JP2023532645A - 免疫原性が減少した新規な移植用細胞 - Google Patents

Abstract

本発明は、哺乳類細胞の免疫原性阻害用組成物およびこれを用いた低免疫原性哺乳類細胞の製造方法に関する。本発明は、幹細胞や免疫細胞など疾患の治療目的で同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）する細胞において、レシピエントの体内で免疫拒絶反応が最小化されながらも長期間活性が維持される効率的な細胞治療剤として有用に利用できる。【選択図】 図１２

Description

本発明は、効率的な同種移植のために遺伝子編集を用いて免疫原性が抑制された新規な細胞治療剤に関する。

ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）は血球細胞の約１０％程度を占め、免疫反応に重要な役割を果たすリンパ球系細胞である。ＮＫ細胞は様々な機能を行うが、特に癌細胞や外因性病原菌に感染した細胞を死滅させる能力を有し、病変化されうる異常細胞を除去する役割を果たす。

体内に存在する大部分のＮＫ細胞は正常状態で不活性化状態（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｔａｔｅ）で存在するが、これを治療用途に用いるためには、活性化されたＮＫ細胞が必要なため、正常血液または患者の血液からＮＫ細胞を活性化させる研究が活発に進められている。体外でＮＫ細胞を活性化させる場合、ＮＫ細胞は高い細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示して、免疫細胞治療に適用できることが確認された。体外で活性化されたＮＫ細胞を多様な癌、特に白血病などの血液癌患者を対象に同種骨髄移植後に投与してその治療効果が確認されたりもした（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＆Ｄｉｓｅａｓｅ，３３：ｐ２６１－２６６，２００４）。

一方、現在、ＮＫ細胞を用いた抗癌免疫治療の場合、ＮＫ細胞の抑制受容体に焦点が合わされている。すなわち、ＮＫ細胞の活性を抑制する抑制受容体（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の機能を遮断することにより、ＮＫ細胞の活性を増進させようとするのである。このために、レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）のＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）と一致しないドナーの同種ナチュラルキラー細胞（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＮＫ ｃｅｌｌ）を用いるか、抑制受容体の機能を抗体で遮断する方法が主に使用されている。同種ＮＫ細胞はドナーとレシピエントのＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉ遺伝型が異なるため、ドナーＮＫ細胞の抑制受容体（ＫＩＲなど）がレシピエントＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉを認識できないことで活性が抑制されない。したがって、同種ＮＫ細胞の場合、癌細胞に依然として存在しうるＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉによる活性の抑制に自由であって、そうでない患者自らのＮＫ細胞よりも効果的な抗癌活性を示すと予想することができる。実際に同種ＮＫ細胞が抗癌治療に多くのメリットを有することは、そもそも血液癌患者の治療に同種造血幹細胞移植（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＨＳＣＴ）が効果的という事実から知られるようになった。さらなる研究により、このような同種造血幹細胞移植において移植片対白血病（ｇｒａｆｔｖｅｒｓｕｓ－ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＧＶＬ）反応の多くの部分がＮＫ細胞によるものであることが知られた。これに基づいて、実際に健康なドナーの純粋分離された同種ＮＫ細胞を体外で大量に培養し、活性化させて、癌患者に投与する多くの試みが行われており、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ、ＭＭ）などで効果的な抗癌活性を示した。しかし、ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉが完全に不一致の同種造血幹細胞移植の場合、患者によって、期待していた抗癌活性が現れない場合が多く、これとともに、「ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ」に含まれた免疫抑制剤による感染など深刻な副作用が報告された。さらに、ＮＫ細胞の場合、最近の研究により、ＮＫ細胞の分化時、十分な抗癌活性の獲得に抑制受容体と標的細胞ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉとの相互作用（「ｅｄｕｃａｔｉｏｎ」あるいは「ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ」過程）が必要であることが知られるようになった。したがって、十分な抗癌活性を有する成熟したＮＫ細胞を得るためには、ドナーとレシピエントのＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉがある程度一致しなければならないことが予想されている。したがって、このような影響により、現在様々なＭＨＣ Ｃｌａｓｓ Ｉのうちの１つが一致する半分一致（ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）造血幹細胞移植とＮＫ細胞を血液癌の治療に多く試みており、それによる臨床的予後が相対的に優れるという事実が確認されている。また、同種免疫細胞を細胞治療剤として用いる場合、レシピエント自らの細胞を攻撃する移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ、ＧＶＨＤ）などの副作用の発生が避けられないのに対し、同種ＮＫ細胞の場合、そのような問題点がほとんど報告されていない。これは、癌細胞とは異なり、正常細胞はＮＫ細胞の活性化受容体に対するリガンドをほとんど発現せずＮＫ細胞の活性化を誘導しないと理解されている。現在、同種ＮＫ細胞を血液癌以外に他の固形癌にも細胞治療剤として使用しようとする研究が活発に試みられている（Ｋｉｍ，ＨＳ，Ｈａｎｙａｎｇ Ｍｅｄ Ｒｅｖ，３３：５９－６４，２０１３）。

同種ＮＫ細胞移植によるもう一つの問題は、移植されたＮＫ細胞がレシピエントにおいて長い間持続しないという点である。これを克服するために、移植後にＮＫ細胞の増殖を誘導可能なサイトカインＩＬ－２を周期的に入れる方法が試みられた。しかし、ＩＬ－２は、ＮＫ細胞以外にも、抗癌免疫反応を抑制する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増幅しかねないため、大きな問題点になりうる（Ｒｏｍａｇｎｅ Ｆ，Ｖｉｖｉｅｒ Ｅ．，Ｆ１０００ Ｍｅｄ Ｒｅｐ，３：９，２０１１；Ｗａｌｄｍａｎｎ ＴＡ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：５９５－６０１，２００６）。

本明細書全体にわたって多数の論文および特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文および特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照により組み込まれて、本発明の属する技術分野における水準および本発明の内容がより明確に説明される。

本発明者らは、患者の体内で免疫拒絶反応が最小化されながらも長期間活性が維持される効率的な細胞治療剤を開発するために、鋭意研究努力した。その結果、免疫原性誘発因子の一つであるＩＩ型ＨＬＡ遺伝者またはその活性化タンパク質、具体的には、ＣＩＩＴＡの特定部分と、Ｂ２Ｍ遺伝子の特定部分をターゲッティングする遺伝子編集手段を治療用細胞に導入する場合、免疫原性抑制効率が極大化されて優れた同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）用細胞治療剤として利用できることを見出すことにより、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、哺乳類細胞の免疫原性阻害用組成物およびこれを用いて製造された低免疫原性哺乳類細胞を提供することである。

本発明の他の目的は、低免疫原性哺乳類細胞の製造方法を提供することである。

本発明の他の目的および利点は下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲および図面によってより明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、ＩＩ型ＨＬＡタンパク質の発現を抑制する核酸分子を有効成分として含む哺乳類細胞の免疫原性阻害用組成物を提供する。

本発明者らは、患者の体内で免疫拒絶反応が最小化されながらも長期間活性が維持される効率的な細胞治療剤を開発するために、鋭意研究努力した。その結果、免疫原性誘発因子の一つであるＩＩ型ＨＬＡ遺伝者またはその活性化タンパク質、具体的には、ＣＩＩＴＡの特定部分と、Ｂ２Ｍ遺伝子の特定部分をターゲッティングする遺伝子編集手段を治療用細胞に導入する場合、免疫原性抑制効率が極大化されて優れた同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）用細胞治療剤として利用できることを見出した。

本明細書において、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）、そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけではなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３－５８４（１９９０））。

本明細書において、用語「発現の抑制」は、目的遺伝子の活性または発現の低下を引き起こすことを意味し、これによって、目的遺伝子の活性または発現が検知不可能になるか、無意味な水準で存在する場合のみならず、目的遺伝子の生物学的機能が有意に低下しうる程度に活性または発現を低下させることを意味する。本発明の発現抑制用核酸分子は、具体的には、目的遺伝子の配列に相補的な核酸分子であって、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、これに限定されず、当業界にて公知のすべての遺伝子の発現抑制手段である核酸分子が利用できる。

本発明の具体的な実施形態によれば、前記核酸分子は、前記ＩＩ型ＨＬＡタンパク質またはその活性化タンパク質をエンコーディングするヌクレオチド配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをエンコーディングするヌクレオチドである。

本明細書において、用語「ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅＲＮＡ）」は、ターゲット遺伝子を認識して核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）を誘導することにより、認識された部位を特異的に切断する遺伝子編集システムに使用されるＲＮＡ分子を意味する。このような遺伝子編集システムには、代表的にＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）システムがある。

本明細書において、「特異的に認識する」とは、ｇＲＮＡがターゲット塩基配列と相補的な配列を有することにより、選択的に混成化できることを意味する。用語「相補的」は、所定のアニーリングまたは混成化条件の下、ｇＲＮＡがターゲット配列に選択的に混成化する程度に十分に相補的であることを意味し、実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）な場合、および完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）な場合をすべて包括する意味であり、好ましくは、完全に相補的な場合を意味する。本明細書において、用語「実質的に相補的な配列」は、完全に一致する配列だけでなく、特定の配列にアニーリングしてｇＲＮＡの役割を果たすことができる範囲内で、比較対象の配列と部分的に不一致の配列も含まれる意味である。

生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明において特異的に認識して発現を抑制しようとするヌクレオチドは、ＩＩ型ＨＬＡ遺伝子の公知の配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むと解釈される。上記の実質的な同一性は、前記公知の遺伝子の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界にて通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、最小７０％の相同性、具体的には８０％の相同性、より具体的には９０％の相同性、最も具体的には９５％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当業界にて公知である。アラインメントに対する多様な方法およびアルゴリズムは、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５－６５（１９９２）ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１（１９９４）に開示されている。ＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０（１９９０））は、ＮＢＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）などでアクセス可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用可能である。

より具体的には、前記ＩＩ型ＨＬＡタンパク質の活性化タンパク質は、ＩＩ型ＨＬＡタンパク質に対するトランス活性因子（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）であり、より具体的には、ＣＩＩＴＡ（Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）タンパク質である。

本発明の具体的な実施形態によれば、前記組成物は、ＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼエンコーディングヌクレオチドを追加的に含む。「ＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼ」は、ターゲット遺伝子部位を認識したｇＲＮＡによって誘導されてターゲット遺伝子を切断する酵素であって、このようなＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ形態またはタンパク質形態で伝達されてもよく、これをコーディングするＤＮＡが搭載されたベクターで形質転換することにより目的細胞に伝達されてもよい。タンパク質形態のエンドヌクレアーゼが用いられる場合、ガイドＲＮＡと複合体をなすＲＮＰ複合体（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）として機能することができる。

本明細書で使われた用語「ＲＮＰ複合体」とは、前記ガイドＲＮＡおよびＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼを有効成分として含むもので、前記複合体は、標的配列を認識して結合し、これを選択的にニッキング（ｎｉｃｋｉｎｇ）または切断することができる。前記ＲＮＡ複合体は、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ複合体であってもよいが、これに限定されない。

本発明の一具体例において、前記ＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ １３ａ、Ｃａｓ １３ｂ、Ｃａｓ １３ｃ、Ｃａｓ １３ｄ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＭＡＤ７からなる群より選択されるいずれか１つであってもよいし、具体的には、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）、Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）またはＭＡＤ７である。

