JP2023532273A - 二重特異性スーパーカイン及びその使用 - Google Patents

Abstract

二重特異性ヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）サイトカイン融合体を提供する。特に、提供するのは、がんの治療のために、単独療法の用途、及び抗ＰＤ－１抗体との併用療法で使用する際に、ＩＬ－２Ｒβ受容体に対する結合能が、野生型ＩＬ－２と比べて向上している二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体である。提供するのは、このような二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を含む医薬組成物でもある。

Description

本願は、米国特許法第１１９条の下、２０２０年６月２４日に出願した米国特許出願第６３／０４３，２２７号、２０２０年１０月１９日に出願した同第６３／０９３，７２４号、２０２０年１０月２０日に出願した同第６３／０９４，３２２号、２０２１年３月２４日に出願した同第６３／１６５，６００号及び２０２１年３月２４日に出願した同第６３／１６５，７３８に対する優先権を主張するものであり、これらの特許出願はいずれも、参照により、その全体が本明細書に明示的に援用される。

インターロイキン２（ＩＬ－２）は、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞によって主に産生される多能性のサイトカインであり、正常な免疫応答をもたらす際に重要な役割を果たす。ＩＬ－２は、活性化Ｔリンパ球の増殖及び増加を促進し、Ｂ細胞の成長を増強し、単球及びナチュラルキラー細胞を活性化する。ＩＬ－２の試験が行われたのは、これらの活性が理由であり、認可済みのがん治療薬（アルデスロイキン、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））として用いられている。真核細胞では、ヒトＩＬ－２は、１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、このポリペプチドから、２０アミノ酸が除去されて、分泌される成熟ＩＬ－２が生成される（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ １９８３）。Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ １９８４）、昆虫細胞（Ｓｍｉｔｈ １９８５）及び哺乳動物ＣＯＳ細胞（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ １９８３）で、組み換えヒトＩＬ－２が作製されてきた。

インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、最初はＴ細胞成長因子として特定された４αヘリックスバンドルのＩ型サイトカインである（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９３：１００７（１９７６））が、その後、広範な作用を有することが示されている。ＩＬ－２は、Ｔヘルパーの分化（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８：４４５（２０１０）、Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：１２８８（２００８）及びＬｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：５５１（２０１１））と、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の発生（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２４１：６３（２０１１））を促進し、ナチュラルキラー活性及びリンフォカイン活性化キラー活性を誘導し（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３８：１３（２０１３））、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を媒介する（Ｌｅｎａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８５８（１９９１））。

ＩＬ－２は、インターロイキン２受容体α（ＩＬ－２Ｒα、ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ１２２）及びインターロイキン２受容体γ（ＩＬ－２Ｒγ、ＣＤ１３２、共通γ鎖）という３つの異なる受容体と相互作用することによって機能する。特定すべき最初の受容体は、Ｔ細胞が活性化すると現れる５５ｋＤのポリペプチド（ｐ５５）であるＩＬ－２Ｒαであったとともに、その受容体は、元々は、Ｔａｃ（Ｔ活性化）抗原と呼ばれていた。ＩＬ－２Ｒαは、ＩＬ－２と、およそ１０^－８ＭのＫ_ｄで結合し、「低親和性」ＩＬ－２受容体としても知られる。ＩＬ－２Ｒαのみを発現している細胞に、ＩＬ－２が結合しても、いずれの検出可能な生物学的応答も起こらない。大半の状況では、ＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγという３つの異なる受容体を通じて機能する。休止Ｔ細胞のような大半の細胞は、ＩＬ－２に応答しない。ＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγしか発現せず、ＩＬ－２に対する親和性が低いからである。休止Ｔ細胞は、刺激すると、比較的親和性の高いＩＬ－２受容体ＩＬ－２Ｒαを発現する。ＩＬ－２が、そのＩＬ－２Ｒαに結合すると、この受容体が、順次にＩＬ－２Ｒβ及びＩＬ－２Ｒγと結合して、Ｔ細胞の活性化をもたらす。ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性の増強により、作用を増大させたＩＬ－２「スーパーカイン」が以前開発された（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４８４：５２９（２０１２））。

ＩＬ－２スーパーアゴニストを含め、ＩＬ－２に関わる豊富な知識にもかかわらず、当該技術分野においては、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体に対するニーズが依然として存在する。本発明は、このニーズを満たし、ＩＬ－２スーパーアゴニストまたはＩＬ－２アゴニストを、第２のサイトカインとの二重特異性融合体として提供する。いくつかの実施形態では、この二重特異性融合体のＩＬ－２ムテイン部分は、野生型ＩＬ－２を基準にして番号付けすると、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含む。

ＩＬ－２は、免疫系に対して広範な作用を及ぼし、免疫の活性化及びホメオスタシスの両方の調節において重要な役割を果たす。二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、免疫系刺激因子として説明されており、がんの治療のために、単独療法とともに、抗ＰＤ－１抗体との併用での用途も見られる。

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインを第２のサイトカインと融合したものを含む二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を提供する。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインが、Ｋ４３Ｎという置換をさらに含み、この番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである、請求項１に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換及びＦ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、表２、４、５及び／または６に記載されているようなＩＬ－２ムテインである。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、表２、４、５、６、１０及び／または１２、及び／または図５４に記載されているような配列を含む。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９または配列番号１５０を含む。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９またはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３を含む。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、Ｆｃ抗体断片をさらに含む。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗体断片は、ヒトＦｃ抗体断片である。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗体断片は、Ｎ２９７Ａという置換を含む。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、アルブミンをさらに含む。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ１５及びＩＬ－１８からなる群から選択されている。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、第２のサイトカインは、ＩＬ－４またはＩＬ－１３である。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、第２のサイトカインは、表７及び／または表８及び／または表１２及び／または表２８及び／または図５４に記載されているようなものである。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、ＩＬ－２Ｒβに対する結合能が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて向上している。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて高い。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体では、ＩＬ２Ｒαとの結合が妨げられる（すなわち、ＩＬ２Ｒαにあまり結合しない）。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、ＣＤ２５に対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて低下している。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８及び２１３、配列番号１４９及び２１３、配列番号１５０、配列番号１５１及び２１４、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７及び２１３、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１及び２１５、配列番号１６２及び２１６、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５及び２１３、配列番号１６６及び２１３もしくは配列番号１６７及び２１７、または表１２、表２８もしくは図５４の配列を含む。

その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２（１：１ＫｉＨ）、Ｆｃ－Ａ１１（１：２）、Ｆｃ－Ａ１１（１：２）、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）、Ｆｃ４－ＭＤＮＡ４１３（１：２）、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ（１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ（２：１）、ＭＤＮＡ－１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ（２：１）、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（１：２）、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２（２：１：１ＫｉＨ）、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２（２：１：１ＫｉＨ）、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）バージョン１、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）バージョン２、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（１：１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（１：１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ（１：１：１ＫＩＨ）またはＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３を含む。

本発明は、がんの治療方法であって、本明細書に記載されているような二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を投与することを含む方法も提供する。

いくつかの実施形態では、そのがんは、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌及び脳腫瘍からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、そのがんは、結腸癌である。

本発明は、がんの治療方法であって、
（ｉ）抗ＰＤ－１の抗体もしくは阻害剤、または抗ＰＤ－Ｌ１の抗体もしくは阻害剤と、
（ｉｉ）本明細書に記載されているような二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体と、
を含む配合治療薬を投与することを含む方法も提供する。

いくつかの実施形態では、その抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤は、ニボルマブ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ）、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＳＨＲ－１２１０（ＣＴＲ２０１６０１７５及びＣＴＲ２０１７００９０）、ＳＨＲ－１２１０（ＣＴＲ２０１７０２９９及びＣＴＲ２０１７０３２２）、ＪＳ－００１（ＣＴＲ２０１６０２７４）、ＩＢＩ３０８（ＣＴＲ２０１６０７３５）、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＣＴＲ２０１６０８７２）、ならびに米国特許出願公開第２０１７／００８１４０９号または表３８に列挙されているようなＰＤ－１抗体からなる群から選択する。

いくつかの実施形態では、その抗ＰＤ－Ｌ１の抗体または阻害剤は、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブからなる群から選択する。

いくつかの実施形態では、そのがんは、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌及び脳腫瘍からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、そのがんは、結腸癌である。

本発明は、本明細書に記載されているような二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。

本発明は、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤と、本明細書に記載されているような二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の配列の例を示す。 ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４の配列の例を示す。 例示的なＨ９－Ｆｃ融合体の配列を示す。 例示的な腫瘍溶解性ウイルスである。 精製後のＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）［ロット：Ｔ１８４８Ａ１２］のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析の結果である。 精製後のＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）［ロット：Ｔ１９０３Ａ０８］のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析の結果である。 精製後のＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）［ロット：Ｔ１９１４Ｂ０８］のＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析の結果である。 ゲーティング方法である。ＰＢＭＣをＩＬ－２（２５ｎＭ）で１５分刺激してから染色し、フローサイトメトリーによる分析を行った。単一のリンパ球を同定し、そのリンパ球から、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）、ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）及び非Ｔｒｅｇ ＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ２５－ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－）をゲーティングした。各免疫細胞サブセットにおいて、ｐＳＴＡＴ５陽性細胞の頻度を求めた。 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールである。Ａ）図４に記載されている刺激及びゲーティング法の後、様々な免疫サブセットを特定するために使用する、ｐＳＴＡＴ５以外のすべての抗体を含めて、各集団において、ｐＳＴＡＴ５＋ゲートをかけるのに使用できるＦＭＯコントロールを供給した。Ｂ）ＦＯＸＰ３及びＣＤ２５のＦＭＯを用いて、Ｔｒｅｇ集団を求めた。 ｐＳＴＡＴ５ ＰＢＭＣでのＩＬ－２、ＩＬ２－Ｆｃ、ＭＤＮＡ１０９バリアント及び二重特異性スーパーカインの代表的な用量応答性である。グラフ及びＥＣ_５０値は、非線形回帰を用いて計算した。各データポイントは、１個である。 ナイーブＣＤ８Ｔ細胞のＥＣ_５０（左）及びＮＫ細胞のＥＣ_５０（右）のＴｒｅｇのＥＣ_５０に対する比率である。 様々な用量のＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（左）及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（右）の投与を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率である。 様々な用量のＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（左）及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（右）の投与を受けたＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存率である。 ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、ＣＴ２６結腸腫瘍の成長を阻害する。（ａ）ビヒクルコントロール及びＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９処置群における腫瘍の平均サイズである。（ｂ）各群における個々の腫瘍の成長結果である。それぞれの線は、１つの腫瘍を表している。ＣＲは、完全な退縮である。 ＣＴ２６腫瘍のリチャレンジ結果である。（ａ）未処置のナイーブマウス、またはＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９によってＣＴ２６腫瘍が事前に治癒したマウスの反対の側腹部に、ＣＴ２６腫瘍細胞のリチャレンジを行った。（ｂ）その時点までの全生存率である。 ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長を阻害する。各処置群の腫瘍の平均サイズ（左）、個々の腫瘍の成長（右）である。 Ａ～Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスをビヒクル（ＰＢＳ）またはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３で処置した結果である。 ４Ｔ１モデルにおいて、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の単独療法及び抗ＰＤ１との併用時の有効性試験の結果である。 ＰＢＳまたはＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）をＢ１６Ｆ１０腫瘍内に注射した結果である。注射は、移植から１４日目、１７日目及び２０日目に行った。 ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３をＣＴ２６腫瘍内に注射した結果である。注射は、１１日目、１４日目及び１７日目に行った。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞において、ヒトＩＬ－４（ｈＩＬ４）、ヒトＩＬ－１３（ｈＩＬ１３）またはマウスＩＬ－１３（ｍＩＬ１３）の存在下で、ＳＴＡＴ６シグナル伝達経路が活性化した結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を、ｈＩＬ１３と併せて、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＦｃ－ＭＤＮＡ４１３とともにインキュベートした場合に、その細胞において、ＳＴＡＴ６シグナル伝達経路が阻害した結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を、ｍＩＬ１３と併せて、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＦｃ－ＭＤＮＡ４１３とともにインキュベートした場合に、その細胞において、ＳＴＡＴ６シグナル伝達経路が阻害した結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を、ｈＩＬ４と併せて、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＦｃ－ＭＤＮＡ４１３とともにインキュベートした場合に、その細胞において、ＳＴＡＴ６シグナル伝達経路が阻害した結果である。 細胞培養液に、示されているタンパク質を添加した場合に、ＣＴＬＬ２細胞が増殖した結果である。 ＭＤＮＡ１１の概略及び結合の情報である。 ＭＤＮＡ１１では、ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対する効力の増強と、Ｔｒｅｇに対する活性の低下が見られる。 ＭＤＮＡ１１は、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、単独療法の場合及びαＣＴＬＡ４と組み合わせた場合に、腫瘍の成長を阻害するとともに、強力なメモリー応答を誘導する。ＣＴ２６腫瘍（約６０ｍｍ^３）を有するＢＡＬＢ／ｃマウスをＭＤＮＡ１１（５ｍｇ／ｋｇ、週に１回で２週間）または抗ＣＴＬＡ４（２００μｇ、週に２回で２週間）で、腹腔内注射によって処置した。さらなる処置を行わずに、２×１０^６個のＣＴ２６細胞を反対の側腹部に移植することによって（４９日目、１１６日目及び１６５日目）、リチャレンジ実験を行った。コントロールマウスでは、それぞれのリチャレンジ実験で、腫瘍の活発な成長が見られた（コントロールの代表的なデータが示されている）。 長期の（ｇｐ７０）特異的なＣＤ８ Ｔ細胞の発現により、マウスがＣＴ２６腫瘍から保護された。マウスには、安楽死の５日前に、ＣＴ２６細胞のチャレンジを行い、コントロールマウスは、週齢を適合させた。ＡＰＣ抗マウスＣＤ３ε、抗ＣＤ８ＦＩＴＣクローンＫＴ１５及びＨ－２Ｌｄ ＭｕＬＶ ｇｐ７０ Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＰＥを用いて、フローサイトメトリーによって分析した。 ＭＤＮＡ１１は、単独療法の場合及びＴＡ９９ ＭＡｂと組み合わせた場合に、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を促すことによって、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長を遅延させる。有効性試験では、１）移植から９日後、腫瘍の平均サイズが約１５ｍｍ^３になった時点に、処置を開始し、２）ＭＤＮＡ１１（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週に１回）、ＴＡ９９ ＭＡｂ（１５０μｇ、腹腔内、週に２回）を３サイクル行った。ＴＩＬ分析では、１）腫瘍の平均サイズが約５０ｍｍ^３となったら、マウスに、ＭＤＮＡ１１を１用量投与し（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、２）ＴＩＬをフローサイトメトリーによって分析した。ＴＩＬについては、フローサイトメトリーによって、１）ＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ４５^＋ＣＤ８^＋）、２）ＮＫ細胞（ＣＤ４５^＋ＮＫ１．１^＋）及び３）Ｔｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）を分析した。 ＭＤＮＡ１１では、マウス及びＮＨＰにおいて、半減期の延長が見られる。 ＭＤＮＡ１１は、ＮＨＰにおいて、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び増加を誘導するが、Ｔｒｅｇでは誘導しない。 ＴＭＥをＩＬ－２／ＩＬ－１３二重特異性スーパーカインによって調節することによって、「コールド腫瘍」を免疫学的に標的とする。「コールド」腫瘍は、腫瘍誘発性のＴＭＥが理由で、すなわち、１）ＣＤ８^＋細胞及びＮＫ細胞のカウント数が低く、Ｔｒｅｇのカウント数が高く、２）免疫抑制性の骨髄系細胞（すなわち、ＴＡＭ及びＭＤＳＣ）の数が多いために、チェックポイント阻害剤に応答しない。 二重特異性ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３スーパーカインは、Ｔｈ１免疫応答を誘導し、Ｔｈ２免疫応答を低減する。 ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対する効力の増強、Ｔｒｅｇに対する活性の低下（強力なＴｈ１応答）が見られたＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ（ＭＤＮＡ１１）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞において、ｈＩＬ－４／ｈＩＬ－１３の誘導によるシグナル伝達を阻害する（Ｔｈ２応答の抑制）。 ヒトＩＬ１３Ｒα２、マウスＩＬ１３Ｒα２、ヒトＩＬ１３Ｒα１、マウスＩＬ１３Ｒα１、ヒトＩＬ４Ｒ及びマウスＩＬ４Ｒを含む様々なＩＬ１３受容体及びＩＬ４受容体へのＦｃ－ｈＩＬ１３の結合を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果である。 Ａは、ヒトＩＬ１３Ｒα２に結合するＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の結合を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果である。Ｂは、マウスＩＬ１３Ｒα２に結合するＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の結合を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果である。 Ａは、ＭＤＮＡ４１３を含む様々な融合タンパク質の、ヒトＩＬ１３Ｒα１への結合を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果である。Ｂは、ＭＤＮＡ４１３を含む様々な融合タンパク質の、マウスＩＬ１３Ｒα１への結合を測定したＥＬＩＳＡアッセイの結果である。 Ａ～Ｂは、リガンドとしてのＦｃ－ＭＤＮＡ１３２（１：１ＫＩＨ）と、抗原としての受容体ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２のＢｉａｃｏｒｅ分析のセンサーグラムである。 Ａ～Ｂは、リガンドとしてのＦｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）と、抗原としての受容体ＩＬ１３Ｒα１のＢｉａｃｏｒｅ分析のセンサーグラムである。 Ａ～Ｂは、リガンドとしてのＦｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）と、抗原としての受容体ＩＬ１３Ｒα２のＢｉａｃｏｒｅ分析のセンサーグラムである。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）による、ＩＬ１３Ｒα１に対する結合親和性である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）によるＩＬ１３Ｒα１に対する結合親和性である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）によるＩＬ１３Ｒα１に対する結合親和性である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）によるＩＬ１３Ｒα１に対する結合親和性である。 Ａ～Ｂは、ヒトＰＢＭＣでのｐＳＴＡＴ５シグナル伝達アッセイの結果である。 ｐＳＴＡＴ６シグナル伝達の測定結果である。 ｐＳＴＡＴ６シグナル伝達の測定結果である。 ｐＳＴＡＴ６シグナル伝達の測定結果である。 Ａ～Ｂは、マクロファージ極性化アッセイの結果である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）による、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２に対する結合親和性である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）による、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２に対する結合親和性である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）による、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２に対する結合親和性である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）による、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２に対する結合親和性である。 ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）による、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２に対する結合親和性である。 ＣＴ２６結腸癌モデルにおいて、二重特異性コンストラクトＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９によって、腫瘍の成長が阻害された結果である。 ＣＴ２６結腸癌モデルにおいて、二重特異性コンストラクトＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９によって、腫瘍の成長が阻害された結果である。 ＣＴ２６結腸癌モデルにおいて、二重特異性コンストラクトＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９によって、腫瘍の成長が阻害された結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ２アッセイ結果である。 ＣＴＴＬ－２アッセイ結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ４アッセイ結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ４アッセイ結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１３アッセイ結果である。 ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１３アッセイ結果である。 ＴＦ－１アッセイ結果である。 ＴＦ－１アッセイ結果である。 ＴＦ－１アッセイ結果である。 ＴＦ－１アッセイ結果である。 ヒトＰＢＭＣでのｐＳＴＡＴ５アッセイ結果である。 ヒトＰＢＭＣでのｐＳＴＡＴ５アッセイ結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 様々なコンストラクトの実施形態の二重特異性配列の情報である。 酵母ディスプレイと組み合わせた指向性進化法により、調整可能なスーパーカインが得られる。 ＭＤＮＡ１０９は、アゴニスト活性の増強が見られる操作済みバージョンのヒトＩＬ－２である。 長時間作用型ＩＬ－２スーパーカインの概論である。 ＭＤＮＡ１１は、ＣＤ１２２に対する親和性が特有の形で増強された「βのみの」スーパーカインである。 ＭＤＮＡ１１は、免疫エフェクター細胞を優先的に刺激する。 ＭＤＮＡ１１では、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、単独療法での抗腫瘍有効性と、抗ＰＤ１との併用効果が見られる。 ＭＤＮＡ１１＋抗ＣＴＬＡ４は、腫瘍の消失を誘導し、リチャレンジから保護し、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を促す。 ＭＤＮＡ１１は、ＮＨＰにおいて、免疫エフェクター細胞の永続性及び持続性の増殖及び増加を誘導するが、Ｔ_ｒｅｇでは誘導しない。 Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＴＡｂ）では、腫瘍における蓄積が向上する。 ＳＴＡｂは、チェックポイント耐性及び「コールド」腫瘍を克服する。 がんにおけるＩＬ－４受容体及びＩＬ－１３受容体の役割である。 ＭＤＮＡ１３２は、腫瘍特異的な抗原を標的とする操作済みバージョンのヒトＩＬ－１３である。 ＭＤＮＡ１３２は、Ｔ細胞エンゲージャー及びチェックポイント阻害剤を腫瘍に局在化させる際に役割を果たす。 ＭＤＮＡ４１３は、アンタゴニスト活性を示す操作済みバージョンのヒトＩＬ－１３である。 Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、ＩＬ－４誘導性及びＩＬ－１３誘導性のシグナル伝達及び機能を阻害する。 二重特異性サイトカイン（ＤＵＣＫ Ｃａｎｃｅｒ）ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３の作用機序である。 ＴＦ－１アッセイ結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＳＰＲ試験結果である。 ＩＬ－４の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－４の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－４の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－４の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－４の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－１３の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－１３の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－１３の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－１３の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。 ＩＬ－１３の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害である。

本開示が、さらに容易に理解されるように、下記及び本明細書全体にわたって、特定の用語及び語句を定義する。

定義
本明細書に引用されているすべての参照文献は、完全に示されているかのように、参照により、その全体が本明細書に援用される。別段の定義がない限り、本明細書で用いられている技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２００１）により、当業者は、本開示で用いられている多くの用語の一般的な指針を得られる。適宜、市販のキット及び試薬の使用を伴う手順は概して、別段の記述がない限り、メーカーの定めたプロトコール及び／またはパラメーターに従って実施する。

本明細書で使用する場合、「ＩＬ－２」は、天然型か組み換え型かにかかわらず、野生型ＩＬ－２を意味する。成熟ヒトＩＬ－２は、Ｆｕｊｉｔａ，ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８０，７４３７－７４４１（１９８３）に記載されているように、１３３個のアミノ酸配列（追加の２０個のＮ末端アミノ酸からなるシグナルペプチドを除く）として生じる。ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列（配列番号１、完全長）は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、アクセッションロケーターＮＰ＿０００５７７．２で見られる。成熟ヒトＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号２（ヒト野生型成熟体、置換位の番号付けは、この配列に基づく）に示されている。マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩＬ－２アミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、アクセッションロケーター（配列番号３）で見られる。成熟マウスＩＬ－２のアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。
配列番号１
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
配列番号２
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ
配列番号３
ＭＹＳＭＱＬＡＳＣＶＴＬＴＬＶＬＬＶＮＳＡＰＴＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＦＫＦＹＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＬＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＣＱＳＩＩＳＴＳＰＱ
配列番号４
ＡＰＴＳＳＳＴＳＳＳＴＡＥＡＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＱＨＬＥＱＬＬＭＤＬＱＥＬＬＳＲＭＥＮＹＲＮＬＫＬＰＲＭＬＴＦＫＦＹＬＰＫＱＡＴＥＬＫＤＬＱＣＬＥＤＥＬＧＰＬＲＨＶＬＤＬＴＱＳＫＳＦＱＬＥＤＡＥＮＦＩＳＮＩＲＶＴＶＶＫＬＫＧＳＤＮＴＦＥＣＱＦＤＤＥＳＡＴＶＶＤＦＬＲＲＷＩＡＦＣＱＳＩＩＳＴＳＰＱ

本明細書で使用する場合、「ＩＬ－２ムテイン」は、インターロイキン－２タンパク質に所定の置換が行われたＩＬ－２ポリペプチドを意味する。そのＩＬ－２ムテインは、天然型のＩＬ－２ポリペプチド鎖における１つ以上の部位、または天然型のＩＬ－２ポリペプチド鎖の他の残基におけるアミノ酸の挿入、欠失、置換及び改変を特徴とする。本開示によれば、このような挿入、欠失、置換及び改変のいずれかにより、ＩＬ－２Ｒβ結合活性を保持するＩＬ－２ムテインが得られる。例示的なムテインは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上のアミノ酸の置換を含むことができる。

ムテインは、ＩＬ－２の他の位置（すなわち、ムテインの二次構造または三次構造に対する作用が最小限である位置）に、保存的な改変及び置換も含む。このような保存的置換としては、ＤａｙｈｏｆｆによってＴｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５（１９７８）に、及びＡｒｇｏｓによってＥＭＢＯ Ｊ．，８：７７９－７８５（１９８９）に説明された置換が挙げられる。例えば、グループＩ（ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ）、グループＩＩ（ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ）、グループＩＩＩ（ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ）、グループＩＶ（ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ）、グループＶ（ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ）及びグループＶＩ（ａｓｐ、ｇｌｕ）というグループのうちの１つに属するアミノ酸は、保存的変化を示す。

「ＩＬ－２を基準にして番号付けした」とは、野生型ＩＬ－２の成熟配列でアミノ酸が通常見られる位置を参照して、所定のアミノ酸を特定することを意味し、例えば、Ｒ８１は、配列番号２で見られる８１番目のアミノ酸であるアルギニンを指し、Ｌ８０は、配列番号２で見られる８０番目のアミノ酸であるロイシンを指す。Ｌ８５は、配列番号２で見られる８５番目のアミノ酸であるロイシンを指す。Ｉ８６は、配列番号２で見られる８６番目のアミノ酸であるイソロイシンを指す。Ｉ９２は、配列番号２で見られる９２番目のアミノ酸であるイソロイシンを指す。Ｆ４２は、配列番号２で見られる４２番目のアミノ酸であるフェニルアラニンを指す。Ｋ４３は、配列番号２で見られる４３番目のアミノ酸であるリシンを指す。

本明細書で使用する場合、遺伝的にコードされるＬ体のエナンチオマーであるアミノ酸であって、本開示の方法で用いるアミノ酸の略号は、従来のものであり、以下の表１に示されているとおりである。

「親水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５－１４２の正規化コンセンサス疎水性スケールによる疎水性が０未満であるアミノ酸を指す。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸には、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ）が含まれる。

「ＩＬ－２Ｒαβγ受容体を有する種類の細胞」という用語は、この種類の受容体を有することが知られている細胞、すなわち、Ｔ細胞、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、活性化単球及び活性化ＮＫ細胞を意味する。「ＩＬ－２Ｒβγ受容体を有する種類の細胞」という用語は、その種類の受容体を有することが知られている細胞、すなわち、Ｂ細胞、休止単球及び休止ＮＫ細胞を意味する。

「同一性」という用語は、ポリペプチド配列またはＤＮＡ配列に関連して本明細書で使用する場合、２つの分子間のサブユニット配列の同一性を指す。両方の分子におけるサブユニットの位置が、同じ単量体サブユニット（すなわち、同じアミノ酸残基または同じヌクレオチド）で占められているときには、それらの分子は、その位置において同一である。２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の類似性は、同じ位置の数の一次関数である。概して、最大限の一致が得られるように、配列をアラインメントする。必要な場合、同一性は、公開されている技法、ならびにＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）のような広く利用可能なコンピュータープログラムを用いて計算できる。配列同一性は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐのＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅのような配列分析ソフトウェアを、そのデフォルトパラメーターとともに用いて測定できる。

「ポリペプチド」、「タンパク質」または「ペプチド」という用語は、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、糖鎖付加もしくはリン酸化）にかかわらず、いずれかのアミノ酸残基鎖を指す。

本開示の変異体ＩＬ－２ポリペプチドが、「実質的に純粋」である場合には、そのポリペプチドでは、対象となるポリペプチド、例えば、その変異体ＩＬ－２のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、少なくとも約６０重量％（乾燥重量）であることができる。例えば、そのポリペプチドでは、対象となるポリペプチドが少なくとも約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％または約９９重量％であることができる。純度は、いずれかの適切な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。

「アゴニスト」は、標的と相互作用して、その標的の活性化を増大させるか、またはその活性化の増大を促す化合物である。

「部分アゴニスト」は、アゴニストと同じ標的と相互作用するが、部分アゴニストの投与量を増加させても、アゴニストほどは大きな生化学的及び／または生理学的な作用を及ぼさない化合物である。

「スーパーアゴニスト」（「スーパーカイン」ともいう）は、標的受容体に対する内因性アゴニストよりも大きい最大応答をもたらすことができる種類のアゴニストであり、すなわち、有効性が１００％超である。

「機能可能に連結された」は、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システム内で、またはベクターを宿主細胞に導入するときには、その宿主細胞内で）対象となるヌクレオチド配列を発現させる形で、目的のヌクレオチド配列（すなわち、ＩＬ－２ムテインをコードする配列）が、調節配列（複数可）に連結していることを意味するように意図されている。「調節配列」としては、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）が挙げられる。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照されたい。調節配列としては、多くの種類の宿主細胞で、ヌクレオチド配列の構成的発現を誘導する配列、及び特定の宿主細胞のみで、ヌクレオチド配列の発現を誘導する配列（例えば、組織特異的な調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が、トランスフォーメーションする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に左右されることがあることは、当業者には明らかであろう。本発明の発現コンストラクトを宿主細胞に導入して、それによって、本明細書に開示されているヒトＩＬ－２ムテインを産生させるか、またはその生物活性バリアントを産生させることができる。

「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」という用語は、本明細書では、同義的に使用する。このような用語は、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。後続の世代では、変異または環境的な影響のいずれかにより、特定の改変が生じる場合があるので、このような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないことがあるが、それでも、本明細書で使用する場合には、上記の用語の範囲内に含まれる。

本明細書で使用する場合、「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈、塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストランの媒介によるトランスフェクション、リポフェクション、粒子銃またはエレクトロポレーションを含め、外来の核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するためのものとして、当該技術分野で認識されている様々な技法を指す。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語としては、医薬的投与と適合する生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などが挙げられるが、これらに限らない。補足的な活性化合物（例えば抗生物質）も、本発明の組成物に組み込むことができる。

本明細書で使用する場合、「抗ＰＤ－１抗体」という用語は、阻害抗体を含め、ＰＤ－１に結合するいずれかの抗体を指す。「抗ＰＤ－１阻害剤」は、ＰＤ－１に結合して、ＰＤ－１を阻害する阻害剤を指す。このような抗ＰＤ－１の抗体及び／または阻害剤としては、ニボルマブ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ－０１１及びＭＫ－３４７５などが挙げられるが、これらに限らない。

本明細書で使用する場合、「がん」（または「がん性」）、「過剰増殖性」及び「新生物」という用語は、自律性の成長能力を持つ細胞（すなわち、急速に増殖する細胞成長を特徴とする異常な状態または病態）を指す。過剰増殖性及び新生物の疾患状態は、病的なものとして分類でき（すなわち、疾患状態を特徴づけるかもしくは構成する）、または非病的なものとして（すなわち、正常な状態から逸脱しているが、疾患状態とは関連しないものとして）分類できる。これらの用語は、侵襲性の組織病理学的な種類または段階にかかわらず、あらゆる種類のがん性の成長、発がんプロセス、転移性の組織、または悪性形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むように意図されている。「病的な過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍の成長を特徴とする疾患状態で見られる。非病的な過剰増殖性細胞の例としては、創傷の修復と関連する細胞増殖が挙げられる。「がん」または「新生物」という用語は、肺、乳房、甲状腺、リンパ腺及びリンパ組織、生殖系、胃腸器官ならびに尿生殖器管に影響を及ぼす悪性腫瘍を含む、様々な器官系の悪性腫瘍と、概して、大半の結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌及び／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、ならびに食道の癌のような悪性腫瘍を含むとみなされる腺癌を指す目的で使用する。がんとしては概して、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、小細胞肺癌を含む肺癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌及び脳腫瘍を挙げることができる。

「癌腫」という用語は、当該技術分野で認識されており、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖器系癌腫、精巣癌腫、乳房癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫及びメラノーマを含め、上皮または内分泌組織の悪性腫瘍を指す。「腺癌」は、腺組織に由来する癌腫、または腫瘍細胞が、認識可能な腺構造を形成する癌腫を指す。

本明細書で使用する場合、「造血器新生物性障害」という用語は、造血器由来の過形成細胞／新生物細胞を伴う疾患、例えば、骨髄、リンパもしくは赤血球の系統、またはその前駆体細胞に起因する疾患を指す。好ましくは、その疾患は、低分化急性白血病（例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病）に起因する。追加の例示的な骨髄障害としては、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられるが、これらに限らず（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ．ｉｎ Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７－９７において論評されている）、リンパ悪性腫瘍としては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ細胞系列ＡＬＬ及びＴ細胞系列ＡＬＬを含む）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）、ならびにワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限らない。追加の形態の悪性リンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫及びその亜型、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、ならびにリード・シュテルンベルグ病が挙げられるが、これらに限らない。

本明細書で使用する場合、「治療」、「治療すること」などの用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的な作用を得ることを指す。その作用は、疾患またはその症状を完全もしくは部分的に予防するという観点では、予防的であってよく、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒という観点では、治療的であってよい。「治療」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の治療のいずれも網羅し、（ａ）その疾患に対する素因を有するか、またはその疾患を罹患するリスクがあるが、まだその疾患と診断されていない対象において、その疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発現を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患を好転させることを含む。治療有効量は、腫瘍の数、腫瘍のサイズを低減し、及び／または生存率を上昇させる量であることができる。

「個体」、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義的に使用し、ヒト及び非ヒト霊長類（類人猿及びヒトを含む）、競技用哺乳動物（例えばウマ）、哺乳動物の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギなど）、哺乳動物のペット（イヌ、ネコなど）、ならびに齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）（ただし、これらに限らない）を含む哺乳動物を指す。

「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」という用語は、１つ以上の投与経路、ｉｎ ｖｉｖｏ送達経路または接触経路に適する生物学的に許容される製剤、気体、液体もしくは固体、またはその混合物を意味する。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的にまたは別段に望ましくないことがない物質であり、例えば、その物質は、対象に、あまり望ましくない生体作用を引き起こさずに投与できる。すなわち、このような医薬組成物は、例えば、ＩＬ－２ムテインを対象に投与する際に使用できる。特に、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含むＩＬ－２ムテインは、抗ＰＤ－１と組み合わせて、がんである対象に投与する。いくつかの実施形態では、投与するＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという位置に置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、投与するＩＬ－２ムテインは、Ｋ４３Ｎという位置に置換をさらに含む。

「単位剤形」という語句は、本明細書で使用する場合、治療する対象への単位投与として適する物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、任意に医薬用担体（賦形剤、希釈剤、ビヒクルまたは充填剤）とともに、所定の量を含み、１回以上の用量で投与すると、所望の作用（例えば、予防的または治療的作用）をもたらす。いくつかの実施形態では、治療的作用は、腫瘍の数を減少させることである。いくつかの実施形態では、治療的作用は、腫瘍のサイズを縮小させることである。いくつかの実施形態では、治療的作用は、生存率を上昇させることである。

いくつかの実施形態では、単位剤形は、液体組成物または凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）状態または凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態の組成物を含め、例えば、アンプル及びバイアル内に入っていてよく、例えば、滅菌液体担体を、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与または送達の前に加えることができる。個々の単位剤形は、多用量のキットまたは容器に含めることができる。抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＩＬ－２ムテイン、及びその医薬組成物は、投与のしやすさ、及び投与量の均一性のために、単一または複数の単位剤形で包装できる。

「治療有効量」は、実験及び／または臨床試験を通じて求めることができる比較的広い範囲に入ることになる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ注射では、例えば、対象の組織または血管系（例えば、肝臓組織または静脈）への直接注射である。他の有効な投与量は、用量応答曲線を定める常法の試験を通じて、当業者が容易に定めることができる。

「有効量」または「十分な量」とは、１回用量または複数回用量で、単独で、または１つ以上の他の組成物（薬物などの治療剤）、治療、プロトコールもしくは治療レジメン剤（例えばワクチンレジメンを含む）と組み合わせて、いずれかの期間（長期または短期）の検出可能な応答、対象における予想または所望の転帰または利益であって、いずれかの測定可能もしくは検出可能な程度、またはいずれかの継続期間（例えば、数分、数時間、数日、数カ月もしくは数年、または治癒）の転帰または利益をもたらす量を指す。

