JP2023534513A - カルミン酸を得るための方法 - Google Patents
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Abstract
食品、化粧品、医薬品及び繊維製品の染料産業において使用される昆虫であるＤａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ Ｃｏｓｔａ（コチニールカイガラムシ）についての血リンパの細胞を用いることによる、新規で、代替手段となり、低コストな、カルミン酸のｉｎ ｖｉｔｒｏでの生成のための合成方法である。【選択図】なし
Description
本発明は、特に、食品産業、化粧品産業、医薬品産業及び繊維産業において広い用途を有する染料産業で使用するためのカルミン酸（carminic acid：ＣＡ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための、新規で、代替手段となり、低コストな方法に関するものである。
長年にわたり、先行技術において、温室、小屋及び／又は露天のシステムを使用して、約８０～９０日の周期内で、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ Ｃｏｓｔａ（コチニールカイガラムシ）の昆虫について、植え付け（sowing）、成長及び収集を含む従来の生成プロセスがある。この生成には、植物と昆虫とが対になることが必要である。コチニールカイガラムシの昆虫から抽出されたカルミン酸は、化粧品（特に口紅）における赤色及び／又は深紅色の色素として使用されることが知られており、食品産業において食品に赤色を付与する食品添加物Ｅ－１２０として使用されることが知られているが、次第に、より安価な合成染料に取って代わられてきている。広く使用されている代用品は、番号Ｅ－１２４のコチニールレッドＡである。ヨーロッパにおいて土着の昆虫から得られるカルミン酸は、少なくとも鉄器時代から使用されており、例えば、ハルシュタット文化の墓所内で形跡が発見されている。
当技術分野で知られている以下のプロセスは、いずれも、カルミン酸を抽出するために、コチニールカイガラムシを準備し、原料を乾燥させ、機械的に分離し、粉砕、脂肪及びワックスを抽出するという、基本的な段階が同じである。それらは、脂肪及びワックスの抽出において異なっている。次の段階であるカルミン酸の抽出では、続けて、析出、沈殿、濾過及びカルミンの乾燥がされる。
カルミン酸を大量に生成するための幾つかの最先端の解決策が、以下の文献に開示されている。
Miguel Gonzalez Gonzalez et al, Scientific Note Rev. Fitotec. Mex. Vol. 25 (2): 209-212, 2002, “In vitro CULTURE OF EMBRYONIC CELLS OF COCHINEAL (Dactylopius coccus Costa) AT DIFFERENT pH VALUES"では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでコチニール（Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ Ｃｏｓｔａ）細胞の培養物が最大の酸生成を記録した最適ｐＨの決定を評価し、ここでは、昆虫細胞株を培養するためのシュナイダー栄養培地において樹立されたコチニール胚のふやけさせた細胞について、幾つかのｐＨレベル（４．５、５．０、５．５、６．０及び６．５）並びに遠心分離（０、２、５及び１０分）画分が評価された。各試料に存在するカルミン酸の含有量は、高速液体クロマトグラフィーにより測定した。色素は、２ＭのＨＣｌ溶液を使用して試料から抽出された。色素の検出限界は、１．０ｍｇ Ｌ－１から１２０．０ｍｇ Ｌ－１であった。カルミン酸の含有量又は細胞株数に関してｐＨの有意な効果は観察されなかったが、中間のｐＨ（５．５）がより良い結果を与える傾向があった。しかし、同文献の結論は、ｐＨ４．５から６．５を有する培地がｉｎ ｖｉｔｒｏでのコチニール細胞培養に適しているが、中間のｐＨ値はカルミン含有量及び細胞株数において良好な傾向があることを示唆している。２分及び５分の遠心分離時間が、Ｄ．ｃｏｃｃｕｓ胚細胞株を樹立するために最も適していた。二次培養におけるカルミン生成量は、少なかった。したがって、培地について他の変数、主に栄養培地について浸透圧及び構成成分を、評価することが提案されている。
