JP2023536148A - Ｒａａｖウイルス粒子の誘導産生のための安定な細胞株 - Google Patents

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Abstract

本明細書に記載されるものは、ポリヌクレオチド構成体およびその内部にペイロードヌクレオチドがパッケージされたｒＡＡＶウイルス粒子の誘導可能な産生のための安定な細胞株である。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月３０日に出願された米国予備特許出願第６３／０５８，８８７号；２０２０年７月３０日に出願された第６３／０５８，８９４号；２０２０年７月３０日に出願された第６３／０５８，９００号；２０２１年３月３日に出願された第６３／１５６，２３０号；２０２１年３月３日に出願された第６３／１５６，２０７号；２０２１年３月３日に出願された第６３／１５６，２３９号；および２０２１年６月３０日に出願された第６３／２１６，６１５号による優先権を主張する。これらの出願は、参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子導入のための好ましいビークルである。ＡＡＶには、既知の疾病関連性はなく、まれに仮に哺乳類細胞ゲノム中に統合される場合には、分割および非分割細胞に感染し、および感染された細胞の生存中は、転写的に活性な核エピソームである。ＦＤＡは、最近ｒＡＡ遺伝子治療製品を承認しており、および他の多くのｒＡＡＶに基づく遺伝子療法およ遺伝子編集製品が開発中である。
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生するために、最も広く用いられている方法は、複数のプラスミドのヘルパーウイルスを含まない 一過性トランスフェクション、通常は接着細胞株中への三重トランスフェクションである。産生能力を増加させるための、現在進行中の投資があるが、現在のＡＡＶ製造プロセスは効率が悪く高価である。加えて、それらは産生物の変動する質をもたらし、治療ペイロードなどのペイロードの低いカプシド化を伴う。
従って、ｒＡＡ産生物の産生のための改善された方法の必要性がある。そのような解決のためには、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の構成的な発現に起因する宿主の産生細胞への毒性およびアデノウイルス・ヘルパータンパク質の構成的な発現に起因する宿主の産生細胞への毒性に取り組まなければならない。
本明細書で開示されるものは、安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は、条件付きで、その内部に発現可能なペイロードをパッケージ化した組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力がある。
本明細書で更に開示されるものは、安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は、条件付きで、その内部に発現可能なペイロードをパッケージ化した組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する能力があり；およびこの安定な細胞により産生されたウイルス粒子の集団は、別の比較可能なｒＡＡＶウイルス粒子産生細胞により一過性トランスフェクションにより産生されたウイルス粒子の集団よりも均一である。
本明細書で更に開示されるものは、安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は、条件付きで、その内部に発現可能なペイロードをパッケージ化した組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する能力があり；およびウイルス粒子の産生は引き金を引く薬剤の添加により誘導可能である。
本明細書で更に開示されるものは、安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は、条件付きで、その内部に発現可能なペイロードをパッケージ化した組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する能力があり；および細胞内のプラスミドの存在により、ウイルス粒子の産生は条件付きではなくなる。
いくつかの態様では、１つの以上の核酸よりなる組成物であって、以下のものをともに含むもの：（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をエンコードする第一の組み換え核酸配列；および（ｉｉ）１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質をエンコードする第二の組み換え核酸配列であって、前記１つの以上の核酸が哺乳類細胞の核ゲノムに組み込まれているときに、前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／または１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、条件付きで発現可能であり、およびそれにより条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を産生する。いくつかの態様では、前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／または１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質の条件付き発現が、前記１つの以上の核酸中に存在する１つの以上の削除可能な要素により制御される。いくつかの実施形態では、前記１つの以上の削除可能な要素は、１つの以上のイントロンおよび／または１つの以上のエクソンを含む。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え核酸の配列は以下のものをエンコードする：ａ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分；ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分；ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分およびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分の間の削除可能な要素；およびｄ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質コーディング配列。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は以下のものを含む：ａ）第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント；ｂ）検出可能なマーカーのコーディング配列を含む第二のスペーサーセグメント；およびｃ）第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメントであって、前記第一のスペーサーセグメントおよび第三のスペーサーセグメントは、哺乳類細胞に内在性の細胞機構により削除可能である能力を有する。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、５’から３’方向に、以下のものを含む：ａ）５’スプライス部位；ｂ）第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント；ｃ）以下のものを含む第二のスペーサーセグメント：ｉ）第一のｌｏｘ配列；ｉｉ）３’スプライス部位；ｉｉｉ）エクソン；ｉｖ）停止シグナル配列；およびｖ）第二のｌｏｘ配列；およびｄ）第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメント。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーは、発光性マーカー、放射性標識または蛍光マーカーであり、随意的に、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙである蛍光マーカーである。いくつかの実施形態では、ａ）前記第一のスペーサーセグメントは、配列番号：１に少なくとも８０％相同の核酸配列を含み；および／または 前記第二のスペーサーセグメントは、配列番号：２；に少なくとも８０％相同の核酸配列を含み：および／またはｃ）前記第三のスペーサーセグメントは、配列番号：３；に少なくとも８０％相同の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは、Ｃｒｅポリペプチドにより削除される能力を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現、および／またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の発現は野生型のプロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、ａ）前記野生型のプロモーターＰ５および／またはＰ１９がＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現を駆動し；および／または前記野生型のプロモーターＰ４０が、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、前記第二の組み換え核酸配列は以下のものをエンコードする：ａ）１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質；ｂ）条件付きでの自己を削除する要素；ｃ）誘導可能なプロモーター。ここで、哺乳類細胞の核ゲノムにいったん組み込まれると、前記１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列の発現は、前記条件付きで自己を削除する要素および前記誘導可能なプロモーターの制御下におかれる。いくつかの実施形態では、前記１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質は、Ｅ２ＡおよびＥ４を含む。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素は、好適には組み換えポリペプチド、より好適にはＣｒｅポリペプチドである、ポリペプチドをエンコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素によりエンコードされるポリペプチドは、条件付きで発現可能であり、および引き金を引く薬剤の存在下でのみ発現される。いくつかの実施形態では、前記引き金を引く薬剤は、ホルモン、好適にはタモキシフェンである。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、Ｔｅｔを誘導可能なプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記第二の組み換え核酸配列は、更にＴｅｔ応答性活性化タンパク質、好適にはＴｅｔ－ｏｎ－３Ｇをエンコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ活性化タンパクは、Ｅ１αプロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記第二の組み換え核酸配列は、配列番号：１１または配列番号：１２に対し、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９９％の相同性、または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、前記１つの以上の核酸は、ＶＡ ＲＮＡ配列をエンコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現は構成的である。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現は誘導可能である。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ配列は、ＶＡ ＲＮＡ内部プロモーターに、好適にはＧ１６ＡおよびＧ６０Ａに１つの以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現は、Ｅ１αプロモーターまたはＵ６プロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現はＵ６プロモーターにより駆動され、ここでＵ６プロモータは以下のものを含む：ａ）Ｕ６プロモーター配列の第一の部分、ｂ）スタッファー配列、およびｃ）Ｕ６プロモーター配列の第二の部分であって、前記スタッファー配列は、Ｃｒｅポリペプチドにより削除可能な能力を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれる。いくつかの実施形態では、血清型はＡＡＶ５であり、およびＣａｐタンパク質は、１つの以上の変異または挿入を含む。いくつかの実施形態では、前記１つの以上の組み換え核酸は、更にペイロードをエンコードする第三の組み換え核酸配列をエンコードし、随意的にこのペイロードは：（ａ）ＲＮＡ編集のためのガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質指向ＤＮＡ編集のためのガイドＲＮＡ、ｔＲＮＡ サプレッサー、または置換遺伝子療法のための遺伝子；または（ｂ）治療的抗体またはワクチン免疫原等のタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記１つの以上の組み換え核酸は、１つ以上の哺乳類細胞選択要素を含む。いくつかの実施形態では、前記１つの以上の哺乳類細胞選択要素は、抗生物質抵抗性遺伝子、随意的にブラストサイジン抵抗性遺伝子をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記１つの以上の哺乳類細胞選択要素は、活性タンパク質、好適にはＤＨＦＲをエンコードする栄養要求性の選択要素である。いくつかの実施形態では、前記１つの以上の哺乳類細胞選択要素は、第一の栄養要求性の選択要素であり、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列からの、第二の不活性タンパク質の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記第一の栄養要求性の選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒ（配列番号：５）活性をエンコードし、および／または前記第二の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ（配列番号：４）をエンコードする。いくつかの実施形態では、ａ）前記第一の組み換え核酸は、抗生物質抵抗性遺伝子、好適にはブラストサイジン抵抗性遺伝子をエンコードする哺乳類細胞選択要素を含み；およびｂ）ｉ．前記第二の組み換え核酸は、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列からの第二の不活性タンパク質の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードする第一の栄養要求性選択要素を含み、およびｉｉ．第三の組み換え核酸は、活性のために、第一の栄養要求性選択コーディング配列からの、第一の不活性タンパク質の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードする第二の栄養要求性選択要素を含み；および（ｉ）または（ｉｉ）においては、第一の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒ（配列番号：５）をエンコードし、前記第二の栄養要求性選択要素は、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ（配列番号：４）をエンコードするか、または第一の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ（配列番号：４）をエンコードし、および第二の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒ（配列番号：５）をエンコードする。
いくつかの態様では、本明細書で開示されるものは、哺乳類細胞であり、この細胞の核ゲノムは複数の統合された組み換え核酸構成物を含み、これは一緒になって組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子をエンコードし、ここでｒＡＡＶウイルス粒子は、条件付きで前記細胞から発現される。いくつかの実施形態では、前記複数の統合された組み換え核酸構成物は、上記の実施形態の内の任意の１つからの、１つの以上の組み換え核酸を含み、ここで前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／またはアデノウイルス・ヘルパータンパク質は、前記細胞から条件付きで発現される。いくつかの実施形態では、前記細胞株は、アデノウイルス・ヘルパータンパク質Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。いくつかの実施形態では、前記複数の統合された組み換え核酸構成体は以下のものを含む：（ｉ）第一の統合された組み換えポリヌクレオチド構成体であって以下を含むもの：ａ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分；ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分；ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分およびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分の間の削除可能な要素であって、この削除可能な要素が以下のものを含むもの：ｉ）第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント；ｉｉ）検出可能なマーカーのコーディング配列を含む第二のスペーサーセグメントであって、この第二のスペーサーセグメントは、Ｃｒｅポリペプチドにより削除可能な；およびｉｉｉ）第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメント；およびｄ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質コーディング配列であって；このＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質は、野生のプロモーターＰ５、Ｐ１９、およびＰ４０により駆動され；（ｉｉ）第二の統合された組み換えポリヌクレオチド構成体であって以下を含むもの：ａ）条件付きで発現可能なＶＡ ＲＮＡコーディング配列であって、ＶＡ ＲＮＡ内部プロモーターに変異を含み、前記ＶＡ ＲＮＡの発現はＵ６プロモーターにより駆動され、随意的に前記ＶＡ ＲＮＡ配列は、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａ変異を含み；ｂ）１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質はＥ２ＡおよびＥ４であり；ｃ）核に転座するＣｒｅポリペプチドをエンコードする条件付きで自己削除可能な要素は、タモキシフェンである引き金を引く薬剤の存在下でのみ自己削除し、およびｄ）誘導可能なプロモーターはＴｅｔ誘導可能プロモーターであり、前記１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列は、前記条件付きで自己削除する要素および誘導可能なプロモーターの制御下にあり；および（ｉｉｉ）第三の統合されたポリヌクレオ構成体は、ペイロードのエンコードを含み、このペイロードはポリヌクレオチドのペイロードである。
いくつかの態様では、ｒＡＡＶウイルス粒子の集団を産生する方法は以下のものを含む：（Ａ）態様３６～３９の中の任意の１つの細胞を、ｒＡＡＶウイルス粒子の発現を可能にする条件で培養し；および（ｂ）ｒＡＡＶウイルス粒子を細胞培養物から単離すること。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルスゲノム（ＶＧ）のウイルス粒子（ＶＧ：ＶＰ）への予備精製の比率は０．５より大きい。いくつかの実施形態では、前記細胞により産生されるｒＡＡＶウイルス粒子の集団は以下のものを有する：（ａ）ウイルスゲノムの形質導入に対する約５００対１～１対１の比；および／または（ｂ）ベクターゲノム対感染性ユニットの１００：１の比。
いくつかの態様では、上記の実施形態の任意の１つの細胞を調製する方法は、以下のものを含む：ｉ）哺乳類細胞および上記の実施形態の任意の１つの、１つの以上の核酸を提供すること；ｉｉ）上記の実施形態の任意の１つの、１つ以上の核酸を前記哺乳類細胞の核ゲノムに統合すること。
いくつかの態様では、先行する実施形態の任意の１つの方法により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子の集団。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子の感染性が、１００００のＭＯＩ（感染の多重性）において、少なくとも５０％である。
いくつかの実施形態では、先行する実施形態の任意の１つによる薬剤として使用するための、随意的には単一遺伝子疾患を治療するための、ｒＡＡＶウイルス粒子の集団を含む薬学的組成物。いくつかの実施形態では、上記の実施形態の任意の１つによるｒＡＡＶウイルス粒子の集団またはまたは上記の実施形態の任意の１つのによる薬学的組成物であって、薬剤として、随意的に単一遺伝子の疾患に使用するもの。いくつかの実施形態では、先行する実施形態の任意の１つによる使用のための、ｒＡＡＶウイルス粒子の集団または薬学的組成物であって、このｒＡＡＶウイルス粒子が、４×１０１４またはそれ未満の用量で投与されるもの。
本明細書で更に提供されるものは、以下を含む細胞である：ａ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のための第一のポリヌクレオチド構成体コーディング；ｂ）１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド構成体であって、哺乳類細胞の核ゲノムに前記１つの以上の核酸が統合されるときに、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／または１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、条件付きで発現可能であり、およびそれにより条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する。
いくつかの実施形態では、前記第二のポリヌクレオチド構成体は、以下のものをコーディングする配列を含む：ａ）１つの以上のヘルパータンパク質；ｂ）１つの以上のヘルパータンパク質の上流の自己を削除する要素；およびｃ）自己を削除する要素の上流の誘導可能なプロモーター。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素は前記誘導可能なプロモーターに操作可能にリンクされている。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素の発現は、前記誘導可能なプロモーターにより駆動される。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、テトラサイクリン応答性プロモーター要素（ＴＲＥ）である。いくつかの実施形態では、前記ＴＲＥは、最小プロモーターに融合したＴｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列を含む。いくつかの実施形態では、最小プロモーターは、ヒトのサイトメガロウイルスのプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２２に対して含む。いくつかの実施形態では、活性化因子との結合によって、誘導可能なプロモーターにより転写が活性化される。いくつかの実施形態では、前記活性化因子は、前記誘導可能なプロモーターに、第一の引き金を引く薬剤の存在下で結合する。いくつかの実施形態では、前記第二のポリヌクレオチド構成体は、更に活性化因子をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記活性化因子は、操作可能に構成的プロモーターとリンクされている。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、Ｅ１αプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記Ｅ１αプロモーターは、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を、配列番号：２０に対して含む。いくつかの実施形態では、前記活性化因子は、ＶＰ１６転写活性化ドメインに融合した、Ｔｅｔリプレッサー結合タンパク質（ＴｅｔＲ）を含む、転写活性化因子（ｒＴＡ）である。いくつかの実施形態では、前記ｒＴＡは、４つの変異をｔｅｔＲ ＤＮＡ結合部分に含む。いくつかの実施形態では、前記ｒＴＡは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を、配列番号：２１に対して含む。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、クミン酸塩オペレーター配列である。いくつかの実施形態では、前記クミン酸塩オペレーター配列は、構成的プロモーターの下流にある。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、第一の引き金を引く薬剤の不在下では、ｃｙｍＲリプレッサーに結合されている。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の引き金を引く薬剤の存在下で活性化される。いくつかの実施形態では、第一の引き金を引く薬剤は、ｃｙｍＲリプレッサーに結合されている。いくつかの実施形態では、第二のポリヌクレオチド構成体は、更にｃｙｍＲリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、前記ｃｙｍＲリプレッサーは、操作可能に構成的プロモーターにリンクされている。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、Ｅ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記Ｅ１αプロモーターは、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を、配列番号：２０に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤はクミン酸塩である。
いくつかの実施形態では、自己を削除する要素の配列コーディングは、ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素は、リコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは、リガンド結合ドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼはＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅポリペプチは、リガンド結合ドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、前記リガンド結合ドメインはホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼはＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素は、第二の引き金を引く薬剤の存在下で核に転座する。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、エストロゲン受容体リガンドである。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）である。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、タモキシフェンである。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは組み換え部位の側面に位置する。いくつかの実施形態では、前記換え部位は、ｌｏｘ部位であるか、またはフリッパーゼ認識ターゲット（ＦＲＴ）部位である。いくつかの実施形態では、前記ｌｏｘ部位は、ｌｏｘＰ部位である。
いくつかの実施形態では、前記１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質は、Ｅ２ＡおよびＥ４を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｅ２Ａは、ＦＬＡＧタグされたＥ２Ａである。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ａをコードする配列およびＥ４をコードする配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａにより分離される。
いくつかの実施形態では、前記第二のポリヌクレオチド構成体は、更に選択可能なマーカーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテイン（ｓｐｌｉｔ ｉｎｔｅｉｎ）であるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテイン（ｓｐｌｉｔ ｉｎｔｅｉｎ）である。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質はピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性である。
いくつかの実施形態では、前記第二のポリヌクレオチド構成体は、更にＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、転写的には不活性な配列である。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ をコーディングする配列は、内部プロモーターに少なくとも２つの変異を有する。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現は、Ｕ６プロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記第二のポリヌクレオチド構成体は、ＶＡ ＲＮＡ 遺伝子配列をコードする配列の上流に、５’から３’に向かって、更に：ａ）Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；ｂ）第一の組み換え部位；ｃ）スタッファー配列；ｄ）第二の組み換え部位；およびｅ）Ｕ６プロモーター配列の第二の部分を有する。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、リコンビナーゼにより削除可能である。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、遺伝子をエンコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
いくつかの実施形態では、第一のヌクレオチド構成体は、以下のものを含む：ａ）Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列；ｂ）Ｒｅｐ遺伝子の第二の部分の配列；ｃ）Ｃａｐ遺伝子の配列；およびｄ）Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列およびＲｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に位置する削除可能な要素。
いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は停止シグナリング配列を含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、ウサギβグロブリンイントロンを含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、エクソンを含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、イントロンおよびエクソンを含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、イントロンを含む。
いくつかの実施形態では、２つのスプライス部位は、Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列およびＲｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に位置する。いくつかの実施形態では、前記２つのスプライス部位は５’スプライス部位および３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、前記５’スプライス部位は、ウサギβグロブリン５’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、前記３’スプライス部位は、ウサギβグロブリン３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、３つのスプライス部位が、Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列およびＲｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に位置する。いくつかの実施形態では、前３つのスプライス部位は５’スプライス部位および３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、第一の３’スプライス部位は、第二の３’スプライス部位の複製である。いくつかの実施形態では、前記第一の３’スプライス部位は、ウサギβグロブリン３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、前記第二の３’スプライス部位は、ウサギβグロブリン３’スプライス部位である。
いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、組み換え部位を含む。いくつかの実施形態では、前記組み換え部位は、ＦＲＴ部位のｌｏｘ部位である。いくつかの実施形態では、前記ｌｏｘ部位は、ｌｏｘＰ部位である。
いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は５’から３’に向かって：
ａ）５’スプライス部位；ｂ）第一の組み換え部位；ｃ）３’スプライス部位；ｄ）停止シグナリング配列；ｅ）第二の組み換え部位；およびｆ）第二の３’スプライス部位を含む。
いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は５’から３’に向かって：
ａ）５’スプライス部位；ｂ）第一のスペーサーセグメント；ｃ）第一のスペーサーセグメントであって、ｉ）第一の組み換え部位ｉｉ）第一の３’スプライス部位；ｉｖ）停止シグナリング配列；およびｖ）第二の組み換え部を含むもの；ならびにｄ）第二のスペーサーセグメントであって、第二の３’スプライス部を含むものを含む。いくつかの実施形態では、前記第一のスペーサーセグメントは、イントロンを含む。いくつかの実施形態では、前記第一のスペーサーセグメントは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を、配列番号：１に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を、配列番号：２に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を、配列番号：３に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントはイントロンを含む。いくつかの実施形態では、前記第一のスペーサーセグメントは内在性の細胞機構により削除される能力を有する。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントはエクソンを含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは、更にポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリＡ配列は、エクソンの３’である。いくつかの実施形態では，前記ポリＡ配列は、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡ配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは５’から３’に向かって：ａ）第一の組み換え部位；ｂ）第一の３’スプライス部位；ｃ）エクソン；ｄ）停止シグナリング配列；およびｅ）第二の組み換え部位を含む。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は、第一のｌｏｘ配列であり、および前記第二の組み換え部位は、第二のｌｏｘ配列である。いくつかの実施形態では、前記第一のｌｏｘ配列は、第一のｌｏｘＰ配列であり、および前記第二の組み換え部位は、第二のｌｏｘＰ配列である。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は、第一のＦＲＴ部位であり、および前記第二の組み換え部位は、第二のＦＲＴ部位である。いくつかの実施形態では、前記停止シグナリング配列は、エクソンの終止コドンであるか、またはポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、前記ポリＡ配列は、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記エクソンは検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーは、発光マーカーであるか、または蛍光マーカーである。いくつかの実施形態では、前記蛍光マーカーは、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙである。
いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントはリコンビナーゼにより削除可能である。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅポリペプチドであるか、フリッパーゼ・ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅポリペプチドは、リガンド結合ドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、前記リガンド結合ドメインはホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐ遺伝子は、Ｃａｐポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐ遺伝子および前記Ｃａｐ遺伝子の転写は、野生型のプロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記野生型のプロモーターは、Ｐ５、Ｐ１９、およびＰ４０を含む。
いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐポリペプチドは、野生型のＲｅｐポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐポリペプチドは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分およびエクソンから発現されたポリペプチドを含む欠失した複製随伴タンパク質は、リコンビナーゼの不在下で発現される能力を有する。
いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐポリペプチドは、野生型のＣａｐポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐポリペプチドは、ＡＡＶカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。いくつかの実施形態では、前記カプシドタンパク質の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれる。
いくつかの実施形態では、前記第一のポリヌクレオチド構成体は、更に選択可能なマーカーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、哺乳類細胞の選択要素である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、栄養要求性の選択要素である。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性の選択要素は、活性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記活性タンパク質はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質はピューロマイシン抵抗性か、またはブラストサイジン抵抗性である。
いくつかの実施形態では、前記第一のポリヌクレオチド構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１～配列番号：３、配列番号６～配列番号：８、または配列番号：３２に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第二のポリヌクレオチド構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：９～配列番号：１９、配列番号２３～配列番号：３２、または配列番号：３５に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第一のポリヌクレオチド構成体および前記第二のポリヌクレオチド構成体は、細胞のゲノムに安定的に統合される。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、更にペイロード構成体を含み、このペイロードはペイロードをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：３３に対して含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロード配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード配列の発現は構成的プロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターおよび前記ペイロードの配列は、ＩＴＲ配列の側面にある。
いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は、遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は選択可能なマーカー、または検出可能なマーカーをコードする。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、治療的ポリペプチドか、または導入遺伝子をコードする。
いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は治療的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記治療的ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡサプレッサーか、またはガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、タンパク質に対して結合する能力を有するポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は触媒的に不活性なＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、前記細胞のゲノム中に安定的に統合される。
いくつかの実施形態では、複数の前記ペイロード構成体は、前記細胞のゲノム中に安定的に統合される。いくつかの実施形態では、前記複数のペイロード構成体は、それぞれ別々に前記細胞のゲノム中に安定的に統合される。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、更に選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする配列をＩＴＲ配列の外部に含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、前記細胞のゲノム中に統合される。
本明細書で更に提供されるものは、上述した細胞の増殖を含む、安定した細胞株を産生する方法である。
本明細書で更に提供されるものは、上述された細胞を、第一の引き金を引く薬剤および第二の引き金を引く薬剤の存在下で培養することを含む、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生方法である。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤は、ドキシサイクリンであり、前記第二の引き金を引く薬剤はタモキシフェンである。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上のカプシド被覆比率を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上のＦ：Ｅ比率を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に、１×１０１１を超えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のミリリットル当たりのウイルスゲノム濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、１×１０５ｖｇ（ウイルスゲノム）／標的細胞の感染多重度（ＭＯＩ）において、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記培養はバイオリアクター中で行われる。
本明細書で更に提供されるものは、前記細胞または上述の方法により産生されるｒＡＡＶウイルス粒子を含む薬学的組成物および薬学的に許容される担体である。本明細書で更に提供されるものは、治療的に有効な量の薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、病的状態または疾患を治療する方法である。
例示的な細胞の、引き金を引く前の状態であり、その中では複数の合成核酸構成体が、核ゲノム中に別々に統合されていることを表現している。この例示的な細胞は、条件付きで、ペイロード（例えば、治療的ポリヌクレオチド）をパッケージする組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有する安定な細胞株を生じさせる。構成体３の括弧は、ＩＴＲ配列の側面にある位置を示す。 図２Ａ－Ｃは、図１からの例示的な実施形態の詳細を表現している。この構成体は、Ｃｒｅの条件付き発現を許容する。引き金を引く前の状態で（図２Ａの最上部）、前記統合された核酸構成体は、Ｃｒｅをコードする配列、およびアデノウイルスＥ２ＡおよびＥ４ヘルパータンパク質をコードする配列を、集合的に、引き金を引く薬剤の添加により活性化される、誘導可能なプロモーターの制御下に有する。他のコーディング要素（哺乳類の選択を許容する活性化因子および遺伝子（哺乳類の選択））は、構成的プロモーター（”ＣＭＶ”プロモーター）の制御下にある。前記Ｃｒｅコーディング要素は、ＬｏｘＰ部位の間に位置し、追加的にエストロゲン応答要素（“ＥＲ２”）に融合し、タモキシフェン等のエストロゲン・アゴニストへの応答によるＣｒｅの局在化に対する制御を許容する。引き金を引く薬剤の添加により、Ｃｒｅが発現され（図２Ａの下部）、およびタモキシフェンの添加により、Ｃｒｅは核に転座する。図２Ｂに示されるように、Ｃｒｅタンパク質の翻訳および核内への転座に続いて、このＣｒｅタンパク質は、それ自身のコーディング配列の削除をもたらし、図２Ｂの下部に示される統合された構成体を残す。図２Ｃに示されるものは、構成体２における随意的な挿入である。この随意的な挿入は、転写的に不活性なＶＡ ＲＮＡ１の変異体（ＶＡ ＲＮ）の発現を駆動する、Ｃｒｅを誘導可能なＵ６プロモーターを含む。特に、このＵ６プロモーターによる駆動は、スタッファー配列の側面に存在するＬｏｘにより２つの部分に分割されている。前記Ｕ６プロモーターは、前記スタッファー配列の存在のために不活性である。Ｃｒｅに媒介されるスタッファー配列の削除は、Ｕ６プロモーターを活性化し、次いでＶＡ ＲＮＡの発現を駆動する。 同上。 同上。 図３Ａ～３Ｂは、構成体１の例示的な実施形態の詳細を表現する模式図である。この構成体は、引き金を引くイベントの後で、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質が、それらの内在性のプロモーターから発現されることを許容する。図３Ａは、統合された核酸構成体の、引き金を引く前の状態を示す。介入するスペーサー（削除可能なスペーサー）が、Ｒｅｐコーディング配列を妨害する。前記削除可能なスペーサーは、第一のスペーサーセグメント、第二の削除可能なスペーサーセグメント（第二の「削除可能な」スペーサーセグメント）、および第三のスペーサーセグメントを含む。前記第二の「削除可能な」スペーサーセグメントは、ＬｏｘＰ部位の側面にあり、３’スプライス部位（３’ＳＳ）の上流にあるＥＧＦＰを含む。引き金を引く前の状態での転写産物が、図の下部に示されている。この引き金を引く前の転写産物は蛍光マーカータンパク質ＥＧＦＰに融合したＡＡＶ Ｒｅｐの５’部分をエンコードする。この引き金を引く前の状態での転写産物は、５’スプライス部位（５’ＳＳ）および３’スプライス部位（３’ＳＳ）が側面にある単一のイントロンを含む。図３Ｂは、引き金を引く前の状態での構成体（模式図の上部）から、細胞核内のＣｒｅへの曝露により、引き金を引いた後の状態（模式図の下部）への転換を示す。Ｃｒｅは、ＥＧＦＰマーカーのコーディング配列および上流の３’スプライス部位（３’ＳＳ）を含む、前記第二の「削除可能な」スペーサーセグメントを削除する。前記第二の「削除可能な」スペーサーセグメントがＣｒｅにより削除されるときに、この構成体は、機能的なＲｅｐおよびＣａｐ転写産物が、それぞれの内在性プロモーターから発現することを可能にする。 同上。 構成体３の例示的な実施形態を表現している。構成体３は、ペイロード（ペイロードポリヌクレオチド）をエンコードする配列を含む。このペイロードポリヌクレオチは、構成的プロモーターの制御下にある。括弧は、側面にあるＩＴＲの位置を示す。示されているように、様々な非制限的な実施形態において、前記ペイロードは、目的のタンパク質、相同性指向修復（例えば、ＨＤＲ相同性領域）のための相同性要素、またはガイドＲＮＡをエンコードする導入遺伝子である。更に示されるものは、哺乳類細胞の中での選択（哺乳類選択）を許容するタンパク質をコードする配列である。 図５Ａは、分割された栄養要求性選択システムの例示的な実施形態を図示し、これは単独の選択圧の下で、２つの統合された核酸構成体の安定な保持を許容する。１つの構成体は、ロイシンジッパータンパク質に融合した、哺乳類のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のＮ－末端フラグメント（“Ｎｔｅｒ－ＤＨＦＲ”）をエンコードする。このＮ－末端フラグメントは、酵素的に非機能的である。他の構成体は、ロイシンジッパータンパク質に融合した、ＤＨＦＲのＣ－末端フラグメント（“Ｃｔｅｒ－ＤＨＦＲ”）をエンコードする。このＣ－末端フラグメントは、酵素的には非機能的である。両方のフラグメントが、細胞中で同時に発現されると、機能的なＤＨＦＲ酵素複合体が、ロイシンジッパータンパク質の会合を介して形成される。両方の構成体は、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠いた（－ＨＴ選択）培地中での生育により、ＤＨＦＲヌル細胞のゲノム中に安定に保持される。 図５Ｂは、引き金を引く前の図１の複数構成体システムにおける、分割された栄養要求性選択デザインの例示的な展開を示す。この実施例では、この分割された栄養要求性選択要素は、構成体１および３において展開される。別々の例示的な抗生物質選択アプローチである、ブラストサイジン抵抗性が構成体２において展開されている。単一の抗生物質であるブラストサイジンを有し、ならびにチミジンおよびヒポキサンチンの両方を欠く培地中での培養により、哺乳類細胞株において、３つの全ての構成体を安定に保持する能力がもたらされた。 タモキシフェンおよび引き金を引く薬剤の添加に続いた、引き金を引いた後の３つの全ての構成体の状態を表している。引き金を引く薬剤の存在下で、アデノウイルスＥ２ＡおよびＥ４ヘルパータンパク質が、発現される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐのコーディング配列が、内在的プロモーターの制御下に発現される。このペイロードは、構成的なプロモーターの制御下に発現される。ペイロードをカプシドで包むｒＡＡＶウイルス粒が、従って産生される。この３つの統合された構成体は、単一の抗生物質（ブラストサイジン）および栄養要求性選択（チミジンおよびヒポキサンチンの両方を欠く培地）により、核ゲノム中に安定に維持される。 図７Ａ－Ｂは、光学および蛍光顕微鏡の画像である。光学顕微鏡画像は左の列に提示されている。緑色蛍光顕微鏡の画像は真ん中の列に提示されている。赤色蛍光顕微鏡の画像は右の列に提示されている。Ｃｒｅタンパク質および赤色蛍光マーカータンパク質を含むＣｒｅビークルの様々な量の添加に続いて、細胞は模擬的にトランスフェクトされる（“Ｍｏｃｋ”）か、構成体１を有するプラスミドに感染される（“ＡＡＶ２ ＣＯＤＥ”）か、またはＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を発現する能力のあるコントロールのＡＡＶ２プラスミドによりトランスフェクトされた（“ＡＡＶ２”）。Ｃｒｅの添加なし（図７Ａ）、構成体１によりトランスフェクトされた細胞だけが、非常に強い緑色の蛍光を示し、Ｒｅｐ－ＥＧＦＰ融合タンパク質の発現を示した（図３Ａの下部を参照）。図７Ｂは、増加するＣｒｅの量の存在下で減少するＥＧＦＰ蛍光を示し、組み換えおよび構成体１からのＥＧＦＰの除去を示す。 同上。 図８Ａ～Ｂは、引き金を引いた後のプラスミド構成体１からのＲｅｐ産生を示すブロットおよびグラフである。図８Ａは、削除可能なスペーサーセグメントのＣｒｅ媒介削除が、引き金を引いた後のプラスミド構成体１からのＲｅｐタンパク質の産生を誘導することを図示するウエスタンブロットを示す。加えて、ウサギβグロブリンイントロンの存在は、Ｒｅｐタンパク質発現の量を妨げない。図８Ｂは、ｐｉｇｇｙｂａｃベクター中でブラストサイジン抵抗性遺伝子（配列番号：８）とクローン化された模式的なＲｅｐ／Ｃａｐポリヌクレオチドを示す。ｐ１９プロモーターの下流に、Ｒｅｐ遺伝子を妨害する削除可能な要素が挿入された。このＧＦＰ量が、親の細胞株（上のＦＡＣＳプロット）と比較して、ＳＴＸＣ００６８細胞株からの細胞中でのＲｅｐ／Ｃａｐ構成体の成功した統合（下のＦＡＣＳプロット）を確定する。ＳＴＸＣ００６８細胞株の細胞密度のグラフ（上のグラフ）および生存能力（下のグラフ）データは、統合されたＡＡＶ配列によるネガティブな効果がなかったことを図示している。親の細胞株、Ｃｒｅ添加後の親の細胞株、ＳＴＸＣ００６８細胞株、Ｃｒｅ添加後のＳＴＸＣ００６８細胞について、左のブロットはＲｅｐタンパク質の産生を示し、および右のブロットは総タンパク質を示す。 同上。 図９Ａは、ＰＫＲ経路の相互作用の模式図を示す。図９Ｂは、ＶＡ ＲＮＡ構成体の略図、および二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造を示すＶＡ ＲＮＡ１の配列を示す。 図１０Ａ～Ｂは、プラスミドの説明（図１０Ａ）および試験（図１０Ｂ）を示しており、この試験は、野生型のＶＡ ＲＮＡ（ｐＨｅｌｐｅｒ）、ＶＡ ＲＮＡノックアウト（ＳＴＸＣ００２）、および補償タンパク質（感染細胞タンパク質３４．５（ＩＣＰ３４．５）；ＳＴＸＣ００１６）を伴うＶＡ ＲＮＡノックアウトを含むＶＡ ＲＮＡを含むこれらのプラスミド構成体に対して、ＶＡ ＲＮＡのＡＡＶ力価へのＶＡ ＲＮＡの効果を評価するために行われた。 図１１Ａ～Ｂは、プラスミドの説明（図１１Ａ）およびこれらのプラスミドの試験（図１１Ｂ）を図示しており、これらのプラスミドは、ＶＡＲＮＡプロモーターの変異体を含んでおり、付着ＨＥＫ２９３細胞中での相対的なＶＡ ＲＮＡ発現が試験された。 図１２Ａ～Ｄは、ＶＡ ＲＮＡ変異体を含む誘導可能なＵ６プロモーターセグメントのデザイン（図１２Ａ）、コントロールおよび試験プラスミドについて、このプラスミドの説明（図１２Ｂ）、およびＬＶ ｍａｘ細胞中での相対的なＶＡ ＲＮＡ発現（図１２Ｃおよび１２Ｄ）を図示しており、誘導可能なプロモーターを有する選択された変異体の救助を描いている。 同上。 図１３Ａ～Ｂは、図１２Ｂに説明される、変異体および誘導可能なＶＡ ＲＮＡ構成体を用いた力価の結果を示すグラフであり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中（図１３Ａ）およびＬＶ Ｍａｘ細胞中（図１３Ｂ）のものを示す。 ＶＡ ＲＮＡ発現のない（ＶＡ ＲＮＡが除去された）ヘルパープラスミドである、ＳＴＸ＿Ｃ００２のプラスミドマップを示す。 ＷＴ ＶＡ ＲＮＡを含むＳＴＸ＿Ｃ００２ヘルパープラスミドバックボーンである、ＳＴＸ＿Ｃ００３２のプラスミドマップを示す。 ＶＡ ＲＮＡが逆の配向にある、ＶＡ ＲＮＡ１ Ｂ１変異体（Ｂ Ｂｏｘから６ヌクレオチドセグメントが除去されている）を含む、ＳＴＸ＿Ｃ００２ヘルパープラスミドバックボーンである、ＳＴＸ＿Ｃ００３３のプラスミドマップを示す。 ＶＡ ＲＮＡ変異Ｇ１６ＡおよびＴ４５Ｃを含み、ＶＡ ＲＮＡが逆の配向にある、ＶＡ ＲＮＡ ＳＴＸ＿Ｃ００２ヘルパープラスミドである、ＳＴＸ＿Ｃ００３６のプラスミドマップを示す。 ＶＡ ＲＮＡ１ Ｂ１変異（Ｂ Ｂｏｘから６ヌクレオチドセグメントを除去）を含むＳＴＸ＿０００３３ヘルパー構成体を修飾して、Ｕ６誘導可能なプロモーター構成体（図１２Ａに示されるもの）を含むように作成した、ＳＴＸ＿Ｃ００４１のプラスミドマップを示す。新しいＵ６プロモーターおよびＬｏｘ部位が示されている。 ＶＡ ＲＮＡ変異Ｇ１６ＡおよびＴ４５Ｃを含むＳＴＸ＿Ｃ００３５ヘルパープラスミドを修飾してＵ６誘導可能プロモーター構成体（図１２Ａに示されるもの）を含むように作成したＳＴＸ＿Ｃ００４２のプラスミドマップを示す。新しいＵ６プロモーターおよびＬｏｘ部位が示されている。 ＶＡ ＲＮＡ変異Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａを含む、ＳＴＸ＿Ｃ００３７ヘルパープラスミドを修飾して作成されたＳＴＸ＿Ｃ００４３のプラスミドマップを示す。新しいＵ６プロモーターおよびＬｏｘ部位が示されている。 ＶＡ ＲＮＡ変異Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａを含む、ＳＴＸ＿Ｃ００３７のプラスミドマップを示す。 Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、ならびにペイロード構成体およびペイロードのパッケージング（目的の遺伝子）をウイルス粒子の中に含む、例示的な安定細胞株（Ｐ２産生細胞株）の産生を示す模式図である。前記Ｐ１ヘルパー細胞株は、誘導可能なヘルパー構成体＃１または構成体＃２のいずれかを、血清を含まない懸濁物に適応した２９３細胞中に統合することにより産生された。 一過性のトランスフェクションシステム中で、誘導可能な２シストロン性の構成体を用いたＲｅｐ産生を示すプラスミドマップおよびグラフを示す。 ＴｅｔＯｎシステムを用いた、ヘルパーおよびＣｒｅ誘のを図示するＳＴＸＣ００９０およびＳＴＸＣ０１１０の模式図を示す。 ＶＡ ＲＮＡ変異構成体および様々なプロモーター、ならびに選択オプションの模式図を示す。 ＳＴＸＣ－０１２３（Ｔ３３、左プロット）、ＴＸＣ－０１２４（Ｔ３４、中央プロット）、またはＳＴＸＣ－０１２５（Ｔ３５、右プロット）ヘルパー構成体の安定な統合を有する細胞からの、疑似誘導、無誘導、またはＣｒｅ誘導後の、ＦＬＡＧ－ｔａｇｇｅｄ Ｅ２Ａの発現のための細胞内染色を示す。 安定に統合された細胞毒性効果を示さないヘルパープラスミドを有するＨＥＫ２９３細胞、およびＣｒｅの誘導、ＶＡ ＲＮＡの産生およびＥ２Ａ発現の良好な分配の概観を示す。 安定な細胞株のプールを産生するためのワークフローを示す。前記模式図および左のワークフローは、Ｔ３３プールを産生するためのＳＴＸＣ０１２３の統合を図示しており、このＴ３３プールでは、ＳＴＸＣ０１３７およびＳＴＸＣ０１３６が、次いで統合され３つの安定な細胞株のプール（Ｔ４０、Ｔ４１、およびＴ４２）を産生する。前記模式図および右のワークフローは、Ｔ４４プールを産生するためのＳＴＸＣ０１３３の統合を図示しており、このＴ４４プールでは、ＳＴＸＣ０１３７およびＳＴＸＣ０１３６が、次いで統合され、３つの安定な細胞株のプール（Ｔ５６、Ｔ５７、およびＴ５８）を産生する。この安定な細胞株は、次いでドキシサイクリンおよびタモキシフェンによって処理されＳＴＸＣ６５０をカプシド被覆するウイルス粒子を産生する。 Ｔ３３プールおよびＴ４４プールについての生存可能な細胞密度（左のグラフ）および生存能力（右のグラフ）のグラフを示し（図２８）、および統合されたプラスミド構成体からのネガティブな効果がなかったことを図示している。 Ｅ２Ａ発現、ＶＡ ＲＮＡ発現、Ｔ３３プール安定細胞株の培養密度および生存能力、Ｔ４４安定細胞株、および親の細胞株（ＶＰＣ）の、非誘導または誘導後のいずれかのグラフを示す。左のグラフは、誘導後２４時間でのものであり、および右のグラフは、誘導後４８時間でのものである。 図２８に図示された、Ｔ４０、Ｔ４１、およびＴ４２細胞株プールについての生存可能な細胞密度（左のグラフ）および生存能力（右のグラフ）のグラフを表している。 図２８に図示された、Ｔ５６、Ｔ５７、およびＴ５８細胞株プールと同じ方法で産生されたＴ５９、Ｔ６０、およびＴ６１細胞株プールについての生存可能な細胞密度（右のグラフ）および生存能力（左のグラフ）のグラフを表している。 誘導後のＴ４２プールの安定細胞株からのカプシド産生を、様々な細胞培地（ＡＡＶ、Ｂａｌ、Ｃｙｔ２、Ｃｙｔ９、Ｆｕｊｉ７、Ｆｕｊｉ７－２、ＨＥ３００、ＴＳ１、ＴＳ３、またはＴＳ５）中で、一過性の三重トランスフェクションにより産生された細胞と比較したグラフを示す。それぞれの培地のタイプのための左のバーは、合計カプシドの力価を示し、それぞれの培地のタイプのための右のバーは、ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの力価を示す。 Ｔ４２安定細胞株プール、Ｔ５９安定細胞プール、Ｔ６０安定細胞プール、およびＴ６１安定細胞プールについて、ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの力価を示しており、（＋）あり、または（－）なしは、ＨＥ３００培地中での誘導の有無を示す。 Ｔ４２プール安定細胞株からＴ６１プール安定細胞株までのカプシドにより、標的細胞（ＣＨＯ Ｐｒｏ－５細胞）を感染させた後の、ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして表した感染性を示す。それぞれの細胞株／培地に対する左のバーは、希釈因子が１の場合であり、それぞれの細胞株／培地に対する右のバーは、希釈因子が４の場合である。 様々な培地中での、ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの、誘導後のＴ４２プール安定細胞株からの細胞１つ当たりの力価のグラフを示しており、ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの三重トランスフェクトさせた親細胞（ＶＰＣ）からの細胞１つ当たりのカプシドの力価と比較している。それぞれの培地のタイプについての左のバーは、Ｔ４２プール安定細胞株からの細胞１つ当たりのウイルスゲノムを包んでいるカプシドの力価であり、それぞれの培地のタイプについての右のバーは、親細胞株（ＶＰＣ）からの細胞１つ当たりのウイルスゲノムを包んでいるカプシドの力価である。 様々な細胞培地中での、異なる播種密度でのＴ４２プール安定細胞の誘導後の、ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの希釈調整された力価のグラフを示している。３ｘＴｆｘｎの点線は、一過性の三重トランスフェクション（３ｘＴｆｘｎ）後の細胞により産生されたウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの希釈調整された力価を示している。 Ｔ４２プール安定細胞株から選択されたミニプールクローンによる、異なる細胞培地中での総カプシドを、異なる細胞培地中での誘導後のＴ４２プール安定細胞株のものと比較したグラフを示す。 図３８からの、様々な細胞培地中での、Ｔ４２プール安定細胞株から選択されたミニプールクローンにより、カプシド対多重感染（ｖｇ／細胞）によって、標的細胞（ＣＨＯ Ｐｒｏ－５細胞）を感染させた後の、ＧＦＰ＋細胞（カプシドに包まれたペイロード）のパーセンテージとして表した感染性を示す。（コントロールは、一過性トランスフェクションの後の細胞により産生された精製されたカプシドである）。 図３８からの、様々な細胞培地中での、Ｔ４２プール安定細胞株から選択されたミニプールクローンにより、カプシド対多重感染（ｖｇ／細胞）によって、標的細胞（ＣＨＯ Ｐｒｏ－５細胞）を感染させた後の、ＧＦＰ＋細胞（カプシドに包まれたペイロード）のパーセンテージとして表した感染性を示す。はめこみのコントロールは、一過性の感染後に細胞により産生される精製されたカプシドによる、カプシド対多重感染（ｖｇ／細胞）によって、標的細胞（ＣＨＯ Ｐｒｏ－５細胞）を感染させた後の、ＧＦＰ＋細胞（カプシドに包まれたペイロード）のパーセンテージとして表した感染性である。
発明の詳細な説明
構成的に発現されたときのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の毒性に取り組みながら、ｒＡＡ産生への一過性感染のアプローチにより提示される問題を解決するために、本明細書で開示されるものは、条件付き（本明細書では「誘導可能な」とも称される）で組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生を可能にする、ポリヌクレオチド構成体およびこのポリヌクレオチド構成体を安定的に統合する細胞株（本明細書では、「安定な細胞株」と称される）である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される前記組成物およびその使用方法は、治療的ペイロード等の所望の発現可能なペイロードをカプシドで包むｒＡＡＶウイルス粒子を提供する。本明細書で更に提供されるものは、安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力があり、このウイルス粒子の中には発現可能なペイロードがパッケージ化されており；この安定な細胞から産生されたウイルス粒子の集団は、一過性感染によりｒＡＡＶウイルス粒子産生する比較可能な他の細胞から産生されるウイルス粒子の集団よりも、より均一である。
本明細書で更に提供されるものは、安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力があり、このウイルス粒子の中には発現可能なペイロードがパッケージ化されており；およびウイルス粒子の産生は、引き金を引く薬剤の添加により誘導される。
本明細書で更に提供されるものは安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力があり、このウイルス粒子の中には発現可能なペイロードがパッケージ化されており；このウイルス粒子の産生は、細胞中のプラスミドの存在により、条件付きにはならない。
定義
別段の他の定義がなければ、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、通常本発明が関係する当業者により理解される意味を有する。
ＡＡＶウイルス粒子に適用される「組み換え」は、ｒＡＡＶウイルス粒子（同義語として、ｒＡＡＶ粒子）が、ＡＡＶウイルス粒子とは、性質として区別できる、ＡＡＶ粒子構成体をもたらす１つの以上の操作手順の生成物である。
いくつかの態様では、本開示は感染された宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞により外来ＤＮＡを取り込むことを称し、細胞膜内に外部ＤＮＡが導入されたときに、細胞は「トランスフェクトされた」と称する。当技術分野では、一連のトランスフェクション技法が一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａら、（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら、（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら、（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような技法は、ヌクレオチド統合ベクターや他の核酸分子などの１つの以上の核酸を、適切な宿主細胞中に導入するために使用できる。
「宿主細胞」は、目的の物質を収容するか、収容する能力のある、任意の細胞を称する。しばしば、宿主細胞は、哺乳類細胞である。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパー構成体、ＡＡＶミニ遺伝子の受け手として用いられ得る。この用語は、トランスフェクトされたオリジナルの細胞の子孫を含む。従って、「宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列によりトランスフェクトされた細胞を称することができる。単一の親細胞の子孫が、自然に、偶発的または変異に起因して、形態学的に、またはゲノム的もしくは総ＤＮＡ相補体として、親細胞と完全に同一である必要はないことが理解される。本明細書で用いられる「宿主細胞」は、アデノウイルスパッケージング細胞として機能する能力のある、即ち、ＨＥＫ２９３細胞およびその誘導体（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、ＨｅＬａ、Ａ５４９、Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ誘導細胞、および他のパッケージング細胞などの、任意の哺乳類細胞を指すことができる。
本明細書で用いられる用語「細胞株」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで継続的な、または延長された成長と分裂を行う能力のある細胞の集団をさす。しばしば、細胞株は単一の先祖細胞からのクローンの集団である。当技術分野では、自然発生的な、または誘導された変化が、そのようなクローン集団の保存または移転の間に核型において生じることも更に知られている。従って、前記細胞株と称されるものから誘導された細胞は、先祖細胞または培養物と厳密に同一でなくてもよく、および前記細胞株と称されるものは、そのような変異体を含む。
本明細書で用いられる、用語「組み換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写、またはＲＮＡ等のように、生物学的に活性な核酸を導く、ＤＮＡセグメント等の外来ＤＮＡセグメントが導入された細胞を称する。
用語「細胞培養」は、付着するか、または懸濁物、バイオリアクター、ローラーボトル、ハイパースタック、ミクロスフェア、マクロスフェア、フラスコ等の中で、上澄み液または懸濁物それ自身の成分として、成長する細胞を指し、これには限定はされないが、ｒＡＡＶ粒子、細胞、細胞破片、細胞汚染物質、コロイド粒子、生体分子、宿主細胞タンパク質、核酸および脂質ならびに凝集剤が含まれる。バイオリアクター等の大スケールのアプローチでは、撹拌されたバイオリアクター中の、培養物の懸濁物、およびマイクロキャリアー、マクロキャリアーに付着して成長する細胞も、用語「細胞培養」に包含される。大および小両方のスケールでのタンパク質産生のための細胞培養の操作手順は、本開示に包含される。
本明細書で用いられる、用語「中間細胞株」は、宿主細胞のゲノムに統合された、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ成分、または宿主細胞のゲノムに統合された、アデノウイルス・ヘルパー機能を含む細胞株を指す。
本明細書で用いられる、用語「パッケージング細胞株」は、宿主細胞のゲノムに統合された、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ成分およびアデノウイルス・ヘルパー機能を含む細胞株を指す。ｒＡＡＶウイルス粒子を生成するためには、ペイロード構成体がパッケージング細胞株に加えられなければならない。
本明細書で用いられる、用語「産生細胞株」は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ成分およびアデノウイルス・ヘルパー機能、およびペイロード構成体を含む細胞株を指す。ｒｅｐおよびｃａｐ成分およびアデノウイルス・ヘルパー機能は、宿主細胞のゲノムに統合されている。前記ペイロード構成体は、安定的に宿主細胞のゲノムに統合されるか、または一過性にトランスフェクトされる。ｒＡＡＶウイルス粒子は、前記産生細胞株から、プラスミドまたはトランスフェクション薬剤の不在下に、１つの以上の引き金を引く薬剤の添加により生成される。
本明細書で用いられる、用語「下流での精製」は細胞性または他の不純物からｒＡＡＶウイルス粒子を分離することを指す。下流での精製プロセスは、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーに基づく精製プロセスを含む。
用語「精製前収率」は、下流での精製プロセス前のｒＡＡＶ収率を指す。用語「精製後収率」は、下流での精製プロセス後のｒＡＡＶ収率を指す。ｒＡＡＶ収率は、ウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌとして測定され得る。
ｒＡＡＶウイルス粒子の、カプシドによる被覆の率は、ｒＡＡＶウイルス粒子（ＶＰ）のウイルスゲノムに対する比率で測定できる。ｒＡＡＶウイルス粒子は、空のカプシド、部分的に完全なカプシド（例えば、部分的なウイルスゲノムを含む）、および完全なカプシド（例えば、完全なウイルスゲノムを含む）を含む。
ｒＡＡＶウイルス粒子集団のＦ：Ｅ比は、ｒＡＡＶ完全カプシドの空のカプシドに対する比として測定できる。ｒＡＡＶ完全カプシド粒子は、部分的に完全なカプシド（例えば、部分的なウイルスゲノムを含む）および完全なカプシド（例えば、完全なウイルスゲノムを含む）を含む。空のカプシドは、ウイルスゲノムを欠く。
ｒＡＡＶウイルス粒子の集団の効力または感染性は、多重感染（ＭＯＩ；ウイルスゲノム／標的細胞）における、ｒＡＡＶウイルス粒子により感染された標的細胞のパーセンテージとして、測定可能である。例示的なＭＯＩ値は、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞である。ＭＯＩは、１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞の範囲から選ばれる値であり得る。
本明細書で用いられる、用語「ベクター」は、細胞間で遺伝子配列を転移できる適正な制御要素に会合したときに複製の能力を有する、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ウイルス粒子等の、任意の遺伝子要素を含む。従って、この用語は、ウイルスベクターと同様にクローニングおよび発現ビークルを含む。本明細書を通じた用語「ベクター」の使用は、プラスミドまたはウイルスベクターのいずれかを指し、これらは、トランスフェクションまたは感染を介して所望の成分が移転することを許容する。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、組み換えＡＡＶゲノムを含むプラスミドである。いくつかの実施形態では、有用なベクターとは、その中で、転写されるべき核酸セグメントが、プロモーターの転写制御の下で配置されるものであると考慮される。
前記語句「操作可能に配置される」、「操作可能にリンクされる」、「制御下に」、または「転写的制御下に」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現のために、核酸に関して正しい位置と配向にあることを意味する。
語句「発現ベクターまたは構成体」または「合成構成体」は、一部分または全体の核酸エンコーディング配列が、転写される能力を有する核酸を含む、任意のタイプの遺伝子構成体を意味する。いくつかの実施形態では、発現は、例えば生物学的に活性なポリペプチド生成物または機能的なＲＮＡ（例えばガイドＲＮＡ）を、転写された遺伝子から生成するための核酸の転写を含む。
本明細書で用いられる用語「栄養要求性」または「栄養要求性選択マーカー」は、例えば、機能的なジヒドロ葉酸還元酵素等の必須栄養素を欠いた、培地中での成長を許容する機能的酵素の選別のための、プリン前駆体である、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）等の必須栄養素等の補助栄養を欠いた培地の使用を指す。
本明細書で用いられる用語である、細胞増殖抑制は、細胞の成長を阻害する細胞成分、または薬剤／要素または状態を指す。細胞性塞栓は、細胞成長および増殖の阻害である。
本明細書で用いられる用語である、「細胞毒性的」は、細胞に対して毒性である性質である。例えば、細胞毒性薬剤または条件に曝露された細胞は、壊死を受け、その中では膜の完全性を失い、細胞の溶解の結果として、急速に死滅する。細胞毒性薬剤に曝露された細胞は、積極的な成長および分裂を停止（細胞生存能力の減少）するか、制御された細胞死（アポトーシス）の遺伝的プログラムを活性化できる。
本明細書で用いられる「モノクローナルな細胞株」または「モノクローナル性」は、単独の祖先細胞から繰り返される細胞複製により産生される細胞を言い表す。従って、「モノクローナル細胞」は、単一クローンを形成することを言うことができる。
用語「テトラサイクリン」は、本明細書では、総称的にテトラサイクリンに構造的および機能的に関係する抗生物質を指し、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、サレサイクリン、オキシテトラサイクリン、オマダサイクリンまたはエラバサイクリンを含む。
用語「構成的」または「構成的な発現」は、本明細書では、互いに交換可能に用いられる。それらは、進行中の様式において転写される遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、発現の引き金を引く薬剤の細胞培養培地への添加により、条件付けされない、治療的なペイロードまたは核酸配列の発現を指す。
用語「発現可能な治療的ポリヌクレオチド」、「ペイロードをエンコードする発現可能なポリヌクレオチド、「ペイロードポリヌクレオチド」または「ペイロード」は、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が側面にある、ＡＡＶゲノムベクター（「ＡＡＶゲノムベクター」）中にエンコードされるポリヌクレオチドを指す。本明細書で開示されるペイロードは、治療的ペイロードである。ペイロードは、以下の任意の１つのまたは組み合わせを含むことができる：導入遺伝子、ｔＲＮＡサプレッサー、ガイドＲＮＡ、または任意の他の標的結合／修飾オリゴヌクレオチドまたはその誘導体、またはペイロードは、ワクチンの免疫原、および任意の遺伝子編集機構（ＤＮＡまたはＲＮＡ編集）を含み得る。ペイロードは、ウイルスベクターに仲介される発現に従う、抗体鎖、またはフラグメント（遺伝子送達のための「ベクター化された抗体」とも称される）をエンコードする導入遺伝子を送達するものも含むことができる。例えばＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ ＨＩＶ ＡＩＤＳ２０１５ Ｍａｙ；１０（３）：１９０－１９７が、ＨＩＶ感染の防止または治療のための、ベクター化された抗体遺伝子送達について記載しているので、参照されたい。ＨＥＲ２＋脳転移の治療のためのトラスツズマブ（ハーセプチン）のＡＡＶ送達を記載する、合衆国特許第１０，７８０，１８２号も参照されたい。本明細書に記載されるペイロードは、治療的ペイロードでなくてもよい（例えば、ＧＦＰ等の検出可能なマーカーに対するコーディング）。
特に、いくつかの例では、前記ペイロードヌクレオチドは、相同性指向修復の相同性要素であることができるポリヌクレオチド、または様々な目的のために送達されるガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＡＤＡＲ編集またはＡＤＡＴ編集のためのガイドＲＮＡの発現のためにコードされた核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子は、遺伝子治療のためにパッケージされた導入遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、前記導入遺伝子はワクチンのためにパッケージされた合成構成体を指す。
システムの概観
前記安定な哺乳類細胞株は、細胞の核ゲノム中への、複数の合成核酸構成体の安定な統合および維持に依存する。これらの構成体の１つのは、ホルモンにより活性化される削除要素の誘導可能な発現を許容する。前記削除要素はリコンビナーゼであることができる。このリコンビナーゼは部位特異的なリコンビナーゼであることができる。この部位特異的なリコンビナーゼは、Ｃｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼであることができる。Ｃｒｅ発現を引き起こすことは、ゲノムの再配列を導き、これは次いでアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現、および随意的に治療的ペイロード（例えば、導入遺伝子、ｔＲＮＡサプレッサー、ガイドＲＮＡ、または他のオリゴヌクレオチド）のカプシドで包まれたｒＡＡＶの産生を導く。