治療（例えば、改善させるか、または治療効果もしくは改善をもたらすための治療）のための「有効量」または「十分な量」の用量は典型的には、その疾患の有害な症状、転帰または合併症の１つ、複数もしくはすべて、例えば、その疾患を原因とするか、もしくはその疾患と関連する１つ以上の有害な症状、障害、疾病、病理または合併症に対する応答を、測定可能な程度までもたらすのに有効である。ただし、その疾患の進行または悪化を減少、低減、阻害、抑制、限定または制御することも、十分な結果である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍の数を減少させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、腫瘍のサイズを縮小させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、生存率を上昇させるのに十分な量である。

「予防」及びその文法的な変形表現は、対象への接触、投与またはｉｎ ｖｉｖｏ送達が、疾患の発症前である方法を意味する。その疾患を原因とするか、またはその疾患と関連する有害な症状、状態、合併症などの発現前に、対象への投与またはｉｎ ｖｉｖｏ送達を行うことができる。例えば、スクリーニング（例えば遺伝子スクリーニング）を用いて、記載されている方法及び用途の候補として、そのような対象を特定できるが、その対象では、その疾患が顕在化していなくてもよい。したがって、このような対象には、その対象において、その疾患の症状が顕在化していなくても、機能的遺伝子産物（タンパク質）が不十分な量であるかもしくは欠損しているか、または異常な遺伝子産物（タンパク質）、機能が部分的な遺伝子産物（タンパク質）もしくは非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生し、疾患につながることに関して、スクリーニングで陽性となった対象、及び疾患につながる異常であるかまたは欠陥がある（変異体）遺伝子産物（タンパク質）に関して、スクリーニングで陽性となった対象が含まれる。

Ｉ．詳細な説明
本明細書に記載されているのは、第２のサイトカインに融合されたＩＬ－２ムテインを含む二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体である。本明細書に記載されているのは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含むＩＬ－２ムテインであって、ＩＬ－２Ｒβ受容体に対する結合能が向上しており、その二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体に含めることができるＩＬ－２ムテインでもある。本明細書に記載されているのは、単独療法、及び抗ＰＤ－１抗体との併用治療での用途に、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を使用することでもある。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２、野生型ｈＩＬ－２）を基準にして番号付けした）を含むＩＬ－２ムテインは、Ｈ９という。このようなＩＬ－２ムテインは、例えば、がんの治療のために、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせると、用途が見出される。提供するのは、このようなＩＬ－２ムテインをコードする核酸、このようなＩＬ－２ムテインを作製する方法、このようなＩＬ－２ムテインを含む医薬組成物、及びこのようなＩＬ－２ムテインを使用する治療方法でもある。

Ａ．二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体で使用するＩＬ－２ムテイン
その置換アミノ酸残基（複数可）は、保存的置換であることができ（だたし、必ずしもそうではない）、その保存的置換には典型的には、グリシン、アラニンというグループ、バリン、イソロイシン、ロイシンというグループ、アスパラギン酸、グルタミン酸というグループ、アスパラギン、グルタミンというグループ、セリン、トレオニンというグループ、リシン、アルギニンというグループ、及びフェニルアラニン、チロシンというグループ内での置換が含まれる。これらの変異は、ＩＬ－２Ｒβ及び／またはＩＬ－２Ｒγと接するアミノ酸残基での変異であることができる。

より具体的には、変異（付加（複数可）または欠失（複数可）による保存的置換または非保存的置換のいずれか）は、１つ以上の位置で行うことができる。例えば、その変異は、Ｉ２４Ｖ、Ｐ６５Ｈ、Ｑ７４Ｒ、Ｑ７４Ｈ、Ｑ７４Ｎ、Ｑ７４Ｓ、Ｌ８０Ｆ、Ｌ８０Ｖ、Ｒ８１Ｉ、Ｒ８１Ｔ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｉ８９Ｖ、Ｉ９２Ｆ、Ｖ９３Ｉであることができる。例示的なＩＬ－２ムテインの配列は、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５、Ｈ９の配列番号１６である。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｆ４２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｙ４５Ａ及びＥ６２Ａ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換であって、ＩＬ－２Ｒβとの結合を増大及び／または増強させる置換には、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明で使用するＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆを含み、ＩＬ－２Ｒβとの結合が増大している。いくつかの実施形態では、本発明で使用するＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという位置に置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明で使用するＩＬ－２ムテインは、Ｋ４３Ｎという位置に置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換、ならびにＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６２Ａからなる群から選択した１つ以上の置換（いずれも、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べたものである）を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ結合親和性を上昇させるアミノ酸置換には、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆが含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ結合親和性を上昇させるアミノ酸置換には、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆが含まれる。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて高い、本発明のＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、

というアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－２Ｒβ／ＩＬ－２Ｒγ_ｃのヘテロ二量化に依存する１つ以上のシグナル伝達経路を刺激する能力が増大している。いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２と比べて、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する能力が増強されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ＩＬ－２が、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上のレベルで、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ＩＬ－２が、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激するレベルと比べて、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％または１９５％以上であるレベルで、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＳＴＡＴ５のリン酸化を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、新たに単離したＣＤ８＋ Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べて、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含む。

いくつかの実施形態では、ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２と比べて、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＥＲＫ１／ＥＲＫ２のシグナル伝達を刺激する能力が増強されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ＩＬ－２が、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２のシグナル伝達を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上であるレベルで、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２のシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ＩＬ－２が、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２のリン酸化を刺激するレベルと比べて、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％または１９５％以上であるレベルで、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でｐＥＲＫ１／ＥＲＫ２のリン酸化を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、新たに単離したＣＤ８＋ Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べて、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含む。

ＳＴＡＴ５及びＥＲＫ１／２のシグナル伝達は、例えば、当該技術分野で知られているいずれかの適切な方法を用いて、ＳＴＡＴ５及びＥＲＫ１／２のリン酸化によって測定できる。例えば、ＳＴＡＴ５及びＥＲＫ１／２のリン酸化は、これらの分子のリン酸化型に特異的な抗体を、本明細書に記載されているようなフローサイトメトリー分析と組み合わせて用いて測定できる。いくつかの実施形態では、ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２と比べて、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＰＩ３キナーゼのシグナル伝達を刺激する能力が増強されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ＩＬ－２が、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＰＩ３キナーゼのシグナル伝達を刺激するレベルの１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以下であるレベルで、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＰＩ３キナーゼのシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ＩＬ－２が、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＰＩ３キナーゼのシグナル伝達のリン酸化を刺激するレベルと比べて、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％または１９５％以上であるレベルで、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞内でＰＩ３キナーゼのシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ＋細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べて、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含む。ＰＩ３キナーゼのシグナル伝達は、当該技術分野で知られているいずれかの適切な方法を用いて測定できる。例えば、ＰＩ３キナーゼのシグナル伝達は、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質に特異的である抗体を、本明細書に記載されているようなフローサイトメトリー分析と併せて用いて測定できる。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞内でのＩＬ－２ ＳＴＡＴ５及び／またはＩＬ－１５ ＳＴＡＴ５のリン酸化の刺激因子である。いくつかの実施形態では、ムテインは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＩＬ－２誘導性及び／またはＩＬ－１５誘導性の増殖のプロモーターである。いくつかの実施形態では、ムテインは、ＩＬ－２依存性のＴＣＲ誘導性細胞増殖の刺激因子である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べて、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含む。

ＩＬ－２は、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ９細胞及びＴｒｅｇ Ｔ細胞の分化を促し、Ｔｈ１７の分化を阻害する。したがって、働きの特定の理論のいずれかに拘束されるものではないが、ＩＬ－２スーパーアゴニストとして機能するＩＬ－２ムテインは、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ９細胞及び／またはＴｒｅｇ細胞の分化を促したり、またはＴｈ１７細胞の分化を阻害したりすることができると考えられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－２依存性のＴｈ１、Ｔｈ９及び／またはＴｒｅｇの分化のプロモーターである。いくつかの実施形態では、ムテインは、Ｔｈ１７の分化の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べて、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２と比べて、ＣＤ２５へのシグナル伝達が低減され、及び／またはＣＤ２５から独立して、シグナル伝達を行う（例えば、ＣＤ２５への結合が低減または喪失している）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に関して、シグナル伝達が低減しているか、及び／またはシグナル伝達が独立していることにより、エフェクターＴ細胞の優先的な活性化が可能となる一方で、Ｔｒｅｇの刺激が制限される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に関して、シグナル伝達が低減しているか、及び／またはシグナル伝達が独立していることにより、毒性の低減が可能となる。いくつかの実施形態では、ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換、ならびにＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６２Ａからなる群から選択した１つ以上の置換（いずれも、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べたものである）を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、アネルギー性ＮＫ細胞に対する応答性を増大及び／または回復することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、腫瘍微小環境において、アネルギー性ＮＫ細胞に対する応答性を増大及び／または回復することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、野生型ヒトＩＬ－２（配列番号２）と比べて、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆという置換を含む。

いくつかの実施形態では、ムテインは、ＩＬ－２依存性のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化の阻害剤である。ＩＬ－２による、ＮＫ細胞の活性化は、当該技術分野で知られているいずれかの適切な方法によって、例えば、本明細書に記載されているように、ＩＬ－２誘導性のＣＤ６９発現及び／または細胞傷害性を測定することによって測定できる。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性の上昇とは、ＩＬ－２Ｒβに対するいずれかの結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２の、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性よりも大きいことである。いくつかの実施形態では、その結合親和性は、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２の、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性と比べて、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２０倍、１５０倍、１７０倍、１９０倍、２００倍、２２０倍または２４０倍以上、上昇している。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβに対する結合能の上昇とは、ＩＬ－２Ｒβに対するいずれかの結合能が、野生型ヒトＩＬ－２の、ＩＬ－２Ｒβに対する結合能よりも高いことである。いくつかの実施形態では、その結合能は、ＩＬ－２Ｒβに対する結合能が、野生型ヒトＩＬ－２の、ＩＬ－２Ｒβに対する結合能と比べて、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１２０倍、１５０倍、１７０倍、１９０倍、２００倍、２２０倍または２４０倍以上、上昇している。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて高い、本発明のＩＬ－２ムテインは、ＣＤ２５への結合が低減されてもおり、Ｆ４２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、その結合親和性の低減の程度は、約２２０分の１であり、すなわち、Ｆ４２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆを含むムテインでは、Ｋｄが、野生型ヒトＩＬ－２の約６．６ｎＭから約１．４μＭに低減されている。いくつかの実施形態では、そのＩＬ－２ムテインは、以下のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて高い、本発明のＩＬ－２ムテインは、ＣＤ２５への結合が低減されてもおり、Ｋ４３Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、その結合親和性の低減は、４３位で糖鎖を付加させたことと、Ｋ４３Ｎという置換によるものである。Ｋ４３Ｎ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインでは、リシンをアスパラギンに置換することによって（Ｋ４３Ｎ）、ＣＤ２５への結合が低減されているか及び／または喪失されている。いくつかの実施形態では、そのＩＬ－２ムテインは、以下のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５に対する結合親和性の低減とは、ＣＤ２５に対するいずれかの結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２の結合親和性よりも低いことである。いくつかの実施形態では、その結合親和性は、ＣＤ２５に対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２の、ＣＤ２５に対する結合親和性の１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、１２０分の１、１５０分の１、１７０分の１、１９０分の１、２００分の１、２２０分の１、２４０分の１以下である。

いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ－２と比べて、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が高いとともに、ＣＤ２５に対する結合親和性が低減された、本発明のＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、そのＩＬ－２ムテインは、以下のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ－２と比べて、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が高いとともに、ＣＤ２５に対する結合親和性が低減された、本発明のＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、そのＩＬ－２ムテインは、以下のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、野生型ヒトＩＬ－２と比べて、ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が高いとともに、ＣＤ２５に対する結合親和性が低減された、本発明のＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６２Ａ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、そのＩＬ－２ムテインは、以下のアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２または配列番号６～配列番号１０のいずれか１つと９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２または配列番号６～配列番号１０のいずれか１つと９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２または配列番号６～配列番号１０のいずれか１つと９９％同一である。

さらなる例示的なＩＬ－２の配列は、下記の表に示されている。

Ｂ．ＩＬ－２ムテイン融合タンパク質
ＩＬ－２ムテインは、本発明のＩＬ－２ムテインと、異種のポリペプチド（すなわち、ＩＬ－２またはその変異体ではないポリペプチド）（例えば、米国特許第６，４５１，３０８号を参照されたい）とを含む融合ポリペプチド、すなわちキメラポリペプチド（例えば、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体が挙げられる）として調製できる。例示的な異種のポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、そのキメラポリペプチドの循環血中半減期を延長できるので、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドの特性をさらに増強し得る。様々な実施形態では、循環血中半減期を延長するポリペプチドは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、ＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、またはＩｇＧサブクラス抗体のＦｃ領域（ＩｇＧの重鎖可変領域を欠損している）であってよい。例示的なＦｃ領域は、補体結合及びＦｃ受容体結合を阻害する変異を含むこともできるし、または、溶菌性であってもよく、すなわち、補体に結合するか、もしくは抗体依存性の補体溶菌（ＡＤＣＣ、１９９４年１２月１２日に出願されたＵＳＳＮ０８／３５５，５０２）のような別の機構によって、細胞を溶解することができる。

その「Ｆｃ領域」は、天然のポリペプチド、またはＩｇＧをパパインで消化することによって生成されるＩｇＧ Ｃ末端ドメインと相同である合成ポリペプチドであることができる。ＩｇＧ Ｆｃは、分子量がおよそ５０ｋＤａである。変異体ＩＬ－２ポリペプチドは、Ｆｃ領域全体、またはそれよりも小さいＦｃ領域部分であって、そのＦｃ領域部分が一部分であるキメラポリペプチドの循環血中半減期を延長する能力を保持するＦｃ領域部分を含むことができる。加えて、完全長Ｆｃ領域または断片化されたＦｃ領域は、野生型分子のバリアントであることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテイン融合タンパク質（例えば、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテイン）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域を含む（例えば、図２Ａ～２Ｂの配列を参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７Ａという置換を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、異種の融合ポリペプチドに直接または間接的に連結されている。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆｃ領域に直接連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆｃ領域に、ＧＧＧＧＳのようなリンカーペプチドを介して連結されている。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、そのｎは、１～１０の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１９）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む（例えば、プロテアーゼ切断性リンカーである）。リンカーは、加えて、１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含むか、酸化及び／または還元による切断を受けやすいことができる。ある１つの例では、補体系の酵素、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーター、トリプシン、プラスミン、カスパーゼ、カリクレイン、カテプシン、レグマイン、ＭＭＰ、トロンビン、ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、マトリプターゼ、またはタンパク質分解活性を有する別の酵素による切断を受けやすいペプチドリンカーを用いてよい。別の例によれば、リンカーは、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子でのジスルフィド結合）を含んでよい。別の例によれば、リンカーは、プロテアーゼ切断性のＶａｌ－Ｃｉｔ（ＶＣ）リンカー、Ｐｈｅ－Ａｒｇリンカー、Ｖａｌ－Ｌｙｓリンカー、Ｖａｌ－Ａｌａリンカー、Ｖａｌ－Ａｒｇリンカー、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓリンカー、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙリンカー、Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓリンカー、ｐｏｌ－Ｌ－リシンリンカー、β－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕリンカー、Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕリンカー、ペプチド模倣体リンカー、レグマイン切断性Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎトリペプチドリンカー、カテプシンＢ及びその他のリソソームプロテアーゼによって切断されるペプチドリンカー（Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ及びＡｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕなど）、カスパーゼ３ ＤＥＶＤ配列、または自壊性リンカーを含んでよい。例えば、Ｐｏｒｅｂａ，Ｍ，ＦＥＢＳ Ｊ．２８７（１０）：１９３６－１９６９（２０２０）（参照により、本明細書に援用される）に開示されているリンカーが、本開示によって企図されている。多くの腫瘍は、天然においては、高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するので、グルタチオンが、ジスルフィド結合を還元でき、その後、送達部位で、カーゴ部分が放出される。いくつかの実施形態では、リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって切断可能なプロテアーゼ切断性リンカーである。ＭＭＰは、腫瘍において、ｉｎ ｓｉｔｕで過剰発現し、このような文脈において切断可能なリンカーは、本開示によって企図されている。例えば、Ｈｓｕ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２（２７６８）：１－１３（２０２１）（参照により、本明細書に援用される）に開示されているリンカーが、本開示によって企図されている。いくつかの実施形態では、ＭＭＰリンカー配列は、ＳＧＡＲＹＲＷＬＴＡ（配列番号２３４）、ＳＧＲＳＹＡＩＬＴＡ（配列番号２３５）、ＳＲＳＧＲＳＰＡＩＦＴＡＴＧ（配列番号２３６）、ＧＳＳＧＲＳＰＡＩＦＴＡＧＳ（配列番号２３７）及びＳＧＦＩＡＮＰＶＴＡ（配列番号２３８）からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、ＭＭＰリンカー配列は、ＳＧＡＲＹＲＷＬＴＡである。いくつかの実施形態では、ＭＭＰリンカー配列は、ＳＧＲＳＹＡＩＬＴＡである。いくつかの実施形態では、ＭＭＰリンカー配列は、ＳＲＳＧＲＳＰＡＩＦＴＡＴＧである。いくつかの実施形態では、ＭＭＰリンカー配列は、ＧＳＳＧＲＳＰＡＩＦＴＡＧＳである。いくつかの実施形態では、ＭＭＰリンカー配列は、ＳＧＦＩＡＮＰＶＴＡである。

Ｆｃ領域は、「溶解性」であることも、または「非溶解性」であることもできるが、典型的には、非溶解性である。非溶解性Ｆｃ領域は典型的には、高親和性のＦｃ受容体結合部位及びＣ’１ｑ結合部位を欠損している。マウスＩｇＧ Ｆｃの高親和性のＦｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ Ｆｃの２３５位に、Ｌｅｕ残基を含む。すなわち、そのＦｃ受容体結合部位は、Ｌｅｕ２３５を変異または欠損させることによって破壊できる。例えば、Ｌｅｕ２３５をＧｌｕに置換することにより、Ｆｃ領域が、高親和性のＦｃ受容体に結合する能力が阻害される。マウスＣ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２の残基を変異または欠損させることによって、機能を破壊できる。例えば、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２をＡｌａ残基に置換すると、ＩｇＧ１ Ｆｃが、抗体依存性の補体溶菌を誘導できなくなる。これに対して、溶解性のＩｇＧ Ｆｃ領域は、高親和性のＦｃ受容体結合部位及びＣ’１ｑ結合部位を有する。高親和性のＦｃ受容体結合部位は、ＩｇＧ Ｆｃの２３５位に、Ｌｅｕ残基を含み、Ｃ’１ｑ結合部位は、ＩｇＧ１のＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０及びＬｙｓ３２２の残基を含む。溶解性のＩｇＧ Ｆｃは、これらの部位に、野生型残基または保存的アミノ酸置換を含む。溶解性のＩｇＧ Ｆｃは、細胞を抗体依存性細胞傷害または補体誘導性細胞溶解（ＣＤＣ）の標的とすることができる。ヒトＩｇＧに適する変異も知られている（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２：１１９－１２４，１９９４及びＢｒｅｋｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ２：１２５，１９９４を参照されたい）。

別の実施形態では、キメラポリペプチドは、本発明のＩＬ－２ムテインと、抗原性タグとして機能するポリペプチド（ＦＬＡＧ配列など）を含むことができる。ＦＬＡＧ配列は、本明細書に記載されているように、特異性の高いビオチン化抗ＦＬＡＧ抗体によって認識される（Ｂｌａｎａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１０１４，１９９２、ＬｅＣｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８１４５，１９９２も参照されたい）。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｃ末端ｃ－ｍｙｃエピトープタグをさらに含む。

別の実施形態では、キメラポリペプチドは、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、その変異体ＩＬ－２ポリペプチドの発現を増強したり、またはその変異体ＩＬ－２ポリペプチドの細胞局在を誘導したりするように機能する異種のポリペプチド（Ａｇａ２ｐというアグルチニンサブユニットなど）を含む（例えば、Ｂｏｄｅｒ ａｎｄ Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３－７，１９９７を参照されたい）。

別の実施形態では、変異体ＩＬ－２と、抗体またはその抗原結合部分とを含むキメラポリペプチドを作製できる。そのキメラタンパク質の抗体または抗原結合成分は、ターゲティング部分として機能できる。例えば、抗体または抗原結合成分を用いて、そのキメラタンパク質を特定の細胞サブセットまたは標的分子に局在させることができる。サイトカイン－抗体キメラポリペプチドを作製する方法は、例えば、米国特許第６，６１７，１３５号に記載されている。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＰＤ－１受容体とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害する抗体もしくはその抗原結合部分、及び／またはＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路の成分に対する抗体への融合体を含む。当該技術分野において知られている抗体であって、ＰＤ－１に結合して、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激する抗体は、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適する。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ－１を標的とするとともに、本発明での用途を見出すことができる抗体としては、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ，Ｉｎｃ．）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）及び／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）（ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６）から得られる。他の適切な抗体としては、米国特許第８，００８，４４９号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている抗ＰＤ－１抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合して、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用を阻害することによって、免疫活性を向上させる。当該技術分野において知られているいずれかの抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激する抗体は、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適する。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とするとともに、臨床試験中にある抗体としては、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の適切な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＰＤ－１抗体への融合体を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＣＴＬＡ－４を標的として、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＣＴＬＡ－４を標的とする例示的な抗体としては、ＦＤＡによって認可済みであるイピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び現在ヒトでの試験が行われているトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ－６７５、２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。ＣＴＬＡ－４を標的とする他の適切な抗体は、ＷＯ２０１２／１２０１２５、米国特許第６，９８４７２０号、同第６，６８２，７３６８号、ならびに米国特許出願公開第２００２／００３９５８１号、同第２００２／００８６０１４号及び同第２００５／０２０１９９４号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＣＴＬＡ－４に結合して、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ－４抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＬＡＧ－３を標的として、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＬＡＧ－３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒトでの試験が行われているＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。ＬＡＧ－３を標的とする他の適切な抗体は、米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＬＡＧ－３に結合して、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＬＡＧ－３抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、Ｂ７－Ｈ３またはＢ７－Ｈ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。Ｂ７ファミリーには、明確に定められた受容体は１つもないが、これらのリガンドは、腫瘍細胞上または腫瘍浸潤細胞上でアップレギュレートする。Ｂ７－Ｈ３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒトでの試験が行われているＭＧＡ２７１（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）である。Ｂ７ファミリーメンバーを標的とする他の適切な抗体は、米国特許出願公開第２０１３／０１４９２３６号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。Ｂ７－Ｈ３またはＨ４に結合するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗Ｂ７－Ｈ３抗体または抗Ｂ７－Ｈ４抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＴＩＭ－３を標的として、ＴＩＭ－３とガレクチン９との相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＴＩＭ－３を標的とする適切な抗体は、米国特許出願公開第２０１３／００２２６２３号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＴＩＭ－３に結合して、ＴＩＭ－３とガレクチン９との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＴＩＭ－３抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７を標的として、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。４－１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合して、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌまたは別のリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗４－１ＢＢ／ＣＤ１３７抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＧＩＴＲを標的として、ＧＩＴＲとそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＧＩＴＲに結合して、ＧＩＴＲとＧＩＴＲＬまたは別のリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＧＩＴＲ抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＯＸ４０を標的として、ＯＸ４０とそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＯＸ４０に結合して、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌまたは別のリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＯＸ４０抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＣＤ４０を標的として、ＣＤ４０とそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＣＤ４０に結合して、ＣＤ４０とそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＣＤ４０抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＣＯＳを標的として、ＩＣＯＳとそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＩＣＯＳに結合して、ＩＣＯＳとそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＩＣＯＳ抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＣＤ２８を標的として、ＣＤ２８とそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＣＤ２８に結合して、ＣＤ２８とそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＣＤ２８抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、ＩＦＮαを標的として、ＩＦＮαとそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体またはその抗原結合部分への融合体を含む。ＩＦＮαに結合して、ＩＦＮαとそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に開示されているキメラポリペプチドでの使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、抗ＩＦＮα抗体への融合体を含む。

いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、腫瘍抗原または腫瘍抗原を標的とするポリペプチドへの融合体を含む。概して、腫瘍抗原により、腫瘍細胞を、その正常な細胞対応物から区別可能になり、腫瘍抗原としては、例えば、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を挙げることができる。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、がん原遺伝子及び／または腫瘍抑制因子、ならびに過剰発現または異常発現した細胞タンパク質、発がん性ウイルスによって産生される腫瘍抗原、がん胎児抗原、変化した細胞表面糖脂質及び糖タンパク質、及び／または細胞種特異的分化抗原である。このような腫瘍抗原としては、メラノーマ抗原、がん－精巣抗原、上皮腫瘍抗原、細胞周期調節タンパク質、前立腺特異抗原（例えば、米国特許第５，５３８，８６６号に開示されている抗原のような前立腺癌抗原を含む）、リンパ腫（米国特許第４，８１６，２４９号、同第５，０６８，１７７号及び同第５，２２７，１５９号）を挙げることができる。腫瘍抗原としては、例えば、２Ｇ３及び３６９Ｆ１０が結合するＨＭＷムチン、ｃ－ｅｒｂＢ－２関連腫瘍抗原（およそ４２ｋＤまたは５５ｋＤの糖タンパク質）、１１３Ｆ１が結合するおよそ４０ｋＤ、６０ｋＤ、１００ｋＤ及び２００ｋＤの抗原、９－Ｏ－アセチルＧＤ３、ｐ９７、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）（例えば、胚細胞腫瘍及び／または肝細胞癌の場合）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）（例えば、腸癌の場合、肺癌または乳癌の場合もある）、ＣＡ－１２５（例えば、卵巣癌の場合）、ＭＵＣ－１（例えば、乳癌の場合）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）（例えば、乳癌の場合）、チロシナーゼ（例えば、悪性メラノーマの場合）、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）（例えば、悪性メラノーマの場合）、がん／精巣抗原１（ＣＴＡＧ１Ｂ）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥＡ１）、異常なＲａｓ産物、異常なｐ５３産物、サイクリン（例えば、サイクリンＢ１を含む）の過剰発現、フィブロネクチンの変異、ＭＵＣ１糖タンパク質の翻訳後変化、分泌腫瘍抗原（例えば、ガングリオシドを含む）を挙げることができるが、これらに限らない。

他の融合体としては、プロアポトーシスペイロードとの融合体を挙げることができる。このような例示的な配列は、下記の表に示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインは、プロアポトーシスペイロード、例えば、ＢＡＤ配列、ＢＡＸ配列、ＢＡＫ配列、ＢＩＫ配列及び／またはＢＩＤ配列に融合されている。いくつかの実施形態では、プロアポトーシスペイロードは、Ｂｃｌ－２ドメインを含むペプチド、及び／またはＢＡＤ配列、ＢＡＸ配列、ＢＡＫ配列、ＢＩＫ配列及び／またはＢＩＤ配列の部分配列である。例示的なプロアポトーシス融合体は、下記の表３に示されている。

いくつかの特定の実施形態では、がんの治療のために、ＩＬ－２アンタゴニストをプロアポトーシスペイロードに融合できる。「アンタゴニスト」は、例えば、アゴニストの活性を阻止、低減、阻害または中和することによって、アゴニストの作用を阻む化合物である。「アンタゴニスト」は、特定されているアゴニストが存在しない場合でも、標的、例えば標的受容体の構成的活性を阻止、阻害または低減することもできる。典型的には、本発明のがんの治療方法では、野生型ＩＬ－２と比べて、アゴニスト活性またはスーパーアゴニスト活性を持つＩＬ－２ムテインを用いるが、上記のようなアンタゴニストをプロアポトーシスペイロードに融合するときには、アンタゴニスト特性を持つＩＬ－２ムテインを用いることができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２アンタゴニストは、配列番号２の野生型ＩＬ－２と比べて、Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｑ１２６Ｔ及びＳ１３０Ｒというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２アンタゴニストは、配列番号２の野生型ＩＬ－２と比べて、Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＱ１２６Ｔというアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２アンタゴニストは、配列番号２の野生型ＩＬ－２と比べて、Ｌ１８Ｒ、Ｑ２２Ｅ、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ、Ｑ１２６Ｔ及びＳ１３０Ｒというアミノ酸置換を含む。上に示したようなプロアポトーシスペイロードと融合できる例示的なアンタゴニストは、下記の表４に示されている。

他の融合体としては、ＣＤ８細胞、ＮＫ細胞及びアネルギー性ＮＫ細胞の活性化を延長するのに用いる抗アポトーシスペイロードとの融合体を挙げることができ、このような例示的な配列は、下記の表に示されている。このような、Ｔ細胞の活性化の延長は、がん療法のための治療方法において有益であるのが明らかとなることがある。

他の例示的なＩＬ－２融合体としては、下記の表に列挙されている融合体が挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテイン－Ｆｃ融合体は、下記の配列のうちの１つを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテイン配列は、配列番号１２～配列番号１５及び／または配列番号２０～配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書に示されているＩＬ－２配列のいずれか）と９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテイン配列は、配列番号１２～配列番号１５及び／または配列番号２０～配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書に示されているＩＬ－２配列のいずれか）と９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテイン配列は、配列番号１２～配列番号１５及び／または配列番号２０～配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書に示されているＩＬ－２配列のいずれか）と９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテイン配列は、配列番号１２～配列番号１５及び／または配列番号２０～配列番号８０のいずれか１つ（例えば、本明細書に示されているＩＬ－２配列のいずれか）と９９％同一である。

Ｃ．二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体で使用するＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ１５及びＩＬ－１８
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に記載されているようなＩＬ－４ムテインに融合できる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に記載されているようなＩＬ－１３ムテインに融合できる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－１０に融合できる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－１２に融合できる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－１５に融合できる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－１８に融合できる。いくつかの実施形態では、このような融合体は、がん細胞及び／またはがん幹細胞を特異的に標的として、がん幹細胞の成長を低減または阻害するとともに、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫抑制細胞を標的とするように機能する。

本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインとの融合体では、いずれのＩＬ－１３配列またはそのバリアントも使用できる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。例示的なＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８１～配列番号１２８及び下記の表に示されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８１～配列番号１２８のいずれか１つに示されているようなものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９４である。いくつかの実施形態では、そのポリペプチド配列は、配列番号９５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号９９である。いくつかの実施形態では、そのポリペプチド配列は、配列番号１００である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１０９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１０である。いくつかの実施形態では、そのポリペプチド配列は、配列番号１１１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１８である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１１９である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２６である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２７である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号１２８である。ＩＬ－１３。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８１～配列番号１２８のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８１～配列番号１２８のいずれか１つと９５％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８１～配列番号１２８のいずれか１つと９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１３のポリペプチド配列は、配列番号８１～配列番号１２８のいずれか１つと９９％同一である。

いくつかの実施形態では、配列番号８１～配列番号１２８のいずれか１つが、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８１が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８２が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８３が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８４が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８５が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８６は、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８７は、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８８が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号８９が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９０が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９１が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９２が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９３が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９４が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９４が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９６が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９７が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９８が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号９９が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１００が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０１が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０２が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０３が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインにに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０４が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０５が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０６が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０７が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０８が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１０９が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１０が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１１が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１２が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１３が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１４が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１５が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１６が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１７が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１８が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１１９が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２０が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２１が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２２が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２３が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２４が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２５が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２６が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２７が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１２８が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ－１３のペプチドは、（１）Ｌ１０Ｆ、Ｌ１０Ｉ、Ｌ１０Ｖ、Ｌ１０Ａ、Ｌ１０Ｄ、Ｌ１０Ｔ、Ｌ１０Ｈ、（２）Ｒ１１Ｓ、Ｒ１１Ｎ、Ｒ１１Ｈ、Ｒ１１Ｌ、Ｒ１１Ｉ、（３）Ｉ１４Ｌ、Ｉ１４Ｆ、１１４Ｖ、Ｉ１４Ｍ、（４）Ｖ１８Ｌ、Ｖ１８Ｆ、Ｖ１８Ｉ、（５）Ｅ１２Ａ、（６）Ｒ６５Ｄ、（７）Ｒ８６Ｋ、Ｒ８６Ｔ、Ｒ８６Ｍ、（８）Ｄ８７Ｅ、Ｄ８７Ｋ、Ｄ８７Ｒ、Ｄ８７Ｇ、Ｄ８７Ｓ、（９）Ｔ８８Ｉ、Ｔ８８Ｋ、Ｔ８８Ｒ、（１０）Ｋ８９Ｒ、Ｋ８９Ｔ、Ｋ８９Ｍ、（１１）Ｌ１０１Ｆ、Ｌ１０１Ｉ、Ｌ１０１Ｙ、Ｌ１０１Ｈ、Ｌ１０１Ｎ、（１２）Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０４Ｔ、Ｋ１０４Ｍ、（１３）Ｋ１０５Ｔ、Ｋ１０５Ａ、Ｋ１０５Ｒ、Ｋ１０５Ｅ、（１４）Ｆ１０７Ｌ、Ｆ１０７Ｉ、Ｆ１０７Ｖ、Ｆ１０７Ｍ及び（１５）Ｒ１０８Ｋ、Ｒ１０８Ｔ、Ｒ１０８Ｍというアミノ酸置換のうちの１つ以上を含み、これらの置換は、ＩＬ－１３Ｒα１及びＩＬ－１３Ｒα２の一方または両方に対する親和性を変化させる。別の実施形態では、改変残基は、上で定義した接触残基を組み合わせたセットにおける２個以上、３個以上、４個以上、５個以上かつ１４個以下のアミノ酸におけるものである。国際公開第ＷＯ２０１３／１１２８７１号（その開示内容は、参照により、その全体が、本明細書に援用される）に記載されているとおりである。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換としては、図４に示されている置換が挙げられるが、これらに限らない。

改変セットは、（１）Ｌ１０Ｈ、Ｌ１０Ａ、（２）Ｒ１１Ｌ、（４）Ｖ１８Ｉ、（７）Ｒ８６Ｍ、Ｒ８６Ｋ、Ｒ８６Ｔ、（８）Ｄ８７Ｋ、Ｄ８７Ｇ、（９）Ｔ８８Ｒ、Ｔ８８Ｓ、Ｔ８８Ｋ、（１０）Ｋ８９Ｒ、（１１）Ｌ１０１Ｎ、（１２）Ｋ１０４Ｒ、（１３）Ｋ１０５Ａ、Ｋ１０５Ｅ、（１４）Ｒ１０８Ｋという具体的な変更を含んでよい。いくつかの実施形態では、改変は、列挙されている具体的な変化のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｌ１０Ｈを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｌ１０Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｒ１１Ｌを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｖ１８Ｉを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｒ８６Ｍを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｒ８６Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｒ８６Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｄ８７Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｄ８７Ｇを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｔ８８Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｔ８８Ｓを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｔ８８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｋ８９Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｌ１０１Ｎを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｋ１０４Ｒを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｋ１０５Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｋ１０５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｒ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、これらの１つ以上の改変を含むポリペプチドが、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換としては、図４に示されているアミノ酸置換が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

ＩＬ－１３Ｒα１よりもＩＬ－１３Ｒα２に結合する選択性が、天然型のＩＬ－１３配列と比べて大きくなる具体的な改変セットとしては、下記のセットを挙げてよいが、これらに限らない。
●［Ｌ１０Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、ｋ８９Ｒ、Ｒ１０８Ｋ］（例えばＣ２、例えば、配列番号３１または配列番号４９）
●［Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｒ１０８Ｋ］（例えばＣ３、例えば、配列番号３２または配列番号５０）
●［Ｌ１０Ｖ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｅ、Ｒ１０８Ｔ］（例えばＣ４、例えば、配列番号３３または配列番号３１）
●［Ｒ１１Ｓ、Ｉ１４Ｍ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ａ、Ｒ１０８Ｋ］（例えばＣ７、例えば、配列番号３４または配列番号５２）
●［Ｌ１０Ｈ、Ｒ１１Ｌ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｅ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｔ、Ｒ１０８Ｋ］（Ｃ９、例えば配列番号５３）
●［Ｌ１０Ｈ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｒ、Ｒ１０８Ｋ］（Ｃ１１、例えば、配列番号３８または配列番号５５）
●［Ｌ１０Ａ、Ｖ１８Ｆ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｉ、Ｋ１０４Ｒ、Ｒ１０８Ｋ］（Ｄ７、例えば、配列番号４０または配列番号５７）
●［Ｌ１０Ｔ／Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ／Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｒ１０８Ｋ］
●［Ｌ１０Ａ／Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ／Ｅ、Ｒ１０８Ｋ／Ｔ］

いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｅ、Ｒ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｉ１４Ｍ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ａ及びＲ１０８Ｋ（Ｃ７、例えば、配列番号３５または配列番号５２）を含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｈ、Ｒ１１Ｌ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｅ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０５Ｔ及びＲ１０８Ｋ（Ｃ９、例えば、配列番号３６または配列番号５３）を含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｈ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｒ及びＲ１０８Ｋ（Ｃ１１、例えば、配列番号３８または配列番号５５）を含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ａ、Ｖ１８Ｆ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｉ、Ｋ１０４Ｒ及びＲ１０８Ｋ（Ｄ７、例えば、配列番号４０または配列番号５７）を含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｔ／Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ／Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｔ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｔ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｋ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｄ、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｒ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ａ／Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ／Ｅ及びＲ１０８Ｋ／Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ及びＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ａ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ及びＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ及びＲ１０８Ｋを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、ｄＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｋ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｎ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｅ及びＲ１０８Ｔを含む。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９０％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９５％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９８％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９９％同一である。いくつかの実施形態では、改変を１つ以上含むポリペプチドが、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換としては、図４に示されているアミノ酸置換が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

ＩＬ－１３Ｒα２よりもＩＬ－１３Ｒα１に結合する選択性が、天然型のＩＬ－１３配列と比べて大きくなる具体的な改変セットとしては、下記のセットを挙げてよいが、これらに限らない。
●［Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ］
●［Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ］
●［Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ］
●［Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ］
これらの置換は、［Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ、Ｒ６５Ｄ／Ｅ］という置換と任意に組み合わされている。

いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ｔを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ａを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ及びＦ１０７Ｍを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄ／Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｄを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７




Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ａ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｇ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｄ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｓ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｍ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ａ／Ｇ／Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ／Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｈ／Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｋ８９Ｒ、Ｌ１０１Ｙ／Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｖ１８Ｉ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ｔ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｔ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｙ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｒ１１Ｉ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ８６Ｋ、Ｄ８７Ｇ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｈ、Ｋ１０４Ｒ、Ｋ１０５Ａ、Ｆ１０７Ｍ、Ｅ１２Ｓ及びＲ６５Ｅを含む。いくつかの実施形態では、改変セットは、Ｌ１０Ｖ、Ｅ１２Ａ、Ｖ１８Ｉ、Ｒ６５Ｄ、Ｄ８７Ｓ、Ｔ８８Ｓ、Ｌ１０１Ｆ、Ｋ１０４Ｒ及びＫ１０５Ｔを含む（例えば、ＩＬ－１３ｄｎ、配列番号３８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９０％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９５％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９８％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９９％同一である。いくつかの実施形態では、改変を１つ以上含むポリペプチドが、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換としては、図４に示されているアミノ酸置換が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

ＩＬ－１３の配列の表は、以下に示されている。

ＩＬ－２ムテインまたはバリアントとの融合体では、本明細書に記載されているようなものを含め、いずれかのＩＬ－４配列またはそのバリアントを使用できる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。例示的なポリペプチド配列は、本明細書に示されている配列のいずれも含め、配列番号１３０～配列番号１３５に示されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３０～配列番号１３５のいずれか１つに示されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３１である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３２である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３３である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３４である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３０～配列番号１３５のいずれか１つと９８％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－４のポリペプチド配列は、配列番号１３０～配列番号１３５のいずれか１つと９９％同一である。いくつかの実施形態では、配列番号１３０～配列番号１３５のいずれか１つが、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３０が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３１が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３２が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３３が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３４が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３５が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

ＩＬ－４の配列の表は、以下に示されている。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－１８の配列に融合できる。いくつかの実施形態では、このような融合体は、その融合コンストラクトをＮＫ細胞及び／またはＣＤ８＋細胞に特異的にターゲティングするように機能する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、配列番号１３６が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３７が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３８が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１３９が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１４０が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、配列番号１４１が、本明細書に記載されているようなＩＬ－２またはＩＬ－２ムテインに連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、下記の表（配列番号１３６～１４１）に示されているようなＩＬ－ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－１８の配列に融合できる。

例示的なＩＬ－２ムテインの配列は、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

いくつかの実施形態では、サイトカイン－サイトカイン融合体は、下記の表に含まれている融合体の１つである。

いくつかの実施形態では、サイトカイン－サイトカイン融合体は、下記の表に含まれている融合体の１つである（表１２及び図５４を参照されたい）。

Ｄ．ＩＬ－２ムテインの組み換え発現、発現ベクター及び宿主細胞
様々な実施形態では、本発明の実施の際に用いるポリペプチドは、合成のものであるか、または組み換え核酸分子を発現させることによって作製する。ポリペプチドが、キメラ（例えば、少なくとも、変異体ＩＬ－２ポリペプチドと、異種のポリペプチドとを含む融合タンパク質（二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を含む））である場合、そのポリペプチドは、ＩＬ－２ムテインの全部または一部をコードする１つの配列と、異種のポリペプチドの全部または一部をコードする第２の配列を含むハイブリッド核酸分子によってコードできる。例えば、本明細書に記載されている本発明のＩＬ－２ムテインは、細菌で発現させたタンパク質の精製を促すためのヘキサヒスチジンタグ、または真核細胞で発現させたタンパク質の精製を促すためのヘマグルチニンタグに融合してよい。

ＩＬ－２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築するとともに、それらの配列を、適切にトランスフォーメーションした宿主で発現させるための方法としては、ＰＣＲによる変異誘発の技法の使用が挙げられるが、これに限らない。また、ＩＬ－２ポリペプチドへのアミノ酸残基の欠失または付加からなる変異は、標準的な組み換え技法によって行うことができる。欠失または付加の場合には、ＩＬ－２をコードする核酸分子を任意に、適切な制限酵素で消化する。得られた断片は、直接発現させるか、または例えば、その断片を第２の断片にライゲーションすることによって、さらに操作するかできる。核酸分子の２つの末端が、互いに重複する相補的なヌクレオチドを含む場合には、ライゲーションが促されることがあるが、平滑末端を有する断片をライゲーションすることもできる。ＰＣＲによって生成された核酸を用いて、様々な変異体配列を作製することもできる。

完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳した遺伝子を構築できる。ＩＬ－２ムテインをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成できる。例えば、所望のポリペプチドの一部分をコードする小さいオリゴヌクレオチドをいくつか合成してから、ライゲーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には、相補的なアセンブルのための５’オーバーハングまたは３’オーバーハングを含む。

分子生物学的な組み換え技法によって変化させた核酸分子を発現させることによって、変異体ポリペプチドを作製するのに加えて、本発明のＩＬ－２ムテインは、化学合成することができる。化学合成したポリペプチドは、当業者であれば常法によって生成できる。

（合成、部位特異的変異誘発または別の方法によって）アセンブルしたら、ＩＬ－２ムテインをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入し、トランスフォーメーションする所望の宿主でＩＬ－２ムテインを発現させるのに適する発現制御配列に機能可能に連結する。適切にアセンブルされたかは、ヌクレオチドシーケンシング、制限酵素マッピング、適切な宿主での生物活性ポリペプチドの発現によって確認できる。当該技術分野において周知なように、宿主において、トランスフェクション遺伝子の高い発現レベルを得るために、その遺伝子は、選択した発現宿主において機能的である転写発現制御配列及び翻訳発現制御配列に機能可能に連結しなければならない。

ＩＬ－２ムテインをコードするＤＮＡ配列は、部位特異的変異誘発、化学合成またはその他の方法によって調製したかにかかわらず、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列も含むことができる。このようなシグナル配列は、存在する場合、そのＩＬ－２ムテインを発現させるために選択した細胞によって認識される配列でなければならない。そのシグナル配列は、原核配列、真核配列またはこれらの２つを組み合わせたものであることができる。その配列は、天然型のＩＬ－２のシグナル配列であることもできる。シグナル配列を含めるかは、ＩＬ－２ムテインが作られる組み換え細胞から、ＩＬ－２ムテインを分泌させるのが望ましいかに左右される。選択した細胞が原核細胞である場合には、概して、そのＤＮＡ配列が、シグナル配列をコードしないことが好ましい。選択した細胞が真核細胞である場合には、概して、シグナル配列がコードされるのが好ましく、野生型ＩＬ－２シグナル配列を用いるのが最も好ましい。

Ｅ．部分を標的とする腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの例では、本明細書に記載されている二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体及び／またはＩＬ－２ムテインを用いて、腫瘍溶解性ウイルスをターゲティングすることができる（例えば、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：１５５６－６４，２００８を参照されたい）。いくつかの例では、腫瘍溶解性ウイルスを用いて、ＩＬ－２ムテインを腫瘍またはＴＭＥにターゲティングすることができる。アデノウイルス、自己複製アルファウイルス及び腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを含め、多くのウイルスを腫瘍溶解性ウイルスとして用いることができる（例えば、ＷＯ２０１３０３８０６６（参照により、その全体が、本明細書に援用される）、特に図１７を参照されたい）。他の腫瘍溶解性ウイルスとしては、セネカバレーウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ニューカッスルウイルスともいう）、マラバウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルス、粘液腫ウイルス及び／またはレトロウイルスを挙げることができる（例えば、Ｔｗｕｍａｓｉ－Ｂｏａｔｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２０１８）及びＫａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，１４：６４２－６６２（２０１５）（いずれも、参照により、その全体が、本明細書に援用されるを参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスとしては、アデノウイルス、自己複製アルファウイルス、ワクシニアウイルス、セネカバレーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、マラバウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２を含む）、麻疹ウイルス、ポリオウイルス、レオウイルス、コクサッキーウイルス、レンチウイルス、モルビリウイルス、インフルエンザウイルス、シンドビスウイルス、粘液腫ウイルス及び／またはレトロウイルスが挙げられるが、これらに限らない。本発明のＩＬ－２スーパーカイン（本明細書に記載されているようなＨ９及びＩＬ－２バリアント）を用いて、Ｔ細胞／ＯＶをＴＭＥに誘導することもできる。ＩＬ－２バリアント（Ｈ９など）は、エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞をブーストできると同時に、ＩＬ－２バリアントは、Ｔｒｅｇの活性を抑制できる。他の腫瘍溶解性ウイルスとしては、例えばｏｎｃｏＶｅｘ／Ｔ－ＶＥＣを挙げることができ、このウイルスは、条件的に複製する単純ヘルペスウイルス（がん細胞に優先的に感染する）の腫瘍内注射を伴う。また、ＧＭ－ＣＳＦを発現するように操作したウイルスは、がん細胞の内側で複製でき、そのプロセスにおいて、その溶解を引き起こし、新たなウイルス及び一連の腫瘍抗原を放出し、ＧＭ－ＣＳＦを分泌する。このような腫瘍溶解性ウイルスワクチンは、腫瘍微小環境内でＤＣの機能を増強して、抗腫瘍免疫応答を刺激する。これらの腫瘍溶解性ウイルスを用いて、本明細書に記載されているＩＬ－２ムテインを腫瘍に導いたり、または送達したりできる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインを発現できる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）というアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインを発現できる導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）というアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、治療用ペイロードとして発現する導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、治療用ペイロードは、本明細書に記載されているようなＩｌ－２である。いくつかの実施形態では、治療用ペイロードは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）というアミノ酸置換を含むＩＬ－２ムテインである。

いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスベクターは、ウイルス粒子が、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）、細胞結合性エンベロープウイルス（ＣＥＶ）または細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）という型の粒子であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス粒子は、ＥＥＶまたはＩＭＶという種類の型である。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス粒子は、ＥＥＶ型の粒子である。

概して、腫瘍細胞で優先的に複製するとともに、少なくとも１つの導入遺伝子（例えば、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテイン）を発現するベクターを含む組み換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、細胞及び医薬組成物の構築により、抗腫瘍効果及びアポトーシスの誘導が促され、対象における宿主免疫応答が調節される。本発明によれば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは腫瘍溶解性アデノウイルスをターゲティングし、及び／またはＩＬ－２ムテインを発現させるために、腫瘍溶解性アデノウイルス及び腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、本明細書に記載されているようなＩＬ－２発現部分またはターゲティング部分と組み合わせることができる。腫瘍溶解により、腫瘍抗原が放出され、共刺激危険シグナルが供給される。しかしながら、ウイルスを武装化させると、有効性をさらに向上できる。例えば、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１５４）は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが知られているともに、いくつかの免疫機構も始動させる。これらの１つは、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させて、免疫抑制を低減させるＴヘルパー１型（Ｔｈｌ）応答である。本発明は、本発明のＩＬ－２ムテインを発現する腫瘍溶解性ウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＩＬ－２ターゲティング部分によってターゲティングされる（例えば、「武装化されている」）腫瘍溶解性ウイルスを提供する。

いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、改変ワクシニアウイルスベクター、ウイルス粒子、宿主細胞、ワクシニアウイルスゲノムを含む医薬組成物及びキットであり、そのチミジンキナーゼ遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子における置換及び／または少なくとも１つのヌクレオチドをオープンリーディングフレームにおいて喪失させる欠失（それにより、部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子をもたらす）のいずれかによって不活化されており、そのワクシニア成長因子遺伝子は、欠失しており、その改変ワクシニアウイルスベクターは、非ウイルスタンパク質（例えば、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインであって、発現できるＩＬ－２ムテイン）をコードする核酸配列を少なくとも１つ含む。別の態様では、その改変ワクシニアウイルスベクター、ウイルス粒子、医薬組成物またはキットは、対象において免疫応答を誘発するためのがん療法で用いることもできるし、哺乳動物において悪性細胞の増殖を阻害する方法で用いることもできるし、がんの療法または予防で用いることもできるし、対象において改変ワクシニアウイルスの存在を検出するために用いることもできるし、及び任意にアデノウイルスと組み合わせたｉｎ ｓｉｔｕがんワクチンとして用いることもできる。いくつかの実施形態では、本発明は、ワクシニアウイルスゲノムを含む改変ワクシニアウイルスを作製する方法であって、そのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子における置換及び／または少なくとも１つのヌクレオチドをオープンリーディングフレームにおいて喪失させる欠失（それにより、部分的に欠失したチミジンキナーゼ遺伝子をもたらす）によって、そのチミジンキナーゼ遺伝子が不活化されており、ワクシニア成長因子遺伝子が欠失しており、その改変ワクシニアウイルスベクターが、非ウイルスタンパク質（例えば、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテイン）をコードする核酸配列を少なくとも１つ含み、ワクシニアウイルス粒子の産生を持続できるとともに、改変ワクシニアベクターを担持できるプロデューサー細胞をもたらす工程と、ウイルスの複製及び産生に適する条件で、そのプロデューサー細胞を培養する工程と、そのウイルス粒子を回収する工程を含む方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインをコードする核酸で「武装化されている」か、またはその核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを投与する方法であって、そのＩＬ－２ムテインが、腫瘍の位置で発現するか、または対象の全身で発現する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインによって「武装化されている」かまたはターゲティングされる腫瘍溶解性ウイルスを投与する方法も提供する。投与経路は当然ながら、腫瘍の位置及び性質によって変動し、その経路としては、例えば、皮内投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮下投与、局部的（例えば、腫瘍の近く、特に、血管系または腫瘍に隣接する血管系）、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、気管内投与、腹腔内投与、動脈内投与、膀胱内投与、腫瘍内投与、吸入投与、灌流投与、洗浄投与及び経口投与が挙げられる。組成物は、特定の投与経路に関連させて調合する。

１．腫瘍溶解性ワクシニアウイルス
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科のオルトポックスウイルス属のメンバーである。ワクシニアウイルスは、大きな二本鎖ＤＮＡゲノム（約２００ｋｂ、約２００遺伝子）を有し、複雑な形態形成経路が、各感染細胞から、独特の形態の感染性ビリオンをもたらす。ウイルス粒子は、コアの周囲に脂質膜（複数可）を含む。ウイルスのコアは、ウイルス構造タンパク質、小さく圧縮されたウイルスＤＮＡゲノム、及び転写酵素を含む。ワクシニアウイルスの寸法は、約３６０×２７０×２５０ｎｍであり、重量は、約５～１０ｆｇである。遺伝子は、非コードＤＮＡがほとんどない状態で小さく束ねられており、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）には、イントロンがない。３つのクラスの遺伝子（初期、中期、後期）が存在する。初期遺伝子（約１００遺伝子、最初期遺伝子及び後初期遺伝子）は、免疫の調節及びウイルスＤＮＡの複製に主に関係するタンパク質をコードする。中期遺伝子は、後期遺伝子（例えば転写因子）の発現に必要となる調節タンパク質をコードし、後期遺伝子は、次の感染ラウンドを開始する目的で、新たなビリオンにパッケージングされるウイルス粒子及び酵素を作るのに必要なタンパク質をコードする。ワクシニアウイルスは、細胞の細胞質内で複製する。

様々なワクシニアウイルス株が特定されている（例：Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株、Ｌｉｓｔｅｒ株、Ｔｉａｎ Ｔａｎ株、Ｗｙｅｔｈ株（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ株）、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株）。ＷＲワクシニアのゲノムは、シーケンシングされている（アクセッション番号ＡＹ２４３３１２）。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ株、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株、Ｌｉｓｔｅｒ株、Ｔｉａｎ Ｔａｎ株、Ｗｙｅｔｈ株またはＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株のワクシニアウイルスである。

形態の異なるウイルス粒子ごとに、ウイルス生活環における役割が異なる。細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）、細胞内エンベロープウイルス（ＩＥＶ）、細胞結合性エンベロープウイルス（ＣＥＶ）、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）という、いくつかの形態のウイルス粒子が存在する。ＥＥＶ粒子は、トランスゴルジ網に由来する外膜を有する。この外側の膜には、ａ）免疫による攻撃から、内部のＩＭＶを保護する役割、及びｂ）細胞表面上へのウイルスの結合を媒介する役割という２つの重要な役割がある。

ＣＥＶ及びＥＥＶは、宿主由来の膜で取り囲まれることによって、ウイルスが宿主の抗体及び補体を回避するのを助ける。ＩＭＶ粒子及びＥＥＶ粒子には、生物学的な特性にいくつか違いがあり、ウイルスの生活環において、異なる役割を果たす。ＥＥＶ及びＩＭＶは、異なる（不明の）受容体（１）に結合し、異なる機序によって細胞に入り込む。ＥＥＶ粒子は、エンドサイトーシスによって細胞に入り込み、そのプロセスは、ｐＨ感受性である。インターナリゼーション後、酸性化したエンドソーム内で、ＥＥＶの外膜が破裂し、暴露されたＩＭＶがエンドソーム膜と融合し、ウイルスのコアが細胞質内に放出される。一方で、ＩＭＶは、細胞膜とウイルス膜の融合によって細胞に入り込み、このプロセスは、ｐＨ非依存性である。これに加えて、ＣＥＶは、細胞表面からのアクチンテールの形成を誘導し、このテールが、ビリオンを、近くの非感染細胞の方に誘導する。

さらには、ＥＥＶには、抗体（ＮＡｂ）及び補体の毒性による中和に対する耐性があり、ＩＭＶにはない。したがって、ＥＥＶは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、広範な拡散を媒介する。コメット阻害試験は、ＥＥＶ特異的抗体を測定する方法の１つとなっている。遊離ＥＥＶをＥＥＶ ＮＡｂによって中和できなくても、感染細胞からのＥＥＶの放出がＥＥＶ ＮＡｂによってブロックされ、コメット状のパターンが見えなくなるからである。ＥＥＶは、ＩＭＶ粒子（粒子／ｐｆｕ比が低い）よりも特異性の高い感染性を有し、このことにより、ＥＥＶは、治療で使用する興味深い候補となっている。しかしながら、ＥＥＶの外膜は、非常に脆弱な構造であり、ＥＥＶ粒子は、慎重に扱う必要があり、それにより、治療用途に必要な量でＥＥＶ粒子を得るのは困難になっている。ＥＥＶの外膜は、低ｐＨ（ｐＨ約６）で破裂する。ＥＥＶの外膜が破裂すると、エンベロープ内側のウイルス粒子は、ＩＭＶとして完全な感染性を保持する。

宿主細胞由来のタンパク質のいくつかは、ＥＥＶ調製物と共局在するが、ＩＭＶとは共局在せず、細胞由来のタンパク質の量は、宿主細胞株及びウイルス株に左右される。例えば、ＷＲ ＥＥＶは、細胞由来のタンパク質を、ＶＶ ＩＨＤ－Ｊ株よりも多く含む。宿主細胞由来のタンパク質は、ＥＥＶ粒子の生体作用を改変できる。例として、宿主膜タンパク質ＣＤ５５が、ＥＥＶの表面に導入されると、その表面は、補体の毒性に対して耐性を持つようになる。本発明では、ＥＥＶ粒子の表面におけるヒトＡ５４９細胞由来のタンパク質が、ウイルスをヒトがん細胞の方にターゲティングすることができることが示されている。類似の現象は、１型ヒト免疫不全ウイルスによる試験で示されており、この試験では、宿主由来のＩＣＡＭ－１糖タンパク質が、ウイルスの感染性を上昇させた。ＩＥＶ膜は、少なくとも９個のタンパク質を含み、そのうちの２つは、ＣＥＶ／ＥＥＶに存在しない。Ｆ１２Ｌタンパク質及びＡ３６Ｒタンパク質は、細胞表面へのＩＥＶの輸送に関与し、これらのタンパク質は、取り残され、ＣＥＶ／ＥＥＶの一部とならない（９，１１）。Ｆ１３Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ３４Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｅ２、（Ｋ２Ｌ）という７つのタンパク質は、（ＩＥＶ）／ＣＥＶ／ＥＥＶに共通である。ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ株では、通常、最大１％のウイルス粒子がＥＥＶであり、プロデューサー細胞の腫瘍溶解前に、培養液上清に放出される。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（ＩＨＤ）－Ｊ株のワクシニアからは、５０倍以上のＥＥＶ粒子が放出される。しかしながら、ＩＨＤは、ヒトのがん治療での用途用として研究されたことがない。ＩＨＤ－Ｗの表現型は、Ａ３４Ｒ ＥＥＶレクチン様タンパク質における点変異に主に起因していた。また、Ａ３４Ｒの欠失により、放出されるＥＥＶの数が増加する。ＥＥＶ粒子は、まず、感染から６時間後に細胞表面上で（ＣＥＶとして）検出でき、５時間後には、上清中で検出できる（ＩＨＤ－Ｊ株）。低い多重感染度（ＭＯＩ）で感染させると、ウイルス量が多い場合よりも、ＥＥＶの比率が高くなる。ＣＥＶとＥＥＶのバランスは、宿主細胞及びウイルス株の影響を受ける。

ワクシニアは、天然痘の撲滅のために使用され、その後、外来遺伝子用の発現ベクターとして、ならびに感染症及びがんに対する組み換え生ワクチンとして使用されている。ワクシニアウイルスは、ヒトにおいて最も広く使用されているポックスウイルスであるので、ヒトでの使用に関する安全性データが豊富である。全世界での天然痘ワクチン接種プログラムでは、数十万人の人々が、改変ワクシニアウイルス株により、安全にワクチン接種を受け、深刻な有害事象が報告されたのは極めてまれに過ぎない。それらの有害事象は、全身性ワクシニア（ワクシニアが体の全身に拡散する）、多形性紅斑（毒性反応／アレルギー反応）、種痘性湿疹（皮膚の広範な感染）、進行性ワクシニア（組織破壊）及び種痘後脳炎である。

１９６０年代～１９９０年代に、早期臨床試験で、合計４４人のメラノーマ患者を野生型ワクシニアウイルスで処置したところ、接種した腫瘍の客観的全奏効率は、５０％であった。また、有益な免疫学的応答が多少見られた（３６）。野生型ワクシニアウイルスは、膀胱癌、肺癌、腎臓癌及び骨髄腫の治療にも使用されており、軽度な有害事象が見られたに過ぎなかった。ＪＸ－５９４（ＧＭ－ＣＳＦをコードする腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＷｙｅｔｈ株）は、３件の第１相試験での評価において成功を収めており、無作為化第２相試験から得られた予備的な結果が、学会で発表されている。

ワクシニアウイルスは、いくつかの特徴により、がん遺伝子療法用として興味深いウイルスである。ワクシニアウイルスは、がん細胞に対して天然のトロピズムを有し、そのウイルス遺伝子のいくつかを欠失させることによって、選択性を有意に増強できる。本発明は、ウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）及びワクシニア成長因子（ＶＧＦ）という２つのウイルス遺伝子が、少なくとも部分的に欠失されている二重欠失ワクシニアウイルス（ｖｖｄｄ）を使用することに関するものである。ＴＫ遺伝子及びＶＧＦ遺伝子は、正常細胞では、ウイルスの複製に必要となるが、がん細胞では不要である。ＴＫの部分欠失は、活性を付与するＴＫ領域で操作し得る。

ＴＫが欠失されたワクシニアウイルスは、ＤＮＡの合成及び複製のためには、分裂細胞に存在する、細胞のヌクレオチドプールに依存する。いくつかの実施形態では、ＴＫの欠失により、静止細胞においては、ウイルスの複製が有意に制限され、活発に細胞分裂を行っている細胞（例えばがん細胞）のみで、効率的なウイルス複製が行われる。ＶＧＦは、感染細胞から分泌され、マイトジェンとして作用することによって、パラクラインプライミング作用を周辺細胞に及ぼす。ＶＧＦが欠失されたワクシニアウイルスの複製は、静止細胞（非がん細胞）において、大きく減弱する。ＴＫ及びＶＧＦの欠失の作用は、相乗的であることが示されている。

２．腫瘍溶解性アデノウイルス
概して、アデノウイルスは、３６ｋｂの直鎖状の二本鎖ＤＮＡウイルスである（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。「アデノウイルス」、すなわち「ＡＡＶ」という用語には、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ９＿ｈｕ１４、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ及びヒツジＡＡＶが含まれる。「霊長類ＡＡＶ」は、霊長類に感染できるＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」は、非霊長類の哺乳動物に感染できるＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」は、ウシ哺乳動物に感染できるＡＡＶを指すなどである。

宿主細胞がアデノウイルスに感染すると、アデノウイルスＤＮＡはエピソーマルに維持され、それにより、組み込まれるベクターと関連する遺伝毒性の可能性は低下する。また、アデノウイルスは、構造的に安定しており、大規模な増幅後でも、ゲノムの再構成が検出されたことはない。アデノウイルスは、実質的にすべての上皮細胞に、それらの細胞周期ステージにかかわらず感染できる（例えば、ＵＳ２００６０１４７４２０（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）。さらに、アデノウイルスのＥ１ａ領域及びＥ４領域は、ヒト細胞への効率的な増殖感染に不可欠である。Ｅ１ａ遺伝子は、増殖感染において転写される最初のウイルス遺伝子であり、その転写は、いずれかの他のウイルス遺伝子産物の作用に依存しない。しかしながら、残りの初期ウイルス遺伝子の転写には、Ｅ１ａ遺伝子の発現が必要となる。Ｅ１ａプロモーターは、Ｅ１ａ遺伝子の発現を調節するのに加えて、ウイルスゲノムのパッケージングのためのシグナル、及びウイルスＤＮＡの複製の開始に必要な部位も集約する。Ｓｃｈｍｉｄ，Ｓ．Ｉ．，ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｐ．ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９９：ｐａｇｅｓ ６７－８０（１９９５）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性アデノウイルスである。天然のウイルスを操作して、腫瘍細胞において腫瘍溶解性作用をもたらすことができることが確立されている（Ｗｉｌｄｎｅｒ，２００１、Ｊａｃｏｔａｔ，１９６７、Ｋｉｍ，２００１、Ｇｅｏｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００２（それぞれ、参照により、本明細書に援用される））。アデノウイルスの場合には、そのアデノウイルスゲノムにおける特定の欠失により、そのウイルスが、正常な静止細胞内で複製する能力を減弱させることができる一方で、腫瘍細胞で複製する能力は保持される。このように条件的に複製するアデノウイルス１つであるΔ２４が、Ｆｕｅｙｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）によって説明されており、米国特許出願公開第２００３０１３８４０５号も参照されたい（それぞれ、参照により、本明細書に援用される）。Δ２４アデノウイルスは、アデノウイルス５型（Ａｄ－５）に由来し、Ｅ１Ａ遺伝子のＣＲ２部分に、２４塩基対の欠失を含む。例えば、ＷＯ２００１０３６６５０Ａ２（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい。

腫瘍溶解性アデノウイルスには、Δ２４のように、条件的に複製するアデノウイルス（ＣＲＡＤ）が含まれ、これらのウイルスは、バイオ治療剤として使用する候補となる特性をいくつか有する。このような特性の１つは、許容細胞または許容組織において複製する能力であり、その能力は、腫瘍溶解性ウイルスの元々の投入量を増幅して、その薬剤が、隣接腫瘍細胞に拡散するのを助けて、直接的な抗腫瘍作用をもたらす。

いくつかの実施形態では、武装化されたΔ２４を産生するための導入遺伝子発現アプローチによる、Δ２４の腫瘍溶解性成分である。武装化されたΔ２４アデノウイルスは、腫瘍内で、バイスタンダー効果をもたらしたり、もしくは増強したり、及び／または患者もしくは腫瘍関連組織及び／または腫瘍関連細胞において、腫瘍溶解性アデノウイルスの検出／撮像を行ったり、もしくは増強したりするのに利用し得る。いくつかの実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスを様々な導入遺伝子策（例えば、ＩＬ－２ムテインの発現）を組み合わせると、例えば、様々な難治性腫瘍に対する潜在能力を含め、潜在的な治療能力が改善することになるとともに、撮像能力が向上する。特定の実施形態では、腫瘍溶解性アデノウイルスは、複製欠損アデノウイルス、別の腫瘍溶解性ウイルス、複製コンピテントなアデノウイルス及び／または野生型アデノウイルスと投与してよい。それぞれのウイルスは、他のアデノウイルスと同時に、またはその前または後に投与してよい。

いくつかの実施形態では、Ｅ１ａアデノウイルスベクターは、ＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス及び転写開始のための開始部位を含め、基本アデノウイルスＥ１ａプロモーターが、腫瘍特異性を示す基本プロモーターに置換されていることを含み、その基本プロモーターは、好ましくはＥ２Ｆ応答性であり、より好ましくはヒトＥ２Ｆ－１プロモーターである。したがって、このウイルスは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターからの転写を活性化する分子を欠損しているか、またはそのような分子が非機能的である細胞で抑制されることになる。正常な非分裂細胞、すなわち静止細胞が、このケースに当たる。転写因子Ｅ２Ｆが、ｐＲｂ、すなわち網膜芽腫タンパク質に結合しているので、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターに結合して活性化するためにＥ２Ｆを利用できないからである。これに対して、遊離Ｅ２Ｆを含む細胞は、Ｅ２Ｆに基づく転写に対応するはずである。このような細胞の例は、ｐＲｂ機能を欠損していて、ウイルスの増殖感染を起こすことができる腫瘍性細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようなＩＬ－２部分を用いて、Ｅ１ａアデノウイルスベクターをターゲティングする。

Ｅ１ａプロモーターにあるエンハンサー配列、パッケージングシグナル及びＤＮＡ複製開始部位の保持により、ｐＲｂ機能を欠損している腫瘍性細胞において、アデノウイルス感染が野生型レベルまで進行するようになる。本質的に、改変Ｅ１ａプロモーターにより、腫瘍特異的な転写活性化が行われ、その結果、腫瘍特異的な殺傷が十分に行われ、さらには、正常細胞での安全性が増強される。

いくつかの実施形態では、Ｅ１ａアデノウイルスベクターは、内因性Ｅ１ａプロモーターをＥ２Ｆ応答性プロモーターに置換することによって調製し、アデノウイルス５型ゲノムにおける３７５番目のヌクレオチドの上流のエレメントは、インタクトなままである。このヌクレオチドの番号付けは、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｓ．Ｉ．，ａｎｄ Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｐ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９９：ｐａｇｅｓ ６７－８０（１９９５）に記載されているとおりである。このエレメントには、ウイルスゲノムのパッケージング用として特定された７つのＡリピートモチーフのすべてが含まれる。３７５番目のヌクレオチドから５３６番目のヌクレオチドまでの配列は、ＢｓａＡＩまたはＢｓｒＢＩの制限開始部位によって欠失させ、その一方で、Ｅ１Ａタンパク質の翻訳開始コドンの上流の２３塩基対は保持したままとする。既知の材料及び方法を用いて、欠失させた内因性Ｅ１ａプロモーター配列を、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター、好ましくはヒトＥ２Ｆ－１に置換する。Ｅ２Ｆ－１プロモーターは、実施例１に記載されているようにして単離してよい。

Ｅ４領域は、アデノウイルス感染の後期に生じるイベントの多くに関与し、効率的なウイルスＤＮＡの複製、後期でのｍＲＮＡの蓄積及びタンパク質の合成、スプライシング、ならびに宿主細胞タンパク質の合成の停止に必要となる。Ｅ４転写ユニットの大半が欠損しているアデノウイルスは、複製が著しく欠損しており、概して、高い力価を得るためには、Ｅ４相補細胞株で増殖させる必要がある。Ｅ４プロモーターは、ウイルスゲノムの右端近くに位置し、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を制御する。このプロモーターでは、最大の転写活性を媒介するのに不可欠である多くの調節エレメントが特徴付けられている。これらの配列に加えて、Ｅ４プロモーター領域は、ウイルスＤＮＡの複製のために必要である調節配列を含む。Ｅ４プロモーター、及びこれらの調節配列の位置の記述は、米国特許第７，００１，５９６号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）の図２及び３に見ることができる。

いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ｅ４基本プロモーターが、腫瘍特異性を示すことが示されているプロモーター、好ましくは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター、より好ましくは、ヒトＥ２Ｆ－１プロモーターに置換されている。Ｅ４の発現を駆動するのに、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターが好ましい理由は、Ｅ１ａプロモーターが、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターに置換されているＥ１ａアデノウイルスベクターに関して、上で論じた理由と同じである。ｐＲｂの腫瘍抑制因子の機能は、ｐＲｂが、Ｅ２Ｆ－１プロモーターのようなＥ２Ｆ応答性プロモーターを抑制する能力と相関する（Ａｄａｍｓ，Ｐ． Ｄ．，ａｎｄ Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．６：９９－１０８、Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ．１９９６，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｅｒｒａｔｕｍ ａｐｐｅａｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １９９６ Ｄｅｃ．９；１２８８（３）、Ｅ－１，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１２８８：Ｍ１－５、Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．，Ｊ．Ｗ．Ｒｏｄｇｅｒｓ，ａｎｄ Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９２：１１５４４－８）。ヒトＥ２Ｆ－１プロモーターは、広範に特徴付けられており、ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ－１／－２／－３及びＧ１サイクリン／ｃｄｋ複合体、ならびにＥ１Ａを含め、ｐＲｂシグナル伝達経路に応答することが示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｋ．Ｏｈｔａｎｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｎｅｖｉｎｓ．１９９４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：１５１４－２５、Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，Ｅ．Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，ａｎｄ Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：４６６０、Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ａ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ．Ｂ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９６，Ｇｅｎｅ．１７３：１６３－９）。この調節は、全部ではないが、大半が、Ｅ２Ｆ－１プロモーター内に存在する複数のＥ２Ｆ部位の存在に起因している。すなわち、この改変（これらの改変）を有するウイルスは、インタクト（野生型）のｐＲｂ経路を含む正常細胞で減弱するが、ｐＲｂの抑制機能を欠損している細胞では、通常の感染／複製プロファイルを示すと予想される。この変異体ウイルスの通常の感染／複製プロファイルを維持するために、我々は、Ｅ４プロモーターの遠位端に、逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を保持させた。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡの複製に必要となるすべての調節エレメントを含むからである（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｌ．ａｎｄ Ｐ．Ｈｅａｒｉｎｇ．１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３９３１－９、Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ，Ｊｒ．１９８４，Ｃｅｌｌ．３７：３０９－１９、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｅ．Ａ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：８７５－８６、Ｗｉｄｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ，ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：８６４－７４）。これにより、ｐＲｂ経路を欠損した腫瘍細胞のうち、このウイルスに感染した腫瘍細胞において、野生型レベルのウイルスの到達が促進される。