ＵＳ８，９１９，２８１ Ｂ２（2013, Means to culture cochineal insects in an artificial medium, Hendrickson, Constance M. Merkle, Denise Lynn）では、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ属の昆虫を養殖するプロセスであって、（ａ）Оｐｕｎｔｉａ属のサボテンから得られるサボテン添加剤、（ｂ）多糖類及び（ｃ）グルコースを含む混合物を加熱することと、加熱された混合物を三次元マトリックスと組み合わせることと、組み合わされた混合物及びマトリックスを冷却して硬化した培地を形成させることと、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ属からなる群より選択された種を硬化した培地に接種することと、を含むプロセスに言及している。
その一部について、MX 295682、ARIGEN PHARMACEUTICALS, INC, LYMPHOKINE-ACTIVATED KILLER CELL PROLIFERATION METHOD, Watarai, Shinobu; Nishikawa, Shigeruでは、非ヒト動物へ適用可能であってもよい程に低コストで行うことができる、がん関連細胞の増殖／活性化プロセスに言及している。この出願の細胞の増殖／活性化プロセスは、細胞培養の間に、少なくとも５～１５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡと、インターロイキン２様活性を有する成長因子と、を培地へ補充するステップを含み、したがって、このプロセスは優先的にαβ細胞を増殖／活性化させることができる。
しかし、これらの解決策が提供されたにも関わらず、カルミン酸の生成時間を削減して即時収集を可能にし、並びに、運転及び人的資源についてコスト削減を可能にする、効果的な解決策が、当技術分野において依然として必要である。
本発明は、次の構造のカルミン酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための新規かつ独創的な方法を提供することにより、この問題を解決する。
本発明は、特に、カルミン酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成するための方法に関するものであり、この方法は、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ Ｃｏｓｔａ（コチニールカイガラムシ）昆虫の卵を満たした成虫雌から得られた血球細胞株の分離、精製及び維持に基づいて、培養により初代培養物を生じさせ（段階Ｉ）、その後、分裂促進因子の混合物を用いて血球を刺激する。
有利には、本発明の新規な方法によるカルミン酸の生成は、使用する昆虫の数の削減と現在約１２～１４日の間と推定される生成及び収集の時間削減との両方を提供し、並びに、運転及び人的資源のコスト削減、小さなスペース内で大量に生成すること、大量投入する処理が必要ない実験室条件中で細胞を用いる管理、原料の削減（宿主植物の排除）、乾燥プロセス（時間及び材料）を必要としない直接に可溶性の形での収集、将来的に昆虫の数が不足した場合に永続用の生成細胞株を凍結保存すること、害虫及び天敵のいない生成、従来のプロセスでは約１キログラムのカルミン酸を生成するために約３５０，０００匹から約４００，０００匹のＤａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ Ｃｏｓｔａ（コチニールカイガラムシ）昆虫を犠牲にする必要があったことに対して同じ量を生成するために約１０～１５匹のより少量の昆虫を使用すること、を提供する。有利には、生成コストが従来のプロセスを使用するコストよりも約５０％低く、さらに、生成ユニットを複製することにより規模を大きくすることができる方法を提供する。
