示は、本開示による化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／若しくはペイロード）又は本開示によるいずれかの化合物を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、その必要がある対象の症状を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、ＧＬＰ１Ｒの刺激、活性化及び／又は標的が有益である任意の疾患又は障害を治療する上で有用である。特に、本開示の抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体は、ＧＬＰ１Ｒの発現又は活性に関連する、又はこれによって媒介される、任意の疾患又は障害の治療、予防及び／又は回復のために使用され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、ＧＬＰ１Ｒ関連症状を治療する上で有用である。いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は１型糖尿病又は２型糖尿病である。投与される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）によって、インスリン分泌の誘導、グルカゴン放出の抑制、血糖の低下、血糖コントロールの改善、膵島新生の促進及び胃内容排出の遅延又は耐糖能のある膵島の増強といった結果のうちの少なくとも１つを引き起こし得る。
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は、神経変性障害、認知障害、記憶障害又は学習障害である。神経変性障害は、例えば認知症、老人性認知症、軽度認知障害、アルツハイマー病関連認知症、ハンチントン病、遅発性ジスキネジア、運動過剰症、躁病、パーキンソン病、スティール・リシャール症候群、ダウン症候群、重症筋無力症、神経外傷、脳外傷、血管アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う脳出血Ｉ、脳炎症、フリードリヒ運動失調症（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ’ｓ ａｔａｘｉａ）、急性錯乱障害、筋萎縮性側索硬化症、緑内障及びアルツハイマー病であり得る。
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は肝疾患である。肝疾患は、例えば非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＡＦＬＤ）、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）及び肝硬変であり得る。
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は冠動脈疾患である。冠動脈疾患は、例えば心筋症及び心筋梗塞であり得る。
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は腎疾患である。腎疾患は、例えば高血圧又は慢性腎不全であり得る。
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒ関連症状は摂食障害である。摂食障害は例えば、過食であり得る。
理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病及びウシ海綿状脳症、慢性消耗症候群及び他のプリオン媒介性アポトーシス神経疾患など、中枢神経系のアポトーシス媒介性変性疾患の影響を減弱させるために利用されてもよい（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｇｒｉｅｇ（２００４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ６：５６５－５７１を参照されたい）。本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）の投与によって、βＡＰＰの発現低下もまた引き起こされ、それによってアルツハイマー病に関連するＡβモノ－又はオリゴマー媒介性症状を回復させることができる（例えば、Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７２：６０３－６１２を参照されたい）。
本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、例えば神経可塑性の増強及び細胞分化の促進によって、学習及び記憶を改善させるために使用され得ることもまた企図されている（例えば、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９：１１７３－１１７９を参照されたい）。さらには、本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、パーキンソン病においてドーパミン神経及び運動機能を保全するためにも使用され得る（例えば、Ｇｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ａｂｓｔｒａｃｔ ８９７．６，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、代謝障害を治療するためにも使用され得る。代謝障害は例えば、肥満、脂質異常症、内臓脂肪症候群及び膵島機能不全により生じる病状であり得る。
本開示の化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）により治療され得るさらなる疾患としては、自己免疫疾患、特に自己免疫性糖尿病、成人発症型糖尿病、病的肥満、内臓脂肪症候群及び脂質異常症を含むがこれらに限定されない、炎症に関連する自己免疫疾患が挙げられる。例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体は、自己免疫性糖尿病に罹患しているヒトの膵島成長を促進させるための成長因子として利用され得る。本明細書に記載の化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）は、うっ血性心不全の治療にも有用であり得る。
一態様では、本開示は、化合物を用いて細胞の表面上の抗原（例えば、ＧＬＰ１Ｒ）を選択的に標的化する方法を提供する。一実施形態では、化合物を用いて細胞の表面上の抗原（例えば、ＧＬＰ１Ｒ）を選択的に標的化する方法は、化合物を標的化した抗体に結合することを含む。一実施形態では、化合物は上記のペイロードである。一実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は膵臓細胞又は脳細胞である。ある特定の実施形態では、本開示は、
からなる群から選択される構造を有する化合物であって、
式中、
は化合物がリンカーＬに結合する箇所であり、
Ｘ１は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ２は、
から選択され、
Ｘ３は、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、
ｎは、０又は１であり、
Ｘ４は、Ｈ及びフェニルから選択され、
Ｘ５は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び
から選択され、
Ｘ６は、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
Ｘ７は、Ｈ、
から選択され、
Ｘ８は、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び
から選択される、化合物又は薬学的に許容されるその塩を用いて、細胞の表面上の抗原を選択的に標的化する方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示はまた、ＧＬＰ１Ｒ発現細胞に関連する、又はＧＬＰ１Ｒ発現細胞によって引き起こされる疾患又は障害（例えば、がん）の治療用の薬物を製造する際の本開示の化合物（例えば、抗体薬物複合体、リンカーペイロード及び／又はペイロード）の使用も含む。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又は抗原結合断片を含むタンパク質薬物複合体に関する。一態様では、本開示は、医薬に使用するための、本明細書に開示される抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を含む化合物に関する。
併用療法及び製剤
本開示は、１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせられる、本明細書に記載の例示的なタンパク質薬物複合体（例えば、抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及びペイロードのうちのいずれかを含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
本開示のタンパク質薬物複合体（例えば、抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及びペイロードと組み合わせられ得る、又はこれらと組み合わせて投与され得る例示的なさらなる治療薬は、他のＧＬＰ１Ｒアゴニスト（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体又はＧＬＰ１Ｒの小分子アゴニスト又は抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）を含む。ＧＬＰ１Ｒアゴニストの非限定的な例としては、エキセナチド（Ｂｙｅｔｔａ，Ｂｙｄｕｒｅｏｎ）、リラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ，Ｓａｘｅｎｄａ）、リキシセナチド（ヨーロッパではＬｙｘｕｍｉａ、米国ではＡｄｌｙｘｉｎ）、アルビグルチド（Ｔａｎｚｅｕｍ）、デュラグルチド（Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ）、セマグルチド（Ｏｚｅｍｐｉｃ）及びタスポグルチドが挙げられる。
例示的なさらなる治療薬は、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＣＧＲデュアルアゴニスト、ＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲ／ＧＣＧＲトリプルアゴニストなどのＧＬＰ１Ｒ／ＧＩＰＲデュアルアゴニストを含む、デュアルアゴニスト又はトリプルアゴニストを含んでもよい。
本開示のタンパク質薬物複合体（例えば、抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及びペイロードと組み合わせて有利に投与され得る他の薬剤は、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、肥満及び／又は他の関連する代謝疾患の治療に有用であるものを含む。
いくつかの実施形態では、さらなる治療薬は抗糖尿病薬である。任意の好適な抗糖尿病薬が使用され得る。抗糖尿病薬の非限定的な例としては、インスリン、インスリン類似体（インスリンリスプロ、インスリンアスパート、インスリングルリジン、イソフェンインスリン、インスリン亜鉛、インスリングラルギン及びインスリンデテミルを含む）、ビグアナイド（メトホルミン、フェンホルミン及びブホルミンを含む）、チアゾリジンジオン又はＴＺＤ（ロシグリタゾン、ピログリタゾン及びトログリタゾンを含む）、スルホニル尿素（トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、クロロプロパミド、グリピジド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリクラジド、グリクロピラミド及びグリキドンを含む）、メグリチニド（レパグリニド及びナテグリニドを含む）、α－グルコシダーゼ阻害剤（ミグリトール、アカルボース及びボグリボースを含む）、グルカゴン様ペプチド類似体及びアゴニスト（エキセナチド、リラグルチド、セマグルチド、タスポグルチド、リキシセナチド、アルブグルチド及びデュラグルチドを含む）、胃抑制ペプチド類似体、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ－４）阻害剤（ビルダグリプチン、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン、セプタグリプチン、テネリグリプチン及びゲミグリプチンを含む）、アミリンアゴニスト類似体、ナトリウム／グルコースコトランスポータ２（ＳＧＬＴ２）阻害剤、グルコキナーゼ活性化剤、スクアレンシンターゼ阻害剤、他の脂質低下剤及びアスピリンが挙げられる。いくつかのかかる実施形態では、抗糖尿病薬は、メトホルミン、アカルボース又はＴＺＤなどの経口抗糖尿病薬（ｏｒａｌ ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ、ＯＡＡ）である。いくつかのかかる実施形態では、抗糖尿病薬はメトホルミンである。
いくつかの実施形態では、ＧＬＰ１Ｒアゴニスト及び１つ以上の抗糖尿病薬は、非経口投与のための溶液又は懸濁液など、同一の剤形へと製剤化され得る。
１つ以上の治療的に有効であるさらなる成分は、本開示の化合物の投与直前、投与と同時に、又は投与直後に投与され得る（本開示の目的のために、かかる投与レジメンは、治療的に有効であるさらなる成分と「組み合わせた」抗原結合分子の投与であると考えられている）。
本開示は、本開示のタンパク質薬物複合体（例えば、抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードが本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の治療的に有効であるさらなる成分のうちの１つ以上とともに合剤化される医薬組成物を含む。
投与レジメン
本開示のある特定の実施形態に従い、タンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの複数の投与量は、規定の時間経過にわたって対象に投与されてもよい。本開示の本態様による方法は、本開示のタンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの複数の投与量を対象に順次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「順次投与」は、タンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの各投与量が、例えば所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間又は数ヶ月）によって分けられた異なる日数など、異なる時点で対象に投与されることを意味する。本開示は、タンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの単独での初回投与量、続いてタンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの１回以上の維持投与量、続いて必要に応じてタンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの１回以上のさらなる維持投与量を、患者に順次投与する方法を含む。
「初回投与量」、「維持投与量」及び「さらなる維持投与量」は、本開示のタンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの投与の時間的順序を指す。したがって、「初回投与量」は、治療レジメン開始時に投与される投与量であり（「ベースライン投与量」と称される）。「維持投与量」は、初回投与量後に投与される投与量であり、「さらなる維持投与量」は、維持投与量後に投与される投与量である。初回投与量、維持投与量及びさらなる維持投与量は全て、同一量のタンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードを含有することができるが、一般には、投与頻度という点では互いに異なり得る。ただしある特定の実施形態では、初回投与量、維持投与量及び／又はさらなる維持投与量に含有されるタンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの量は、治療経過中に互いに（例えば、適切に上方制御又は下方制御される）異なっている。ある特定の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回又は５回）の投与量は「負荷投与量」として治療レジメンの治療開始時に投与され、続いてより少ない頻度で投与される投与量（例えば、「管理投与」）で投与される。
本開示の例示的な一実施形態では、各維持投与量及び／又はさらなる維持投与量は、直前投与後、１～２６（例えば、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５以上）週間投与される。本明細書で使用される場合、「直前投与量」といった語句は、複数投与の順序においては、介入投与がない順序では直近の投与量の投与前に患者に投与されるタンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの投与量を意味する。
本開示の本態様による方法は、タンパク質薬物複合体（例えば、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体薬物複合体）、リンカーペイロード及び／又はペイロードの任意の回数の維持投与量及び／又はさらなる維持投与量を患者に投与することを含んでもよい。例えば、ある特定の実施形態では、１回のみの維持投与量が患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回以上）の維持投与量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、１回のみさらなる維持投与量が患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回以上）のさらなる維持投与量が患者に投与される。
複数回の維持投与量を含む実施形態では、各維持投与量は、他の維持投与量と同一の頻度で投与されてもよい。例えば、各維持投与量は、直前の投与後１～２週間で患者に投与されてもよい。同様に、複数回のさらなる維持投与量を含む実施形態では、さらなる維持投与量のそれぞれは、他のさらなる維持投与量と同一の頻度で投与されてもよい。例えば、さらなる維持投与量のそれぞれは、直前の投与後２～４週間で患者に投与されてもよい。あるいは、維持投与量及び／又はさらなる維持投与量が患者に投与される回数は、治療レジメンの経過中に変化し得る。投与回数はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて医師による治療経過中に調節されてもよい。
以下の実施例は、当該説明の特定の態様を例示する。この実施例は、実施形態及びそれらの種々の態様の具体的な理解及び実践を提供しているにすぎないため、実施例は限定であると解釈されるべきではない。
実施例及び本明細書全体で使用される略語は以下のとおりである：
実施例１．小分子ペイロード及びリンカーペイロードの合成
１．１ ペプチド模倣ペイロードの固相ペプチド合成
ＳＰＰＳアプローチを使用したペプチド模倣薬（ペイロード）の調製の一般的手順
スキーム１は、本開示によるペプチド模倣ペイロードの樹脂上での構築を示す。ペプチドは、フィルタディスクを備えたポリプロピレンカラムを使用し、Ｆｍｏｃ ＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）上へローラミキサによって手動で構築された。十分な量のリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（負荷量：０．５～０．６ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＭＦ又はＣＨ２Ｃｌ２中に１５分間膨潤させた。
工程１：Ｆｍｏｃ－リンクアミドＭＢＨＡ樹脂からＦｍｏｃを除去するための一般的手順
ＤＭＦ中の２０％ピペリジン（１０～３０ｍｌ／１００ｍｇの樹脂）で５～１５分間樹脂をインキュベーションすることで、樹脂上のＦｍｏｃ基を除去した。脱保護樹脂を濾過し、過剰なＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄した。３回洗浄した後に、樹脂を新たに蒸留したＤＭＦ（１ｍＬ／１００ｍｇの樹脂）中で、窒素雰囲気下で５分間インキュベートした。
工程２：リンクアミドＭＢＨＡ樹脂上でアミドカップリングするための一般的手順
ＳＰＰＳ反応物を用いたアミドカップリング反応については、ＨＡＴＵ（１．５～４当量）を含有するＤＭＦ溶液、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（０．５Ｍ濃度で１．５～５当量）及びＤＩＰＥＡ（５～１０当量）を樹脂に加えた。反応物として天然アミノ酸を用いたアミドカップリング反応については、Ｆｍｏｃアミノ酸（５当量）、ＨＡＴＵ（４．５当量）及びＤＩＰＥＡ（１０当量）を樹脂と混合し、反応物として非天然アミノ酸を用いたアミドカップリング反応については、Ｆｍｏｃアミノ酸（１．５～２当量）、ＨＡＴＵ（１．５当量）及びＤＩＰＥＡ（５．０当量）を樹脂と混合した。続いて混合した樹脂混合物を窒素雰囲気下で１～３時間にわたって振盪させ、ニンヒドリン試験定性分析を使用してカップリング反応を監視した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸の結合後、続いて樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄し、対応するペプチド結合樹脂を生成した。
工程３：樹脂からの切断と、それに続く全ての脱保護の一般的手順
ＴＦＡカクテルで樹脂結合ペプチド模倣ペイロードを以下のように切断及び脱保護した。ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５）の溶液（ペプチジル樹脂１００ｍｇあたり１０ｍＬ）をペプチジル樹脂に加え、混合物を室温に維持した。２～３時間後、樹脂を濾過し、切断溶液ですすいだ。組み合わせた濾液を冷ｔ－ＢｕＯＭｅで処理し、ペプチドを沈殿させた。懸濁液を１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。粗白色粉末を組み合わせ、分取ＨＰＬＣで精製した。
スキーム１に表すように、脱保護、洗浄、カップリング及び洗浄手順からなる多数の反復処理（すなわち、樹脂を各回とも１時間反応条件に供し、溶液を排出して、各回とも樹脂を再度新しい試薬に供した）によりペプチド鎖伸長反応を実施した。最後に、上記のように２０％のピペリジンにより得られたＦｍｏｃ保護ペプチジル樹脂を脱保護し、ＤＭＦ及びＤＣＭでそれぞれ４回洗浄した。樹脂結合ペプチドを窒素流下で１０～１５分間乾燥させ、切断／脱保護に供した。上記プロトコール及び好適なそれらの変形を使用し、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳアプローチを使用して本開示で設計したペプチド模倣薬を調製した。さらには、樹脂結合ペプチド模倣薬を切断及び脱保護し、以下のプロトコールを使用して精製及び特性評価した。
１．２ 粗ペプチド模倣薬の分取ＨＰＬＣ精製
分取ＨＰＬＣを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－８ａ液体クロマトグラフで実施した。ＤＭＦ又は水に溶解した粗ペプチドの溶液をカラムに注入し、ＡＣＮ水溶液の直線的勾配で溶出した。異なる方法を使用した（一般的な情報を参照されたい）。溶出した所望の生成物の量はほんの少しであり、それぞれのＨＰＬＣ画分を凍結乾燥することで、非晶質の粉末で純粋なペプチド模倣薬を得た。一般には、分取ＨＰＬＣ精製後、全体の回収率は収率４０～５０％の範囲であることが分かった。
分取ＨＰＬＣ方法Ａ：ＦＡ条件（カラム；Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １５０＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：４０％～７０％，７分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｂ：ＴＦＡ条件（カラム；ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ １２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｃ：中性条件（カラム；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２１％～５１％，１１分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｄ：中性条件（カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ １５０＊２５５ｕ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～５０％，７分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｅ：ＦＡ条件（カラム；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０＊５０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５５％～８６％，２１分）を使用し、純粋な生成物を得る。
１．３ 精製したペプチド模倣薬のＨＰＬＣ分析
上記の調製ＨＰＬＣによる精製後、方法Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ又はＦを使用し、各ペプチドを分析ＨＰＬＣにより分析した。ＰＤＡ検出器を使用し、クロマトグラムの取得は２２０ｎｍで実施した。一般には、分取ＨＰＬＣ精製後に得られた純粋なペプチド模倣薬の純度は９５％超であることが分かった。
ＨＰＬＣ方法Ａ（２０分）：移動相：４Ｌの水中の４．０ｍＬのＴＦＡ（溶媒Ａ）及び４Ｌのアセトニトリル中の３．２ｍＬのＴＦＡ（溶媒Ｂ）、流量１．０ｍＬ／分で、２０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で３．５分間保持；カラム：Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μｍ １５０＊４．６ｍｍ，Ｃ１８，１１０Ａ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度：３０℃を使用。
ＨＰＬＣ方法Ｂ（１５分）：移動相：２．７５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＷＥＬＣＨ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＰ－Ｃ１８ １５０＊４．６ｍｍ ５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２１５ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
ＨＰＬＣ方法Ｃ（８分）：移動相：２．７５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で７分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間の保持；カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２１５ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
ＨＰＬＣ方法Ｄ（１５分）：移動相：０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）及び０．０２％ＴＦＡを含有するアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、１５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で３．５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度：３０℃を使用。
ＨＰＬＣ方法Ｅ（８分）：移動相：０．２ｍＬ／１ＬのＮＨ３＊Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍＬ／分で、５分間の０％～６０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ－１８，５μｍ，２．１＊５０ｍｍ。波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度：３０℃を使用。
ＨＰＬＣ方法Ｆ（７分）：移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ｍＬ／４Ｌ ＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）を使用。カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃。
１．４ 質量分析法による特性評価
エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、ＥＳＩ－ＭＳ）により、フローインジェクション又はＬＣ／ＭＳモードで各ペプチドを特性評価した。全ての場合では、実験で測定された分子量は、計算されたモノアイソトピック分子量の０．５ダルトンの範囲内であった。上記プロトコールを使用し、質量分析法により全ての粗／純粋なペプチド模倣薬を特性評価した。一般には、ペプチド模倣薬の観察された質量は計算質量／理論質量と一致するが、これは所望のペプチド模倣薬の合成が成功したことを立証している。
ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ（ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍ）カラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＬＣ－ＭＳ方法Ｂ：Ｘｔｉｍａｔｅ（Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ）カラム、流量０．８ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＬＣ－ＭＳ方法Ｃ：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ（Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍ）カラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＬＣ－ＭＳ方法Ｄ：Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐｕｒｓｕｉｔ（５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍ）カラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＬＣ－ＭＳ方法Ｅ：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３０＊２．０ｍｍ，３．５μｍカラム，流量１．０ｍＬ／分、５％～９５％勾配で溶出。移動相：Ａ）０．０５％ ＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液；Ｂ）ＡＣＮ。勾配：０％のＢから５．８分以内に９５％のＢに増加；９５％のＢで１．１分間保持；続いて６．９１分で０％のＢに戻り、０．０９分間保持。
ＬＣ－ＭＳ方法Ｆ：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ２．１＊３０ｍｍカラム、流量１．０ｍＬ／分で、移動相：０．８ｍＬ／４ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、２分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間保持。
１．５ ＨＲＭＳ分析をＡｇｉｌｅｎｔ ６２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＴＯＦ及び６５００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳで実施
移動相：０．１％のＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及びＡＣＮ（溶媒Ｂ）；溶出勾配：１ｍｌ／分の流量で３分間の５％～９５％（溶媒Ｂ）及び９５％で１分間保持；カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ １８ ５μｍ，２．１＊５０ｍｍ イオン源：ＡＪＳ ＥＳＩ源；イオンモード：正；噴霧ガス：窒素；乾燥ガス（Ｎ２）流：８Ｌ／分；ネブライザ圧力：３５ｐｓｉｇ；気体温度：３２５℃；シースガス温度：３５０℃；シースガス流：１１Ｌ／分；キャピラリ電圧：３．５ＫＶ；フラグメンタ圧力：１７５Ｖ。
実施例２．非天然アミノ酸の合成
２．１ 非天然アミノ酸（ａａ１ｂ）の合成
スキーム２は、非天然アミノ酸（ａａ１ｂ）の合成を概説している：
試薬及び条件：ａ）１－（ベンジルオキシ）－４－（ブロモメチル）ベンゼン（ａａ１ｂ－４）（１．０当量），ｔ－ＢｕＯＫ（１．０当量），ＴＨＦ，０～１０℃，１時間，６７．９３％；ｂ）Ｐｄ／Ｃ（１０％），Ｈ２（５０Ｐｓｉ），ＭｅＯＨ，４０℃，４４時間；９４．２４％；ｃ）１－クロロ－４－ヨードブタン（１．５当量），Ｋ２ＣＯ３（２．０当量），ＤＭＦ，５０℃，１６時間，８３．４４％；ｄ）ＮａＮ３（２．１７当量），Ｋ２ＣＯ３（２．０当量），ＤＭＦ，６５℃，１６時間，９８．４４％；ｅ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（２．０当量），ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ，２２℃，１時間，１００％；ｆ）ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ，２２℃，１時間，８５．０４％；ｇ）ＮａＨＣＯ３水溶液（０．４３Ｍ），Ｆｍｏｃ－ｏｓｕ，ＴＨＦ，０～２２℃，１６時間，９２．１１％；ｈ）（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．０当量），ＤＩＰＥＡ（３．０当量），Ｐｄ／Ｃ（１０％），Ｈ２（１５Ｐｓｉ），４時間，２２．５０％。
Ｗｕ，Ｘ．Ｙ．；Ｓｔｏｃｋｄｉｌｌ，Ｊ．Ｌ．；Ｐａｒｋ，Ｐ．Ｋ．；Ｓａｍｕｅｌ Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｉｓｏｎｉｔｒｉｌｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｉｄａｔｉｏｎｓ：Ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ Ｓｔｅｒｅｏｓｕｂｔｌｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｌａｃｔａｍ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｅｃｏ－Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，２３７８－２３８４に見られる詳細な合成手順に従い、ａａ１ｂ－２を調製した。ａａ１ｂ－１の調製は、Ｄｕ，Ｊ．Ｊ．；Ｇａｏ，Ｘ．Ｆ．；Ｘｉｎ，Ｌ．Ｍ．；Ｌｅｉ，Ｚ．；Ｌｉｕ，Ｚ．；ａｎｄ Ｇｕｏ，Ｊ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｖｉａ Ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ω－Ａｓｐ ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１６，１８，４８２８－４８３１に言及されている。
工程１：（Ｓ，Ｚ）－メチル５－（４－ベンジルオキシ）フェニル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ペント－４－エノアート（ａａ１ｂ－３）の合成
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中、ａａ１ｂ－２（１７．５０ｇ，３２．４３ｍｍｏｌ，１．０当量）懸濁液に、０℃、窒素下でｔ－ＢｕＯＫ（３．６４ｇ，３２．４３ｍｍｏｌ，１．０当量）を加えた。混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のａａ１ｂ－１（７．５ｇ，３２．４３ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液を混合物に滴下した。反応物を１０℃で加温し、１時間撹拌した。淡黄色の懸濁液を観察した。反応物を氷水（３００ｍＬ）に加え、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ×２）で抽出した。有機層を組み合わせ、塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して黄色油として粗生成物を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～１８％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（５０ｍＬ／分）の溶出）で１．５時間、総体積２．５Ｌで精製し、淡黄色の油としてａａ１ｂ－３（９．７ｇ，２３．５７ｍｍｏｌ，収率６７．９３％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．４５－７．２６（ｍ，６Ｈ），７．１８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄｄ，Ｊ＝８．７，１１．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５６－６．３４（ｍ，１Ｈ），５．９８－５．８３（ｍ，１Ｈ），５．５５－５．４２（ｍ，１Ｈ），５．０７（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，３Ｈ），４．４８－４．３６（ｍ，１Ｈ），３．７７－３．６８（ｍ，３Ｈ），２．９４－２．５６（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）
工程２：（Ｓ）－メチル２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－（４－ヒドロキシフェニル）ペンタノアート（ａａ１ｂ－４）の合成
ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中のメチルａａ１ｂ－３（９．７ｇ，２３．５７ｍｍｏｌ，１．０当量）及びＰｄ／Ｃ（１０％パラジウム活性炭，１．０ｇ，９．４０ｍｍｏｌ）の溶液を、４０℃、５０Ｐｓｉの水素下で４４時間撹拌した。黒色懸濁液を観察した。反応物をセライトパッドに通して濾過し、ケーキをＭｅＯＨ（５０ｍＬ×３）で洗浄した。濾液を真空状態で濃縮し、ａａ１ｂ－４（７．５ｇ，２２．２２ｍｍｏｌ，収率９４．２４％，純度９５．７８８％）を灰色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．０５－６．９２（ｍ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．７９－６．７０（ｍ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），５．５９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．０３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．３７－４．２６（ｍ，１Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），２．６１－２．４７（ｍ，２Ｈ），１．８１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．６８－１．５４（ｍ，３Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９２７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１７Ｈ２５ＮＯ５ ３２３．１７，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ３４５．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ｃを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程３：（Ｓ）－メチル２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－５－（４－（４－クロロブトキシ）フェニル）ペンタノアート（ａａ１ｂ－５）の合成
ＤＭＦ（７０ｍＬ）中のａａ１ｂ－１０（７ｇ，２１．６５ｍｍｏｌ，１．０当量）、１－クロロ－４－ヨードブタン（７．０９ｇ，３２．４７ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＫ２ＣＯ３（５．９８ｇ，４３．２９ｍｍｏｌ，２．０当量）の溶液を、５０℃で１６時間撹拌した。組み合わせた反応物を氷水（２００ｍＬ）に加え、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ×３）で抽出した。有機層を組み合わせ、塩水（１５０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して黄色油として粗生成物を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～２０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（５０ｍＬ／分）の溶出）で１．５時間、総体積２．５Ｌで精製し、無色の油としてａａ１ｂ－５（８ｇ，１９．３３ｍｍｏｌ，収率８３．４４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．０４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．９５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．３４－４．２２（ｍ，１Ｈ），３．９８－３．９２（ｍ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．６０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６２－２．４８（ｍ，２Ｈ），２．０４－１．８４（ｍ，４Ｈ），１．８３－１．５９（ｍ，４Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）
工程４：（Ｓ）－メチル５－（４－（４－アジドブトキシ）フェニル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタノアート（ａａ１ｂ－６）の合成
ＤＭＦ（７５ｍＬ）中、ａａ１ｂ－５（７．５ｇ，１８．１２ｍｍｏｌ，１．０当量）と、ＮａＮ３（２．５６ｇ，３９．３２ｍｍｏｌ，２．１７当量）と、Ｋ２ＣＯ３（５．０１ｇ，３６．２４ｍｍｏｌ，２．０当量）と、ＫＩ（３００．７８ｍｇ，１．８１ｍｍｏｌ，０．１当量）との混合物を、６５℃で１６時間撹拌した。反応物を氷水（２００ｍＬ）に加え、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機層を組み合わせ、塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して黄色油としてａａ１ｂ－６（７．５ｇ，１７．８４ｍｍｏｌ，収率９８．４４％）を得た。
工程５：（Ｓ）－５－（４－（４－アジドブトキシ）フェニル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ペンタン酸（ａａ１ｂ－７）の合成
ＴＨＦ（７０ｍＬ）中のａａ１ｂ－６（７．５ｇ，１７．８４ｍｍｏｌ，１．０当量）及びＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１Ｍ，３５．６７ｍＬ，２．０当量）の溶液を、２２℃で１時間撹拌した。変化は何ら観察されなかった。反応物を真空状態で濃縮し、ＴＨＦを除去した。１Ｎ ＨＣｌを用いて反応物のｐＨを５に調整し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×２）を用いて抽出した。有機層を組み合わせ、塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して無色の油としてａａ１ｂ－７（７．２５ｇ，１７．８４ｍｍｏｌ，収率１００．００％）を得た。
工程６：（Ｓ）－２－アミノ－５－（４－（４－アジドブトキシ）フェニル）ペンタン酸塩酸塩（ａａ１ｂ－８）の合成
４Ｍ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）中のａａ１ｂ－７（７．２５ｇ，１７．８４ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液を、２２℃で１時間撹拌した。反応物を真空状態で濃縮し、ａａ１ｂ－８（５．２ｇ，１５．１７ｍｍｏｌ，収率８５．０４％，ＨＣｌ）を白色固体として得た。
工程７：（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－５－（４－（４－アジドブトキシ）フェニル）ペンタン酸（ａａ１ｂ－９）の合成
ＴＨＦ（１１６ｍＬ）中のａａ１ｂ－８（５ｇ，１４．５８ｍｍｏｌ，１．０当量，ＨＣｌ）溶液に、Ｈ２Ｏ（５８ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（２．４５ｇ，２９．１７ｍｍｏｌ，２．０当量）を加え、続いてＦｍｏｃ－ＯＳｕ（５．４１ｇ，１６．０４ｍｍｏｌ，１．１当量）を０℃で加えた。反応混合物を２２℃で１６時間撹拌した。変化は何ら観察されなかった。１Ｎ ＨＣｌを用いて反応物のｐＨを６に調整し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）を用いて抽出した。有機層を組み合わせ、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して黄色油として粗生成物を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ勾配（５０ｍＬ／分）の溶出）で２．５時間、総体積３Ｌで精製し、黄色油としてａａ１ｂ－９（７ｇ，１２．２０ｍｍｏｌ，収率８３．６４％，純度９２．１１３％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．７５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６０－７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４１－７．３４（ｍ，２Ｈ），７．２９（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．０５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．７８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），５．１８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），４．２１（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９８－３．８８（ｍ，２Ｈ），３．３４（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．５７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９８－１．６０（ｍ，８Ｈ）
工程８：（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－５－（４－（４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブトキシ）フェニル）ペンタン酸（ａａ１ｂ）の合成
ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中、ａａ１ｂ－１５（７ｇ，１３．２４ｍｍｏｌ，１．０当量）、ＤＩＰＥＡ（５．１３ｇ，３９．７３ｍｍｏｌ，６．９２ｍＬ，３．０当量）及びＢｏｃ２Ｏ（８．６７ｇ，３９．７３ｍｍｏｌ，９．１３ｍＬ，３．０当量）及びＰｄ／Ｃ（１０％パラジウム活性炭，３．５ｇ，３２．９ｍｍｏｌ）の混合物を、２５℃、１５ＰｓｉのＨ２下で４時間撹拌した。黒色懸濁液を観察した。反応物をセライトパッドに通して濾過し、ケーキをＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）で洗浄した。濾液を、ＮＨ４Ｃｌ（１００ｍＬ×３）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過して真空状態で濃縮し、無色の油として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（２）Ｃ１８ ２５０＊５０ １０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：４５％～７８％，２１．５分）で精製し、ａａ１ｂ（１．８ｇ，２．９９ｍｍｏｌ，収率２２．５０％）を黄色油として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９５４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４２Ｎ２Ｏ７Ｎａ ６２５．２９，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ６２５．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．７５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６０－７．５５（ｍ，２Ｈ），７．３８（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），７．２９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），７．０４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），５．２４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．４０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），４．２３－４．１８（ｍ，１Ｈ），３．９２（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．２１－３．０７（ｍ，２Ｈ），２．６１－２．５１（ｍ，２Ｈ），１．９７－１．８４（ｍ，２Ｈ），１．８２－１．５４（ｍ，８Ｈ），１．４３（ｓ，９Ｈ）
２．２ 非天然アミノ酸（ａａ２）の合成
スキーム３は、非天然アミノ酸（ａａ２）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）Ｋ２ＣＯ３，ＰＭＢ－Ｃｌ，ＤＭＦ，２５℃，１２時間；（ｂ）Ｐｈ３ＰＣＨ２Ｂｒ，ｔ－ＢｕＯＫ，ＴＨＦ，０～２５℃，４時間，７１．９１％；（ｃ）Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２，ＫＯＡｃ，４，４，５，５－テトラメチル－２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－１，３，２－ジオキサボロラン，１，４－ジオキサン，８０℃，２０時間，４２．７５％；（ｄ）ａａ２－６，Ｋ２ＣＯ３，Ｐｄ（ＰＰｈ３）４，１．４－ジオキサン及びＨ２Ｏ，８０℃，２．５時間，７６．２０％；（ｅ）Ｐｄ／Ｃ，Ｈ２（１５ｐｓｉ），ＭｅＯＨ，２５℃，４８時間，８５．０１％；（ｆ）Ｋ２ＣＯ３，１－クロロ－４－ヨード－ブタン，ＤＭＦ，５０℃，１２時間；（ｇ）Ｋ２ＣＯ３，Ｋｌ，ＮａＮ３，ＤＭＦ，５０℃，７時間；
化合物ａａ２－５は、以下の参考文献：Ｉ．Ｂｅｒｅｚｏｗｓｋａ，Ｎ．Ｎ．Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｂ．Ｃ．Ｗｉｌｋｅｓ，ａｎｄ Ｐ．Ｗ．Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ａｇｏｎｉｓｔ ｖｓ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ δ Ｏｐｉｏｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ Ｐｌａｃｅ ｏｆ Ｔｙｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．２１，２００９，６９４１－６９４５に従って調製した。
工程１：２－ブロモ－５－（（４－メトキシベンジル）オキシ）ベンズアルデヒド（ａａ２－２）の合成
ＤＭＦ（１００ｍＬ）中のａａ２－１（１０ｇ，４９．７５ｍｍｏｌ，１．０当量）とＫ２ＣＯ３（１０．３１ｇ，７４．６２ｍｍｏｌ，１．５当量）の溶液に、ＰＭＢ－Ｃｌ（１１．６９ｇ，７４．６２ｍｍｏｌ，１０．１６ｍＬ，１．５当量）を加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。化合物ａａ２－２（２１ｇ，粗）を白色固体として得た。これをさらなる精製なしに次の工程で直接使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝１０．１６（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．３４（ｍ，３Ｈ），７．２８（ｄｄ，Ｊ＝３．３，８．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９９－６．９０（ｍ，２Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ）。
工程２：１－ブロモ－４－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－２－ビニルベンゼン（ａａ２－３）の合成
ＴＨＦ（２５ｍＬ）中のＰｈ３ＰＣＨ３Ｂｒ（４．５６ｇ，１２．７７ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、窒素下でｔ－ＢｕＯＫ（７．１６ｇ，６３．８３ｍｍｏｌ，５．０当量）を加えた。混合物を０℃で１時間撹拌した。続いてＴＨＦ（２５ｍＬ）中のａａ２－２（４．１ｇ，１２．７７ｍｍｏｌ，１．０当量）を滴下した。混合物を２５℃で３時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～５％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（３０ｍＬ／分）の溶出）で２４分、総体積０．９Ｌで精製した。化合物ａａ２－３（２．９３ｇ，９．１８ｍｍｏｌ，収率７１．９１％）を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．４６－７．２９（ｍ，３Ｈ），７．１８－７．０９（ｍ，１Ｈ），７．０６－６．９６（ｍ，１Ｈ），６．９５－６．８６（ｍ，２Ｈ），６．８１－６．７０（ｍ，１Ｈ），５．７２－５．５９（ｍ，１Ｈ），５．４０－５．２９（ｍ，１Ｈ），５．０３－４．９０（ｍ，２Ｈ），３．８６－３．７４（ｍ，３Ｈ）。
工程３：２－（４－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－２ービニルフェニル）－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン（ａａ２－４）の合成
１，４－ジオキサン（３ｍＬ）中のａａ２－３（２００ｍｇ，６２６．５８μｍｏｌ，１当量）の溶液を、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（７２．４１ｍｇ，６２．６６μｍｏｌ，０．１当量）及びＫＯＡｃ（１２２．９９ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ，２当量）で処理し、続いて４，４，５，５－テトラメチル－２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）－１，３，２－ジオキサボロラン（４７７．３４ｍｇ，１．８８ｍｍｏｌ，３当量）を加えた。混合物を、８０℃、窒素下で１２時間撹拌した。反応混合物を塩水（３０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～１０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（１８ｍＬ／分）の溶出）で精製した。化合物ａａ２－４（１９０ｍｇ，５１８．７６μｍｏｌ，収率８２．７９％）を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．７５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，１７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９７－６．８９（ｍ，２Ｈ），６．８７（ｄｄ，Ｊ＝２．４，８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｓ，１２Ｈ）。
工程４：（Ｓ）－メチル２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（４’－（（４－メトキシベンジル）オキシ）－２’－ビニル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパノアート（ａａ２－６）の合成
１，４－ジオキサン（３ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１ｍＬ）中のａａ２－４（１００ｍｇ，２７３．０３μｍｏｌ，１当量）の溶液を、Ｋ２ＣＯ３（５６．６０ｍｇ，４０９．５５μｍｏｌ，１．５当量）及びＰｄ（ＰＰｈ３）４（３１．５５ｍｇ，２７．３０μｍｏｌ，０．１当量）で処理し、続いてａａ２－５（１１６．６９ｍｇ，２７３．０３μｍｏｌ，１当量）を加えた。混合物を、８０℃、窒素下で２．５時間撹拌した。反応混合物を塩水（３０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～１０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（１８ｍＬ／分）の溶出）で１４分、総体積０．３Ｌで精製した。化合物ａａ２－６（１００ｍｇ，１９３．２０μｍｏｌ，収率７０．７６％）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９５０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３１Ｈ３５ＮＯ６Ｎａ ５４０．２４，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ５４０．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．３９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．２７－７．２５（ｍ，２Ｈ），７．２３（ｓ，２Ｈ），７．１７（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１６．２Ｈｚ，３Ｈ），６．９７－６．９１（ｍ，３Ｈ），６．６７（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．６７（ｄｄ，Ｊ＝１．１，１７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２２－５．１５（ｍ，１Ｈ），５．０５（ｓ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），１．４７－１．３５（ｍ，１Ｈ），１．４３（ｓ，８Ｈ）。
工程５：（Ｓ）－メチル２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（２’－エチル－４’－ヒドロキシ－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパノアート（ａａ２－７）の合成
ＭｅＯＨ（２５ｍＬ）中のａａ２－６（２．８ｇ，５．４１ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（３００ｍｇ，１０％パラジウム活性炭）を加え、２５℃、水素下（１５ｐｓｉ）で４８時間撹拌した。反応混合物を濾過して減圧下で濃縮した。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～３０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（３５ｍＬ／分）の溶出）で２２分、総体積０．９Ｌで精製した。化合物ａａ２－７（１．８５ｇ，４．６０ｍｍｏｌ，収率８５．０１％，純度９９．３％）を無色の油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９３５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ２９ＮＯ５Ｎａ ４２２．２０，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ４２２．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．２２－７．１１（ｍ，４Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．６９（ｄｄ，Ｊ＝２．６，８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），５．０５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．７０－４．５８（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），３．２０－３．１１（ｍ，１Ｈ），３．１１－３．０２（ｍ，１Ｈ），２．５３（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ）。
工程６：（Ｓ）－メチル２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３－（４’－（４－クロロブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパノアート（ａａ２－８）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のａａ２－７（３５０ｍｇ，８７６．１４μｍｏｌ，１当量）及びＫ２ＣＯ３（２４２．１８ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ，２．０当量）の溶液に、１－クロロ－４－ヨード－ブタン（２８７．１１ｍｇ，１．３１ｍｍｏｌ，１．５当量）を２５℃で加えた。混合物を５０℃で１２時間撹拌した。残渣を塩水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～３０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（３５ｍＬ／分）の溶出）で１４分、総体積０．４Ｌで精製した。化合物ａａ２－８（３４０ｍｇ，粗）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１４５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ３６ＣｌＮＯ５Ｎａ ５１２．２２，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ５１２．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程７：（Ｓ）－メチル３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパノアート（ａａ２－９）の合成
ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のａａ２－８（１．６ｇ，３．２７ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（９０２．５１ｍｇ，６．５３ｍｍｏｌ，２．０当量）、ＫＩ（５４．２０ｍｇ，３２６．５１μｍｏｌ，０．１当量）及びＮａＮ３（４６０ｍｇ，７．０８ｍｍｏｌ，２．１当量）を加えた。混合物を５０℃で７時間撹拌した。反応混合物を塩水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。ＮａＣｌＯ水溶液（１．０Ｍ，１００ｍＬ）を加えることで水層をクエンチした。化合物ａａ２－９（１．７ｇ，粗）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１４０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ３６Ｎ４Ｏ５Ｎａ ５１９．２７，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ５１９．３［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程８：（Ｓ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）プロパン酸（ａａ２－１０）の合成
ＴＨＦ（１２ｍＬ）中のａａ２－９（１．７ｇ，３．４２ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、Ｈ２Ｏ（６ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（２８７．３１ｍｇ，６．８５ｍｍｏｌ，２．０当量）を０℃で加え、続いて混合物を２５℃まで徐々に加温し、２時間撹拌させた。混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で処理し、水（２５ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた水層を酸性化（１Ｍ ＨＣｌ水溶液）し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ×３）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。化合物ａａ２－１０（２．０１ｇ，粗）を黄色油として得た。これをさらなる精製なしに次の工程で直接使用した。
工程９：（Ｓ）－２－アミノ－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸塩酸塩（ａａ２－１１）の合成
化合物ａａ２－１０（２．０１ｇ，４．１７ｍｍｏｌ，１．０当量）を４．０Ｍ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に溶解した。混合物を２５℃で１時間撹拌した。反応混合物を濾過した。濾過ケーキをＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）で洗浄し、真空下で乾燥した。化合物ａａ２－１１（１ｇ，粗）を白色固体として得た。これをさらなる精製なしに次の工程で直接使用した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１２１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２７Ｎ４Ｏ３ ３８３．２１［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ３８３．２［Ｍ＋Ｈ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程１０：（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸（ａａ２）の合成
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のａａ２－１１（１ｇ，２．３９ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、Ｈ２Ｏ（８ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（４０１．０７ｍｇ，４．７７ｍｍｏｌ，２．０当量）を加え、続いて（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルカルボナート（８０５．２３ｍｇ，２．３９ｍｍｏｌ，１．０当量）を０℃で加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を塩水（１００ｍＬ）で希釈し、ｐＨを２～３に酸性化した（１Ｍ ＨＣｌ水溶液）。反応混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～１０％のメタノール／ジクロロメタン勾配（３０ｍＬ／分）の溶出）で１６分、総体積０．６Ｌで精製した。生成物ａａ２（１．３ｇ，２．１４ｍｍｏｌ，収率８９．５２％，純度９９．４％）を白色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１１３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３６Ｈ３６Ｎ４Ｏ５Ｎａ ６２７．２６，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ６２７．３［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝７．８８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄｔ，Ｊ＝２．３，７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４－７．２５（ｍ，４Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７６（ｄｄ，Ｊ＝２．５，８．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２７－４．１７（ｍ，３Ｈ），４．１７－４．１３（ｍ，１Ｈ），４．０３－３．９８（ｍ，２Ｈ），３．４２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），３．１３（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝３．９，１３．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９６－２．８７（ｍ，１Ｈ），２．５２（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８２－１．７４（ｍ，２Ｈ），１．７３－１．６６（ｍ，２Ｈ），０．９８－０．９０（ｍ，３Ｈ）。
ＳＦＣ：ｅｅ％＝９７．９５％～２．０５％＝９５．９％；方法へのコメント：カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＪ－３ １００×４．６ｍｍ（内径），３μｍ；移動相：Ａ：ＣＯ２：Ｂ：エタノール（０．０５％ＤＥＡ）；勾配：４分間でＢを５％～４０％、４０％で２．５分間保持、続いて１．５分間でＢを５％；流量：２．８ｍＬ／分；カラム温度；３５℃；ＡＢＰＲ；１５００ｐｓｉ。
２．３ 非天然アミノ酸（ａａ２ｂ）の合成
スキーム４は、非天然アミノ酸（ａａ１ｂ）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）Ｈ２，Ｐｄ／Ｃ，（Ｂｏｃ）２Ｏ，ＤＩＰＥＡ，ＭｅＯＨ，２０℃，１２時間，４７％
工程１：（Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（４’－（４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸（ａａ２ｂ）の合成
ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中のａａ２（３．２ｇ，５．２９ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（７００ｍｇ，１０％パラジウム活性炭）、ＤＩＰＥＡ（１．３７ｇ，１０．６０ｍｍｏｌ，１．８４ｍＬ，２．０当量）及びＢｏｃ２Ｏ（２．３１ｇ，１０．５８ｍｍｏｌ，２．４３ｍＬ，２．０当量）を加えた。混合物を、２０℃、水素下（１５ｐｓｉ）で１２時間撹拌した。反応混合物を小さなセライトパッドに通して濾過し、４０＊５ｍＬのＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ＊５）を用いてすすいだ。続いて、塩水（４００ｍＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ＊２）で抽出した。組み合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０＊５０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５５％～８６％，２１分間）で精製し、生成物を水（１５０ｍＬ）に懸濁させ、混合物をドライアイス／エタノール浴で凍結させ、生成物ａａ２ｂ（３．４ｇ，５．０１ｍｍｏｌ，収率４７．３２％、純度１００％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９２２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４６Ｎ２Ｏ７Ｎａ ７０１．３３，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７０１．３［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ｃを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝７．８７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６９－７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４３－７．３６（ｍ，２Ｈ），７．３３－７．２０（ｍ，４Ｈ），７．１５－７．０５（ｍ，３Ｈ），６．９５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８９－６．７０（ｍ，４Ｈ），４．２８（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝５．９，９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１７－４．０９（ｍ，２Ｈ），４．００－３．９１（ｍ，３Ｈ），３．１９－３．０９（ｍ，２Ｈ），３．０２－２．８８（ｍ，２Ｈ），２．４６－２．３８（ｍ，２Ｈ），１．７３－１．６２（ｍ，２Ｈ），１．５６－１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ），０．９３（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，３Ｈ）。
２．４ 非天然アミノ酸（ａａ１３）の合成
スキーム５は、非天然アミノ酸（ａａ１３）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）ＨＡＴＵ（１．５当量），ＤＨＰ（１．０当量），ＤＩＰＥＡ（３．０当量），ＤＣＭ，２５℃，２時間；（ｂ）１０％Ｐｄ／Ｃ，ＭｅＯＨ，２５℃，５時間。
本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている国際公開第２０１０／０５２２５３号に従い、ａａ１３－１を調製した。
工程１：ベンジル ２，２－ジメチル－３－オキソ－３－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）アミノ）プロパノアート（ａａ１３－２）の合成
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のａａ１３－１（２００ｍｇ，８９９．９４μｍｏｌ，１当量）、ＨＡＴＵ（５１３．２８ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＤＩＰＥＡ（３４８．９３ｍｇ，２．７０ｍｍｏｌ，４７０．２６μＬ，３当量）の溶液を、２５℃で１０分間撹拌した。Ｏ－テトラヒドロピラン－２－イルヒドロキシルアミン（１０５．４２ｍｇ，８９９．９４μｍｏｌ，１当量）を混合物に加え、２５℃で２時間撹拌した。反応物をＤＣＭ（５ｍＬ）に加え、ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５ｍＬ）で洗浄した。水層を分離し、ＤＣＭ（５ｍＬ）で抽出した。有機層を組み合わせ、塩水（５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮し、黄色油として粗生成物を得た。これをフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～３５％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（３０ｍＬ／分）の溶出）により精製し、無色の油としてａａ１３－２（２３０ｍｇ，７１５．６９μｍｏｌ，収率７９．５３％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝９．２８－９．１４（ｍ，１Ｈ），７．３８－７．３０（ｍ，５Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），４．８７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．９３－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，１Ｈ），１．７６（ｂｒ ｓ，３Ｈ），１．６５－１．５８（ｍ，１Ｈ），１．５６－１．５２（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，６Ｈ）
工程２：２，２－ジメチル－３－オキソ－３－（（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）アミノ）プロパン酸（ａａ１３）の合成
ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中、ａａ１３－２（２３０ｍｇ，７１５．６９μｍｏｌ，１当量）及び１０％Ｐｄ／Ｃ（２３ｍｇ）の黒色懸濁液を、２５℃、１５ＰｓｉのＨ２で５時間撹拌した。反応物をセライトパッドに通して濾過し、ケーキをＭｅＯＨ（５ｍＬ＊３）で洗浄した。濾液を真空状態で濃縮し、ａａ１３（１２０ｍｇ，５１８．９３μｍｏｌ，収率７２．５１％）を無色の油として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ＝４．９０－４．８８（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．５９－３．５３（ｍ，１Ｈ），１．８５－１．６８（ｍ，３Ｈ），１．６８－１．５１（ｍ，３Ｈ），１．４０（ｓ，６Ｈ）。
２．５ 非天然アミノ酸（ａａ１４）の合成
スキーム６は、非天然アミノ酸（ａａ１４）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）ａａ－１４－１ａ（１．０当量），ジオキサン，５０℃、１５時間；（ｂ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（２．０当量），ＴＨＦ／Ｈ２０＝１／１，５０℃、１６時間；（ｃ）１０％Ｐｄ／Ｃ触媒ＴＦＡ，ＥｔＯＨ
化合物ａａ１４－１を米国特許出願公開第２０１５／３８０６６６号に従って調製した。
工程１：メチル２－（１－ベンジル－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－２ーメチルプロパノアート（ａａ１４－３）の合成
ジオキサン（３０ｍＬ）中、ａａ１４－１（２．７６ｇ，１３．８５ｍｍｏｌ，１当量）とａａ１４－１ａ（２．２０ｇ，１３．８５ｍｍｏｌ，１当量）との混合物を、５０℃で１５時間撹拌した。反応物を濾過し、濾液を真空状態で濃縮し、粗生成物を褐色油として得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～２０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（２５ｍＬ／分）の溶出）で精製し、淡黄色の油としてａａ１４－２（０．９ｇ，３．４８ｍｍｏｌ，収率２５．１５％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．５３（ｓ，１Ｈ），７．２９－７．２６（ｍ，１Ｈ），７．２３－７．１６（ｍ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），５．２３（ｓ，２Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），１．５６（ｓ，６Ｈ）