本明細書において、用語「ヌクレオチド」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）、そしてＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有する。核酸分子の基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明において、ｇＲＮＡまたはＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼをエンコーディングするヌクレオチド配列は、添付した配列リストに記載のヌクレオチド配列に限定されないことは当業者に明確である。ヌクレオチドでの変異は、タンパク質（例えば、エンドヌクレアーゼ）で変化をもたらさないこともあるが、このような核酸は、機能的に均等なコドン、コドンの縮退性によって同一のアミノ酸をコーディングするコドン、または生物学的に均等なアミノ酸をコーディングするコドンを有する核酸分子をすべて包括する。

本発明の具体的な実施形態によれば、前記ｇＲＮＡは、配列リスト第２０配列、配列リスト第２２配列、配列リスト第２４配列、配列リスト第２７配列、配列リスト第２９配列、配列リスト第３０配列、配列リスト第４０配列および配列リスト第４４配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する。

本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物は、β２－マイクログロブリンタンパク質の発現を抑制する核酸分子を追加的に含む。

より具体的には、前記核酸分子は、前記β２－マイクログロブリンタンパク質をエンコーディングするヌクレオチド配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをエンコーディングするヌクレオチドである。

さらにより具体的には、前記誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列リスト第１配列、配列リスト第８配列、配列リスト第９配列および配列リスト第１４配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識する。

本発明の具体的な実施形態によれば、前記組成物は、Ｉ型ＨＬＡタンパク質をエンコーディングする核酸分子を追加的に含む。より具体的には、前記Ｉ型ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質である。

同種細胞移植のもう一つの問題は、移植された治療用細胞がレシピエントにおいて長い間持続しないという点である。これを克服するために、移植後に細胞増殖を誘導可能な特定のサイトカインを周期的に注入する方法が提案されたが、ＩＬ－２のようなサイトカインは、抗癌免疫反応を抑制する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増幅しかねないため、抗癌治療で逆効果が発生しうる（Ｒｏｍａｇｎｅ Ｆ，Ｖｉｖｉｅｒ Ｅ．，Ｆ１０００ Ｍｅｄ Ｒｅｐ，３：９、２０１１；Ｗａｌｄｍａｎｎ ＴＡ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，６：５９５－６０１，２００６）。そこで、本発明者らは、免疫細胞や幹細胞などの治療用細胞上で抑制性受容体ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを刺激して細胞死滅を予防できるＨＬＡ－Ｅを導入しようとした。下記の実施例に示すように、これによりレシピエントの免疫反応によって本発明の治療用移植細胞が死滅するのを防ぐことができ、これによりレシピエントの体内で長く維持されながら薬理効果を発揮できることを確認した。

本明細書において、用語「発現させる」は、対象細胞が外来（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子を発現させるか、または内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）遺伝子の自然的発現量を増加させるために、遺伝子伝達体を用いて人為的にこれを導入することにより、遺伝子が対象体細胞内で染色体外因子としてまたは染色体の統合完成によって複製可能になることを意味する。したがって、用語「発現」は、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、「形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」または「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」と同じ意味である。

本明細書において、用語「遺伝子伝達システム（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）」は、遺伝子を細胞内に運ぶすべての手段を意味し、遺伝子伝達は、遺伝子の細胞内浸透（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）と同じ意味を有する。組織レベルで、前記用語の遺伝子伝達は、遺伝子の拡散（ｓｐｒｅａｄ）と同じ意味を有する。したがって、本発明の遺伝子伝達システムは、遺伝子浸透システムおよび遺伝子拡散システムとして記載される。

本発明の遺伝子伝達体を製造するために、本発明のヌクレオチド配列は、好適な発現コンストラクト（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）内に存在することが好ましい。前記発現コンストラクトにおいて、本発明のヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に連結されることが好ましい。本明細書において、用語「作動的に結合した」は、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写および／または解読を調節する。本発明のヌクレオチド配列に結合したプロモーターは、具体的には、動物細胞、より具体的には、哺乳動物細胞で作動してＨＬＡ－Ｅ遺伝子の転写を調節可能なものであって、哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターおよび哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（哺乳動物サイトメガロウイルス）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、メタロチオニンプロモーター、ベータ－アクチンプロモーター、ヒトＩＬ－２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ－４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーターおよびヒトＧＭ－ＣＳＦ遺伝子のプロモーターを含むが、これに限定されるものではない。

ＨＬＡ－Ｅ遺伝子のヌクレオチド配列は、通常の遺伝子導入に用いられるすべての遺伝子伝達システムに適用可能であり、好ましくは、プラスミド、アデノウイルス（Ｌｏｃｋｅｔｔ ＬＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３：２０７５－２０８０（１９９７））、アデノ－関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ：ＡＡＶ，Ｌａｓｈｆｏｒｄ ＬＳ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レトロウイルス（Ｇｕｎｚｂｕｒｇ ＷＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ Ｅｄ．Ａ．Ｍｅａｇｅｒ，１９９９）、レンチウイルス（Ｗａｎｇ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４（１１）：Ｒ５５－６２（１９９９））、ヘルペスシンプレックスウイルス（Ｃｈａｍｂｅｒ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｔ．Ｓｃｉ ＵＳＡ９２：１４１１－１４１５（１９９５））、ワクチニアウイルス（Ｐｕｈｌｍａｎｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１０：６４９－６５７（１９９９））、リポソーム（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９，Ｓ．Ｃ．Ｂａｓｕ ａｎｄ Ｍ．Ｂａｓｕ（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ２００２）またはニオソームに適用可能である。具体的には、本発明の遺伝子伝達体は、本発明のヌクレオチド分子をレンチウイルスに適用して製造できる。

本発明において、遺伝子伝達体がウイルスベクターに基づいて作製された場合には、前記接触させるステップは、当業界にて公知のウイルス感染方法によって実施される。ウイルスベクターを用いた宿主細胞の感染は、上述した引用文献に記載されている。

本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の組成物が導入される細胞は、移植用同種（Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または自家（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞であり、より具体的には、移植用同種細胞である。

より具体的には、前記細胞は、幹細胞または免疫細胞である。

本明細書において、用語「幹細胞」は、組織を構成する各細胞に分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）される前の段階の未分化細胞であって、特定の分化刺激（環境）下で特定の細胞に分化できる能力を有する細胞を総称する。幹細胞は、細胞分裂が停止された分化された細胞とは異なり、細胞分裂によって自らと同一の細胞を生産（ｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌ）することができ、分化刺激が加えられると、刺激の性格によって多様な細胞に分化できる、分化の柔軟性（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を有することを特徴とする。

本発明が適用される幹細胞は制限はなく、幹細胞の特性、すなわち未分化、無制限増殖および特定細胞への分化能を有する細胞は、本発明が適用可能な細胞である。具体的には、本発明で用いられる幹細胞は、中間葉幹細胞または全能性幹細胞である。

本明細書において、用語「中間葉幹細胞」は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞、心筋細胞への分化が可能な多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する幹細胞を意味する。中間葉幹細胞は、渦状の形態と基本的な細胞表面標識子ＣＤ７３（＋）、ＣＤ１０５（＋）、ＣＤ３４（－）、ＣＤ４５（－）の発現程度により識別される。中間葉幹細胞の重要な特性の一つは、免疫反応を調節する機能も有するということである。中間葉幹細胞は、骨組織、中枢神経系組織、皮膚組織および筋肉組織などへの分化能を有し、適切な分化誘導因子により物理的に消失したこれら組織の再生に使用できるだけでなく、Ｔ－細胞、Ｂ－細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ－ｃｅｌｌ）および樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）の増殖、機能および活性を抑制することにより、強力な免疫調節効果を発揮することが報告され、所望しないか（ｕｎｄｅｓｉｒｅｄ）過度な（ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ）免疫反応を原因とする移植拒絶、自己免疫疾患、炎症疾患およびアレルギー性疾患などの多様な疾患の治療に適用されてもよい。よって、本発明が中間葉幹細胞に適用される場合、多様な退行性疾患での再生治療または自己免疫／炎症疾患の治療に適用可能である。

本明細書において、用語「全能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、受精卵より発生が進行した状態の細胞であって、内胚葉、中間葉および外胚葉を構成する細胞にすべて分化可能な幹細胞を意味する。本発明の具体的な実施形態によれば、本発明で用いられる全能性幹細胞は、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ＥＳＣ）、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ）、胚性腫瘍細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌ）または誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）であり、より具体的には、誘導多能性幹細胞である。

本明細書において、用語「誘導多能性幹細胞」は、非－全分化能細胞（例えば、体細胞）に未分化または全分化能表現型に関連する特定の遺伝子を挿入して人工的に由来する全分化能幹細胞の一つである。誘導多能性幹細胞は、幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、染色体のメチル化、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）、胚体形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性および分化性を有するという点から、胚性幹細胞のような天然の全分化能幹細胞と同一の表現型、生理学的特性および発生学的特性を有するものと当業界にて見なされている。

本明細書において、用語「免疫細胞」は、免疫反応の開始または促進過程に関与するすべての細胞を意味し、より具体的には、免疫エフェクター細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）を意味する。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞および肥満細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）を含むが、これに限定されるものではない。より具体的には、前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞である。

本発明が免疫細胞に適用される場合、腫瘍および感染性疾患の治療に適用可能である。本発明による方法で製造されたＮＫ細胞は、固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ）および血液癌を含む全種類の腫瘍に適用可能である。固形癌とは、血液癌とは異なり、臓器（ｏｒｇａｎ）で塊をなして形成された癌を意味し、大部分の臓器で発生する癌がこれに相当する。本発明によるＮＫ細胞を用いて治療可能な腫瘍は特別な制限はなく、胃癌、肝癌、肺癌、大腸癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、甲状腺癌、喉頭癌、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽腫、網膜芽腫、頭頸部癌、唾液腺癌、リンパ腫などであってもよいが、これに限定されるものではない。本発明の免疫細胞を用いて治療可能な感染性疾患は、ウイルスまたは病原菌の感染によって発生する疾患で、呼吸器および血液、皮膚接触などにより伝染して感染しうる疾患をすべて含む概念である。このような感染性疾患は、例えば、Ｂ型およびＣ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ：ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）感染、ウイルス性呼吸器疾患、インフルエンザを含むが、これに限定されるものではない。

本明細書において、用語「治療」は、（ａ）疾患、疾病または症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病または症状の軽減；または（ｃ）疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の免疫原性抑制組成物が導入された幹細胞が対象体に投与されると、過度であるか所望しない免疫反応による症状の発展を抑制したり、これを除去したりまたは軽減させる役割を果たし、本発明の免疫原性抑制組成物が導入された免疫細胞が対象体に投与されると、癌細胞や感染細胞の死滅を誘導することで、同じく腫瘍または感染疾患による症状の発展を抑制したり、これを除去したりまたは軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体で疾患の細胞治療剤組成物になってもよく、あるいは他の薬理成分と共に投与されて前記疾患に対する治療補助剤として適用されてもよい。よって、本明細書において、用語「治療」または「治療剤」は、「治療補助」または「治療補助剤」の意味を含む。

