JP2023530335A - ヘテロ二量体リラキシン融合物及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヘテロ二量体リラキシン融合ポリペプチド、特にヘテロ二量体リラキシン２融合ポリペプチド及びその使用に関する。したがって、本発明は、リラキシン融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、並びに医薬組成物を含むキット及び治療の方法を含む医薬組成物の使用を提供する。本発明のポリペプチド及び組成物は、特に、心臓血管系疾患の治療において、たとえば心不全の治療に有用であってもよい。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年６月１１日に作成され、名称は、２０１０１１（ＰＣＴ）＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは、２３６，２０３バイトである。

本発明は、ヘテロ二量体リラキシン融合物及びその使用に関する。特に、本発明は、リラキシン－２融合物及びその使用に関する。

リラキシンは、インスリンスーパーファミリーに属するペプチドホルモンである。ヒトでは、リラキシンペプチドファミリーは、構造の類似性が高いが配列類似性が低い、７つのペプチドを含む：リラキシン１、２、及び３並びにインスリン様ペプチドＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＮＳＬ５、及びＩＮＳＬ６。天然のリラキシンは、２つの鎖間ジスルフィド結合により共有結合されたＡ及びＢポリペプチド鎖から構成される。Ａ鎖は、さらに別の鎖内ジスルフィド結合を有する。リラキシン遺伝子は、構造Ｂ－Ｃ－Ａ（Ｃペプチドによって連結されたＢ及びＡポリペプチド鎖）でプロホルモンをコードする。プロホルモンは、ＰＣ１及びＰＣ２酵素による細胞内タンパク質分解切断を受けて、Ｃペプチドを除去した後、成熟リラキシンを分泌する。

リラキシンは、妊娠中、全身血液動態の適応変化及び腎臓の適応変化を媒介することが知られている多面的ホルモンである。リラキシンはまた、抗線維化の特性を有し、且つ心不全、例えば、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）において有益な効果を有することも明らかにされている。心不全は、深刻な罹患率及び死亡率に関連する。心不全は、心筋細胞死の増加及び間質性線維症を伴う複雑な組織リモデリングによって特徴付けられる。リラキシンは、虚血再灌流及び心不全といった状況において有益であることが示された多くのシグナル伝達カスケードを活性化する。これらのシグナル伝達経路は、ホスホイノシチド３－キナーゼ経路の活性化及び一酸化窒素シグナル伝達経路の活性化を含む（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。

非修飾組換えヒトリラキシン２であるセレラキシンを使用して、臨床試験が実施された。入院した患者に対するセレラキシンの連続した静脈内投与は、心臓、腎臓、及び肝臓の損傷並びにうっ血のマーカーを改善した（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。しかしながら、患者の血液循環からのセレラキシンの急速な排除のために、治療効果は限られたものであり、一旦静脈内注射を止めたら、正の効果は、急速に消滅した。そのうえ、およそ３分の１の患者は、セレラキシンを静脈内に受けた後に、深刻な血圧低下（＞４０ｍｍ Ｈｇ）を経験し、半分又はさらにもっと用量を低下させなければならなかったという結論に達した。

特許文献１及び特許文献２は、リラキシンＡとリラキシンＢが、リンカーペプチドにより単鎖に融合されている組換えリラキシンポリペプチドについて記載している。特許文献１は、少なくとも５アミノ酸で、且つ１５アミノ酸未満のリンカーペプチドを含む組換えリラキシンを記載している。特許文献２は、少なくとも１５アミノ酸のリンカーペプチドを含む組換えリラキシンを記載している。

国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレット 国際公開第２０１８／１３８１７０号パンフレット

Ｂａｔｈｇａｔｅ ＲＡ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．９３（１）：４０５－４８０ Ｍｅｎｔｚ ＲＪ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１６５（２）：１９３－１９９ Ｔｉｅｔｊｅｎｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｈｅａｒｔ １０２：９５－９９ Ｗｉｌｓｏｎ ＳＳ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３５：３１５－３２７ Ｆｅｌｋｅｒ ＧＭ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６４（１５）：１５９１－１５９８ Ｍｅｔｒａ Ｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．６１（２）：１９６－２０６ Ｔｅｅｒｌｉｎｋ ＪＲ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｌａｎｃｅｔ ３８１（９８６０）：２９－３９

未修飾組換えリラキシンによりこれまでに行われた有望な臨床研究を考慮すれば、リラキシン生物学的活性を保持し、長期にわたる半減期及び好都合な投薬などのような利点を提供する、さらなる組換えリラキシンの必要性が残っている。

本発明は、リラキシン活性を有するヘテロ二量体融合物に関する。

従って、一態様では、本発明は、以下：
（ｉ）少なくとも１つのリラキシンＡ鎖ポリペプチド又はその変異体に連結された第１のヘテロ二量体化ドメインと；
（ｉｉ）少なくとも１つのリラキシンＢ鎖ポリペプチド又はその変異体に連結された第２のヘテロ二量体化ドメインと、
を含むヘテロ二量体融合物を提供し、
ここで、第１のヘテロ二量体化ドメインは、第２のヘテロ二量体化ドメインとヘテロ二量体化し、上記ヘテロ二量体融合物は、リラキシン活性を有する。

いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖とリラキシンＢ鎖は、１つ以上の（例えば２つの）鎖間結合、好ましくは１つ以上の（例えば２つの）鎖間ジスルフィド結合によって共有結合で結合される。いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖とリラキシンＢ鎖は、アミノ酸リンカーによって互いに共有結合で連結されていない。

いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖は、リラキシン－２Ａ鎖であり、リラキシンＢ鎖は、リラキシン２Ｂ鎖である。

好ましい実施形態では、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ領域、例えば 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）Ｆｃ領域（「第１のＦｃ領域」及び「第２のＦｃ領域」）に由来する。第１及び第２のＦｃ領域は、定常ドメインＣＨ２及び／又はＣＨ３を含み得る。好ましくは、第１及び第２のＦｃ領域は、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。

別の実施形態では、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリンＦａｂ領域に由来する。

さらに別の実施形態では、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインは、ヘテロ二量化して、平行なコイルドコイルを形成する。

いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖は、コネクターを介して第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）につながれ、リラキシンＢ鎖は、コネクターを介して第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）につながれる。好ましい実施形態では、一方又は好ましくは両方のコネクターが、ポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコネクターは、６～４０アミノ酸の長さを有するポリペプチドである。好ましくは、両方のコネクターが、６～４０アミノ酸の長さを有するポリペプチドである。好ましい実施形態では、少なくとも１つのコネクターは、２１アミノ酸の長さを有するポリペプチドである。特に好ましい実施形態では、両方のコネクターが、２１アミノ酸の長さを有するポリペプチドである。特定の実施形態では、両方のコネクターが、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ［配列番号５］を有する。

好ましい実施形態では、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＣ末端は、リラキシンＡ鎖のＮ末端に連結され、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＣ末端は、リラキシンＢ鎖のＮ末端に連結される。別の実施形態では、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＮ末端は、リラキシンＡ鎖のＣ末端につながれ、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＮ末端は、リラキシンＢ鎖のＣ末端に連結される。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１及び第２のＦｃ領域）は、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異及び／又は修飾、好ましくは不斉ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異及び／又は修飾を含む。好ましい実施形態では、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異は、「Ｆｃノブ（Ｋｎｏｂ）」及び「Ｆｃホール（Ｈｏｌｅ）」突然変異である。特に好ましい実施形態では、「Ｆｃノブ」及び「Ｆｃホール」突然変異は、ＣＨ３ドメインに存在する。好ましい実施形態では、第１のＦｃ領域は「Ｆｃノブ」突然変異を含み、第２のＦｃ領域は「Ｆｃホール」突然変異を含む。或いは、第１のＦｃ領域は「Ｆｃホール」突然変異を有し、第２のＦｃ領域は「Ｆｃノブ」突然変異を有する。好ましくは、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異は、一方のＣＨ３ドメインに、「Ｆｃホール」突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、又はそれらの保存的置換を含み；他方のＣＨ３ドメインに、「Ｆｃノブ」突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ、又はそれらの保存的置換を含み、ここで、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。

本発明の任意の態様の実施形態では、リラキシン２Ａ鎖ポリペプチドは、配列番号１に記載の配列又はその変異体を含み、リラキシン２Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号２に記載の配列又はその変異体を含む。いくつかの実施形態では、リラキシン２Ａ鎖ポリペプチドは、アミノ酸突然変異Ｋ９Ｈを含む。

また、本発明によって、以下：
（ｉ）ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ａ融合ポリペプチドと；
（ｉｉ）ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ｂ融合ポリペプチドと、
を含むヘテロ二量体融合物が提供され、
ここで、
Ａは、リラキシンＡ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ａ鎖又はその変異体であり；
Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ｂ鎖又はその変異体であり；
ＦｃＹは、「Ｆｃホール」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）Ｆｃ領域であり、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ又はそれらの保存的置換を有するＣＨ３ドメインを含み；
ＦｃＸは、「Ｆｃノブ」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）Ｆｃ領域、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ又はそれらの保存的置換を有するＣＨ３ドメインを含み；
ｃｏｎは、コネクター、例えば、好ましくは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ［配列番号５］を有するコネクターポリペプチドであり、
ここで、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものであり、また、ＦｃＸは、ＦｃＹとヘテロ二量体化し、上記ヘテロ二量体融合物は、リラキシン活性を有する。

特に好ましい実施形態では、ヘテロ二量体融合物は、配列番号１１のアミノ酸配列との融合ポリペプチドと、配列番号２０のアミノ酸配列との融合ポリペプチドを含む。

本発明の任意の態様のいくつかの実施形態では、ヘテロ二量体融合物は、１つ以上のＦａｂをさらに含み、任意選択で、ヘテロ二量体融合物は、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＮ末端に連結された１つのＦａｂと、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＮ末端に連結された第２のＦａｂとを含む。

本発明の任意の態様のいくつかの実施形態では、ヘテロ二量体融合物は、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＮ末端につながれた第２のリラキシンＡ鎖ポリペプチド又はその変異体と、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＮ末端につながれた第２のリラキシンＢ鎖ポリペプチド又はその変異体をさらに含み、任意選択で、第２のリラキシンＡ鎖は、コネクターポリペプチドを介して第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）につながれ、第２のリラキシンＢ鎖は、コネクターポリペプチドを介して第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）につながれる。

別の態様では、本発明は、以下：
（ｉ）ＦｃＸ－Ｂ－Ｌ－Ａ及びＦｃＹ、任意選択でＦｃＹ－Ｂ－Ｌ－Ａ；又は
（ｉｉ）ＦｃＹ－Ｂ－Ｌ－Ａ及びＦｃＸ、任意選択でＦｃＸ－Ｂ－Ｌ－Ａ；
を含むヘテロ二量体融合物を提供し、
ここで、
ＦｃＹは、「Ｆｃホール」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）Ｆｃ領域であり、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ、又はそれらの保存的置換を有するＣＨ３ドメインを含み；
ＦｃＸは、「Ｆｃノブ」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）Ｆｃ領域であり、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ、又はそれらの保存的置換を有するＣＨ３ドメインを含み；
Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ｂ鎖又はその変異体であり；
Ａは、リラキシンＡ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ａ鎖又はその変異体であり；
Ｌは、好ましくは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ［配列番号６０］を有するリンカーポリペプチドであり、
ここで、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものであり、また、ＦｃＸは、ＦｃＹとヘテロ二量体化し、上記ヘテロ二量体融合物は、リラキシン活性を有する。或いは、ＦｃＸ及びＦｃＹは、本明細書に記載されるような非Ｆｃヘテロ二量体化ドメインである。いくつかの実施形態では、リラキシンＢ鎖は、コネクター、任意選択で、６～４０アミノ酸の長さ、例えば２１アミノ酸の長さを有するコネクターポリペプチドを介して、ＦｃＸ及び／又はＦｃＹにつながれている。

さらに別の態様において、本発明は、以下：
（ｉ）ＦｃＸ－Ａ－Ｌ－Ｂ及びＦｃＹ、任意選択でＦｃＹ－Ａ－Ｌ－Ｂ；又は
（ｉｉ）ＦｃＹ－Ａ－Ｌ－Ｂ及びＦｃＸ、任意選択でＦｃＸ－Ａ－Ｌ－Ｂ；
を含むヘテロ二量体融合物を提供し、
ここで、
ＦｃＹは、「Ｆｃホール」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）Ｆｃ領域であり、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ、又はそれらの保存的置換を有するＣＨ３ドメインを含み；
ＦｃＸは、「Ｆｃノブ」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１）Ｆｃ領域であり、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ、又はそれらの保存的置換を有するＣＨ３ドメインを含み；
Ａは、リラキシンＡ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ａ鎖又はその変異体であり；
Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ｂ鎖又はその変異体であり；
Ｌは、好ましくはアミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ［配列番号６０］を有するリンカーポリペプチドであり、
ここで、アミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによるものであり、また、ＦｃＸは、ＦｃＹとヘテロ二量体化し、上記ヘテロ二量体融合物はリラキシン活性を有する。或いは、ＦｃＸ及びＦｃＹは、本明細書に記載されるような非Ｆｃヘテロ二量体化ドメインである。いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖は、コネクター、任意選択で、６～４０アミノ酸の長さ、例えば２１アミノ酸の長さを有するコネクターポリペプチドを介して、ＦｃＸ及び／又はＦｃＹにつながれている。

本発明の任意の態様のいくつかの実施形態では、基準リラキシンタンパク質のリラキシン活性に対するヘテロ二量体融合物のリラキシン活性の比は、約０．００１～約１０である。

関連する態様では、本発明は、本発明のヘテロ二量体融合物をコードする核酸分子（例えばＤＮＡ分子）、核酸分子を含むベクター、ベクター又は核酸を含む宿主細胞、及び宿主細胞を培養し、融合タンパク質を収集することによって本発明のヘテロ二量体融合物を製造する方法を提供する。