図１は、例示的な実施形態の引き金を引く前の状態を表している。示されている実施形態では、３つの合成核酸構成体が、ＨＥＫ２９３細胞等のアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する細胞株の核ゲノムに別々に統合されている。引き金を引く前の状態では、構成体１上のｒｅｐの転写的読み過ごし（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ）は、介入するスペーサーによりブロックされる。構成体３上のペイロードポリヌクレオチドは、ＡＡＶ ＩＴＲが側面にあり、括弧で示されている。
例示的な構成体２の詳細は図２Ａ～２Ｃに示されている。この構成体は、Ｃｒｅの条件付き発現を許容する。いくつかの実施形態では、前記構成体２は、Ｅ２Ａ配列とＥ４配列の間に配置されたＰ２Ａ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記構成体２は、Ｅ２Ａ配列とＥ４配列の間に配置された、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む。いくつかの実施形態では、前記構成体２の誘導可能なプロモーターシステムは、Ｔｅｔ Ｏｎ誘導可能なプロモーターシステムである。いくつかの実施形態では、前記構成体２の誘導可能なプロモーターシステムは、Ｔｅｔ Ｏｆｆ誘導可能なプロモーターシステムである。いくつかの実施形態では、前記構成体２の誘導可能なプロモーターシステムは、クミン酸塩誘導可能なプロモーターシステムである。
引き金を引く前の状態（図２Ａの上部）では、Ｃｒｅコーディング配列は、誘導可能なプロモーターの制御下にある。例えば、前記誘導可能なプロモーターは、Ｔｅｔ－誘導可能なプロモーターである。引き金を引く薬剤の不在下では、誘導可能なプロモーターは不活性である。例えば、Ｔｅｔ－誘導可能なプロモーターの引き金を引く薬剤はテトラサイクリンである。テトラサイクリンの不在下では、ドキシサイクリン（“Ｄｏｘ”）、Ｔｅｔ活性化タンパク質（ＴｅｔＯｎ３Ｇ）は、基礎Ｔｅｔ Ｏｎプロモーターには結合できず、活性化できない。加えて、Ｃｒｅの局在化は、エストロゲン応答要素（“ＥＲ２”）の支配下にあり、このエストロゲン応答要素は、細胞質から核への転座に、エストロゲンアゴニストまたはタモキシフェン等の選択的モデュレーターの結合を必要とする。このアプローチは、引き金を引く前のＣｒｅ発現を、後続する偶然の組み換えイベントおよび毒性によって制限する。このＥＲ２ Ｃｒｅ要素は、強い３’ポリアデニル化シグナルも含み、これは下流のアデノウイルス・ヘルパー遺伝子であるＥ２ＡおよびＥ４の基礎発現を防止する。いくつかの実施形態では、このＣｒｅは、２つのフラグメント中に分割され、ラパマイシンのような化学薬品の存在で融合され得る。いくつかの実施形態では、このＣｒｅは、光により誘導可能なＣｒｅである。
引き金を引く薬剤（例えばＤｏｘ）およびタモキシフェンが培養培地に加えられたとき、ＴｅｔＯｎ３Ｇは、Ｔｅｔ応答性基礎プロモーターに結合し、エストロゲン応答要素が活性化され、Ｃｒｅ発現の引き金を引く（図２Ａの下部）。Ｃｒｅタンパク質の翻訳およびその次に細胞核内への転座に続いて、Ｃｒｅは自身のコーディング配列を構成体２から削除し、図２Ｂの下部に示される統合された構成体を残す。上流のポリアデニル化部位の除去は、Ｅ２ＡおよびＥ４タンパク質の発現を可能にし、ドキシサイクリンの存在により維持される。同様に随意的な追加のインサートが図２Ｃに示され、ＶＡ－ＲＮＡが、スタッファー配列のＣｒｅ媒介削除により発現され、これがＵ６プロモーターを活性化し、次いでＶＡ ＲＮＡの発現を駆動する。
図３Ａ～３Ｂは、模式図的に構成体１の例示的な実施形態を表している。この構成体は、引き金を引くイベントの前に、ＡＡＶ Ｒｅｐの発現を防止するためにデザインされているが、引き金を引くイベントの後に、内在的なプロモーターからの、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現を許容する。
図３Ａは、統合された構成体１の引き金を引く前の状態を示す。削除可能なスペーサーがｒｅｐコーディング配列を妨害し、完全な長さのｒｅｐコーディング配列の転写的な読み過ごしをブロックしている。引き金を引く前の状態での転写産物が、図の下部に示されている。この引き金を引く前の転写産物は蛍光マーカータンパク質ＥＧＦＰに融合したＡＡＶ Ｒｅｐの５’部分をエンコードする。この転写産物は、５’および３’スプライス部位が側面にある単一イントロンである。ルーチンのスプライシングは、強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）に融合したｒｅｐのＮ－末端を含む融合タンパク質をエンコードする転写産物を産生する。この融合タンパク質は、完全な長さのＲｅｐタンパク質の毒性を欠いており、および細胞ゲノム中の、引き金を引く前の構成体１は、品質管理のためにＥＧＦＰの蛍光により検出可能である。いくつかの実施形態では、このＥＧＦＰの蛍光は、次いで安定な細胞プールを形成する統合された核酸構成体１を有する細胞の選択のために用いることができる。核酸構成体１を有する安定な細胞プールは、従って、ＥＧＦＰを発現する細胞の選択から産生される。
図３Ａの上部に示されるように、削除可能なスペーサーは、第一のスペーサーセグメント、第二のスペーサーセグメント、および第三のスペーサーセグメントを含む。図３Ｂは、細胞核内のＣｒｅへの曝露により、引き金を引く前の構成体（上）の、引き金を引いた後の状態（下）への変換を示す。Ｃｒｅは、ＥＧＦＰマーカーコーディング配列および上流の３’スプライス部位を有する、第二のスペーサーセグメントを削除する。転位すると、この構成体は、今や機能的ＲｅｐおよびＣａｐの、それぞれの内在的なプロモーターからの発現を可能にする。これは図３Ｂの上部に示される。ＥＧＦＰ発現の欠失は、成功したＣｒｅ媒介ゲノム組み換えを示す。
図４は、例示的なペイロード構成体である、構成体３の例示的な実施形態を示す。構成体３は、ペイロードをエンコードする配列を含む。この配列要素は、構成的プロモーターの制御下にある。このペイロードは、ｒＡＡＶが適切なビークルである、任意のペイロードであることができ、それには目的のタンパク質をエンコードする導入遺伝子、相同性指向修復のための相同性要素、またはガイドＲＮＡが含まれる．このペイロードは括弧で示されるＡＡＶ ＩＴＲの側面にある。
図６は、細胞培地タモキシフェンおよびドキシサイクリンを添加して、引き金を引いた後の状態の全ての３つの構成体を表す。誘導可能なプロモーター（例えば、Ｄｏｘの存在下で活性化されるＴｅｔ－Ｏｎプロモーター）の制御下に、アデノウイルスＥ２ＡおよびＥ４ヘルパータンパク質が、統合された構成体２から発現される。ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐコーディング配列は、内在的なプロモーターの制御下に、構成体１から発現される。このペイロードは、構成的プロモーターの制御下に発現される。ペイロードをカプシドで包むｒＡＡＶウイルス粒子が、従って産生される。
このアプローチは、現行のペイロード送達のためのＡＡＶシステムに比較して膨大な利益を提供する。
前記細胞ゲノム中に構成体を安定的に維持するためには、選択圧が必要である。細胞株のゲノム中に統合された３つの構成体を安定的に維持するために必要な選択的薬剤（特に抗生物質）の数を減らすために、本発明者らは、単一の抗生物質選択および単一の栄養要求性の選択によって、全ての３つの構成体を核ゲノムに安定的に維持するためのアプローチをデザインした。
図５Ａは、単一の選択圧の下で、２つの統合された核酸構成体の安定な保持を許容する、分割された栄養要求性選択システムを表す。１つの構成体は、ロイシンジッパータンパク質に融合した哺乳類ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のＮ－末端フラグメント（“Ｎｔｅｒ－ＤＨＦＲ”）をエンコードする。このＮ－末端フラグメントは、酵素的に非機能的である。他の構成体は、ロイシンジッパータンパク質に融合した、ＤＨＦＲのＣ－末端フラグメント（“Ｃｔｅｒ－ＤＨＦＲ”）をエンコードする。このＣ－末端フラグメントは、酵素的には非機能的である。両方のフラグメントが、細胞中で同時に発現されると、機能的なＤＨＦＲ酵素複合体が、ロイシンジッパータンパク質の会合を介して形成される。両方の構成体は、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠いた培地の中での、ＤＨＦＲヌル細胞のゲノム中に安定的に保持される。
図５Ｂは、引き金を引く前の図１の複数構成体システムにおける、分割された栄養要求性選択デザインの例示的な展開を示す。この実施例では、前記栄養要求性選択要素が、構成体１および３に展開されている。別の例示的な抗生物質選択アプローチ、ブラストサイジン抵抗性が構成体２に展開される。このことが、単一の抗生物質を用い、ブラストサイジンを含み、チミジンおよびヒポキサンチンを欠いた培地中での培養により、全ての３つの構成体を安定的に哺乳類細胞株に維持する能力をもたらす。
引き金を引くことおよびＣｒｅ媒介ゲノム転位の後で、前記選択要素は未変化であり、単一の抗生物質を用いて、チミジンおよびヒポキサンチンを欠いた培地を使用し、３つの引き金を引いた後の構成体の継続した維持を可能にする。
ＡＡＶウイルス粒子の形成に必要なウイルスタンパク質は、宿主細胞の機構により阻害される。本明細書で記載される安定な細胞株中で、ＡＡＶウイルスの力価を最大化するための、これらの宿主細胞メカニズムの阻害は、限定はされないが：ＰＫＲのノッキング（ＰＫＲ ＫＯ）、ＥＩＦ２ａα変異体（ＰＫＲ経路中）の開始細胞株（Ｐ０）への導入、および／またはウイルス付随（ＶＡ）ＲＮＡ（ＶＡ ＲＮＡｓ、ＰＫＲの阻害剤）の操作または媒介を含む。アデノウイルスからのウイルス随伴（ＶＡ）ＲＮＡは、ｓｍａｌｌ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡとして作用し、ベクターのゲノムから転写される。これらのＶＡ ＲＮＡは自然免疫応答を引き起こす。更に、ＶＡ ＲＮＡは機能的なウイルスｍｉＲＮＡへと処理され、膨大な数の細胞遺伝子の発現を妨害する。従って、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子を欠くか、または修飾されたＶＡ ＲＮＡを有する、ＶＡ－削除アデノウイルスベクター産生構成体（ＡｄＶ）には利点があるであろう。しかしながら、ＶＡ－削除ＡｄＶは、商業的に十分な量のＡＡＶ力価を産生しない（例えば、より少なく、性質が不良なウイルス粒子をもたらす）。逆に、ＶＡ ＲＮＡの過剰発現も、ＡＡＶ産生の低い力価をもたらし、スケールアップのための商業的な実現可能性がないであろう。従って、条件付きのＶＡ ＲＮＡ構成体の開発、およびそれらの最適化された構成体の任意のものを本明細書に記載される条件付きヘルパー構成体と組み合わせることは、商業的に妥当な高品質のウイルス粒子を、本明細書に記載されるＡＡＶ産生システムから提供するであろう。これらの全ての３つの戦略が、任意の結合によりなされ得る。
ＶＡ ＲＮＡは、ＡＡＶウイルスタンパク質合成を阻害することに責任を有する経路に含まれる、ＰＫＲの阻害剤でもある。特に、ＰＫＲは、ＥＩＦ２αをリン酸し、このことはウイルスタンパク質合成の阻害をもたらす。図４Ａは、ＰＫＲのＶＡ ＲＮＡによる阻害の模式図を表し、ＰＫＲ経路は下の左側に示される。二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、ＶＡ ＲＮＡが、図４Ｂに示されている。
ＶＡ ＲＮＡ、ＰＫＲ、およびＥＩＦ２αの間の相互作用については、限られた理解しかないが、ＰＫＲは、自己リン酸化できる主なキナーゼであり、ＥＩＦ２αは他のキナーゼによりリン酸化されることができる。そのようなものとして、３つの戦略（ＰＫＲ ＫＯ、ＥＩＦ２ａα変異、ＶＡ ＲＮＡの操作）が、本明細書に記載されるＡＡＶ産生システムにおいて、任意の組み合わせにおける使用において開発されている。
従って、哺乳類細胞によるＡＡＶウイルス粒子産生の一般的な抗ウイルス効果の克服のための選択肢は、ＶＡ ＲＮＡの発現を修飾することである。従って、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子を欠くか、または修飾されたＶＡ ＲＮＡを有するＶＡ－削除アデノウイルスベクター産生構成体（ＡｄＶ）がデザインされ、本明細書の図２Ｃおよび図４～１５に記載される。ＶＡ－削徐ＡｄＶが、商業的に十分な量のＡＡＶ力価を産生しない（例えば、より少なく不良な品質のウイルス粒子をもたらす）ことに注意されたい。逆に、ＶＡ ＲＮＡを過剰発現することも、スケールアップのために商業的な実現可能性のない低力価のＡＡＶウイルス粒子産生をもたらす。従って、条件付きのＶＡ ＲＮＡ構成体の開発、およびそれらの最適化された構成体の任意のものを本明細書に記載される条件付きヘルパー構成体と組み合わせることは、商業的に妥当な高品質のウイルス粒子を、本明細書に記載されるＡＡＶ産生システムから提供するであろう。図２Ｃおよび図４～１５は、様々な修飾がなされ、および誘導可能な変異体ＶＡ ＲＮＡ構成体およびそのウイルス粒子産生への効果を図示している。これらの様々なアプローチは、現行のＡＡＶ産生のためのシステムを越える膨大な利益を提供する。
条件付き発現
第一の態様では、前記安定な細胞株が提供される。いくつかの実施形態では、この安定な細胞株は、哺乳類の安定な細胞株である。これらの細胞は、条件付きで組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、条件付きで組み換えＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、発現可能なペイロードをパッケージする。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、ペイロードをエンコードする配列をパッケージする。好適な実施形態では、細胞内のエピソームまたは独立したプラスミドの細胞の存在により条件付けされない。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐの発現は条件付けされる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は条件付けされる。特定の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、細胞培養培地への、少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加により、条件付きになる。特定の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、細胞培養培地への、第一の発現の引き金を引く薬剤および第二の発現の引き金を引く薬剤の添加により、条件付きになる。
引き金を引く薬剤を有するシステムでは、ドキシサイクリンが適切な薬剤である。特定の実施形態では、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターが、ドキシサイクリンの制御下に用いられ得る。代替的に、クミン酸塩により誘導可能なプロモーターのシステムは、クミン酸塩により誘導可能なプロモーターが、クミン酸塩の制御下にある場合には用いられ得る。
引き金を引く薬剤を有するシステムでは、ドキシサイクリンが適切な薬剤である。特定の実施形態では、ドキシサイクリンが、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターのコントロールに用いられる。代替的に、クミン酸塩により誘導可能なプロモーターのシステムは、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターの代わりに、クミン酸塩の制御下で用い得る。
任意の適切な既存の誘導可能な薬剤（例えば、リコンビナーゼ）を用い得る。既存の薬剤はリコンビナーゼであることができる。既存の薬剤は部位特異的なリコンビナーゼであり得る。既存の薬剤は組み換え部位を標的とし得る。適切な誘導可能な既存の薬剤の例は、Ｃｒｅおよびフリッパーゼを含む。前記Ｃｒｅ要素は、ホルモンにより活性化されたＣｒｅ、または光により誘導可能なＣｒｅであり得る。組み換え部位はｌｏｘ部位であり得る。ｌｏｘ部位はｌｏｘＰ部位であり得る。組み換え部位はＦＲＴ部位であり得る。
前記フリッパーゼリコンビナーゼシステムは、Ｆｌｐ－ＦＲＴ組み換えに基づいており、これはｉｎ ｖｉｖｏでの制御された条件下で、ＤＮＡを操作するために用いられる技術である、部位指向組み換え技術である。Ｃｒｅ－ｌｏｘ組み換えに類似しているが、パン酵母である、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μプラスミドから誘導された、リコンビナーゼフリッパーゼ（Ｆｌｐ）による、ｓｈｏｒｔ ｆｌｉｐｐａｓｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔ（ＦＲＴ）部位の間の配列の組み換えを含む。前記Ｆｌｐタンパク質は、Ｃｒｅに大変類似しているが、チロシンファミリーの部位特異的なリコンビナーゼである。
典型的な実施形態では、第一の発現および第二の引き金を引く薬剤の両方を細胞培養培地に添加する前には、前記細胞は、細胞毒性的な量のＲｅｐタンパク質を発現しない。特定の実施形態では、第一のおよび第二の発現の引き金を引く薬剤の両方を細胞培養培地に添加する前には、前記細胞は、細胞毒性的な量のＲｅｐタンパク質を発現しない。特定の実施形態では、細胞内のＲｅｐタンパク質の平均濃度は、第一のおよび第二の発現の引き金を引く薬剤の両方を細胞培養培地に添加する前の量よりも少ない。いくつかの実施形態では、少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の全てを、細胞培養培地に添加した後には、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は構成的になる。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現は条件付きである。
特定の実施形態では、少なくとも１つのアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現は、少なくとも第三の発現の引き金を引く薬剤を、細胞培養培地に添加することにより条件付けされる。特定の実施形態では、前記第三の発現の引き金を引く薬剤は、第一の発現の引き金を引く薬剤と同じである。特定の実施形態では、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現は、第三の発現の引き金を引く薬剤および第四の発現の引き金を引く薬剤の細胞培養培地への添加により条件付きになる。特定の実施形態では、第四の発現の引き金を引く薬剤は、第二の発現の引き金を引く薬剤と同一である。特定の実施形態では、第三の発現の引き金を引く薬剤は、第一の発現の引き金を引く薬剤と同一であり、および第四の発現の引き金を引く薬剤は、第二の発現の引き金を引く薬剤と同一である。
いくつかの実施形態では、少なくとも第三の発現の引き金を引く薬剤の細胞への接触により、発現の引き金を引くことに続く、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の継続した発現は、細胞培養培地中に第三の発現の引き金を引く薬剤の存在のみを必要とする。特定の実施形態では、第三の発現の引き金を引く薬剤は、前記第一の発現の引き金を引く薬剤と同一である。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアデノウイルス・ヘルパーＲＮＡの発現は条件付きである。特定の実施形態では、前記アデノウイルス・ヘルパタンパク質はＡｄ Ｅ２Ａを含む。特定の実施形態では、アデノウイルス・ヘルパータンパク質Ａｄ Ｅ４を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルス・ヘルパータンパク質は標識されている。タグはタンパク質の標識であり得る。タンパク質標識は、ＦＬＡＧタグであり得る。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ａは、ＦＬＡＧ標識されている。いくつかの実施形態では、Ｅ４は、ＦＬＡＧ標識されている。
特定の実施形態では、前記アデノウイルス・ヘルパーＲＮＡは、ＶＡ ＲＮＡである。特定の実施形態では、前記アデノウイルス・ヘルパーＲＮＡは、誘導可能なＶＡ ＲＮＡ構成体である。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡは変異体ＶＡ ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡは転写的に不活性なＶＡ ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態では、前記第三の発現の引き金を引く薬剤はテトラサイクリンである。特定の実施形態では、このテトラサイクリンは、ドキシサイクリン（“Ｄｏｘ”）である。いくつかの実施形態では、前記第四の発現の引き金を引く薬剤はエストロゲン受容体リガンドである。特定の実施形態では、このエストロゲン受容体リガンドは、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）である。特定の実施形態では、前記エストロゲン受容体リガンドは、タモキシフェンである。
安定な細胞株のいくつかの実施形態では、ペイロードの発現は、細胞培養培地中への少なくとも第五の発現の引き金を引く薬剤の添加により条件付けされる。いくつかの実施形態では、ペイロードの発現は、細胞培養培地中への発現の引き金を引く薬剤の添加により条件付けされない。
いくつかの実施形態では、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、アデノウイルス・ヘルパータンパク質およびペイロードの発現は、細胞培養培地中への１つの発現の引き金を引く薬剤の添加により構成的になる。特定の実施形態では、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、ならびにアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現は、細胞培養培地中へのただ１つの発現の引き金を引く薬剤の添加により構成的になる。
特定の実施形態では、前記ただ１つの引き金を引く薬剤は、第一の発現の引き金を引く薬剤である。特定の実施形態では、前記第一の発現の引き金を引く薬剤はテトラサイクリンである。特定の実施形態では、前記第一の発現の引き金を引く薬剤はドキシサイクリンである。
合成核酸構成体
典型的な実施形態では、安定な細胞株の細胞の核ゲノムは、複数の統合された合成核酸構成体を含む。典型的には、それぞれの合成核酸構成体は、細胞の核ゲノムに別々に統合される。いくつかの実施形態では、ただ単独の非栄養要求性選択が、前記複数の合成核酸構成体を前記細胞の核ゲノムに安定的に維持するために必要である。いくつかの実施形態では、抗生物質抵抗性が、前記複数の合成核酸構成体を前記細胞の核ゲノムに安定的に維持するために必要である。いくつかの実施形態では、非栄養要求性選択および抗生物質抵抗性が前記複数の合成核酸構成体を前記細胞の核ゲノムに安定的に維持するために必要である。Ｉ
いくつかの実施形態では、前記細胞の核ゲノムは、２つの統合された合成構成体を含む。
いくつかの実施形態では、前記細胞の核ゲノムは、３つの統合された合成構成体を含む。特定の実施形態では、前記第一の統合された合成構成体は、条件的に発現可能なＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐのコーディング配列を含み；前記第二の統合された合成構成体は、条件的に発現可能なＣｒｅのコーディング配列および条件的に発現可能なアデノウイルス・ヘルパータンパク質のコーディング配列を含み；前記第三の統合された合成構成体は、条件的に発現可能なペイロードのコーディング配列を含む。
構成体１（ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体）
本明細書で開示されるものは、ＲｅｐおよびＣａｐポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド構成体である。本明細書で提供されるものは、ＲｅｐおよびＣａｐポリペプチドをエンコードし、およびスペーサーまたは削除可能な要素を含む第一の核酸構成体である。この第一の核酸構成体も、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体および／または「ＡＡＶ Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体」と称される。
これらのポリヌクレオチド構成体は、細胞株に安定的に統合され、削除要素の存在下でＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐポリペプチドを産生するためだけに引き金を引かれるようにデザインされている。いくつかの実施形態では、前記第一の統合された合成構成体は、条件付きで発現可能なＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコーディング配列を含む。
このＲｅｐ配列は、任意の所望のＡＡＶ血清型からのＲｅｐをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記エンコードされたＲｅｐタンパク質は、同じ血清型からＣａｐタンパク質として引き出される。いくつかの実施形態では、前記エンコードされたＲｅｐタンパク質は、異なる血清型からＣａｐタンパク質として引き出される。特定の実施形態では、前記エンコードされたＲｅｐタンパク質は、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０およびＡＡＶ－１１、またはそれらのキメラ的組み合わせからのＲｅｐタンパク質を含む。
ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＮＣ＿００２０７７に提供されており；ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，４５：５５５－５６４（１９８３）に提供されており；ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿１８２９に提供されており；ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００１８２９に提供されており；ＡＡＶ－５の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０８５７１６に提供されており；ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００ １８６２に提供されており；ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９にそれぞれ提供されている（ＡＡＶ－８に関係する米国特許第７，２８２，１９９号および第７，７９０，４４９号も参照のこと）；ＡＡＶ－９の完全なゲノムは、Ｇａｏら、Ｖｉｒｏｌ，７８：６３８１－６３８８（２００４）に提供されており；ＡＡＶ－１０ゲノムはＭｏｌ Ｔｈｅｒ，１３（１）：６７－７６（２００６）に提供されており；ＡＡＶ－１１ゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）に提供されている。
図３Ａに図示される例示的な実施形態では、前記細胞が第一の発現の引き金を引く薬剤と接触する前に、前記Ｒｅｐコーディング配列は、介入するスペーサーによって妨害される。
特定の実施形態では、前記介入するスペーサーセグメントは、５’から３’方向へ、第一のスペーサーセグメント、第二のサーセグメント、および第三のスペーサーセグメントを含む。
特定の実施形態では、前記第一のスペーサーセグメントは、前記第一のスペーサー要素の５’に対して５’スプライス部位（５’ＳＳ）を含む。特定の実施形態では、前記第一のスペーサーセグメントは、８０％の同一性のある核酸配列を配列番号：１に対して含む。
いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは、ｌｏｘ部位が側面にある検出可能なタンパク質マーカーを含む。特定の実施形態では、前記検出可能なタンパク質マーカーは、蛍光タンパク質である。特定の実施形態では、前記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。特定の実施形態では、前記ＧＦＰはＥＧＦＰである。特定の実施形態では、前記蛍光タンパク質は、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）である。蛍光マーカーのスクリーニングは、細胞ゲノムへの構成体の統合を確定するために用いることができ、続いて、介入するスペーサーセグメントの削除を確定するために用い得る。いくつかの実施形態では、第二のスペーサーセグメントはポリＡ配列を更に含む。特定の実施形態では、このは、ポリＡ配列は、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡである。特定の実施形態では、第二のスペーサーセグメントは、更に第一のスプライシング部位（３’ＳＳ）を、前記第一のｌｏｘ部位と前記タンパク質マーカーをエンコードするポリヌクレオチドとの間に含む。
いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは、８０％の同一性を配列番号：２に対して含む。
いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントは、３’スプライス部位（３’ＳＳ）を更に含む。特定の実施形態では、前記３’スプライス部位は、第二のｌｏｘ部位に位置している。
いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントは、８０％の同一性を配列番号：３に対して含む。
様々な実施形態では、Ｒｅｐコーディング配列は、操作可能に内在性Ｐ５プロモーターにリンクしている。様々な実施形態では、Ｒｅｐコーディング配列は、操作可能に内在性Ｐ１９プロモーターにリンクしている。いくつかの実施形態では、前記介入するスペーサーが、Ｒｅｐコーディング配列のＰ１９プロモーターの下流の位置に挿入されている。
いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐコーディング配列は、Ｃａｐコーディング配列に対して５’にある。特定の実施形態では、前記Ｃａｐコーディング配列は、操作可能に内在性Ｐ４０プロモーターにリンクされる。
様々な実施形態では、前記Ｃａｐタンパク質は、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶおよびヒツジＡＡＶ、およびそれらの修飾体、誘導体、または偽型のカプシドから選ばれる。
いくつかの実施形態では、前記カプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６またはＡＡＶｈｕ６８から選ばれる（ＷＯ２０２０／０３３８４２に記載され、その全体が引用により本明細書に組み込まれる）。前記ｈｕ６８カプシドは、ＷＯ２０１８／１６０５８２に記載され、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、前記カプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６またはＡＡＶｈｕ６８の誘導体、修飾体、または偽型である。
いくつかの実施形態では、前記カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選ばれる２または３の血清型からのカプシドタンパク質のキメラである。（ＷＯ２０２０／０３３８４２に記載され、その全体が引用により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、前記カプシドは、米国特許第８，９９９，６７８号に記載されるｒｈ３２．３３カプシドであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、前記カプシドは、ＡＡＶ１カプシドである。特定の実施形態では、前記カプシドは、ＡＡＶ５カプシドである。特定の実施形態では、前記カプシドは、ＡＡＶ９カプシドである。
様々な実施形態では、前記第一の統合された構成体は、更に第一の哺乳類細胞選択要素を含む。
様々な実施形態では、前記誘導可能なＲｅｐおよびＣａｐ構成体は、図８Ｂに示されている。いくつかの実施形態では、ＲｅｐおよびＣａｐをエンコードする前記誘導可能なポリヌクレオチド構成体は、Ｒｅｐポリペプチドの第一の部分、Ｒｅｐポリペプチドの第二の部分、Ｃａｐポリヌクレオチド、および削除可能な要素をエンコードする。前記削除可能な要素は、Ｒｅｐポリペプチドの第一の部分およびＲｅｐポリペプチドの第二の部分の間に配置される。前記削除可能な要素は、従って、Ｒｅｐをエンコードする配列に沿った任意の点において、Ｒｅｐポリペプチドをエンコードする配列を妨害できる。削除可能な要素の削除なしでは、Ｒｅｐは最小限発現されるか、または全く発現されない。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐポリペプチダーゼは野生型のＲｅｐポリペプチダーゼである。他の実施形態では、前記Ｒｅｐポリペプチダーゼは変異体Ｒｅｐポリペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐポリペプチダーゼは野生型のＣａｐポリペプチダーゼである。他の実施形態では、前記Ｃａｐポリペプチダーゼは変異体Ｃａｐポリペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、イントロン、エクソン、またはイントロンおよびエクソンを含む。特定の実施形態では、前記削除可能な要素は、５’から３’に向かって、５’スプライス部位、第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント；第一のｌｏｘ配列、３’スプライス部位、エクソン、停止シグナリング配列、第二のｌｏｘ配列を含む第二のスペーサーセグメント、第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメントを含む。前記第一のスペーサーセグメントおよび第三のスペーサーセグメントは、内在的な細胞機構により削除され得る。
いくつかの実施形態では、削除可能な要素の中の第二のスペーサーセグメントは、Ｃｒｅにより削除される。Ｃｒｅは、Ｃｒｅゲシクル（ｇｅｓｉｃｌｅ）等の外来性Ｃｒｅの任意の形態であり得る。Ｃｒｅは第二のポリヌクレオチド構成体によってもエンコードされ得る。いくつかの実施形態では、アデノウイルス・ヘルパータンパク質をエンコードする構成体は、Ｃｒｅもエンコードする。いくつかの実施形態では、セクション４．３．２の下に記載されるように、第二のポリヌクレオチド構成体も、誘導可能である。
いくつかの実施形態では、ＲｅｐおよびＣａｐの発現は、Ｐ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびそれらの組み合わせを含む野生型のプロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、削除可能な要素のエクソンは、任意の検出可能なマーカーであることができる。例えば、本明細書で考慮される検出可能なマーカーは、発光マーカー、蛍光マーカーまたは放射性同位体標識を含む。蛍光マーカーは、限定はされないが、ＥＧＦ、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＲＦＰ、またはその任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、ａ）Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列；ｂ）Ｒｅｐ遺伝子の第二の部分の配列；ｃ）Ｃａｐ遺伝子の配列；およびｄ）Ｒｅｐ遺伝子の配列の第一の部分およびＲｅｐ遺伝子の配列の第二の部分の間に配置された削除可能な要素を含む、ポリヌクレオチド構成体である。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、停止シグナリング配列を含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、ウサギβグロブリンイントロンを含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素はエクソンを含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素はイントロンとエクソンを含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素はイントロンを含む。いくつかの実施形態では、２つのスプライス部位が、Ｒｅｐ遺伝子の配列の第一の部分およびＲｅｐ遺伝子の配列の第二の部分の間に配置されている。いくつかの実施形態では、前記２つのスプライス部位は、５’スプライス部位および３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、５’スプライス部位はウサギβグロブリン５’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、３’スプライス部位はウサギβグロブリン３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、３つのスプライス部位が、Ｒｅｐ遺伝子の配列の第一の部分およびＲｅｐ遺伝子の配列の第二の部分の間に配置されている。いくつかの実施形態では、前記３つのスプライス部位は、５’スプライス部位ならびに第一の３’スプライス部位および第二の３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、第一の３’スプライス部位は、第二の３’スプライス部位の複製である。いくつかの実施形態では、第一の３’スプライス部位は、ウサギβグロブリン３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、第二の３’スプライス部位は、ウサギβグロブリン３’スプライス部位である。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は組み換え部位を含む。いくつかの実施形態では、前記組み換え部位は、ｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位である。いくつかの実施形態では、前記ｌｏｘ部位はｌｏｘＰ部位である。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、５’から３’に向かって、ａ）５’スプライス部位；ｂ）第一の組み換え部位；ｃ）第一の３’スプライス部位；ｄ）停止シグナリング配列；ｅ）第二の組み換え部位；およびｆ）第二の３’スプライス部位を含む。いくつかの実施形態では、前記削除可能な要素は、５’から３’に向かって、ａ）５’スプライス部位；ｂ）第一のスペーサーセグメント；以下のものを含む第二のスペーサーセグメント：ｉ）第一の組み換え部位；ｉｉ）第一の３’スプライス部位；ｉｖ）停止シグナリング配列；およびｖ）第二の組み換え部位；およびｄ）第二の３’スプライス部位を含む第三のスペーサーセグメントを含むものを含む。いくつかの実施形態では、前記第一のスペーサー配列はイントロンを含む。いくつかの実施形態では、前記第一のスペーサーセグメントは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：３に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントはイントロンを含む。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントは内在的な細胞機構により削除される能力を有する。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーセグメントはエクソンを含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーセグメントは更にポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリＡ配列はエクソンの３’である。いくつかの実施形態では、前記ポリＡ配列はウサギβグロブリン（ＲＢＧ）のポリＡ配列である。全ての請求項のポリヌクレオチド構成体であって、第二のスペーサーセグメントは、５’から３’に向かって：ａ）第一の組み換え部位：ｂ）第一の３’スプライス部位；ｃ）エクソン；ｄ）停止シグナリング配列；およびｅ）第二の組み換え部位を含む。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は、第一のｌｏｘ配列であり、および前記第二の組み換え部位は、第二のｌｏｘ配列である。いくつかの実施形態では、前記第一のｌｏｘ配列は第一のｌｏｘＰ配列であり、前記第二のｌｏｘ配列は第二のｌｏｘＰ配列である。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は、第一のＦＲＴ部位であり、前記第二の組み換え部位は、第二のＦＲＴ部位である。
いくつかの実施形態では、前記停止シグナリング配列は、前記エクソンの停止コドンであるか、またはポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、前記ポリＡ配列は、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）のポリＡ配列である。いくつかの実施形態では、前記エクソンは、検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーは、発光マーカーであるか、または蛍光マーカーである。いくつかの実施形態では、前記蛍光マーカーは、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの実形態では、前記第二のスペーサーセグメントは、リコンビナーゼにより削除可能である。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは部位特異的なリコンビナーゼである。前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドである、前記任意の１つの請求項のポリヌクレオチド構成体。前記Ｃｒｅポリペプチドが、リガンド結合ドメインに融合されている、前記任意の１つの請求項Ｘのポリヌクレオチド構成体。いくつかの実施形態では、前記リガンド結合ドメインは、ホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、前記ホルモン受容体は、エストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体は点変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体はＥＲＴ２である。前記任意の１つの請求項Ｘのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドであるポリヌクレオチド構成体。請求項９に記載の前記ポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼが第二のポリヌクレオチド構成体によりエンコードされるか、または外来的に提供されるもの。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐ遺伝子は、Ｒｅｐポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐ遺伝子は、Ｃａｐポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子の転写は、野生型のプロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記野生型のプロモーターは、Ｐ５、Ｐ１９、およびＰ４０を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐポリペプチダーゼは、野生型Ｒｅｐポリペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐポリペプチダーゼは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分、および前記エクソンから発現されるポリペプチドを含む、タンパク質に随伴する、欠失した複製随伴タンパク質は、リコンビナーゼの不在下で発現される能力を有する。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐポリペプチドは、野生型のＣａｐポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐポリペプチドは、ＡＡＶカプシドポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶカプシドポリペプチドは、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶカプシドタンパク質の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６およびＡＡＶｈｕ６８から成る群より選ばれる。
いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、選択可能マーカーをコーディングする配列を、更に含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、哺乳類細胞選択要素である。いくつかの実施形態では、前記選択可能マーカーは、栄養要求性選択要素である。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択要素は、活性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記活性タンパク質はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択コーディング配列は、活性のために第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する、不活性なタンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記不活性なタンパク質は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒである。請求項２～６までの、任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含むもの。請求項２～６までの、任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒが少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含むもの。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたスプリットインテインであるか、抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末端にリンクしたスプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたロイシンジッパーであるか、抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末制にリンクしたロイシンジッパーである。抗生物質抵抗性タンパク質は、ピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性である。
いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、ベクター中にある。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、プラスミド中にある。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、微生物の人工的な染色体中にあるか、または酵母の人工的な染色体中にある。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、合成核酸構成体である。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１～配列番号：３、配列番号６～配列番号：８、または配列番号：３２の任意のものに対して含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１～配列番号：３、配列番号６～配列番号：８、または配列番号：３２の任意のものに対して含む。
いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体は、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコードする配列は、転写的に不活性な配列である。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコードする配列は、その内部プロモーターに少なくとも２つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現はＵ６プロモーターにより駆動される。ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の配列の上流を含む、請求項Ｘの任意の１つのポリヌクレオチド構成体は、５’から３’に向かって：ａ）Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；ｂ）第一の組み換え部位；ｃ）スタッファー配列；ｄ）第二の組み換え部位；ｅ）Ｕ６プロモーター配列の第二の部分を含む。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、リコンビナーゼにより削除可能である。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、遺伝子をエンコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
本明細書で開示される誘導可能なＲｅｐおよびＣａｐをエンコードする、ポリヌクレオチド構成体の主要な利点は、哺乳類細胞中への安定な統合により、ＲｅｐおよびＣａｐの発現が、トランスフェクション薬剤またはプラスミドが存在しなくても誘導可能であることである。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される安定な細胞の集団は均一である。例えば、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％の安定細胞の集団は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をエンコードする、統合されたポリヌクレオチド構成体を含む。
構成体２（アデノウイルス・ヘルパー構成体（Ｅ２Ａ／Ｅ４を提供する））
本明細書で提供されるものは、１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質をエンコードする第二の構成体である。この第二のポリヌクレオチド構成体は、誘導可能なヘルパー構成体とも称される（アデノウイルス・ヘルパー構成体（Ｅ２Ａ／Ｅ４を提供する））。特定の実施形態では、前記アデノウイルス・ヘルパー構成体は、Ｅ２Ａ／Ｅ４の誘導可能な産生を提供する。いくつかの実施形態では、前記アデノウイルス・ヘルパー構成体は、更にタンパク質タグを含む。タンパク質標識は、ＦＬＡＧタグであり得る。いくつかの実施形態では、Ｅ２Ａは、ＦＬＡＧタグが付いたＥ２Ａである。いくつかの実施形態では、Ｅ４は、ＦＬＡＧタグが付いたＥ４である。ＦＬＡＧタグ等のタンパク質タグは、第二のポリヌクレオチド構成体のスクリーニングまたは統合、および誘導後の細胞中での第二のポリヌクレオチド構成体からのアドレノウイルス・ヘルパータンパク質の発現の確定のために用い得る。
いくつかの実施形態では、前記第二の統合された合成構成体は、条件付きで発現可能なＣｒｅリコンビナーゼ、および条件付きで発現可能なアデノウイルス・ヘルパータンパク質を含む。図２Ａに図示される、例示的な実施形態では、第三の発現の引き金を引く薬剤に前記細胞が接触される前に、前記第二の統合された合成構成体は、５’から３’に向かって：誘導可能なプロモーター、Ｃｒｅコーディング配列、第一のポリＡ配列、アデノウイルス・ヘルパータンパク質のコーディング配列、第二のポリＡ配列、構成的プロモーター、前記第一の発現の引き金を引く薬剤に対して応答性のタンパク質のコーディング配列、および第二の哺乳類細胞選択要素を含む。
典型的な実施形態では、前記Ｃｒｅコーディング配列は、操作可能に誘導可能なプロモーターにリンクする。様々な実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第三の発現の引き金を引く薬剤に対して応答性の要素を含む。特定の実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、テトラサイクリンの存在下で、Ｔｅｔ応答性の活性化因子タンパク質に結合する能力を有する、複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーター要素を含む。いくつかの実施形態では、前記複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーター要素は、テトラサイクリン応答性要素（ＴＲＥ）を形成する。いくつかの実施形態では、前記ＴＲＥは、１９塩基対が７回繰り返すオペレーター配列を含む。更なる実施形態では、前記ＴＲＥは、１９塩基対が７回繰り返すオペレーター配列を、最小限のＣＭＶプロモーター配列の上流に含む。
いくつかの実施形態では、前記第二の構成体は、更に第四の発現の引き金を引く薬剤に対して応答性の要素を更に含む。特定の実施形態では、第四の発現の引き金を引く薬剤に対して応答性の要素は、複数のホルモンに対して応答性の要素を含む。特定の実施形態では、前記ホルモンに対して応答性の要素は、エストロゲン応答性要素（ＥＲＥ）である。様々な実施形態では、第三の発現の引き金を引く要素は、第一の発現の引き金を引く要素と同じであり、第四の発現の引き金を引く要素は、第二の発現の引き金を引く要素と同じである。
いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅコーディング配列は、第一のｌｏｘ部位および第二のｌｏｘ部位の側面にある。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第三の発現の引き金を引く要素の存在下で、Ｔｅｔ応答性の活性化因子タンパク質に結合する能力を有する、複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーター要素を含む。特定の実施形態では、前記第三の発現の引き金を引く薬剤は、第一の発現の引き金を引く薬剤と同じである。
いくつかの実施形態では、前記第一のポリＡ配列は、Ｃｒｅコーディング配列と、アデノウイルスＥ２ＡおよびＥ４の１つのまたは両方をエンコードするアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列の間に位置する。アデノウイルス・ヘルパータンパク質のコーディング配列の上流（５’）に位置する３’ポリアデニル化シグナルは、下流のアデノウイルス・ヘルパー遺伝子、Ｅ２ＡおよびＥ４の基礎の発現を防止する。
いくつかの実施形態では、図２Ｃに示される、更なるセグメントは、構成体２からのＶＡ－ＲＮＡの誘導的産生を提供する。
この実施形態では、前記更なるセグメントは、Ｃｒｅ－誘導可能なＵ６プロモーターを含む。前記Ｕ６プロモーターは、スタッファー配列の側面にあるＬｏｘにより２部分に分割される。前記Ｕ６プロモーターは、前記スタッファー配列の存在のために不活性である。前記スタッファーのＣｒｅ媒介削除は前記Ｕ６プロモーターを活性化する。前記Ｕ６プロモーターは、ＶＡ ＲＮＡ１の転写的に不活性な変異体の発現を駆動する（好適な実施形態は、二重点変異Ｇ１６Ａ－Ｇ６０Ａである）。他の実施形態は、ＶＡ－ＲＮＡの代替的なソースを提供する。
様々な実施形態では、第一の引き金を引く薬剤に応答性のタンパク質のコーディング配列は操作可能にＣＭＶプロモーターにリンクされる。いくつかの実施形態では、第一の引き金を引く薬剤に応答性のタンパク質のコーディング配列はＴｅｔ応答性活性化因子タンパク質のコーディング配列を含む。特定の実施形態では、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質は、Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ活性化因子タンパク質である。
様々な実施形態では、第二の哺乳類細胞選択要素は、抗生物質抵抗性を与える。特定の実施形態では、前記抗生物質抵抗性を与える要素は、ブラストサイジン抵抗性遺伝子である。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパーポリヌクレオチド構成体は図２５の左または右に示される。本明細書では、複数の誘導可能なヘルパーポリヌクレオチドが考慮される。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパーポリヌクレオチド構成体は、ＶＡ ＲＮＡ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、またはそれらの組み合わせ等の１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、本開示は変異したＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列をコードする、誘導可能なポリヌクレオチド構成体を提供する。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡへの変異は、その内部プロモーターを不活性にする。例えば、図２５（左側）に示されるように、前記誘導可能なポリヌクレオチド構成体は、５’から３’方向へ、Ｕ６プロモーター配列の第一の部分、第一のｌｏｘ部位、スタッファー配列、第二のｌｏｘ部位、およびＵ６プロモーター配列の第二の部分を含むことができる。前記スタッファー配列は、任意のポリヌクレオチド配列であって、Ｃｒｅにより切除されるものであってよい。Ｃｒｅは、Ｃｒｅゲシクルの形態等で、外来的に提供される。Ｃｒｅは、同じ誘導可能なポリヌクレオチド構成体中にエンコードされることもでき、Ｃｒｅの発現は、ドキシサイクリンおよびタモキシフェン等の、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の存在下に条件付けされ得る。Ｃｒｅは、ホルモンにより活性化されたＣｒｅであることができる。
他の実施形態では、変異したＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列の代わりに、誘導可能なヘルパー構成体は、例えば、図２５（右側）に示されるように、変異していない構成的に発現されたＶＡ ＲＮＡを含み得る。
いくつかの実施形態では、誘導可能なヘルパーポリヌクレオチド構成体は、１つの以上のヘルパータンパク質、１つの以上のヘルパータンパク質の上流の自己を削除する要素、および前記自己を削除する要素の上流の誘導可能なプロモーターもエンコードする。前記自己を削除する要素の発現は、Ｔｅｔ－Ｏｎ－３Ｇシステムにより駆動され得る。例えば、前記構成体は、発現がＥ１αプロモーターにより駆動される、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ遺伝子配列を含むことができる。Ｅ１αプロモーターは、変異したＥ１αプロモーターであり得る。前記変異したＥ１αプロモーターは：ｇｇａｔｃｔｇｃｇａｔｃｇｃｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｇｔｃａｇｔｇｇｇｃａｇａｇｃｇｃａｃａｔｃｇｃｃｃａｃａｇｔｃｃｃｃｇａｇａａｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｃｇｇｃａａｔｔｇａａｃｇｇｇｔｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｔａａａｃｔｇｇｇａａａｇｔｇａｔｇｔｃｇｔｇｔａｃｔｇｇｃｔｃｃｇｃｃｔｔｔｔｔｃｃｃｇａｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇａａｃｃｇｔａｔｇｔａａｇｔｇｃａｇｔａｇｔｃｇｃｃｇｔｇａａｃｇｔｔｃｔｔｔｔｔｃｇｃａａｃｇｇｇｔｔｔｇｃｃｇｃｃａｇａａｃａｃａｇｃｔｇａａｇｃｔｔｃｇａｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｔｃｔｃｔｃｃｔｔｃａｃｇｃｇｃｃｃｇｃｃｇｃｃｃｔａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃａｔｃｃａｃｇｃｃｇｇｔｔｇａｇｔｃｇｃｇｔｔｃｔｇｃｃｇｃｃｔｃｃｃｇｃｃｔｇｔｇｇｔｇｃｃｔｃｃｔｇａａｃｔｇｃｇｔｃｃｇｃｃｇｔｃｔａｇｇｔａａｇｔｔｔａａａｇｃｔｃａｇｇｔｃｇａｇａｃｃｇｇｇｃｃｔｔｔｇｔｃｃｇｇｃｇｃｔｃｃｃｔｔｇｇａｇｃｃｔａｃｃｔａｇａｃｔｃａｇｃｃｇｇｃｔｃｔｃｃａｃｇｃｔｔｔｇｃｃｔｇａｃｃｃｔｇｃｔｔｇｃｔｃａａｃｔｃｔａｃｇｔｃｔｔｔｇｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｔｔａｃａｇａｔｃｃａａｇｃｔｇｔｇａｃｃｇｇｃｇｃｃｔａｃ（配列番号：２０）の配列を有し得る。
ドキシサイクリン等の第一の引き金を引く薬剤の存在下で、Ｔｅｔ－Ｏｎ－３Ｇは、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターに結合できる。この結合イベントにより、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターは、自己を削除する要素の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、前記削除要素は、ホルモンにより活性化されたＣｒｅである。タモキシフェン等の第二の引き金を引く薬剤の存在下で、Ｃｒｅの発現により、Ｃｒｅの自己削除それ自身が、下流のアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現を導く。従って、本明細書で開示される、誘導可能なヘルパー構成体を安定的に統合した、哺乳類細胞株は、少なくとも２つの引き金を引く薬剤（例えば、ドキシサイクリンおよびタモキシフェン）の存在下で、アドレノウイルス・ヘルパータンパク質だけを発現する。
いくつかの実施形態では、誘導可能なヘルパー構成体は、以下のものをコーディングするポリヌクレオチド構成体である：ａ）１つの以上のヘルパータンパク質；ｂ）１つの以上のヘルパータンパク質の上流の自己を削除する要素；およびｃ）前記自己を削除する要素の上流の誘導可能なプロモーター。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素は、操作可能に前記誘導可能なプロモーターにリンクされる。いくつかの実施形態では、自己を削除する要素の発現は、前記誘導可能なプロモーターにより駆動される。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、テトラサイクリン応答性プロモーター要素（ＴＲＥ）である。いくつかの実施形態では、前記ＴＲＥは、最小限のプロモーターに融合したＴｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列のコンカテマーを含む。いくつかの実施形態では、前記最小限のプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２２に対して含む。いくつかの実施形態では、活性化剤との結合により前記誘導可能なプロモーターにより転写が活性化される。いくつかの実施形態では、前記活性化剤は、第一の引き金を引く薬剤の存在下に、前記誘導可能なプロモーターに結合する。いくつかの実施形態では、活性化因子を更に含む。いくつかの実施形態では、前記活性化因子は、構成的プロモーターに操作可能にリンクされる。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、Ｅ１αプロモーターであるか、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記Ｅ１αプロモーターは、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２０に対して含む。いくつかの実施形態では、前記活性化剤は、ＶＰ１６転写促進ドメインに融合したＴｅｔリプレッサー結合タンパク質（ＴｅｔＲ）を含む、逆テトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｒＴＡ）である。いくつかの実施形態では、前記ｒＴＡは、ｔｅｔＲ ＤＮＡ結合部分に４つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記ｒＴＡは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２１に対して含む。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の引き金を引く薬剤の不在下に、リプレッサーに結合される。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の引き金を引く薬剤の存在下に活性化される。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤はリプレッサーに結合する。いくつかの実施形態では、前記リプレッサーは、テトラサイクリン制御トランス活性化因子である。いくつかの実施形態では、前記リプレッサーを更に含む。いくつかの実施形態では、前記リプレッサーは、操作可能に構成的プロモーターに結合される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン制御トランス活性化因子を更に含む。いくつかの実施形態では、前記テトラサイクリン制御トランス活性化因子トランス活性化因子は操作可能に構成的プロモーターに結合される。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、Ｅ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記Ｅ１αプロモーターは、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２０に対して含む。いくつかの実施形態では、前記テトラサイクリン制御トランス活性化因子は、第一の引き金を引く薬剤の存在下では結合されない。いくつかの実施形態では、前記テトラサイクリン制御トランス活性化因子は、第一の引き金を引く薬剤の存在下では結合しない。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモータはＥ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、Ｅ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２０に対して含む。いくつかの実施形態では、第一の引き金を引く薬剤が前記リプレッサーに結合すると、転写が前記誘導可能なプロモーターから活性化される。いくつかの実施形態では、前記リプレッサーは、前記第一の引き金を引く薬剤に結合する。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤はテトラサイクリンである。いくつかの実施形態では、前記テトラサイクリンはドキシサイクリンである。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターはクミン酸塩オペレーター配列である。いくつかの実施形態では、前記クミン酸塩オペレーター配列は、構成的プロモーターの下流にある。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の引き金を引く薬剤の不在下で、ｃｙｍＲリプレッサーに結合する。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の引き金を引く薬剤の存在下で、活性化される。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤は、ｃｙｍＲリプレッサーに結合する。請求項Ｘの任意の１つのポリヌクレオチド構成体は、ｃｙｍＲリプレッサーを更に含む。いくつかの実施形態では、前記ｃｙｍＲリプレッサーは、構成的プロモーターに操作可能に結合される。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、Ｅ１αプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記Ｅ１αプロモーターは少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：２０に対して含む。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤はクミン酸塩である。
いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素をコードする配列はポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素はリコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは部位特異的リコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼはリガンド結合ドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼはＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅポリペプチドはリガンド結合ドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、前記リガンド結合ドメインはホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、前記ホルモン受容体はエストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体は点変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体はＥＲＴ２である。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼはＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記自己を削除する要素は第二の引き金を引く薬剤の存在下で核に転座する。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、エストロゲン受容体リガンドである。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）である。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はタモキシフェンである。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは、組み換えサイトの側面にある。いくつかの実施形態では、前記組み換えサイトは、ｌｏｘ部位かまたはフリッパーゼ組み換え標的（ＦＲＴ）部位である。いくつかの実施形態では、前記ｌｏｘ部位はｌｏｘＰ部位である。
いくつかの実施形態では、前記１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質はＥ２ＡおよびＥ４を含む。いくつかの実施形態では、前記１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質は更にタンパク質タグを含む。いくつかの実施形態では、前記タンパク質標識ＦＬＡＧタグである。いくつかの実施形態では、前記Ｅ２Ａは、ＦＬＡＧによりタグ付けされたＥ２Ａである。いくつかの実施形態では、前記Ｅ２Ａをコーディングする配列および前記Ｅ４をコーディングする配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａにより分離されている。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、更に選択可能なマーカーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたスプリットインテインであるか、抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末制にリンクしたスプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたロイシンジッパーであるか、抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末端にリンクしたロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質は、ピューロマイシン抵抗性かまたはブラストサイジン抵抗性である。
いくつかの実施形態では、誘導可能なヘルパー構成体は、更にＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、転写的に不活性な配列である。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、内部プロモーター内に少なくとも２つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現はＵ６プロモーターにより駆動される。請求項Ｘの任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列の上流で５’から３’に向かって、以下のものを含むもの：ａ）Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；ｂ）第一の組み換え部位；ｃ）スタッファー配列；ｄ）第二の組み換え部位；ｅ）Ｕ６プロモーター配列の第二の部分。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列はリコンビナーゼにより削除可能である。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は遺伝子をエンコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列はプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
いくつかの実施形態では、前記遺伝子は検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたスプリットインテインであるか、抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末端にリンクしたスプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたロイシンジッパーであるか、抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末端にリンクしたロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、哺乳類細胞選択要素である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、栄養要求性選択要素である。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択要素は活性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記活性タンパク質はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択コーディング配列は、活性のために第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する不活性なタンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記不活性なタンパク質は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒである。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含む。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含む。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質は、ピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性である。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーは、発光性マーカーまたは蛍光マーカーである。いくつかの実施形態では、前記蛍光マーカーはＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は第一のｌｏｘ配列であり、前記第二の組み換え部位は第二のｌｏｘ配列である。いくつかの実施形態では、前記第一のｌｏｘ配列は、第一のｌｏｘＰ配部位であり、前記第二のｌｏｘ配列は、第二のｌｏｘＰ配部位である。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は、第一のＦＲＴ部位であり、前記第二の組み換え部位は、第二のＦＲＴ部位である。
いくつかの実施形態では、誘導可能なヘルパー構成体は、ベクター中にある。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、プラスミド中にある。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、微生物の人工的な染色体中にあるか、または酵母の人工的な染色体中にある。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、合成核酸構成体である。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：９～配列番号：１９、配列番号２３～配列番号：３２、または配列番号：３５の任意の１つに対して含む。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：９～配列番号：１９、配列番号２３～配列番号：３２、または配列番号：３５の任意の１つに対して含む。
いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド構成体を含み、ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列では内部プロモーターに少なくとも２つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコードする別のポリヌクレオチド構成体では、ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は内部プロモーターに少なくとも２つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、転写的に不活性なＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、前記プロモーター領域に約５～１０ヌクレオチドの削除を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの変異は、Ａ Ｂｏｘプロモーター領域にある。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの変異は、Ｂ Ｂｏｘプロモーター領域にある。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの変異は、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａである。いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡの発現はＵ６プロモーターにより駆動される。請求項Ｘの任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列の上流に５’から３’に向かって以下のものを含むもの：ａ）Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；ｂ）第一の組み換え部位；ｃ）スタッファー配列；ｄ）第二の組み換え部位；ｅ）Ｕ６プロモーター配列の第二の部位。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、リコンビナーゼにより削除可能である。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、遺伝子をエンコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は、プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードするる。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは哺乳類細胞選択要素である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは栄養要求性選択要素である。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択要素は活性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記活性なタンパク質はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択コーディング配列は、活性のために第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する不活性なタンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記不活性なタンパク質は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒである。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含む。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質はピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性である。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーは、発光マーカーまたは蛍光マーカーである。いくつかの実施形態では、前記蛍光マーカーは、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、ＶＡ ＲＮＡ、またはリコンビナーゼをコードする配列を更に含むＶＡ ＲＮＡをコードする、ポリヌクレオチド構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは外来的に提供される。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは部位特異的リコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼはＣｒｅポリペプチダーゼか、またはフリッパーゼポリペプチダーゼである。いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅポリペプチドはリガンド結合ドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、前記リガンド結合ドメインはホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、前記ホルモン受容体はエストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体は点変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体はＥＲＴ２である。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼはＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は第一のｌｏｘ配列であり、前記第二の組み換え部位は第二のｌｏｘ配列である。いくつかの実施形態では、前記第一のｌｏｘ配列は第一のｌｏｘＰ部位であり、前記第二のｌｏｘ配列は第二のｌｏｘＰ部位である。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位は第一のＦＲＴ部位であり、前記第二の組み換え部位は第二のＦＲＴ部位である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される前記ＶＡ ＲＮＡを含む構成体は、更に選択可能なマーカーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたスプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末端にリンクしたスプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクしたロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末端にリンクしたロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質はピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性である。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、ＶＡ ＲＮＡをコーディングするポリヌクレオチド構成体を含むか、またはＶＡ ＲＮＡ構成体はベクター中にある。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、ＶＡ ＲＮＡをコーディングするポリヌクレオチド構成体を含むか、またはＶＡ ＲＮＡ構成体はプラスミド中にある。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、ＶＡ ＲＮＡをコーディングするポリヌクレオチド構成体を含むか、またはＶＡ ＲＮＡ構成体は微生物の人工的染色体中にあるか、または酵母の人工的染色体中にある。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、ＶＡ ＲＮＡをコーディングするポリヌクレオチド構成体を含むか、またはＶＡ ＲＮＡ構成体は合成核酸構成体である。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１３～配列番号：１９または配列番号２３～配列番号：２の任意の１つに対して含む。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：１３～配列番号：１９または配列番号２３～配列番号：２の任意の１つに対して含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡ構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１３～配列番号：１９または配列番号２３～配列番号：２の任意の１つに対して含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡ構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１３～配列番号：１９または配列番号２３～配列番号：２の任意の１つに対して含む。
構成体３（ペイロードをエンコードするポリヌクレオチド）
いくつかの実施形態では、前記第三の統合された合成構成体は、削除可能なペイロードのコーディング配列、および第三の哺乳類細胞選択要素を含む。図４に示される例示的な実施形態では、前記削除可能なペイロードは、構成的プロモーターの制御下にある。この構成体は、相互交換可能に、構成体３、またはペイロード構成体と称されることができる。
いくつかの実施形態では、発現可能なペイロードはガイドＲＮＡをエンコードする。特定の実施形態では、前記ガイドＲＮＡはＤＮＡ編集を命令する。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡはＣＡＳ媒介ＤＮＡ編集を命令する。いくつかの実施形態では、前記第三の統合された合成構成体は、本明細書で開示される削除可能なペイロードの任意のものをエンコードする配列を含む。例えば、前記配列は任意の治療薬をエンコードできる。例えば、前記治療薬は、導入遺伝子、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡサプレッサー、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、任意の遺伝子編集酵素、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。いくつかの実施形態では、前記第三の統合された合成構成体は、本明細書で開示される１つの以上の削除可能なペイロードをエンコードする配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記削除可能なペイロードはタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記削除可能なペイロードは酵素であり、置換遺伝子療法にとって有用である。いくつかの実施形態では、タンパク質は治療用抗体である。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はワクチン抗原である。特定の実施形態では、前記ワクチン免疫原はウイルスタンパク質である。
いくつかの実施形態では、前記発現可能なペイロードは、相同性組み換えのための相同性構成体である。
様々な実施形態では、前記第三の哺乳類細胞選択要素は、栄養要求性選択要素である。
いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：３３に対して含む。いくつかの実施形態では、前記いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：３３に対して含み、配列番号：配列番号：３３中の３４は、目的のペイロードの配列により置換される。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロードの配列を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードの配列の発現は、構成的プロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターおよびペイロードの配列はＩＴＲ配列の側面にある。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は、遺伝子をコーディングするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、治療的ポリペプチドか、または導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は、治療的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの配列を含む。いくつかの実施形態では、前記治療的ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡサプレッサーまたはガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、タンパク質に結合する能力のある、ポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、Ｃａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は前記細胞の遺伝子に安定的に統合される。いくつかの実施形態では、前記複数のペイロード構成体は前記細胞の遺伝子に安定的に統合される。いくつかの実施形態では、前記複数のペイロード構成体は前記細胞の遺伝子に別々に安定的に統合される。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、更にＩＴＲ配列外にある選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、哺乳類細胞選択要素である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、栄養要求性選択要素である。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択要素は活性タンパク質のためのものである。いくつかの実施形態では、前記活性タンパク質はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択コーディング配列は、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記第二の栄養要求性の選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記不活性タンパク質は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーはＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒである。請求項２～６までの、任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含むもの。請求項２～６までの、任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒが少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含むもの。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＩＴＲの外部の選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記ＩＴＲの外部の選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質は、ピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性である。
宿主産生細胞
前記複数の合成核酸構成体は、産生宿主細胞のゲノムに統合される。いくつかの実施形態では、前記産生細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、前記産生細胞は哺乳類細胞である。
典型的な実施形態では、前記産生細胞はアデノウィルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する哺乳類細胞株である。特定の実施形態では、前記細胞は、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株か、またはその誘導体（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞）、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するヒトＨｅＬａ細胞株、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、またはアデノウィルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するＶｅｒｏ細胞である。特定の実施形態では、前記宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
特定の実施形態では、前記宿主細胞は、ＤＨＦＲヌルである。特有の実施形態では、前記宿主細胞は、ＤＨＦＲヌルＨＥＫ２９３細胞である。
いくつかの実施形態では、前記ＨＥＫ２９３細は、ＡＡＶ Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。ドキシサイクリンおよびタモキシフェンの存在下に前記ＥＲ２ Ｃｒｅは、前記第一の統合された合成構成体から削除され、それによりＡＡＶ Ｅ２ＡおよびＥ４の発現を許容する。自己削除されるＥＲ２ Ｃｒｅは、第二の統合された合成構成体中のＥＧＦＰカセットの側面にあるｌｏｘ部位のおかげで組み換えし、それにより第二の統合された合成構成体中の前記第二のスペーサーからＥＧＦＰセグメントを除去する。そのようなものとして、引き金を引く薬剤の添加に続いて、第二の統合された合成構成体のみを含む任意の細胞は、ＥＧＦＰのシグナルに対して陽性である一方、第一のおよび第二の統合された合成構成体を含む細胞は、ＥＧＦＰのシグナルに対して陰性である。ＥＧＦＰのシグナルの不在は、第一のおよび第二の統合された合成構成体の両方が、細胞中に成功裡にトランスフェクトされたことを示す。このことは、更に抗生物質抵抗性選択、例えば、ブラストサイジン抵抗性により確実になる。
加えて、ＥＧＦＰカセットの除去は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の機能的発現を提供し、これらはＤＨＦＲ選択要素、例えば、Ｚ－Ｃｔｅｒ ＤＨＦＲにリンクされ得る。前記Ｚ－Ｃｔｅｒ ＤＨＦＲは、第三の統合された合成構成体中に存在する、第二のＤＨＦＲ選択要素、例えば、Ｚ－Ｎｔｅｒ ＤＨＦＲと会合し、例えばＨＴを欠く選択培地中で、細胞が生存することを許容する活性分子を形成する能力がある。
いくつかの実施形態では、前記第三の統合された合成構成体はペイロードを含む。このペイロードは、ガイドＲＮＡ（図４および５Ｂ）、ＨＤＲ相同性領域、または目的の遺伝子である。
要約すると、このシステムの好適な実施形態は、１つの抗生物質抵抗性マーカー、および全ての３つのプラスミドの選択のための２つの分割された栄養要求性構成体だけを要求し、前記全ての３つのプラスミドのそれぞれが、ただ一度だけ、ＤＨＦＲノックアウト種に変換され、保存できるウイルス粒子産生のためのマスター細胞株を産生し、その後は保存され、次いで更なる変換なしでスケールアップされた産生に利用される。このアプローチは、典型的にはＲｅｐ／Ｃａｐ産生に伴う毒性を避けながら、および治療用製品には好まれない複数の抗生物質による選択を避けながらの、Ｒｅｐ／Ｃａｐ生成物の発現に対する誘導可能な制御を提供する。Ｒｅｐ／Ｃａｐの過剰発現および複数の抗生物質には毒性があることができ、減少したウイルス粒子産生をもたらす。前記変換された細胞は、凍結保存して、後続の適用のために解凍することはできない。
ペイロード
本明細書で開示されるものは、ペイロードをエンコードするポリヌクレオチド構成体３によりエンコードされ得る、ペイロードである。このポリヌクレオチド構成体３は、本明細書では、「ペイロード構成体」または「治療的ペイロード」と称される。従って、本明細書で開示されるものは、ペイロードをカプシドで被覆する安定な哺乳類細胞株である。前記ペイロードは、発現可能なペイロードであり得る。前記ポリヌクレオチドは、任意の治療薬をエンコードできる。例えば、前記治療薬は、導入遺伝子、ガイドＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡサプレッサー、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、任意の遺伝子編集酵素、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される前記安定な哺乳類細胞株は、１つの以上のペイロードをカプシドで覆うｒＡＡＶウイルス粒子を条件付きで産生できる。本明細書で開示される、任意のペイロードの組み合わせが考慮される。
分割された栄養要求性選択
前記細胞ゲノム中に構成体を安定的に維持するためには、選択圧が必要である。
典型的には、それぞれの統合された核酸構成体が、哺乳類細胞選択要素を含む。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株は、３つの統合された核酸構成体を含み、この第一の核酸構成体は、第一の哺乳類細胞選択要素を、この第二の核酸構成体は、第二哺乳類細胞選択要素を、およびこの第三の核酸構成体は、第三哺乳類細胞選択要素を含む。
図５Ａは、単一の選択圧の下で、２つの統合された核酸構成体の安定な保持を許容する例示的な分割された栄養要求性選択システムを示す。１つの構成体は、ロイシンジッパータンパク質に融合した、哺乳類ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のＮ－末端フラグメント（“Ｎｔｅｒ－ＤＨＦＲ”）をエンコードする。このＮ－末端フラグメントは、酵素的に非機能的である。他の構成体は、ロイシンジッパータンパク質に融合した、ＤＨＦＲのＣ－末端フラグメント（“Ｃｔｅｒ－ＤＨＦＲ”）をエンコードする。このＣ－末端フラグメントは、酵素的には非機能的である。両方のフラグメントが前記細胞内で同時に発現されると、ロイシンジッパータンパク質の会合を通じて、機能的なＤＨＦＲ酵素複合体が形成される。両方の構成体は、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠いた培地の中での、ＤＨＦＲヌル細胞のゲノム中に安定的に保持される。
図５Ｂは、引き金を引く前の図１の複数構成体システムにおける、分割された栄養要求性選択デザインの例示的な展開を示す。この実施形態では、分割された栄養要求性選択要素が、構成体１および３に展開される。別の例示的な抗生物質選択要素である、ブラストサイジン抵抗性が、構成体２に展開される。このことが、単一の抗生物質を用い、ブラストサイジンを含み、チミジンおよびヒポキサンチンを欠いた培地中での培養により、全ての３つの構成体を安定的に哺乳類細胞株に維持する能力をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書で記載されるように、前記構成体２は更にＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡは、変異したＶＡ ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡは、転写的に不活性なＶＡ ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、前記Ｕ６プロモーターは、条件付きで活性である。いくつかの実施形態では、前記Ｕ６プロモーターは、引き金を引く薬剤（例えば、この引き金を引く薬剤は、本明細書に記載されるリコンビナーゼの発現を誘導する）の添加により、フロックス（２つのｌｏｘＰ部位でＤＮＡ配列をサンドイッチすること）される能力を有する妨害配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記第一の核酸構成体は、第一の哺乳類細胞選択要素を含み、この第一の哺乳類細胞選択要素は、第一の栄養要求性選択要素である。特定の実施形態では、前記第一の栄養要求性選択要素は、活性タンパク質をエンコードする。特定の実施形態では、前記第一の栄養要求性選択要素は、ＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記第一の栄養要求性選択コーディング配列は、活性のために第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を必要とする不活性なタンパク質をエンコードする。特定の実施形態では、前記第一の栄養要求性選択要素は、Ｚ－Ｃｔｅｒ－ＤＨＦＲ（配列番号：５）をエンコードする。
様々な実施形態では、第二の核酸構成体は第二の哺乳類細胞選択要素を含み、およびこの第二の哺乳類細胞選択要素は、抗生物質抵抗性をエンコードする。特定の実施形態では、前記抗生物質抵抗性遺伝子はブラストサイジン抵抗性遺伝子である。
様々な実施形態では、前記第三の核酸構成体は第三の哺乳類細胞選択要素を含む。いくつかの実施形態では、前記第三の核酸構成体は第二の栄養要求性選択要素である。特定の実施形態では、前記第二の栄養要求性選択要素は活性タンパク質をエンコードする。特定の実施形態では、前記第二の栄養要求性選択要素はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記第二の栄養要求性選コーディング配列は、活性のために第一の栄養要求性選択コーディング配列の発現を必要とする不活性なタンパク質をエンコードする。特定の実施形態では、前記第二の栄養要求性選択要素は、Ｚ－Ｎｔｅｒ－ＤＨＦＲ（配列番号：４）をエンコードする。
様々な実施形態では、前記安定な哺乳類細胞株は、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠いた培地中での成長により増殖する。
完全なシステムの詳細
前記第一の統合された合成構成体は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質のコーディング配列の中に挿入された妨害するスペーサー配列を含む。前記妨害するスペーサー配列は、、２つのｌｏｘ部位の側面にあり、ＲＢＧイントロン内にある強化された緑の蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、およびウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含む。前記ＲＢＧイントロンは、５’スプライス部位（５’ＳＳ）および３’スプライス部位（３’ＳＳ）を含む（図３Ａ～３Ｂに示されるように）。前記ＲＢＧイントロンは、Ｒｅｐ内在性のＰ５およびＰ１９プロモーターの下流に挿入され、Ｒｅｐコーディング配列を遮断する。このデザインは、Ｐ５およびＰ１９プロモーター’の両方により生成されたＲｅｐタンパク質の発現をブロックする。前記ＥＧＦＰは、成功した統合の可視的なインディケータ―として機能し、およびＣｒｅ媒介削除の監視のために機能し、ならびに任意の適切なマーカーにより置換され得る。例えば、ＥＧＦＰ発現の損失は、成功したＣｒｅ媒介ゲノム組み換えを示す（図３Ｂ参照）。現在のアプローチは、３’スプライス部位（３’ＳＳ）の複製なしでの、ＥＧＦＰおよびポリＡのイントロンへの挿入に依存する。もしポリＡの後に読み過ごしがあると、５’ＳＳは野生型の３’ＳＳに組み合わされることができ、従って、全てのＲＢＧイントロンを取り除き、および結果としてＲｅｐ発現を開始する。対照的に、本明細書に記載されるデザインは、ＥＧＦＰの上流に追加的な３’ＳＳを含み、望まれないＲｅｐ発現の問題を解決する。現在のデザインは、もし読み過ごしがある場合には、前記構成体は、３’ＳＳの上流の５’ＳＳへのスプライシングを可能にする。いかなる理論にも束縛されることなしに、前記５’ＳＳに最も近い追加的な３’ＳＳが好適である、というのは、これは下流の３’ＳＳと同一であり、これら２つの３’ＳＳが等しい強度を持つからである。そのようなものとして、全てのＲｅｐタンパク質が、ＥＧＦＰに融合して産生され、次いで終了する。万一、Ｒｅｐタンパク質がＥＧＦＰ後にも終了しない場合、それらは、ＲＢＧイントロンの残りによってコードされるコドンを産生し続け、それによって、非機能的なＲｅｐタンパク質を作成する。このアプローチは、アデノウィルスおよび細胞の成長に対して阻害的な効果を有し得る、Ｒｅｐタンパク質の過剰発現を防止し、それによって、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構成体の毒性を軽減する。
本明細書に記載されるように、機能的なＲｅｐタンパク質の発現は、第一の引き金を引く薬剤の存在、例えばＣｒｅの産生をもたらす、ドキシサイクリンの添加によってのみ誘導される。Ｃｒｅの存在下で、遮断するスペーサーが削除され、それによりＲｅｐタンパク質の完全なままのコーディングシークエンシングが再開される。このアプローチは、制御された誘導可能なＲｅｐ発現を提供する。
これは、第二の統合された合成構成体により駆動され、この構成体は、エストロゲン誘導可能なＣｒｅ（ＥＲ２ Ｃｒｅ）遺伝子、およびアドレノウイルス・ヘルパータンパク質、Ｅ２ＡおよびＥ４ ｏｒｆ６（Ｅ４）を含む（図１、２Ａ～２Ｂ、３Ａ～３Ｂ、および６を参照）。
特定の実施形態では、前記第三の統合された合成核酸構成体（「構成体三」）は、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ、図１、図４、図５Ｂ、および図６）に、括弧で示される）の側面にあるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、前記第三の統合された合成核酸構成体は、上記のセクション４．４．５に記載されるように、分裂した栄養要求性選択の成分を更に含む。特定の実施形態では、前記分裂した栄養要求性選択の構成成分は、ロイシンジッパーに融合した、第一の酵素的に非機能的なジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）フラグメントを含む。同様にロイシンジッパーに融合した第二のＤＨＦＲとの結合は、活性な複合体を産生しおよび第一および第三の統合された合成構成体の両方を発現する細胞についての選択を可能にする。前記構成体３のポリヌクレオチドは、少なくともガイドＲＮＡ、目的の遺伝子、導入遺伝子、ＨＤＲ相同性領域、ミニ遺伝子、または治療的ポリヌクレオチドを含み得る。このアプローチでは、複数の合成核酸構成体が、安定的に細胞の核ゲノムに統合されるために、細胞培養培地中に、単独の栄養要求性選択薬剤および単独の抗生物質選択薬剤のみを必要とする。このアプローチは、例えば、遺伝子療法などの下流の応用に対して望ましくない、複数の抗生物質抵抗性選択を回避する。
１つの態様では、本明細書により提供されるものは、安定な哺乳類細胞株であり、この細胞は、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力があり、この粒子の中には発現可能なペイロードがパッケージ化され；およびウイルス粒子産生は、細胞内のエピソームの存在により、条件付けはされなくなる。
様々な実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の発現は条件付きである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の発現は、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加により条件付けされる。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の発現は、前記細胞培養培地への第一の発現の引き金を引く薬剤および第二の発現の引き金を引く薬剤の添加により条件付けされる。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加の前は、細胞毒性レベルのＲｅｐタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加の前は、細胞毒性レベルのＲｅｐタンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、前記細胞中のＲｅｐタンパク質の平均濃度は、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加の前は、１～９９％、１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、４０～６０％の間未満である。いくつかの実施形態では、前記細胞中のＲｅｐタンパク質の平均濃度は、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加の前は、約１％、５％、１０％、１５％、２０、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０、９５％、または９９％未満である。
様々な実施形態ではＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加後は、構成的になる。アデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現が条件付きであるものを含む、前記安定な細胞株。いくつかの実施形態では、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤の添加後は、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現は、条件付きになる。いくつかの実施形態では、前記細胞培養培地への少なくとも第一の発現の引き金を引く薬剤および第二の発現の引き金を引く薬の添加後は、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現は、条件付きになる。いくつかの実施形態では、発現の引き金を引いた後は、継続したアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現は、前記細胞培養培地への第一の発現の引き金を引く薬剤の存在だけを要求する。
いくつかの実施形態では、アデノウイルス・ヘルパータンパク質は、Ｅ２ＡおよびＥ４を含む。
いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤は、テトラサイクリンである。いくつかの実施形態では、前記テトラサイクリンはドキシサイクリンである。
いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、エストロゲン受容体リガンドである。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体リガンドは、選択的前記エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）である。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体リガンドは、タモキシフェンである。
いくつかの実施形態では、ペイロードの発現は、前記細胞培養培地への発現の引き金を引く薬剤の添加によっては、条件付けされない。
様々な実施形態では、前記細胞の核ゲノムは、複数の統合された合成核酸構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞の核ゲノムは２つの統合された合成構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞の核ゲノムは３つの統合された合成構成体を含む。いくつかの実施形態では、複数の合成核酸構成体のそれぞれは、前記細胞の核ゲノムに別々に統合される。
いくつかの実施形態では、前記細胞の核ゲノム中に、全ての複数の合成核酸構成体が安定的に維持するためには、前記細胞培養培地中に、単一の非栄養要求性選択薬剤が存在することが要求される。
いくつかの実施形態では、第一の統合された合成構成体は、条件付きで発現可能なＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコーディング配列を含み；第二の統合された合成構成体は、条件付きで発現可能なＣｒｅコーディング配列および条件付きで発現可能なアデノウイルス・ヘルパータンパク質のコーディング配列を含み；および第三の統合された合成構成体は、ペイロードの発現可能なコーディング配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記第一の統合された合成構成体は、介入するスペーサーにより遮断されるＲｅｐコーディング配列を含む。いくつかの実施形態では、前記介入するスペーサーは、５’から３’に向かって、第一のスペーサー、第二のスペーサー、および第三のスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、前記介入するスペーサーは、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）イントロンおよびウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡの核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一のスペーサーは、配列番号：１に対して少なくとも８０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、前記第一のスペーサーは、第一のスペーサーの５’に、５’スプライス部位（５’ＳＳ）を含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーは、配列番号：２に対して少なくとも８０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーは、５’から３’に向かって、第一のｌｏｘ部位、強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、前記ＲＢＧポリＡ配列、およ第二のｌｏｘ部位を含む。いくつかの実施形態では、前記第二のスペーサーは、第一のｌｏｘ部位およびＥＧＦＰの側面にある、第一の３’スプライス部位（３’ＳＳ）を更に含む。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーは、配列番号：３に対して少なくとも８０％の同一性を含む。いくつかの実施形態では、前記第三のスペーサーは、前記第三のスペーサーの３’に対して第二の３’スプライス部位（３’ＳＳ）を更に含む。
いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐコーディング配列は、内在的なＰ５プロモーターに操作可能にリンクされた、ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐコーディング配列は、内在的なＰ１９プロモーターに操作可能にリンクされた、ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記介入するスペーサーは、Ｐ１９プロモーターの下流の位置のＲｅｐコーディング配列中に挿入される。いくつかの実施形態では、前記介入するスペーサーは、Ｐ５プロモーターおよびＰ１９プロモーターの活性化から産生されたタンパク質を有するフレーム内の位置で、Ｒｅｐコーディング配列中に挿入される。いくつかの実施形態では、前記Ｒｅｐコーディング配列は、Ｃａｐコーディング配列の５’にある。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｐコーディング配列は、内在的なＰ４０プロモーターに操作可能にリンクされる。
いくつかの実施形態では、前記第二の統合された構成体は、５’から３’に向かって、Ｃｒｅコーディング配列、および第一のポリＡ配列、アデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列、および第二のポリＡ配列、第一の発現の引き金を引く薬剤に応答性の要素、ならびに抗生物質選択要素を含む。いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅコーディング配列は、第一のｌｏｘ部位および第二のｌｏｘ部位の側面にある。いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅコーディング配列は、リンク可能に誘導可能なプロモーターにリンクされる。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の発現の引き金を引く薬剤の存在下で、Ｔｅｔ応答性活性化剤タンパク質に結合する能力を有する、複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーター要素を含む。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の発現の引き金を引く薬剤および第二の発現の引き金を引く薬剤に応答性の要素の存在下で、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質に結合する能力を有する、複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーター要素を含む。いくつかの実施形態では、前記アデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列は、Ｅ２ＡおよびＥ４配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第一の発現の引き金を引く薬剤に応答性の要素は、操作可能にＣＭＶプロモーターにリンクされている。いくつかの実施形態では、前記第一の発現の引き金を引く薬剤に応答性の要素は、Ｔｅｔ応答性活性化剤タンパク質（Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ）を含む。いくつかの実施形態では、前記抗生物質選択要素は、ブラストサイジン抵抗性である。
いくつかの実施形態では、前記第三の統合された合成構成体は、発現可能なペイロードのコーディング配列、および栄養要求性選択薬剤の第一の要素を含み、および第一の統合された合成構成体は、栄養要求性選択薬剤の第二の要素のコーディング配列を含む。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択薬剤の第一の要素は、第一のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）選択可能なマーカー（配列番号：４）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲは、ロイシンジッパー（Ｎｔｅｒ）を含む。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択薬剤の第二の要素は、第二のＤＨＦＲ（配列番号：５）を含む。いくつかの実施形態では、前記第二のＤＨＦＲは、ロイシンジッパー（Ｃｔｅｒ）を含む。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ選択は、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠いた培地中で成長する能力を含む。
いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞株は、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株、ヒトＨｅＬａ細胞株、およびチャイニーズハムスター子宮（ＣＨＯ）細胞株から成る群から選ばれる。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞株である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞株は、アデノウイルス・ヘルパー機能Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する。
Ａ．安定な哺乳類細胞または細胞株
本明細書で記載されるように、前記安定な哺乳類細胞または細胞株は、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株、またはヒトＨｅＬａ細胞株等のヒトから誘導された細胞または細胞株、またはチャイニーズハムスター子宮（ＣＨＯ）細胞株等の哺乳類細胞または細胞株であることができる。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞株はＨＥＫ２９３細胞株である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞株はアデノウィルス・ヘルパー機能Ｅ１ＡおよびＥ１を発現する。
Ｂ．第一の統合された合成構成体
示されるものは、第一の統合された合成構成体の例示的なデザインである（図１、３Ｂおよび６）。
図３Ａ～３Ｂに記載されるように、前記第一の統合された合成構成体は、Ｃａｐコーディング配列の５’のＲｅｐコーディング配列を含む。前記Ｒｅｐコーディング配列は介入するスペーサーにより遮断される。いくつかの実施形態では、前記第一の統合された合成構成体は、栄養要求性選択マーカー等の選択要素を含む（図５Ｂ）。いくつかの実施形態では、前記選択要素は、非栄養要求性選択マーカーの部分的または第二の要素である。前記介入するスペーサーは、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）イントロン中の強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）カセットの上流にある、ＲＢＧ３’スプライス部位（３’ＳＳ）を複製することにより修飾された、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）イントロンを含む。前記ＥＧＦＰカセットは、この重複したスプライス部位の直下の下流で、ウサギβグロブリン信号に続いてクローン化される。この全体の修飾（３’ＳＳ、ＥＧＦＰおよびポリＡ）は、２つのｌｏｘ部位の側面にあるため、Ｃｒｅが発現されると、このモジュールは除去される。この修飾されたウサギβグロブリンイントロン（介入するスペーサー配列）は、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質のコーディング配列に挿入される。挿入点はＰ１９プロモーターの下流であり、既知の規制要素からはるかに離れている。それはＰ５およびＰ１９タンパク質から産生されたフレーム中にもあるので、ＥＧＦＰの発現が可視化される。任意の血清型からのＣａｐ遺伝子が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐカセットの下流にクローン化される。このＣａｐ遺伝子は、それらの内在的なＰ４０プロモーターにより駆動される。Ｃｒｅの不在下では、５’スプライス部位（５’ＳＳ）は、３’ＳＳの上流でスプライスされるので、ＥＧＦＰは、終末エクソンになり、転写がβグロブリンポリアデニル化シグナルで停止する。従って、Ｐ５またはＰ１９プロモーターのいずれかからのＲｅｐタンパク質の発現は、時期尚早に停止される。Ｐ４０プロモーターの発現は、Ｒｅｐタンパク質の存在に依存するために、Ｐ４０プロモーターは、サイレントであり、Ｃａｐタンパク質の発現はない。第二の統合された合成構成体からのＣｒｅ発現により、第二のスペーサー要素全体（左のｌｏｘ部位を除き）が、βグロブリンイントロンから削除される。前記５’ＳＳが、今や野生型の３’ＳＳとスプライスされ、全てのＲｅｐタンパク質の発現が開始する。Ｒｅｐ発現はＰ４０タンパク質を活性化し、Ｃａｐタンパク質も、従って発現される。
Ｃ．第二の統合された合成構成体
示されるものは第二の統合された合成構成体の例示的なデザインである（図２Ａ～２Ｃ）。
図２Ａに示されるように、前記第二の統合された合成構成体は、５’から３’に向かって、Ｃｒｅコーディング配列、および第一のポリＡ配列、アデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列および第二のポリＡ配列、第一の引き金を引く薬剤に応答性の要素、ならびに抗生物質選択要素を含む。前記Ｃｒｅコーディング配列は、第一のｌｏｘおよび第二のｌｏｘ部位の側面にあり、ならびに誘導可能なプロモーターに操作可能にリンクされている。前記誘導可能なプロモーターは、第一の引き金を引く薬剤、例えば、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンの存在下に、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質に結合する能力を有する、複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーター要素を含む。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なプロモーターは、第一の引き金を引く薬剤および第二の引き金を引く薬剤、例えば、タモキシフェンンの存在下にＴｅｔ応答性活性化因子タンパク質に結合する能力を有する、複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーター要素を含む。前記第一の引き金を引く要素は、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質（Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ）を含むことができ、操作可能にＣＭＶプロモーターにリンクされる。前記抗生物質選択要素はブラストサイジン抵抗性（図５Ｂ）である。図２Ｃに示される随意的な挿入は、アデノウィルスの複製に必須の短い非コーディング転写産物である、ＶＡ－ＲＮＡの誘導可能な産生を提供する。構成体２の代替的な挿入である、この構成体では、転写的に不活性なＶＡ ＲＮＡ１の発現を駆動するＣｒｅ誘導可能なＵ６プロモーターを含む（好適な実施形態は、二重点変異体Ｇ１６Ａ－Ｇ６０Ａである）。前記Ｕ６プロモーターは、スタッファー配列の側面にあるＬｏｘにより２部分に分割される。前記Ｕ６プロモーターは、前記スタッファー配列の存在のために不活性である。前記スタッファー配列のＣｒｅ媒介削除は、前記Ｕ６プロモーターを活性化し、次いでＶＡ ＲＮＡの発現を駆動する。他の実施形態は、代替的なＶＡ－ＲＮＡを提供できる。
いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅコーディング配列は、その３’末端に強いポリアデニル化シグナル（停止シグナル）を有する、エストロゲンにより誘導可能なＣｒｅである。これに続くものは、２シストロン性のＥ２Ａ、Ｅ４ ｏｒｆ６カセットである。このプラスミドは、Ｔｅｔ応答性活性化剤タンパク質（Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ）の発現を駆動する、構成的プロモーター（ＣＭＶ）も有する。
ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）が存在しないオフ状態では、前記Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇは、Ｔｅｔ－規制可能なプロモーター中のＴｅｔオペレーター要素に結合できないので、このプロモーターは活性ではない。エストロゲン応答性Ｃｒｅが単純なＣｒｅの代わりに、Ｔｅｔ－規制可能なプロモーターの基礎的またはリーキーな発現（ｌｅａｋｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））に対抗する。オフ状態でＣｒｅ遺伝子のリーキーな発現がある場合、発現されたＣｒｅタンパク質は、細胞質内で不活性なままでとどめられる。Ｃｒｅ遺伝子の３’の強いポリアデニル化シグナルは、アデノウイルス・ヘルパー遺伝子、Ｅ２ＡおよびＥ４の発現を防止する。発現を誘導するために、細胞培養にドキシサイクリンおよびタモキシフェンが添加される（図６）。ドキシサイクリンはＴｅｔ－ｏｎ ３Ｇタンパク質に結合し、これがＴｅｔ－規制可能なプロモーター中のＴｅｔオペレーター要素へのＴｅｔ－ｏｎ ３の結合を促進する。これが、プロモーターの活性化の引き金を引く。ＥＲ２ Ｃｒｅが高レベルで発現され、およびタモキシフェンがＣｒｅを核にもたらす。
Ｄ．第三の統合された合成構成体
示されるものは、第三の統合された合成構成体の例示的なデザインである（図１、４、５Ｂおよび６）。図４および６に記載されるように、前記第三の統合された合成構成体は、発現可能なペイロードのためのコーディング配列、および／またはガイドＲＮＡ、および前記第一の統合された合成構成体中の、非栄養要求性選択薬剤の第二の要素に、部分的、または全体的に結合する能力のある、非栄養要求性選択薬剤を含む。いくつかの実施形態では、前記非栄養要求性選択薬剤の第一の要素は、第一のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）選択可能なマーカー（配列番号：４）を含む。前記第一のＤＨＦＲはロイシンジッパーを含む（Ｎｔｅｒ）。いくつかの実施形態では、前記非栄養要求性選択薬剤の第二の要素は、第二のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）（配列番号：５）を含む。前記第二のＤＨＦＲはロイシンジッパーを含む（Ｃｔｅｒ）。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ選択はヒポキサンチン－チミジン選択を含む。いくつかの実施形態では、前記第一および第二のＤＨＦＲ選択マーカーの再会合は、前記第一の統合された合成構成体および前記三の統合された合成構成体両方を発現する哺乳類細胞の選択を可能にする。
いくつ実施形態では、細胞は２つの構成体（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体の任意の組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態では、細胞は前記Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体および前記誘導可能なヘルパー構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記誘導可能なヘルパー構成体は、本明細書において記載されるＶＡ ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞は更にＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は全ての３つの構成体（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体）を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記誘導可能なヘルパー構成体は、本明細書において記載されるＶＡ ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、細胞は更に前記ＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。いくつかの実施形態では、この細胞は少なくとも１つの引き金を引く薬剤の添加により、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質およびペイロード核酸を含む前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、１×１０５ｖｇ／標的細胞以下のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生された野生型のＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は条件付きで、ペイロードのカプシド被覆率が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上である、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力がある。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上であるペイロードのカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、精製前に、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上であるペイロード核酸配列力価のｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力がある。いくつかの実施形態では、前記細胞は精製前に、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬであるペイロード核酸配列濃度のｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力がある。いくつかの実施形態では、前記細胞は細胞の集団を産生するために増殖される。いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、本明細書に記載される安定な細胞株である。いくつかの実施形態では、前記細胞は少なくとも３回継代培養された。いくつかの実施形態では、前記細胞は最大６０回継代培養された。いくつかの実施形態では、前記細胞は６０回を越えて培養された。いくつかの実施形態では、前記細胞は、各回の継代培養後に条件付きで誘導される能力を維持した。
構成体を含む細胞
いくつかの実施形態では、前記細胞は１つの構成体を含む（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体）。いくつかの実施形態では、前記１つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、細胞は２つの構成体を含む（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体の任意の組み合わせ）。いくつかの実施形態では、前記２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、前記２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合される。いくつかの実施形態では、細胞はＲｅｐ／Ｃａｐ構成体および誘導可能なヘルパー構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記誘導可能なヘルパー構成体は、本明細書に記載されるＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、更に本明細書に記載されるＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡ構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。
いくつかの実施形態では、細胞は３つの全ての構成体を含む（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体）。いくつかの実施形態では、前記３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、前記３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合される。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記誘導可能なヘルパー構成体は、本明細書に記載されるＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。いくつかの実施形態では、細胞は更にＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。
いくつかの実施形態では、ＶＡ ＲＮＡ構成体は、ＶＡ ＲＮＡをコーディングするポリヌクレオチド構成体であり、ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は少なくとも２つの変異を内部プロモーターに含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、転写的に不活性なＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、前記プロモーター中に５～１０のヌクレオチドの削除を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの変異は、Ａ Ｂｏｘプロモーター領域中にある。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの変異は、Ｂ Ｂｏｘプロモーター領域中にある。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの変異は、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａである。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡの発現は、Ｕ６プロモーターに駆動される。請求項Ｘのヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の上流に、５’から３’方向に：ａ）Ｕ６プロモーターの第一の部分；ｂ）第一の組み換え部位；ｃ）スタッファー配列；ｄ）第二の組み換え部位；ｅ）Ｕ６プロモーターの第二の部分を含むもの。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列はリコンビナーゼにより削除可能である。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列は遺伝子をエンコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記スタッファー配列はプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーを含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、哺乳類細胞選択要素である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、栄養要求性選択要素である。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択要素は活性なタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記活性なタンパク質はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択コーディング配列は、活性のために第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を必要とする不活性タンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記不活性タンパク質は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒである。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含む。いくつかの実施形態では、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒは、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質は、ピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性である。いくつかの実施形態では、前記検出可能なマーカーは、発光マーカーか、または蛍光マーカーである。いくつかの実施形態では、前記蛍光マーカーは、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙである。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡ構成体は、更にリコンビナーゼをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは外来的に供給される。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは部位特異的リコンビナーゼである。前記請求項の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅポリペプチドか、またはフリッパーゼポリペプチドであるもの。いくつかの実施形態では、前記Ｃｒｅポリペプチドは、リガンド結合ドメインに融合している。いくつかの実施形態では、前記リガンド結合ドメインはホルモン受容体である。いくつかの実施形態では、前記ホルモン受容体はエストロゲン受容体である。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体は、点変異を含む。いくつかの実施形態では、前記エストロゲン受容体はＥＲＴ２である。任意の請求項Ｘのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドであるもの。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位が、第一のｌｏｘ配列であり、前記第二の組み換え部位が、第二のｌｏｘ配列である。いくつかの実施形態では、前記第一のｌｏｘ配列が第一のｌｏｘＰ部位であり、前記第二のｌｏｘ配列が第二のｌｏｘＰ部位である。いくつかの実施形態では、前記第一の組み換え部位が、第一のＦＲＴ部位であり、前記第二一の組み換え部位が、第二一のＦＲＴ部位である。任意の請求項Ｘのポリヌクレオチド構成体であって、更に選択可能なマーカーをコードする配列を含むもの。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質Ｎ－末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質Ｃ－末端に結合した、スプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質Ｎ－末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質Ｃ－末端に結合した、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパク質は、ピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性である。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡ構成体が、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１３～配列番号：１９または配列番号２３～配列番号：２の任意の１つに対して含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡ構成体が、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：１３～配列番号：１９または配列番号２３～配列番号：２６の任意の１つに対して含む。
いくつかの実施形態では、前記細胞は哺乳類細胞であるか、または昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＳＦ９細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、更にペイロード構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：３３に対して含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロードの配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体の発現は、構成的プロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターおよび前記ペイロードの配列は、ＩＴＲ配列の側面にある。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は、遺伝子をコーディングするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、治療的ポリペプチドか、または導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は、治療的ポリヌクレオチドをコーディングするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記治療的ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡサプレッサーまたはガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、タンパク質に結合する能力を有するポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、安定的に前記細胞のゲノム中に統合される。いくつかの実施形態では、複数の前記ペイロード構成体は、安定的に前記細胞のゲノム中に統合される。いくつかの実施形態では、前記複数のペイロード構成体は、安定的に前記細胞のゲノム中に別々に統合される。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、前記ＩＴＲ配列の外部にある選択可能なマーカー、または検出可能なマーカーをコーディングする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、哺乳類細胞選択要素である。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、栄養要求性選択要素である。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択要素は活性タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、前記活性タンパク質はＤＨＦＲである。いくつかの実施形態では、前記栄養要求性選択コーディング配列は、活性のために第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する不活性タンパク質をエンコードする。いくつかの実施形態では、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードする。いくつかの実施形態では、前記不活性なタンパク質は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒである。請求項２～６の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含む。請求項２～６の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＩＴＲの外部の選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記ＩＴＲ配列外の前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパクは、ピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性である。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、プラスミド中にある。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、微生物の人工的な染色体中であるか、酵母の人工的な染色体中にある。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、前記細胞のゲノム中に安定的に統合される。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、合成核酸構成体である。いくつかの実施形態では、前記細胞は前記ペイロードの配列をカプシドで覆うｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、少なくとも１つの引き金を引く薬剤の添加により、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。
いくつかの実施形態では、前記細胞は、少なくとも１つの引き金を引く薬剤の添加により、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記カプシドタンパク質およびペイロード核酸配列を有するｒＡＡＶウイルス粒子は、１×１０５ｖｇ／標的細胞の感染多重度（ＭＯＩ）またはそれ未満において、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞から産生された野生型のＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、Ｆ：Ｅ比率が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上である、ｒＡＡＶウイルス粒子を条件付きで、産生する能力がある。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のＦ：Ｅ比を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のペイロードのカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、条件付きで、ペイロードのカプシド被覆率が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上の、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力がある。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、精製前に１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬであるペイロード核酸配列力価のｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力がある。いくつかの実施形態では、前記細胞は精製前に、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上のペイロード核酸配列濃度を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力がある。いくつかの実施形態では、前記いくつかの実施形態では、前記細胞は細胞の集団を産生するために増殖される。いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、本明細書に記載される安定な細胞株である。いくつかの実施形態では、前記細胞は少なくとも３回継代培養される。いくつかの実施形態では、前記細胞は最大６０回継代培養されることができる。いくつかの実施形態では、前記細胞は６０回を越えて培養された。いくつかの実施形態では、前記細胞は、各回の継代培養後に条件付きで誘導される能力を維持した。
構成体を含む細胞の集団
いくつかの実施形態では、１つの構成体（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体）を含む。いくつかの実施形態では、前記１つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の前記１つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、細胞集団は２つの構成体（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体の任意の組み合わせ）を含むいくつかの実施形態では、前記２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、前記２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の前記２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の前記２つの構成体は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合される。いくつかの実施形態では、細胞はＲｅｐ／Ｃａｐ構成体および誘導可能なヘルパー構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、本明細書に記載されるＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、更に本明細書に記載されるＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記ＶＡ ＲＮＡ構成は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。
いくつかの実施形態では、細胞の集団は、全ての３つの構成体（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体、誘導可能なヘルパー構成体、およびペイロード構成体）を含む。いくつかの実施形態では、前記３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、前記３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数の前記３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に安定に統合される。いくつかの実施形態では、複数前記３つの構成体は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合される。いくつかの実施形態では、前記誘導可能なヘルパー構成体は、本明細書に記載されるＶＡ ＲＮＡ構成体を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、前記細胞のゲノム中に別々に安定に統合されるＶＡ ＲＮＡ構成体を更に含む。
０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のカプシド被覆率を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する細胞集団。いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、哺乳類細胞の集団化、または昆虫細胞の集団である。いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞またはＳＦ９細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、更にペイロード構成体を含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロードの配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体の発現は、構成的プロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記構成的プロモーターおよびペイロードの配列はＩＴＲの側面にある。いくつかの実施形態では、前記ペイロードは、遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、治療的ポリペプチドか、または導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は治療的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記治療的ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡサプレッサーか、またはガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、タンパク質に対して結合する能力を有するポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は触媒的に不活性なＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるいくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、更にＩＴＲ配列外の選択可能なマーカー、または検出可能なマーカーをコードする配列を更に含む。いくつかの実施形態では、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＩＴＲの外部の選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインである。いくつかの実施形態では、前記ＩＴＲ配列外の前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーである。いくつかの実施形態では、前記抗生物質抵抗性タンパクは、ピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性である。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、プラスミド中にある。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、微生物の人工的な染色体中にあるか、酵母の人工的な染色体中にある。いくつかの実施形態では、前記ペイロード構成体は、前記細胞集団のゲノム中に安定的に統合される。請求項Ｘの任意の１つの細胞を増殖することにより産生された細胞集団。いくつかの実施形態では、増殖は少なくとも３回継代培養することを含む。いくつかの実施形態では、細胞集団の細胞は、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により、条件付きでｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記少なくとも２つの引き金を引く薬剤は、ドキシサイクリンおよびタモキシフェンを含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも２つの引き金を引く薬剤は、削除する要素の発現および核への転座を誘導する。いくつかの実施形態では、細胞集団の細胞は、削除する要素の添加により、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記削除する要素はリコンビナーゼであるいくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは部位特異的なリコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、前記削除する要素は、Ｃｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼである。いくつかの実施形態では、前記削除する要素は、ホルモンにより規制される。いくつかの実施形態では、この細胞集団は、条件付きで、その内部にペイロードをエンコードする発現可能なポリヌクレオチドをパッケージ化したｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力があり；およびこの細胞集団により産生されたウイルス粒子の集団は、別の比較可能なｒＡＡＶウイルス粒子産生細胞により一過性トランスフェクションにより産生されたウイルス粒子の集団よりも均一である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団により産生されたウイルス粒子の集団は、５００：１～１：１のウイルスゲノム対形質導入ユニットの比を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞集団により産生されたウイルス粒子の集団は、１００：１のベクターゲノム対感染ユニットの比を有する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子の産生は引き金を引く薬剤の添加により誘導可能である。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子の産生は少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により誘導可能である。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、条件付きで、ペイロードのカプシド被覆率が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のペイロードのカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、１×１０６、２×１０６、５×１０６、または１×１０７細胞／ｍＬ以上の生存可能な細胞濃度に到達する能力がある。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬを越える濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬの力価のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞集団は、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬの濃度のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記カプシドタンパク質およびペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子は、１×１０５ｖｇ／標的細胞またはそれ未満のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生された野生型ＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上であるＦ：Ｅ比を有するｒＡＡＶウイルス粒子を条件付きで産生する能力がある。いくつかの実施形態では、精製前に、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上であるＦ：Ｅ比を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、凍結保存される。いくつかの実施形態では、前記細胞は、バイアル、フラスコ、シリンジまたは他の適切な細胞保存容器に含まれることができる。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、プラスミドの不在下で産生される。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、プラスミドの不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質は、プラスミドの不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質は、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能である。先行する実施形態の任意の１つの細胞集団の増殖により産生される第二の細胞集団。第二の細胞集団であって、細胞集団の増殖が前記細胞集団を少なくとも３回継代培養することを含むもの。いくつかの実施形態では、細胞集団の増殖が前記細胞集団を少なくとも３～６０回継代培養することを含むもの。いくつかの実施形態では、前記細胞集団の増殖が前記細胞集団を、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０回継代培養することを含むもの。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法により産生されるｒＡＡＶウイルス粒子は、一過性トランスフェクション法により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子と比較して、増大された感染性を有する。