本明細書において、用語「投与」または「投与する」は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接的に投与することにより、対象体の体内で同量が形成されるようにすることをいう。

本発明において、用語「治療的有効量」は、本発明の組成物を投与しようとする個体に治療的または予防的効果を提供するのに十分な程度に含有された組成物の含有量を意味し、よって、「予防的有効量」を含む意味である。

本明細書において、用語「対象体」は、制限なく、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒまたはアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。

本発明の他の態様によれば、本発明は、上述した本発明の組成物を用いて製造された低免疫原性哺乳類細胞を提供する。

本発明の免疫原性阻害用組成物および前記組成物が導入される対象細胞に対してはすでに上述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次のステップを含む低免疫原性哺乳類細胞の製造方法を提供する：
（ａ）哺乳類個体から分離された細胞においてβ２－マイクログロブリンタンパク質、ＩＩ型ＨＬＡタンパク質、ＩＩ型ＨＬＡタンパク質の活性化タンパク質およびこれらの組み合わせからなる群よりの選択されるタンパク質の発現を抑制するステップ；および
（ｂ）前記細胞にＨＬＡ－Ｅ遺伝子を導入するステップ。

本発明によれば、減少した免疫原性を有しながら活性が長期間維持できる本発明の治療用同種移植細胞を製造するにあたり、免疫原性誘発遺伝子を先に抑制した後、次いで、レシピエントのＮＫ細胞からの攻撃を抑制させるための遺伝子を導入する過程が順次に行われる場合、細胞の優れた成長特性、生存性および活性が現れることを見出した。

後述する実施例に示すように、ＨＬＡ－Ｅの導入を先に行う場合、Ｂ２Ｍ遺伝子を除去してもＨＬＡ－Ｅの発現が持続して、培養過程でＨＬＡ－ＡＢＣ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋表現型を有するＮＫ細胞の生存および成長が維持できるという予想とは異なり、ＨＬＡ－ＡＢＣ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋特性を有する細胞の収率が非常に低く、むしろ免疫原性遺伝子の除去後、順次にＨＬＡ－Ｅを導入する工程が培養終了時までＨＬＡ－ＡＢＣ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋特性を有する細胞が９６％以上存在する高い収率を示すことにより、本発明の低免疫原性哺乳類細胞を製造する最適な工程順序であることを確認した。

本発明の具体的な実施形態によれば、前記ステップ（ａ）は、上述した各タンパク質に対する発現抑制用核酸分子およびエンドヌクレアーゼを用いて行われる。これらの核酸分子およびエンドヌクレアーゼについてはすでに上述したので、過度の重複を避けるためにその記載を省略する。

本発明の具体的な実施形態によれば、前記ステップ（ｂ）は、前記ステップ（ａ）が完了した後、１～５日経過後に行われ、より具体的には、２日～５日経過後に行われ、最も具体的には、３日経過後に行われる。

本発明の特徴および利点をまとめると、次の通りである：
（ａ）本発明は、哺乳類細胞の免疫原性阻害用組成物およびこれを用いた低免疫原性哺乳類細胞の製造方法を提供する。
（ｂ）本発明は、幹細胞や免疫細胞など疾患の治療目的で同種移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）する細胞において、レシピエントの体内で免疫拒絶反応が最小化されながらも長期間活性が維持される効率的な細胞治療剤として有用に利用できる。

Ｂ２Ｍ遺伝子に対するｇＲＮＡ処理３日後のＨＬＡ－ＡＢＣの発現量をＦＡＣＳで測定した結果を示す図である。 本発明の遺伝子編集システムの伝達のために使用したシャトルの濃度によるＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト効率を測定した結果を示す図である。 Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされたＮＫ細胞の培養によるＨＬＡ－ＡＢＣの発現比率の変化を示す図である。 ＨＬＡ－Ｅ形質導入によるＢ２Ｍ^－ ＮＫ細胞の生存能力増加の結果を示す図である。 ＨＬＡ－Ｅ形質導入によるＢ２Ｍ^－ ＮＫ細胞の生存能力増加の結果を示す図である。 ＨＬＡ－Ｅ形質導入によるＢ２Ｍ^－ ＮＫ細胞の生存能力増加の結果を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトまたはＨＬＡ－Ｅ形質転換されたＮＫ細胞の生存率を示す図である。 Ｂ２ＭノックアウトまたはＨＬＡ－Ｅ形質転換されたＮＫ細胞の成長率を示す図である。 製造方法によるＬｏｇ－ＮＫ表現型および製造効率を示す図である。 Ｌｏｇ－ＮＫの培養時点によるＨＬＡ－ＡＢＣの発現量を示す図である。 Ｌｏｇ－ＮＫの培養時点によるＨＬＡ－Ｅの発現量を示す図である。 Ｌｏｇ－ＮＫの培養時点によるＨＬＡ－Ｅの発現量を示す図である。 Ｌｏｇ－ＮＫの培養終了時点のＮＫ特性マーカーの発現量を示す図である。 Ｌｏｇ－ＮＫの培養による細胞生存率を示す図である。 Ｌｏｇ－ＮＫの培養による細胞成長率を示す図である。 Ｌｏｇ－ＮＫの癌細胞株殺害能を評価した結果を示す図で、野生型ＮＫ細胞またはＬｏｇ－ＮＫ細胞によるＫ５６２癌細胞株の溶解程度を示す。 Ｌｏｇ－ＮＫの癌細胞株殺害能を評価した結果を示す図で、Ｋ５６２ターゲット細胞と接触時、野生型ＮＫ細胞とＬｏｇ－ＮＫ細胞のサイトカイン発現量の変化を示す。 ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭを用いてＣＤ８（＋）Ｔ細胞によって溶解する野生型ＮＫ細胞の比率を長期観察した結果を示す。 ＣＦＳＥを用いてＣＤ８（＋）細胞によって溶解する野生型ＮＫ細胞およびＬｏｇ－ＮＫ細胞の比率を長期観察した結果を示す。 フローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウトによるＩＩ型ＨＬＡ遺伝子の発現抑制を確認した結果を示す図である。 フローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞においてＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウト後の培養時点によってＩＩ型ＨＬＡ遺伝子の発現抑制を確認した結果を示す図である。 Ｂ２ＭとＣＩＩＴＡ遺伝子が同時に除去されたＮＫ細胞を作製するための過程をまとめた模式図である。 図１４Ａの各作製方法で作製されたＮＫ細胞においてＢ２ＭとＣＩＩＴＡのダブルノックアウト効率を示す図である。 Ｂ２Ｍ遺伝子内のｇＲＮＡのオン－ターゲットおよびオフ－ターゲット予想部位の配列を示す図である。 Ｂ２Ｍの３個のオフ－ターゲット予想部位で挿入／欠失が起こらなかったことを示す図である。 Ｂ２Ｍの３個のオフ－ターゲット予想部位で挿入／欠失が起こらなかったことを示す図である。 ＣＩＩＴＡ遺伝子内のｇＲＮＡのオン－ターゲットおよびオフ－ターゲット予想部位の配列を示す図である。 ＣＩＩＴＡの２個のオフ－ターゲット予想部位で挿入／欠失が起こらなかったことを示す図である。 ＣＩＩＴＡの２個のオフ－ターゲット予想部位で挿入／欠失が起こらなかったことを示す図である。 図１４Ａの作製方法１で作製したＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の増殖率および生存率をそれぞれ示す図である。 図１４Ａの作製方法２で作製したＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の増殖率および生存率をそれぞれ示す図である。 培養期間中のＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の表現型を確認した結果を示す図で、ＨＬＡ－ＡＢＣとＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱの発現抑制を示す。 培養期間のＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の表現型を確認した結果を示す図で、ＨＬＡ－Ｅの発現を示す。 Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭの細胞染色方法を用いてＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の癌細胞殺傷力を測定した結果を示す。 ＣＦＳＥの細胞染色方法を用いてＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の癌細胞殺傷力を測定した結果を示す。 多様なｇＲＮＡ伝達方法によるＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト効率を確認した結果を示す図である。 多様なｇＲＮＡ伝達方法によるＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウト効率を確認した結果を示す図である。 本発明のＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞が授与者のＣＤ８（＋）Ｔ細胞の攻撃を回避できるか否かを確認した結果を示す図である。 本発明のＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞が授与者のＣＤ４（＋）Ｔ細胞の攻撃を回避できるか否かを確認した結果を示す図である。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。

実施例１：遺伝子はさみを用いたＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）
低免疫原性ＮＫ細胞は供与者から受けた臍帯血から分離したＮＫ（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ、ＣＢＮＫ）細胞を用いて作製した。

細胞表面に存在するヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＬＡ）であるＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃに共通に存在するβ２ｍはＢ２Ｍ遺伝子から発現して作られる。ＨＬＡ－ＡＢＣを発現しないＮＫ細胞の作製のために、遺伝子はさみ技術でＮＫ細胞のゲノムからＢ２Ｍ遺伝子の所望する部分を以下の方法で切断してβ２ｍの発現を抑制した。

まず、１．５ｍＬ遠心分離チューブに以下のようにｇＲＮＡとヌクレアーゼとの複合体であるＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）反応液を製造して、常温で５分以上反応させた後、６０分以内に使用した。

２６．８４μＬの１Ｘ ＰＢＳに４０μＭのＣｐｆ１ヌクレアーゼ（Ｆｅｌｄａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）３．３２μＬまたは２６μＬの１Ｘ ＰＢＳに４０μＭのＭＡＤ７ヌクレアーゼ（Ｆｅｌｄａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）４μＬとＢ２Ｍ遺伝子を切断する多様な配列のｇＲＮＡ（ＩＤＴ社合成、１０μＭ）２０μＬをそれぞれ混合した後、常温で５分以上反応させてＲＮＰ反応液を得た。製造したＲＮＰ反応液は細胞数１～４×１０^６まで使用可能な用量であり、本実施例では、ＡＤＡＭ細胞計数器（ＡＤＡＭ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ、ナノエンテック）を用いて細胞数を測定した後、２×１０^６個のＮＫ細胞を使用した。別の１．５ｍＬ遠心分離チューブに２×１０^６個のＮＫ細胞を入れて、２０００ｒｐｍ、３分間遠心分離した後、上澄液を除去した。５００μＬの１Ｘ ＰＢＳを入れた後、２０００ｒｐｍ、３分間遠心分離して上澄液を除去して細胞のみ残した。さらに他の１．５ｍＬ遠心分離チューブに４８μＬのαｌｐｈａ ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｍ８０４２）に２μＬのＦｅｌｄａｎシャトル（Ｆｅｌｄａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、５μＭ）を添加した後、前記反応済みの５０μＬのＲＮＰ反応液を混合した。その後、上澄液を除去したＮＫ細胞に混合液を入れて、１分３０秒間常温で静置状態で反応させた後、１％（ｖ／ｖ）のヒト血漿と１０００ＩＵ ｈＩＬ－２（プロロイキン注射、韓国ノバルティス）を含むＣｅｌｌｇｒｏ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ、２０８０２－０５００）２ｍＬを入れてＮＫ細胞を浮遊させた後、６－ウェルプレートに移して培養した。

