JP2023531096A - 全菌カプセル及びその調製方法と使用 - Google Patents

全菌カプセル及びその調製方法と使用 Download PDF

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Abstract

本願は全菌カプセル及びその調製方法と使用を提供する。調製方法は、ハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別するステップ（１）と、ステップ（１）で選別された糞便菌のドナーの糞便を収集して糞便菌液を調製するステップ（２）と、ステップ（２）で調製された糞便菌液を凍結乾燥保護剤と混合した後に、降温凍結及び真空乾燥を行い、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末をカプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得るステップ（３）とを含む。ハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別することで、異なる糞便菌の受容体に対する糞便菌のドナーを速やかに選別することを実現することにより、調製された全菌カプセルと糞便菌の受容体を精度よくマッチングすることができる。【選択図】図１

Description

本願は糞便菌移植（Ｆｅｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）の技術分野に属し、全菌カプセル及びその調製方法と使用に関する。
菌叢移植（ＦＭＴ）は、健康なヒトの糞便における機能性菌叢を患者の腸内に移植し、患者の腸内に新しい腸内菌叢を確立し、腸内と腸外の疾患を治療する技術である。過去１０年間で、ＦＭＴは腸内と腸外の疾患の治療において画期的な進歩を遂げており、腸内外の困難な疾患の治療においてＦＭＴに臨床的に高い期待が寄せられている。しかし、ＦＭＴ方法論の確立は複雑で、国内外でまだ統一された標準がないため、さまざまな研究の治療効果の異質性が大きく、ＦＭＴの臨床的な展開と使用は大幅に制限されている。現在、糞便菌移植は、クロストリジウム・ディフィシル感染症、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患などの腸内菌叢の不均衡による疾患の治療において良好な効果を有している。臨床的には、主に浣腸、経鼻胃管、十二指腸、空腸及び結腸鏡などの経路で細菌叢の移植を行うが、これらの経路はすべて侵襲的な移植に関し、患者体験が悪い。
ＣＮ２０９９６７４０２Ｕは、中空に設けられたハンドルと糞便菌をボーラス注入するためのカテーテルとを含む、胃腸鏡を介した糞便菌移植ボーラス注入カテーテルを開示しており、ハンドルの一端にカテーテルを接続するための接続部が設けられ、ハンドルのカテーテルから離れる一側に糞便菌を注射するための注射管が設けられる。該カテーテルを用いて糞便菌移植を行うことにより、ボーラス注入過程全体を視覚的な条件下で行い、糞便菌が検査器具を汚染することを回避し、糞便菌移植鏡下での操作の標準化を強化することができる。しかしながら、該装置は浣腸処理と配合使用する必要があり、虚弱体質又は腸内にびらん損傷がある患者に二次障害を引き起こしやすい。
ＣＮ１１０６３８７８３Ａは、糞便菌移植ドナーの健康で高品質の糞便を用いてインビトロで腸内微生物の党参サポニンに対する酵素加水分解作用をシミュレートし、適切な発酵条件を通じて、党参サポニンを分解して二次サポニン類活性小分子物質に変換し、次いで薬効を発揮するカプセルの調製方法を開示している。活性小分子物質を含む糞便菌発酵液を腸溶性カプセルシェルに入れて患者に投与することにより、腸内菌叢を改善するとともに、患者が活性物質をよりよく吸収でき、健康に有益である。しかしながら、この技術案では善玉菌の保存などの操作が行われず、不活化しやすく、短期間でできるだけ早く使用する必要があり、長期保存に適していない。
ＣＮ１０９０１０３８０Ａは、糞便の収集、腸内菌叢製剤の調製、及び腸内菌叢製剤の充填の３つのステップを含む糞便菌移植の臨床治療における腸内菌叢製剤のプロセスを開示しており、腸内菌叢製剤の調製は、「好気＋嫌気」の新型の分離方法を用いて腸内の「好気性菌」と「嫌気性菌」の菌叢多様性を最大限に保護し、グリセリン保護剤を加えて細菌の活性を維持する。しかしながら、該プロセスでは、操作時に一定体積の懸濁液をグリセリン溶液と混合する必要があり、調製された腸内菌叢製剤は、細菌叢の濃度が低く、薬効が低い。
現在、糞便菌移植は主に機械により介入する方法で、過程が複雑で、患者に一定の痛みを与える。患者の痛みを和らげるだけでなく、疾患の治療又は症状の改善に十分な数の善玉菌を提供できる迅速で効率的なＦＭＴ新技術をどのように提供するかは、解決すべき緊急の課題となっている。
本願は、ハイスループットシーケンシングにより選別された糞便菌のドナーの菌叢の凍結乾燥粉末が充填された全菌カプセル及びその調製方法と使用を提供し、細菌叢移植の有効率及び快適性が向上し、臨床的に幅広い見通しがある。
第１の態様では、本願は、
ハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別するステップ（１）と、
ステップ（１）で選別された糞便菌のドナーの糞便を収集して糞便菌液を調製するステップ（２）と、