安定細胞株
いくつかの実施形態では、安定な細胞株は、本明細書に記載される細胞から産生される。いくつかの実施形態では、安定な細胞株は、本明細書に記載される前記集団から産生される。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株は単一の細胞から誘導され、およびモノクローナルである。前記安定な細胞株は、哺乳類の安定な細胞株であり得る。前記安定な細胞株は、本明細書に記載される細胞の増殖または継代培養により産生される。
いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株は、本明細書に記載される細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞の集団は単一の細胞から誘導される。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞の細胞の少なくとも７０、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、本明細書に記載される細胞の集団である。安定な細胞株は、本明細書に記載される細胞から誘導される。安定な細胞株は、本明細書に記載される細胞から増殖される。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株は哺乳類の安定な細胞株である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質は、プラスミドの不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質は、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、プラスミドの不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現は、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子は、プラスミドの不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子は、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能である。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株は、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の濃度のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株は、精製前に１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の濃度のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のカプシド被覆率を有するｒＡＡＶウイルス粒子を条件付きで産生する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記カプシドタンパク質およびペイロード核酸を含むｒＡＡＶウイルス粒子は、１×１０５ｖｇ／標的細胞またはそれ以下のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生された野生型のＡＡＶウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４または１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞の範囲である。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上のＦ：Ｅ比率を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上のＦ：Ｅ比率を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、凍結保存される。いくつかの実施形態では、前記安定な細胞株の少なくとも１つの細胞は、バイアル、フラスコ、シリンジまたは他の適切な細胞保存容器に含まれることができる。
いくつかの実施形態では、安定な細胞株の産生方法は、細胞を本明細書に記載されるＲｅｐ／Ｃａｐ構成体に接触させ、この細胞を増殖して安定な細胞株を産生することを含む。いくつかの実施形態では、安定な細胞株の産生方法は、細胞を本明細書に記載される誘導可能なヘルパー構成体に接触させ、この細胞を増殖して安定な細胞株を産生することを含む。いくつかの実施形態では、安定な細胞株の産生方法は、細胞をＲｅｐ／Ｃａｐ構成体に接触させ、本明細書に記載される誘導可能なヘルパー構成体に接触させ、この細胞を増殖して安定な細胞株を産生することを含む。いくつかの実施形態では、安定な細胞株の産生方法は、細胞をＲｅｐ／Ｃａｐ構成体に接触させ、本明細書に記載される誘導可能なヘルパー構成体に接触させ、この細胞をペイロード構成体に接触させ、この細胞を増殖して安定な細胞株を産生することを含む。
細胞培養およびバイオリアクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞、細胞の集団、または安定な細胞株は、細胞培養中にある。いくつかの実施形態では、細胞培養組成物は以下のものを含む：ａ）懸濁に適応した細胞、ｂ）血清を含まない細胞培養培地、およびｃ）組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子であって、前記細胞培養組成物が、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、およびアデノウィルスを含まず、および前記細胞培養組成物が、プラスミドおよびトランスフェクション薬剤を含まないもの。いくつかの実施形態では、前記細胞培養組成物が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含まない。いくつかの実施形態では、前記懸濁に適応した細胞は、懸濁に適応した哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記懸濁に適応した細胞は、懸濁に適応したＨＥＫ２９３細胞およびその誘導体である。いくつかの実施形態では、前記懸濁に適応した哺乳類細胞は、本明細書に開示される安定な細胞株からのものであり、本明細書に開示される細胞の集団または本明細書に開示される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞培養組成物が、１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、９×１０１４、１×１０１５、または５×１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌ以上の精製前のｒＡＡＶ濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記細胞培養組成物が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上の精製前のｒＡＡＶのカプシド被覆率を有する。
いくつかの実施形態では、前記安定細胞からのｒＡＡＶウイルス粒子は、バイオリアクター中で産生される。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは本明細書で開示される安定細胞株を含む。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは本明細書で開示される細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは本明細書で開示される細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは本明細書で開示される細胞培養を含む。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは１Ｌのバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、前記１Ｌのバイオリアクターは、１×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶの収率を有する。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクター５Ｌのバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、前記５Ｌのバイオリアクターは、５×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶの収率を有するいくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは５０Ｌのバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、前記５０Ｌのバイオリアクターは、５×１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶの収率を有する。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは１００Ｌのバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、前記１００Ｌのバイオリアクターは、１×１０１６ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶの収率を有する。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは５００Ｌのバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、前記５００Ｌのバイオリアクターは、５×１０１６ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶの収率を有する。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは２０００Ｌのバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、前記２０００Ｌのバイオリアクターは、２×１０１７ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶの収率を有する。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、９×１０１４、１×１０１５、または５×１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌ以上の濃度を有するｒＡＡＶウイルス粒子を含む。いくつかの実施形態では、前記１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、９×１０１４、１×１０１５、または５×１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌ以上の精製前の濃度を有するｒＡＡＶウイルス粒子を含む。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは、１Ｌ、５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、または２０００Ｌのバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは単回使用のバイオリアクターである。
ｒＡＡＶの組成物
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される、前記細胞、細胞の集団、または安定な細胞株は誘導されて（本明細書で開示される、例えば、バイオリアクター中に第一および第二の引き金を引く薬剤の添加後）複数のｒＡＡＶウイルス粒子を産生する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子のカプシドで被覆された複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物は、１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の精製前の濃度を有する。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子のカプシドで被覆された複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物は、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上の精製前のカプシドのカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記ウイルスゲノムをカプシドで被覆する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物は、精製前に、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上のＦ：Ｅ比率を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物は、１×１０５ｖｇ／標的細胞のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、同一のＭＯＩにおいて、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有する。いくつかの実施形態では、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、同一のＭＯＩにおいて、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、同一のＭＯＩにおいて、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記組成物は更に、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の精製前の濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上であるカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上であるＦ：Ｅ比を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、同一のＭＯＩにおいて、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生された複数のｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、同一のＭＯＩにおいて、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、同一のＭＯＩにおいて、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞である。いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞の範囲から選ばれる。いくつかの実施形態では、前記ウイルスゲノムはペイロードをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列の発現は、構成的プロモーターにより駆動される。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は、遺伝子をコーディングするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする。いくつかの実施形態では、前記遺伝子は、治療的ポリペプチドか、または導入遺伝子をコードする。いくつかの実施形態では、前記ペイロードの配列は、治療的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記治療的ポリヌクレオチドは、ｔＲＮＡサプレッサーか、またはガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ガイドＲＮＡは、タンパク質に結合する能力を有するポリリボヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記Ｃａｓタンパク質は触媒的に不活性なＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子はＣａｐポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐポリペプチドは、ＡＡＶカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、第一の組成物および第二の組成物の中にある。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物および第二の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の範囲で変動するカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物および第二の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％の未満の範囲で変動するＦ：Ｅ比を有する。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物および第二の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の範囲で変動するウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物および第二の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％を越える範囲で変動する感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物は第一の用量であり、および第二の組成物は第二の用量である。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物は、第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日前に産生される。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、第二の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日前に産生される。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物は、第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月前に産生される。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月前に産生される。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物は、第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２年前に産生される。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２年前に産生される。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物は、第一のバイオリアクターからの複数のウイルス粒子から産生され、前記第二の組成物は、第二のバイオリアクターからの複数のウイルス粒子から産生される。いくつかの実施形態では、第三の組成物またはより多い組成物は、本明細書で開示される、ｒＡＡＶから産生される。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物、第二の組成物、および第三の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の範囲で変動するカプシド被覆率を有する。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物、第二の組成物、および第三の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の範囲で変動するＦ：Ｅ比を有する。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物、第二の組成物、および第三の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の範囲で変動するウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有する。いくつかの実施形態では、前記第一の組成物、前記第二の組成物、および前記第三の組成物は、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の範囲で変動する感染性を有する。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物は、第三の用量である。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物は、前記第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日後に産生される。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、前記第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日後に産生される。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物は、前記第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月後に産生される。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、前記第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月後に産生される。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物は、前記第二組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ年後に産生される。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子は、第二の組成物が産生される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月後に産生される。いくつかの実施形態では、前記第三の組成物は、第三のバイオリアクターからの複数のウイルス粒子から産生される。
薬学的組成物
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書で開示される請求項の複数のｒＡＡＶウイルス粒子、および薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、複数の薬学的な用量は、それぞれが独立して、本明細書で開示される複数のｒＡＡＶウイルス粒子および薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、前記カプシド被覆率は、複数の薬学的用量の第一の用量および第二の用量の間で、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の差を有する。いくつかの実施形態では、前記Ｆ：Ｅ比は、複数の薬学的用量の第一の用量および第二の用量の間で、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の差を有する。いくつかの実施形態では、前記ウイルスゲノムの濃度は複数の薬学的用量の第一の用量および第二の用量の間で、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の差を有する。いくつかの実施形態では、前記ベクターゲノムの濃度は複数の薬学的用量の第一の用量および第二の用量の間で、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の差を有する。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子の感染性は複数の薬学的用量の第一の用量および第二の用量の間で、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満の差を有する。
ｒＡＡＶを産生する方法
別の態様では、安定な細胞株からｒＡＡＶを産生する方法が提供される。この方法は、上述の安定な哺乳類細胞株の培養されている培地に、少なくとも第一の、および第二の発現の引き金を引く薬剤の添加することを含む。
特定の実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤はテトラサイクリンである。特定の実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤はＤｏｘである。特定の実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はエストロゲンアゴニストか、または選択的エストロゲン受容体モデュレーターである。特定の実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はタモキシフェンである。
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記第一の引き金を引く薬剤のみの存在下で、安定な哺乳類細胞株の培養の後期のステップを含む。
いくつかの実施形態では、前記方法は、培養培地からｒＡＡＶを精製することを更に含む。いくつかの実施形態では、前記精製することは、クロマトグラフィー的な精製を行うことを含む。いくつかの実施形態では、前記クロマトグラフィー的な精製は、陽性に荷電したアニオン交換樹脂を用いること、陰性に荷電したアニオン交換樹脂を用いること、カチオン交換クロマトグラフィーを用いること、親和性クロマトグラフィーを用いること、サイズ排除クロマトグラフィーを用いること、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記クロマトグラフィー的な精製は、カラムクロマトグラフィー的な分画化を用いることを含む。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、本明細書に記載されるバイオリアクター中で産生される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞を誘導する方法、本明細書に記載される前記細胞の集団、または本明細書に記載される安定な細胞株は、前記細胞、細胞の集団、または前記安定な細胞株に、第一の引き金を引く薬剤を投与し、それにより細胞、細胞の集団または安定な細胞株中で、Ｒｅｐポリペプチド、Ｃａｐポリペプチド、および１つの以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤は、活性化因子またはリプレッサーに結合する。いくつかの実施形態では、誘導可能な活性化が誘導される。いくつかの実施形態では、前記活性化された誘導可能なプロモーターはリコンビナーゼを転写する。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤は、テトラサイクリン、またはクミン酸塩である。いくつかの実施形態では、前記テトラサイクリンはドキシサイクリンである。本明細書に記載される方法は、前記細胞、前記細胞の集団、または前記安定な細胞株を第二の引き金を引く薬剤とともに培養することを更に含む。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、エストロゲン受容体リガンドである。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）である。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はタモキシフェンである。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はリコンビナーゼに結合する。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はリコンビナーゼを誘導して、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記細安定な細胞株の細胞の核に転座させる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する方法は、第一の引き金を引く薬剤を、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記細安定な細胞株の細胞に投与し、第二の引き金を引く薬剤を、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記細安定な細胞株の細胞に投与し、それにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記細安定な細胞株中で産生することを含む。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤は、活性化因子またはリプレッサーに結合する。いくつかの実施形態では、誘導可能なプロモーターの活性化が誘導される。いくつかの実施形態では、前記活性化された誘導可能なプロモーターがリコンビナーゼを転写する。いくつかの実施形態では、前記第一の引き金を引く薬剤は、テトラサイクリン、またはクミン酸塩である。いくつかの実施形態では、前記テトラサイクリンはドキシサイクリンである。請求項Ｘの任意の１つの方法であって、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株を第二の引き金を引く薬剤とともに培養することを更に含むもの。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、エストロゲン受容体リガンドである。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤は、エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）である。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はタモキシフェンである。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はリコンビナーゼに結合する。いくつかの実施形態では、前記第二の引き金を引く薬剤はリコンビナーゼを誘導して、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞の核に転座させる。いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼは、リコンビナーゼ部位を切断する。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つのアドレノウイルスヘルパータンパク質、前記Ｒｅｐポリペプチド、およびＣａｐポリペプチドが発現される。いくつかの実施形態では、前記ＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドは、ｒＡＡＶウイルス粒子中で組み立てられる。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子はペイロードの配列をカプシドで被覆する。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞は、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前に、細胞毒性レベルのＲｅｐポリペプチドを発現しない。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞は、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前に、細胞毒性レベルのＣａｐポリペプチドを発現しない。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞は、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前に、細胞毒性レベルのＲｅｐポリペプチドを発現しない。いくつかの実施形態では、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞中のＲｅｐポリペプチドの平均濃度は、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前の量よりも少ない。いくつかの実施形態では、前記ＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドの発現は、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の後に、構成的になる。請求項Ｘの任意の１つの方法であって、方法の少なくとも一部分がバイオリアクターであるもの。いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは、２０Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、または５００Ｌを越える。
いくつかの実施形態では、前記方法は、ｒＡＡＶウイルス粒子を複数のバッチ中で産生することを更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、第一のバッチおよび第二のバッチの間のカプシド被覆率中の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、第一のバッチおよび第二のバッチの間のＦ：Ｅ比の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、第一のバッチおよび第二のバッチの間のウイルスのゲノムの濃度の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、第一のバッチおよび第二のバッチの間のベクターのゲノムの濃度の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、第一のバッチおよび第二のバッチの間の感染性の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に従って前記方法を遂行することを更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＧＭＰ施設で前記方法を遂行することを更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記細胞を培養培地中で培養し、この培養培地から前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子の部分を収集することを含むことを更に含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、この培養培地から収集された前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子の少なくともいくらかを、精製されたｒＡＡＶ集団を得るために、精製することを更に含む。いくつかの実施形態では、前記精製することは、クロマトグラフィー的な精製を含む。いくつかの実施形態では、前記クロマトグラフィー的な精製は、陽性に荷電したアニオン交換樹脂を用いること、陰性に荷電したアニオン交換樹脂を用いること、カチオン交換クロマトグラフィーを用いること、親和性クロマトグラフィーを用いること、サイズ排除クロマトグラフィーを用いること、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記クロマトグラフィー的な精製は、カラムクロマトグラフィー的な分画化を用いることを含む。
いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、本明細書で開示される方法により作成される。いくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物は、本明細書で開示される方法により作成される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法により作成された前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な一過性トランスフェクションにより産生されたｒＡＡＶウイルス粒子と比較して、増大した感染性を有する。
治療の方法
いくつかの実施形態では、治療の方法が提供される。様々な実施形態では、前記方法は、上述の方法で産生されたｒＡＡを、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記投与は、静脈内投与、筋肉内投与、くも膜下投与、嚢内投与、または脳の外科手術を介することによる。
いくつかの実施形態では、病態または疾患を治療する方法は、本明細書で開示される、治療的に有効な量の薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記疾患は単一遺伝子の疾患である。いくつかの実施形態では、前記治療は、少なくとも１つの望まれない副作用をもたらし、この望まれない副作用は、期待される用量から、５０％、４０％、３０％、３０％、１５％、１０％、５％、または２％以上逸脱する１日用量の投与により、相対的に軽減される。いくつかの実施形態では、前記投与は注射による。いくつかの実施形態では、前記注射は点滴である。いくつかの実施形態では、前記１日用量は患者に一度投与される。いくつかの実施形態では、前記１日用量は患者に２回以上投与される。いくつかの実施形態では、前記治療は、少なくとも１つの望まれない副作用をもたらし、この望まれない副作用は、三重トランスフェクション法から産生された複数のｒＡＡＶに比較して軽減される。
いくつかの実施形態では、前記方法あらかじめ決められた数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶの用量の免疫原性を、一過性三重トランスフェクションにより調製された同じｒＡＡＶ ＶＧに比較して軽減する。いくつかの実施形態では、前記免疫原性は、被験者中の中和抗体の抗体力価または濃度により測定される。いくつかの実施形態では、患者の血液血清中のｒＡＡＶウイルス粒子中和抗体の濃度は、トランスフェクション法から産生された複数のｒＡＡＶウイルス粒子の投与後の患者の血液血清中のｒＡＡＶウイルス粒子中和抗体の濃度よりも軽減される。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶウイルス粒子中和抗体の濃度は、ＥＬＩＳＡ検定により測定される。
いくつかの実施形態では、前記方法は、あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶの投与により引き起こされる有害作用の数または強度を、一過性三重トランスフェクション法から調製された、同じｒＡＡＶ ＶＧ用量に比較して軽減する。いくつかの実施形態では、前記方法は有害作用の数を軽減する。いくつかの実施形態では、用量中の前記あらかじめ決定された数のＶＧは、３×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満である。いくつかの実施形態では、用量中の前記あらかじめ決定された数のＶＧは、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ未満である。いくつかの実施形態では、用量中の前記あらかじめ決定された数のＶＧは、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ未満である。いくつかの実施形態では、前記方法は有害作用の強度を軽減する。いくつかの実施形態では、前記方法は有害作用の数と強度の両方を軽減する。
いくつかの実施形態では、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムＶＧ）を有するｒＡＡＶウイルス粒子の用量を被験者に投与する方法は、一過性三重トランスフェクション法から調製された、同じｒＡＡＶ ＶＧ用量に比較して有害作用の数または強度を軽減し、この方法は、本明細書で開示される前記細胞、本明細書で開示される前記細胞集団、または本明細書で開示される前記安定な細胞株において産生されたｒＡＡＶの用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記有害作用は：肝臓機能不全、肝臓の炎症、消化器の感染、嘔吐、微生物感染、敗血症、トロポニンレベルの増大、赤血球細胞数の減少、血小板数の減少、補体免疫システム応答の活性化、急性腎障害、心肺機能不全、および死亡より成る群から選ばれる。いくつかの実施形態では、前記有害作用は１つの以上の炎症反応を促進するサイトカインの血清レベルの増加である。いくつかの実施形態では、前記有害作用は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、およびインターロイキン６（ＩＬ－６）の１つの以上の血清濃度の増加である。
別の態様では、それを必要とする患者にｒＡＡＶの用量を反復投与する方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記方法は、上述の細胞株およびプロセスにより産生されたｒＡＡＶの第一の用量を投与すること、および次いで上述の細胞株およびプロセスにより産生されたｒＡＡＶの少なくとも第二の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は上述の細胞株およびプロセスにより産生されたｒＡＡＶの第一の用量および第二の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は上述の細胞株およびプロセスにより産生されたｒＡＡＶの第一の用量、第二の用量および第三の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、上述の細胞株およびプロセスにより産生されたｒＡＡＶの３つ以上の用量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶの第一の用量および少なくとも第二の用量は、同じ投与のルートを通じて投与される。いくつかの実施形態では、前記ｒＡＡＶの第一の用量および少なくとも第二の用量は、異なる投与のルートを通じて投与される。いくつかの実施形態では、前記投与のルートは、静脈内投与、筋肉内投与、くも膜下投与、嚢内投与、または脳の外科手術を通じた投与である。
いくつかの実施形態では、病態または疾患を治療する方法は、本明細書で開示される、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムを有する薬学的組成物の第一の治療的に有効な量を、それを必要とする患者に投与すること、および本明細書で開示される、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムを有する薬学的組成物の第二の治療的に有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記第一の治療的に有効な量、および前記第二の治療的に有効な量は、１％、５％、１０％、１５％未満によって変動する。
キット
別の態様では、本明細書に記載される、システムのための組成物または実施形態は、キットにおいて提供される。例えば、プラスミドのいずれかと同様に前記哺乳類の細胞、関連するバッファー、培地、引き金を引く薬剤、または他随意的な成分とともに、単独または他の薬剤の任意のもの別々の容器および随意的な使用説明とともに提供されることができる。いくつかの実施形態では、前記キットは、培養容器、バイアル、チューブ等を含むことができる。
前記ｒＡＡＶを産生するための、所望のＡＡＶカプシド中の組み換えベクターを産生してパッケージングする前記方法は、制限することを意味せず、および他の適切な方法は当業者にとって明白である。
発明の態様
以下の項目は、本発明の様々な態様を開示する。以下に記載される態様のそれぞれは、組み合わせが明らかに互換的である場合には、請求項を含む本明細書の他の部分で開示される他の態様および実施形態と組み合わされることができる。例えば、本明細書に記載されるものは３つの例示的な構成体であり、「構成体１」、「構成体２」および「構成体３」と称される。本明細書で提供される開示は、これらの構成体を、具体的および一般的な詳細で記載する。
以下の態様では、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をエンコードする、前記第一の組み換え核酸配列は、本明細書で提供される「構成体１」の具体的および一般的な詳細な開示に対応する。前記第一の組み換え核酸に関係する以下に記載される態様のいかなるものも、組み合わせが明らかに互換的である場合には、本明細書で提供される「構成体１」の具体的および一般的な詳細な開示と組み合わされることができることが意図される。
以下の態様では、１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質をエンコードする前記第二の組み換え核酸配列は、本明細書で提供される「構成体２」の特定および一般的な詳細な開示に対応する。前記第二の組み換え核酸に関係する以下に記載される態様のいかなるものも、組み合わせが明らかに互換的である場合には、本明細書で提供される「構成体２」の具体的および一般的な詳細な開示と組み合わされることができることが意図される。
以下の態様では、ペイロードをエンコードする前記第三の組み換え核酸配列は、本明細書で提供される「構成体３」の具体的および一般的な詳細な開示に対応する。前記第三の組み換え核酸に関係する以下に記載される態様のいかなるものも、組み合わせが明らかに互換的である場合には、本明細書で提供される「構成体３」の具体的および一般的な詳細な開示と組み合わされることができることが意図される。
本明細書で提供される、前記第一、第二および第三の組み換え核酸に関係する、および構成体１、２、３の具体的および一般的な詳細な開示に関係するいかなる’態様および開示も、組み合わせが明らかに互換的である場合には、一緒に組み合わせることができることが意図される。
１． １つ以上の核酸を含む組成物であってともに以下を含むもの：
（ｉ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をエンコードする第一の組み換え核酸配列；および
（ｉｉ）１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質をエンコードする第二の組み換え核酸配列
１つ以上の核酸が哺乳類細胞の核ゲノムに統合され、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／または１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質が、条件付きで発現可能であり、それにより条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生するもの。
２． 態様１の組成物であって、前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、前記ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／または１つの以上の前記アドレノウイルス・ヘルパータンパク質の条件付き発現が、１つの以上の核酸に存在する１つの以上の削除可能な要素に制御されるもの。
３． 態様２の組成物であって、前記１つの以上の削除可能な要素が、１つ以上のイントロン、および／または１つ以上のエクソンを含むもの。
４． 先行する態様の任意の１つの組成物であって、前記第一の核酸配列が以下のものをエンコードするもの：
ａ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分；
ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分；
ｃ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分およびＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分の間の削除可能な要素；および
ｄ）前記ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質コーディング配列。
５． 態様２～４の任意の１つの組成物であって、前記削除可能な要素が以下を含むもの：
ａ）第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント、
検出可能なマーカーのコーディング配列を含む第二のスペーサーセグメント；および
ｃ）第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメントを含み、および
前記第一のスペーサーセグメントおよび第三のスペーサーセグメントが、内在的な哺乳類細胞の細胞機構により削除される能力を有するもの。
６． 態様５の組成物であって、５’から３’に向かって、以下のものを含むもの：
ａ）５’スプライス部位；
ｂ）第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント；
ｃ）第二のスペーサーセグメントであって以下を含むもの：
ｉ）第一のｌｏｘ配列；
ｉｉ）３’スプライス部位；
ｉｉｉ）エクソン；
ｉｖ）停止シグナリング配列；および
ｖ）第二のｌｏｘ配列；および
ｄ）第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメント。
７． 態様５または態様６の組成物であって、前記検出可能なマーカーが、発光マーカー、放射性標識または蛍光マーカーであり、随意的に蛍光マーカーが、ＧＦＰ、ＥＧＦ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦ、ＹＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙであるもの。
８． 態様５～７の任意の１つの組成物であって：
ａ） 前記第一のスペーサーセグメントが、配列番号：１に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含み；および／または
ｂ） 前記第二のスペーサーセグメントが、配列番号：２に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含み；および／または
ｃ） 前記第三のスペーサーセグメントが、配列番号：３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を含むもの。
９． 態様５～８の任意の１つの組成物であって、前記第二のスペーサーセグメントがＣｒｅポリペプチドにより削除される能力を有するもの。
１０． 先行する態様の任意の１つの組成物であって、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および／またはＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の発現が、野生型のプロモーターにより駆動されるもの」。
１１． 態様１０の組成物であって：
ａ） 前記野生型のプロモーターＰ５および／またはＰ１９が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の発現を駆動し；および／または
ｂ） 前記野生型のプロモーターＰ４０が、ＡＡＶＣａｐタンパク質の発現を駆動するもの。
１２． 先行する態様の任意の１つの組成物であって、前記第二の組み換え核酸配列が以下をエンコードするもの：
ａ）１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質；
ｂ）条件付きで自己削除する要素；および
ｃ）誘導可能なプロモーターであって；
哺乳類細胞の核ゲノムに統合されると、１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列の発現が、前記条件付きで自己削除する要素および前記誘導可能なプロモーターの制御下におかれるもの。
１３． 態様２の組成物であって、前記１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質がＥ２ＡおよびＥ４を含むもの。
１４． 態様１２および態様１３の組成物であって、前記自己削除する要素が、ポリペプチド、好適にはリコンビナーゼポリペプチド、より好適にはＣｒｅポリペプチドをエンコードする配列を含むもの。
１５． 態様１４の組成物であって、前記自己削除する要素によりエンコードされる前記ポリペプチドが、条件付きで発現可能であり、引き金を引く薬剤の存在下でのみ発現されるもの。
１６． 態様１５の組成物であって、前記引き金を引く薬剤がホルモン、好適にはタモキシフェンであるもの。
１７． 態様９～１６の任意の１つの組成物であって、前記誘導可能なプロモーターが、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターであるもの。
１８． 態様１２～１７の任意の１つの組成物であって、前記第二の組み換え核酸配列が、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質、好適にはＴｅｔ－ｏｎ－３Ｇをエンコードする配列を更に含むもの。
１９． 態様１８の組成物であって、前記Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ活性化因子タンパク質の発現が、Ｅ１αプロモーターにより駆動されるもの。
２０． 態様１２～１９の任意の１つの組成物であって、前記第二の組み換え核酸配列が、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９９％の相同性、または同一の配列を、配列番号：１１または配列番号：１２に対して含むもの。
２１． 先行する態様の任意の１つの組成物であって、前記１つ以上の核酸がＶＡ ＲＮＡ配列をエンコードする核酸配列を更に含むもの。
２２． 態様２１の組成物であって、ＶＡ ＲＮＡの発現が構成的であるもの。
２３． 態様２１の組成物であって、ＶＡ ＲＮＡの発現が誘導的であるもの。
２４． 態様２３の組成物であって、前記ＶＡ ＲＮＡの配列がＶＡ ＲＮＡ内部プロモーター、好適にはＧ１６ＡおよびＧ６０Ａに１つ以上の変異を含むもの。
２５． 態様２１～２４の任意の１つの組成物であって、ＶＡ ＲＮＡの発現が、Ｅ１αプロモーターまたはＵ６プロモーターにより駆動されるもの。
２６． 態様２５の組成物であって、ＶＡ ＲＮＡの発現が、Ｕ６プロモーターにより駆動され、このＵ６プロモーターが以下のものを含むもの：
ａ）Ｕ６プロモーター配列の第一の部分、
ｂ）スタッファー配列、および
ｃ）Ｕ６プロモーター配列の第二の部分を含み、および
前記スタッファー配列が、Ｃｒｅポリペプチドにより削除される能力を有するもの。
２７． 先行する態様の任意の１つの組成物であって、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれるもの。
２８． 態様２７の組成物であって、前記血清型がＡＡＶ５および１つ以上の変異または挿入を含むＣａｐタンパク質であるもの。
２９． 先行する態様の任意の１つの組成物であって、前記１つ以上の組み換え核酸が、ペイロード、好適には以下のペイロードをエンコードする第三の組み換え核酸配列を更に含むもの：
（ａ）ＲＮＡ編集のためのガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質指向ＤＮＡ編集のためのガイドＲＮＡ、ｔＲＮＡサプレッサー、または置換遺伝子療法のための遺伝子等のポリヌクレオチドペイロード；または
（ｂ）治療的抗体またはワクチン免疫原等のタンパク質。
３０． 先行する態様の任意の１つの組成物であって、前記１つ以上の組み換え核酸が１つ以上の哺乳類細胞選択要素を含むもの。
３１． 態様３０の組成物であって、１つ以上の前記哺乳類細胞選択要素が、抗生物質抵抗性遺伝子、随意的にはブラストサイジン抵抗性遺伝子をエンコードするもの。
３２． 態様３０または態様３１の組成物であって、１つ以上の哺乳類細胞選択要素が、活性タンパク質、好適にはＤＨＦＲをエンコードする栄養要求性選択要素であるもの。
３３． 態様３０または態様３１の組成物であって、１つ以上の前記哺乳類細胞選択要素が、第一の栄養要求性の選択要素であり、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列からの、第二の不活性タンパク質の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードするもの。
３４． 態様３３の組成物であって、前記第一の栄養要求性選択コーディング配列がＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒ（配列番号：５）活性をエンコードし、および／または前記二の栄養要求性選択コーディング配列がＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ（配列番号：４）をエンコードするもの。
３５． 態様１～３０の任意の１つの組成物であって：
前記第一の組み換え核酸が、抗生物質抵抗性遺伝子、好適にはブラストサイジン抵抗性遺伝子をエンコードする哺乳類細胞選択要素を含み；および

前記第二の組み換え核酸が、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列からの、第二の不活性タンパク質の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードする第一の栄養要求性の選択要素を含み；および
前記第三の組み換え核酸が、活性のために、前記第一の栄養要求性選択コーディング配列からの、前記第一の不活性タンパク質の発現を要求する、前記不活性タンパク質をエンコードする前記第二の栄養要求性の選択要素を含み；および
（ｉ）または（ｉｉ）では、前記第一の栄養要求性選択コーディング配列が、ＤＨＦＲ
Ｚ－Ｃｔｅｒ（配列番号：５）をエンコードし、および前記第二の栄養要求性の選択コーディング配列がＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ（配列番号：４）をエンコードするか、または前記第一の栄養要求性選択コーディング配列がＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ（配列番号：４）をエンコードし、および前記第二の栄養要求性の選択コーディング配列がＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒ（配列番号：５）をエンコードするもの。
３６． 哺乳類細胞であって、この細胞の核ゲノムが、共に組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子をエンコードする、複数の統合された組み換え核酸構成体を含み、このｒＡＡＶウイルス粒子は前記細胞から条件付きで発現されることができるもの。
３７． 態様３６の哺乳類細胞であって、前記複数の統合された組み換え核酸構成体が、前記１つ以上の態様１～３５の任意の１つの組み換え核酸を含み、前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、前記ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／または前記アデノウイルス・ヘルパータンパク質が、前記細胞から条件付きで発現されるもの。
３８． 態様３６または態様３７の哺乳類細胞であって、この細胞株がアデノウイルス・ヘルパータンパク質Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するもの。
３９． 態様３６～３８の任意の１つの哺乳類細胞であって、前記複数の統合された組み換え核酸構成体が以下のものを含むもの：
（ｉ）第一の統合された組み換え核酸構成体であって、以下のものを含むもの：
ａ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分；
ｂ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分；
ｃ）前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分および前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分の間の削除可能な要素であって以下のものを含むもの：
ｉ）第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント；
ｉｉ）検出可能なマーカーのコーディング配列を含む第二のスペーサーセグメントであって、この第二のスペーサーセグメントが、Ｃｒｅポリペプチドにより削除される能力を有するもの；および
ｉｉｉ）第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメント；および
ｄ）ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質コーディング配列であって；
前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および前記ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質が、野生型のプロモーターＰ５、Ｐ１９、およびＰ４０により駆動され；
（ｉｉ）第二の統合された組み換えポリヌクレオチド構成体であって以下のものを含むもの：
ＶＡ ＲＮＡ内部プロモーター中に変異を含む、条件付きで削除可能なＶＡ ＲＮＡコーディング配列であって、ＶＡ ＲＮＡがＵ６プロモーターにより駆動され、随意的に前記ＶＡ ＲＮＡ配列が、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａ変異を含み；
１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列であって、前記アデノウイルス・ヘルパータンパク質がＥ２ＡおよびＥ４であり；
タモキシフェンである引き金を引く薬剤の存在下でのみ核に転座して自己削除するＣｒｅポリペプチドをエンコードする条件付きで自己削除する要素、および
ｄ）Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターである誘導可能なプロモーター、
および
前記１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列の発現が、条件付きで自己削除する要素および誘導可能なプロモーターの制御下にあり；および
（ｉｉｉ）第三の統合されたポリペプチド構成体であって、ポリヌクレオチドペイロードである、ペイロードをエンコードするもの。
４０． ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する方法であって、以下を含むもの：
（ａ）態様３６～３９の任意の１つの細胞を、ｒＡＡＶウイルス粒子の発現を可能にする条件で培養すること；および
（ｂ）前記ｒＡＡＶウイルス粒子を前記細胞培養から単離すること。
４１． 態様４０の方法であって、精製前のｒＡＡＶウイルスゲノム（ＶＧ）のウイルス粒子（ＶＧ：ＶＰ）に対する比が、０．５を越えるもの。
４２． 態様４０または態様４１の方法であって、細胞により産生されるｒＡＡＶウイルス粒子の集団が以下のものを有するもの：
（ａ）ウイルスゲノム対形質導入ユニットの比が、約５００対１～１対であること；および／または
（ｂ）ベクターゲノム対感染性ユニットの比が１００：１であること。
４３． 態様３６～３９の任意の１つの細胞を調製する方法であって、以下のものを含むもの：
ｉ）態様１～３５の任意の１つの哺乳類細胞および１つ以上の核酸を提供すること；および
ｉｉ）態様１～３５の任意の１つの１つ以上の核酸を前記哺乳類細胞に統合すること。
４４． 態様４０～４２の任意の１つの方法により産生された、ｒＡＡＶウイルス粒子の集団。
４５． 態様４４のｒＡＡＶウイルス粒子の集団であって、１００００のＭＯＩにおいて、ウイルス粒子の感染性が少なくとも５０％であるもの。
４６． 態様４４または態様４５によるｒＡＡＶウイルス粒子の集団を含む薬学的組成物であって、薬剤としての使用のためのもの、随意的には単一遺伝子の疾患を治療するための使用のためのもの。
４７． 態様４４または態様４５によるｒＡＡＶウイルス粒子の集団または態様４６による薬学的組成物であって、薬剤としての使用のためのもの、随意的には単一遺伝子の疾患を治療するための使用のためのもの。
４８． 態様４７による使用のためのｒＡＡＶウイルス粒子の集団または薬学的組成物であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、４×１０１４以下の用量において投与されるもの。
番号付けされた実施形態＃１
ポリヌクレオチド構成体であって、以下をコーディングするもの：
ａ） Ｒｅｐポリペプチドの第一の部分；
ｂ） Ｒｅｐポリペプチドの第二の部分；
ｃ） Ｃａｐポリペプチド；および
ｄ） Ｒｅｐポリペプチドの第一の部分およびＲｅｐポリペプチドの第二の部分の間の削除可能な要素。
実施形態１のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｒｅｐポリペプチドが野生型のＲｅｐポリペプチドであるもの。
実施形態１～２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃａｐポリペプチドが野生型のＣａｐポリペプチドであるもの。
実施形態１～３の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素がイントロンを含むもの。
実施形態１～４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素がエクソンを含むもの。
実施形態１～５の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素がイントロンおよびエクソンを含むもの
実施形態１～６の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が、５’から３’に向かって以下のものを含むもの：
ａ） ５’スプライス部位；
ｂ） 第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント；
ｃ） 第二のスペーサーセグメントであって以下を含むもの：
ｉ） 第一のｌｏｘ配列；
ｉｉ） ３’スプライス部位；
ｉｉｉ） エクソン；
ｉｖ） 停止シグナリング配列；および
ｖ） 第二のｌｏｘ配列；および
ｄ） 第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメント
前記第一のスペーサーセグメントおよび前記第三のスペーサーセグメントは、内在的細胞機構により削除される能力を有する。
実施形態７のポリヌクレオチド構成体であって、前記第一および第二のｌｏｘ配列がｌｏｘＰ配列であるもの。
実施形態７のポリヌクレオチド構成体であって、前記第二のスペーサーセグメントが、Ｃｒｅポリペプチドにより削除されるもの。
実施形態９のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃｒｅポリペプチドが、第二のポリヌクレオチド構成体によりエンコードされるもの。
実施形態１～１０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｒｅｐポリペプチドおよび前記Ｃａｐポリペプチドの発現が、野生型のプロモーターにより駆動されるもの。
実施形態１１のポリヌクレオチド構成体であって、前記野生型のプロモーターが、Ｐ５、Ｐ１９、およびＰ４０を含むもの。
実施形態７～１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記エクソンが検出可能なマーカーをエンコードするもの。
実施形態１３のポリヌクレオチド構成体であって、前記検出可能なマーカーが、発光マーカー、蛍光マーカーまたは放射性標識を含むもの。
実施形態１４のポリヌクレオチド構成体であって、前記蛍光マーカーが、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙであるもの。
安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞がｒＡＡＶウイルス粒子の条件付き産生に適しており、ＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドの発現が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞がｒＡＡＶウイルス粒子の条件付き産生に適しており、ＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドの発現が、プラスミドの不在下で誘導可能であるもの。
実施形態１６～１７の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、この細胞が実施形態１～１５の任意の１つのポリペプチド構成体を含み、安定的にこの細胞の核ゲノムに統合されるもの。
実施形態１８の安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株がモノクローナルであるもの。
実施形態１６～１９の任意の１つの前記安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、削除要素の添加によって、条件付きで組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、実施形態１～１４の任意の１つの安定に統合されたポリヌクレオチド構成体を含み、この細胞が、削除要素の添加によって、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態２１の安定な哺乳類細胞株であって、前記削除要素がＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼであるもの。
実施形態２２の安定な哺乳類細胞株であって、前記Ｃｒｅポリペプチドが、第二のポリヌクレオチド構成体によりエンコードされるもの。
実施形態２１～２３の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記削除要素の局在化がホルモンにより規制されるもの。
実施形態１６～２４の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、この細胞が、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加によって、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態２５の安定な哺乳類細胞株であって、少なくとも２つの引き金を引く薬剤が、ドキシサイクリンおよびタモキシフェンを含むもの。
変異したＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド構成体であって、この変異したＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列が内部プロモーターに少なくとも２つの変異を含むもの。
実施形態２７のポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡの発現がＵ６プロモーターにより駆動されるもの。
実施形態２７～２８のポリヌクレオチド構成体であって、変異したＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列の上流に、５’から３’に向かって、以下のものを含むもの：
ａ） Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；
ｂ） 第一のｌｏｘ配列；
ｃ） スタッファー配列；
ｄ） 第二のｌｏｘ配列；
ｅ） Ｕ６プロモーター配列の第二の部分。
実施形態２９のポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列がＣｒｅポリペプチドにより削除可能なもの。
実施形態３０のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃｒｅポリペプチドが外来的に供給されるもの。
実施形態３０のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃｒｅポリペプチドが前記ポリヌクレオチド構成体によりエンコードされるもの。
実施形態３０のポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列が、前記Ｕ６プロモーター配列の第一の部分および前記Ｕ６プロモーター配列の第二の部分の間に配置されるもの。
ポリヌクレオチド構成体であって、以下をコーディングするもの：
ａ） １つ以上のヘルパータンパク質；
ｂ） １つ以上のヘルパータンパク質の上流の自己削除する要素；および
ｃ） 前記自己削除する要素の上流の誘導可能なプロモーター。
実施形態３４のポリヌクレオチド構成体であって、前記自己削除する要素の発現がＴｅｔ－Ｏｎ－３Ｇシステムによって駆動されるもの。
実施形態３４～３５の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、このポリヌクレオチド構成体が、更にＴｅｔ応答性活性化因子タンパク質（Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ）をエンコードする配列を更に含むもの。
実施形態３６のポリヌクレオチド構成体であって、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ活性化因子タンパク質の発現がＥ１αプロモーターにより駆動されるもの。
実施形態３７のポリヌクレオチド構成体であって、第一の引き金を引く薬剤の存在下に、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ活性化因子タンパクが前記誘導可能なプロモーターに結合するもの。
実施形態３８のポリヌクレオチド構成体であって、前記誘導可能なプロモーターが、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターであるもの。
実施形態３４～３９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記自己削除する要素が、Ｃｒｅポリペプチドをエンコードする配列であるもの。
実施形態３４～４０の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体であって、前記自己削除する要素の発現がホルモンにより規制されるもの。
実施形態４１のポリヌクレオチド構成体であって、ホルモンの存在下でのみ、前記自己削除する要素が、発現され、および自己を削除するもの。
実施形態４２のポリヌクレオチド構成体であって、前記ホルモンがタモキシフェンであるもの。
実施形態３４～４３の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体であって、前記１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質がＥ２およびＥ４を含むもの。
実施形態３４～４４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、このポリヌクレオチド構成体が、更にＶＡ ＲＮＡをエンコードするもの。
実施形態４５のポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡの発現がＥ１αプロモーターにより駆動されるもの。
実施形態４５～４６の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体であって、前記ＶＡ ＲＮＡが、実施形態２７～３３の任意の１つの変異したＶＡ ＲＮＡであるもの。
実施形態３７または４６のポリヌクレオチド構成体であって、Ｅ１αプロモーターが、少なくとも１つの変異を含むもの。
安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生に適しており、１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生に適しており、１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、プラスミドの不在下で誘導可能であるもの。
安定な哺乳類細胞株であって、細胞の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％が、実施形態２７～４８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が安定に、この細胞の核ゲノムに統合されたものを含むもの。
実施形態４９～５１の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、実施形態２７～４８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が安定に、この細胞の核ゲノムに統合されたものを含むもの。
実施形態４９～５２の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の存在下に、条件付きで組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、この細胞の核ゲノムに安定に統合された実施形態２７～４８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含み、およびこの細胞が少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により、条件付きで組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態５３～５４の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記少なくとも２つの引き金を引く薬剤がドキシサイクリンおよびタモキシフェンを含むもの。
安定な哺乳類細胞株であって：
この細胞がペイロードをエンコードする発現可能なポリヌクレオチドがパッケージ化された組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を条件付きで産生する能力を有し；および
安定な細胞により産生されたウイルス粒子の集団が、別の比較可能なｒＡＡＶウイルス粒子を産生する哺乳類細胞により一過性トランスフェクションにより産生されたウイルス粒子の集団よりも均一であるもの。
実施形態５６の安定な哺乳類細胞株であって、この安定な細胞により産生されたウイルス粒子の集団が、５００：１～１：１ウイルスゲノム対形質導入ユニット比を有するもの。
実施形態５７の安定な哺乳類細胞株であって、この安定な細胞により産生されたウイルス粒子の集団が、１００：１のベクターゲノム対感染ユニット比を有するもの。
実施形態５６～５８の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、引き金を引く薬剤の添加により、ウイルス粒子の産生が誘導可能であるもの。
実施形態５６～５８の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により、ウイルス粒子の産生が誘導可能であるもの。
実施形態５６～６０の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、この細胞株の細胞が、実施形態１～１５、２７～３３、および３４～４８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が安定に、この細胞の核ゲノムに統合されたものを含むもの。
安定な哺乳類細胞株であって：
この細胞がペイロードをエンコードする発現可能なポリヌクレオチドがパッケージ化された組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を条件付きで産生する能力を有し；および
ウイルス粒子の産生が、引き金を引く薬剤の添加により誘導可能であるもの。