工程２：メチル２－（１－ベンジル－１Ｈ－ピラゾール－５－イル）－２ーメチルプロパノアート（ａａ１４－３）の合成
ＴＨＦ（５．４ｍＬ）中、ａａ１４－２（７００ｍｇ，２．７１ｍｍｏｌ，１当量）とＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（１Ｍ，５．４２ｍＬ，２当量）との混合物を、５０℃で１６時間撹拌した。反応物を真空状態で濃縮し、ＴＨＦを除去した。反応物を水（５ｍＬ）及びＭＴＢＥ（５ｍＬ）で希釈した。水層を分離し、１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを６に調整した。有機層を廃棄した。水層をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ＊３）で抽出した。有機層を組み合わせ、塩水（５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮し、白色固体としてａａ１４－３（６００ｍｇ，２．４６ｍｍｏｌ，収率９０．６４％）を得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．５３（ｓ，１Ｈ），７．２６－７．１７（ｍ，３Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），６．２４（ｓ，１Ｈ），５．２３（ｓ，２Ｈ），１．５４（ｓ，６Ｈ）。
工程３：２－メチル－２－（１Ｈ－ピラゾール－５－イル）プロパン酸（ａａ１４）の合成
ＥｔＯＨ（５ｍＬ）中、ａａ１４－３（５００ｍｇ，２．０５ｍｍｏｌ，１当量）と、ＴＦＡ（２３．３４ｍｇ，２０４．６８μｍｏｌ，１５．１５μＬ，０．１当量）と、１０％Ｐｄ／Ｃ（１００ｍｇ）との混合物を、８０℃、１００ＰｓｉのＨ２で１６時間撹拌した。反応物をセライトパッドに通して濾過し、ケーキをＥｔＯＨ（５ｍＬ＊３）で洗浄した。濾液を真空状態で濃縮し、ａａ１４（３００ｍｇ，１．５２ｍｍｏｌ，収率７４．２７％，純度７８．１１％）を淡黄色の油として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．０３６分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７Ｈ１１Ｎ２Ｏ２ ［Ｍ＋Ｈ］＋１５５．０７，ｆｏｕｎｄ １５５．０。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ＝７．５７－７．５０（ｍ，１Ｈ），６．２６（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），１．５６（ｓ，６Ｈ）。
２．６ 非天然アミノ酸［ａａ２０：（Ｒ）－異性体及びａａ２１：（Ｓ）－異性体］の合成
スキーム７は、非天然アミノ酸（ａａ２０）及び（ａａ２１）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）ＮａＨ（１．２当量），ジブロモエタン（２当量），ＴＨＦ（２５ｍｌ），０～１００°Ｃ，１６時間；（ｂ）２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エタンアミン（０．９当量），ＤＭＦ（５ｍｌ），６０°Ｃ，１６時間；（ｃ）ＬｉＯＨ（４当量），Ｈ２Ｏ（１０ｍｌ），ＴＨＦ（１０ｍｌ），２０°Ｃ，１６時間；（ｄ）ＳＦＣ分離。
工程１：ジエチル２－（２－ブロモエチル）－２－メチルマロナート（ａａ２０－２）の合成
一定量のＴＨＦ（１０ｍＬ）を、Ｎ２雰囲気下でＮａＨ（２５２．５７ｍｇ，６．３１ｍｍｏｌ，純度６０％，１．１当量）に加えた。ＴＨＦ溶液を０℃に冷却した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中、化合物ａａ２０－１（１ｇ，５．７４ｍｍｏｌ，９８０．３９μＬ，１当量）を３０分間にわたって撹拌させながら加えた。反応混合物を２０℃で６０分間撹拌した。生成されたエノラートを、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１，２－ジブロモエタン（２．１６ｇ，１１．４８ｍｍｏｌ，８６６．２３μＬ，２当量）に窒素雰囲気下で６０分間にわたって撹拌させながら滴下した。次いで、反応混合物を溶媒中で１４時間、１００℃に加熱した。ＴＬＣは、反応物が消費され、極性が低い主要な新規スポットが１つ検出されたことを示した。残渣を１Ｎ ＨＣｌに注ぎ、ｐＨを２～４に調整した。続いて水相を酢酸エチル（３０ｍＬ＊３）で抽出した。組み合わせた有機相を塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮した。その残渣を、０．８Ｌの溶媒を用いたフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２４ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～２０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（２０ｍＬ／分）の溶出）で４０分間精製した。化合物ａａ２０－２（１．２ｇ，４．２７ｍｍｏｌ，収率７４．３５％）を淡黄色の液体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ４．１８（ｑ，Ｊ＝７．２０Ｈｚ，４Ｈ），３．３３－３．４１（ｍ，２Ｈ），２．３９－２．４７（ｍ，２Ｈ），１．４３（ｓ，３Ｈ），１．２２（ｓ，６Ｈ）
工程２：エチル３－メチル－２－オキソ－１－（２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル）ピロリドン－３－カルボキシラート（ａａ２０－３）の合成
イミダゾールＤＭＦ（１０ｍＬ）中の２－（１－トリチル－１Ｈ－－５－イル）エタンアミン（１ｇ，２．８３ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ａａ２０－２（８７４．９５ｍｇ，３．１１ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えた。混合物を６０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、物質が完全に消費され、主生成物として所望の生成物が観察されたことを示した。残渣を水（１００ｍＬ）に注いだ（１００ｍＬ）。水相を酢酸エチル（５０ｍＬ＊３）で抽出した。組み合わせた有機相を塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮した。粗生成物を、Ｃ－１８逆相クロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇ，Ｃ－１８カラム、０～１００％のアセトニトリル／Ｈ２Ｏ勾配（４０ｍＬ／分）の溶出、総体積２４００ｍＬで６０分間）で精製し、黄色固体を得た。化合物ａａ２０－３（６５０ｍｇ，９０３．４７μｍｏｌ，収率３１．９３％、純度７０．５５％）を黄色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８６１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ３４Ｎ３Ｏ３ ５０８．２５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ５０８．３。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程３：３－メチル－２－オキソ－１－（２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル）ピロリドン－３－カルボン酸（ａａ２０－４）の合成
ａａ２０－３（６５０ｍｇ，１．２８ｍｍｏｌ，１当量）の混合物に、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）及びＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（２６８．６７ｍｇ，６．４０ｍｍｏｌ，５当量）を加えた。混合物を２０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、物質が完全に消費され、主生成物として所望の生成物が観察されたことを示した。残渣をＨ２Ｏ（５０ｍＬ）に注ぎ、５％のＫＨＳＯ４を加え、ｐＨを２～３に調整した。水相を酢酸エチル（５０ｍＬ＊３）で抽出した。組み合わせた有機相を塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮した。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｍａｘ－ＲＰ ２５０＊５０ｍｍ＊１０ｕｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３０％～６０％，６０分）で精製し、ａａ２０－４（１８０ｍｇ，３７５．３４μｍｏｌ，収率２９．３１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．３９１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ３０Ｎ３Ｏ３ ４８０．６，ｆｏｕｎｄ ４８０．３［Ｍ＋Ｈ］＋。Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
１Ｈ ＮＭＲ（ＥＳ８５８６－４９６－Ｐ１Ｂ１）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ７．９２（ｓ，１Ｈ），７．３５－７．４２（ｍ，９Ｈ），７．１２－７．１９（ｍ，６Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），３．３９－３．６４（ｍ，３Ｈ），３．３２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．７５Ｈｚ，１Ｈ），２．８４（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．９５Ｈｚ，２Ｈ），２．３４－２．４２（ｍ，１Ｈ），１．８６（ｔｄ，Ｊ＝７．９９，１２．９０Ｈｚ，１Ｈ），１．２５（ｓ，３Ｈ）
工程４：（Ｒ）－３－メチル－２－オキソ－１－（２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル）ピロリジン－３－カルボン酸（ａａ２０）及び（Ｓ）－３－メチル－２－オキソ－１－（２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル）ピロリジン－３－カルボン酸（ａａ２１）の合成
ａａ２０（Ｒ）及びａａ２１（Ｓ）の絶対配置は確認されなかった。
化合物ａａ２０－４（１８０ｍｇ，３７５．３４μｍｏｌ）を、分取ＳＦＣ（カラム：ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＩＣ（２５０ｍｍ＊３０ｍｍ，１０μｍ；移動相：０．１％ＮＨ３Ｈ２Ｏ ＭＥＯＨ；Ｂ％：５０％～５０％，８０分）で精製した。異性体（Ｒ）であるａａ２０（８６ｍｇ，１７７．１８μｍｏｌ，収率９４．４１％，純度９８．８％）を白色固体として得て、異性体（Ｓ）であるａａ２１（８５ｍｇ，１７５．２９μｍｏｌ，収率９３．４１％，純度９８．９％）もまた白色固体として得た。
ＳＦＣ－ＨＰＬＣ上での異性体ａａ２０：ＲＴ＝２．３４６分。ＨＰＬＣ条件：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ－３ １００×４．６ｍｍ（内径），３μｍ，流量２．８ｍＬ／分。４０％のメタノール（０．０５％ＤＥＡ）（溶媒Ｂ）の勾配及びＣＯ２（溶媒Ａ）で溶出。
ＳＦＣ－ＨＰＬＣ上での異性体ａａ２１：ＲＴ＝３．６０７分。ＨＰＬＣ条件：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＩＣ－３ １００×４．６ｍｍ（内径），３μｍ，流量２．８ｍＬ／分。４０％のメタノール（０．０５％ＤＥＡ）（溶媒Ｂ）の勾配及びＣＯ２（溶媒Ａ）で溶出。
２．７ 非天然アミノ酸［ａａ２２：（Ｒ）－異性体及びａａ２３：（Ｓ）－異性体］の合成
スキーム８は、非天然アミノ酸（ａａ２２）及び（ａａ２３）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）ＴｒｔＣｌ（１．２当量），Ｅｔ３Ｎ（２当量），ＤＭＦ，２０°Ｃ，２時間，３１％；（ｂ）ＴｓＣｌ（１．５当量），Ｅｔ３Ｎ（３当量），ＤＭＡＰ（０．５当量），ＤＣＭ，２０°Ｃ，２時間，６６％；（ｃ）ａａ２２－３（１．０当量），ａａ２２－３ａ（１．２当量），ＬｉＩ（１．５当量），ＤＩＰＥＡ（４当量），６０°Ｃ，２当量，収率１７％；（ｄ）ａａ２２－３（１．０当量），ａａ２２－３ｂ（１．２当量），ＬｉＩ（１．５当量），Ｋ２ＣＯ３（４当量），２０°Ｃ，３当量，収率５８％；（ｅ）ＮａＯＨ（２当量），ＭｅＯＨ／水，２０°Ｃ，２時間，収率８７％。
工程１：２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エタノール（ａａ２２－２）の合成
ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のａａ２２－１（２ｇ，１７．８４ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＴＥＡ（３．６１ｇ，３５．６７ｍｍｏｌ，４．９７ｍＬ，２当量）、［クロロ（ジフェニル）メチル］ベンゼン（５．９７ｇ，２１．４０ｍｍｏｌ，１．２当量）を２０℃で加えた。反応混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）で監視した。これは、出発物質が消費され、新規スポットが１つ観察されたことを示していた。反応混合物をＮａＨＣＯ３（飽和水溶液、２０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ＊２）で抽出した。組み合わせた有機層を塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～１００％の酢酸エチル／石油エーテル、その後０～１０％のＭｅＯＨ（０．５％ＴＥＡ添加）／ＤＣＭ勾配（３０ｍＬ／分）の溶出）で２５分、総体積１．６Ｌで精製した。化合物ａａ２２－２（２．２ｇ，５．５９ｍｍｏｌ，収率３１．３２％，純度９０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．３９７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２３Ｎ２Ｏ ３５５．２，ｆｏｕｎｄ ３５５．２［Ｍ＋Ｈ］＋；方法Ｂを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．３９－７．３１（ｍ，１０Ｈ），７．１７－７．１１（ｍ，６Ｈ），６．６３－６．５７（ｍ，１Ｈ），３．８９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）。
工程２：２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エチル４－メチルベンゼンスルホナート（ａａ２２－３）の合成
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のａａ２２－２（２．２ｇ，５．５９ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＴＥＡ（１．７０ｇ，１６．７６ｍｍｏｌ，２．３３ｍＬ，３当量）、４－メチルベンゼンスルホニルクロリド（１．６０ｇ，８．３８ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＤＭＡＰ（３４１．２３ｍｇ，２．７９ｍｍｏｌ，０．５当量）を２０℃で加えた。反応混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視したところ、これは出発物質が残っていないことと所望の生成物の形成を示していた。反応混合物をＮａＨＣＯ３（飽和水溶液、５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ＊２）で抽出した。組み合わせた有機層を塩水（２０ｍＬ×２）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２４ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～５％のＭｅＯＨ（４％ＴＥＡ添加）／ＤＣＭ勾配（２０ｍＬ／分）の溶出）で３５分、総体積１．２Ｌで精製した。化合物ａａ２２－３（２．１ｇ，３．７２ｍｍｏｌ，収率６６．５２％，純度９０％）を褐色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７７５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３１Ｈ２８Ｎ２Ｏ３ＳＮａ ５３１．２［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ５３１．１。方法Ｄを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．７３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３８－７．２８（ｍ，１２Ｈ），７．１５－７．０８（ｍ，６Ｈ），６．６１（ｓ，１Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９１－２．８６（ｍ，２Ｈ），２．４２（ｓ，３Ｈ）。
工程３：（Ｒ）－１－（２－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）エチル）ピロリドン－３－カルボン酸（ａａ２２）の合成
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ２２－３（５００ｍｇ，９８３．０３μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ａａ２２－３ａ（１３５．８１ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＬｉＩ（１９７．３６ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ，５６．５５μＬ，１．５当量）及びＤＩＰＥＡ（５０８．２０ｍｇ，３．９３ｍｍｏｌ，６８４．９１μＬ，４．０当量）を加えた。続いて、混合物を６０℃に加熱し、６０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応物が完全に消費され、所望のＭＳが検出されたことを示した。水（１０ｍＬ）を加えて反応混合物をクエンチし、続いてＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、続いてＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ＊２）で抽出した。水層を２Ｍ ＨＣｌでｐＨ６に酸性化した。続いて水相をＤＣＭ（２０ｍＬ＊５）で抽出した。組み合わせた有機層を濃縮し、残渣を得た。粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（中性条件）で精製した。生成物ａａ２２（８０ｍｇ，１６８．３１μｍｏｌ，収率１７．１２％、純度９５％）をオフホワイト色の固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．９８６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ３０Ｎ３Ｏ２ ４５２．２３，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ４５２．３［Ｍ＋Ｈ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程４：（３Ｓ）－１－［２－（１－トリチルイミダゾール－４－イル）エチル］ピロリジン－３－カルボキシラート（ａａ２３－１）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のａａ２２－３（７５０ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（８１５．１７ｍｇ，５．９０ｍｍｏｌ，４当量）、ａａ２２－３ｂ（２９３．０５ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ，１．２当量，ＨＣｌ）及びＬｉＩ（２９６．０４ｍｇ，２．２１ｍｍｏｌ，８４．８３μＬ，１．５当量）を２０℃で加えた。反応混合物を２０℃で３時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視したところ、これは出発物質が残っていないことと所望の生成物の形成を示していた。混合物を２５℃に冷却し、水（３０ｍＬ）に注ぎ、５分間撹拌した。水相を酢酸エチル（５０ｍＬ＊２）で抽出した。組み合わせた有機相を塩水（１５ｍＬ＊２）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮した。その残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～１００％の酢酸エチル／石油エーテル、その後０～１０％のＭｅＯＨ（０．５％ＴＥＡ添加）／ＤＣＭ勾配（３０ｍＬ／分）の溶出）で２５分、総体積１．６Ｌで精製した。生成物ａａ２３－１（４２０ｍｇ，８５６．９９μｍｏｌ，収率５８．１２％，純度９５％）を褐色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７１７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ３１Ｎ３Ｏ２ ４６６．２［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４６５．９；ＬＣ－ＭＳ条件：方法Ｄを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．４０－７．３０（ｍ，１０Ｈ），７．２０－７．０９（ｍ，６Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），３．７５－３．６４（ｍ，３Ｈ），３．１０－２．９５（ｍ，２Ｈ），２．８３－２．７４（ｍ，５Ｈ），２．７２－２．６４（ｍ，１Ｈ），２．５５（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），２．１４－２．０７（ｍ，２Ｈ）。
工程５：（３Ｓ）－１－［２－（１－トリチルイミダゾール－４－イル）エチル］ピロリジン－３－カルボキシラート（ａａ２３）の合成
ＭｅＯＨ（３ｍＬ）と水（３ｍＬ）中のａａ２３－１（３９０．００ｍｇ，８３７．６６μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＮａＯＨ（６７．０１ｍｇ，１．６８ｍｍｏｌ，２当量）を２０℃で加えた。反応混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視したところ、これは出発物質が残っていないことと所望の生成物の形成を示していた。完了後、反応混合物を室温に冷却した。反応混合物を減圧下で濃縮し、溶媒を除去した。１Ｍ ＨＣｌを用いて残渣のｐＨを６に調整し、凍結乾燥で乾燥させた。残渣をＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１（１５ｍＬ＊３）でトリチュレートした。組み合わせた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮した。生成物ａａ２３（３５０ｍｇ，７３６．３４μｍｏｌ，収率８７．９０％、純度９５％）を褐色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７０８分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ３０Ｎ３Ｏ２ ４５２．２［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４５１．９；方法Ｄを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．３８（ｓ，１Ｈ），７．３６－７．３１（ｍ，９Ｈ），７．１２（ｄｄ，Ｊ＝３．３，６．３Ｈｚ，６Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），３．８３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．５６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．２０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１８．５Ｈｚ，２Ｈ），３．０５－２．９６（ｍ，４Ｈ），２．６５－２．６１（ｍ，１Ｈ），２．４２－２．３０（ｍ，１Ｈ），２．１８－２．０９（ｍ，１Ｈ）。
２．８ 非天然アミノ酸（ａａ２７）の合成
スキーム９は、非天然アミノ酸（ａａ２７）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）ＨＣｌ／ジオキサン，０～２５°Ｃ，２時間，１００％；（ｂ）ＣｂｚＣｌ（１．２当量），ＨＯＳｕ（１．３当量），ＤＩＰＥＡ（２当量），ＤＣＭ，０～２０℃，１２時間，９６％；（ｃ）３ａ（２当量），Ｋ２ＣＯ３（２当量），６０°Ｃ，１２時間，５６％；（ｄ）ＬｉＯＨ（２．０当量），ＴＨＦ，Ｈ２Ｏ，２０°Ｃ，１２時間，９４％；（ｅ）Ｈ２，Ｐｄ（ＯＨ）２，ＡｃＯＨ，ＭｅＯＨ，２０℃，１２時間；（ｆ）ＦｍｏｃＯＳｕ（１．２当量），ＮａＨＣＯ３（２．０当量），ＴＨＦ，Ｈ２Ｏ，０～２０℃，１２時間，４４％；（ｇ）ＰｈＮＨ２（１．１当量），ＤＩＣ（１．０当量），ＨＯＢｔ（１．０当量），ＤＣＭ，０～２０℃，１時間，７６％；（ｈ）ピペリジン（５．０当量），ＤＭＦ，２０℃，１時間，６５％。
工程１：メチル（２Ｓ）－２－アミノ－３－［４－（２－エチル－４－ヒドロキシ－フェニル）フェニル］プロパノアート（ａａ２７－２）の合成
化合物ａａ２７－１（３．５ｇ，８．７６ｍｍｏｌ，１当量）を、ＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ，１００ｍＬ，４５．６５当量）中に０℃で溶解した。混合物を２５℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。反応混合物を減圧下で濃縮し、粗生成物を得た。化合物ａａ２７－２（２．６ｇ，粗）を無色の油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７７２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ２２ＮＯ３ ３００．１６［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ３００．００［Ｍ＋Ｈ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程２：メチル（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－３－［４－（２－エチル－４－ヒドロキシ－フェニル）フェニル］プロパノアート（ａａ２７－３）の合成
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中のＨＯＳｕ（１．２５ｇ，１０．８６ｍｍｏｌ，１．３当量）溶液に、ＤＩＰＥＡ（３．２４ｇ，２５．０５ｍｍｏｌ，４．３６ｍＬ，３当量）及びＣｂｚＣｌ（１．５７ｇ，９．１９ｍｍｏｌ，１．３１ｍＬ，１．１当量）を０℃で加えた。２５℃で２時間撹拌した後、化合物 ａａ２７－２（２．５ｇ，８．３５ｍｍｏｌ，１当量）を加え、混合物を２０℃で１０時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳ及びＴＬＣで監視した。混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ＊２）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して残渣を得た。続いてカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，石油エーテル／酢酸エチル＝２／１）で精製した。化合物ａａ２７－３（３．５ｇ，８．０７ｍｍｏｌ，収率９６．６８％）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９９２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２７ＮＮａＯ５ ４５６．１８，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ４５６．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ９．３５（ｓ，１Ｈ）７．８８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ，１Ｈ）７．２１－７．３８（ｍ，７Ｈ）７．１５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ，２Ｈ）６．９３（ｄ，Ｊ＝８．３１Ｈｚ，１Ｈ）６．７０（ｄ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ，１Ｈ）６．６３（ｄｄ，Ｊ＝８．０７，２．４５Ｈｚ，１Ｈ）４．９９（ｂｒ ｓ，２Ｈ）４．２４－４．３６（ｍ，１Ｈ）３．６０－３．６５（ｍ，３Ｈ）３．０７（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１３．６９，４．８９Ｈｚ，１Ｈ）２．９１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１３．５７，１０．３９Ｈｚ，１Ｈ）２．４０－２．４８（ｍ，２Ｈ）０．９９（ｔ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，３Ｈ）。
工程３：（Ｓ）－メチル２－（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ－３－（４’－（４－（（ｔｅｒｔーブトキシカルボニル）アミノ）ブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパノアート（ａａ２７－４）の合成
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中のａａ２７－３（３．３ｇ，７．６１ｍｍｏｌ，１当量）とａａ２７－３ａ（５．２３ｇ，１５．２３ｍｍｏｌ，２当量）の溶液に、Ｋ２ＣＯ３（２．１０ｇ，１５．２３ｍｍｏｌ，２当量）を加えた。混合物を６０℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳ及びＴＬＣで監視した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（８０ｍＬ×３）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して残渣を得た。続いてカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，石油エーテル／酢酸エチル＝１０／１～２／１）で精製した。化合物ａａ２７－４（２．９ｇ，４．３２ｍｍｏｌ，収率５６．７０％，純度９０％）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１４０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４４Ｎ２ＮａＯ７ ６２７．３０［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ６２７．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程４：（Ｓ）－２－（（（ベンジルオキシ）カルボニル）アミノ－３－（４’－（４－（（ｔｅｒｔーブトキシカルボニル）アミノ）ブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸（ａａ２７－５）の合成
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中のａａ２７－４（２．７ｇ，４．４６ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）中のＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（３７４．７２ｍｇ，８．９３ｍｍｏｌ，２当量）の溶液を加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。１Ｍ ＨＣｌを用いて混合物のｐＨを３～４に調整し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ＊３）を用いて抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して生成物を得た。化合物ａａ２７－５（２．５ｇ，４．２３ｍｍｏｌ，収率９４．７９％）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．０８２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ４２Ｎ２ＮａＯ７ ６１３．２９，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ６１３．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ７．２９－７．３６（ｍ，５Ｈ）７．１４－７．２１（ｍ，４Ｈ）７．０７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，１Ｈ）６．８１（ｓ，１Ｈ）６．７３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，１Ｈ）５．２７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，１Ｈ）５．０５－５．１６（ｍ，２Ｈ）４．６８－４．７５（ｍ，１Ｈ）４．５０－４．６８（ｍ，２Ｈ）３．９９（ｂｒ ｓ，２Ｈ）３．２０－３．２８（ｍ，２Ｈ）２．５３（ｑ，Ｊ＝７．４２Ｈｚ，２Ｈ）１．６２－１．６８（ｍ，２Ｈ）１．５１－１．５７（ｍ，２Ｈ）１．４４（ｂｒ ｓ，９Ｈ）１．０７（ｔ，Ｊ＝７．４６Ｈｚ，３Ｈ）。
工程５：（２Ｓ）－２－アミノ－３－［４－［４－［４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］プロパン酸（ａａ２７－６）の合成
ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中のａａ２７－５（１．５ｇ，２．５４ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ（３００ｍｇ，２１３．６２μｍｏｌ，純度１０％）及びＡｃＯＨ（１０５．００ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ，０．１ｍＬ）を加えた。混合物を２０℃、Ｈ２下で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物を濾過し、濃縮して粗生成物を得た。化合物ａａ２７－６（１．１６ｇ，粗）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８９０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３６Ｎ２ＮａＯ５ ４７９．２５，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ４７９．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程６：（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（４’－（４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）プロパン酸（ａａ２７－７）の合成
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のａａ２７－６（１．１６ｇ，２．５４ｍｍｏｌ，１当量）溶液に、Ｈ２Ｏ（８ｍＬ）中のＮａＨＣＯ３（４２６．６４ｍｇ，５．０８ｍｍｏｌ，１９７．５２μＬ，２当量）及びＦｍｏｃ－ＯＳｕ（１．０３ｇ，３．０５ｍｍｏｌ，１．２当量）を０℃で加えた。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物のｐＨを３～４に調整し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ＊２）を用いて抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して残渣を得た。続いて分取ＨＰＬＣ（ＡｃＯＨ条件；ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ，０～１００％）で精製した。化合物ａａ２７－７（９５０ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ，収率４４．０９％、純度８０％）を無色の油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１４２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４１Ｈ４６Ｎ２ＮａＯ７ ７０１．３２，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７０１．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝４．３３分；移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４Ｌ ＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で２分間保持；カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ３．０＊５０ｍｍ，３μｍを使用。
ＳＦＣ：ＲＴ＝０．５９８分，カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－３ ５０×４．６ｍｍ（内径），３μｍ；移動相：Ａ：ＣＯ２：Ｂ：エタノール（０．０５％ＤＥＡ）イソクラティック：４０％Ｂ；流量：４ｍＬ／分。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ７．２９－７．３６（ｍ，５Ｈ）７．１４－７．２１（ｍ，４Ｈ）７．０７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．５６Ｈｚ，１Ｈ）６．８１（ｓ，１Ｈ）６．７３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，１Ｈ）５．２７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，１Ｈ）５．０５－５．１６（ｍ，２Ｈ）４．６８－４．７５（ｍ，１Ｈ）４．５０－４．６８（ｍ，２Ｈ）３．９９（ｂｒ ｓ，２Ｈ）３．２０－３．２８（ｍ，２Ｈ）２．５３（ｑ，Ｊ＝７．４２Ｈｚ，２Ｈ）１．６２－１．６８（ｍ，２Ｈ）１．５１－１．５７（ｍ，２Ｈ）１．４４（ｂｒ ｓ，９Ｈ）１．０７（ｔ，Ｊ＝７．４６Ｈｚ，３Ｈ）。
工程７：９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［（１Ｓ）ー２－アニリノ－１－［［４－］４－］４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］カルバマート（ａａ２７－８）の合成
ＤＣＭ（１．５ｍＬ）中のａａ２７－７（２５０ｍｇ，３６８．２９μｍｏｌ，１当量）及びＨＯＢｔ（４９．７６ｍｇ，３６８．２９μｍｏｌ，１当量）の溶液に、アニリン（３６．０１ｍｇ，３８６．７１μｍｏｌ，３５．３１μＬ，１．０５当量）及びＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のＤＩＣ（４６．４８ｍｇ，３６８．２９μｍｏｌ，５７．０３μＬ，１当量）の溶液を０℃で加えた。混合物を２０℃で１時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ＊２）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して残渣を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～５０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（２０ｍＬ／分）の溶出）で精製した。化合物ａａ２７－８（２２０ｍｇ，２８３．０５μｍｏｌ，収率７６．８６％、純度９７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１９８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５１Ｎ３ＮａＯ６ ７７６．３７，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７７７．３［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．０７分、方法Ｄを使用して逆相ＨＰＬＣ分析を実施した。ＳＦＣ：ＲＴ＝２．１８６分；カラム：キラルセル ＯＤ－３．５０×４．６ｍｍ（内径），３μｍ；移動相：Ａ：ＣＯ２ Ｂ：エタノール（０．０５％ＤＥＡ）；イソクラティック：４０％Ｂ；流量：４ｍＬ／分。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ７．７４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，２Ｈ）７．５１－７．５８（ｍ，３Ｈ）７．３０－７．４０（ｍ，４Ｈ）７．２８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，４Ｈ）７．１７－７．２４（ｍ，４Ｈ）７．０７－７．１１（ｍ，１Ｈ）７．０２（ｄ，Ｊ＝８．３１Ｈｚ，１Ｈ）６．８１（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ）６．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．３１，２．４５Ｈｚ，１Ｈ）５．５７（ｂｒ ｓ，１Ｈ）４．３２－４．６９（ｍ，４Ｈ）４．２０（ｔ，Ｊ＝６．７２Ｈｚ，１Ｈ）３．９９（ｔ，Ｊ＝６．２４Ｈｚ，２Ｈ）３．０６－３．２９（ｍ，４Ｈ）２．４９（ｑ，Ｊ＝７．４２Ｈｚ，２Ｈ）１．７７－１．８７（ｍ，２Ｈ）１．６８（ｄｔ，Ｊ＝１４．５５，７．１５Ｈｚ，２Ｈ）１．４４（ｓ，９Ｈ）１．０３（ｔ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，３Ｈ）。
工程８：ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［４－［４－［４－［（２Ｓ）－２－アミノ－３－アニリノ－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ブチル］カルバマート（ａａ２７）の合成
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ２７－８（２２０ｍｇ，２９１．８１μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ピペリジン（１２４．２４ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ，５当量）の溶液を加えた。混合物を２０℃で１時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ＊３）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して残渣を得た。続いてカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ＝１：０～５：１）で精製した。化合物ａａ２７（１０５ｍｇ，１９１．５６μｍｏｌ，収率６５．６５％、純度９７％）を黄色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９５３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３２Ｈ４１Ｎ３ＮａＯ４ ５５４．３０，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ５５４．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．１３分、方法Ｃを使用して逆相ＨＰＬＣ分析を実施した。
ＳＦＣ：ＲＴ＝３．１８５分：カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＳ－３ １００×４．６ｍｍ（内径），３μｍ；移動相：Ａ：ＣＯ２：Ｂ：エタノール（０．１％エタノールアミン）；勾配：４。５分間でＢを５％～４０％、２．５分間で４０％保持、続いて１分間Ｂを５％；流量：２．８ｍＬ／分。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ ｐｐｍ ９．４５（ｓ，１Ｈ）７．６０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，２Ｈ）７．３３（ｔ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，２Ｈ）７．２０－７．２９（ｍ，４Ｈ）７．０６－７．１３（ｍ，２Ｈ）６．８４（ｄ，Ｊ＝２．２０Ｈｚ，１Ｈ）６．７５（ｄｄ，Ｊ＝８．３１，２．４５Ｈｚ，１Ｈ）４．６８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）４．０１（ｔ，Ｊ＝６．１１Ｈｚ，２Ｈ）３．８２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．３８Ｈｚ，１Ｈ）３．４１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１３．８２，３．３０Ｈｚ，１Ｈ）３．１３－３．２７（ｍ，２Ｈ）２．８４（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１３．８２，９．９０Ｈｚ，１Ｈ）２．５６（ｑ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ，２Ｈ）１．７９－１．８６（ｍ，２Ｈ）１．６９（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，２Ｈ）１．４５（ｓ，９Ｈ）１．０９（ｔ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，３Ｈ）
２．９ 非天然アミノ酸（ａａ２８）の合成
スキーム１０は、非天然アミノ酸（ａａ２８）の合成を概説している：
試薬及び条件：（ａ）ＰｈＮＨ２（１．１当量），ＤＩＣ（１．０当量），ＨＯＢＴ（１．０当量），ＤＣＭ，０～２０℃，１時間；（ｂ）ピペリジン（３．０当量），ＤＭＦ，２０℃，１２時間，５２％；（ｃ）３ａ（１当量），ＤＩＣ（１．０当量），ＨＯＢＴ（１．０当量），ＤＣＭ，０～２０℃，１時間，６１％；（ｄ）ピペリジン（１５．０当量），ＤＭＦ，２０℃，０．５時間，４１％。
工程１：９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［（１Ｓ）－４－（３，５－ジメチルフェニル）－１－（フェニルカルバモイル）ブチル］カルバマート（ａａ２８－１）の合成
ＤＣＭ（１．５ｍＬ）中のａａ１（３００ｍｇ，６７６．３９μｍｏｌ，１当量）及びＨＯＢｔ（９１．４０ｍｇ，６７６．３９μｍｏｌ，１当量）の溶液に、アニリン（６６．１４ｍｇ，７１０．２１μｍｏｌ，６４．８４μＬ，１．０５当量）を０℃で加えた。ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のＤＩＣ（８５．３６ｍｇ，６７６．３９μｍｏｌ，１当量）の溶液を、混合物に加えた。反応物を２０℃で１時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ＊２）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して粗生成物を得た。化合物ａａ２８－１（４００ｍｇ，粗）を黄色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．１７８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３４Ｈ３５Ｎ２Ｏ３ ＋５１９．２６［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ５１９．１［Ｍ＋Ｈ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
工程２：（２Ｓ）－２－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－Ｎ－フェニル－ペンタンアミド（ａａ２８－２）の合成
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ２８－１（４００ｍｇ，７７１．２４μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ピペリジン（１９７．０１ｍｇ，２．３１ｍｍｏｌ，３当量）を２０℃で加えた。反応物を２０℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳ及びＴＬＣで監視した。混合物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ＊３）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して残渣を得た。続いてフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～１００％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（２０ｍＬ／分）の溶出）で精製した。化合物ａａ２８－２（１５０ｍｇ，３９９．７９μｍｏｌ，収率５１．８４％、純度７９％）を黄色の泡として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８６１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２５Ｎ２Ｏ ２９７．２［Ｍ＋Ｈ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ２９７．１［Ｍ＋Ｈ］＋。方法Ａを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ ｐｐｍ ９．４６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｔ，Ｊ＝７．９５Ｈｚ，２Ｈ），７．０７－７．１４（ｍ，１Ｈ），６．７８－６．８６（ｍ，４Ｈ），３．５１（ｄｄ，Ｊ＝７．９５，４．２８Ｈｚ，１Ｈ），２．５７－２．６４（ｍ，２Ｈ），２．２９（ｓ，６Ｈ），１．６７－１．８１（ｍ，４Ｈ）。
工程３：９Ｈ－フルオレン－９－イルメチルＮ－［（１Ｓ）－１－［［４－］４－］４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－４－（３，５－ジメチルフェニル）－１－（フェニルカルバモイル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］カルバマート（ａａ２８－３）の合成
ＤＣＭ（２．５ｍＬ）中のａａ２ｂ（３４３．５２ｍｇ，５０６．０６μｍｏｌ，１当量）及びＨＯＢｔ（６８．３８ｍｇ，５０６．０６μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ａａ２８－２（１５０ｍｇ，５０６．０６μｍｏｌ，１当量）を０℃で加えた。ＤＣＭ（０．５ｍＬ）のＤＩＣ（６３．８６ｍｇ，５０６．０６μｍｏｌ，１当量）の溶液を混合物に加えた。反応物を２０℃で１時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣで監視した。混合物をＤＣＭ（２０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ＊２）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮して残渣を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～４５％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（２０ｍＬ／分）の溶出）で精製した。化合物ａａ２８－３（４００ｍｇ，３０９．２３μｍｏｌ，収率６１．１１％、純度７４％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝６．６１７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６０Ｈ６８Ｎ４ＮａＯ７ ９７９．５０，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９７９．８［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ｂを使用し、逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ ｐｐｍ７．７２－７．８０（ｍ，２Ｈ），７．４９－７．５７（ｍ，３Ｈ），７．３５－７．４１（ｍ，２Ｈ），７．２０－７．３３（ｍ，５Ｈ），７．０８－７．２０（ｍ，４Ｈ），６．９６－７．０８（ｍ，２Ｈ），６．７６－６．８４（ｍ，２Ｈ），６．６８－６．７５（ｍ，３Ｈ），５．３２－５．４７（ｍ，１Ｈ），４．６４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．５２－４．６０（ｍ，１Ｈ），４．４２－４．５１（ｍ，２Ｈ），４．３７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．１３－４．２３（ｍ，１Ｈ），４．００（ｔ，Ｊ＝６．２４Ｈｚ，２Ｈ），３．０５－３．２７（ｍ，４Ｈ），２．４４－２．６１（ｍ，４Ｈ），２．２０－２．２５（ｍ，６Ｈ），１．８２－１．８９（ｍ，２Ｈ），１．６２－１．７５（ｍ，６Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．０１－１．０９（ｍ，３Ｈ）。
工程４：ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［４－［４－［４－［（２Ｓ）－２－アミノ－３－［［（１Ｓ）－４－（３，５－ジメチルフェニル）－１－（フェニルカルバモイル）ブチル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ブチル］カルバマート（ａａ２８）の合成
ＤＭＦ（２．５ｍＬ）中のａａ２８－３（３８０ｍｇ，３９６．９９μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ピペリジン（５０７．０６ｍｇ，５．９５ｍｍｏｌ，１５当量）を２０℃で加えた。反応物を２０℃で０．５時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物をＡＣＮ（２ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣ（ＨＣｌ条件；カラム：Ａｇｅｌａ ＡＳＢ １５０＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０５％ＨＣｌ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５５％～８５％，８分）で精製した。化合物ａａ２８（１２５ｍｇ，１６４．９７μｍｏｌ，収率４１．５６％、純度９７％）を小さな黄色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．０６１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４５Ｈ５８Ｎ４ＮａＯ５ ７５７．４３，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７５７．５［Ｍ＋Ｎａ］＋。方法Ａを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。ＨＰＬＣ：ＲＴ＝１０．６６分、方法Ｃを使用して逆相ＨＰＬＣ分析を実施した。ＳＦＣ：ＲＴ＝２．１６１分、カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ－３ ５０＊４．６ｍｍ（内径），３μｍ；移動相：Ａ：ＣＯ２ Ｂ：イソプロパノール（０．０５％ＤＥＡ）；勾配：Ｂを５％～４０％で２分間、４０％で１．２分間保持、続いて５％のＢについては０．８分；流量：４ｍＬ／分。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ｐｐｍ ７．５５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ，２Ｈ），７．２４－７．３１（ｍ，４Ｈ），７．１４（ｄ，Ｊ＝８．０７Ｈｚ，２Ｈ），７．０５－７．１１（ｍ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝８．３１Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄ，Ｊ＝２．４５Ｈｚ，１Ｈ），６．７８（ｓ，３Ｈ），６．６８－６．７２（ｍ，１Ｈ），４．５４（ｔ，Ｊ＝６．７２Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｔ，Ｊ＝６．８５Ｈｚ，１Ｈ），４．００（ｔ，Ｊ＝６．１１Ｈｚ，２Ｈ），３．２５－３．３０（ｍ，１Ｈ），３．１２（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．８５Ｈｚ，３Ｈ），２．５４－２．６３（ｍ，２Ｈ），２．５１（ｑ，Ｊ＝７．５０Ｈｚ，２Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．６２－１．９５（ｍ，８Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ），１．０３（ｔ，Ｊ＝７．５８Ｈｚ，３Ｈ）。
２．１０ 非天然アミノ酸（ａａ２９）の合成
スキーム１１は、非天然アミノ酸（ａａ２９）の合成を概説している：
工程１：（Ｅ）－３－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）アクリル酸（ａａ２９－２）の合成
ＤＭＦ（３４ｍＬ）中の化合物ａａ２９－１（２ｇ，１４．４８ｍｍｏｌ，１．０当量），ＴＥＡ（４．４０ｇ，４３．４４ｍｍｏｌ，６．０５ｍＬ，３．０当量）及びＴｒｔＣｌ（４．０４ｇ，１４．４８ｍｍｏｌ，１．０当量）を２０℃で１２時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１）は、反応が完了したことを示した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｈ２Ｏ（３＊５０ｍＬ）及びクエン酸溶液（３＊５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（溶出：ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９：１）により精製した。化合物ａａ２９－２（１．６ｇ，４．２１ｍｍｏｌ，収率２９．０５％）を白色固体として得た。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．５７（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝１５．７７Ｈｚ，１Ｈ），７．３８－７．４５（ｍ，９Ｈ），７．３２（ｓ，１Ｈ），７．１５－７．２２（ｍ，６Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝１５．６５Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ。
工程２：３－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）プロパン酸（ａａ２９）の合成
ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中の化合物ａａ２９－２（１．６ｇ，４．２１ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（１ｇ，純度１０％）をＮ２雰囲気下で加えた。懸濁液を脱気し、Ｈ２で３分間パージした。混合物を２０℃、Ｈ２下（１５Ｐｓｉ）で２時間撹拌した。完了後、混合物を濾過し、濾液を濃縮して生成物を得た。化合物ａａ２９（１．２ｇ，３．１４ｍｍｏｌ，収率７４．６０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８０２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２５Ｈ２１Ｎ２Ｏ２ ３８１．１７［Ｍ－Ｈ］－，ｆｏｕｎｄ ３８１．１７［Ｍ－Ｈ］－；Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３０＊２．０ｍｍ，３．５μｍを使用し、流量１．２ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、ＡＣＮを含有する５％～９５％のアセトニトリル（溶媒Ｂ）及び水中０．０５％のＮＨ３Ｈ２Ｏを含有する水（溶媒Ａ）の勾配で溶出した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．３４－７．３９（ｍ，４Ｈ），７．２２－７．３９（ｍ，４Ｈ），７．１１－７．１４（ｍ，３Ｈ），７．０６－７．２０（ｍ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝７．２５Ｈｚ，４Ｈ），２．９０（ｔ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ），２．８０（ｔ，Ｊ＝７．３８Ｈｚ，１Ｈ），２．５１－２．６２（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２．１１ 非天然アミノ酸（ａａ３０）の合成
スキーム１２は、非天然アミノ酸（ａａ３０）の合成を概説している：
工程１：（３－ヒドロキシプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ａａ３０－２）の合成
トルエン（１００ｍＬ）中の３－ブロモプロパン－１－オール（１０ｇ，７１．９５ｍｍｏｌ，６．４９ｍＬ，１当量）の溶液に、ＰＰｈ３（２２．６５ｇ，８６．３４ｍｍｏｌ，１．２当量）を加えた。混合物を１００℃、Ｎ２下で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、反応物を０℃に冷却して濾過し、濾過ケーキをトルエン（１０ｍＬ＊３）で洗浄し、続いて減圧下で乾燥した。化合物ａａ３０－２（２０．７ｇ，粗）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７５８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２１Ｈ２２ＯＰ＋３２１．１４［Ｍ］＋，ｆｏｕｎｄ ３２１．０［Ｍ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ ７．８３－７．６５（ｍ，１５Ｈ），４．９４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），３．８７－３．７３（ｍ，４Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
工程２：（Ｅ）－４－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ブト－３－エン－１－オール（ａａ３０－３）の合成
ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のａａ３０－２（１０．６７ｇ，２６．６０ｍｍｏｌ，１．５当量）の溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（１Ｍ，７０．９２ｍＬ，４当量）を加えた。混合物を０℃で０．５時間撹拌し、続いてＴＨＦ（６０ｍＬ）中のａａ３０－２Ａ（１－トリチルイミダゾール－４－カルバルデヒド ６ｇ，１７．７３ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液を上記混合物に加え、得られた混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過して減圧下で濃縮して残渣を得、続いて残渣をジオキサン（５０ｍＬ）中に再度溶解させ、最終溶液を１００℃で１２時間撹拌した。その後、溶液を減圧下で濃縮し、残渣を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～８０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（６０ｍＬ／分）の溶出）で精製した。化合物ａａ３０－３（６５０ｍｇ，粗）を黄色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２４Ｎ２ＯＮａ ４０３．１９，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｆｏｕｎｄ ４０３．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．６８－７．５７（ｍ，１Ｈ），７．４０－７．３７（ｍ，９Ｈ），７．１８－７．１３（ｍ，６Ｈ），６．８３（ｄ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３６－６．１４（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．３６（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）ｐｐｍ。
工程３：４－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ブタン－１－オール（ａａ３０－４）の合成
ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中のａａ３０－３（６５０ｍｇ，１．７１ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ，４８９．６１ｍｍｏｌ，純度１０％）を加えた。混合物を２５℃、Ｈ２下で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。その残渣の総体積をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；２５ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～５０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（４０ｍＬ／分）の溶出）で８分間精製した。化合物ａａ３０－４（４５０ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ，収率６８．８７％、純度１００％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８５０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２６Ｎ２ＯＮａ ４０５．２０，［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｆｏｕｎｄ ４０５．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
工程４：４－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ブタン酸（ａａ３０）の合成
ＭｅＣＮ（５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（７ｍＬ）中のａａ３０－４（４５０ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＴＥＭＰＯ（２７７．５１ｍｇ，１．７６ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＰＩＤＡ（ヨードベンゼンジアセタート（３２４０－３４－４），９４７．３５ｍｇ，２．９４ｍｍｏｌ，２．５当量）を加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、ｐＨを４に調整するために、混合物にクエン酸（水溶液、１５ｍＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ＊２）で抽出した。有機層を回収し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し減圧下で濃縮して残渣を得た。続いて、残渣をＭＴＢＥでトリチュレートした。化合物ａａ３０（２５０ｍｇ，粗）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．４８４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ２５Ｎ２Ｏ２ ３９７．１８［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ３９７．２［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４Ｌ ＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持を使用。ＥＳＩ源、正イオンモード；波長２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ，オーブン温度５０℃。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ８．６９（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５３－７．３８（ｍ，９Ｈ），７．２８－７．１４（ｍ，７Ｈ），２．７５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３４（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．００－１．８７（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２．１２ 非天然アミノ酸（ａａ３１）の合成
スキーム１３は、非天然アミノ酸（ａａ３１）の合成を概説している：
工程１：（３－カルボキシプロピル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ａａ３１－２）の合成
トルエン（７０ｍＬ）中の４－ブロモブタン酸（５ｇ，２９．９４ｍｍｏｌ，６．７６ｍＬ，１当量）の溶液に、ＰＰｈ３（８．６４ｇ，３２．９３ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えた。混合物を１１０℃、Ｎ２下で１２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣ及びＬＣＭＳで監視した。完了時に、反応混合物を０℃に冷却し、続いて濾過してトルエン（１０ｍＬ＊３）で洗浄し、濾過ケーキを回収して減圧下で乾燥した。化合物ａａ３１－２（５．６ｇ，粗）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．０７６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ２２Ｏ２Ｐ＋３４９．１４［Ｍ］＋，ｆｏｕｎｄ ３４９．２［Ｍ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で１．３５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．９分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ ７．９１－７．６６（ｍ，１５Ｈ），３．３１－３．２２（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８４（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
工程２：（Ｅ）－５－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ペンタ－４－エン酸（ａａ３１－３）の合成
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のａａ３１－２（３．８１ｇ，８．８７ｍｍｏｌ，１．５当量）の溶液を、０℃、Ｎ２下でｔＢｕＯＫ（１．９９ｇ，１７．７３ｍｍｏｌ，３当量）で加え、混合物を０℃で３０分間撹拌し、続いてＴＨＦ（２０ｍＬ）中のａａ３１－２Ａ（２ｇ，５．９１ｍｍｏｌ，１当量）の溶液を上記混合物に０℃で加え、最終混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了時に、ｐＨを４に調整するために、混合物にクエン酸を加え、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ＊２）で抽出した。有機層を回収し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し減圧下で濃縮して残渣を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、溶出０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（４０ｍＬ／分））で精製した。化合物ａａ３１－３（４ｇ，粗）を淡黄色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．４８７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ２５Ｎ２Ｏ２ ４０９．１８［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４０９．３［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で１．３５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．９分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
工程３：５－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ペンタン酸（ａａ３１）の合成
ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中のａａ３１－３（３ｇ，７．３４ｍｍｏｌ，粗純度，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（３００ｍｇ，４８９．６１ｍｍｏｌ，純度１０％）を加えた。混合物を２５℃、Ｈ２下で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了時に、混合物を濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。その残渣の総体積をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、溶出０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（４０ｍＬ／分））で７分間精製した。その後、生成物をＴＢＭＥによってトリチュレートした。化合物ａａ３１（２９０ｍｇ，６９２．３２ｍｍｏｌ，収率７１．０５％、純度９８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．８０５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２７Ｈ２７Ｎ２Ｏ２ ４１１．２０［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４１１．３［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：０．８ｍＬ／４ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍＬ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５ｍｍ ２．１＊３０ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ ７．６５（ｓ，１Ｈ），７．４４－７．３４（ｍ，９Ｈ），７．１６（ｄｄ，Ｊ＝２．９，６．８Ｈｚ，６Ｈ），６．７７（ｓ，１Ｈ），２．５８（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．２８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．７０－１．５５（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
２．１３ 非天然アミノ酸（ａａ３２）の合成
スキーム１４は、非天然アミノ酸（ａａ３２）の合成を概説している：
工程１：（４－カルボキシブチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ａａ３２－２）の合成
トルエン（１００ｍＬ）中の５－ブロモペンタン酸（１０ｇ，５５．２４ｍｍｏｌ，６．７６ｍＬ，１当量）の溶液に、ＰＰｈ３（１５．９４ｇ，６０．７６ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えた。混合物を１１０℃、Ｎ２下で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了時に、反応混合物を０℃に冷却し、続いて濾過してトルエン（１０ｍＬ＊３）で洗浄し、濾過ケーキを回収して減圧下で乾燥した。化合物ａａ３２－２（１６．４ｇ，３６．９９ｍｍｏｌ，収率６６．９７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．０７６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ２２Ｏ２Ｐ＋３４９．１４［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ３４９．２［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で１．３５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．９分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃を使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３Ｃｌ）δ ７．９１－７．６６（ｍ，１５Ｈ），３．３１－３．２２（ｍ，２Ｈ），２．５５（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．８６－１．８２（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
工程２：（Ｅ）－６－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ヘキサ－５－エン酸（ａａ３２－３）の合成
ＴＨＦ（６０ｍＬ）中のａａ３２－２（７．８６ｇ，１７．７３ｍｍｏｌ，１．５当量）の溶液に、ｔ－ＢｕＯＫ（３．９８ｇ，３５．４６ｍｍｏｌ，３当量）を０℃、Ｎ２下で加えた。混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のａａ３２－２Ａ（４ｇ，１１．８２ｍｍｏｌ，１．０当量）の溶液を上記混合物に０℃で加え、得られた混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了時に、ｐＨを４に調整するために、混合物にクエン酸を加え、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ＊２）で抽出した。有機層を回収し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し減圧下で濃縮して残渣を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、溶出０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（４０ｍＬ／分））で精製した。化合物ａａ３２－３（４ｇ，粗）を淡黄色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．７３９分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ２７Ｎ２Ｏ２ ４２３．２０［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４２３．２［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で１．３５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．９分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