別の態様において、本発明は、本発明のヘテロ二量体融合物を含む医薬組成物、それを含むキット、及び心不全を有する対象の治療方法などの治療におけるヘテロ二量体融合物の使用を提供する。

本発明の態様及び実施形態は、添付の請求項において述べられる。本発明のこれらの及び他の態様及び実施形態はまた、本明細書においても記載される。

図面の簡単な説明及び配列表

図１は、本発明のいくつかの実施形態によるヘテロ二量体融合物の例示的なフォーマットを示す図である。ヘテロ二量体融合物の各融合ポリペプチドのフォーマットは、ＦｃＸ、ＦｃＹ、Ａ、Ｂ、ｃｏｎ及びＬに関して付与され、ここで、ＦｃＸ（「Ｆｃノブ」）及びＦｃＹ（「Ｆｃホール」）は、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異及び／又は修飾を含む２つのＦｃ領域であり；Ａ（「Ｒｌｘ Ａ」）及びＢ（「Ｒｌｘ Ｂ」）は、リラキシンＡ鎖及びリラキシンＢ鎖ポリペプチドであり；「ｃｏｎ」は、コネクターポリペプチドであり；Ｌは、リンカーポリペプチドであり、ＨＣ Ｘ及びＨＣ Ｙは、抗体の重鎖、ＬＣは、抗体の軽鎖、ヒンジは、抗体のヒンジ領域であり、Ｆａｂは、抗体のＦａｂフラグメントである。 図２は、ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３のＬＣ－ＭＳ分析を示す図であり、Ａ）ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３脱グリコシル化及び非還元分析は、インタクトな分子の質量を示し、Ｂ）ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３脱グリコシル化及び還元分析は、個々のＦｃ融合鎖（ノブリラキシン鎖Ａ及びホールリラキシン鎖Ｂ）の質量を示している。 図３は、ＬＣ－ＭＳを用いた非還元ペプチドマッピングによるＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３のＣ末端ペプチドの分析を示す図である。線で表される予測ジスルフィド結合を有するＣ末端ペプチドのアミノ酸配列を上部パネルに示す。パネルＡ及びＥ－還元剤の非存在下（－ＤＴＴ）でのＣ末端ペプチドの抽出イオンクロマトグラム。パネルＣ及びＧ－還元剤の非存在下でのＣ末端ペプチドのデコンボリューションマススペクトル。パネルＢ及びＦ－還元剤の存在下（＋ＤＴＴ）での抽出イオンクロマトグラム並びにパネルＤ及びＨ－還元剤の存在下でのデコンボリューションマススペクトル。図３は、配列番号７５、７７、及び７６をそれぞれ出現順に開示している。 図４は、組換えヒトＲＸＦＰ１を発現する細胞においてｃＡＭＰ誘導により測定された本発明のいくつかのヘテロ二量体融合物のインビトロ生物学的活性を示す図である。 図５は、本発明のヘテロ二量体融合物をマウスに静脈内投与した一連のＥＬＩＳＡ実験からのインビボ薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す図である。データは、５分時点（Ｔ１）における％ｃＭａｘとして正規化される。 図６は、ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３で処置したマウスにおけるイソプロテレノール誘発性心筋線維化及び肥大の回復を示す図である。（１）ビヒクル（ベースライン）、（２）イソプロテレノール、（３）イソプロテレノール＋リラキシン２、（４）イソプロテレノール＋ＲＥＬＡＸ００１９、及び（５）イソプロテレノール＋ＲＥＬＡＸ００２３についての線維化及び肥大のレベルが示されている。 図７は、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）（ＢＶ）ＥＬＩＳＡアッセイにおける本発明のヘテロ二量体融合物のインビトロ非特異的結合を示す図である。 図８は、保存時の溶液中のＲＥＬＡＸ００２３、ＲＥＬＡＸ０１２７、及びＲＥＬＡＸ０１２８の純度減少、凝集及びフラグメント化のパーセンテージを示す。 図９は、還元ＬＣ－ＭＳ分析によって評価される溶液中のＲＥＬＡＸ００２３、ＲＥＬＡＸ０１２７、及びＲＥＬＡＸ０１２８の経時的な安定性を示す図である。Ａ）全イオンクロマトグラム、Ｂ）還元分子のマススペクトル 図１０は、静脈内及び皮下注射後のカニクイザルにおけるＲＥＬＡＸ００２３のＰＫプロファイルを示す。 図１１は、本発明のポリペプチドの一部をコードする塩基配列（それぞれ配列番号８０～１４０、出現順）を示す。

リラキシン
本発明は、少なくとも部分的には、リラキシンＡ鎖とリラキシンＢ鎖がアミノ酸リンカーを介して互いに共有結合で連結されていない場合に、本明細書に記載のヘテロ二量体融合物が、リラキシン活性を示し得るという知見に基づいている。これは、リラキシンＡとリラキシンＢが単鎖に融合されている組換えリラキシンを記載する国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレット及び同第２０１８／１３８１７０号パンフレットの開示によれば、驚くべきことである。本発明者らはさらに、ヘテロ二量体化ドメインのヘテロ二量体化が、リラキシンＡ鎖及びリラキシンＢ鎖の正しい折り畳み及びヘテロ二量体化を誘導することも見出した（実施例２を参照されたい）。加えて、野生型リラキシンタンパク質とは異なり、本発明の融合ポリペプチドは、生物学的活性のために内部タンパク質分解プロセシングを必要としない。

本明細書において使用される場合、用語「ヘテロ二量体融合物」は、融合ポリペプチドのヘテロ二量体を指し、ここで、一方の融合ポリペプチドは、ヘテロ二量体タンパク質の第１のサブユニット（例えばリラキシンＡ鎖）につながれた第１のヘテロ二量体化ドメインを含み、他方の融合ポリペプチドは、ヘテロ二量体タンパク質の第２のサブユニット（例えばリラキシンＢ鎖）につながれた第２のヘテロ二量体化ドメインを含む。

本発明のヘテロ二量体融合物は、リラキシン１、リラキシン２及びリラキシン３から選択されるリラキシンの群からのリラキシンＡ鎖及びＢ鎖ポリペプチドを含み得る。好ましい実施形態では、本発明のリラキシンＡ鎖ポリペプチドは、リラキシン２ Ａ鎖ポリペプチド又はその変異体であり；本発明のリラキシンＢ鎖ポリペプチドは、リラキシン２ Ｂ鎖ポリペプチド又はその変異体である。特定の実施形態では、リラキシンＡ鎖ポリペプチドは、ヒトリラキシン２ Ａ鎖ポリペプチド又はその変異体及びヒトリラキシン２ Ｂ鎖ポリペプチド又はその変異体を含む。

「鎖」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して連結された２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために本明細書において互換的に使用され得る。

いくつかの実施形態では、リラキシン２ Ａ鎖ポリペプチドは、配列番号１に記載の配列又はその変異体を有し、リラキシン２ Ｂ鎖ポリペプチドは、配列番号２に記載の配列又はその変異体を有する。変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を含み得る。いくつかの実施形態では、リラキシン２ Ａ鎖ポリペプチドは、Ｋ９Ｅ、Ｋ９Ｈ、Ｋ９Ｌ、Ｋ９Ｍ、Ｒ１８Ｅ、Ｒ１８Ｈ、Ｒ２２Ａ、Ｒ２２Ｉ、Ｒ２２Ｍ、Ｒ２２Ｑ、Ｒ２２Ｓ、Ｒ２２Ｙ、Ｆ２３Ｅ、Ｆ２３Ａ及びＦ２３Ｉから選択される１つ以上のアミノ酸突然変異を含む。好ましい実施形態では、リラキシン２ Ａ鎖は、アミノ酸突然変異Ｋ９Ｈを含む。

リラキシンＡ鎖及びＢ鎖の変異体は、当技術分野において知られている。そのうえ、リラキシンＡ鎖及びＢ鎖の変異体の設計の手引きは、当業者に入手可能である。たとえば、変異体が、リラキシン機能に必要とされるアミノ酸を保持してもよいことは理解されるであろう。たとえば、リラキシン２ Ｂ鎖変異体は、保存モチーフＡｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ａｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ｉｌｅ（Ｃｌａａｓｚ ＡＡ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９（２４）：６２８７－６２９３）又はＡｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ａｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ｖａｌ（Ｂａｔｈｇａｔｅ ＲＡ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．９３（１）：４０５－４８０）を含んでいてもよい。変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、及び／又は挿入を含んでいてもよい。たとえば、リラキシン－２ Ｂ鎖変異体は、配列番号６２と比較して、Ｋ３０及びＲ３１、Ｎ－末端Ｖ－２、Ａ－１及びＭ－１等の１つ以上のさらなるアミノ酸を有していてもよい。その代わりに又はそのうえ、変異体は、１つ以上のアミノ酸誘導体を含んでいてもよい。たとえば、リラキシン－２ Ｂ鎖変異体の第１のアミノ酸は、ピログルタミン酸であってもよい。

好ましい実施形態では、リラキシンＡ鎖及びリラキシンＢ鎖は、２つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合により結合される（実施例２を参照されたい）。

ペプチドのリラキシンファミリーは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の活性化及びそれぞれＧｓ又はＧｉタンパク質サブユニットによるｃＡＭＰシグナル伝達経路の続く刺激又は阻害を通して、少なくとも部分的に、それらの生物学的効果を伝達する。リラキシン－２は、ＧＰＣＲ ＲＸＦＰ１（ＬＧＲ７としても知られている）及び程度はより低いが、ＧＰＣＲ ＲＸＦＰ２（ＬＧＲ８としても知られている）を活性化して、したがって、Ｇｓ－ｃＡＭＰ依存性のシグナル伝達経路を刺激し、セカンドメッセンジャー分子ｃＡＭＰの増加に至ることが知られている。

本明細書において使用されるように、用語「リラキシン活性」は、リラキシン分子が、リラキシン受容体に結合する及び／又は前記リラキシン受容体を活性化する及び／又は細胞の内部でシグナル伝達カスケードを開始する能力を指す。リラキシン活性がリラキシン２活性である実施形態では、リラキシン活性は、受容体ＲＸＦＰ１及び／又はＲＸＦＰ２に結合する及び／又はそれを活性化する能力を指してもよい。用語「リラキシン活性」は、「生物学的活性」と区別なく使用されてもよい。

リラキシン活性は、リラキシン受容体へのリラキシン分子の結合を測定することによって及び／又はリラキシン受容体への結合の下流のイベントを測定することによって決定されてもよい。

リラキシン活性は、インビトロにおいて及び／又はインビボにおいて決定されてもよい。いくつかの実施形態では、リラキシン活性は、インビトロにおいて決定される。

リラキシン活性は、受容体のリラキシンによる活性化の下流の分子の量及び／又は存在を測定することによって決定されてもよい。たとえば、リラキシン活性は、受容体のリラキシンによる活性化後のｃＡＭＰ産生を測定することによって決定されてもよい。リラキシン誘発性のｃＡＭＰ生成の検出のための方法は、当技術分野において知られている。このような方法としては、ｃＡＭＰ ＥＬＩＳＡ、ＨＴＲＦ ｃＡＭＰアッセイ及びＨｉｔＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイが含まれる。いくつかの実施形態では、リラキシン活性は、例えば、実施例３で実施されるようなＨＴＲＦ ｃＡＭＰアッセイによりリラキシン誘導ｃＡＭＰ産生を測定することによって決定される。リラキシン活性はまた、受容体のリラキシンによる活性化後の一酸化窒素（ＮＯ）産生を測定することによって決定されてもよい。リラキシン活性はまた、受容体のリラキシンによる活性化の下流の分子の活性化を測定することによって決定されてもよい。たとえば、リラキシン活性は、ｐ４２／４４ ＭＡＰＫの活性化を測定することによって決定されてもよい。

その代わりに又はそのうえ、リラキシン活性は、既知のリラキシン標的遺伝子の活性化を測定することによって決定されてもよい。たとえば、リラキシン活性は、ＴＨＰ－１細胞における既知のリラキシン標的遺伝子、ＶＥＧＦの転写の活性化を測定することによって決定されてもよい。遺伝子の転写の活性化を決定する方法は、当技術分野において知られており、ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ分析を含む。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現は、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．４：１９５３において記載されるように、リラキシンとのＴＨＰ－１細胞のインキュベーション後にＶＥＧＦ転写物の定量リアルタイムＰＣＲ誘発によって測定することができる。

その代わりに又はそのうえ、リラキシン活性は、リラキシンの１つ以上の下流の効果を測定することによって決定されてもよい。たとえば、心肥大の低下は、心エコー法、標準的な方法による体重及び／又は下腿長に比べた左心室重量によって測定することができる。別の実施例では、リラキシン活性は、マッソン三色染色法によって線維症低下を測定することによって決定されてもよい。別の実施例では、リラキシン活性は、線維化促進性（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）因子（ＴＧＦ－ベータなど）の阻害、線維芽細胞増殖及び分化の阻害、並びに／又はＭＭＰ媒介性の細胞外マトリックス分解の活性化などのような結合組織代謝の変化を測定することによって決定されてもよい（Ｂａｔｈｇａｔｅ ＲＡ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｖ．９３（１）：４０５－４８０）。

いくつかの実施態様では、リラキシン活性は、例えば実施例７で実施されるように、イソプロテレノール誘発性心肥大（脛骨長に対する心臓重量として測定される）及び線維化（心臓重量に対するコラーゲン含有量として測定される）の回復を測定することにより決定される。