ステップ（２）で調製された糞便菌液を凍結乾燥保護剤と混合した後に、降温凍結及び真空乾燥を行い、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末をカプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得るステップ（３）とを含む全菌カプセルの調製方法を提供する。
本願では、ハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別し、糞便菌のドナーの細菌叢組成を正確に鑑別するのに役立ち、糞便菌のドナーの未知の種、病原体の発見に利点があり、検出分解能が菌株レベルに達し、一度に複数の糞便菌のドナーを検出する効果を実現する。
好ましくは、ステップ（１）における前記したハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別する方法は、
糞便菌のドナーから抽出されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対して次世代シーケンシングを行い、生シーケンシングデータを得るステップ（１’）と、
生シーケンシングデータから宿主遺伝子を除去した後に、微生物データベースと照合して菌種の同定及び存在度（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の検出を行うステップ（２’）と、
病原菌データベースと照合して糞便菌のドナーに病原菌がないことを確認するステップ（３’）と、
糞便菌の受容体の腸内菌叢と比較し、糞便菌の受容体と相補的な糞便菌のドナーを選別して得るステップ（４’）とを含む。
本願では、ハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーの糞便菌組成を同定し、糞便菌の受容体（患者）の腸内菌叢と比較し、異なる糞便菌の受容体に対して異なる糞便菌のドナーを選別するのに役立ち、「高精度マッチング」を実現し、薬効が向上し、ハイスループットシーケンシングは、病原菌を同定することもでき、潜在的なリスクを有する糞便菌のドナーを除外し、品質モニタリングを行うのに役立つ。
好ましくは、ステップ（２’）における前記微生物データベースは、共通データベースに由来する細菌ゲノム、真菌ゲノム又はウイルスゲノムのいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む。
好ましくは、ステップ（３’）における前記病原菌データベースは、共通データベースに由来する病原菌ゲノムを含む。
本願では、ＮＣＢＩ、ＫＥＧＧなどの共通データベースを用いて微生物データベース及び病原菌データベースを構築し、糞便菌のドナーのシーケンシングデータを上記データベースに照合し、菌株レベルの微生物同定を実現し、病原菌を持つ糞便菌のドナーを除外し、健康リスクが減少する。
好ましくは、ステップ（１）における前記したハイスループットシーケンシングを用いた糞便菌のドナーの選別は、糞便菌のドナーが発現するバイオマーカー及び前記バイオマーカーの多様性指数に応じたものである。
好ましくは、前記バイオマーカーは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ラモーサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ）、ユーバクテリウム・シリンドロイデス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）又はバクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む。
好ましくは、前記バイオマーカーの多様性指数は前記バイオマーカーのα多様性指数を含む。
本願では、ハイスループットシーケンシングを用いて機械学習モデルと組み合わせて、バイオマーカーの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ラモーサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ）、ユーバクテリウム・シリンドロイデス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）及びバクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）、並びにバイオマーカーのα多様性指数を選別し、糞便菌のドナーを選別するための指標とする。
好ましくは、ステップ（２）における前記糞便菌液の調製方法は、
収集された糞便を無菌生理食塩水に浸し、濾過した後に糞便濾液を得るステップ（１”）と、
糞便濾液を遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して前記糞便菌液を得るステップ（２”）とを含む。
本願では、無菌容器を用いて糞便菌のドナーの糞便をその場で収集し、１時間以内に収集された糞便を実験室に送り、情報登録、糞便同定、計量、評価及び処理を行い、糞便提供後６時間以内に嫌気環境で糞便菌液の調製を完了する。
好ましくは、ステップ（１”）における前記無菌生理食塩水の温度は３～５℃であり、例えば、３℃、４℃又は５℃であってもよい。
