JP2023526926A - 改善された薬物動態特性を有する抗体変異体 - Google Patents

Abstract

本開示は、抗体の変異体であって、変異体抗体は、対応する非改変抗体と比較して改変された正味電荷特性を有する、抗体の変異体が提供される。特定の変異体は、対応する非改変抗体と比較して改善された薬物動態特性を有する。特定の抗体変異体はＣＤ４０に結合する。組成物およびその使用方法もまた提供される。

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年５月１８日に出願された米国仮出願第６３／０２６，４９９号の利益を主張し、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。２０２１年５月１６日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは２００８９６＿００１６＿ＷＯ－＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは２８１，５３８バイトである。

分野
本開示は、抗体の変異体であって、変異体抗体は、対応する非改変抗体と比較して改善された薬物動態特性を有する、抗体の変異体が提供される。場合によっては、抗体ポリペプチドはＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０アゴニスト活性を示さない。抗体を含む組成物、ＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための使用方法、およびＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための薬剤の調製における使用が提供される。

背景
バイオ医薬品分子は、しばしば治療効果、疾患への曝露、および／または安全性プロファイルを向上させることを目的とした改変実験の対象となる。抗体治療分子の場合、改変には、ヒト化、ペグ化、グリコシル化、およびアルブミンなどの分子への結合が含まれうる。

薬物動態（ＰＫ）とは、薬物が体内に入り、通過し、出て行く動きを指す。薬物動態は、薬物の効果の開始、持続時間、および強度を評価する。

抗体治療薬の薬物動態は、分子サイズ、折り畳みの安定性、溶解度、標的相互作用、胎児性Ｆｃ結合能、および電荷を含む広範囲の特性による影響を受け得る（例えば、Warnders et al.,2018, Med. Res. Rev.38:1837-1873;Leipold and Prabhu,2019, Clin. Transl. Sci.12:130-139を参照）。抗体の電荷の改変は、電荷依存性相互作用に影響を与えうる。例えば、タンパク質の塩基性／正電荷の増加（カチオン化）は、膜および細胞外マトリクスとのオフターゲット相互作用を増加させる可能性があり、薬物動態を低下させる傾向があるが、塩基性電荷パッチを有するタンパク質のアニオン化は一般にＰＫを向上させる。しかしながら、インビボでの挙動を意図的に調節するためのタンパク質改変は、タンパク質の多くの特性の相互依存性のために、意図しない好ましくない効果をもたらす可能性もある。したがって、ＰＫを調節するために抗体の電荷の改変を追求することは簡単ではなく、インテリジェントなタンパク質設計／エンジニアリング、および機能する変異を見つけるための実験が必要である。

ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する共刺激分子である。ＡＰＣは、ＣＤ４０がそのリガンドであるＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）とＴ_Ｈ細胞上で結合すると活性化される。ＣＤ４０を介したＡＰＣの活性化は、サイトカイン産生、共刺激分子（ＣＤ８６など）のアップレギュレーション、ならびに抗原提示およびＢ細胞増殖の強化を含む、様々な免疫応答に関与している。ＣＤ４０はまた、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および上皮細胞によっても発現され得る。

また、ＣＤ４０の活性化は、例えば、自己免疫、移植片拒絶反応、またはアレルギー反応に関連する様々な望ましくないＴ細胞反応にも関与している。望ましくないＴ細胞反応を制御するための戦略の１つは、アンタゴニスト抗体によりＣＤ４０を標的化することであり、これは、以前はＣｈｉｒｏｎ １２１２と呼ばれていたモノクローナル抗体ＨＣＤ１２２（ルカツムマブ）、完全ヒトドメイン抗体ＢＭＳ－９８６０９０（米国特許第９，４７５８７９号）などのいくつかの抗ＣＤ４０抗体の開発につながった。例えば、ＷＯ ２０１８／２１７９７６およびＷＯ ２０１８／２１７９８８も参照されたい。

概要
本開示は、抗体の変異体であって、変異体抗体は、対応する非改変抗体と比較して改善された薬物動態特性を有する、抗体の変異体が提供される。また、少なくとも１つの薬物動態特性を増加させる方法も提供される。本開示はさらに、対応する非改変親抗体と比較して同様な、または改善された薬物動態特性を有する抗ＣＤ４０モノクローナル抗体変異体を提供する。本開示はまた、対応する非改変抗体と比較して同様な、または改善された薬物動態を有する抗体変異体のインテリジェントな設計のための方法を提供する。

ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、抗体は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む第１のポリペプチド部分、および軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を含む第２のポリペプチド部分を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、以下から選択される：

単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト重鎖定常領域を含む第１のポリペプチド部分；およびヒト軽鎖定常領域を含む第２のポリペプチド部分を含み得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、（１）Ｆｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減させるＫａｂａｔ位置２３８における突然変異であって、プロリン２３８（Ｐ２３８）がリジン、セリン、アラニン、アルギニン、およびトリプトファンからなる群から選択される残基の１つに突然変異しており、抗体またはその抗原結合部分が低下したＦｃγＲ結合を有する、突然変異；または（２）Ｋａｂａｔ位置２９７における置換されたアラニン、のいずれかを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み得る。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分のいくつかの実施形態において、第１のポリペプチド部分は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含み、第２のポリペプチド部分は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含み、

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減させるＫａｂａｔ位置２３８における突然変異であって、プロリン２３８（Ｐ２３８）がリジン、セリン、アラニン、アルギニン、およびトリプトファンからなる群から選択される残基の１つに突然変異しており、抗体またはその抗原結合部分が低下したＦｃγＲを有する、突然変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み得る。例示的な抗体は、リジンに変異したＰ２３８を有していてもよい。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み得る：

単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２２または配列番号２３のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み得る。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｋａｂａｔ位置２９７に置換されたアラニンを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含んでいてもよい。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０の活性に拮抗し得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗体であり得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト化抗体であり得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含み得る。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、およびｓｃＦｖ－ＦＣからなる群から選択される抗原結合部分を含んでいてもよい。本明細書に記載の例示的な単離された抗体またはその抗原結合部分は、ｓｃＦｖ－Ｆｃである。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分は、治療薬に連結され得る。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分は、前記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結され得る。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分は、さらに追加の部位を含み得る。

単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子が、本明細書に開示される。核酸分子を含む発現ベクターが、本明細書に開示される。本明細書に開示の単離された抗体またはその抗原結合部分を発現できる発現ベクターで形質転換された細胞もまた開示される。また、抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、
ａ）本明細書に開示の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された細胞において、抗体またはその抗原結合部分を発現させること；および
ｂ）細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離すること
を含む方法も開示される。

また、ａ）本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分；およびｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を処置または予防する方法が提供される。さらに提供されるものは、対象における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防する方法であって、本明細書に開示の抗体または抗原結合部分を対象に投与することを含む方法である。抗体またはその抗原結合部分は、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と共に投与されてもよい。投与は同時または順次でありうる。同時投与のための例示的な薬剤は、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ－Ｉｇ（ベラタセプト）などのＣＴＬＡ４突然変異体分子である。

そのような対象における免疫応答を処置または予防する方法、ならびにそのような対象における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防する方法において、対象は、好ましくは、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、目の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組み換え医薬品（例えば、血友病患者の第ＶＩＩ因子）に対する免疫応答、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群より選択される疾患を有する。

また、医薬として使用するための、本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分も企図される。さらに企図されるものは、本明細書に開示の抗体もしくはその抗原結合部分、または処置を必要とする対象を処置するために使用するためのそれを含む医薬品である。さらに、免疫応答の処置または予防に使用するための治療有効量の本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分が企図され、抗体またはその抗原結合部分は、それを必要とする患者に投与するためのものである。

図１は、プロテインＡ捕捉抗体へのｈＣＤ４０結合の結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）対解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）（等親和性）プロットのグラフを示している。Ｘ軸は解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）（ｋｄ）、Ｙ軸は結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）（ｋａ）である；グラフは対数スケールである。野生型＝ＨＣ１／ＬＣ１抗体のデータ。ＨＣ１３塩基性変異体＝抗体ＨＣ１３／ＬＣ１、ＨＣ１３／ＬＣ２、ＨＣ１３／ＬＣ３、ＨＣ１３／ＬＣ４、ＨＣ１３／ＬＣ５、およびＨＣ１３／ＬＣ６のデータ。ＨＣ１１パッチ１＝抗体ＨＣ１１／ＬＣ１、ＨＣ１１／ＬＣ２、ＨＣ１１／ＬＣ３、ＨＣ１１／ＬＣ４、ＨＣ１１／ＬＣ５、およびＨＣ１１／ＬＣ６のデータ。ＨＣ１２パッチ１＝抗体ＨＣ１２／ＬＣ１、ＨＣ１２／ＬＣ２、ＨＣ１２／ＬＣ３、ＨＣ１２／ＬＣ４、ＨＣ１２／ＬＣ５、およびＨＣ１２／ＬＣ６のデータ。

図２は、可溶性ヒトＩＬ－４の存在下（＋ＩＬ－４ ２０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ－４の非存在下（培地）で、^３Ｈチミジン取り込みによって測定した、ヒトＢ細胞増殖のＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体による受容体活性化作用に関するデータを示している。これらのデータは、ドナーＮＡＢＶＨＪ－ＯＣ２ＰＶＳからのヒトＢ細胞を使用したものである。

図３は、ＩＬ－４の存在下（＋ＩＬ－４ ２０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ－４の非存在下（培地）で、^３Ｈチミジン取り込みによって測定した、ヒトＢ細胞増殖のＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体による受容体活性化作用に関するデータを示している。これらのデータは、ドナーＮＡＢＺＷＣ－０６９０６ＴからのヒトＢ細胞を使用したものである。