いくつかの実施形態では、Ｅ４プロモーターは、ウイルスゲノムの右端近くに位置し、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を制御する（Ｆｒｅｙｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｙ．Ｋａｔｏｈ，ａｎｄ Ｒ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ．１９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３５０３－１９、Ｔｉｇｇｅｓ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｈ．Ｊ．Ｒａｓｋａｓ．１９８４． Ｓｐｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ２ ｅａｒｌｙ ｒｅｇｉｏｎ ４ ｍＲＮＡｓ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｐｌｉｃｅ ｓｉｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅ １８ ｔｏ ２４ ＲＮＡｓ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５０：１０６－１７、Ｖｉｒｔａｎｅｎ，Ａ．Ｐ．Ｇｉｌａｒｄｉ，Ａ．Ｎａｓｌｕｎｄ，Ｊ．Ｍ．ＬｅＭｏｕｌｌｅｃ，Ｕ．Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，ａｎｄ Ｍ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ．１９８４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：８２２－３１）。このプロモーターでは、転写活性を媒介する多くの調節エレメントが特徴付けられている（Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．１９８６，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０：４５－７９、Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ．１９８６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０３５－４９、Ｇｉｌａｒｄｉ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍ．Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ．１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７８７７－８８、Ｈａｎａｋａ，Ｓ．，Ｔ．Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ，Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，ａｎｄ Ｈ．Ｈａｎｄａ．１９８７，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：２５７８－８７、Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．，ａｎｄ Ｋ．Ａ．Ｌｅｅ．１９９１，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：４２９７－３０５、Ｌｅｅ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ．１９８７，Ｅｍｂｏ Ｊ．６：１３４５－５３）。これらの配列に加えて、Ｅ４プロモーター領域は、ウイルスＤＮＡの複製に関与するエレメントを含む（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｌ．，ａｎｄ Ｐ．Ｈｅａｒｉｎｇ．１９９３，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６７：３９３１－９、Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ，Ｊｒ．１９８４，Ｃｅｌｌ．３７：３０９－１９、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｅ．Ａ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：８７５－８６、Ｗｉｄｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ，ａｎｄ Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：８６４－７４）。Ｅ４プロモーター、及びこれらの調節配列の位置の記述は、図１及び２に見ることができる。Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．，ａｎｄ Ｋ．Ａ．Ｌｅｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：４２９７－３０５（１９９１）も参照されたい。これらの考察を考慮して、３５，５７６番目のヌクレオチドにおけるＸｈｏＩ部位、及び３５，８１５番目のヌクレオチドにおけるＳｐｅＩ部位という２つの新規な制限酵素部位を作ることによって、Ｅ４プロモーターシャトルを設計した（図３を参照されたい）。ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩの両方で消化すると、３５，５８１～３５，８１７番目のヌクレオチドが除去される。これにより、Ｅ４の転写に最大級の影響を及ぼすことが知られているすべての配列を含め、Ｅ４転写開始部位を基準にして－２０８番目から＋２９番目の塩基が効果的に排除される。特に、この配列には、プロモーターの活性化に最も大きい影響を及ぼすことが示されている、Ｅ４Ｆ結合部位の２つの逆位反復配列が含まれる。しかしながら、ウイルスＤＮＡの複製に不可欠である、３つのＳｐ１結合部位のすべて、５つのＡＴＦ結合部位のうちの２つ、ならびにＮＦ１結合部位及びＮＦＩＩＩ／Ｏｃｔ－１結合部位の両方は保持される。

いくつかの実施形態では、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、ヒトＥ２Ｆ－１プロモーターである。Ｅ２Ｆ－１プロモーターにおける調節エレメントのうち、ｐＲｂ経路に対する応答を媒介する重要な調節エレメントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でマッピングされている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｋ．Ｏｈｔａｎｉ，ａｎｄ Ｊ．Ｒ．Ｎｅｖｉｎｓ．１９９４，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．８：１５１４－２５、Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，Ｅ．Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，ａｎｄ Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：４６６０、Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｙ．Ｍａｎｏｍｅ，Ｔ．Ｔａｎａｋａ，Ｐ．Ｗｅｎ，Ｄ．Ｗ．Ｋｕｆｅ，Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．，ａｎｄ Ｈ．Ａ．Ｆｉｎｅ．１９９７，Ｎａｔ Ｍｅｄ．３：１１４５－９）。したがって、我々は、ＳｐｅＩ部位及びＸｈｏＩ部位をそれらの塩基対に組み込むプライマーを用いたＰＣＲによって、転写開始部位を基準にして－２１８番目から＋５１番目までの塩基対から、ヒトＥ２Ｆ－１プロモーター断片を単離した。これにより、Ｅ４プロモーターシャトルに存在する同じ部位が作られ、Ｅ４プロモーターをＥ２Ｆ－１プロモーターに直接置換可能になる。

Ｆ．変異体ＩＬ－２をコードする核酸分子
いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ－２ムテインは、単独で、または上に記載されているようなキメラポリペプチド（二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を含む）の一部として、核酸分子の発現によって得ることができる。ＩＬ－２ムテインを、野生型ＩＬ－２ポリペプチドとの同一性の観点で説明できるように、ＩＬ－２ムテインをコードする核酸分子は必ず、野生型ＩＬ－２をコードする核酸分子と特定の同一性を有することになる。例えば、本発明のＩＬ－２ムテインをコードする核酸分子は、野生型ＩＬ－２（例えば配列番号２）をコードする核酸と少なくとも５０％、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％（例えば９９％）同一であることができる。

提供する核酸分子は、天然の配列、または天然で見られる配列とは異なるが、遺伝暗号の縮退により、同じポリペプチドをコードする配列を含むことができる。これらの核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ（ホスホロアミダイトベースの合成によって作製したＤＮＡなど））、またはこれらの種類の核酸内のヌクレオチドを組み合わせるかもしくは改変したものからなることができる。加えて、その核酸分子は、二本鎖、または一本鎖（すなわち、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか）であることができる。

その核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限らず、コード配列（例えば、ＩＬ－２のコード配列）から上流または下流にある非コード配列の一部または全部も含めることができる。分子生物学の当業者は、核酸分子を単離するための常法の手順に精通している。それらの分子は、例えば、ゲノムＤＮＡを制限酵素で処理するか、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって作製できる。その核酸分子がリボ核酸（ＲＮＡ）である場合には、分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって作製できる。

本開示の例示的な単離核酸分子は、天然の状態などでは見られない断片を含むことができる。すなわち、本開示には、ベクター（例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター）に、または異種の細胞のゲノムに（もしくは天然の染色体位置以外の位置で、相同な細胞のゲノムに）、核酸配列（例えば、変異体ＩＬ－２をコードする配列）が組み込まれているような組み換え分子が含まれる。

上記のように、本発明のＩＬ－２ムテインは、キメラポリペプチドの一部として存在してよい。上記の異種のポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本発明の核酸分子は、「マーカー」または「レポーター」をコードする配列を含むことができる。マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子の例としては、β－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ、Ｇ４１８^ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃｚ（β－ガラクトシダーゼをコードする）及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。当業者は、例えば、マーカーまたはレポーターの機能を果たすことができる追加の配列の追加の有用な試薬を認識するであろう。

本発明の核酸分子は、ＩＬ－２をコードするＤＮＡであって、いずれかの生体細胞（哺乳動物の細胞など）から得たＤＮＡに、変異を導入することによって得ることができる。すなわち、本発明の核酸（及びその核酸がコードするポリペプチド）は、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、サル、ヒヒ、イヌまたはネコのものであることができる。一実施形態では、核酸分子は、ヒトの分子となる。

Ｇ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
標的免疫療法は、悪性腫瘍の治療において有望な研究分野として台頭しており、近年、大きな関心が寄せられている。実際、ＣＤ１９悪性細胞を標的とする操作済みまたは遺伝子改変済みのＴ細胞によって、リンパ腫患者の治癒が報告されている。このことにより、遺伝子療法及び免疫療法の標的として、がん細胞上に存在する抗原に対する関心が増大している。これらのＣＡＲを用いて、本明細書に記載されている二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体及び／またはＩＬ－２ムテインを腫瘍に導いたりもしくは送達したりでき、または全身でＩＬ－２ムテインを発現させることさえできる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。

特定の腫瘍抗原を特異的に標的とするように、自己または同種異系のＴ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子操作することにより、細胞傷害性免疫応答の誘導が、大半の腫瘍細胞によって無効化されるのを回避するための方策が得られる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子操作済みのＴ細胞またはＮＫ細胞を用いて、本明細書に記載されているＩＬ－２ムテインを腫瘍にターゲティングして、例えば、そのＩＬ－２ムテインが、その腫瘍の場所で発現するようにできる。これらの技法は、ヒト免疫細胞の遺伝子改変をベースとしており、その際に、その免疫細胞は、患者またはドナーから、白血球アフェレーシスによって採取してよい。特定の細胞、通常Ｔ細胞を精製し、対象となるがん抗原を標的とする受容体を発現するように操作する。操作では、レトロウイルス、レンチウイルス、トランスポゾン、ｍＲＮＡエレクトロポレーションなどによるトランスダクションを用いてよい。免疫細胞を所望の量まで増加させて、患者に導入してよい。その操作済み細胞は、細胞媒介性の傷害作用（細胞傷害性Ｔ細胞）を通じて、がん細胞を特異的に殺傷したり、及び／または腫瘍の免疫認識、サイトカインの放出及び免疫細胞の動員によって、がん細胞に対する免疫応答を誘発したりできる。

例えば、悪性腫瘍の免疫遺伝子療法に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を適用することは、有望な方策であり、このＣＡＲでは、抗体またはリガンド結合ドメインが、Ｔ細胞受容体のζシグナル伝達鎖と融合している。得られたＣＡＲ免疫細胞を、新たに獲得した特異性によってリダイクレクトし、遺伝子を改変したそのＴ細胞受容体によって認識される表面抗原または受容体を発現している腫瘍を攻撃するとともに、このＣＡＲ免疫細胞によって、高度に調節された形式の正常な宿主免疫応答を通じて、腫瘍を攻撃する細胞療法が実現する。これらの細胞は、脳循環及び体循環の全体にわたって自由に循環し、共局在化及びバイオアベイラビリティのニーズにおける問題を少なくする。

何世代ものＣＡＲ免疫細胞が開発されてきた。ＣＡＲは、腫瘍特異的なｓｃＦｖ抗体またはその他の細胞外リガンド結合ドメインを、ＴＣＲと会合されたＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、または共刺激タンパク質受容体由来の別の細胞内シグナル伝達ドメインのいずれかに融合することによって作製する。この構造により、ＣＡＲは、Ｂ細胞抗原受容体の腫瘍特異性を有するとともに、ＭＨＣとの結合とは無関係に、Ｔ細胞抗原受容体を通じて、Ｔ細胞を活性化するようになる。第１世代のＣＡＲは、ＴＣＲのシグナル伝達を可能にするために、細胞内シグナル伝達ドメインを１つ、典型的にはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとともに含んでいた。第２世代のＣＡＲは、２つの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインまたは４－１ＢＢシグナル伝達ドメインのいずれかを含む共刺激ドメインを、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと結合したものを有する。この構成により、ＣＡＲのｓｃＦｖ領域によって抗原が認識されると、Ｔ細胞の活性化及び増殖が行われる。第３世代のＣＡＲは、２つの共刺激ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとを有する。第１の共刺激ドメインは、ＣＤ２８ドメインまたは４－１ＢＢドメインのいずれかであり、第２の共刺激ドメインは、ＣＤ２８ドメイン、４－１ＢＢドメインまたはＯＸ４０ドメインのいずれかからなる。第４世代の「武装化ＣＡＲ Ｔ細胞」では、ＣＡＲ Ｔ細胞の殺腫瘍活性作用を増強するために、第２世代のＣＡＲと、サイトカインを含む追加の様々な遺伝子及び共刺激リガンドが組み合わされている。例えば、Ｂａｔｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １３：２５－４０を参照されたい。米国特許第７，７４１，４６５号及び国際公開第ＷＯ２０１４１２７２６１号（いずれも、参照により、その全体が、本明細書に援用されるも参照されたい。

Ｔ細胞のターゲティングに対する代替的なアプローチとしては、「Ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｕｐｌｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」という名称の国際公開第ＷＯ２０１５／１１７２２９号（参照により、本明細書に具体的に援用される）に記載されているようなＴ細胞抗原カップラーが挙げられる。Ｔ細胞抗原カップラーシステムは、標的特異的なポリペプチドリガンド、ＴＣＲ複合体と関連するタンパク質、例えばＣＤ３（ＴＣＲ、Ｔ細胞受容体）に結合するｓｃＦｖと結合して、Ｔ細胞の活性化を刺激するリガンド、及びＴ細胞受容体シグナル伝達メイン、例えば、Ｔ細胞の活性化を増幅するＣＤ４膜貫通細胞内ドメインという３つのドメインを連結したものを含む。ＴＡＣは、ＴＣＲを通じて、Ｔ細胞の活性化を刺激することによって、Ｔ細胞の本質的な分子機構とともに働くように操作されている。

Ｔ細胞受容体と結合した抗体が、Ｔ細胞のターゲティングの別のアプローチである。ＡＣＴＲは、ＣＡＲと確立済みのモノクローナル抗体によるオンコロジー医薬に対するハイブリッドなアプローチである。ＡＣＴＲは、Ｆｃ受容体ＣＤ１６の高親和性バリアントを通じて、抗体の重鎖と結合できる典型的なＣＡＲコンストラクトで構成される。ＡＣＴＲ－Ｔ細胞は、特異的ながん抗原にターゲティングされるリガンドと結合することによって、腫瘍を標的とできる。Ｔ細胞の活性化は、ＣＡＲモジュールによって行われる。

二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、がんを標的とするリガンドと、Ｔ細胞を腫瘍に架橋するＣＤ３結合性ｓｃＦｖドメインという２つのモジュールを通じて、Ｔ細胞のＴＣＲと標的腫瘍細胞を結合できる二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、スーパーカインを含む二重特異性融合タンパク質は、Ｂｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＳｕｐｅｒＫｉｎｅｓ ａｓ ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｉｅｓ（ＢｉＳＫＩＴ）と称されることもある。いくつかの実施形態では、新規なインターロイキンスーパーアゴニスト、部分アゴニスト及びスーパーアンタゴニストは、指向性進化を用いて設計する。いくつかの実施形態では、合理的なアプローチを用いて、機能的活性を遮断することなく、長時間作用型のＩＬ－２スーパーカイン、ＩＬ－４スーパーカイン及びＩＬ－１３スーパーカインをさらに設計する。

いくつかの実施形態では、酵母ディスプレイとともに、指向性進化を用いるプラットフォームにより、調整可能なスーパーカインをもたらす。いくつかの実施形態では、このようなプラットフォームによって、特有の特性を有するＩＬ－２スーパーカイン、ＩＬ－４スーパーカイン及びＩＬ－１３スーパーカインの広範なライブラリーを作製する（図５５）。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１０９は、アゴニスト活性が増強されている操作済みバージョンのヒトＩＬ－２である（図５６）。いくつかの実施形態では、「ＩＬ－２スーパーカイン」のＭＤＮＡ１０９ファミリーは、ＰＫ特性が改善するとともに、治療域をさらに改善させるための選択性が増強されるように操作されている（図５７）。

いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１１は、ＣＤ１２２に対する親和性が独自に増強された「βのみの」スーパーカインである（図５８）。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１１は、免疫エフェクター細胞を優先的に刺激する（図５９）。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１１は、ＭＣ３８腫瘍モデルにおいて、単独療法での抗腫瘍有効性と、抗ＰＤ１との併用効果を示す（図６０）。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４と併せたＭＤＮＡ１１は、腫瘍の消失を誘導し、リチャレンジから保護し、抗原特異的なＣＤ８ Ｔ細胞を促す（図６１）。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１１は、ＮＨＰにおいて、免疫エフェクター細胞の耐性及び持続性のある増殖及び増加を誘導するが、Ｔ_ｒｅｇｓでは誘導しない（図６２）。

いくつかの実施形態では、Ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＴＡｂ）では、腫瘍での蓄積が増強される（図６３）。いくつかの実施形態では、ＳＴＡｂは、チェックポイント耐性及び「コールド」腫瘍を克服する（図６４）。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－４受容体及びＩＬ－１３受容体は、がんにおいて重要な役割を果たす（図６５）。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ５５は、腫瘍細胞及び腫瘍微小環境（ＭＤＳＣ及びＴＡＭ）に発現した２型ＩＬ－４Ｒを標的とする強力なペイロードを有する増強型のスーパーカインである。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ４１３は、２型ＩＬ－４Ｒを介して、ＩＬ－４及びＩＬ－１３のシグナル伝達をブロックして、ＭＤＳＣ及びＴＡＭを抑制するスーパーアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１３２は、固形腫瘍上に過剰発現するデコイＩＬ－１３Ｒα２を選択的に標的とするスーパーカインである。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１３２は、腫瘍特異的な抗原を標的とする操作済みバージョンのヒトＩＬ－１３である（図６６）。いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ１３２は、Ｔ細胞エンゲージャー及びチェックポイント阻害剤を腫瘍に局在化させる際に役割を果たす（図６７）。

いくつかの実施形態では、ＭＤＮＡ４１３は、アンタゴニスト活性を示す操作済みバージョンのヒトＩＬ－１３である（図６８）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、ＩＬ－４及びＩＬ－１３の誘導によるシグナル伝達及び機能を阻害する（図６９）。

いくつかの実施形態では、二重特異性サイトカイン（ＤＵＣＫ Ｃａｎｃｅｒ）は、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３であり、図７０に示されているような作用機序を有する。

標的療法は、ＩＬ１３にコンジュゲートされた細菌毒素、ナノ粒子、腫瘍溶解性ウイルス、ならびにモノクローナル抗体、ＩＬ１３Ｒα２パルス樹状細胞及びＩＬ１３Ｒα２標的キメラ抗原受容体を用いた免疫療法を含め、ＩＬ１３Ｒα２に対して開発されてきた（Ｋａｈｌｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．６４（２４）：９１６０－９１６６、Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１８（２１）：５９４９－５９６０、Ｔｈａｃｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎｅｕｒｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ならびに臨床試験ＮＣＴ０２２０８３６２、ＮＣＴ００７３０６１３及びＮＣＴ０１０８２９２６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、これらの標的療法を用いて、ＩＬ－２ムテインを腫瘍に送達できる。

ＩＬ－１３の活性を選択的に変更させる生物製剤は、Ｔ細胞の特異性を操作することによる、特定のがんの治療を含め、多くの治療目的で注目されている。本発明は、この課題に対処するものである。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カップラー（ＴＡＣ）、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）（これらに限らない）を含む標的化組成物によって、抗腫瘍免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞などを増強するための方法及び組成物を提供し、この場合には、ＩＬ－１３スーパーカインまたはＩＬ－４スーパーカインが、標的特異的なリガンドをもたらす。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞が、ＩＬ－２ムテインを発現する。

ＩＬ－２スーパーカイン配列を含む免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトを提供し、このコンストラクトは、本明細書に記載されているようないずれかのＩＬ－２配列を含むことができる。スーパーカインは、少なくとも１つの受容体を発現している細胞、例えば腫瘍細胞に、免疫細胞をターゲティングするのに有用である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。

そのコンストラクトのＩＬ－２スーパーカイン成分またはＩＬ－２ムテイン成分は、少なくとも約５０アミノ酸長、少なくとも約７５アミノ酸長、少なくとも約１００アミノ酸長、少なくとも約１１０アミノ酸長、少なくとも約１１５アミノ酸長、最大で、膜貫通ドメインにおける野生型タンパク質の完全長、すなわち、約１１６アミノ酸長であってよい。例えば、そのスーパーカインまたはムテインは、ＣＡＲのヒンジドメイン、膜貫通ドメインまたはシグナル伝達ドメインに融合されていてもよい。例示的なポリペプチド配列は、示されている。

スーパーカインまたはムテインとして含まれるのは、これらの配列と９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列及び核酸コード配列、それらの配列を含むうえに、３’末端または５’末端に、追加のヌクレオチド、例えば、いずれかの数の追加のヌクレオチドまたはコドン（３個、６個、９個もしくは１２個以上のヌクレオチド、または最大で約１２個、２０個、５０個もしくは１００個の追加のヌクレオチドなど）も含むさらに長い配列、ならびに遺伝暗号の縮退により、これらの核酸と同じアミノ酸配列をコードするいずれかの配列である。特に、所望の宿主による発現に合わせて、コドン最適化（ＣＯ）されている配列は、本発明の一部として企図されている。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９０％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９５％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９８％同一である。いくつかの実施形態では、そのアミノ酸配列は、９９％同一である。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドは、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトに連結されている。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、ＣＤ３－ζ、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ及びＣＤ１３７に由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトもしくは発現コンストラクト、または発現は、ＣＤ３－ζに由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、ＣＤ２８に由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、ＤＡＰ１０に由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、ＯＸ－４０に由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、ＣＤ１３７に由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、本明細書に示されているものを含むＩＬ－２バリアント／ＩＬ－２スーパーカインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、配列番号２～配列番号３８に示されているものを含むＩＬ－２バリアント／ＩＬ－２スーパーカインを含む。

１．ＮＫ細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、ならびにナチュラルキラー細胞の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）（ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＮＫｐ３０など）を含む複数の細胞表面受容体を通じて、感染細胞または形質転換細胞を認識する。これらの受容体は、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２及びＣＤ３ζのようなシグナル伝達アダプタータンパク質を活性化し、これらのタンパク質は、パーフォリン及びグランザイムを含む細胞傷害性顆粒の放出を開始するとともに、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのようなサイトカイン及びケモカインの産生及び放出を媒介する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。重要なことに、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害は、自己ＨＬＡの提示には依存しない。したがって、ＮＫ細胞は、同種異系の設定で用いることができるとともに、既製の細胞製品を実現できる可能性があることにより、細胞ベースのがん療法として、臨床上大きな関心が保たれている。

ナチュラルキラー細胞は、養子免疫療法でのＴ細胞の使用に対する代替策をもたらす。ナチュラルキラー細胞では、ＨＬＡの一致が不要であるので、同種異系エフェクター細胞として使用できるからである。養子導入する同種異系ＮＫ細胞の臨床試験により、これらの細胞が、患者において、数週間から数カ月生存できることが示されている。加えて、ＮＫ細胞でＣＡＲを発現させることにより、これらの細胞は、ＮＫ細胞媒介性の活性に耐性を持つことが多い固形腫瘍を、典型的にはＮＫ細胞感受性が高めである血液悪性腫瘍（特に急性骨髄性白血病）よりも効果的に殺傷可能になる。ＮＫ細胞のターゲティングに有用なＣＡＲとしては、例えば、ＣＤ３ζを唯一のシグナル伝達ドメインとして含む第１世代のＣＡＲコンストラクトが挙げられる。第２世代及び第３世代のＣＡＲも、ＮＫ細胞において有用である。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫ細胞活性化受容体）の細胞外ドメインが、ＣＤ３ζに直接連結されている。

改変用のＮＫ細胞としては、細胞株または末梢血ＮＫ細胞が挙げられ、末梢血ＮＫ細胞は、ドナーから、単純な採血を通じて、またはもっと多くの細胞が必要な場合には、アフェレーシスによって単離できる。活性化ＰＢ－ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６、ならびにＫＩＲ（ＮＫ細胞のライセンシングにおいて、重要な役割を果たす）のような広範な活性化受容体を発現する。加えて、ＰＢ－ＮＫ細胞は、その細胞に照射を行うことなく投与できるので、ｉｎ ｖｉｖｏで増殖する能力を有する。ＣＡＲを発現させるのに適するＮＫ細胞の別の供給源は、ヒト多能性幹細胞（誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の両方）に由来するＮＫ細胞である。これらのＮＫ細胞は、ＰＢ－ＮＫ細胞と類似の表現型を示し、ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ－ＮＫ細胞は、臨床スケールで成長することができる。

２．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
スーパーカイン配列に加えて、ＣＡＲは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン、ならびにＣＡＲを発現している免疫細胞のリサイクル、生存及び／または増加をさらに促進する１つ以上の共刺激受容体のシグナル伝達ドメインを含む。その共刺激受容体のシグナル伝達ドメインは、細胞で活性化シグナルを生成する各受容体タンパク質の細胞内部分である。例は、天然型のＣＤ２８分子の１８０～２２０番目のアミノ酸、及び天然型の４－１ＢＢ分子の２１４～２５５番目のアミノ酸である。

スーパーカインをシグナル伝達領域に連結する適切なヒンジ領域及び膜貫通領域の例としては、免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域、ヒトＣＤ８ａ、ならびに標的細胞へのアクセス及び結合の改善のために、ターゲティング部分を細胞表面から遠くに移動させる役割を果たす人工のリンカーを挙げてよいが、これらに限らない。適切な膜貫通ドメインの例としては、白血球ＣＤマーカーの膜貫通ドメイン、好ましくは、ＣＤ４またはＣＤ２８の膜貫通ドメインが挙げられる。細胞内受容体シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞抗原受容体複合体、好ましくは、ＣＤ３のζ鎖が挙げられるが、ＣＡＲを膜内に固定するのに十分であるいずれの膜貫通領域も用いることができる。当業者は、数多くの膜タンパク質において膜貫通ドメインを作る数多くの膜貫通領域及び構造エレメント（新油性のアミノ酸領域など）を認識しており、したがって、いずれかの利便的な配列を置換できる。ＣＡＲ発現細胞の機能及び活性を向上させるのに適するＴ細胞共刺激シグナル伝達受容体としては、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＯＸ－４０が挙げられるが、これらに限らない。

ＣＤ２８を介したシグナル伝達は、ＩＬ２の産生及び増殖に必要であるが、Ｔ細胞の機能及び活性の持続では、中心的な役割は果たさない。ＣＤ１３７（ＣＤ２８の活性化後に発現する腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバー）及びＯＸ－４０は、Ｔ細胞の長期生存及びＴ細胞の蓄積を促すのに関与する。これらの受容体のリガンドは典型的には、樹状細胞及び活性化マクロファージのようなプロフェッショナルな抗原提示細胞上に発現するが、腫瘍細胞上には発現しない。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞において、ＣＤ２８及び／または４－１ＢＢのシグナル伝達ドメインが組み込まれているＣＡＲを発現させると、それらの細胞の活性及び抗腫瘍効果が、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインしか含まないＣＡＲを発現する細胞よりも増強される（このコンストラクトは、第２世代または第３世代のＣＡＲと称する場合もある）。

対象となるＣＡＲコンストラクトとして含まれるのは、タンデムＣＡＲであり、例えば、Ｈｅｇｄｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １２６（８）：３０３６－３０５２（参照により、本明細書に具体的に援用される）を参照されたい。このようなコンストラクトでは、腫瘍特異的な抗原に対する結合部分が、ＩＬ－１３スーパーカインとタンデムに組み合わされている。その結合部分は例えば、当該技術分野において知られているようなＨＥＲ－２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０など（これらに限らない）を含め、腫瘍細胞抗原に特異的なｓｃＦｖであってよい。

様々な実施形態では、抗原結合ドメインは、標的細胞、例えばがん細胞上の抗原に結合する。その抗原結合ドメインは、腫瘍標的抗原（ただし、これらに限らない）のような抗原と結合できる。場合によっては、その抗原結合ドメインは、１つ以上の抗原と結合する。例示的な抗原結合ドメインは、Ｄ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４ともいう）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１またはＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、上皮細胞成長因子受容体バリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒα２またはＣＤ２１３Ａ２）、メソセリン、インターロイキン１１受容体α（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１（テスチシンまたはＰＲＳＳ２１）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体β（ＰＤＧＦＲ－β）、ステージ特異的胚性抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体α、受容体チロシンタンパク質キナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２変異型（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロペイン）サブユニットβ型９（ＬＭＰ２）、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びアベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）（ｂｃｒ－ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体β、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分、乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体β３（ＡＤＲＢ３）、パネキシン３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合体座位Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、ＴＣＲγオルタネートリーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）、メラノーマ関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座バリアント遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）、精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、Ｘ抗原ファミリーメンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ２）、メラノーマがん精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）、メラノーマがん精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）、ラット肉腫（Ｒａｓ）変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座切断点、アポトーシスのメラノーマ阻害剤（ＭＬ－ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫ウイルスがん遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳ、すなわちＢｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ）、Ｔ細胞３によって認識される扁平上皮細胞癌抗原（ＳＡＲＴ３）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）、滑膜肉腫Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）、最終糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）、腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）、腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）、レグマイン、ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、腸カルボキシルエステラーゼ、熱ショックタンパク質７０－２変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）及び免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）（ただし、これらに限らない）を含む抗原に結合できる。

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、ナノボディ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどを含む。その抗原結合ドメインは、ＣＡＲの膜貫通ドメインに連結することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインをコードする核酸が、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸に機能可能に連結されている。

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来することができる。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインの野生型アミノ酸配列と比べて、１つ以上、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個以上のアミノ酸の改変（例えば、置換、挿入及び欠失）を含む。ＣＡＲの膜貫通ドメインの非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３エンプシロン（ＣＤ３ξ）、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはエリスロポエチン受容体の少なくとも膜貫通領域（複数可）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その膜貫通ドメインは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域、例えばＩｇＧ４Ｆｃヒンジを含む。別の実施形態では、その膜貫通ドメインは、疎水性のアミノ酸残基（例えば、ロイシン及びバリン）を含む組み換えドメインまたは合成ドメインである。場合によっては、その膜貫通ドメインは、そのドメインの一方または両方の末端に、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンを含む。

その膜貫通ドメインは、抗原結合ドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインをコードする核酸は、膜貫通ドメインをコードする核酸であって、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸に機能可能に連結されている核酸に機能可能に連結されている。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、シグナル活性化ドメインまたはシグナル伝達ドメインを含む。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは、タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインであって、シグナル、例えば活性化シグナルを伝達もしくは運搬するか、または細胞内で細胞応答を媒介するのに十分なドメインのいずれかの部分を含む。非限定的な例としては、ＴＣＲ、ＣＤ２、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ８６、共通ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、これらのいずれかの誘導体、バリアントまたは断片が挙げられる。特定の実施形態では、その細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ－１、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、これらのいずれかの誘導体またはいずれかのバリアントのような共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドからなる群から選択されている。

３．ＢｉＴＥＳ
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、ＣＤ３に特異的に結合する抗体可変領域に融合されたＩＬ－１３スーパーカインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、その抗体可変領域は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。そのスーパーカインは、リンカーを通じて、可変領域に融合されていてよい。Ｆｃ領域が、任意に供給されている。

４．ＴＡＣ
ＴＡＣコンストラクトは、ＴＣＲ複合体と関連するタンパク質と結合するリガンド融合されたＩＬ－２スーパーカインを含み、そのリガンドは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドに融合されている。それらのドメインは、リンカーによって隔てられていてよい。ＴＣＲ複合体と関連するタンパク質は、ＣＤ３であってよい。ＴＣＲ複合体と関連するタンパク質と結合するリガンドは、一本鎖抗体であってよい。ＴＣＲ複合体と関連するタンパク質と結合するリガンドは、ＵＣＨＴ１またはそのバリアントであってよい。そのＴ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、細胞質ドメイン及び膜貫通ドメインを含んでよい。その細胞質ドメインは、ＣＤ４の細胞質ドメインであってよく、その膜貫通ドメインは、ＣＤ４の膜貫通ドメインである。

５．ＡＣＴＲ
ＡＣＴＲは、ＣＡＲと、確立済みのモノクローナル抗体によるオンコロジー医薬に対するハイブリッドなアプローチである。ＡＣＴＲは、Ｆｃ受容体ＣＤ１６の高親和性バリアントを通じて、抗体の重鎖と結合できる典型的なＣＡＲコンストラクトで構成される。スーパーカインは、ＣＡＲによって認識される部分に融合されており、その部分としては、ＣＤ１６に対する親和性が高い抗体のＦｃ領域を挙げてよいが、これに限らない。

免疫細胞ターゲティングコンストラクト、または配列をコードする発現コンストラクトは、組み換えＤＮＡ技法を含め、当該技術分野において知られているいずれかの手段によって作製できる。そのキメラ受容体の核酸領域のいくつかをコードする核酸は、利便的であるように、当該技術分野において知られている分子クローニングの標準的な技法（ゲノムライブラリーのスクリーニング、ＰＣＲ、プライマーによるライゲーション、部位特異的変異誘発など）によって、完全なコード配列に調製及びアセンブルできる。得られたコード領域を発現ベクターに挿入して、それを用いて、適切な発現宿主細胞株、例えば、同種異系または自己のＴリンパ球、同種異系または自己のＮＫ細胞（初代培養物、細胞株、ｉＰＳＣ由来の細胞などを含む）の集団をトランスフォーメーションしてよい。この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば無細胞系中）、培養下、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて、細胞で用いることができる。例えば、ＩＬ－２スーパーカインＣＡＲを発現する細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、培養培地において培養及び増加させることができる。

非ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトを用いて、免疫細胞を特異的に誘導して、所定の腫瘍細胞を標的とするようにすることもできる。ＣＤ３－ζ、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ及びＣＤ１３７に由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含むスーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトをＴ細胞に導入することによって、抗腫瘍エフェクター細胞、例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞を作製して、上記のような腫瘍細胞を認識するようにリダイレクトする。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインを発現できる導入遺伝子をさらに含むことができる。ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、腫瘍細胞を含め、ＩＬ－２Ｒ発現細胞を標的とするように、免疫細胞を特異的に誘導できる。ＣＤ３－ζ、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ及びＣＤ１３７に由来するシグナル伝達ドメインを１つ以上含むＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトをＴ細胞に導入することによって、抗腫瘍エフェクター細胞、例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋エフェクターＴ細胞を作製して、上記のような腫瘍細胞を認識するようにリダイレクトする。

ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、例えば、当該技術分野において知られているような非ウイルスプラスミドベクター及びエレクトロポレーション方法、ウイルスベクター及び感染法などを用いて、ヒト免疫細胞に感染またはトランスフェクションする。共刺激シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、養子療法のプロトコールの臨床効果を有意に向上させることができる形式で、抗腫瘍活性の持続期間及び／または保持を増強し得る。ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞エフェクターの機能、ならびにＮＫ細胞の機能は、これらの受容体を介して誘発できるので、これらの種類の細胞は、本発明とともに使用するものとして企図されている。これらの細胞の機能の中でもとりわけ、本発明のＩＬ１３スーパーカインＣＡＲを発現するＣＤ８^＋ Ｔ細胞を用いて、標的細胞を溶解させるとともに、標的細胞の存在下でＩＬ－２を産生させてよい。ＣＤ４^＋ Ｔ細胞及びＣＤ８^＋ Ｔ細胞のいずれかまたは両方での適切な共刺激ＣＡＲの発現を用いて、養子免疫療法用の最も効果的な細胞集団、すなわち、生存能及び抗腫瘍活性が増強されており及び／または長期的であるプロフェッショナルなヘルパーＴ細胞及びキラーＴ細胞のいずれかまたは両方からなる集団をもたらす。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、図２に示されているものを含むＩＬ－２バリアント／ＩＬ－２スーパーカインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、本明細書に示されているもののいずれかを含むＩＬ－２バリアント／ＩＬ－２スーパーカインを含む。

本発明のポリペプチドは、様々な目的でさらに改変でき、例えば、多種多様な他のオリゴペプチドまたはタンパク質に接合できる。例えば、例えば、プレニル化、アセチル化、アミド化、カルボキシル化、糖鎖付加、ペグ化などによって翻訳後修飾される。このような修飾としては、糖鎖付加の改変、例えば、ポリペプチドの合成及びプロセシングの際に、またはさらなるプロセシング工程において、例えば、哺乳動物の糖鎖付加酵素または糖鎖除去酵素のように、糖鎖付加に影響を及ぼす酵素に、そのポリペプチドを暴露することによって、ポリペプチドの糖鎖付加パターンを改変することによって行う改変を挙げることができる。