工程３：６－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ヘキサン酸（ａａ３２）の合成
ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中のａａ３２－３（４ｇ，９．４７ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（３００ｍｇ，４８９．６１ｍｍｏｌ，純度１０％）を加えた。混合物を２５℃、Ｈ２下で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了時に、混合物を濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、溶出０～１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ（４０ｍＬ／分））で精製した。その後、生成物をＴＢＭＥによってトリチュレートした。化合物ａａ３２（６６０ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ，収率１５．９３％、純度９７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．８０７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ２９Ｎ２Ｏ２ ４２５．２２［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４２５．２［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６．０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．４３（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４１－７．３４（ｍ，９Ｈ），７．１９－７．１１（ｍ，６Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６０（ｍ，４Ｈ），１．３８－１．２７（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
２．１４ 非天然アミノ酸（ａａ３３）の合成
スキーム１５は、非天然アミノ酸（ａａ３３）の合成を概説している：
工程１：（５－カルボキシペンチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ａａ３３－２）の合成
トルエン（５０ｍＬ）中の６－ブロモヘキサン酸（５ｇ，２５．６３ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＰＰｈ３（７．０６ｇ，２６．９２ｍｍｏｌ，１．０５当量）を加えた。得られた溶液を１２０℃で１２時間にわたり撹拌した。完了後、反応混合物を０℃に冷却し、続いて濾過してトルエン（１０ｍＬ＊３）で洗浄し、濾過ケーキを回収して減圧下で乾燥した。化合物ａａ３３－２（６．８５ｇ，１４．４７ｍｍｏｌ，収率５６．４４％、純度９６．６％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９１６分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２６ＰＯ２ ＋３７７．１７，ｆｏｕｎｄ ３７７．１［Ｍ－Ｂｒ］＋。Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍ ３ｍｍ，ＳＮ：３Ｕ４１１３０１５３０カラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
工程２：（Ｅ）－７－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ヘプタ－６－エン酸（ａａ３３－３）の合成
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のａａ３３－２（４．０５ｇ，８．８７ｍｍｏｌ，２当量）の溶液を、０℃、Ｎ２下でｔＢｕＯＫ（１Ｍ，２２．１６ｍＬ，５当量）で加え、混合物を０℃で３０分間撹拌し、続いてＴＨＦ（２０ｍＬ）中のａａ３３－２Ａ（１．５ｇ，４．４３ｍｍｏｌ，１当量）の溶液を上記混合物に０℃で加え、最終混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、ｐＨを４に調整するために、混合物にクエン酸を加え、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ＊２）で抽出した。有機層を回収し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。粗生成物をさらなる精製なしで次の工程に使用した。化合物ａａ３３－３（３．８ｇ，粗）を黄色のシロップとして得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．９０４分及び３．０６８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ２９Ｎ２Ｏ２ ４３７．２２，ｆｏｕｎｄ ４３７．３［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
工程３：７－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ヘプタン酸（ａａ３３）の合成
ＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中のａａ３３－３（３ｇ，６．８７ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（３００ｍｇ，４８９．６１ｍｍｏｌ，純度１０％）を加えた。混合物を２５℃、Ｈ２下で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｐｒｉｍｅ Ｃ１８ １５０＊２５ｍｍ＊５ｍｍ；移動相：［水（０．０５ｖ／ｖ％水酸化アンモニウム］；Ｂ％：２２％～４５％，７分間）で精製した。化合物ａａ３３（２００ｍｇ，４５６．０４ｍｍｏｌ，収率６．６４％、純度１００％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．２３１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ３１Ｎ２Ｏ２ ４３９．２３［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４３９．３［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．４５－７．３１（ｍ，１０Ｈ），７．１９－７．１１（ｍ，６Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．２４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６５－１．５２（ｍ，４Ｈ），１．３８－１．２６（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
２．１５ 非天然アミノ酸（ａａ３４）の合成
スキーム１６は、非天然アミノ酸（ａａ３４）の合成を概説している：
工程１：７－［ＢＬＡＨ（トリフェニル）－λ５－ホスファニル］ヘプタン酸（ａａ３４－２）の合成
トルエン（１００ｍＬ）中のａａ３４－１（１０ｇ，４７．８３ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＰＰｈ３（１３．８０ｇ，５２．６１ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えた。混合物を１１０℃で１２時間撹拌した。完了後、反応物を減圧下で濾過し、残渣を得た。粗生成物をさらなる精製なしで次の工程に使用した。化合物ａａ３４－２（２２．８ｇ，４３．７３ｍｍｏｌ，収率９１．４３％，純度９０．４１０％）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７９２分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２５Ｈ２８Ｏ２Ｐ＋３９１．１８［Ｍ］＋，ｆｏｕｎｄ ３９１．１［Ｍ］＋；ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ｍＬ／４Ｌ ＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４Ｌ ＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中のａａ３４－２（１０．４５ｇ，２２．１６ｍｍｏｌ，１．５当量）の溶液を、０℃、Ｎ２下でｔＢｕＯＫ（４．９７ｇ，４４．３３ｍｍｏｌ，３当量）で加え、混合物を０℃で撹拌し、続いてＴＨＦ（２０ｍＬ）中のａａ３４－２Ａ（５ｇ，１４．７８ｍｍｏｌ，１当量）の溶液を上記混合物に０℃で加え、最終混合物を２５℃で１２時間撹拌した。完了後、ｐＨを４に調整するために、混合物にクエン酸を加え、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ＊２）で抽出した。有機層を回収し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮し、白色固体として目的のａａ３４－３（１４．５ｇ，粗）を得た。
工程２：（Ｅ）－８－（１－トリチルイミダゾール－４－イル）オクタ－７－エン酸（ａａ３４－３）の合成
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８７０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ３１Ｎ２Ｏ２ ４５１．２３［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ３０Ｈ３０Ｎ２Ｏ２Ｎａ ４７３．２３［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｆｏｕｎｄ ４７３．１［Ｍ＋Ｎａ］＋；ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）中のａａ３４－３（１４ｇ，１５．５４ｍｍｏｌ，純度５０％，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（４ｇ，純度１０％）及びＨ２を加えた。混合物を２５℃で３時間撹拌した。完了後、混合物を濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。粗生成物を、Ｃ－１８逆相クロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）Ｃ－１８カラム、６０～７０％のアセトニトリル／Ｈ２Ｏ勾配（８０ｍＬ／分）の溶出、総体積２Ｌで４０分間）で精製し、残渣（中性）を得た。化合物ａａ３４（２．１ｇ，４．５３ｍｍｏｌ，収率２９．１５％、純度９７．６％）を白色固体として得た。
工程３：８－（１－トリチルイミダゾール－４－イル）オクタン酸（ａａ３４）の合成
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．９５６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ３３Ｎ２Ｏ２ ４５３．２５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４５３．３［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６．０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ ７．４７－７．３３（ｍ，１０Ｈ），７．２２－７．１０（ｍ，６Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），２．５２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６９－１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３７－１．２６（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。
２．１６ 非天然アミノ酸（ａａ３５）の合成
スキーム１７は、非天然アミノ酸（ａａ３５）の合成を概説している：
工程１：（７－カルボキシヘプチル）トリフェニルホスホニウムブロミド（ａａ３５－２）の合成
トルエン（１５０ｍＬ）中のａａ３５－１（１５ｇ，７１．７４ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＰＰｈ３（２０．７０ｇ，７８．９２ｍｍｏｌ，１．１当量）を加えた。混合物を１１０℃、Ｎ２下で２０時間撹拌した。完了後、反応混合物を０℃に冷却し、続いて濾過してトルエン（１０ｍＬ＊３）で洗浄し、濾過ケーキを回収して減圧下で乾燥した。残渣をＴＨＦ（２００ｍＬ）でトリチュレートした。続いて、混合物を濾過し、濾過ケーキを乾燥させて生成物ａａ３５－２（２０ｇ，４０．３１ｍｍｏｌ，収率５６．１８％，純度９５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．１７５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２６Ｈ３０Ｏ２Ｐ＋［Ｍ＋Ｈ］＋４０５．２０，ｆｏｕｎｄ ４０５．７０；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
工程２：（Ｅ）－９－（１－トリチル－１Ｈ－イミダゾール－４－イル）ノナン－８－エン酸（ａａ３５－３）の合成
ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中のａａ３５－２（１０．４５ｇ，２２．１７ｍｍｏｌ，１．５当量）の溶液に、ｔ－ＢｕＯＫ（４．９７ｇ，４４．３４ｍｍｏｌ，３．０当量）を０℃で加えた。続いて、混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のａａ３５－２Ａ（５ｇ，１４．７８ｍｍｏｌ，１当量）の溶液を加えた。続いて、混合物を２０℃で１２時間撹拌した。完了後、０℃のＨ２Ｏ（１００ｍＬ）を加えることで反応混合物をクエンチし、続いてＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ＊２）で抽出した。組み合わせた有機層を、飽和ＮａＣｌ１００ｍＬ（５０ｍＬ＊２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して残渣を得た。その残渣の総体積をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；８０ｇのＳｐｅｃｉａｌ Ｆｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～２０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（６０ｍＬ／分）の溶出）で精製し、淡黄色油として生成物ａａ３５－３（１．４ｇ，粗）を得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝３．３１０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３１Ｈ３３Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋４６５．２５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４６５．２０；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
工程３：９－（１－トリチルイミダゾール－４－イル）ノナン酸（ａａ３５）の合成
ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）中のａａ３５－３（１．４ｇ，３．０１ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（０．２ｇ，純度１０％）を加えた。混合物を２５℃、Ｈ２下で３時間撹拌した。完了後、混合物を濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８，球状，２０～３５ｕｍ，１００Ａ，１２ｇ；移動相：［水－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～９０％，１５分）で精製し、生成物ａａ３５（０．１２ｇ，２４４．３１μｍｏｌ，収率８．１１％，純度９５％）を得て、白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝３．２５７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３１Ｈ３５Ｎ２Ｏ２［Ｍ＋Ｈ］＋４６７．２６［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ４６７．２０；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
２．１７ 非天然アミノ酸（ａａ３６）の合成
スキーム１８は、非天然アミノ酸（ａａ３６）の合成を概説している：
工程１：１－（２－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）エチル）ピペリジン－２－オン（ａａ３６－２）の合成
ＴＨＦ（３００ｍＬ）中のａａ３６－１（６ｇ，６０．５３ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＮａＨ（２．６６ｇ，６６．５８ｍｍｏｌ，純度６０％、１．１当量）を０℃で加えた。混合物を２０℃で０．５時間撹拌し、ａａ３６－１Ａ（１４．４８ｇ，６０．５３ｍｍｏｌ，１当量）を加えた。反応混合物を７０℃で１２時間加熱した。ＬＣＭＳは、所望の生成物が観察されたことを示した。混合物を室温に冷却し、水（１５０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ×２）で抽出した。組み合わせた有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，石油エーテル／酢酸エチル＝１／１）で精製した。化合物ａａ３６－２（２．７ｇ，１０．４９ｍｍｏｌ，収率１７．３３％）を無色の油として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９７４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ２７ＮＯ２ ＳｉＨ ２５８．１８，ｆｏｕｎｄ ２５８．２［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．７分間の５％～９５％勾配（溶媒Ｂ）で溶出及び９５％で０．４分間保持した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）３．６４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．３２－３．２９（ｍ，４Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７４－１．５７（ｍ，４Ｈ），０．８３（ｓ，９Ｈ），０．００（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
工程２：１－（２－ヒドロキシエチル）ピペリジン－２－オン（ａａ３６－３）の合成
ＭｅＯＨ（１２ｍＬ）中のａａ３６－２（２．７ｇ，１０．４９ｍｍｏｌ，１当量）に、ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ＝３０％，８ｍＬ）の溶液を０℃で加えた。溶液を０℃で０．５時間撹拌した。完了後、溶液を真空状態で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１）で精製した。粗生成物ａａ３６－３（１．４ｇ，９．７３ｍｍｏｌ，収率９２．７６％，純度９９．５％）を黄色固体として得て、これをさらなる精製なしで次の工程に使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）４．１３－４．１１（ｍ，１Ｈ），３．５２－３．４４（ｍ，２Ｈ），３．３４－３．２９（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７５－１．６１（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．４４８～０．５７４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７Ｈ１３ＮＯ２Ｈ １４４．０９，ｆｏｕｎｄ １４４．２［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．７分間の５％～９５％勾配（溶媒Ｂ）で溶出及び９５％で０．４分間保持した。
工程３：２－（２－（２－オキソピペリジン－１－イル）エチル）イソインドリン－１，３－ジオン（ａａ３６－４）の合成
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のａａ３６－３（１．５ｇ，１０．４８ｍｍｏｌ，１当量）及びａａ３６－３Ａ（１．８５ｇ，１２．５７ｍｍｏｌ，１．２当量）の溶液に、ＰＰｈ３（４．１２ｇ，１５．７１ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＤＩＡＤ（３．１８ｇ，１５．７１ｍｍｏｌ，３．０６ｍＬ，１．５当量）を０℃で加えた。得られた混合物を２０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、所望の生成物が観察されたことを示した。混合物を濾過し、濾液を真空状態で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，石油エーテル／酢酸エチル＝１／１）で精製した。化合物ａａ３６－４（０．１５ｇ，５５０．８７μｍｏｌ，収率５．２６％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７６４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１６Ｎ２Ｏ３Ｈ ２７３．１２，ｆｏｕｎｄ ２７３．１［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．７分間の５％～９５％勾配（溶媒Ｂ）で溶出及び９５％で０．４分間保持した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）７．８３－７．６５（ｍ，４Ｈ），３．６８－３．５８（ｍ，２Ｈ），３．４５－３．３９（ｍ，２Ｈ），３．２１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．８９（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６４－１．５６（ｍ，２Ｈ），１．５５－１．４７（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ。
工程４：１－（２－アミノエチル）ピペリジン－２－オン（ａａ３６－５）の合成
ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中のａａ３６－４（０．１５ｇ，５５０．８７μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（２７５．７６ｍｇ，５．５１ｍｍｏｌ，２６７．７３μＬ，１０当量）を加えた。溶液を４５℃で２時間撹拌した。完了後、溶液を室温に冷却し、真空状態で濃縮した。粗生成物ａａ３６－５（０．０７ｇ，粗）を無色の油として得た。これをさらなる精製なしに次の工程で使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）３．２７－３．２２（ｍ，６Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．１７（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７６－１．５８（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ。
工程５：２，２－ジメチル－４－オキソ－４－（（２－（２－オキソピペリジン－１－イル）エチル）アミノ）ブタン酸（ａａ３６）の合成
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ３６－５（０．０７ｇ，４９２．２７μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ａａ３６－５Ａ（６９．３８ｍｇ，５４１．５０μｍｏｌ，６０．８６μＬ，１．１当量）を加えた。溶液を２０℃で１２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、所望の生成物が観察されたことを示した。溶液を真空状態で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（ＦＡ条件；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ Ｃ１８ １５０＊３０ｍｍ＊４ｕｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～２５％，１１分）で精製した。化合物ａａ３６（２０ｍｇ，７３．９９μｍｏｌ，収率１５．０３％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．１９分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３Ｈ２２Ｎ２Ｏ４Ｈ ２７１．１６，ｆｏｕｎｄ ２７１．１［Ｍ＋Ｈ］＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．７分間の５％～９５％勾配（溶媒Ｂ）で溶出及び９５％で０．４分間保持した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）３．５１－３．４４（ｍ，２Ｈ），３．４３－３．３５（ｍ，４Ｈ），２．４７（ｓ，２Ｈ），２．３５（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９１－１．７６（ｍ，４Ｈ），１．２５（ｓ，６Ｈ）ｐｐｍ。
２．１８ 非天然アミノ酸（ａａ３７）の合成
スキーム１９は、非天然アミノ酸（ａａ３７）の合成を概説している：
工程１：ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［２－（５－メチル－１，３－ジオキソ－イソインドリン－２－イル）エチル］カルバマート（ａａ３７－２）の合成
トルエン（１０ｍＬ）中のａａ３７－１（５００ｍｇ，３．０８ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ａａ３７－１Ａ（５４３．４６ｍｇ，３．３９ｍｍｏｌ，５３２．８０μＬ，１．１当量）を加えた。混合物を１２０℃で１２時間撹拌した。完了後、反応混合物を真空状態で濃縮して粗生成物を得た。これを２５℃で１時間、ＭＴＢＥ／ＰＥ（１：１）を用いてトリチュレートした。化合物ａａ３７－２（４６０ｍｇ，１．４４ｍｍｏｌ，収率４６．５６％、純度９５％）を黄色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８９８分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ２１Ｎ２Ｏ４ ３０５．１４［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１６Ｈ２１Ｎ２Ｏ４Ｎａ ３２７．１４［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｆｏｕｎｄ ３２７．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
工程２：２－（２－アミノエチル）－５－メチル－イソインドリン－１，３－ジオン（ａａ３７－３）の合成
ａａ３７－２（４６０ｍｇ，１．５１ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（４Ｍ，３７７．８７μＬ，１当量）を加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。完了後、反応物を真空状態で濃縮して粗生成物ａａ３７－３（３００ｍｇ，粗，ＨＣｌ塩）を得て、白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．６３８分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１Ｈ１３Ｎ２Ｏ２ ２０５．０９［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ２０５．０［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．９９（ｂｒ ｓ，２Ｈ），７．２６－７．２１（ｍ，１Ｈ），３．５６（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．７７（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
工程３：２ー［２－［２ー（５－メチル－１，３－ジオキソ－イソインドリン－２－イル）エチルアミノ］２－オキソ－エチル］スルファニル酢酸（ａａ３７）の合成
ＤＭＦ（４ｍＬ）中のａａ３７－３（２５０ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ，１当量）及びａａ３７－３Ａ（１９４．１１ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ，１．２当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３１６．４２ｍｇ，２．４５ｍｍｏｌ，４２６．４５μＬ，２当量）を加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）と水（６０ｍＬ）とに分配した。水層を、１Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ＝４に酸性化した。有機相を分離して塩水（３０ｍＬ×３）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。得られた溶液を減圧下で濃縮した。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～３０％の酢酸エチル／石油エーテル勾配（３５ｍＬ／分）の溶出）で精製した。化合物ａａ３７（２００ｍｇ，５３５．１４μｍｏｌ，収率４３．７２％、純度９０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７５７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１６Ｎ２Ｏ５ＳＮａ ３５９．０８［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｆｏｕｎｄ ３５８．９［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．６９－７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５５（ｓ，１Ｈ），７．４３（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８２－３．７０（ｍ，２Ｈ），３．５２－３．４１（ｍ，２Ｈ），２．８６（ｓ，２Ｈ），２．７６（ｓ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。
実施例３．ＧＬＰ１ペプチド模倣薬の合成
図１３にあるように本開示によるＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードを作製するための一般的な合成スキームを示す。以下に示す表２は、リンクアミドＭＢＨＡ樹脂結合ペプチドの構造及び中間体１～５９を表す。
樹脂からの切断後、ＬＣ－ＭＳによりリンクアミドＭＢＨＡ樹脂結合ペプチド及び中間体（１～５９）を分析した。以下の表２Ｂはこれらの中間体をまとめたものである。
図１４は、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ１及びＰ８の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．１（３Ｓ，６Ｓ，９Ｒ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ）－２１－アミノ－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アミノブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－１２－メチル－５，８，１１，１４，１７，２０－ヘキサオキソ－２２－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）－４，７，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザドコサン－１－酸（Ｐ１）の調製
対応するＦｍｏｃ保護されたａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（９，１６．５９μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。樹脂結合ペプチド９を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。この粗生成物をＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、ピペリジン（１４．１３ｍｇ，１６５．９４μｍｏｌ，１６．３９μＬ，１０．０当量）を２０℃、窒素下で一度に加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。混合物を真空状態で濃縮し、残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３０％～６０％，６０分）で精製し、純粋な生成物を得た。生成物を水（１０ｍＬ）中に懸濁し、混合物をドライアイス／エタノール浴で凍結させ、続いて凍結乾燥で乾燥させて所望の生成物Ｐ１（１．０２ｍｇ，７．４８ｅ－１μｍｏｌ，収率４．５０％，純度１００％）を白色固体として得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６５Ｈ８７ＦＮ１７Ｏ１５ １３６４．６５５２，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １３６４．４８８７ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝１０．１５分、ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．２ｍＬ／分で逆相ＨＰＬＣを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
３．２（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アミノブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ８）の調製
対応するａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１０，１００．９９μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように構築した。樹脂結合ペプチド１０を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、カラム：Ｌｕｎａ ２００＊２５ｍｍ，Ｃ１８，１０μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３０％～６０％，６０分を使用して分取ＨＰＬＣで精製し、純粋な生成物を得た。生成物を水（１０ｍＬ）中に懸濁し、混合物をドライアイス／アセトン浴で凍結させ、続いて凍結乾燥で乾燥させて所望の生成物Ｐ８（２５．００ｍｇ，１７．４９μｍｏｌ，収率１７．３２％，純度１００％）を白色固体として得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１００ＦＮ２０Ｏ１７ １５７１．７５５９，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １５７１．７５８９［Ｍ＋Ｈ］＋。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝１０．１４分、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍのカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＨＰＬＣを実施し、０．０６２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６８％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
図１５は、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２及びＰ９の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．３（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｒ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アミノブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ２）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，７４．７５μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。樹脂結合ペプチド１８を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（カラム：移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～５０％，６０分）に送り、純粋な生成物を得た。生成物を水（１００ｍＬ）中に懸濁し、混合物をドライアイス／アセトン浴で凍結させ、続いて凍結乾燥で乾燥させて所望の生成物Ｐ２（１１．５６ｍｇ，８．４５μｍｏｌ，収率１１．２７％，純度９７．８４％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８３０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６５Ｈ８８ＦＮ１５Ｏ１５ １３３７．６６［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋６Ｈ］＋６６９．８３［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋７Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ６７０．０［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋７Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．７７分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．４（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アミノブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ９）の調製
対応するａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１９）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。樹脂結合ペプチド１９を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ：移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）に送り、純粋な生成物を得た。生成物を水（２０ｍＬ）中に懸濁し、混合物をドライアイス／アセトン浴で凍結させ、続いて凍結乾燥で乾燥させて所望の生成物Ｐ９（１２５ｍｇ，７９．８２μｍｏｌ，収率７．７０％，純度９８．７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１０２ＦＮ１８Ｏ１７ １５４５．７７［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋６Ｈ］＋７７３．３８５［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋７Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７７３．９［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋７Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
図１６は、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ１１、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６及びＰ１７の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．５ ３－［［（１Ｓ）－２－［［２－［［（１Ｓ，２Ｒ）－１－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ，２Ｒ）－１－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－１－（カルボキシメチル）－２－オキソ－エチル］アミノ］－１－（ヒドロキシメチル）－２－オキソ－エチル］カルバモイル］－２－ヒドロキシ－プロピル］アミノ］－１－［（２－フルオロフェニル）メチル］－１－メチル－２－オキソ－エチル］カルバモイル］－２－ヒドロキシ－プロピル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－１－（２Ｈ－テトラゾール－５－イルメチル）エチル］アミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパン酸（Ｐ３）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，１５２．９６μｍｏｌ）及びａａ１１（５７．５８ｍｇ，３０５．９１μｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ１１－ａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２０，１１９μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド２０（１１９μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ３（８ｍｇ，５．４７μｍｏｌ，収率３．５８％，純度９９．３７％）を淡黄色の固体として得た。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．１０分。ＨＰＬＣ条件：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で、０．１２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ２１ＮＯ２，１４５２．６９［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ７２７．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋；逆相ＬＣＭＳ条件：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
３．６（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［（３－アミノ－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル）アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ４）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物１８（１９２．７３μｍｏｌ）及びａａ１２（７５．８２ｍｇ，５７８．１８μｍｏｌ，３当量）から出発して、対応するａａ１２－ａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２１，１９２．７３μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように取得した。
対応する樹脂結合ペプチド２１（１９２．７３μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ４（３５ｍｇ，２４．０３μｍｏｌ，収率８．７３％，純度９９．６６％）を淡黄色の固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８６１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１７，７２６．３６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７２６．７ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８５４分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１７，７２６．３６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７２６．７ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．９０分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．７（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－（ヒドロキシアミノ）－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ５）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物１８（１５２．９６μｍｏｌ）及びａａ１３（６０ｍｇ，２５９．４７μｍｏｌ，１．７当量）から出発して、対応するａａ１３－ａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２２，１５２．６７μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように取得した。
対応する樹脂結合ペプチド２２を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ５（４ｍｇ，２．６６μｍｏｌ，収率４２．１２％，純度９７．７％）を淡黄色の固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７０５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７０Ｈ９６ＦＮ１６Ｏ１８，７３３．８５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７１８．２ ｍ／ｚ［Ｍ－２ＯＨ＋４Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７０Ｈ９６ＦＮ１６Ｏ１８，７３３．８５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７３５．２ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．００分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．８（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－メチル－２－（１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌ－５－イル）プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ６）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物１８（８２．６０μｍｏｌ）及びａａ１４（２５．４７ｍｇ，１６５．１９μｍｏｌ，２当量）から出発して、対応するａａ１４－ａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２３，８２．６０μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように取得した。
対応する樹脂結合ペプチド２３（８２．６０μｍｏｌ）を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ６（９ｍｇ，６．１０μｍｏｌ，収率７．４０％，純度９７．３４％）を淡黄色の固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８５６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ９８ＦＮ１７Ｏ１６，７３７．８７ ｍ／ｚ ［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋８Ｈ］２＋，リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ｆｏｕｎｄ ７３８．２ ｍ／ｚ［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋８Ｈ］２＋、リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８５６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ９８ＦＮ１７Ｏ１６，７３７．８７ ｍ／ｚ ［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋８Ｈ］２＋，リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ｆｏｕｎｄ ７３８．２ ｍ／ｚ［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋８Ｈ］２＋、リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．１６分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．９（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ７）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，７６．４８μｍｏｌ）及びａａ４（８７．９８ｍｇ，２２９．４４μｍｏｌ，３当量）から出発した。対応するａａ４－ａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２４，７６．４８μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように得た。
対応する樹脂結合ペプチド２４（７６．４８μｍｏｌ）を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２８％～５８％，３０分）で精製し、Ｐ７（１７ｍｇ，１１．１６μｍｏｌ，収率１４．５９％，純度９３．５７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．６７５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６８Ｈ９５ＦＮ１６Ｏ１７ ７１３．３５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７１３．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋；移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持を使用。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７５７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６８Ｈ９５ＦＮ１６Ｏ１７，７１３．３５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７１３．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ（Ｒｔ＝７．５８分；移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
３．１０（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［６－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）ヘキサノイルアミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１１）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，７４．７５μｍｏｌ）及びａａ１７（７０．１３ｍｇ，１６５．１９μｍｏｌ，２当量）から出発して、対応するａａ１７－ａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２７，７４．７５μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように取得した。
対応する樹脂結合ペプチド化合物２７（７４．７５μｍｏｌ）を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ７（９ｍｇ，５．８０μｍｏｌ，収率７．０５％，純度９６．９２％）を白色固体として得た。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．７２分。ＨＰＬＣ条件：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で、０．１２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８２８分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１８Ｈ２１ＮＯ２，１５０２．７５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ７５２．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋；逆相ＬＣＭＳ条件：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
３．１１（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２，５－ジアミノ－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］－３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１３）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物１８（８２．６０μｍｏｌ）、ａａ１５（７７．１４ｍｇ，２４７．７９μｍｏｌ，３当量）、ａａ１６（９３．４０ｍｇ，２４７．４９μｍｏｌ，３当量）及びａａ１９（４０．６３ｍｇ，１６５．００μｍｏｌ，２当量）から出発して、対応するａａ１９－ａａ１６－ａａ１５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３０，８２．５０μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３０（８２．５０μｍｏｌ）を、一般的手順に従って切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１３（１０ｍｇ，５．６９μｍｏｌ，収率６．９０％，純度９５．２８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８０７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７９Ｈ１１０ＦＮ２１Ｏ１９ ８３７．９ ｍ／ｚ ［Ｍ－４ｔＢｕ－２Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋９Ｈ］２＋，リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ｆｏｕｎｄ ８３８．４ ｍ／ｚ［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋９Ｈ］２＋、リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８２０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７９Ｈ１１０ＦＮ２１Ｏ１９ ８３７．９ ｍ／ｚ ［Ｍ－４ｔＢｕ－２Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋９Ｈ］２＋，リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ｆｏｕｎｄ ８３８．３ ｍ／ｚ［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋９Ｈ］２＋、リンクアミド（Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４，正確な質量＝２９９．１２）；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．３７分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．１２（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（３Ｒ）－１－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル］－３－メチル－２－オキソ－ピロリドン－３－カルボニル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１４）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，８２．６０μｍｏｌ）及びａａ２０（７９．２２ｍｇ，１６５．１９μｍｏｌ，２当量）から出発して、対応するａａ２０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３１，８２．６０μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３１（８２．６０μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１４（８ｍｇ，３．８５μｍｏｌ，収率６．２％，純度９３．３７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１７，７７９．３９ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７７９．９ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８６４分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１７，７７９．３９ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７７９．９ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．６０分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，８２．６０μｍｏｌ）及びａａ２１（７９．２２ｍｇ，１６５．１９μｍｏｌ，２当量）から出発して、対応するａａ２１－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３２，８２．６０μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
３．１３（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（３Ｒ）－１－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル］－３－メチル－２－オキソ－ピロリドン－３－カルボニル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１５）の調製
対応する樹脂結合ペプチド３２（８２．６０μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１５（１０．５ｍｇ，６．５４μｍｏｌ，収率７．９１％，純度９６．９６％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８２８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１７，７７９．３９ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７７９．８ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８３０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１７，７７９．３９ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７７９．８ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．６２分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．１４（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（３Ｓ）－１－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル］ピロリドン－３－カルボニル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１６）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，１４１．１３μｍｏｌ）及びａａ２２（１２７．４６ｍｇ，２８２．２７μｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２２－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３３，１４１．１３μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３３（１４１．１３μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１６（１５ｍｇ，９．７１μｍｏｌ，収率６．８８％，純度９９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．３６１分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１６，１５３０．７６ Ｍ－Ｂｏｃ－４ｔＢｕ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７６５．８，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、２．５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７５５分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１６，１５３０．７６ Ｍ－Ｂｏｃ－４ｔＢｕ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７６５．８，移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ｍＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍ 波長 ＵＶ２２０ｎｍ；カラム温度５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．１８分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ、２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．１５（３Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，１８Ｓ，２１Ｓ）－ｔｅｒｔ－ブチル１－（（Ｒ）－１－（２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル）ピロリジン－３－イル）－３－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２１－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アミノブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－１８－（ヒドロキシメチル）－１２－メチル－１，４，７，１０，１３，１６，１９－ヘプタオキソ－２，５，８，１１，１４，１７，２０－ヘプタアザトリコサン－２３－オアート（Ｐ１７）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物１８（１０１．９７μｍｏｌ）及びａａ２３（８０ｍｇ，１７７．１６μｍｏｌ，１．７４当量）から出発して、対応するａａ２３－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３４，１０１．８８μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３４（１０１．８８μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１７（１８ｍｇ，１１．６５μｍｏｌ，収率１１．４３％，純度９９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８２８分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１０３ＦＮ１８Ｏ１６，１５３０．７６ Ｍ－Ｂｏｃ－４ｔＢｕ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７６５．８，移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍ 波長 ＵＶ２２０ｎｍ；カラム温度５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．３６分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ；波長：２２０ｎｍ、２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
図１７Ａ及び図１７Ｂは、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ１０、Ｐ１２、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２５、Ｐ２６、Ｐ２７、Ｐ２８、Ｐ２９、Ｐ３０、Ｐ３１、Ｐ３６、Ｐ３７及びＰ３８の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．１６ ［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－アミノ－３－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１０）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，１３７．６６μｍｏｌ）から出発して、対応するａａ１６－ａａ１５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２６，１３７．２８μｍｏｌ）を、ａａ１５（１２８．５８ｍｇ，４１２．９９μｍｏｌ，３当量）、続いてａａ１６（１５５．４２ｍｇ，４１１．８３μｍｏｌ，３当量）を用いてペプチドを伸長させることでＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド２６（１３７．２８μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１０（１６ｍｇ，１０．３３μｍｏｌ，収率７．５５％，純度９９．８５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８０８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７４Ｈ１００ＦＮ１９Ｏ１７ １５４５．７５［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋６Ｈ］＋７７３．８８［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋７Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７７４．２［Ｍ－４ｔＢｕ－Ｂｏｃ＋７Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．４６分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．１７（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３－ヒドロキシ－５－メチル－フェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノイルアミノ］アセチル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１２）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１８，８２．６０μｍｏｌ）から出発して、対応するａａ１８－ａａ８－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（２９，８２．６０μｍｏｌ）を、ａａ８（７３．６７ｍｇ，２４７．７９μｍｏｌ，３当量）、続いてａａ１８（６３．１８ｍｇ，１６５．１９μｍｏｌ，２当量）を用いてペプチドを伸長させることでＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド２９（８２．６０μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１２（１１ｍｇ，７．０９μｍｏｌ，収率８．５９％，純度９７．９９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８２８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ９６ＦＮ１８Ｏ１８，７５９．８６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７５９．７ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８２８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７２Ｈ９６ＦＮ１８Ｏ１８，７５９．８６ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７５９．８ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．６５分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．１８（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－アミノ－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１８）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物１８（７６．４８μｍｏｌ）から出発して、対応するａａ２４－ａａ１５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３５（７６．４８μｍｏｌ）を、ａａ１５（７１．４３ｍｇ，２２９．４４μｍｏｌ，３当量）、続いてａａ２４（６４．５４ｍｇ，２２９．４４μｍｏｌ，３当量）を用いてペプチドを伸長させることでＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３５（７６．４８μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ，１２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、Ｐ１８（１６ｍｇ，１０．１５μｍｏｌ，収率１１．７６％，純度９９．７７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７６２分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７７Ｈ１０４ＦＮ１７Ｏ１８，７８６．８９［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７８７．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ（Ｒｔ＝７．６８分；移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持を使用。
３．１９（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ１９）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物１８（８１．０７μｍｏｌ）から出発して、対応するａａ２４－ａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３７（８１．０７μｍｏｌ）を、ａａ２５（７９．１３ｍｇ，２４３．２０μｍｏｌ，３当量）、続いてａａ２４（６８．４１ｍｇ，２４３．２０μｍｏｌ，３当量）を用いてペプチドを伸長させることでＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３７を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０４％ＮＨ３Ｈ２Ｏ＋１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１０％～５０％，１５分）で精製し、Ｐ１９（９ｍｇ，５．６２μｍｏｌ，収率７．０３％，純度９９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１０６ＦＮ１７Ｏ１８，７９３．９０［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７９４．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
粗ＨＰＬＣ：（Ｒｔ＝７．８１分；移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８１３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１０６ＦＮ１７Ｏ１８，７９３．９０［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７９４．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝７．８１分；移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
３．２０（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ）－２１－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－２８－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－１２，２４，２４－トリメチル－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタオキソ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－１－酸（Ｐ２５）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１．０３ｍｍｏｌ）、ａａ２５（６６９ｍｇ，２０６ｍｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３６Ａ（１．０３ｍｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物３６Ａ（０．１ｇ，５０．７０μｍｏｌ，１．０当量）の混合物に、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の化合物ａａ２９（５８．１７ｍｇ，１５２．１１μｍｏｌ，３．０当量）、ＰｙＢＯＰ（７３．８８ｍｇ，１４１．９６μｍｏｌ，２．８当量）及びＤＩＰＥＡ（３９．３２ｍｇ，３０４．２１μｍｏｌ，５２．９９μＬ，６．０当量）の溶液を２０℃で一度に加えた。混合物を２０℃で２時間、Ｎ２でバブリングした。混合物を濾過し、回収した樹脂をＤＭＦ（５０ｍＬ＊３）、ＤＣＭ（５０ｍＬ＊３）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（６ｍＬのＴＦＡ，０．４ｍＬの水，０．３ｍＬのトリイソプロピルシラン，１２０ｍｇのフェノール）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（１０００ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ Ｃ１８ ８０＊３ ０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１０％～６０％、２０分間）により精製し、生成物Ｐ２５（２．３ｍｇ，１．３３μｍｏｌ，収率２．６３％、純度９１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．００６分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１００ＦＮ２０Ｏ１７，１５７１．７６［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ７８６．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、２．５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．５４分、純度９８．４８％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持を使用。