図４は、ＩＬ－４の存在下（＋ＩＬ－４ ２０ｎｇ／ｍｌ）またはＩＬ－４の非存在下（培地）で、^３Ｈチミジン取り込みによって測定した、ヒトＢ細胞増殖のＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体による受容体活性化作用に関するデータを示している。これらのデータは、ドナーＮＡＢＺＷＣ－０６９０６２からのヒトＢ細胞を使用したものである。

図５は、ドナーＮＡＢＶＨＪ－ＯＣ２ＰＶＳからのヒトＢ細胞を用いた、培地または＋ＩＬ－４（＋ＩＬ－４ ２０ｎｇ／ｍｌ）におけるＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体に関するヒトＢ細胞ＩＬ－６分泌のデータを示している。

図６は、ドナーＮＡＢＺＷＣ－０６９０６ＴからのヒトＢ細胞を用いた、培地または＋ＩＬ－４（＋ＩＬ－４ ２０ｎｇ／ｍｌ）におけるＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体に関するヒトＢ細胞ＩＬ－６分泌のデータを示している。

図７は、ドナーＮＡＢＺＷＣ－０６９０６２からのヒトＢ細胞を用いた、培地または＋ＩＬ－４（＋ＩＬ－４ ２０ｎｇ／ｍｌ）におけるＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体に関するヒトＢ細胞ＩＬ－６分泌のデータを示している。

図８は、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与でのＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体の単回投与薬物動態（ＰＫ）のデータを示している。

詳細な説明
本開示は、抗体の変異体であって、変異体抗体は、対応する非改変抗体と比較して改善された薬物動態特性を有する、抗体の変異体が提供される。ここに示されているように、表面電荷パッチを改変する突然変異の特定の部位または位置が、抗体ＰＫの改善に重要であることが見出された。ＰＫ改変を行うには単に総抗体電荷を改変することが必要であると先行技術が示唆していたことから、この発見は予想外である。有利なことに、場合によっては、全体的な電荷における小さな変化、例えば－２または－３を伴う１つまたは２つの戦略的な位置の突然変異のみを有する変異体が、複数の突然変異およびより大きな電荷変化、例えば－８を有する変異体と比較して、同等または改善されたＰＫを有する。

本開示は、ＣＤ４０に結合する抗体の変異体であって、変異体抗体は、対応する非改変抗体と比較して改善された薬物動態特性を有する、抗体の変異体をさらに提供する。抗体ポリペプチドはＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０アゴニスト活性を示さない。抗体を含む組成物、ＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための使用方法、およびＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための薬剤の調製における使用が提供される。

本開示の変異体抗体は、実施例１に記載の方法によって同定された。

定義＆略語
さらなる略語および定義が以下に提供される。
ＡＰＣ 抗原提示細胞
ＡＵＣ 曲線下面積
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣＤ５４ ＩＣＡＭ－１とも呼ばれる
ＣＤＲ 相補性決定領域
Ｃ_ＨまたはＣＨ 定常重鎖
Ｃ_ＬまたはＣＬ 定常軽鎖
ＣＨＯ細胞 チャイニーズハムスター卵巣細胞
ＤＣ 樹状細胞
ＦｃｇＲ ＦｃγＲと交換可能
ＦｃγＲ Ｆｃ－ガンマ－受容体
ＦＲ フレームワーク領域
ＧＭ－ＣＳＦ 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＨＣ 重鎖
ＩＣＡＭ－１ 細胞内接着分子１
ｉＤＣ 未熟樹状細胞
ＩＦＮ インターフェロン
ＩｇＧ 免疫グロブリンＧ
ＩＬ－６ インターロイキン－６
ＬＣ 軽鎖
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ｍｇ ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ ミリリットル
ｎｇ ナノグラム
ｎＭ ナノモル
ｐＩ 等電点
ＳＰＲ 表面プラズモン共鳴
ＴＮＦ 腫瘍壊死因子
μｇ マイクログラム
μＭ マイクロモル
Ｖ_ＬまたはＶＬまたはＶｌ 可変軽鎖ドメイン
ＶκまたはＶｋまたはＶＫ カッパ可変軽鎖ドメイン
Ｖλ ラムダ可変軽鎖ドメイン
Ｖ_ＨまたはＶＨまたはＶｈ 可変重鎖ドメイン

この詳細な説明に従って、以下の略語および定義が適用される。本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「１つの抗体」への言及は、複数のそのような抗体を含み、「投与量」への言及は、当業者に知られている１つまたは複数の投与量およびその等価物への言及を含む、などである。

本明細書で使用される「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈によってある程度変動するものであろう。一般に「約」は、本明細書で別段の指示がない限り、参照値のプラス／マイナス１０％の値の範囲を包含する。

記載された範囲の間の全ての整数または部分的な整数が、ここに含まれることが理解される。

ＣＤ４０はまた、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｂｐ５０、ＣＤ４０Ｌ受容体、ＣＤｗ４０、ＣＤＷ４０、ＭＧＣ９０１３、ｐ５０、ＴＮＦＲＳＦ５、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバー５とも呼ばれる。「ヒトＣＤ４０」は、以下のアミノ酸配列を含むＣＤ４０を指す：
MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ（配列番号５２）

本明細書で使用される「可変ドメイン」という用語は、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest,5th ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.(1991)によって定義された免疫グロブリン可変ドメインを指す。可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび配置は、周知のＫａｂａｔ番号付け規則に従っている。ＶＨ、「可変重鎖」および「可変重鎖ドメイン」は、重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬ、「可変軽鎖」および「可変軽鎖ドメイン」は、軽鎖の可変ドメインを指す。

「ヒト」という用語は、抗体に適用される場合、抗体がヒト免疫グロブリンに由来する配列、例えばＦＲおよび／またはＣＨドメインを有することを意味する。配列は、配列が以下のいずれかである場合、ヒト免疫グロブリンコード配列に「由来する」：（ａ）ヒト個体から、またはヒト個体の細胞もしくは細胞株から単離されたものである場合；（ｂ）クローン化されたヒト抗体遺伝子配列もしくはヒト抗体可変ドメイン配列のライブラリーから単離されたものである場合；または（ｃ）上記のポリペプチドの１つもしくは複数からの突然変異および選択によって多様化されたものである場合。

本明細書で使用される「単離された」化合物は、化合物が自然界で天然に結合している少なくとも１つの成分から、化合物が取り出されていることを意味する。

抗ＣＤ４０抗体などの本開示の抗体は、可変重鎖および可変軽鎖を含み、その各々は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＣＤＲには、抗原と特異的な相互作用を形成する残基のほとんどが含まれており、主に抗原認識を担っている。

薬物動態（ＰＫ）とは、薬物が体内に入り、通過し、出て行く動きを指す；ＰＫは、薬物の吸収、分布、代謝、および体からの薬物の排泄を評価する。薬物動態を評価するためのパラメーターには、以下が含まれる：ＡＵＣ０－ｉｎｆ（μＭ．ｈ）、Ｔ－ｈａｌｆ（ｈ）、ＭＲＴ（ｈ）、ＣＬ（ｍＬ／ｈ／ｋｇ）およびＶｓｓ（Ｌ／ｋｇ）。

ＰＫパラメーターは、本明細書に記載の方法によって評価され得る。

本明細書において使用される「改善された薬物動態特性」とは、抗体変異体の少なくとも１つのＰＫパラメーターが、対応する非改変抗体において測定した同じＰＫパラメーターと比較して増加（ＡＵＣ、Ｔ－ｈａｌｆおよびＭＲＴについて）または減少（ＣＬおよびＶｓｓについて）していることを意味する。実施形態において、抗体変異体は、対応する非改変抗体における同じＰＫパラメーターと比較して、少なくとも２つのＰＫパラメーター、少なくとも３つのＰＫパラメーター、少なくとも４つのＰＫパラメーター、または少なくとも５つのＰＫパラメーターにおいて改善された薬物動態特性を有する。本明細書で使用される場合、改善された薬物動態特性とは、対応する非改変抗体の同じ薬物動態特性よりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも１００％大きい変異体抗体の薬物動態特性を指す。

本開示の例示的な抗ＣＤ４０抗体は、ヒト化抗体ＢＭＳ－９８６３２５（Ｙ１２ＸＸ－ｈｚ２８とも呼ばれる）の変異体である。ＢＭＳ－９８６３２５の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の概要を表１に示す。

ＢＭＳ－９８６３２５のアミノ酸配列の詳細を表２に示す。

本開示の抗ＣＤ４０変異体抗体は、少なくともＢＭＳ－９８６３２５における対応するフレームワーク領域に対して可変ドメインに少なくとも１つの特定のアニオン化突然変異を有している。アニオン化突然変異は、一般に可変鎖のフレームワーク領域中、一部の変異体ではＣＤＲ中に位置するリジン（Ｌｙｓ；Ｋ）またはアルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）残基のいずれかである。一般に、特定のリジンおよびアルギニン残基は、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）もしくはアスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）などの非荷電残基、またはグルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）などの負に荷電した（酸性）残基に突然変異され得る。潜在的な脱アミド化または異性化を避けるため、ＧｌｎおよびＧｌｕへの突然変異が、ＡｓｎおよびＡｓｐへの突然変異よりもそれぞれ優先され、より短いＡｓｎとＡｓｐ側鎖に共通する脱アミド化（Ａｓｎ）または異性化（Ａｓｐ）の問題が回避される。開示の変異体は、ＢＭＳ－９８６３２５に関連する改善されたＰＫを有する。