好ましくは、ステップ（１”）における前記濾過はスクリーンを用いて行われる。
好ましくは、前記スクリーンの孔径は０．２５～２ｍｍであり、例えば、０．２５ｍｍ、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ又は２．０ｍｍであってもよい。
好ましくは、ステップ（１”）における前記濾過は、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて２～３回濾過し、得られた液相は糞便濾液であることを含む、
好ましくは、ステップ（２”）における前記遠心処理の回転速度は１５００～３０００ｒ／ｍｉｎであり、例えば、１５００ｒ／ｍｉｎ、１６００ｒ／ｍｉｎ、１７００ｒ／ｍｉｎ、１８００ｒ／ｍｉｎ、１９００ｒ／ｍｉｎ、２０００ｒ／ｍｉｎ、２１００ｒ／ｍｉｎ、２２００ｒ／ｍｉｎ、２３００ｒ／ｍｉｎ、２４００ｒ／ｍｉｎ、２５００ｒ／ｍｉｎ、２６００ｒ／ｍｉｎ、２７００ｒ／ｍｉｎ、２８００ｒ／ｍｉｎ、２９００ｒ／ｍｉｎ又は３０００ｒ／ｍｉｎであってもよい。
好ましくは、ステップ（２”）における前記遠心処理の時間は１０～２０ｍｉｎであり、例えば、１０ｍｉｎ、１１ｍｉｎ、１２ｍｉｎ、１３ｍｉｎ、１４ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１６ｍｉｎ、１７ｍｉｎ、１８ｍｉｎ、１９ｍｉｎ又は２０ｍｉｎであってもよい。
好ましくは、ステップ（３）における前記凍結乾燥保護剤は脱脂粉乳、トレハロース、ショ糖、ビタミンＣ及び無菌生理食塩水を含む。
好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は質量百分率で、脱脂粉乳１０％～２０％、トレハロース１０％～１５％、ショ糖１％～１０％、ビタミンＣ１％～５％を含み、残りが生理食塩水である。
本願では、凍結乾燥保護剤は効果的に細菌叢の生存時間を延長させ、細菌叢の定植効果を向上させることができる。
好ましくは、ステップ（３）における前記糞便菌液と前記凍結乾燥保護剤の体積比は（２～５）：１であり、例えば、２：１、３：１、４：１又は５：１であってもよく、好ましくは３：１である。
好ましくは、ステップ（３）における前記降温凍結の条件は１０～２０ｓで室温から３～６℃に降温し、１～２℃／ｍｉｎで３～６℃から－３０～－５０℃に降温し、４～５℃／ｍｉｎで－３０～－５０℃から－７５～－８０℃に降温するものである。
好ましくは、ステップ（３）における前記降温凍結の時間は１２～２４ｈであり、例えば、１２ｈ、１３ｈ、１４ｈ、１５ｈ、１６ｈ、１７ｈ、１８ｈ、１９ｈ、２０ｈ、２１ｈ、２２ｈ、２３ｈ又は２４ｈであってもよい。
好ましくは、ステップ（３）における前記真空乾燥の真空度は５～１５ｐａであり、例えば、５ｐａ、６ｐａ、７ｐａ、８ｐａ、９ｐａ、１０ｐａ、１１ｐａ、１２ｐａ、１３ｐａ、１４ｐａ又は１５ｐａであってもよい。
好ましくは、ステップ（３）における前記真空乾燥の温度は－５０～－６０℃であり、例えば、－５０℃、－５１℃、－５２℃、－５３℃、－５４℃、－５５℃、－５６℃、－５７℃、－５８℃、－５９℃又は－６０℃であってもよい。
好ましくは、ステップ（３）における前記真空乾燥の時間は２４～４８ｈであり、例えば、２４ｈ、３０ｈ、３６ｈ、４２ｈ又は４８ｈであってもよい。
好ましくは、ステップ（３）における前記カプセルシェルは腸溶性カプセルシェルを含む。
本願では、腸溶性カプセルシェルは効果的に胃液の分解に抵抗することができ、腸内ｐＨ値の条件下でしかカプセルにおける有効細菌叢を放出せず、菌叢が腸内に到達するように効果的に保護し、菌叢の早期放出を防止し、菌叢の活性損失を減少させ、菌叢の放出時間を延長し、特定の定植効果を達成し、経口経路での投与の実現に役立つことができる。
好ましくは、前記全菌カプセルは－７５～－８０℃の温度で保存される。
好ましい技術案として、本願は、
糞便菌のドナーから抽出されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対して次世代シーケンシングを行い、生シーケンシングデータを得て、生シーケンシングデータから宿主遺伝子を除去した後に、ＮＣＢＩ微生物データベースと照合して菌種の同定及び存在度の検出を行い、ＫＥＧＧ病原菌データベースと照合して糞便菌のドナーに病原菌がないことを確認し、糞便菌の受容体の腸内菌叢と比較し、糞便菌の受容体と相補的な糞便菌のドナーを選別して得るステップ（１）と、
ステップ（１）で選別された糞便菌のドナーの糞便を収集し、３～５℃の無菌生理食塩水に浸し、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて２～３回濾過し、得られた液相は糞便濾液であり、糞便濾液を１５００～３０００ｒ／ｍｉｎで１０～２０分間遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して糞便菌液を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で調製された糞便菌液と凍結乾燥保護剤を体積比が（２～５）：１の割合で混合し、前記凍結乾燥保護剤は質量百分率で、脱脂粉乳１０％～２０％、トレハロース１０％～１５％、ショ糖１％～１０％、ビタミンＣ１％～５％を含み、残りが生理食塩水であり、その後に１０～２０ｓ内で室温から３～６℃に降温し、さらに１～２℃／ｍｉｎの降温速度で３～６℃から－３０～－５０℃に降温し、４～５℃／ｍｉｎの降温速度で－３０～－５０℃から－７５～－８０℃に降温し、降温凍結した後に、５～１５ｐａの真空度及び－５０～－６０℃の条件下で２４～４８時間真空乾燥させ、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末を腸溶性カプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得て、－７５～－８０℃で保存するステップ（３）とを含む全菌カプセルの調製方法を提供する。