安定な哺乳類細胞株であって：
この細胞がペイロードをエンコードする発現可能なポリヌクレオチドがパッケージ化された組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を条件付きで産生する能力を有し；および
ウイルス粒子の産生が、この細胞内のプラスミドの存在により条件付きにはならないもの。
先行する任意の実施形態の安定な細胞株であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現が条件付きであるもの。
先行する任意の実施形態の安定な細胞株であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現がこの細胞の培養培地への、少なくとも第一の引き金を引く薬剤の添加により条件付きであるもの。
実施形態６５の安定な細胞株であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現がこの細胞の培養培地への、第一の引き金を引く薬剤およびの第二の引き金を引く薬剤の添加により条件付きになるもの。
実施形態６６の安定な細胞株であって、第一の発現および第二の引き金を引く薬剤の両方を細胞培養培地に添加する前には、前記細胞は、細胞毒性的な量のＲｅｐタンパク質を発現しないもの。
実施形態６７の安定な細胞株であって、第一の発現および第二の引き金を引く薬剤の両方を細胞培養培地に添加する前には、前記細胞は、細胞増殖抑制性の量のＲｅｐタンパク質を発現しないもの。
実施形態６７または６８の安定な細胞株であって、この細胞内のＲｅｐタンパク質の平均濃度が、第一の発現および第二の引き金を引く薬剤の両方を細胞培養培地に添加する前の量よりも少ないもの。
実施形態６５～６９の任意の１つの安定な細胞株であって、少なくとも第一の引き金を引く薬剤の全ての添加により、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現が構成的になるもの。
実施形態６５～７０の任意の安定な細胞株であって、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現が、条件付きであるもの。
実施形態７１の安定な細胞株であって、少なくとも第三の引き金を引く薬剤の添加により、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現が、条件付きになるもの。
実施形態７２の安定な細胞株であって、前記第三の引き金を引く薬剤が、前記第一の引き金を引く薬剤と同じであるもの。
実施形態７２または７３の安定な細胞株であって、第三の引き金を引く薬剤および第四の引き金を引く薬剤の細胞培養培地への添加により、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現が、条件付きになるもの。
実施形態７４の安定な細胞株であって、第四の引き金を引く薬剤が、第二の引き金を引く薬剤と同じであるもの。
実施形態７２または７４の安定な細胞株であって、第三の引き金を引く薬剤が、第一の引き金を引く薬剤と同じであり、および第四の引き金を引く薬剤が、第二の引き金を引く薬剤と同じであるもの。
実施形態７６の安定な細胞株であって、少なくとも第三の引き金を引く薬剤と、この細胞の接触により、発現の引き金を引くことに続く、アデノウイルス・ヘルパータンパク質の継続する発現は、細胞培養培地中に第三の引き金を引く薬剤のみの存在を要求するもの。
実施形態７７の安定な細胞株であって、第三の引き金を引く薬剤が、第一の引き金を引く薬剤と同じであるもの。
実施形態７１～７８の任意の１つの安定な細胞株であって、前記アデノウイルス・ヘルパータンパク質がＥ２ＡおよびＥ４を含むもの。
実施形態６５～７５の任意の１つの安定な細胞株であって、前記第一の引き金を引く薬剤がテトラサイクリンであるもの。
実施形態８０の安定な細胞株であって、前記テトラサイクリンがドキシサイクリンであるもの。
実施形態７４～７６の任意の１つの安定な細胞株であって、前記第四の引き金を引く薬剤が、エストロゲン受容体リガンドであるもの。
実施形態８２の安定な細胞株であって、前記エストロゲン受容体リガンドが、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）であるもの。
実施形態８３の安定な細胞株であって、前記エストロゲン受容体リガンドがタモキシフェンであるもの。
先行する実施形態の任意の安定な細胞株であって、前記治療的なペイロードの発現が、少なくとも第五の引き金を引く薬剤の細胞培養培地への添加により、条件付けされるもの。
実施形態６２～８４の任意の１つの安定な細胞株であって、前記治療的なペイロードの発現が、発現の引き金を引く薬剤の細胞培養培地への添加により、条件付けされないもの。
実施形態６２～８６の任意の１つの安定な細胞株であって、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、アデノウイルス・ヘルパータンパク質、およびペイロードをエンコードする発現可能なポリヌクレオチドの発現が、発現の引き金を引く薬剤の細胞培養培地への添加により、構成的になるもの。
実施形態６２～８７の任意の１つの安定な細胞株であってＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、およびアデノウイルス・ヘルパータンパク質の発現が、ただ１つの発現の引き金を引く薬剤の細胞培養培地への添加により、構成的になるもの。
実施形態８７または８８の安定な細胞株であって、前記１つの発現の引き金を引く薬剤が前記第一の発現の引き金を引く薬剤であるもの。
実施形態８９の安定な細胞株であって、第一の発現の引き金を引く薬剤がテトラサイクリンであるもの。
実施形態９０の安定な細胞株であって、第一の発現の引き金を引く薬剤がドキシサイクリンであるもの。
実施形態６２～９１の任意の１つの安定な細胞株であって、前記細胞の核ゲノムが、複数の合成核酸構成体を含むもの。
９３．実施形態９２の安定な細胞株であって、この記細胞の核ゲノムが、少なくとも２つの合成核酸構成体を含むもの。
実施形態９３の安定な細胞株であって、この細胞の核ゲノムが、少なくとも３つの合成核酸構成体を含むもの。
実施形態９２～９４の任意の１つの安定な細胞株であって、複数の合成核酸構成体のそれぞれが、別々にこの細胞の核ゲノムに統合されるもの。
実施形態９２～９４の任意の１つの安定な細胞株であって、前記細胞の核ゲノム中に安定に統合された複数の合成核酸構成体の全てを維持するために、単独の非栄養要求性選択のみを要求するもの。
実施形態９２～９６の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって：
前記第一の統合された合成核酸構成体が、条件付きで発現可能なＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ コーディング配列を含み；
前記第二の統合された合成核酸構成体が、条件付きで発現可能なＣｒｅコーディング配列および条件付きで発現可能なアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列を含み；および
前記第三の統合された合成核酸構成体が、ペイロードをエンコードする、発現可能なポリヌクレオチドのためのコーディング配列を含むもの。
実施形態９７の安定な哺乳類細胞株であって、第一の発現の引き金を引く薬剤に前記細胞が接触する前に、前記第一の統合された構成体のＲｅｐコーディング配列が、介入するスペーサーにより妨害されるもの。
実施形態９８の安定な哺乳類細胞株であって、前記介入するスペーサーが、５’から３’に向かって、第一のスペーサーセグメント、第二のスペーサーセグメント、および第三のスペーサーセグメントを含むもの。
実施形態９９の安定な哺乳類細胞株であって、前記第一のスペーサーセグメントが第一のスペーサー要素の５’に、５’スプライス部位（５’ＳＳ）を含むもの。
実施形態９９～１００の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第一のスペーサーセグメントが、配列番号：１に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を有するもの。
実施形態９９～１０１の安定な哺乳類細胞株であって、前記第二のスペーサーセグメントが、ｌｏｘ部位の側面にある検出可能なマーカーををエンコードするポリヌクレオチドを含むもの。
実施形態１０２の安定な哺乳類細胞株であって、前記検出可能なマーカーが蛍光タンパク質であるもの。
実施形態１０３の安定な哺乳類細胞株であって、前記蛍光タンパク質がＧＦＰであるもの。
実施形態１０４の安定な哺乳類細胞株であって、前記ＧＦＰがｅＧＦＰであるもの。
実施形態９９の安定な哺乳類細胞株であって、前記第二のスペーサーセグメントが、更にポリＡ配列を含むもの。
実施形態１０６の安定な哺乳類細胞株であって、前記ポリＡ配列が、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡを含むもの。
実施形態９９の安定な哺乳類細胞株であって、前記第二のスペーサーセグメントが、第一のｌｏｘ部位と前記タンパク質マーカーをエンコードする前記ポリヌクレオチドの間に３’スプライス部位（３’ＳＳ）を含むもの。
実施形態９８～１０１の安定な哺乳類細胞株であって、前記第二のスペーサーセグメントが、配列番号：２に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を有するもの。
実施形態９９の安定な哺乳類細胞株であって、前記第三のスペーサーセグメントが、更に３’スプライス部位（３’ＳＳ）を含むもの。
実施形態１１０の安定な哺乳類細胞株であって前記第二の３’スプライス部位が、第二のｌｏｘ部位の３’に配置されるもの。
実施形態９８～１１１の安定な哺乳類細胞株であって、前記第三のスペーサーセグメントが配列番号：３に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸配列を有するもの。
実施形態９８～１１２の安定な哺乳類細胞株であって、前記Ｒｅｐコーディング配列が操作可能に内在性Ｐ５プロモーターにリンクされるもの。
実施形態９８～１１３の安定な哺乳類細胞株であって、前記Ｒｅｐコーディング配列が操作可能に内在性Ｐ１９プロモーターにリンクされるもの。
実施形態９８～１１４の安定な哺乳類細胞株であって、前記介入するスペーサーが、Ｒｅｐコーディング配列の、Ｐ１９プロモーターの下流の位置に挿入されるもの。
実施形態９８～１１５の安定な哺乳類細胞株であって、前記Ｒｅｐコーディング配列が、前記Ｃａｐコーディング配列の５’にあるもの。
実施形態１１６の安定な哺乳類細胞株であって、前記Ｃａｐコーディング配列が操作可能に内在性Ｐ４０プロモーターにリンクされるもの。
実施形態９８～１１７の安定な哺乳類細胞株であって、前記第一の統合された構成体が、第一の哺乳類細胞選択要素を更に含むもの。
実施形態１１８の安定な哺乳類細胞株であって、前記哺乳類細胞選択要素が、栄養要求性選択要素であるもの。
実施形態１１９の安定な哺乳類細胞株であって、前記栄養要求性選択要素が、活性タンパク質をエンコードするもの。
実施形態１２０の安定な哺乳類細胞株であって、前記活性タンパク質がＤＨＦＲであるもの。
実施形態１１９～１２１の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記栄養要求性選択コーディング配列が、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードするもの。
実施形態１２２の安定な哺乳類細胞株であって、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列が、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒ（配列番号：５）をコードするもの。
実施形態９７～１２３の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第一の引き金を引く薬剤に前記細胞が接触する前に、前記第二の統合された構成体が、５’から３’に向かって、誘導可能なプロモーター、Ｃｒｅコーディング配列、第一のポリＡ配列、アデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列、第二のポリＡ配列、構成的プロモーター、前記第一の発現の引き金を引く薬剤に応答性のタンパク質のためのコーディング配列、および第二の哺乳類細胞選択要素を含むもの。
実施形態１２４の安定な哺乳類細胞株であって、前記Ｃｒｅコーディング配列が、操作可能に前記誘導可能なプロモーターにリンクされるもの。
実施形態１２５の安定な哺乳類細胞株であって、前記誘導可能なプロモーターが、第三の発現の引き金を引く薬剤に応答性の要素を含むもの。
実施形態１２５の安定な哺乳類細胞株であって、前記誘導可能なプロモーターが、テトラサイクリンの存在下で、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質に結合する能力を有する複数のテトラサイクリン（Ｔｅｔ）オペレーターを含むもの。
実施形態１２４～１２７の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第四の発現の引き金を引く薬剤に応答性の要素を更に含むもの。
実施形態１２８の安定な哺乳類細胞株であって、前記第四の発現の引き金を引く薬剤に応答性の要素が、複数のホルモン応答性の要素を含むもの。
実施形態１２９の安定な哺乳類細胞株であって、前記ホルモン応答性の要素がエストロゲン応答性の要素（ＥＲＥ）であるもの。
実施形態１２４～１３０の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第三の発現の引き金を引く薬剤が、前記第一の発現の引き金を引く薬剤と同じであり、および前記第四の発現の引き金を引く薬剤が、前記第二の発現の引き金を引く薬剤と同じであるもの。
実施形態１２４の安定な哺乳類細胞株であって、Ｃｒｅコーディング配列が、第一のｌｏｘ部位および第二のｌｏｘ部位の側面にあるもの。
実施形態１２４の安定な哺乳類細胞株であって、前記誘導可能なプロモーターが、第一の発現の引き金を引く薬剤の存在下で、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質に結合する能力を有する複数のＴｅｔオペレーター要素を含むもの。
実施形態１２４～１３３の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記アデノウイルス・ヘルパータンパク質が、Ｅ２ＡおよびＥ４を含むもの。
実施形態１２４～１３３の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第一の発現の引き金を引く薬剤に応答性のタンパク質のコーディング配列が、操作可能にＣＭＶプロモーターにリンクされるもの。
実施形態１２４～１３５の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第一の発現の引き金を引く薬剤に応答性のタンパク質のコーディング配列が、Ｔｅｔ 応答性活性化因子タンパク質（Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ）のコーディング配列を含むもの。
実施形態１２４～１３６の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第二の哺乳類細胞選択要素が、抗生物質抵抗性を与えるもの。
実施形態１３７の安定な哺乳類細胞株であって、前記抗生物質抵抗性を与える要素が、ブラストサイジン抵抗性遺伝子であるもの。
実施形態９８～１３８の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、第三の統合された合成構成体が、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロード、および第三の哺乳類細胞選択要素のコーディング配列を含むもの。
実施形態１３９の安定な哺乳類細胞株であって、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロードが、ＲＮＡ編集のためのガイドＲＮＡをエンコードするもの。
実施形態１３９の安定な哺乳類細胞株であって、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロードが、Ｃａｓタンパク質指向ＤＮＡ編集のためのガイドＲＮＡをエンコードするもの。
実施形態１３９の安定な哺乳類細胞株であって、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロードが、タンパク質をエンコードするもの。
実施形態１３９の安定な哺乳類細胞株であって、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロードが、置換遺伝子療法のための遺伝子を含むもの。
実施形態１３９の安定な哺乳類細胞株であって、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロードが、相同的組み換えのための相同性構成体を含むもの。
実施形態１３９の安定な哺乳類細胞株であって、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロードが、治療的抗体をエンコードするもの。
実施形態１３９の安定な哺乳類細胞株であって、前記発現可能なポリヌクレオチドペイロードが、ワクチン免疫原をエンコードするもの。
実施形態１３９～１４６の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記第三の哺乳類細胞選択要素が、栄養要求性選択要素であるもの。
実施形態１４７の安定な哺乳類細胞株であって、前記栄養要求性選択要素が、活性タンパク質をエンコードするもの。
実施形態１４８の安定な哺乳類細胞株であって、前記活性タンパク質がＤＨＦＲであるもの。
実施１４７～１４９の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記栄養要求性選択コーディング配列が、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードするもの。
実施形態１５０の安定な哺乳類細胞株であって、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列が、ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ （配列番号：４）をコードするもの。
実施形態１２３または１５１の安定な哺乳類細胞株であって、ＤＨＦＲ選択が、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠いた培地中での成長を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記哺乳類細胞株が、アデノウイルス・ヘルパータンパク質Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現し、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞株、ヒトＨｅＬａ細胞株、またはチャイニーズハムスター子宮（ＣＨＯ）細胞株であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記哺乳類細胞株が、ＨＥＫ２９３細胞であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な哺乳類細胞株であって、前記哺乳類細胞株が、アデノウイルス・ヘルパータンパク質Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するもの。
ｒＡＡＶを産生する方法であって、少なくとも第一のおよび少なくとも第二の発現の引き金を引く薬剤の全てを、培養中の、実施形態６２～１５５の任意の１つの安定な哺乳類細胞株に加えることを含むもの。
実施形態１５６の方法であって、前記第一の発現の引き金を引く薬剤の存在のみの下で、前記安定な哺乳類細胞株を培養する、後期のステップを更に含むもの。
実施形態１５７の方法であって、ｒＡＡＶを培養培地から精製することを更に含むもの。
実施形態１５６～１５８のプロセスにより作成されるｒＡＡＶ生成物。
病態または疾患を治療する方法であって、治療的に有効な量の、実施形態１５９によるｒＡＡＶ生成物を、それを必要とする患者に投与することを含むもの。
単一遺伝子の疾患を治療する方法であって、治療的に有効な量の、実施形態１５９によるｒＡＡＶ生成物を、単一遺伝子の疾患を有する患者に投与することを含み、このｒＡＡＶペイロードが、この疾患の症状を改善するもの。
実施形態２７～４８、５４～５５、および７１の任意の１つの安定な細胞株であって、誘導可能なＶＡ ＲＮＡを更に含むもの。
実施形態１６２の安定な細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡが、ＶＡ ＲＮＡエンコード配列に操作可能にリンクされたプロモーター中に少なくとも１つの変異を含む構成体によりエンコードされるもの。
１６４．実施形態１６３の安定な細胞株であって、前記少なくとも１つの変異が、Ａ Ｂｏｘプロモーター領域にあるもの。
１６５．実施形態１６３の安定な細胞株であって、前記少なくとも１つの変異が、Ｂ Ｂｏｘプロモーター領域にあるもの。
１６６．実施形態１６４の安定な細胞株であって、少なくとも１つの変異を、Ｂ Ｂｏｘプロモーター領域に更に含むもの。
１６７．実施形態１６３の安定な細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡが、前記プロモーター領域中の約５～１０ヌクレオチドの欠失を含む構成体によりエンコードされるもの。
１６８．実施形態１６２～１６７の任意の安定な細胞株であって、前記誘導可能なアデノウィルスＲＮＡが、操作可能にＵ６プロモーターセグメントにリンクされたもの。
１６９．実施形態１６８の安定な細胞株であって、前記Ｕ６プロモーターセグメントが、第一のｌｏｘ部位および第二のｌｏｘ部位の側面にあるスタッファーまたはフィラ―配列を含むもの。
番号付けされた実施形態＃２
パッケージング細胞株であって：
第一の統合されたポリヌクレオチド構成体および、
第二の統合されたポリヌクレオチド構成体を含み、
ここで、
この第一の統合されたポリヌクレオチド構成体は、条件付きで発現可能なＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のコーディング配列を含み；
この第二の統合されたポリヌクレオチド構成体は、１つ以上の条件付きで発現可能なアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列、および随意的に条件付きで発現可能なＶＡ ＲＮＡコーディング配列を含み；および
Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質および１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、プラスミドの不在下に誘導可能であるもの。
実施形態１のパッケージング細胞株であって、Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質および１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、トランスフェクション薬剤の不在下に誘導可能であるもの。
実施形態１または２のパッケージング細胞株であって、第一の統合されたポリヌクレオチド構成が以下のものを含むもの：
ａ） ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分、
ｂ） ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第二の部分
ｃ） 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のコーディング配列の第一の部分および前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のコーディング配列の第二の部分の間の削除可能な要素、および
ｄ） ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のコーディング配列。
実施形態３のパッケージング細胞株であって、前記削除可能な要素が
ａ） 第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント、
ｂ） 検出可能なマーカーのコーディング配列を含む第二のスペーサーセグメント、および
ｃ） 第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメントを含み、および
前記第一のスペーサーセグメントおよび前記第三のスペーサーセグメントが、内在性の細胞機構により削除可能であるもの。
実施形態４のパッケージング細胞株であって、前記検出可能なマーカーが蛍光マーカーか、または発光マーカーであるもの。
実施形態４または５のパッケージング細胞株であって、前記第二のスペーサーセグメントが、Ｃｒｅポリヌクレオチドにより削除される能力を有するもの。
先行する実施形態の任意のパッケージング細胞株であって、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の発現が、野生型のプロモーターにより駆動されるもの。
実施例７のパッケージング細胞株であって、前記野生型のプロモーターが、Ｐ５、Ｐ１９およびＰ４０を含むもの。
先行する実施形態の任意のパッケージング細胞株であって、前記第二の統合されたポリヌクレオチド構成体が
ａ） １つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列、
ｂ） 条件付きで自己削除する要素、および
ｃ） 誘導可能なプロモーターを含み、および
前記１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列の発現が、条件付きで自己削除する要素、および前記誘導可能なプロモーターの制御下にあるもの。
実施例９のパッケージング細胞株であって、前記１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、Ｅ２ＡおよびＥ４を含み、および随意的に、Ｅ２Ａ がＦＬＡＧタグを含むもの。
実施形態９または１０のパッケージング細胞株であって、前記自己削除する要素が、Ｃｒｅポリペプチドをエンコードするもの。
実施形態９または１１の任意の１つのパッケージング細胞株であって、前記自己削除する要素によりエンコードされる前記ポリペプチドが、核に転座し、および引き金を引く薬剤の存在下でのみ自己削除するもの。
実施形態１２のパッケージング細胞株であって、前記引き金を引く要素が、タモキシフェンであるもの。
実施形態９～１３の任意の１つのパッケージング細胞株であって、前記誘導可能なプロモーターが、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターであるもの。
実施形態９～１４の任意の１つのパッケージング細胞株であって、第二の統合されたポリヌクレオチド構成体が、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質（Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ）をエンコードする配列を更に含むもの。
実施形態１５のパッケージング細胞株であって、Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ活性化因子タンパク質がＥ１αプロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意のパッケージング細胞株であって、第二の統合されたポリヌクレオチド構成体が、ＶＡ ＲＮＡ配列をエンコードするセグメントを更に含むもの。
実施形態１７のパッケージング細胞株であって、ＶＡ ＲＮＡの発現が構成的であるもの。
実施形態１７のパッケージング細胞株であって、ＶＡ ＲＮＡの発現が誘導可能であるもの。
実施形態１９のパッケージング細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡの配列が、ＶＡ ＲＮＡの内部プロモーターに変異を含むもの。
実施形態２０のパッケージング細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡの配列が、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａ 変異を含むもの。
実施形態１９～２１の任意の１つのパッケージング細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡの発現がＵ６プロモーターにより駆動されるもの。
実施形態２２のパッケージング細胞株であって、
前記Ｕ６プロモーターが
ａ） Ｕ６プロモーター配列の第一の部分、
ｂ） スタッファー配列、および
ｃ） Ｕ６プロモーター配列の第二の部分を含み、および
前記スタッファー配列が、Ｃｒｅポリペプチドにより削除される能力を有するもの。
先行する実施形態の任意のパッケージング細胞株であって、この細胞株がアドレノウイルス・ヘルパータンパク質Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するもの。
先行する実施形態の任意のパッケージング細胞株であって、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれるカプシドであるもの。
実施形態２５のパッケージング細胞株であって、前記ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質が、１つ以上の変異を挿入に含むＡＡＶ５カプシドタンパク質であるもの。
組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する方法であって、この方法が、
先行する実施形態の任意のパッケージング細胞株を、ペイロードに対するパッケージ可能なコーディング配列を含むポリヌクレオチド構成体でトランスフェクトすること、および
Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質、１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質、および随意的にＶＡ ＲＮＡの発現を誘導することを含み、
前記ペイロードのためのパッケージ可能なコーディング配列が、ＡＡＶカプシドによりカプシド被覆されるもの。
実施形態２７の方法であって、細胞培養培地および／または細胞溶解物からｒＡＡＶウイルス粒子を精製する後続するステップを含むもの。
産生細胞株であって：
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株および
ペイロードのパッケージ可能なコーディング配列を含むポリヌクレオチド構成体を含むもの。
産生細胞株であって：
第一の統合されたポリヌクレオチド構成体、
第二の統合されたポリヌクレオチド構成体、および
第三の統合されたポリヌクレオチド構成体を含み、
ここで、
この第一の統合されたポリヌクレオチド構成体は、条件付きで発現可能なＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のコーディング配列を含み；
前記第二の統合されたポリヌクレオチド構成体が、１つ以上の条件付きで発現可能なアデノウイルス・ヘルパータンパク質のコーディング配列、および随意的に条件付きで発現可能なＶＡ ＲＮＡのコーディング配列を含み、
前記第三の統合されたポリヌクレオチド構成体が、ペイロードのパッケージ可能なコーディング配列を含み；および
ペイロードのコーディング配列を含む組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子の産生が、プラスミドの不在下で誘導可能なもの。
実施形態３０の産生細胞株であって、ペイロードのコーディング配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
実施形態３０または３１の産生細胞株であって、第一の統合されたポリヌクレオチド構成体が以下のものを含むもの：
ａ） ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コーディング配列の第一の部分、
ｂ） ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のコーディング配列の第二の部分、
ｃ） 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のコーディング配列の第一の部分および前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質のコーディング配列の第二の部分の間の削除可能な要素、および
ｄ） ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質のコーディング配列。
実施形態３２の産生細胞株であって、削除可能な要素が
ａ） 第一のイントロンを含む第一のスペーサーセグメント、
ｂ） 検出可能なマーカーのコーディング配列を含む第二のスペーサーセグメント、および
ｃ） 第二のイントロンを含む第三のスペーサーセグメントを含み、および
前記第一のスペーサーセグメントおよび前記第三のスペーサーセグメントは、内在的細胞機構により削除される能力を有する。
実施形態３３の産生細胞株であって、前記検出可能なマーカーが、蛍光マーカーか、あるいは発光マーカーであるもの。
実施形態３３または３４の産生細胞株であって、前記第二のスペーサーセグメントが、Ｃｒｅポリペプチドにより削除される能力を有するもの。
実施形態３０または３５の産生細胞株であって、前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質および前記ＡＡＶ Ｃａｐ タンパク質の発現が、野生型のプロモーターにより駆動されるもの。
実施形態３６の産生細胞株であって、前記野生型プロモーターが、Ｐ５、Ｐ１９、およびＰ４０を含むもの。
実施形態３０～３７の産生細胞株であって、前記第二の統合された構成体ポリヌクレオチドが
ａ） １つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列、
ｂ） 条件付きで自己削除する要素、および
ｃ） 誘導可能なプロモーターを含み、および
前記１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質コーディング配列の発現が、条件付きで自己削除する要素、および前記誘導可能なプロモーターの制御下にあるもの。
実施形態３８の産生細胞株であって、前記１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質が、Ｅ２ＡおよびＥ４を含むもの。
実施形態３８または３９の産生細胞株であって、前記自己削除する要素がＣｒｅポリペプチドをエンコードするもの。
実施形態３８～４０の任意の１つの産生細胞株であって、前記自己削除する要素によりエンコードされるポリペプチドが、核に転座し、引き金をを引く薬剤の存在下でのみ自己削除するもの。
実施形態４１の産生細胞株であって、前記引き金をを引く薬剤がタモキシフェンであるもの。
実施形態３８～４２の産生細胞株であって、前記誘導可能なプロモーターが、Ｔｅｔ誘導可能なプロモーターであるもの。
実施形態３８～４３の任意の１つの産生細胞株であって、前記第二の統合された構成体ポリヌクレオチドが、Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質（Ｔｅｔ－ｏｎ－３Ｇ）をエンコードする配列を更に含むもの。
実施形態４４の産生細胞株であって、Ｔｅｔ－Ｏｎ ３Ｇ活性化因子タンパク質がＥ１αプロモーターにより駆動されるもの。
実施形態３０～４５の任意の１つの産生細胞株であって、前記第二の統合された構成体ポリヌクレオチドが、ＶＡ ＲＮＡ配列をエンコードするセグメントを更に含むもの。
実施形態４６の産生細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡの発現が構成的であるもの。
実施形態４６の産生細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡの発現が誘導可能なもの。
実施形態４８の産生細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡ配列が、前記ＶＡ ＲＮの内部プロモーターに変異を含むもの。
実施形態４９の産生細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡ配列が、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａ変異を含むもの。
実施形態４８～５０の任意の１つの産生細胞株であって、前記ＶＡ ＲＮＡの発現が、Ｕ６プロモーターにより駆動されるもの。
実施形態５１の産生細胞株であって、
前記Ｕ６プロモーターが
ａ） Ｕ６プロモーター配列の第一の部分、
ｂ） スタッファー配列、および
ｃ） Ｕ６プロモーター配列の第二の部分を含み、および
前記スタッファー配列が、Ｃｒｅポリペプチドにより削除される能力を有するもの。
実施形態３０～５２の任意の１つの産生細胞株であって、前記細胞株がアデノウイルス・ヘルパータンパク質Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを発現するもの。
実施形態３０～５３の任意の１つの産生細胞株であって、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれるもの。
実施形態５４の産生細胞株であって、前記ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質が、１つ以上の変異または挿入を含み、前記血清型がＡＡＶ５またはＡＡＶ９である、ＶＰ１カプシドタンパク質を含むもの。
組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する方法であって、この方法が、
実施形態２９～５５の任意の１つの産生細胞株を培養すること、および
Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質、１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質、および随意的にＶＡ ＲＮＡの発現を誘導することを含むもの。
実施形態５６の方法であって、細胞培養培地または細胞溶解物からｒＡＡＶウイルス粒子を精製する後続するステップを含むもの。
組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生するための産生細胞株であって、
ｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、プラスミドの不在下で誘導可能であり、および
誘導に続いて、この産生細胞株が、精製前に１×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌ以上のｒＡＡＶの収量のｒＡＡＶを産生する能力を有するもの。
実施形態５８の産生細胞株であって、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
実施形態５８または５９の産生細胞株であって、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルスおよびアデノウィルスの不在下で誘導可能であるもの。
実施形態５８～６０の任意の１つの産生細胞株であって、誘導に続いてこの産生株が、精製前にｒＡＡＶ完全カプシド対空カプシド比が０．５以上のものを産生する能力を有するもの。
実施形態５８～６１の任意の１つの産生細胞株であって、誘導、培養、および下流のプロセシングに続いて、この産生細胞株が、精製後のｒＡＡＶの収率が超遠心分離なしで、１×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌ以上の収量ものを産生する能力を有するもの。
実施形態５８～６２の任意の１つの産生細胞株であって、誘導、培養、および下流のプロセシングに続いて、この産生細胞株が、精製後のｒＡＡＶでｒＡＡＶ完全カプシド対空カプシド比が、超遠心分離なしで０．５以上のものを産生する能力を有するもの。
実施形態５８～６３の任意の１つの産生細胞株であって、誘導に続いて、この産生細胞株は、比較可能なｒＡＡＶウイルス粒子産生細胞により一過性トランスフェクションにより産生されたウイルス粒子の集団よりも均一である、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生するための産生細胞株であって、
ｒＡＡＶウイルス粒子の産生がプラスミドの不在下で誘導可能であり、および
誘導に続いてこの産生細胞株が、精製前のｒＡＡＶで、０．５以上のｒＡＡＶ完全カプシド対空カプシド比を有するものを産生する能力を有するもの。
実施形態［６５］の産生細胞株であって、比較可能な細胞株から一過性三重トランスフェクションにより産生され、同じ投与経路で比較可能な被験者に投与された同じカプシドおよびｒＡＡＶウイルスゲノムを持つｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、この産生細胞株が、精製に続く被験者への投与において、投与されたｒＡＡＶウイルスゲノム当たりの中和抗体がより低い力価を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態［６５］の産生細胞株であって、比較可能な細胞株から一過性三重トランスフェクションにより産生され、同じ投与経路で比較可能な被験者に投与された同じカプシドおよびｒＡＡＶウイルスゲノムを持つｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、この産生細胞株が、精製に続く被験者への投与において、投与されたｒＡＡＶウイルスゲノム当たりで、より少ないか、および／またはより低い強度の有害作用を誘導するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態［６７］の産生細胞株であって、前記有害作用が：肝臓機能不全、肝臓の炎症、消化器の感染、嘔吐、微生物感染、敗血症、トロポニンレベルの増大、赤血球細胞数の減少、血小板数の減少、補体免疫システム応答の活性化、急性腎障害、心肺機能不全、および死亡より成る群から選ばれるもの。
実施形態［６７］の産生細胞株であって、前記有害作用が、１つ以上のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、およびインターロイキン６（ＩＬ－６）の血清濃度の増大であるもの。
実施形態［６５］～［６９］の任意の１つの産生細胞株であって、この産生細胞株が、１×１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）／ｋｇ未満の有効用量を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態［６５］～［７０］の任意の１つの産生細胞株であって、この産生細胞株が、患者に１回以上投与できるｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態［６５］～［７１］の任意の１つの産生細胞株であって、一過性三重トランスフェクションに続く比較可能な細胞株により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子の集団に比較して、低減された精製前の品質の変動性を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態［６５］～［７１］の任意の１つの産生細胞株であって、一過性三重トランスフェクションに続く比較可能な細胞株により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子の集団に比較して、低減された精製後の品質の変動性を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
［７２］または［７３］の産生細胞株であって、精製品質の変動性が：ウイルスゲノム対ウイルス粒子の比の変動性、収率の変動性、力価の変動性、純度の変動性、ＤＮＡ含量の変動性、およびカプシドの変動性から選ばれるもの。
組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生するための産生細胞株であって、
ｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、プラスミドの不在下で誘導可能であり、および
誘導に続いて、産生細胞株が、一過性三重トランスフェクションに続く比較可能な細胞株により産生された同じカプシドおよびウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶウイルス粒子の集団に比較して、増大したバッチ一貫性を有する、あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
実施形態［７５］の産生細胞株であって、前記バッチの一貫性が、あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶウイルス粒子の、異なるバッチの間でのウイルス粒子（ＶＰ）の数の変動により測定されるもの。
実施形態［７５］または［７６］の産生細胞株であって、前記バッチの一貫性が、一過性三重トランスフェクションに続く比較可能な細胞株により産生された同じカプシドおよびＶＧを有するｒＡＡＶウイルス粒子の集団に比較して、２倍に増加するもの。
実施形態［７７］の産生細胞株であって、前記バッチの一貫性が、一過性三重トランスフェクションに続く比較可能な細胞株により産生された同じカプシドおよびＶＧを有するｒＡＡＶウイルス粒子の集団に比較して、５倍に増加するもの。
実施形態［７８］の産生細胞株であって、前記バッチの一貫性が、一過性三重トランスフェクションに続く比較可能な細胞株により産生された同じカプシドおよびＶＧを有するｒＡＡＶウイルス粒子の集団に比較して、１０倍に増加するもの。
実施形態［７５］～［７９］の任意の１つの産生細胞株であって、あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶのバッチ間でのウイルス粒子（ＶＰ）の数が、２０％未満で変動するもの。
実施形態［８０］の任意の１つの産生細胞株であって、あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶのバッチ間でのウイルス粒子（ＶＰ）の数が、１０％未満で変動するもの。
実施形態［８１］の任意の１つの産生細胞株であって、あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶのバッチ間でのウイルス粒子（ＶＰ）の数が、５％未満で変動するもの。
細胞培養組成物であって：
ａ） 懸濁物に適応した哺乳類細胞、
ｂ） 血清を含まない細胞培養培地、および
ｃ） 組み換えＡＡＶ （ｒＡＡＶ） ウイルス粒子を含み、
前記細胞培養組成物が、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、およびアデノウィルスを含まず、および
前記細胞培養組成物が、プラスミドおよびトランスフェクション薬剤を含まないもの。
実施形態８３の細胞培養組成物であって、この細胞培養組成物がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含まないもの。
実施形態８３または８４の細胞培養組成物であって、前記懸濁物に適応した哺乳類細胞が、懸濁物に適応したＨＥＫ２９３細胞またはその誘導体であるもの。
実施形態８３～８５の任意の１つの細胞培養組成物であって、前記懸濁物に適応した哺乳類細胞が、実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株の細胞であるか、または２９～５５の任意の１つの産生細胞株の細胞であるもの。
実施形態８３～８６の任意の１つの細胞培養組成物であって、この細胞培養組成物が、１×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌを越える精製前のｒＡＡＶ濃度を有するもの。
実施形態８３～８７の任意の１つの細胞培養組成物であって、この細胞培養組成物が、精製前に０．５以上のｒＡＡＶウイルス粒子対ウイルスゲノム（ＶＧ）比を有するもの。
実施形態５９～８８の任意の１つの細胞培養組成物を含むバイオリアクター。
実施形態８９のバイオリアクターであって、このバイオリアクターが１Ｌのバイオリアクターであるもの。
実施形態９０のバイオリアクターであって、１×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶ収量を有するバイオリアクター。
実施形態８９のバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５Ｌのバイオリアクターであるもの。
実施形態９２のバイオリアクターであって、５×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶ収量を有するバイオリアクター。
実施形態８９のバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５０Ｌのバイオリアクターであるもの。
実施形態９４のバイオリアクターであって、５×１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶ収量を有するバイオリアクター。
実施形態８９のバイオリアクターであって、このバイオリアクターが１００Ｌのバイオリアクターであるもの。
実施形態９６のバイオリアクターであって、１×１０１６ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶ収量を有するバイオリアクター。
実施形態８９のバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５００Ｌのバイオリアクターであるもの。
実施形態９８のバイオリアクターであって、５×１０１６ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶ収率を有するバイオリアクター。
実施形態８９のバイオリアクターであって、このバイオリアクターが２０００Ｌのバイオリアクターであるもの。
実施形態１００のバイオリアクターであって、２×１０１７ウイルスゲノム（ｖｇ）を越える合計ｒＡＡＶ収量を有するバイオリアクター。
実施形態８９～１０１のバイオリアクターであって、このバイオリアクターが単回使用のバイオリアクターであるもの。
バイオリアクターを使用して組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
前記バイオリアクター中で、実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株を培養すること、
前記パッケージング細胞株を、ペイロードのパッケージ可能なコーディング配列を含むポリヌクレオチド構成体でトランスフェクトすること、および
Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質、１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質、および随意的にＶＡ ＲＮＡの発現を誘導することを含むもの。
バイオリアクターを使用して組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
前記バイオリアクター中で、実施形態２９～５５の任意の１つの産生細胞株を培養すること、および
Ｒｅｐタンパク質、Ｃａｐタンパク質、１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質、および随意的にＶＡ ＲＮＡの発現を誘導することを含むもの。
実施形態１０３～１０４の方法であって、細胞培養組成物からｒＡＡＶウイルス粒子を精製する後続するステップを更に含むもの。
薬学的組成物であって：
前記パッケージング細胞株、前記産生細胞株、前記細胞培養組成物、前記バイオリアクター、または前記方法により産生されたｃＧＭＰグレードのｒＡＡＶウイルス粒子、および
薬学的に許容される担体を含むもの。
実施形態１０６の薬学的組成物であって、この薬学的組成物が、プラスミドおよびトランスフェクション薬剤を含まないもの。
実施形態１０６または１０７の薬学的組成物であって、この薬学的組成物が、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、およびアデノウィルスを含まないもの。
実施形態１０６～１０８の任意の１つの薬学的組成物であって、この薬学的組成物が、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、およびアデノウィルスＤＮＡを含まないもの。
実施形態１０６～１０９の任意の１つの薬学的組成物であって、この薬学的組成物が、少なくとも１ｘ１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）／ｍＬの精製後のｒＡＡＶ濃度を有するもの。
実施形態１０６～１１０の任意の１つの薬学的組成物であって、この薬学的組成物が、精製後に０．８以上のｒＡＡＶ ウイルス粒子対ウイルスゲノム（ＶＧ）比を有するもの。
実施形態１０６～１１１の任意の１つの薬学的組成物を含む薬学的な単位用量。
実施形態１１２の薬学的組成物であって、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムを有するｒＡＡＶの用量間のウイルス粒子の数が、２０％未満で変動するもの。
実施形態［１１３］の薬学的単位用量であって、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムを有するｒＡＡＶの用量間のウイルス粒子の数が、１０％未満で変動するもの。
実施形態［１１４］の薬学的単位用量であって、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムを有するｒＡＡＶの用量間のウイルス粒子の数が、５％未満で変動するもの。
薬学的単位用量であって、精製後に、２ｍＬ中に０．８以上のｒＡＡＶ完全カプシド対空カプシド比において、少なくとも１ｘ１０１１ｒＡＡＶウイルスゲノムを含むもの。
あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶの用量の免疫原性を、一過性三重トランスフェクションにより調製された同じｒＡＡＶ ＶＧ 用量と比較して低減させる方法であって、この方法は以下のものを含む：
ｒＡＡＶを、実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態
２９～５５および５８～７４の任意の１つの産生細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いてｒＡＡＶを産生すること。
あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶの投与により引き起こされる有害作用の数または強度を、一過性三重トランスフェクションにより産生された同じｒＡＡＶ ＶＧ用量に比較して低減する方法であって、以下のものを含むもの：
ｒＡＡＶを、実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態
２９～５５および５８～７４の任意の１つの産生細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いてｒＡＡＶを産生すること。
実施形態［１１８］の方法であって、前記有害反応が、肝臓機能不全、肝臓の炎症、消化器の感染、嘔吐、微生物感染、敗血症、トロポニンレベルの増大、赤血球細胞数の減少、血小板数の減少、補体免疫システム応答の活性化、急性腎障害、心肺機能不全、および死亡より成る群から選ばれるもの。
実施形態［１１８］の方法であって、前記有害作用が、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、およびインターロイキン６（ＩＬ－６）の１つの以上の血清濃度の増加であるもの。
あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶの用量を被験者へ投与する方法であって、この被験者による中和抗体の産生を、一過性三重トランスフェクションにより産生された同じｒＡＡＶ ＶＧ用量に比較して低減する方法であって、この方法は以下のものを含む：
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて産生されたｒＡＡＶの第一の用量を投与すること。
実施形態［１２１］の方法であって、更に
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて産生されたｒＡＡＶの少なくとも第二の用量を投与すること。
あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶの用量の被験者へ投与する方法であって、有害反応の数または強度を、一過性三重トランスフェクションにより産生された同じｒＡＡＶ ＶＧ用量に比較して低減する方法であって、この方法は以下のものを含む：
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて産生されたｒＡＡＶの用量を投与すること。
実施形態［１２３］の方法であって、前記有害反応が、肝臓機能不全、肝臓の炎症、消化器の感染、嘔吐、微生物感染、敗血症、トロポニンレベルの増大、赤血球細胞数の減少、血小板数の減少、補体免疫システム応答の活性化、急性腎障害、心肺機能不全、および死亡より成る群から選ばれるもの。
実施形態［１２３］の方法であって、前記有害作用が、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、およびインターロイキン６（ＩＬ－６）の１つの以上の血清濃度の増加であるもの。
ｒＡＡＶの用量を、それを必要とする患者に反復投与す方法であって：
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて産生されたｒＡＡＶの第一の用量を投与すること、およびその後に
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて産生されたｒＡＡＶの少なくとも第二の用量を投与することを含み、
ペイロードの治療的効果が、第一の用量を投与後に、少なくとも第二の用量を投与した後に比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満で変動するもの。
実施形態１２６の方法であって、ペイロードの治療的効果が、第一の用量を投与後に、第二の用量を投与した後に比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満で変動するもの。
一過性三重トランスフェクションにより産生された同じｒＡＡＶ ＶＧ用量に比較して、より多い数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有する複数のｒＡＡＶバッチを製造する方法であって、この方法は：
複数のｒＡＡＶバッチを、実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて産生することを含む。
実施形態１２８の方法であって、複数のｒＡＡＶバッチの間で、ウイルスゲノム（ＶＧ）数が、５０、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満で変動するもの。
実施形態１２８または１２９の方法であって、複数のｒＡＡＶバッチの間で、ウイルス粒子の数が、５０、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満で変動するもの
実施形態１２８～１３０の任意の１つの方法であって、ウイルス粒子（ＶＰ）の数またはウイルスゲノムの数が、精製前の複数のバッチからのものであるもの。
あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有する第一のｒＡＡＶバッチおよび第二のｒＡＡＶバッチのバッチ一貫性を増大する方法であって：
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて第一のｒＡＡＶバッチを産生すること；および
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて第二のｒＡＡＶバッチを産生することを含み；
この第一のｒＡＡＶバッチ中のウイルス粒子（ＶＰ）の数が、第二のｒＡＡＶバッチ中のウイルス粒子（ＶＰ）の数およびウイルスゲノム（ＶＧ）数に比較して、５０、４０％、３０％、または２０％未満で変動する、あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）数を有するもの。
第一のｒＡＡＶバッチおよび第二のｒＡＡＶバッチのバッチ一貫性を増大する方法であって：
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて第一のｒＡＡＶバッチを産生すること；および
実施形態１～２６の任意の１つのパッケージング細胞株中、実施形態２９～５５および５８～７４の任意の１つの細胞株中、または実施形態８３～８８の任意の１つの細胞培養組成物中、もしくは実施形態８９～９４の任意の１つのバイオリアクター中で産生するか、または実施形態２７、２８、５６、５７および１０３～１０５の任意の１つの産生方法を用いて第二のｒＡＡＶバッチを産生することを含み；
前記第二のｒＡＡＶバッチが、前記第一のｒＡＡＶバッチ中のウイルスゲノムの数に比べて、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満で変動する、ウイルスゲノム数を有するもの。
実施形態１３３の方法であって、精製前の前記第二のｒＡＡＶバッチが、前記第一のｒＡＡＶバッチ中のウイルスゲノムの数に比べて、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満で変動する、ウイルスゲノム数を有するもの。
実施形態１３３または１３４の方法であって、前記第二のｒＡＡＶバッチが、前記第一のｒＡＡＶバッチ中のウイルス粒子の数に比べて、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満で変動する、ウイルス粒子の数を有するもの。
実施形態１３３～１３５の任意の１つの方法であって、前記第二のｒＡＡＶバッチが、前記第一のｒＡＡＶバッチ中のウイルス粒子の数に比べて、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満で変動する、ウイルス粒子の数を有するもの。
実施形態１３３～１３６の任意の１つの方法であって、前記第一のｒＡＡＶバッチおよび前記第二のｒＡＡＶバッチが、モノクローナル細胞により産生されるもの。
実施形態１３３～１３７の任意の１つの方法であって、前記第一のｒＡＡＶバッチおよび前記第二のｒＡＡＶバッチが、異なるモノクローナル細胞株からの細胞により産生されるもの。
実施形態１２８～１３８の任意の１つの方法であって、細胞培養培地および／または細胞溶解物からｒＡＡＶウイルス粒子を精製する後続するステップを更に含むもの。
実施形態２７、２８、５６、５７、および１０３～１０５の任意の１つの方法により産生されるｒＡＡＶの生成物。
番号付けされた実施形態＃３
ポリヌクレオチド構成体であって、以下をコーディングするもの：
ａ） １つ以上のヘルパータンパク質；
ｂ） 前記１つ以上のヘルパータンパク質の上流の自己削除する要素；および
ｃ） 前記自己削除する要素の上流の誘導可能なプロモーター。
実施形態１のポリヌクレオチド構成体であって、前記自己削除する要素が、操作可能に前記誘導可能なプロモーターにリンクされるもの。
実施形態２のポリヌクレオチド構成体であって、前記自己削除する要素の発現が、前記誘導可能なプロモーターにより駆動されるもの。
実施形態２～３の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記誘導可能なプロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーター要素（ＴＲＥ）であるもの。
実施形態４のポリヌクレオチド構成体であって、前記ＴＲＥが最小限のオペレーターに融合したＴｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ） 配列コンカテマーを含むもの。
実施形態５のポリヌクレオチド構成体であって、前記最小限のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターであるもの。
実施形態２～６の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記誘導可能なプロモーターが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２２に対して含むもの。
実施形態２～７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、活性化因子の結合により、転写が前記誘導可能なプロモーターにより活性化されるもの。
実施形態８のポリヌクレオチド構成体であって、第一の引き金を引く薬剤の存在下で前記活性化因子が前記誘導可能なプロモーターに結合するもの。
実施形態８～９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、活性化因子を更に含むもの。
実施形態８～１０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記活性化因子が操作可能に構成的プロモーターにリンクされるもの。
実施形態１１のポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的プロモーターが、Ｅ１αプロモーターか、またはヒトサイトメガロウイルスプロモーターであるもの。
実施形態１２のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｅ１αプロモーターが少なくとも１つの変異を含むもの。
実施形態１１～１３の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的なプロモーターが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２０に対して含むもの。
実施形態８～１４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記活性化因子が、ＶＰ１６転写活性化ドメインに融合したＴｅｔリプレッサー結合タンパク質（ＴｅｔＲ）を含む逆テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｒＴＡ）であるもの。
実施形態１５のポリヌクレオチド構成体であって、前記ｒＴＡがｔｅｔＲ ＤＮＡ結合部分に４つの変異を含むもの。
実施形態１５～１６の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ｒＴＡが少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２１に対して含むもの。
実施形態２～７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、第一の引き金を引く薬剤の不在下に、前記誘導可能なプロモーターが、リプレッサーにより抑制されるもの。
実施形態２～１９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、第一の引き金を引く薬剤の存在下に、前記誘導可能なプロモーターが、リプレッサーにより抑制されるもの。
実施形態１８～１９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記誘導可能なプロモーターが、リプレッサーに結合するもの。
実施形態１８～２０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リプレッサーがテトラサイクリン制御転写活性化因子であるもの。
実施形態１８～２１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リプレッサーを更に含むもの。
実施形態１８～２２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リプレッサーが操作可能に構成的プロモーターにリンクされるもの。
実施形態１８～２３の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、テトラサイクリン制御転写活性化因子を更に含むもの。
実施形態１８～２４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記テトラサイクリン制御転写活性化因子が、操作可能に構成的プロモーターにリンクされるもの。
実施形態１８～２５の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的プロモーターがＥ１αプロモーターであるもの。
実施形態１８～２６の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｅ１αプロモーターが、少なくとも１つの変異を含むもの。
実施形態２７のポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的プロモーターが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２０に対して含むもの。
実施形態２１または２４～２８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記テトラサイクリン制御転写活性化因子が、第一の引き金を引く薬剤の不在下で抑制されないもの。
実施形態２１または２４～２９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記テトラサイクリン制御転写活性化因子が、第一の引き金を引く薬剤の存在下で、前記誘導可能なプロモーターに結合しないもの。
実施形態１８～３０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的プロモーターが、Ｅ１αプロモーターであるもの。
実施形態３１のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｅ１αプロモーターが少なくとも１つの変異を含むもの。
実施形態３１～３２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的プロモーターが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２０に対して含むもの。
実施形態１８～３３の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記誘導可能なプロモーターからの転写が、前記リプレッサーへの前記第一の発現の引き金を引く薬剤の結合により活性化されるもの。
実施形態１８～３４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リプレッサーが前記第一の発現の引き金を引く薬剤に結合するもの。
実施形態１８～３５の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の発現の引き金を引く薬剤がテトラサイクリンであるもの。
実施形態３６のポリヌクレオチド構成体であって、前記テトラサイクリンがドキシサイクリンであるもの。
実施形態２～３の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記誘導可能なプロモーターがクミン酸塩オペレーター配列であるもの。
実施形態３８のポリヌクレオチド構成体であって、前記クミン酸塩オペレーター配列が、構成的プロモーターの下流にあるもの。
実施形態３９のポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的なプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターであるもの。
実施形態３８～４０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、第一の引き金を引く薬剤の不在下で、前記誘導可能なプロモーターがｃｙｍＲリプレッサーにより抑制されるもの。
実施形態３８～４１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、第一の引き金を引く薬剤の存在下で、前記誘導可能なプロモーターが活性化されるもの。
実施形態４１のポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の引き金を引く薬剤が、ｃｙｍＲリプレッサーに結合するもの。
実施形態４１または４３のポリヌクレオチド構成体であって、ｃｙｍＲリプレッサーを更に含むもの。
実施形態４１または４３～４４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ｃｙｍＲリプレッサーが操作可能に構成的プロモーターにリンクされるもの。
実施形態４５のポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的なプロモーターが、Ｅ１αプロモーターであるもの。
実施形態４６のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｅ１αプロモーターが少なくとも１つの変異を含むもの。
実施形態４６～４７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記構成的なプロモーターが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２０に対して含むもの。
実施形態４１～４９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の発現の引き金を引く薬剤が、クミン酸塩であるもの。
実施形態１～４９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、自己削除する要素をコードする配列がポリＡ配列を含むもの。
実施形態１～５０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記自己削除する要素がリコンビナーゼであるもの。
実施形態５１のポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼが部位特異的なリコンビナーゼであるもの。
実施形態５１のポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼがリガンド結合ドメインに融合したもの。
実施形態５１のポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドであるもの。
実施形態５４のポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃｒｅポリペプチドがリガンド結合ドメインに融合したもの。
実施形態５５のポリヌクレオチド構成体であって、前記リガンド結合ドメインがホルモン受容体であるもの。
実施形態５６のポリヌクレオチド構成体であって、前記ホルモン受容体がエストロゲン受容体であるもの。
実施形態５７のポリヌクレオチド構成体であって、前記エストロゲン受容体が点変異を含むもの。
実施形態５８のポリヌクレオチド構成体であって、前記エストロゲン受容体がＥＲＴ２であるもの。
実施形態５１のポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドであるもの。
実施形態１～６１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、第二の引き金を引く薬剤の存在下で、前記自己削除する要素が、核に転座するもの。
実施形態６１のポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の引き金を引く薬剤がエストロゲン受容体のリガンドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、タモキシフェンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼが、組み換え部位の側面にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記組み換え部位が、ｌｏｘ部位か、またはフリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質がＥ２ＡおよびＥ４を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質が更にタンパク質タグを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記タンパク質標識が、ＦＬＡＧタグであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｅ２ＡがＦＬＡＧタグ付けされたＥ２Ａであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｅ２をコードする配列および前記Ｅ４をコードする配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）により分離されているもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、選択可能なマーカーをコードする配列を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、前記抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または前記抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、ロイシンジッパーであるか、または前記抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質がピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列が、転写的に不活性な配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列が、その内在的なプロモーターに少なくとも２つの変異を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡの発現がＵ６プロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列をコードする配列の上流に、５’から３’に向かって、以下のものを含むもの：
ａ） Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；
ｂ） 第一の組み換え部位；
ｃ） スタッファー配列；
ｄ） 第二の組み換え部位；
ｅ） Ｕ６プロモーター配列の第二の部分。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列がリコンビナーゼにより削除可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列が遺伝子をエンコードする配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列がプロモーターを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記プロモーターが構成的プロモーターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記プロモーターがＣＭＶプロモーターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記遺伝子が検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが哺乳類細胞選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが栄養要求性選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択要素が、活性タンパク質をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記活性タンパク質がＤＨＦＲであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択コーディング配列が、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードするものであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記不活性なタンパク質が、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：４に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：５に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質がピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記検出可能なマーカーが、発光マーカーか、または蛍光マーカーを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記蛍光マーカーが、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の組み換え部位は、第一のｌｏｘ配列であり、および前記第二の組み換え部位は、第二のｌｏｘ配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一のｌｏｘ配列は、第一のｌｏｘＰ配列であり、および前記第二の組み換え部位は、第二のｌｏｘＰ配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の組み換え部位は、第一のＦＲＴ部位であり、および前記第二の組み換え部位は、第二のＦＲＴ部位であるもの。
ベクター中の実施形態１～１０７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体。
プラスミド中の実施形態１～１０７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体。
微生物人工染色体中か、または酵母人工染色体中の実施形態１～１０７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体。