当業者に周知である方法を用いて、コード配列と、適切な転写／翻訳制御シグナルとを含むＴ細胞ターゲティングコンストラクト発現ベクターを構築できる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技法、合成技法及びｉｎ ｖｉｖｏ組み換え／遺伝子組み換えが挙げられる。あるいは、対象となるポリペプチドをコードできるＲＮＡを化学合成してもよい。当業者は容易に、周知のコドン使用頻度表及び合成方法を用いて、本発明のポリペプチドのいずれかに適するコード配列をもたらすことができる。その核酸は、十分な純度で単離及び入手し得る。通常、その核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとして、他の天然の核酸配列を実質的に含まない状態で、概して、純度が少なくとも約５０％、通常は、少なくとも約９０％である状態で得ることになり、典型的には「組み換え体」例えば、天然の染色体では通常は会合していない１つ以上のヌクレオチドによって挟まれた組み換え体である。本発明の核酸は、直鎖状分子として、または環状分子内に供給できるとともに、自律的に複製する分子（ベクター）または複製配列を含まない分子内に供給できる。その核酸の発現は、その核酸自体によって、または当該技術分野において知られている他の調節配列によって調節できる。本発明の核酸は、当該技術分野において利用可能な様々な技法を用いて、適切な宿主細胞に導入できる。

本発明によれば、免疫細胞ターゲティングコンストラクトベクターまたは発現コンストラクトベクター、及び免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクト改変細胞は、治療的用途、例えばヒトの治療に適する医薬組成物に供給できる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の治療用物質、またはその薬学的に許容される塩、エステルもしくは溶媒和物を１つ以上含む。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、別の治療剤、例えば別の抗腫瘍剤と組み合わせて、本発明の治療用物質を１つ以上含む。

本発明の治療用物質は、活性な治療剤と別の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物として投与する場合が多い。このような製剤は、無毒の薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤及び／またはアジュバントを１つ以上含むことができる。好ましい形態は、意図する投与方法及び治療用途に左右される。その組成物は、所望の製剤に応じて、薬学的に許容される無毒の担体または希釈剤も含むことができ、これらは、動物またはヒトへの投与用の医薬組成物を調合するのに一般に使用されるビヒクルとして定義されている。その希釈剤は、組みわせたものの生物活性に影響が及ばないように選択する。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的なリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及びハンクス液である。加えて、その医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバントまたは無毒な非治療用の非免疫原性安定剤なども含んでよい。

さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、タンパク質、多糖（キトサンなど）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、コポリマー（ラテックスで官能化したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、アガロース、セルロースなど）、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び脂質集合体（油滴またはリポソームなど）のような大きくてゆっくり代謝される巨大分子も含むことができる。

ＣＡＲ免疫細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）は、臨床試験の展開の際に求めてよく、実験に基づき求めた場合、例えば、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^４Ｔ細胞、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^５細胞、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^６細胞、最大で体重１ｋｇ当たり約５×１０^６細胞、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^７細胞、最大で体重１ｋｇ当たり約５×１０^７細胞以上である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）は、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^４Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）は、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^５Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）は、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^６Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）は、最大で体重１ｋｇ当たり約１０^７Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）は、最大で体重１ｋｇ当たり約５×１０^６Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ免疫細胞の最大耐用量（ＭＴＤ）は、最大で体重１ｋｇ当たり約５×１０^７Ｔ細胞である。

本明細書に記載されている細胞の毒性は、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ_５０（集団の半数致死量）またはＬＤ_１００（集団の全数致死量）を求めることによって判断することができる。毒性作用と治療的作用との用量比が、治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータは、ヒトで使用する際に毒性がない投与量範囲を策定する際に用いることができる。本明細書に記載されている投与量は好ましくは、毒性がほとんどないかまたは毒性がない有効用量を含む循環濃度の範囲内である。その投与量は、採用する剤形及び使用する投与経路に応じて、この範囲内で変更し得る。厳密な製剤、投与経路及び投与量は、個々の医師が、患者の状態に鑑みて選択できる。

拡大コホートの患者は、用量漸増フェーズの後、ＭＴＤの免疫細胞で処置する。例示的な治療レジメは、２週間に１回、１カ月に１回または３～６カ月に１回の投与を伴う。本発明の治療用物質は通常、複数回で投与する。各投与間の間隔は、１週間、１カ月または１年であることができる。間隔は、患者において、治療用物質の血中レベルを測定することによって定める場合のように、不定期であることもできる。

例えば、患者において寛解を維持するための予防的な用途では、比較的低い投与量を比較的頻度の低い間隔で、長期間にわたって投与してよい。一部の患者では、残りの生涯にわたって治療を継続する。他の治療的用途では、疾患の進行が低減または停止されるまで、好ましくは、患者において、疾患の症状の部分的または完全な改善が見られるまで、比較的高い投与量を比較的短い間隔で必要とすることもある。その後、その患者は、予防的なレジメで投与できる。

免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトと併用投与及び／または同時配合できる追加の治療剤の例には、宿主における腫瘍細胞及びその他の望ましくない細胞を除去する目的で治療で使用するとともに、電離性放射線の送達及び化学療法剤の投与のような療法の使用を含む抗増殖性療法剤または細胞減少療法が挙げられる。化学療法剤は、例えば、アントラサイクリン（ダウノルビシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、エピルビシン、イダルビシン、アナマイシン、ＭＥＮ １０７５５などの化合物を含む）のようなトポイソメラーゼ阻害剤を含め、当該技術分野において周知であり、従来の用量及びレジメン、または低減した投与量もしくはレジメンで使用する。他のトポイソメラーゼ阻害剤としては、ポドフィロトキシンアナログであるエトポシド及びテニポシド、ならびにアントラセンジオン、ミトキサントロン及びアムサクリンが挙げられる。他の抗増殖性剤、例えば、ビンカアルカロイドのファミリーは、微小管重合を妨げる。ビンカアルカロイドの例としては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）、ビンデシン、ビンドリン、ビンカミンなどが挙げられる。ＤＮＡ傷害剤としては、ヌクレオチドアナログ、アルキル化剤などが挙げられる。アルキル化剤としては、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）など、及びニトロソウレア、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、クロロゾトシンなどが挙げられる。ヌクレオチドアナログとしては、ピリミジン、例えば、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ－Ｕ）、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）など、プリン、例えば、チオグアニン（６－チオグアニン）、メルカプトプリン（６－ＭＰ）、ペントスタチン、フルオロウラシル（５－ＦＵ）など、及び葉酸アナログ、例えば、メトトレキサート、１０－プロパルギル－５，８－ジデアザ葉酸（ＰＤＤＦ、ＣＢ３７１７）、５，８－ジデアザテトラヒドロ葉酸（ＤＤＡＴＨＦ）、ロイコボリンなどが挙げられる。対象となる他の化学療法剤としては、金属錯体、例えば、シスプラチン（ｃｉｓ－ＤＤＰ）、カルボプラチン、オキサリプラチンなど、尿素、例えば、ヒドロキシウレア及びヒドラジン、例えばＮ－メチルヒドラジンが挙げられる。

例えば、電離性放射線（ＩＲ）は、治療する区域内の細胞を損傷または破壊するエネルギーを堆積させることによって、がん患者の約６０％を治療するのにを用いられており、本発明の目的では、ＩＲは、従来の線量及びレジメンで、または低減した線量で送達してよい。放射線による細胞の損傷は、非特異的であるとともに、ＤＮＡに対して複雑な作用が及ぶ。療法の有効性は、正常細胞への損傷よりも、がん細胞への細胞損傷が大きいことに依存する。放射線療法を用いて、あらゆる種類のがんを治療し得る。いくつかの種類の放射線療法は、Ｘ線またはγ線のような光子を伴う。放射線をがん細胞に送達する別の技法は、内部放射線療法であり、この療法では、放射性インプラントを腫瘍または体腔に直接配置して、放射線量が小さい区域に集中するようにする。適切な電離性放射線量は、少なくとも約２Ｇｙ～約１０Ｇｙ以下の範囲、通常約５Ｇｙであってよい。適切な紫外線量は、少なくとも約５Ｊ／ｍ^２～約５０Ｊ／ｍ^２以下の範囲、通常約１０Ｊ／ｍ^２であってよい。紫外線の照射から少なくとも約４時間～約７２時間以内、通常約４時間前後に、試料を採取してよい。

治療は、免疫共刺激分子、例えばＣＤ４０、ＯＸ４０などをアゴナイズする薬剤、及び／または（ｉｉｉ）免疫阻害分子、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１などをアンタゴナイズする薬剤を含む免疫調節剤と組み合わせてもよい。その活性剤は、宿主におけるがん細胞の除去に対して相加作用または相乗作用を及ぼす期間内で投与する。投与方法としては、全身投与、腫瘍内投与などが挙げられるが、これらに限らない。

いくつかの実施形態では、個別のがんは、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、ＴＩＭ－３アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＶＩＳＴＡアンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストなどに応答する種類のがんであるという理由で、併用療法による治療に対して選択する。いくつかの実施形態では、このような免疫調節剤は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、ＰＤ１アンタゴニストまたはＰＤＬ１アンタゴニスト、例えば、アベルマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブなどである。いくつかのこのような実施形態では、がんは、メラノーマまたは小細胞肺癌であるが、これらに限らない。いくつかのこのような実施形態では、がんは、ネオアンチゲン量、すなわち変異誘発量が高い種類のものである（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２７）：１５４６－１５５８（参照により、本明細書に具体的に援用される）を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、個別のがんは、免疫応答アゴニスト、例えば、ＣＤ２８アゴニスト、ＯＸ４０アゴニスト、ＧＩＴＲアゴニスト、ＣＤ１３７アゴニスト、ＣＤ２７アゴニスト、ＨＶＥＭアゴニストなどに応答する種類のがんであるという理由で、本発明の併用療法による治療に対して選択する。いくつかの実施形態では、このような免疫調節剤は、ＯＸ４０アゴニスト、ＣＤ１３７アゴニストまたはＧＩＴＲアゴニスト、例えばトレメリムマブなどである。いくつかのこのような実施形態では、がんは、メラノーマまたは小細胞肺癌であるが、これらに限らない。いくつかのこのような実施形態では、がんは、ネオアンチゲン量、すなわち変異誘発量が高い種類のものである。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＰＤ－１に結合して、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激する抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。例えば、ＰＤ－１を標的とする抗体であって、本発明における用途を見出すことができる抗体としては、例えば、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５もしくはＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ，Ｉｎｃ．）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、及び／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）（ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６）から得たものである。他の適切な抗体としては、米国特許第８，００８，４４９号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている抗ＰＤ－１抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合して、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用を阻害することによって、免疫活性を向上させる。当該技術分野において知られているいずれかの抗体であって、ＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激する抗体は、本明細書に開示されている併用治療法での使用に適する。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とするとともに、臨床試験中にある抗体としては、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）が挙げられる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の適切な抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合して、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＣＴＬＡ－４に結合して、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＣＴＬＡ－４を標的とする例示的な抗体としては、ＦＤＡによって認可済みであるイピリムマブ（ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－１０１、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び現在ヒトでの試験が行われているトレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ－６７５、２０６、Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。ＣＴＬＡ－４を標的とする他の適切な抗体は、ＷＯ２０１２／１２０１２５、米国特許第６，９８４７２０号、同第６，６８２，７３６８号、ならびに米国特許出願公開第２００２／００３９５８１号、同第２００２／００８６０１４号及び同第２００５／０２０１９９４号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＣＴＬＡ－４に結合して、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＬＡＧ－３に結合して、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＬＡＧ－３を標的とする例示的な抗体は、現在ヒトでの試験が行われているＩＭＰ３２１（Ｉｍｍｕｔｅｐ）である。ＬＡＧ－３を標的とする他の適切な抗体は、米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＬＡＧ－３に結合して、ＬＡＧ－３とＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＴＩＭ－３に結合して、ＴＩＭ－３とガレクチン９との相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＴＩＭ－３を標的とする適切な抗体は、米国特許出願公開第２０１３／００２２６２３号（参照により、本明細書に援用される）に開示されている。ＴＩＭ－３に結合して、ＴＩＭ－３とガレクチン９との相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合して、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌとの相互作用を阻害する抗体が含まれる。４－１ＢＢ／ＣＤ１３７に結合して、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７とＣＤ１３７Ｌまたは別のリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＧＩＴＲに結合して、ＧＩＴＲとそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＧＩＴＲに結合して、ＧＩＴＲとＧＩＴＲＬまたは別のリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＯＸ４０に結合して、ＯＸ４０とそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＯＸ４０に結合して、ＯＸ４０とＯＸ４０Ｌまたは別のリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＣＤ４０に結合して、ＣＤ４０とそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＣＤ４０に結合して、ＣＤ４０とそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＩＣＯＳに結合して、ＩＣＯＳとそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＩＣＯＳに結合して、ＩＣＯＳとそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＣＤ２８に結合して、ＣＤ２８とそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＣＤ２８に結合して、ＣＤ２８とそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

いくつかの実施形態では、併用療法には、当該技術分野において知られている抗体であって、ＩＦＮαに結合して、ＩＦＮαとそのリガンドとの相互作用を阻害する抗体が含まれる。ＩＦＮαに結合して、ＩＦＮαとそのリガンドとの相互作用を阻害するとともに、抗腫瘍活性を全身にもたらす抗腫瘍免疫応答または免疫刺激応答を刺激するいずれの抗体も、この併用治療法での使用に適することを当業者は理解するであろう。

「抗がん治療」は、がん細胞の成長及び／または転移を阻止または遅延する化合物、組成物または治療（例えば手術）である。このような抗がん治療としては、手術（例えば、腫瘍の全部または一部の除去）、化学療法薬による治療、放射線照射、遺伝子療法、ホルモン操作、免疫療法（例えば、治療用抗体及びがんワクチン）、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドによる療法が挙げられるが、これらに限らない。有用な化学療法薬の例としては、ヒドロキシウレア、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、メルファラン、シクロホスファミド、イホスファミド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）（ビノレルビン）、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、シトシン、アラビノシド、ブレオマイシン、ネオカルジノスタチン、スラミン、タキソール、マイトマイシンＣ、アバスチン、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、フルオロウラシル及びテモゾロミドなどが挙げられるが、これらに限らない。その化合物は、２つ以上の化学療法剤を用いる標準的な併用療法での使用にも適する。抗がん治療には、今後開発される新規な化合物または治療が含まれることを理解されたい。

上記の医薬組成物及び／または製剤は、治療用物質を１つ以上、意図する目的を達成するのに有効な量で含む。すなわち、「治療有効用量」という用語は、がんの症状を改善する治療用物質量を指す。化合物の治療有効用量の決定は十分に、当業者の能力の範囲内である。例えば、治療有効用量はまず、細胞培養アッセイ、または本明細書に記載されているような動物モデルのいずれかで推定できる。動物モデルを用いて、適切な濃度範囲及び投与経路も求めることができる。そして、このような情報を用いて、当業者において既知の標準的な方法を使用して、ヒトを含む他の動物において有用な投与用量及び投与経路を求めることができる。

本発明の組成物と使用説明書とを含むキットも、本発明の範囲内である。そのキットは、追加の試薬、例えば、化学療法薬、抗腫瘍抗体などを少なくとも１つ、さらに含んでよい。キットは典型的には、そのキットの中身の、意図する用途を示しているラベルを含む。ラベルという用語には、キット上にまたはキットとともに供給されるか、または別段にキットに添付される文書または記録物のいずれかが含まれる。

これまで、本発明について十分に説明してきたが、本発明の趣旨または範囲から逸脱しなければ、様々な変更及び改変を加えることができることは、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されているようなＩＬ－２バリアント／ＩＬ－２スーパーカインを含むＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に示されているものを含むＩＬ－２バリアント／ＩＬ－２スーパーカインを含むＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２スーパーカイン免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、本明細書に示されているものを含むＩＬ－２バリアント／ＩＬ－２スーパーカインを含む。

６．例示的な免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトの実施形態
免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、インターロイキン－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）結合タンパク質を含み、その結合タンパク質のＩＬ－２Ｒβに対する平衡解離定数は、免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトに連結された野生型ヒトＩＬ－２（ｈＩＬ－２）よりも小さい。いくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、インターロイキン－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）結合タンパク質でもある。

いくつかの実施形態では、免疫細胞ターゲティングコンストラクトまたは発現コンストラクトは、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＤ４＋ Ｔ細胞に対して細胞傷害性作用を示す。

いくつかの実施形態では、そのコンストラクトは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、本発明のＩＬ－２スーパーカインが、細胞内シグナル伝達領域に連結された膜貫通ドメインに融合されている。

いくつかの実施形態では、その細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ３シグナル伝達ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、その細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、ＣＤ１３７シグナル伝達ドメイン、ＯＸ－４０シグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＤＡＰ１０シグナル伝達ドメインの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態では、そのコンストラクトは、Ｔ細胞抗原カップラー（ＴＡＣ）であり、ＩＬ－２スーパーカインが、ＴＣＲ複合体と関連するタンパク質と結合するリガンドに融合されており、そのリガンドは、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドに融合されている。

いくつかの実施形態では、ＴＣＲ複合体と関連するタンパク質は、ＣＤ３である。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＣＤ４の細胞質ドメイン及びＣＤ４の膜貫通ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、そのコンストラクトは、高い親和性で、ＩＬ－２スーパーカインに結合するキメラ抗原受容体成分を含む抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ成分は、ＣＤ１６を含み、ＩＬ－２スーパーカインが、Ｆｃ配列に融合されている。

いくつかの実施形態では、そのコンストラクトは、Ｔ細胞受容体の成分に結合する抗体の可変領域に融合されたＩＬ－２スーパーカインを含む二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体のＢｉＴＥ成分は、ＣＤ３である。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２Ｒβ結合タンパク質は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（野生型ｈＩＬ－２を基準にして番号付けした）というアミノ酸置換を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＩＬ－２をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、その核酸を含むベクターを提供する。

いくつかの実施形態では、上記のいずれかによるコンストラクトを含むＴ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、上記のいずれかによるコンストラクトを含むＮＫ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、ＣＤ４^＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞である。

上記の免疫細胞の単離集団も提供する。提供するのは、上記の免疫細胞集団を含む医薬製剤でもある。

Ｈ．変異体ＩＬ－２遺伝子産物の発現
上記の核酸分子は、例えば、ベクターをトランスダクションした細胞において、発現を誘導できるベクター内に含めることができる。したがって、本発明のＩＬ－２ムテイン及び／または二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体に加えて、本発明のＩＬ－２ムテインをコードする核酸分子を含む発現ベクター、及びこれらのベクターをトランスフェクションした細胞は、好ましい実施形態に含まれる。

当然ながら、すべてのベクター及び発現制御配列が、本明細書に記載されているＤＮＡ配列を発現するように十分に等しく機能するわけではないことを理解されたい。また、すべての宿主は、同じ発現系で十分に等しく機能するわけではない。しかしながら、当業者は、過度の実験を行うことなく、これらのベクター、発現制御配列及び宿主から選択を行うことができる。例えば、ベクターを選択する際には、宿主を考慮する必要がある。ベクターは、宿主内で複製しなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及びそのベクターによってコードされるいずれかの他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現も考慮する必要がある。例えば、使用できるベクターとしては、ＩＬ－２ムテインをコードするＤＮＡをコピー数で増幅させるベクターが挙げられる。このような増幅可能なベクターは、当該技術分野において周知である。このベクターとしては例えば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎの米国特許第４，４７０，４６１号、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒａｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｃＤＮＡ Ｇｅｎｅ：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｓ Ｕｔｉｌｉｚｅｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．１３０４－１９（１９８２）を参照されたい）またはグルタミンシンテターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号及び欧州特許出願公開第３３８，８４１号を参照されたい）によって増幅できるベクターが挙げられる。

いくつかの実施形態では、本開示のヒトＩＬ－２ムテインは、ベクター、好ましくは発現ベクターから発現することになる。そのベクターは、宿主細胞での自律性複製に有用であるか、または宿主細胞に導入したときに、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、それによって、宿主ゲノムとともに複製される（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）。発現ベクターは、そのベクターに機能可能に連結されているコード配列の発現を誘導できる。概して、組み換えＤＮＡ技法で有用な発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態である場合が多い。しかしながら、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような他の形態の発現ベクターも含まれる。

例示的な組み換え発現ベクターは、発現のために使用する宿主細胞に基づいて選択した調節配列であって、発現させる核酸配列に機能可能に連結された調節配列を１つ以上含むことができる。

発現コンストラクトまたは発現ベクターは、原核宿主細胞または真核宿主細胞で、ＩＬ－２ムテインまたはそのバリアントを発現するように設計できる。

ベクターＤＮＡは、原核細胞または真核細胞に、従来のトランスフォーメーション技法またはトランスフェクション技法によって導入できる。宿主細胞にトランスフォーメーションまたはトランスフェクションするのに適する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）及びその他の標準的な分子生物学ラボマニュアルに見ることができる。

原核生物におけるタンパク質の発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで行うことが最も多い。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、組み換えタンパク質の発現を最大化する方策は、例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ（１９９０）ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．），ｐｐ．１１９－１２８及びＷａｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１－２１１８に見ることができる。ＩＬ－２ムテインまたはそのバリアントを細胞から成長、回収、破壊または抽出するプロセスは実質的に、例えば、米国特許第４，６０４，３７７号、同第４，７３８，９２７号、同第４，６５６，１３２号、同第４，５６９，７９０号、同第４，７４８，２３４号、同第４，５３０，７８７号、同第４，５７２，７９８号、同第４，７４８，２３４号及び同第４，９３１，５４３号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）に記載されている。

いくつかの実施形態では、組み換えＩＬ－２ムテインまたはその生物活性バリアントは、酵母またはヒト細胞のような真核生物において作製することもできる。適切な真核宿主細胞としては、昆虫細胞（培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターの例としては、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６－２１６５）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１－３９）が挙げられる）、酵母細胞（酵母Ｓ．ｃｅｒｅｎｖｉｓｉａｅでの発現用のベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９－２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３－９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３－１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）及びｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる）、または哺乳動物細胞（哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７：１９５）が挙げられる）が挙げられる。適切な哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞が挙げられる。哺乳動物細胞では、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによってもたらす場合が多い。例えば、一般的に用いられているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞及び真核細胞の両方に適する他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２^ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）のチャプター１６及び１７を参照されたい。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を参照されたい。

本開示のヒトＩＬ－２ムテインをコードする配列は、対象となる宿主細胞での発現に合わせて最適化できる。その配列のＧ－Ｃ含有率は、所定の宿主細胞で発現する既知の遺伝子を参照することによって計算した場合の、その細胞宿主での平均レベルに調整できる。コドンの最適化方法は、当該技術分野において周知である。ＩＬ－２ムテインコード配列内のコドンは、宿主細胞での発現を増強させるように最適化して、そのコード配列内のコドンの約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約７５％または最大で１００％が、特定の宿主細胞での発現に合わせて最適化されるようにできる。

使用に適するベクターとしては、細菌で用いられるＴ７ベースのベクター（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５６：１２５，１９８７を参照されたい）、哺乳動物細胞で用いられるｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：３５２１，１９８８）、及び昆虫細胞で用いられるバキュロウイルス由来ベクター（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．製の発現ベクターｐＢａｃＰＡＫ９）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、このようなベクターにおいて、本発明のＩＬ－２ムテインをコードする核酸インサートは、プロモーターに機能可能に連結でき、このプロモーターは、例えば、発現を行わせようとする細胞の種類に基づき選択する。

発現制御配列を選択する際には、様々な要因を考慮する必要もある。これらの要因としては、例えば、その配列の相対的強度、制御性、及び本発明のＩＬ－２ムテインをコードする実際のＤＮＡ配列との適合性（特に、潜在的な二次構造に関する適合性）が挙げられる。宿主は、選択したベクターとの適合性、本発明のＤＮＡ配列によってコードされる産物の毒性、その宿主の分泌特性、ポリペプチドを正確にフォールティングさせる能力、発酵または培養の要件、及びそのＤＮＡ配列によってコードされる産物の精製のしやすさを考慮することによって選択する必要がある。

当業者は、これらのパラメーター内で、発酵時、または例えば、ＣＨＯ細胞もしくはＣＯＳ７細胞を用いた大規模な動物培養時に、所望のＤＮＡ配列を発現する、様々なベクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを選択し得る。

発現制御配列及び発現ベクターの選択は、いくつかの実施形態では、宿主の選択に左右されることになる。多種多様な発現宿主／発現ベクターの組み合わせを用いることができる。真核宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス及びサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を有するベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲＩ、ｐＥＲ３２ｚ、ｐＭＢ９及びその誘導体を含むＥ．ｃｏｌｉ由来プラスミドのような既知の細菌プラスミド、ＲＰ４のような広宿主域プラスミド、ファージＤＮＡ、例えば、λファージの数多くの誘導体、例えばＮＭ９８９、ならびにＭ１３及び繊維状一本鎖ＤＮＡファージのようなＤＮＡファージが挙げられる。酵母細胞に有用な発現ベクターとしては、２μプラスミド及びその誘導体が挙げられる。昆虫細胞に有用なベクターとしては、ｐＶＬ９４１及びｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）が挙げられる。Ｃａｔｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｂｏｖｉｎｅ Ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ Ｆｏｒ Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ”，Ｃｅｌｌ，４５，ｐｐ．６８５－９８（１９８６）。

加えて、多種多様な発現制御配列のいずれかをこれらのベクターで用いることができる。このような有用な発現制御配列としては、上記の発現ベクターの構造的遺伝子と関連する発現制御配列が挙げられる。有用な発現制御配列の例としては、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系またはＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、例えばＰＬ、ｆｄのコートタンパク質の制御領域、３－ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の解糖系酵素に対するプロモーター、酸性ホスファターゼ、例えばＰｈｏＡのプロモーター、酵母ａ交配系のプロモーター、バキュロウイルスの多角体プロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られているその他の配列とともに、それらを様々に組み合わせたものが挙げられる。

Ｔ７プロモーターは、細菌で使用でき、ポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞で使用でき、サイトメガロウイルスプロモーターまたはメタロチオネインプロモーターは、哺乳動物細胞で使用できる。また、高次の真核生物の場合には、組織特異的及び細胞種特異的なプロモーターが、広く利用可能である。これらのプロモーターは、体内における所定の種類の組織または細胞での核酸分子の発現を誘導する能力から名付けられている。当業者は、核酸の発現を誘導するのに使用できる数多くのプロモーター及びその他の調節エレメントを十分に認識している。

ベクターは、挿入された核酸分子の転写を促す配列に加えて、複製起点、及び選択可能なマーカーをコードするその他の遺伝子を含むことができる。例えば、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ^ｒ）遺伝子は、発現する細胞にＧ４１８耐性を付与するので、トランスフェクションされた細胞の表現型の選択を可能にする。当業者は、所定の調節エレメントまたは選択可能なマーカーが、実験の特定の状況での使用に適するかを容易に判断できる。

本発明で使用できるウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクターベクター、ヘルペスウイルスベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター及びウシパピローマウイルスベクターが挙げられる（例えば、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｅｄ．），Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。

本明細書に開示されている本発明のＩＬ－２ムテインをコードする核酸分子を含むとともに、その核酸分子を発現する原核細胞または真核細胞も、本発明の特徴である。本発明の細胞は、トランスフェクション細胞、すなわち、核酸分子、例えば、変異体ＩＬ－２ポリペプチドをコードする核酸分子が、組み換えＤＮＡ技法によって導入されている細胞である。このような細胞の子孫も、本発明の範囲内とみなす。

その発現系の正確な成分は、重要ではない。例えば、ＩＬ－２ムテインは、細菌であるＥ．ｃｏｌｉのような原核宿主、または昆虫細胞（例えばＳｆ２１細胞）もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞もしくはＨｅＬａ細胞）のような真核宿主で産生させることができる。これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）を含む多くの供給源から入手可能である。発現系を選択する際には、その成分が、互いに適合していることのみが重要である。当業者は、このような判断をすることができる。さらに、発現系を選択する際に、手引きが必要な場合には、当業者は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）及びＰｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８５ Ｓｕｐｐｌ．１９８７）を参考にすることができる。

発現させたポリペプチドは、常法の生化学的な手順を用いて発現系から精製できるとともに、例えば、本明細書に記載されているような治療剤として使用できる。

いくつかの実施形態では、得られたＩＬ－２ムテインには、そのムテインを産生させるのに使用した宿主生物に応じて、糖鎖付加または糖鎖除去を行うことになる。細菌を宿主とした選択した場合には、産生されたＩＬ－２ムテインでは、糖鎖除去を行うことになる。一方で、真核細胞では、ＩＬ－２ムテインに糖鎖付加を行うことになるが、おそらくは、天然型のＩＬ－２に糖鎖付加が行われる方法とは、同じではない。トランスフォーメーションした宿主によって産生されたＩＬ－２ムテインは、いずれかの適切な方法に従って精製できる。ＩＬ－２を精製するための様々な方法が知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ ２．Ｅｄｓ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｂｅｎ Ｍ．Ｄｕｎｎ，Ｈｉｄｄｅ Ｌ．Ｐｌｏｅｈｇ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｐａｕｌ Ｔ．Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｕｎｉｔ ６．５（Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ １９９７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。ＩＬ－２ムテインは、Ｅ．ｃｏｌｉで作られる封入体から、または所定のムテインを産生する哺乳動物培養液もしくは酵母培養液のいずれかに由来する馴化培地から、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー及び／または逆相液体クロマトグラフィーを用いて単離できる。

ＩＬ－２ムテインをコードするＤＮＡ配列を構築する別の例示的な方法は、化学合成によるものである。この方法には、記載されている特性を示すＩＬ－２ムテインをコードするタンパク質の化学的手段によって、ペプチドを直接合成することが含まれる。この方法では、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ及び／またはＩＬ－２Ｒγとの相互作用に影響を及ぼす位置に、天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸の両方を組み込むことができる。あるいは、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、化学的手段によって、所望のＩＬ－２ムテインをコードする遺伝子を合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、所望のＩＬ－２ムテインのアミノ酸配列に基づき、好ましくは、組み換えムテインを産生する宿主細胞において優先されるこれらのコドンの選択に基づき設計する。この点では、遺伝暗号が縮退していること、すなわち、アミノ酸が、２つ以上のコドンによってコードされることができることは十分に認識されている。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、ＴＩＣまたはＴＴＴという２つのコドンによってコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）は、ＴＡＣまたはＴＡＴによってコードされ、ｈｉｓ（Ｈ）は、ＣＡＣまたはＣＡＴによってコードされる。Ｔｒｐ（Ｗ）は、ＴＧＧという１つのコドンによってコードされる。したがって、特定のＩＬ－２ムテインをコードする所定のＤＮＡ配列においては、そのＩＬ－２ムテインをコードするＤＮＡ縮退配列が数多く存在することは明らかであろう。例えば、ムテインＨ９に好ましいＤＮＡ配列に加えて、示されているＩＬ－２ムテインをコードする縮退ＤＮＡ配列が数多く存在することは明らかであろう。これらの縮退ＤＮＡ配列は、本開示の範囲内であるとみなす。したがって、本発明の関連では、「その縮退バリアント」は、特定のムテインをコードし、それによって、そのムテインを発現させるすべてのＤＮＡ配列を意味する。

そのＩＬ－２ムテインの生物学的活性は、当該技術分野で知られているいずれかの適切な方法によってアッセイできる。このようなアッセイとしては、ＰＨＡ幼若化細胞の増殖及びＮＫ細胞の増殖が挙げられる。

Ｉ．抗ＰＤ－１抗体及び組み合わせ
本発明及び本明細書に記載されている方法に従って用いる抗ＰＤ－１抗体としては、ニボルマブ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ）、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＳＨＲ－１２１０（ＣＴＲ２０１６０１７５及びＣＴＲ２０１７００９０）、ＳＨＲ－１２１０（ＣＴＲ２０１７０２９９及びＣＴＲ２０１７０３２２）、ＪＳ－００１（ＣＴＲ２０１６０２７４）、ＩＢＩ３０８（ＣＴＲ２０１６０７３５）、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＣＴＲ２０１６０８７２）、及び／または米国特許出願公開第２０１７／００８１４０９号に列挙されているようなＰＤ－１抗体（例えば、表３８を参照されたい）が挙げられるが、これらに限らない。認可済みの抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）、ＭＫ－３４７５－０３３）及びニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）、ＣｈｅｃｋＭａｔｅ０７８）と、２つ存在し、本明細書に記載されている併用法で使用できるさらに多くが開発中である。例示的な抗ＰＤ－１抗体配列は、図１０に示されており、これらのいずれかを、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインとの併用法で使用できる。

いくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のＩＬ－２ムテイン部分は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含み、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ニボルマブと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ペムブロリズマブと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、セミプリマブと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ＢＭＳ－９３６５５８と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ＭＤＸ－１１０６と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ＯＮＯ－４５３８と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ＡＭＰ２２４と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ＣＴ－０１１と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、ＭＫ－３４７５と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

いくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含み、言及した抗体のいずれかと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて用いるＩＬ－２ムテインは、本明細書に記載されているような融合ムテインである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて用いるＩＬ－２ムテインは、本明細書に記載されているような融合ムテインである。

Ｊ．抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び組み合わせ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＩＬ－２ムテインまたは二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のいずれも、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて使用できる。認可済みの抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）、ＭＳＢ００１０７１ ８Ｃ）及びデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）と３つ存在し、開発中の他の抗ＰＤ－Ｌ１抗体も存在する。数多くの抗ＰＤ－Ｌ１抗体が利用可能であり、本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインと組み合わせて使用できるさらに多くが開発中である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国特許出願公開第２０１７／０２８１７６４号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１３／０７９１７４号（アベルマブ）及び同第ＷＯ２０１０／０７７６３４号（または米国特許出願公開第２０１６０２２２１１７号もしくは米国特許第８，２１７，１４９号、アテゾリズマブ）に記載されている抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、配列番号３４の重鎖配列及び配列番号３６の軽鎖配列（ＵＳ２０１７／２８１７６４から得られる）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＩＭｐｏｗｅｒ１１０）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）、ＭＳＢ００１０７１ ８Ｃ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１抗体は、例えば、アテゾリズマブ（ＩＭｐｏｗｅｒ１３３）、ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５及び／またはＲＧ－７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ及び／またはＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ならびに本発明の図１７に示されている例示的な抗ＰＤ－Ｌ１抗体のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、参照した抗体のいずれかと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて用いるＩＬ－２ムテインは、本明細書に記載されているような融合ムテインである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と組み合わせて用いるＩＬ－２ムテインは、本明細書に記載されているような融合ムテインである。

Ｋ．その他の免疫療法の組み合わせ
本発明の方法に従って用いるその他の抗体及び／または免疫療法としては、抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂ（イピリムマブ、トレメリムマブなど）、抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体（ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ－７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａなど）、抗ＬＡＧ－３（ＩＭＰ－３２１など）、免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体（ＣＰ－８７０，８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブのような抗ＣＤ４０ ｍＡｂを含む）、抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ（抗４－１－ＢＢ抗体）（ＢＭＳ－６６３５１３ウレルマブ（抗４－１ＢＢ抗体、例えば、米国特許第７，２８８，６３８号及び同第８，９６２，８０４号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）など）、リリルマブ（抗ＫＩＲ ｍＡＢ、ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ－９８６０１５、ＮＫ細胞抑制性受容体をブロックする）、及びＰＦ－０５０８２５６６（ウトミルマブ、例えば、米国特許第８，８２１，８６７号、同第８，３３７，８５０号及び同第９，４６８，６７８号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１２／０３２４３３号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）、抗ＯＸ４０ ｍＡｂ（例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９またはＷＯ２０１０／０９６４１８（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（ＴＲＸ５１８（例えば、米国特許第７，８１２，１３５号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）など）、抗ＣＤ２７ ｍＡｂ（バルリルマブＣＤＸ－１１２７（例えば、ＷＯ２０１６／１４５０８５、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２７４６８５号及び同第２０１２／０２１３７７１号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）、抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ（例えば、ＭＥＤＩ－５７０、ＪＴＸ－２０１１及び抗ＴＩＭ－３抗体（例えば、ＷＯ２０１３／００６４９０または米国特許出願公開第２０１６／０２５７７５８号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）など）が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、参照した抗体のいずれかと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