本発明によれば、実験室条件下及び１，０００ｍｌ容器内での生成において、再現性のある一定のＣＡ生成の収集物を得るために、純粋なＣＡ生成細胞株を分離し、抽出し、維持し、並びに、刺激剤が培養物へ投与される前に反復され得る再現可能な一定の方法において、汚染物のない細胞株を維持するための方法論が提供される。
本発明について、特定の特徴及び利点並びにその他の目的は、添付の図に関連してなされる次の説明から、明らかとなる。
図２は、パーコール勾配（分離段階（separation phases））と、最後の二本のチューブの表面に黒い上清としてカルバミン酸（細胞の生成物）が形成されていることと、の結果を示している。
図５は、接種後９６時間の顆粒細胞についての顕微鏡観察を示す。
図１２は、培養中の１０日目の顆粒細胞についての顕微鏡写真である。
図１４は、灌流の間に得られたタンパク質についての完全性を示す。
本発明を、よりよく理解できるように、次の定義を提供する。
用語「おおよそ（approximate）／約（approximately）」の使用は、ある程度の追加範囲を提供する。この用語は、次のように定義される。この用語により提供される追加範囲は、約±１０％である。非限定的な例として、「約４０グラム（approximately 40 grams）」と書かれている場合、範囲は、標準偏差±１０％の間であり、他の測定値についても同様である。
本発明によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのカルミン酸の生成には、次の一般的なプロセスにおいて、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ Ｃｏｓｔａ（コチニールカイガラムシ）昆虫の卵を満たした成虫雌から得られた血球の細胞株を、抽出、分離、精製及び維持することが含まれる。
［血リンパからの血球の抽出］
塩基、イオン性塩、キレート剤及び有機酸を含む抗凝血性緩衝液を使用して、特に、カルミン酸（ＣＡ）を生成する細胞を含む赤い色素溶液が得られるまで、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓの卵を満たした系統（egg-filled pregnant strains）の血体腔を灌流することにより、血球が得られる。
塩基、イオン性塩、キレート剤及び有機酸を含む抗凝血性緩衝液を使用して、特に、カルミン酸（ＣＡ）を生成する細胞を含む赤い色素溶液が得られるまで、Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓの卵を満たした系統（egg-filled pregnant strains）の血体腔を灌流することにより、血球が得られる。
本発明の一実施形態において、抗凝血性緩衝液には、ＮａＯＨ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ及びクエン酸が含まれている。
得られた色素溶液を、滅菌容器内で沈殿させ、遠心分離する。
上清を回収する。
一方、リン酸緩衝生理食塩水を用いて、不連続なパーコール勾配を調製する。
遠心分離により、不連続なパーコール勾配をプレラン（pre-run）させる。
プレラン（pre-run）が終わったら、得られた色素溶液を加える。
遠心分離によるラン（run）を行い、識別した細胞を得る（表２）。
このラン（run）の終わりに、培養物を生じさせるために使用することとなる、血リンパの細胞が得られる。