好ましい技術案として、本願は、
糞便菌のドナーから抽出されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対して次世代シーケンシングを行い、生シーケンシングデータを得て、生シーケンシングデータから宿主遺伝子を除去した後に、ＮＣＢＩ微生物データベースと照合し、大腸菌、クロストリジウム・ラモーサム、ユーバクテリウム・シリンドロイデス、ロゼブリア・ホミニス、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、バクテロイデス・フラジリス又はバクテロイデス・ブルガタスのいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを発現する糞便菌のドナーを選別するステップ（１）と、
ステップ（１）で選別された糞便菌のドナーの糞便を収集し、３～５℃の無菌生理食塩水に浸し、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて２～３回濾過し、得られた液相は糞便濾液であり、糞便濾液を１５００～３０００ｒ／ｍｉｎで１０～２０分間遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して糞便菌液を得るステップ（２）と、
ステップ（２）で調製された糞便菌液と凍結乾燥保護剤を体積比が（２～５）：１の割合で混合し、前記凍結乾燥保護剤は質量百分率で、脱脂粉乳１０％～２０％、トレハロース１０％～１５％、ショ糖１％～１０％、ビタミンＣ１％～５％を含み、残りが生理食塩水であり、その後に１０～２０ｓ内で室温から３～６℃に降温し、さらに１～２℃／ｍｉｎの降温速度で３～６℃から－３０～－５０℃に降温し、４～５℃／ｍｉｎの降温速度で－３０～－５０℃から－７５～－８０℃に降温し、降温凍結した後に、５～１５ｐａの真空度及び－５０～－６０℃の条件下で２４～４８時間真空乾燥させ、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末を腸溶性カプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得て、－７５～－８０℃で保存するステップ（３）とを含む全菌カプセルの調製方法を提供する。
第２の態様では、本願は第１の態様に記載の調製方法により調製して得られる全菌カプセルを提供する。
第３の態様では、本願は第２の態様に記載の全菌カプセルを含む医薬組成物を提供する。
好ましくは、前記医薬組成物はＰＤ－１阻害剤をさらに含む。
好ましくは、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせをさらに含む。
第４の態様では、本願は疾患を治療する薬物の調製における第２の態様に記載の全菌カプセル及び／又は第３の態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。
好ましくは、前記疾患は炎症性腸疾患、腸ポリープ、腺腫、腸癌、肝性脳症、移植片対宿主病又はクロストリジウム・ディフィシル感染症のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む。
従来の技術と比較して、本願は次の有益な効果を有する。
（１）本願はハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別し、糞便菌のドナーのシーケンシングデータを共通データベースに照合し、糞便菌の受容体（患者）の腸内菌叢と比較することにより、異なる糞便菌の受容体に対する糞便菌のドナーを速やかに選別することを実現し、同定レベルが菌株レベルに達し、また、ハイスループットシーケンシングは、さらに病原菌を同定し、潜在的なリスクを有する糞便菌のドナーを除外し、品質モニタリングを行うこともできる。
（２）本願で選別された糞便菌を凍結乾燥保護剤と混合した後に凍結乾燥処理を行うことにより、効果的に菌叢の生存時間を延長し、菌叢の定植效果を向上させる。
（３）本願の全菌カプセルは糞便菌の受容体に対する「高精度マッチング」を実現し、薬効が著しく、患者が３回服用した後、腹痛スコア、毎日の排便回数及びグレード２の食物不耐症の食物の種類数がいずれも著しく減少し、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の存在度が著しく増加し、健康なドナーと一致する傾向がある。
ハイスループットシーケンシングに基づいて糞便菌のドナーを選別するフローチャートである。 過敏性腸症候群患者が全菌カプセルを経口服用する前後の過敏性腸症候群のスケールスコア比較図である。 過敏性腸症候群患者が全菌カプセルを経口服用する前後の菌叢の差異及びドナーとの関係である。