以後、７２時間を静置培養した後、２×１０^５個のＮＫ細胞を収集して、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、培地を除去した後、２ｍＬの２％ＦＢＳが添加されたＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、２０００ｒｐｍ、３分間遠心分離して上澄液を除去してＮＫ細胞のみ残した。次に、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を入れた後、表１のように分析する抗体を添加し、４℃で３０分間反応させた。２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を加えて、２０００ｒｐｍ、３分間遠心分離した後、上澄液を除去し、３００μＬのＦｉｘａｔｉｏｎ（ＢＤ、５５４６５５）溶液を入れてＮＫ細胞を固定させた。その後、フローサイトメーターであるＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色したＮＫ細胞表面の発現を分析した。

Ｂ２Ｍ遺伝子をＣｐｆ１またはＭＡＤ７ヌクレアーゼを用いて切断可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）としてｂｅｎｃｈｌｉｎｇ（ｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）プログラムを用いて選定したｇＲＮＡ候補配列は、表２に挙げた。ＨＬＡ－ＡＢＣの発現をＦＡＣＳで確認して、それぞれのｇＲＮＡのノックアウト効率を評価した。

その結果、１９個の配列のうち、＃１（ＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴ）、＃８（ＡＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡ）、＃９（ＡＧＴＧＧＧＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡＧＴ）および＃１４（ＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＡＴ）の４個のｇＲＮＡ配列において最も高い比率でＢ２Ｍ遺伝子がノックアウトされたことを確認し（図１）、なかでも、最も高い効率を有する＃９ ｇＲＮＡを選定して、Ｃｐｆ１でＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトを行った。Ｃｐｆ１を用いる場合、ｇＲＮＡの配列長さは１９－２３ｂｐの範囲で適用可能であり、同一部位をターゲッティングする場合、配列の長さが長いほどオフ－ターゲット（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ）現象を最小化できる。一方、ＭＡＤ７ヌクレアーゼの場合は、２１ｂｐのｇＲＮＡを使用するため、＃９ ｇＲＮＡ配列のような部位を切断しながら長さが２ｂｐ短い＃８ ｇＲＮＡを使用した。

＃８と＃９ ｇＲＮＡとＣｐｆ１またはＭＡＤ７を用いてＮＫ細胞のＢ２Ｍ遺伝子を切断した後、ゲノムＤＮＡを分離して全長遺伝体シーケンシング（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。ｇＲＮＡ配列と不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の核酸配列が４個以下で存在するゲノムＤＮＡ配列をオフ－ターゲットの可能性がある部位と仮定し、実際にオフ－ターゲットによる挿入／欠失が発生したか否かを確認した。その結果、３個のオフ－ターゲット予想部位が確認され、遺伝子挿入／欠失に対する配列分析の結果を確認して、２個の予想部位では挿入／欠失が起こらなかったことを確認し、４番目の染色体部位では挿入／欠失が発見されたが、対照群ＮＫと同一の位置で示される挿入／欠失であった。結果として、＃８と＃９ ｇＲＮＡを用いたＢ２Ｍノックアウトは、オフ－ターゲット予想部位で変異が起こらないことを確認した（添付１）。

本実施例では、ペプチド伝達体であるシャトル（Ｓｈｕｔｔｌｅ、Ｆｅｌｄａｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を用いてＲＮＰ反応液を細胞内に伝達したが、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、陽イオン性重合体（例えば、ポリアルギニン）などの多様な伝達方法を使用することもできる。

実施例２：Ｂ２Ｍ遺伝子ノックアウトのためのシャトル効率評価
シャトルタンパク質を用いてＢ２Ｍ遺伝子のノックアウトを行った。使用したシャトルの配列は表３に示し、Ｂ２Ｍ遺伝子のノックアウトは実施例１に記述した過程と同様の方法で行った。

シャトルを５μＭと１０μＭ使用してＣＢＮＫ細胞内のＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト効率を確認した結果、５μＭのＦＳＤ６４ｄ１シャトルがＢ２Ｍのノックアウト効率および細胞生存率の面で１０μＭより優れていることが確認されたので（図２）、以後、実施例において、Ｂ２Ｍノックアウトは５μＭのＦＳＤ６４ｄ１シャトルを用いて行った。

実施例３．低免疫原性ＮＫ細胞の作製およびインビトロ評価
Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトさせたＮＫ細胞を培養し、Ｂ２ＭとＨＬＡ－ＡＢＣの発現を確認した結果、全体細胞においてＢ２ＭとＨＬＡ－ＡＢＣを同時に発現しない細胞の比率が時間の経過とともに減少することを確認した（図３）。図３の結果がＢ２Ｍ遺伝子がノックアウトされてＨＬＡ－ＡＢＣの発現が抑制されたＮＫ細胞がＨＬＡ－ＡＢＣを発現するＮＫ細胞によって攻撃されたためであるかを確認するために、野生型ＣＢＮＫ、Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトさせたＮＫ細胞のみ分離したグループ（Ｂ２Ｍ ＫＯ ＮＫ）、ｓｃＨＬＡ－Ｅを野生型ＣＢＮＫに形質導入したグループ（ＨＬＡ－Ｅ ＴＤ ＮＫ）、Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされたＮＫ細胞のみ分離してｓｃＨＬＡ－Ｅを形質導入したグループ（Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＴＤ ＮＫ）をそれぞれ作製してインビトロ細胞死滅アッセイを行った。ＨＬＡ－Ｅ遺伝子は外来細胞が宿主のＮＫ細胞から攻撃されることを抑制することが知られていて、これをＢ２Ｍ遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）ＮＫ細胞に導入し、このようにＢ２Ｍ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋の発現特性を有する同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）低免疫原性ＮＫ細胞として体内注入時、宿主のＣＤ８（＋）Ｔ細胞およびＮＫ細胞による攻撃を回避できると予想した。

３－１）Ｂ２Ｍ ＫＯ ＮＫ細胞の作製（Ｂ２Ｍ^－ ＮＫ）
ＨＬＡ－ＡＢＣを発現しない細胞の比率が最も高く維持されるノックアウト３日目にＢ２Ｍ遺伝子がノックアウトされたＮＫ細胞を分離した。Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトしたＮＫ細胞は遠心分離で細胞を集めた後、上澄液を除去し、１×１０^７／１００μＬの濃度でＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が溶解したＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ））で再浮遊させた後、１００μＬあたりビオチンが接合されたＢ２Ｍ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＡ１－１９５０６）１０μｇを入れて、４℃で１５分間染色した後、２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を入れて、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離して上澄液を除去した。その後、ペレット状態のＮＫ細胞を８０μＬのＭＡＣＳ緩衝液で浮遊させ、２０μＬの抗－ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９０－４８５）を混合して、４℃で１５分間反応させた後、２ｍＬの洗浄緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９１－２２２）を入れて、１２００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した後、上澄液を除去した。５００μＬの洗浄緩衝液でＮＫ細胞を浮遊させた。ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）をＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ^ＴＭ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に固定させ、２ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した後、浮遊させたＮＫ細胞をカラムに流した。その後、３ｍＬの洗浄緩衝液を２回流して、カラムに結合しないＢ２Ｍノックアウト細胞を回収した。細胞数の測定後、ＮＫ細胞培地に１×１０^６／ｍｌの濃度で浮遊させた後、好適な大きさのウェルプレート培養容器に入れて培養した。

３－２）ＨＬＡ－Ｅ ＴＤ ＮＫ細胞の作製（ＨＬＡ－Ｅ^＋ ＮＫ）
単鎖ＨＬＡ－Ｅ三量体（ｓｃＨＬＡ－Ｅ）をＮＫ細胞で発現させるためにレンチウイルスベクターを用いた。本発明で用いられた単鎖ＨＬＡ－Ｅ三量体はＵＳ２００５０１９６４０４Ａ１で開示されたアミノ酸配列を使用しかつ、そのコーディング核酸配列はコドン最適化を行って使用した（配列リスト第４６配列）。コドンを最適化した単鎖三量体の配列を発現するレンチウイルスベクターはＦｌａｓｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（フランス）で作製した。

ｓｃＨＬＡ－ＥをＮＫ細胞に形質導入するために、５０ＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のｓｃＨＬＡ－Ｅレンチウイルスベクターと１０μｇ／ｍＬのＰｒｏｔｒａｎｓｄｕｚｉｎ－Ａ（ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ／Ａ ２１１５ＡＧ．１）との複合体を製造して、５分以上常温に放置した後、培養容器に入っているＮＫ細胞に処理した。レンチウイルスベクターの細胞内導入および発現を促進できるように、培地に６μＭの５Ｚ－７－Ｏｘｏｚｅａｅｎｏｌ（ＴＯＣＲＩＳ ＃３６０４２０）、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ／５７１２０４）を共に処理した。

３－３）Ｂ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＴＤ ＮＫ細胞（Ｂ２Ｍ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋ ＮＫ）の作製
前記１）のように作製されたＢ２Ｍ ＫＯ ＮＫ細胞を培養容器に入れた後、前記２）のようにｓｃＨＬＡ－Ｅを形質導入した。最終的に、ＨＬＡ－ＡＢＣ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋またはＨＬＡ－ＡＢＣ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋表現型を有するように、このように遺伝子組換えが完了した低免疫原性のＮＫ細胞を、本発明者らは「Ｌｏｇ－ＮＫ」（Ｌｏｇ－ｌａｓｔｉｎｇ ＮＫ）と名付けた。作製されたＮＫ細胞は、表４の抗体を用いてＦＡＣＳ分析を行った。

実施例４．低免疫原性ＮＫ細胞のインビトロ特性評価
４個のグループのＮＫ細胞（野生型ＣＢＮＫ、Ｂ２Ｍ^－ ＮＫ、ＨＬＡ－Ｅ^＋ ＮＫ、Ｂ２Ｍ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋ ＮＫ）はターゲット細胞として使用され、１Ｘ ＰＢＳで洗浄した後、上澄液を除去し、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、１１８７５０９３）であるａｓｓａｙ培地を１ｍＬ入れて、１×１０^６／ｍｌの濃度で浮遊させた後、３０μＬ Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ、Ｃ３４８５２）を加えた後、３７℃で１時間、ＣＯ_２培養器で反応させた。以後、ａｓｓａｙ培地で２回洗浄後、ａｓｓａｙ培地１０ｍＬで細胞を浮遊させて、１×１０^５／ｍｌの濃度で製造した。エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞として用いるＰＢＮＫ（供与者の末梢血由来ＮＫ細胞）またはＣＢＮＫ（供与者の臍帯血由来ＮＫ細胞）も１ｘ ＰＢＳで洗浄した後、上澄液を除去し、ａｓｓａｙ培地を入れて、３０：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために３×１０^６／ｍｌ、または１０：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために１×１０^６／ｍｌの比率で製造した。丸底の９６ウェルプレートに３０：１または１０：１の比率で製造されたエフェクター細胞を３つのウェルにそれぞれ１００μＬずつ入れた後、１×１０^５／ｍＬの濃度のターゲット細胞を１００μＬずつ入れた。細胞殺傷能を数式で計算するために、自然放出（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｒｅｌｅａｓｅ）ウェルと最大放出（ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）ウェルを用意した。自然放出ウェルには染色されたターゲット細胞を１００μＬずつ入れて、ａｓｓａｙ培地を１００μＬずつ入れた。最大放出（ｍａｘｉｍｕｍ ｒｅｌｅａｓｅ）ウェルには染色されたターゲット細胞を１００μＬずつ入れて、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００溶液を１００μＬずつ入れた。ａｓｓａｙ培地および２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００溶液に存在する自己蛍光値を補正するために、ａｓｓａｙ培地２００μＬを入れて培地値を用意し、ａｓｓａｙ培地１００μＬに２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００溶液１００μＬを入れて、２つの溶液の混合液の値を用意した。培地値から混合液の値を引いた差（Ａ）を最大値に加えて自己蛍光値を補正した。光を遮断して、３７℃で４時間、ＣＯ_２培養器で反応させた後、プレートを２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を９６－ウェルのブラックプレートに１００μＬずつ入れて、蛍光プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＶＩＣＴＯＲ Ｎｉｖｏ）を用いて蛍光値（ＯＤ_{４８０／５３５ｎｍ}）を測定して、エフェクター細胞のターゲット細胞に対する細胞殺傷能を下記の式を用いて計算した：
細胞殺傷能（％）＝（サンプルウェルの平均蛍光値－自然放出ウェルの平均蛍光値）／
｛（最大放出ウェルの平均蛍光値＋Ａ）－自然放出ウェルの平均蛍光値｝×１００