実施形態１～１１０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、このポリヌクレオチド構成体が、合成核酸構成体であるもの。
実施形態１～１１１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を、配列番号：９～配列番号：１９、配列番号：２３～配列番号：３２、または配列番号：３５に対して含むもの。
実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態１１３の細胞であって、前記ポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノムに安定的に統合されたもの。
実施形態１１３～１１４の任意の１つの細胞であって、この細胞が哺乳類細胞であるか、または昆虫細胞であるもの。
実施形態１１３～１１４の任意の１つの細胞であって、この細胞がＨＥＫ２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＳＦ９細胞であるもの。
実施形態１１３～１１６の任意の１つの細胞であって、この細胞がＥ１Ａ タンパク質またはＥ１Ｂタンパク質を発現するもの。
実施形態１１３～１１７の任意の１つの細胞であって、前記細胞がＤＨＦＲヌル細胞であるもの。
ポリヌクレオチド構成体であって：
ａ） Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列；
ｂ） Ｒｅｐ遺伝子の第二の部分の配列；
ｃ） Ｃａｐ遺伝子の配列；および
ｄ） Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列およびＲｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に配置される削除可能な要素。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が、停止シグナリング配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が、ウサギβグロブリンイントロンを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が、エクソンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が、イントロンおよびエクソンを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が、イントロンを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列および前記Ｒｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に２つのスプライス部位が配置されたもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記２つのスプライス部位が５’スプライス部位および３’スプライス部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記５’スプライス部位が、ウサギβグロブリン５’スプライス部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記３’スプライス部位が、ウサギβグロブリン３’スプライス部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列および前記Ｒｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に３つのスプライス部位が配置されたもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記３つのスプライス部位が、５’スプライス部位、第一の３’スプライス部位、および第二の３’スプライス部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、第一の３’スプライス部位が、第二の３’スプライス部位の複製であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の３’スプライス部位が、ウサギβグロブリン３’スプライス部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の３’スプライス部位が、ウサギβグロブリン３’スプライス部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が組み換え部位を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記組み換え部位がｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ｌｏｘ部位がｌｏｘＰ部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素が５’から３’に向かって：
ａ） 前記５’スプライス部位；
ｂ） 第一の組み換え部位；
ｃ） 前記第一の３’スプライス部位；
ｄ） 停止シグナリング配列；
ｅ） 第二の組み換え部位；および
ｆ） 前記第二の３’スプライス部位。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記削除可能な要素は５’から３’に向かって：
ａ） 前記５’スプライス部位；
ｂ） 第一のスペーサーセグメント；
ｃ） 第二のスペーサーセグメントであって以下を含むもの：
ｉ） 第一の組み換え部位；
ｉｉ） 第一の３’スプライス部位；
ｉｖ） 停止シグナリング配列；および
ｖ） 第二の組み換え部位；ならびに
ｄ） 第二の３’スプライス部位を含む、第三のスペーサーセグメント。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一のスペーサー配列がイントロンを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一のスペーサーセグメントが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：１に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二のスペーサーセグメントが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第三のスペーサーセグメントが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：３に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第三のスペーサーセグメントが、イントロンを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一のスペーサーセグメントおよび前記第三のスペーサーセグメントが、内在性の細胞機構により削除される能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二のスペーサーセグメントがエクソンを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二のスペーサーセグメントがポリＡ配列を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ポリＡ配列が前記エクソンの３’であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ポリＡ配列がウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡ配列を含むもの。
実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二のスペーサーセグメントが５’から３’に向かって：
ａ） 第一の組み換え部位；
ｂ） 前記第一の３’スプライス部位；
ｃ） エクソン
ｄ） 停止シグナリング配列；および
ｅ） 第二の組み換え部位。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の組み換え部位が第一のｌｏｘ配列であり、前記第二の組み換え部位が第二のｌｏｘ配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一のｌｏｘ配列が、第一のｌｏｘＰ配列であり、前記第二のｌｏｘ配列が、第二のｌｏｘＰ配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の組み換え部位が第一のＦＲＴ部位であり、前記第二の組み換え部位が第二のＦＲＴ部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記停止シグナリング配列が、前記エクソンまたはポリＡ配列の終末コドンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ポリＡ配列が、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ）ポリＡ配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記エクソンが、検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記検出可能なマーカーが発光マーカーまたは蛍光マーカーを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記蛍光マーカーがＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二のスペーサーセグメントがリコンビナーゼにより削除可能なもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼが部位特異的リコンビナーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃｒｅポリペプチドがリガンド結合ドメインに融合しているもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リガンド結合ドメインがホルモン受容体であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ホルモン受容体がエストロゲン受容体であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記エストロゲン受容体が点変異を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記エストロゲン受容体がＥＲＴ２であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼがＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼが第二のポリヌクレオチド構成体によりエンコードされるか、または外来的に供給されるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｒｅｐ遺伝子がＲｅｐポリペプチドをコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃａｐ遺伝子がＣａｐポリペプチドをコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子の転写が野生型のプロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記野生型のプロモーターが、Ｐ５、Ｐ１９、およびＰ４０を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｒｅｐポリペプチドが野生型のＲｅｐポリペプチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＲｅｐポリペプチドがＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分から発現されるポリペプチドを含む欠失した複製随伴タンパク質、および前記エクソンがリコンビナーゼの不在下で削除されるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃａｐポリペプチドが野生型のＣａｐポリペプチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＣａｐポリペプチドがＡＡＶカプシドタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、選択可能なマーカーをコードする配列を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが哺乳類細胞選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが栄養要求性選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択要素が、活性タンパク質をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記活性タンパク質がＤＨＦＲであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択コーディング配列が、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列が、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記不活性タンパク質が、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＤＨＦＲ
Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒを含むもの。
実施形態１８５～１８７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：４に対して含むもの。
実施形態１８５～１８８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：５に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質が、ピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性であるもの。
実施形態１１９～１９３の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を更に含むもの。
実施形態１１９～１９４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ベクター中にあるもの。
実施形態１１９～１９４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、プラスミド中にあるもの。
実施形態１１９～１９４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、微生物人工染色体か、または酵母人工染色体中にあるもの。
実施形態１１９～１９７の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、このポリヌクレオチド構成体が合成核酸構成体であるもの。
実施形態１１９～１９８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：１～配列番号：３、配列番号６～配列番号：８、または配列番号：３２に対して有する配列を含むもの。
実施形態１１９～１９９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列を更に含むもの。
実施形態２００のポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡをコードする配列が、転写的に不活性な配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＶＡ ＲＮＡをコードする配列が、その内部プロモーター中に２つの変異を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡの発現が、Ｕ６プロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子の上流に５’から３’に向かって：
ａ） Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；
ｂ） 第一の組み換え部位；
ｃ） スタッファー配列；
ｄ） 第二の組み換え部位；
ｅ） Ｕ６プロモーター配列の第二の部分。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列は、リコンビナーゼにより削除可能である。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列は、遺伝子をエンコードする配列を含む。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列は、プロモーターを含む。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記プロモーターは、構成的プロモーターである。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態２１０の細胞であって、前記ポリヌクレオチド構成体は前記細胞の核ゲノム中に安定的に統合される。
実施形態２１０～２１１の任意の１つの細胞であって、前記細胞が哺乳類細胞であるか、または昆虫細胞であるもの。
実施形態２１０～２１１の任意の１つの細胞であって、前記細胞がＨＥＫ２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＳＦ９細胞であるもの。
実施形態２１０～２１３の任意の１つの細胞であって、前記細胞がＥ１Ａ タンパク質またはＥ１Ｂタンパク質を発現するもの。
実施形態２１０～２１４の任意の１つの細胞であって、前記細胞がＤＨＦＲヌル細胞であるもの。
ＶＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド構成体であって、このＶＡ ＲＮＡが内在的なプロモーターに少なくとも２つの変異を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、このＶＡ ＲＮＡをコードする配列が、転写的に不活性なＶＡ ＲＮＡをコードする配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、前記プロモーター領域中に５～１０のヌクレオチドの削除を含む。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列は、少なくとも１つの変異を含む。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記少なくとも１つの変異は、Ａ Ｂｏｘプロモーター領域中にある。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記少なくとも１つの変異は、Ｂ Ｂｏｘプロモーター領域中にある。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記少なくとも１つの変異は、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａである。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ＶＡ ＲＮＡの発現は、Ｕ６プロモーターに駆動される。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子配列の上流に、ＶＡ ＲＮＡ遺伝子配列の上流で５’から３’に向かって、以下のものを含むもの：
ａ） Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；
ｂ） 第一の組み換え部位；
ｃ） スタッファー配列；
ｄ） 第二の組み換え部位；
ｅ） Ｕ６プロモーター配列の第二の部分。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列はリコンビナーゼにより削除可能である。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列は遺伝子をエンコードする配列を含む。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記スタッファー配列はプロモーターを含む。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記プロモーターは構成的プロモーターである。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記遺伝子は検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードする。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、哺乳類細胞選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、栄養要求性選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択要素が活性タンパク質をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記活性タンパク質がＤＨＦＲであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択コーディング配列が、活性のために、第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する、不活性タンパク質をエンコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の栄養要求性の選択コーディング配列は、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ をエンコードする。
実施形態２３６のポリヌクレオチド構成体であって、前記不活性なタンパク質がＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒ またはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒ を含むもの。
実施形態２３６～２３７のポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒであるもの。
実施形態２３６～２３８のポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含むもの。
実施形態２３６～２３９のポリヌクレオチド構成体であって、前記ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒが少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテイであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質がピューロマイシン抵抗性か、またはブラストサイジン抵抗性であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記検出可能なマーカーが、発光マーカーであるか、または蛍光マーカーであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記蛍光マーカーが、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、 ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、リコンビナーゼをコードする配列を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼが外来的に供給されるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼ部位特異的リコンビナーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼはＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記Ｃｒｅポリペプチドがリガンド結合ドメインに融合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リガンド結合ドメインがホルモン受容体であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記ホルモン受容体がエストロゲン受容体であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記エストロゲン受容体が点変異を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記エストロゲン受容体がＥＲＴ２であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の組み換え部位が、第一の ｌｏｘ配列であり、および前記第二の組み換え部位が、第二のｌｏｘ配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一のｌｏｘ 配列が、第一のｌｏｘＰ配列であり、および前記第二の組み換え部位が、第二のｌｏｘＰ配列であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第一の組み換え部位が、第一のＦＲＴ部位であり、および前記第二の組み換え部位が、第二のＦＲＴ部位であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、選択可能なマーカーをコードする配列を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質がピューロマイシン抵抗性か、またはブラストサイジン抵抗性であるもの。
実施形態２１６～２６４の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体の配列を更に含むもの。
実施形態２１６～２６５の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体の配列を更に含むもの。
実施形態２１６～２６６の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、ベクター中にあるもの。
実施形態２１６～２６６の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、プラスミド中にあるもの。
実施形態２１６～２６６の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、微生物人工染色体中か、または酵母人工染色体中にあるもの。
実施形態２１６～２６９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、このポリヌクレオチド構成体が合成核酸構成体であるもの。
実施形態２１６～２７０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：１３～配列番号：１９または配列番号２３～配列番号：２６に対して含むもの。
実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態２７２の細胞であって、前記ポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノムに安定的に統合されたもの。
実施形態２７２～２７３の任意の１つの細胞であって、前記細胞が哺乳類細胞であるか、または昆虫細胞であるもの。
実施形態２７２～２７３の任意の１つの細胞であって、前記細胞がＨＥＫ２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＳＦ９細胞であるもの。
実施形態２７２～２７５の任意の１つの細胞であって、前記細胞がＥ１Ａ タンパク質またはＥ１Ｂタンパク質を発現するもの。
実施形態２７２～２７６の任意の１つの細胞であって、前記細胞がＤＨＦＲヌル細胞であるもの。
実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態Ｚの任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態２７８～２８１の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体がこの細胞に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２８２の任意の１つの細胞であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞。
実施形態２７８～２８３の任意の１つの細胞であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体がこの細胞に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２８４の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、別々にこの細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２８５の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、別々にこの細胞のゲノムに安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２８６の任意の１つの細胞であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、別々にこの細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２８７の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、別々にこの細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２８８の任意の１つの細胞であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、別々にこの細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２８９の任意の１つの細胞であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体がこの細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９０の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９１の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９２の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９３の任意の１つの細胞であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９４の任意の１つの細胞であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９５の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９６の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されているもの。
実施形態２７８～２９７の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中の安定的な統合を維持するために、単一の栄養要求性選択のみを要求するもの。
実施形態２７８～２９８の任意の１つの細胞であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中の安定的な統合を維持するために、単一の非栄養要求性選択のみを要求するもの。
実施形態２７８～２９９の任意の１つの細胞であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つののポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中の安定的な統合を維持するために、単一の非栄養要求性選択のみを要求するもの。
実施形態２７８～３００の任意の１つの細胞であって、この細胞が哺乳類細胞であるか、または昆虫細胞であるもの。
実施形態２７８～３０１の任意の１つの細胞であって、この細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＳＦ９細胞であるもの。
実施形態２７８～３０２の任意の１つの細胞であって、この細胞が、Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を発現するもの。
実施形態２７８～３０３の任意の１つの細胞であって、この細胞が、更にペイロード構成体を含むもの。
実施形態３０４の細胞であって、前記ペイロード構成体が、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：３３に対して含むもの。
実施形態３０４～３０５の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロードの配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体の発現が、構成的プロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記構成的プロモーターおよび前記ペイロードの配列が、ＩＴＲ配列の側面にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロードの配列が、遺伝子をコーディングするポリヌクレオチド配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記遺伝子が、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記遺伝子が、治療的ポリペプチドまたは導入遺伝子をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロードの配列が、治療的ポリヌクレオチドをコーディングするポリヌクレオチド配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記治療的ポリヌクレオチドが、ｔＲＮＡサプレッサーまたはガイドＲＮＡであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ガイドＲＮＡが、タンパク質に結合する能力を有するポリリボヌクレオチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記タンパク質がヌクレアーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記タンパク質がＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記Ｃａｓタンパク質が触媒的に不活性なＣａｓタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、複数の前記ペイロード構成体が、前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記複数のペイロード構成体が、別々に前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、更に選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする配列をＩＴＲ配列の外部に含むもの。
先行する実施形態の任意のポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、哺乳類細胞選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、栄養要求性選択要素であるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択要素が活性タンパク質をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記活性タンパク質がＤＨＦＲであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記栄養要求性選択コーディング配列が、活性のために第二の栄養要求性選択コーディング配列の発現を要求する不活性なタンパク質をエンコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記第二の栄養要求性選択コーディング配列がＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒをエンコードするもの。
実施形態の３２７のポリヌクレオチド構成体であって、前記不活性なタンパク質が、ＤＨＦＲ Ｚ－ＣｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒを含むもの。
実施形態３２７～３２８の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記選択可能なマーカーが、ＤＨＦＲ Ｚ－ＮｔｅｒまたはＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒであるもの。
実施形態３２７～３２９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記 ＤＨＦＲ Ｚ－Ｎｔｅｒが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：４に対して含むもの。
実施形態３２７～３３０の任意の１つのポリヌクレオチド構成体であって、前記 ＤＨＦＲ Ｚ－Ｃｔｅｒが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を持つ配列を配列番号：５に対して含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ＩＴＲ配列の外部の、前記選択可能なマーカーは、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテイであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテイであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ＩＴＲ配列の外部の、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質が、ピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞のゲノム中での、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および先行する実施形態の任意の１つのペイロード構成体の安定的な統合を維持するために、単一の非栄養要求性選択のみを要求するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞のゲノム中での、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および先行する実施形態の任意の１つのペイロード構成体の安定的な統合を維持するために、単一の非栄養要求性選択のみを要求するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞のゲノム中での、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および先行する実施形態の任意の１つのペイロード構成体の安定的な統合を維持するために、単一の非栄養要求性選択のみを要求するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ポリヌクレオチド構成体がプラスミド中にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ポリヌクレオチド構成体が、微生物人工染色体中か、または酵母人工染色体中にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、合成核酸構成体であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞が前記ペイロードの配列をカプシドで被覆したｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞が、少なくとも１つの引き金を引く薬剤の添加により、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、カプシドタンパク質およびペイロード核酸を含む前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、１×１０５ｖｇ／標的細胞以下のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％ 大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ＡＡＶウイルス粒子は、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生された野生型のＡＡＶウイルス粒子である。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ＭＯＩは、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞である。
いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩは、１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞である。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞が、条件付きで、ペイロードのカプシド被覆率が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上である、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力があるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上であるペイロードのカプシド被覆率を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が精製前に、１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞が精製前に、
１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または
１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬ以上であるペイロード核酸配列力価を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力があるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、この細胞が精製前に、
１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬ以上の濃度のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力があるもの。
０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上であるカプシド被覆率を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力がある細胞集団。
実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞集団。
実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞集団。
実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態
１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞集団。
実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９、および実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体を含む細胞集団。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、この細胞集団のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、この細胞集団のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が、この細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、先行する実施形態の任意の１つのペイロード構成体が、この細胞集団のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団が、先行する実施形態の任意の１つの複数の細胞であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団が、哺乳類細胞集団であるか、または昆虫細胞集団であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団が、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＳＦ９細胞の集団であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞が、Ｅ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質を発現するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞が、更にペイロード構成体を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロード構成体が、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロードの配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロード構成体の発現が、構成的プロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記構成的プロモーターおよび前記ペイロードの配列が、ＩＴＲ配列の側面にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロードの配列が、遺伝子をコーディングするポリヌクレオチド配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記遺伝子が、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記遺伝子が、治療的ポリペプチドまたは導入遺伝子をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロードの配列が、治療的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記治療的ポリヌクレオチドが、ｔＲＮＡサプレッサーまたはガイドＲＮＡであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ガイドＲＮＡが、タンパク質に結合する能力を有するポリリボヌクレオチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記タンパク質がヌクレアーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記タンパク質がＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記Ｃａｓタンパク質が触媒的に不活性なＣａｓタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロード構成体が、前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロード構成体が、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードする配列をＩＴＲ配列の外部に更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記選択可能なマーカーが抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ＩＴＲ配列外の選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ＩＴＲ配列外の選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質がピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロード構成体がプラスミド中にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロード構成体が微生物の人工的染色体中にあるか、または酵母の人工的染色体中にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ペイロード構成体がこの細胞集団のゲノムに安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞の増殖により産生される細胞集団。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、増殖は少なくとも３回継代培養することを含む。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団の細胞が、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞が、少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により、条件付きでｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記少なくとも２つの引き金を引く薬剤が、ドキシサイクリンおよびタモキシフェンを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記少なくとも２つの引き金を引く薬剤が、削除する要素の発現およびおよび核への転座を誘導するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団の細胞が、削除する要素の添加により、条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記削除する要素がリコンビナーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記リコンビナーゼが部位特異的なリコンビナーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記削除する要素が、Ｃｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記削除する要が、ホルモンにより規制されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団が、条件付きで、その内部にペイロードをエンコードする発現可能なポリヌクレオチドをパッケージ化したｒＡＡＶを産生する能力があり；およびこの細胞集団により産生されたウイルス粒子の集団は、別の比較可能なｒＡＡＶウイルス粒子産生細胞により一過性トランスフェクションにより産生されたウイルス粒子の集団よりも均一である。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団により産生されたウイルス粒子の集団が、５００：１～１：１のウイルスゲノム対形質導入の比を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団により産生されたウイルス粒子の集団が、１００：１のベクターゲノム対感染ユニットの比を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、ウイルス粒子の産生が引き金を引く薬剤の添加により誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、ウイルス粒子の産生が少なくとも２つの引き金を引く薬剤の添加により誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記細胞集団は、条件付きで、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のペイロードのカプシド被覆率を有するｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記細胞集団は、条件付きで、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のペイロードのカプシド被覆率を有する、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団が、
１×１０６、２×１０６、５×１０６、または１×１０７細胞／ｍＬ以上の生存可能な細胞濃度に到達する能力があるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、精製前に、１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の濃度を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団が、精製前に、１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または
１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の力価のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、この細胞集団が、精製前に、１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または
１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の濃度のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有する。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記カプシドタンパク質およびペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子が、１×１０５ｖｇ／標的細胞またはそれ未満のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、同一のＭＯＩにおいて、このｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、同一のＭＯＩにおいて、このｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、同一のＭＯＩにおいて、このｒＡＡＶウイルス粒子が、ＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、このＡＡＶウイルス粒子が、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生された野生型のＡＡＶウイルス粒子であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、いくつかの実施形態では、前記ＭＯＩが、１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ＭＯＩが、１×１０１～
１×１０５ｖｇ／標的細胞の範囲から選ばれるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記細胞が凍結保存されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記細胞が、バイアル、フラスコ、シリンジまたは他の適切な細胞保存容器に含まれることができるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、プラスミドの不在下で産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現が、プラスミドの不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質の発現が、プラスミドの不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であって、前記少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質の発現が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団の増殖により産生される第二の細胞集団。
実施形態４３０の第二の細胞集団であって、この細胞集団の増殖が、前記細胞集団を少なくとも３回継代培養することを含むもの。
実施形態４３０の第二の細胞集団であって、この細胞集団の増殖が、前記細胞集団を、少なくとも３～６０回継代培養することを含むもの。
実施形態４３０の第二の細胞集団であって、この細胞集団の増殖が前記細胞集団を、少なくとも、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０回継代培養することを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団を含む安定な細胞株。
実施形態４３４の安定な細胞株であって、この細胞集団が単一の細胞から誘導されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団を含む安定な細胞株。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、この細胞集団が単一の細胞から誘導されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、この単一の細胞が先行する実施形態の任意の１つからのものであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、この安定な細胞株の、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％が、先行する実施形態の任意の１つの細胞集団であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞から誘導された安定な細胞株。
先行する実施形態の任意の１つの細胞から増殖された安定な細胞株。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株が、哺乳類の安定な細胞株であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質の発現が、プラスミドの不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、少なくとも１つ以上のヘルパータンパク質の発現が、トランスフェクションの不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現が、プラスミドの不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の発現が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、ｒＡＡＶウイルス粒子が、プラスミドの不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、ｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、トランスフェクション薬剤の不在下で誘導可能であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記安定な細胞株が、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の濃度のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、この安定な細胞株が、精製前に１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の濃度のペイロード核酸配列を含むｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、この安定な細胞株が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のカプシド被覆率を有するｒＡＡＶウイルス粒子を条件付きで産生する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、精製前に０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７、または０．９９以上のカプシド被覆率を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記カプシドタンパク質およびペイロード核酸を含むｒＡＡＶウイルス粒子が、１×１０５ｖｇ／標的細胞またはそれ以下のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有する。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記ＡＡＶウイルス粒子が、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生された野生型のＡＡＶウイルス粒子であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記ＭＯＩが、
１×１０１、１×１０２、２×１０３、５×１０４または１×１０５ｖｇ／標的細胞であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記ＭＯＩが、
１×１０１～１×１０５ｖｇ／標的細胞の範囲であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記細胞が凍結保存されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株であって、前記安定な細胞株の少なくとも１つの細胞が、バイアル、フラスコ、シリンジまたは他の適切な細胞保存容器に含まれることができるもの。
細胞培養組成物であって：
ａ） 懸濁に適応した細胞、
ｂ） 血清を含まない細胞培養培地、および
ｃ） 組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を含み、
前記細胞培養組成物が、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、およびアデノウィルスを含まず、および
前記細胞培養組成物が、プラスミドおよびトランスフェクション薬剤を含まないもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞培養組成物であって、この細胞培養組成物が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含まないもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞培養組成物であって、前記懸濁に適応した細胞が、懸濁に適応した哺乳類細胞であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞培養組成物であって、前記懸濁に適応した細胞が、懸濁に適応したＨＥＫ２９３細胞およびその誘導体であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞培養組成物であって、前記懸濁に適応した哺乳類細胞が、先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株からのものであるか、または先行する実施形態の任意の１つの細胞を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞培養組成物であって、前記細胞培養組成物が、精製前１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、
７×１０１４、８×１０１４、９×１０１４、１×１０１５、または５×１０１５ウイルスゲノム／ｍＬ以上のｒＡＡＶ濃度を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞培養組成物であって、前記細胞培養組成物が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上の精製前のｒＡＡＶのカプシド被覆率を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株を含むバイオリアクター。
先行する実施形態の任意の１つの細胞集団を含むバイオリアクター。
先行する実施形態の任意の１つの細胞を含むバイオリアクター。
先行する実施形態の任意の１つの細胞培養物を含むバイオリアクター。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが１Ｌのバイオリアクターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが１Ｌのバイオリアクターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが１×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）以上の合計ｒＡＡＶ収量を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５Ｌのバイオリアクターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５×１０１４ウイルスゲノム（ｖｇ）以上の合計ｒＡＡＶ収量を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５０Ｌのバイオリアクターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５×１０１５ウイルスゲノム（ｖｇ）以上の合計ｒＡＡＶ収量を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが１００Ｌのバイオリアクターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが１×１０１６ウイルスゲノム（ｖｇ）以上の合計ｒＡＡＶ収量を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５００Ｌのバイオリアクターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが５×１０１６ウイルスゲノム（ｖｇ）以上の合計ｒＡＡＶ収量を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが２０００Ｌのバイオリアクターであるもの。
先行する実施形態の任意の１つのバイオリアクターであって、このバイオリアクターが２×１０１７ウイルスゲノム（ｖｇ）以上の合計ｒＡＡＶ収量を有するもの。
１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、
９×１０１４、１×１０１５、または５×１０１５以上のミリリットルあたりのウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌの濃度を有する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むバイオリアクター。
１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、
９×１０１４、１×１０１５、または５×１０１５以上のミリリットルあたりのウイルスゲノム（ｖｇ）／Ｌの精製前濃度を有する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含むバイオリアクター。
いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは、１Ｌ、５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、５００Ｌ、または２０００Ｌのバイオリアクターである。
いくつかの実施形態では、前記バイオリアクターは単回使用のバイオリアクターである。
ウイルス粒子をカプシドで被覆する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物であって、この組成物が、１×１０１１を越えるか、５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、
１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上の精製前の濃度を有するもの。
ウイルス粒子をカプシドで被覆する複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物であって、この組成物が０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上の精製前のカプシドの被覆比を有するもの。
ウイルスゲノムをカプシドで被覆するｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物であって、この組成物が１×１０５ｖｇ／標的細胞のＭＯＩにおいて、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有するもの
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、同一のＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子は、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞集団により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有するも
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、同じＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型のＡＡＶを有する細胞から産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、同じＭＯＩにおいて、前記ｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型のＡＡＶを有する細胞から産生されたＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有するもの。
実施形態の組成物であって、複数のｒＡＡＶウイルス粒子を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、精製前に１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４ウイルスゲノム／ｍＬ以上のｒＡＡＶ濃度を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、前記細胞培養組成物が、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上の精製前のｒＡＡＶのカプシド被覆率を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、同一のＭＯＩにおいて、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、増大した感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、同一のＭＯＩにおいて、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、比較可能な他の一過性トランスフェクションにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する能力のある細胞により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、同一のＭＯＩにおいて、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、野生型のＡＡＶを有する細胞により産生された複数のＡＡＶウイルス粒子に比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、前記ＭＯＩが１×１０１、
１×１０２、２×１０３、５×１０４、または１×１０５ｖｇ／標的細胞であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、前記ＭＯＩが、１×１０１～
１×１０５ｖｇ／標的細胞の範囲で選ばれるもの。
先行する実施形態の任意の１つの組成物であって、前記ウイルスゲノムが、ペイロードをコードする配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記ペイロードの配列の発現が、構成的プロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記ペイロードの配列が、遺伝子をコーディングするポリヌクレオチド配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記遺伝子が、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記遺伝子が、治療的ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記ペイロードの配列が、治療的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記治療的ポリヌクレオチドが、ｔＲＮＡサプレッサーか、またはガイドＲＮＡであるもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記ガイドＲＮＡが、タンパク質に結合する能力を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記タンパク質がヌクレアーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記タンパクがＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ細胞であって、前記Ｃａｓタンパク質が触媒的に不活性なＣａｓタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ組成物であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子ｇａＣａｐポリペプチドを含むもの。
先行する実施形態の任意の１つ組成物であって、前記Ｃａｐポリペプチドが、ＡＡＶカプシドタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ組成物であって、前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ組成物であって、ＡＡＶカプシドタンパク質の血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれるもの。
第一および第二の組成物であって、この第一の組成物が、先行する実施形態の任意の１つ組成物を含み、この第二の組成物が、先行する実施形態の任意の１つの組成物を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、これら第一および第二の組成物が、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満変動するカプシド被覆率を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、これら第一および第二の組成物が、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満変動するウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、これら第一および第二の組成物が、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満変動する感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物が第一の用量であり、この第二の組成物が第二の用量であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物が第二の組成物が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日前に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、第二の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日前に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物が第二の組成物が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月前に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が第二の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月前に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物が第二の組成物が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ年前に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が第二の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ年前に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物が、第一のバイオリアクターからの複数のウイルス粒子から産生され、この第二の組成物が、第二のバイオリアクターからの複数のウイルス粒子から産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、第三の組成物を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物、第二の組成物、および第三の組成物が、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満で変動するカプシド被覆率を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物、第二の組成物、および第三の組成物が、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満で変動するウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第一の組成物、第二の組成物、および第三の組成物が、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満で変動する感染性を有するもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物が第三の用量であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物が第二の組成物が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日後に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が第二の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、または７日後に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物が第二の組成物が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月後に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が第二の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月後に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物が第二の組成物が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ年後に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が第二の組成物の複数のｒＡＡＶウイルス粒子が産生される、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ年後に産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの第一および第二の組成物であって、この第三の組成物が、第三のバイオリアクターからの複数のウイルス粒子から産生されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む薬学的組成物および薬学的に許容される担体。