本願で採用される技術的手段及びその効果をさらに説明するために、以下、実施例及び図面を参照しながら本願をさらに説明する。ここで説明される具体的な実施形態は本願を説明するためのものにすぎず、本願に対する限定ではないことを理解できる。
実施例に具体的な技術又は条件が示されていないものは、本分野内の文献で説明される技術又は条件に従って、或いは製品仕様書に従って行われる。製造メーカが示されていない使用される試薬又は器具は、いずれも正規のルートを通じて購入できる従来の製品である。
実施例１ 健康なドナーの判断標準
糞便は健康なドナーに由来し、健康なドナーの選択標準は次のとおりである。
（１）年齢が１８～２３歳、身体が健康である未婚の男女であり、
（２）生活が規則的で良くない嗜好がなく、
（３）３ヶ月以内に抗生物質の使用歴がなく、
（４）消化器疾患がなく、
（５）血清学及び糞便感染性病原体の検査及び培養がすべて陰性であり、
（６）腸内菌叢の種類と多様性が良好であり、ハイスループット腸内菌叢１６ｓｒＤＮＡ遺伝子を検出した後に、プロバイオティクスの種類と菌叢の多様性が良好であると判断された。
健康なドナーの除外標準は次のとおりである。
（１）薬物服用歴：３ヶ月以内に抗生物質、下剤、ダイエット剤を使用したり、免疫抑制剤、化学療法剤を服用したりしている者。
（２）ウイルス接触歴：ＨＩＶウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスに以前曝露したか、又は最近曝露した者。
（３）病歴：精神疾患、悪性肥満、便秘、糖尿病、炎症性腸疾患、アレルギー、メタボリックシンドローム、免疫不全、自己免疫疾患、消化器系疾患、慢性疲労症候群、消化器系手術歴、消化器悪性腫瘍又はポリープ、アトピー疾患（例えば、湿疹、喘息及び消化器好酸球関連疾患）がある者。
（４）ウイルス学及び病因学：糞便サンプルから、ヘリコバクター・ピロリ菌、エルシニア菌、カンピロバクター菌、赤痢菌属、サルモネラ菌属、腸内病原性大腸菌、ロタウイルス、アデノウイルス、星状ウイルス、トキソプラズマ及びジアルジアが検出された者。
（５）血清学的にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）、梅毒、糞線虫症及びアメーバ症等が検出された者。
（６）高リスク性の行為の履歴、麻薬使用又は違法薬物使用の履歴、最近の収監歴又は最近の感染症の流行地への旅行歴がある者。
上記ドナー選択標準のすべての条件を満たし、且つドナーの除外標準のいずれか一項が存在しない人々を、健康なドナーと判断した。
実施例２ ハイスループットシーケンシングに基づく糞便菌のドナーの選別
実施例１に従って健康なドナーと判断された人々を糞便菌のドナーとし、ハイスループットシーケンシングの技術に基づいてさらに選別し、フローチャートは図１に示すとおりで、ステップは次のとおりである。
糞便菌のドナーの糞便からＤＮＡを抽出し、ライブラリを構築して次世代シーケンシングを行い、生シーケンシングデータを得て、生シーケンシングデータから宿主遺伝子を除去した後に、ＮＣＢＩ微生物データベース（細菌ゲノム、真菌ゲノム、ウイルスゲノム）と照合して菌種の同定及び存在度の検出を行い、ＫＥＧＧ病原菌データベースと照合して糞便菌のドナーに病原菌がないことを確認し、糞便菌の受容体の腸内菌叢と比較し、糞便菌の受容体と相補的な糞便菌のドナーを選別した。
本実施例において、選別された糞便菌のドナーはバイオマーカーの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・ラモーサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ）、ユーバクテリウム・シリンドロイデス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）及びバクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）を発現し、バイオマーカーのα多様性は１６３８０４．８である。ただし、健康に正相関するバイオマーカーはクロストリジウム・ラモーサム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｍｏｓｕｍ）、ユーバクテリウム・シリンドロイデス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｏｉｄｅｓ）、ロゼブリア・ホミニス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｈｏｍｉｎｉｓ）、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）及びバクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ）であり、健康に負相関するバイオマーカーは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ１）である。
健康な人々においては、健康に正相関する各微生物に対してｂｏｘｐｌｏｔ分析を行い、各微生物の中央値を得た。患者においては、健康に負相関する各微生物に対してついてｂｏｘｐｌｏｔ分析を行い、各微生物の中央値を得て、各微生物の中央値をドナー選別の標準値とした。