この細胞を回収し、適応させるために、昆虫細胞株を培養するための成長培地を用いてプレーティングする。
得られた色素溶液を、滅菌容器内で沈殿させ、遠心分離する。
上清を回収する。
一方、リン酸緩衝生理食塩水を用いて、不連続なパーコール勾配を調製する。
遠心分離により、不連続なパーコール勾配をプレラン（pre-run）させる。
プレラン（pre-run）が終わったら、得られた色素溶液を加える。
遠心分離によるラン（run）を行い、識別した細胞を得る（表２）。
このラン（run）の終わりに、培養物を生じさせるために使用することとなる、血リンパの細胞が得られる。
この細胞を回収し、適応させるために、昆虫細胞株を培養するための成長培地を用いてプレーティングする。
［細胞株の選択及び初代培養物の取得］
顕微鏡下で、分化した細胞を示す培養物を、確認し、評価し及び選択する。
顆粒細胞及び血球を選択する。
選択した細胞を、適応させるために、昆虫細胞株を培養するための成長培地を用いてプレーティングする。
最後に、細胞表現型の完全性に従って、それらを検査及び評価する。
顕微鏡下で、分化した細胞を示す培養物を、確認し、評価し及び選択する。
顆粒細胞及び血球を選択する。
選択した細胞を、適応させるために、昆虫細胞株を培養するための成長培地を用いてプレーティングする。
最後に、細胞表現型の完全性に従って、それらを検査及び評価する。
［細胞株の刺激及び活性化］
各々の培養細胞に、リン酸緩衝生理食塩水中の分裂促進因子の組合せを加えて、有糸分裂を促進させる。
培養物を、徐々に赤くなるまでインキュベートし、分裂促進因子に起因する細胞分裂を観察する。
集団密度の増加を示す培養物を選択して、容器内で増殖させ、極低温（cryogenic）保存の準備をしておくことを推奨する。
各々の培養細胞に、リン酸緩衝生理食塩水中の分裂促進因子の組合せを加えて、有糸分裂を促進させる。
培養物を、徐々に赤くなるまでインキュベートし、分裂促進因子に起因する細胞分裂を観察する。
集団密度の増加を示す培養物を選択して、容器内で増殖させ、極低温（cryogenic）保存の準備をしておくことを推奨する。
［容器内での増殖及び生成］
選択した細胞を、適応させるために、昆虫細胞株を培養するための成長培地を用いてプレーティングする。
容器を、約１０～１４日間培養する（初代株）。この間に、細胞は、容器に付着した細胞のコンフルエントな単層を形成し、培地は、色の生成についてのポジティブなサインとして赤色に変化する。
容器を毎日確認し、有糸分裂があることを評価及び確認する。
周期の終わりに、培養物を収集し、各々の培養容器から色を搾り取る又は収集する。
この「搾り取り（milking）」又は「収集（harvest）」を、殺菌された雰囲気中で行い、細胞残屑の除去及びこの場合の「色素（The pigment）」（カルミン酸）である上清のみを回収する目的で、容器内で各々の収集物を遠心分離させる。
選択した細胞を、適応させるために、昆虫細胞株を培養するための成長培地を用いてプレーティングする。
容器を、約１０～１４日間培養する（初代株）。この間に、細胞は、容器に付着した細胞のコンフルエントな単層を形成し、培地は、色の生成についてのポジティブなサインとして赤色に変化する。
容器を毎日確認し、有糸分裂があることを評価及び確認する。
周期の終わりに、培養物を収集し、各々の培養容器から色を搾り取る又は収集する。
この「搾り取り（milking）」又は「収集（harvest）」を、殺菌された雰囲気中で行い、細胞残屑の除去及びこの場合の「色素（The pigment）」（カルミン酸）である上清のみを回収する目的で、容器内で各々の収集物を遠心分離させる。
本発明の目的のために、上述したプロセスのステップを、詳細に提示する。
［血リンパからの血球の抽出］