Ｂ２ＭをノックアウトしたＢ２Ｍ ＫＯ ＮＫグループ（供与者１）は、他の供与者に由来するＰＢＮＫ細胞（供与者Ａまたは供与者Ｂ）または同一供与者のｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＮＫ細胞（供与者１）によって攻撃されやすいことを確認した。これに対し、ＨＬＡ－Ｅを発現するＨＬＡ－Ｅ ＴＤ ＮＫまたはＢ２Ｍ ＫＯ／ＨＬＡ－Ｅ ＴＤ ＮＫグループでは攻撃される程度が著しく減少することを観察して、ＨＬＡ－Ｅを発現させたＮＫ細胞は他の供与者に由来するか、ＨＬＡ－ＡＢＣを発現する野生型ＮＫ細胞の攻撃を効率的に回避できることを確認した（図４）。表５は、エフェクター細胞の表面に発現しているＨＬＡ－Ｅ結合受容体であるＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｃの発現をＦＡＣＳ分析で測定した結果である。

また、作製された遺伝子組換えＮＫ細胞グループをそれぞれ培養する場合、各グループ間の生存に大きな差はなかったが、生長性においては、Ｂ２Ｍ ＫＯ ＮＫグループが他のグループに比べて非常に低い結果を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。

実施例５：Ｌｏｇ－ＮＫ細胞（Ｂ２Ｍ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋ ＮＫ細胞）の作製方法の最適化
Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされてＨＬＡ－ＡＢＣの発現が抑制され、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子を形質導入して作製したＬｏｇ－ＮＫ細胞は、表６に示されたように、４つの方法で作製した。

各過程の詳細な実験方法および発現特性のＦＡＣＳ分析方法は、実施例１と３に記述された通りである。図６にて、グラフの第２象限の領域（太い実線）がＬｏｇ－ＮＫ細胞を示す。製造方法１の場合、ＮＫ細胞培養の初期時点である７日目にＢ２Ｍ ｇＲＮＡを処理し、３日経過後にＢ２Ｍ^－細胞のみ分離した後、ｓｃＨＬＡ－Ｅを導入して発現させ、その結果、培養終了時まで９６％以上のＬｏｇ－ＮＫ細胞が存在することを確認した。

製造方法２の場合、全体培養の培養１／３地点の時点である１４日目にｓｃＨＬＡ－Ｅを先に導入して発現させ、３日後にＢ２Ｍを除去してＢ２Ｍ^－細胞を分離する過程は行わなかった。ＨＬＡ－Ｅを発現する細胞は他のＮＫ細胞の攻撃を回避できるので、Ｂ２Ｍ遺伝子を除去してもＨＬＡ－Ｅの発現が持続して細胞の生存および成長が維持できると予想したが、実際の結果は、Ｌｏｇ－ＮＫ細胞の作製効率が低く（約１３％）、培養時間の経過とともに存在するＬｏｇ－ＮＫ細胞が減少して、終了時点では残っているＬｏｇ－ＮＫ細胞が存在しなかった。

製造方法３の場合、製造方法１と同様に、培養７日目に製造過程を開始し、Ｂ２Ｍ除去およびＨＬＡ－Ｅ導入の順序のみ反対に進行させた後、Ｂ２Ｍ^－細胞を分離する過程を含んでＬｏｇ－ＮＫ細胞を製造した。その結果、製造方法２と比較して高いＬｏｇ－ＮＫ細胞の作製効率（８７％）を示したが、培養終了時点でＬｏｇ－ＮＫ細胞が約２０％に減少して収率が非常に低くなったことを確認した。

製造方法４の場合、培養７日目にＢ２Ｍを除去し、Ｂ２Ｍ^－細胞を分離する過程なしにＨＬＡ－Ｅを導入した後、培養した結果、前記３つの製造方法と比較してＬｏｇ－ＮＫ細胞がほとんど得られないこと（約３％）を確認した。

前記結果から、ＨＬＡ－ＡＢＣの発現を抑制して免疫原性を除去するためにＢ２Ｍ遺伝子の発現を抑制し、他のＮＫ細胞による攻撃を回避するためにＨＬＡ－Ｅを発現させる本発明のＬｏｇ－ＮＫ細胞は、前記製造方法１による時、最もよく実現されることが確認された。

実施例６．ＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ細胞の培養および特性評価
ＣＢＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫは培養開始日、培養１４日目、培養２８日目に支持細胞を用いて再刺激を与えて培養した。培養に使用した支持細胞は４－１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ－２１（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｕｎｄ ＩＬ－２１）およびｍＴＮＦ－α（ｍｅｍｂｒａｎｅ ＴＮＦ－α）遺伝子で形質転換されたＣＤ４＋ Ｔ細胞である。支持細胞を用いた再刺激は１４～１６日の間隔範囲で可能である。適切な培養容器に入れて静置培養したＬｏｇ－ＮＫ細胞は、３９日まで培養後に凍結し、細胞の成長速度によって最大４２日まで培養可能である。４２日以上培養が必要な場合、培養４２日目に支持細胞で再刺激して持続培養が可能である。ＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ細胞は、表７の抗体で染色してＣＤ３^－／ＣＤ５６^＋の純度を有するＮＫ細胞内でＬｏｇ－ＮＫ（ＨＬＡ－ＡＢＣ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋）表現型が維持されているかを培養終了時点まで確認した。その結果、Ｌｏｇ－ＮＫ細胞はＨＬＡ－ＡＢＣ遺伝子の発現が５％以下に維持され、野生型ＮＫ細胞より各細胞のＨＬＡ－Ｅの発現程度（ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）が強く維持されていることを確認した（図７）。培養終了時点でＮＫ細胞特性マーカーを確認するために、表４のヒトＣＤ５６、ヒトＣＤ３、７ＡＡＤ抗体と共に、表７に挙げられたそれぞれのマーカーに相当する抗体を入れて、計１４個の染色チューブを作った後、実施例３と同様の方法でフローサイトメトリーで発現を確認した。その結果、野生型ＮＫ細胞と比較して有意に活性マーカーが減少したり、阻害マーカーが増加する現象は現れなかった（図８）。

製造方法１で作製したＬｏｇ－ＮＫ細胞は、作製過程が終了する培養１０日目から培養終了時点の３９日目まで、野生型ＮＫ細胞と比較して類似の細胞生存率を示した。培養１０日目から１４日目の間に現れるＬｏｇ－ＮＫ細胞の生存率および成長率の減少はＨＬＡ－Ｅレンチウイルスベクターが形質転換されないまま残っているＢ２Ｍ^－ ＮＫ細胞が死滅する過程によって一時的に現れる現象で、１４日目に支持細胞の再刺激後には培養速度および生存率がすべて回復することを確認することができた（図９）。

実施例７．Ｌｏｇ－ＮＫ細胞の腫瘍細胞の毒性評価
野生型ＮＫ細胞またはＬｏｇ－ＮＫ細胞の腫瘍細胞殺傷能を評価するために、Ｋ５６２血液癌細胞株をターゲット細胞として使用した。Ｋ５６２細胞を１Ｘ ＰＢＳで洗浄した後、上澄液を除去し、１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地であるａｓｓａｙ培地を入れて、１×１０^６／ｍｌの濃度で浮遊させた後、３０μＬ Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅ、Ｃ３４８５２）を加えて、３７℃で１時間、ＣＯ_２培養器で反応させた。その後、１０ｍＬのａｓｓａｙ培地で２回洗浄後、１０ｍＬのａｓｓａｙ培地で細胞を浮遊させて１×１０^５／ｍｌの濃度で製造した。野生型ＮＫ細胞またはＬｏｇ－ＮＫ細胞を１ｘ ＰＢＳで洗浄した後、上澄液を除去し、ａｓｓａｙ培地を入れて、１０：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために１×１０^６／ｍｌで、３：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために３×１０^５／ｍｌで、１：１のエフェクター：ターゲットの比率のために１×１０^５／ｍｌで、０．３：１のエフェクター：ターゲットの比率のために３×１０^４／ｍｌで製造した。丸底の９６ウェルプレートに４つの比率で製造されたエフェクター細胞を３つのウェルにそれぞれ１００μＬずつ入れた後、１×１０^５／ｍｌの濃度のターゲット細胞を１００μＬずつ入れた。以後の実験過程および腫瘍細胞殺害能の計算は実施例４と同様の方法で行った。Ｋ５６２癌細胞株の細胞殺害能の評価結果、高いＥ：Ｔ比率でＮＫ細胞がＬｏｇ－ＮＫ細胞間の癌細胞殺害能に有意な差がないことを確認し、Ｅ：Ｔ比率が低くなるほど、ＮＫ細胞とＬｏｇ－ＮＫ細胞との間の差は完全になくなった（図１０Ａ）。

実施例８．Ｌｏｇ－ＮＫ細胞のサイトカイン分泌の確認
ＮＫ細胞が癌細胞殺傷のために分泌する主要サイトカインであるＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αの分泌量を、細胞内ｃｙｔｏｋｉｎｅ染色（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＣＳ）試験方法で確認した。ＩＣＳ実験で使用する抗体は表８に明示し、細胞染色方法によって使用する抗体の種類は表９に明示した。

エフェクター細胞である野生型ＮＫ細胞またはＬｏｇ－ＮＫ細胞を１ｘ ＰＢＳで洗浄した後、上澄液を除去し、１：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために２．５×１０^６／ｍＬで１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地であるａｓｓａｙ培地を入れて懸濁した後、１．２ｍＬを新しいチューブに取って、Ｇｏｌｇｉ－ｓｔｏｐ（ＢＤ、５５４７２４）１．５６μＬとＧｏｌｇｉ－ｐｌｕｇ（ＢＤ、５５５０２９）２．４μＬを入れる。