本明細書に開示のＢＭＳ－９８６３２５の変異体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列の組合せが表３～８に提供される。これらの組合せはそれぞれ、ＢＭＳ－９８６３２５と比較して可変領域の正味電荷に変化を有する。具体的には、ＨＣ１３を含む組合せを除いて、各組合せは正味の正電荷に減少を有する。変異体は、ＢＭＳ－９８６３２５のＫＤと同様なＫＤ値または約４倍以下のＫＤ値でヒトＣＤ４０に結合する（上清から捕捉されたＢＭＳ－９８６３２５およびＢＭＳ－９８６３２５変異体抗体へのｈＣＤ４０の結合によって測定）。

表３は、様々な重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域ＬＣ１との組合せを含んでいる。

表４は、様々な重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域ＬＣ２との組合せを含んでいる。

表５は、様々な重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域ＬＣ３との組合せを含んでいる。

表６は、様々な重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域ＬＣ４との組合せを含んでいる。

表７は、様々な重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域ＬＣ５との組合せを含んでいる。

表８は、様々な重鎖可変領域配列と軽鎖可変領域ＬＣ６との組合せを含んでいる。

改善されたＰＫを有するＢＭＳ－９８６３２５の例示的な変異体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列が表９に提供される。

本開示の例示的なＣＤ４０抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を含むことができ、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分、および軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分を含み、

本開示の例示的なＣＤ４０抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を含むことができ、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分、および軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分を含み、

「抗体」（Ａｂ）は、限定されないが、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン、またはその抗原結合部分を含むものとする。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３の３つの定常ドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン、Ｃ_Ｌを含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、そこにはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。

Ａｂの「抗原結合部分」（「抗原結合フラグメント」とも呼ばれる）またはその抗原結合部分とは、Ａｂ全体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持するＡｂ（全長抗体または全長抗体のフラグメント）の１つまたは複数の配列を指す。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、およびｓｃＦｖ－Ｆｃが含まれる。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＡｂのＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てが、ヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換されているＡｂを指す。Ａｂのヒト化形態の一実施形態では、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置換されているのに対し、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の一部、大部分または全てのアミノ酸は変更されていない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換、または改変は、それらが特定の抗原に結合するＡｂの能力を無効にしない限り、許容される。「ヒト化」されたＡｂは、元のＡｂと同様な抗原特異性を保持する。

「キメラ抗体」とは、可変領域配列がマウスＡｂに由来し、定常領域配列はヒトＡｂに由来するＡｂなど、可変領域が１つの種に由来し、定数領域が別の種に由来するＡｂを指す。

本明細書で使用される場合、「特異的結合」は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される約１μＭまたはそれ以下の解離定数（Ｋ_ｄ）を有する抗体による抗原の結合を指す。適切なアッセイシステムには、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マールボロ、マサチューセッツ）表面プラズモン共鳴システムおよびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動態評価ソフトウェア（例えば、バージョン２．１）が含まれる。

本抗体のＣＤ４０への結合は、少なくとも１つのＣＤ４０活性に拮抗する。「ＣＤ４０活性」には、Ｔ細胞の活性化（例えば、Ｔ細胞の増殖またはサイトカイン分泌の誘導）、マクロファージの活性化（例えば、マクロファージにおける活性酸素種および一酸化窒素の誘導）、Ｂ細胞の活性化（例えば、Ｂ細胞の増殖、抗体のアイソタイプスイッチング、またはプラズマ細胞への分化）が含まれるが、それらに限定はされない。ＣＤ４０活性は、他の分子との相互作用によって媒介され得る。「ＣＤ４０活性」には、括弧内のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号によって識別される以下の分子とＣＤ４０との間の機能的相互作用が含まれる：
ＣＡＬＲ （Ｐ２７７９７）；
ＥＲＰ４４ （Ｑ９ＢＳ２６）；
ＦＢＬ （Ｐ２２０８７）；
ＰＯＬＲ２Ｈ （Ｐ５２４３４）；
ＲＦＣ５ （Ｐ４０９３７）；
ＳＧＫ１ （Ｏ００１４１）；
ＳＬＣ３０Ａ７ （Ｑ８ＮＥＷ０）；
ＳＬＣ３９Ａ７ （Ｑ９２５０４）；
ＴＲＡＦ２ （Ｑ５Ｔ１Ｌ５）；
ＴＲＡＦ３ （Ｑ１３１１４）；
ＴＲＡＦ６ （Ｑ９Ｙ４Ｋ３）；
ＴＸＮ （Ｑ５Ｔ９３７）；
ＵＧＧＴ１ （Ｑ９ＮＹＵ２）；および
ＵＳＰ１５ （Ｑ９Ｙ４Ｅ８）。

例えば、ＣＤ４０の「活性」には、ＴＲＡＦ２との相互作用が含まれる。ＣＤ４０／ＴＲＡＦ２相互作用は、ＮＦ－κＢとＪＮＫを活性化する。Davies et al., Mol. Cell Biol.25:9806-19(2005)を参照されたい。したがって、このＣＤ４０活性は、基準と比較した細胞性ＮＦ－κＢおよびＪＮＫのＣＤ４０に依存的な活性化によって決定され得る。

本明細書で使用される「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」、「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅｓ）」および「活性化された（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」という用語は、所与の測定可能なＣＤ４０活性が、基準に対して少なくとも１０％、例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、さらには１００％、またはそれ以上増加することを指す。ＣＤ４０活性が、アンタゴニストの不在と比較して、少なくとも１０％、例示的な実施形態では、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、さらには１００％（すなわち検出できる活性なし）減少している場合、「拮抗」していることになる。例えば、抗体はＣＤ４０活性の一部または全部に拮抗し、ＣＤ４０を活性化しなくてもよい。例えば、抗体はＢ細胞増殖を活性化しなくてもよい。抗体は、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を活性化しなくてもよく、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＴＮＦ－α、およびＩＦＮ－γからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインである。

単離された抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０の１つまたは複数の活性に拮抗し得る。単離された抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗体であり得る。単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト化抗体であり得る。単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含み得る。

特定の態様において、本開示は、塩基性アミノ酸を有する特定の位置が中性アミノ酸または酸性アミノ酸に突然変異している変異体フレームワーク領域（ＦＲ）、場合によっては可変ドメインのＣＤＲについて記載する。開示される変異体ＦＲは、ＶＨ１重鎖生殖系列およびＶＫ１軽鎖生殖系列などのヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされるフレームワーク領域の変異体、またはヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントの改変ＦＲの変異体、例えば、抗体ライブラリーの変異原性親和性成熟から生じる変異体であってもよい。本明細書に記載の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本明細書に記載の抗ＣＤ４０抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するものである。１つまたは複数のＰＫパラメーターを改善するために、任意の抗体のＶ_Ｈ ＣＤＲ１、２、３配列、およびＶ_Ｌ ＣＤＲ１、２、および３配列が、本明細書に開示のフレームワーク領域に移植され得る。本明細書に記載されるように、塩基性アミノ酸を有するＣＤＲの特定の位置も改変され得ることも企図される。

抗体変異体は、塩基性残基に少なくとも１つのアニオン化突然変異を含む。変異体の重鎖可変領域は、親抗体において塩基性残基を有する少なくとも１つの位置に突然変異を含んでいてもよく、その少なくとも１つの位置は、配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７および７４、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される。変異体の重鎖可変領域は、Ｋ１２、Ｋ１３、Ｋ１９、Ｋ２３、Ｒ３８、Ｒ５７、Ｋ６３、Ｒ６７、およびＲ７４、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される位置に少なくとも１つの変異を含み得る。突然変異は、塩基性アミノ酸を中性アミノ酸または酸性アミノ酸のいずれかに置き換え得る。例示的な中性アミノ酸には、グルタミン、アスパラギン、バリン、セリン、アラニン、およびスレオニンが含まれる。例示的な酸性アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。突然変異の組合せは、配列番号７３の位置１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４のうちの２つ以上においてなされ得る。例には、位置１２および１３の突然変異；位置１２、１３、および２３の突然変異；位置３８、６３、および６７の突然変異；位置６３位および６７位の突然変異；ならびに位置５７および７４の突然変異が含まれるが、これらに限定はされない。一部の変異体抗体では、組合せの例には、Ｋ１２およびＫ１３Ｑにおける突然変異；Ｋ１２、Ｋ１３およびＫ２３における突然変異；Ｒ３８、Ｋ６３およびＲ６７における突然変異；Ｋ６３およびＲ６７における突然変異；ならびにＲ５７およびＫ７４における突然変異が含まれるが、これらに限定はされない。突然変異の例示的な組合せには、Ｋ１２Ｑ、およびＫ１３Ｑ；Ｋ１２Ｑ、Ｋ１３Ｑ、およびＫ２３Ｑ；Ｋ１２Ｅ、Ｋ１３Ｑ、およびＫ２３Ｅ；Ｋ１２Ｖ、Ｋ１９Ｓ、およびＫ２３Ａ；Ｒ３８Ｑ、Ｋ６３Ｑ、およびＲ６７Ｑ；Ｋ６３ＱおよびＲ６７Ｅ；ならびにＲ５７ＥおよびＫ７４Ｑが含まれる。