まず、卵を満たした系統（egg-filled pregnant strains）のＤａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓについて少なくとも約２０～約９５ｍｇ、好ましくは卵を満たしたこの昆虫について約３０～約８５ｍｇから、Graham et al., 1986により文献に報告された抗凝血性緩衝液を用いて、この系統の血体腔を灌流することにより、血リンパを得る。この抗凝血性緩衝液は、約０．２５ｍＭから約０．７５ｍＭの範囲（好ましくは約０．６１ｍＭ）のＮａＯＨと、約０．１５Ｍから約０．５０Ｍの範囲（好ましくは約０．５６Ｍ）のＮａＣｌと、約０．１０ｍＭから約０．２５ｍＭの範囲（好ましくは約０．１６ｍＭ）のＥＤＴＡと、約１００ｍＭから約２５０ｍＭの範囲（好ましくは約１００ｍＭ）のクエン酸と、で構成されており、後の表１において見られるように、おおよそのｐＨが４．５～６．５の範囲内である。得られる溶液は、カルミン酸（ＣＡ）を生成する細胞と、血リンパの他の細胞変種（血球）と、が懸濁された赤い色素溶液である。
まず、卵を満たした系統（egg-filled pregnant strains）のＤａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓについて少なくとも約２０～約９５ｍｇ、好ましくは卵を満たしたこの昆虫について約３０～約８５ｍｇから、Graham et al., 1986により文献に報告された抗凝血性緩衝液を用いて、この系統の血体腔を灌流することにより、血リンパを得る。この抗凝血性緩衝液は、約０．２５ｍＭから約０．７５ｍＭの範囲（好ましくは約０．６１ｍＭ）のＮａＯＨと、約０．１５Ｍから約０．５０Ｍの範囲（好ましくは約０．５６Ｍ）のＮａＣｌと、約０．１０ｍＭから約０．２５ｍＭの範囲（好ましくは約０．１６ｍＭ）のＥＤＴＡと、約１００ｍＭから約２５０ｍＭの範囲（好ましくは約１００ｍＭ）のクエン酸と、で構成されており、後の表１において見られるように、おおよそのｐＨが４．５～６．５の範囲内である。得られる溶液は、カルミン酸（ＣＡ）を生成する細胞と、血リンパの他の細胞変種（血球）と、が懸濁された赤い色素溶液である。
得られた色素溶液を、滅菌容器内に沈殿させ、好ましくは本発明の目的用のポリプロピレン製滅菌コニカルチューブ内に沈殿させ、１分あたり約５００～１，２００回転（revolution per minute：ｒｐｍ）の範囲、好ましくは約６００～１，０００ｒｐｍの範囲で、約８～１７分、好ましくは約１０～１５分、約２～５℃の範囲で、好ましくは約４℃で、遠心分離させる。
上清を、滅菌容器内に回収し、好ましくは本発明の目的用のポリプロピレン製滅菌コニカルチューブ内に回収し、室温の状態に保つ。
さらに、後の表２と図面の項目中の図１０とにおいて見ることができるように、不連続なパーコール勾配（約１０～９０％範囲、好ましくは約２０～８０％範囲）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ約４．５～５．２の範囲の、好ましくはｐＨ約５．５の、１×ＰＢＳ）を用いて調製する。
この勾配を、少なくとも約４，０００～５，５００ｒｐｍの範囲で、好ましくは約４，５００～５，０００ｒｐｍの範囲で、約１２から２２分、好ましくは約１５から２０分、遠心分離することによりプレラン（pre-run）させる。
得られた色素溶液を、プレラン（pre-run）が終わった後に、約９５～５５０μｌの範囲内（好ましくは約１００～５００μｌの範囲内）の量で加える。
１分あたり約１，０００回転（ｒｐｍ）で、約１０分から約２０分、好ましくは約１５分、室温で遠心分離して、再び複写された下記の表２からと図面の項目中の図１０とにおいて見ることができるように、次の結果が得られる。
遠心分離のラン（run）の終わりに、幾つかの相が得られ、パーコールと染料（色素）との間の境界面には、精製された血リンパの細胞が含まれ、この細胞は初代培養物を生じさせる（段階Ｉ）ために使用されることとなる。
細胞を回収してプレーティングする。好ましいが非限定的なプロセスでは、約１００μｌから約５００μｌの、好ましくは約２５０μｌの、昆虫細胞を培養するための培地、好ましくは市販のシュナイダー培地を用いて、１６ウェルのマルチウェルプレート内にプレーティングし、約２０～３０時間、好ましくは約２４～２６時間にわたり、約２０～２８℃の範囲内、好ましくは２２～２６℃の範囲で適応させる。