ターゲット細胞であるＫ５６２も２．５×１０^６／ｍｌでａｓｓａｙ培地を入れて懸濁する。９６ウェルの丸底プレートを用意して、（－）とターゲットウェルにはＡＰＣ－ＣＤ１０７ａ抗体を、ｉｓｏウェルにはＡＰＣ－ＩｇＧ１ｋ抗体を入れた。（－）ウェルには１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地１００μＬを、ターゲットとｉｓｏウェルにはターゲット細胞１００μＬずつを入れた。すべてのウェルにエフェクター細胞１００μＬを入れた後、３７℃、ＣＯ_２培養器で４時間反応させた。プレートを遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分、４℃）してＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ、５５４７２３）２００μＬで２回洗浄した後、すべてのウェルに固定／透過化溶液（ＢＤ、５５４６５５）２００μＬを入れて、４℃で３０分間反応させた。プレートを遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分、４℃）してＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ、５５４７２３）２００μＬで２回洗浄した後、すべてのウェルにＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ、５５４７２３）１００μＬを入れる。（－）とターゲットウェルにはＩＦＮ－γとＴＮＦ－α抗体を、ｉｓｏウェルにはＦＩＴＣ－ＩｇＧ１ｋとＰＥ－Ｃｙ７－ＩｇＧ１ｋ抗体を入れた後、４℃で３０分間反応させた。１Ｘ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液を１００μＬずつ入れて、プレートを遠心分離（２０００ｒｐｍ、３ｍｉｎ、４℃）した後、上澄液を捨てた。プレートを遠心分離（２０００ｒｐｍ、３分、４℃）してＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ、５５４７２３）２００μＬで２回洗浄した後、１Ｘ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液を２００μＬずつ入れて、細胞ペレットをＦＡＣＳチューブ（ＢＤ ｆａｌｃｏｎ、３５２０５２）に移して、フローサイトメーターでサイトカインの発現を分析した。その結果、Ｋ５６２ターゲット細胞と接触した時、ＮＫ細胞とＬｏｇ－ＮＫ細胞の主要サイトカインであるＣＤ１０７ａ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αとも６０％以上増加し、ＮＫ細胞とＬｏｇ－ＮＫ細胞の両グループ間の有意な差はなかった（図１０Ｂ）。

実施例９．Ｌｏｇ－ＮＫ細胞のインビトロ低免疫原性評価
作製されたＬｏｇ－ＮＫの体内低免疫原性を評価するために、インビトロ混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）試験を行った。ＣＤ８（＋）Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－４９５）を用いて、次のようにＣＤ８（＋）Ｔ細胞を分離した。供与者の血液から得たＰＢＭＣをＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）に溶解した０．５％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で１回洗浄した後に得られた細胞ペレットを１×１０^７／１０μＬとなるようにＭＡＣＳ緩衝液で懸濁させた。前記懸濁液にビオチン－抗体カクテルを１×１０^７／１０μＬの濃度となるように添加してよく混合し、４℃で５分間反応させた。反応が終わると、再度１×１０^７の細胞ベースで３０μＬの濃度でＭＡＣＳ緩衝液を添加し、１×１０^７の細胞ベースで２０μＬのＣＤ８（＋）Ｔ細胞マイクロビーズカクテルを追加的に入れた後に、４℃で１０分間反応した。反応が終わった細胞懸濁液をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通過させて、ＣＤ８を発現するＴ細胞のみを分離した。

分離されたＣＤ８（＋）Ｔ細胞を培養するために、さらに他の供与者から供与されたＰＢＭＣを２，０００ｃＧｙで放射線照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）した後、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞と１：１の比率で混合し、７日間培養した。同様の方法でＰＢＭＣを用意して７日間培養したＣＤ４（＋）Ｔ細胞とＣＤ８（＋）Ｔ細胞を１：１の比率で混合し、抗－ＣＤ３（１μｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＩＬ－２（１００Ｕ／ｍＬ）、１０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養した。７日間さらに培養して、最終１４日培養後に実験に使用した。前記使用した同一の供与者由来ＰＢＭＣを２０００ｃＧｙで再度放射線照射した後、培養されたＣＤ８（＋）Ｔ細胞と１：１で混合し、１週間さらに培養した。計１４日間培養したＣＤ８（＋）Ｔ細胞をエフェクター細胞として用い、ＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫをターゲット細胞として用いて、Ｌｏｇ－ＮＫがＣＤ８（＋）Ｔ細胞の攻撃を回避できるかを、実施例３と同様の方法で細胞死滅能の測定により確認した。図１１Ａに示すように、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞によって溶解する細胞の比率がＬｏｇ－ＮＫよりＮＫが３倍以上高く、この結果から、Ｌｏｇ－ＮＫがＣＤ８（＋）Ｔ細胞の攻撃を回避できることを確認した。ＭＬＲ反応がよく起こるように、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞とＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ細胞のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃタイプは１００％不一致になり、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の培養に使用する放射線照射されたＰＢＭＣはＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ細胞のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃタイプと８３％一致する条件で進行させた。

また、ＮＫとＬｏｇ－ＮＫをＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ３４５５４）で染色した後、３０：１のＣＤ８（＋）Ｔ：ＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫの比率となるようにＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、１０００ＩＵ ＩＬ－２）培地に１．２×１０^６／ｍＬのＣＤ８（＋）Ｔ細胞１００μＬと４×１０^４／ｍＬのＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫをそれぞれ１００μＬずつ９６平面ウェルプレートに３ウェルずつ入れた。プレートは細胞培養インキュベータの内部に設けられたＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、生きている状態で毎時間ウェルイメージを保存した後、イメージからＣＦＳＥ蛍光陽性細胞のみ計数する分析を実施した。その結果、ＮＫはＣＤ８（＋）Ｔ細胞と共培養する場合、時間の経過とともに最初にウェルに入れた細胞に比べてその比率が減少するのに対し、Ｌｏｇ－ＮＫは最初にウェルに入れた細胞数を維持する結果を確認することができた（図１１Ｂ）。

実施例１０：ＣＩＩＴＡ遺伝子ノックアウトのための最適なｇＲＮＡ配列の選定
１０－１）遺伝子はさみを用いたＣＩＩＴＡおよびＲＦＸＡＮＫ遺伝子のノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）
ヒトのＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＰで構成されている。ＨＬＡ－ＤＲ／ＤＱ／ＤＰを発現しないＮＫ細胞を作製するために、遺伝子はさみ技術を用いて、主要調節因子（ｍａｓｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）として知られたＣｌａｓｓ ＩＩ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＩＩＴＡ）または転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であるＲＦＸＡＮＫ（ＲＦＸ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｋｙｒｉｎ－ｃｏｎｔａｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の所望する部分を、以下の方法で伝達してＣＩＩＴＡまたはＲＦＸＡＮＫの発現を抑制した。

表１０に挙げられたＣＩＩＴＡまたはＲＦＸＡＮＫをターゲットとするｇＲＮＡ候補配列は、それぞれ実施例１と同様の方法でＲＮＰ反応液を製造し、反応液は常温で５分以上反応後６０分以内に使用した。

製造したＲＮＰ反応液は細胞数１～４×１０^６まで使用可能な用量であり、ＡＤＡＭ細胞計数器（ＡＤＡＭ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ、ナノエンテック）を用いてＮＫ細胞数を測定した後、２×１０^６個の細胞を使用した。以後の実験過程および細胞培養は実施例１と同様の方法で行った。

１０－２）フローサイトメトリーのためのＮＫ細胞染色
ＮＫ細胞のＣＩＩＴＡまたはＲＦＸＡＮＫ遺伝子のノックアウト程度を確認するために、実施例１０－１）でＣＩＩＴＡ ＲＮＰ反応液を処理したＮＫ細胞を染色した後、フローサイトメトリーを行った。２×１０^５個のＮＫ細胞に２％ＦＢＳを含んでいる２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を入れて懸濁し、２，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離した後、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を浮遊させ、蛍光物質を含む抗体を加えた後（表１１）、４℃で３０分間インキュベーションした。３０分後、２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を加えて、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、３００μＬの固定溶液を入れた後、フローサイトメーターであるＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析し、その結果を図１２に示した。

ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩのノックアウト程度はＨＬＡ－ＤＲの発現で確認し、テストした計２５個のｇＲＮＡ配列のうち対照群である野生型ＮＫ細胞に比べてＣｐｆ１－＃１ ｇＲＮＡを処理したＮＫ細胞は２８．２％のＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウト効率を示し、Ｃｐｆ１－＃５ ｇＲＮＡを処理したＮＫ細胞は１７．７％、Ｃｐｆ１－＃８ ｇＲＮＡを処理したＮＫ細胞は１９．９％のノックアウト効率を確認した。そして、ＭＡＤ７－＃２１ ｇＲＮＡを処理したＮＫ細胞は１５．５％、ＭＡＤ７－＃２５ ｇＲＮＡを処理したＮＫ細胞は４０．１％のノックアウト効率を確認した。したがって、ＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウト効率が最も優れたＭＡＤ７ヌクレアーゼと＃２５ ｇＲＮＡを選定して以後の実験を進行させた。また、図１３に示すように、ＲＮＰ反応液の伝達後、培養３－７日にＣＩＩＴＡのノックアウト効率を確認した結果、培養３日で対照群ＮＫ細胞対比２１．３％から培養７日で５０．４％に増加した。このような結果は、ＮＫ細胞にＣＩＩＴＡノックアウト後、培養期間が長くなるほどノックアウト効率が増加することを示すものである。

実施例１１：Ｂ２ＭとＣＩＩＴＡ遺伝子が除去されたＮＫ細胞の作製条件の最適化
Ｂ２ＭとＣＩＩＴＡ遺伝子が同時に除去されたＮＫ細胞を作製するために、図１４Ａに示すように２つの方法で作製し、Ｂ２ＭとＣＩＩＴＡ遺伝子のダブルノックアウト効率を比較した。作製方法１では、１．５ｍＬ遠心分離チューブに１３μＬの１Ｘ ＰＢＳと２μＬの３．２μＭ ＭＡＤ７と１０μＬの１０μＭ Ｂ２Ｍ ｇＲＮＡを混合した後、室温で５分以上反応させてＲＮＰ反応液チューブ１を用意する。他の１．５ｍＬ遠心分離チューブには、１３μＬの１Ｘ ＰＢＳと２μＬの３．２μＭ ＭＡＤ７と１０μＬの１０μＭ ＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡを室温で５分以上反応させてＲＮＰ反応液チューブ２を用意する。用意されたＲＮＰ反応液チューブ１と２を混合して計５０μＬのＲＮＰ反応液を作った。以後の実験過程は、実施例１０と同様の方法で２×１０^６個の培養７日目のＮＫ細胞に進行させた。作製方法２では、２×１０^６個の培養７日目のＮＫ細胞にＣＩＩＴＡをノックアウトし、４日間培養した後、２×１０^６個の培養１１日目のＮＫ細胞にＢ２Ｍを順次にノックアウトした。具体的な実験過程および細胞培養は、実施例１と同様の方法で行った。ノックアウト後に培養したＮＫ細胞は、実施例１０－２）と同様の方法でＦＡＣＳ用抗体で染色した後、フローサイトメーターを用いてＢ２ＭとＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウト効率を確認した。