本発明のヘテロ二量体融合物の活性は、基準となるリラキシンタンパク質と比較して決定され得る。いくつかの実施形態では、基準リラキシンタンパク質は、組換えタンパク質である。好ましい実施形態では、基準リラキシンタンパク質は、成熟リラキシンタンパク質のリラキシンＡ鎖及びリラキシンＢ鎖のアレイを有するリラキシンタンパク質である。成熟リラキシンタンパク質のリラキシンＡ鎖及びリラキシンＢ鎖のアレイを有する組換えリラキシンは市販されている。例えば、組換えヒトリラキシン２、マウスリラキシン１及びＩＮＳＬ３は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である（それぞれ、カタログ番号６５８６－ＲＮ、６６３７－ＲＮ及び４５４４－ＮＳ）。

いくつかの実施形態では、基準となるリラキシンタンパク質は、本発明のヘテロ二量体融合物と同じリラキシンＡ鎖及びリラキシンＢ鎖を有する又は１０以下のアミノ酸、たとえば１つ若しくは２つのアミノ酸が、本発明のヘテロ二量体融合物のリラキシンＡ鎖及びリラキシンＢ鎖と異なる。ある実施形態では、基準となるリラキシン－２のＢ鎖の第１のアミノ酸は、Ｄであり、このアミノ酸は、本発明のヘテロ二量体融合物のリラキシンＢ鎖において欠失している。

基準リラキシンタンパク質は、以下：
（ｉ）組換えヒトリラキシン２（本明細書では、ＲＥＬＡＸ００１３と呼ばれる）；
（ｉｉ）組換えマウスリラキシン１（本明細書では、ＲＥＬＡＸ００１４と呼ばれる）；
（ｉｉｉ）リラキシンＡとリラキシンＢが単鎖に融合しており、且つＦｃが半減期延長Ｆｃ領域である、組換えＦｃ融合リラキシン２（本明細書では、ＲＥＬＡＸ００１０と呼ばれ、国際公開第２０１８／１３８１７０号パンフレットに記載されている）；
（ｉｖ）リラキシンＡとリラキシンＢが単鎖に融合しており、且つＦｃが半減期延長Ｆｃ領域である、組換えＦｃ融合リラキシン２（本明細書では、ＲＥＬＡＸ０００９と呼ばれ、国際公開２０１８／１３８１７０号パンフレットに記載されている）；
（ｖ）リラキシンＡとリラキシンＢが単鎖に融合されている、組換えＦｃ融合リラキシン２（本明細書では、ＲＥＬＡＸ０１２６と呼ばれ、国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレットに記載されている）；
（ｖｉ）リラキシンＡとリラキシンＢが単鎖に融合されている、組換えＦｃ融合リラキシン２（本明細書では、ＲＥＬＡＸ０１２７と呼ばれ、国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレットに記載されている）；並びに
（ｖｉｉ）リラキシンＡとリラキシンＢが単鎖に融合されている、組換えＦｃ融合リラキシン（本明細書では、ＲＥＬＡＸ０１２８と呼ばれ、国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレットに記載されている）
から選択することができる。

特に好ましい実施形態では、基準リラキシンタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０４０９０．１に開示されている成熟リラキシン２タンパク質のリラキシン２鎖 Ａ及びリラキシン２ Ｂ鎖のアレイを有するリラキシン２タンパク質である。

本発明のヘテロ二量体融合物は、それらが、基準となるリラキシンタンパク質の活性の少なくとも一部を示す場合、リラキシン活性を有すると考えられてもよい。たとえば、融合ポリペプチドは、それが、基準となるリラキシンタンパク質の活性の少なくとも約半分を有する場合、リラキシン活性を有すると考えられてもよい。本発明のヘテロ二量体融合物は、基準となるリラキシンタンパク質の活性に対する前記融合ポリペプチドの活性の比が、約１０^－５及び約１の間、約１０^－４及び約１の間、約１０^－３及び約１の間、約１０^－２及び約１の間、約１／５０及び約１の間、約１／２０及び約１の間、約１／１５及び約１の間、約１／１０及び約１の間、約１／５及び約１の間、約１／２及び約１の間である場合、リラキシン活性を有すると考えられてもよい。或いは、本発明のヘテロ二量体融合物は、基準リラキシンタンパク質の活性に対する前記融合ポリペプチドの活性の比が、約１～約１０^５、約１～約１０^４、約１～約１０^３、約１～約１００、約１～約５０、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、約１～約５、又は約１～約２であれば、リラキシン活性を有するとみなされ得る。

いくつかの実施形態では、基準リラキシンタンパク質のリラキシン活性に対するヘテロ二量体融合物のリラキシン活性は、約０．００１～約１０である。

リラキシン活性は、ＥＣ５０値として決定されてもよい。本明細書において使用されるように、用語「ＥＣ５０」（半有効濃度）は、ベースライン及び特定の暴露時間の後の最大値の間の中間の応答を誘発する治療用化合物の有効な濃度を指す。

ヘテロ二量体化ドメイン
本発明のヘテロ二量体融合物は、第１のヘテロ二量体化ドメイン及び第２のヘテロ二量体化ドメインを含む。好ましい実施形態では、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域に由来する。

用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義し、これは、インタクトな抗体のパパイン消化によって生成され得る。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によりＣＨ４ドメインを含む。

第１及び第２のＦｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及び／又はＣＨ３を含み得る。好ましい実施形態では、第１及び第２Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む。

Ｆｃ領域は、任意の種、好ましくはヒト（例えばヒトＩｇＧ）からの免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）に由来するものであってよい。Ｆｃ領域がＩｇＧに由来する実施形態では、Ｆｃ領域は、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）のＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１に由来し得る。好ましくは、第１及び第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する。他の実施形態では、第１及び第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４免疫グロブリンに由来する。

好ましい実施形態では、第１及び第２のＦｃ領域は、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異及び／又は修飾を含む。そのような修飾は、第１及び第２のＦｃ領域の各々への不斉相補的修飾の導入を含んでもよく、その結果、両方の鎖は互いに適合性となり、従って、ヘテロ二量体を形成することができるが、各鎖はそれ自身と二量体化することはできない。そのような修飾は、挿入、欠失、保存的及び非保存的置換並びに再構成を包含し得る。このような修飾の組込みによって、組換え細胞培養により産生されるヘテロ二量体の収率を、ホモ二量体などの他の不要な最終産物に比して増加させる方法を提供する。

第１及び第２のＦｃ領域は、当該技術分野において公知の任意のヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異及び／又は修飾を含み得る。修飾の組み合わせを用いて、抗体の安定性への影響を最小限に抑えながら、アセンブリの効率を最大化することができる。

「ノブインホール」法では、接触する残基の間に立体障害を導入することによりヘテロ二量体化が促進され得る。「突起」は、１つのＦｃ領域（「Ｆｃノブ」）の界面からの１つ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置換することによって生成される。大きな側鎖と同じか又は類似のサイズの補償「キャビティ」は、大きな側鎖を有するアミノ酸をより小さな側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン又はバリン）で置換することによって、他のＦｃ領域（「Ｆｃホール」）の界面に形成される。「ノブインホール」修飾は、例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（７）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ ＡＭ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（７）：６７７－６８１に詳述されている。

ヘテロ二量体を生成するために使用され得る他の修飾としては、限定されないが、２つのＦｃ領域間の好ましい静電相互作用を生成する修飾がある。例えば、１つ以上の正荷電アミノ酸を１つのＦｃ領域に導入してもよく、１つ以上の負荷電アミノ酸を他のＦｃ領域の対応する位置に導入してもよい。これに代わり又は加えて、Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を導入する突然変異を含むように修飾してもよい。これに代わり又は加えて、Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体形成をホモ二量体形成よりもエントロピー的及びエンタルピー的に有利にするために、鎖間の界面における親水性及び疎水性残基に対する１つ以上の修飾を含み得る。

従って、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異及び／又は修飾は、接触残基間に立体障害を生じさせ（例えば「ノブインホール」により）、２つのＦｃ領域間に好ましい静電相互作用を生成して、ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を導入し、且つ／又は２つのＦｃ領域間の界面で親水性残基及び疎水性残基を修飾する。

好ましい実施形態では、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異は、「Ｆｃノブ」及び「Ｆｃホール」突然変異である。好ましい実施形態では、「Ｆｃノブ」及び「Ｆｃホール」突然変異は、ＣＨ３ドメインに存在する。

いくつかの実施形態では、第１及び第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに由来し、ＣＨ３ドメインに突然変異を有する「ＦｃＸ」及び「ＦｃＹ」を含み、ここで、「ＦｃＸ」及び「ＦｃＹ」突然変異は、表２に記載される組み合わせ（又はそれらの保存的置換）から選択される。

好ましい実施形態では、「ＦｃＹ」は、突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ、又はそれらの保存的置換を有する「Ｆｃホール」であり、「ＦｃＸ」は、突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ、又はそれらの保存的置換を有する「Ｆｃノブ」であり、ここで、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。

「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」という用語は、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤに記載されているヒトｌｇＧ１ ＥＵ抗体のナンバリング方式を指す。本出願において参照されるアミノ酸位置はすべて、ＥＵインデックス位置を指す。

いくつかの実施形態では、第１のＦｃ領域は「Ｆｃホール」突然変異を有し、第２のＦｃ領域は「Ｆｃノブ」突然変異を有する。別の好ましい実施形態では、第１のＦｃ領域は「Ｆｃノブ」突然変異を有し、第２のＦｃ領域は「Ｆｃホール」突然変異を有する。

Ｆｃ領域が、野生型Ｆｃ領域に対して他のアミノ酸修飾をさらに含んでもよいことは理解されよう。Ｆｃ領域は、例えば、ＦｃＲｎに対するＩｇＧ分子の親和性を高めるように修飾することができる。国際公開第０２／０６０９１９号パンフレットは、１つ以上のアミノ酸修飾を有するＦｃ領域を含む修飾免疫グロブリンを開示し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。１つ以上のアミノ酸修飾を有するＦｃ領域を作製する方法は、当該技術分野において公知である。

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を低減又は消失させるための１つ以上のアミノ酸修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸修飾は、細胞傷害、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低減又は回避する。

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、ヘテロ二量体融合物の半減期を増加させるための１つ以上のアミノ酸改変を含み得る。

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、アミノ酸突然変異の以下の組み合わせ：
（ｉ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ、若しくはそれらの保存的置換；
（ｉｉ）Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｑ及びＫ３２２Ｑ、若しくはそれらの保存的置換；
（ｉｉｉ）Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓ、若しくはそれらの保存的置換；
（ｉｖ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｑ及びＫ３２２Ｑ、若しくはそれらの保存的置換；又は
（ｖ）Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓ、若しくはそれらの保存的置換
のうちの少なくとも１つを含み、ここで、アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃ領域は、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓ、若しくはそれらの保存的置換を含んでもよく、ここで、アミノ酸ナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである。

いくつかの実施形態において、「Ｆｃホール」突然変異を含むＦｃ領域は、配列番号３に記載の配列又はその変異体を有し、「Ｆｃノブ」突然変異を含むＦｃ領域は、配列番号４に記載の配列又はその変異体を有する。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｙ３４９に戻されたアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃを有する配列番号３変異体と、Ｓ３５４に戻されたアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃを有する配列番号４変異体とを含み、その結果、Ｆｃ領域は、安定化ジスルフィド結合を形成することができない。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３変異体及び／又は配列番号４変異体を含み、ここで、最初の５残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号６９）が修飾されている。いくつかの実施形態では、この領域は、配列ＤＫＴＨＴＡＣＰＰＣ（配列番号７０）で置換される。別の実施形態では、この領域は、配列ＧＧＡＧＧＡＣＰＰＣ（配列番号７１）で置換される。別の実施形態では、この領域は、配列ＡＣＰＰＣ（配列番号７２）で置換される。

別の実施形態では、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリンＦａｂ領域に由来する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは、ＣＨ１及びＣＬ領域を含む。Ｌ鎖及びＦｄ鎖を含むＦａｂ領域は、効率的なヘテロ二量体化を媒介することが見出されている（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ Ｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１２）：７０５０－７０５７）。従って、別の実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは、Ｌ鎖及びＦｄ鎖を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ鎖及びＦｄ鎖は、ヘテロ二量体化して、ジスルフィド架橋安定化ヘテロ二量体を形成する。

さらに別の実施形態では、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインは、ヘテロ二量化して、平行なコイルドコイルを形成する。ヘテロ二量体コイルドコイルは、例えばＡｒｏｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１４０６３に記載されている。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは、折り畳まれた望ましくないアセンブリの形成を防止するため、及び／又は平行コイルドコイルの形成を促進するためのアミノ酸突然変異及び／又は修飾を含む。

第１及び第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば、第１及び第２のＦｃ領域）は、半減期延長部分を形成し得る。従って、いくつかの実施形態では、本発明のヘテロ二量体融合物は、基準リラキシンと比較して長い半減期を有する。

本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、血漿中の融合タンパク質の濃度がその本来のレベルの５０％に低下するのにかかる時間を指すために用いられる。血漿中のタンパク質の「半減期」は、タンパク質のサイズ、その安定性、そのクリアランス速度、代謝回転速度、インビボタンパク質分解、身体又は特定の組織による吸収速度などの様々な要因に応じて変動し得る。タンパク質の半減期を決定する方法は、当該技術分野において公知であり、後述の実施例に記載されている。

本発明者らは、免疫グロブリンＦｃに由来する第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインを有する本発明のヘテロ二量体融合物が、マウスモデルにおいて少なくとも５時間の半減期を有することを明らかにした（実施例６参照）。比較すると、ＩＶ投与後のヒトリラキシン２の半減期は、約０．０９＋／－０．０４時間、即ち、ヒトでは５．４＋／－２．４分である（Ｃｈｅｎ ＳＡ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０（６）：８３４－８３８）。