複数の薬学的用量であって、実施形態５４６の薬学的組成物を含むもの。
実施形態５４７の複数の薬学的用量であって、第一の用量と第二の用量の間の、カプシド被覆率の差が２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの複数の薬学的用量であって、第一の用量と第二の用量の間の、ウイルスゲノムの濃度の差が２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの複数の薬学的用量であって、第一の用量と第二の用量の間の、ウイルスゲノムの濃度の差が２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの複数の薬学的用量であって、第一の用量と第二の用量の間の、ｒＡＡＶウイルス粒子の感染性の差が２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％未満であるもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態Ｚの任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態２１６～２７１の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体および実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、および実施形態１１９～２０９の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、および実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体が、別々に細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記細胞をペイロード構成体に接触させることを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記ペイロード構成体が、細胞のゲノムに安定に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体および前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体および前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体および前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体、および実施形態１１９～２０９の任意の１つの前記ポリヌクレオチド構成体および前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記細胞を複数のペイロード構成体に接触させることを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記複数のペイロード構成体が、安定的に前記細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体および複数の前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体および複数の前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体および複数の前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、および複数の前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、および複数の前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、および複数の前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数の前記ポリヌクレオチド構成体、および複数の前記ペイロード構成体が、別々に細胞に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記継代培養が、選択圧を含む細胞培地中であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記継代培養が、少なくとも２つの選択圧を含む細胞培地中であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記選択圧が抗生物質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記抗生物質がブラストサイジンまたはピューロマイシンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記継代培養が、少なくとも２つの抗生物質を含む細胞培地中であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記選択圧が栄養素の欠損であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記栄養の欠損が、ヒポキサンチンの欠損およびチミジンの欠損であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記安定な細胞株が、
１×１０６、２×１０６、５×１０６、または１×１０７細胞／ｍＬ以上の生存可能な細胞密度に達する能力を有するもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記安定な細胞集団が、
１×１０６、２×１０６、５×１０６、または１×１０７細胞／ｍＬ以上の生存可能な細胞濃度に到達する能力があるもの。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
安定な細胞株を生成する方法であって、この方法が：
細胞を、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；
細胞を、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体と接触させることであって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体は安定的にこの細胞のゲノムに統合されており；および
この細胞を安定な細胞集団を生成するために継代培養すること。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体および実施形態Ｙの任意の１つのポリヌクレオチド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、細胞をペイロードに接触させることを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、この細胞のゲノムに前記ペイロード構成体が安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が別々に定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つのポリヌクレオチド構成体、および前記ペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、この細胞を複数のペイロード構成体に接触させることを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記複数のペイロード構成体が、この細胞のゲノムに安定的に統合されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および複数の前記ペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および前記複数のペイロードド構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および前記複数のペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および前記複数のペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および前記複数のペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および前記複数のペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、実施形態１～１１２の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、実施形態２１６～２７１の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、実施形態１１９～２０９の任意の１つの複数のポリヌクレオチド構成体、および前記複数のペイロード構成体が別々に安定的にこの細胞のゲノムに統合されているもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロードの配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロードの配列の発現が、構成的プロモーターにより駆動されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記構成的プロモーターおよび前記ペイロードの配列がＩＴＲ配列の側面にあるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ペイロードの配列が、遺伝子をコーディングするポリヌクレオチド配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記遺伝子が、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記遺伝子が、治療的ポリペプチドまたは導入遺伝子をコードするもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、ペイロードの配列が、治療的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記治療的ポリヌクレオチドが、ｔＲＮＡサプレッサーまたはガイドＲＮＡであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記ガイドＲＮＡが、タンパク質に結合する能力のある、ポリリボヌクレオチドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記タンパク質がヌクレアーゼであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記タンパク質が、Ｃａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの細胞であって、前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つ方法であって、前記継代培養が、選択圧を含む細胞培地中であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記継代培養が、少なくとも２つの選択圧を含む細胞培地中であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記選択圧が抗生物質であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記抗生物質がブラストサイジンまたはピューロマイシンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記継代培養が、少なくとも２つの抗生物質を含む細胞培地中であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記選択圧が栄養素の欠損であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記栄養素の欠損が、ヒポキサンチンの欠損およびチミジンの欠損であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記安定な細胞株が、１×１０６、２×１０６、５×１０６、または１×１０７細胞／ｍＬ以上の生存可能な細胞密度に達する能力を有するもの。

先行する実施形態の任意の１つの細胞、実施形態の任意の１つの細胞集団、または実施形態の任意の１つの安定な細胞株を誘導する方法であって、この方法が、第一の引き金を引く薬剤を、前記細胞、前記細胞集団または前記安定な細胞株に投与し、それにより前記細胞、前記細胞集団または前記安定な細胞株中で、Ｒｅｐポリペプチド、Ｃａｐポリペプチド、および１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質の発現を誘導するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第一の引き金を引く薬剤が、活性化因子またはリプレッサーに結合するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、誘導可能なプロモーターの活性化が誘導されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記活性化された誘導可能なプロモーターがリコンビナーゼを転写するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第一の引き金を引く薬剤が、テトラサイクリン、またはクミン酸塩であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記テトラサイクリンがドキシサイクリンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株を第二の引き金を引く薬剤とともに培養することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、エストロゲン受容体リガンドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤がタモキシフェンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤がリコンビナーゼに結合するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤がリコンビナーゼを誘導して、前記細胞、細胞集団の細胞、または安定な細胞株の細胞の核に転座させる。
ｒＡＡＶウイルス粒子を産生する方法であって、この方法が以下のものを含むもの：
第一の引き金を引く薬剤を、前記細胞、前記細胞集団または安定な細胞株に投与すること、
第二の引き金を引く薬剤を、前記細胞、前記細胞集団または安定な細胞株に投与すること、
それにより、ｒＡＡＶウイルス粒子を前記細胞、前記細胞集団または前記安定な細胞株中で産生すること。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第一の引き金を引く薬剤が、活性化因子またはリプレッサーに結合するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、誘導可能なプロモーターの活性化が誘導されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記活性化された誘導可能なプロモーターがリコンビナーゼを転写するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第一の引き金を引く薬剤が、テトラサイクリン、またはクミン酸塩であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記テトラサイクリンがドキシサイクリンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記細胞、前記細胞の集団、または前記安定な細胞株を第二の引き金を引く薬剤とともに培養することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、エストロゲン受容体リガンドであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）であるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤がタモキシフェンであるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤がリコンビナーゼに結合するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記第二の引き金を引く薬剤がリコンビナーゼを誘導して、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞の核に転座させるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、いくつかの実施形態では、前記リコンビナーゼが、リコンビナーゼ部位を切断するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記少なくとも１つのアドレノウイルスヘルパータンパク質、前記Ｒｅｐポリペプチド、およびＣａｐポリペプチドが発現されるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記ＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドが、ｒＡＡＶウイルス粒子中で組み立てられるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子がペイロードの配列をカプシドで被覆するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞が、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前に、細胞毒性レベルのＲｅｐポリペプチドを発現しないもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞が、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前に、細胞毒性レベルのＣａｐポリペプチドを発現しないもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞が、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前に、細胞毒性レベルのＲｅｐポリペプチドを発現しないもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記細胞、前記細胞集団の細胞、または前記安定な細胞株の細胞中のＲｅｐポリペプチドの平均濃度が、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の前の量よりも少ないもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記ＲｅｐポリペプチドおよびＣａｐポリペプチドの発現が、前記第一の引き金を引く薬剤および前記第二の引き金を引く薬剤の両方の投与の後に、構成的になるもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、方法の少なくとも一部分をバイオリアクター中で遂行することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記バイオリアクターが、２０Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、または５００Ｌ以上のもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、ｒＡＡＶウイルス粒子を複数のバッチ中で産生することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、第一のバッチおよび第二のバッチの間のカプシド被覆率中の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、第一のバッチおよび第二のバッチの間のウイルスゲノムの濃度の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含む。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、第一のバッチおよび第二のバッチの間のベクターゲノムの濃度の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％未満の差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含む。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、第一のバッチおよび第二のバッチの間の感染性の差が、２０％、１５％、１０％、５％、３％、２％、または１％を越えない差を有するｒＡＡＶウイルス粒子の産生を更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）に従って前記方法を遂行することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、ＧＭＰ施設で前記方法を遂行することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、この細胞を培養培地中で培養し、およびこの培養培地から前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子の一部を収集することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記方法が、この培養培地から収集された前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子の少なくともいくらかを、精製されたｒＡＡＶ集団を得るために、精製することを更に含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記精製することが、クロマトグラフィー的な精製を含むもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記クロマトグラフィー的な精製が、陽性に荷電したアニオン交換樹脂を用いること、陰性に荷電したアニオン交換樹脂を用いること、カチオン交換クロマトグラフィーを用いること、親和性クロマトグラフィーを用いること、サイズ排除クロマトグラフィーを用いること、またはそれらの組み合わせを含む。
先行する実施形態の任意の１つの方法であって、前記クロマトグラフィー的な精製が、カラムクロマトグラフィー的な分画化を用いることを含むもの。
病的状態または疾患を治療する方法であって、前記方法が、先行する実施形態の任意の１つの治療的に有効な量の薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含むもの。
実施形態７１６の方法であって、前記疾患が単一遺伝子の疾患であるもの。
実施形態７１６～７１７の方法であって、前記治療が、少なくとも１つの望まれない副作用をもたらし、この望まれない副作用は、期待される用量から、５０％、４０％、３０％、３０％、１５％、１０％、５％、または２％以上逸脱する１日用量の投与により、相対的に軽減されるもの。
実施形態７１６～７１９の方法であって、前記投与が注射によるもの。
実施形態７１９の方法であって、前記注射が点滴であるもの。
実施形態７１６～７２０の方法であって、前記１日用量が患者に一度投与されるもの。
実施形態７１６～７２０の方法であって、前記１日用量が患者に２回以上投与されるもの。
実施形態７１６～７２２の方法であって、前記治療が、少なくとも１つの望まれない副作用をもたらし、この望まれない副作用は、三重トランスフェクション法から産生された複数のｒＡＡＶに比較して軽減されるもの。
実施形態７１６～７２３の方法であって、前記患者の血液血清中のｒＡＡＶウイルス粒子中和抗体の濃度が、一過性三重トランスフェクションにより調製された同じｒＡＡＶウイルス粒子を投与した後の、前記患者の血液血清中のｒＡＡＶウイルス粒子中和抗体の濃度に比較して軽減されるもの。
実施形態７２４の方法であって、前記ｒＡＡＶウイルス粒子中和抗体の濃度が、ＥＬＩＳＡ検定により測定されるもの。
あらかじめ決定された数のウイルスゲノム（ＶＧ）を有するｒＡＡＶウイルス粒子の用量を被験者に投与する方法であって、有害作用の数または強度を、一過性三重トランスフェクション法から調製された、同じｒＡＡＶ ＶＧ用量の投与に比較して軽減し、この方法が以下のものを含むもの：
先行する実施形態の任意の１つの細胞、先行する実施形態の任意の１つの細胞集団、または先行する実施形態の任意の１つの安定な細胞株中で産生されたｒＡＡＶの用量を投与すること。
実施形態７２６の方法であって、前記有害作用が：肝臓機能不全、肝臓の炎症、消化器の感染、嘔吐、微生物感染、敗血症、トロポニンレベルの増大、赤血球細胞数の減少、血小板数の減少、補体免疫システム応答の活性化、急性腎障害、心肺機能不全、および死亡より成る群から選ばれるもの。
実施形態７２６～７２７の方法であって、前記有害作用が、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、インターロイキン１β（ＩＬ－１β）、およびインターロイキン６（ＩＬ－６）の１つの以上の血清濃度の増加であるもの。
病態または疾患を治療する方法であって、この方法が、先行する実施形態の任意の１つの、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムを有する薬学的組成物の第一の治療的に有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含み、および先行する実施形態の任意の１つの、あらかじめ決定された数のウイルスゲノムを有する薬学的組成物の第二の治療的に有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含むもの。
実施形態７２９の方法であって、第一の治療的に有効な量および第二の治療的に有効な量が、１％、５％、１０％、または１５％未満で変動するもの。
先行する実施形態の任意の１つの方法により作成されるｒＡＡＶウイルス粒子。
先行する実施形態の任意の１つの方法により作成される複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物。
先行する実施形態の任意の１つの方法により作成されるｒＡＡＶウイルス粒子。
先行する実施形態の任意の１つの方法により作成される複数のｒＡＡＶウイルス粒子を含む組成物。
以下のものは、本発明を遂行するための具体的な実施形態の例である。これらの実施例は、説明の目的のためのみに提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定することを意図しない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関する正確性を確実にする努力がなされているが、いくつかの実験的誤差または偏差は、もちろん許容される。
本発明の実践は、他に示されない限り、当該技術分野の技能の内にある、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技法および薬理学の従来の方法を援用する。そのような技法は、文献中で完全に説明されている。
実施例１－３つの安定的に統合されたプラスミドを有する哺乳類細胞株
ペイロードをカプシドで被覆しているｒＡＡＶの誘導可能な発現の能力を有する安定な哺乳類細胞株が、３つの核酸構成体を、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂを発現する細胞株の核ゲノムに統合して構成される（図１、５Ｂ、および６）。図６に記載されるように、この細胞株はＤＨＦＲヌルか、ＨＥＫ２９３細胞株である。全ての３つの構成体を成功裡に統合した細胞が選択され、ヒポキサンチンおよびチミジンを欠いた培地中で、ブラストサイジンの存在下に成長させることで維持される。構成体２からの同時のＣｒｅ発現の抑止を伴う、構成体１の成功裡の統合は、引き金を引く前のＥＧＦＰからの蛍光発光から確定される。
実施例２－Ｒｅｐ／Ｃａｐタンパク質のＣｒｅ誘導可能な発現
図３Ａの図示されるように、構成体１の性能を試験するために実験が行われた。この構成体は、Ｃｒｅ媒介組み換えが第二のスペーサーセグメントを削除するようにデザインされている（図３Ｂ）。第二のスペーサーセグメントの削除は、（ｉ）ＥＧＦＰの発現を停止し（図７Ａ～７Ｂ）、（ｉｉ）内在性Ｐ５およびＰ１９プロモーターからのＲｅｐ転写産物の産生をもたらし、（ｉｉｉ）Ｃａｐ転写産物の内在性Ｐ４０プロモーターからの産生を促進する。Ｃａｐ遺伝子がＲｅｐ遺伝子の下流でクローン化され、内在性Ｐ４０プロモーターに操作可能にリンクされる。従って、Ｒｅｐタンパク質の発現が、Ｃａｐタンパク質の発現を促進する。
ＨＥＫ２９３細胞が２４ウエルのプレートに播種された。プレートは室温で３０分間遠心分離され、続いて３７℃で３０分間インキュベートされた。培地が成長培地に置換され、および細胞がＡＡＶ２陽性コントロールプラスミド（ＡＡＶ２）またはＡＡＶ２構成体１プラスミド（ＡＡＶ ＣＯＤＥ）のいずれかに、ＴｒａｎｓＩＴ ２９３試薬を用いてトランスフェクトされた。模擬のサンプルはトランスフェクトされなかった。ウエルに様々な容量のＣｒｅグラシクルが加えられた。図７Ａに画像化されているウエルにはＣｒｅグラシクルは加えられなかった。Ｃｒｅグラシクルなし、５μＬのＣｒｅグラシクル、または１０μＬのＣｒｅグラシクルが、示されているように図７Ｂに画像化されているウエルに加えられた。細胞はトランスフェクションの２４時間後に画像化され、次いでタンパク質解析のために収穫された。
この結果が図７Ａ～７Ｂに示されており、これらは光学顕微鏡および蛍光顕微鏡の画像である。光学顕微鏡の画像は一番左の列に示されている。緑色蛍光顕微鏡の画像は、真ん中の列に示されている。赤色蛍光顕微鏡の画像は、一番右の列に示されている。
図７Ａに示されるように、Ｃｒｅの添加なしで、構成体１にトランスフェクトされた細胞は、Ｒｅｐ－ＥＧＦＰ融合転写産物の発現、イントロンのスプライシング、および翻訳により、非常に強いＥＧＦＰ蛍光を示す（図３Ａを参照）。図７Ｂは、Ｃｒｅの送達による減少したＧＦＰ蛍光を示す。細胞中への送達を追跡するために、Ｃｒｅは、Ｃｒｅタンパク質および赤色蛍光マーカータンパク質が充填されたゲシクルにより送達される。Ｃｒｅの送達は、ＥＧＦＰカセットの構成体１からの除去を伴い組み換えに影響する。
図８Ａは、削除可能なスペーサーセグメントのＣｒｅ媒介削除が、引き金を引いた後のプラスミド構成体１からのＲｅｐタンパク質の産生を誘導することを図示するウエスタンブロットを示す。加えて、ウサギβグロブリンイントロンの存在は、Ｒｅｐタンパク質発現の量を妨げない。図８Ｂは、ＧＦＰの発現、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体を含む細胞の生存能力および密度のグラフであり、およびＲｅｐ産生および総タンパク質産生を図示したブロットを示す。
実施例３－構成体１の例示的配列および構築（Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体）
ＡＴＣＣからＡＡＶ２ゲノム（ｐＡＶ２）をエンコードするプラスミドが、ＡＡＶ２ ゲノムマイナス前記ＩＴＲの増幅に用いられた。この増幅された構成体は、ｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ Ｔｏｐｏベクター中にクローン化され、構成体１のバックボーンを形成した。前記構成体１に介入するスペーサーおよびＲｅｐ／Ｃａｐコーディング配列は、ｇｂｌｏｃｋｓから組み立てられ、およびヌクレオチドの位置１０２２に挿入された（ＷＴ ＡＡＶ２への参照とともに）。このクローニング位置は、Ｐ１９プロモーターから下流であり、既知のｃｉｓ規制要素からは離れている。前記第二の削除可能なスペーサー要素中のＥＧＦＰカセットは、Ｐ５およびＰ１９転写物の両方により産生されたタンパク質を有するフレーム中にある。引き金を引く前の構成体１の詳細は、図３Ａに配列番号：６に提供される例示的配列とともに示されており、付随する特徴の説明が下に示される。
実施例４－抗ウイルス応答の修飾または阻害
ＡＡＶウイルス粒子の形成に必要なウイルスタンパク質は、宿主細胞の機構により阻害される。本明細書で記載される安定な細胞株中のＡＡＶウイルス粒子の力価を最大化するための、これらの宿主細胞機構の阻害は、限定はされないが：開始細胞株（Ｐ０）中のＰＫＲのノックアウト（ＰＫＲ ＫＯ）（ウイルスタンパク質の阻害に責任のある経路）、開始細胞株（Ｐ０）中への変異Ｅ１Ｆ２αの導入（前記ＰＫＲ経路）、および／またはＶＡ ＲＮＡ（ＰＫＲの阻害剤）の操作または調節を含む。そのようなものとして、３つの戦略の開発：ＶＡ ＲＮＡの操作、ＰＫＲ ＫＯ、およびＥ１Ｆ２α変異が、本明細書に記載されるＡＡＶ産生システムにおいて、任意の組み合わせでの使用のために開発されつつある。これらの全ての３つの戦略が、任意の結合によりなされ得る。
Ａ．最適の発現のためのＶＡ ＲＮＡの修飾
ＶＡ ＲＮＡ発現は４つの方法で分析されている：
１．ＶＡ ＲＮＡの構成的発現（従来のアプローチ）は、コントロールとして利用され、ＶＡ ＲＮＡプロモーターまたは配列は無操作。
２．誘導可能なＶＡ ＲＮＡ
ＶＡ ＲＮＡは、天然では内部構成的プロモーター（Ａ ＢｏｘおよびＢ Ｂｏｘ）を有する；図９Ｂの上右手の構成体マップを参照のこと）。誘導可能なＶＡ ＲＮＡ構成体を生成する実験のためには、内部プロモーターの活性を停止するために変異が第一に内部プロモーターに導入される。
図２Ｃおよび図１８～２０に示されるように、誘導可能なＵ６プロモーターシステムがＶＡ ＲＮＡの発現を駆動するために用いられる。この戦略の利点は、ＶＡ ＲＮＡの構成的な発現に伴ういくらかの細胞毒性があり得るために、その中に最適化された量のＶＡ ＲＮＡが産生細胞システム中にある、誘導可能なＶＡ ＲＮＡシステムを用いるときに、より良い細胞の生存能力およびより高いＡＡＶの力価が期待されることである。
３．ＶＡ ＲＮＡなし＋補償／アナログウイルスタンパク質
ＶＡ ＲＮＡがシステムから完全に除去される、第三のオプションが開発されつつあり、およびアナログが補償できるか、および／またはＶＡ ＲＮＡが産生システム中にある場合に比較して、最終的なＡＡＶ力価を改善できるかを決定するために、別のウイルスタンパク質（例えば、ＨＳＶからのＩＣ３４．５；ＶＡ ＲＮＡのアナログ）がＶＡ ＲＮＡ機能（ＰＫＲの阻害剤）を置換できるか試験されている。
４．ＶＡ ＲＮＡなし
ウイルスタンパク質合成が影響を受けず、およびＶＡ ＲＮＡが完全に除外され、ＶＡ ＲＮＡが産生細胞システムから除去された場合に、ヘルパー構成体中のＡＡＶ力価には真の打撃がないというシナリオ。これは、ＡＡＶ産生のために最適化するように遺伝子的に操作された細胞株（例えば、前記ＬＶ ｍａｘ細胞）の中でのみ、実現可能であろう図１３を参照。
以下の実験は、三重トランスフェクションを通じて実施された。この三重トランスフェクション実験からの結果は、応用され、最適化され、および安定な細胞株の文脈で試験されることが期待される（例えば、本明細書に記載される構成体）。
Ｂ：ＶＡ ＲＮＡを補償するための代替的なウイルスタンパク質
ＡＡＶ力価が改善される可能性があるかを見るために、ＶＡ ＲＮＡが別のウイルスタンパク質（感染された細胞タンパク質３４．５（ＩＣＰ３４．５））で置換された。図１０Ａに示されるように、３つのグループが試験された：
・ｐＨｅｌｐｅｒ（ヘルパープラスミドに変化がなく、およびＶＡ ＲＮＡが存在する）
これはＶＡ ＲＮＡの陽性のコントロールであり、およびこれらの実験には、以下のプラスミドによる、三重トランスフェクションが遂行された：ＳＴＸ２９５とともに、ｐＨｅｌｐｅｒベクター（構成体３であって、その中のペイロードがＡＡＶ２ ＩＴＲの側面にある蛍光マーカーであるもの）、およびｐＲＣ２（これはＲｅｐ／Ｃａｐ構成体、ＡＡＶ２からのＲｅｐ／ＩＴＲおよびＡＡＶ２Ｃａｐである）。
・ＳＴＸＣ０００２（ＶＡ ＲＮＡが削除されている）
これは、これらの実験のためのＶＡ ＲＮＡの陰性のコントロールであり、以下のプラスミドによる、三重トランスフェクションが遂行された：ＳＴＸ２９５とともに、ＳＴＸＣ０００２ヘルパーベクター（構成体３であって、その中のペイロードがＡＡＶ２ ＩＴＲの側面にある蛍光マーカーであるもの）、およびｐＲＣ２（これはＲｅｐ／Ｃａｐ構成体、ＡＡＶ２からのＲｅｐ／ＩＴＲおよびＡＡＶ２ Ｃａｐである）。
・ＳＴＸＣ００１６（ＶＡ ＲＮＡが削除され、およびＩＣ３４．５が添加されている）
これは実験グループであり、以下のプラスミドによる三重トランスフェクションが遂行された：ＳＴＸＣ００１６ヘルパーベクター（ＶＡ ＲＮＡが削除され、およびＩＣ３４．５が、００１６プラスミドにエンコードされたものとして添加されている）、ＳＴＸ２９５（構成体３であって、その中のペイロードがＡＡＶ２ ＩＴＲの側面にある蛍光マーカーであるもの）、およびｐＲＣ２（これはＲｅｐ／Ｃａｐ構成体、ＡＡＶ２からのＡＡＶ２からのＲｅｐ／ＩＴＲおよびＡＡＶ２からのＣａｐである）。
結果：ＶＡ ＲＮＡを補償するための代替的なウイルスタンパク質
図１０Ｂは、三重トランスフェクションからの相対的ＡＡＶ力価であり、３つのグループのそれぞれが、図１０Ａ ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、およびＬＶ ｍａｘ細胞からのものである。ＡＡＶ力価は、ｑＰＣＲにより決定された。ＡＡＶ力価は、ＳＴＸＣ０００２（ＶＡ ＲＮＡが削除されている）による三重トランスフェクション後に、相対的に無効にされていた。２９３Ｔ細胞では、ＡＡＶ力価は、ＳＴＸＣ００１６（ＶＡ ＲＮＡが削除され、ＩＣ３４．５が添加されている）による三重トランスフェクション後に回復された。ＬＶ ｍａｘ細胞では、ＡＡＶ力価は、ＳＴＸＣ０００２（ＶＡ ＲＮＡが削除されている）およびＳＴＸＣ００１６（ＶＡ ＲＮＡが削除され、ＩＣ３４．５が添加されている）の間で同様であった。（図１０Ｂ）。野生型のＶＡ ＲＮＡに対する結果は、ｐＨｅｌｐｅｒ構成体から示されており、これは陽性コントロールとして作用する。
Ｃ．修飾されたか、誘導可能なＶＡ ＲＮＡ構成体
修飾されたＶＡ ＲＮＡ構成体を試験するために、ＶＡ－ＲＮＡ中の内部プロモーターに、前記Ａ Ｂｏｘおよび前記Ｂ Ｂｏｘへの削除または変異を含む、削除または変異が行われた。図１１Ａは、試験されたそれぞれのプラスミドおよびＶＡ－ＲＮＡにおける対応する削除または変異の説明である。Ｇ１６Ａは、Ａ Ｂｏｘ内の変異であり、およびＧ６０Ａは、Ｂ Ｂｏｘプロモーター領域内の変異である。図１１Ｂは、陽性コントロール（ＳＴＸＣ００３２；ＷＴ ＶＡが添加されたＳＴＸＣ０００２である）に比較したＶＡ ＲＮＡの発現を示す。
誘導可能なＶＡ ＲＮＡシステムを試験するために、Ｃｒｅ－誘導可能なＵ６プロモーターを含む構成体が、図１１Ａに示された変異ＶＡ－ＲＮＡ構成体のそれぞれに対するＶＡ－ＲＮＡの発現を駆動するために作成された。図１２Ａは、前記誘導可能なＵ６プロモーターの模式図である。（同様の模式図が図２Ｃに示されている）。この例では、前記Ｕ６プロモーターは、Ｌｏｘ部位の側面にあるスタッファー配列（ＰＧＫ－ｎｅｏ）により分離されている。存在する場合には、Ｃｒｅはスタッファー配列を削除し、それにより組み換えを媒介し、および誘導可能なＵ６プロモーターをもたらす。図１１ＡからのＳＴＸＣ００３３、ＳＴＸＣ００３５、およびＳＴＸＣ００３７構成体は、Ｃｒｅ誘導可能なＵ６プロモーターをを含むように修飾され、それぞれＳＴＸＣ００４１、ＳＴＸＣ００４２、およびＳＴＸＣ００４３を産生する（図１２Ｂ）。
結果：誘導可能なＶＡ ＲＮＡ構成体
ＳＴＸＣ００４１およびＳＴＸＣ００４３が、相対的なＶＡ ＲＮＡ発現と同様のレベルを示した一方で、ＳＴＸＣ００４３は、ＶＡ ＲＮＡ発現のこれらのレベルを、ＳＴＸＣ００４１プラスミド（Ｂ Ｂｏｘプロモーター領域に６ヌクレオチドの削除を有する）に比較し、より少ないＶＡ ＲＮＡの妨害を伴って達成した（ただ２つの変異、Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａを伴い）（図１２Ｃ～１２Ｄ）。
図１３Ａ～１３Ｂは、図１２Ｂからのプラスミド構成体のサブセットに対して遂行された三重トランスフェクション実験の結果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＡＡＶ９を使用（図１３Ａ）およびＬＶ Ｍａｘ細胞中のＡＡＶ２を使用（図１３Ｂ）。ＳＴＸＣ００４１およびＳＴＸＣ００４３構成体を利用した三重トランスフェクションは、最高のレベルの力価を示した。
以下の表は上記の構成体の様々な要素の配列をしめす。
実施例５－安定な細胞株へのＲｅｐ／Ｃａｐ構成体の統合
この実施例は、ＲｅｐおよびＣａｐポリペプチド（配列番号：７）をエンコードする構成体１の安定な細胞株への統合を説明し、および前記安定な細胞株中でのＲｅｐおよびＣａｐポリペプチドの誘導可能な発現を説明する。図８Ｂの上右側に示される、ＩＴＲなしで、前記ポリヌクレオチド構成体を伴うＡＡＶ２ゲノムが、ｐｉｇｇｙｂａｃベクター中にブラストサイジン抵抗性遺伝子（配列番号：８）と共にクローン化された。図８Ｂに示されるように、Ｒｅｐを妨害する削除可能な要素が、Ｐ１９プロモーターの下流に挿入された。
懸濁ＨＥＫ２９３細胞（ウイルス産生細胞、ＶＰＣ：親細胞、または親ＶＰＣプールとも称される）が、ＰＥＩ ｐｒｏトランスフェクション試薬を用いて、トランスフェクトされた。使用されたトランスポゾン対トランスポーゼースの比は２：１であった。細胞は、非選択的な培地中で７２時間回復することを許容され、および選択的培地中で継代培養された（１０μｇ／ｍＬブラストサイジン）。Ｖｉｃｅｌｌ細胞カウンターを用いて、３～４日ごとに細胞の成長と生存能力をモニターした。完全な回復後に、細胞プールの倍増期間は約２５時間であり、前記親ＶＰＣプールに匹敵し、統合されたＡＡＶ配列が、ネガティブな効果を持たないことを示した（図８Ｂ一番上のグラフ）。
ＧＦＰ発現細胞を定量するために、細胞をフローサイトメトリーで解析した。図８Ｂ（左側、および底部のＦＡＣＳプロット）に示されるように、殆どすべての細胞がＧＦＰ陽性であり、従って、図８Ｂに示されるｒｅｐ／ｃａｐポリヌクレオチド構成体の細胞への成功した統合を確定した。
実施例６－Ｒｅｐタンパク質のＣｒｅ媒介誘導
この実施例は、図８Ｂおよび実施例５に説明されるＲｅｐ／Ｃａｐ構成体が統合した安定細胞株中へのＲｅｐタンパク質のＣｒｅ媒介誘導を説明している。図８ＢのＡＡＶ２ Ｒｅｐ構成体が統合したＶＰＣは、Ｃｒｅゲシクルにより処理された。簡潔に２００，０００の細胞が、１０μｇ／ｍＬのポリブレン培地中の５μＬのＣｒｅゲシクルにより処理された。細胞は、２５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離され、３７℃で２時間インキュベートされた。親細胞はコントロールとして用いられた。インキュベーション後に、細胞は新鮮な培地中に再懸濁され、追加の２４時間インキュベートされた。Ｒｅｐ発現は、抗Ｒｅｐ抗体を用いるウエスタンブロットにより解析された。図８Ｂに示された結果は、Ｃｒｅ処理により、様々なＲｅｐアイソフォームの誘導可能な発現を実証した。
実施例７－誘導可能なヘルパー構成体
この実施例は、本開示の誘導可能なヘルパー構成体を説明する。本明細書で開示される、２つのバージョンの誘導可能なヘルパー構成体が、図２４に示される。テトラサイクリン／ドキシサイクリン（“Ｄｏｘ”）誘導可能なプロモーター（ＴＲＥ３Ｇ）が、エストロゲン誘導可能なＣｒｅ（ＥＲ２ Ｃｒｅ）の発現を駆動する。このエストロゲン誘導可能なＣｒｅは、強いポリアデニル化シグナル（停止シグナル）を、その３’末端に有する。このＣｒｅ遺伝子およびポリアデニル化シグナはｌｏｘ部位の側面にある。これに続くものは、２シストロン性のＥ２Ａ Ｅ４、ｏｒｆ６カセットである。このプラスミドも構成的プロモーター（変異ＥＦ１ａ）を有し、これがＴｅｔ－ｏｎ ３Ｇ（Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質）の発現を駆動する。
作用の機構：オフの状態（Ｄｏｘの不在下）で、Ｔｅｔ－ｏｎ ３Ｇは、ＴＲＥ３Ｇ中のＴｅｔオペレーター要素に結合することは不可能であり、従ってこのＴＲＥ３Ｇは活性ではない。このシステムの実施形態では、エストロゲン応答性Ｃｒｅが、単純なＣｒｅの代わりに、ＴＲＥ３Ｇプロモーターの何らかの基礎の（またはリーキーな（ｌｅａｋｙ））発現に対抗するために用いられた。従って、もしこのシステムがＣｒｅ遺伝子のリーキーな発現を生み出しても、この発現されたＣｒｅタンパク質は、細胞質中で不活性に保持される。Ｃｒｅ遺伝子の３’に位置する強いポリアデニル化停止シグナルは、アデノウイルス・ヘルパー遺伝子（Ｅ２ＡおよびＥ４）の基礎発現を防止する。
発現を誘導するために、Ｄｏｘおよびタモキシフェンが細胞培養に加えられる。ＤｏｘはＴｅｔ－ｏｎ ３Ｇタンパク質に結合して、Ｔｅｔ－ｏｎ ３ＧのＴＲＥ３Ｇプロモーター中のＴｅｔオペレーター要素への結合を促進する。これがプロモーターの活性化の引き金を引く。ＥＲ２ Ｃｒｅが高いレベルで発現され、タモキシフェンがＣｒｅを核にもたらす。Ｃｒｅがｌｏｘ部位に再結合し、Ｃｒｅ－ポリアデニル化カセットの削除を引き起こす。これが、２シストロン性のＥ２ＡおよびＥ４カセットを、それらの発現の引き金を引くＴｅｔ誘導可能なプロモーターの隣にもたらす。Ｃｒｅの自己削除は、この細胞中でのＣｒｅ発現の持続時間を制限し、従って、Ｃｒｅ関連毒性およびでたらめな組み換えイベントを制限する。
第一のバージョンの誘導可能なヘルパー構成体が、図２４の左に示されている。図２４（左に）示されている、この構成体も、Ｕ６プロモーターにより駆動されるＶＡ ＲＮＡの変異体（Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａ、これらは内在的ＰｏｌＩＩＩプロモーターを無効にする）を有する。Ｕ６プロモーターの近位配列要素（ＰＳＥ）および遠位配列要素（ＤＳＥ）が、Ｌｏｘ配列の側面にあるスタッファー配列（ＰＧＫにより駆動される融合Ｒｅｄ－ＰｕｒｏＲ）により分離され、従ってこのプロモーターを無効化する。このプロモーターは、前記スタッファー配列のＣｒｅ媒介削除により再構成され、Ｃｒｅの発現により条件付きになるＶＡ ＲＮＡの発現をもたらす。
第二のバージョンの誘導可能なヘルパー構成体が、図２４の右に示されている。図２４（右に）示されている、この構成体は、その内部野生型プロモーターにより駆動される構成的に発現されるＶＡ ＲＮＡ要素を有する。
図２５は、図２４（左側）に示されている誘導可能なヘルパー構成体の複数のバリエイションを示す。融合Ｒｅｄ－ＰｕｒｏＲは、ＰｕｒｏｍｙｃｉｎＲにより置換され、およびＰＧＫプロモーターは、２つの異なる配向にあるＣＭＶプロモーターにより置換される。懸濁ＨＥＫ２９３細胞（ウイルス産生細胞、ＶＰＣ）が、プラスミド中にエンコードされた誘導可能なヘルパー構成体の異なるバリエーション（図２５に示される）により、ＰＥＩ ｐｒｏトランスフェクション試薬を用いて、トランスフェクトされた。使用されたトランスポゾン対トランスポーゼースの比は２：１であった。細胞は、非選択的な培地中で７２時間回復することを許容され、および選択的培地中で継代培養された（１．５μｇ／ｍＬピューロマイシン）。Ｖｉｃｅｌｌ細胞カウンターを用いて、３～４日ごとに細胞の成長と生存能力をモニターした。結果は図２７の一番上のグラフに示されている。完全な回復後に、細胞プールの倍増期間は約２３時間であり、前記親ＶＰＣプールに匹敵し、統合されたＡＡＶ配列が、ネガティブな効果を持たないことを示した。
実施例８－細胞株に安定的に統合されたヘルパー構成体
この実施例は、本開示の誘導可能なヘルパー構成体の、細胞株への安定的な統合を説明する。プールは、２０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンおよび２μＭのタモキシフェンで誘導され、誘導後４８時間に解析された。プールは基礎発現を示さず、誘導後のＥ２Ａの強固な発現をウエスタンブロット（図２７）および抗ＦＬＡＧ抗体により検出される細胞内染色の両方により示した。ＲＮＡサンプルは、ＶＡ ＲＮＡ特異的プライマーおよび誘導後のＶＡ ＲＮＡ発現の上方制御を示すプローブを用いた、ＲＴ ＱＰＣＲにより解析された（図２７）。図２７は、安定に統合された細胞毒性効果を示さないヘルパープラスミドを有するＨＥＫ２９３細胞、およびＣｒｅの誘導、ＶＡ ＲＮＡの産生およびＥ２Ａ発現の良好な分配の概観を示す。
実施例９－誘導可能な安定細胞株
この実施例は、誘導可能な安定細胞株の本開示の構成体を用いる産生について説明する。本明細書で開示される誘導可能なヘルパー構成体の２つのバージョン（バージョン１：ＳＴＸＣ０１２３およびバージョン２：ＳＴＸＣ０１３３）が、図２８に示される。この両方の誘導可能なヘルパー構成体において、テトラサイクリン／ドキシサイクリン（“Ｄｏｘ”）により誘導可能なプロモーター（ＴＲＥ３Ｇ）が、エストロゲン誘導可能なＣｒｅ（ＥＲ２ Ｃｒｅ）の発現を駆動する。このエストロゲン誘導可能なＣｒｅは、強いポリアデニル化シグナル（停止シグナル）を、その３’末端に有する。このＣｒｅ遺伝子およびポリアデニル化シグナはｌｏｘ部位の側面にある。これに続くものは、２シストロン性のＥ２Ａ Ｅ４、ｏｒｆ６カセットである。このプラスミドも構成的プロモーター（変異ＥＦ１ａ）を有し、これがＴｅｔ－ｏｎ ３Ｇ（Ｔｅｔ応答性活性化因子タンパク質）の発現を駆動する。
しかしながら、ＳＴＸＣ０１２３はＵ６プロモーターにより駆動されるＶＡ ＲＮＡの変異体を含む（Ｇ１６およびＧ６０Ａであり、これらは内在的ＰｏｌＩＩＩプロモーターを無効化する）。Ｕ６プロモーターの近位配列要素（ＰＳＥ）および遠位配列要素（ＤＳＥ）が、Ｌｏｘ配列の側面にあるスタッファー配列、（ＰＧＫにより駆動される融合Ｒｅｄ－ＰｕｒｏＲ）により分離され、従ってこのプロモーターを無効化する。このプロモーターは、前記スタッファー配列のＣｒｅ媒介削除により再構成され、Ｃｒｅの発現により条件付きになるＶＡ ＲＮＡの発現をもたらす。
対照的に、ＳＴＸＣ０１３３は、ＴｅｔＯｎ－３Ｇピューロマイシン抵抗性遺伝子カセット、および構成的に発現された、内在的な野生型プロモーターにより駆動される、ＶＡ ＲＮＡ要素を含む。
懸濁ＨＥＫ２９３細胞（ウイルス産生細胞、ＶＰＣ：親細胞、または親ＶＰＣプールとも称される）が、トランスフェクション試薬を用いて、プラスミド中にエンコードされた、ＳＴＸＣ０１２３またはＳＴＸＣ０１３３によりトランスフェクトされた。細胞は、非選択的な培地中で回復することを許容され、およびピューロマイシンを含む培地中で継代培養された。両方のバージョンに対して、ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）中への構成体の統合を確実にするために、ピューロマイシン選択が用いられた。ＳＴＸＣ０１２３はＴ３３ （Ｐ１Ｖ１）細胞株を産生し、およびＳＴＣ０１３３はＴ４４（Ｐ１Ｖ２）細胞株を産生した。生存可能な細胞密度は、Ｔ３３およびＴ４４に対して３日ごとにモニターされた。結果は、図２９のグラフに示される。完全な回復後に、細胞プールの倍増期間はＴ３３に対して約２４．６時間であり、Ｔ４４対して約２６．３時間であり、前記親ＶＰＣプールに匹敵し、統合された配列が、ネガティブな効果を持たないことを示した。
Ｔ３３およびＴ４４プールの安定な統合および誘導可能性を確定するために、これらのプールからの細胞は、Ｅ２Ａ発現、ＶＡ ＲＮＡ発現、培養密度、および細胞生存能力について試験された。Ｔ３３プールおよびＴ４４プールからの細胞は、１００万細胞／ｍＬで播種され、１６０ｎｇ／μｌのＤｏｘおよび４μＭのタモキシフェンで誘導され、および誘導後２４時間および４８時間後に解析された。プールは最小限の基礎発現を示し、誘導後のＥ２Ａの強固な発現を誘導後２４時間および４８時間の両方で示した（図３０の一番上のグラフ）。ＲＮＡサンプルは、ＶＡ ＲＮＡ特異的プライマーおよび誘導後のＶＡ ＲＮＡ発現を示すプローブを用いて、誘導されていないＶＰＣと比較して、誘導後２４時間および４８時間に、ＲＴ ＱＰＣＲにより解析された（図３０の一番上から２番目のグラフ）か、誘導後２４時間および４８時間に、誘導されていないＴ３３またはＴ４４細胞に比較したＶＡ ＲＮＡ発現を示すことにより解析された（図３０の一番上から３番目のグラフ）。培養密度（図３０の一番上から４番目のグラフ）および細胞生存能力（図３０の一番下のグラフ）も誘導後２４時間および４８時間に試験された。
次に、Ｒｅｐ／Ｃａｐ構成体（ＳＴＸＣ０１３７）およびペイロード構成体（ＳＴＣ０１３６）が、トランスフェクション試薬を用いて、統合のために前記Ｔ３３（Ｐ１Ｖ１）細胞株および前記Ｔ４４（Ｐ１Ｖ２）細胞株中にトランスフェクトされた。Ｔ３３およびＴ４４の両方に対して、このＲｅｐ／Ｃａｐ構成体は、誘導後に、分割されたブラストサイジン抵抗性遺伝子の半分の構成的発現、およびＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質の、それらの内在性プロモーターからの発現を許容するためにデザインされている。図２８に示されるこの構成体は、誘導前の統合された核酸構成体である。介入するスペーサーはＲｅｐコード配列を遮断する。この介入するスペーサーは、第一のスペーサーセグメント、削除可能である第二のスペーサーセグメント（Ｌｏｘ部位の側面にあるＢＦＰ）および第三のスペーサーセグメントを含む。この転写産物は、’５’および３’スプライス部位の側面にある単一のイントロンを含む。
前記ペイロード構成体（ＳＴＸＣ０１３６）は、ＩＴＲの側面にあるＧＦＰをエンコードする配列（ＳＴＸ６５０（ｓｃＧＦＰ ＡＡＶ））および分割されたブラストサイジン抵抗性遺伝子の他の半分を含み、その両方は構成的プロモーターの制御下にある。
トランスフェクション後に、細胞は非選択的な培地中で回復することを許容され、次いでブラストサイジンを含む培地中で継代培養された。両方のバージョンに対して、ブラストサイジン選択が、両方の構成体が、Ｔ３３安定細胞株およびＴ４４安定細胞株中に統合されたことを確実にするために用いられた。Ｔ３３中への統合は以下の３つの安定細胞株を産生する：Ｔ４０（Ｐ２Ｖ１）、Ｔ４１（Ｐ２Ｖ１）、およびＴ４２（Ｐ２Ｖ１）。Ｔ４４中への統合は以下の３つの安定細胞株を産生する：Ｔ５６（Ｐ２Ｖ２）、Ｔ５７（Ｐ２Ｖ２）、およびＴ５８（Ｐ２Ｖ２）。生存可能な細胞密度および生存能力が、Ｔ４０、Ｔ４１およびＴ４２に対してモニターされ（図３１）、およびＴ５９、Ｔ６０およびＴ６２に対してモニターされた（図３２）。
オフの状態（Ｄｏｘの不在下）で、Ｔｅｔ－ｏｎ ３Ｇは、ＴＲＥ３Ｇ中のＴｅｔオペレーター要素に結合することは不可能であり、従ってこのＴＲＥ３Ｇは活性ではない。図２８の構成体では、ＴＲＥ３Ｇプロモーターの何らかの基礎（またはリーキーな）発現に対抗するために、エストロゲン応答性Ｃｒｅが、単純なＣｒｅの代わりに用いられた従って、もしこのシステムがＣｒｅ遺伝子のリーキーな発現を生み出しても、この発現されたＣｒｅタンパク質は、細胞質中で不活性に保持される。Ｃｒｅ遺伝子の３’に位置する強いポリアデニル化停止シグナルは、アデノウイルス・ヘルパー遺伝子（Ｅ２ＡおよびＥ４）の基礎発現を防止する。
発現を誘導するために、ＤｏｘおよびタモキシフェンがＴ４０、Ｔ４１、Ｔ４２、Ｔ５６、Ｔ５７、およびＴ５８安定細胞株の細胞培養に加えられる。ＤｏｘはＴｅｔ－ｏｎ ３Ｇタンパク質に結合して、Ｔｅｔ－ｏｎ ３ＧのＴＲＥ３Ｇプロモーター中のＴｅｔオペレーター要素への結合を促進した。これがプロモーターの活性化の引き金を引いた。ＥＲ２ Ｃｒｅが高いレベルで発現され、タモキシフェンがＣｒｅを核にもたらした。Ｃｒｅがｌｏｘ部位に再結合し、Ｃｒｅ－ポリアデニル化カセットの削除を引き起こした。これが、２シストロン性のＥ２ＡおよびＥ４カセットを、それらの発現の引き金を引くＴｅｔ誘導可能なプロモーターの隣にもたらす。Ｃｒｅが追加的に、ピューロマイシン抵抗性遺伝子カセットＳＴＸＣ０１２３を削除し、Ｕ６プロモーターを再構成し、次いで、変異体ＶＡ ＲＮＡ１ Ｇ１６ＡおよびＧ６０Ａほ発現を許容した。Ｃｒｅは、ＢＦＰマーカーコーディング配列および３’スプライス部位の上流を含む、ＳＴＸ０１３７の第二のスペーサーセグメントも削除した。再配置されると、このＳＴＸ０１３７構成体は、機能的なＲｅｐおよびＣａｐ転写産物のそれぞれの内在性プロモーターからの発現を許容する、Ｃｒｅの自己削除は、この細胞中でのＣｒｅ発現の持続時間を制限し、従って、Ｃｒｅ関連毒性およびランダムな組み換えイベントを制限する。ヘルパー構成体およびＲｅｐ／Ｃａｐ構成体の導入は、後続してカプシドの産生および産生されたカプシド中へのＳＴＸＣ０１３６のパッケージングを許容する。
実施例１０－誘導可能な安定細胞株の誘導
この実施例は、本開示の誘導可能な安定細胞株の誘導を悦明する。Ｔ４２プール細胞株（Ｔ４２）およびＶＰＣの三重トランスフェクションからの細胞（３ｘＴｆｘｎ）が異なる細胞培地に導入された。総カプシド力価を決定するために、カプシドＥＬＩＳＡが行われた。ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）をカプシド被覆するカプシドの力価を決定するために、ヌクレアーゼ処理およびｑＰＣＲが行われた。図３３は、三重トランスフェクション後の細胞におけるカプシド産生と比較した、誘導後のＴ４２プール安定細胞株からの異なる細胞培地中でのカプシド産生のグラフを示す。それぞれの培地のタイプのための左のバーは、合計カプシドの力価を示し、それぞれの培地のタイプのための右のバーは、ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの力価を示す。ＥＬＩＳＡにより示される総カプシド力価は、三重トランスフェクションにより産生された細胞に比較して、Ｆｕｊｉ７、Ｆｕｊｉ７－２、およびＨＥ３００培地に誘導されたＴ４２細胞で高かった。以下の表１は、総カプシド力価および図３３のウイルスゲノムをカプシド被覆しているカプシドの力価を示す。
表１：異なる細胞培地中での誘導後の、Ｔ４２細胞対３ｘＴｆｘｎ細胞の総カプシド力価、およびウイルスゲノムをカプシド被覆するカプシドの力価。
＊ＢＬＯＱ＝ｂｅｌｏｗ ａｓｓａｙ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（定量のアッセイ限界未満）
前記Ｔ４２安定細胞株プール、前記Ｔ５９安定細胞株プール、前記Ｔ６０安定細胞株プール、または前記Ｔ６１安定細胞株プールは、ＨＥ３００培地中で、誘導されなかった（－）か、または誘導された（＋）かのいずれかであった。ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）をカプシド被覆するカプシドの力価を決定するために、ヌクレアーゼ処理およびｑＰＣＲが行われた（図３４）。
前記Ｔ４２プール安定細胞株の誘導からのカプシドおよび前記Ｔ６１プール安定細胞株の誘導からのカプシドが、細胞の感染および感染性の決定に用いられた。カプシド（ペイロードはＧＦＰ）による細胞の感染後のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージが、図３５に示される。各細胞株のタイプ／培地のための左のバーは、１の希釈因子のためのものであり、各細胞株のタイプ／培地のための右のバーは、４の希釈因子のためのものである。
細胞当たりに産生されたウイルス（力価線産生）も、誘導後の前記Ｔ４２プール安定細胞株と三重にトランスフェクトされた親細胞（ＶＰＣ）の比較において試験された。Ｔ４２プール安定細胞株の培養物は、３×１０６細胞／ｍＬで誘導され、誘導後９６時間で収穫された。親細胞株（ＶＰＣ）の培養物は、３ｘ１０６細胞／ｍＬで三重にトランスフェクトされ、トランスフェクト後９６時間で収穫された。収穫された細胞は、ヌクレアーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）処理を受け、およびウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）をカプシド被覆するカプシドの力価を決定するためにｑＰＣＲが行われた。細胞当たりのベースでの生産性（ｖｇ／細胞）が、総ｑＰＣＲ力価を、収穫時の生存可能な細胞密度により割ることで計算された。図３６は、ウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）を包んでいるカプシドの、誘導後の前記Ｔ４２プール安定細胞株からの細胞１つ当たりの力価のグラフからの細胞１つ当たりのカプシドのタイタ―と比較している。それぞれの培地のタイプについての左のバーは、前記Ｔ４２プール安定細胞株からの細胞１つ当たりのウイルスゲノムを包んでいるカプシドのタイタ―であり、それぞれの培地のタイプについての右のバーは、親細胞株（ＶＰＣ）からの細胞１つ当たりのウイルスゲノムを包んでいるカプシドのタイタ―である。
実施例１１－培地スクリーン
この実施例は、様々な細胞培地中での、本開示の誘導可能な安定細胞株の誘導を説明する。Ｔ４２プール細胞株からの細胞（Ｔ４２）は、１８の異なる細胞培地で試験された。細胞は、５×１０６細胞／ｍＬ、６．５ｘ１０６細胞／ｍＬ、８×１０６細胞／ｍＬ、または９．５×１０６細胞／ｍＬで播種された。次いで、これらの細胞はタモキシフェンおよびＤｏｘで誘導された。細胞は７０％の生存能力で収穫された。収穫された細胞は、ヌクレアーゼ（ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）処理を受け、およびウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）をカプシド被覆するカプシドの力価を決定するためにｑＰＣＲが行われた。誘導後の、各播種密度での各細胞培地におけるウイルスゲノム（例えば、ペイロード構成体）をカプシド被覆するカプシドの力価は、図３７に示される。
実施例１２－誘導可能な安定細胞株の誘導
この実施例は、前記Ｔ４２プール細胞株と比較した、前記Ｔ４２プール細胞株からのミニプールクローンの誘導を説明する。前記Ｔ４２プール細胞株からのミニプールクローンは、最小限の３回の継代培養で継代培養された。それぞれのミニプールクローンは、８つの異なる培地において試験された。前記Ｔ４２プール細胞株からのミニプールクローンは、５×１０６細胞／ｍＬで誘導され、タモキシフェンおよびドキシサイクリンによる誘導後、９６時間で収穫された。総カプシド力価を決定するために、図３８に示される細胞培地のそれぞれに対する誘導後に、前記Ｔ４２プール細胞株に対する各ミニプールクローンに対して、カプシドＥＬＩＳＡが行われた。選択されたミニプールクローンからのカプシドの感染性、および様々な細胞培地中での誘導後の、Ｔ４２安定細胞株の感染性が、次いで試験された。標的細胞（ＣＨＯ Ｐｒｏ－５細胞）をカプシド（ペイロードはＧＦＰ）で感染させた後のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを、感染の多重度（ＭＯＩ；ｖｇ／標的細胞）が図３９および図４０に示される。ＨＥ３００中のミニプールクローン１Ｄ３およびＦｕｊｉ７中の１Ｄ３は、１×１０５未満のＭＯＩにおいて、５０％を越える感染性を示した。
実施例１３－バイオリアクター産生
この実施例は、本開示の安定細胞からの５０Ｌバイオリアクター中でのｒＡＡＶウイルス粒子の産生対一過性にトランスフェクトされた細胞からのものとの比較を説明している。三重に一過性トランスフェクトされた細胞、現在の安定細胞株（例えば、実施例１２のＴ４２安定細胞株のクローンから増殖された安定細胞株）、または新しい安定細胞株が、培養され、５０Ｌバイオリアクター中に誘導された。これらの５０ＬバイオリアクターからのｒＡＡＶウイルス粒子の産生が、表２に示される。現在の安定細胞株または新しい安定細胞株からのものと比較して、三重の一過性トランスフェクトを受けた細胞からは、より低いバイオリアクター力価が産生された。標準的精製プロセスを用い、三重の一過性トランスフェクトを受けた細胞および現在の安定細胞株からは、ｒＡＡＶウイルス粒子に対して４０％の終了時点での収率が産生された。新しい安定細胞株からより高い品質のｒＡＡＶウイルス粒子（例えば、より高い完全なカプシド：空カプシドの比）、および新しい細胞株のために、精製プロセスが改善される時に、６０％への収率の増大が生み出された。従って、ｒＡＡＶウイルス粒子に対する、より高い最終的なプロセス収率が、新しい安定細胞株からの新しいクローン、および三重の一過性トランスフェクトを受けた細胞に比較した現在の安定細胞株からのクローンから生み出される。
表２：ｒＡＡＶウイルス粒子は５０Ｌバイオリアクターから産生される
実施例１４－ｒＡＡＶウイルス粒子の投薬
この実施例は、患者への非静脈内、または静脈内投与によるｒＡＡＶウイルス粒子の投薬を説明する。表３は、患者への非静脈内、または静脈内投与のいずれかでの、感染の多重性（ＭＯＩ）、平均容量、および細胞への三重の一過性トランスフェクション、現在の安定細胞株（例えば、前記Ｔ４２安定細胞株のクローンから増殖された安定な細胞株実施例１２）、または新しい安定細胞株からのｒＡＡＶウイルス粒子の収量／収率を示す。ＭＯＩは、新しい安定細胞株により生産されたｒＡＡＶウイルス粒子では、現在の細胞株、または三重の一過性トランスフェクションを受けた細胞に比較して増加した。従って、新しい安定細胞株により生産されたｒＡＡＶウイルス粒子では、現在の細胞株、または三重の一過性トランスフェクションを受けた細胞に比較して、平均容量が減量される。
表４は、患者への非静脈内、または静脈内投与のいずれかでの、細胞への三重の一過性トランスフェクション、現在の安定細胞株、または、５０Ｌもしくは５００Ｌバイオリアクター中の新しい安定細胞株から産生されたｒＡＡＶウイルス粒子のバッチ当たりの、患者容量の数を示す。収量／収率は、現在の安定細胞株、または新しい安定細胞株により生産されたｒＡＡＶウイルス粒子では、三重の一過性トランスフェクションを受けた細胞に比較して増加した（表３を参照のこと）。従って、新しい安定細胞株、または現在の細胞株により生産されたｒＡＡＶウイルス粒子では、三重の一過性トランスフェクションを受けた細胞に比較して、バッチ当たりの容量の数が増大する。
非公式の配列リスト
第一のスペーサーセグメント- SEQ ID NO:1:
GTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAAC
第二のスペーサーセグメント- SEQ ID NO:2:
ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat
第三のスペーサーセグメント- SEQ ID NO:3:
AATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACACCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTtTTTCCTACAG
DHFR Z-Nter - SEQ ID NO:4:
ATGAGAGGGTCAGATCCGGCAGCGTTGAAGCGGGCTAGGAACACTGAGGCAGCAAGGCGCTCTCGAGCAAGGAAGTTGCAACGGATGAAACAATTGGAAGACAAAGTTGAAGAGCTGCTTTCAAAAAACTACCACCTTGAAAATGAAGTCGCGAGGCTGAAGAAATTGGTCGGATCTGCTGGCAGCGCAGCGGGGAGCGGTGAGTTTATGGTCAGACCTCTCAACTGTATTGTCGCTGTCTCACAGAACATGGGTATCGGAAAGAACGGTGACTTGCCGTGGCCGCCACTGCGGAATGAGTTCAAATACTTTCAGCGCATGACGACCACCAGCAGTGTGGAGGGTAAGCAAAATCTTGTCATAATGGGTCGCAAGACTTGGTTTTCTATTCCAGAGAAAAACAGACCGCTTAAAGATAGGATTAACATCGTGTTGAGCCGGGAACTGAAAGAGCCACCAAGGGGAGCACATTTTTTGGCTAAGTCCTTGGATGACGCCCTGCGACTGATAGAGCAACCAGAACTTGCTTAGTAA
DHFR Z-Cter - SEQ ID NO:5:
ATGCGCGGTTCCGACCCAGCAGCTTTGAAACGAGCACGAAACACGGAAGCAGCCCGCAGGAGTCGAGCGAGAAAACTTCAGCGGATGAAGCAGCTTGAAGATAAAGTCGAGGAATTGCTTAGCAAGAATTATCACCTCGAGAATGAAGTGGCGCGACTGAAAAAACTTGTAGGTTCTGCTGGGAGCGCAGCCGGAAGCGGCGAGTTCTCAAAAGTTGACATGGTGTGGATCGTGGGTGGAAGTTCTGTCTATCAAGAGGCGATGAATCAGCCTGGCCACCTCAGACTGTTTGTTACAAGGATCATGCAGGAGTTCGAGTCTGACACGTTTTTTCCAGAGATCGACCTGGGGAAATATAAACTCCTCCCAGAGTACCCAGGAGTGCTTAGTGAGGTCCAAGAAGAGAAGGGAATCAAATATAAATTTGAAGTTTACGAAAAGAAGGATTAGTAA
構成体1を有するITRが削除されたAAV2ゲノム
SEQ ID NO:6
ggaggggtggagtcgtgacgtgaattacgtcatagggttagggaggtcctgtattagaggtcacgtgagtgttttgcgacattttgcgacaccatgtggtcacgctgggtatttaagcccgagtgagcacgcagggtctccATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCCatgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaCCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACACCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTtTTTCCTACAGgggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcAGTTGCGCagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacagGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagc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SEQ ID NO:7 (AAV2のためのRep/Cap構成体)
GGCCTCCACGGCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTGGAGGGGTGGAGTCGTGACGTGAATTACGTCATAGGGTTAGGGAGGTCCTGTATTAGAGGTCACGTGAGTGTTTTGCGACATTTTGCGACACCATGTGGTCACGCTGGGTATTTAAGCCCGAGTGAGCACGCAGGGTCTCCATTTTGAAGCGGGAGGTTTGAACGCGCAGCCGCCATGCCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGTGAGTTTGGGGACCCTTGATTGTTCTTTCTTTTTCGCTATTGTAAAATTCATGTTATATGGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTGTTGTTTAGAATGGGAAGATGTCCCTTGTATCACCATGGACCCTCATGATAATTTTGTTTCTTTCACTTTCTACTCTGTTGACAACCATTGTCTCCTCTTATTTTCTTTTCATTTTCTGTAACTTTTTCGTTAAACTTTAGCTTGCATTTGTAACGAATTTTTAAATTCACTTTTGTTTATTTGTCAGATTGTAAGTACTTTCTCTAATCACTTTTTTTTCAAGGCAATCAGGGTATATTATATTGTACTTCAGCACAGTTTTAGAGAACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACCTCAGGTGCAGGCTGCCTATCAGAAGGTGGTGGCTGGTGTGGCCAATGCCCTGGCTCACAAATACCACTGAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGGAGATCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATAATTGTTATAATTAAATGATAAGGTAGAATATTTCTGCATATAAATTCTGGCTGGCGTGGAAATATTCTTATTGGTAGAAACAACTACACCCTGGTCATCATCCTGCCTTTCTCTTTATGGTTACAATGATATACACTGTTTGAGATGAGGATAAAATACTCTGAGTCCAAACCGGGCCCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGA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SEQ ID NO:8 (STXC0068)
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SEQ ID NO:9 (STXC0090)
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SEQ ID NO:10 (STXC0110)
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SEQ ID NO:11 (Helper construct, V1)
GCCTCCACGGCCACTAGTCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCTAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGTGCATCAGGATAGGGCGGTGGTGCTGCAGCAGCGCGCGAATAAACTGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCCTGCAGGAATACAACATGGCAGTGGTCTCCTCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCAGCATGAGACGCCTTGTCCTCCGGGCACAGCAGCGCACCCTGATCTCACTTAAATCAGCACAGTAACTGCAGCACAGCACCACAATATTGTTCAAAATCCCACAGTGCAAGGCGCTGTATCCAAAGCTCATGGCGGGGACCACAGAACCCACGTGGCCATCATACCACAAGCGCAGGTAGATTAAGTGGCGACCCCTCATAAACACGCTGGACATAAACATTACCTCTTTTGGCATGTTGTAATTCACCACCTCCCGGTACCATATAAACCTCTGATTAAACATGGCGCCATCCACCACCATCCTAAACCAGCTGGCCAAAACCTGCCCGCCGGCTATGCACTGCAGGGAACCGGGACTGGAACAATGACAGTGGAGAGCCCAGGACTCGTAACCATGGATCATCATGCTCGTCATGATATCAATGTTGGCACAACACAGGCACACGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAAGCTCCTCCCGCGTCAGAACCATATCCCAGGGAACAACCCATTCCTGAATCAGCGTAAATCCCACACTGCAGGGAAGACCTCGCACGTAACTCACGTTGTGCATTGTCAAAGTGTTACATTCGGGCAGCAGCGGATGATCCTCCAGTATGGTAGCGCGGGTCTCTGTCTCAAAAGGAGGTAGGCGATCCCTACTGTACGGAGTGCGCCGAGACAACCGAGATCGTGTTGGTCGTAGTGTCATGCCAAATGGAACGCCGGACGTAGTCATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACCACGTCCCCGTGGTTCGGGGGGCCTAGACGTTTTTTTAACCTCGACTAAACACATGTAAAGCATGTGCACCGAGGCCCCAGATCAGATCCCATACAATGGGGTACCTTCTGGGCATCCTTCAGCCCCTTGTTGAATACGCTTGAGGAGAGCCATTTGACTCTTTCCACAACTATCCAACTCACAACGTGGCACTGGGGTTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATCTTATACACGTGGCTTTTGGCCGCAGAGGCACCTGTCGCCAGGTGGGGGGTTCCGCTGCCTGCAAAGGGTCGCTACAGACGTTGTTTGTCTTCAAGAAGCTTCCAGAGGAACTGCTTCCTTCACGACATTCAACAGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAGGGGAAAGACCCCTAGGAATGCTCGTCAAGAAGACAGGGCCAGGTTTCCGGGCCCTCACATTGCCAAAAGACGGCAATATGGTGGAAAATAACATATAGACAAACGCACACCGGCCTTATTCCAAGCGGCTTCGGCCAGTAACGTTAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGCGCATCACTATGCGCCACTGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTGTTTAGTGCTCCACTTAAACTCAGGCACAACCATCCGCGGCAGCTCGGTGAAGTTTTCACTCCACAGGCTGCGCACCATCACCAACGCGTTTAGCAGGTCGGGCGCCGATATCTTGAAGTCGCAGTTGGGGCCTCCGCCCTGCGCGCGCGAGTTGCGATACACAGGGTTGCAGCACTGGAACACTATCAGCGCCGGGTGGTGCACGCTGGCCAGCACGCTCTTGTCGGAGATCAGATCCGCGTCCAGGTCCTCCGCGTTGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTAGCTGCCTTCCCAAAAAGGGTGCATGCCCAGGCTTTGAGTTGCACTCGCACCGTAGTGGCATCAGAAGGTGACCGTGCCCGGTCTGGGCGTTAGGATACAGCGCCTGCATGAAAGCCTTGATCTGCTTAAAAGCCACCTGAGCCTTTGCGCCTTCAGAGAAGAACATGCCGCAAGACTTGCCGGAAAACTGATTGGCCGGACAGGCCGCGTCATGCACGCAGCACCTTGCGTCGGTGTTGGAGATCTGCACCACATTTCGGCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTTTCGCTCGTCACATCCATTTCAATCACGTGCTCCTTATTTATCATAATGCTCCCGTGTAGACACTTAAGCTCGCCTTCGATCTCAGCGCAGCGGTGCAGCCACAACGCGCAGCCCGTGGGCTCGTGGTGCTTGTAGGTTACCTCTGCAAACGACTGCAGGTACGCCTGCAGGAATCGCCCCATCATCGTCACAAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAACCCGCGGTGCTCCTCGTTTAGCCAGGTCTTGCATACGGCCGCCAGAGCTTCCACTTGGTCAGGCAGTAGCTTGAAGTTTGCCTTTAGATCGTTATCCACGTGGTACTTGTCCATCAACGCGCGCGCAGCCTCCATGCCCTTCTCCCACGCAGACACGATCGGCAGGCTCAGCGGGTTTATCACCGTGCTTTCACTTTCCGCTTCACTGGACTCTTCCTTTTCCTCTTGCGTCCGCATACCCCGCGCCACTGGGTCGTCTTCATTCAGCCGCCGCACCGTGCGCTTACCTCCCTTGCCGTGCTTGATTAGCACCGGTGGGTTGCTGAAACCCACCATTTGTAGCGCCACATCTTCTCTTTCTTCCTCGCTGTCCACGATCACCTCTGGGGATGGCGGGCGCTCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCTTCTTTTTCTTTTTGGACGCAATGGCCAAATCCGCCGTCGAGGTCGATGGCCGCGGGCTGGGTGTGCGCGGCACCAGCGCATCTTGTGACGAGTCTTCTTCGTCCTCGGACTCGAGACGCCGCCTCAGCCGCTTTTTTGGGGGCGCGCGCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGGAGGCGGCGGCGACGGCGACGGGGACGACACGTCCTCCATGGTTGGTGGACGTCGCGCCGCACCGCGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGACTGGCCATGGTGGCCGAGGATAACTTCGTATATGGTTTCTTATACGAAGTTATGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCTCTAGAGTCGCAGATCTGCTACGTATCAAGCTGTGGCAGGGAAACCCTCTGCCTCCCCCGTGATGTAATACTTTTGCAAGGAATGCGATGAAGTAGAGCCCGCAGTGGCCAAGTGGCTTTGGTCCGTCTCCTCCACGGATGCCCCTCCACGGCTAGTGGGCGCATGTAGGCGGTGGGCGTCCGCCGCCTCCAGCAGCAGGTCATAGAGGGGCACCACGTTCTTGCACTTCATGCTGTACAGATGCTCCATGCCTTTGTTACTCATGTGTCGGATGTGGGAGAGGATGAGGAGGAGCTGGGCCAGCCGCTGGTGCTGCTGCTGCAGGGTCAGGCCTGCCTTGGCCATCAGGTGGATCAAAGTGTCTGTGATCTTGTCCAGGACTCGGTGGATATGGTCCTTCTCTTCCAGAGACTTCAGGGTGCTGGACAGAAATGTGTACACTCCAGAATTAAGCAAAATAATAGATTTGAGGCACACAAACTCCTCTCCCTGCAGATTCATCATGCGGAACCGAGATGATGTAGCCAGCAGCATGTCGAAGATCTCCACCATGCCCTCTACACATTTTCCCTGGTTCCTGTCCAAGAGCAAGTTAGGAGCAAACAGTAGCTTCACTGGGTGCTCCATGGAGCGCCAGACGAGACCAATCATCAGGATCTCTAGCCAGGCACATTCTAGAAGGTGGACCTGATCATGGAGGGTCAAATCCACAAAGCCTGGCACCCTCTTCGCCCAGTTGATCATGTGAACCAGCTCCCTGTCTGCCAGGTTGGTCAGTAAGCCCATCATCGAAGCTTCACTGAAGGGTCTGGTAGGATCATACTCGGAATAGAGTATGGGGGGCTCAGCATCCAACAAGGCACTGACCATCTGGTCGGCCGTCAGGGACAAGGCCAGGCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTGATCATGAGCGGGCTTGGCCAAAGGTTGGCAGCTCTCATGTCTCCAGCAGATGGCTCGAGATCGCCATCTTCCAGCAGGCGCACCATTGCCCCTGTTTCACTATCCAGGTTACGGATATAGTTCATGACAATATTTACATTGGTCCAGCCACCAGCTTGCATGATCTCCGGTATTGAAACTCCAGCGCGGGCCATATCTCGCGCGGCTCCGACACGGGCACTGTGTCCAGACCAGGCCAGGTATCTCTGACCAGAGTCATCCTAAAATACACAAACAATTAGAATCAGTAGTTTAACACATTATACACTTAAAAATTTTATATTTACCTTAGCGCCGTAAATCAATCGATGAGTTGCTTCAAAAATCCCTTCCAGGGCGCGAGTTGATAGCTGGCTGGTGGCAGATGGCGCGGCAACACCATTTTTTCTGACCCGGCAAAACAGGTAGTTATTCGGATCATCAG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ACGACCGGGATTCGAACCCCGGATCCGGCCGTCCGCCGTGATCCATGCGGTTACCGCCCGCGTGTCGAACCCAGGTGTGCGACGTCAGACAACGGGGGAGCGCTCC