［細胞株の選択及び初代培養物の取得］
培養後の約２４時間に、顕微鏡下で、より良い細胞の完全性と表現型とを示す培養物を、検査し、評価し及び選択する。
培養後の約２４時間に、顕微鏡下で、より良い細胞の完全性と表現型とを示す培養物を、検査し、評価し及び選択する。
細胞の変種「若い顆粒細胞」と変種「若い未分化の血球」とを選択する（候補の選択）。
これら２つの変種を選択して、プレート内へと再びプレーティングする。好ましいが非限定的なプロセスでは、適応させるために、約１００μｌから約５００μｌ、好ましくは約２５０μｌの、昆虫細胞株を培養するための培地、好ましくは市販のシュナイダー培地を用いて、１６ウェルマルチプレート内へと再びプレーティングし、約２０時間にわたり、約２０～２８℃の範囲内、好ましくは約２２～２６℃の温度で適応させる。
最後に、約２４時間後に、細胞の完全性と表現型の維持とに従ってそれらを検査して評価する。
［細胞株の刺激及び活性化］
培養中の細胞を含む各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（約４．８～５．２の間のｐＨ（好ましくはｐＨ約５．０）の１×ＰＢＳ）中における分裂促進因子の組み合わせ（約０．２０～０．３０マイクロモルの範囲（好ましくは約０．２５マイクロモル）のコンカナバリンＡ、及び、約０．４０～０．６０マイクロモルの範囲（好ましくは約０．５０マイクロモル）のフィトヘムアグルチニン）を加えて、若い顆粒細胞において有糸分裂を促進させる。
培養中の細胞を含む各ウェルに、リン酸緩衝生理食塩水（約４．８～５．２の間のｐＨ（好ましくはｐＨ約５．０）の１×ＰＢＳ）中における分裂促進因子の組み合わせ（約０．２０～０．３０マイクロモルの範囲（好ましくは約０．２５マイクロモル）のコンカナバリンＡ、及び、約０．４０～０．６０マイクロモルの範囲（好ましくは約０．５０マイクロモル）のフィトヘムアグルチニン）を加えて、若い顆粒細胞において有糸分裂を促進させる。
培養物を、約２０～２８℃の温度範囲、好ましくは約２２～２６℃の温度範囲で、約２０～５０時間、好ましくは約２４～４８時間にわたり培養して、それらは徐々に赤色に変化し、細胞では分裂促進因子に起因する細胞分裂が観察される。
集団密度において増加を示す培養物を選択し、容器内での増殖及び生成の段階へ持っていく。
容器での増殖の段階において、液体窒素タンク内（約－１６０～－１８０℃の間の範囲内、好ましくは約－１７０℃）で約２～３ヵ月間保存するために、極低温（cryogenic）保存の準備をすることを推奨する。
［容器内での増殖及び生成］
プレーティングした細胞を、昆虫細胞株を増殖させるための培地を用いて、容器内で培養する。本発明の目的のためには、約２００～３００ｃｍ２の範囲内の表面積を有する平底容器が好ましく、さらに好ましくは約２２５ｃｍ２の表面積を有する容器である。このために、例として、約２００μｌのプレーティングした培養物を用いて、約２００～３５０μｌの範囲内、さらに好ましくは約２５０～３００μｌの範囲内の、昆虫細胞株を培養するための培地、好ましくはシュナイダー培地に接種する。
プレーティングした細胞を、昆虫細胞株を増殖させるための培地を用いて、容器内で培養する。本発明の目的のためには、約２００～３００ｃｍ２の範囲内の表面積を有する平底容器が好ましく、さらに好ましくは約２２５ｃｍ２の表面積を有する容器である。このために、例として、約２００μｌのプレーティングした培養物を用いて、約２００～３５０μｌの範囲内、さらに好ましくは約２５０～３００μｌの範囲内の、昆虫細胞株を培養するための培地、好ましくはシュナイダー培地に接種する。
この容器を、約２０～２８℃の範囲、好ましくは約２２～２６℃の範囲で、約１０～１４日間、好ましくは約１２～１３日間、培養する（初代株）。この期間中に、容器に付着した細胞はコンフルエントな単層を形成し、培地は色の生成を示すポジティブなサインとして赤色に変化する。