長期の半減期は、安全で好都合な投薬スケジュールに従って治療用タンパク質が投与されるのを可能にするので、たとえば、より少ない用量をより低い頻度で投与することができるので、有利であることが認識されるであろう。さらに、より少ない用量の達成は、改善された安全性プロファイルの提供及び／又はインビボにおける多数の作用メカニズムの活性化などのような、さらなる利点をもたらしてもよい。

コネクター
リラキシンＡ鎖及びＢ鎖の一方又は両方は、コネクターポリペプチドによってそれぞれのヘテロ二量体化ドメインにつながれてもよい。いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖は、コネクターポリペプチドを介して第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）に連結され、リラキシンＢ鎖は、コネクターポリペプチドを介して第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）に連結される。

コネクターポリペプチドは、任意の適した長さ、例えば、長さが約６～４０アミノ酸、好ましくは長さが約６～２１アミノ酸であってよい。いくつかの実施形態では、コネクターポリペプチドは、長さが少なくとも６アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１１アミノ酸長、好ましくは少なくとも１６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コネクターポリペプチドは、長さが４０アミノ酸未満である。異なる又は同じ長さのコネクターポリペプチドを、本発明のヘテロ二量体融合物の各アームに使用することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコネクターポリペプチドは、２１アミノ酸の長さを有する。好ましい実施形態では、両方のコネクターポリペプチドは、２１アミノ酸の長さを有する。コネクターポリペプチドは、任意のアミノ酸配列を有してよい。異なる又は同一のアミノ酸組成のコネクターポリペプチドを、本発明のヘテロ二量体融合物の各アームに使用することができる。

いくつかの実施形態では、一方又は好ましくは両方のコネクターポリペプチドは、プロリン及びアラニンリピート（ＰＡ）ｘ（配列番号７３）を含み、好ましくは、ｘは、３～１５であり、好ましくは、コネクターポリペプチドは、１６アミノ酸を超える長さを有し、好ましくは、コネクターポリペプチドは、２１アミノ酸配列ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＧ（配列番号６）から構成される。

いくつかの実施形態では、一方又は好ましくは両方のコネクターポリペプチドは、Ｃｈｅｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されているようなグリシン及びセリンリピートを含む。いくつかの実施形態では、一方又は両方のコネクターポリペプチドは、モチーフ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７４）を含み、ここで、ｎは１～８であってよく、例えば、ｎは４である。いくつかの実施形態では、１つ以上のコネクターポリペプチドが、２１アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号５）から構成される。特定の実施形態では、両方のコネクターポリペプチドが、２１アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号５）から構成される。

いくつかの実施形態では、一方のコネクターポリペプチドは、本明細書に記載のプロリン及びアラニンリピートを含み、他方のコネクターポリペプチドは、本明細書に記載のグリシン及びセリンリピートを含む。

或いは、リラキシンＡ鎖及びＢ鎖の一方又は両方は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖などの合成コネクターポリペプチドによってそれぞれのヘテロ二量体化ドメインにつながれてもよい。従って、リラキシンＡ鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖などの合成コネクターを介して第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）につながれてもよく、リラキシンＢ鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖などの合成コネクターを介して第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）につながれてもよく、ここで、合成コネクターは、ヘテロ二量体化ドメイン（例えばＦｃ領域）に共有結合又は非共有結合で結合され得る。ＰＥＧ化、即ち、ＰＥＧポリマー鎖を分子に付着させるプロセスは、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。

安定性
本発明者らは、本発明のヘテロ二量体融合物が予想外に優れた物理的及び化学的安定性を有することを明らかにした。従って、いくつかの実施形態では、本発明のヘテロ二量体融合物は、基準リラキシンタンパク質と比較して優れた物理的及び／又は化学的安定性を有する。

リラキシンの物理的安定性は、実施例９のように例えばＨＰ－ＳＥＣによって純度及び凝集を測定することによって決定され得る。リラキシンの化学的安定性は、実施例９のように、例えばＬＣ－ＭＳにより、分子のフラグメント化及び修飾を測定することによって決定され得る。

驚くべきことに、本発明者らは、本発明のヘテロ二量体融合物が、（個別の融合ポリペプチドにおけるリラキシンＡ及びＢではなく）リラキシンＡ及びリラキシンＢが単鎖に融合されている組換えＦｃ融合リラキシンと比較して、優れた物理的及び化学的安定性を有することを明らかにした。国際公開第２０１３／００４６０７号パンフレットは、免疫グロブリンＦｃ領域に融合した組換え単鎖リラキシン融合ポリペプチド、例えば本明細書においてＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８と呼ばれる融合ポリペプチドを記載している。従って、いくつかの実施形態では、本発明のヘテロ二量体融合物は、ＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８と比較して、優れた物理的及び／又は化学的安定性を有する。

ヘテロ二量体融合物は、第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインに加えて、半減期延長部分を含み得る。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、タンパク質性半減期延長部分である。タンパク質性半減期延長部分は、免疫グロブリンのＦｃ領域、アルブミン結合ドメイン及び血清アルブミンからなる群から選択することができる。さらなる実施形態では、半減期延長部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖などのタンパク質又はペプチドではない化学物質である。

半減期延長部分は、第１又は第２のヘテロ二量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に付着させることができる。いくつかの実施形態では、半減期延長部分は、第１又は第２のヘテロ二量体化ドメインのＮ末端に付着させる。他の実施形態では、半減期延長部分は、第１又は第２のヘテロ二量体化ドメインのＣ末端に付着させる。半減期延長部分をヘテロ二量体融合に付着させる方法は、当該技術分野において公知である。例えば、半減期延長部分は、化学的結合又は組換え技術によって付着させることができる。半減期延長部分は、ヘテロ二量体融合物に直接又はコネクター（例えばコネクターポリペプチド）を介して付着させることができる。コネクターポリペプチドの使用は、融合ポリペプチドがＦｃ領域などのタンパク質性半減期延長部分を含む場合に特に適切であり得る。

例示的な実施形態
本発明のヘテロ二量体融合物は、様々なフォーマット及び／又は配列を有し得る。

用語「本発明の融合ポリペプチド」及び「本発明の融合ポリペプチド」は、リラキシンＡ鎖に融合した第１のヘテロ二量体化ドメイン、及び／又はリラキシンＢ鎖に融合した第２のヘテロ二量体化ドメインを指すために使用され得る。本発明の融合ポリペプチドは、組換え融合ポリペプチド、即ち、組換えＤＮＡ技術によって作製されたものであってもよい。

好ましい実施形態では、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＣ末端はリラキシンＡ鎖のＮ末端につながれ、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＣ末端はリラキシンＢ鎖のＮ末端につながれる。いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖ポリペプチド及び／又はリラキシンＢ鎖ポリペプチドは、遊離Ｃ末端を有する。

別の実施形態では、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＮ末端は、リラキシンＡ鎖のＣ末端につながれ、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＮ末端は、リラキシンＢ鎖のＣ末端につながれる。いくつかの実施形態では、リラキシンＡ鎖ポリペプチド及び／又はリラキシンＢ鎖ポリペプチドは、遊離Ｎ末端を有する。

本発明のヘテロ二量体融合物は、１つ以上のＦａｂをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体融合物は、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＮ末端に連結された１つのＦａｂと、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＮ末端に連結された第２のＦａｂとを含む。

本発明のヘテロ二量体融合物は、第２のリラキシンＡ鎖ポリペプチド又はその変異体と、第２のリラキシンＢ鎖ポリペプチド又はその変異体をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、第２のリラキシンＡ鎖ポリペプチド又はその変異体は、第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）のＮ末端につながれ、第２のリラキシンＢ鎖ポリペプチド又はその変異体は、第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）のＮ末端につながれ、任意選択で、この場合、第２のリラキシンＡ鎖は、コネクター（例えばコネクターポリペプチド）を介して第１のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第１のＦｃ領域）につなれ、第２のリラキシンＢ鎖は、コネクター（例えばコネクターポリペプチド）を介して第２のヘテロ二量体化ドメイン（例えば第２のＦｃ領域）につながれる。

従って、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体融合物のフォーマットは、以下：
（ｉ）ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ａ／ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ｂ（例えば、図１を参照）；
（ｉｉ）ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ｂ／ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ａ（例えば、図１を参照）；
（ｉｉｉ）Ａ－ｃｏｎ－ＦｃＸ／Ｂ－ｃｏｎ－ＦｃＹ（例えば、図１を参照）；
（ｉｖ）Ｂ－ｃｏｎ－ＦｃＸ／Ａ－ｃｏｎ－ＦｃＹ（例えば、図１を参照）；
（ｖ）Ｆａｂ－ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ａ／Ｆａｂ－ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ｂ（例えば、図１を参照）；
（ｖｉ）Ｆａｂ－ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ｂ／Ｆａｂ－ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ａ；
（ｖｉｉ）Ａ－ｃｏｎ－ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ａ／Ｂ－ｃｏｎ－ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ｂ（例えば、図１を参照）；
（ｖｉｉｉ）Ｂ－ｃｏｎ－ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ｂ／Ａ－ｃｏｎ－ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ａ；
（ｉｘ）ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ｂ－Ｌ－Ａ、及びＦｃＹ、任意選択でＦｃＹ－ｃｏｎ－Ｂ－Ｌ－Ａ（例えば、図１を参照）；
（ｘ）ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ｂ－Ｌ－Ａ、及びＦｃＸ、任意選択でＦｃＸ－ｃｏｎ－Ｂ－Ｌ－Ａ；
（ｘｉ）ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ａ－Ｌ－Ｂ、及びＦｃＹ、任意選択でＦｃＹ－ｃｏｎ－Ａ－Ｌ－Ｂ；並びに
（ｘｉｉ）ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ａ－Ｌ－Ｂ、及びＦｃＸ、任意選択でＦｃＸ－ｃｏｎ－Ａ－Ｌ－Ｂ
から選択され、
ここで、ＦｃＹは、「Ｆｃホール」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリンＦｃ領域であり、好ましくはアミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖを有するＣＨ３ドメイン、又はそれらの保存的置換を含み；
ＦｃＸは、「Ｆｃノブ」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有するＦｃ領域であり、好ましくはアミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗを有するＣＨ３ドメイン、又はそれらの保存的置換を含み；
「ｃｏｎ」は、コネクターポリペプチドであり；
Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体であり；
ＡはリラキシンＡ鎖又はその変異体であり；
Ｌは、好ましくは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６０）を有するリンカーポリペプチドである。

別の態様において、本発明は、以下：
（ｉ）Ｘ－Ｂ－Ｌ－Ａ及びＹ、任意選択でＹ－Ｂ－Ｌ－Ａ；又は
（ｉｉ）Ｙ－Ｂ－Ｌ－Ａ及びＸ、任意選択でＸ－Ｂ－Ｌ－Ａ
を含むヘテロ二量体融合物を提供し、
ここで、Ｘ及びＹは、本明細書に記載のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体、例えばリラキシン－２Ｂ鎖又はその変異体であり；
Ａは、リラキシンＡ鎖又はその変異体、例えばリラキシン－２Ａ鎖又はその変異体であり；
Ｌは、好ましくはアミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６０）を有するリンカーポリペプチドであり、
ここで、ＸはＹとヘテロ二量化し、ヘテロ二量体融合物は、リラキシン活性を有する。

さらに別の態様では、本発明は、以下；
（ｉ）Ｘ－Ａ－Ｌ－Ｂ及びＹ、任意選択でＹ－Ａ－Ｌ－Ｂ又は
（ｉｉ）Ｙ－Ａ－Ｌ－Ｂ及びＸ、任意選択でＸ－Ａ－Ｌ－Ｂ
を含むヘテロ二量体融合物を提供し；
ここで、Ｘ及びＹは、本明細書に記載のヘテロ二量体化ドメインであり；
Ａは、リラキシンＡ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ａ鎖又はその変異体であり；
Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ｂ鎖又はその変異体であり；
Ｌは、好ましくはアミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号６０）を有するリンカーポリペプチドであり、
ここで、ＸはＹとヘテロ二量化し、ヘテロ二量体融合物は、リラキシン活性を有する。

特に好ましい実施形態では、ヘテロ二量体融合物は、配列番号１１に記載の融合ポリペプチドＲｌｘ０１１ＤＤ及び配列番号２０に記載のＲｌｘ０１４ＤＤを含む。別の好ましい実施形態では、ヘテロ二量体融合物は、配列番号１７に記載の融合ポリペプチドＲｌｘ０１３ＤＤ及び配列番号１４に記載のＲｌｘ０１２ＤＤを含む。

本発明の態様では、表３に記載されるＦｃＸとＦｃＹの組み合わせから選択される融合ポリペプチドの組み合わせを含むヘテロ二量体融合物が提供される。

一態様において、配列番号１１及び配列番号２０に記載の融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体融合物が提供される。

別の態様では、配列番号１７及び配列番号１４に記載の融合ポリペプチドを含むヘテロ二量体融合物が提供される。

本発明の融合ポリペプチドは、当技術分野において知られている任意の方法によって生成されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、宿主細胞における、融合ポリペプチドをコードする核酸分子の組換え発現によって生成される。

当業者らに知られている方法は、本発明の核酸分子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。適したベクターは、たとえばプラスミド、ファージミド、ファージ、又はウイルスベクターを含む。

本発明の核酸分子を含有するベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移されてもよい。適した宿主細胞は、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞などのような哺乳動物細胞である。

トランスフェクトされた細胞は、本発明の融合ポリペプチドを産生するために、従来の技術によって培養されてもよい。

一旦、本発明の融合ポリペプチドが、たとえば組換え発現によって産生されたら、それは、当技術分野において知られている任意の方法によって精製されてもよい。例示的なタンパク質精製技術は、クロマトグラフィー（たとえばイオン交換、アフィニティー、及び／又はサイジングカラムクロマトグラフィー（ｓｉｚｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））、遠心分離法、並びに溶解度差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を含む。本発明は、任意選択で少なくとも１つの精製ステップによって、細胞培養物から分離された単離融合ポリペプチドを提供する。