SEQ ID NO:12 (ヘルパー構成、 v2)
GCCTCCACGGCCACTAGTCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCTAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGTGCATCAGGATAGGGCGGTGGTGCTGCAGCAGCGCGCGAATAAACTGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCCTGCAGGAATACAACATGGCAGTGGTCTCCTCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCAGCATGAGACGCCTTGTCCTCCGGGCACAGCAGCGCACCCTGATCTCACTTAAATCAGCACAGTAACTGCAGCACAGCACCACAATATTGTTCAAAATCCCACAGTGCAAGGCGCTGTATCCAAAGCTCATGGCGGGGACCACAGAACCCACGTGGCCATCATACCACAAGCGCAGGTAGATTAAGTGGCGACCCCTCATAAACACGCTGGACATAAACATTACCTCTTTTGGCATGTTGTAATTCACCACCTCCCGGTACCATATAAACCTCTGATTAAACATGGCGCCATCCACCACCATCCTAAACCAGCTGGCCAAAACCTGCCCGCCGGCTATGCACTGCAGGGAACCGGGACTGGAACAATGACAGTGGAGAGCCCAGGACTCGTAACCATGGATCATCATGCTCGTCATGATATCAATGTTGGCACAACACAGGCACACGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAAGCTCCTCCCGCGTCAGAACCATATCCCAGGGAACAACCCATTCCTGAATCAGCGTAAATCCCACACTGCAGGGAAGACCTCGCACGTAACTCACGTTGTGCATTGTCAAAGTGTTACATTCGGGCAGCAGCGGATGATCCTCCAGTATGGTAGCGCGGGTCTCTGTCTCAAAAGGAGGTAGGCGATCCCTACTGTACGGAGTGCGCCGAGACAACCGAGATCGTGTTGGTCGTAGTGTCATGCCAAATGGAACGCCGGACGTAGTCATGGTTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTCAAAGGAAAACCACGTCCCCGTGGTTCGGGGGGCCTAGACGTTTTTTTAACCTCGACTAAACACATGTAAAGCATGTGCACCGAGGCCCCAGATCAGATCCCATACAATGGGGTACCTTCTGGGCATCCTTCAGCCCCTTGTTGAATACGCTTGAGGAGAGCCATTTGACTCTTTCCACAACTATCCAACTCACAACGTGGCACTGGGGTTGTGCCGCCTTTGCAGGTGTATCTTATACACGTGGCTTTTGGCCGCAGAGGCACCTGTCGCCAGGTGGGGGGTTCCGCTGCCTGCAAAGGGTCGCTACAGACGTTGTTTGTCTTCAAGAAGCTTCCAGAGGAACTGCTTCCTTCACGACATTCAACAGACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAGGGGAAAGACCCCTAGGAATGCTCGTCAAGAAGACAGGGCCAGGTTTCCGGGCCCTCACATTGCCAAAAGACGGCAATATGGTGGAAAATAACATATAGACAAACGCACACCGGCCTTATTCCAAGCGGCTTCGGCCAGTAACGTTAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGCGCATCACTATGCGCCACTGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTGTTTAGTGCTCCACTTAAACTCAGGCACAACCATCCGCGGCAGCTCGGTGAAGTTTTCACTCCACAGGCTGCGCACCATCACCAACGCGTTTAGCAGGTCGGGCGCCGATATCTTGAAGTCGCAGTTGGGGCCTCCGCCCTGCGCGCGCGAGTTGCGATACACAGGGTTGCAGCACTGGAACACTATCAGCGCCGGGTGGTGCACGCTGGCCAGCACGCTCTTGTCGGAGATCAGATCCGCGTCCAGGTCCTCCGCGTTGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTAGCTGCCTTCCCAAAAAGGGTGCATGCCCAGGCTTTGAGTTGCACTCGCACCGTAGTGGCATCAGAAGGTGACCGTGCCCGGTCTGGGCGTTAGGATACAGCGCCTGCATGAAAGCCTTGATCTGCTTAAAAGCCACCTGAGCCTTTGCGCCTTCAGAGAAGAACATGCCGCAAGACTTGCCGGAAAACTGATTGGCCGGACAGGCCGCGTCATGCACGCAGCACCTTGCGTCGGTGTTGGAGATCTGCACCACATTTCGGCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTTTCGCTCGTCACATCCATTTCAATCACGTGCTCCTTATTTATCATAATGCTCCCGTGTAGACACTTAAGCTCGCCTTCGATCTCAGCGCAGCGGTGCAGCCACAACGCGCAGCCCGTGGGCTCGTGGTGCTTGTAGGTTACCTCTGCAAACGACTGCAGGTACGCCTGCAGGAATCGCCCCATCATCGTCACAAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAACCCGCGGTGCTCCTCGTTTAGCCAGGTCTTGCATACGGCCGCCAGAGCTTCCACTTGGTCAGGCAGTAGCTTGAAGTTTGCCTTTAGATCGTTATCCACGTGGTACTTGTCCATCAACGCGCGCGCAGCCTCCATGCCCTTCTCCCACGCAGACACGATCGGCAGGCTCAGCGGGTTTATCACCGTGCTTTCACTTTCCGCTTCACTGGACTCTTCCTTTTCCTCTTGCGTCCGCATACCCCGCGCCACTGGGTCGTCTTCATTCAGCCGCCGCACCGTGCGCTTACCTCCCTTGCCGTGCTTGATTAGCACCGGTGGGTTGCTGAAACCCACCATTTGTAGCGCCACATCTTCTCTTTCTTCCTCGCTGTCCACGATCACCTCTGGGGATGGCGGGCGCTCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCTTCTTTTTCTTTTTGGACGCAATGGCCAAATCCGCCGTCGAGGTCGATGGCCGCGGGCTGGGTGTGCGCGGCACCAGCGCATCTTGTGACGAGTCTTCTTCGTCCTCGGACTCGAGACGCCGCCTCAGCCGCTTTTTTGGGGGCGCGCGCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGGGAGGCGGCGGCGACGGCGACGGGGACGACACGTCCTCCATGGTTGGTGGACGTCGCGCCGCACCGCGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGACTGGCCATGGTGGCCGAGGATAACTTCGTATATGGTTTCTTATACGAAGTTATGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATGATCCTCTAGAGTCGCAGATCTGCTACGTATCAAGCTGTGGCAGGGAAACCCTCTGCCTCCCCCGTGATGTAATACTTTTGCAAGGAATGCGATGAAGTAGAGCCCGCAGTGGCCAAGTGGCTTTGGTCCGTCTCCTCCACGGATGCCCCTCCACGGCTAGTGGGCGCATGTAGGCGGTGGGCGTCCGCCGCCTCCAGCAGCAGGTCATAGAGGGGCACCACGTTCTTGCACTTCATGCTGTACAGATGCTCCATGCCTTTGTTACTCATGTGTCGGATGTGGGAGAGGATGAGGAGGAGCTGGGCCAGCCGCTGGTGCTGCTGCTGCAGGGTCAGGCCTGCCTTGGCCATCAGGTGGATCAAAGTGTCTGTGATCTTGTCCAGGACTCGGTGGATATGGTCCTTCTCTTCCAGAGACTTCAGGGTGCTGGACAGAAATGTGTACACTCCAGAATTAAGCAAAATAATAGATTTGAGGCACACAAACTCCTCTCCCTGCAGATTCATCATGCGGAACCGAGATGATGTAGCCAGCAGCATGTCGAAGATCTCCACCATGCCCTCTACACATTTTCCCTGGTTCCTGTCCAAGAGCAAGTTAGGAGCAAACAGTAGCTTCACTGGGTGCTCCATGGAGCGCCAGACGAGACCAATCATCAGGATCTCTAGCCAGGCACATTCTAGAAGGTGGACCTGATCATGGAGGGTCAAATCCACAAAGCCTGGCACCCTCTTCGCCCAGTTGATCATGTGAACCAGCTCCCTGTCTGCCAGGTTGGTCAGTAAGCCCATCATCGAAGCTTCACTGAAGGGTCTGGTAGGATCATACTCGGAATAGAGTATGGGGGGCTCAGCATCCAACAAGGCACTGACCATCTGGTCGGCCGTCAGGGACAAGGCCAGGCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTGATCATGAGCGGGCTTGGCCAAAGGTTGGCAGCTCTCATGTCTCCAGCAGATGGCTCGAGATCGCCATCTTCCAGCAGGCGCACCATTGCCCCTGTTTCACTATCCAGGTTACGGATATAGTTCATGACAATATTTACATTGGTCCAGCCACCAGCTTGCATGATCTCCGGTATTGAAACTCCAGCGCGGGCCATATCTCGCGCGGCTCCGACACGGGCACTGTGTCCAGACCAGGCCAGGTATCTCTGACCAGAGTCATCCTAAAATACACAAACAATTAGAATCAGTAGTTTAACACATTATACACTTAAAAATTTTATATTTACCTTAGCGCCGTAAATCAATCGATGAGTTGCTTCAAAAATCCCTTCCAGGGCGCGAGTTGATAGCTGGCTGGTGGCAGATGGCGCGGCAACACCATTTTTTCTGACCCGGCAAAACAGGTAGTTATTCGGATCATCAG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SEQ ID NO:21 (逆テトラサイクリン制御転写活性化因子変異体)
ATGTCTAGACTGGACAAGAGCAAAGTCATAAACTCTGCTCTGGAATTACTCAATGGAGTCGGTATCGAAGGCCTGACGACAAGGAAACTCGCTCAAAAGCTGGGAGTTGAGCAGCCTACCCTGTACTGGCACGTGAAGAACAAGCGGGCCCTGCTCGATGCCCTGCCAATCGAGATGCTGGACAGGCATCATACCCACTCCTGCCCCCTGGAAGGCGAGTCATGGCAAGACTTTCTGCGGAACAACGCCAAGTCATACCGCTGTGCTCTTCTCTCACATCGCGACGGGGCTAAAGTGCATCTCGGCACCCGCCCAACAGAGAAACAGTACGAAACCCTGGAAAATCAGCTCGCGTTCCTGTGTCAGCAAGGCTTCTCCCTGGAGAACGCACTGTACGCTCTGTCCGCCGTGGGCCACTTTACACTGGGCTGCGTATTGGAGGAACAGGAGCATCAAGTAGCAAAAGAGGAAAGAGAGACACCTACCACCGATTCTATGCCCCCACTTCTGAAACAAGCAATTGAGCTGTTCGACCGGCAGGGAGCCGAACCTGCCTTCCTTTTCGGCCTGGAACTAATCATATGTGGCCTGGAGAAACAGCTAAAGTGCGAAAGCGGCGGGCCGACCGACGCCCTTGACGATTTTGACTTAGACATGCTCCCAGCCGATGCCCTTGACGACTTTGACCTTGATATGCTGCCTGCTGACGCTCTTGACGATTTTGACCTTGACATGCTCCCCGGG
SEQ ID NO:22 (Tet誘導可能なプロモーター配列)
GAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGAAGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGCAGACTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGGAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATGACCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATCTACAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATATCCAGTTTACTCCCTATCAGTGATAGAGAACGTATAAGCTTTAGGCGTGTACGGTGGGCGCCTATAAAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGCAATTCCACAACACTTTTGTCTTATACCAACTTTCCGTACCACTTCCTACCCTCGTAAA
SEQ ID NO:23 (STXC0034)
GGTACCCAACTCCATGCTTAACAGTCCCCAGGTACAGCCCACCCTGCGTCGCAACCAGGAACAGCTCTACAGCTTCCTGGAGCGCCACTCGCCCTACTTCCGCAGCCACAGTGCGCAGATTAGGAGCGCCACTTCTTTTTGTCACTTGAAAAACATGTAAAAATAATGTACTAGGAGACACTTTCAATAAAGGCAAATGTTTTTATTTGTACACTCTCGGGTGATTATTTACCCCCCACCCTTGCCGTCTGCGCCGTTTAAAAATCAAAGGGGTTCTGCCGCGCATCGCTATGCGCCACTGGCAGGGACACGTTGCGATACTGGTGTTTAGTGCTCCACTTAAACTCAGGCACAACCATCCGCGGCAGCTCGGTGAAGTTTTCACTCCACAGGCTGCGCACCATCACCAACGCGTTTAGCAGGTCGGGCGCCGATATCTTGAAGTCGCAGTTGGGGCCTCCGCCCTGCGCGCGCGAGTTGCGATACACAGGGTTGCAGCACTGGAACACTATCAGCGCCGGGTGGTGCACGCTGGCCAGCACGCTCTTGTCGGAGATCAGATCCGCGTCCAGGTCCTCCGCGTTGCTCAGGGCGAACGGAGTCAACTTTGGTAGCTGCCTTCCCAAAAAGGGTGCATGCCCAGGCTTTGAGTTGCACTCGCACCGTAGTGGCATCAGAAGGTGACCGTGCCCGGTCTGGGCGTTAGGATACAGCGCCTGCATGAAAGCCTTGATCTGCTTAAAAGCCACCTGAGCCTTTGCGCCTTCAGAGAAGAACATGCCGCAAGACTTGCCGGAAAACTGATTGGCCGGACAGGCCGCGTCATGCACGCAGCACCTTGCGTCGGTGTTGGAGATCTGCACCACATTTCGGCCCCACCGGTTCTTCACGATCTTGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGCGCGCGCTGCCCGTTTTCGCTCGTCACATCCATTTCAATCACGTGCTCCTTATTTATCATAATGCTCCCGTGTAGACACTTAAGCTCGCCTTCGATCTCAGCGCAGCGGTGCAGCCACAACGCGCAGCCCGTGGGCTCGTGGTGCTTGTAGGTTACCTCTGCAAACGACTGCAGGTACGCCTGCAGGAATCGCCCCATCATCGTCACAAAGGTCTTGTTGCTGGTGAAGGTCAGCTGCAACCCGCGGTGCTCCTCGTTTAGCCAGGTCTTGCATACGGCCGCCAGAGCTTCCACTTGGTCAGGCAGTAGCTTGAAGTTTGCCTTTAGATCGTTATCCACGTGGTACTTGTCCATCAACGCGCGCGCAGCCTCCATGCCCTTCTCCCACGCAGACACGATCGGCAGGCTCAGCGGGTTTATCACCGTGCTTTCACTTTCCGCTTCACTGGACTCTTCCTTTTCCTCTTGCGTCCGCATACCCCGCGCCACTGGGTCGTCTTCATTCAGCCGCCGCACCGTGCGCTTACCTCCCTTGCCGTGCTTGATTAGCACCGGTGGGTTGCTGAAACCCACCATTTGTAGCGCCACATCTTCTCTTTCTTCCTCGCTGTCCACGATCACCTCTGGGGATGGCGGGCGCTCGGGCTTGGGAGAGGGGCGCTTCTTTTTCTTTTTGGACGCAATGGCCAAATCCGCCGTCGAGGTCGATGGCCGCGGGCTGGGTGTGCGCGGCACCAGCGCATCTTGTGACGAGTCTTCTTCGTCCTCGGACTCGAGACGCCGCCTCAGCCGCTTTTTTGGGGGCGCGCGGGGAGGCGGCGGCGACGGCGACGGGGACGACACGTCCTCCATGGTTGGTGGACGTCGCGCCGCACCGCGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGACTGGCCATTTCCTTCTCCTATAGGCAGAAAAAGATCATGGAGTCAGTCGAGAAGGAGGACAGCCTAACCGCCCCCTTTGAGTTCGCCACCACCGCCTCCACCGATGCCGCCAACGCGCCTACCACCTTCCCCGTCGAGGCACCCCCGCTTGAGGAGGAGGAAGTGATTATCGAGCAGGACCCAGGTTTTGTAAGCGAAGACGACGAGGATCGCTCAGTACCAACAGAGGATAAAAAGCAAGACCAGGACGACGCAGAGGCAAACGAGGAACAAGTCGGGCGGGGGGACCAAAGGCATGGCGACTACCTAGATGTGGGAGACGACGTGCTGTTGAAGCATCTGCAGCGCCAGTGCGCCATTATCTGCGACGCGTTGCAAGAGCGCAGCGATGTGCCCCTCGCCATAGCGGATGTCAGCCTTGCCTACGAACGCCACCTGTTCTCACCGCGCGTACCCCCCAAACGCCAAGAAAACGGCACATGCGAGCCCAACCCGCGCCTCAACTTCTACCCCGTATTTGCCGTGCCAGAGGTGCTTGCCACCTATCACATCTTTTTCCAAAACTGCAAGATACCCCTATCCTGCCGTGCCAACCGCAGCCGAGCGGACAAGCAGCTGGCCTTGCGGCAGGGCGCTGTCATACCTGATATCGCCTCGCTCGACGAAGTGCCAAAAATCTTTGAGGGTCTTGGACGCGACGAGAAACGCGCGGCAAACGCTCTGCAACAAGAAAACAGCGAAAATGAAAGTCACTGTGGAGTGCTGGTGGAACTTGAGGGTGACAACGCGCGCCTAGCCGTGCTGAAACGCAGCATCGAGGTCACCCACTTTGCCTACCCGGCACTTAACCTACCCCCCAAGGTTATGAGCACAGTCATGAGCGAGCTGATCGTGCGCCGTGCACGACCCCTGGAGAGGGATGCAAACTTGCAAGAACAAACCGAGGAGGGCCTACCCGCAGTTGGCGATGAGCAGCTGGCGCGCTGGCTTGAGACGCGCGAGCCTGCCGACTTGGAGGAGCGACGCAAGCTAATGATGGCCGCAGTGCTTGTTACCGTGGAGCTTGAGTGCATGCAGCGGTTCTTTGCTGACCCGGAGATGCAGCGCAAGCTAGAGGAAACGTTGCACTACACCTTTCGCCAGGGCTACGTGCGCCAGGCCTGCAAAATTTCCAACGTGGAGCTCTGCAACCTGGTCTCCTACCTTGGAATTTTGCACGAAAACCGCCTCGGGCAAAACGTGCTTCATTCCACGCTCAAGGGCGAGGCGCGCCGCGACTACGTCCGCGACTGCGTTTACTTATTTCTGTGCTACACCTGGCAAACGGCCATGGGCGTGTGGCAGCAATGCCTGGAGGAGCGCAACCTAAAGGAGCTGCAGAAGCTGCTAAAGCAAAACTTGAAGGACCTATGGACGGCCTTCAACGAGCGCTCCGTGGCCGCGCACCTGGCGGACATTATCTTCCCCGAACGCCTGCTTAAAACCCTGCAACAGGGTCTGCCAGACTTCACCAGTCAAAGCATGTTGCAAAACTTTAGGAACTTTATCCTAGAGCGTTCAGGAATTCTGCCCGCCACCTGCTGTGCGCTTCCTAGCGACTTTGTGCCCATTAAGTACCGTGAATGCCCTCCGCCGCTTTGGGGTCACTGCTACCTTCTGCAGCTAGCCAACTACCTTGCCTACCACTCCGACATCATGGAAGACGTGAGCGGTGACGGCCTACTGGAGTGTCACTGTCGCTGCAACCTATGCACCCCGCACCGCTCCCTGGTCTGCAATTCGCAACTGCTTAGCGAAAGTCAAATTATCGGTACCTTTGAGCTGCAGGGTCCCTCGCCTGACGAAAAGTCCGCGGCTCCGGGGTTGAAACTCACTCCGGGGCTGTGGACGTCGGCTTACCTTCGCAAATTTGTACCTGAGGACTACCACGCCCACGAGATTAGGTTCTACGAAGACCAATCCCGCCCGCCAAATGCGGAGCTTACCGCCTGCGTCATTACCCAGGGCCACATCCTTGGCCAATTGCAAGCCATCAACAAAGCCCGCCAAGAGTTTCTGCTACGAAAGGGACGGGGGGTTTACCTGGACCCCCAGTCCGGCGAGGAGCTCAACCCAATCCCCCCGCCGCCGCAGCCCTATCAGCAGCCGCGGGCCCTTGCTTCCCAGGATGGCACCCAAAAAGAAGCTGCAGCTGCCGCCGCCGCCACCCACGGACGAGGAGGAATACTGGGACAGTCAGGCAGAGGAGGTTTTGGACGAGGAGGAGGAGATGATGGAAGACTGGGACAGCCTAGACGAAGCTTCCGAGGCCGAAGAGGTGTCAGACGAAACACCGTCACCCTCGGTCGCATTCCCCTCGCCGGCGCCCCAGAAATTGGCAACCGTTCCCAGCATCGCTACAACCTCCGCTCCTCAGGCGCCGCCGGCACTGCCTGTTCGCCGACCCAACCGTAGATGGGACACCACTGGAACCAGGGCCGGTAAGTCTAAGCAGCCGCCGCCGTTAGCCCAAGAGCAACAACAGCGCCAAGGCTACCGCTCGTGGCGCGGGCACAAGAACGCCATAGTTGCTTGCTTGCAAGACTGTGGGGGCAACATCTCCTTCGCCCGCCGCTTTCTTCTCTACCATCACGGCGTGGCCTTCCCCCGTAACATCCTGCATTACTACCGTCATCTCTACAGCCCCTACTGCACCGGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCAACAGCAGCGGTCACACAGAAGCAAAGGCGACCGGATAGCAAGACTCTGACAAAGCCCAAGAAATCCACAGCGGCGGCAGCAGCAGGAGGAGGAGCGCTGCGTCTGGCGCCCAACGAACCCGTATCGACCCGCGAGCTTAGAAATAGGATTTTTCCCACTCTGTATGCTATATTTCAACAAAGCAGGGGCCAAGAACAAGAGCTGAAAATAAAAAACAGGTCTCTGCGCTCCCTCACCCGCAGCTGCCTGTATCACAAAAGCGAAGATCAGCTTCGGCGCACGCTGGAAGACGCGGAGGCTCTCTTCAGCAAATACTGCGCGCTGACTCTTAAGGACTAGTTTCGCGCCCTTTCTCAAATTTAAGCGCGAAAACTACGTCATCTCCAGCGGCCACACCCGGCGCCAGCACCTGTCGTCAGCGCCATTATGAGCAAGGAAATTCCC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SEQ ID NO:24 (STXC0036)
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GAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGATGGATCC
SEQ ID NO:25 (STXC0030)
CCGCGGCCGCCAACTTTGTATAGAAAAGTTGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCATGGCCAGTCGGGAAGAGGAGCAGCGCGAAACCACCCCCGAGCGCGGACGCGGTGCGGCGCGACGTCCACCAACCATGGAGGACGTGTCGTCCCCGTCGCCGTCGCCGCCGCCTCCCCGCGCGCCCCCAAAAAAGCGGCTGAGGCGGCGTCTCGAGTCCGAGGACGAAGAAGACTCGTCACAAGATGCGCTGGTGCCGCGCACACCCAGCCCGCGGCCATCGACCTCGACGGCGGATTTGGCCATTGCGTCCAAAAAGAAAAAGAAGCGCCCCTCTCCCAAGCCCGAGCGCCCGCCATCCCCAGAGGTGATCGTGGACAGCGAGGAAGAAAGAGAAGATGTGGCGCTACAAATGGTGGGTTTCAGCAACCCACCGGTGCTAATCAAGCACGGCAAGGGAGGTAAGCGCACGGTGCGGCGGCTGAATGAAGACGACCCAGTGGCGCGGGGTATGCGGACGCAAGAGGAAAAGGAAGAGTCCAGTGAAGCGGAAAGTGAAAGCACGGTGATAAACCCGCTGAGCCTGCCGATCGTGTCTGCGTGGGAGAAGGGCATGGAGGCTGCGCGCGCGTTGATGGACAAGTACCACGTGGATAACGATCTAAAGGCAAACTTCAAGCTACTGCCTGACCAAGTGGAAGCTCTGGCGGCCGTATGCAAGACCTGGCTAAACGAGGAGCACCGCGGGTTGCAGCTGACCTTCACCAGCAACAAGACCTTTGTGACGATGATGGGGCGATTCCTGCAGGCGTACCTGCAGTCGTTTGCAGAGGTAACCTACAAGCACCACGAGCCCACGGGCTGCGCGTTGTGGCTGCACCGCTGCGCTGAGATCGAAGGCGAGCTTAAGTGTCTACACGGGAGCATTATGATAAATAAGGAGCACGTGATTGAAATGGATGTGACGAGCGAAAACGGGCAGCGCGCGCTGAAGGAGCAGTCTAGCAAGGCCAAGATCGTGAAGAACCGGTGGGGCCGAAATGTGGTGCAGATCTCCAACACCGACGCAAGGTGCTGCGTGCATGACGCGGCCTGTCCGGCCAATCAGTTTTCCGGCAAGTCTTGCGGCATGTTCTTCTCTGAAGGCGCAAAGGCTCAGGTGGCTTTTAAGCAGATCAAGGCTTTCATGCAGGCGCTGTATCCTAACGCCCAGACCGGGCACGGTCACCTTCTGATGCCACTACGGTGCGAGTGCAACTCAAAGCCTGGGCATGCACCCTTTTTGGGAAGGCAGCTACCAAAGTTGACTCCGTTCGCCCTGAGCAACGCGGAGGACCTGGACGCGGATCTGATCTCCGACAAGAGCGTGCTGGCCAGCGTGCACCACCCGGCGCTGATAGTGTTCCAGTGCTGCAACCCTGTGTATCGCAACTCGCGCGCGCAGGGCGGAGGCCCCAACTGCGACTTCAAGATATCGGCGCCCGACCTGCTAAACGCGTTGGTGATGGTGCGCAGCCTGTGGAGTGAAAACTTCACCGAGCTGCCGCGGATGGTTGTGCCTGAGTTTAAGTGGAGCACTAAACACCAGTATCGCAACGTGTCCCTGCCAGTGGCGCATAGCGATGCGCGGCAGAACCCCTTTGATTTTTAAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGACTACGTCCGGCGTTCCATTTGGCATGACACTACGACCAACACGATCTCGGTTGTCTCGGCGCACTCCGTACAGTAGGGATCGCCTACCTCCTTTTGAGACAGAGACCCGCGCTACCATACTGGAGGATCATCCGCTGCTGCCCGAATGTAACACTTTGACAATGCACAACGTGAGTTACGTGCGAGGTCTTCCCTGCAGTGTGGGATTTACGCTGATTCAGGAATGGGTTGTTCCCTGGGATATGGTTCTGACGCGGGAGGAGCTTGTAATCCTGAGGAAGTGTATGCACGTGTGCCTGTGTTGTGCCAACATTGATATCATGACGAGCATGATGATCCATGGTTACGAGTCCTGGGCTCTCCACTGTCATTGTTCCAGTCCCGGTTCCCTGCAGTGCATAGCCGGCGGGCAGGTTTTGGCCAGCTGGTTTAGGATGGTGGTGGATGGCGCCATGTTTAATCAGAGGTTTATATGGTACCGGGAGGTGGTGAATTACAACATGCCAAAAGAGGTAATGTTTATGTCCAGCGTGTTTATGAGGGGTCGCCACTTAATCTACCTGCGCTTGTGGTATGATGGCCACGTGGGTTCTGTGGTCCCCGCCATGAGCTTTGGATACAGCGCCTTGCACTGTGGGATTTTGAACAATATTGTGGTGCTGTGCTGCAGTTACTGTGCTGATTTAAGTGAGATCAGGGTGCGCTGCTGTGCCCGGAGGACAAGGCGTCTCATGCTGCGGGCGGTGCGAATCATCGCTGAGGAGACCACTGCCATGTTGTATTCCTGCAGGACGGAGCGGCGGCGGCAGCAGTTTATTCGCGCGCTGCTGCAGCACCACCGCCCTATCCTGATGCACGATTATGACTCTACCCCCATGTAGCAACTTTATTATACATAGTTGATGGCCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAGCGGCCGCGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCTCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATT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SEQ ID NO:26 (STXC0031)
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SEQ ID NO:27 (STXC00124)
TGGTATGGCTTTTTCCCCGTATCCCCCCAGGTGTCTGCAGGCTCAAAGAGCAGCGAGAAGCGTTCAGAGGAAAGCGATCCCGTGCCACCTTCCCCGTGCCCGGGCTGTCCCCGCACGCTGCCGGCTCGGGGATGCGGGGGGAGCGCCGGACCGGAGCGGAGCCCCGGGCGGCTCGCTGCTGCCCCCTAGCGGGGGAGGGACGTAATTACATCCCTGGGGGCTTTGGGGGGGGGCTGTCCCTGATATCTATAACAAGAAAATATATATATAATAAGTTATCACGTAAGTAGAACATGAAATAACAATATAATTATCGTATGAGTTAAATCTTAAAAGTCACGTAAAAGATAATCATGCGTCATTTTGACTCACGCGGTCGTTATAGTTCAAAATCAGTGACACTTACCGCATTGACAAGCACGCCTCACGGGAGCTCCAAGCGGCGACTGAGATGTCCTAAATGCACAGCGACGGATTCGCGCTATTTAGAAAGAGAGAGCAATATTTCAAGAATGCATGCGTCAATTTTACGCAGACTATCTTTCTAGGGTTAATCTAGCTGCATCAGGATCATATCGTCGGGTCTTTTTTCCGGCTCAGTCATCGCCCAAGCTGGCGCTATCTGGGCATCGGGGAGGAAGAAGCCCGTGCCTTTTCCCGCGAGGTTGAAGCGGCATGGAAAGAGTTTGCCGAGGATGACTGCTGCTGCATTGACGTTGAGCGAAAACGCACGTTTACCATGATGATTCGGGAAGGTGTGGCCATGCACGCCTTTAACGGTGAACTGTTCGTTCAGGCCACCTGGGATACCAGTTCGTCGCGGCTTTTCCGGACACAGTTCCGGATGGTCAGCCCGAAGCGCATCAGCAACCCGAACAATACCGGCGACAGCCGGAACTGCCGTGCCGGTGTGCAGATTAATGACAGCGGTGCGGCGCTGGGATATTACGTCAGCGAGGACGGGTATCCTGGCTGGATGCCGCAGAAATGGACATGGATACCCCGTGAGTTACCCGGCGGGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCCTCGTTCATTCACGTTTTTGAACCCGTGGAGGACGGGCAGACTCGCGGTGCAAATGTGTTTTACAGCGTGATGGAGCAGATGAAGATGCTCGACACGCTGCAGAACACGCAGCTAGATTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTATGAGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGGATACGGGGAAAAGGCCTCCACGGCCACTAGTCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCTAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGTGCATCAGGATAGGGCGGTGGTGCTGCAGCAGCGCGCGAATAAACTGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCCTGCAGGAATACAACATGGCAGTGGTCTCCTCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCAGCATGAGACGCCTTGTCCTCCGGGCACAGCAGCGCACCCTGATCTCACTTAAATCAGCACAGTAACTGCAGCACAGCACCACAATATTGTTCAAAATCCCACAGTGCAAGGCGCTGTATCCAAAGCTCATGGCGGGGACCACAGAACCCACGTGGCCATCATACCACAAGCGCAGGTAGATTAAGTGGCGACCCCTCATAAACAC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SEQ ID NO:28 (STXC0125)
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SEQ ID NO:29 (STXC0126)
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SEQ ID NO:30 (STXC0123)
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SEQ ID NO:31 (STXC0133)
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SEQ ID NO:32 (STXC0137)
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SEQ ID NO:33 (STXC0136)
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SEQ ID NO:34 (STX650)
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGGATCCTCTACGCCATATTATCCACAGTCCAACGGCCAGGCGGAGGCTAGTAACAAGGTTATCCTCGGCATCCTCCGCAGGTACCATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGTAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTAAGCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTACTCAGATCTCGAGCTCAAGTGAACCGGTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGGTACCCTCACGGACCAGTGCAACATATTCCCAACATCCCGTTGCAGCCTATCATTAAACCTTGGCCGGTCGCGGCTGCAGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAAAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
SEQ ID NO:35 (STXC002)
ggtacccaactccatgcttaacagtccccaggtacagcccaccctgcgtcgcaaccaggaacagctctacagcttcctggagcgccactcgccctacttccgcagccacagtgcgcagattaggagcgccacttctttttgtcacttgaaaaacatgtaaaaataatgtactaggagacactttcaataaaggcaaatgtttttatttgtacactctcgggtgattatttaccccccacccttgccgtctgcgccgtttaaaaatcaaaggggttctgccgcgcatcgctatgcgccactggcagggacacgttgcgatactggtgtttagtgctccacttaaactcaggcacaaccatccgcggcagctcggtgaagttttcactccacaggctgcgcaccatcaccaacgcgtttagcaggtcgggcgccgatatcttgaagtcgcagttggggcctccgccctgcgcgcgcgagttgcgatacacagggttgcagcactggaacactatcagcgccgggtggtgcacgctggccagcacgctcttgtcggagatcagatccgcgtccaggtcctccgcgttgctcagggcgaacggagtcaactttggtagctgccttcccaaaaagggtgcatgcccaggctttgagttgcactcgcaccgtagtggcatcagaaggtgaccgtgcccggtctgggcgttaggatacagcgcctgcatgaaagccttgatctgcttaaaagccacctgagcctttgcgccttcagagaagaacatgccgcaagacttgccggaaaactgattggccggacaggccgcgtcatgcacgcagcaccttgcgtcggtgttggagatctgcaccacatttcggccccaccggttcttcacgatcttggccttgctagactgctccttcagcgcgcgctgcccgttttcgctcgtcacatccatttcaatcacgtgctccttatttatcataatgctcccgtgtagacacttaagctcgccttcgatctcagcgcagcggtgcagccacaacgcgcagcccgtgggctcgtggtgcttgtaggttacctctgcaaacgactgcaggtacgcctgcaggaatcgccccatcatcgtcacaaaggtcttgttgctggtgaaggtcagctgcaacccgcggtgctcctcgtttagccaggtcttgcatacggccgccagagcttccacttggtcaggcagtagcttgaagtttgcctttagatcgttatccacgtggtacttgtccatcaacgcgcgcgcagcctccatgcccttctcccacgcagacacgatcggcaggctcagcgggtttatcaccgtgctttcactttccgcttcactggactcttccttttcctcttgcgtccgcataccccgcgccactgggtcgtcttcattcagccgccgcaccgtgcgcttacctcccttgccgtgcttgattagcaccggtgggttgctgaaacccaccatttgtagcgccacatcttctctttcttcctcgctgtccacgatcacctctggggatggcgggcgctcgggcttgggagaggggcgcttctttttctttttggacgcaatggccaaatccgccgtcgaggtcgatggccgcgggctgggtgtgcgcggcaccagcgcatcttgtgacgagtcttcttcgtcctcggactcgagacgccgcctcagccgcttttttgggggcgcgcggggaggcggcggcgacggcgacggggacgacacgtcctccatggttggtggacgtcgcgccgcaccgcgtccgcgctcgggggtggtttcgcgctgctcctcttcccgactggccatttccttctcctataggcagaaaaagatcatggagtcagtcgagaaggaggacagcctaaccgccccctttgagttcgccaccaccgcctccaccgatgccgccaacgcgcctaccaccttccccgtcgaggcacccccgcttgaggaggaggaagtgattatcgagcaggacccaggttttgtaagcgaagacgacgaggatcgctcagtaccaacagaggataaaaagcaagaccaggacgacgcagaggcaaacgaggaacaagtcgggcggggggaccaaaggcatggcgactacctagatgtgggagacgacgtgctgttgaagcatctgcagcgccagtgcgccattatctgcgacgcgttgcaagagcgcagcgatgtgcccctcgccatagcggatgtcagccttgcctacgaacgccacctgttctcaccgcgcgtaccccccaaacgccaagaaaacggcacatgcgagcccaacccgcgcctcaacttctaccccgtatttgccgtgccagaggtgcttgccacctatcacatctttttccaaaactgcaagatacccctatcctgccgtgccaaccgcagccgagcggacaagcagctggccttgcggcagggcgctgtcatacctgatatcgcctcgctcgacgaagtgccaaaaatctttgagggtcttggacgcgacgagaaacgcgcggcaaacgctctgcaacaagaaaacagcgaaaatgaaagtcactgtggagtgctggtggaacttgagggtgacaacgcgcgcctagccgtgctgaaacgcagcatcgaggtcacccactttgcctacccggcacttaacctaccccccaaggttatgagcacagtcatgagcgagctgatcgtgcgccgtgcacgacccctggagagggatgcaaacttgcaagaacaaaccgaggagggcctacccgcagttggcgatgagcagctggcgcgctggcttgagacgcgcgagcctgccgacttggaggagcgacgcaagctaatgatggccgcagtgcttgttaccgtggagcttgagtgcatgcagcggttctttgctgacccggagatgcagcgcaagctagaggaaacgttgcactacacctttcgccagggctacgtgcgccaggcctgcaaaatttccaacgtggagctctgcaacctggtctcctaccttggaattttgcacgaaaaccgcctcgggcaaaacgtgcttcattccacgctcaagggcgaggcgcgccgcgactacgtccgcgactgcgtttacttatttctgtgctacacctggcaaacggccatgggcgtgtggcagcaatgcctggaggagcgcaacctaaaggagctgcagaagctgctaaagcaaaacttgaaggacctatggacggccttcaacgagcgctccgtggccgcgcacctggcggacattatcttccccgaacgcctgcttaaaaccctgcaacagggtctgccagacttcaccagtcaaagcatgttgcaaaactttaggaactttatcctagagcgttcaggaattctgcccgccacctgctgtgcgcttcctagcgactttgtgcccattaagtaccgtgaatgccctccgccgctttggggtcactgctaccttctgcagctagccaactaccttgcctaccactccgacatcatggaagacgtgagcggtgacggcctactggagtgtcactgtcgctgcaacctatgcaccccgcaccgctccctggtctgcaattcgcaactgcttagcgaaagtcaaattatcggtacctttgagctgcagggtccctcgcctgacgaaaagtccgcggctccggggttgaaactcactccggggctgtggacgtcggcttaccttcgcaaatttgtacctgaggactaccacgcccacgagattaggttctacgaagaccaatcccgcccgccaaatgcggagcttaccgcctgcgtcattacccagggccacatccttggccaattgcaagccatcaacaaagcccgccaagagtttctgctacgaaagggacggggggtttacctggacccccagtccggcgaggagctcaacccaatccccccgccgccgcagccctatcagcagccgcgggcccttgcttcccaggatggcacccaaaaagaagctgcagctgccgccgccgccacccacggacgaggaggaatactgggacagtcaggcagaggaggttttggacgaggaggaggagatgatggaagactgggacagcctagacgaagcttccgaggccgaagaggtgtcagacgaaacaccgtcaccctcggtcgcattcccctcgccggcgccccagaaattggcaaccgttcccagcatcgctacaacctccgctcctcaggcgccgccggcactgcctgttcgccgacccaaccgtagatgggacaccactggaaccagggccggtaagtctaagcagccgccgccgttagcccaagagcaacaacagcgccaaggctaccgctcgtggcgcgggcacaagaacgccatagttgcttgcttgcaagactgtgggggcaacatctccttcgcccgccgctttcttctctaccatcacggcgtggccttcccccgtaacatcctgcattactaccgtcatctctacagcccctactgcaccggcggcagcggcagcggcagcaacagcagcggtcacacagaagcaaaggcgaccggatagcaagactctgacaaagcccaagaaatccacagcggcggcagcagcaggaggaggagcgctgcgtctggcgcccaacgaacccgtatcgacccgcgagcttagaaataggatttttcccactctgtatgctatatttcaacaaagcaggggccaagaacaagagctgaaaataaaaaacaggtctctgcgctccctcacccgcagctgcctgtatcacaaaagcgaagatcagcttcggcgcacgctggaagacgcggaggctctcttcagcaaatactgcgcgctgactcttaaggactagtttcgcgccctttctcaaatttaagcgcgaaaactacgtcatctccagcggccacacccggcgccagcacctgtcgtcagcgccattatgagcaaggaaattccc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例示的な構成体１／Ｒｅｐ／Ｃａｐの特徴
等価体および参照による組み込み
本明細書で引用した全ての参考文献は、あたかも、各個別の出版、データベースへの入力（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、またはＧｅｎｅＩＤ入力）、特許出願、または特許が、明確に、および個別に参照により、その全体が、全ての目的で組み込まれるために示されるのと同程度に参照により組み込まれる。この参照による組み込みの言明は、本特許の出願人により、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．５７（ｂ）（１）に従って、それぞれの、または全ての個別の刊行物、データベースへの入力（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、またはＧｅｎｅＩＤ入力）、特許出願、または特許のそれぞれが、たとえこのような引用が、参照による組み込みの専用の言明に直ちに隣接していなくても、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．５７（ｂ）（２）に従って明確に特定される。参照による組み込みの専用の言明が、もしあるとしても、その特許明細書への包含は、参照による組み込みの一般的な言明を、いかなる方法によっても弱めない。本明細書の参考文献の引用は、その参考文献が適切な先行技術であることを承認することを意図しておらず、またこれらの刊行物または文書の内容または日付の何らかの承認を構成するものではない。
本発明が、好適な実施形態および様々な代替的な実施形態の参照とともに、具体的に示され、および記載されたが、関連する技術分野の当業者により、形態および詳細における様々な変更が、発明の精神および範囲を逸脱することなくなされることが、理解されるであろう。

Claims (157)

  1. 細胞であって：
    ａ）ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ Ｃａｐタンパク質をコードする第一のポリヌクレオチド構成体；
    ｂ）１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質をコードする第二のポリヌクレオチド構成体とを含み；
    １つ以上の核酸が哺乳類細胞の核ゲノムに統合され、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、および／または１つ以上のアドレノウイルス・ヘルパータンパク質が、条件付きで発現可能であり、それにより条件付きで組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子を産生するもの。
  2. 請求項１の細胞であって、前記第二のポリヌクレオチド構成体が、以下をコードする配列を含むもの：
    ａ）１つ以上のヘルパータンパク質；
    ｂ）前記１つ以上のヘルパータンパク質の上流の自己削除する要素；および
    ｃ）前記自己削除する要素の上流の誘導可能なプロモーター。
  3. 請求項２の細胞であって、前記自己を削除する要素が、操作可能に前記誘導可能なプロモーターにリンクされるもの。
  4. 請求項２、または３の細胞であって、前記自己を削除する要素の発現が、前記誘導可能なプロモーターにより駆動されるもの
  5. 請求項２～４の任意の１つの細胞であって、前記誘導可能なプロモーターが、テトラサイクリン応答性プロモーター要素（ＴＲＥ）であるもの。
  6. 請求項５の細胞であって、前記ＴＲＥが最小限のプロモーターに融合した、Ｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）配列コンカテマーを含むもの。
  7. 請求項６の細胞であって、前記最小限のプロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターであるもの。
  8. 請求項３～７の任意の１つの細胞であって、前記誘導可能なプロモーターが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２２に対して含むもの。
  9. 請求項３～８の任意の１つの細胞であって、転写が活性化因子に結合した前記誘導可能なプロモーターにより活性化されるもの。
  10. 請求項９の細胞であって、第一引き金を引く薬剤の存在下で、前記活性化因子が前記誘導可能なプロモーターに結合するもの。
  11. 請求項１～１０の任意の１つの細胞であって、前記第二のポリヌクレオチド構成体が前記活性化因子をコードする配列を更に含むもの。
  12. 請求項９～１１の任意の１つの細胞であって、前記活性化因子が操作可能に構成的プロモーターにリンクされるもの。
  13. 請求項１２の細胞であって、前記構成的なプロモーターがＥ１αプロモーターまたはヒトサイトメガロウイルスプロモーターであるもの。
  14. 請求項１３の細胞であって、前記Ｅ１αプロモーターが少なくとも１つの変異を含むもの。
  15. 請求項１２～１４の任意の１つの細胞であって、前記構成的なプロモーターが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に対して含むもの。
  16. 請求項９～１５の任意の１つの細胞であって、前記活性化因子が、ＶＰ１６転写活性化ドメインに融合したＴｅｔリプレッサー結合タンパク質（ＴｅｔＲ）を含む逆テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｒＴＡ）であるもの。
  17. 請求項１６の細胞であって、前記ｒＴＡが、ｔｅｔＲ ＤＮＡ結合部分に、４つの変異を含むもの。
  18. 請求項１６または１７の細胞であって、前記ｒＴＡが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２１に対して含むもの。
  19. 請求項２～４の任意の１つの細胞であって、前記誘導可能なプロモーターが、クミン酸塩オペレーター配列であるもの。
  20. 請求項１９の細胞であって、前記クミン酸塩オペレーター配列が、構成的プロモーターの下流にあるもの。
  21. 請求項２０の細胞であって、前記構成的プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルスプロモーターであるもの。
  22. 請求項１９～２１の任意の１つの細胞であって、前記誘導可能なプロモーターが、第一の引き金を引く薬剤の不在下で、ｃｙｍＲリプレッサーに結合するもの。
  23. 請求項１９～２２の任意の１つの細胞であって、前記誘導可能なプロモーターが、第一の引き金を引く薬剤の存在下で、活性化されるもの。
  24. 請求項２３の細胞であって、前記第一の引き金を引く薬剤が、ｃｙｍＲリプレッサーに結合するもの。
  25. 請求項１９～２４の任意の１つの細胞であって、ｃｙｍＲリプレッサーを更に含むもの。
  26. 請求項２５の細胞であって、前記ｃｙｍＲリプレッサーが、構成的プロモーターに操作可能にリンクされるもの。
  27. 請求項２６の細胞であって、前記構成的プロモーターがＥ１αプロモーターであるもの。
  28. 請求項２７の細胞であって、前記Ｅ１αプロモーターが少なくとも１つの変異を含むもの。
  29. 請求項２０～２８の任意の１つの細胞であって、前記構成的なプロモーターが、少なくとも、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に対して含むもの。
  30. 請求項１９～２９の任意の１つの細胞であって、前記第一の引き金を引く薬剤がクミン酸塩であるもの。
  31. 請求項２～３０の任意の１つの細胞であって、前記自己を削除する要素が、ポリＡ配列を含むもの。
  32. 請求項２～３１の任意の１つの細胞であって、前記自己を削除する要素が、リコンビナーゼであるもの。
  33. 請求項３２の細胞であって、前記リコンビナーゼがリガンド結合ドメインに融合されているもの。
  34. 請求項３２または３３の細胞であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドであるもの。
  35. 請求項３４の細胞であって、前記Ｃｒｅポリペプチドが、リガンド結合ドメインに融合されているもの。
  36. 請求項３５の細胞であって、前記リガンド結合ドメインがホルモン受容体であるもの。
  37. 請求項３６の細胞であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドであるもの。
  38. 請求項３２～３７の任意の１つの細胞であって、前記自己を削除する要素が、第二の引き金を引く薬剤の存在下に、核に転座するもの。
  39. 請求項３８の細胞であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、エストロゲン受容体リガンドであるもの。
  40. 請求項３８または３９の細胞であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、選択的エストロゲン受容体モデュレーター（ＳＥＲＭ）であるもの。
  41. 請求項４０の細胞であって、前記第二の引き金を引く薬剤が、タモキシフェンであるもの。
  42. 請求項３２～４１の任意の１つの細胞であって、前記リコンビナーゼが、組み換え部位の側面にあるもの。
  43. 請求項４２の細胞であって、前記組み換え部位が、ｌｏｘ部位か、またはフリッパーゼ組み換え標的（ＦＲＴ）部位であるもの。
  44. 請求項４３の細胞であって、前記ｌｏｘ部位が、ｌｏｘＰ部位であるもの。
  45. 請求項１～４４の任意の１つの細胞であって、前記１つ以上のアデノウイルス・ヘルパータンパク質が、Ｅ２ＡおよびＥ４を含むもの。
  46. 請求項４５の細胞であって、前記Ｅ２ＡがＦＬＡＧ標識されたＥ２Ａであるもの。
  47. 請求項４５または４６の細胞であって、Ｅ２Ａをコーディングする配列およびＥ４をコーディングする配列が、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはＰ２Ａにより分離されるもの。
  48. 請求項１～４７の任意の１つの細胞であって、選択可能なマーカーをコーディングする配列を更に含むもの。
  49. 請求項４８の細胞であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
  50. 請求項４９の細胞であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ－末端にリンクされたスプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ－末端にリンクされたスプリットインテインにより分割されるもの。
  51. 実施例４９または５０の細胞であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質がピューロマイシン抵抗性であるか、ブラストサイジン抵抗性であるもの。
  52. 請求項１～５１の任意の１つの細胞であって、前記第二のポリヌクレオチド構成体が、ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列を更に含むもの。
  53. 請求項５２の細胞であって、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列が転写的に不活性であるもの。
  54. 請求項５２または５３の細胞であって、前記ＶＡ ＲＮＡをコーディングする配列が、その内部プロモーターに少なくとも２つの変異を含むもの。
  55. 請求項５２～５４の任意の１つの細胞であって、ＶＡ ＲＮＡの発現がＵ６プロモーターにより駆動されるもの。
  56. 請求項５２～５５の任意の１つの細胞であって、ＶＡ ＲＮＡの遺伝子配列をコードする配列の上流に、５’から３’に向かって以下のものを含むもの：
    ａ）Ｕ６プロモーター配列の第一の部分；
    ｂ）第一の組み換え部位；
    ｃ）スタッファー配列；
    ｄ）第二の組み換え部位；および
    ｅ）Ｕ６プロモーター配列の第二の部分。
  57. 請求項５６の細胞であって、前記スタッファー配列がリコンビナーゼにより削除可能なもの。
  58. 請求項５６または５７の細胞であって、前記スタッファー配列が、遺伝子をエンコードする配列を含むもの。
  59. 請求項５６～５８の任意の１つの細胞であって、前記スタッファー配列が、プロモーターを含むもの。
  60. 請求項５９の細胞であって、前記プロモーターが、構成的プロモーターであるもの。
  61. 請求項６０の細胞であって、前記プロモーターがＣＭＶプロモーターであるもの。
  62. 請求項１～６１の任意の１つの細胞であって、第一のポリヌクレオチド構成体が以下のものを含むもの：
    ａ）Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列；
    ｂ）Ｒｅｐ遺伝子の第二の部分の配列；
    ｃ）Ｃａｐ遺伝子の配列；および
    ｄ）Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列およびＲｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に配置される削除可能な要素。
  63. 請求項６２の細胞であって、前記削除可能な要素が停止シグナリング配列を有するもの。
  64. 請求項６２または６３の細胞であって、前記削除可能な要素がウサギβグロブリンイントロンを含むもの。
  65. 請求項６２～６４の任意の１つの細胞であって、前記削除可能な要素がエクソンを含むもの。
  66. 請求項６２～６４の任意の１つの細胞であって、前記削除可能な要素がイントロンおよびエクソンを含むもの。
  67. 請求項６２～６４の任意の１つの細胞であって、前記削除可能な要素がイントロンを含むもの。
  68. 請求項６２～６７の任意の１つの細胞であって、２つのスプライス部位が、Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列およびＲｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に配置されるもの。
  69. 請求項６８の細胞であって、前記２つのスプライス部位が、５’スプライス部位および３’スプライス部位であるもの。
  70. 請求項６９の細胞であって、前記５’スプライス部位が、ウサギβグロブリン５’スプライス部位であるもの。
  71. 請求項６８または６９の細胞であって、前記３’スプライス部位が、ウサギβグロブリン３’スプライス部位であるもの。
  72. 請求項６２～６７の任意の１つの細胞であって、３つのスプライス部位が、Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分の配列およびＲｅｐ遺伝子の第二の部分の配列の間に配置されるもの。
  73. 請求項７２の細胞であって、前記３つのスプライス部位が、５’スプライス部位、第一の３’スプライス部位および第二の３’スプライス部位であるもの。
  74. 請求項７３の細胞であって、第一の３’スプライス部位が、第二の３’スプライス部位の複製であるもの。
  75. 請求項７２または７３の細胞であって、 前記３’スプライス部位が、ウサギβグロブリン３’スプライス部位であるもの。
  76. 請求項７２～７４の任意の１つの細胞であって、前記第二の３’スプライス部位が、ウサギβグロブリン３’スプライス部位であるもの。
  77. 請求項６２～７４の任意の１つの細胞であって、前記削除可能な要素が組み換え部位を含むもの。
  78. 請求項７７の細胞であって、前記組み換え部位が、ｌｏｘ部位か、ＦＲＴ部位であるもの。
  79. 請求項７８の細胞であって、前記ｌｏｘ部位が、ｌｏｘＰ部位であるもの。
  80. 請求項６２～７９の任意の１つの細胞であって、前記削除可能な要素が５’から３’に向かって、以下のものを含むもの：
    ａ）前記５’スプライス部位；
    ｂ）第一の組み換え部位；
    ｃ）前記第一の３’スプライス部位；
    ｄ）停止シグナリング配列；
    ｅ）第二の組み換え部位；および
    ｆ）前記第二の３’スプライス部位。
  81. 請求項６２～７９の任意の１つの細胞であって、前記削除可能な要素が５’から３’に向かって、以下のものを含むもの：
    ａ）前記５’スプライス部位；
    ｂ）第一のスペーサーセグメント；
    ｃ）第二のスペーサーセグメントであって以下を含むもの：
    ｉ）第一の組み換え部位；
    ｉｉ）第一の３’スプライス部位；
    ｉｖ）停止シグナリング配列；および
    ｖ）第二の組み換え部位；ならびに
    ｄ）第二の３’スプライス部位を含む、第三のスペーサーセグメント。
  82. 請求項８１の細胞であって、第一のスペーサーセグメントがイントロンを含むもの。
  83. 請求項８１または８２の細胞であって、前記第一のスペーサーセグメントが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：１に対して含むもの。
  84. 請求項８１～８３の任意の１つの細胞であって、前記第二のスペーサーセグメントが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：２に対して含むもの。
  85. 請求項８１～８４の任意の１つの細胞であって、前記第三のスペーサーセグメントが、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：３に対して含むもの。
  86. 請求項８１～８５の任意の１つの細胞であって、前記第三のスペーサーセグメントが、イントロンを含むもの。
  87. 請求項８１～８６の任意の１つの細胞であって、前記第一のスペーサーセグメントおよび前記第三のスペーサーセグメントが、内在性の細胞機構により削除される能力を有するもの。
  88. 請求項８１～８７の任意の１つの細胞であって、前記第二のスペーサーセグメントが、エクソンを含むもの。
  89. 請求項８１～８８の任意の１つの細胞であって、前記第二のスペーサーセグメントが、ポリＡ配列を更に含むもの。
  90. 請求項８９の細胞であって、前記ポリＡ配列が、エクソンの３であるもの。
  91. 請求項８９または９０の細胞であって、前記ポリＡ配列が、ウサギβグロブリン（ＲＢＧ） ポリＡ配列を含むもの。
  92. 請求項８１～９１の任意の１つの細胞であって、前記第二のスペーサーセグメントが、５’から３’に向かって以下のものを含むもの：
    ａ）第一の組み換え部位；
    ｂ）前記第一の３’スプライス部位；
    ｃ）エクソン；
    ｄ）停止シグナリング配列；および
    ｅ）第二の組み換え部位。
  93. 請求項９２の細胞であって、前記第一の組み換え部位が第一のｌｏｘ配列であり、および前記第二の組み換え部位が第二のｌｏｘ配列であるもの。
  94. 請求項９３の細胞であって、前記第一のｌｏｘ配列が第一のｌｏｘＰ配列であり、および第二のｌｏｘ配列が第二のｌｏｘＰ配列であるもの。
  95. 請求項９２の細胞であって、前記第一の組み換え部位が第一のＦＲＴ部位であり、前記第二の組み換え部位が第二のＦＲＴ部位であるもの。
  96. 請求９２～９５の任意の１つの細胞であって、前記停止シグナリング配列が、エクソンの終止コドンであるか、またはポリＡ配列であるもの。
  97. 請求項９６の細胞であって、前記ポリＡ配列がウサギβグロブリン（ＲＢＧ） ポリＡ配列を含むもの。
  98. 請求９２～９７の任意の１つの細胞であって、前記エクソンが、検出可能なマーカーまたは選択可能なマーカーをエンコードするもの。
  99. 請求項９８の細胞であって、前記検出可能なマーカーが発光マーカーまたは蛍光マーカーを含むもの。
  100. 請求項９９の細胞であって、前記蛍光マーカーが、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、 ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙであるもの。
  101. 請求８１～１００の任意の１つの細胞であって、前記第二のスペーサーセグメントが、が、リコンビナーゼにより削除可能なもの。
  102. 請求項１０１の細胞であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅポリペプチドまたはフリッパーゼポリペプチドであるもの。
  103. 請求項１０２の細胞であって、前記Ｃｒｅポリペプチドが、リガンド結合ドメインに融合されているもの。
  104. 請求項１０３の細胞であって、 前記リガンド結合ドメインがホルモン受容体であるもの。
  105. 請求項１０４の細胞であって、前記リコンビナーゼがＣｒｅ－ＥＲＴ２ポリペプチドであるもの。
  106. 請求項６２～１０５の任意の１つの細胞であって、前記Ｒｅｐ遺伝子がＲｅｐポリペプチドをコードするもの。
  107. 請求項６２～１０６の任意の１つの細胞であって、前記Ｃａｐ遺伝子がＣａｐポリペプチドをコードするもの。
  108. 請求項６２～１０７の任意の１つの細胞であって、前記Ｒｅｐ遺伝子および前記Ｃａｐ遺伝子の転写が、野生型のプロモーターにより駆動されるもの。
  109. 請求項１０８の細胞であって、前記野生型のプロモーターが、Ｐ５、Ｐ１９、およびＰ４０を含むもの。
  110. 請求項１０６～１０９の任意の１つの細胞であって、前記Ｒｅｐポリペプチドが、野生型のポリペプチドであるもの。
  111. 請求項１０６～１１０の任意の１つの細胞であって、前記Ｒｅｐポリペプチドが、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０を含むもの。
  112. 請求項１０６～１１１の任意の１つの細胞であって、Ｒｅｐ遺伝子の第一の部分配列およびエクソンから発現されたポリペプチドを含む欠失した複製随伴タンパク質が、リコンビナーゼの不在下で発現される能力を有するもの。
  113. 請求項１０７の細胞であって、前記Ｃａｐポリペプチドが野生型のリペプチドであるもの。
  114. 請求項１１３の細胞であって、前記ＣａｐポリペプチドがＡＡＶカプシドタンパク質であるもの。
  115. 請求項１１４の細胞であって、前記ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むもの。
  116. 請求項１１３または１１４の細胞であって、ＡＡＶカプシドタンパク質の血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６ならびにＡＡＶｈｕ６８より成る群から選ばれるもの。
  117. 請求項６２～１１６の任意の１つの細胞であって、選択可能なマーカーをコードする配列を更に含むもの。
  118. 請求項１１７の細胞であって、前記選択可能なマーカーが、哺乳類細胞選択要素であるもの。
  119. 請求項１１７または１１８の細胞であって、前記選択可能なマーカーが、栄養要求性選択要素であるもの。
  120. 請求項１１９の細胞であって、前記栄養要求性選択要素が活性タンパク質をコードするもの。
  121. 請求項１２０の細胞であって、前記活性なタンパク質がＤＨＦＲであるもの。
  122. 請求項１１７または１１８の細胞であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質であるもの。
  123. 請求項１２２の細胞であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、スプリットインテインであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、スプリットインテインであるもの。
  124. 請求項１２２の細胞であって、前記選択可能なマーカーが、抗生物質抵抗性タンパク質のＮ末端に結合した、ロイシンジッパーであるか、または抗生物質抵抗性タンパク質のＣ末端に結合した、ロイシンジッパーであるもの。
  125. 請求項１２２～１２４の任意の１つの細胞であって、前記抗生物質抵抗性タンパク質が、ピューロマイシン抵抗性であるか、またはブラストサイジン抵抗性であるもの。
  126. 請求項１～１２５の任意の１つの細胞であって、前記第一のポリヌクレオチド構成体が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：１～配列番号：３、配列番号６～配列番号：８、または配列番号：３２の任意の１つに対して含むもの。
  127. 請求項１～１２６の任意の１つの細胞であって、前記第二のポリヌクレオチド構成体が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：９～配列番号：１９、配列番号２３～配列番号：３２、または配列番号：３５の任意の１つに対して含むもの。
  128. 請求項１～１２７の任意の１つの細胞であって、前記第一のポリヌクレオチド構成体および前記第二のポリヌクレオチド構成体が、前記細胞のゲノムに安定的に統合されるもの。
  129. 請求項１～１２８の任意の１つの細胞であって、ペイロード構成体を更に含み、このペイロード構成体が、ペイロードをコードするポリヌクレオチドであるもの。
  130. 請求項１２９の細胞であって、前記ペイロード構成体が、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％の配列同一性を配列番号：３３に対して含むもの。
  131. 請求項１２９または１３０の細胞であって、前記ペイロード構成体が、ＩＴＲ配列の側面にあるペイロードの配列を含むもの。
  132. 請求項１３１の細胞であって、前記ペイロードの配列の発現が、構成的プロモーターにより駆動されるもの。
  133. 請求項１３２の細胞であって、前記構成的なプロモーターおよび前記ペイロードの配列が、ＩＴＲ配列の側面にあるもの。
  134. 請求項１３１～１３３の任意の１つの細胞であって、前記ペイロードの配列が、遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を含むもの。
  135. 請求項１３４の細胞であって、前記遺伝子が選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコードするもの。
  136. 請求項１３４または１３５の細胞であって、前記遺伝子が、治療的ポリペプチドまたは導入遺伝子をコードするもの。
  137. 請求項１３１～１３３の任意の１つの細胞であって、前記ペイロードの配列が、治療的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むもの。
  138. 請求項１３７の細胞であって、前記治療的ポリヌクレオチドが、ｔＲＮＡサプレッサーまたはガイドＲＮＡであるもの。
  139. 請求項１３８の細胞であって、前記ガイドＲＮＡが、タンパク質に結合する能力を有するポリリボヌクレオチドであるもの。
  140. 請求項１３９の細胞であって、前記タンパク質がヌクレアーゼであるもの。
  141. 請求項１３９または１４０の細胞であって、前記タンパク質がＣａｓタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＡＤＡＴタンパク質であるもの。
  142. 請求項１４１の細胞であって、前記Ｃａｓタンパク質が、触媒的に不活性なＣａｓタンパク質であるもの。
  143. 請求項１２９～１４２の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
  144. 請求項１２９～１４３の任意の１つの細胞であって、複数の前記ペイロード構成体が、前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
  145. 請求項１４４の細胞であって、複数の前記ペイロード構成体が、前記細胞のゲノム中に別々に安定的に統合されるもの。
  146. 請求項１２９～１４５の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、ＩＴＲの配列外で、選択可能なマーカーまたは検出可能なマーカーをコーディングする配列を更に含むもの。
  147. 請求項１２９～１４６の任意の１つの細胞であって、前記ペイロード構成体が、前記細胞のゲノム中に安定的に統合されるもの。
  148. 請求項１～１４７の任意の１つの細胞を増殖させることを含む安定な細胞株産生の方法。
  149. 請求項１～１４７の任意の１つの細胞を、第一の引き金を引く薬剤および第二の引き金を引く薬剤の存在下に、培養することを含む複数のｒＡＡＶウイルス粒子の産生法。
  150. 請求項１４９の方法であって、第一の引き金を引く薬剤がドキシサイクリンであり、および第二の引き金を引く薬剤がタモキシフェンであるもの。
  151. 請求項１４９または１５０の方法であって、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、精製前に、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上のカプシド被覆比率を有するもの。
  152. 請求項１４９または１５０の方法であって、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、精製前に、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、０．９５、０．９７または０．９９以上のＦ：Ｅ 比を有するもの。
  153. 請求項１４９または１５０の方法であって、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、精製前に、１×１０１１を越えるか、または５×１０１１、１×１０１２、５×１０１２、１×１０１３または１×１０１４以上のウイルスゲノム／ｍＬの濃度を有するもの。
  154. 請求項１４９または１５０の方法であって、前記複数のｒＡＡＶウイルス粒子が、１×１０５ ｖｇ／標的細胞またはそれ未満のＭＯＩにおいて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％以上の感染性を有するもの。
  155. 請求項１４９～１５４の任意の１つの方法であって、前記培養が、バイオリアクター中であるもの。
  156. 請求項１～１４７の任意の１つの細胞、または請求項１４９～１５５の任意の１つの方法により産生されたｒＡＡＶウイルス粒子を含む薬学的組成物および薬学的に許容される担体。
  157. 病態または疾患を治療する方法であって、請求項１５６の任意の１つの薬学的組成物の治療的に有効な 量を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
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