容器を約２４時間ごとに確認し、細胞株に有糸分裂があることを評価し確認する。
周期の終わりに、培養物を収集し、色を、各々の培養容器から搾り取る又は収集する。
この「搾り取り（milking）」又は「収集（harvest）」を、衛生的にした環境中で行い、各々の収集物を容器内で遠心分離する。本発明の目的のために、細胞残屑を除去して、この場合における「色素」（カルミン酸）である上清のみを回収する目的のためには、容量において約４０～６０ｍｌの最大容量、さらに好ましくは約５０ｍｌの最大容量を有するコニカルチューブが好ましく、約３，５００～５，５００ｒｐｍ、好ましくは４，０００～５，０００ｒｐｍの速度範囲で、約１８～２２分、好ましくは約２０分にわたり遠心分離する。
従来のカルミン酸の生成プロセスを用いる先行技術では、約１ｋｇのカルミン酸（ＣＡ）を生成するために数千匹の昆虫が必要であり、さらに、高品質な宿主の植物が必要であり、それはこれらの場合、Ｏｐｕｎｔｉａ ｆｉｃｕｓ－ｉｎｄｉｃａサボテン植物であり、常に交換又は栽培しなければならない（コスト）、並びに、茎の予防と予防的植物検疫制御（prophylactic phytosanitary control）とが必要であり、常に栽培の手がかかるために人的資源の使用を示唆することが開示されていることが重要である。収集のためには、昆虫を成長させ、成虫期に達して収集するために、８０～９０日の成長周期を必要としている。さらに、ＣＡ生成のためには、収集後の乾燥プロセスが必要であり、その際に自然な生成量の低減があり、それは約３：１（生きている昆虫：乾燥させた昆虫）の割合であり、害虫及び捕食者の存在により生成量が減少する時期がある。上記のすべてに起因して生成コストが高く、ＣＡを大量に生成する国により国際価格が独占されており、それが唯一の生成の形態であるために、また、生成量の多い国では生物地理的条件により年間に大量に生成可能であるために、その価格が恣意的に設定されている。そのため、魅力ある量のＣＡを生成するには、広い生産地域が必要とされている。
本発明の幾つかの実施形態において、容器内での増殖及びカルミン酸生成は、例えば、平底の培養瓶内、Ｒｏｕｘフラスコ内、ベンチトップ型バイオリアクター内、特殊バイオリアクター内、工業用バイオリアクター内、生物若しくは微生物を含む又は前記生物及び／若しくは微生物に由来する生化学的活性物質を含む化学プロセスが実施される容器内、並びに／又は、本発明において説明されたもののように増殖反応をさせることが可能な他の適切な容器内若しくは装置内、等の容器内で行われてもよいが、これらに限定されるものでない。
実施例１．生体培養物からのＣＡを識別するための吸収スペクトル
ＰＶＤＦメンブレン（０．２ｍｍ）／３０分加熱（５５℃）を用いて、ろ過を行った。
結果３を用いてＣＡの％を求める例
式： ％ＣＡ＝０．５２０８／０．１３９×０．１ｇ＝３７．４６％
結果３を用いてＣＡの％を求める例
式： ％ＣＡ＝０．５２０８／０．１３９×０．１ｇ＝３７．４６％
実施例２．精製された生体培養物からのＣＡを識別するための吸収スペクトル
ＣＡの％を求める例
式： ％ＣＡ＝０．５５６２／０．１３９×０．０５ｇ＝８０．０２％
式： ％ＣＡ＝０．５５６２／０．１３９×０．０５ｇ＝８０．０２％
本発明について前述の実施形態は、その理解を向上させる目的のための説明及び例により、ある程度は詳細に説明されているが、この説明及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるものではなく、主旨及びその範囲内に含まれる幾つかの変形を解説するものである。この内容において平均的な知識を有する者に明らかなように、本発明の主旨から逸脱しない変形又は修正はその範囲内にある。本明細書に引用された科学文献の記述は、参照により明示的に組み込まれる。
Claims (15)
- Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ（コチニールカイガラムシ）属の昆虫からカルミン酸を生成するための方法であって、