治療法
本発明の融合ポリペプチドは、医薬組成物において提供されてもよい。

本発明の医薬組成物は、１つ以上の賦形剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において知られており、たとえば、その全体が本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｂｙ Ｊｏｓｅｐｈ Ｐ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）を参照されたい。

本発明は、疾患、障害、又は感染に関連する症状を予防する、治療する、又は寛解させるために、動物、特に哺乳動物、たとえばヒトに本発明の融合ポリペプチドを投与するステップを含む療法を包含する。

したがって、本発明の融合ポリペプチド又は医薬組成物は、たとえば、疾患又は障害を治療するために、療法において使用されてもよい。対象又はその必要がある患者に治療有効量の本発明の融合ポリペプチドを投与するステップを含む、疾患又は障害を治療するための方法もまた、提供される。使用又は方法は、野生型リラキシン分子の治療的に有効な投薬スケジュールよりも、本発明の融合ポリペプチドの服用の頻度が低い治療的に有効なスケジュールを行うステップを含んでいてもよい。

本発明の融合ポリペプチドは、心臓血管系疾患の治療において、たとえば心不全の治療に使用されてもよいことが理解されるであろう。

本明細書において使用されるように、用語「心不全」は、急性心不全、慢性心不全（ＣＨＦ）、及び急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）を含む。用語「心不全」はまた、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が軽度低下した心不全、又は駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）などのような、より詳細な診断を含んでいてもよい。

本発明の融合ポリペプチドはまた、腎疾患、肺疾患、並びに線維性の障害、たとえば、腎臓、心臓、肺、及び肝臓の線維性の障害の治療において並びに創傷治癒において使用されてもよい（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ ＯＤ（２００４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２５（２）：２０５－２３４）。本発明の融合ポリペプチドはまた、糖尿病患者におけるインスリン抵抗性の回復において使用されてもよい（Ｂｏｎｎｅｒ ＪＳ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ６２（９）：３２５１－３２６０）。本発明の融合ポリペプチドはまた、肺高血圧の様々な形態にも使用することができる。本発明の融合ポリペプチドはまた、動脈硬化、動脈弾性低下、動脈コンプライアンス及び伸展性の低下に起因する疾患又はその原因となる疾患にも使用することができ、そうした疾患として、高血圧、腎臓疾患、末梢動脈疾患、頸動脈及び脳血管疾患（即ち、脳卒中及び認知症）、糖尿病、末端臓器損傷をもたらす微小血管疾患、冠状動脈疾患、及び心不全が挙げられる。

本発明の融合ポリペプチド及び／又は医薬組成物は、対象又は患者への非経口投与に適している。いくつかの実施形態では、対象又は患者は、哺乳動物、特にヒトである。

野生型ヒトリラキシン－２は、インビボにおいて数分間の半減期を有する。結果として、それは、入院患者において連続静脈内注入によって投与されなければならず、血圧低下を含む重度の副作用を引き起こす。対照的に、本発明の融合ポリペプチド及び／又は医薬組成物の実施形態は、対象又は患者に、静脈内、皮下、又は筋肉内注射によってなどのように、注射によって投与されてもよいことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチド及び／又は医薬組成物は、皮下注射によって投与される。皮下注射によってなどのような注射による投与は、対象又は患者にとってより快適であるという長所及び病院の外で対象又は患者に投与する自由度を提供する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチド又は医薬組成物は、自己投与によって投与される。

いくつかの実施形態では、本発明の融合ポリペプチドは、野生型リラキシンと比較して、半減期の増加を有し、これは、モル濃度に基づいて、より低い全体的な暴露を可能にする。たとえば、本発明の融合ポリペプチドは、野生型リラキシンよりも低い頻度で投与されてもよく、したがって、より好都合な投薬スケジュールを提供する。

本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、本発明の医薬組成物及び説明書を含有するパッケージを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、単一用量バイアル又は容器施栓系（たとえば、あらかじめ充填されたシリンジ）において製剤される。任意選択で、そのような容器に、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する、政府機関によって指示された形態をした通知を添えることができ、この通知は、ヒト投与に対する、製造、使用、又は販売についての機関による承認を表わす。

本明細書において使用されるように、冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、１つの又は１つを超える（たとえば少なくとも１つの）、冠詞の文法上の目的語を指してもよい。

「約」は、一般に、測定法の性質又は精度を考慮すれば、測定される数量について許容される程度の誤差を意味してもよい。誤差の例示的な程度は、与えられた値又は値の範囲のパーセント（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％以内である。

１つ以上の特徴を「含む」として本明細書において記載される実施形態はまた、そのような特徴「からなる」対応する実施形態の開示と考えられてもよい。

本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」は、動物における、より詳細にはヒトにおける使用について、連邦政府若しくは州政府の規制機関によって承認されている又は米国の薬局方、欧州の薬局方、若しくは他の一般に認識されている薬局方に載っていることを意味する。

濃度、量、容量、パーセンテージ、及び他の数値は、範囲形式で本明細書において示されてもよい。そのような範囲形式は、単に便宜及び簡潔さのために使用され、範囲の限界として明示的に詳述される数値だけでなく、あたかもそれぞれの数値及び部分範囲が明示的に詳述されるかのように、その範囲内に包含される個々の数値又は部分範囲のすべてを含むことが柔軟に解釈されるべきであることもまた、理解されるべきである。

上記の実施形態は、例証となる実施例として理解されるべきである。さらなる実施形態が、想定される。任意の１つの実施形態に関して記載されるいかなる特徴も、単独で又は記載される他の特徴と組み合わせて使用されてもよく、また、任意の他の実施形態又は任意の他の実施形態の任意の組み合わせの１つ以上の特徴と組み合わせて使用されてもよいことが理解されるべきである。さらに、上記に記載されない等価物及び変更もまた、添付の請求項において定義される本発明の範囲から逸脱することなく用いられてもよい。

本開示に関連して、本明細書において記載される融合ポリペプチド及び方法の他の例及び変形は、当業者に明らかになるであろう。他の例及び変形は、添付の請求項において述べられるように、本開示の範囲内にある。

本明細書において引用されるすべての文献は、引用される文献において示されるデータ、表、図、及び原文をすべて含め、それぞれ、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。

実施例１：組換えヘテロ二量体Ｆｃリラキシン２融合タンパク質の作製
本明細書に記載のＦｃリラキシン２融合タンパク質は、リラキシン２の鎖Ａ及びＢの正しい折り畳み及びヘテロ二量体化を誘導するように、ノブインホールＦｃドメイン（Ｆｃノブ及びＦｃホール）のヘテロ二量体化特性を使用して設計されている。

より正確には、図１に示すように、リラキシン２鎖Ａ及びＢは、コネクターを介して２つの相補的なＦｃ（ＦｃのＮ末端及び／又はＣ末端）に遺伝的に融合されている。次に、ＣＨＯ細胞を、単一のＦｃ－リラキシン鎖（Ａ及び／又はＢ）の各々を含む２つの発現ベクターで共トランスフェクトした。２つの相補的なＦｃ部分は、ＣＨＯ細胞内でアセンブリングするため、リラキシン２のアセンブリ及び正しい折り畳みを容易にする。以下の実施例２に示すように、続いて、相補的なＦｃ鎖の間及び鎖Ａと鎖Ｂとの間にジスルフィド結合が形成され、天然のリラキシン２構造を再構築する。

ヘテロ二量体Ｆｃリラキシン２融合タンパク質が上清中に分泌されたら、アフィニティークロマトグラフィーによる自動システムを用いて精製し、ここで、タンパク質のＦｃ領域がカラムマトリックスに結合する。

実施例２：Ｆｃリラキシン２ノブインホールヘテロダイマーのＬＣ－ＭＳ分析
ＬＣ－ＭＳ分析は、非還元及び還元脱グリコシル化Ｆｃ－リラキシン２ヘテロ二量体の両方について実施した。脱グリコシル化のために、サンプルを１ｍｇ／ｍｌに希釈し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌを用いてｐＨ７．８０で緩衝した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｒｏｃｈｅ）を５０μｇのＦｃ－リラキシン２につき１単位の酵素の濃度でサンプルに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。非還元分析の場合、サンプルを水で０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈し、２０μＬをプレスリットキャップ付きのＬＣ－ＭＳ認定全回収バイアル（Ｗａｔｅｒｓ部品番号：１８６００５６６３ＣＶ）に充填した。還元分析の場合、１０ｍＭ ＴＣＥＰを添加し、分析前にサンプルをさらに３７℃で３０分間インキュベートした。

実験は、Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ計器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に接続したＡＣＱＵＩＴＹ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣを用いて実施し、いずれも、ＵＮＩＦＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して操作した。ＬＣシステムの場合、溶媒Ａは０．１％ギ酸を含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ギ酸を含むアセトニトリルであった（いずれもＵＰＬＣ－ＭＳグレード、ＢｉｏＳｏｌｖｅ）。ＵＶ検出器は、２２０ｎｍ及び２８０ｎｍの波長で測定するように設定し、４℃の温度を維持したサンプルチャンバー内に、バイアルを配置した。逆相ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４カラム、３００Å孔径カラム（Ｗａｔｅｒｓ部品番号：１８６００４４９５）に体積１μＬを注入し、６分かけて５％から７５％に増加する溶媒Ｂの勾配を用いて、タンパク質を溶出した。

質量分析計は、５０％２－プロパノールに２μｇ／μＬのヨウ化ナトリウムを注入することにより５００～５０００ｍ／ｚから較正し、ｌｏｃｋｓｐｒａｙは、２００ｐｇ／μＬのロイシンエンケファリンであった。計器は、下記キー設定値を用いて、正イオン化モード及び感度解析器モードで作動させた：キャピラリー電圧＝３．０Ｖ；サンプルコーン電圧＝４０Ｖ；ソース温度＝１２０℃；脱溶媒温度＝４５０℃；コーンガス流量＝１２０Ｌ／ｈ；脱溶媒ガス流量＝１０００Ｌ／ｈ；質量範囲＝５００～５０００ｍ／ｚ、スキャン時間＝１．０秒。

データは、ＵＮＩＦＩソフトウェアで処理した。目的のタンパク質が溶出したクロマトグラムにおける保持時間からスペクトルを合わせた。生データを背景減算し、高分子のＭａｘＥｎｔ１アルゴリズムを使用してデコンボリューションした。実験データを、非還元分析のためのジスルフィド結合と還元分析のための遊離システインを考慮に入れた理論シーケンスの質量と比較した。ＰＮＧａｓＥ Ｆ脱グリコシル化後には、アスパラギンの脱アミド化（＋１Ｄａ）も考慮した。

相補的なＦｃ鎖の間及び鎖Ａと鎖Ｂの間にジスルフィド結合が形成され、天然のリラキシン－２構造が再構築されていることをＬＣ－ＭＳ分析により確認した。図２Ａは、例として、ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３のＬＣ－ＭＳデータを示す。非還元分析では、ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３についてそれぞれ５８９３２Ｄａ及び５９３６１Ｄａの予想される質量を有するヘテロ二量体の形成が確認され：ホモ二量体は検出されなかった。縮小分析（図２Ｂ）によって、両方の鎖の配列同一性を確認し、それらに修飾がないことが判明した。

ジスルフィド結合を同定するための非還元ペプチドマッピング
ヘテロ二量体Ｆｃ－リラキシン（５０μｇ）を清浄なサンプルチューブに入れ、１７μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０で希釈した。０．５μＬの５ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドを添加した後、室温で２０分間インキュベートすることによって、遊離システインのアルキル化を達成した。アルキル化の後、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーをさらに２．５μＬ添加し、次いで２．５μＬの塩化ナトリウムを加えた。４０μＬの８．０ＭグアニジンＨＣｌの添加によりタンパク質を変性させ、３７℃で３０分間インキュベートした。希釈は、１２５μＬの１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０の添加、続いて０．５μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡの添加によって達成した。エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に再構成し、５μＬをＦｃ－リラキシン２に添加した。消化は３７℃で２時間行い、その後さらに５μＬのＬｙｓ－Ｃを添加し、さらに２時間インキュベーションを続けた。ペプチド分析のために、４２．５μＬのサンプルをＵＰＬＣバイアルに移し、２．５μＬの水を加えた。ジスルフィド結合の還元のために、２．５μＬの５００ｍＭ ＤＴＴを別の４２．５μＬアリコートのサンプルに添加し、室温で１５分放置した後、ＬＣ－ＭＳ分析を実施した。

ペプチドの分析は、Ｘｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ計器（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）に接続されたＡＣＱＵＩＴＹ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣを用いて実施し、いずれも、ＵＮＩＦＩ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して操作した。ＬＣシステムの場合、溶媒Ａは０．１％ギ酸を含む水であり、溶媒Ｂは０．１％ギ酸を含むアセトニトリルであった（いずれもＵＰＬＣ－ＭＳグレード、ＢｉｏＳｏｌｖｅ）。ＵＶ検出器は、２１４ｎｍの波長で測定するように設定し、４℃の温度を維持したサンプルチャンバー内に、バイアルを配置した。逆相ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８ ３００Å孔径カラム（Ｗａｔｅｒｓ部品番号：１８６００３６８７）に体積１０μＬを注入し、７３．５分かけて５％から３７％に、さらに２．５分で６０％Ｂに増加する溶媒Ｂの増加勾配を用いて、タンパク質を溶出した。７７．５分後、カラムを９５％Ｂで５分保持した。