３．２１（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ）－２１－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－２９－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－１２，２４，２４－トリメチル－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタオキソ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザノナコサン－１－酸（Ｐ２６）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１．０３ｍｍｏｌ）、ａａ２５（６６９ｍｇ，２０６ｍｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３６Ａ（１．０３ｍｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
樹脂結合化合物３６Ａ（５０ｍｇ，２５．３５μｍｏｌ，１当量）を、ＴＦＡカクテル（５ｍＬ，ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（５０ｍＬ）で希釈し、続いて１０分間遠心分離（５０００Ｒ）にかけ、白色固体として粗生成物（ａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１（５０ｍｇ，粗）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．９６８分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６９Ｈ９５ＦＮ１８Ｏ１６，１４４９．７０，ｆｏｕｎｄ １４４９．７［Ｍ＋Ｈ］＋，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、２．５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＤＭＦ（４ｍＬ）中のａａ３０（３４．１９ｍｇ，８６．２３μｍｏｌ，２．５当量）の溶液に、ＰｙＢＯＰ（３９．４９ｍｇ，７５．８８μｍｏｌ，２．２当量）及びＤＩＰＥＡ（２６．７５ｍｇ，２０６．９６μｍｏｌ，３６．０５μＬ，６当量）を加え、混合物を２５℃で１０分間撹拌し、続いてａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１（５０ｍｇ，３４．４９μｍｏｌ，１当量）を加え、最終混合物を２５℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物をＴＢＭＥ（２５ｍＬ）でトリチュレートして粗生成物を得た。これをＨ２Ｏ（０．１ｍＬ）と、トリイソプロピルシラン（７７．１０ｍｇ，４８６．８８μｍｏｌ，０．１ｍＬ，１４．８３当量）と、ＴＦＡ（２．７７ｇ，２４．３１ｍｍｏｌ，１．８ｍＬ，７４０．６９当量）との溶液に加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、続いてＴＢＭＥ（５０ｍＬ）でトリチュレートして粗生成物を得た。これを、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ Ｃ１８ ５μｍ＊１０＊１５０ｍｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１０％～６０％，３０分）で精製し、Ｐ２６（７．７２ｍｇ，４．７７μｍｏｌ，収率１４．５４％，純度９８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．９９１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０３ＦＮ２０Ｏ１７ ７９３．３８［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ７９３．７［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６．０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．５５分，ＨＰＬＣ条件：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持、カラム：ＷＥＬＣＨ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＰ－Ｃ１８ １５０＊４．６ｍｍ ５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ、２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．２２（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ）－２１－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－３０－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－１２，２４，２４－トリメチル－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタオキソ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザトリアコンタン－１－酸（Ｐ２７）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１．０３ｍｍｏｌ）、ａａ２５（６６９ｍｇ，２０６ｍｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３６Ａ（１．０３ｍｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物３６Ａ（１２０ｍｇ，６０．８４μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３１（６２．４４ｍｇ，１５２．１１μｍｏｌ，２．５当量）と、ＰｙＢＯＰ（６９．６６ｍｇ，１３３．８５μｍｏｌ，２．２当量）と、ＤＩＰＥＡ（４７．１８ｍｇ，３６５．０５μｍｏｌ，６３．５９μＬ，６当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングし、この進行を２回繰り返した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ＊４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ＊４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（５０ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～４５％、３０分間）により精製し、生成物Ｐ２７（２．４ｍｇ，１．４７μｍｏｌ，収率２．４８％、純度９８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．０７１分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７７Ｈ１０５ＦＮ２０Ｏ１７，８００．３９ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ８００．８，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で２．５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．５８分，ＨＰＬＣ条件：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持、カラム：ＷＥＬＣＨ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＰ－Ｃ１８ １５０＊４．６ｍｍ ５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ、２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．２３（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ）－２１－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－３１－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－１２，２４，２４－トリメチル－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタオキソ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザヘントリアコンタン－１－酸（Ｐ２８）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１．０３ｍｍｏｌ）、ａａ２５（６６９ｍｇ，２０６ｍｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３６Ａ（１．０３ｍｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物３６Ａ（１２０ｍｇ，６０．８４μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３２（６４．５７ｍｇ，１５２．１０μｍｏｌ，２．５当量）と、ＰｙＢＯＰ（６９．６５ｍｇ，１３３．８５μｍｏｌ，２．２当量）と、ＤＩＰＥＡ（３９．３２ｍｇ，３０４．２０μｍｏｌ，５２．９９μＬ，５当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングし、この進行を２回繰り返した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ＊４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ＊４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（５０ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０５ｖ／ｖ％水酸化アンモニウム）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～４５％、３０分間）により精製し、生成物Ｐ２８（８．５ｍｇ，５．２１μｍｏｌ，収率１０．３４％、純度９９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．０３５分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１０７ＦＮ２０Ｏ１７，８０７．４０ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ８０７．８，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で２．５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．６０分，ＨＰＬＣ条件：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持、カラム：ＷＥＬＣＨ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＰ－Ｃ１８ １５０＊４．６ｍｍ ５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ、２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．２４（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ）－２１－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－３２－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）－１２，２４，２４－トリメチル－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタオキソ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オウタアザドトリアコンタン－１－酸（Ｐ２９）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１．０３ｍｍｏｌ）、ａａ２５（６６９ｍｇ，２０６ｍｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３６Ａ（１．０３ｍｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物３６Ａ（１２０ｍｇ，６０．８４μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３３（６４．０４ｍｇ，１４６．０２μｍｏｌ，２．４当量）と、ＰｙＢＯＰ（６３．３２ｍｇ，１２１．６８μｍｏｌ，２当量）と、ＤＩＰＥＡ（３９．３２ｍｇ，３０４．２１μｍｏｌ，５２．９９μＬ，５当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングし、この進行を２回繰り返した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ＊４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ＊４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（５０ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～５５％、２０分間）により精製し、生成物Ｐ２９（５ｍｇ，３．０５μｍｏｌ，収率５．２２％、純度９９．４％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．９９７分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７７Ｈ１０３ＦＮ２０Ｏ１７，８１４．４０ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ８１４．９，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で２．５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．６１分，ＨＰＬＣ条件：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持、カラム：ＷＥＬＣＨ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＰ－Ｃ１８ １５０＊４．６ｍｍ ５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ、２１５ｎｍ、２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．２５（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アジドブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［８－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）オクタノイルアミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］ アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ３０）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１．０３ｍｍｏｌ）、ａａ２５（６６９ｍｇ，２０６ｍｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３６Ａ（１．０３ｍｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物３６Ａ（５００ｍｇ，１２６．７５μｍｏｌ，純度５０％、１当量）の混合物に、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のａａ３４（２８６．８４ｍｇ，６３３．７７μｍｏｌ，５当量）と、ＨＡＴＵ（８６．７５ｍｇ，２２８．１６μｍｏｌ，１．８当量）と、ＤＩＰＥＡ（６５．５３ｍｇ，５０７．０２μｍｏｌ，８８．３１μＬ，４当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングした。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ＊４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ＊４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（１０ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（１００ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＯＤＳ１５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２２％～６２％、９分間）により精製し、生成物Ｐ３０（７．６８ｍｇ，４．６２μｍｏｌ，収率４．４５％、純度９８．８２％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．９９８分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ１１０ＦＮ２０Ｏ１７ １６４１．８３［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ８０Ｈ１１１ＦＮ２０Ｏ１７ ８２１．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ８２１．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．６３分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
３．２６（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アジドブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［９－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）ノナノイルアミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ３１）の調製
対応するａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１．０３ｍｍｏｌ）、ａａ２５（６６９ｍｇ，２０６ｍｍｏｌ，２．０当量）から出発して、対応するａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３６Ａ（１．０３ｍｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
ＤＭＦ（４ｍＬ）中の化合物３６Ａ（１２５ｍｇ，６３．３８μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３５（５７．３７ｍｇ，１２６．７５μｍｏｌ，２．０当量）と、ＨＡＴＵ（４３．３８ｍｇ，１１４．０８μｍｏｌ，１．８当量）と、ＤＩＰＥＡ（３２．７６ｍｇ，２５３．５１μｍｏｌ，４４．１６μｌ，４．０当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングした。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ＊４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ＊４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（５０ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＯＤＳ１５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２５％～６５％、９分間）により精製し、生成物Ｐ３１（７．０ｍｇ，４．２３μｍｏｌ，収率６．６９％、純度１００％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．０２３分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１００ＦＮ２０Ｏ１７，１５７１．７６［Ｍ＋Ｈ］＋，７８６．３８［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７８６．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、２．５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ、２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．８０分、純度１００％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持を使用。
３．２７（９Ｓ，１５Ｓ，１８Ｓ，２１Ｓ，２４Ｓ，２７Ｓ）－９－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２７－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１８－（２－フルオロベンジル）－１５，２１－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２４－（ヒドロキシメチル）－６，６，１８－トリメチル－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタオキソ－１－（２－オキソピペリジン－１－イル）－３，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタアザノナコサン－２９－酸（Ｐ３６）の調製
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（７５ｍｇ，１９．８７μｍｏｌ，純度５０％、１当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３６（２０ｍｇ，７３．９９μｍｏｌ，３．７２当量）と、ＨＡＴＵ（１５．１１ｍｇ，３９．７４μｍｏｌ，２当量）と、ＤＩＰＥＡ（２５．６８ｍｇ，１９８．７１μｍｏｌ，３４．６１μＬ，１０当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングした。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ×４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ×４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（５０ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５０％～８０％、１０分間）により精製し、生成物Ｐ３６（２．４ｍｇ，１．４８μｍｏｌ，収率７．４７％、純度１００％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．４１６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１２２Ｎ２０Ｏ２２ＦＨ １９１７．１１［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ９５Ｈ１２２Ｎ２０Ｏ２２Ｆ ８０９．１［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ８０９．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈカラム、１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝５．２４分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％（溶媒Ｂ）溶出勾配及び８０％で５分間保持；カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍを使用。
３．２８（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アジドブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［２－［２－（５－メチル－１，３－ジオキソ－イソインドリン－２－イル）エチルアミノ］－２－オキソ－エチル］スルファニルアセチル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］ アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ３７）の調製
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１００ｍｇ，２６．４９μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３６（４４．５６ｍｇ，１３２．４７μｍｏｌ，５当量）と、ＨＡＴＵ（１８．１３ｍｇ，４７．６９μｍｏｌ，１．８当量）と、ＤＩＰＥＡ（１３．７０ｍｇ，１０５．９８μｍｏｌ，１８．４６μＬ，４当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングした。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ×４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ×４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（５ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（５０ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １００＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～８０％、１５分間）により精製し、生成物Ｐ３７（４．８１ｍｇ，２．８６μｍｏｌ，収率１０．８６％、純度１００％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．６０２分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８０Ｈ１０１ＦＮ１９Ｏ１９Ｓ １６８２．７１［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ８０Ｈ１００ＦＮ１９Ｏ１９Ｓ ８４１．８５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ８４２．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝４．８４４分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
３．２９（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ）－２１－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－１２－メチル－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２７－オクタオキソ－２９－（２－オキソピロリジン－１－イル）－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２６－オクタアザノナコサン－１－酸（Ｐ３８）の調製
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（０．２ｇ，５２．９９μｍｏｌ，純度５０％，１．０当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３８（８２．４８ｍｇ，２６４．９４μｍｏｌ，５．０当量）と、ＨＡＴＵ（９０．６６ｍｇ，２３８．４５μｍｏｌ，４．５当量）と、ＤＩＰＥＡ（６８．４８ｍｇ，５２９．８８μｍｏｌ，９２．２９μＬ，１０．０当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングした。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ×４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ×４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これを２０％のピペリジン／ＤＭＦ（２０ｍＬ）で再度膨潤させ、Ｎ２、２０℃で２時間バブリングした。完了後、混合物を濾過し、回収した樹脂をＤＭＦ（１００ｍＬ×３）、ＤＣＭ（１００ｍＬ×３）で洗浄して固相上で粗生成物ａａ３８－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１（５２．９９μｍｏｌ）を得た。
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のａａ３８－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（５２．６０μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のａａ３９（４１．３３ｍｇ，２６２．９８μｍｏｌ，５．０当量）と、ＨＡＴＵ（９０．００ｍｇ，２３６．６９μｍｏｌ，４．５当量）と、ＤＩＰＥＡ（６７．９８ｍｇ，５２５．９７μｍｏｌ，９１．６１μＬ，１０．０当量）との溶液を２０℃で一度に加え、最終混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングした。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了後、混合物を濾過し、ＤＭＦ（１０ｍＬ×４）及びＤＣＭ（１０ｍＬ×４）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これをＴＦＡカクテル（１０ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで酸性切断に供した。混合物を濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅ（１００ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＯＤＳ１５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３６％～７６％、９分間）及び分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－ｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １００＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０５％ＮＨ３Ｈ２Ｏ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５％～４９％，１１分間）により精製し、生成物Ｐ３８（３．０ｍｇ，１．７１μｍｏｌ，収率３．２６％、純度９０％）を白色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．３１３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１０２ＦＮ１９Ｏ１８ １５７５．７６［Ｍ＋Ｈ］＋，７８８．３８［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７８８．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍ；ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．９３分，純度９０％を使用。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持を使用。
図１８は、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２０及びＰ２１の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．３０（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２，５－ジアミノ－５－オキソペンタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ２０）の調製
対応するａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（１７，１７５．１７μｍｏｌ）及びａａ２６（１９３．５９ｍｇ，５２５．５１μｍｏｌ，３当量）から出発して、対応するａａ２６－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３８，１７５．１７μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３８（１７５．１７μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～９０％，２５分）で精製し、Ｐ２０（４．６５ｍｇ，３．３５μｍｏｌ，純度９５．７７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７８９分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６６Ｈ９３ＦＮ１２Ｏ１６，６６４．３４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ６６５．０ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．３６２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６６Ｈ９２ＦＮ１２Ｏ１６ １３２７．６７ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］＋；ｆｏｕｎｄ １３２７．７ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］＋；ＬＣ－ＭＳ：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、２分間の１０％～８０％勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間保持を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．４０分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
３．３１（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－５－アミノ－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ２１）の調製
対応するａａ２６－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂化合物３８（１７５．１７μｍｏｌ）及びａａ１０（１６３．８０ｍｇ，３５０．３４μｍｏｌ，２当量）から出発して、対応するａａ１０－ａａ２６－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｂ－ａａ１ペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（３９，１７５．１７μｍｏｌ）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド３９（１７５．１７μｍｏｌ）を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，２０分）で精製し、Ｐ２１（２０ｍｇ，１２．９４μｍｏｌ，収率７．３９％，純度９９．３１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８３３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０６ＦＮ１５Ｏ１８，７６７．８９ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ７６８．３ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．４４分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
図１９は、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２２及びＰ２３の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．３２（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－アニリノ－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ２２）の調製
対応するａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３ペプチジル２－クロロトリチルクロリド樹脂４７を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド（４７，５５３．９８μｍｏｌ）の混合物に、ＤＣＭ（８ｍＬ）中のＴＦＥ（２．６１ｇ，２６．０９ｍｍｏｌ，１．８８ｍＬ，４７．０９当量）及びＡｃＯＨ（１．９７ｇ，３２．８３ｍｍｏｌ，１．８８ｍＬ，５９．２６当量）を、２５℃、Ｎ２下で一度に加えた。混合物を２５℃で２時間振盪した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。混合物を濾過し、ケーキをＤＣＭ（５ｍＬ×３）で洗浄した。濾液を真空状態で濃縮して黄色油を得た。これを水（５ｍＬ）で希釈した。ＮａＨＣＯ３飽和水溶液を用いて混合物のｐＨを８に調整し、黄色固体を沈殿させた。混合物を濾過し、ケーキを水（５ｍＬ×２）で洗浄し、真空状態で乾燥して粗生成物（５５０ｍｇ，粗）を黄色固体として得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １５０＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：４８％～５８％，１１分）で精製し、化合物４７（２２０ｍｇ，１２２．６５μｍｏｌ，収率３６．１０％，純度８２．０５％）をオフホワイト色の固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．０７３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０４ＦＮ１４Ｏ１５ １４７１．７８，ｍ／ｚ ［Ｍ－Ｃ１９Ｈ１３Ｃｌ＋２Ｈ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １４７１．６５；［Ｍ－Ｃ１９Ｈ１３Ｃｌ＋２Ｈ］＋リンク２－［クロロ（ジフェニル）メチル］ベンゼン（Ｃ１９Ｈ１３Ｃｌ，正確な質量＝２７６．１）；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．０７９分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７６Ｈ１０４ＦＮ１４Ｏ１５ １４７１．７８ ｍ／ｚ［Ｍ－Ｃ１９Ｈ１３Ｃｌ＋２Ｈ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １４７１．８；［Ｍ－Ｃ１９Ｈ１３Ｃｌ＋２Ｈ］＋，リンク２－［クロロ（ジフェニル）メチル］ベンゼン（Ｃ１９Ｈ１３Ｃｌ，正確な質量＝２７６．１）；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝１０．９６分。ＨＰＬＣ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
ＣＨＣｌ３（０．２２５ｍＬ）及びＤＭＦ（０．０２５ｍＬ）中の化合物４７（３７．３７μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（５．０５ｍｇ，３７．３７μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ａａ２７（１９．８７ｍｇ，３７．３７μｍｏｌ，１当量）を２０℃で加えた。ＣＨＣｌ３（０．２２５ｍＬ）及びＤＭＦ（０．０２５ｍＬ）中のＤＩＣ（４．７２ｍｇ，３７．３７μｍｏｌ，５．７９μＬ，１当量）の溶液を混合物に加えた。反応物を２０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。反応物を真空状態で濃縮し、褐色油として粗生成物４８（７４．２ｍｇ，３７．３７μｍｏｌ）を得た。これをさらなる精製なしに次の工程に使用した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．２１５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０８Ｈ１４４ＦＮ１７Ｏ１８ ９９３．０５ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９９３．８ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
化合物４８（７４．２ｍｇ，３７．３７μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＴＦＡ（２ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．０６ｍＬ）中のトリイソプロピルシラン（１３７．３０ｍｇ，８６７．０１μｍｏｌ，１７８．０８μＬ，２３．２０当量）を２５℃、Ｎ２下で一度に加えた。混合物を１５℃、２．５時間で静置した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。混合物を真空状態で濃縮し、黄色油として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊３０ｍｍ，１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２８％～５８％，１１分）で精製し、化合物Ｐ２２（７．５ｍｇ，５．１８μｍｏｌ，収率１３．８６％，純度９７．９６％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８１１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６８Ｈ９０ＦＮ１７Ｏ１６ ７０９．８４ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７１０．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．０６分。ＨＰＬＣ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
３．３３（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－（４－アミノブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－４－（３，５－ジメチルフェニル）－１－（フェニルカルバモイル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］ アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ２３）の調製
ＣＨＣｌ３（０．２２５ｍＬ）及びＤＭＦ（０．０２５ｍＬ）中の４７（２７．１８μｍｏｌ）とＨＯＢｔ（３．６７ｍｇ，２７．１８μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ａａ２８（１９．９８ｍｇ，２７．１８μｍｏｌ，１当量）を２０℃で加えた。ＣＨＣｌ３（０．２２５ｍＬ）及びＤＭＦ（０．０２５ｍＬ）中のＤＩＣ（３．４３ｍｇ，２７．１８μｍｏｌ，４．２１μＬ，１当量）の溶液を混合物に加えた。反応物を２０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。反応物を真空状態で濃縮し、褐色油として粗生成物４９（５９．４９ｍｇ，２７．１８μｍｏｌ）を得た。これをさらなる精製なしに次の工程に使用した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．２２３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１６Ｈ１５４ＦＮ１８Ｏ１７ １０４５．０９ ｍ／ｚ［Ｍ－Ｂｏｃ＋３Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０４４．８［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
化合物４９（５９．４９ｍｇ，２７．１８μｍｏｌ，１当量）の混合物に、ＴＦＡ（６ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．１７ｍＬ）中のトリイソプロピルシラン（１３１．０７ｍｇ，８２７．６７μｍｏｌ，０．１７ｍＬ，３０．４５当量）を１５℃、Ｎ２下で一度に加えた。混合物を１５℃、２．５時間で静置した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。混合物を真空状態で濃縮し、黄色油として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １０μｍ，２５０ｍｍ＊５０ｍｍ；移動相：［水（０．０４％ＮＨ３Ｈ２Ｏ＋１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２５％～５５％，８分）で精製し、化合物Ｐ２３（７．５ｍｇ，４．６０μｍｏｌ，収率１６．９１％，純度９９．３８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８７５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８１Ｈ１０７ＦＮ１８Ｏ１７ ８１１．４ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ８１１．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８８２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８１Ｈ１０７ＦＮ１８Ｏ１７ ８１１．４ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ８１１．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．３０分。ＨＰＬＣ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
図２０は、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ２４の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．３４（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－４－［４－（４－アミノブトキシ）フェニル］－１－カルバモイル－ブチル］アミノ］－１－［［４－（２－エチル－４－メトキシ－フェニル）フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｒ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（Ｐ２４）の調製
対応するａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２ｃ－ａａ１ｂペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂（５９）を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。
対応する樹脂結合ペプチド５９を、一般的手順に従ってさらに切断し、白色固体として粗生成物を得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（カラム：移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）で精製し、純粋な生成物を得た。生成物を水（２０ｍＬ）中に懸濁し、混合物をドライアイス／アセトン浴で凍結させ、続いて凍結乾燥で乾燥させて所望の生成物を得た。化合物Ｐ２４（５０ｍｇ，２９．６９μｍｏｌ，収率６．７６％，純度９８．６８６％，ＴＦＡ塩）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８２１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７４Ｈ９９ＦＮ１８Ｏ１８ １５４６．７４［Ｍ＋Ｈ］＋，７７３．４［Ｍ＋Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７７４．８［Ｍ＋Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
図２１は、本開示に従ったＧＬＰ１ペプチド模倣ペイロードＰ３２、Ｐ３３、Ｐ３４及びＰ３５の固相合成のための工程のシーケンスを表す。
３．３５（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（４－（アミノメチル）フェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ２４Ａ）の調製
Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｌｉｔｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置を使用し、０．５ｍｍｏｌでペプチド伸長反応を実施した。ポリプロピレン固相反応容器に、リンクアミドＭＢＨＡ樹脂（０．５ｍｍｏｌ，１当量）を加えた。樹脂を２回、以下のように洗浄した：容器上部を通しＤＭＦ（１０ｍＬ）を反応容器に加え、混合物を５分間撹拌し、その後溶媒を、フリットを通して排出した。
各アミノ酸の一般的なカップリング反応を、Ｆｍｏｃ基除去の一般的手順の後に実施した。Ａ）Ｆｍｏｃ基を一般的な除去手順：前の工程から樹脂を含有する反応容器に、ピペリジン：ＤＭＦ（１：４ｖ／ｖ，５ｍＬ）を加えた。混合物をマイクロ波で９０℃、２分間撹拌し、続いて溶液をフリットを通して排出した。樹脂を５回、以下のように洗浄した：各洗浄では、ＤＭＦ（５ｍＬ）を容器上部を通して加え、得られた混合物を０．５分間にわたって定期的に撹拌し、その後溶液をフリットを通して排出した。Ｂ）一般的なカップリング反応手順：
反応容器にアミノ酸（ＤＭＦ中０．２Ｍ，１２．５ｍＬ，５当量）を加え、続いてＤＩＣ（ＤＭＦ中０．５Ｍ，４ｍＬ，４当量）及びオキシマ（ＤＭＦ中０．５Ｍ，２ｍＬ，２当量）を加えた。混合物を９０℃、マイクロ波下で１０分間撹拌し、続いてフリットを通して反応溶液を排出した。樹脂を４回、以下のように洗浄した：各洗浄では、ＤＭＦ（８ｍＬ）を容器上部を通して加え、得られた混合物を０．５分間にわたって定期的に撹拌し、その後溶液をフリットを通して排出した。合成の完了後、樹脂をＤＭＦ（６×６ｍＬ）、続いてＣＨ２Ｃｌ２（６×６ｍＬ）で完全にすすいだ。ＴＦＡカクテル（ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで得られた樹脂を２時間酸性切断に供し、続いてこれを濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅで希釈して沈殿を得た。これを１０分間遠心分離（５０００Ｒ）にかけ、デカントして粗生成物を得た。
対応するａａ１０－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－ａａ２－ａａ１ｂペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ Ｃ１８ ８０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５％～５５％，８分）で精製し、純粋な生成物Ｐ２４Ａ（５０ｍｇ，３１．７９μｍｏｌ，収率４１．８０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．９１３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｃ７５Ｈ１０１ＦＮ２０Ｏ１７ ７８６．３７，ｆｏｕｎｄ ７８６．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．４４分、純度９９．１８％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
３．３６（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（４－（１３－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキソ－２，５，８，１１－テトラアザトリデシル）フェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ３２）の調製
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＰ２４Ａ（２０ｍｇ，１２．７２μｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐ３２－１（７．１３ｍｇ，１５．２６μｍｏｌ，１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（３．２９ｍｇ，２５．４３μｍｏｌ，４．４３μＬ，２．０当量）を加えた。溶液を２０℃で２時間撹拌した。完了後、水（６ｍＬ）を加え、混合物を凍結乾燥して白色固体（２５ｍｇ，粗）を得た。これをＤＣＭ（２．５ｍＬ）中に加え、続いてＴＦＡ（３．８５ｇ，３３．７７ｍｍｏｌ，２．５ｍＬ，２５６７．５２当量）を加えた。溶液を２０℃で２時間撹拌した。完了後、減圧下で溶液の溶媒を除去し、粗生成物を得た。これを、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ８０＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５％～４５％，３０分）で精製した。Ｐ３２（７．２ｍｇ，３．６０μｍｏｌ，収率２７．３６％、純度９０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．８８０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８２Ｈ１１２ＦＮ２５Ｏ２１９０１．２０，ｆｏｕｎｄ ９００．９１［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．２３分、純度１００％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
３．３７（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（４－（１７－ヒドロキシ－３－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－２－アザヘプタデシル）フェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ３３）の調製
ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＰ２４Ａ（１０ｍｇ，６．３６μｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐ３３－１（２．９６ｍｇ，７．６３μｍｏｌ，１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（１．６４ｍｇ，１２．７２μｍｏｌ，２．２２μＬ，２．０当量）を加えた。溶液を２０℃で２時間撹拌した。完了後、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件，カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＯＤＳ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１４％～５４％，９分）で精製し、Ｐ３３（２．０ｍｇ，１．１３μｍｏｌ，収率１７．６９％，純度９５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝３．３８３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８５Ｈ１２０ＦＮ２１Ｏ２３ ９１１．４０ ｆｏｕｎｄ ９１１．４０［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．９６分、純度９５．４７％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
３．３８（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（４－（２９，２９－ジメチル－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７－ノナオキサ－２８－ｏｘａ－２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－ノナアザトリアコンチル）フェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ３４）の調製
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＰ３２（５ｍｇ，２．７８μｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐ３２－１（１．５６ｍｇ，３．３３μｍｏｌ，１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（７１７．６４ｕｇ，５．５５μｍｏｌ，９．６７ｅ－１μＬ，２．０当量）を加えた。溶液を２０℃で２時間撹拌した。完了後、水（６ｍＬ）を加え、混合物を凍結乾燥して白色固体（２５ｍｇ，粗）を得た。これをＤＣＭ（０．２ｍＬ）中に加え、続いてＴＦＡ（２５６．６７ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ，１６６．６７μＬ，９５８．６０当量）を加えた。溶液を２０℃で２時間撹拌した。完了後、減圧下で溶液の溶媒を除去し、粗生成物を得た。これを、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １００＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１０％）で精製した。Ｐ３４（１．７２ｍｇ，７．６３ｅ－１μｍｏｌ，収率３２．４９％、純度９０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．７６０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９０Ｈ１２４ＦＮ２９Ｏ２５ １０１４．９８ ｆｏｕｎｄ １０１５．２０［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．１５分、純度１００％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
３．３９（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（４－（１７－ヒドロキシ－３－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－２－アザヘプタデシル）フェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－アジドブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（Ｐ３５）の調製
ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＰ２４Ａ（２０ｍｇ，１２．７２μｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐ３５－１（１０．７５ｍｇ，１９．０８μｍｏｌ，１．５当量）及びＤＩＰＥＡ（３．２９ｍｇ，２５．４３μｍｏｌ，４．４３μＬ，２．０当量）を加えた。溶液を２０℃で２時間撹拌した。完了後、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＯＤＳ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１４％～５４％，９分）で精製し、Ｐ３３（２０ｍｇ，１０．０１μｍｏｌ，収率７８．７５％，純度１００％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝３．３２５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９３Ｈ１３６ＦＮ２１Ｏ２７ ９９８．９８ ｆｏｕｎｄ ９９９．４０［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．８８分、純度１００％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
図２２は、Ｐ３９の合成のためのシーケンスを表す。
（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，２１Ｓ，２７Ｓ）－２１－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２７－アミノ－３－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（４－（アミノメチル）フェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４－ヒドロキシフェニル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１２－（２－フルオロベンジル）－９，１５－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－６－（ヒドロキシメチル）－２８－（４－ヒドロキシフェニル）－１２，２４，２４－トリメチル－５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６－オクタオキソ－４，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－１－酸（Ｐ３９）の調製
Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｌｉｔｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置を使用し、０．５ｍｍｏｌでペプチド伸長反応を実施した。ペプチド合成装置での標準操作に従い、ａ）脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液を樹脂容器に加え、９０℃、Ｎ２で２分間撹拌した。続いて容器からこれを排出し、ＤＭＦ（３ｍＬ×３）を用いて２０℃で洗浄した。ｂ）カップリング（各アミノ酸は５．０当量で３つ組で反応した）：ＤＭＦ（５ｍＬ）、ＤＩＣ（２ｍＬ）及びオキシマ（１ｍＬ）中のアミノ酸（２．５ｍｍｏｌ，５当量）の溶液を容器に加え、９０℃、Ｎ２で１０分間撹拌した。全てのアミノ酸についてａ）及びｂ）を繰り返す。ＴＦＡカクテル（ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで樹脂を酸性切断に供し、続いてこれを濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅで希釈して沈殿を得た。これを１０分間遠心分離（５０００Ｒ）にかけて粗生成物を得た。
対応するａａ２４－ａａ２５－ａａ９－ａａ８－ａａ７－ａａ６－ａａ５－ａａ４－ａａ３－Ｙ－ａａ１ｂペプチジルリンクアミドＭＢＨＡ樹脂を、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｐｒｉｍｅ Ｃ１８ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０５ｖ／ｖ％水酸化アンモニウム）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～３５％，９分）で精製し、純粋な生成物Ｐ３９（１５ｍｇ，９．３５μｍｏｌ，収率９．３５％，純度８８％）を白色固体として得た。生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５％～４５％，１２分）で精製し、生成物（１０ｍｇ，６．９６μｍｏｌ，収率６５．５１％，純度９８．２６％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．５７３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ６５Ｈ８７ＦＮ１７Ｏ１８ ［Ｍ＋Ｈ］＋１４１２．６３，Ｃ６５Ｈ８８ＦＮ１７Ｏ１８ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋７０７．８１，ｆｏｕｎｄ Ｃ６５Ｈ８７ＦＮ１７Ｏ１８ ［Ｍ＋Ｈ］＋１４１２．７０，Ｃ６５Ｈ８８ＦＮ１７Ｏ１８ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋７０７．３０ ｆｏｕｎｄ。ＬＣＭＳ条件：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝４．７２分，純度９８．２６％ ＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
実施例４．リンカーの合成
４．１ ＰＥＧリンカーの調製
以下のスキーム２０は、ＰＥＧｎリンカー（ｎ＝４、８、１２及び２４）の合成を表す：
例として、ｎ＝８のＰＥＧｎリンカーの合成を提供する。他の長さのリンカーを同一の様式で調製した。Ｌ１（（１１，１２－ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタン酸）の合成は、Ｌ．Ｓ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ－Ｖｅｒｄｕｙｎ，Ｌ．Ｍｉｒｆｅｉｚｉ，Ａ．Ｋ．Ｓｃｈｏｏｎｅｎ，Ｒ．Ａ．Ｄｉｅｒｃｋｘ，Ｐ．Ｈ．Ｅｌｓｉｎｇａ，ａｎｄ Ｂ．Ｌ．Ｆｅｒｉｎｇａ，Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｃｏｐｐｅｒ－Ｆｒｅｅ ”Ｃｌｉｃｋ” Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ １８Ｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｂｏｍｂｅｓｉｎ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．４７，２０１１，１１１１７－１１１２０に従って実施した。
工程１：２，５－ジオキソピロリジン－１－イル－４－（ジデヒドロジベンゾ［ｂ，ｆ］アゾシン－５（６Ｈ）－イル）－４－オキソブタノアート（Ｌ２）の合成
ＤＣＭ（４ｍＬ）中のＬ１（０．３５ｇ，１．１５ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＨＯＳｕ（１５８．３１ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ，１．２当量）及びＥＤＣＩ（２６３．７０ｍｇ，１．３８ｍｍｏｌ，１．２当量）を加えた。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ＰＥ：ＥｔＯＡｃ＝１：１）は、反応物の完全な消費を示した。混合物を濾過し、濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，石油エーテル／酢酸エチル＝３／１～１／１）で精製した。所望の化合物Ｌ２（４５０ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ，収率９７．５６％）を白色固体として得た。
工程２：３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（３９－アザトリシクロヘキサデカ－（４），１（５），２（６），３（７），３１，３３－ヘキサエン－９－イン－３９－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパン酸（Ｌ４）の合成
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＬ２（５４．６８ｍｇ，１３５．９０μｍｏｌ，１．５当量）の溶液に、Ｌ３（ｎ＝８，４０ｍｇ，９０．６０μｍｏｌ，１当量）及びＤＩＰＥＡ（５８．５４ｍｇ，４５２．９９μｍｏｌ，７８．９０μＬ，５当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応物の完全な消費及び所望の質量の形成を示した。混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣ（ＡｃＯＨ ０．３％，ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ，０～４３％，２５ｍＬ／分，１５分）で精製した。所望のＬ４（６０ｍｇ，７４．０９μｍｏｌ，収率８１．７８％、純度９０％）を淡黄色の油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９００分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ３８Ｈ５３Ｎ２Ｏ１２ ７２９．３６，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７２９．３［Ｍ＋Ｈ］＋。ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
工程３：（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（４３－アザトリシクロヘキサデカ－（４），１（５），２（６），３（７），３３，３５－ヘキサエン－１１－イン－４３－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノアート（Ｌ５）の合成
ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のＬ４（２０ｍｇ，２７．４４μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＨＯＳｕ（６．３２ｍｇ，５４．８８μｍｏｌ，２当量）及びＤＣＣ（８．４９ｍｇ，４１．１６μｍｏｌ，８．３３μＬ，１．５当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応物の完全な消費及び所望の質量の形成を示した。混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣ（ＡｃＯＨ ０．３％，ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ，０～６５％，１８ｍＬ／分，１５分）で精製した。所望の化合物Ｌ５（１８ｍｇ，１７．８７μｍｏｌ，収率６５．１３％、純度８２％）を淡黄色の油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９２０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４２Ｈ５５Ｎ３Ｏ１４ ８２５．３７，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ８４８．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
４．２ ペプチドリンカーＬ８の調製
以下のスキーム２１は、ＳＧ４－ＳＨペプチドリンカーＬ８の合成を表す：
以下、参考文献として、Ｄ．Ｃｒｉｃｈ，Ｋ．Ｓａｎａ，ａｎｄ Ｓ．Ｇｕｏ，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ２，４－Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．２２，２００７，４４２３－４４２６ ａｎｄ Ｘ．Ｙ．Ｗｕ，Ｊ．Ｌ．Ｓｔｏｃｋｄｉｌｌ，Ｐ．Ｋ．Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｓａｍｕｅｌ，ａｎｄ Ｓ．Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｉｓｏｎｉｔｒｉｌｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｉｄａｔｉｏｎｓ：Ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ Ｓｔｅｒｅｏｓｕｂｔｌｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｌａｃｔａｍ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｅｃｏ－Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１３４，Ｎｏ．４，２０１２，２３７８－２３８４を参照されたい。
工程１：（Ｓ）－Ｓ－（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル）６－（ｔｅｒｔ－ブトキシメチル）－２，２－ジメチル－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタアザノナデカン－１９－チオアート（Ｌ８－３）
ＤＭＦ（７ｍＬ）中のＬ８－１（７００ｍｇ，１．４３ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、４Ａモレキュラーシーブ（１ｇ）及びＬ８－２（４５５．４０ｍｇ，２．１４ｍｍｏｌ，１．５当量）を加え、混合物を－２０℃で撹拌した。１５分後、ＰｙＢＯＰ（１．１２ｇ，２．１４ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＤＩＰＥＡ（３６９．６３ｍｇ，２．８６ｍｍｏｌ，４９８．１５μＬ，２当量）を加え、反応混合物を－２０℃で１．５時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完全に変換したことを示した。反応物をＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で希釈して濾過し、ケーキをＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ＊２）で洗浄した。濾液を、ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）、塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過して真空状態で濃縮し、黄色油として粗生成物を得た。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、０～２０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの溶出勾配（３０ｍＬ／分））で精製し、淡黄色油としてＬ８－３（７００ｍｇ，８１４．７８μｍｏｌ，収率５６．９８％，純度７９．５９４％）を得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８８２分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２９Ｈ３８Ｎ５Ｏ６Ｓ，５８４．２５［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ５８４．３［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］２＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ＝７．７８（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４２－７．２９（ｍ，４Ｈ），４．１５（ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，２Ｈ），４．０４（ｓ，２Ｈ），３．９２（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６Ｈ），３．６８－３．５７（ｍ，４Ｈ），３．３８－３．３５（ｍ，３Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．１９（ｓ，１０Ｈ）。
工程２：（Ｓ）－６－（ｔｅｒｔ－ブトキシメチル）－２，２－ジメチル－４，７，１０，１３，１６－ペンタオキソ－３－オキサ－５，８，１１，１４，１７－ペンタアザノナデカン－１９－チオＳ－酸（Ｌ８）
ＴＨＦ（７ｍＬ）中のＬ８－３（５６０ｍｇ，８１８．９４μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ピペリジン（１３９．４６ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ，１６１．７５μＬ，２当量）を２０℃で加えた。反応物を２０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完全に変換したことを示した。反応物にＭＴＢＥ（５０ｍＬ）を加え、白色固体を沈殿させた。混合物を濾過して、オフホワイト色の固体として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（逆相カラム，４０ｇ，０％～３５％ ０．４％ＡｃＯＨ水溶液／ＡＣＮ，１５分）をＬ８（１８０ｍｇ，２５２．８８μｍｏｌ，収率３０．８８％，純度７１．０２８％）をオフホワイト色の固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７０９分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２８Ｎ５Ｏ６Ｓ，４０６．１８［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ４０６．２［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
４．３ ペプチドリンカーＬ９の調製
以下のスキーム２２は、ＳＧ４－ＳＨペプチドリンカーＬ８の合成を表す：
糖ペプチドＬ１３－３ａを、Ｊ．Ｊ．Ｄｕ，Ｘ．Ｆ．Ｇａｏ，Ｌ．Ｍ．Ｘｉｎ，Ｚ．Ｌｅｉ，Ｚ．Ｌｉｕ，ａｎｄ Ｊ．Ｇｕｏ，Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｖｉａ Ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ω－Ａｓｐ ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１９，２０１６，４８２８－４８３１に従って合成した、Ｌ１３－１ａの合成は、Ｙ．Ａ．Ｎａｕｍｏｖｉｃｈ，Ｉ．Ｓ．Ｇｏｌｏｖａｎｏｖ，Ａ．Ｙ．Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ，ａｎｄ Ｓ．Ｌ．Ｌｏｆｆｅ，Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＯ－Ａｃｉｄｓ ｔｏ Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（ｏｘｙ）ｅｎａｍｉｎｅｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｓｃｏｐｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２０１７，Ｎｏ．４，２０１７，６２０９－６２２７に従って実施した。
工程１：ベンジル２，２－ジメチル－４，７，１０，１３－テトラオキソー３－オキソ－５，８，１１，１４－テトラアザヘキサデカン－１６－オアート（Ｌ１３－２）の合成