糞便菌のドナーの選別標準は、健康に正相関する各微生物の値が該微生物の標準値よりも大きく、健康に負相関する各微生物の値が該微生物の標準値よりも小さい。
実施例３ 糞便菌液の調製
実施例２で選別された糞便菌の受容体に対する特異的な糞便菌のドナーの糞便をその場で収集し、１時間以内に収集された糞便を実験室に送り、情報登録、糞便同定、計量、評価及び処理を行い、嫌気環境で糞便菌液を調製し、ステップは次のとおりである。
（１）收集された糞便を５℃の無菌生理食塩水に浸し、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて３回濾過し、得られた液相は糞便濾液であり、
（２）糞便濾液を３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して糞便菌液を得た。
実施例４ 糞便菌液の調製
実施例２で選別された糞便菌の受容体に対する特異的な糞便菌のドナーの糞便をその場で収集し、１時間以内に収集された糞便を実験室に送り、情報登録、糞便同定、計量、評価及び処理を行い、嫌気環境で糞便菌液を調製し、ステップは次のとおりである。
（１）收集された糞便を３℃の無菌生理食塩水に浸し、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて２回濾過し、得られた液相は糞便濾液であり、
（２）糞便濾液を１５００ｒ／ｍｉｎで２０分間遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して糞便菌液を得た。
実施例５ 全菌カプセルの調製
実施例３で調製された糞便菌液を凍結乾燥保護剤（脱脂粉乳１５％、トレハロース１５％、ショ糖５％、ビタミンＣ５％、残りが生理食塩水）と３：１（ｖ／ｖ）で混合し、その後に１０ｓ内で室温から４℃に降温し、さらに２℃／ｍｉｎの降温速度で４℃から－４０℃に降温し、５℃／ｍｉｎの降温速度で－４０℃から－８０℃に降温し、降温凍結した後に１０ｐａの真空度と－５０℃の条件下で４８時間真空乾燥させ、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末を腸溶性カプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得て、－８０℃で保存した。
実施例６ 全菌カプセルの調製
実施例４で調製された糞便菌液を凍結乾燥保護剤（脱脂粉乳１０％、トレハロース１５％、ショ糖１％、ビタミンＣ５％、残りが生理食塩水）と混合し、その後に１０ｓ内で室温から６℃に降温し、さらに２℃／ｍｉｎの降温速度で６℃から－５０℃に降温し、５℃／ｍｉｎの降温速度で－５０℃から－７５℃に降温し、降温凍結した後に５ｐａの真空度と－５０℃の条件下で４８時間真空乾燥させ、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末を腸溶性カプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得て、－８０℃で保存した。
実施例７ 全菌カプセルの調製
実施例４で調製された糞便菌液を凍結乾燥保護剤（脱脂粉乳２０％、トレハロース１０％、ショ糖１０％、ビタミンＣ１％、残りが生理食塩水）と混合し、その後に２０ｓ内で室温から３℃に降温し、さらに１℃／ｍｉｎの降温速度で３℃から－３０℃に降温し、４℃／ｍｉｎの降温速度で－３０℃から－８０℃に降温し、降温凍結した後に１５ｐａの真空度と－６０℃の条件下で２４時間真空乾燥させ、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末を腸溶性カプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得て、－７５℃で保存した。
実施例８ 全菌カプセルの治療効果
過敏性腸症候群患者が実施例５で調製された全菌カプセルを３回服用し、毎週１回合計３週間服用した。
図２に示すように、患者の腹痛スコア、毎日の排便回数、及びグレード２の食物不耐症の食物の種類数がいずれも著しく減少し（ｐ＜０．０１）、グレード１の食物不耐症とグレード３の食物不耐症の食物の種類数がそれに応じて減少した。
図３に示すように、患者の糞便サンプルに対して１６ＳｒＲＮＡ検出を行い、サンプルは科の分類レベルで、フィルミクテス門の存在度が著しく増加し（ｐ＜０．０１）、健康なドナーと一致する傾向があった。
上記をまとめると、ハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別し、異なる糞便菌の受容体に対する特異的な糞便菌のドナーを正確に選別し、調製された全菌カプセルは「高精度マッチング」し、薬効が著しく、安全性が高い。
本願は上記の実施例によって本願の詳細な方法を説明したが、本願は上記の詳細な方法に限定されず、即ち、本願は上記の詳細な方法により実施しなければならないことを意味しないことを出願人は声明する。当業者は、本願に加えたいかなる改良、本願の製品の各原料に対する同等の置換及び補助成分の追加、具体的な方法の選択などはいずれも本願の保護範囲及び開示範囲内に入ることを理解すべきである。

Claims (14)

  1. ハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別するステップ（１）と、