その他の抗体としては、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、肺癌（小細胞肺癌を含む）、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、脳腫瘍に対するモノクローナル抗体も挙げることができる（概して、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照されたい）。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、参照した抗体のいずれかと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。

抗体としては、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のための抗体も挙げることができる。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のための抗体と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

Ｌ．治療方法
いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ－２ムテイン及び／または二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体、及び／またはこれらを発現する核酸を対象に投与して、異常なアポトーシスプロセスまたは分化プロセスと関連する障害を治療できる（例えば、能動免疫または受動免疫をもたらすことによって、例えば、細胞増殖性障害または細胞分化性障害（がんなど）を治療できる）。このような疾患の治療では、開示されているＩＬ－２ムテインは、血管漏出症候群の軽減のような有益な特性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、本明細書に開示されているいずれかのＩＬ－２ムテインまたはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの配列は、配列番号２、配列番号６～配列番号１０または配列番号１６のいずれか１つと９０％同一である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、５－１の配列番号５、５－２の配列番号６、６－６の配列番号７、Ａ２の配列番号８、Ｂ１の配列番号９、Ｂ１１の配列番号１０、Ｃ５の配列番号１１、Ｄ１０の配列番号１２、Ｅ１０の配列番号１３、Ｇ８の配列番号１４、Ｈ４の配列番号１５及びＨ９の配列番号１６のいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインにおける置換は、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にして番号付けした）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、ＣＡＲ－Ｔコンストラクトと会合しており、及び／またはＣＡＲ－Ｔコンストラクトによって発現される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、腫瘍溶解性ウイルスによって発現され、及び／または腫瘍溶解性ウイルスと会合している。

細胞増殖性障害及び／または細胞分化性障害の例としては、がん（例えば、癌腫、肉腫、転移性障害または造血器新生物性障害、例えば白血病）が挙げられる。転移腫瘍は、数多くの種類の原発腫瘍に起因することができ、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、肺癌（小細胞肺癌を含む）、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌及び脳腫瘍の原発腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。

本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドを用いて、腎臓癌もしくはメラノーマを含むいずれかの種類のがん、またはいずれかのウイルス性疾患である疑いがある患者、あるいはそのがんまたはウイルス性疾患を発現するリスクが高い場合のある患者を治療できる。例示的な癌腫としては、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸及び卵巣の組織から形成される癌腫が挙げられる。この用語には、がん性組織及び肉腫性組織で構成される悪性腫瘍を含む癌腫も含まれる。

増殖性障害のさらなる例としては、造血器新生物性障害が挙げられる。

患者への投与を行う方法の代わりに、またはその方法に加えて、いくつかの実施形態では、変異体ＩＬ－２ポリペプチドをｅｘ ｖｉｖｏの方法で使用できる。例えば、細胞（例えば、患者から単離して、培養液に配置するかまたは培養液で維持するかした末梢血リンパ球または精製リンパ球集団）をｉｎ ｖｉｔｒｏで、培養培地において培養でき、その接触工程では、ＩＬ－２変異体をその培養培地に加えることによって、作用を及ぼすことができる。その培養工程は、例えば、対象となる抗原（例えば、がん抗原またはウイルス抗原）に対する反応性がある細胞集団の増殖を刺激するか、またはその集団を増加させるために、細胞を他の物質で刺激または処理する工程をさらに含むことができる。そして、その細胞を処理した後に、その細胞を患者に投与する。

治療法用に、本明細書に開示されているＩＬ－２ムテインと組み合わせて使用する抗ＰＤ－１抗体としては、ニボルマブ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ－０１１及びＭＫ－３４７５が挙げられるが、これらに限らない。

いくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含み、がんの治療のために、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、がんの治療のために、ニボルマブと組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、がんの治療のために、ＢＭＳ－９３６５５８と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、がんの治療のために、ＭＤＸ－１１０６と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、がんの治療のために、ＯＮＯ－４５３８と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、がんの治療のために、ＡＭＰ２２４と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、がんの治療のために、ＣＴ－０１１と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインは、がんの治療のために、ＭＫ－３４７５と組み合わせて使用する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｋ４３Ｎという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

いくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含み、がんの治療のために、抗ＣＴＬＡ４ ｍＡｂｓ（イピリムマブ、トレメリムマブなど）、抗ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト抗体（ＢＭＳ－９３６５５９／ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＲＧ－７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａなど）、抗ＬＡＧ－３（ＩＭＰ－３２１など）、免疫刺激タンパク質を標的とするアゴニスト抗体（ＣＰ－８７０，８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブのような抗ＣＤ４０ ｍＡｂを含む）、抗ＣＤ１３７ ｍＡｂ（抗４－１－ＢＢ抗体）（ＢＭＳ－６６３５１３ウレルマブ（抗４－１ＢＢ抗体、例えば、米国特許第７，２８８，６３８号及び同第８，９６２，８０４号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）など）、リリルマブ（抗ＫＩＲ ｍＡＢ、ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ－９８６０１５、ＮＫ細胞抑制性受容体をブロックする）、及びＰＦ－０５０８２５６６（ウトミルマブ、例えば、米国特許第８，８２１，８６７号、同第８，３３７，８５０号及び同第９，４６８，６７８号、ならびに国際公開第ＷＯ２０１２／０３２４３３号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）、抗ＯＸ４０ ｍＡｂ（例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９またはＷＯ２０１０／０９６４１８（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）、抗ＧＩＴＲ ｍＡｂ（ＴＲＸ５１８（例えば、米国特許第７，８１２，１３５号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）など）、抗ＣＤ２７ ｍＡｂ（バルリルマブＣＤＸ－１１２７（例えば、ＷＯ２０１６／１４５０８５、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２７４６８５号及び同第２０１２／０２１３７７１号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）、抗ＩＣＯＳ ｍＡｂ（例えば、ＭＥＤＩ－５７０、ＪＴＸ－２０１１及び抗ＴＩＭ－３抗体（例えば、ＷＯ２０１３／００６４９０または米国特許出願公開第２０１６／０２５７７５８号（参照により、その全体が、本明細書に援用される）を参照されたい）など）を含む（ただし、これらに限らない）抗体及び／または免疫療法と組み合わせて使用する。

いくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含み、がんの治療のために、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、肺癌（小細胞肺癌を含む）、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、脳腫瘍に対するモノクローナル抗体（概して、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖを参照されたい）を含むことができる別の抗体と組み合わせて使用する。

いくつかの実施形態では、二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体のＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含み、がんの治療のために、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のための抗体と組み合わせて使用する。

Ｍ．医薬組成物及び投与方法
いくつかの実施形態では、本発明のＩＬ－２ムテイン及び／または二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体、ならびに核酸は、医薬組成物を含む組成物に組み込むことができる。このような組成物は典型的には、ポリペプチドまたは核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む。このような組成物は、抗ＰＤ－１抗体も含むことができる。いくつかの実施形態では、その組成物は、融合タンパク質であり、及び／またはＣＡＲ－Ｔコンストラクトと会合されており、及び／または腫瘍溶解性ウイルスによって発現されるか、もしくは腫瘍溶解性ウイルスと会合しているＩＬ－２ムテインを含む。

その抗ＰＤ－１抗体、ならびにＩＬ－２ムテイン及び／または二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、複合組成物として、２つの別々の組成物として同時に、及び／または２つの別々の組成物として順次に投与することができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤、及びＩＬ－２ムテインは、１つの複合組成物として一緒に投与する（すなわち、一緒に配合する）。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤、及びＩＬ－２ムテインは、２つの別々の組成物（すなわち、別々の製剤）として同時に投与する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤、及びＩＬ－２ムテインは、別々の組成物（すなわち、別々の製剤）として順次に投与する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤、及びＩＬ－２ムテインを別々の組成物として順次に投与するときには、ＩＬ－２ムテインの前に、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤を投与する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤、及びＩＬ－２ムテインを別々の組成物として順次に投与するときには、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤の前に、ＩＬ－２ムテインを投与する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体としては、ニボルマブ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ－０１１及びＭＫ－３４７５が挙げられるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｋ４３Ｎという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

記載されているような他の免疫療法剤、ならびにＩＬ－２ムテイン及び／または二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体は、複合組成物として、２つの別々の組成物として同時に、及び／または２つの別々の組成物として順次に投与することができる。いくつかの実施形態では、他の免疫療法剤及びＩＬ－２ムテインは、１つの複合組成物として一緒に投与する（すなわち、一緒に配合する）。いくつかの実施形態では、他の免疫療法剤及びＩＬ－２ムテインは、２つの別々の組成物（すなわち、別々の製剤）として同時に投与する。いくつかの実施形態では、他の免疫療法剤及びＩＬ－２ムテインは、別々の組成物（すなわち、別々の製剤）として順次に投与する。いくつかの実施形態では、他の免疫療法剤及びＩＬ－２ムテインを別々の組成物として順次に投与するときには、ＩＬ－２ムテインの前に、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤を投与する。いくつかの実施形態では、他の免疫療法剤及びＩＬ－２ムテインを別々の組成物として順次に投与するときには、他の免疫療法剤の前に、ＩＬ－２ムテインを投与する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆ（ヒト野生型ＩＬ－２（配列番号２）を基準にして番号付けした）という置換を含むＩＬ－２ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｋ４３Ｎという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けは、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである。

医薬組成物は、意図する投与経路と適合するように調合する。本発明の抗ＰＤ－１抗体及び／または変異体ＩＬ－２ポリペプチド（二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を含む）は、経口投与してよいが、例えば静脈内投与を含む非経口経路を通じて投与する可能性の方が高い。非経口投与経路の例としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与及び直腸投与が挙げられる。非経口的な適用に使用する溶液または懸濁液としては、滅菌希釈剤（注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒）、抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）、緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩など）、及び浸透圧調整剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）という成分を挙げることができる。ｐＨは、リン酸一ナトリウム及び／または第二リン酸ナトリウム、塩酸、あるいは水酸化ナトリウムのような酸または塩基で、（例えば、ｐＨ約７．２～７．８、例えば７．５）に調整できる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは多用量バイアルに入れることができる。

注射用に適する医薬組成物としては、滅菌した水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び滅菌した注射用溶液または注射用分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与用では、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、その組成物は、滅菌されている必要があるとともに、容易に注射針を通過する程度に、流体である必要がある。その組成物は、製造条件及び保存条件下で安定である必要があり、細菌及び真菌のような微生物の汚染物の作用から保護されるように保存しなければならない。その担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散の場合には、所要の粒径を維持することによって、及び界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムを用いることによって維持できる。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって行うことができる。多くの場合、その組成物に、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、塩化ナトリウムを含めるのが好ましいであろう。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによって実現できる。

滅菌注射用溶液は、必要な場合には、上に列挙されている成分の１つまたはそれらを組み合わせたものとともに、活性化合物を所要量で適切な溶媒に組み込んだ後に、ろ過滅菌することによって調製できる。概して、分散液は、塩基性分散媒、及び上に列挙されている他の成分のうちの必要な成分を含む滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、この方法により、活性成分の粉末、及びいずれかの所望の追加成分が、事前に滅菌ろ過したそれらの溶液から得られる。

経口組成物を使用する場合には、その経口組成物は概して、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療剤を投与する目的では、活性化合物は、賦形剤とともに組み込むことができ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態で使用できる。経口組成物は、流体担体を用いて、含嗽剤として使用するように調製することもできる。薬学的に適合性のある結合剤及び／またはアジュバント材を、その組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ剤などは、結合剤（微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチンなど）、賦形剤（デンプンもしくはラクトースなど）、崩壊剤（アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ（商標）もしくはコーンスターチなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ（商標）など）、流動化剤（コロイド状二酸化ケイ素など）、甘味剤（スクロースもしくはサッカリンなど）、または香味剤（ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバーなど）という成分、または類似の性質の化合物のうちのいずれかを含むことができる。

吸入による投与の場合には、抗ＰＤ－１抗体及び／またはＩＬ－２ムテイン、あるいはそれらをコードする核酸は、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素のような気体を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーから供給されるエアゾールスプレー剤の形態で送達する。このような方法としては、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されている方法が挙げられる。

抗ＰＤ－１抗体及び／またはＩＬ－２ムテイン、あるいは核酸の全身投与は、経粘膜的または経皮的な手段によるものであることもできる。経粘膜投与または経皮投与では、透過させるバリアに適する透過剤を製剤において使用する。このような透過剤は概して、当該技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与用では、洗浄剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻スプレーまたは坐剤の使用を通じて行うことができる。経皮投与では、活性化合物は、概ね当該技術分野において知られているような軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル剤またはクリームに調合する。

いくつかの実施形態では、化合物（抗ＰＤ－１抗体及び／または変異体ＩＬ－２ポリペプチド、あるいは核酸）は、直腸送達用の坐剤（例えば、カカオ脂及びその他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を有する）または保持型浣腸剤の形態で調製することもできる。

いくつかの実施形態では、化合物（本発明のＩＬ－２ムテインまたは核酸）は、当該技術分野において知られている方法を用いて、トランスフェクションまたは感染によって投与することもでき、その方法としては、ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ４１８：６８９３，２００２）、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１００６－１０１０，２００２）またはＰｕｔｎａｍ（Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３：１５１－１６０，１９９６，ｅｒｒａｔｕｍ ａｔ Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５３：３２５，１９９６）に記載されている方法が挙げられるが、これらに限らない。

一実施形態では、抗ＰＤ－１抗体及び／またはＩＬ－２ムテイン及び／または二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体、あるいは核酸は、その抗ＰＤ－１抗体及び／または変異体ＩＬ－２ポリペプチドが体内から急速に排除されないように保護する担体とともに調製する（インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御型製剤など）。エチレン酢酸ビニル、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸のような生分解性生体適合性ポリマーを使用できる。このような製剤は、標準的な技法を用いて調製できる。その材料は、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販のものを入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって、感染細胞にターゲティングされるリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているような、当業者に知られている方法に従って調製できる。

このような抗ＰＤ－１抗体、ＩＬ－２ムテインまたは核酸の化合物の投与量、毒性及び治療効果は、例えば、ＬＤ_５０（集団の半数致死量）及びＥＤ_５０（集団の５０％で治療上有効な用量）を求めるための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順によって求めることができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表すことができる。治療指数が高い化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してよいものの、非感染細胞が損傷する可能性を最小限にすることによって、副作用を軽減するために、そのような化合物を罹患組織の部位にターゲティングする送達システムを設計するように配慮する必要がある。

ヒトで用いるための投与量の範囲を策定する際には、細胞培養アッセイ及び動物試験から得たデータを使用できる。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどないかまたは毒性がないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内であるのが好ましい。その投与量は、採用する剤形及び使用する投与経路に応じて、この範囲内で変更し得る。本発明の方法で用いるいずれの化合物でも、最初は、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定できる。用量は、細胞培養液で求めた場合に、ＩＣ_５０（すなわち、症状の最大阻害作用の５０％を得られる試験化合物濃度）を含む循環血漿中濃度範囲が得られるように、動物モデルで策定してよい。このような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に求めることができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してよい。

本明細書に定義されているように、本発明のＩＬ－２ムテイン及び／または二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体の治療有効量（すなわち、有効な投与量）、及び／または抗ＰＤ－１の抗体もしくは阻害剤の治療有効量は、選択したポリペプチドまたは抗体に左右される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインの１回投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり、およそ０．００１ｍｇ～０．１ｍｇの範囲であることができる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤の１回投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり、およそ１ｍｇ～２０ｍｇもしくは約５ｍｇ～約１５ｍｇの範囲、または約１０ｍｇであることができる。いくつかの実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約５．０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＰＤ－１の抗体もしくは阻害剤、及び／またはＩＬ－２ムテインを投与してよい。いくつかの実施形態では、６００，０００ＩＵ／ｋｇを投与する（ＩＵは、リンパ球増殖バイオアッセイによって求めることができ、Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ １^ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２（ｈｕｍａｎ）によって定められた国際単位（ＩＵ）で表される）。その投与量は、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）で処方される量と同程度であってもよいが、その量よりも少ないことが予測される。その組成物は、１日に１回以上から、週に１回以上まで投与でき、２日に１回を含む。その疾患または障害の重症度、過去の治療、対象の全身健康状態及び／または年齢、ならびに存在するその他の疾患（ただし、これらに限らない）を含む特定の要因により、対象を効果的に治療するのに必要な投与量及びタイミングが影響を受けることがあることは、当業者には明らかであろう。さらに、治療有効量の本発明のＩＬ－２ムテインによる、対象の治療は、１回の治療を含むこともできるし、または一連の治療を含むこともできる。一実施形態では、その組成物は、５日間、８時間おきに投与した後、２～１４日、例えば９日の休薬期間を設けてから、さらに５日間、８時間おきに投与する。いくつかの実施形態では、投与は、４日おきに３回の投与である。

その医薬組成物は、容器、パックまたはディスペンサーに、投与の説明書とともに入れることができる。

下記の実施例は、本明細書に示されている本発明の特定の実施形態を説明する目的で示されており、限定するものとして解釈すべきではない。

実施例１：強力な免疫調節剤としての長時間作用型の単一特異性及び二重特異性の新規ＩＬ－２／ＩＬ－１３スーパーカインの台頭
この実施例では、活発な応答を用量依存的にもたらす併用療法を示すデータを提供する。

背景：
ＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））の利用は、ＩＬ２ＲβよりもＩＬ２Ｒαに対する親和性が高いことによって誘導される短い半減期、毒性及びＴｒｅｇｓの優先的な活性化により、限られたままである。これらの制限を回避するために、我々は、（１）ＩＬ２Ｒαへの結合を妨げる変異の付加、及び（２）半減期を延長するための、アルブミンとの融合によって、ＩＬ－２スーパーカインであるＭＤＮＡ１０９をさらに操作して、ＭＤＮＡ１１を作製した。また、我々は、我々のスーパーカインプラットフォームの多用途性を利用して、同時に、ＩＬ－２のシグナル伝達を活性化する（すなわち炎症誘発性）とともに、ＩＬ－４／ＩＬ－１３の機能を抑制し（すなわち抗炎症性）及び／または腫瘍に蓄積させるように、長時間作用型の二重特異性コンストラクトを操作した。

材料及び方法：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験及びｉｎ ｖｉｖｏ試験に、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の存在下または非存在下で、ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－２シグナル伝達、ＢＬＩ／Ｏｃｔｅｔ結合分析、マウスにおけるＰＫ試験、及び同系腫瘍モデルにおける有効性試験を含めた。カニクイザル（ＮＨＰ）での用量設定試験を行って、ＭＤＮＡ１１の安全性及びＰＫ／ＰＤプロファイルを特徴付けた。

結果
ＭＤＮＡ１１及び二重特異性コンストラクトでは、ヒトＮＫ細胞及び休止ＣＤ８ Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５シグナル伝達の増強が見られ、Ｔｒｅｇ活性が、ＩＬ－２よりも低下した。週に１回で２週間という投与だったにもかかわらず、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて、ＭＤＮＡ１１の単独療法またはＩＣＩとの併用で、強力な有効性が見られ、その結果、長期の腫瘍退縮及び強力なメモリー応答が得られた。ＭＤＮＡ１１は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長も阻害し、腫瘍に浸潤しているＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の持続的な増加も見られた。二重特異性コンストラクトによる予備試験では、ＣＴ２６及びＢ１６Ｆ１０の腫瘍モデルの両方において、治療応答性が示された。ＮＨＰでは、ＭＤＮＡ１１は、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の持続的な増殖及び増加を誘導したとともに、Ｔｒｅｇに対する作用は限られていた。ＭＤＮＡ１１を反復投与しても、サイトカインストーム、抗薬物抗体応答または好酸球増加症（血管漏出症候群（ＶＬＳ）と関連する）は誘発されなかった。組織病理学的な評価により、主なＩＬ－２誘発毒性である肺水腫が見られないことが確認された。

結論
ＭＤＮＡ１１は、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化において、優れた効力を有するとともに、Ｔｒｅｇに対する活性が低減された長時間作用型ＩＬ－２スーパーカインである。ＭＤＮＡ１１は、腫瘍の成長を強力に阻害したとともに、持続的な退縮及び強力なメモリー応答を誘導した。新規な二重特異性コンストラクトでは、上記のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおける有効性も示された。ＮＨＰでは、ＭＤＮＡ１１は、有害な副作用なしに、免疫エフェクター細胞の持続的な増殖及び増加を誘導した。これらのデータにより、ＭＤＮＡ１１の効力が示され、イムノオンコロジーな適応のための多機能な医薬の設計に対する、我々のスーパーカインプラットフォームの多用途性が浮き彫りになった。

実施例２：ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）二重特異性スーパーカイン
序論
ＭＤＮＡ１０９は、親和性が中程度であるＩＬ２受容体（ＩＬ２Ｒ）（ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞上及びＮＫ細胞上に発現するＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）及びＩＬ－２Ｒγｃ（ＣＤ１３２）からなる）に対する選択性が高いＩＬ－２スーパーカインである。したがって、ＭＤＮＡ１０９は、ＮＫ細胞及びＣＤ８ Ｔ細胞の強力な活性化因子であり、ＩＬ－２よりも優れた抗がん応答を誘導できる。しかしながら、ＭＤＮＡ１０９は依然として、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）に結合することがあり、その結果、免疫抑制性のＴｒｅｇ上に発現する高親和性のＩＬ－２Ｒ（ＩＬ－２Ｒαβγｃ）が強力に活性化されるので、エフェクターＴ細胞の抗がん作用が低下する。ＦＥＡＡ変異をＭＤＮＡ１０９に付加することにより、ＭＤＮＡ１０９のＣＤ１２２への結合能に影響を及ぼさずに、ＣＤ２５への結合が消失し、それにより、エフェクター免疫細胞間のバランスがシフトし、がん細胞を制御または根絶させる。

ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡは、ｈＩｇＧ１ Ｆｃ（エフェクター機能を抑制するＮ２９７Ａという変異を有する）のような足場タンパク質に結合して、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長できる多用途な分子である。これらのＦｃ融合コンストラクトを、追加のサイトカインまたはスーパーカインとさらに融合して、特有の特性及び潜在的に新規な機能を有する二重特異性分子を作製できる。Ｍｅｄｉｃｅｎｎａはこれまで、３つの特有の二重特異性スーパーカインの操作及び製造を行ってきた（開発中のものは６個以上である）とともに、イムノオンコロジーにおけるそれらの潜在的な治療能力の評価を行う予定である。これらの二重特異性物質の開発の明細及び理由が、表１４及び下記の節に示されている。これらの二重特異性スーパーカインの配列は、表１５及び図５４に列挙されている。

ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）二重特異性スーパーカイン：
ＩＬ１３Ｒα２は、ＩＬ－１３サイトカインに対するデコイ受容体であり、理論に拘束されるものではないが、炎症組織において、ＩＬ１３媒介性の応答を弱めることによって作用すると考えられる。ＩＬ１３Ｒα２は、正常組織では、発現が最小限であるが、グリオブラストーマ、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍及び基底細胞様型乳房腫瘍を含む特定の腫瘍で過剰発現する。したがって、ＩＬ１３Ｒα２は、これらの種類のがんにおいて、免疫療法の潜在的な標的とみなすことができ、ＭＤＮＡ１０９のようなサイトカインの治療活性を増強する目的で、そのサイトカインの腫瘍部位への局在化を向上させる手段として利用できる。

ＭＤＮＡ１３２は、ＩＬ１３Ｒα２に選択的に結合するように操作したＩＬ－１３スーパーカインであり、親和性が、ＩＬ－１３よりも１０倍向上している。標的部位におけるバイオアベイラビリティを向上させることによって、ＭＤＮＡ１０９の治療的作用を増強するために、ＩＬ１３Ｒα２を過剰発現する腫瘍に局在化させるＭＤＮＡ１３２を利用する目的で、二重特異性スーパーカインＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（表１２を参照されたい）を設計した。ＦＥＡＡの変異によって操作したＭＤＮＡ１０９を含むバリアントコンストラクト（例えばＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ）を試験用に作製した。

ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）二重特異性スーパーカイン：
インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）は、免疫系の重要な成分である。ＩＬ４Ｒは、Ｔ細胞の分化、抗体のアイソタイプスイッチ及びその他の免疫反応に深く関与する。興味深いことに、ＩＬ４Ｒは、Ｉ型受容体またはＩＩ型受容体のいずれかに分類できる。Ｉ型受容体の関連では、ＩＬ４Ｒα－鎖は、γｃ鎖（通常、免疫細胞上に発現する）に結合する。これに対して、ＩＩ型受容体は、ＩＬ１３Ｒα１に結合するＩＬ４Ｒα鎖からなる。ＩＩ型ＩＬ４Ｒは、様々な種類の腫瘍上に多く見られるので、特に、がん免疫療法に関連付けられている。例えば、ＩＩ型ＩＬ４Ｒは、膵臓腫瘍及び卵巣腫瘍の５０％超、結腸直腸癌、乳癌、頭頸部癌及び肺癌（すなわちＮＳＣＬＣ）の７０％超で過剰発現する。固形腫瘍に加えて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）の重要な成分を構成する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）は、ＩＩ型ＩＬ４Ｒが陽性である。この関連では、ＩＬ４／ＩＬ４Ｒの軸は、ＴＡＭにおいて、がん促進性の表現型を誘導し、いくつかの作用の中でも特に、増殖の促進、アポトーシスの阻害を含め、ＭＤＳＣを増強し、腫瘍代謝を高める。したがって、この経路の阻害により、ＴＭＥを大幅に変化できるとともに、腫瘍の成長を制限できるであろう。

ＭＤＮＡ４１３は、ＩＬ４Ｒ ＩＩ型への結合を選択的にブロックすることによって、ＩＬ－４誘導性及びＩＬ－１３誘導性の活性を効率的に阻害するように設計された二重のＩＬ４／ＩＬ－１３スーパーアンタゴニストである。したがって、ＭＤＮＡ４１３は、ＭＤＳＣの機能を阻害して、ＴＡＭが免疫抑制性のＭ２表現型に偏るのを最小限にすることができ、それによって、バランスが、抗がん応答に優位な方にシフトする。ＭＤＮＡ４１３のＭＤＮＡ１０９－ＦｃまたはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃへの融合体（表１５及び図５４）では、エフェクター免疫細胞（すなわち、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞）の抗がん活性を刺激する一方で、ＭＤＳＣ及びＭ２／ＴＡＭの腫瘍促進機能を低減するという利点が組み合わされている。

二重特異性スーパーカインの作製及び精製
ＨＥＫ２９３細胞において、二重特異性スーパーカインを作製した。ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡの後に、陽イオン交換を行った）によって精製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣによって分析した（図４）。ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ４１３ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（２：１：２）は、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって分析した（それぞれ、図５及び図６）。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬ発色エンドトキシンアッセイによって測定し、表１６に、純度及び緩衝剤に関する情報とともに報告されている。

ヒトＰＢＭＣにおけるシグナル伝達
ＳＴＡＴ５のリン酸化（ｐＳＴＡＴ５）に基づく、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシグナル伝達アッセイにより、重要な機能上の情報が得られ、このアッセイを用いて、異なる形態のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を発現している様々な免疫細胞サブセットを活性化することにおいて、ＭＤＮＡ１０９スーパーカインの効力を評価した（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。健常なヒトドナーから採取したＰＢＭＣにおいて、用量－応答実験を行って、同じ実験条件で、様々な免疫細胞サブセットにおける二重特異性スーパーカインの効力を測定した。これらの試験を用いて、二重特異性スーパーカインの薬理学的なプロファイルの知見を得たとともに、ＭＤＮＡ４１３及びＭＤＮＡ１３２との融合が、ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡの活性に影響を及ぼすかを判断した。ヒト初代ＰＢＭＣを用いることによる主な強みは、遺伝的不均一性が、試験コンストラクトによって誘導される免疫応答に及ぼす潜在的作用を理解するために、複数のドナーで試験を行える能力である。

ＰＢＭＣを密度勾配によって単離し、完全培地にて静置してから、１５分、ＩＬ－２、様々なＭＤＮＡ１０９バリアントまたは二重特異性スーパーカインの１０点５倍希釈系列で刺激した。コントロールには、未刺激の（すなわち、ＭＤＮＡ１０９バリアントまたはＩＬ－２を加えていない）ＰＢＭＣ細胞を含めた。刺激の直後に、細胞を固定し、表１７に列挙されているような免疫サブセットで、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の細胞内染色を行った後、試料をフローサイトメトリーによって分析した。様々な免疫サブセットにおいてｐＳＴＡＴ５分析を可能にするために用いたゲーティング方法は、図７に示されており、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールは、図８に示されている。

示されている試験コンストラクトで刺激した後の各免疫サブセットの代表的な用量－応答曲線が、図９に示されており、様々なＰＢＭＣドナーの分析から得たＥＣ５０値の要約が、プロットの下の表に示されている。ＩＬ－２またはＩＬ２－Ｆｃと比べて、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃは、ナイーブ（ＣＤ２５－）ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化において、ＥＣ５０値が低いことによって示されているように、明らかに強力であった。ＭＤＮＡ１０９－ＦｃのＥＣ５０（１５２．２±３５．８ｐＭ）は、ＩＬ２－Ｆｃ（２１８９．２±４３５．３ｐＭ）の１４分の１であり、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－ＦｃのＥＣ５０（３７０．６±１３１．１ｐＭ）は、６分の１であった。ＮＫ細胞に関しては、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃはいずれも、ＩＬ２よりも強力であったが、ＩＬ２－Ｆｃとの比較では、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃは、ＩＬ２－Ｆｃよりも優れた効力が見られ、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃは、ＩＬ２－Ｆｃと同等の効力が見られ、それほど明らかではなかった。

ＩＬ２－Ｆｃ及びＭＤＮＡ１０９－Ｆｃのいずれも、Ｔｒｅｇ集団に対しては同等の効力が見られ、ＥＣ５０はそれぞれ、０．８５±０．４ｐＭ及び０．９±０．４２ｐＭであった。これに対して、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃでは、Ｔｒｅｇの活性化が大幅に低下し、ＥＣ５０は、１３５．５±５３．９ｐＭで、ＩＬ２－Ｆｃ及びＭＤＮＡ１０９－Ｆｃの１５０分の１であった。

これらのデータから、上記の二重特異性スーパーカインが、ＩＬ－２またはＩＬ２－Ｆｃと比べて、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞を効果的に刺激する能力を保持することが明らかに示された。ＩＬ２－Ｆｃと比べて、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＥＣ５０＝２５８±５８．８ｐＭ）は、約８倍強力であり、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＥＣ５０＝３７８．４±１２３．１ｐＭ）は、約６倍強力であり、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（ＥＣ５０＝５７５．８±１１９ｐＭ）は、約４倍強力である。加えて、３つの二重特異性スーパーカインはすべて、ＮＫ細胞の刺激において、ＩＬ－２よりも強力である。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化において、他の二重特異性スーパーカインよりも強度が低いが、ＩＬ２－Ｆｃよりも高い効果を保持しており、他のいずれのバリアントよりも、Ｔｒｅｇを刺激する能力が低減されているという特有の特性を有する。ＩＬ２－Ｆｃ（ＥＣ５０＝０．８５±０．４ｐＭ）と比べて、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（ＥＣ５０＝２１０．３±５８）は、Ｔｒｅｇを刺激する強度がほぼ２５０分の１である。

これらのコンストラクトの潜在的な治療活性を予測するのに有用な測定基準は、ＴｒｅｇでのｐＳＴＡＴ５ ＥＣ５０に対する、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞でのｐＳＴＡＴ５ ＥＣ５０の比率である。図１０に示されているように、ＩＬ－２及びＩＬ－２－Ｆｃにおける、ＣＤ８ Ｔ細胞／ＴｒｅｇのＥＣ５０比は高く（ＩＬ－２では６９４、ＩＬ－２－Ｆｃでは３００８）、これらのコンストラクトが、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞の活性化因子であることよりも、Ｔｒｅｇの良好な活性化因子であることと整合している。この比率は、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ、ならびにＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９では、有意に低下しており、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞に対する効力が増加していることと整合している。最も有意な変化は、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３で得られ、これらでは、ＣＤ８ Ｔ細胞／ＴｒｅｇのＥＣ５０比が、１桁の小さい値まで大幅に低下している。ＴｒｅｇのＥＣ５０に対する、ＮＫ細胞のＥＣ５０の比率は、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９で同様の傾向が見られ、ＩＬ－２及びＩＬ２－Ｆｃよりも比率が低い。ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３において、ＮＫ細胞／ＴｒｅｇのＥＣ５０比が最低レベルである。これらの結果には、これらのコンストラクトにおいて、ＮＫ細胞及びナイーブＣＤ８ Ｔ細胞に対する効力が向上しているのみならず、Ｔｒｅｇに対する効力も低下していることが反映されている。免疫誘導性のＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増加と、免疫抑制性のＴｒｅｇの低下が組み合わさると、強力な抗がん免疫応答が誘導されると見込まれる。

結論：
ＭＤＮＡ１０９またはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡの中心成分を有する二重特異性スーパーカインは、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化において、ＩＬ２－Ｆｃよりも増強された効力を保持する。ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、Ｔｒｅｇの活性化に対する効力が、ＩＬ２－Ｆｃと同程度であるのに対して、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－ＦＣ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）は、Ｔｒｅｇ集団の刺激が、ほぼ２５０分の１に低下している。

ＭＴＤ（最大耐用量）及び投与スケジュールの試験
ＭＴＤは、顕著な副作用または明白な毒性を引き起こさない最大薬物用量として定義される。ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６というという２つのマウス系統で、ＭＴＤの試験を行い、その後、これらを用いて、二重特異性スーパーカインの抗がん効果を評価した。これらの２系統の使用により、ＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスのいずれかと適合する様々な同系がんモデルを用いた有効性試験が可能となった。これらのデータは、最適な有効性及び実用性を得るために、二重特異性スーパーカインの投与を、併用薬の投与と提携させる併用試験を設計する際にも重要であった。一例として、マウス及び臨床における免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の投与スケジュールは、十分に立証されている。

二重特異性スーパーカインは、腹腔内（ＩＰ）注射によって投与したが、ＩＰ注射は、マウスにおいてＩＣＩを送達するための一般的な経路でもある。試験に応じて、各処置群のマウスは、５匹であった。これらの試験では、ＭＴＤは、試験期間中に、自然死、または体重減少もしくは瀕死による強制的な殺処分が発生したすべてのケースとして厳密に定義した。ＭＴＤ試験は、今日まで、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）について行われている。

ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＭＴＤ試験：
ＢＡＬＢ／ｃマウスで行ったＭＴＤ試験の設計の明細は、表１８に示されている。試験は、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９によって実施し、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、これらの実験を行う時には利用不可能であった。

図１１に示されているように、１ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇのＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９またはＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれかで、週に２回、２週間処置したＢＡＬＢ／ｃマウスはすべて、試験の終了時に生存していた。試験期間中、いずれの群のマウスも、臨床的に正常なようであったとともに、体重を維持した。要約すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれでも、週に２回の投与スケジュールで２週間試験した最大用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）では、ＭＴＤには到達しなかった。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭＴＤ試験：
表１９には、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで行ったＭＴＤ試験の設計の大要が示されている。ＢＡＬＢ／ｃマウスよりも低い用量範囲を使用した。Ｃ５７Ｂｌ／６は、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりも、ＩＬ－２に対する感受性が高いことが分かっているからである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

図１２に示されているように、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９またはＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９で、週に２回、２週間、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇで処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスはすべて、試験の終了時に生存していた。試験期間中、いずれの群のマウスも、臨床的に正常なようであったとともに、体重を維持した。要約すると、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいては、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれでも、週に２回の投与スケジュールで２週間試験した最大用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）では、ＭＴＤには到達しなかった。

図１２：様々な用量のＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（左）及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（右）の投与を受けたＣ５７Ｂｌ／６マウスの生存率

結論：
ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、週に２回で２週間、１．０ｍｇ／ｋｇ及び２．５ｍｇ／ｋｇで投与したところ、十分な忍容性が示され、試験した最大用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）では、ＭＴＤに到達しなかったことが示された。

ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９は、Ｃ５７Ｂ／６マウスにおいては、週に２回で２週間、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇで投与したところ、十分な忍容性が示され、試験した最大用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）では、ＭＴＤに到達しなかったことが示された。