ＤＭＦ（６０ｍＬ）中のＬ１３－１ａ（１０ｇ，３４．５７ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＨＯＢｔ（５．６１ｇ，４１．４８ｍｍｏｌ，１．２当量）、ＤＩＰＥＡ（２２．３４ｇ，１７２．８４ｍｍｏｌ，３０．１０ｍＬ，５当量）及びＥＤＣＩ（７．９５ｇ，４１．４８ｍｍｏｌ，１．２当量）を２０℃で加えた。混合物を２０℃で１５分間撹拌し、Ｌ１３－１（１１．０８ｇ，３２．８４ｍｍｏｌ，０．９５当量）を加え、反応混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視したところ、これは出発物質が残っていないことと所望の生成物の形成を示していた。混合物をＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）の飽和溶液と塩水（２０ｍＬ×３）でクエンチし、固体沈殿物を回収してＰＥ（２０ｍＬ×２）で洗浄し、減圧下で濃縮して、白色固体としてＬ１３－２（１３．５ｇ，２９．３８ｍｍｏｌ，収率８５．００％，純度９５％）を得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７１４分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２０Ｈ２８Ｎ４Ｏ７Ｎａ ４５９．２［Ｍ＋Ｎａ］＋，ｆｏｕｎｄ ４５９．１；ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ＝８．３１（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４３－７．２９（ｍ，５Ｈ），７．０４－６．９５（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｓ，２Ｈ），３．９０（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，４Ｈ），３．５８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ）。
工程２：ベンジル２－（２－（２－（２－アミノアセトアミド）アセトアミド）アセトアミド）アセタート塩酸塩（Ｌ１３－３）の合成
ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃ（４Ｍ，１４．８０ｍＬ，４当量）の溶液を、Ｌ１３－２（７ｇ，１４．８０ｍｍｏｌ，１当量、ＨＣｌ）に２０℃で滴下した。混合物を２０℃で１０分間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視したところ、これは出発物質が残っていないことと所望の生成物の形成を示していた。混合物を真空状態で濃縮し、凍結乾燥させてＬ１３－３（５．５ｇ，１０．３３ｍｍｏｌ，収率６９．７７％，純度７０％，ＨＣｌ）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．４７９分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ２１Ｎ４Ｏ５ ３３７．１［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ３３７．１；ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
工程３：（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－２－（（（Ｓ）－１６－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－１－フェニル－２－オキサ－５，８，１１，１４－テトラアザヘプタデカン－１７－イル）オキシ）－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリイルトリアセタート（Ｌ１３－４）の合成
ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のＬ１３－３ａ（２．９ｇ，４．４１ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＨＯＢｔ（７１５．０３ｇ，５．２９ｍｍｏｌ，１．２当量）、ＤＩＰＥＡ（３．４２ｇ，２６．４６ｍｍｏｌ，４．６１ｍＬ，６当量）及びＤＩＣ（６６７．８２ｇ，５．２９ｍｍｏｌ，８１９．４２μＬ，１．２当量）を２０℃で加えた。混合物を２０℃で１５分間撹拌し、Ｌ１３－３（３．２９ｇ，６．６１ｍｍｏｌ，１．５当量、ＨＣｌ）を加え、反応混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視したところ、これは出発物質が残っていないことと所望の生成物の形成を示していた。混合物を水（４０ｍＬ）でクエンチし、酢酸エチル（４０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を水及び塩水（３０ｍＬ×３）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して真空状態で濃縮した。その残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；４０ｇのＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）シリカフラッシュカラム、溶出０～５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で２５分間、総体積１．６Ｌで精製し、白色固体としてＬ１３－４（２．１ｇ，１．７２ｍｍｏｌ，収率３９．０４％，純度８０％）を得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．９３７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ５４Ｎ５Ｏ１８ ９７６．３［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ９７６．３；ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、２．０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）δ＝７．８３－７．７３（ｍ，２Ｈ），７．５９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４７－７．２８（ｍ，１０Ｈ），７．２１－７．０３（ｍ，２Ｈ），５．８７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２７－４．８９（ｍ，５Ｈ），４．６１－４．３８（ｍ，４Ｈ），４．２９－３．８１（ｍ，１３Ｈ），２．１０－１．９８（ｍ，１２Ｈ）。
工程４：（Ｓ）－１－（９Ｈ－フルオレン－９－イル）－３，６，９，１２，１５－ペンタオキソ－５－（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）－３，４，５－トリアセトキシ－６－（アセトキシメチル）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）メチル）－２－オキサ－４，７，１０，１３，１６－ペンタアザオクタデカン－１８－酸（Ｌ１３）の合成
ＥｔＯＡｃ（１６ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２ｍＬ）中のＬ１３－４（２．１ｇ，２．１５ｍｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｐｄ／Ｃ（３００ｍｇ，４３０．３５μｍｏｌ，１０．３５μＬ，純度１０％，０．２０当量）を２０℃で加え、混合物を２０℃、Ｈ２下で４時間撹拌した（４．３５ｍｇ，２．１５ｍｍｏｌ，１当量）（１５ｐｓｉ）。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視したところ、これは出発物質が残っていないことと所望の生成物の形成を示していた。混合物を濾過し、濾過ケーキをＭｅＯＨ（１０ｍＬ×３）で洗浄し、真空状態で濃縮してＬ１３（１．２ｇ，１．２９ｍｍｏｌ，収率５９．８１％，純度９５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７８８分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４０Ｈ４８Ｎ５Ｏ１８ ８８６．３［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ８８６．３；ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ＝７．８１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７３－７．６３（ｍ，２Ｈ），７．４４－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．２９（ｍ，２Ｈ），５．３１－５．１８（ｍ，１Ｈ），５．０３（ｔ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９４－４．８９（ｍ，２Ｈ），４．５１－４．２０（ｍ，５Ｈ），４．１６－４．０８（ｍ，１Ｈ），４．０６－３．７５（ｍ，１１Ｈ），２．０５－１．９８（ｍ，１２Ｈ）。
実施例５．ＧＬＰ１ペプチド模倣リンカーペイロードの合成
図２６は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１、ＬＰ２、ＬＰ３、ＬＰ４及びＬＰ５の合成を表す。
５．１（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［［４－（１２４－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），６８，７０（７３）－ヘキサエン－３３－ｙｎ－１２４－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］－２－エチル－７２－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＰ９（９．４６ｍｇ，１４．５６μｍｏｌ，１．５当量）の溶液に、Ｌ５（ｎ＝４，１５ｍｇ，９．７０μｍｏｌ，１当量）及びＤＩＰＥＡ（６．２７ｍｇ，４８．５２μｍｏｌ，８．４５μＬ，５当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応物の完全な消費及び所望の質量の形成を示した。混合物を濾過し、これを分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３０％～６０％，１１分）で精製し、ＬＰ１（４．８４ｍｇ，２．２３μｍｏｌ，収率２３．０２％，純度９６％）を得て、白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９４４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０５Ｈ１３５ＦＮ２０Ｏ２４ ２０７８．９９，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０４１．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋。Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
５．２ ３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（１３２－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），７６，７８（８１）－ヘキサエン－３３－イン－１３２－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］－２－エチル－８０－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２）の調製
Ｐ９（１８ｍｇ，２１．７９μｍｏｌ，２．２５当量）から出発し、実施例１に記載されているのと同一手順を使用し、所望のＬＰ２（３．４１ｍｇ，１．４１μｍｏｌ，収率１４．６３％、純度９４％）を白色固体として得た。ＬＰ２の水溶性を評価し、６０ｎＭ以上であると決定した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９４９分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１３Ｈ１５１ＦＮ２０Ｏ２８ ２２５５．１０，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １１２８．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝１５．２７３分、Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５μｍ １５０＊４．６ｍｍ，Ｃ１８，１１０Ａカラムを使用し、流量１．０ｍＬ／分で逆相ＨＰＬＣを実施し、０．１２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１２％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
５．３（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（１４０－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），８４，８６（８９）－ヘキサエン－３３－イン－１４０－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］－２－エチル－８８－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ３）の調製
Ｐ９（１４．５９ｍｇ，１４．５６μｍｏｌ，１．５当量）から出発し、実施例１に記載されているのと同一手順を使用し、所望の生成物ＬＰ３（４．６８ｍｇ，１．６８μｍｏｌ，収率１７．２７％、純度８７．１％）を白色固体として得た。
ＨＰＬＣ条件：ＲＴ＝１５．１２０分、Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５ｕ Ｃ１８ １１０Ａ １５０＊４．６ｍｍのカラムを使用し、流量１．０ｍＬ／分で逆相ＨＰＬＣを実施し、０．１％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
５．４（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（１６４－アザトリシクロヘキサデカ－８，１０（１６），１２（１８），１４（１０８），１５（１０９），１１０（１１３）－ヘキサエン－３３－ｙｎ－１６４－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］－２－エチル－１１２－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ４）の調製
Ｐ９（２０ｍｇ，１２．９４μｍｏｌ，１．０当量）から出発し、実施例１に記載されているのと同一手順を使用し、所望の生成物ＬＰ４（５．５８ｍｇ，１．７６μｍｏｌ，収率１３．５９％、純度９３．２９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９１２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１４５Ｈ２１５ＦＮ２０Ｏ４４ ２９６１．３６［Ｍ＋Ｈ］＋，９８７．５１４［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９８８．３［Ｍ＋３Ｈ］３＋。ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１４５Ｈ２１６ＦＮ２０Ｏ４４ ２９６０．５２６３ ［Ｍ＋Ｈ］＋，１４８０．７６３２ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，９８７．５０８８ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ２９６０．５３ ［Ｍ＋Ｈ］＋，１４８１．２６ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，９８７．８５１７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋。
５．５ ８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（（１－（（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イル）－３，１７－ジオキソ－２，７，１０，１３，１６－ペンタオキサ－４，１８－ジアザドコサン－２２－イル）ｏｘｙ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（ＬＰ５）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＰ９（１２ｍｇ，７．７６μｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｌ６（８．３０ｍｇ，１５．５３μｍｏｌ，２．０当量）及びＴＥＡ（１．５７ｍｇ，１５．５３μｍｏｌ，２．１６μＬ，２．０当量）を加えた。続いて、混合物を２０℃で１２時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応物の大部分が完全に消費され、所望のＭＳが検出されたことを示した。これを、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～５５％，４５分）で精製した。化合物ＬＰ５（４ｍｇ，２．００μｍｏｌ，収率２５．７５％、純度９７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝４．０８７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１３２ＦＮ１９Ｏ２４ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋９７１．５，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９７１．５［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：（ＥＳＩ）Ｒｔ＝１０．１２分、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍのカラムを使用し、流量１．５ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
図２７は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ６及びＬＰ７の合成を表す。
５．６（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［４－（１２８－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），６３，６５（６８）－ヘキサエン－３３－ｙｎ－１２８－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－６７－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ６）の調製
オーブンで乾燥させたバイアルに、Ｌ７（１６３．５４ｍｇ，３２３．４８μｍｏｌ，２．５当量）及びＰ９（２００ｍｇ，１２９．３９μｍｏｌ，１当量）を入れた。ＨＯＢｔのストック溶液（６９．９３ｍｇ，５１７．５６μｍｏｌ，４当量）、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（５０．１７ｍｇ，３８８．１７μｍｏｌ，３当量）及びＤＭＦ（１ｍＬ）中のＩ２（３９．４１ｍｇ，１５５．２７μｍｏｌ，１．２当量）をバイアルに加えた。反応混合物を１５℃で１２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳのトレースで監視した。混合物を濾過し、続いてＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加えることで沈殿させた。濾過後、保護された粗生成物Ｇ４Ｓ－Ｐ９（２６１ｍｇ，１１６．４５μｍｏｌ，収率９０．００％，純度９０％）を淡黄色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．２８３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１３６ＦＮ２３Ｏ２５ ２＋１００９．００５［Ｍ＋２Ｈ－Ｂｏｃ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １００９．５［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍ、流量０．８ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
オーブンで乾燥させたバイアルに、保護されたＧ４Ｓ－Ｐ９（２６１ｍｇ，１２９．３９μｍｏｌ，１当量）及びＤＣＭ（５ｍＬ）を入れた。ＴＦＡ（６．７０ｇ，５８．７５ｍｍｏｌ，４．３５ｍＬ，４５４．０８当量）をバイアルに入れた。反応混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。反応混合物を濃縮し、分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～７０％，３０分）で精製した。Ｇ４Ｓ－Ｐ９（２０６ｍｇ，９８．６１μｍｏｌ，収率７６．２１％、純度１００％，２ＴＦＡ）を白色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．４９７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１３６ＦＮ２３Ｏ２５ ２＋９３０．９４５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９３１．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍ、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
オーブンで乾燥させたバイアルに、ＤＩＢＡＣ－ｓｕｃ－ＯＳｕ（３９．６８ｍｇ，９８．６１μｍｏｌ，１当量）及びＧ４Ｓ－Ｐ９（２０６ｍｇ，９８．６１μｍｏｌ，１当量，２ＴＦＡ）を入れた。ＤＭＦ（２ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（３８．２３ｍｇ，２９５．８３μｍｏｌ，３当量）をバイアルに入れた。反応混合物を２０℃で１時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。反応物を濃縮し、分取ＨＰＬＣ（中性条件；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～５０％，３０分）で精製した。ＬＰ６（１１２ｍｇ，５２．１３μｍｏｌ，収率５２．８７％、純度１００％）を白色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．４１９分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０５Ｈ１３３ＦＮ２４Ｏ２５ ２＋１０７４．４９［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０７４．８［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３０＊２．０ｍｍ，３．５μｍ 移動相：Ａ）０．０５％ＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液；Ｂ）ＡＣＮ，勾配：０％のＢから５．８分以内に９５％のＢに増加；９５％のＢで１．１分間保持；続いて６．９１分で０％のＢに戻り、０．０９分間保持、流量１．０ｍＬ／分。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝３．５８分：ＨＰＬＣ条件：移動相：０．２ＭＬ／１ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、５分間の０％～６０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ－１８，５μｍ，２．１＊５０ｍｍを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトニトリル－ｄ３）δ ｐｐｍ８．４０（ｓ，１Ｈ）７．５２（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．８２Ｈｚ，２Ｈ）７．３５－７．４６（ｍ，３Ｈ）７．２７－７．３４（ｍ，２Ｈ）７．１９－７．２５（ｍ，１Ｈ）７．０５－７．１５（ｍ，４Ｈ）６．９５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝５．７５Ｈｚ，４Ｈ）６．８６－６．９１（ｍ，１Ｈ）６．７４－６．８２（ｍ，５Ｈ）６．７０（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．１３Ｈｚ，１Ｈ）４．９８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１４．５１Ｈｚ，１Ｈ）４．６１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）４．３８－４．４６（ｍ，２Ｈ）４．２９（ｂｒ ｓ，２Ｈ）４．１６－４．２１（ｍ，１Ｈ）４．０９－４．１２（ｍ，２Ｈ）３．８９－４．０１（ｍ，６Ｈ）３．７９－３．８８（ｍ，１０Ｈ）３．５７－３．７７（ｍ，７Ｈ）３．２８－３．３６（ｍ，３Ｈ）３．１６（ｂｒ ｓ，４Ｈ）３．０９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）２．８２－２．８９（ｍ，１Ｈ）２．７６（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．７５Ｈｚ，２Ｈ）２．６１－２．７０（ｍ，１Ｈ）２．３７－２．４８（ｍ，６Ｈ）２．１６（ｓ，６Ｈ）１．５３－１．８１（ｍ，８Ｈ）１．２８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝３．３８Ｈｚ，３Ｈ）１．１７－１．２２（ｍ，６Ｈ）１．１１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝６．００Ｈｚ，６Ｈ）０．９２（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，３Ｈ）。
５．７（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［２－［［２－［［２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［４－（１２８－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），６３，６５（６８）－ヘキサエン－３３－ｙｎ－１２８－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－６７－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ７）の調製
Ｌ８（５０ｍｇ，３２．３５μｍｏｌ，１当量）及びＰ９（３２．７１ｍｇ，６４．７０μｍｏｌ，２当量）、ＬＰ７（１５ｍｇ，６．７４μｍｏｌ，収率５３．２１％、純度９６．４７％）を、実施例６に記載されているのと同一手順を使用して白色固体としてこれを得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０５Ｈ１３３ＦＮ２４Ｏ２５，１０７５．５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０７４．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝３．５５分；移動相：移動相：０．５ＭＬ／１ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、５分間の０％～６０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で２分間保持。
図２８は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ８、ＬＰ９、ＬＰ１０及びＬＰ１１の合成を表す。
５．８（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［［４－（２－アザトリシクロ［１０．４．０．０４，９］ヘキサデカ－１（１２），４（９），５，７，１３，１５－ヘキサエン－１０－イン－２－イル）－４－オキソブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ８）の調製
Ｈ２Ｏ（０．２５ｍＬ）及びｔ－ＢｕＯＨ（０．５ｍＬ）中のＰ８（２０ｍｇ，１２．７３μｍｏｌ，１当量）及びＬ９（８．８３ｍｇ，３８．１８μｍｏｌ，３．０当量）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（６３５．４５μｇ，２．５５μｍｏｌ，０．２当量）及びナトリウム（２Ｒ）－２－［（１Ｓ）－１，２－ジヒドロキシエチル］－４－ヒドロキシ－５－オキソ－２Ｈ－フラン－３－オラート（１．０１ｍｇ，５．０９μｍｏｌ，０．４当量）を加えた。混合物を２０℃で１．５時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、物質が消失し、主生成物として所望の生成物が観察されたことを示した。緑色の溶液を濾過し、粗生成物を得た。粗生成物を、逆相ＨＰＬＣ（ＩＳＣＯ（登録商標），２０ｇ Ｃ１８（登録商標）シリカフラッシュカラム，０～６０．１％のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（０．４％ＡｃＯＨ）勾配（１８ｍＬ／分）の溶出）で精製した。所望の流体をフリーズドライヤーで凍結乾燥して化合物６１（１５ｍｇ，８．２４μｍｏｌ，収率６４．７８％，純度９９．０９０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７６４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ２３Ｈ４３Ｎ１１Ｏ６ ９０１．９５，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９０２．３［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍカラム、流量１．２ｍＬ／分で、０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）で溶出。
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の６１（１７ｍｇ，９．４３μｍｏｌ，１当量）とＤＩＢＡＣ－ｓｕｃ－ＯＳｕ）（５．０５ｍｇ，１２．５５μｍｏｌ，１．３３当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２．４４ｍｇ，１８．８６μｍｏｌ，３．２８μＬ，２．０当量）を加えた。溶液を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換され、所望の生成物が観察されたことを示した。溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣ（中性条件：カラム：Ｄｕｒａｓｈｅｌｌ Ｃ１８（Ｌ）１００＊１０ｍｍ＊５μｍ，移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１２％～５２％，１２分）で精製した。所望の流体をフリーズドライヤーで凍結乾燥してＬＰ８（７．０ｍｇ，３．２１μｍｏｌ，収率３０．４２％，純度９５．７４５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．３３７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０５Ｈ１３５ＦＮ２２Ｏ２３［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０４５．５０，ｆｏｕｎｄ １０４６．１。ＬＣＭＳ条件：０．８ｍＬ／４ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１ｍＬ／分で２分間の１０％～８０％勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間保持、カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ２．１＊３０ｍｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝２．８６８分；移動相：０．２ｍＬ／１ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ Ｃ１８，５μｍ，２．１＊５０ｍｍを使用。
５．９（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［［（１Ｓ，８Ｒ）－９－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－インイル］メトキシカルボニルアミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ９）の調製
ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の化合物６１（１４．５５ｍｇ，８．０７μｍｏｌ，１当量）の溶液に、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カルボナート（ＢＣＮ－ＣＯ－ＰＮＰ）（５．８１ｍｇ，１８．４１μｍｏｌ，２．２８当量）及びＤＩＰＥＡ（２．０９ｍｇ，１６．１４μｍｏｌ，２．８１μＬ，２．０当量）を加えた。この溶液を分取ＨＰＬＣ（ＦＡ条件）（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～５５％，４５分）で精製し、ＬＰ９（３．６ｍｇ，１．７９μｍｏｌ，収率２２．２１％，純度９８．５４％）を得て、白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．０４０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９７Ｈ１３４ＦＮ２１Ｏ２３［Ｍ＋２Ｈ］２＋９８９．８９，ｆｏｕｎｄ ９９０．６。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍ；
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．８９分，移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
５．１０（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［（２－シクロオクト－２－ｙｎ－１－イルオキシアセチル）アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１０）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の６１（１４ｍｇ，７．７６μｍｏｌ，１当量）の溶液に、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル２－（シクロオクト－２－イル－１－イルオキシ）アセタート（５．１８ｍｇ，１８．５３μｍｏｌ，２．３９当量）及びＤＩＰＥＡ（２．０１ｍｇ，１５．５３μｍｏｌ，２．７０μＬ，２．０当量）を加えた。溶液を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換され、所望の生成物が観察されたことを示した。混合物をＣＨ３ＣＮで希釈し、粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（ＦＡ条件：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５％～５５％，３５分）で精製した。所望の流体をフリーズドライヤーで凍結乾燥してＬＰ１０（２．６ｍｇ，１．２６μｍｏｌ，収率１３．０８％，純度９５．２６％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．８０５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９６Ｈ１３４ＦＮ２１Ｏ２３［Ｍ＋２Ｈ］２＋９８３．９９，ｆｏｕｎｄ ９８４．７。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍ。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．７４分，移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ），流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用；ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．８９分，移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ），流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
５．１１（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１１）の調製
ｔ－ＢｕＯＨ（０．８ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．４ｍＬ）中のＰ８（１０ｍｇ，６．３６μｍｏｌ，１当量）と、アスコルビン酸ナトリウム（５０４．１８μｇ，２．５４μｍｏｌ，０．４当量）と、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（３１７．７２μｇ，１．２７μｍｏｌ，０．２当量）との混合物を２０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、Ｐ８が完全に消費されたことを示した。反応物を濾過して残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｎｉｍｉ ＮＸ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％、２５分）で精製し、ＬＰ１１（４．３２ｍｇ，２．１８μｍｏｌ，収率３４．３１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．１２１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９４Ｈ１３８ＦＮ２１Ｏ２５ ９９０．０１［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９９０．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋；移動相：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持を使用。
ＨＰＬＣ（ＥＳ８５８４－１１２０－Ｐ１Ｃ１）を取り付けた。ＲＴ＝３．７５分，純度９９．７２％。ＨＰＬＣ方法：カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、７分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持。
図２９は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１２の合成を表す。
５．１２（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（１６２－アザトリシクロヘキサデカ－６（１２），７（１３），８（１４），１０（１６），１０９，１１１（１１４）－ヘキサエン－３１－ｙｎ－１６２－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］－２－エチル－１１３－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［６－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）ヘキサノイルアミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１２）の調製
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＰ１１（３０ｍｇ，１４．６５μｍｏｌ，１当量，ＴＦＡ）及びＬ１１（２２．４３ｍｇ，１４．６５μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（９．４７ｍｇ，７３．２５μｍｏｌ，１２．７６μＬ，５当量）を１５℃で加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。混合物を濾過して粗生成物を黄色油として得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～８０％、３０分）で精製し、ＬＰ１２（２５ｍｇ，８．１８μｍｏｌ，収率４７．７２％、純度９５．４９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９７０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１４４Ｈ２１７ＦＮ１９Ｏ４３ ９７３．１８ ｍ／ｚ［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９７４．０［Ｍ＋３Ｈ］３＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝２．５３；移動相：０．２ＭＬ／１ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ－１８，５μｍ，２．１＊５０ｍｍを使用。
図３０は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１３及びＬＰ１４の合成を表す。
５．１３（３Ｓ）－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［（３－アミノ－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル）アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（１５７－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），１０４，１０６（１０９）－ヘキサエン－３１－ｙｎ－１５７－イル）－４－オキソブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］－２－エチル－１０８－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１３）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＰ４（１０ｍｇ，６．８９μｍｏｌ，１当量）及びＬ１２（１０．５５ｍｇ，６．８９μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（４．４５ｍｇ，３４．４４μｍｏｌ，６．００μＬ，５当量）を１５℃で加えた。混合物を１５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換されたことを示した。混合物を濾過して粗生成物を黄色油として得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊３０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１０％～５０％、５５分）で精製し、ＬＰ１３（１１ｍｇ，３．８４μｍｏｌ，収率３６．６７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９６５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１４０Ｈ２１３ＦＮ１８Ｏ４４ ７１７．３８［Ｍ＋４Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ７１７．８［Ｍ＋４Ｈ］４＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝３．９７；移動相：０．２ＭＬ／１ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、５分間の０％～６０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ－１８，５μｍ，２．１＊５０ｍｍ 波長：２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍを使用。
５．１４（３Ｓ）－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［（３－アミノ－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル）アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［４－（１２１－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），５９，６１（６４）－ヘキサエン－３１－ｙｎ－１２１－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－６３－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１４）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＰ４（４０ｍｇ，２７．５６μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＨＯＢｔ（１４．８９ｍｇ，１１０．２２μｍｏｌ，４当量）、ＤＩＰＥＡ（１０．６８ｍｇ，８２．６７μｍｏｌ，１４．４０μＬ，３当量）及びＬ７（３４．８３ｍｇ，６８．８９μｍｏｌ，２．５当量）を加え、続いてＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＩ２（８．３９ｍｇ，３３．０７μｍｏｌ，６．６６μＬ，１．２当量）を加えた。続いて、反応混合物を２０℃で１６時間撹拌した。反応物にＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）を加え、白色固体を沈殿させた。混合物を３分間遠心分離にかけ（５０００Ｒ）、固体を得た。続いて、この固体をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）及びＣＡＮ（２ｍＬ）中に溶解した。溶液を凍結乾燥して粗保護化合物６２（５９ｍｇ，２３．０１μｍｏｌ，収率８３．５０％，純度７５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．８８２分、ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９０Ｈ１３０ＦＮ２１Ｏ２５，１９２３．９４ ９６１．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９６２．５ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、３分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ 波長：ＵＶ２２０ｎｍ；カラム温度５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中の保護化合物６２（５９ｍｇ，３０．６８μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）を０℃で加えた。続いて、混合物を２０℃に加温し、２０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応物が完全に消費され、所望のＭＳが検出されたことを示した。溶媒を３０℃、減圧下で除去して粗生成物を得た。残渣を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ Ｃ１８ ７５＊３０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％，３５分）で精製し、化合物６２（１１ｍｇ，５．９１μｍｏｌ，収率１９．２８％，純度９５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．９３６分、ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８１Ｈ１１４ＦＮ２１Ｏ２３，１７６７．８２ ８８４．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ８８４．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋；移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、ＥＳＩ源、正イオンモード；波長：２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ、オーブン温度５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝６．０５分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度を使用。
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物６２（１１ｍｇ，６．２３μｍｏｌ，１当量）とＤＩＢＡＣ－ｓｕｃ－ＯＳｕ）（２．７６ｍｇ，６．８５μｍｏｌ，１．１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（４．０２ｍｇ，３１．１３μｍｏｌ，５．４２μＬ，５．０当量）を２０℃で加えた。続いて、混合物を２０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応物が完全に消費され、所望のＭＳが検出されたことを示した。これを、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ Ｃ１８ ７５＊３０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％，３５分）で精製した。ＬＰ１４（１０ｍｇ，４．６２μｍｏｌ，収率７４．２８％、純度９５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９３９分、ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１００Ｈ１２７ＦＮ２２Ｏ２５，２０５４．９２，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０２８．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ｍＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍ 波長：ＵＶ２２０ｎｍ；カラム温度５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝３．７５分 移動相：水（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、５分間の０％～６０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ－１８，５μｍ，２．１＊５０ｍｍ 波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ、カラム温度：４０℃を使用した。
図３１は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１５及びＬＰ１６の合成を表す。
５．１５（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［４－（１３４－アザトリシクロヘキサデカ－１１（１９），１２（２０），１３（２１），１５（２３），６９，７１（７４）－ヘキサエン－３８－イン－１３４－イル）－４－オキソブタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－７３－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－４－（３，５－ジメチルフェニル）－１－（フェニルカルバモイル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチルプロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１５）の調製
オーブンで乾燥させたバイアルに、Ｌ７（４７．３３ｍｇ，９３．６２μｍｏｌ，２．５当量）及びＰ２３（６５ｍｇ，３７．４５μｍｏｌ，１当量，ＴＦＡ）を入れた。ＨＯＢｔのストック溶液（２０．２４ｍｇ，１４９．７８μｍｏｌ，４当量）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（１４．５２ｍｇ，１１２．３４μｍｏｌ，１９．５７μＬ，３当量）及びＤＭＦ（２ｍＬ）中のＩ２（１１．４０ｍｇ，４４．９４μｍｏｌ，９．０５μＬ，１．２当量）をバイアルに加えた。反応混合物を２０℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。反応物をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）に加え、白色固体を沈殿させた。混合物を３分間遠心分離にかけ（５０００Ｒ）、粗生成物６３（６０ｍｇ，２７．８２μｍｏｌ，収率７４．２９％及び純度９７．０６％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９４０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９６Ｈ１３２ＦＮ２３Ｏ２３ ９９７ｍ／ｚ［Ｍ－Ｂｏｃ＋３Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９９７．５ｍ／ｚ［Ｍ－Ｂｏｃ＋３Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＴＦＡ（１ｍＬ）及びＤＣＭ（１ｍＬ）中の６３（６０ｍｇ，２８．６６μｍｏｌ，１当量）の溶液を、２０℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。反応物を真空状態で濃縮し、黄色油として粗生成物を得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％，３０分）で精製し、６４（４５ｍｇ，２２．７２μｍｏｌ，収率７９．２７％，純度９７．８１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８９０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９２Ｈ１２４ＦＮ２３Ｏ２３ ９６８．９６ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９６９．５ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ（ＥＳ８５８４－７１９－Ｐ１Ｃ１）を取り付けた。ＲＴ＝４．１８分，純度９７．８１％。ＨＰＬＣ方法Ａ：移動相：１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）を１分；続いて５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）を５分；１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）で２分間保持；８．０１分で１．０％のＣＡＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）に戻し、２分間保持。流量：１．２ｍｌ／分。
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の６４（４０ｍｇ，１９．５０μｍｏｌ，１当量，ＴＦＡ）とＤＩＢＡＣ－ｓｕｃ－ＯＳｕ（７．８５ｍｇ，１９．５０μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１２．６０ｍｇ，９７．５１μｍｏｌ，１６．９８μＬ，５当量）を１８℃で加えた。反応物を１８℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完了したことを示した。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～５０％，３５分）で精製し、ＬＰ１５（２７ｍｇ，１２．０７μｍｏｌ，収率５５．７５％，純度９９．４２％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９４８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１１Ｈ１３７ＦＮ２４Ｏ２５ １１１２．５１ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １１１３．１ ｍ／ｚ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：逆相０．２ＭＬ／１ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ＭＬ／分で、５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ－１８、５μｍ、２．１＊５０ｍｍ 波長：２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ、カラム温度：４０℃を使用した。
５．１６（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［２－［［２－［［２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［４－（１３４－アザトリシクロヘキサデカ－１１（１９），１２（２０），１３（２１），１５（２３），６９，７１（７４）－ヘキサエン－３８－イン－１３４－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－７３－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－４－（３，５－ジメチルフェニル）－１－（フェニルカルバモイル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１６）の調製
Ｐ２３（７０ｍｇ，４３．１６μｍｏｌ，１当量）、Ｌ８（４３．６４ｍｇ，８６．３２μｍｏｌ，２当量）及びＤＩＢＡＣ－ｓｕｃ－ＯＳｕ（３．９２ｍｇ，９．７５μｍｏｌ，１当量）、ＬＰ１６（１０ｍｇ，４．２５μｍｏｌ，収率３４．８７％、純度９４．５３％）を、実施例１５に記載されているのと同一手順を使用して白色固体として調製した。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８４５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１１Ｈ１３７ＦＮ２４Ｏ２５ １１１２．５１［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １１１２．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋；移動相：０．８ｍＬ／４ＬのＮＨ３・Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１ｍｌ／分で、２分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間保持を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝３．７３分、純度９４．５３％。移動相：２．０ＭＬ／４ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアエトニトリル（Ａｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、４分間の０％～６０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で２分間保持。
図３２は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１７の合成を表す。
５．１７（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［４－（１４４－アザトリシクロヘキサデカ－８（１４），９（１５），１０（１６），１２（１８），６８，７０（７３）－ヘキサエン－３３－イン－１４４－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－７２－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１７）の調製
オーブンで乾燥させたバイアルに、Ｌ７（２６．１７ｍｇ，５１．７６μｍｏｌ，２当量）、Ｐ９（４０．００ｍｇ，２５．８８μｍｏｌ，１当量）及び４Ａ ＭＳ（５ｍｇ）を入れた。ＨＯＢｔのストック溶液（６．９９ｍｇ，５１．７６μｍｏｌ，２当量）、ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（５．０２ｍｇ，３８．８２μｍｏｌ，６．７６μＬ，１．５当量）及びＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＩ２（３．９４ｍｇ，１５．５３μｍｏｌ，３．１３μＬ，０．６当量）をバイアルに加えた。反応混合物を１５℃で４８時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物を濾過し、続いてＥｔＯＡｃ（３ｍＬ）を加えることで沈殿させた。濾過後、保護されたＧ４Ｓ－Ｐ９（５０ｍｇ，２２．３１μｍｏｌ，収率８６．２０％，純度９０％）を白色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９０７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１３６ＦＮ２３Ｏ２５ ２＋１００９．００５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０１０．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．８７分。ＨＰＬＣ条件：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で、０．１２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
オーブンで乾燥させたバイアルに、Ｇ４Ｓ－Ｐ９（３５ｍｇ，１７．３５μｍｏｌ，１当量）及びＤＣＭ（１ｍＬ）を入れた。ＴＦＡ（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ，１ｍＬ，７７８．４２当量）をバイアルに入れた。反応混合物を２０℃で３時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８３２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１３６ＦＮ２３Ｏ２５ ２＋９３０．９４５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９３１．３［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。反応混合物を濃縮し、黄色固体として粗生成物６７（３５ｍｇ，粗）を得た。
オーブンで乾燥させたバイアルに、Ｌ７（１９．０２ｍｇ，３７．６１μｍｏｌ，２当量）及び化合物６７（３５ｍｇ，１８．８１μｍｏｌ，１当量）を入れた。ＨＯＢｔのストック溶液（１０．１６ｍｇ，７５．２３μｍｏｌ，４当量）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（７．２９ｍｇ，５６．４２μｍｏｌ，９．８３μＬ，３当量）及びＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＩ２（５．７３ｍｇ，２２．５７μｍｏｌ，４．５５μＬ，１．２当量）をバイアルに加えた。反応混合物を１５℃で２４時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。混合物を濾過し、続いてＥｔＯＡｃ（６ｍＬ）を加えることで沈殿させた。濾過後、保護された粗生成物Ｇ４Ｓ－Ｇ４Ｓ－Ｐ９（４０ｍｇ，１３．３８μｍｏｌ，収率７１．１２％，純度７８％）を淡黄色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．４００分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０６Ｈ１５３ＦＮ２８Ｏ３１ ２＋１１６６．５６，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １１６６．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量０．８ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．１０分。ＨＰＬＣ条件：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で、０．１２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
オーブンで乾燥させたバイアルに、Ｇ４Ｓ－Ｇ４Ｓ－Ｐ９（４０ｍｇ，１７．１５μｍｏｌ，１当量）及びＤＣＭ（２ｍＬ）を入れた。ＴＦＡ（３．０８ｇ，２７．０１ｍｍｏｌ，２ｍＬ）をバイアルに入れた。反応混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。反応物を濃縮して残渣を得た。続いて、分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊３０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％，１６分）で精製した。化合物６８（１５ｍｇ，６．６２μｍｏｌ，収率３８．５８％、純度９６％）を白色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７４４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９７Ｈ１３７ＦＮ２８Ｏ２９ ２＋１０８８．５０５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０８９．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
ＨＰＬＣ ＲＴ＝３．８９分。ＨＰＬＣ条件：移動相：１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）を１分；続いて５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）を５分；１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）で２分間保持；８．０１分で１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）に戻し、２分間保持。流量：１．２ｍｌ／分。
ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＤＩＢＡＣ－ｓｕｃ－ＯＳｕ（３．３７ｍｇ，８．３６μｍｏｌ，１．３当量）の溶液に、化合物６８（１４ｍｇ，６．４３μｍｏｌ，１当量）及びＤＩＰＥＡ（４．１６ｍｇ，３２．１７μｍｏｌ，５．６０μＬ，５当量）を加えた。混合物を２０℃で２時間撹拌した。反応の進行をＬＣ－ＭＳで監視した。反応混合物をＤＭＳＯ（２ｍＬ）で希釈し、分取ＨＰＬＣ（中性条件；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｃ１８ １５０＊４０ｍｍ＊１０μｍ；移動相：［水（１０ｍＭＢＨＡ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％，５５分）で精製した。ＬＰ１７（１。７３ｍｇ，０．６５μｍｏｌ，収率１０．１５％、純度９３％）を白色の泡として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．５３１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１６Ｈ１５０ＦＮ２９Ｏ３１ ２＋１２３２．０５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １２３２．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣＭＳ条件：移動相：Ａ）０．０５％ ＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液；Ｂ）ＡＣＮ。勾配：０％のＢから５．８分以内に９５％のＢに増加；１．１分間９５％のＢで保持；続いて６．９１分で０％のＢに戻り、０．０９分間保持、流量１．０ｍＬ／分；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３０＊２．０ｍｍ，３．５μｍ。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝２．１７分：ＨＰＬＣ条件：移動相：０．２ＭＬ／１ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１．２ｍｌ／分で、５分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で２分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ－１８，５μｍ，２．１＊５０ｍｍ；
図３３は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１８及びＬＰ２０の合成を表す。
５．１８（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［２－［［２－［［２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［３－［［（１Ｓ，８Ｒ）－９－ビシクロ［６．１．０］ノン－４－インイル］メトキシカルボニルアミノ］プロパノイルアミノ］－３－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－３，４，５－トリヒドロキシ－６－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロピラン－２－イル］オキシプロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アスミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１８）の調製
ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＬ１３（２２．９２ｍｇ，２５．８８μｍｏｌ，２当量）、ＰｙＢＯＰ（１３．４７ｍｇ，２５．８８μｍｏｌ，２当量）及びＤＩＰＥＡ（６．６９ｍｇ，５１．７６μｍｏｌ，９．０１μＬ，４当量）の溶液を、２５℃で５分間撹拌した。ＤＭＦ（０．１ｍＬ）中のＰ９（２０ｍｇ，１２．９４μｍｏｌ，１当量）の溶液を混合物に加え、反応物を２５℃で５分間撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）で希釈して沈殿を得た。これを３分間（５０００Ｒ）遠心分離にかけ、白色固体として粗生成物を得た。残渣を水（２ｍＬ）及びＡＣＮ（２ｍＬ）で希釈した。溶液を凍結乾燥によって乾燥させ、化合物６９（２５ｍｇ，８．５３μｍｏｌ，収率６５．９５％，純度８２．３８４％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．３７６分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１５Ｈ１４８ＦＮ２３Ｏ３４ １２０７．０３［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １２０７．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋；移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、３分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持を使用。
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物６９（２０ｍｇ，８．２９μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（４８８．０４μｇ，８．２９μｍｏｌ，０．２ｍＬ，純度８５％，１当量）を２５℃で加えた。反応物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換したことを示した。混合物を濾過して残渣を得た。これを分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％，３０分）で精製し、化合物７０（１５ｍｇ，７．３８μｍｏｌ，収率７１．２８％，純度９９．５８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．７９１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９２Ｈ１３０ＦＮ２３Ｏ２８，１０１１．９７［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０１２．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｍｅｒｃｋ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝３．４７分。移動相：１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）を１分；続いて５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）を５分；１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）で２分間保持；８．０１分で１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）に戻し、２分間保持。流量：１．２ｍｌ／分。
ＰＢＳ緩衝液（０．４５ｍＬ，ｐＨ＝８．２）及びＤＭＦ（０．９ｍＬ）中の化合物７０（１８ｍｇ，８．９０μｍｏｌ，１当量）及びＬ１４（６．８８ｍｇ，１７．７９μｍｏｌ，２当量）の溶液を、２５℃で６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。反応物を濾過して残渣を得た。残渣を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～６０％，３５分）で精製し、ＬＰ１８（７．５ｍｇ，３．２４μｍｏｌ，収率３６．４５％，純度９８．１８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．５９５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０６Ｈ１４７ＦＮ２４Ｏ３１ １１３５．５３［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １１３６．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋；移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、２分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間保持；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２．１－３０ｍｍを使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．１７分、純度９８．１８％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ１５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
５．１９（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［［２－［［２－［［２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［４－（１５３－アザトリシクロヘキサデカ－８（１８），１０（２０），１２（２２），１５（２５），７７（７９），８１（８５）－ヘキサエン－４２（４４）－ｙｎ－１５３－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］－３－［６－［［４－（１５３－アザトリシクロヘキサデカ－８（１８），１０（２０），１２（２２），１５（２５），７７（７９），８１（８５）－ヘキサエン－４２（４４）－ｙｎ－１５３－イル）－４－オキソ－ブタノイル］オキシメチル］－３，４，５－トリヒドロキシテトラヒドロピラン－２－イル］オキシ－プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－８４－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソプロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２０）の調製
７０（７．９０ｍｇ，１８．５４μｍｏｌ，２．５当量）の溶液に、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（４．７９ｍｇ，３７．０７μｍｏｌ，６．４６μＬ，５当量）を２５℃で加えた。反応物を２５℃で１６時間撹拌した。続いてＨ２Ｏ（２．５ｍＬ）を加え、これを２５℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。反応物を濾過し、黄色溶液として残渣を得た。残渣を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０４％ＮＨ３Ｈ２Ｏ＋１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１７％～４７％，８分）で精製し、ＬＰ２０（３．７ｍｇ，１．５２μｍｏｌ，収率２０．８２％，純度９５．０９３％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝１．３２８分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１１Ｈ１４３ＦＮ２４Ｏ３０ １１５５．５２［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １１５６．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋；移動相：０．８ｍＬ／４ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１ｍｌ／分で、２分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．４８分間保持；カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ２．１＊３０ｍｍ；波長：ＵＶ ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃を使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝１．３２８分、純度９２．３１％。ＨＰＬＣ方法Ａ：移動相：０．８ｍＬ／４ＬのＮＨ３Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）及びアセトニトリル（溶媒Ｂ）、流量１ｍｌ／分で、５分間の０％～６０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で０．４８分間保持、カラム：Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８ ５μｍ ２．１＊５０ｍｍ 波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍを使用。
図３４は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ１９の合成を表す。