変異体の軽鎖可変領域は、親抗体において塩基性残基を有する少なくとも１つの位置に突然変異を含んでいてもよく、その少なくとも１つの位置は、配列番号７４の４５、５４、６１、および１０７、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの位置、または配列番号７５の４５、５４、６１、１０７、および１０８、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。変異体の軽鎖可変領域は、Ｋ４５、Ｒ５４、Ｒ６１、Ｋ１０７、存在する場合はＲ１０８、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの位置に変異を含み得る。突然変異は、塩基性アミノ酸を中性アミノ酸または酸性アミノ酸に置き換え得る。例示的な中性アミノ酸には、グルタミン（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、およびスレオニン（Ｔ）が含まれる。場合によっては、中性アミノ酸はグルタミンである。例示的な酸性アミノ酸には、グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｅ）が含まれる。場合によっては、酸性アミノ酸はグルタミン酸である。突然変異の組合せは、配列番号７４の位置４５、５４、６１、および１０７、または配列番号７５の位置４５、５４、６１、１０７、および１０８のうちの２つ以上においてなされ得る。例には、位置４５、５４、および６１における突然変異；または位置１０７および１０８における突然変異が含まれるが、これらに限定はされない。一部の変異体抗体においては、組合せの例には、Ｋ４５、Ｒ５４およびＲ６１；ならびにＫ１０７およびＫ１０８が含まれるが、これらに限定はされない。突然変異の例示的な組合せには、Ｋ４５Ｑ、Ｒ５４Ｑ、およびＲ６１Ｑ；ならびにＫ１０７ＱおよびＫ１０８Ｑが含まれる。

本開示は、親抗体の少なくとも１つの薬物動態特性を改善するための方法をさらに提供する。本方法は、非改変親抗体に比べて、少なくとも１つの改善された薬物動態特性を有する変異体を生成するために、配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４から選択される少なくとも１つの位置の残基を突然変異させることを含む。場合によっては、本方法は、非改変親抗体に比べて少なくとも１つの改善された薬物動態特性を有する変異体を生成するために、配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４ならびに／または配列番号７５の４５、５４、６１、１０７、および１０８から選択される少なくとも１つの位置の残基を突然変異させることを含む。

本方法の実施において、突然変異は中性アミノ酸または酸性アミノ酸へのものであり得る。例示的な中性アミノ酸には、グルタミン、アスパラギン、バリン、セリン、アラニン、およびスレオニンが含まれる。例示的な酸性アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。

突然変異の組合せは、配列番号７４の位置４５、５４、６１、および１０７、ならびにそれらの組合せ、または配列番号７５の位置４５、５４、６１、１０７、および１０８、ならびにそれらの組合せのうちの２つ以上の残基においてなされ得る。例には、配列番号７４の位置４５、５４、および６１における突然変異；または配列番号７５の位置１０７および１０８における突然変異が含まれるが、これらに限定はされない。

突然変異の組合せは、配列番号７３の２つ以上の位置１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４、ならびにそれらの組合せにおいてなされ得る。例には、位置１２および１３；位置１２、１３および２３；位置３８、６３および６７；位置６３および６７、ならびに位置５７および７４における突然変異が含まれるが、これらに限定はされない。

本方法により得られる改善された薬物動態特性は、時間０から無限大までの濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ０－ｉｎｆ（ｕＭ．ｈ））、半減期（Ｔ－ｈａｌｆ（ｈ））、平均滞留時間（ＭＲＴ（ｈ））、クリアランス（ＣＬ（ｍＬ／ｈ／ｋｇ）、定常状態分布容積（Ｖｓｓ（Ｌ／ｋｇ））であり得る。

変異体フレームワーク領域の例示的な組合せが表１０に提供される。

本開示において企図される抗体は、抗原に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を含むことができ、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分、および軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分を含み、

Ｆｃドメインおよび定常領域
重鎖のカルボキシル末端の「半分」は定常領域（Ｆｃ）を定義し、これは主にエフェクター機能を担っている。本明細書で使用される「Ｆｃドメイン」という用語は、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest,5th ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.(1991)に従って区切られたＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む定常領域抗体配列を指す。Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧに由来するものであってもよい。例えば、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に由来し得る。重鎖可変ドメインは、Ｆｃドメインに融合され得る。可変ドメインのカルボキシル末端は、Ｆｃ ＣＨ２ドメインのアミノ末端に連結または融合されていてもよい。あるいは、可変ドメインのカルボキシル末端は、それ自体がＦｃドメインのアミノ末端に融合されるリンカーアミノ酸配列のアミノ末端に連結または融合されていてもよい。あるいは、可変ドメインのカルボキシル末端は、それ自体がＦｃ ＣＨ２ドメインに融合されるＣＨ１ドメインのアミノ末端に連結または融合されていてもよい。タンパク質は、ＣＨ１ドメインの後にヒンジ領域を全体的または部分的に含んでいてもよい。アミノ酸リンカー配列が、可変ドメインとＦｃドメインの間に存在してもよい。軽鎖可変ドメインのカルボキシル末端は、ＣＬドメインのアミノ末端に連結または融合されていてもよい。

重鎖ＣＨ１の例示的な配列は、配列番号８２のアミノ酸１１８～２１５である（ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶ；配列番号８２）。軽鎖ＣＬの例示的な配列は、配列番号８３のアミノ酸１０８～２１４である（ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ；配列番号８３）。

改善されたＰＫを有するＢＭＳ－９８６３２５の例示的な変異体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列が表１１に提供される。これらの配列において、重鎖は例示的なＣＨ１ドメインを含み、軽鎖は例示的なＣＬドメインを含む。

抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する第１の可変ドメインと、Ｆｃドメインを含む第２のドメインとを含む融合抗体であり得る。

融合タンパク質において使用される例示的なＦｃドメインには、ヒトＩｇＧドメインが含まれ得る。例示的なヒトＩｇＧ Ｆｃドメインには、ＩｇＧ４ ＦｃドメインおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメインが含まれる。ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子はＣ末端にリジンをコードしているが、このリジンはしばしば血液循環中の切断の結果として内因性抗体には存在しない。Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ重鎖を有する抗体は、哺乳動物細胞培養物中で発現させた場合、Ｃ末端リジンの存在レベルが変動することもある（Cai et al,2011, Biotechnol. Bioeng.108(2):404-12）。したがって、本明細書に開示されるＩｇＧ重鎖ＦｃドメインのＣ末端リジンは省略されてもよい。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｃ－ガンマ－受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減させるＫａｂａｔ位置２３８における突然変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含むことができ、プロリン２３８（Ｐ２３８）は、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される残基の１つに突然変異されており、抗体またはその抗原結合部分は、低下したＦｃγＲ結合を有する。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインにリジンに突然変異されたＰ２３８を有し得る。

単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号２２～２９から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。

上記のＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む例示的な配列には、表１２に示される４つの異なるＶＨ鎖配列が含まれる。

本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｋａｂａｔ位置２９７で置換されたアラニンを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み得る。例えば、単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号１４１～１４８から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。

改善されたＰＫを有するＢＭＳ－９８６３２５の例示的な変異体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域配列が表１２に提供される。これらの配列において、重鎖は、例示的なＣＨ１ドメインと、Ｆｃ－ガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合を低減させる突然変異をＫａｂａｔ位置２３８に含むヒトＩｇＧ１ Ｃドメインを含み、プロリン２３８（Ｐ２３８）は、リジン（Ｋ）からなる群から選択される残基の１つに突然変異されている。軽鎖は、例示的なＣＬドメインを含む。

本明細書に開示される抗体のその抗原結合部分は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）_２、ダイアボディ、およびｓｃＦｖ－ＦＣからなる群から選択され得る。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合部分が治療剤に連結されている免疫複合体であり得る。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分は、抗体またはその抗原結合部分が、前記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結されている二重特異性抗体であり得る。

本明細書に開示の抗体またはその抗原結合部分は、さらに追加の部位を含み得る。

本抗体の可変領域は、「アミノ酸リンカー」または「リンカー」によってＦｃドメインに連結されていてもよい。例えば、可変重鎖ドメインのＣ末端が、アミノ酸リンカーのＮ末端に融合されていてもよく、Ｆｃドメインが、リンカーのＣ末端に融合されていてもよい。アミノ酸リンカーは、任意の長さであり、アミノ酸の任意の組合せからなり得るが、リンカーの長さは、連結されたドメイン間の相互作用を低減するために比較的短くてもよい（例えば、５個以下のアミノ酸）。また、リンカーのアミノ酸組成を調整して、嵩高な側鎖を有するアミノ酸または二次構造を導入する可能性のあるアミノ酸の数を減らしてもよい。適切なアミノ酸リンカーには、３、４、５、６、７、１０、１５、２０、または２５アミノ酸までの長さが含まれるが、これらに限定はされない。代表的なアミノ酸リンカー配列には、ＧＧＧＧＳ（配列番号９２）、および２、３、４、もしくは５コピーのＧＧＧＧＳを含むリンカー（それぞれ配列番号９３～９６）が含まれる。表１３は、本開示で使用するのに適したリンカー配列を列挙している。

抗体の調製
抗体は、ＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ、ＮＳＯなどの適当な哺乳動物宿主細胞株において通常の技術を用いて産生および精製した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、逆相技術などを含む方法の１つまたは組合せを使用して精製することができる。

当技術分野で周知のように、複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る。したがって、タンパク質配列をコードする核酸には、コドン縮重を有する核酸が含まれる。本明細書に開示のポリペプチド配列は、様々な核酸によってコードされ得る。遺伝暗号は普遍的であり、よく知られている。本明細書に開示の任意のポリペプチド配列をコードする核酸は、当技術分野における従来の知識に基づいて容易に想到され、生産のために最適化され得る。所与のポリペプチドをコードする核酸配列の可能な数は多いが、遺伝暗号の標準的な表が与えられ、コンピュータによって支援されれば、当業者は、所与のポリペプチドをコードする核酸配列のあらゆる可能な組合せを容易に生成することが可能である。