ｉｎ ｖｉｖｏでの有効性試験
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルを用いて、強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ機能データを、臨床的に関連する抗がん表現型に転用できるかを試験した。これらのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性試験は、二重特異性スーパーカインを単剤として、またはＩＣＩと組み合わせて用いて行った。ＭＴＤには到達しなかったので、試験した用量よりも高い用量を使用した。ただし、投与スケジュールの頻度は低くした。加えて、二重特異性スーパーカインを腫瘍に直接送達して、局部投与が有効性に及ぼす作用を評価する予備試験も行った。

ＣＴ２６結腸癌モデルにおける有効性試験：
下記の多くの理由から、二重特異性スーパーカインの潜在的な治療能力を評価するために、同系結腸癌モデルＣＴ２６を選択した。
●ＣＴ２６というがんモデルは、多くの他のがんモデル（例えば、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデル、４Ｔ１転移性乳癌モデルまたはＰａｎｃ２膵臓癌モデル）と比べて侵襲性が低いので、ＭＤＮＡ１０９バリアントの治療効果を追跡するための、より広い治療域が得られる。
●ＣＴ２６というがんモデルは、いくつかの他のモデルとは対照的に、ＩＣＩに応答するので、併用治療を評価して、相乗作用の可能性を判断する機会が得られる。
●比較的成長がゆっくりであるという、ＣＴ２６腫瘍の特徴により、早期の腫瘍（すなわち、小さい腫瘍）と後期の腫瘍（すなわち、大きい腫瘍）の比較という関連で、ＭＤＮＡ１０９バリアントの抗腫瘍活性を評価する機会が得られる。

ＣＴ２６モデルにおいて、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）で行った有効性試験の試験設計は、以下のとおりである。
●雌（８～１０週齢）のＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０^６個のＣＴ２６細胞を右側腹部に皮下移植し、腫瘍の平均サイズが６０ｍｍ３に達するまで、腫瘍を成長させた。
●マウスを、腫瘍のサイズに基づき、それぞれ６匹（ビヒクルコントロール）または８匹（ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９）のいずれかの群に無作為に分けた。
●マウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）またはＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれかを５ｍｇ／ｋｇで週に１回、２週間、腹腔内投与した。
●含めた試験測定項目：
○ケージサイドでの臨床観察を毎日
○体重及び腫瘍の測定を週に２回
○食物と水の消費のモニタリング
●下記の基準のいずれかを満たす場合には、途中で終了する動物：
○そのマウスの最大体重の２０％を超える体重減少
○２０００ｍｍ^３を超える腫瘍体積
○瀕死のように見えるマウス

図１３（ａ）に示されているように、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）による処置により、ＣＴ２６腫瘍の成長が強力に阻害された。実際、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）で処置した８匹のマウスの３匹では、完全に腫瘍が退縮した一方で、コントロールマウス（図１３（ｂ））では、腫瘍の完全な退縮は観察されなかった。これらの３匹のマウスでは、移植から１２０日超、または処置を停止ししてから３カ月超、腫瘍再発のいずれの徴候も見られなかったことから、がんが治癒したことが示された。

ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の２回投与後、原発ＣＴ２６腫瘍が治癒したマウスが、その後のリチャレンジから保護されるかを検証するために、上記の３匹のマウスに、試験の４９日目に、ＣＴ２６を反対の側腹部に移植し、さらなる処置はいずれも行わなかった。コントロールとして、未処置のナイーブマウスにも、ＣＴ２６腫瘍細胞を移植した。図１４（ａ）に示されているように、ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＣＴ２６腫瘍の活発な成長が見られた。これに対して、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９で処置して、原発腫瘍が治癒したマウスでは、リチャレンジ部位において、腫瘍の成長のいずれの徴候も見られなかったことから、これらのマウスでは、ＣＴ２６腫瘍細胞に対する強力なメモリー応答が発現したことが示唆された。これらのマウスには、２回目のリチャレンジを行い、引き続きモニタリングしている。したがって、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９は、これらのマウスに、複数回のリチャレンジにもかかわらず、全生存率の点で効果をもたらす（図１４（ｂ））。

Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデルにおける有効性試験：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＢ１６Ｆ１０同系メラノーマモデルは、部分的には、マウスにおいて、これらの腫瘍が成長して転移する速度により、多くの治療努力に耐性を示してきた侵襲性のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルである。Ｂ１６Ｆ１０は、ＣＴ２６腫瘍モデルよりも有意に治療が困難なモデルであるので、二重特異性スーパーカインの潜在的な治療活性を評価するための重要な難問をもたらす。２回の有効性試験を別々に行って、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の有効性を評価した。いずれの試験も、下に概説されているのと同様のプロトコールに従った。
●雌（８～１０週齢）のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、３×１０５個のＣ５７Ｂｌ／６細胞を右側腹部に皮下移植し、投与開始前に、腫瘍の成長が確立されるまで、腫瘍をそのままにした。
●腫瘍のサイズに基づき、マウスを無作為に処置群に分けて、各群の腫瘍の平均サイズが同程度になるようにした。
●マウスに、各試験に特有の用量及びスケジュールで、腹腔内投与した（下記を参照されたい）。
●含めた試験測定項目：
○ケージサイドでの臨床観察を毎日
○体重及び腫瘍の測定を週に２回
○食物と水の消費のモニタリング
● ●下記の基準のいずれかを満たす場合に、途中で終了するマウス：
○そのマウスの最大体重の２０％を超える体重減少
○２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積
○瀕死のように見えるマウス

ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）による、Ｂ１６Ｆ１０での有効性試験：
腫瘍の平均サイズは、投与開始時点において、約２０ｍｍ３であった。マウスに、ＰＢＳ（ｎ＝９）またはＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９を１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）または２．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）で、週に２回、２週間、腹腔内注射した。図１５に示されているように、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９での処置により、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の成長が、用量依存的に阻害された。２．５ｍｇ／ｋｇで投与したＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９では、成長阻害が、１ｍｇ／ｋｇの用量よりも強力であった。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３による、Ｂ１６Ｆ１０での有効性
この試験では、投与開始時において、腫瘍を約１５ｍｍ３の平均サイズまで成長させた。マウスに、ＰＢＳ（ｎ＝８）またはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（ｎ＝８）を週に１回、３週間、５ｍｇ／ｋｇで投与した。図１６Ａ～１６Ｂに示されているように、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長に対する作用を有さず、腫瘍は、コントロールマウスの場合と同程度に成長した。これらのデータにより、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３によって治療的応答を得るためには、さらに頻度の高い投与スケジュール（週に２回）が必要であり得ることが示唆されている。

４Ｔ１乳癌モデルにおける有効性試験：
４Ｔ１乳癌モデルも、腫瘍の転移発生率が高い侵襲性モデルである。このモデルを用いて、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、及び腫瘍随伴線維芽細胞のＭ１型からＭ２型への偏り（両方とも、腫瘍の成長を補佐するように働く）の調節を目的とする薬物の治療活性を試験している。

これまで、単独療法としての（すなわち、アイソタイプコントロール、ＢｉｏＸｃｅｌ ＢＥ００８９との併用）または抗ＰＤ１（クローンＲＭＰ１－４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ ＢＥ０１４６）と組み合わせたＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）の潜在的な治療能力を評価するために、４Ｔ１での有効性試験を１回行った。試験設計は、下記のとおりであった。
●８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０６個の４Ｔ１細胞を皮下移植し、腫瘍を１４日間成長させてから、投与を開始した。
●マウスを無作為に、腫瘍のサイズに基づき、それぞれ８匹のマウスの群に分けた。
●処置は、表２０に概説されているとおりであった。
●含めた試験測定項目：
○ケージサイドでの臨床観察を毎日
○体重及び腫瘍の測定を週に２回
○食物と水の消費のモニタリング
● ●下記の基準のいずれかを満たす場合に、途中で終了するマウス：
○そのマウスの最大体重の２０％を超える体重減少
○２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積
○瀕死のように見えるマウス

図１７に示されているように、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９による単独療法群及び併用群におけるマウスは、２回目の投与後、死亡が明らかとなり、このモデルにおいては、５ｍｇ／ｋｇ、週に１回の投与レジメンでは、有害な毒性が示された。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＴ２６モデルでの以前の試験（上記を参照されたい）では、同じレジメンでのＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９による処置では、毒性が見られなかったことから、毒性が、４Ｔ１腫瘍モデル自体に関連し得ることが示唆された。

二重特異性スーパーカインの腫瘍内送達による予備的な有効性試験：
ＣＴ２６腫瘍またはＢ６Ｆ１０腫瘍が樹立された限られた数のマウスにおいて、予備試験を行って、二重特異性スーパーカインのその腫瘍への腫瘍内送達が、強力な治療的作用を及ぼすことができたかを判断した。

ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９による、Ｂ１６Ｆ１０の腫瘍内処置：
樹立したＢ１６Ｆ１０腫瘍に、ＰＢＳ（ｎ＝２）または１０μｇのＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）を３日間空けて、３回（ｎ＝２）、腫瘍内注射した。サンプルサイズは非常に小さかったが、このデータにより、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の腫瘍内注射により、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長が遅くなったことが示唆された（図１８）。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３による、ＣＴ２６の腫瘍内処置：
樹立されたＣＴ２６腫瘍を有するマウス（ｎ＝５）に、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３を１回当たり１０μｇで、３日間空けて合計３回、腫瘍内注射した。図１９に示されているように、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３を注射した腫瘍は、試験中、一様に成長し続けた。しかしながら、ＰＢＳコントロールを利用しなかったので、処置が、成長速度に作用を及ぼしたかは明らかではない。

概要
ここでの報告により、二重特異性スーパーカイン（すなわち、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（２：１：２））に関して、生物学的活性を評価する目的で行っているそれらの作製、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ試験及びｉｎ ｖｉｖｏ試験を含め、現時点で入手可能である情報の概要が得られる。

ヒトＰＢＭＣでの試験により、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３が、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞の活性化において、ＩＬ－２及びＩＬ２－Ｆｃよりも強力であることが示されたことから、これらの二重特異性スーパーカインの中心成分であるＭＤＮＡ１０９またはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡの活性が保持されることが示されている。ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９では、Ｔｒｅｇ集団に対して、ＩＬ－２及びＩＬ２－Ｆｃと同程度の活性が見られたが、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３では、ＦＥＡＡ変異により、予想どおりに、これらの免疫抑制性細胞を刺激する能力が劇的に低下した。これらのデータから、これらの二重特異性スーパーカイン、特にＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１４３が、ＩＬ－２及びＩＬ２－Ｆｃよりも良好な抗がん性の免疫学的プロファイルを有することが示されている。

ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＣ５７Ｂｌ／６マウスでのＭＴＤ試験により、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９が、週に２回のスケジュールで２週間投与すると、試験した最大用量（ＢＡＬＢ／ｃでは２．５ｍｇ／ｋｇ、Ｃ５７Ｂｌ／６では１．０ｍｇ／ｋｇ）で十分な忍容性を示したことが示された。いずれの場合にも、ＭＴＤに到達しなかったことから、これらの二重特異性スーパーカインが、さらに高い用量でも、安全に投与できることが示された。

ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）をＣＴ２６結腸腫瘍モデルで試験し、この試験では、処置スケジュールを、週に１回で２週間まで低減した一方で、用量を５ｍｇ／ｋｇに増加させた。この投与レジメンでは、十分な忍容性が示された。データから、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）の単独療法により、成長及びＣＴ２６腫瘍が強力に阻害されたことが示され、実際、８匹のマウスのうち３匹において、腫瘍の完全かつ持続的な退縮が誘導された。これらのマウスは、処置を停止してから３カ月を超えても、まだ生存しており、腫瘍のないままである。重要なことに、これらのマウスに、ＣＴ２６腫瘍細胞でリチャレンジを行ったところ、腫瘍の成長に対する耐性があることが分かったことから、これらのマウスにおいて、ＣＴ２６に対して強力なメモリー応答が発現したことが示唆された。これらのマウスにおいては、追加のリチャレンジを開始した。

ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、週に２回で２週間投与したところ、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長を阻害した。その阻害作用は、用量依存的であり、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスは、１ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスよりも腫瘍の成長が遅かった。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９は、５ｍｇ／ｋｇで週に１回、３週間投与した時には、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長に対する作用がほとんどないか、作用がなかった。治療的作用を得るには、もっと高い用量またはもっと高い頻度の投与スケジュールが必要である可能性がある。

ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＣＴ２６腫瘍モデルでは十分な忍容性を示したが（上記を参照されたい）、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、４Ｔ１モデルでは、５ｍｇ／ｋｇで週に１回、２週間という厳密な投与レジメンにおては、あまり十分な忍容性を示さなかった。マウスは、処置が単独療法であるか、抗ＰＤ１との併用であるかにかかわらず、２回目のＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９を投与してから間もなく死亡した。同様に、週に１回、５ｍｇ／ｋｇのＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９によって処置した４Ｔ１腫瘍担持マウスも、２回目の投与から間もなく死亡した。これらのデータから、これらの二重特異性スーパーカインに伴う致死は、その実験で使用したマウス系統ではなく、４Ｔ１モデル自体に関連し得ることが示唆されている。

二重特異性スーパーカインの腫瘍内投与による予備試験は、コントロールの欠如及び／またはサンプルサイズの小ささにより、不確実なものである。ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３を注射したＣＴ２６腫瘍は、試験中、一様に成長し続けたが、ビヒクルを注射したコントロール腫瘍を比較として利用しなかったので、成長速度に作用を及ぼしたかは明らかではなかった。ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９は、腫瘍内注射したところ、ＰＢＳを注射したコントロール腫瘍と比べて、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の成長を遅らせたようであったが、有意義な比較を行うには、サンプルサイズが非常に小さかった（１群当たりのｎ＝２）。

ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３のアンタゴニスト作用
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞を用いることによって、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３が、ＩＬ－４及びＩＬ－１３の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を阻害する能力をアッセイした。これらの細胞は、ヒトＳＴＡＴ６遺伝子をＨＥＫ２９３細胞に安定的に導入して、十分な活性を有するＳＴＡＴ６シグナル伝達経路を得ることによって作製した。この経路の他の遺伝子は、天然の状態で、十分な量で発現する。さらに、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞は、４つのＳＴＡＴ６結合部位に融合されたＩＦＮｂ最小プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子である分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を安定的に発現する。ＩＬ－４またはＩＬ－１３によって、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞でＳＴＡＴ６経路が活性化されることにより、そのレポーター遺伝子の発現が誘導された。ＳＥＡＰの存在下で紫色／青色に変化する媒体であるＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）を用いたところ、上清に分泌されたＳＥＡＰが検出された。

示されている融合タンパク質の存在下または非存在下で、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞をヒトＩＬ－４（ｈＩＬ４）、ヒトＩＬ－１３（ｈＩＬ１３）またはマウスＩＬ－１３（ｍＩＬ１３）で２４時間処理した。続いて、２０μｌの細胞培養液上清を採取し、１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）溶液と混合し、２時間、３７℃でインキュベートした。吸光度を６５０ｎｍで測定した。

図２０に示されているように、ヒトＩＬ－４（ｈＩＬ４）、ヒトＩＬ－１３（ｈＩＬ１３）及びマウスＩＬ－１３（ｍＩＬ１３）は、ＳＴＡＴ６シグナル伝達経路を用量依存的に活性化させた。各インターロイキンタンパク質について、ＥＣ５０が、図に示されている。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞をヒトＩＬ－１３（ｈＩＬ１３）で、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＦｃ－ＭＤＮＡ１０９とともに処理した後、ＳＴＡＴシグナル伝達経路のｈＩＬ１３による活性化は、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３によってアンタゴナイズされた（図２１）。上記の３つの融合タンパク質の中でも、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、ｈＩＬ－１３の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を、比較的有効に阻害する。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞をヒトＩＬ－１３（ｈＩＬ１３）で、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＦｃ－ＭＤＮＡ１０９とともに処理した後、ＳＴＡＴシグナル伝達経路のｈＩＬ１３による活性化は、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３によってアンタゴナイズされた（図２１）。上記の３つの融合タンパク質の中でも、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３が、ｈＩＬ１３の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を特に有効に阻害する。ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、ｈＩＬ１３の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を阻害するが、その程度は、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３よりも低い。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞をマウスＩＬ－１３（ｍＩＬ１３）で、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＦｃ－ＭＤＮＡ１０９とともに処理した後、ＳＴＡＴシグナル伝達経路のｍＩＬ１３による活性化は、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３によってアンタゴナイズされた（図２２）。上記の３つの融合タンパク質の中でも、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３が、ｍＩＬ１３の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を特に有効に阻害する。ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、ｍＩＬ１３の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を阻害するが、その程度は、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３よりも低い。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－４／ＩＬ－１３細胞をヒトＩＬ－４（ｈＩＬ４）で、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＦｃ－ＭＤＮＡ１０９とともに処理した後、ＳＴＡＴシグナル伝達経路のｈＩＬ４による活性化が、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３によってアンタゴナイズされた（図２３）。これらの３つの融合タンパク質の中でも、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３が、ｈＩＬ４の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を特に有効に阻害する。ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、ｈＩＬ４の誘導による、ＳＴＡＴ６の活性化を阻害するが、その程度は、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３よりも低い。

ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、ＩＬ－２ムテインの活性を保持する
ＩＬ－２ムテインを含む二重特異性融合タンパク質において、ＩＬ－２活性を評価した。マウスＴ細胞株ＣＴＬＬ２を使用した。この株は、ＩＬ－２依存性であり、αβγ型のＩＬ－２Ｒを構成的に発現する。１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン及び５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０において、この細胞を培養した。組み換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩｌ２）または様々な融合タンパク質を、この細胞培養液に添加し、その細胞の増殖をアッセイした。

図２４Ａに示されているように、細胞の増殖は、ＩＬ－２に依存していた。細胞培養液に、ＩＬ－２の代わりに、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３を添加したところ、細胞の増殖は見られなかった（図２４Ｂ）。細胞培養液に、ＩＬ－２ムテインを含む二重特異性融合タンパク質（ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３またはＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、図２４Ｃ）を添加したところ、細胞の増殖は、維持されたか、または増大した。したがって、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）は、ＩＬ－２ムテイン活性を保持していた。

ヒトＰＢＭＣでのＰ－ＳＴＡＴ５アッセイ：
簡潔に述べると、実験デザイン（ＣＲＬ，Ｐｏｒｔｉｓｈｅａｄ，ＵＫで行った）は、以下のとおりであった。すなわち、ＰＢＭＣを密度勾配によって単離し、完全培地にて静置してから、各試験コンストラクトの１０点５倍希釈液（２５，０００ｐＭ～０．０１３ｐＭ）で１５分刺激して、ＥＣ５０を求めるために、用量－応答曲線を作成した。刺激の直後に、細胞を固定し、表２１に列挙されている免疫サブセットで、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の細胞内染色を行った後、試料をフローサイトメトリーによって分析した。これらのサブセットにおいてｐＳＴＡＴ５分析を可能にするために用いたゲーティング方法は、図７に示されており、代表的なＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロールは、図８に示されている。

図７に示されているようなゲーティング方法。ＰＢＭＣをＩＬ－２（２５ｎＭ）で１５分刺激してから染色し、フローサイトメトリーによる分析を行った。単一のリンパ球を同定し、そのリンパ球から、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）及び非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ２５－ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－）をゲーティングした。各免疫細胞サブセットにおいて、ｐＳＴＡＴ５陽性細胞の頻度を求めた。

図８に示されているような、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｎｕｓ Ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロール。Ａ）図４に記載されている刺激及びゲーティング法の後、様々な免疫サブセットを特定するために使用する、ｐＳＴＡＴ５以外のすべての抗体を含めて、各集団において、ｐＳＴＡＴ５＋ゲートをかけるのに使用できるＦＭＯコントロールを供給した。Ｂ）ＦＯＸＰ３及びＣＤ２５のＦＭＯを用いて、Ｔｒｅｇ集団を求めた。

ＭＴＤ（最大耐用量）：
図１１及び１２に示されているように、６～８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（表２２）またはＣ５７ＢＬ／６マウス（表２３）を少なくとも７日間馴化してから、実験を開始した。下記の用量及びスケジュールに従って、マウスに、コンストラクトを腹腔内（ＩＰ）注射によって投与した。２週間の試験の間、ケージサイドでの観察によって、マウスを毎日モニタリングし、体重を週に２回測定した。これらの試験では、ＭＴＤは、試験期間中に、自然死、または体重減少（投与前の体重の２０％超）もしくは瀕死による強制的な殺処分が発生したすべてのケースとして厳密に定義した。試験の終了時に、マウスを安楽死させて、検死を行った。

ＢＡＬＢ／ｃマウスでの試験：
１ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇのＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９またはＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれかで、週に２回、２週間処置したＢＡＬＢ／ｃマウスはすべて、試験の終了時に生存していた。試験期間中、いずれの群のマウスも、臨床的に正常なようであったとともに、体重を維持した。要約すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれでも、週に２回の投与スケジュールで２週間試験した最大用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）では、ＭＴＤには到達しなかった。

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでの試験：
ＢＡＬＢ／ｃマウスよりも低い用量範囲を使用した。Ｃ５７Ｂｌ／６は、ＢＡＬＢ／ｃマウスよりも、ＩＬ－２に対する感受性が高いことが分かっているからである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９またはＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９で、週に２回、２週間、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇで処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスはすべて、試験の終了時に生存していた。試験期間中、いずれの群のマウスも、臨床的に正常なようであったとともに、体重を維持した。要約すると、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいては、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれでも、週に２回の投与スケジュールで２週間試験した最大用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）では、ＭＴＤには到達しなかった。

記：Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ＪＪ，Ｈｏｗａｒｄ ＯＭ． ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ｈａｖｅ ｍｏｒｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｈｏｗ ｇｒｅａｔｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ＣＤ４＋ＣＤ２５－ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｎ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．（２００５）７８（１）：１１４－２１．

ＣＴ２６での有効性試験：
下記の多くの理由から、二重特異性スーパーカインの潜在的な治療能力を評価するために、同系結腸癌モデルＣＴ２６を選択した。

ＣＴ２６というがんモデルは、多くの他のがんモデル（例えば、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマモデル、４Ｔ１転移性乳癌モデルまたはＰａｎｃ２膵臓癌モデル）と比べて侵襲性が低いので、ＭＤＮＡ１０９バリアントの治療効果を追跡するための、より広い治療域が得られる。

ＣＴ２６というがんモデルは、いくつかの他のモデルとは対照的に、ＩＣＩに応答するので、併用治療を評価して、相乗作用の可能性を判断する機会が得られる。

比較的成長がゆっくりであるという、ＣＴ２６腫瘍の特徴により、早期の腫瘍（すなわち、小さい腫瘍）と後期の腫瘍（すなわち、大きい腫瘍）の比較という関連で、ＭＤＮＡ１０９バリアントの抗腫瘍活性を評価する機会が得られる。

これまで、ＣＴ２６モデルにおいて、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）を用いて、有効性試験が１件行われている。試験設計は、下記のとおりである。

雌（８～１０週齢）のＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０６個のＣＴ２６細胞を右側腹部に皮下移植し、腫瘍の平均サイズが６０ｍｍ３に達するまで、腫瘍を成長させた。

マウスを、腫瘍のサイズに基づき、それぞれ６匹（ビヒクルコントロール）または８匹（ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９）のいずれかの群に無作為に分けた。

マウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）またはＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９のいずれかを５ｍｇ／ｋｇで週に１回、２週間、腹腔内投与した。これは、その時点に研究中であった他のＭＤＮＡ１０９コンストラクトの用量及びスケジュールがベースであった。

含めた試験測定項目：
●ケージサイドでの臨床観察を毎日
●体重及び腫瘍の測定を週に２回
●食物と水の消費のモニタリング

下記の基準のいずれかを満たす場合に、途中で終了するマウス：
●そのマウスの最大体重の２０％を超える体重減少
●２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積
●瀕死のように見えるマウス

図１３に示されているように、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）による処置により、ＣＴ２６腫瘍の成長が強力に阻害された。実際、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）で処置した８匹のマウスの３匹では、完全に腫瘍が退縮した一方で、コントロールマウスでは、腫瘍の完全な退縮は観察されなかった。これらの３匹のマウスでは、移植から１２０日超、または処置を停止ししてから３カ月超、腫瘍再発のいずれの徴候も見られなかったことから、がんが治癒したことが示された。

図１４に示されているように、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の２回投与後、原発ＣＴ２６腫瘍が治癒したマウスが、その後のリチャレンジから保護されるかを検証するために、上記の３匹のマウスに、試験の４９日目に、ＣＴ２６を反対の側腹部に移植し、さらなる処置はいずれも行わなかった。コントロールとして、未処置のナイーブマウスにも、ＣＴ２６腫瘍細胞を移植した。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスでは、ＣＴ２６腫瘍の活発な成長が見られた。これに対して、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９で処置して、原発腫瘍が治癒したマウスでは、リチャレンジ部位において、腫瘍の成長のいずれの徴候も見られなかったことから、これらのマウスでは、ＣＴ２６腫瘍細胞に対する強力なメモリー応答が発現したことが示唆された。これらのマウスには、２回目のリチャレンジを行い、引き続きモニタリングしている。したがって、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９により、これらのマウスにおいて、複数回のリチャレンジにもかかわらず、全生存率の点で、効果が得られる。

Ｂ１６Ｆ１０での有効性試験
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＢ１６Ｆ１０同系メラノーマモデルは、部分的には、マウスにおいて、これらの腫瘍が成長して転移する速度により、多くの治療努力に耐性を示してきた侵襲性のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルである。Ｂ１６Ｆ１０は、ＣＴ２６腫瘍モデルよりも有意に治療が困難なモデルであるので、二重特異性スーパーカインの潜在的な治療活性を評価するための重要な難問をもたらす。これまで、２回の有効性試験を別々に行って、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９の有効性を評価した。いずれの試験も、下に概説されているのと同様のプロトコールに従った。

雌（８～１０週齢）のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、３×１０５個のＣ５７Ｂｌ／６細胞を右側腹部に皮下移植し、投与開始前に、腫瘍の成長が確立されるまで、腫瘍をそのままにした。

腫瘍のサイズに基づき、マウスを無作為に処置群に分けて、各群の腫瘍の平均サイズが同程度になるようにした。

マウスに、各試験に特有の用量及びスケジュールで、腹腔内投与した（下記を参照されたい）。

含めた試験測定項目：
●ケージサイドでの臨床観察を毎日
●体重及び腫瘍の測定を週に２回
●食物と水の消費のモニタリング

下記の基準のいずれかを満たす場合に、途中で終了するマウス：
●そのマウスの最大体重の２０％を超える体重減少
●２０００ｍｍ３を超える腫瘍体積
●瀕死のように見えるマウス

ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）による、Ｂ１６Ｆ１０での有効性試験：
図１５に示されているように、腫瘍の平均サイズは、投与開始時点において、約２０ｍｍ３であった。マウスに、ＰＢＳ（ｎ＝９）またはＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９を１ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝７）または２．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝９）で、週に２回、２週間、腹腔内注射した。ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９での処置により、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の成長が、用量依存的に阻害された。２．５ｍｇ／ｋｇで投与したＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９では、成長阻害が、１ｍｇ／ｋｇの用量よりも強力であった。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３による、Ｂ１６Ｆ１０での有効性
図１６に示されているように、この試験では、投与開始時において、腫瘍を約１５ｍｍ３の平均サイズまで成長させた。マウスに、ＰＢＳ（ｎ＝８）またはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（ｎ＝８）を週に１回、３週間、５ｍｇ／ｋｇで投与した。図１３に示されているように、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３は、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマの成長に対する作用を有さず、腫瘍は、コントロールマウスの場合と同程度に成長した。これらのデータにより、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３によって治療的応答を得るためには、さらに頻度の高い投与スケジュール（週に２回）が必要であり得ることが示唆されている。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３アッセイ：
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した（カタログｂｋｂ０ｉｌ４１３）。そのキットには、実施に必要な内容物がすべて含まれていた。方法の詳細な説明は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎによって供給されている。この細胞株は、サイトカインＩＬ－４／ＩＬ－１３に応答して、ＩＬ－４／ＩＬ－１３シグナル伝達が活性化されたという情報をもたらす。

ヒト（ｈ）ＩＬ１３、マウス（ｍ）ＩＬ１３及びヒト（ｈ）ＩＬ４に対する用量応答性
図２０に示されているように、細胞を１ウェル当たり５０，０００細胞で、メーカーの説明に従って試験培地に播種し、段階希釈したｈＩＬ１３、ｍＩＬ１３及びｈＩＬ４で２４時間処理した。インキュベート後、細胞上清（２０μＬ）を新たなプレートに取り出してから、１８０のＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液を加え、２時間、３７Ｃでインキュベートした。プレートを従来のプレートリーダーで、６５０ｎｍの吸光度について読み取った。

二重特異性コンストラクトによるブロッキングアッセイ
試験したバリアントは、表２４に示されている。細胞を１ウェル当たり５０，０００細胞で、メーカーの説明に従って試験培地に播種し、漸増濃度のｈＩＬ１３、ｍＩＬ１３及びｈＩＬ４で２４時間処理した。加えて、ｈＩＬ１３（１０ｎｇ／ｍＬ及び３０ｎｇ／ｍＬ）、ｍＩＬ１３（１０ｎｇ／ｍＬ）、ならびにｈＩＬ４（０．１ｎｇ／ｍＬ）を含むウェルを、表２５に列挙されている漸増濃度の試験コンストラクトで処理した。ｈＩＬ１３においては、２つの濃度を選択して、飽和レベルのｈＩＬ１３でアッセイを行った場合、またはわずかの差で不飽和となるレベルのｈＩＬ１３でアッセイを行った場合の違いを調べた。インキュベート後、細胞上清（２０μＬ）を新たなプレートに取り出してから、１８０のＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液を加え、２時間、３７Ｃでインキュベートした。プレートを従来のプレートリーダーで、６５０ｎｍの吸光度について読み取った。

図２１に示されているように、ｈＩＬ１３については、ｈＩＬ１３を１０ｎｇ／ｍＬ（ほぼＥＣ８０）で試験した場合、最大で１０，０００ｎｇ／ｍＬの各種試験タンパク質を加えたところ、Ｆｃ４－ＭＤＮＡ４１３及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－４１３で、ｈＩＬ１３応答に対する明らかな阻害作用が見られた。ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９ ＫＩＨは、作用が弱く、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９では、明白な作用は観察されなかった。ｈＩＬ１３を３０ｎｇ／ｍＬ（ＥＣ１００）で含めた場合には、応答は同程度であったが、その反応液に含まれるｈＩＬ１３レベルが高くなったために、観察された全体的な阻害レベルは、格段に低かった。

図２２（ｍＩＬ１３）及び図２３（ｈＩＬ４）に記載されているように、ｍＩＬ１３（この実験における標準曲線用に、１０ｎｇ／ｍＬ、すなわちＥＣ６０で試験した）及びｈＩＬ４（この標準曲線用に、０．１ｎｇ／ｍＬ、すなわちＥＣ５５で試験した）についても、その傾向は同様であった。Ｆｃ４－ＭＤＮＡ４１３及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－４１３では、ｍＩＬ１３の活性化応答（図２２及び２３を参照されたい）及びｈＩＬ４の活性化の明らかな阻害が観察されたが、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９ ＫＩＨは、全体的な作用が、これらよりも弱かった。これらのケースでも、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９単独では、阻害はほとんど観察されなかった。

ＣＴＬＬ－２増殖アッセイ
図２４に記載されているように、ＣＴＬＬ－２は、成長の際にＩＬ－２に依存するマウス細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株であり、ＩＬ－２の効力を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ機能モデルとして用いられている。ＣＴＬＬ－２は、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２及びＣＤ２５からなる高親和性のＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）を発現し、ＩＬ－２による処理に対する感受性が高いことが示されているからである（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。

Ｃａｒｍｅｎａｔｅ Ｔ，Ｐａｃｉｏｓ Ａ，Ｅｎａｍｏｒａｄｏ Ｍ，Ｍｏｒｅｎｏ Ｅ，Ｇａｒｃｉａ－Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｋ，Ｆｕｅｎｔｅ Ｄ，Ｌｅｏｎ Ｋ．Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ｍｕｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｈａｎ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ＩＬ－２． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１３）１９０：６２３０－６２３８．

ＣＴＴＬ２細胞を９６ウェルプレートに、１ウェル当たり３０，０００細胞で、ＴＳＴＩＭ増殖補助剤を含まない培地中に播種した。播種後、細胞を、表２５に列挙されている漸増濃度の様々な試料で、４８時間処理した。処理後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅという生存率試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８０８０）を各ウェルに加え、３時間後、そのプレートを５６０Ｅｘ／５９０Ｅｍで、蛍光の生存シグナルの発光について読み取った。各濃度の試験試料で、トリプリケートウェルを試験した。

結果：
ｒｈＩＬ－２：（予測どおりに、）漸増濃度のｒｈＩＬ－２に対して用量応答性のＣＴＬＬ－２細胞の増殖が見られる。ｒｈＩＬ－２をコントロールとして使用した。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３：
漸増濃度のこのコンストラクトに対して用量応答性のＣＴＬＬ－２細胞の増殖が見られる。このコンストラクト（Ｅｃ５０＝５３ｐＭ）は、ｒｈＩＬ２（ＥＣ５０＝６．４ｐＭ）よりも、効力が低下している。これは、ＦＥＡＡ変異が、ＣＴＬＬ２によって発現されるＣＤ２５への結合を妨げるためと予想される。

ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（ＫＩＨ）：
試験した濃度範囲の全体にわたり、同程度のシグナルが見られたことから、両方のコンストラクトとも、作用は非常に強力である。これは、両方のコンストラクトとも、ＦＥＡＡ変異を含まないので、ＣＤ２５と結合できるからであると予想される。追加のＭＤＮＡ１０９成分が、ＣＤ１２２への結合を増加させたので、ｒｈＩＬ２よりもかなり強力であった（ＣＤ２５にも結合する）。我々は、用量－応答曲線を得るには、このアッセイでは、これらの２つのコンストラクトの濃度をさらに低下させる必要があるであろう。

Ｆｃ４－ＭＤＮＡ４１３：
予想どおり、ＣＴＬＬ２の増殖を誘導しない。ＩＬ－２／ＭＤＮＡ１０９部分がないからである。

ｒｈＩＬ２及びＭＤＮＡ１９：
本明細書には、比較のために、履歴データを含めた。

参考文献
Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ ＪＪ，Ｈｏｗａｒｄ ＯＭ． ＢＡＬＢ／ｃ ｍｉｃｅ ｈａｖｅ ｍｏｒｅ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｈｏｗ ｇｒｅａｔｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ＣＤ４＋ＣＤ２５－ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｎ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ． Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．（２００５）７８（１）：１１４－２１

Ｌｅｖｉｎ ＡＭ，Ｂａｔｅｓ ＤＬ，Ｒｉｎｇ ＡＭ，Ｋｒｉｅｇ Ｃ，Ｌｉｎ ＪＴ，Ｓｕ Ｌ，Ｍｏｒａｇａ Ｉ，Ｒａｅｂｅｒ ＭＥ，Ｂｏｗｍａｎ ＧＲ，Ｎｏｖｉｃｋ Ｐ，Ｐａｎｄｅ ＶＳ，Ｆａｔｈｍａｎ ＣＧ，Ｂｏｙｍａｎ Ｏ，Ｇａｒｃｉａ ＫＣ． Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｗｉｔｃｈ ｔｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒ ａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ‘ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ’． Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８４（７３９５）：５２９－３３

実施例３：新規な長時間作用型の単一特異性及び二重特異性ＩＬ－２／ＩＬ－１３スーパーカインの強力な免疫調節剤としての台頭
背景：
腎臓癌及び転移性メラノーマを治療するためにＩＬ－２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）を用いると、症例の約１５％で持続的な応答が得られたが、その適用は、短い半減期、毒性及びＴｒｅｇｓの望ましくない活性化により、限られたままである。適用が限られるのは、ＩＬ－２Ｒαβγへの結合が原因である。

ＭＤＮＡ１１は、ＩＬ－２Ｒβγ（ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞によって発現される）への親和性が増強されたとともに、ＩＬ－２Ｒαβγ（Ｔｒｅｇによって発現される）への結合が減少した長時間作用型のＩＬ－２スーパーカインである。