    ステップ（１）で選別された糞便菌のドナーの糞便を収集して糞便菌液を調製するステップ（２）と、
    ステップ（２）で調製された糞便菌液を凍結乾燥保護剤と混合した後に、降温凍結及び真空乾燥を行い、得られた糞便叢の凍結乾燥粉末をカプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得るステップ（３）とを含む、全菌カプセルの調製方法。
  2. ステップ（１）におけるハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別する方法は、
    糞便菌のドナーから抽出されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対して次世代シーケンシングを行い、生シーケンシングデータを得るステップ（１’）と、
    生シーケンシングデータから宿主遺伝子を除去した後に、微生物データベースと照合して菌種の同定及び存在度の検出を行うステップ（２’）と、
    病原菌データベースと照合して糞便菌のドナーに病原菌がないことを確認するステップ（３’）と、
    糞便菌の受容体の腸内菌叢と比較し、糞便菌の受容体と相補的な糞便菌のドナーを選別して得るステップ（４’）とを含む、請求項１に記載の調製方法。
  3. ステップ（２’）における前記微生物データベースは、共通データベースに由来する細菌ゲノム、真菌ゲノム又はウイルスゲノムのいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む、請求項１又は２に記載の調製方法。
  4. ステップ（３’）における前記病原菌データベースは、共通データベースに由来する病原菌ゲノムを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の調製方法。
  5. ステップ（１）における前記したハイスループットシーケンシングを用いて糞便菌のドナーを選別することは、糞便菌のドナーが発現するバイオマーカー及び前記バイオマーカーの多様性指数に応じて選別する、請求項１～４のいずれか一項に記載の調製方法。
  6. 前記バイオマーカーは大腸菌、クロストリジウム・ラモーサム、ユーバクテリウム・シリンドロイデス、ロゼブリア・ホミニス、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、バクテロイデス・フラジリス又はバクテロイデス・ブルガタスのいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の調製方法。
  7. 前記バイオマーカーの多様性指数は前記バイオマーカーのα多様性指数を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の調製方法。
  8. ステップ（２）における前記糞便菌液の調製方法は、
    収集された糞便を無菌生理食塩水に浸し、濾過した後に糞便濾液を得るステップ（１”）と、
    糞便濾液を遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して前記糞便菌液を得るステップ（２”）とを含み、
    好ましくは、ステップ（１”）における前記無菌生理食塩水の温度は３～５℃であり、
    好ましくは、ステップ（１”）における前記濾過はスクリーンを用いて行われ、
    好ましくは、前記スクリーンの孔径は０．２５～２ｍｍであり、
    好ましくは、ステップ（１”）における前記濾過は、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて２～３回濾過し、得られた液相が糞便濾液であることを含み、
    好ましくは、ステップ（２”）における前記遠心処理の回転速度は１５００～３０００ｒ／ｍｉｎであり、
    好ましくは、ステップ（２”）における前記遠心処理の時間は１０～２０ｍｉｎである、請求項１～７のいずれか一項に記載の調製方法。
  9. ステップ（３）における前記凍結乾燥保護剤は脱脂粉乳、トレハロース、ショ糖、ビタミンＣ及び無菌生理食塩水を含み、
    好ましくは、前記凍結乾燥保護剤は質量百分率で、脱脂粉乳１０％～２０％、トレハロース１０％～１５％、ショ糖１％～１０％、ビタミンＣ１％～５％を含み、残りが生理食塩水であり、
    好ましくは、ステップ（３）における前記糞便菌液と前記凍結乾燥保護剤の体積比は（２～５）：１であり、
    好ましくは、ステップ（３）における前記降温凍結の条件は１０～２０ｓで室温から３～６℃に降温し、１～２℃／ｍｉｎで３～６℃から－３０～－５０℃に降温し、４～５℃／ｍｉｎで－３０～－５０℃から－７５～－８０℃に降温することであり、
    好ましくは、ステップ（３）における前記降温凍結の時間は１２～２４ｈであり、
    好ましくは、ステップ（３）における前記真空乾燥の真空度は５～１５ｐａであり、
    好ましくは、ステップ（３）における前記真空乾燥の温度は－５０～－６０℃であり、
    好ましくは、ステップ（３）における前記真空乾燥の時間は２４～４８ｈであり、
    好ましくは、ステップ（３）における前記カプセルシェルは腸溶性カプセルシェルを含み、
    好ましくは、前記全菌カプセルは－７５～－８０℃の温度で保存される、請求項１～８のいずれか一項に記載の調製方法。