重鎖可変ドメインの４つをコードする代表的な核酸配列が以下に提供される。これらの配列において、ヌクレオチド１～３５１は重鎖可変領域をコードし、その中でヌクレオチド９１～１０５は重鎖の可変ドメインのＣＤＲ１をコードし、ヌクレオチド１４８～１９５はＣＤＲ２をコードし、ヌクレオチド２９５～３１８はＣＤＲ３をコードしている。ヌクレオチド３５２～６４５はＣＨ１ドメインをコードし、ヌクレオチド６４６～１３４１はＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋをコードしている。ヌクレオチド１３４２～１３４４は停止コドンである。

Ｍ３９およびＭ３３の重鎖可変ドメイン（ＨＣ１、すなわちＨＣ－ｗｔ）（ＣＤＲに下線が引かれている）をコードし、定常領域ＣＨ１（斜体）およびＦｃドメインＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋを含む代表的な核酸配列は、以下のとおりである：

Ｍ４７の重鎖可変ドメイン（ＨＣ－１５）をコードし、定常領域ＣＨ１およびＦｃドメインＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋを含む代表的な核酸配列は、以下のとおりである：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTCAAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACGCTTTCACCTCCTATTGGATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCAGATCAACCCAACCACAGGCCGCAGCCAGTACAATGAGAAGTTTAAGACCCAGGTGACCATCACAGCCGACAAGTCCACCAGCACAGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGATCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCTCGCTGGGGCCTGCAGCCTTTCGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGCGTCGACCAAGGGCCCAAGCGTGTTTCCACTGGCTCCCTCCAGCAAGTCTACCTCCGGAGGAACAGCCGCTCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACATTTCCAGCTGTGCTGCAGTCTTCCGGCCTGTACTCTCTGAGCTCTGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAATACAAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGCCCAAGTCTTGTGATAAGACCCATACATGCCCACCTTGTCCTGCTCCAGAGCTGCTGGGCGGCAAGTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCCATCTCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGATATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCTCCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCTCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCTGTGATGCACGAAGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAGTCACTGTCACTGTCTCCTGGCAAATGA（配列番号１０２）

Ｍ４およびＭ３６の重鎖可変ドメイン（ＨＣ－４）をコードし、定常領域ＣＨ１およびＦｃドメインＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋを含む代表的な核酸配列は、以下のとおりである：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGTGCCGAGGTCGAGAAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCTGGCTACGCTTTCACCTCCTATTGGATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCAGATCAACCCAACCACAGGCAGAAGCCAGTACAATGAGAAGTTTAAGACCCGCGTGACCATCACAGCCGACAAGTCCACCAGCACAGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGGTCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCTCGGTGGGGCCTGCAGCCTTTCGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGCGTCGACCAAGGGCCCAAGCGTGTTTCCACTGGCTCCCTCCAGCAAGTCTACCTCCGGAGGCACAGCCGCTCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACATTTCCAGCTGTGCTGCAGTCTTCCGGCCTGTACTCTCTGAGCTCTGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAATACAAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGCCCAAGTCTTGTGATAAGACCCATACATGCCCACCTTGTCCTGCTCCAGAGCTGCTGGGCGGCAAGTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCCATCTCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGATATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCTCCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCTGTGATGCACGAAGCACTGCACAACCATTACACTCAGAAGTCACTGTCACTGTCTCCTGGGAAATGA（配列番号１０３）

Ｍ５３の重鎖可変ドメイン（ＨＣ－５）をコードし、定常領域ＣＨ１およびＦｃドメインＩｇＧ１－Ｐ２３８Ｋを含む代表的な核酸配列は、以下のとおりである：
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGTGCCGAGGTCGAGCAGCCAGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCGAGGCCTCTGGCTACGCTTTCACCTCCTATTGGATGCACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGCCAGATCAACCCAACCACAGGCAGAAGCCAGTACAATGAGAAGTTTAAGACCCGCGTGACCATCACAGCCGACAAGTCCACCAGCACAGCTTATATGGAGCTGTCTTCCCTGAGGTCTGAGGATACAGCCGTGTACTATTGCGCTCGGTGGGGCCTGCAGCCTTTCGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCTGCGTCGACCAAGGGCCCAAGCGTGTTTCCACTGGCTCCCTCCAGCAAGTCTACCTCCGGAGGCACAGCCGCTCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACAGTGTCCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGAGTGCATACATTTCCAGCTGTGCTGCAGTCTTCCGGCCTGTACTCTCTGAGCTCTGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGGCACCCAGACATATATCTGCAACGTGAATCACAAGCCAAGCAATACAAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGCCCAAGTCTTGTGATAAGACCCATACATGCCCACCTTGTCCTGCTCCAGAGCTGCTGGGCGGCAAGTCCGTGTTCCTGTTTCCACCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTACAACTCTACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCCCTGCCCGCTCCTATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAGCCACAGGTGTACACACTGCCTCCATCTCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCTCCGATATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCCCCTGTGCTGGACTCTGATGGCTCCTTCTTTCTGTATAGCAAGCTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCTGTGATGCACGAAGCACTGCACAACCATTACACTCAGAAGTCACTGTCACTGTCTCCTGGGAAATGA（配列番号１０４）

軽鎖可変ドメインの３つをコードする代表的な核酸配列が以下に提供される。これらの配列において、ヌクレオチド１～３２１は軽鎖可変領域をコードし、その中でヌクレオチド７０～１０２はＣＤＲ１、ヌクレオチド１４８～１６８はＣＤＲ２、ヌクレオチド２６５～２９１はＣＤＲ３をコードしている。ヌクレオチド３２２～６４２はＣＬをコードしている。ヌクレオチド６４３～６４５は停止コドンである。

Ｍ３９およびＭ５３の軽鎖可変ドメイン（ＬＣ４）（ＣＤＲに下線が引かれている）をコードし、定常領域ＣＬ（斜体）を含む代表的な核酸配列は、以下のとおりである：

Ｍ３３、Ｍ４７、およびＭ３６の軽鎖可変ドメイン（ＬＣ３）をコードし、定常領域Ｃｌを含む代表的な核酸配列は、以下のとおりである：

Ｍ４の軽鎖可変ドメイン（ＬＣ１、すなわちＬＣ－ｗｔ）をコードし、定常領域Ｃｌを含む代表的な核酸配列は、以下のとおりである：

例示的なコード配列を以下の表１４にまとめる。配列は、配列表中に提供されている。

重鎖および／または軽鎖のコード配列は、コード配列の５’末端においてＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ（配列番号５１）などのシグナルペプチドをコードしてもよい。このシグナルペプチドの例示的な核酸コード配列は、ＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＴＣＧＣＡ（配列番号３２）である。

したがって、本明細書に開示される抗体をコードする核酸もまた企図される。そのような核酸は、適当な発現ベクター、例えばｐＨＥＮ－１（Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:4133-4137）などのベクターに挿入され得る。さらに、ベクターおよび／または核酸を含む単離された宿主細胞が提供される。

本開示の抗体は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、２９３（ヒト胚性腎臓２９３細胞）、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞などの任意の適切な哺乳動物宿主細胞株において通常の技術のみを使用して産生および精製した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換、逆相技術などを含む方法の１つまたは組合せを使用して精製することができる。

医薬組成物および処置の方法
医薬組成物は、本開示の１つまたは複数の抗体の治療有効量と、薬学的に許容される担体とを含んでいてもよい。薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組合せが含まれる。薬学的に許容される担体は、融合タンパク質の保存性または有効性を高める湿潤剤または乳化剤、保存剤、または緩衝剤などの少量の補助物質をさらに含み得る。組成物は、投与後に活性成分の迅速な、持続的な、または遅延した放出を提供するように製剤化され得る。適切な医薬組成物およびそれらを調製するためのプロセスは、当技術分野で知られている。例えば、Remington, THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro, et al., eds.,21st ed., Mack Publishing Co.(2005)を参照されたい。

特定の実施形態では、医薬組成物は、単独または免疫抑制／免疫調節剤および／もしくは抗炎症剤との併用療法で（すなわち、同時または順次に）投与され得る。薬剤の例示的なタイプは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）の突然変異体分子である。例示的なＣＴＬＡ４突然変異分子は、改変されたＣＴＬＡ４－ＩｇであるＬ１０４ＥＡ２９Ｙ－Ｉｇ（ベラタセプト）である。異なる免疫疾患は、免疫疾患の処置に有用な特定の補助化合物の使用を要求し得るが、これは患者ごとに決定され得る。例えば、医薬組成物は、１つまたは複数の適切なアジュバント、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３）または他の免疫刺激因子、例えば、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドと組み合わせて投与され得る。適切なアジュバントは、当技術分野で知られている。

特定の実施形態では、そのような処置を必要とする患者における免疫疾患を処置する方法は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を患者に投与することを含み得る。さらに提供されるのは、そのような処置を必要とする患者における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防する方法であり、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分の治療有効量を患者に投与することを含んでいてもよい。また、治療有効量の抗体またはその抗原結合部分を患者に投与することを含み得る、そのような処置を必要とする患者の免疫疾患を処置するため、および／または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患を処置もしくは予防するための、本開示の抗体もしくはその抗原結合部分、またはその薬学的に許容される塩の使用も提供される。ＣＤ４０を介したＴ細胞の活性化に拮抗することは、例えば、自己免疫、移植片拒絶反応、またはアレルギー反応の際に発生する望ましくないＴ細胞反応を抑制し得るであろう。ＣＤ４０を介したＴ細胞の活性化を阻害することは、これらの疾患の進行および／または重症度を緩和し得るであろう。