結論
ＭＤＮＡ１１では、マウス腫瘍モデルにおいて、単独療法として、及び免疫チェックポイント阻害剤との併用において、強力な治療効果が示された。

ＮＨＰでは、ＭＤＮＡ１１は、半減期が長くなり、ＣＤ８ Ｔ細胞、ＣＤ４ Ｔヘルパー細胞、ＮＫ細胞の持続的な増殖及び増加を誘導したが、Ｔｒｅｇでは誘導されなかった。

ＭＤＮＡ１１は、血管漏出症候群（すなわち肺水腫）、高血圧、サイトカインストーム及び抗薬物抗体応答を引き起こさなかった。

ＩＬ－２及びＩＬ－１３スーパーカインプラットフォームの多用途性により、長時間作用型の二重特異性コンストラクトを操作して、ＩＬ－２のシグナル伝達の活性化（すなわち炎症誘発性）と、ＩＬ－４／ＩＬ－１３の機能の抑制（すなわち抗炎症性）を同時に行って、「コールド」腫瘍を免疫学的に標的とすることが可能になる。

ＴＭＥ（腫瘍微小環境）をＩＬ－２／ＩＬ－１３二重特異性スーパーカインで調節することによって、「コールド腫瘍」を免疫学的に標的とする。

「コールド」腫瘍は、ＣＤ８^＋細胞及びＮＫ細胞のカウント数が低く、Ｔｒｅｇのカウント数が高く、免疫抑制性の骨髄系細胞（すなわち、ＴＡＭ及びＭＤＳＣ）の数が多いことを含む腫瘍誘発性のＴＭＥにより、チェックポイント阻害剤に応答しない。

実施例４：ＭＤＮＡ１３２／ＭＤＮＡ４１３の試験
ＭＤＮＡ１３２及びＭＤＮＡ４１３のＩＬ－１３Ｒα２及びＩＬ－１３Ｒα１への結合を評価した。簡潔に述べると、下記の表２６に列挙されている受容体を９６ウェルプレートに（１ウェル当たり１μｇで）１時間、室温で、コーティング緩衝液（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ｐＨ９．６）において吸着させた。コーティング後、ウェルを５回、Ｔｗｅｅｎを含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ：１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）２５０μＬで洗浄してから、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ－Ｔ中の１％ＢＳＡ）２５０μＬで１時間、室温でブロックした。受容体を受け入れなかったウェルを単に、ブロッキング緩衝液で１時間、室温でブロックした。ウェルを５回、ＴＢＳＴで洗浄してから、試料を加えた。記載されているようにして、試料を希釈してから、受容体がコーティングされたウェル、またはアルブミンでブロックしたウェルのいずれかに、各希釈液１００μＬを１時間、室温で加えた。続いて、ウェルを５回、ＴＢＳＴで洗浄し、１００μＬの検出用抗体（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ ＳＡＢ３７０１２８４）の１：５，０００希釈液）で、ブロッキング緩衝液（１ウェル当たり１００μＬ）において、室温で４５分プローブした。ウェルを再度洗浄してから、ＨＲＰコンジュゲート抗ヤギＩｇＧ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ４０１５１５）とともに４５分、室温でインキュベートした。最後の一連の洗浄を行った後、１００μＬの発光剤（ＴＭＢ基質緩衝液中の０．１ｍｇ／ｍＬのＴＭＢ、０．００６％の過酸化水素）を加えた。１０分後、プレートを１ＭのＨＣｌ１００μＬでクエンチし、プレートを、４５０ｎｍの吸光度について読み取って、各ウェルの光学密度単位（ＯＤ）を得た。

図３５に示されているように、ヒト及びマウスのＩＬ１３Ｒα２受容体をコーティングしたウェルでは、Ｆｃ－ｈＩＬ１３の良好な結合が得られたが、ｍＩＬ１３Ｒα２をコーティングしたウェルは、おそらくは、検出用抗体またはＨＲＰコンジュゲート二次抗体のいずれかとの非特異的な相互作用により、全体的にバックグラウンドが高かった。ｍＩＬ１３Ｒα１では、低い結合が観察され、ｈＩＬ１３Ｒα１、並びにヒト及びマウスのＩＬ４Ｒ受容体では、未コーティングのウェルと同程度の結合が観察された。

図３６Ａ及び図３６Ｂに示されているように、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（１：１：１）分子は実際には、ヒト及びマウスのＩＬ１３Ｒα２受容体に、Ｆｃ－ＩＬ１３と同程度の親和性で結合する。

図３７Ａ及び図３７Ｂに示されているように、すべてのＭＤＮＡ４１３バリアントで、ヒト及びマウスのＩＬ１３Ｒα１受容体での結合が見られた。結合は、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）及びＦｃ４－ＭＤＮＡ４１３分子において、最大レベルの強度であったとともに、同程度であった一方で、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：１：１）の結合は、Ｆｃ－ＩＬ１３と同程度であった。

実施例５：ＭＤＮＡ１３２／ＭＤＮＡ４１３試験
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００という計器を用いて、表面プラズモン共鳴によって、ＭＤＮＡ１３２及びＭＤＮＡ４１３の受容体結合親和性を評価した。簡潔に述べると、プロテインＡ（または抗ヒトＦｃ）をそのセンサーチップ上に予め固定化し、各コンストラクトを、そのＦｃ部分を介して捕捉させた。受容体をその表面の上方に流して、結合を測定した後、解離を測定した。複数の濃度の受容体を別々のサイクルで試験した（マルチサイクルカイネティクス（ＭＣＫ））。

図３８に示されているように、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２（１：１ＫＩＨ）は、ＩＬ１３Ｒα２に結合したが、ＩＬ１３Ｒα１には結合しなかった。Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２のＩＬ１３Ｒα２に対するＫ_Ｄは、１．３０Ｅ－０９Ｍと推定される。

図３９に示されているように、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）は、野生型ＩＬ１３よりも高い親和性で、ＩＬ１３Ｒα１に結合した。図４０に示されているように、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）は、野生型ＩＬ１３よりも低い親和性で、ＩＬ１３Ｒα２に結合した。このアッセイから得られたＫ_Ｄの推定値は、下記の表２７に示されている。

実施例６：がんに対する免疫応答の、二重特異性ＩＬ－２／ＩＬ－１３スーパーカインによる調節
背景
ＩＬ－２経路は、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増加及び活性化を通じて、がんに対する炎症誘発性（Ｔｈ１）応答を刺激する際に、極めて重要な役割を果たす。これに対して、ＩＬ－４／ＩＬ－１３経路は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）のＭ２型への偏りを刺激して、がんによって、Ｔｈ１経路の作用を弱める手段として利用されることの多い抗炎症性（Ｔｈ２）応答を促進する。したがって、ＩＬ－４／ＩＬ－１３経路の阻害を通じて、ＭＤＳＣ及びＭ２型ＴＡＭを抑制するとともに、ＩＬ－２経路の活性化を通じて、エフェクター免疫細胞を刺激することには、別段の免疫抑制性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において、炎症誘発性応答を活気づける可能性がある。この目標を達成するために、ＩＬ－２及びＩＬ－１３スーパーカインプラットフォームの多用途性を利用して、長時間作用型の二重特異性コンストラクトを操作して、このそれぞれの経路の表面受容体を同時に標的とするようにした。

材料及び方法
試験には、ＢＬＩ／Ｏｃｔｅｔ及びＢｉａｃｏｒｅ／ＳＰＲによる結合分析、ＩＬ－２及びＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーターアッセイを用いたシグナル伝達分析、ヒトＰＢＭＣでのシグナル伝達分析、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのＭ１／Ｍ２マクロファージ極性化アッセイを含めた。

ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）捕捉チップの原理を用いて、ＳＰＲ（ＭＣＫ、マルチサイクルカイネティクス）による、ＩＬ１３Ｒα１及びＩＬ１３Ｒα２への結合親和性を測定した。この原理では、（１）固定化（抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５チップ上に固定化する）、（２）捕捉（ＩＬ－１３タンパク質、Ｆｃタグまたは試料を捕捉する）、（３）アナライト（アナライトは、ヒトＩＬ－１３Ｒα１タンパク質またはヒトＩＬ－１３Ｒα２タンパク質である）、及び（４）再生（３Ｍの塩化マグネシウム）という工程が用いられる。

ヒトＰＢＭＣでのｐＳＴＡＴ５シグナル伝達アッセイは、下記のようにして実施した。ＰＢＭＣを密度勾配によって単離し、完全培地にて静置してから、ＩＬ２、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－ＦｃまたはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３で１５分刺激した。コントロールには、未刺激のＰＢＭＣ細胞を含めた。刺激の直後に、細胞を固定し、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ２５－）、ＮＫ細胞及びＴｒｅｇという免疫サブセットで、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐ－ＳＴＡＴ５）の細胞内染色を行った後、試料をフローサイトメトリーによって分析した。

アッセイをＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）で行って、ｐＳＴＡＴ６シグナル伝達を下記のようにして測定した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を１ウェル当たり５０，０００細胞で、メーカーの説明に従って試験培地に播種し、漸増濃度のｈＩＬ４またはｈＩＬ１３（標準曲線）のいずれかで２４時間処理した。加えて、ｈＩＬ１３またはｈＩＬ４を含むウェルを漸増濃度の試験試料で処理した。それぞれの標準試料または試験試料の段階希釈液をデュプリケートウェルでアッセイした。インキュベート後、細胞上清（２０μＬ）を新たなプレートに取り出してから、１８０のＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液を加え、２時間、３７℃でインキュベートした。プレートを従来のプレートリーダーで、６５０ｎｍの吸光度について読み取った。

マクロファージ極性化アッセイは、下記のようにして行った。まず、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈｏｕｔ ＣＤ１６ ＤｅｐｌｅｔｉｏｎをＲｏｂｏＳｅｐで用いて、２人のドナーに由来するヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の新鮮なバイアルまたは解凍した凍結バイアルから、単球を単離した。続いて、細胞を低結合性６ウェルプレートに、２×１０^６細胞／ウェルで播種した。次に、Ｌ－グルタミンを含むＲＰＭＩＬ（Ｇｉｂｃｏ ２１８７５－０３４）、１０％ＦＢＳ、２％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐを含む培地において、５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦへの暴露を用いて、単球の成熟を７２時間誘導し、３７℃及び５％ＣＯ^２でインキュベートした。その後、さらに７２時間、ＩＬ－１３アゴニストまたはコントロールを用いて、極性化を行った後、それらを解離させ、ＢＤ ＣｅｌｌＦＩＸを用いて固定し、染色し、フローサイトメトリーを用いて調べた。

下記のようにして、ＣＴ２６結腸癌同系マウスモデルを作製及び使用した。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに、２×１０^６個のＣＴ２６細胞を右側腹部に皮下移植し（試験０日目）、１１日間成長させてから、投与を開始した。投与時点での処置群の腫瘍の平均サイズは、約６０ｍｍ^３であった。ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９を５ｍｇ／ｋｇで使用し、腹腔内投与は、週１回を２回であった。

結果
図４１ＤにおけるＫ_Ｄ値とともに、図４１Ａ～４１Ｃによって、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３が、機能的受容体ＩＬ１３Ｒα１に、Ｆｃ－ＩＬ１３よりも高い親和性で結合することが示されている。また、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３では、デコイ受容体ＩＬ１３Ｒα２に対する親和性が、Ｆｃ－ＩＬ１３よりも低下している。Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３のＩＬ１３Ｒα１に対する高い結合親和性は、二重特異性コンストラクトＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３でも観察されたことから、Ｆｃ－ＩＬ－１３よりも強力にＩＬ１３Ｒα１受容体に結合できることが示された。

図４２Ａ～４２Ｂには、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３が、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞において、ｒｈＩＬ－２よりも高い効力でシグナル伝達を活性化できることが示されている。しかしながら、その効力は、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３では、ＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５のシグナル伝達に対しては、ｒｈＩＬ－２よりも大幅に低下している。これらのデータにより、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３が、抗がんの有効性を得るために必要とされる、免疫エフェクター細胞応答の活性化において、ｒｈＩＬ－２よりも優れていることが示されている。

図４３Ａ～４３Ｃには、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（単一特異性）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（二重特異性）の両方とも、ＨＥＫ Ｂｌｕｅレポーター細胞において、上記の表に示されているようなＥＣ_５０で、ＩＬ４（上パネル）及びＩＬ１３（下パネル）の誘導による、ｐＳＴＡＴ６のシグナル伝達を阻害できることが示されている。これらのデータから、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３及びＭＤＮＡ１０９ＦＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３が、ＩＬ－４及びＩＬ－１３の誘導によるシグナル伝達を抑制できることが示された。

図４４Ａ～４４Ｂには、ＣＤ２０９が、Ｍ２マクロファージのマーカーであり、ＩＬ１３で刺激されると誘導されることが示されている。上記の図から分かるように、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（単一特異性）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（二重特異性）の両方とも、ＩＬ１３の誘導による、マクロファージのＭ２への極性化を用量依存的に阻害できる。

図４５ＥにおけるＫ_Ｄ値とともに、図４５Ａ～４５Ｄによって、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２が、デコイ受容体ＩＬ１３Ｒα２に対して優先的な結合親和性を有し、機能的受容体ＩＬ１３Ｒα１に対しては、結合が観察されないことが示されている。これに対して、Ｆｃ－ＩＬ１３は、機能的受容体ＩＬ１３Ｒα１及びデコイ受容体ＩＬ１３Ｒα２の両方に結合する。これらのデータにより、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２の強力な受容体選択性プロファイルが強調されている。

図４６Ａ～４６Ｃには、二重特異性コンストラクトＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９が、ビヒクルコントロールと比べて、ＣＴ２６結腸癌モデルにおいて、腫瘍の成長を阻害できるとともに、全生存率も向上させることができることが示されている。

ｓＩＬ２^Ｍ－Ｆｃ－ｓＩＬ１３^Ｍは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃによって連結されたＩＬ－２スーパーアゴニスト（ｓＩＬ２^Ｍ）及びＩＬ－１３スーパーアンタゴニスト（ｓＩＬ１３^Ｍ）で構成される二重特異性スーパーカインである。ｓＩＬ２^Ｍは、ＣＤ１２２に、ＩＬ－２よりも優れた親和性で結合するが、免疫抑制性のＴｒｅｇ上で発現するＣＤ２５には結合しない。ｓＩＬ１３^Ｍは、ＩＬ－４Ｒαと合わさって機能的な受容体複合体を形成するＩＬ１３Ｒα１に対する親和性が、ＩＬ－１３よりも高い。初代ヒトＰＢＭＣを用いたｐＳＴＡＴ５アッセイでは、ｓＩＬ２^Ｍ－Ｆｃ－ｓＩＬ１３^Ｍによって、ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化において、ＩＬ－２よりも増強された効力が見られた一方で、Ｔｒｅｇに対する活性は限られていた。ＩＬ－４／ＩＬ－１３依存性のｐＳＴＡＴ６レポーターアッセイでは、ｓＩＬ２^Ｍ－Ｆｃ－ｓＩＬ１３^Ｍにより、ＩＬ－４及びＩＬ－１３の両方の刺激活性に対して、用量依存性のアンタゴニスト作用が見られた。このアンタゴニスト作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＩＬ－１３の誘導による、マクロファージのＭ２への極性化の阻害によって、さらに検証された。

結論
ｓＩＬ２^Ｍ－Ｆｃ－ｓＩＬ１３^Ｍは、ＩＬ－２経路の活性化を通じた、Ｔｈ１応答の刺激と、ＩＬ－４／ＩＬ－１３経路の阻害を通じた、Ｔｈ２応答の抑制を同時に行うことができる二重特異性スーパーカインである。様々な種類の腫瘍の多くで過剰発現するデコイＩＬ－１３Ｒα２と結合することによって、ＴＭＥにおける蓄積が可能となるように設計されたコンストラクトを含め、追加の二重特異性スーパーカインコンストラクトを試験するつもりである。

実施例７：二重特異性融合コンストラクトを用いたアッセイ
ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ２アッセイ
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２レポーター細胞は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入し、試験は、ＭＤＳ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）で行った。そのキットには、実施に必要な内容物がすべて含まれていた。細胞は、メーカーの説明に従って増加させた。アッセイをコントロール化合物で実施して、原理の実証を示すとともに、用量応答範囲を事前に確立した。その後、アッセイを実施して、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－２ ｐＳＴＡＴ５レポーターシステムにおいて、ＩＬ－２アゴニストを有する二重特異性コンストラクトの効力を試験した。

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ２レポーター細胞を１ウェル当たり５０，０００細胞で、メーカーの説明に従って試験培地に播種し、表２９に示されているコンストラクトで、示されている濃度で２４時間処理した。インキュベート後、細胞上清（２０μＬ）を新たなプレートに取り出してから、１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液を加え、２時間、３７℃でインキュベートした。プレートを従来のプレートリーダーで、６５０ｎｍの吸光度について読み取った。

ｒｈＩＬ２（１１９７９－８２８８７９、ＬＰ）及びＭＤＮＡ１９（ＭＤＮＡ０１９ＦＥＡＡ－Ｆｃ）とともに、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）、ＭＤＮＡ１３２^{Ｌ３９／Ｑ１１１}－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９^Ｃ１２５（１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９^Ｃ１２５（１：１：１ＫＩＨ）及びＨ４ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）を実験コントロールとして使用した。Ｈ４ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）以外のすべての分子は、観察したところ、ＥＣ_５０が、ｒｈＩＬ２（１１９７９－８２８８７９、ＬＰ）の１．４～１．８分の１であったことから、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ２レポーターシステムでのｐＳＴＡＴ５の誘導において、ｒｈＩＬ２（１１９７９－８２８８７９、ＬＰ）よりも強力であることが示された（図４７）。

ＣＴＴＬ－２アッセイ
ＣＴＴＬ２細胞を９６ウェルプレートに、１ウェル当たり３０，０００細胞で、ＴＳＴＩＭ増殖補助剤を含まない培地中に播種した。播種後、細胞を、下の表３０に列挙されている漸増濃度のコンストラクトで、４８時間処理した。活性の対照物として、各プレートには、ＭＤＮＡ１１（ＴＰ２８７６７Ｆ）も含めた。処理後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅという生存率試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８０８０）を各ウェルに加え、そのプレートを３～６時間、５６０Ｅｘ／５９０Ｅｍで、蛍光の生存シグナルの発光について読み取った。６個のプレートでアッセイを行い、対照物であるＭＤＮＡ１１と、２つの試験コンストラクトの段階希釈液を含むその各プレートを、デュプリケートウェルで試験した。

実験コントロールとしてのｒｈＩＬ２（１１９７９－８２８８７９、ＬＰ）及びＭＤＮＡ１１とともに、ＣＴＴＬ－２アッセイ試料の増殖を誘導する能力について試験したコンストラクト、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）、ＭＤＮＡ１３２^{Ｌ３９／Ｑ１１１}－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９^Ｃ１２５（１：１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９^Ｃ１２５（１：１：１ＫＩＨ）及びＨ４ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）のうち、ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９^Ｃ１２５（１：１：１ＫＩＨ）及びＭＤＮＡ１３２^{Ｌ３９／Ｑ１１１}－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９^Ｃ１２５（１：１：１ＫＩＨ）は、相対的効力が同程度であり（それぞれ、ＭＤＮＡ１１の４７倍及び３８倍）、ＭＤＮＡ１９（ＭＤＮＡ０１９ＦＥＡＡ－Ｆｃ）及びＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）は、相対的効力が互いと同程度であった（それぞれ、ＭＮＤＡ１１の２．８９倍及び２．６３倍）とともに、活性が、ｒｈＩＬ２よりも約１．５ｌｏｇ低かった。観察された効力が一番低かったのは、Ｈ４ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）による場合であり、ＭＤＮＡ１１の効力の約２％であったとともに、活性は、ｒｈＩＬ２の約１６００分の１であった（図４８）。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ４／ＩＬ３
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ４／ＩＬ１３レポーター細胞は、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入し、試験は、ＭＤＳ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）で行った。そのキットには、実施に必要な内容物がすべて含まれていた。細胞は、メーカーの説明に従って増加させた。アッセイをコントロール化合物で実施して、原理の実証を示すとともに、用量応答範囲を事前に確立した。その後、アッセイを実施して、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３ ｐＳＴＡＴ６レポーターシステムにおいて、ＭＤＮＡ４１３バリアントの効力を試験した。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ４
ＩＬ－４競合アッセイにおいては、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を１ウェル当たり５０，０００細胞で、メーカーの説明に従って試験培地に播種し、漸増濃度のｈＩＬ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０４－ＩＬ－０１０／ＣＦ）で２４時間処理した（標準曲線は、約０．５ ｌｏｇ間隔で段階希釈した０．２ｎＭから０．０００２ｎＭのｈＩＬ４から得た）。加えて、ｈＩＬ４を（０．１ｎＭで）含むウェルを、表３０に列挙されている漸増濃度の試験試料（０．５ｌｏｇ間隔で１５０ｎＭ～０．１５ｎＭ）で処理した。それぞれの標準試料または試験試料の段階希釈液をデュプリケートウェルでアッセイした。このアッセイでは、合計４個のプレートを試験した。インキュベート後、細胞上清（２０μＬ）を新たなプレートに取り出してから、１８０のＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液を加え、２時間、３７Ｃでインキュベートした。プレートを従来のプレートリーダーで、６５０ｎｍの吸光度について読み取った（図４９）。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１３
ＩＬ－１３競合アッセイにおいては、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－４／ＩＬ－１３レポーター細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を１ウェル当たり５０，０００細胞で、メーカーの説明に従って試験培地に播種し、漸増濃度のｈＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２１３－ＩＬＢ－００５／ＣＦ）で２４時間処理した（標準曲線は、２．５倍間隔で段階希釈した８ｎＭから０．０３３ｎＭのｈＩＬ１３から得た）。加えて、ｈＩＬ１３を（０．８ｎＭ、１０ｎｇ／ｍＬで）含むウェルを、表３０に列挙されている漸増濃度の試験試料（３．３３倍間隔で１５０ｎＭ～０．１１ｎＭ）で処理した。それぞれの標準試料または試験試料の段階希釈液をデュプリケートウェルでアッセイした。このアッセイでは、合計４個のプレートを試験した。インキュベート後、細胞上清（２０μＬ）を新たなプレートに取り出してから、１８０のＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液を加え、２４時間、３７℃でインキュベートした。プレートを従来のプレートリーダーで、６５０ｎｍの吸光度について読み取った（図５０）。

ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ１３レポーターシステムにおいて、ＩＬ１３の誘導による、ｐＳＴＡＴ６の活性化を阻害する能力について、コンストラクトをスクリーニングしたことによって得たデータから、（１）３９位のロイシンＬによって、その分子の強度が、同じ位置にアルギニンＲがある場合よりも低くなるようであること、及び（２）ＦｃのＣ末端にあるＭＤＮＡ４１３が、ＦｃのＮ末端にあるＭＤＮＡ４１３よりも強力であるようであることが立証されている。また、このアッセイから得たＥＣ_５０により、下記のように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能的な効力に関して、分子を序列化させることができた。

ＴＦ－１アッセイ
１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加したＲＰＭＩ培地（ＡＴＣＣ）において、ＴＦ－１細胞を培養した。ＴＦ－１細胞を回収し、２回ＰＢＳで洗浄した後に、ＧＭ－ＣＳＦを含まない培地に入れた。実験日に、細胞を１ウェル当たり３０，０００細胞で、体積１００μＬで加えた。アンタゴニストアッセイを行うために、増殖アッセイでのＥＣ５０またはＥＣ８０のｒｈＩＬ１３を用いて、上で概説したように、ＴＦ－１増殖アッセイを設定した。反応物には、漸増濃度の抗ＩＬ１３Ｒａ１抗体またはコンストラクトも添加した。プレートに含めたコントロールは、１）完全培地で成長させた細胞、２）無添加培地（ＩＬ１３またはＧＭ－ＣＳＦを含まない）で成長させた細胞、３）ＥＣ５０またはＥＣ８０のｒｈＩＬ１３を添加した細胞、ならびに標準曲線用のＩＬ１３で処理した細胞からなるものであった。各条件下で、トリプリケートウェルを処理した。細胞を９６時間インキュベートし、ＣｙＱＵＡＮＴで発光させた。発光の際には、ＣｙＱＵＡＮＴアッセイ試薬の３倍溶液をメーカーの説明に従って調製し、この溶液１００μＬを各ウェルに加えた。プレートを１時間、３７℃でインキュベートし、混合してから遠心分離して、細胞を沈殿させた。プレートを４８５Ｅｘ／５３５Ｅｍで読み取った。

すべてのコンストラクトで、ＴＦ－１の増殖の用量依存的な阻害が見られ、ＭＤＮＡ０１９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）において、最大の阻害が見られた一方で、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｑ１１１}で、最小の阻害が見られた。ＭＤＮＡ０１９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）においては、ＥＣ５０及びＥＣ８０のｒｈＩＬ１３の両方で、ＴＦ－１の増殖の阻害が見られた一方で、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｑ１１１}（１：２）及びＦｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｒ１１１}（１：２）では、有意な阻害が見られたのはＥＣ５０のみにおいてであった（図５１）。

ＴＦ－１細胞を回収し、２回ＰＢＳで洗浄した後に、ＧＭ－ＣＳＦを含まない培地に入れた。実験日に、細胞を１ウェル当たり３０，０００細胞で、体積１００μＬで加えた。アンタゴニストアッセイを行うために、増殖アッセイでのＥＣ８０のｒｈＩＬ１３を用いて、ＴＦ－１増殖アッセイを設定した。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}では、ＩＣ５０の３７ｎＭによって、ＴＦ－１の増殖の用量依存的な阻害が見られた（図７１）。

ヒトＰＢＭＣでのｐＳＴＡＴ５アッセイ
ＰＢＭＣを密度勾配によって単離し、完全培地にて静置してから、ＩＬ２、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－ＦｃまたはＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}で１５分刺激した。コントロールには、未刺激のＰＢＭＣ細胞を含めた。刺激の直後に、細胞を固定し、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ２５－）、ＮＫ細胞及びＴｒｅｇという免疫サブセットで、リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐ－ＳＴＡＴ５）の細胞内染色を行った後、試料をフローサイトメトリーによって分析した（図５２）。

ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}、ヒト抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｓ１２５、マウス抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｓ１２５は、ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるシグナル伝達を、ｒｈＩＬ－２よりも高い効力で活性化できる。しかしながら、その効力は、ＴｒｅｇにおけるｐＳＴＡＴ５シグナル伝達に対しては、ｒｈＩＬ－２よりも大幅に低下している。これらのデータにより、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}、ヒト抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｓ１２５、マウス抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｓ１２５が、抗がんの有効性を得るために必要とされる、免疫エフェクター細胞応答の活性化において、ｒｈＩＬ－２よりも優れていることが示されている。しかし、コンストラクトＨ４ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｌ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）は、ヒトＰＢＭＣｓにおけるｐＳＴＡＴ５の誘導においては強力ではない。

ＳＰＲ試験
ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）捕捉チップの原理：（１）固定化：抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体をＣＭ５チップ上に固定化する。（２）捕捉：ＩＬ－１３タンパク質、Ｆｃタグまたは試料を捕捉する。（３）アナライト：アナライトは、ヒトＩＬ－１３Ｒα１タンパク質またはヒトＩＬ－１３Ｒα２タンパク質である。（４）再生：３Ｍの塩化マグネシウム（図５３）。

ＩＬ１３Ｒａ１及びＩＬ１３Ｒａ２への結合は、図７２及び表３２に示されている。

ＣＤ３エピトープであるＣＤ３ε／δへの結合は、図７３及び表３３に示されている。その結果から、ヒト及びマウスの抗ＣＤ３－ＭＤＮＡ１３２が、それぞれヒト及びマウスのＣＤ３エピトープに結合し、交差反応性も見られないことが示された。

ＩＬ２Ｒα（ＣＤ２５）及びＩＬ２Ｒβ（ＣＤ１２２）への結合が、図７４及び表３４に示されている。

ＰＤ１への結合が、図７５及び表３５に示されている。

実施例８：ＩＬ－４及びＩＬ－１３の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害
実験プロトコール：
●ＰＢＭＣを全血から単離した。
●磁気選別を用いて、ＣＤ１４＋単球を分離し、Ｍ－ＣＳＦを用いて、ＡＢ血清の存在下で、６日間かけてＭ０型マクロファージに分化させた。
●６日目に、ＥＣ８０値のＩＬ－１３またはＩＬ－４のいずれかを用いて、対照または試験アンタゴニスト（１０点３倍希釈液）の存在下で、マクロファージをＭ２に極性化した。
●処理後、フローサイトメトリーによる表現型解析のために、マクロファージを集め、抗体染色の前に、Ｆｃ受容体をブロックした。

ＩＬ－４の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害が、図７６及び表３６に示されている。

図７６Ａには、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－４で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７６Ｂには、Ｆｃ４－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－４で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７６Ｃには、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）の存在下で、ＩＬ－４で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７６Ｄには、ｈｕ抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－４で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７６Ｅには、マウス抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－４で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されている。いずれの場合にも、点線は、ＩＬ－４のみのコントロールを表しており、破線は、Ｍ０コントロールを表している。

ＩＬ－１３の誘導による、Ｍ２への極性化の阻害が、図７７及び表３７に示されている。

図７７Ａには、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－１３で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７７Ｂには、Ｆｃ４－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－１３で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７７Ｃには、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ^Ｃ１２５－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（２：１：２）の存在下で、ＩＬ－１３で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７７Ｄには、ｈｕ抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－１３で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されており、図７７Ｅには、マウス抗ＰＤ１－ＭＤＮＡ４１３^{Ｒ３９／Ｑ１１１}（１：２）の存在下で、ＩＬ－１３で処理したマクロファージの表現型解析結果が示されている。いずれの場合にも、点線は、ＩＬ－１３のみのコントロールを表しており、破線は、Ｍ０コントロールを表している。

上に示されている実施例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者にもたらす目的で示されており、本発明者が本発明とみなす内容の範囲を限定するようには意図されていない。本発明を実施するための上記形態の改変形態であって、当業者に明らかである改変形態は、添付の特許項の範囲内であるように意図されている。本明細書で言及されている特許及び刊行物はいずれも、本発明が属する分野の当業者の知識レベルを示している。本開示で引用されている参照文献はいずれも、参照により、それぞれの参照文献の全体が、参照により、個々に援用された場合と同程度に援用される。

いずれの見出し及びセクションの表記も、明瞭化及び参照目的のために使用されているに過ぎず、いかなる場合も、限定するものとみなすべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載されている本発明の趣旨及び範囲に従って、それぞれ異なる見出し及びセクションから、様々な態様を適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。

本明細書に引用されているいずれの参照文献も、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願の全体が、参照により、あらゆる目的で援用されることが、具体的かつ個別に示されている場合と同程度に、参照により、あらゆる目的で、その全体が本明細書に援用される。

当業者には明らかなように、本願の趣旨及び範囲から逸脱せずに、本願の改変及び変形を数多く行うことができる。本明細書に記載されている具体的な実施形態及び実施例は、例として示されているに過ぎず、本願は、添付の請求項が権利を与えられている均等物の全範囲とともに、請求項の条項によってのみ限定されるものとする。

Claims (32)

1. 本明細書に記載されているようなＩＬ－２ムテインを第２のサイトカインと融合したものを含む二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
2. 前記ＩＬ－２ムテインが、Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆというアミノ酸置換を含み、この番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである、請求項１に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
3. 前記ＩＬ－２ムテインが、Ｆ４２Ａという置換をさらに含み、この番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである、請求項２に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
4. 前記ＩＬ－２ムテインが、Ｋ４３Ｎという置換をさらに含み、この番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである、請求項２または３に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
5. 前記ＩＬ－２ムテインが、Ｙ４５Ａという置換をさらに含み、この番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである、請求項２～４のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
6. 前記ＩＬ－２ムテインが、Ｅ６２Ａという置換をさらに含み、この番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである、請求項２～５のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
7. 前記ＩＬ－２ムテインが、Ｅ６２Ａという置換及びＦ４２Ａという置換をさらに含み、これらの番号付けが、配列番号２の野生型ヒトＩＬ－２を基準にしたものである、請求項２～６のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
8. 前記ＩＬ－２ムテインが、表２、４、５及び／または６に記載されているようなＩＬ－２ムテイン配列である、請求項２～７のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
9. 表２、４、５、６、１０及び／または１２、及び／または図５４に記載されているような配列を含む、請求項２～８のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
10. Ｆｃ抗体断片をさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
11. 前記Ｆｃ抗体断片が、ヒトＦｃ抗体断片である、請求項１０に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
12. 前記Ｆｃ抗体断片が、Ｎ２９７Ａという置換を含む、請求項１０または１１に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
13. アルブミンをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
14. 前記第２のサイトカインが、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ１５及びＩＬ－１８からなる群から選択されている、請求項１～１３のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
15. 前記第２のサイトカインが、ＩＬ－４またはＩＬ－１３である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
16. 前記第２のサイトカインが、表７及び／または表８及び／または表１２及び／または表２８及び／または図５４に記載されているようなものである、請求項１～１７のいずれかに記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
17. ＩＬ－２Ｒβに対する結合能が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて向上している、請求項１～１６のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
18. ＩＬ－２Ｒβに対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて高い、請求項１～１７のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
19. ＩＬ２Ｒαへの結合が妨げられる（すなわち、ＩＬ２Ｒαにあまり結合しない）、請求項１～１８のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
20. ＣＤ２５に対する結合親和性が、野生型ヒトＩＬ－２と比べて低下している、請求項１～１９のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
21. 配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８及び２１３、配列番号１４９及び２１３、配列番号１５０、配列番号１５１及び２１４、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７及び２１３、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１及び２１５、配列番号１６２及び２１６、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５及び２１３、配列番号１６６及び２１３もしくは配列番号１６７及び２１７、または表１２、表２８もしくは図５４の配列を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
22. ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２（１：１ＫｉＨ）、Ｆｃ－Ａ１１（１：２）、Ｆｃ－Ａ１１（１：２）、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）、Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（１：２）、Ｆｃ４－ＭＤＮＡ４１３（１：２）、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ（１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ（２：１）、ＭＤＮＡ－１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ（２：１）、Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（１：２）、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２（２：１：１ＫｉＨ）、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１３２（２：１：１ＫｉＨ）、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）バージョン１、ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３（２：１：２）バージョン２、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（１：１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ４１３－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９（１：１：１ＫＩＨ）、ＭＤＮＡ１３２－Ｆｃ－ＭＤＮＡ１０９ＦＥＡＡ（１：１：１ＫＩＨ）またはＭＤＮＡ１０９－Ｆｃ－ＭＤＮＡ４１３を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体。
23. 請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体を投与することを含む、がんの治療方法。
24. 前記がんが、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、肺癌（小細胞肺癌を含む）、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌及び脳腫瘍からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記がんが、結腸癌である、請求項２４に記載の方法。
26. （ｉ）抗ＰＤ－１の抗体もしくは阻害剤、または抗ＰＤ－Ｌ１の抗体もしくは阻害剤と、
    （ｉｉ）請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体と、
    を含む配合治療薬を投与することを含む、がんの治療方法。
27. 前記抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤が、ニボルマブ、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、ＯＮＯ－４５３８、ＡＭＰ２２４、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５（ペムブロリズマブ）、セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０）、ＳＨＲ－１２１０（ＣＴＲ２０１６０１７５及びＣＴＲ２０１７００９０）、ＳＨＲ－１２１０（ＣＴＲ２０１７０２９９及びＣＴＲ２０１７０３２２）、ＪＳ－００１（ＣＴＲ２０１６０２７４）、ＩＢＩ３０８（ＣＴＲ２０１６０７３５）、ＢＧＢ－Ａ３１７（ＣＴＲ２０１６０８７２）、ならびに表３８に列挙されているようなＰＤ－１抗体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記抗ＰＤ－Ｌ１の抗体または阻害剤が、アテゾリズマブ、アベルマブ及びデュルバルマブからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
29. 前記がんが、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、子宮体癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、リンパ腫、肺癌（小細胞肺癌を含む）、腎臓癌、肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌及び脳腫瘍からなる群から選択される、請求項２７または２８に記載の方法。
30. 前記がんが、結腸癌である、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
32. 抗ＰＤ－１の抗体または阻害剤と、請求項１～２２のいずれか１項に記載の二重特異性ＩＬ－２サイトカイン融合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

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