５．２０（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［４－［４－［［（２Ｒ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［（２－シクロオクト－２－イン－１－イルオキシアセチル）アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシプロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ１９）の調製
ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＰ９（２５ｍｇ，１６．１７μｍｏｌ，１当量）と、Ｌ１５（１６．３５ｍｇ，３２．３５μｍｏｌ，２．０当量）と、ＨＯＢｔ（４．３７ｍｇ，３２．３５μｍｏｌ，２．０当量）と、ＤＩＰＥＡ（３．１４ｍｇ，２４．２６μｍｏｌ，４．２３μＬ，１．５当量）の無色の溶液に、ＤＭＦ（０．２５ｍＬ）中のＩ２（２．８７ｍｇ，１１．３２μｍｏｌ，２．２８μＬ，０．７当量）の溶液を加えた。溶液を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完全に変換され、所望の生成物が観察されたことを示した。溶液をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）で処理し、形成された沈殿物を５分間遠心分離にかけることで回収した（５０００Ｒ）。回収された白色固体をフリーズドライヤーで凍結乾燥して化合物７１（４５ｍｇ，２１．１１μｍｏｌ，収率９３．２５％，純度９４．６５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８８０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９５Ｈ１２６ＦＮ２３Ｏ２３ ［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］２＋９５８．９７，ｆｏｕｎｄ ９５９．０。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍカラム、流量１．２ｍＬ／分で、０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）で溶出。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝４．４３分。移動相：１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）を１分；続いて５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）を５分；１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）で２分間保持；８．０１分で１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）に戻し、２分間保持。流量：１．２ｍｌ／分。
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の７１（３５ｍｇ，１７．３５μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＴＦＡ（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ，１ｍＬ，７７８．４２当量）を加えた。溶液を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完全に変換され、所望の生成物が観察されたことを示した。溶液を真空状態で濃縮し、残渣を得た。残渣を逆相ＨＰＬＣ（０．４％ＡｃＯＨ）（２０ｇのカラム、０～４４％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ溶出、勾配（２５ｍＬ／分））により精製した。所望の流体をフリーズドライヤーで凍結乾燥して７２（１８ｍｇ，８．９１μｍｏｌ，収率５１．３５％，純度９２．１０８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８１５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８６Ｈ１２０ＦＮ２３Ｏ２３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋９３０．９４，ｆｏｕｎｄ ９３１．２。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍカラム、流量１．２ｍＬ／分で、０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）で溶出。
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の７２（１７ｍｇ，９．１３μｍｏｌ，１当量）とＬ１６（５．１０ｍｇ，１８．２７μｍｏｌ，２．０当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２．３６ｍｇ，１８．２７μｍｏｌ，３．１８μＬ，２．０当量）を加えた。溶液を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完全に変換され、所望の生成物が観察されたことを示した。溶液を分取ＨＰＬＣ（ＦＡ条件：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～５０％，３５分）で精製した。所望の流体をフリーズドライヤーで凍結乾燥してＬＰ１９（８．３６ｍｇ，４．１２μｍｏｌ，収率３６．３４％，純度９９．７２％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．３７９分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９６Ｈ１３２ＦＮ２３Ｏ２５ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０１２．９８，ｆｏｕｎｄ １０１３．７。ＬＣＭＳ条件：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍ；
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．７０分，移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
図３５は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２１の合成を表す。
５．２１（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（１６３－アザトリシクロヘキサデカ－７（１３），８（１４），９（１５），１１（１７），１０８，１１０（１１３）－ヘキサエン－３３－ｙｎ－１６３－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］フェニル］－１－カルバモイル－ブチル］アミノ］－１－［［４－（２－エチル－４－メトキシ－フェニル）フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｒ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２１）の調製
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＰ２４（１５ｍｇ，９．６９μｍｏｌ，１当量）及びＬ１７（２２．２５ｍｇ，１４．５４μｍｏｌ，１．５当量）の混合物に、ＤＩＰＥＡ（６．２６ｍｇ，４８．４６μｍｏｌ，８．４４μＬ，５当量）を２５℃、窒素下で一度に加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌した。ＬＣＭＳのトレースは、反応が完全に変換されたことを示した。反応混合物を真空状態で濃縮し、残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～５０％，５５分）で精製し、純粋な生成物を得た。生成物を水（１０ｍＬ）中に懸濁し、混合物をドライアイス／エタノール浴で凍結させ、続いて凍結乾燥で乾燥させて所望の生成物ＬＰ２１（８．２ｍｇ，２．７０μｍｏｌ，収率２７．８６％，純度９７．５７９８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．９２４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１４４Ｈ２１３ＦＮ２０Ｏ４５ ２９６１．５０［Ｍ＋Ｈ］＋，９８７．１６７［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ ９８８．８［Ｍ＋３Ｈ］３＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ条件：ＲＴ＝１４．４９６分、Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５ｕ Ｃ１８ １１０Ａ １５０＊４．６ｍｍのカラムを使用し、流量１．０ｍＬ／分で逆相ＨＰＬＣを実施し、０．１％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
図３６は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２２の合成を表す。
５．２２（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－［２０２－［［１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１３６，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１，１４２－ｄｏｄｅｃａヒドロキシ－１２６，１２７，１２８，１２９，１３０－ペンタキス（ヒドロキシメチル）－２４０，２４１，２４２，２４３，２４４，２４５，２４６，２４７，２４８，２４９，２５０，２５１－ドデカオキサヘプタシクロドテトラコンタン－１２５－イル］メチル］－１８７，１８９，２０２，２０３－テトラザテトラシクロノナデカ－８（１４），１０（１６），１１（１７），１２（１８），１１２（１１４），１１５（１１７），１２３，１８７（１８９）－オクタエン－２０３－イル］－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］－２－エチル－１１６－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｒ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２２）の調製
ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中の化合物ＬＰ４（５ｍｇ，１．６９μｍｏｌ，１当量）の混合物に、化合物Ｌ１８（シクロデキストリン－Ｎ３，４．３８ｍｇ，４．３９μｍｏｌ，２．６当量）を２５℃、Ｎ２下で一度に加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。ＬＣＭＳ及びＨＰＬＣのトレースは、反応が完了したことを示した。残渣を、分取ＨＰＬＣ（中性：カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ １５０＊２５ ５ｕ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～５０％，７分）で精製し、ＬＰ２２（１．６６ｍｇ，４．０３ｅ－１μｍｏｌ，収率２３．８８％，純度９６．１４９％）を白色固体として得た。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝１１．９７６分、Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ５ｕ Ｃ１８ １１０Ａ １５０＊４．６ｍｍのカラムを使用し、流量１．０ｍＬ／分で逆相ＨＰＬＣを実施し、０．１％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８７７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７４Ｈ１２０Ｎ３Ｏ３０ ３９５６．８４［Ｍ＋Ｈ］＋，１３１８．９５［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｆｏｕｎｄ １３２０．２［Ｍ＋３Ｈ］３＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
図３７は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２３の合成を表す。
５．２３（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－［４－［４－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－［２０１－［［１３０，１３１，１３２，１３３，１３４，１３５，１３６，１３７，１３８，１３９，１４０，１４１－ドデカヒドロキシ－１２５，１２６，１２７，１２８，１２９－ペンタキス（ヒドロキシメチル）－２３９，２４０，２４１，２４２，２４３，２４４，２４５，２４６，２４７，２４８，２４９，２５０－ドデカオキサヘプタシクロドテトラコンタン－１２４－イル］メチル］－１８６，１８８，２０１，２０２－テトラザテトラシクロノナデカ－７（１３），９（１５），１０（１６），１１（１７），１１２（１１４），１１５（１１７），１２２，１８６（１８８）－オクタエン－２０２－イル］－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ブトキシ］フェニル］ブチル］アミノ］－１－［［４－（２－エチル－４－メトキシ－フェニル）フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２３）の調製
ＬＰ２１（９．３ｍｇ，３．１０μｍｏｌ，１当量）及びＬ１８（シクロデキストリン－Ｎ３，３．７ｍｇ，３．７μｍｏｌ，１．２当量）、ＬＰ２３（３．５ｍｇ，８．８４ｅ－１μｍｏｌ，収率５０．００％、純度１００％）を、実施例２２と同一手順に従って、白色固体として得た。
ＨＰＬＣ条件：ＲＴ＝８．１４分、ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＨＰＬＣを実施し、０．１％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．１％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝０．８６８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７５Ｈ１０２ＦＮ１８Ｏ１７ ３９５８．８２［Ｍ＋Ｈ］＋，１３１９．６１［Ｍ＋Ｈ］３＋，ｆｏｕｎｄ １３２１．５［Ｍ＋Ｈ］３＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－１８ｅ ２５－３ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で逆相ＬＣ－ＭＳを実施し、０．０４％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０６％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
図３８は、本開示に従ったリンカーペイロードＬＰ２４の合成を表す。
５．２４（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［２－エチル－４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［［（６８Ｓ，６９Ｒ，７１Ｓ）－１０６，１０７，１０８－トリアザトリシクロドデカ－７２（１０７），１０６（１０８）－ジエン－７１－イル］メトキシカルボニルアミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１２０－イル］ブトキシ］－６１－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソエチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２４）の調製
ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）中、ＬＰ９（１．１３ｍｇ，０．５７１μｍｏｌ，１当量）とＮａＮ３（４４．５４μｇ，０．６８５μｍｏｌ，１．２当量）との混合物を３７℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。粗生成物ＬＰ２４（１．１５ｍｇ，０．５６９μｍｏｌ，収率１００．００％）をさらなる精製なしにバイオアッセイのために直接送った。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．５６１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９７Ｈ１３５ＦＮ２４Ｏ２３ １０１１．５１［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １０１２．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋；方法Ｂを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
図３９は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ２５）の合成経路を表す。
５．２５（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［２－エチル－４－［４－［２－［２－［２－［２－［［（６５Ｒ，６６Ｓ，６８Ｒ）－１０２，１０３，１０４－トリアザトリシクロドデカ－６９（１０３），１０２（１０４）－ジエン－６８－イル］メトキシカルボニルアミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシカルボニルアミノ］ブトキシ］－５９－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチルプロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２５）の調製
ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）中、ＬＰ５（１．１２ｍｇ，０．５７７μｍｏｌ，１当量）とＮａＮ３（４５．０１μｇ，０．６９２μｍｏｌ，１．２当量）との混合物を３７℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。粗生成物ＬＰ２５（１．１４ｍｇ，４．４２ｅ－１μｍｏｌ，収率７６．６８％，純度７７％）をさらなる精製なしにバイオアッセイのために直接送った。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．５７１分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０５Ｈ１３４ＦＮ２７Ｏ２５ ９９２．４９ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ９９３．０ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；方法Ｂを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
図４０は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ２６）の合成経路を表す。
５．２６（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［２－エチル－４－［４－［［（２Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［４－オキソ－４－（１１２，１１３，１１４，１３１－テトラザテトラシクロノナデカ－８（１４），１０（１６），１１（１７），１２（１８），６１（６４），６５，７３（１１３），１１２（１１４）－オクタエン－１３１－イル）ブタノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］プロパノイル］アミノ］ブトキシ］－６３－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２６）の調製
ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）中、ＬＰ１８（１ｍｇ，４．６５ｅ－１μｍｏｌ，１当量）とＮａＮ３（３６．３１μｇ，０．５５９μｍｏｌ，１．２当量）との混合物を３７℃で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了したことを示した。粗生成物ＬＰ２６（１．０２ｍｇ，０．４６５μｍｏｌ，収率１００．００％）をさらなる精製なしにバイオアッセイのために直接送った。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．２５９分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０５Ｈ１３４ＦＮ２７Ｏ２５ １０９６．０，ｆｏｕｎｄ １０９６．７ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋；方法Ｆを使用して逆相ＬＣ－ＭＳを実施した。
図４１は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ２７及びＬＰ２８）の合成経路を表す。
５．２７（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－（２－アザトリシクロ［１０．４．０．０４，９］ヘキサデカ－１（１２），４（９），５，７，１３，１５－ヘキサエン－１０－イン－２－イル）－４－オキソ－ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２７）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＬＰ１１（７０ｍｇ，３５．３７μｍｏｌ，１当量）とＤＩＢＡＣ－ｓｕｃ－ＯＳｕ（１９．９２ｍｇ，４９．５１μｍｏｌ，１．４当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（９．１４ｍｇ，７０．７４μｍｏｌ，１２．３２μＬ，２当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換され、所望の生成物が観察されたことを示した。溶液を濾過し、分取ＨＰＬＣ（中性条件：カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ ８０＊３０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２５％～５５％，９分）で精製した。所望の流体をフリーズドライヤーで凍結乾燥してＬＰ２７（２４．８７ｍｇ，１０．５６μｍｏｌ，収率２９．８６％，純度９６．２３５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．３１６分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１３Ｈ１５０ＦＮ２２Ｏ２７ ２２６６．０９［Ｍ＋Ｈ］＋，７５６．０３［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｆｏｕｎｄ ７５６．３［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．１７分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
５．２８（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［２－エチル－４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［４－オキソ－４－（３，４，５，１３－テトラザテトラシクロ［１３．４．０．０２，６．０７，１２］ノナデカ－１（１５），２（６），３，７（１２），８，１０，１６，１８－オクタエン－１３－イル）ブタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２８）の調製
ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）中のＬＰ２７（３ｍｇ，１．３２μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＮａＮ３（２５８．１４ｕｇ，３．９７μｍｏｌ，３当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、ＬＰ２７が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主ピークが検出されたことを示した。反応物をＮＨ４Ｃｌ溶液（５ｍＬ）に加えた。水層を分離し、ＥｔＯＡｃ（５ｍＬ＊２）で抽出した。有機層を組み合わせ、水／塩水＝１／１（４００ｍＬ＊２）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し真空状態で濃縮して褐色の油として生成物を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １００＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～５５％，１６分）で精製し、ＬＰ２８（１．０２ｍｇ，４．２３ｅ－１μｍｏｌ，収率３１．９９％，純度９５．８６９％）を得て、白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．５１２分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１３Ｈ１５１ＦＮ２５Ｏ２７ ２３０９．１１［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１１３Ｈ１５２ＦＮ２５Ｏ２７ １１５５．５６［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １１５５．５［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝４．０２４分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
図４２は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ２９）の合成経路を表す。
工程１：ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－［［［４－（２－アミノ－２－オキソ－エトキシ）フェニル］－（２，４－ジメトキシフェニル）メチル］カルバモイル］－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［４－（４－アジドブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］ブタノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタノアート（ＬＰ２９－２）の調製
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のＬＰ２９－１Ａ（８６．２０ｇ，２６４．９４μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＨＡＴＵ（１８１．３３ｍｇ，４７６．８９μｍｏｌ，１．８当量）及びＤＩＰＥＡ（１３６．９６ｍｇ，１．０６ｍｍｏｌ，１８４．５９μＬ，４当量）を２５℃で１０分間にわたって加えた。続いて、溶液をＬＰ２９－１（１ｇ，２６４．９４μｍｏｌ，純度５０％，１当量）に加え、混合物をＮ２、２０℃で２時間バブリングした。完了後、混合物を濾過し、回収した樹脂をＤＭＦ（３０ｍＬ＊３），ＤＣＭ（３０ｍＬ＊３）で洗浄し、固相で粗生成物を得た。これを２０％のピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）で膨潤させ、２５℃のＮ２で２時間バブリングした。完了後、混合物を濾過し、回収した樹脂をＤＭＦ（１００ｍＬ＊３）、ＤＣＭ（１００ｍＬ＊３）で洗浄して樹脂に結合された粗生成物ＬＰ２９－２（２６４．９４μｍｏｌ，粗）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．９２３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０２Ｈ１４１ＦＮ１９Ｏ２０ １４４８．７０，ｆｏｕｎｄ １４５０．４０ ［Ｍ－４＊ｔＢｕ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４＋７Ｈ］＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
工程２：ｔｅｒｔ－ブチル（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－２－［［（１Ｓ）－１－［［［４－（２－アミノ－２－オキソ－エトキシ）フェニル］－（２，４－ジメトキシフェニル）メチル］カルバモイル］－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－１－［［４－［４－（４－アジドブトキシ）－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）プロパノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］ブタノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタノアート（ＬＰ２９－３）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＬＰ２９－２Ａ（２２２．３９ｍｇ，６５９．１２μｍｏｌ，５当量）の溶液に、ＨＡＴＵ（９０．２２ｍｇ，２３７．２８μｍｏｌ，１．８当量）及びＤＩＰＥＡ（６８．１５ｍｇ，５２７．３０μｍｏｌ，９１．８５μＬ，４当量）を２５℃で１０分間にわたって加えた。続いて、溶液をＬＰ２９－２（１３１．８２μｍｏｌ，１当量）に加え、混合物をＮ２、２５℃で１時間バブリングした。完了後、混合物を濾過し、回収した樹脂をＤＭＦ（５０ｍＬ＊３）、ＤＣＭ（５０ｍＬ＊３）で洗浄して樹脂に結合された粗生成物ＬＰ２９－３（１３１．８２μｍｏｌ，粗）を黄色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．９９０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ７８Ｈ１０２ＦＮ１９Ｏ１８ ８０６．８８，ｆｏｕｎｄ ８０７．３［Ｍ－５ｔＢｕ－Ｂｏｃ－Ｃ１７Ｈ１７ＮＯ４］２＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
工程３：（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－［［［４－（２－アミノ－２－オキソ－エトキシ）フェニル］－（２，４－ジメトキシフェニル）メチル］カルバモイル］－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ｔｅｒｔ－ブトキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－３－（４－ｔｅｒｔ－ブトキシフェニル）プロパノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］ブタノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタノアート（ＬＰ２９－４）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＬＰ２９－３（２２．２３μｍｏｌ，１当量）及びＬＰ２９－３Ａ（１７．７８ｍｇ，４３．６４μｍｏｌ，２当量）の溶液に、アスコルビン酸ナトリウム（２１．６１ｍｇ，１０９．０９μｍｏｌ，５当量）、ＴＢＴＡ（１１．５８ｍｇ，２１．８２μｍｏｌ，１当量）及びＣｕＩ（２０．７８ｍｇ，１０９．０９μｍｏｌ，５当量）を加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌した。完了後、混合物を濾過し、回収した樹脂をＤＭＦ（５０ｍＬ＊３）、ＤＣＭ（５０ｍＬ＊３）で洗浄して樹脂に結合された粗生成物ＬＰ２９－４（２２．２３μｍｏｌ，粗）を緑色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．０８５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９７Ｈ１３９ＦＮ２０Ｏ２６ １０１０．５１，ｆｏｕｎｄ １０１１．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、０．７分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で０．４分間保持、カラム；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｕｒｓｕｌｔ５ Ｃ１８ ２０＊２．０ｍｍを使用。
工程４：（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－アミノ－３－（４－ヒドロキシフェニル）プロパノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－（２－フルオロフェニル）－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ２９）の合成
樹脂結合化合物ＬＰ２９－４（２２．２３μｍｏｌ，１当量）を、ＴＦＡカクテル（ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５，１０ｍＬ）を使用して酸性切断に供し、混合物を２５℃で２時間振盪した。混合物を濾過し、濾液を０℃のｔ－ＢｕＯＭｅ（１００ｍＬ）で希釈し、沈殿を得た。これを１０分間遠心分離にかけた（５０００Ｒ）。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｂｏｓｔｏｎ Ｇｒｅｅｎ ＯＤＳ１５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１７％～５７％、９分間）により精製し、生成物ＬＰ２９（７．５５ｍｇ，３．６９μｍｏｌ，収率１６．５８％、純度９８．６３％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．１３３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９７Ｈ１３９ＦＮ２０Ｏ２６ １０１０．５１，ｆｏｕｎｄ １０１１．０［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝３．７７分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
図４３は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ３０）の合成経路を表す。
５．３０（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－３－（４’－（４－（４－（２５－アミノ－２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３－オウタオキサペンタコシル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（４－（２３－ヒドロキシ－３－オキソ－６，９，１２，１５，１８，２１－ヘキサオキサ－２－アザトリコシル）フェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（ＬＰ３０）の調製
Ｈ２Ｏ（０．０９ｍＬ）中のＰ３５（１５ｍｇ，７．５１μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１．８８ｍｇ，７．５１μｍｏｌ，１．０当量）、ナトリウムの溶液；ＤＭＳＯ（０．０３ｍＬ）中の（２Ｒ）－２－［（１Ｓ）－１，２－ジヒドロキシエチル］－４－ヒドロキシ－５－オキソ－２Ｈ－フラン－３－オラート（１．４９ｍｇ，７．５１μｍｏｌ，１．０当量）、続いてＨ２Ｏ（０．０３ｍＬ）中のＴＢＴＡ（１．９９ｍｇ，３．７６μｍｏｌ，０．５当量）及びＤＭＳＯ（０．０３ｍＬ）中のＬＰ３０－１（６．１２ｍｇ，１５．０２μｍｏｌ，２．０当量）の溶液を加えた。混合物を３０℃で２．５時間撹拌した。ＬＣＭＳは、所望のＭＳが検出されたことを示した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘ ｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １００＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５％～４２．５％，１２分）で精製し、ＬＰ３０（２ｍｇ，８．１５ｅ－１μｍｏｌ，収率１０．８５％，純度９８％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．６２８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１２Ｈ１７４ＦＮ２２Ｏ３５ ２４０６．２３［Ｍ＋Ｈ］＋，８０２．７４［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｆｏｕｎｄ ８０２．２０［Ｍ＋３Ｈ］３＋。ＬＣ－ＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６．０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用。波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝６．３２分、純度９８％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持を使用。
図４４は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ３１）の合成経路を表す。
５．３１（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－アミノエト－キシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ３１）の調製
ＤＭＳＯ（０．１ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．４ｍＬ）中のＰ８（４０ｍｇ，２５．４５μｍｏｌ，１当量）及びＬＰ３１－１（２９．７１ｍｇ，５０．９０μｍｏｌ，２当量）の溶液に、ＴＢＴＡ（６．７５ｍｇ，１２．７２μｍｏｌ，０．５当量）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（６．３５ｍｇ，２５．４５μｍｏｌ，１当量）及びアスコルビン酸ナトリウム（５．０４ｍｇ，２５．４５μｍｏｌ，１当量）に加えた。混合物を３７℃で４時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、所望の質量が検出されたことを示した。緑色の溶液を濾過し、粗生成物を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件，カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２３％～５３％，１０分）で精製し、ＬＰ３１（バッチ１：１１．５９ｍｇ，５．２１μｍｏｌ，収率２０．４８％，純度９６．９４％）及び（バッチ２：１１．１３ｍｇ，４．９５μｍｏｌ，収率１９．４５％，純度９５．８６％）を黄色ゴムとして得た。
バッチ１：ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．１６０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０２Ｈ１５３ＦＮ２１Ｏ２９，２１５５．１０［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１０２Ｈ１５４ＦＮ２１Ｏ２９，１０７８．０５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １０７８．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．４８分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
バッチ２：ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．１４７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０２Ｈ１５３ＦＮ２１Ｏ２９ ２１５５．１０ ［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１０２Ｈ１５４ＦＮ２１Ｏ２９ １０７８．０５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １０７８．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．４８分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
図４５は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ３２）の合成経路を表す。
５．３２（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－３－［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］－２－［［（２Ｓ）－３－カルボキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－５－（３，５－ジメチルフェニル）ペンタン酸（ＬＰ３２）の調製
Ｈ２Ｏ（１ｍＬ）中のＬＰ３１－１（３５ｍｇ，２２．２５μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（５．５６ｍｇ，２２．２５μｍｏｌ，１当量）及びＮａＶｃ（４．４１ｍｇ，２２．２５μｍｏｌ，１当量）の溶液、ＤＭＳＯ（０．２５ｍＬ）中のＴＢＴＡ（５．９０ｍｇ，１１．１３μｍｏｌ，０．５当量）の溶液及びＤＭＳＯ（０．２５ｍＬ）中のＰ４１（１８．１４ｍｇ，４４．５１μｍｏｌ，２当量）の溶液を加えた。混合物を４０℃で１２時間撹拌した。反応混合物をＨ２Ｏ（３ｍＬ）及びＡＣＮ（２ｍＬ）で希釈し、続いて混合物を濾過した。濾液を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～６０％，１０分）で精製し、ＬＰ３１（１ｍｇ，０．４６μｍｏｌ，収率１０．１１％，純度９１％）を得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．９１０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９４Ｈ１３６ＦＮ２０Ｏ２６，９９１．０５［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ９９０．９［Ｍ＋Ｈ］＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラムを使用し、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝７．５６分，移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び１００％で５分間保持；カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ１５０＊４．６ｍｍ，５μｍを使用。
図４６は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ３３）の合成経路を表す。
工程１：（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－４－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ３３－２）の合成
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＬＰ１１（１０ｍｇ，５．０５μｍｏｌ，１当量）とＬＰ３３－１（２．９ｍｇ，５．５μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１．９６ｍｇ，１５．１６μｍｏｌ，２．６４μＬ，３当量）を加えた。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、ＬＰ１１が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主ピークが検出されたことを示した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．０３０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１８Ｈ１６３Ｏ３０Ｎ２２Ｆ ７９６．６［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｆｏｕｎｄ ７９６．５。移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。反応物を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｏ－ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｃｌａｒｉｔｙ ＲＰ １５０＊１０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～７０％，２０分）で精製し、生成物ＬＰ３３－２（８ｍｇ，３．１２μｍｏｌ，収率６１．７０％，純度９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．００３分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１８Ｈ１６３Ｏ３０Ｎ２２Ｆ，１１９４．１７［Ｍ＋２Ｈ］＋／２，ｆｏｕｎｄ １１９４．３ 移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ 波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
工程２：（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－４－アミノ－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－５－オキソペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ３３－３）
ＴＨＦ（０．５ｍＬ）中のＬＰ３２－２（８ｍｇ，３．３５μｍｏｌ，１当量）の溶液に、Ｎ－エチルエタンアミン（２．４５ｍｇ，３３．５２μｍｏｌ，３．４５μＬ，１０当量）を加えた。混合物を２０℃で３時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、ＬＰ３２－３が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主ピークが検出されたことを示した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．０７０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１１８Ｈ１５３Ｏ２８Ｎ２２Ｆ １０８２．５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １０８２．９。移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。反応混合物を減圧下で濃縮し、無色の油としてＬＰ３３－３（７ｍｇ，粗）を得た。
工程３：（２Ｓ）－２－アミノ－５－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［１－［４－［４－［４－［（２Ｓ）－３－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－［［（２Ｓ）－３－カルボキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ブチル］トリアゾール－４－イル］メトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－５－オキソ－ペンタン酸（ＬＰ３３）
ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のＬＰ３３－３（７ｍｇ，３．２３μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＴＦＡ（７７０．００ｍｇ，６．７５ｍｍｏｌ，５００．００μｌ，２０８８．０６当量）を加えた。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣ－ＭＳは、ＬＰ３２－４が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主ピークが検出されたことを示した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．９７７分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９９Ｈ１４５Ｏ２８Ｎ２２Ｆ １０５４．５２［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １０５４．９。移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持、カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ、波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。反応混合物を濾過して残渣を得た。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｏ－ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｃｌａｒｉｔｙ ＲＰ １５０＊１０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～６５％，２５分）で精製し、生成物ＬＰ３３（２．１ｍｇ，９．６６ｅ－１μｍｏｌ，収率２９．８７％，純度９７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．９５０分、ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９９Ｈ１４５Ｏ２８Ｎ２２Ｆ，１０５４．５２［Ｍ＋２Ｈ］＋／２，ｆｏｕｎｄ １０５４．９ 移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ 波長：ＵＶ２２０ｎｍ，２５４ｎｍ；カラム温度５０℃；ＭＳイオン化：ＥＳＩを使用。
ＵＰＬＣ：ＲＴ＝３．２７７分，移動相：０．０５％のＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．０５％のＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．６ｍｌ／分で、５分間の５％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で３分間保持；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ １．８ｕｍ，２．１ｘ１００ｍｍを使用。
図４７は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ３４）の合成経路を表す。
工程１：［（２－クロロフェニル）－ジフェニル－メチル］２－［［２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）アセチル］アミノ］アセタート（ＬＰ３４－２）の調製
ＤＭＦ（２００ｍＬ）中のＬＰ３４－１（２０ｇ，２１．０１ｍｍｏｌ，純度３２．８％，１当量）の混合物を３０分間振盪し、ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の２－［［２－（９Ｈ－フルオレン－９－イルメトキシカルボニルアミノ）アセチル］アミノ］酢酸（３７．２３ｇ，１０５．０６ｍｍｏｌ，５当量）と、ＤＩＰＥＡ（２７．１６ｇ，２１０．１１ｍｍｏｌ，３６．６０ｍＬ，１０当量）との溶液を加えた。得られた混合物を２０℃で１２時間振盪した。得られた混合物を２０℃で１２時間振盪した。混合物をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に加え、さらに２時間振盪した。粗生成物ＷＵＸＩ－２６２－２（２６．６８ｇ，粗）を、黄色固体としてさらなる精製なしに次の工程で使用した。
工程２：（４Ｓ）－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－２－アミノ－４－メチル－ペンタノイル］ピロリジン－２－カルボニル］アミノ］－５－［［（１Ｓ，２Ｒ）－１－［［２－（カルボキシメチルアミノ）－２－オキソ－エチル］カルバモイル］－２－ヒドロキシ－プロピル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸（ＬＰ３４－３）の調製
Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｌｉｔｅ－Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置で固相ペプチド合成を行った。ＬＰ３４－２樹脂（０．４３ｍｍｏｌ，１当量）を、標準で３００秒、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で膨潤させた。ペプチド合成装置での標準操作に従い、ａ）脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液を樹脂容器に加え、９０℃、Ｎ２で２分間撹拌した。続いて容器からこれを排出し、ＤＭＦ（３ｍＬ×３）を用いて２０℃で洗浄した。ｂ）カップリング（各アミノ酸は５．０当量で３つ組で反応した）：ＤＭＦ（５ｍＬ）、ＤＩＣ（２ｍＬ）及びオキシマ（１ｍＬ）中のアミノ酸（２．５ｍｍｏｌ，５当量）の溶液を容器に加え、９０℃、Ｎ２で１０分間撹拌した。全てのアミノ酸についてａ）及びｂ）を繰り返す。ＴＦＡカクテル（ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで樹脂を酸性切断に供し、続いてこれを濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅで希釈して沈殿を得た。これを１０分間遠心分離（５０００Ｒ）にかけて白色固体として生成物Ｐ３４－３（０．６ｇ，粗，ＴＦＡ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）１３．１３－１１．７１（ｍ，２Ｈ），８．５２－７．９７（ｍ，７Ｈ），７．８５－７．５９（ｍ，１Ｈ），５．０６（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．４８－４．２８（ｍ，２Ｈ），４．２６－４．１６（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．０４－３．９４（ｍ，１Ｈ），３．９０－３．６８（ｍ，５Ｈ），２．３５－１．７２（ｍ，９Ｈ），１．６４－１．４４（ｍ，２Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，３Ｈ），０．９６－０．８７（ｍ，６Ｈ）。
工程３：（４Ｓ）－５－［［（１Ｓ，２Ｒ）－１－［［２－（カルボキシメチルアミノ）－２－オキソ－エチル］カルバモイル］－２－ヒドロキシ－プロピル］アミノ］－４－［［（２Ｓ）－１－［（２Ｓ）－４－メチル－２－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－プロプ－２－インオキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］ペンタノイル］ピロリジン－２－カルボニル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸（ＬＰ３４－５）の調製
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＬＰ３４－３（４５ｍｇ，６５．５４μｍｏｌ，１当量，ＴＦＡ）とＬＰ３４－４（３６．５４ｍｇ，６５．５４μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１６．９４ｍｇ，１３１．０７μｍｏｌ，２２．８３μｌ，２当量）を加えた。溶液を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、所望の生成物が観察されたことを示した。（ＥＳＩ）：ＲＴ＝２．４５５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ７７Ｎ１９Ｏ１９Ｎ６ ９９２．０８［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ９９１．６［Ｍ＋Ｈ］＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ、１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の１０％～８０％の溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用した。混合物をＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）で希釈した。残渣を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件；カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，１０分）で精製した。ＬＰ３４－５（５０ｍｇ，４９．５４μｍｏｌ，収率７５．５９％，純度９８．２％）を無色の油として得て、ＬＣＭＳ：ＥＳ１７４７８－９７－Ｐ１Ｄ２，ＨＰＬＣ：ＥＳ１７４７８－９７－ｐ１Ｃ１及びＨＮＭＲ：ＥＳ１７４７８－９７－Ｐ１Ｂ１で確認した。
（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．１５８分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ４７Ｈ７７Ｎ１９Ｏ１９Ｎ６ ９９２．０８［Ｍ＋Ｈ］＋，ｆｏｕｎｄ ９９１．６［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ １．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の０％～６０％の勾配（溶媒Ｂ）及び６０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝３．６９分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１％～１００％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び１００％で５分間保持；カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍを使用。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）８．２０－８．０６（ｍ，４Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６２－４．５０（ｍ，１Ｈ），４．３４（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝４．４，８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３１－４．２４（ｍ，１Ｈ），４．１９（ｄｄ，Ｊ＝４．０，８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ），４．０４－３．９６（ｍ，１Ｈ），３．８２－３．７３（ｍ，４Ｈ），３．６０－３．４７（ｍ，３４Ｈ），２．４１－２．２５（ｍ，４Ｈ），１．９９－１．８２（ｍ，４Ｈ），１．８０－１．６９（ｍ，１Ｈ），１．６７－１．５６（ｍ，１Ｈ），１．５０－１．３５（ｍ，２Ｈ），１．３２－１．２２（ｍ，１Ｈ），１．０３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ）。
工程４：（４Ｓ）－４－［［（２Ｒ）－１－［（２Ｓ）－２－［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［１－［５－［４－［４－［（２Ｓ）－３－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－［［（２Ｓ）－３－カルボキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ペンチル］トリアゾール－４－イル］メトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］－４－メチル－ペンタノイル］ピロリジン－２－カルボニル］アミノ］－５－［［（１Ｓ，２Ｒ）－１－［［２－（カルボキシメチルアミノ）－２－オキソ－エチル］カルバモイル］－２－ヒドロキシ－プロピル］アミノ］－５－オキソ－ペンタン酸（ＬＰ３４）の調製
ＤＭＳＯ（０．８ｍＬ）及びＨ２Ｏ（０．８ｍＬ）中のＰ８（１５ｍｇ，９．５４μｍｏｌ，１当量）、ＬＰ３４－５（１９．００ｍｇ，１９．１７μｍｏｌ，２．０１当量）の溶液に、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（２．３８ｍｇ，９．５４μｍｏｌ，１当量）及びアスコルビン酸ナトリウム（１．８９ｍｇ，９．５４μｍｏｌ，１当量）及び１－（１－ベンジルトリアゾール－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ビス［（１－ベンジルトリアゾール－４－イル）メチル］メタンアミン（２．５ｍｇ，４．７７μｍｏｌ，０．５当量）に加えた。得られた混合物を２５℃で３時間撹拌した。ＬＣＭＳは、所望の生成物が観察されたことを示した。（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．６７７分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１２０Ｈ１７５Ｎ２６Ｏ３６ ２５６２．２５［Ｍ＋Ｈ］＋，１２８２．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １２８２．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ １．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用した。ＭｅＯＨ（２ｍＬ）で混合物を希釈し、濾過して濾液を分取ＨＰＬＣに送った。残渣を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）で精製した。カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２８％～５８％，８分。ＬＰ３４（８．９ｍｇ，３．３３μｍｏｌ，収率３４．８５％、純度９６．３％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ ＲＴ＝３．６８２分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１２０Ｈ１７５Ｎ２６Ｏ３６ ２５６２．２５［Ｍ＋Ｈ］＋，１２８２．６［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １２８２．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ １．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝４．３４分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１％～１００％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び１００％で５分間保持；カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍを使用。
図４８は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ３５）の合成経路を表す。
（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－４－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－４－メチル－ペンタノイル］アミノ］－４－メチル－ペンタノイル］アミノ］－５－［［２－［［（１Ｓ）－２－（カルボキシメチルアミノ）－１－（ヒドロキシメチル）－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ３５）の調製
ＬＰ１１（６．０ｍｇ，２．７２μｍｏｌ，１．０当量，２ＴＦＡ）及びＰＢＳ緩衝液（Ｋ－フリー，１００ｍＭ，ｐＨ＝７．２０）（７．２ｍＬ）の溶液のｐＨを７．２と測定した。ＬＰ３５－１（９．６２ｍｇ，１３．５９μｍｏｌ，５．０当量）及びＭＴＧａｓｅ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ－ＴＩ，５１．６ｍｇ）を加えた。得られた混合物を３７℃で１６時間撹拌した。反応の進行をＬＣＭＳで監視した。完了時に、反応混合物をＡｃＯＨ水溶液（１％ｖ／ｖ，７．２ｍＬ）でクエンチした。得られた固体をＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（３ｍＬ，１／１）ですすぎ、続いて濾液を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｏ－Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ １５０＊１０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１０％～６５％，２０分）で精製してＬＰ３５（２．６２ｍｇ，０．９２６μｍｏｌ，収率３４．１％，純度９８．３％，ＴＦＡ塩）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．６２分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１２６Ｈ１８４ＦＮ２７Ｏ３６ １３３５．１７［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １３３５．６；２２０ｎｍで純度１００％。ＬＣＭＳ条件：Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ ２．１＊３０ｍｍ，３μｍ；１．５ｍＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ｍＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍＬ／分で、６分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持。
ＵＰＬＣ：ＲＴ＝７．１５分、２２０ｎｍで純度９８．３８％。ＵＰＬＣ方法：カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ，２．１＊１００ｍｍ；１Ｌの水中の０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ａ）及び１Ｌのアセトニトリル中の０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）、流量０．４ｍＬ／分で、１１分間の３％～１００％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び１００％で４分間保持。
図４９は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ３６，ＬＰ３７，ＬＰ３８，ＬＰ３９，ＬＰ４０，ＬＰ４１）の合成経路を表す。
５．３６（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［（２－アミノアセチル）アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］メチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ３６）の調製
Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｌｉｔｅ－Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅペプチド合成装置で固相ペプチド合成を行った。ＬＰ３６－１（０．４３ｍｍｏｌ，１当量）を、標準で３００秒、ＤＭＦ（１０ｍＬ）で膨潤させた。ペプチド合成装置での標準操作に従い、ａ）脱保護：２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）の溶液を樹脂容器に加え、９０℃、Ｎ２で２分間撹拌した。続いて容器からこれを排出し、ＤＭＦ（３ｍＬ×３）を用いて２０℃で洗浄した。ｂ）カップリング（各アミノ酸は５．０当量で３つ組で反応した）：ＤＭＦ（５ｍＬ）、ＤＩＣ（２ｍＬ）及びオキシマ（１ｍＬ）中のアミノ酸（２．５ｍｍｏｌ，５当量）の溶液を容器に加え、９０℃、Ｎ２で１０分間撹拌した。全てのアミノ酸についてａ）及びｂ）を繰り返す。ＴＦＡカクテル（ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ＝９５：２．５：２．５）を使用することで樹脂を酸性切断に供し、続いてこれを濾過し、濾液をｔ－ＢｕＯＭｅで希釈して沈殿を得た。これを１０分間遠心分離（５０００Ｒ）にかけて粗生成物を得た。
ＬＰ３６は、ＳＰＰＳの一般的な手順に記載されるように調製した。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～４０％，１５分）で精製し、純粋な生成物ＬＰ３６（１３．９ｍｇ，６．２５μｍｏｌ，収率１．４４％，純度９７．５８％，２ＴＦＡ）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．７１５分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ８９Ｈ１２３ＦＮ２６Ｏ２３，９７１．４６，［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ｆｏｕｎｄ ９７１．９［Ｍ＋２Ｈ］２＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰＣ１８２５－３ｍｍカラムを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ ＲＴ＝６．６２分。ＨＰＬＣ条件：移動相：１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）を１分；続いて５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）を５分；１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）で２分間保持；８．０１分で１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）に戻し、２分間保持；流量：１．２ｍｌ／分；カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍ。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ８９Ｈ１２１ＦＮ２６Ｏ２３ １９４１．９１［Ｍ＋Ｈ］＋，９７１．４６［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １９４２．９２９９［Ｍ＋Ｈ］＋，９７１．９７３６［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
ＵＰＬＣ：ＲＴ＝５．８２４分，条件：移動相：１Ｌの水中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ａ）及び１Ｌのアセトニトリル中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）、流量０．４ｍＬ／分で、１０分間の３０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ １．８ｕｍ，２．１＊１００ｍｍを使用。
５．３７ ＬＰ３７をＬＰ３６と同様に得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：０％～４０％，１５分）で精製し、純粋な生成物ＬＰ３７（５ｍｇ，２．５０μｍｏｌ，収率１．２５％，純度９７％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．８００分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ８９Ｈ１２１ＦＮ２６Ｏ２３ ９７１．４５［Ｍ／２＋Ｈ］＋ｆｏｕｎｄ ９７１．０；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝６．６１分。移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間の保持；カラム：ＷＥＬＣＨ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＬＰ－Ｃ１８ １５０＊４．６ｍｍ ５μｍ；波長：ＵＶ２２０ｎｍ＆２１５ｎｍ＆２５４ｎｍ；カラム温度：４０℃を使用。
ＨＲＭＳ－ＴＯＦ：Ｃ８９Ｈ１２２Ｎ２６Ｏ２３Ｆ［Ｍ＋Ｈ］＝１９４２．９５７３。移動相：０．１％のＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及びＡＣＮ中０．０５％のＦＡ（溶媒Ｂ）；溶出勾配：１．２ｍｌ／分間の流量で１．３分間の５％～９５％（溶媒Ｂ）及び０．７分間９５％で保持；カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ＨＰＨ－Ｃ１８２．７ｕｍ，２．１＊５０ｍｍ；イオン源：ＡＪＳ ＥＳＩ源；イオンモード：正；噴霧ガス：窒素；乾燥ガス（Ｎ２）流：８Ｌ／分；ネブライザ圧力：３５ｐｓｉ；気体温度：３２５℃；シースガス温度：３５０℃；シースガス流：１１Ｌ／分；キャピラリ電圧：３．５ＫＶ；フラグメンタ圧力：３００Ｖ。
ＵＰＬＣ：ＲＴ＝４．５９５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．移動相：１Ｌの水中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ａ）及び１Ｌのアセトニトリル中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）、流量０．６ｍＬ／分で、６分間の０％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で４分間保持；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ ２．１＊５０ｍｍ，１．８μｍ；カラム温度：４０℃を使用。
５．３８ ＬＰ３８をＬＰ３６と同様に得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘ ｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，１５分）で精製し、純粋な生成物ＬＰ３８（５２．１７ｍｇ，８．８７μｍｏｌ，収率２．５３％，純度９５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．７２３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９６Ｈ１３４ＦＮ２９Ｏ２７ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０７１．９９，Ｃ９６Ｈ１３５ＦＮ２９Ｏ２７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋７１４．９９；ｆｏｕｎｄ １０７２．４０［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｆｏｕｎｄ ７１５．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８ ２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．００分、純度９５％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
５．３９ ＬＰ３９をＬＰ３６と同様に得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １００＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：水（０．０５％ＮＨ３Ｈ２Ｏ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５％～３２％，１１分）で精製し、純粋な生成物ＬＰ３９（２０ｍｇ，８．７５μｍｏｌ，収率２．５０％，純度９５％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．７１１分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ９７Ｈ１３５ＦＮ３０Ｏ２７ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋１０８５．４９，Ｃ９７Ｈ１３６ＦＮ３０Ｏ２７ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋７２４．３０；ｆｏｕｎｄ １０８５．９０［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｆｏｕｎｄ ７２５．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰ－Ｃ１８２５－３ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝８．９９分、純度９５％。ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
５．４０ ＬＰ４０をＬＰ３６と同様に得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘ ｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：６％～４６％，２０分）で精製し、純粋な生成物ＬＰ４０（３．５ｍｇ，１．３８μｍｏｌ，収率３．９４ｅ－１％，純度９７．９９％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．７４０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０８Ｈ１５２ＦＮ３５Ｏ３３ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋１２４３．０５，Ｃ１０８Ｈ１５３ＦＮ３５Ｏ３３ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋８２９．０３；ｆｏｕｎｄ ８２９．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｆｏｕｎｄ １２４３．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋；Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ２．１＊３０ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及びＮＨ３・Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝６．５０分，純度９７．９９％ ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