特定の実施形態では、そのような処置を必要とする患者における免疫疾患の処置および／または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の処置もしくは予防のための医薬品の調製における、本開示の抗体もしくはその抗原結合部分、またはその薬学的に許容される塩の使用もまた提供される。医薬品は、例えば、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と組み合わせて投与され得る。

本明細書で使用される場合、「患者」は動物、例えば、ヒトを含む哺乳動物を意味する。例えば、患者は免疫疾患と診断されてもよい。「処置」または「処置する」または「処置すること」は、症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を軽減することを含むプロセスを指す。「免疫疾患」とは、細胞性および／または体液性免疫反応を含む、個体における免疫反応の発生に関連する任意の疾患を指す。免疫疾患の例には、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、または移植片関連疾患が含まれるが、これらに限定はされない。したがって、患者は自己免疫疾患または炎症性疾患と診断され得る。「自己免疫疾患」とは、細胞性および／または体液性免疫反応を含む、個体における自己免疫反応の発生に関連する任意の疾患を指す。自己免疫疾患の例は、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）であるが、これらに限定はされない。他の自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、乾癬、強皮症、およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。移植片関連疾患には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植拒絶反応、および慢性移植拒絶反応が含まれる。

特定の実施形態では、本開示の抗体を投与することによって処置され得る疾患は、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、目の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組み換え医薬品（例えば、血友病患者の第ＶＩＩ因子）に対する免疫応答、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択され得る。

抗体もしくはその抗原結合部分、または医薬組成物を投与するために任意の適切な方法または経路が使用され得る。投与経路には、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が含まれる。投与される抗体の治療有効用量は、例えば、処置される疾患のタイプおよび重症度、併用療法の使用、抗体もしくはその抗原結合部分または医薬組成物の投与経路、ならびに患者の体重を含む、多数の要因に依存する。抗体の治療有効量の非限定的な範囲は、患者の体重に対して０．１～２０ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）であり、１つの態様では１～１０ｍｇ／ｋｇである。

キット
ヒト患者における免疫疾患を処置するのに有用なキットが提供される。ヒト患者における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防するために有用なキットもまた提供される。キットは、（ａ）投与量の本開示の抗体またはその抗原結合部分、ならびに（ｂ）患者において免疫疾患を処置する方法において抗体もしくはその抗原結合部分を使用するため、または自己免疫疾患もしくは炎症疾患を処置もしくは予防する方法において抗体もしくはその抗原結合部分を使用するための説明資料を含み得る。

本明細書で使用される「説明資料」という用語には、キット中の本発明の組成物および／または化合物の有用性を伝達するために使用され得る出版物、記録、図表、または任意の他の表現媒体が含まれる。キットの説明資料は、例えば、本発明の化合物および／または組成物を含む容器に貼付されてもよく、または化合物および／または組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、受領者が説明資料と化合物を協同的に使用することを意図して、説明資料を容器とは別に出荷してもよい。説明資料のデリバリーは、例えば、出版物またはキットの有用性を伝達する他の表現媒体の物理的なデリバリーによるものであってもよく、あるいは、例えば、電子メールもしくはウェブサイトからのダウンロードなど、コンピュータを使った電子的送信によって達成されてもよい。

例示的な実施形態
実施形態１：ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、
（ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、ＨＣ６、ＨＣ７、ＨＣ８、ＨＣ９、ＨＣ１６、ＨＣ１０、ＨＣ１５、ＨＣ１１、ＨＣ１２、およびＨＣ１４から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、表３に示されるＬＣ１を含むか；

（ｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、ＨＣ６、ＨＣ７、ＨＣ８、ＨＣ９、ＨＣ１６、ＨＣ１０、ＨＣ１５、ＨＣ１１、ＨＣ１２、およびＨＣ１４、ならびにＨ１３から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、表４に示されるＬＣ２を含むか；

（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、ＨＣ６、ＨＣ７、ＨＣ８、ＨＣ９、ＨＣ１６、ＨＣ１０、ＨＣ１５、ＨＣ１１、ＨＣ１２、およびＨＣ１４、ならびにＨ１３から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、表５に示されるＬＣ３を含むか；

（ｉｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、ＨＣ６、ＨＣ７、ＨＣ８、ＨＣ９、ＨＣ１６、ＨＣ１０、ＨＣ１５、ＨＣ１１、ＨＣ１２、およびＨＣ１４、ならびにＨ１３から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、表６に示されるＬＣ４を含むか；

（ｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、ＨＣ６、ＨＣ７、ＨＣ８、ＨＣ９、ＨＣ１６、ＨＣ１０、ＨＣ１５、ＨＣ１１、ＨＣ１２、およびＨＣ１４、ならびにＨ１３から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、表７に示されるＬＣ５を含むか；

または
（ｖｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１、ＨＣ２、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５、ＨＣ６、ＨＣ７、ＨＣ８、ＨＣ９、ＨＣ１６、ＨＣ１０、ＨＣ１５、ＨＣ１１、ＨＣ１２、およびＨＣ１４、ならびにＨ１３から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、表８に示されるＬＣ６を含む、単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２．ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、

実施形態３．実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、

実施形態４．実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記第１のポリペプチド部分が、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはからなる、単離された抗体またはその抗原結合部分：

実施形態５．実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、

実施形態６．前記重鎖可変領域が、ＨＣ１（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＱＬＬＩＹＳＡＳＹＱＹＴＧＶＰＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；配列番号４０）を含む、実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態７．前記重鎖可変領域が、ＨＣ１（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号４０）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；配列番号４２）を含む、実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態８．前記重鎖可変領域が、ＨＣ１５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＱＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号４３）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；配列番号４２）を含む、実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態９．前記重鎖可変領域が、ＨＣ４（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＥＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号４４）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ１（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；配列番号４５）を含む、実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態１０．前記重鎖可変領域が、ＨＣ４（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＥＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号４４）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹＳＡＳＹＲＹＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；配列番号４２）を含む、実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態１１．前記重鎖可変領域が、ＨＣ５（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＥＱＰＧＳＳＶＫＶＳＣＥＡＳＧＹＡＦＴＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＱＩＮＰＴＴＧＲＳＱＹＮＥＫＦＫＴＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＷＧＬＱＰＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ；配列番号４６）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＱＬＬＩＹＳＡＳＹＱＹＴＧＶＰＳＱＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＳＴＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ；配列番号４１）を含む、実施形態２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態１２．抗原結合部分がｓｃＦｖ－Ｆｃである、実施形態２～１１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。

実施形態１３．抗体またはその抗原結合部分が、治療剤に連結されている、実施形態２～１２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。

実施形態１４．抗体またはその抗原結合部分が、前記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結されている、実施形態２～１３のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。

実施形態１５．付加的な部分をさらに含む、実施形態２～１４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。

実施形態１６．実施形態２～１５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を処置または予防する方法。

実施形態１７．実施形態２～１５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防する方法。

実施形態１８．抗体またはその抗原結合部分が、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と共に投与される、実施形態１６または１７に記載の方法。

実施形態１９．前記免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤がＣＴＬＡ４突然変異体分子である、実施形態１８に記載の方法。

実施形態２０．前記ＣＴＬＡ４突然変異体分子がＬ１０４ＥＡ２９Ｙ－Ｉｇ（ベラタセプト）である、実施形態１９に記載の方法。

実施形態２１．対象が、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、目の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組み換え医薬品（例えば、血友病患者の第ＶＩＩ因子）に対する免疫応答、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される疾患を有する、実施形態１６または１７に記載の方法。

実施形態２２．単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、

重鎖可変領域および軽鎖可変領域の少なくとも１つが、塩基性残基における突然変異を含み、重鎖可変領域の突然変異は、配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４の位置、ならびにそれらの組合せからなる群から選択され、ならびに／または軽鎖可変領域の変異は、配列番号７４の４５、５４、６１、および１０７の位置、ならびにそれらの組合せからなる群から選択され；
塩基性残基における少なくとも１つの突然変異は、中性アミノ酸または酸性アミノ酸への突然変異である、単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２３．中性アミノ酸が、グルタミン、アスパラギン、バリン、セリン、アラニン、およびスレオニンから選択される、実施形態２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２４．酸性アミノ酸が、グルタミン酸またはアスパラギン酸から選択される、実施形態２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２５．配列番号７４の４５、５４、６１、および１０７、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される塩基性残基において、少なくとも２つの変異が軽鎖可変領域中に存在する、実施形態２２に記載の単離抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２６．配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４からなる群より選択される基本残基において、少なくとも２つの変異が重鎖可変領域中に存在する、実施形態２２に記載の単離抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２７．前記軽鎖可変領域が、ＬＣ１フレームワーク（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＸＸＸＸＸＸＸＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＸＸＸＸＸＸＸＸＸＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ；配列番号７５）もしくはその突然変異を含み、４５、５４、６１、１０７、および１０８の位置、ならびにそれらの組合せが突然変異され得る、実施形態２２に記載の単離抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２８．ヒトＣＤ４０に特異的に結合するための、実施形態２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態２９．第１の抗体の少なくとも１つの薬物動態特性を改善するための方法であって、非改変の第１の抗体と比較して、少なくとも１つの突然変異した残基と、少なくとも１つの改善された薬物動態特性を有する第１の抗体の変異体を生成するために、配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４、もしくはそれらの組合せから選択される少なくとも１つの位置、ならびに／または配列番号７４の４５、５４、６１、および１０７、もしくはその組合せから選択される少なくとも１つの位置の残基を突然変異させることを含む、方法。