図１４Ｂから確認できるように、３人の供与者から分離されたＮＫ細胞で前記作製方法で実験した結果、供与者１から作製方法１で作製したＮＫ細胞のＢ２ＭとＣＩＩＴＡのダブルノックアウト効率は対照群ＮＫ細胞対比３２．４％であり、作製方法２で作製したＮＫ細胞の効率は１７％であった。残りの２人の供与者から分離したＮＫ細胞でも作製方法２より作製方法１の方でより高いダブルノックアウト効率を示した。

作製方法１で作製したＢ２ＭとＣＩＩＴＡがダブルノックアウトされたＮＫ細胞からゲノムＤＮＡを分離して全長遺伝体シーケンシング（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。Ｂ２ＭおよびＣＩＩＴＡそれぞれのｇＲＮＡ配列と不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の核酸配列が４個以下で存在するゲノムＤＮＡ配列をオフ－ターゲットの可能性がある部位と仮定し、実際にオフ－ターゲットによる挿入／欠失が発生したか否かを確認した。その結果、Ｂ２Ｍ ｇＲＮＡ配列で３個のオフ－ターゲット予想部位が確認され（図１４Ｃ）、ＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡ配列で２個のオフ－ターゲット予想部位が確認された（図１４Ｆ）。遺伝子挿入／欠失に対する配列分析の結果を確認して、すべてのオフ－ターゲット予想部位では挿入／欠失が起こらなかったことを確認し、結果として、＃８ ｇＲＮＡ（配列番号８）と＃２５ ｇＲＮＡ（配列番号４４）を用いたＢ２ＭとＣＩＩＴＡのダブルノックアウトはオフ－ターゲット予想部位で変異が起こらないことを確認した（図１４Ｄ、図１４Ｅ、図１４Ｇおよび図１４Ｈ）。

実施例１２：Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞（Ｂ２Ｍ－／ＣＩＩＴＡ－／ＨＬＡ－Ｅ＋ ＮＫ細胞）の作製
Ｂ２Ｍ－／ＨＬＡ－Ｅ＋発現特性を有するＬｏｇ－ＮＫにＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトして、ＩＩ型ＨＬＡタンパク質であるＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱの発現も抑制させたＨＬＡ－ＡＢＣ^－／ＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ^－／ＨＬＡ－Ｅ^＋の表現型を有するＮＫ細胞を、前記図１４Ａの作製方法１または作製方法２で作製して「Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ」細胞と名付けた。Ｉ型ＨＬＡとＩＩ型ＨＬＡの発現が同時に抑制された同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）低免疫原性ＮＫ細胞は、体内注入時、宿主のＣＤ８（＋）Ｔ細胞、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞およびＮＫ細胞による免疫反応を回避できると予想した。実施例１１の作製方法１と同様の方法でＢ２ＭとＣＩＩＴＡをノックアウトしたＮＫ細胞を作製した後、ＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）装置を用いてＢ２Ｍを発現しないＮＫ細胞を分離し、再度ＨＬＡ－ＤＲを発現しない細胞を順次に分離した。ビオチンが標識されたＢ２Ｍ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４℃で２０分間反応させた後、２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液（０．５％ＦＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡが溶解したＰＢＳ）を入れて、１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液を除去した後、８０μＬのＭＡＣＳ緩衝液を入れて、２０μＬの抗－ビオチンＭｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を混合した後、４℃で１５分間反応した後、２ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を入れて、１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。５００μＬの洗浄緩衝液でＮＫ細胞を懸濁した後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ^ＴＭ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に付着したＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に細胞を流した。その後、３ｍＬの洗浄緩衝液を２回流して、カラムに結合しないＢ２Ｍ^－細胞を回収した。回収した細胞は再度１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離上澄液を除去した後、ペレット状態の細胞に８０μＬの洗浄緩衝液を入れて、２０μＬの抗－ＨＬＡ－ＤＲマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を混合した後、４℃で１５分間反応させ、２ｍＬの洗浄緩衝液を入れた後、１，２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。５００μＬの緩衝液でＮＫ細胞を懸濁した後、ＱｕａｄｒｏＭＡＣ^ＴＭ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に付着したＬＤカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に細胞を流し、１ｍＬの洗浄緩衝液を２回流して、最終的にＢ２Ｍ^－／ＨＬＡ－ＤＲ^－ＮＫ細胞を回収した。分離されたＢ２Ｍ^－／ＨＬＡ－ＤＲ^－ ＮＫ細胞は細胞数を測定した後、直ちに実施例３－２）と同様の方法でレンチウイルスベクターを用いて単鎖ＨＬＡ－Ｅ三量体（ｓｃＨＬＡ－Ｅ）を導入した。１×１０^６／ｍＬの濃度でＮＫ細胞を培地に浮遊させて、好適な大きさのウェルプレートに入れて培養した。

実施例１３：Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の培養および表現型発現の確認
１３－１）Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞増殖能の測定
前記実施例１２で作製されたＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の増殖能を確認するために、図１５に示すように、培養期間中の細胞増殖と細胞生存率を測定した。その結果、作製方法１で作製したＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞生存率は対照群ＮＫ細胞の生存率と大きな差はなく、対照群ＮＫ細胞の増殖は培養４３日間持続的に増加し、Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞は培養開始時点の細胞数より培養４３日で約２６８倍増加することを確認した（図１５Ａ）。作製方法２で作製したＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞は前記実施例１２の細胞分離過程後に細胞数が減少したが、以後、培養３９日まで細胞増殖が回復することを確認し、培養開始時点の細胞数より培養３９日目に約９３６倍増加することを確認した（図１５Ｂ）。

１３－２）培養期間中のＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の表現型の確認
Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の作製後、培養４３日間、ＨＬＡ－ＡＢＣとＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱの発現が持続的に抑制されるかを確認するために、実施例１１の方法で作製したＮＫ細胞を染色した後、フローサイトメーターで発現を確認した。２×１０^５個のＮＫ細胞に２％ＦＢＳを含んでいる２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を入れた後、２，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離した後、上澄液を除去する。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を浮遊させ、表１２に挙げられた抗体を加えて、４℃で３０分間反応した。以後、２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を加えて、２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した後、３００μＬの固定溶液を入れた後、フローサイトメーターであるＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で発現を分析した。その結果、図１６Ａに示すように、供与者３人ともにおいて培養２２日後にＨＬＡ－ＡＢＣとＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱの発現が同時に抑制された細胞が全体細胞中の６０％以上存在し、供与者１と２の場合、培養４３日で全体細胞中の９０％以上に増加したことを確認した。また、培養４３日目にＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞のＨＬＡ－Ｅの発現を分析した結果、対照群ＮＫ細胞に比べて、供与者１は６９．１％、供与者２は７２．３％、供与者３は５３．８％のＨＬＡ－Ｅの発現が増加していることを確認した（図１６Ｂ）。

実施例１４：Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞の抗癌能力の分析
１４－１）Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭを用いた癌細胞殺傷能力の確認
癌細胞であるＫ５６２（慢性骨髄性白血病）、ＤＵ１４５（前立腺癌）、ＨｅｐＧ２（肝癌）、ＨＣＣ１９５４（乳癌）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳癌）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（乳癌）、ＳＫＯＶ３（卵巣癌）をターゲット細胞として用いるために、それぞれ１×１０^６／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地であるａｓｓａｙ培地１ｍＬを入れて懸濁した後、３０μＬのＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理した後、１時間、３７℃のＣＯ_２培養器で反応した。反応を終えた細胞はａｓｓａｙ培地で２回洗浄した後、１×１０^５／ｍＬの濃度で用意する。エフェクター細胞であるＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯは３：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために３×１０^６／ｍＬでａｓｓａｙ培地に懸濁し、１：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために１×１０^６／ｍＬでａｓｓａｙ培地に懸濁する。用意されたエフェクター細胞は丸底の９６ウェルプレートの３つのウェルにそれぞれ１００μＬずつ入れた後、１×１０^５／ｍＬの濃度のターゲット細胞を１００μＬずつ入れた。以後の実験過程と測定値の計算方法は実施例４と同一である。

図１７Ａに示すように、Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞は、多様な癌細胞株に対して対照群ＮＫ細胞より類似または増加した癌細胞殺傷能を示した。

１４－２）ＣＦＳＥ染色を用いた癌細胞殺傷能力の確認
癌細胞であるＤＵ１４５、ＨｅｐＧ２、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＳＫＯＶ３は４×１０^４／ｍＬの濃度で１０％ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地であるａｓｓａｙ培地に懸濁した後、９６－ウェルプレートのウェルに１００μＬずつ入れて、１８－２２時間培養した後、エフェクター細胞を入れる。エフェクター細胞であるＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞は２：１のエフェクター：ターゲット細胞の比率のために８×１０^４／ｍＬで１０％ＦＢＳと１０００ＩＵ ＩＬ－２が溶解したＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した後、ターゲット細胞を培養中の９６－ウェルプレートに３つのウェルに１００μＬずつ入れる。３７℃のＣＯ_２培養器内に設けられているリアルタイム細胞映像分析器ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で７日間培養し、毎２時間の間隔で細胞イメージを保存し分析して、癌細胞殺傷能を評価した。その結果、Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞はＤＵ１４５とＭＤＡ－ＭＢ－２３１で対照群ＮＫ細胞より増加した癌細胞殺傷能を示し、それ以外の癌細胞株に対しては対照群ＮＫ細胞と類似の殺傷能を示した（図１７Ｂ）。前記結果は、Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞を作製するために遺伝子を編集し導入しても、ＮＫ細胞自らの癌細胞殺傷能が減少する現象が発生しなかったことを示す。

実施例１５：多様なｇＲＮＡ伝達方法を用いたＢ２ＭおよびＣＩＩＴＡ遺伝子のノックアウト
シャトル以外の伝達システムでも同一のノックアウト効果が発揮されるかを追加的に確認するために、Ｂ２Ｍ ｇＲＮＡまたはＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡとＭＡＤ７ヌクレアーゼのＲＮＰをＮＫ細胞に多様な方法で伝達して各遺伝子のノックアウト効率を確認した。Ｂ２Ｍ遺伝子に対しては＃８ ｇＲＮＡ（配列番号８）を用い、ＣＩＩＴＡ遺伝子に対しては＃２５ ｇＲＮＡ（配列番号４４）を用いた。それぞれの伝達方法に１×１０^６個の同数のＮＫ細胞を使用した。ノックアウト当日はｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、３１９８５０６２）５００μＬの培地に細胞を浮遊させて、１２ウェルプレートに細胞を培養し、翌日にＮＫ細胞培養培地１ｍＬを各ウェルに添加した。

方法１は、２６μＬのＰＢＳ、４０μＭのＭＡＤ７ヌクレアーゼ４μＬと１００μＭのＢ２ＭまたはＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡ２μＬを混合した後、室温で５分以上反応させてＲＮＰ反応液を製造し、４８μＬのα－ＭＥＭ培地に５μＭのＦＳＤ６４ｄ１シャトル２μＬを添加した後、前記反応済みの５０μＬのＲＮＰ反応液に混合してＮＫ細胞に処理後、１分３０秒間常温で反応させた。詳細な伝達方法は実施例１で記述された内容と同一に進行させた。