カルミン酸生成細胞を含む溶液を得るまで、前記昆虫から血リンパの血球を抽出するステップと、
パーコール勾配液をプレランするステップと、
前記カルミン酸生成細胞を含む前記溶液を、プレランした前記パーコール勾配液へ加えて、血球を含む混合物を得るステップと、
前記混合物から前記血球を精製するステップと、
精製された前記血球を回収するステップと、
精製された前記血球を、昆虫細胞株を培養するための培地を用いて培養するステップと、
前記昆虫細胞株を刺激し活性化させるステップと、
カルミン酸を生成する前記昆虫細胞株を増殖させるステップと、を含む方法。 - 血リンパの血球を抽出するステップは、塩基、イオン性塩、キレート剤及び有機酸を含む抗凝血性緩衝液を用いて血体腔を灌流することにより行われ、
前記パーコール勾配液は、リン酸緩衝生理食塩水を用いて調製され、
前記パーコール勾配をプレランするステップは遠心分離により行われ、
前記混合物から前記血球を精製するステップは遠心分離により行われる、請求項１に記載された方法。 - 前記細胞株を刺激し活性化するステップの前に、若い顆粒細胞及び血球を選択して、該選択された細胞を、昆虫細胞株を培養するための培地を用いて培養するステップを含む、請求項１に記載された方法。
- 前記細胞株を刺激し活性化させるステップは、
リン酸緩衝食塩水中に分裂促進因子の組み合わせを加えるステップと、
加えられた分裂促進因子の組み合わせと共に前記細胞株をインキュベートして培養物を生じさせるステップと、
インキュベートの後に、集団密度の増加を示す前記培養物を選択するステップと、を含む請求項１に記載された方法。 - 前記昆虫細胞株を増殖させるステップ及びカルミン酸を生成するステップは、
昆虫細胞株を成長させるための培地を有する容器内で、集団密度の増加を示す前記培養物から選択された前記細胞を培養するステップと、
前記培養物を収集して、生成された前記カルミン酸（色）を収集するステップと、を含む請求項４に記載された方法。 - 前記パーコール勾配が約１０～９０％である、請求項１に記載された方法。
- 前記培養は、約２０～２８℃の範囲内の温度で約２０～５０時間行われる、請求項４に記載された方法。
- 集団密度の増加を示す前記培養物が、液体窒素と共に極低温段階中で保存される、請求項４に記載された方法。
- 前記極低温段階が、約－１６０℃から－１８０℃の間の範囲内の温度で約２～３ヵ月行われる、請求項８に記載された方法。
- 前記血リンパから血球を抽出するステップは、卵を満たした系統のＤａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ（コチニールカイガラムシ）の前記昆虫を約２０ｍｇから約９５ｍｇ含む、請求項１に記載された方法。
- 前記抗凝血性緩衝液は、０．２５ｍＭから約０．７５ｍＭのＮａＯＨ、約０．１５Ｍから約０．５０Ｍの範囲のＮａＣｌ、約０．１０ｍＭから約０．２５ｍＭの範囲のＥＤＴＡ、約１００ｍＭから約２５０ｍＭの範囲のクエン酸、を含み、ｐＨがおおよそ４．５～６．５の範囲内である、請求項２に記載された方法。
- 前記抗凝血性緩衝液は、好ましくは、０．６１ｍＭのＮａＯＨ、０．５６ＭのＮａＣｌ、０．１６ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのクエン酸、を含み、ｐＨがおおよそ４．５～６．５の範囲内である、請求項１１に記載された方法。
- 昆虫細胞株の前記培地は、シュナイダー培地である、請求項３に記載された方法。
- 前記分裂促進因子は、約０．２０～０．３０マイクロモルの範囲のコンカナバリンＡ、及び、約０．４０～０．６０マイクロモルの範囲のフィトヘムアグルチニンである、請求項４に記載された方法。
- 請求項１に記載された方法に従って生成された、次の構造を含むことを特徴するカルミン酸。
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