５．４１ ＬＰ４１をＬＰ３６と同様に得た。粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：６％～４６％，２０分）で精製し、純粋な生成物ＬＰ４１（４．５ｍｇ，１．８９μｍｏｌ，収率０．５４％，純度９８．５２％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ：（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝２．５９０分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１０３Ｈ１４５ＦＮ３２Ｏ３１ ［Ｍ＋２Ｈ］２＋１１７３．２１，Ｃ１０３Ｈ１４６ＦＮ３２Ｏ３１ ［Ｍ＋３Ｈ］３＋７８２．４７；ｆｏｕｎｄ １１７２．９０［Ｍ＋２Ｈ］２＋ｆｏｕｎｄ ７８２．３０［Ｍ＋３Ｈ］３＋；Ｘ Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８ ３．５μｍ ２．１＊３０ｍｍを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及びＮＨ３ Ｈ２Ｏ水溶液（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝６．５４分，純度９８．５２％ ＨＰＬＣ方法Ａ：カラム：ＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－Ａ １５０＊４．６ｍｍ，５μｍ；２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ｍｌ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持。
図５０は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ４２）の合成経路を表す。
工程１：（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－４－［（１８－ｔｅｒｔ－ブトキシ－１８－オキソ－オクタデカノイル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］メチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ４２－２）の調製
ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＬＰ４２－１（４５．７５ｍｇ，５４．０７μｍｏｌ，１．５当量）とＨＡＴＵ（１６．４５ｍｇ，４３．２５μｍｏｌ，１．２当量）との溶液に、ＤＩＰＥＡ（１３．９８ｍｇ，１０８．１３μｍｏｌ，１８．８３μＬ，３当量）を加えた。混合物を２０℃で０．１時間撹拌した。ＬＰ３６（７０ｍｇ，３６．０４μｍｏｌ，１当量）を加え、混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換したことを示した。反応混合物をＭＴＢＥ（４０ｍＬ）に滴下した。沈殿した黄色固体を遠心分離により回収した。ＬＰ４２－２（１１０ｍｇ，２５．４９μｍｏｌ，収率７０．７１％、純度６４．１８％）を淡黄色の固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．６７０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１３２Ｈ１９９ＦＮ２９Ｏ３５ １３８５．２３［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １３８５．８；ＬＣＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍ，３μｍを使用。
工程２：１８－［［（１Ｓ）－４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［（１Ｓ）－２－［［１－［４－［４－［４－［（２Ｓ）－３－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－［［（２Ｓ）－３－カルボキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ブチル］トリアゾール－４－イル］メチルアミノ］－１－（ヒドロキシメチル）－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－１－カルボキシ－４－オキソ－ブチル］アミノ］－１８－オキソ－オクタデカン酸（ＬＰ４２）の調製
ＤＣＭ（１ｍＬ）中のＬＰ４２－２（１１０ｍｇ，２５．４９μｍｏｌ，純度６４．１８％，１当量）の溶液に、ＴＦＡ（１．５４ｇ，１３．５１ｍｍｏｌ，１ｍＬ，５２９．９５当量）を加えた。混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換したことを示した。反応混合物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｗｅｌｃｈ Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １００＊４０ｍｍ＊３μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１０％～５０％，４０分）で精製し、所望の化合物ＬＰ４２（２４ｍｇ，８．６８μｍｏｌ，収率１７．０３％，純度９６．１１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：Ｒｔ＝３．９４３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１２４Ｈ１８４ＦＮ２９Ｏ３５，１３２９．１７［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １３２９．６；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰＣ１８２５－３ｍｍカラムを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ ＲＴ＝８．５２分。ＨＰＬＣ条件：移動相：１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）を１分；続いて５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）を５分；１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）で２分間保持；８．０１分で１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）に戻し、２分間保持。流量：１．２ｍｌ／分。カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍ。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１２４Ｈ１８３ＦＮ２９Ｏ３５ ２６５７．３３［Ｍ＋Ｈ］＋，１３２９．６６５［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ ２６５７．３３［Ｍ＋Ｈ］＋，１３２９．６７０３［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
ＵＰＬＣ：ＲＴ＝５．４１１分，条件：移動相：１Ｌの水中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ａ）及び１Ｌのアセトニトリル中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）、流量０．４ｍＬ／分で、６分間の０％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び９５％で４分間保持；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ １．８ｕｍ，２．１＊１００ｍｍを使用。
図５１は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ４３）の合成経路を表す。
工程１：（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［［［２－［［２－［［２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－４－［（１８－ｔｅｒｔ－ブトキシ－１８－オキソ－オクタデカノイル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］アセチル］アミノ］メチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ４３－１）の調製
ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中のＬＰ４２－１（４１ｍｇ，１８．８９μｍｏｌ，１当量）とＨＡＴＵ（８．６２ｍｇ，２２．６７μｍｏｌ，１．２当量）との溶液に、ＤＩＰＥＡ（７．３２ｍｇ，５６．６７μｍｏｌ，９．８７μＬ，３当量）を加えた。混合物を２０℃で０．１時間撹拌した。ＬＰ３９（２３．９８ｍｇ，２８．３４μｍｏｌ，１．５当量）を加え、混合物を２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換したことを示した。反応混合物をＭＴＢＥ（４０ｍＬ）に滴下した。沈殿した黄色固体を遠心分離により回収した。ＬＰ４３－１（８０ｍｇ，１２．５６μｍｏｌ，収率６６．４９％、純度４７．０８％）を淡黄色の固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．６０３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１４０Ｈ２１３ＦＮ３３Ｏ３９ ９９９．８５［Ｍ＋３Ｈ］３＋；ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １０００．３；ＬＣＭＳ条件：移動相：１．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量０．８ｍｌ／分で、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍ，３μｍを使用。
工程３：１８－［［（１Ｓ）－４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［（１Ｓ）－２－［［２－［［２－［［２－［［２－［［１－［４－［４－［４－［（２Ｓ）－３－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－［［（２Ｓ）－３－カルボキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［（２Ｓ）－３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ブチル］トリアゾール－４－イル］メチルアミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－１－（ヒドロキシメチル）－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－１－カルボキシ－４－オキソ－ブチル］アミノ］－１８－オキソ－オクタデカン酸（ＬＰ４３）の調製
ＤＣＭ（０．７ｍＬ）中のＬＰ４３－１（８０ｍｇ，１２．５６μｍｏｌ，純度４７．０８％，１当量）の溶液に、ＴＦＡ（２．３１ｇ，２０．２６ｍｍｏｌ，１．５ｍＬ，１６１２．８３当量）を加えた。混合物を２０℃で３時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完全に変換したことを示した。残渣を分取ＨＰＬＣ（カラム：Ｏ－ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｃｌａｒｉｔｙ ＲＰ １５０＊１０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３０％～５２％，２０分）で精製し、所望の化合物ＬＰ４３（１．８ｍｇ，０．５７１μｍｏｌ，収率４．５５％，純度９１．６０％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．８８３分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．Ｆｏｒ Ｃ１３２Ｈ１９６ＦＮ３３Ｏ３９，１４４３．２１［Ｍ＋２Ｈ］２＋；ｍ／ｚ ｆｏｕｎｄ １４４３．８；Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ ＲＰＣ１８２５－３ｍｍカラムを使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出した。
ＨＰＬＣ ＲＴ＝８．３０分。ＨＰＬＣ条件：移動相：１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）を１分；続いて５％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）～１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）を５分；１００％のＡＣＮ（０．１％ＴＦＡ）で２分間保持；８．０１分で１．０％のＡＣＮ水溶液（０．１％ＴＦＡ）に戻し、２分間保持。流量：１．２ｍｌ／分。カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍ。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１３２Ｈ１９５ＦＮ３３Ｏ３９ ２８８５．４２［Ｍ＋Ｈ］＋，１４４２．２１［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １４４２．２１［Ｍ＋Ｈ］＋，１４４３．７１６１［Ｍ＋２Ｈ］２＋。
ＵＰＬＣ：ＲＴ＝５．３１６分，条件：移動相：１Ｌの水中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ａ）及び１Ｌのアセトニトリル中０．０５％のＴＦＡ（溶媒Ｂ）、流量０．４ｍＬ／分で、１０分間の０％～９５％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３ １．８ｕｍ，２．１＊１００ｍｍを使用。
図５２は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ４４）の合成経路を表す。
工程１：（８Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，２０Ｓ，２３Ｓ，２６Ｓ）－８－（（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）メチル）－２６－（（（Ｓ）－１－（（（Ｓ）－１－アミノ－５－（３，５－ジメチルフェニル）－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－３－（４’－（４－（４－（（Ｓ）－６０－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－８１，８１－ジメチル－３９，４８，５７，６２，７９－ペンタオキソ－２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５，４１，４４，５０，５３，８０－ヘプタデカオキサ－３８，４７，５６，６１－テトラアザドオクタコンチル）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）ブトキシ）－２’－エチル－［１，１’－ビフェニル］－４－イル）－１－オキソプロパン－２－イル）カルバモイル）－１７－（２－フルオロベンジル）－１４，２０－ビス（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－２３－（ヒドロキシメチル）－１－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）－５，５，１７－トリメチル－４，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキソ－３，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５－オクタアザオクタコサン－２８－酸（ＬＰ４４－２）の調製
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＬＰ３０（４０ｍｇ，１８．５６μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（７．２ｍｇ，５５．６８μｍｏｌ，１０μＬ，３当量）及びＬＰ４４－１（２２ｍｇ，２２．２７μｍｏｌ，１．２当量）を加えた。得られた混合物を２０℃で０．５時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了し、所望の生成物が観察されたことを示した。混合物を氷冷したＭＴＢＥに注ぎ、続いてこれを濾過し、濾過ケーキを真空状態で乾燥させた。ＬＰ４４－２（５５ｍｇ，粗）を無色の油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝６．３９６分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１４５Ｈ２３０ＦＮ２４Ｏ４１ ２９８２．６６［Ｍ＋Ｈ］＋，７４６．４４［Ｍ＋４Ｈ］４＋，ｆｏｕｎｄ ７４７．２［Ｍ＋４Ｈ］４＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ １．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用して実施した。
ＴＦＡ（０．５ｍＬ）及びＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のＬＰ４４－２（５５ｍｇ，１８．２６μｍｏｌ，１当量）の溶液を、２０℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、反応が完了し、所望の生成物が観察されたことを示した。（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．２１９分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３７Ｈ２１４ＦＮ２４Ｏ４１ ２８７０．５３［Ｍ＋Ｈ］＋，１４３６．２７［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １４３６．２［Ｍ＋２Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ １．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用して実施した。反応溶液を真空状態で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件；カラム：Ｏ－ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ｃｌａｒｉｔｙ ＲＰ １５０＊１０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．０７５％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：４０％）で精製した。所望の化合物ＬＰ４４（１２ｍｇ，４．０５μｍｏｌ，収率２２．１９％、純度９６．９７％）を白色固体として得た。
工程２：１８－［［（１Ｓ）－４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［１－［４－［４－［４－［（２Ｓ）－３－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－（３，５－ジメチルフェニル）ブチル］アミノ］－２－［［（２Ｓ）－３－カルボキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ブチル］トリアゾール－４－イル］メトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－１－カルボキシ－４－オキソ－ブチル］アミノ］－１８－オキソ－オクタデカン酸（ＬＰ４４－２）の調製
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝４．２４３分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１３７Ｈ２１４ＦＮ２４Ｏ４１ ２８７０．５３［Ｍ＋Ｈ］＋，１４３６．２７［Ｍ＋２Ｈ］２＋，ｆｏｕｎｄ １４３６．４［Ｍ＋２Ｈ］２＋。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ Ｆｌａｓｈ １．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び０．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）を使用し、流量０．８ｍｌ／分で逆相ＬＣＭＳを実施し、６分間の１０％～８０％の勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で０．５分間保持；カラム：Ｘｔｉｍａｔｅ ３μｍ，Ｃ１８，２．１＊３０ｍｍを使用して実施した。
ＨＰＬＣ：ＲＴ＝９．１３分；ＨＰＬＣ条件：移動相：２．７５ＭＬ／４ＬのＴＦＡ水溶液（溶媒Ａ）及び２．５ＭＬ／４ＬのＴＦＡアセトニトリル溶液（溶媒Ｂ）、流量１．５ＭＬ／分で、１０分間の１０％～８０％溶出勾配（溶媒Ｂ）及び８０％で５分間保持；カラム：Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＸＢ－Ｃ１８，３μｍ，３．０＊５０ｍｍを使用。
図５３は、ＧＬＰ－１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ４５）の合成経路を表す。
工程１：（３Ｓ）－４－［［（１Ｓ）－１－［［４－［４－［４－［４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［２－［２－［２－［［（４Ｓ）－５－ｔｅｒｔ－ブトキシ－４－［（１８－ｔｅｒｔ－ブトキシ－１８－オキソ－オクタデカノイル）アミノ］－５－オキソ－ペンタノイル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］アセチル］アミノ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシメチル］トリアゾール－１－イル］ブトキシ］－２－エチル－フェニル］フェニル］メチル］－２－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－［４－［［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］メチル］フェニル］ブチル］アミノ］－２－オキソ－エチル］アミノ］－３－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］－４－オキソ－ブタン酸（ＬＰ４５－２）の調製
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中のＬＰ２９（２１０ｍｇ，８７．３３μｍｏｌ，１当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２２．５７ｍｇ，１７４．６６μｍｏｌ，３０．４２μＬ，２当量）及びＬＰ４５－１（１６８．９３ｍｇ，１７４．６６μｍｏｌ，２当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣＭＳは、ＬＰ２９が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主ピークが検出されたことを示した。反応混合物をＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で分配し、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を分離して塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮し、残渣を得た。所望の化合物ＬＰ４５－２（２００ｍｇ，粗）を黄色油として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝５．１５４分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１５５Ｈ２４８ＦＮ２５Ｏ４７ ３２３１．７８［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１５５Ｈ２５１ＦＮ２５Ｏ４７ １０７７．９［Ｍ＋３Ｈ］３＋，ｆｏｕｎｄ １０７８．４５［Ｍ＋３Ｈ］３＋。ＬＣＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する５％～９５％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
工程２：１８－［［（１Ｓ）－４－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［［１－［４－［４－［４－［（２Ｓ）－３－［［（１Ｓ）－１－カルバモイル－４－［４－［［３－［２－［２－［２－［２－［２－［２－［２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］プロパノイルアミノ］メチル］フェニル］ブチル］アミノ］－２－［［（２Ｓ）－３－カルボキシ－２－［［（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－２－［［３－（２－フルオロフェニル）－２－［［（２Ｓ，３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－［［２－［［（２Ｓ）－２－［［３－［２－（１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチルアミノ］－２，２－ジメチル－３－オキソ－プロパノイル］アミノ］－３－（２Ｈ－テトラゾール－５－イル）プロパノイル］アミノ］アセチル］アミノ］ブタノイル］アミノ］－２－メチル－プロパノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－ブタノイル］アミノ］－３－ヒドロキシ－プロパノイル］アミノ］プロパノイル］アミノ］－３－オキソ－プロピル］フェニル］－３－エチル－フェノキシ］ブチル］トリアゾール－４－イル］メトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－２－オキソ－エトキシ］エトキシ］エチルアミノ］－１－カルボキシ－４－オキソ－ブチル］アミノ］－１８－オキソ－オクタデカン酸（ＬＰ４５）の調製
１，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール（２ｍＬ）中のＬＰ４５－２（２００ｍｇ，６１．８７μｍｏｌ，１当量）の溶液に。混合物を、９０℃、マイクロ波の下で２時間撹拌した。ＬＣＭＳは、ＬＰ４５－２が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主ピークが検出されたことを示した。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．５７５分，ｍａｓｓ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１４７Ｈ２３３ＦＮ２５Ｏ４７ ３１１９．６５［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１４７Ｈ２３５ＦＮ２５Ｏ４７ ７８０．７［Ｍ＋４Ｈ］４＋，ｆｏｕｎｄ ７８１．０［Ｍ＋４Ｈ］４＋。ＬＣＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。反応混合物を真空下で濃縮し、粗生成物を得た。残渣を、分取ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ－Ａｃｔｕｓ Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：３６％～５６％，１０．５分）で精製し、ＬＰ４５（１８．０３ｍｇ，５．７５μｍｏｌ，収率９．２９％，純度９９．５１％）を白色固体として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）：ＲＴ＝３．５５０分，ｍ／ｚ ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ１４７Ｈ２３３ＦＮ２５Ｏ４７ ３１１９．６５［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃ１４７Ｈ２３５ＦＮ２５Ｏ４７ ７８０．７［Ｍ＋４Ｈ］４＋，ｆｏｕｎｄ ７８１．０［Ｍ＋４Ｈ］４＋。ＬＣ－ＭＳ方法Ａ：ＭＥＲＣＫ，ＲＰ－１８ｅ ２５－２ｍｍカラム、流量１．５ｍＬ／分で、０．０２％のＴＦＡを含有する１０％～８０％のアセトニトリル勾配（溶媒Ｂ）及び０．０４％のＴＦＡを含有する水（溶媒Ａ）で溶出。
実施例６．粗ペプチド模倣薬の分取ＨＰＬＣ精製
分取ＨＰＬＣを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－８ａ液体（Ｌｉｇｕｉｄ）クロマトグラフで実施した。ＤＭＦ又は水に溶解した粗ペプチドの溶液をカラムに注入し、ＡＣＮ水溶液の直線的勾配で溶出した。異なる方法を使用した（一般的な情報を参照されたい）。溶出した所望の生成物の量はほんの少しであり、それぞれのＨＰＬＣ画分を凍結乾燥することで、非晶質の粉末で純粋なペプチド模倣薬を得た。一般には、分取ＨＰＬＣ精製後、全体の回収率は収率４０～５０％の範囲であることが分かった。
分取ＨＰＬＣ方法Ａ：ＦＡ条件（カラム；Ｘｔｉｍａｔｅ Ｃ１８ １５０＊２５ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：４０％～７０％，７分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｂ：ＴＦＡ条件（カラム；ＹＭＣ－Ｅｘｐｈｅｒｅ Ｃ１８ １０μｍ ３００＊５０ｍｍ １２ｎｍ；移動相：［水（０．１％ＴＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～４５％，５５分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｃ：中性条件（カラム；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １５０＊３０ｍｍ＊５μｍ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２１％～５１％，１１分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｄ：中性条件（カラム；Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ １５０＊２５５ｕ；移動相：［水（１０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：２０％～５０％，７分）を使用し、純粋な生成物を得る。
分取ＨＰＬＣ方法Ｅ：ＦＡ条件（カラム；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ ２５０＊５０ｍｍ＊１０ｕｍ；移動相：［水（０．２２５％ＦＡ）－ＡＣＮ］；Ｂ％：５５％～８６％，２１分）を使用し、純粋な生成物を得る。
実施例７．抗体薬物複合体の調製
７．１ 一般的な部位特異的結合
本実施例は、一般には、ペイロードがＱタグを含む抗体に部位特異的ＡＴＤＣ結合するための２つの方法を実証している。ＡＴＤＣ１～３０を、以下の表３にまとめられるように、ＬＰ１～ＬＰ１１及び抗ＧＬＰ１Ｒ抗体ｍＡｂ１～ｍＡｂ１３又はコントロール抗体ｍＡｂ１～ｍＡｂ６で調製した。ＥＳ－ＭＳの結果及び本開示に記載のＡＤＣのＤＡＲ値を表３にまとめる。
７．２ 一般的な二段階結合プロトコール
この方法は、図５４に示されている二段階プロセスを含む。第１の工程は、例えばアジド－ＰＥＧ３－アミンといった小分子アミンなどの第１のリンカー（Ｌａ）の抗体への微生物トランスグルタミナーゼ（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ、ＭＴＧ）媒介性結合であり、抗体鎖の潜在的な架橋を防止するために過剰なアミン試薬を使用する。第２の工程は、歪み促進型アジド－アルキル付加環化（ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ａｚｉｄｅ－ａｌｋｙｎｅ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ、ＳＰＡＡＣ）によって、アジドタグ化複合体にアルキン結合ペイロードリンカーペイロード（ＬＰ）を結合する。
一般的な手順は以下のとおりである。
工程１：２つのアジド基を含有する部位特異的アジド官能化抗体薬物複合体の作製
Ｑタグを含有する抗ＧＬＰ１ＲヒトＩｇＧ抗体又はアイソタイプコントロール抗体を、１００～２００モル当量のアジド－ＰＥＧ３－アミン（Ｌ１，分子量２１８．２６ｇ／ｍｏｌ）と混合した。得られた溶液と、トランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１ｍｇの抗体あたり１Ｕ ＭＴＧ）を混合し、抗体の最終濃度を１～１０ｍｇ／ｍＬにした。ＥＳＩ－ＭＳで反応を監視しつつ、穏やかに振盪させながら反応混合物を２５～３７℃で４～７２時間インキュベートした。完了時に、過剰なアミンとＭＴＧをサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）又はプロテインＡカラムクロマトグラフィーにより除去した。複合体をＵＶ－Ｖｉｓ、ＳＥＣ及びＥＳＩ－ＭＳにより特性評価した。アジドリンカー結合抗体（Ａｂ－Ｎ３）によって、ＤＡＲ２複合体については４０２Ｄａの質量増加がもたらされた。複合体の単量体純度は９５％超であった。
工程２：アジド官能化抗体（Ａｂ－Ｎ３）とアルキン含有リンカーペイロードとの間の［２＋３］クリック反応による、表１の部位特異的複合体の作製
部位特異的抗体薬物複合体を、ＤＭＳＯ又はＤＭＡ（１０～２０ｍｇ／ｍＬ）といった有機溶媒中に溶解された３モル当量以上のリンカーペイロードを用いて、５～１５％の有機溶媒（ｖ／ｖ）を含有する反応混合物を有するように、２５～３７℃で１～４８時間、穏やかに振盪させながら、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中でアジド官能化抗体（Ａｂ－Ｎ３，１～２０ｍｇ／ｍＬ）をインキュベートすることで調製した。ＥＳＩ－ＭＳで反応を監視した。完了時に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により過剰な量のリンカーペイロード及びタンパク質凝集体を除去した。精製した複合体を濃縮し、滅菌濾過してＵＶ－Ｖｉｓ、ＳＥＣ、ＨＩＣ及びＥＳＩ－ＭＳによって特性評価した。複合体の単量体の純度は９５％超であった。
特定の実施例では、３６ｍｇの重鎖Ｎ末端Ｑタグを含有する抗ＧＬＰ１ＲマウスＩｇＧ抗体 ＣＯＭＰｍＡｂ１を、１５０モル当量のアジド－ＰＥＧ３－アミン（Ｌ１，分子量２１８．２６ｇ／ｍｏｌ）と混合した。得られた溶液と、微生物トランスグルタミナーゼ（１ｍｇの抗体あたり１Ｕ ｍＴＧ，Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を混合し、抗体の最終濃度を４．０ｍｇ／ｍＬとした。ＥＳＩ－ＭＳで反応を監視しつつ、穏やかに振盪させながら反応混合物を３７℃で１８時間インキュベートした。完了時に、過剰なアミンとｍＴＧをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により除去した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の濃縮された部位特異的抗体であるアジド複合体（２．９ｍｇ／ｍＬ）を、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中の５モル当量のリンカーペイロード（ＬＰ４）と混合した。追加のＤＭＳＯを１０％の総ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）に加え、溶液を穏やかに振盪させながら、２５℃で２２時間静置した。ＥＳＩ－ＭＳで反応を監視した。完了時に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により過剰な量のリンカーペイロード及びタンパク質凝集体を除去した。精製した複合体を濃縮し、滅菌濾過してＵＶ－Ｖｉｓ、ＳＥＣ、ＨＩＣ及びＥＳＩ－ＭＳによって特性評価した。複合体の単量体純度は９９．７であった。薬物結合抗体）によって、ＤＡＲ２複合体については５９３１Ｄａの質量増加がもたらされた。
Ｓ７．３ 一般的な一段階結合プロトコール
本方法は、図５５に示される、抗体へのリンカーペイロード（ＬＰ）の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）媒介性結合を含む。
一般的な手順は以下のとおりである。
Ｑタグを含有する抗ＧＬＰ１ＲヒトＩｇＧ抗体又はアイソタイプコントロール抗体を、１０～２０モル当量のリンカーペイロード（ＬＰ１１，分子量１９７９．２４ｇ／ｍｏｌ）と混合した。トリス－ＨＣｌを加え、ｐＨを約７．４に上昇させた。得られた溶液と、トランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１ｍｇの抗体あたり１Ｕ ＭＴＧ）を混合し、抗体の最終濃度を１～１０ｍｇ／ｍＬにした。ＥＳＩ－ＭＳで反応を監視しつつ、穏やかに振盪させながら反応混合物を２５～３７℃で４～７２時間インキュベートした。完了時に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により過剰な量のリンカーペイロード及びタンパク質凝集体及びＭＴＧを除去した。精製した複合体を滅菌濾過し、ＵＶ－Ｖｉｓ、ＳＥＣ、ＨＩＣ及びＥＳＩ－ＭＳによって特性評価した。複合体の単量体の純度は９５％超であった。
特定の実施例では、１．５ｍｇの重鎖Ｎ末端Ｑタグを含有する抗ＧＬＰ１ＲヒトＩｇＧ抗体 ｍＡｂ６を、１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中で１５モル当量のリンカーペイロード（ＬＰ１１）と混合した。さらなるＤＭＳＯを合計１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）を加え、その後１Ｍ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８）により、トリス濃度を２５ｍＭ（ｐＨ＝約８）とした。得られた溶液と、トランスグルタミナーゼ（Ｚｅｄｉｒａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１ｍｇの抗体あたり１Ｕ ＭＴＧ）を混合し、抗体の最終濃度を３．０ｍｇ／ｍＬにした。溶液を穏やかに振盪させながら、３７℃で２３時間静置した。ＥＳＩ－ＭＳで反応を監視した。完了時に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により過剰な量のリンカーペイロード及びタンパク質凝集体及びＭＴＧを除去した。精製した複合体を濃縮し、滅菌濾過してＵＶ－Ｖｉｓ、ＳＥＣ、ＨＩＣ及びＥＳＩ－ＭＳによって特性評価した。薬物結合抗体）によって、ＤＡＲ２複合体については３９２４Ｄａの質量増加がもたらされた。
実施例８．ペイロード及びリンカーペイロードのインビトロ特性評価
８．１ ヒトＧＬＰ１Ｒ ｃＡＭＰ累積アッセイ（サイクリックＡＭＰ決定）
細胞ベースのアッセイを使用し、ＧＬＰ１Ｒを刺激するための試験化合物の官能活性を評価した。このアッセイのため、全長ヒトＧＬ－Ｐ１Ｒを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を利用し、ヒトＧＬＰ－１Ｒ刺激の尺度として下流のｃＡＭＰ累積を評価した。このアッセイのため、化合物を、Ｂｒａｖｏ自動液体分注プラットフォームを使用してＰＰ－３８４マイクロプレート中の１μＭの開始濃度でＤＭＳＯ中で５倍段階希釈した。希釈した化合物を、Ｅｃｈｏリキッドハンドラを使用し、ＯｐｔｉＰｌａｔｅｓ（１００ｎＬ／ウェル）に映した。ＨＥＫ２９３／細胞を、３７℃の水浴で解凍し、ＨＢＳＳで２回洗浄しｈＧＬＰ１Ｒてアッセイ緩衝液（ＨＢＳＳ＋５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋５００μＭ ＩＢＭＸ＋０．１％ＢＳＡ）中で再懸濁させた。化合物を加えた後に、続いてＨＥＫ２９３細胞を、１×１０５／ウェル（１０μＬ）で希釈した化合物を含有する３８４ ＯｐｔｉＰｌａｔｅへと播種した。遠心分離後、アッセイプレートを２３℃、３０分間インキュベートした。サイクリックＡＭＰイムノアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ，カタログ番号６２ＡＭ４ＰＥＪ）からのＤ２－ｃＡＭＰ及びｃＡＭＰ抗体を含有する１０μＬの溶解緩衝液を加えることで、反応を終了させた。１時間のインキュベーション後、アッセイプレートを、６６５／６１５ｎｍでＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダで読み取った。ウェルあたりのｃＡＭＰのレベルを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより生じた標準曲線を使用して計算した。活性パーセントを、式（％活性＝１００％＊（ｃＡＭＰレベル－ＬＣ）／（ＨＣ－ＬＣ））に従って計算した。１０点の応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）上に４パラメータのロジスティック方程式からのＥＣ５０値をフィットさせた。
表４に示されるように、試験ペイロード及びリンカーペイロードは、３９ｐＭ～１１ｎＭを超える範囲のＥＣ５０値を有するｃＡＭＰ活性化を実証し、大部分は１ｎＭ未満のＥＣ５０値を有するＧＬＰ１Ｒを刺激した。参照化合物であるＧＬＰ１は、２８ｐＭのＥＣ５０値を有するｃＡＭＰ活性化を実証した。
８．２ 血漿安定性
本開示のペイロード及びリンカーペイロードの血漿安定性を測定した。このアッセイのため、試験前に、プール凍結血漿（ヒト、マウス及びサル）を冷水又は３７℃の浴で解凍した。血餅が観察された場合には、血漿を４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、後にこれを除去した。必要に応じ、ｐＨを７．４±０．１に調整した。化合物及びポジティブコントロールの調製のため、９０μＬのＤＭＳＯで１０μＬのストック溶液を希釈することで１ｍＭの中間溶液を調製し、９０μＬの超純水で１０μＬのストック溶液を希釈することでポジティブコントロール（プロパンテリン）の１ｍＭ 中間溶液を調製した。その後、１８０μＬの４５％のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏで２０μＬの中間溶液（１ｍＭ）を希釈することで、各化合物の１００μＭ投与溶液を調製した。２μＬの投与溶液（１００μＭ）で９８μＬの血漿を添加し、２連で２μＭの最終濃度を得た。続いて、試料を水浴中で３７℃でインキュベートした。４つの設定時点で回収した：（Ａ）２時間の試験については、０分、１０分、３０分、６０分及び１２０分で試料を回収し、（Ｂ）２４時間の試験については、０分、１０分、６０分、２４０分及び１４４０分で試料を回収し、（Ｃ）３日間の試験については、０時間、２４時間、４８時間及び７２時間で試料を回収し、（Ｄ）７日間の試験については、０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間及び１６８時間で回収した。各時点では、４００μＬの停止溶液（５０％のＡＣＮ／ＭｅＯＨ中、２００ｎｇ／ｍＬのトルブタミド＋２００ｎｇ／ｍＬのラベタロール）を加え、タンパク質を沈殿させて完全に混合した。続いて試料プレートを４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた。上清のアリコート（５０μＬ）を各ウェルから移し、１００μＬの超純水と混合した。続いて試料を８００ｒｐｍでおよそ１０分間振盪させ、その後ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。
表５Ａに示されるように、大部分の試験ペイロード及びリンカーペイロードはヒト血漿では非常に安定した状態であり、１日の血漿アッセイでは４８時間超のＴ１／２値、及び７日間の血漿アッセイでは１４日間超のＴ１／２値を有し、参照化合物であるＧＬＰ１は、ヒト血漿中では不安定であり、１０分未満のＴ１／２値を示した。表５Ｂに示されるように、サル血漿中で試験された本開示の１つのリンカーペイロード（ＬＰ１１）は、４９．４時間超のＴ１／２値を有した。マウス血漿安定性について試験された本開示の２つのリンカーペイロード（ＬＰ１１及びＬＰ２３）は、３日間のアッセイでは６日超の、又は２時間のアッセイでは４時間超のＴ１／２値を有した。
以下の表５Ｃは、以下で示される構造を有するリンカーペイロードＬＰ１１についての試験パラメータをまとめた。
８．３ ｈＥＲＧアッセイ
本開示の化合物がｈＥＲＧカリウムチャネル活性に影響するかどうかを決定するため、細胞ベースのアッセイを実施した。このアッセイのため、ｈＥＲＧカリウムチャネルを安定して発現するＣＨＯ細胞を播種し、電気生理学的実験での使用前に、３７℃の湿度があり空気制御されている（５％ＣＯ２）インキュベータ中で少なくとも２日間培養した。続いて細胞をＴｒｙｐＬＥを使用して回収し、生理学的溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，８０ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭグルコース，６０ｍＭ ＮＭＤＧ，ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。試験化合物を水中に溶解し、異なる試験濃度のストック溶液を得た。ストック溶液を外部電気生理学的記録溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１４０ｍＭ ＮａＣｌ，４ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ２，１ｍＭ ＭｇＣｌ２，５ｍＭ グルコース、ｐＨ７．４）へと希釈し、試験用の最終濃度を得た。Ｎａｎｉｏｎ ＳｙｎｃｒｏＰａｔｃｈ ３８４ＰＥ（３８４ウェル自動パッチクランププラットフォーム（内部記録溶液：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１１０ｍＭ ＫＦ，１０ｍＭ ＥＧＴＡ，ｐＨ７．２））を使用して室温で記録を行った。電気生理学的記録に使用される電圧コマンドプロトコールの概略図を図５６に示す。４０μＬのビヒクルを１回加え、続いてベースライン記録期間を３００秒とった。続いて４０μＬの投与量の化合物を各濃度で加えたが、この時の曝露時間は３００秒以下であった。記録は、記録期間中の品質管理に合格するために必要とされる。又はウェルを廃棄し、化合物を再試験し、全てをＰａｔｃｈＣｏｎｔｒｏｌによって自動的に設定する。５つの濃度（０．３μＭ，３μＭ，１０．００μＭ，３０．００μＭ及び１００．００μＭ）を、各化合物及びポジティブコントロール（アミトリプチリン）について試験した。濃度につき、最低でも２回の反復が得られた。ＤａｔａＣｏｎｔｒｏｌ、Ｅｘｃｅｌ２０１３（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０を使用し、データ分析を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５．０でカーブフィッティング及びＩＣ５０値の計算を実施した。試験された最低濃度で得られた阻害が、５０％超又は最高濃度では５０％未満であった場合、ＩＣ５０値は、それぞれ最低濃度未満又は最高濃度よりも高いと報告される。全細胞のｈＥＲＧ電流における試験化合物のＩＣ５０値を表６にまとめた。
８．４ エームスアッセイ
このミニエームス試験の目的は、代謝活性化の存在下及び不在状態で、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＴＡ９８及びＴＡ１００の株のゲノムに復帰突然変異を誘発する能力について、試験物質ＬＰ１１を評価することであった（Ｓ９混合物）。
このミニエームスアッセイは、６つのウェルを使用してネガティブ／溶媒コントロール（ＤＭＳＯ）及び３つのウェルを使用してポジティブコントロール（２μｇ／ウェル ＴＡ９８単独、０．２μｇ／ウェル ＴＡ１００単独又はＳ９の存在下での０．４μｇ／ウェル ＴＡ９８＋ＴＡ１００）とともに、Ｓ９混合物の存在下及び不在状態での試験物質について行った。Ｓ９ミックスの存在下及び不在状態での試験物質について試験された投与量レベルは、ウェルあたり１０００μｇ、４００μｇ、１６０μｇ、６４μｇ、２５μｇ、１０μｇ、４μｇ及び１．５μｇであり、各投与量を三連で試験した。菌株の新しい培養物及び新しい試験物質製剤を使用し、この試験を行った。
試験物質ＬＰ１１については、試験株中のＳ９ミックスの有無にかかわらず、いずれの投与量レベルでも明らかな細胞傷害性は観察されなかった。試験株中のＳ９ミックスの有無にかかわらず、いずれの投与量レベルでも明らかな沈殿（インキュベーション期間後、肉眼による）は観察されなかった。
ＬＰ１１は、２つの株ＴＡ９８又はＴＡ１００においては、Ｓ９ミックスの存在下で、又は不在状態で、同時に行ったネガティブ／溶媒コントロールに関しては、どの投与量レベルでも復帰突然変異体コロニーの平均数の２．０倍を超える増加を誘発しなかった。どの用量反応も観察されなかった。
この試験で使用された両方の試験株については、ネガティブ／溶媒コントロールについて観察された復帰突然変異体コロニーの平均数は、実験室での過去のネガティブコントロールデータに相当する。全てのポジティブコントロールは、同時に行ったネガティブ／溶媒コントロールと比較すると、Ｓ９ミックスの存在下及び不在状態では、復帰突然変異体コロニーの平均数の３倍を超えるという予想された増加を誘発し、それによって株の応答性を確認した。
本アッセイで使用された全ての試験株の遺伝子型を確認した。このミニエームス試験は有効であり、ＬＰ１１は本試験の条件下での変異原性については陰性であったことを結論づけた。
８．５ インビトロＡＤＭＥ
ＬＰのインビトロＡＤＭＥ特性を評価するため、ミクロソーム安定性アッセイを実施して固有クリアランスを決定した。さらに血漿タンパク質結合アッセイを実施して分布能を理解した。結果を以下の表７及び表８に列挙した。
アッセイを実施し、本開示の化合物の血漿タンパク質結合を決定した。このアッセイのため、実験日に血漿を冷水で解凍し、３２２０ｒｐｍで５分間遠心分離にかけて血餅を取り除いた。得られた血漿のｐＨ値を確認した。
９６ウェルの平衡透析装置（カタログ番号１００６）及び１２～１４ｋＤａの分画分子量を有するＨＴＤ ９６ａ／ｂセルロース膜ストリップ（カタログ番号１１０１）をＨＴＤｉａｌｙｓｉｓ ＬＬＣ，Ｇａｌｅｓ Ｆｅｒｒｙ，ＣＴから取得し、透析装置を製造業者による以下の説明書に従って組み立てた（＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｄｉａｌｙｓｉｓ．ｃｏｍ／＞）。
透析については、試験化合物及びコントロール化合物をＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭ ストック溶液を得た。ＤＭＳＯ希釈標準溶液を４００μＭで調製した。添加マトリックスを調製するため、化合物希釈標準溶液（５μＬ）をブランクマトリックス（９９５μＬ）に対して１：２００で加え、完全に混合した。回収の決定に使用するゼロ時間（Ｔ０）試料を調製するため、５０μＬの添加マトリックスのアリコートを試料回収プレートに三連で移した。試料を反対側のブランク緩衝液と直ちに組み合わせ、各ウェルに最終体積が１００μＬである１：１のマトリックス／透析緩衝液（ｖ／ｖ）を得た。これらのＴ０試料に５００μＬの停止溶液を加えた。続いてこれを他の透析後試料とともに、さらなるプロセスまで２～８℃で保存した。透析装置に投入するため、添加マトリックスの１５０μＬのアリコートを各透析ウェルのドナー側に三連で移し、１５０μＬの透析緩衝液をウェルのレシーバ側に投入した。透析プレートを、４時間にわたりゆっくりと（約１００ｒｐｍ）回転する振盪プラットフォーム上で、３７℃、５％のＣＯ２の加湿状態のインキュベータ中に静置した。透析終了時に、試料の５０μＬのアリコートを、透析装置の緩衝液側とマトリックス側の両方から採取した。これらの試料を新しい９６ウェルプレートに移した。各試料を、各ウェル中にて１：１マトリックス／透析緩衝液（ｖ／ｖ）の最終体積が１００μＬに達するように、等量の反対のブランクマトリックス（緩衝液又はマトリックス）と混合した。全ての試料を、内部標準を含有する５００μＬの停止溶液を加えることでさらに処理した。混合物をボルテックスにかけ、４０００ｒｐｍで約２０分間遠心分離にかけた。続いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のため、全ての試料の上清のアリコート（１００μＬ）を取り出した。５０μＬのブランクマトリックスを９６ウェルプレートに移し、５０μＬのブランクＰＢＳ緩衝液を各ウェルに加えることで単一のブランク試料を調製した。ブランク血漿は、ウェルの血漿側で使用された血漿種と一致していなければならない。続いて、透析試料と同様の試料処理方法に従い、内部標準を含有する５００μＬのストップ溶液を加えることで、マトリックスと組み合わせた試料をさらに処理した。
非結合パーセント、結合パーセント、回収パーセントの値を以下の式：
であって、
式中、［Ｆ］は、膜の緩衝液（レシーバ）側での分析物濃度又は分析物／内部標準のピーク領域比であり、［Ｔ］は、膜の緩衝液（ドナー）側での分析物濃度又は分析物／内部標準のピーク領域比であり、［Ｔ０］は、時間０での添加マトリックス試料における分析物濃度又は分析物／内部標準のピーク領域比である、式を使用して計算した。以下の表８には、血漿タンパク質結合アッセイの結果をまとめている。
実施例９．ＧＰＣＲファミリーのメンバーに対するＧＬＰ１Ｒペプチド模倣ペイロード及びリンカーペイロードの活性
インビトロでＧＬＰ１Ｒアゴニストペイロード及びＧＬＰ１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ）の活性を試験するため、細胞ベースのｃＡＭＰ応答性ルシフェラーゼレポーターアッセイを開発した。サイクリックＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）ルシフェラーゼレポーターを発現するヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）を産生した。これは、安定した細胞を産生するために標準的な方法を使用し、Ｍｙｃタグ化全長ヒトＧＬＰ１Ｒ（ＨＥＫ２９３／Ｍｙｃ－ｈＧＬＰ１Ｒ／Ｃｒｅ－Ｌｕｃ細胞株と呼ばれる、アクセス番号ＮＰ＿００２０５３のアミノ酸１～４６３）、全長ヒト胃抑制ポリペプチド受容体（ＧＩＰＲ）（ＨＥＫ２９３／Ｍｙｃ－ｈＧＩＰＲ／Ｃｒｅ－Ｌｕｃ細胞株と呼ばれる、アクセス番号ＮＰ＿０００１５５．１のアミノ酸１～４６６）、全長ヒトグルカゴン様ペプチド２受容体（ＧＬＰ２Ｒ）（ＨＥＫ２９３／Ｍｙｃ－ｈＧＬＰ２Ｒ／Ｃｒｅ－Ｌｕｃ細胞株と呼ばれる、アクセス番号ＮＰ＿００４２３７のアミノ酸１～５５３）又は全長ヒトグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）（ＨＥＫ２９３／Ｍｙｃ－ｈＧＣＧＲ／Ｃｒｅ－Ｌｕｃ細胞株と呼ばれる、アクセス番号ＮＰ＿０００１５１．１のアミノ酸１～４７７）のいずれかを発現する。Ｍｙｃタグを認識する抗体を使用するフローサイトメトリーにより、受容体の細胞表面発現を確認した。
バイオアッセイについては、細胞を、９６ウェル クリアボトムホワイトプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，＃３５６６９３）に、０．１％ＦＢＳを補充した８０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に２０，０００個の細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。ペイロード、リンカーペイロードを含む試験試薬及びポジティブコントロールリガンド［ヒトＧＬＰ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃５３７４）、ヒトＧＩＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２０８４）、ヒトＧＣＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃６９２７）又はヒトＧＬＰ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２２５８）］を、０．１％ＦＢＳを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で段階希釈し、続いて試験される各濃度について、１０μＬ／ウェルで細胞にこれを加えた。プレートを３７℃、５％のＣＯ２で５．５時間、インキュベートした。エンドポイント測定のため、１００μＬ／ウェルのＯｎｅ－Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｅ６０５１）を加え、プレートを室温で５～１０分間維持した。ルシフェラーゼ活性を、発光モードのＥｎｖｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で測定した。相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔ、ＲＬＵ）値を得て、結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ）で非線形回帰を使用して分析した。
表９及び図６Ａ～図６Ｄに示すように、ペイロード及びリンカーペイロードは、３．３２ｐＭ～７１．５ｐＭの範囲のＥＣ５０値により、ＨＥＫ２９３／Ｍｙｃ－ｈＧＬＰ１Ｒ／Ｃｒｅ－Ｌｕｃ細胞株での活性化を実証した。ペイロード及びリンカーペイロードは、評価した他の細胞株では測定可能な活性を実証しなかった。全てのポジティブコントロール参照リガンド（ヒトＧＬＰ１、ＧＩＰ、ＧＬＰ２及びＧＣＧ）は、予想されたとおり、個々の細胞株を活性化した。
実施例１０．インビトロ血漿安定性
ＧＬＰ１ＲアゴニストＰ８を有するＡＴＤＣ抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡＢ２－ＬＰ１１の血漿安定性を決定するため、様々な種に由来する血漿とともにＡＴＤＣをインビトロでインキュベートし、抗体に対する薬物の比（ＤＡＲ）を評価した。抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡＢ２は、ビオチン化抗Ｆｃ抗体である。
プールしたＣ５７ＢＬ／６マウス、カニクイザル（Ｃｙｎｏ）又はＩｇＧ除去ヒト血漿（ＢｉｏＩＶＴ）に、最終濃度５０μｇ／ｍＬまでＡＴＤＣ溶液を添加し、その後、３７℃でＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，カタログ番号２２３１０００５７４）でインキュベートした。０日目、１日目、２日目、３日目及び７日目に１００μＬのアリコートを取り出し、続いて分析まで、これを直ちに－８０℃に凍結して保存した。
ＤＡＲ分析のために、ＤｙｎａＭａｇ－２磁気ラック（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１２３２１Ｄ）を使用し、免疫アフィニティー捕捉により血漿試料からＡＴＤＣを精製した。最初に、ビオチン化抗ヒトＦｃ抗体（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ発生試薬）をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ２８０ストレプトアビジンビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号６０２１０）上に固定化した。ＡＴＤＣを含有する各血漿試料を、穏やかに振盪しながら室温で２時間、０．５ｍｇのビーズとともに９５０ｒｐｍで混合した。続いてビーズを５００μＬのＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（ｐＨ７．４）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，カタログ番号ＢＲ１００１８８）で３回、５００μＬの水で１回及び５００μＬの１０％アセトニトリル水溶液（ＶＷＲ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，カタログ番号ＢＤＨ８３６４０．１００Ｅ）で１回洗浄した。洗浄後、室温で１５分間、アセトニトリル：水＝３０：７０（ｖ／ｖ）中の７０μＬの１％ギ酸でビーズをインキュベートすることで、ＡＴＤＣを溶出した。５０μＬの１０ｍＭ ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ，カタログ番号６４６５４７－１０Ｘ１ＭＬ）を加えることで５０μＬの溶出試料を還元し、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃにて３７℃、２０分これをインキュベートした。
続いて、分離のために０．３ｘ５０ｍｍ １．７μｍ ＢＥＨ３００ Ｃ４カラム（Ｗａｔｅｒｓ，カタログ番号１８６００９２６０）上に還元したＡＴＤＣ試料を注入し、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ）により検出した。使用された流量は１０μＬ／分であった（移動相Ａ：０．１％のギ酸水溶液；移動相Ｂ：０．１％のギ酸アセトニトリル溶液）。ＨＰＬＣ勾配は、移動相Ｂの２５～４０％に対応して３．５～６．５分ＡＴＤＣ溶出した。取得されたスペクトルを、以下のパラメータ：質量範囲：２０～６０ｋＤａ；ｍ／ｚ範囲：８００～２５００Ｄａ；分解度：１．０Ｄａ／チャネル；半値幅：０．８Ｄａ；最小強度比：３３％；最大反復回数：１５で、ＭａｘＥｎｔ１ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してデコンボリューションした。ＤＡＲを、デコンボリューションされたスペクトル中の個々のＤＡＲ種に対応するピーク信号強度に基づいて計算した。
マウス、カニクイザル又はＩｇＧ除去ヒト血漿での７日間のインキュベーション後、抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ２－ＬＰ１１についてＤＡＲの有意な変化は観察されなかった。結果を表１０及び図５７に示す。
実施例１１．ルシフェラーゼレポーターアッセイ
本開示のＧＬＰ１Ｒアゴニストペイロード、ＧＬＰ１Ｒアゴニストリンカーペイロード（ＬＰ）及び抗ＧＬＰ１Ｒ抗体結合薬物複合体（ＡＴＤＣ）の活性を試験するため、細胞ベースのｃＡＭＰ応答性ルシフェラーゼレポーターアッセイを開発した。アッセイ細胞株を産生するため、最小プロモータの上流に位置するｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）の制御下にホタルルシフェラーゼ遺伝子を置き、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。これを本明細書ではＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ細胞と称する。続いてＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ細胞を改変して全長ヒトＧＬＰ１Ｒ（アクセス番号ＮＰ＿００２０５３のアミノ酸１～４６３）を発現させ、これを本明細書ではＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＧＬＰ１Ｒ細胞と称する。
このアッセイのため、アッセイ培地（Ｏｐｔｉｍｅｍ，０．１％ＢＳＡ，１００単位／ｍＬのペニシリン，１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン，２９２μｇ／ｍｌのＬ－グルタミン）中に１０，０００個又は２０，０００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに細胞を播種し、一晩インキュベートした。遊離ペイロード又はＬＰの３倍段階希釈物を１００％ＤＭＳＯ中に調製し、新しいアッセイ培地にこれを移し、０．２％のＤＭＳＯ最終一定濃度で細胞に加えた。プレートの最後のウェルは、アッセイ培地及び０．２％ＤＭＳＯ（未処理のウェル）を含有するブランクコントロールとして機能し、３倍段階希釈物の連続としてこれをプロットした。４～６時間後、各ウェルにＯｎｅ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，カタログ番号Ｅ６１３０）の添加後にルシフェラーゼ活性を決定した。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で相対発光量（ＲＬＵ）を測定し、１２点の用量反応曲線に４パラメータのロジスティック方程式を使用し、ＥＣ５０値を決定した。未処理のウェルにおけるＲＬＵに対する用量反応曲線上の最大ＲＬＵの比を取得することで信号雑音比（Ｓ／Ｎ）を決定した。ＥＣ５０及びＳ／Ｎ値を表１１にまとめる。ペイロード相対力価［（Ｐ８ ＥＣ５０／ペイロードＥＣ５０）＊１００］及び相対Ｓ／Ｎ［（ペイロードＳＮ／Ｐ８ＳＮ）＊１００］を計算するため、各実験での参照標準として機能するＰ８を用いて、いくつかの実験（Ａ，Ｂ及びＤ）についてデータを生成した。
表１１に示されるように、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＧＬＰ１Ｒ細胞においてはペイロード及びリンカーペイロードＥＣ５０値は３．９７ｐＭ～１．９５ｎＭの範囲であり、相対力価（％Ｐ８）は０．３％～１３３．８％の範囲であった。大部分の試験ペイロードは類似の最大活性に到達しており、相対Ｓ／Ｎ値（Ｐ８％）の範囲は６８．６％～１１６．２７％であった。ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＧＬＰ１Ｒ細胞における参照ＣＲＥ依存性ルシフェラーゼ活性及び増加したＣＲＥ依存性ルシフェラーゼ活性にはＧＬＰ１リガンドもまた含まれ、ＥＣ５０は１４．３ｐＭ、相対力価は３７．２％及び相対Ｓ／Ｎは９６．８％であった。試験した全てのアゴニストは、ｈＧＬＰ１Ｒ発現（ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ細胞）が存在しない状態ではルシフェラーゼ活性における影響が最小であり、Ｓ／Ｎ値は１．７以下、ＥＣ５０値は２００．０ｎＭ超であった。
ＧＬＰ１Ｒアゴニストリンカーペイロードを、Ｎ末端重鎖又は軽鎖Ｑタグにより抗ｈＧＬＰ１Ｒ抗体に結合した。得られた抗ＧＬＰ１Ｒ抗体結合薬物複合体（ＡＴＤＣ）のいくつかを、遊離ＧＬＰ１Ｒペイロード及びリンカーペイロードアゴニストについて上記のＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＧＬＰ１Ｒレポーターアッセイにおける活性について試験した。表１２に示されるように、抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣは、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＧＬＰ１Ｒ細胞におけるＣＲＥ依存性ルシフェラーゼレポーター活性を増加させた。ＥＣ５０値は２１．７ｐＭ～１１２ｐＭの範囲であり、相対力価値（％Ｐ８）は１４．５％～１２６％の範囲であった。大部分の試験ＡＴＤＣは類似の最大活性に到達しており、相対Ｓ／Ｎ値（Ｐ８％）の範囲は８７．４％～１５８．４％であった。抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣは、ｈＧＬＰ１Ｒ（ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ）を発現しないレポーター細胞では不活性であった。非結合ＡＴＤＣは、抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣよりも活性が小さい傾向があり、ＥＣ５０値は１．９２ｎＭ～７４．６ｎＭの範囲であり、相対力価値（％Ｐ８）は０．１％～１．４％の範囲であった。結果の選択されたセットを図１０に示す。
別の実験では、抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣ活性に関して競合する非結合抗ＧＬＰ１Ｒ抗体の能力を、ＨＥＫ２９３／ＣＲＥ－Ｌｕｃ／ｈＧＬＰ１Ｒレポーターアッセイで評価した。この実験では、一定量（０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭ又は１００ｎＭ）の非結合抗ＧＬＰ１Ｒ抗体レポーター活性の不在状態又は存在下で、抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣを用量漸増させながらレポーター細胞をインキュベートした。ＥＣ５０値を表１３に報告するが、ＡＴＤＣ単独条件についてのＥＣ５０値での倍率変化（ＥＣ５０倍率変化）を、ＡＴＤＣ＋非結合ｍＡｂのＥＣ５０／ＡＴＤＣ単独でのＥＣ５０といったように計算した。表１３に示されるように、最大１０ｎＭの非結合ｍＡｂ濃度は、抗ＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣ活性における影響が最小であり、ＥＣ５０倍率変化値は１．５以下であった。１００ｎＭの試験非結合抗体の最大濃度は、ＥＣ５０値を４．０倍減少させた。非結合コントロールＡＴＤＣは、非結合抗ＧＬＰ１Ｒ抗体の存在では影響を受けなかった。
実施例１２．食事性肥満ＧＬＰ１Ｒヒト化マウスにおける体重及び血糖への抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ ＡＴＤＣの効果
肥満動物における３つの抗ＧＬＰ１Ｒ抗体結合薬物複合体（ＡＴＤＣ）の体重及び血糖低下効果を決定するため、マウスＧＬＰ１Ｒの代わりにヒトＧＬＰ１Ｒの発現についてホモ接合性であるマウス（ＧＬＰ１Ｒヒト化マウスと称される）を、６ヶ月間、高脂肪飼料（６０％ｋｃａｌ％の脂肪）に設定した。４４匹の９月齢のオスのＧＬＰ１Ｒヒト化マウスを、０日目の体重に基づいて５～８匹のマウスの６つのグループに層別化した。層別化の後、０日目に、各グループに２５ｍｇ／ｋｇのＣＯＭＰ抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ１－ＬＰ４（ｎ＝８）、抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ３－ＬＰ１１（ｎ＝８）、抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ４－ＬＰ１１（ｎ＝５）、コントロール抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ（ｎ＝７）、アイソタイプコントロール ｍＡｂ ＡＴＤＣ（ｎ＝８）又は参照化合物（ｎ＝８）を皮下投与した。
本試験で使用されるコントロール抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂは、任意の薬物結合なしにＧＬＰ１Ｒを活性化させない、又はこれを不活化する高アフィニティー抗ＧＬＰ１Ｒ抗体である。コントロール抗ＧＬＰ１Ｒ抗体は、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用されている米国特許出願公開第２００６０２７５２８８号に開示されている抗体５Ａ１０である。コントロール抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂはＱタグを有さない。ＣＯＭＰ抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ１－ＬＰ４は、Ｎ末端の重鎖Ｑタグを有する同一のコントロール抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂを含む。アイソタイプコントロール ｍＡｂ ＡＴＤＣは、本明細書に記載され、ＧＬＰ１Ｒヒト化マウスにおいてタンパク質に一切結合しない抗体に結合したＧＬＰ１ペプチド模倣薬である。参照化合物は、ＧＬＰ１類似体及びリンカーセグメントにおいてデュラグルチドと同一のアミノ酸配列を有するが、３つの変異（Ｐ１６Ｅ；Ｖ１７Ａ；Ｇ１９インサート）を有するｈＦＣで作製された。
投与後３日目及び７日目、並びに１４日目から５６日目の毎週、動物の体重を記録し、その血糖値を小型のグルコメータを用いて測定した。各時点での０日目の体重における変化パーセントの平均±ＳＥＭを各グループについて計算し、これを表１４に示す。各時点での血糖値の平均±ＳＥＭを各グループについて計算し、これを表１５に示す。２元配置分散分析、続いてボンフェローニ事後検定により統計分析を実施し、コントロール抗体群と他の５つの群と比較した。結果もまた図３９及び図４０に示す。
コントロール抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂを投与した動物では、名目上の取扱い（すなわち、採血、ケージの変更）に関する変動とともに、体重及び血糖値は安定していた。コントロール抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ群の動物と比較すると、アイソタイプコントロール ｍＡｂ ＡＴＤＣを投与した動物は、体重変化パーセント又は血糖値に関しては有意な差はなかった。参照化合物を投与した動物では、３日目及び７日目に体重減少が観察されたが、グルコースは３日目にのみ減少した。抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ ＡＴＤＣを投与した動物では、体重減少は、どのＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣが投与されたかに応じて４２日間、５６日間及び２８日間継続したが、グルコースは試験した全てのＧＬＰ１Ｒ ＡＴＤＣについて７日間減少した。
結論としては、試験した３つの抗ＧＬＰ１Ｒ ｍＡｂ ＡＴＤＣの単回投与によって、肥満動物においては長期間の体重減少がもたらされた。
参考文献：
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９．米国特許出願公開第２００６／４２２２号
１０．Ｓｕｒｅｓｈｂａｂｕ，Ｖ．Ｖ．；Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎａｒａｏ，Ｒ．；Ｎａｉｋ，Ｓ．Ａ．；Ｇ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｅｔｒａｚｏｌｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｕｓｉｎｇ Ｆｍｏｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ｆｒｅｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００７，４８，７０３８－７０４１
１１．Ｃｅｒｅｔｔｉ，Ｓ．；Ｌｕｐｐｉ，Ｇ．；Ｐｏｌ，Ｓ．Ｄ．；Ｆｏｒｍａｇｇｉｏ，Ｆ．；Ｃｒｉｓｍａ，Ｍ．；Ｔｏｎｉｏｌｏ，Ｃ．；Ｔｏｍａｓｉｎｉ，Ｃ．Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｒｅｔｒｏ－Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４，４１８８－４１９６
１２．国際公開第２０１０／０５２２５３号
１３．米国特許出願公開第２００３／１１４６６８号
１４．Ｃｏｌｏｂｅｒｔ，Ｆ．；Ｍａｚｅｒｙ，Ｒ．Ｄ．；Ｓｏｌｌａｄｉｅ，Ｇ．；Ｃａｒｒｅｎｏ，Ｍ．Ｃ．；Ｆｉｒｓｔ Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ（－）－Ｃｅｎｔｒｏｌｏｂｉｎｅ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００２，４，１７２３－１７２５
１５．Ｄｏｎｄｏｎｉ Ａ．；Ｍａｓｓｉ，Ａ．；Ａｌｄｈｏｕｎ，Ｍ．Ｈａｎｔｚｓｃｈ－Ｔｙｐｅ Ｔｈｒｅｅ－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ａ Ｎｅｗ Ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃ－Ｇｌｙｃｏｓｙｌｍｅｔｈｙｌ Ｐｙｒｉｄｙｌａｌａｎｉｎｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，７２，７６７７－７６８７
１６．Ｂｅｒｅｚｏｗｓｋａ，Ｉ．；Ｃｈｕｎｇ，Ｎ．Ｎ．；Ｌｅｍｉｅｕｘ，Ｃ．；Ｗｉｌｋｅｓ，Ｂ．Ｃ．；Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｗ．Ａｇｏｎｉｓｔ ｖｓ Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ δ Ｏｐｉｏｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ Ｐｌａｃｅ ｏｆ Ｔｙｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，６９４１－６９４５
１７．米国特許出願公開第２０１５／３８０６６６号
１８．Ｃａｍｐｂｅｌｌ－Ｖｅｒｄｕｙｎ，Ｌ．Ｓ．；Ｍｉｒｆｅｉｚｉ，Ｌ．；Ｓｃｈｏｏｎｅｎ，Ａ．Ｋ．；Ｒｕｄｉ Ａ．Ｄｉｅｒｃｋｘ，Ｒ．Ａ．；Ｅｌｓｉｎｇａ，Ｐ．Ｈ．；Ｆｅｒｉｎｇａ，Ｂ．Ｌ．Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ｃｏｐｐｅｒ－Ｆｒｅｅ ”Ｃｌｉｃｋ” Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ １８Ｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｂｏｍｂｅｓｉｎ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１１，５０，１１１１７－１１１２０
１９．Ｃｒｉｃｈ，Ｄ．；Ｓａｎａ，Ｋ．；Ｇｕｏ，Ｓ．Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ２，４－Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅｓ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００７，９，４４２３－４４２６．
２０．Ｗｕ，Ｘ．Ｙ．；Ｓｔｏｃｋｄｉｌｌ，Ｊ．Ｌ．；Ｐａｒｋ，Ｐ．Ｋ．；Ｓａｍｕｅｌ Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ，Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ｉｓｏｎｉｔｒｉｌｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｉｄａｔｉｏｎｓ：Ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ Ｓｔｅｒｅｏｓｕｂｔｌｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｍａｃｒｏｌａｃｔａｍ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｓｅｃｏ－Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，２３７８－２３８４
２１．Ｄｕ，Ｊ．Ｊ．；Ｇａｏ，Ｘ．Ｆ．；Ｘｉｎ，Ｌ．Ｍ．；Ｌｅｉ，Ｚ．；Ｌｉｕ，Ｚ．；ａｎｄ Ｇｕｏ，Ｊ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｖｉａ Ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ω－Ａｓｐ ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ ｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１６，１８，４８２８－４８３１．
２２．Ｎａｕｍｏｖｉｃｈ，Ｙ．Ａ．；Ｇｏｌｏｖａｎｏｖ，Ｉ．Ｓ．；Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ，Ａ．Ｙ．；Ｌｏｆｆｅ，Ｓ．Ｌ．Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＨＯ－Ａｃｉｄｓ ｔｏ Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（ｏｘｙ）ｅｎａｍｉｎｅｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，Ｓｃｏｐｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１７，４１，６２０９－６２２７．
＊ ＊ ＊
本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく、上記の主題において様々な変更を行うことが可能であることから、上記の説明に含まれる、又は添付の特許請求の範囲に定義される全ての主題は、本開示の説明的及び例示的なものとして解釈されることが意図される。上記の教示に照らして、本開示の多くの修正及び変形が可能である。したがって、本明細書は、添付の特許請求の範囲に含まれる全てのそのような代替形態、修正形態及び変形形態を包含することを意図している。
本明細書中に引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献及び他の材料は、あたかも本明細書中に物理的に存在するかのように、本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体が援用される。