質量分析計は、５０％２－プロパノールに２μｇ／μＬのヨウ化ナトリウムを注入することにより１００～２６００ｍ／ｚから較正し、ｌｏｃｋｓｐｒａｙは、２００ｐｇ／μＬのロイシンエンケファリンであった。計器は、下記キー設定値を用いて、正イオン化モード及び感度解析器モードで作動させた：キャピラリー電圧＝３．０Ｖ；サンプルコーン電圧＝２５Ｖ；ソース温度＝１００℃；脱溶媒温度＝２５０℃；コーンガス流量＝０Ｌ／ｈ；脱溶媒ガス流量＝５００Ｌ／ｈ；質量範囲＝１００～２６００ｍ／ｚ、スキャン時間＝０．５秒。

予想されるジスルフィド結合を有する配列をインポートし、一致するＬｙｓ－Ｃ生成ペプチドの検索を実行することによって、データをＵＮＩＦＩソフトウェアで処理した。還元剤の非存在下及び存在下で得られたクロマトグラムを重ね合わせて、同定されたジスルフィド結合ペプチドが一度還元されるともはや観察されなくなったことを確認した。

図３の上部に描かれているように、鎖Ａ及びＢの両方を組み込んだジスルフィド結合リラキシン２ペプチドの予測質量と一致するペプチドを同定した（ＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳＱＬＹＳＡＬＡＮＫＣＣＨＶＧＣＴＫ＝ＬＣＧＲＥＬＶＲＡＱＩＡＩＣＧＭＳＴＷＳ＝ＲＳＬＡＲＦＣ（それぞれ配列番号７５～７７）、３つのジスルフィド結合６８３６．２３Ｄａを含む予測質量）。図３（Ａ～Ｄ）は、ＲＥＬＡＸ００１９に対するこのペプチドの同定と、還元剤を添加したときにペプチドが観察されなくなったことの確認を示し：パネルＡ及びＢは、ＤＴＴの非存在下及び存在下での抽出イオンクロマトグラムを示し、パネルＣ及びＤは、ペプチドの対応するマススペクトルを示す。図３（Ｅ～Ｈ）は、ＲＥＬＡＸ００２３についての同じペプチドの同定と、還元剤を添加したときにペプチドが観察されなくなったことの確認を示し：パネルＥ及びＦは、ＤＴＴの非存在下及び存在下での抽出イオンクロマトグラムを示し、パネルＧ及びＨは、ペプチドの対応するマススペクトルを示す。これらのデータは、リラキシン鎖Ａ及びＢがヘテロ二量体ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３内のジスルフィド結合を介して相互作用していることを裏付けるものである。

実施例３：Ｆｃ－リラキシン２融合タンパク質のインビトロ活性（細胞ベースのｃＡＭＰ活性アッセイ）
前述のようにして生成したリラキシン２融合ポリペプチドを、以下の方法により、生物学的活性、例えば１つ以上の細胞受容体応答の刺激について試験した。

ＣＨＯ細胞で作製されたヒト又はマウス受容体を発現する安定な細胞株をＤｉｓｃｏｖｅｒＸから購入した。
－ ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標） ＣＨＯ－Ｋ１ ＲＸＦＰ１ Ｇｓ細胞株（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸカタログ番号９５－０１２７Ｃ２）
－ ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標） ＣＨＯ－Ｋ１ ＲＸＦＰ２ Ｇｓ細胞株（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸカタログ番号９５－０１４０Ｃ２）
－ ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標） ＣＨＯ－Ｋ１ ｍＲＸＦＰ１ Ｇｓ細胞株（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸカタログ番号９５－０１８０Ｃ２）
これらの受容体の活性化は、機能活性アッセイにおいて測定することができるｃＡＭＰセカンドメッセンジャーの下流の産生をもたらす。

通常のｃＡＭＰアッセイを、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ベースのアッセイバッファー：０．１％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ９４１８）及び０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｉ７０１８）を補足し、１Ｍ ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調整したハンクス液（Ｓｉｇｍａ ＃Ｈ８２６４）を使用して実行した。関心のある受容体を発現する細胞の冷凍クライオバイアルを、ウォーターバスにおいて速やかに解凍し、あらかじめ温めた細胞培地に移し、５分間２４０ｘｇで回転させた。細胞を、最適化濃度（たとえば３．３３×１０^４細胞／ｍｌのｈＲＸＦＰ１）で細胞培地中に再懸濁し、及び３０μＬ細胞懸濁液を、ポリ－Ｄ－リシンコーティング３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃７８１９４６）に追加し、一晩接着させた。翌日、培地をプレートから軽く払い落とし、５μＬアッセイバッファーと交換した。試験組換えペプチド又はＦｃ融合サンプルの１１段階連続希釈液を非接触液体ディスペンサー（ＥＣＨＯ（商標）、Ｌａｂｃｙｔｅ）を使用して細胞に追加した。サンプル希釈液はすべて、二通り作製した。さらなる５μＬアッセイバッファーを、それぞれのウェルに追加し、プレートを３０分間室温でインキュベートした。

ｃＡＭＰレベルは、メーカーの推奨どおり２段階のプロトコルに従って市販で入手可能なｃＡＭＰ ｄｙｎａｍｉｃ Ｇ_Ｓ ＨＴＲＦ ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｃａｔ ＃６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用して測定した。手短に言えば、抗ｃＡＭＰクリプタート（ドナーフルオロフォア）及びｃＡＭＰ－ｄ２（アクセプターフルオロフォア）を、キットにおいて提供されるコンジュゲート＆溶解バッファー中でそれぞれ１／２０に希釈することによって別々に用意した。５μＬ抗ｃＡＭＰクリプタートをアッセイプレートのすべてのウェルに追加し、５μＬ ｃＡＭＰ－ｄ２を、非特異的結合（ＮＳＢ）ウェル以外のすべてのウェルに追加し、これらにはコンジュゲート及び溶解バッファーを追加した。プレートを１時間室温でインキュベートし、次いで、３２０ｎｍの励起波長及び６２０ｎｍ＆６６５ｎｍの放射波長を使用してＥｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。データは、メーカーのガイドラインにおいて記載されるように、％Ｄｅｌｔａ Ｆに変換し、次いで、最大天然アゴニスト応答に対する活性化パーセントに変換し、ＥＣ_５０値を決定するために４パラメーターロジスティックフィットによって分析した。これらの結果を、ｈＲＸＦＰ１細胞の場合の組換えｈＲｅｌａｘｉｎ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ ＃６５８６ ＲＮ）、ｍＲＸＦＰ１細胞の場合のｍＲｅｌａｘｉｎ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ ＃ ６６３７ ＲＮ）、及びｈＲＸＦＰ２細胞の場合のＩＮＳＬ３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ ＃ ４５４４ ＮＳ）の対応する結果と比較する。

データ解析は、統計解析ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ、Ｖ６）を用いて行った。

試験した構築物の生物学的活性を表４及び図４に記載する。いくつかのアッセイからの組換えヒトリラキシン２及び融合ポリペプチドの両方についての平均ＥＣ５０測定値を表４に要約した。

ＲＥＬＡＸ００１３、ＲＥＬＡＸ００１４及びＲＥＬＡＸ００１０は、基準となるタンパク質であり、ここで、ＲＥＬＡＸ００１３は、組換えヒトリラキシン２であり、ＲＥＬＡＸ００１４は、組換えマウスリラキシン１であり、ＲＥＬＡＸ００１０は、鎖Ａ、１５アミノ酸のリンカー、鎖Ｂ、１５アミノ酸のコネクター、及びＦｃを含む一本鎖融合タンパク質であり、国際公開第２０１８／１３８１７０号パンフレットに記載される配列番号８のアミノ酸配列を含む。

表４に示された結果から、試験したヘテロ二量体Ｆｃリラキシン融合タンパク質は、一本鎖融合ＲＥＬＡＸ００１０又は組換えヒトリラキシン２ペプチドよりも効力は低いが、依然として高レベルの生物学的活性（ヒトＲＸＦＰ１細胞株では、約１０ｐＭ～約８０ｐＭ）を保持していたと結論付けることができる。

これらの結果は、リラキシンＡ鎖とＢ鎖が、ヘテロ二量体Ｆｃの一／両末端（リラキシン鎖のＮ若しくはＮ末端にコネクターを付着させることができる）及びいずれかの鎖（Ｘ又はＹ）に融合されて、生物学的活性を保持できることを示している。従って、本明細書に記載されるヘテロ二量体Ｆｃリラキシン融合タンパク質のフォーマットは、長い半減期で活性のリラキシンを生成するための頑強なフォーマットを構成する。

ヘテロ二量体Ｆｃを安定化させるためのジスルフィド結合の存在は、融合タンパク質の効力に影響しなかった（ＲＥＬＡＸ００２３とＲＥＬＡＸ００２１、及びＲＥＬＡＸ００２４とＲＥＬＡＸ００２２を比較）。

使用した２つの上部ヒンジ領域（ＧＧＡＧＧＡ（配列番号７８）及びネイティブＤＫＴＨＴ（配列番号７９））は効力に影響しなかった（ＲＥＬＡＸ００２３とＲＥＬＡＸ００１９、及びＲＥＬＡＸ００２４とＲＥＬＡＸ００２０を比較）。上部ヒンジの正確なアミノ酸配列は、融合タンパク質の活性にとって重要ではない。

実施例４：ヘテロ二量体リラキシン２ Ｆｃ融合タンパク質におけるコネクター組成及び長さの影響
コネクターは、グリシン及びセリン残基（ＧＳ）で構成することもできるし、又はプロリン及びアラニンリピート（ＰＡ）で構成することもできる。ここで使用されるコネクターは、６～２１残基の長さを有した。長いＧＳコネクターの例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ（配列番号５）（２１アミノ酸）である。長いＰＡコネクターの例は、ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＧ（配列番号６）（２１アミノ酸）である。異なる長さ及び組成のコネクターを、ヘテロ二量体リラキシン２ Ｆｃ融合ポリペプチドの各Ｆｃ鎖上に配置することができる。

種々のコネクターを有するヘテロ二量体リラキシン２ Ｆｃ融合タンパク質の例を表５に示す。この表には、発生性／製造可能性（細胞培養上清からのプロテインＡ捕捉後の単量体／非凝集リラキシン－２ Ｆｃ融合タンパク質の発現収率及びパーセンテージ）、並びに生物学的活性に関する情報も示される。

コネクターの長さ及び組成は、分子の発生性の側面に影響を与える。表５に示すように、１６アミノ酸以下のＰＡコネクターを有するヘテロ二量体リラキシン２ Ｆｃ融合ポリペプチドは、良好に発現しなかった。対照的に、２１残基長のＰＡコネクターは、発現収率を有意に増加させた。ＧＳコネクターを有する構築物の発現収率は、より一貫している。

短く、且つ非対称の（異なる）コネクターを有するヘテロ二量体リラキシン２ Ｆｃ融合タンパク質は、効力を保持した。生物学的活性の低下は、モノマー含有量の低い融合タンパク質（ＲＥＬＡＸ０１０９、ＲＥＬＡＸ０１１０及びＲＥＬＡＸ０１１１）でのみ観察された。

実施例５：リラキシン２配列の点突然変異
ヘテロ二量体Ｆｃリラキシン２融合タンパク質として、リラキシン一点突然変異アナログを作製した。表６は、効力及び好ましい発生性を保持したそのような分子の例を示す。

標的とされた天然残基は正荷電されており、タンパク質分解を被る傾向を有し得るが、リラキシンとその受容体への結合には関与しなかった。

例えば、Ｒ２２Ｘ類似体のヘテロ二量体Ｆｃリラキシン２融合タンパク質は、一貫して改善された発生性／製造可能性を有すると思われる。

表６に提示する結果は、リラキシン２鎖Ａのアミノ酸配列の幾分の変動性が、好ましい発生性を保持しながら、効力を失わずに、許容されることを実証するものである。

実施例６：Ｆｃ－リラキシン２融合タンパク質のＰＫプロファイル
リラキシン２融合ポリペプチドの薬物動態（ＰＫ）プロファイルは、リラキシンＥＬＩＳＡアッセイ及び／又はｃＡＭＰアッセイを使用して決定した。リラキシン２融合ポリペプチドは、６～１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、皮下（ＳＣ）及び／又は静脈内（ＩＶ）経路のいずれかにより、６ｍｇ／ｋｇで投与した。ＩＶ投与経路の場合、血清サンプルを、薬剤投与後５分、３０分及び６０分、続いて３時間及び／又は６時間及び／又は８時間並びに２４時間の時点で、その後、続けて最小１日間隔で、最大２１日時点まで収集した。ＳＣ投与経路の場合も同様のスケジュールに従ったが、最初の８時間以内の収集の頻度はより低く；例えば、最初のサンプルを３０分後に収集し、次に３時間、８時間、２４時間、３０時間、４８時間の時点で収集し、その後、続けて最小１日間隔で、最大２１日時点まで実施した。サンプルは、心臓穿刺によって血清チューブ中に収集し、室温で１５～３０分間保持した後、収集から３０分以内に１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。アリコートに分けたサンプルを＜－８０℃で保存し、後に、ＥＬＩＳＡ又はｃＡＭＰ活性アッセイにより検査した。

大部分の分子について、ＰＫサンプルは、抗ヒトＦｃキャプチャー及び抗ｈＲｅｌａｘｉｎ２検出（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｌａｘｉｎ－２ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃ ＤＲＬ２００のポリクローナルＨＲＰ標識抗体を使用）を用いてＥＬＩＳＡで検査したＲＥＬＡＸ００１０（国際公開第２０１８／１３８１７０号パンフレットに記載）を除き、抗ｈリラキシン２キャプチャー（プレコーティングされたＨｕｍａｎ Ｒｅｌａｘｉｎ－２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃ ＤＲＬ２００）及び抗ヒトＦｃ検出抗体（ＨＲＰで標識されたＡＵ００３）を用いてＥＬＩＳＡで検査した。両方のアッセイにおいて、捕捉抗体でコーティングしたプレートを、１００μＬ ＲＤ１－１９アッセイ希釈液で、室温にて１時間遮断した。５０μＬの標準物質又はサンプルを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした。サンプルを吸引し、ウェルをアッセイ洗浄バッファーで３回洗浄した。ＨＲＰ標識検出抗体をウェルあたり５０μＬ添加し、抗ヒトＦｃ特異的検出の場合はＰＢＳ／１％ＢＳＡで１：１０００に希釈し、又は抗ｈリラキシン２検出の場合は希釈せずに使用した。室温で１時間のインキュベーション、次に３回の洗浄の後、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＫＰＬ ５３－００－０３）を添加し、色の変化が起こったら、ウェル当たり５０μＬのＴＭＢ停止溶液（ＫＰＬ ５０－８５－０６）を添加して反応を停止した。