  10. 糞便菌のドナーから抽出されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対して次世代シーケンシングを行い、生シーケンシングデータを得て、生シーケンシングデータから宿主遺伝子を除去した後に、ＮＣＢＩ微生物データベースと照合して菌種の同定及び存在度の検出を行い、ＫＥＧＧ病原菌データベースと照合して糞便菌のドナーに病原菌がないことを確認し、糞便菌の受容体の腸内菌叢と比較し、糞便菌の受容体と相補的な糞便菌のドナーを選別して得るステップ（１）と、
    ステップ（１）で選別された糞便菌のドナーの糞便を収集し、３～５℃の無菌生理食塩水に浸し、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて２～３回濾過し、得られた液相は糞便濾液であり、糞便濾液を１５００～３０００ｒ／ｍｉｎで１０～２０分間遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して糞便菌液を得るステップ（２）と、
    ステップ（２）で調製された糞便菌液と凍結乾燥保護剤を体積比が（２～５）：１の割合で混合し、前記凍結乾燥保護剤は質量百分率で、脱脂粉乳１０％～２０％、トレハロース１０％～１５％、ショ糖１％～１０％、ビタミンＣ１％～５％を含み、残りが生理食塩水であり、その後に１０～２０ｓ内で室温から３～６℃に降温し、さらに１～２℃／ｍｉｎの降温速度で３～６℃から－３０～－５０℃に降温し、４～５℃／ｍｉｎの降温速度で－３０～－５０℃から－７５～－８０℃に降温し、降温凍結した後に、５～１５ｐａの真空度及び－５０～－６０℃の条件下で２４～４８時間真空乾燥させ、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末を腸溶性カプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得て、－７５～－８０℃で保存するステップ（３）とを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の調製方法。
  11. 糞便菌のドナーから抽出されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡに対して次世代シーケンシングを行い、生シーケンシングデータを得て、生シーケンシングデータから宿主遺伝子を除去した後に、ＮＣＢＩ微生物データベースと照合し、大腸菌、クロストリジウム・ラモーサム、ユーバクテリウム・シリンドロイデス、ロゼブリア・ホミニス、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツィ、バクテロイデス・フラジリス又はバクテロイデス・ブルガタスのいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを発現する糞便菌のドナーを選別するステップ（１）と、
    ステップ（１）で選別された糞便菌のドナーの糞便を収集し、３～５℃の無菌生理食塩水に浸し、順に２．０ｍｍ、１．０ｍｍ、０．５ｍｍ及び０．２５ｍｍのスクリーンを用いて大きな粒状物を除去し、その後に０．２５ｍｍのスクリーンを用いて２～３回濾過し、得られた液相は糞便濾液であり、糞便濾液を１５００～３０００ｒ／ｍｉｎで１０～２０分間遠心処理し、沈殿物を取って無菌生理食塩水と混合して糞便菌液を得るステップ（２）と、
    ステップ（２）で調製された糞便菌液と凍結乾燥保護剤を体積比が（２～５）：１の割合で混合し、前記凍結乾燥保護剤は質量百分率で、脱脂粉乳１０％～２０％、トレハロース１０％～１５％、ショ糖１％～１０％、ビタミンＣ１％～５％を含み、残りが生理食塩水であり、その後に１０～２０ｓ内で室温から３～６℃に降温し、さらに１～２℃／ｍｉｎの降温速度で３～６℃から－３０～－５０℃に降温し、４～５℃／ｍｉｎの降温速度で－３０～－５０℃から－７５～－８０℃に降温し、降温凍結した後に、５～１５ｐａの真空度及び－５０～－６０℃の条件下で２４～４８時間真空乾燥させ、得られた糞便菌の凍結乾燥粉末を腸溶性カプセルシェル内に入れて前記全菌カプセルを得て、－７５～－８０℃で保存するステップ（３）とを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の調製方法。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の調製方法により調製して得られる、全菌カプセル。
  13. 請求項１２に記載の全菌カプセルを含み、
    好ましくは、前記医薬組成物はＰＤ－１阻害剤をさらに含み、
    好ましくは、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせをさらに含む、医薬組成物。
  14. 疾患を治療する薬物の調製における請求項１２に記載の全菌カプセル及び／又は請求項１３に記載の医薬組成物の使用であって、
    好ましくは、前記疾患は炎症性腸疾患、腸ポリープ、腺腫、腸癌、肝性脳症、移植片対宿主病又はクロストリジウム・ディフィシル感染症のいずれか１種又は少なくとも２種の組み合わせを含む、使用。
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