実施形態３０．第１の抗体が、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する、実施形態２９に記載の方法。

実施形態３１．単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、

実施形態３２．前記第１のポリペプチド部分が、ヒト重鎖定常領域を含み；前記第２のポリペプチド部分が、ヒト軽鎖定常領域を含む、実施形態３１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。

実施形態３３．実施形態１～１５、２２～２８、３１、および３２のいずれか１つに記載の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子。

実施形態３４．実施形態３３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。

実施形態３５．実施形態３４に記載の発現ベクターまたは実施形態３３に記載の核酸で形質転換された細胞。

実施形態３６．抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を調製するための方法であって、
ａ）実施形態３５に記載の細胞において、抗体またはその抗原結合部分を発現させること；および
ｂ）細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離すること
を含む方法。

実施形態３７．ａ）実施形態１～１５、２２～２８、３１および３２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分；ならびにｂ）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

実施形態３８．医薬品として使用するための、実施形態１～１５、２２～２８、３１、および３２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。
実施形態３９．処置を必要とする対象の処置に使用するための、実施形態１～１５、２２～２８、３１、および３２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合部分。

［実施例１］
改善された薬物動態特性のためのＢＭＳ－９８６３２５変異体のエンジニアリング
薬物動態（ＰＫ）特性を最適化するためのタンパク質エンジニアリング戦略を開発するために、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体ＢＭＳ－９８６３２５（ＰＣＴ／ＵＳ１９／６２０１１）を選択した。ＢＭＳ－９８６３２５の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を表１５に示す。各可変領域のＣＤＲに下線が引かれ、太字で示されている。

タンパク質エンジニアリング戦略は、細胞膜または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のような負に荷電した（酸性）細胞内表面への望ましくない結合に関与し得る抗体表面の正に荷電した（塩基性）パッチを破壊することであった。この戦略の一部として、ＣＤ４０との高親和性相互作用および機能的効力、ならびに抗体の好ましい生物物理学的特性を維持することも重要であった。

潜在的な免疫原性リスクを制限するために、最初の最適化では、配列の変動が自然に生じやすい重鎖および軽鎖の可変領域に焦点を当てた。これらの可変重鎖（Ｖｈ）および可変軽鎖（Ｖｌ）領域について、アミノ酸の一次配列レベルでの解析と、ＢＭＳ－９８６３２５のＦａｂドメインの構造モデルの生成による解析の両方を行った。相同性モデルは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）のＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｅｒを使用して、利用可能なＸ線構造に基づいて作成した。アミノ酸配列をモデリングＧＵＩに読み込んだ。その後、ツールがフレームワークとＣＤＲループテンプレートを検索する。抗体のバックボーンは、最も類似したフレームワークテンプレートから構築され、その後、ＣＤＲループが生成される。モデル構築の最後のステップは、ＭＯＥのＡｍｂｅｒ１０ＥＨＴ力場を使用した全原子最小化により行われる精密化である。

配列分析では、まず、生理的なｐＨおよび温度において正電荷の主要な供給源となるであろう重鎖可変領域（Ｖｈ）と軽鎖可変領域（Ｖｌ）の全てのリジン（Ｌｙｓ）およびアルギニン（Ａｒｇ）残基の同定を行った。ＢＭＳ－９８６３２５のこれらのアミノ酸残基の位置をネイティブヒト生殖系列レパートリーに対して評価し、また、ＢＭＳ－９８６３２５を同定したＣＤ４０免疫化から同定された同じ配列ファミリーからの抗体セットに関しても評価して、ＣＤ４０結合を改善するために突然変異を受けた可能性のある残基を同定した。表１６を参照されたい。（ＢＭＳ－９８６３２５の軽鎖可変領域は、カッパ軽鎖「Ｖｋ」である）。

ＣＤ４０結合に潜在的に関与し得る残基からタンパク質エンジニアリングの活動を遠ざけるために配列分析を使用した。構造モデルの分析には、（１）抗体表面上の荷電および疎水性パッチに関してＬｙｓおよびＡｒｇ残基のそれぞれの位置を評価すること、ならびに（２）非塩基性残基への突然変異がこれらの表面特性に対して与える可能性が高い影響を評価することを含めた。荷電パッチとは、折り畳まれたタンパク質構造の表面上で互いに空間的に近接している複数の荷電残基を指す。疎水性パッチとは、折り畳まれたタンパク質構造の表面上で互いに空間的に近接している複数の非荷電残基を指す。

全部で、７個のＬｙｓおよび５個のＡｒｇ残基がＢＭＳ－９８６３２５のＶｈ配列中に同定され、６個のＬｙｓおよび３個のＡｒｇ残基がＶ１配列中に同定された。さらに、Ｖ１の最後の残基（Ｋ１０７）および軽鎖定常領域の最初の残基（Ｒ１０８）は塩基性残基であるため、Ｒ１０８残基は突然変異の基質の一部とみなした。上記の配列および構造モデルの分析に基づき、ＬｙｓとＡｒｇの各残基についてアノテーションを行った：（１）電荷パッチへのそれらのクラスタリング、（２）（ｉ）ＣＤＲの近接性および（ｉｉ）配列ファミリー変異体の結合データに基づく突然変異が結合に影響を与える可能性、（３）生殖系列解析、および（４）構造モデルに基づくその他の予測される特性。表１７を参照されたい。

塩基性残基は、（１）非荷電アミノ酸または（２）酸性残基のいずれかに突然変異された。塩基性残基を突然変異させるアミノ酸残基を選択するために、ＬｙｓまたはＡｒｇの塩基性側鎖を同様な長さの非荷電側鎖に置き換えるアミノ酸としてＧｌｎを優先させた。Ｇｌｕは、同様な長さの負に帯電した側鎖を持つＬｙｓまたはＡｒｇの正電荷を逆転させることにより、正に荷電したパッチのより劇的な破壊をもたらすであろう酸性残基として優先させた。また、より短いＡｓｎおよびＡｓｐの側鎖に共通する脱アミド化（Ａｓｎ）または異性化（Ａｓｐ）の問題を避けるため、ＧｌｎおよびＧｌｕをそれぞれ、ＡｓｎおよびＡｓｐ残基よりも優先的に使用した。また、ＧｌｕおよびＧｌｎは、免疫原性が比較的低いことからも、優先させた。さらに、ＬｙｓおよびＡｒｇの位置をヒト生殖系列レパートリー全体で比較して、塩基性のＬｙｓまたはＡｒｇの側鎖を、他のヒトＩｇＧで構造的に許容されることが知られており、免疫原性のリスクが低い可能性が高い中性または酸性残基で置き換えることができる代替的な天然生殖系列残基を同定した。

上記の分析に基づいて、ＶｈおよびＶｌ領域中のＬｙｓおよびＡｒｇ残基のそれぞれに、突然変異誘発の相対的な優先順位を割り当て、その後さらに、最も優先度の高い突然変異のサブセットを表し得る単一の突然変異または突然変異の組合せからなる１４の突然変異体ＨＣおよび５つの突然変異体ＬＣの短いリストに整理した。表１８および表１９を参照。

さらに、１つの追加の変異体ＨＣ（ＨＣ１３）を概念実証対照として設計し、２つの酸性残基を２つの塩基性残基（Ｅ４６Ｋ、Ｅ６２Ｋ）に置き換えて、オフターゲット結合の増加とＰＫの低下、つまり、他のエンジニアリングされた変異体とは反対の特性を潜在的に示すと予測される、より正に荷電した表面パッチを導入した。

これらの１５個の変異体ＨＣおよび５個の変異体ＬＣを、野生型ＨＣおよび野生型ＬＣと合わせて、全部で１６個のＨＣおよび６個のＬＣコンストラクト（表１８）が得られ、これらを全ての可能なＨＣ×ＬＣの組合せで組み合わせて、９６個の固有の抗体を生成することができた。これらの異なるＨＣおよびＬＣの組合せにおける正味電荷の全体的な変化は、ＨＣ５（ＨＣ－Ｋ１２Ｅ、Ｋ１３Ｑ、Ｋ２３Ｅ）とＬＣ４（ＬＣ－Ｋ４５Ｑ、Ｒ５４Ｑ、Ｒ６１Ｑ）の組合せのマイナス８（－８）から、ＨＣ１３（ＨＣ－Ｅ４６Ｋ、Ｅ６２Ｋ）と野生型ＬＣ１（ＬＣ－ｗｔ）の組合せの概念実証抗体のプラス４（＋４）までの範囲であった。表１９を参照されたい。

［実施例２］
ＢＭＳ－９８６３２５変異体上清の力価分析
１６個のＨＣ×６個のＬＣの組合せの９６個の抗体に、Ｍ１～Ｍ９６の抗体変異体識別番号（Ｍ＃）を割り当てた（表２０）。

１６個のＨＣ×６個のＬＣの組合せから生成された９６個の抗体を一過性のトランスフェクションによって３ｍＬ規模で生成し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６機器を使用して力価を分析した。

各ＨＣ×ＬＣの組合せについて、抗体発現（力価）が検出された。力価は、５μｇ／ｍｌ（Ｍ５６）から３２２μｇ／ｍｌ（Ｍ８０）までの広い範囲にわたって変動し、野生型抗体（Ｍ１／ｗｔ）の力価は１３４μｇ／ｍｌであった。表２１を参照されたい。