細胞ベースのｃＡＭＰ活性アッセイにおけるＰＫサンプルの生物学的活性
上に概説したように動物から収集された血清サンプルを、機能的リラキシン２を測定して、Ｆｃ－リラキシン２融合ポリペプチドの完全性を評価するために、生物学的活性について検査した。ＣＨＯ細胞で作製したヒトＲＸＦＰ１受容体を発現する安定な細胞株をＤｉｓｃｏｖｅｒＸから購入した。この受容体の活性化により、ｃＡＭＰセカンドメッセンジャーの下流産生が起こり、これは、機能的活性アッセイで測定することができる。

ｃＡＭＰアッセイは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ベースのアッセイバッファー：０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃Ａ９４１８）及び０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ＃Ｉ７０１８）を添加し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ ７．４に調整したハンクス平衡塩溶液（Ｓｉｇｍａ＃Ｈ８２６４）を用いて実施した。

リラキシン２融合ポリペプチド又は組換えリラキシン２ペプチド（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃６５８６－ＲＮ）の投与溶液をアッセイバッファーで希釈してから、非接触液体ディスペンサー（ＥＣＨＯ、Ｌａｂｃｙｔｅ）を用いて、４つのマトリックス濃度での１１点標準曲線を作成した。使用したマトリックスは、模擬投与された動物からのブランク血清であり、これは、細胞の添加を可能にするために必要な濃度の２倍の濃度でウェルに手で添加した。試験サンプルを血清チューブから３８４ウェルソースプレートに移し、これを、非接触液体ディスペンサー（ＥＣＨＯ、Ｌａｂｃｙｔｅ）により使用して、アッセイバッファーに４つの希釈液をセットアップした。すべてのサンプル希釈は二重繰り返して実施した。

ｈＲＸＦＰ１を発現する細胞の凍結クライオバイアルを水浴中で急速に解凍し、予熱した細胞培地に移し、２４０×ｇで５分間回転させた。細胞を８ｍＬ細胞培養培地に再懸濁させ、１０ｍＬ培養培地を含むＴ７５フラスコに播種し、一晩付着させた。翌日、アキュターゼを用いて細胞を剥離し、２４０×ｇで５分間スピンさせた。得られた細胞ペレットを最適な濃度で再懸濁し、コンビドロップディスペンサーを用いて、２．５μＬの細胞懸濁液をアッセイプレートの各ウェルに添加した。

ｃＡＭＰレベルは、市販のｃＡＭＰ ｄｙｎａｍｉｃ ２ ＨＴＲＦ ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｃａｔ＃６２ＡＭ４ＰＥＪ）を使用して、製造者の推奨に従い、２段階のプロトコルに従って測定した。手短には、抗ｃＡＭＰクリプテート（ドナーフルオロフォア）及びｃＡＭＰ－ｄ２（アクセプターフルオロフォア）は、キットに備え付けのコンジュゲート及び溶解バッファーでそれぞれ１／２０に希釈することによって別々に作製した。２．５μＬの抗ｃＡＭＰクリプテートをアッセイプレートの全ウェルに添加し、２．５μＬのｃＡＭＰ－ｄ２を、非特異的結合（ＮＳＢ）ウェルを除くすべてのウェルに添加し、コンジュゲート及び溶解バッファーを添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、３２０ｎｍの励起波長と、６２０ｎｍ及び６６５ｎｍの発光波長を用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。データを、製造者のガイドラインに記載されているように％デルタＦに変換し、標準曲線の線形部分からサンプル値を算出した。

結果及び結論
図５は、Ｆｃ－リラキシン２ポリペプチドをマウスにＩＶ投与した一連のインビボＰＫ実験からのデータの概要を示す。データは、５分の時点で正規化されている。

ＩＶ投与後のヒトリラキシン２の半減期は、約０．０９＋／－０．０４時間、即ちヒトでは５．４＋／－２．４分である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．１９９３）。組換えリラキシンＦｃ融合ポリペプチドはすべて、天然リラキシン－２と比較して半減期の改善を示している。リラキシンＡ鎖及びＢ鎖が異なるヘテロ二量体Ｆｃ鎖に連結されたＦｃ－リラキシンポリペプチド（ＲＥＬＡＸ００１９、ＲＥＬＡＸ００２３、ＲＥＬＡＸ００３４、ＲＥＬＡＸ００４６及びＲＥＬＡＸ０１１７により例示される）は、リラキシン鎖がリンカーで連結されたＦｃ－リラキシンポリペプチド（ＲＥＬＡＸ００１０及びＲＥＬＡＸ０００９により例示される）と比較して改善されたＰＫ特性を有する。しかしながら、リンカーを含む分子であるＲＥＬＡＸ００８８及びＲＥＬＡＸ０１２２はいずれも良好なインビボ安定性を示すことから、リラキシン鎖Ａとリラキシン鎖Ｂとの間の連結リンカーの存在が単独でＦｃ－リラキシンポリペプチドの迅速なインビボ排除に直接関連するわけではない。

この研究では予想外にも、ヘテロ二量体Ｆｃ－リラキシン融合ポリペプチド（ＲＥＬＡＸ００１９、ＲＥＬＡＸ００２３、ＲＥＬＡＸ００３４、ＲＥＬＡＸ００４６、ＲＥＬＡＸ０１１７、ＲＥＬＡＸ００８８及びＲＥＬＡＸ０１２２）はすべて、Ｆｃ－リラキシン融合ポリペプチドＲＥＬＡＸ００１０及びＲＥＬＡＸ０００９と比較して有意に改善された薬物動態特性を有する。

実施例７：ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３による、確立された肥大及び線維化の回復
ミニポンプ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）を介して、イソプロテレノールをＣ５７Ｂ６マウスに１０日間注入し、心肥大及び線維化を誘発した。同じ期間ビヒクルを注入したマウスをベースライン対照として使用した。１０日後、ミニポンプを取り外し、マウスは、ｒリラキシン２（５００ｕｇ／ｋｇ／日）を含有する新しいミニポンプを投与されるか、又はＲＥＬＡＸ００１９（２０ｍｇ／ｋｇ）若しくはＲＥＬＡＸ００２３（２０ｍｇ／ｋｇ）の２回の週１回（ＱＷ）皮下注射の最初の注射を受けた。１４日間の処置期間の後、マウスを犠牲にし、肥大及び線維化の分析のためにそれらの心臓を採取した。ビヒクルミニポンプの取り外し後に、ベースライン対照マウスから心臓を採取した。肥大は、脛骨の長さに対する心臓重量の尺度として決定され、線維化は、心臓重量に対するコラーゲン含有量の定量によって確認した。イソプロテレノールの注入は、このモデルにおいて肥大及び線維化の両方を有意に誘発した。ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３のＱＷ投与は、ｒリラキシン２の持続注入と同様に、イソプロテレノール誘発肥大をベースラインレベルにまで戻した。すべてのリラキシン処置はまた、心筋線維化を５０％超低減した。各グループについてＮ＝８。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１

組換えリラキシンＦｃ融合タンパク質ＲＥＬＡＸ００１９及びＲＥＬＡＸ００２３は、天然ｈリラキシン２と同様に、肥大及び線維化を回復させることができた（図６）。

実施例８：バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ＥＬＩＳＡを用いたＦｃ－リラキシン２タンパク質の非特異的結合の評価。
ＲＥＬＡＸタンパク質をＣＨＯ細胞に発現させ、前述のように精製した。モノクローナル抗体の非特異的結合を評価するために開発されたバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）ＥＬＩＳＡ（Ｒｅｆ：Ｈｏｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ ２０１２ ｍＡｂｓ ４：６，７５３－７６０）は、Ｆｃ－リラキシンポリペプチドの非特異的結合を決定するように改変され、この場合、「ＢＶスコア」（バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）プレートの吸光度／ブランクプレートの吸光度）を計算する代わりに、バックグラウンドに対するシグナルとして、バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）プレートとブランクプレートについて非特異的結合を別々に計算した（この場合、バックグラウンドは、Ｆｃ－リラキシンポリペプチドである）。この測定値を導入して、モノクローナル抗体と比較した場合の、コーティングされたプレートとコーティングされていない（ブランク）プレートの両方に対する一部のＦｃペプチドの非特異的結合の増加を反映させた。各タンパク質の調製物は、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ １４１９０－０８６）＋０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ９５７６）中１００ｎＭ又は１０ｎＭで作製し、５０ｍＭ炭酸ナトリウム中の１％バキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）抽出物（ＢＶプレート）又は５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ブランクプレート）のいずれかを５０μＬ／ウェルで、４℃にて一晩コーティングした９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＦプレートでのＥＬＩＳＡ アッセイで２回繰り返して使用した。ＰＢＳで洗浄した後、プレートを３００μＬ／ウェルのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで、室温にて１時間遮断し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ（バックグラウンド）又はＲＥＬＡＸタンパク質希釈物のいずれかを５０μＬ／ウェル添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡで１：５０００に希釈した検出抗体（抗ヒトＦｃ特異的－ＨＲＰ Ｓｉｇｍａ Ａ０１７０）を５０μＬ／ウェル添加した。サンプルを室温で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＨＲＰ基質であるＴＭＢ（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ＫＰＬ ５３－００－０３）を５０μＬ／ウェルで添加し、色の変化の後、５０μＬ／ウェルの０．５Ｍ硫酸を添加して反応を停止した。４５０ｎｍで吸光度を測定し、各サンプルについて非特異的結合を決定した。非特異的結合（バックグラウンドに対する結合倍率）は、Ｆｃリラキシン２タンパク質の存在下及びＦｃリラキシン２タンパク質の非存在下（バックグラウンド）での非特異的結合の比として定義した。１００ｎＭ又は１０ｎＭいずれかの２つの異なる濃度で試験したＦｃ－リラキシン２タンパク質のデータを表７に示す。

表７及び図７に示すように、ヘテロ二量体リラキシン２ Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＧＳコネクターを用いてリラキシン鎖をＣ末端に結合させると、より低い非特異的結合を示す。いくつかの非対称及びＰＡコネクター、特定の点突然変異及びＮ末端でのリラキシン鎖の配置は、特に、二価分子（ＲＥＬＡＸ０１１７）に関して、ブランクプレートとＢＶコーティングプレートの両方に対する非特異的結合を増加させる。特に高い非特異的結合を有する一部のＦｃ－リラキシンタンパク質は、高濃度（１００ｎＭ）及び低濃度（１０ｎＭ）の両方で、ＢＶコーティングプレートよりもブランクプレートに対して高い非特異的結合を示す。対照分子（リンカーを含有する二価ＲＥＬＡＸ０００９、ＲＥＬＡＸ００１０、ＲＥＬＡＸ０１２６、ＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８）はすべて、高い非特異的結合を示すが、ＲＥＬＡＸ０１２２の低い非特異的結合によって実証することができるように、リラキシンの鎖Ａ及びＢの間のリンカーの存在又は二価性のいずれもそれ自体では、高い非特異的結合を駆動しない。

実施例９：溶液中での安定性
高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）及び液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を用いて、ＲＥＬＡＸ００２３の安定性を評価し、ＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８と比較した。２８０ｎｍでの吸光度による検出を含むＨＰ－ＳＥＣを使用して、純度、凝集及びフラグメント化を測定することができる。分子を、最適化製剤組成物にバッファー交換した後、１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。すべてのサンプルをストレス温度条件（４０℃）に最大４週間配置した。１、２、及び４週間の時点で、サンプルを収集して、サイズ排除カラムに注入し、一定流量の水性移動相を用いて、均一濃度で溶出した。より大きな分子は、より小さな分子よりも多量にサイズ排除カラムの細孔から排除されるため、より早く溶出する。モノマーピークよりも早く溶出するピークは、凝集体として記録される。モノマーピークの後に溶出するピーク（緩衝剤関連ピークを除く）は、フラグメントとして記録される。結果は、純度パーセント；凝集体パーセント；及びフラグメントパーセントとして記録され、それらを図８に示す。ＲＥＬＡＸ００２３は、ＲＥＬＡＸ０１２８及びＲＥＬＡＸ０１２７のそれぞれ７．７％及び９．３％と比較して、純度減少率（％）が月当たりわずか０．１％と、最も安定な分子である。ＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８は、いずれも凝集の兆候を示したが、ＲＥＬＡＸ００２３の凝集体レベルは増加せず，物理的溶液の安定性が良好であることを示している。月当たり６．６％のフラグメント化を有するＲＥＬＡＸ０１２７、及び６．８％のＲＥＬＡＸ０１２８について、フラグメント化が純度減少の主な要因であると思われた。ＲＥＬＡＸ００２３は、月当たりわずか０．７％のフラグメント化率を有する。さらに、４０℃で４週間保存した後、ＲＥＬＡＸ０１２８の総ピーク面積は、２２４０３から１８２１６に減少し（１９％の減少）、ＲＥＬＡＸ０１２７は、２２２２５から１８８２３に減少した（１５％の減少）。この総ピーク面積の有意な喪失は、高いフラグメント化率と共に、これら２つの分子に伴う高い化学的分解の可能性を示した。この総面積の喪失が、これら２つの分子のクロマトグラムプロファイルに強い影響を与えたことを指摘しておく必要がある。これは、保存後の凝集体ピーク面積が明らかに増加したにもかかわらず、ＲＥＬＡＸ０１２８及びＲＥＬＡＸ０１２７が以前の時点と比較して４週間でより低い凝集体パーセントを示した理由を説明している。対照的に、ＲＥＬＡＸ００２３の総ピーク面積は、２１８２８から２１７６１へと０．０３％しか低下せず、ＲＥＬＡＸ０１２８及びＲＥＬＡＸ０１２７と比較して良好な安定性プロファイルを示している。