Claims (106)

  1. 式（Ａ）
    ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）、
    の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
    ＢＡが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    Ｌが、非切断型リンカーであり、
    Ｐが、

    からなる群から選択される構造を有するペイロードであって、
    式中、

    が、前記ペイロードがＬに結合する箇所であり、
    Ｘ１が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ２が、

    から選択され、
    Ｘ３が、結合、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨであって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、結合、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨから選択され、
    ｎが、０又は１であり、
    Ｘ４が、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
    Ｘ５が、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び

    から選択され、
    Ｘ６が、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
    Ｘ７が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ８が、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び

    から選択され、
    Ａｒが、

    から選択され、
    Ｘ９が、－ＮＨ２、

    から選択され、
    ｍが、１～４の整数である、ペイロードである、化合物又は薬学的に許容されるその塩。
  2. 式（Ｉ）
    ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）
    の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
    ＢＡが、抗体又はその抗原結合断片であり、
    Ｌが、非切断型リンカーであり、
    Ｐが、

    からなる群から選択される構造を有するペイロードであって、
    式中、

    が、前記ペイロードがＬに結合する箇所であり、
    Ｘ１が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ２が、

    から選択され、
    Ｘ３が、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、
    ｎが、０又は１であり、
    Ｘ４が、Ｈ及びフェニルから選択され、
    Ｘ５が、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び

    から選択され、
    Ｘ６が、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
    Ｘ７が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ８が、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び

    から選択される、ペイロードである、
    化合物又は薬学的に許容されるその塩。
  3. ＢＡが、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片である、請求項１又は２に記載の化合物。
  4. 前記ＧＬＰ１Ｒ標的抗体がＧＬＰ１Ｒアゴニスト抗体である、請求項３に記載の化合物。
  5. 前記ＧＬＰ１Ｒ標的抗体が、５Ａ１０、９Ａ１０、ＡＢ９４３３－Ｉ、ｈ３８Ｃ２、ＰＡ５－１１１８３４、ＮＬＳ１２０５、ＭＡＢ２８１４、ＥＰＲ２１８１９又はグルタズマブである、請求項４に記載の化合物。
  6. リンカーＬが、前記ＢＡの一方又は両方の重鎖に結合される、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. リンカーＬが、前記ＢＡの一方又は両方の重鎖可変ドメインに結合される、請求項６に記載の化合物。
  8. リンカーＬが、前記ＢＡの一方又は両方の軽鎖に結合される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
  9. リンカーＬが、前記ＢＡの一方又は両方の軽鎖可変ドメインに結合される、請求項８に記載の化合物。
  10. リンカーＬが、グルタミン残基を介してＢＡに結合される、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
  11. 前記グルタミン残基が、前記ＢＡの一方又は両方の重鎖のＮ末端に導入される、請求項１０に記載の化合物。
  12. 前記グルタミン残基が、前記ＢＡの一方又は両方の軽鎖のＮ末端に導入される、請求項１０又は１１に記載の化合物。
  13. 前記グルタミン残基が、前記ＢＡのＣＨ２又はＣＨ３ドメイン中に天然に存在する、請求項１０に記載の化合物。
  14. 前記グルタミン残基が、１つ以上のアミノ酸を修飾することで前記ＢＡに導入される、請求項１０に記載の化合物。
  15. 前記グルタミン残基がＱ２９５又はＮ２９７Ｑである、請求項１４に記載の化合物。
  16. リンカーＬがリジン残基を介してＢＡに結合される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物。
  17. 前記抗体又はその抗原結合断片がグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
  18. 前記抗体又はその抗原結合断片が脱グリコシル化されている、請求項１～１６のいずれか一項に記載の化合物。
  19. 前記抗原結合断片がＦａｂ断片である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の化合物。
  20. ｍが１である、請求項１及び３～１９のいずれか一項に記載の化合物。
  21. ｍが２～４の整数である、請求項１及び３～１９のいずれか一項に記載の化合物。
  22. ｍが２である、請求項２０に記載の化合物。
  23. リンカーＬが式（Ｌ’）
    －Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）
    の構造であって、式中、
    Ｌａが、前記ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
    Ｙが、トリアゾールを含む基であり、
    Ｌｐが、存在しない、又はＰに共有結合された第２のリンカーであり、前記Ｌｐが存在しないときにはＹもまた存在しない、構造を有する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の化合物。
  24. Ｙ－Ｌｐが存在しない、請求項２３に記載の化合物。
  25. Ｙが、

    からなる群から選択される構造であって、式中、Ｑは、Ｃ又はＮである、構造を有する、請求項２３に記載の化合物。
  26. Ｌｐが、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを含む、請求項２３又は２４に記載の化合物。
  27. 前記ＰＥＧセグメントが２～３０個のＥＧ単位を含む、請求項２６に記載の化合物。
  28. 前記ＰＥＧセグメントが４～２４個のＥＧ単位を含む、請求項２６又は２７に記載の化合物。
  29. 前記ＰＥＧセグメントが４個のＥＧ単位、又は８個のＥＧ単位、又は１２個のＥＧ単位、又は２４個のＥＧ単位を含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の化合物。
  30. 前記ＰＥＧセグメントが４個のＥＧ単位を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の化合物。
  31. 前記ＰＥＧセグメントが８個のＥＧ単位を含む、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の化合物。
  32. Ｙ－Ｌｐが、

    又はそのトリアゾール位置異性体からなる群から選択される構造であって、
    式中、ｐは１～３６の整数である、構造を有する、請求項２３に記載の化合物。
  33. 前記Ｌｐが、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸を含む、請求項２３又は２４に記載の化合物。
  34. 前記Ｌｐが１～１０個のグリシンを含む、請求項３３に記載の化合物。
  35. 前記Ｌｐが１～６個のセリンを含む、請求項３３に記載の化合物。
  36. 前記Ｌｐが１～１０個のグリシンと、１～６個のセリンと、を含む、請求項３３に記載の化合物。
  37. 前記Ｌｐが４個のグリシンと、１個のセリンと、を含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の化合物。
  38. 前記Ｌｐが、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）（配列番号１）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＧ４）（配列番号２）及びＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ－Ｇ４Ｓ）（配列番号３）からなる群から選択される、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の化合物。
  39. 前記Ｌｐが、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の化合物。
  40. セリン残基が炭水化物基を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の化合物。
  41. セリン残基がグルコース基を含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の化合物。
  42. Ｌｐが、

    からなる群から選択される構造であって、
    式中、Ｙがトリアゾールを含む基であり、Ｐがペイロードであり、式中、ＲｃがＨ及びグルコースから選択され、ｇが１～１０の整数であり、ｓが０～４の整数である、構造を有する、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の化合物。
  43. Ｙ－Ｌｐが、


    又はそのトリアゾール位置異性体からなる群から選択される構造を有する、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の化合物。
  44. Ｌａが、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントを含む、請求項２３～４３のいずれか一項に記載の化合物。
  45. 前記ＰＥＧセグメントが４個のＥＧ単位、又は８個のＥＧ単位、又は１２個のＥＧ単位、又は２４個のＥＧ単位を含む、請求項４４に記載の化合物。
  46. 前記ＰＥＧセグメントが８個のＥＧ単位を含む、請求項４５に記載の化合物。
  47. Ｌａが、

    からなる群から選択される構造を有する、請求項２３～４６のいずれか一項に記載の化合物。
  48. Ｌａが、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸を含む、請求項２３～４５のいずれか一項に記載の化合物。
  49. 前記Ｌａが１～１０個のグリシンと、１～６個のセリンと、を含む、請求項４６に記載の化合物。
  50. 前記Ｌａが４個のグリシンと、１個のセリンと、を含む、請求項４６～４９のいずれか一項に記載の化合物。
  51. 前記Ｌａが、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（Ｇ４Ｓ）（配列番号１）、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ＳＧ４）（配列番号２）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（Ｇ２Ｓ－Ｇ２Ｓ－Ｇ２）及びＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（Ｇ４Ｓ－Ｇ４）（配列番号３）からなる群から選択される、請求項４６～５０のいずれか一項に記載の化合物。
  52. Ｌａが、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む、請求項４６に記載の化合物。
  53. 前記Ｌａが、

    からなる群から選択される、請求項４６～５２のいずれか一項に記載の化合物。
  54. Ｌａが－（ＣＨ２）２－２４－鎖を含む、請求項２３～５３のいずれか一項に記載の化合物。
  55. Ｌａが、－（ＣＨ２）２－２４－鎖と、１～３６個のＥＧ単位を有するＰＥＧセグメントと、グリシン、スレオニン、セリン、グルタミン、グルタミン酸、アラニン、バリン、ロイシン及びプロリン、並びにそれらの組合せから選択される１つ以上のアミノ酸との組合せを含む、請求項５４に記載の化合物。
  56. 前記Ｌａが、

    からなる群から選択される、請求項５５に記載の化合物。
  57. Ｐが、構造

    を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の化合物。
  58. Ｘ１がＨであり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－から選択され、ｎが１であり、Ｘ４がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  59. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ５が、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び

    から選択される、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  60. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  61. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ６が各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、Ｘ７がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  62. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であって、式中、Ｔｒがトリアゾール部分である、－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ５が

    である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  63. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ６が各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７が

    であり、Ｘ８が－ＮＨ２である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  64. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ８がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  65. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ６が各発生時にはＨであり、Ｘ７が

    であり、Ｘ８がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  66. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ６が各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７が

    であり、Ｘ８が

    である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  67. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  68. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  69. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ６が各発生時に独立してＨ及び－ＣＨ３から選択され、Ｘ７が

    である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  70. Ｘ１がＨであり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨである、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  71. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ５が

    である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  72. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが０であり、Ｘ４がフェニルであり、Ｘ５が

    である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  73. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、ｎが１であり、Ｘ４がフェニルであり、Ｘ５が

    である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の化合物。
  74. Ｐが、構造

    を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の化合物。
  75. Ｘ１が

    であり、Ｘ２が

    であり、Ｘ３が－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ－であり、Ｘ４がＨであり、Ｘ５が

    である、請求項７４に記載の化合物。
  76. Ｐが、

    からなる群から選択される構造を有する、請求項１～７５のいずれか一項に記載の化合物。
  77. 前記化合物の半減期が血漿中では７日間よりも長い、請求項１～７６のいずれか一項に記載の化合物。
  78. 前記化合物がＧＬＰ１Ｒ以外のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合しない、請求項１～７７のいずれか一項に記載の化合物。
  79. 請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
  80. 請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬剤形。
  81. 請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物を用いて細胞の表面上のＧＬＰ１Ｒを選択的に標的化する方法。
  82. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記細胞がヒト細胞である、請求項８１又は８２に記載の方法。
  84. 前記細胞が膵臓細胞、脳細胞、心臓細胞、血管組織細胞、腎細胞、脂肪組織細胞、肝臓細胞又は筋細胞である、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 方法であって、請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物の有効量、請求項７９に記載の組成物の有効量、又は請求項８０に記載の剤形の有効量を個体に投与することを含む、前記個体でＧＬＰ１Ｒ活性を増強する方法。
  86. 方法であって、請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物の有効量、請求項７９に記載の組成物の有効量、又は請求項８０に記載の剤形の有効量を個体に投与することを含む、前記個体で血糖値を低下させる方法。
  87. 方法であって、請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物の有効量、請求項７９に記載の組成物の有効量、又は請求項８０に記載の剤形の有効量を個体に投与することを含む、前記個体で体重を低下させる方法。
  88. 方法であって、請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物の有効量、請求項７９に記載の組成物の有効量、又は請求項８０に記載の剤形の有効量を個体に投与することを含む、前記個体でＧＬＰ１Ｒ関連症状を治療する方法。
  89. 前記ＧＬＰ１Ｒ関連症状が２型糖尿病、肥満、肝疾患、冠動脈疾患又は腎疾患である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記ＧＬＰ１Ｒ関連症状が２型糖尿病及び／又は肥満である、請求項８８に記載の方法。
  91. 請求項１～７８のいずれか一項に記載の化合物、請求項７９に記載の組成物又は請求項８０に記載の剤形が、皮下に、静脈内に、皮内に、腹腔内に、又は筋肉内に投与される、請求項８１～８９のいずれか一項に記載の方法。
  92. 式（Ａ）
    ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）
    の構造を有する請求項１に記載の化合物を作製する方法であって、前記方法が、
    ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくともｍ個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと、少なくともｍ当量の化合物Ｌ－Ｐとを接触させる工程と、
    ｂ）前記作製された式（Ａ）の化合物を単離する工程と、
    を含む、方法。
  93. 式（Ｉ）
    ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）
    の構造を有する請求項２に記載の化合物を作製する方法であって、前記方法が、
    ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも１個のグルタミン残基Ｇｌｎを含むＢＡと化合物Ｌ－Ｐとを接触させる工程と、
    ｂ）作製された式（Ｉ）の化合物を単離する工程と、
    を含む、方法。
  94. 式（Ａ）
    ＢＡ－（Ｌ－Ｐ）ｍ （Ａ）
    の構造を有する請求項１に記載の化合物であって、式中、前記リンカーＬが、式（Ｌ’）
    －Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）
    の構造であって、
    式中、Ｌａが、ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
    Ｙが、トリアゾールを含む基であり、
    Ｌｐが、Ｐに共有結合された第２のリンカーである、構造を有する、化合物を作製する方法であって、
    前記方法が、
    ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくともｍ個のグルタミン残基Ｇｌｎを含む前記ＢＡと、アジド又はアルキン部分を含む前記第１のリンカーＬａとを接触させる工程と、
    ｂ）工程ａ）の生成物と、少なくともｍ当量の化合物Ｌｐ－Ｐとを接触させる工程であって、前記第２のリンカーＬｐがアジド又はアルキン部分を含み、Ｌａ及びＬｐは反応してトリアゾールを作製することが可能である、工程と、
    ｃ）作製された式（Ａ）の化合物を単離する工程と、
    を含む、方法。
  95. 式（Ｉ）
    ＢＡ－Ｌ－Ｐ （Ｉ）
    の構造を有する請求項２に記載の化合物であって、式中、前記リンカーＬが、式（Ｌ’）
    －Ｌａ－Ｙ－Ｌｐ－ （Ｌ’）
    の構造であって、
    式中、Ｌａが、ＢＡに共有結合された第１のリンカーであり、
    Ｙが、トリアゾールを含む基であり、
    Ｌｐが、Ｐに共有結合された第２のリンカーである、構造を有する、化合物を作製する方法であって、
    前記方法が、
    ａ）トランスグルタミナーゼの存在下で、少なくとも１個のグルタミン残基Ｇｌｎを含む前記ＢＡと、アジド又はアルキン部分を含む前記第１のリンカーＬａとを接触させる工程と、
    ｂ）工程ａ）の生成物と、化合物Ｌｐ－Ｐとを接触させる工程であって、前記第２のリンカーＬｐがアジド又はアルキン部分を含み、Ｌａ及びＬｐは反応してトリアゾールを作製することが可能である、工程と、
    ｃ）作製された式（Ｉ）の化合物を単離する工程と、
    を含む、方法。
  96. 式（Ｐ－ＩＢ）、式（Ｐ－ＩＩＢ）及び式（Ｐ－ＩＩＩＢ）

    からなる群から選択される構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
    Ｘ１が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ２が、

    から選択され、
    Ｘ３が、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２から選択され、
    ｎが、０又は１であり、
    Ｘ４が、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
    Ｘ５が、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び

    から選択され、
    Ｘ６が、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
    Ｘ７が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ８が、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び

    から選択され、
    Ａｒが、

    から選択され、
    Ｘ９が、－ＮＨ２、

    から選択され、
    ｍが、１～４の整数である、化合物又は薬学的に許容されるその塩。
  97. 式（ＩＩ）

    の構造を有する化合物並びに薬学的に許容されるその塩であって、
    式中、
    Ｘ１が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ２が、

    から選択され、
    Ｘ３が、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－ＣＨ３から選択されるが、Ｘ３が－ＣＨ３といった条件では、ｎが１であり、少なくとも１個の発生においてＲａが－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
    ｎが、０又は１であり、
    ｍが、０～３の整数であり、
    Ｒａが、各発生時に独立して－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
    Ｘ４が、Ｈ及びフェニルから選択され、
    Ｘ５が、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び

    から選択され、
    Ｘ６が、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
    Ｘ７が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ８が、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び

    から選択される、
    化合物並びに薬学的に許容されるその塩。
  98. Ｐが、

    からなる群から選択される構造を有する、請求項９６に記載の化合物。
  99. 式（Ｃ）

    の構造を有する化合物又は薬学的に許容されるその塩であって、式中、
    Ｌｐが、存在しない、又は

    カルバマート基、シクロデキストリン、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメント、－（ＣＨ２）２－２４－鎖、トリアゾール、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリンから選択される１つ以上のアミノ酸並びにそれらの組合せ、のうちの１つ以上を含むリンカーであり、
    Ｑが、－ＮＨ２、－Ｎ３、

    から選択され、式中、ＡがＣ又はＮである、部分であり、
    Ｘ１が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ２が、

    から選択され、
    Ｘ３が、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２であって、式中、Ｔｒはトリアゾール部分である、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－（ＣＨ２）２－６－Ｔｒ－（ＣＨ２）１－６－ＮＨ２から選択され、
    ｎが、０又は１であり、
    Ｘ４が、－ＮＨ２、－ＯＨ及び－Ｎ（Ｈ）（フェニル）から選択され、
    Ｘ５が、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び

    から選択され、
    Ｘ６が、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
    Ｘ７が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ８が、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び

    から選択され、
    Ａｒが、

    から選択され、
    Ｘ９が、－ＮＨ２、

    から選択され、
    ｍは、１～４の整数である、化合物又は薬学的に許容されるその塩。
  100. 式（ＩＩＩ）

    の構造を有する化合物並びに薬学的に許容されるその塩であって、式中、
    Ｌｐが、存在しない、又は

    カルバマート基、シクロデキストリン、１～３６個の－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－（ＥＧ）単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメント、グリシン、セリン、グルタミン酸、アラニン、バリン及びプロリンから選択される１つ以上のアミノ酸並びにそれらの組合せ、のうちの１つ以上を含むリンカーであり、
    Ｑが、－Ｎ３、

    から選択され、式中、ＡがＣ又はＮである、部分であり、
    Ｘ１が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ２が、

    から選択され、
    Ｘ３が、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２、－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３及び－ＣＨ３から選択されるが、Ｘ３が－ＣＨ３といった条件では、ｎが１であり、少なくとも１個の発生においてＲａが－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
    ｎが、０又は１であり、
    Ｒａが、各発生時に独立してＨ、－ＣＨ３、－（ＣＨ２）２－６－ＮＨ２及び－（ＣＨ２）２－６－Ｎ３から選択され、
    Ｘ４が、Ｈ及びフェニルから選択され、
    Ｘ５が、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＮＨ－ＯＨ及び

    から選択され、
    Ｘ６が、各発生時に独立してＨ、－ＯＨ、－ＣＨ３及び－ＣＨ２ＯＨから選択され、
    Ｘ７が、Ｈ、

    から選択され、
    Ｘ８が、Ｈ、－ＯＨ、－ＮＨ２及び

    から選択される、化合物並びに薬学的に許容されるその塩。

  101. からなる群から選択される構造を有する、請求項９９に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
  102. 抗体薬物複合体であって、

    からなる群から選択される構造又は薬学的に許容されるその塩のペイロードに、必要に応じてリンカーを介して結合されたグルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片を含む、抗体薬物複合体。
  103. グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片と、構造

    を有するペイロードであって、
    式中、

    が、前記ＧＬＰ１Ｒ標的抗体又はその抗原結合断片に直接的に、又はリンカーを介して、前記ペイロードが結合する箇所である、ペイロードとを含む、抗体薬物複合体。
  104. 前記ペイロードが、構造

    を有する、請求項１０３に記載の抗体薬物複合体。
  105. グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）標的抗体又はその抗原結合断片と、構造

    を有するリンカーペイロードであって、
    式中、

    が、前記ＧＬＰ１Ｒ標的抗体又はその抗原結合断片に前記リンカーペイロードが結合する箇所である、リンカーペイロードとを含む、抗体薬物複合体。
  106. 前記リンカーペイロードが、構造

    を有する、請求項１０５に記載の抗体薬物複合体。
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