方法２は、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）でｇＲＮＡをＮＫ細胞に伝達し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）装置とＨｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、ＶＰＡ－１００５）を用いた。Ｋｉｔで提供される溶液１００μＬに、方法１と同量のｇＲＮＡとＭＡＤ７ヌクレアーゼおよびＮＫ細胞を混合してキキュベットに入れた後、Ｕ－０１プログラムで電気穿孔を実施した。

方法３は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＭＡＸ００００８）を用いた。１２－ウェルプレートに１×１０^６個のＮＫ細胞を予め浮遊させて用意し、１．５ｍＬチューブに方法１と同量のｇＲＮＡとＭＡＤ７ヌクレアーゼおよびＣａｓ９ ｐｌｕｓ試薬２．５μＬ、ｏｐｔｉ－ＭＥＭ２５μＬを混合してチューブ１を製造して常温で反応させた。他の１．５ｍＬチューブにＣＲＩＳＰＲＭＡＸ試薬１．５μＬとｏｐｔｉ－ＭＥＭ２５μＬを混合してチューブ２を用意した後、チューブ１に用意された反応液を混合して、５分間常温で反応させた後、ＮＫ細胞に処理した。

方法４は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１６６８０２７）を用いた。１２－ウェルプレートに１×１０^６個のＮＫ細胞を予め浮遊させて用意し、１．５ｍＬチューブに方法１と同量のｇＲＮＡとＭＡＤ７ヌクレアーゼおよびｏｐｔｉ－ＭＥＭ２５μＬを混合してチューブ１を製造した。他の１．５ｍＬチューブにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ ２．５μＬとｏｐｔｉ－ＭＥＭ２５μＬを混合してチューブ２を用意した後、チューブ１に用意された反応液を混合して、５分間常温で反応させた後、ＮＫ細胞に処理した。

Ｂ２Ｍ遺伝子をノックアウトさせたＮＫ細胞は培養３日後にＢ２Ｍ抗体を用いて、ＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトさせたＮＫ細胞は培養７日後にＨＬＡ－ＤＲ抗体を用いてフローサイトメトリーで遺伝子発現の減少を確認した。フローサイトメーターで測定した野生型ＮＫの遺伝子発現量を１に換算した後、Ｂ２ＭまたはＣＩＩＴＡ遺伝子をノックアウトさせたＮＫ細胞の発現量をＮＫ細胞対比の比率で計算して遺伝子発現の減少効率を確認した。図１８Ａに示すように、対照群ＮＫ細胞のＢ２Ｍ発現量を１とした時、方法１は０．４６、方法２は０．７４、方法３は０．８９、方法４は０．７４でＢ２Ｍの発現が減少し、伝達方法による発現量減少値の差は統計的有意性を示さなかった。図１８Ｂに示すように、対照群ＮＫ細胞のＨＬＡ－ＤＲ発現量を１とした時、方法１は０．４８、方法２は０．５３、方法３は０．６７、方法４は０．６６で、ＣＩＩＴＡのノックアウトによってＨＬＡ－ＤＲの発現が減少し、伝達方法による発現量減少値の差は統計的有意性を示さなかった。実施例１４の結果から、本発明で使用するＢ２Ｍ ｇＲＮＡまたはＣＩＩＴＡ ｇＲＮＡを含む遺伝子編集システムは、多様な伝達方法を用いて目的細胞に伝達できることを確認した。

実施例１６：Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞のインビトロ低免疫原性評価
Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞は表面にＩ型ＨＬＡとＩＩ型ＨＬＡの発現が抑制されているＮＫ細胞であるので、低免疫原性の特性を有すると予想した。体内注入時、授与者のＣＤ４（＋）Ｔ細胞とＣＤ８（＋）Ｔ細胞による攻撃を回避して長く生存できるかを確認するために、インビトロ混合リンパ球反応試験（ＭＬＲ ａｓｓａｙ）を行った。まず、ＭＬＲ反応がよく起こるように、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞またはＣＤ４（＋）Ｔ細胞と野生型ＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ１タイプは１００％不一致になり、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞またはＣＤ４（＋）Ｔ細胞培養のために使用する放射線照射されたＰＢＭＣは野生型ＮＫまたはＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲＢ１タイプと３７．５％一致する条件で進行させた。ＰＢＭＣからＣＤ８（＋）Ｔ細胞を分離する方法は、実施例９に記述した過程と同一であり、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞を分離するためにＣＤ４（＋）Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－５３３）を使用し、方法は次の通りである。ＰＢＭＣをＭＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した後、細胞ペレットを１×１０^７／４０μＬとなるように懸濁させ、ビオチン－抗体カクテルを１×１０^７細胞／１０μＬを入れて、４℃で５分間反応させた。以後、再度１×１０^７／３０μＬのＭＡＣＳ緩衝液を加え、１×１０^７／２０μＬのＣＤ４（＋）Ｔ細胞のマイクロビーズカクテルを入れた後、４℃で１０分間反応した。反応が終わった細胞懸濁液をＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に通過させて、ＣＤ４を発現するＴ細胞のみを分離した。ＨＬＡタイプが３７．５％一致するＰＢＭＣを２，０００ｃＧｙで放射線照射した後、分離したＣＤ４（＋）Ｔ細胞またはＣＤ８（＋）Ｔ細胞と１：１の比率で混合し、７日間培養した。同様の方法でＰＢＭＣを用意して７日間培養したＣＤ４（＋）Ｔ細胞とＣＤ８（＋）Ｔ細胞を１：１の比率で混合し、７日間さらに培養して、最終１４日培養後に実験に使用した。対照群ＮＫ細胞とＬｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞をＣＦＳＥで蛍光染色した後、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞またはＣＤ４（＋）Ｔ細胞をエフェクター細胞：ターゲット細胞１０：１の比率を作るために、実施例９と同様の方法で希釈して９６平面ウェルプレートに入れた。ＣＤ４（＋）Ｔ細胞を入れたウェルには２，０００ｃＧｙで放射線照射したＣＤ３ Ｔ細胞が除去されたＰＢＭＣをＣＤ４（＋）Ｔ細胞と同一の細胞数で入れた。細胞を入れて用意した９６ウェルプレートは３７℃のＣＯ_２培養器で培養しながら、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて２時間に１回ずつＣＦＳＥ蛍光陽性細胞のみ計数する分析を実施した。その結果、図１９Ａに示すように、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞と４日間共培養する場合、Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞は、対照群ＮＫ対比最大５倍以上の細胞が存在することを確認した。また、Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞はＣＤ４（＋）Ｔ細胞および放射線照射したＰＢＭＣと共に４日間の共培養後、対照群ＮＫ対比１．６倍以上の細胞が存在することを確認した（図１９Ｂ）。これらの結果を通じて、Ｌｏｇ－ＮＫ－ＣＩＩＴＡ ＫＯ細胞がＣＤ４（＋）Ｔ細胞とＣＤ８（＋）Ｔ細胞の攻撃を野生型ＮＫ細胞より著しく高い効率で回避できることが分かった。

以上、本発明の特定部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施形態に過ぎず、よって、本発明の範囲が制限されるものではないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物によって定義される。

Claims (24)

1. ＩＩ型ＨＬＡタンパク質の発現を抑制する核酸分子を有効成分として含む哺乳類細胞の免疫原性阻害用組成物。
2. 前記核酸分子は、前記ＩＩ型ＨＬＡタンパク質またはその活性化タンパク質をエンコーディングするヌクレオチド配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをエンコーディングするヌクレオチドであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＩＩ型ＨＬＡタンパク質の活性化タンパク質は、ＣＩＩＴＡ（Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）タンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
4. 前記組成物は、ＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼエンコーディングヌクレオチドを追加的に含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
5. 前記ｇＲＮＡは、配列リスト第２０配列、配列リスト第２２配列、配列リスト第２４配列、配列リスト第２７配列、配列リスト第２９配列、配列リスト第３０配列、配列リスト第４０配列および配列リスト第４４配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
6. 前記組成物は、β２－マイクログロブリンタンパク質の発現を抑制する核酸分子を追加的に含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
7. 前記核酸分子は、前記β２－マイクログロブリンタンパク質をエンコーディングするヌクレオチド配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをエンコーディングするヌクレオチドであることを特徴とする請求項６に記載の組成物。
8. 前記記組成物は、ＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼエンコーディングヌクレオチドを追加的に含むことを特徴とする請求項７に記載の組成物。
9. 前記誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列リスト第１配列、配列リスト第８配列、配列リスト第９配列および配列リスト第１４配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識することを特徴とする請求項７に記載の組成物。
10. 前記ＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９）、Ｃｐｆ１（ＣＲＩＳＰＲ ｆｒｏｍ Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）およびＭＡＤ７からなる群より選択されることを特徴とする請求項４または８に記載の組成物。
11. 前記組成物は、Ｉ型ＨＬＡタンパク質をエンコーディングする核酸分子を追加的に含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
12. 前記Ｉ型ＨＬＡタンパク質は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
13. 前記細胞は、移植用同種（Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）または自家（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）細胞であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
14. 前記細胞は、幹細胞または免疫細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の組成物。
15. 前記免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。
16. 請求項１～９および請求項１１～１５のいずれか１項に記載の組成物を用いて製造された低免疫原性哺乳類細胞。
17. 次のステップを含む低免疫原性哺乳類細胞の製造方法：
    （ａ）哺乳類個体から分離された細胞においてβ２－マイクログロブリンタンパク質、ＩＩ型ＨＬＡタンパク質、ＩＩ型ＨＬＡタンパク質の活性化タンパク質およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるタンパク質の発現を抑制するステップ；および
    （ｂ）前記細胞にＨＬＡ－Ｅ遺伝子を導入するステップ。
18. 前記ステップ（ａ）は、前記タンパク質をエンコーディングするヌクレオチド配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または前記ｇＲＮＡをエンコーディングするヌクレオチドおよびＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼまたはＲＮＡ－誘導エンドヌクレアーゼエンコーディングヌクレオチドを前記細胞に導入することにより行われることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 前記β２－マイクログロブリンタンパク質をエンコーディングするヌクレオチド配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列リスト第１配列、配列リスト第８配列、配列リスト第９配列および配列リスト第１４配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識することを特徴とする請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＩＩ型ＨＬＡタンパク質の活性化タンパク質は、ＣＩＩＴＡ（Ｃｌａｓｓ ＩＩ Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）タンパク質であることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
21. 前記ＣＩＩＴＡタンパク質をエンコーディングするヌクレオチド配列を特異的に認識する誘導ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、配列リスト第２０配列、配列リスト第２２配列、配列リスト第２４配列、配列リスト第２７配列、配列リスト第２９配列、配列リスト第３０配列、配列リスト第４０配列および配列リスト第４４配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはこれらの相補的な配列を特異的に認識することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. 前記ステップ（ｂ）は、前記ステップ（ａ）が完了した後、２～４日経過後に行われることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
23. 前記ステップ（ａ）の後に、前記タンパク質の発現が抑制された細胞を分離するステップを追加的に含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
24. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物を哺乳類細胞に導入するステップを含む哺乳類細胞の免疫原性阻害方法。