分子のフラグメント化は、還元質量分析を用いたＬＣ－ＭＳによってさらに検証され、これは、ＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８のフラグメントピークが４０℃での保存後に強度が増加することを示した（図９Ａ）。対照的に、ＲＥＬＡＸ００２３のフラグメントピークは、ストレス後も変化しなかった。還元条件下でのマススペクトルは、ＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８の経時的な変化も示し、これはより大きな質量へのピークのシフトと、より大きな不均一性を示すピークの広がりによって証明される（図９Ｂ）。対照的に、ＲＥＬＡＸ００２３のインタクトなマススペクトルは不変のままであり、変化が起こらなかったことを示している。この試験は、ＲＥＬＡＸ００２３が、ＲＥＬＡＸ０１２７及びＲＥＬＡＸ０１２８と比較して優れた物理的及び化学的安定性を有することを示している。

実施例１０：カニクイザルにおけるＲＥＬＡＸ００２３のＰＫプロファイル
カニクイザルにおけるＲＥＬＡＸ００２３の薬物動態（ＰＫ）プロファイルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによるイムノアッセイを用いて決定した。ＲＥＬＡＸ００２３を、１グループ当たり３匹ずつの４つのグループに無作為に割り当てられた計１２匹の雌カニクイザルに投与した。グループ１、２、及び３の動物には、それぞれ０．１、１、及び１０ｍｇ／ｋｇのＲＥＬＡＸ００２３ ＳＣを投与した。４群の動物には、ＲＥＬＡＸ００２３の１０ｍｇ／ｋｇＩＶボーラスを投与した。血清サンプルは、薬剤投与から０．２５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、７日、１４日及び２１日後に採取した。

アッセイプレートをヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体でコーティングし、グループ１～４の動物由来のカニクイザル血清と一緒にインキュベートした。プレートに結合したＲＥＬＡＸ００２３は、ＨＲＰを結合させた抗リラキシン抗体により検出された。カニクイザル血清をプレートに添加する前に１：１０に希釈した。１００％血清中の定量下限は０．０１０μｇ／ｍＬであり、定量上限は０．３００μｇ／ｍＬである。

結果及び結論
図１０は、単回用量後のカニクイザルにおけるＲＥＬＡＸ００２３の平均血清濃度－時間プロファイルを示す。単回用量をＳＣ投与した後、ＲＥＬＡＸ００２３は、０．０１～１０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で線形ＰＫを示した。Ｃ_ｍａｘの用量比例増加が観察された。平均Ｃ_ｍａｘ値は、０．１、１、及び１０ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量グループでそれぞれ０．４００、４．６９、３４．８μｇ／ｍＬであった。また、ＡＵＣ_{０－ｌａｓｔ}値の用量比例増加が、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇＳＣグループから観察された。平均ＡＵＣ_{０－ｌａｓｔ}値は、０．１、１、及び１０ｍｇ／ｋｇのＳＣ用量グループでそれぞれ２．０１、２５．５、１９３μｇ・日／ｍＬであった。全体として、ＲＥＬＡＸ００２３ ＰＫは、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲で線形であり、平均ＣＬ／Ｆは５１．０ｍＬ／日／ｋｇ、平均ｔ_１／２は３．０７日である。ＲＥＬＡＸ００２３のＳＣバイオアベイラビリティは、８８．２％と推定された。

Claims (37)

1. 以下：
   （ｉ）少なくとも１つのリラキシンＡ鎖ポリペプチド又はその変異体に連結された第１のヘテロ二量体化ドメインと；
   （ｉｉ）少なくとも１つのリラキシンＢ鎖ポリペプチド又はその変異体に連結された第２のヘテロ二量体化ドメインと、
   を含むヘテロ二量体融合物であって、
   前記第１のヘテロ二量体化ドメインは、第２のヘテロ二量体化ドメインとヘテロ二量体化し、前記ヘテロ二量体融合物は、リラキシン活性を有する、ヘテロ二量体融合物。
2. 前記リラキシンＡ鎖ポリペプチドと前記リラキシンＢ鎖ポリペプチドが、少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合で結合されている、請求項１に記載のヘテロ二量体融合物。
3. 前記リラキシンＡ鎖と前記リラキシンＢ鎖が、アミノ酸リンカーによって互いに共有結合で連結されていない、請求項１又は２に記載のヘテロ二量体融合物。
4. 前記リラキシンＡ鎖が、リラキシン－２Ａ鎖であり、前記リラキシンＢ鎖が、リラキシン－２Ｂ鎖である、請求項１～３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
5. 前記リラキシンＡ鎖が、コネクターを介して前記第１のヘテロ二量体化ドメインにつながれ、前記リラキシンＢ鎖が、コネクターを介して前記第２のヘテロ二量体化ドメインにつながれ、任意選択で、一方又は好ましくは両方のコネクターは、ポリペプチドである、請求項１～４のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
6. 前記コネクターの一方又は好ましくは両方が、６～４０アミノ酸の長さを有し、例えば、コネクターの一方又は好ましくは両方が、２１アミノ酸の長さを有する、請求項５に記載のヘテロ二量体融合物。
7. 前記第１及び第２のヘテロ二量体化ドメインが、免疫グロブリンＦｃ領域（それぞれ、「第１のＦｃ領域」及び「第２のＦｃ領域」）に由来し、任意選択で、前記第１及び第２のＦｃ領域は、定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
8. 前記第１のＦｃ領域のＣ末端が、リラキシンＡ鎖のＮ末端につながれ、前記第２のＦｃ領域のＣ末端が、リラキシンＢ鎖のＮ末端につながれている、請求項７に記載のヘテロ二量体融合物。
9. 前記第１及び第２のＦｃ領域が、ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異及び／又は修飾を含み、任意選択で、前記ヘテロ二量体化促進アミノ酸突然変異は、「Ｆｃノブ（Ｋｎｏｂ）」及び「Ｆｃホール（Ｈｏｌｅ）」突然変異、例えば、ＣＨ３ドメインに存在する「Ｆｃノブ」及び「Ｆｃホール」突然変異である、請求項７又は８に記載のヘテロ二量体融合物。
10. 前記第１及び第２のＦｃ領域が、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに由来する、請求項７～９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
11. 前記ヘテロ二量体促進アミノ酸突然変異が、以下：
    ａ．一方のＣＨ３ドメインにおける「Ｆｃホール」突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ；並びに
    ｂ．他方のＣＨ３ドメインにおける「Ｆｃノブ」突然変異Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ
    を含み、
    ここで、前記アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、請求項１０に記載のヘテロ二量体融合物。
12. ａ．前記第１のＦｃ領域が、前記「Ｆｃノブ」突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域が、前記「Ｆｃホール」突然変異を含むか；又は
    ｂ．前記第２のＦｃ領域が、前記「Ｆｃノブ」突然変異を含み、前記第１のＦｃ領域が、前記「Ｆｃホール」突然変異を含む、請求項１１に記載のヘテロ二量体融合物。
13. 前記第１及び／又は第２のＦｃ領域が、前記アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３３１Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものである、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
14. 前記リラキシン－２Ａ鎖ポリペプチドが、配列番号１に記載の配列又はその変異体を含み、前記リラキシン－２Ｂ鎖ポリペプチドが、配列番号２に記載の配列又はその変異体を含む、請求項４～１３のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
15. 前記リラキシン－２Ａ鎖ポリペプチドが、アミノ酸突然変異Ｋ９Ｈ、Ｋ１７Ｍ又はＫ１７Ｉを含む、請求項１４に記載のヘテロ二量体融合物。
16. 両方のコネクターが、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ［配列番号５］を有する、請求項５～１５のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
17. 以下：
    （ｉ）ＦｃＸ－ｃｏｎ－Ａ融合ポリペプチドと；
    （ｉｉ）ＦｃＹ－ｃｏｎ－Ｂ融合ポリペプチドと、
    を含むヘテロ二量体融合物であって、
    Ａは、リラキシンＡ鎖又はその変異体、例えばリラキシン－２Ａ鎖又はその変異体であり；
    Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体、例えばリラキシン－２Ｂ鎖又はその変異体であり；
    ＦｃＹは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含むＦｃ領域であり、「Ｆｃホール」アミノ酸突然変異及び／又は修飾、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖを含み；
    ＦｃＸは、好ましくは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンの定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３を含む、「Ｆｃノブ」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有するＦｃ領域であり、「Ｆｃノブ」アミノ酸突然変異及び／又は修飾、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗを含み；
    ｃｏｎは、好ましくは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＳ［配列番号５］を有するコネクターポリペプチドであり、
    ここで、前記アミノ酸のナンバリングは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるものであり、また、ＦｃＸは、ＦｃＹとヘテロ二量体化し、前記ヘテロ二量体融合物は、リラキシン活性を有する、ヘテロ二量体融合物。
18. 前記ヘテロ二量体融合物が、配列番号１１のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドと、配列番号２０のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドとを含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
19. 前記ヘテロ二量体融合物が、１つ以上のＦａｂをさらに含み、任意選択で、前記ヘテロ二量体融合物は、前記第１のＦｃ領域のＮ末端に連結された１つのＦａｂと、前記第２のＦｃ領域のＮ末端に連結された第２のＦａｂとを含む、請求項８～１８のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
20. 前記ヘテロ二量体融合物が、前記第１のＦｃ領域のＮ末端につながれた第２のリラキシンＡ鎖ポリペプチド又はその変異体と、前記第２のＦｃ領域のＮ末端につながれた第２のリラキシンＢ鎖ポリペプチド又はその変異体をさらに含み、任意選択で、前記第２のリラキシンＡ鎖は、コネクターポリペプチドを介して前記第１のＦｃ領域につながれ、前記第２のリラキシンＢ鎖は、コネクターポリペプチドを介して前記第２のＦｃ領域につながれている、請求項８～１９のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
21. 以下：
    （ｉ）ＦｃＸ－Ｂ－Ｌ－Ａ及びＦｃＹ、任意選択でＦｃＹ－Ｂ－Ｌ－Ａ；又は
    （ｉｉ）ＦｃＹ－Ｂ－Ｌ－Ａ及びＦｃＸ、任意選択でＦｃＸ－Ｂ－Ｌ－Ａ；
    を含むヘテロ二量体融合物であって、
    ＦｃＹは、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖを有するＣＨ３ドメインを含む「Ｆｃホール」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリンＦｃ領域であり；
    ＦｃＸは、好ましくは、アミノ酸突然変異Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗを有するＣＨ３ドメインを含む「Ｆｃノブ」アミノ酸突然変異及び／又は修飾を有する免疫グロブリンＦｃ領域であり；
    Ｂは、リラキシンＢ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ｂ鎖又はその変異体であり；
    Ａは、リラキシンＡ鎖又はその変異体、例えばリラキシン２Ａ鎖又はその変異体であり；
    Ｌは、好ましくは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧ［配列番号６０］を有するリンカーポリペプチドであり、
    ここで、前記アミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスによるものであり、この場合、ＦｃＸは、ＦｃＹとヘテロ二量体化し、前記ヘテロ二量体融合物はリラキシン活性を有する、ヘテロ二量体融合物。
22. 前記リラキシンＢ鎖が、コネクター、任意選択で、６～４０アミノ酸の長さ、例えば２１アミノ酸の長さを有するコネクターポリペプチドを介して、ＦｃＸ及び／又はＦｃＹにつながれている、請求項２１に記載のヘテロ二量体融合物。
23. 基準リラキシンタンパク質のリラキシン活性に対する前記ヘテロ二量体融合物のリラキシン活性の比が、約０．００１～約１０である、請求項１～２２のいずれか１項に記載のヘテロ二量体融合物。
24. 請求項１～２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合物をコードする核酸分子。
25. 請求項２４に記載の核酸分子を含むベクター。
26. 請求項２５に記載のベクター又は請求項２４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
27. 請求項１～２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合物を産生するための方法であって、請求項２６に記載の宿主細胞を培養するステップ及び前記融合タンパク質を収集するステップを含む方法。
28. 請求項１～２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
29. 療法における使用のための請求項１～２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合物又は請求項２８に記載の医薬組成物。
30. 前記ヘテロ二量体融合物又は医薬組成物は、前記対象に投与される、心不全を有する対象の治療における使用のための、請求項１～２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合物又は請求項２８に記載の医薬組成物。
31. 前記ヘテロ二量体融合物又は医薬組成物は、皮下注射によって前記対象に投与される、請求項２９若しくは３０に記載の使用のためのヘテロ二量体融合物又は請求項２９若しくは３０に記載の使用のための医薬組成物。
32. 前記融合ポリペプチド又は医薬組成物は、自己投与によって投与される、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の使用のためのヘテロ二量体融合物又は請求項２９～３１のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物。
33. 請求項２８の医薬組成物を含むキット。
34. 疾患又は障害を有する対象を治療するための方法であって、請求項１～２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合物又は請求項２８に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
35. 心不全を有する対象を治療するための方法であって、請求項１～２３のいずれか一項に記載のヘテロ二量体融合物又は請求項２８に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
36. 前記ヘテロ二量体融合物又は医薬組成物は、皮下注射によって前記対象に投与される、請求項３４又は３５に記載の方法。
37. 前記ヘテロ二量体融合物又は医薬組成物は、自己投与によって投与される、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。

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