特定のＨＣまたはＬＣ突然変異体に関連する力価データにおいて、いくつかの傾向が観察された。例えば、ＨＣパッチ＃２に対する二重または三重の突然変異（ＨＣ８＝ＨＣ－Ｒ３８Ｑ、Ｋ６３Ｑ、Ｒ６７Ｑ、およびＨＣ９＝ＨＣ－Ｋ６３Ｑ、Ｒ６７Ｅ）は、６個のＬＣのいずれかと組合せた場合に抗体価を著しく低下させ、三重突然変異体（ＨＣ８）は、６個の異なるＬＣのいずれかとペアにした場合に特に低い力価（５～７μｇ／ｍｌ）を示した。興味深いことに、ＬＣの突然変異は一般に抗体力価を改善し、突然変異したＬＣを含む抗体の７３／８０（９１％）は、野生型ＬＣとペアになったそれぞれのＨＣよりも高い力価を有していた。表２１を参照されたい。

［実施例３］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体上清のＣＤ４０結合ＳＰＲ分析
９６個の突然変異体ＢＭＳ－９８６３２５抗体を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＣＤ４０結合についてテストした。力価データ（表２１）を使用して、各上清中の抗体濃度を３μｇ／ｍｌに標準化し、これらの抗体をプロテインＡ ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で上清から捕捉し、可溶性ｈＣＤ４０細胞外ドメインの２つの濃度（５ｎＭおよび５０ｎＭ）に対する結合をテストした。実験の最初、中間および最後に３つのフローセルのそれぞれで合計ｎ＝３で精製した野生型ＢＭＳ－９８６３２５を対照として含め、各フローセルでの実験の過程で優れた再現性が示された（表２２）。

９６個の上清サンプルに対するＣＤ４０結合のＫＤ値が表２３にまとめられ、動的結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）（ｋａ）および解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）（ｋｄ）の値のプロット（等親和性プロット）が図１に提供されている。図１からわかるように、変異体の大部分（７２／９５＝７６％）が、野生型抗体Ｍ１と比較してＣＤ４０に対する親和性が同等であるか、または向上さえしていた。複数のＨＣ×ＬＣの組合せで一貫して結合親和性を改善させた突然変異には、パッチ２へのＨＣ突然変異（ＨＣ８、ＨＣ９、ＨＣ１０、ＨＣ１５、ＨＣ１６）および三重ＬＣ突然変異体ＬＣ４（ＬＣ－Ｋ４５Ｑ、Ｒ５４Ｑ、Ｒ６１Ｑ）が含まれる。親和性が低下した変異体には、ＨＣ１１、ＨＣ１２、およびＨＣ１３を含む全ての抗体が含まれていた。図１を参照されたい。これらのうち、ＨＣ１１およびＨＣ１２はどちらも、ＣＤＲ領域に最も近いパッチである塩基性パッチ１への突然変異を含んでいる。ＨＣ１３は、正味正電荷を増加させるようにエンジニアリングされた概念実証対照サンプルである（ＨＣ－Ｅ４６Ｋ、Ｅ６２Ｋ）。

［実施例４］
さらなる精製および追加の特徴付けのためのＢＭＳ－９８６３２５変異体の選択
力価データ、ｈＣＤ４０結合ＳＰＲデータ、および抗体配列と構造モデルのインシリコ分析を総合的に考慮して、追加の特徴付けのために、より大規模に発現させ、精製するための抗体のサブセットを同定した。この分析では、野生型抗体と比較して力価が低い、または親和性が低いなどの特性は望ましくなく、優先順位を下げるのがより適当であるとみなした。しかしながら、最も高い親和性と力価を持つ特定のＨＣ×ＬＣの組合せのみの生産に偏るのではなく、精製された一連の抗体が、５つの塩基性パッチそれぞれに対する少なくとも１つの突然変異を含む、多様な異なる特性を表すことを目指した。例えば、全てのパッチ３突然変異体は、良好な力価とＣＤ４０結合特性を備えて十分に許容され、パッチ４またはパッチ５のＬＣ突然変異体のどちらとも良好に組み合わされるように見えたが、ＨＣ４、ＨＣ５およびＨＣ６変異体は力価の望ましくない減少または結合の損失を伴わずに正味電荷により大きな変化を示したため、ＨＣ２またはＨＣ３を有するものよりも、ＨＣ４、ＨＣ５、およびＨＣ６を含む抗体が優先された。精製されたセットがＭ１３（＋４）からＭ５３（－８）までの正味電荷における変化の全範囲を確実に表すように、Ｍ１３とＭ５３の両方を含めた。精製セットのさらなる多様性のために、このセットには、ＬｙｓおよびＡｒｇがＧｌｕまたはＧｌｎに突然変異した変異体だけでなく、ＬｙｓまたはＡｒｇがＨＣ１４（ＨＣ－Ｋ７４Ｔ）を含むＭ６２、ＨＣ６（ＨＣ－Ｋ１２Ｖ、Ｋ１９Ｓ、Ｋ２３Ａ）を含むＭ３８とＭ５４を含むヒト生殖系列残基に突然変異した変異体も含めた。さらに、総突然変異負荷を低く保ち、不安定性または免疫原性のリスクを軽減するために、ＨＣまたはＬＣへの突然変異が１つしかないいくつかの変異体を含めた。これら全ての要因を考慮した結果、より大規模な発現、精製および特徴付けのための野生型抗体と１５の突然変異体抗体の最終セットを同定した。最終的なセットが表２４に示されている。

［実施例５］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体の発現および精製
表２４からの１６の抗体をＥｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）において、これらの細胞について指し示された条件下で一過的に発現させた。抗体は、追加の分析的および生物物理学的な特徴付けのために精製した。追加の特徴付けには、Ｍ４およびＭ４－ｂとして識別されるＭ４の２つのバッチの生産を含めて、２つの別々の生産過程から生成された材料を比較した；２つの別々の生産過程は、同様な分析的特性と生物物理学的特性を有していることが見出された。

［実施例６］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体のａＳＥＣ分析
ＢＭＳ－９８６３２５と１５の変異体の純度とオリゴマー状態を分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によって特徴付けた。データを表２５に示す。

全てのサンプルが、モノマーの割合が９３％を超え、高分子量（ＨＭＷ）種が７％未満であり、低分子量（ＬＭＷ）種は検出されず、追加の研究に適した品質であることが見出された。

［実施例７］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体のｉｃＩＥＦ分析
ＢＭＳ－９８６３２５の電荷特性に対する様々な突然変異の影響を画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）を使用して評価した。これらのデータを表２６に示す。

野生型ＢＭＳ－９８６３２５のメインピーク等電点（ｐＩ）は９．２１であり、メインピークは７６．１％、酸性変異体は２２．２％、塩基性変異体は１．７％であった。表２６のＭ１を参照。他の全ての抗体のｉｃＩＥＦプロファイルも、主にメインピーク（７１．７～９４．２％）で一貫しており、いくつかの酸性変異体（５．８～２６．１％）と少量の塩基性変異体または塩基性変異体なし（０～２．４％）のいずれかであった。

予想されたとおり、正電荷を増加させるように設計された唯一の突然変異体であるＭ１３は、野生型ＢＭＳ－９８６３２５よりも高いメインピークｐＩ（９．４２）を有することが見出されたが、正に荷電した残基を中性または酸性の残基に置き換えるように設計された他の突然変異体は全て、野生型ＢＭＳ－９８６３２５よりも低いｐＩを持つことが見出された。

［実施例８］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体のａＨＩＣ分析
野生型および突然変異体ＢＭＳ－９８６３２５分子の疎水性を分析的疎水性相互作用クロマトグラフィー（ａＨＩＣ）によって評価した。データは表２７に提供されている。

この分析において、野生型ＢＭＳ－９８６３２５は、１０．１分のメインピーク保持時間（ＲＴ）を持つ単一の対称ピークとして溶出した。表２７のＭ１を参照されたい。Ｍ４、Ｍ１０、Ｍ１３、Ｍ３３、Ｍ３６、Ｍ４７、Ｍ８０、Ｍ８１を含む正に荷電したパッチを破壊するように設計された突然変異のいくつかは、低い疎水性を維持したまま、そうした（ＲＴ＝１０．１～１０．３分）。この抗体のサブセットには、Ｍ４７、Ｍ８０、およびＭ８１などの非荷電残基に突然変異した１つまたは２つの荷電残基を有する変異体が含まれている。対照的に、テストされた最も突然変異の多い軽鎖であり、３つの荷電残基が３つの非荷電残基に置き換えられたＬＣ４（ＬＣ－Ｋ４５Ｑ、Ｒ５４Ｑ、Ｒ６１Ｑ）を利用する変異体は全て、野生型と比較して疎水性が増加していた（ＲＴ＝１０．５～１０．８分）。

ＢＭＳ－９８６３２５変異体の不均一性もまた、突然変異が増えるにつれて一般に増加した。例えば、３つの突然変異（ＨＣ５、ＨＣ６、ＬＣ４）を含むＨＣまたはＬＣを利用する抗体は全て、８０％未満のメインピークとして溶出し、それに対応してピーク後の（後で溶出する）より疎水性の種のレベルが増加していた。ＨＣとＬＣのそれぞれに３つの突然変異を有し、合計６個の突然変異を有する２つの変異体（Ｍ５３とＭ５４）は、特に高い不均一性を示し、メインピークは５３．４～５５．２％、ピーク後は４６．６～４４．８％であった。

［実施例９］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体のＵＮｃｌｅ熱安定性解析
ＢＭＳ－９８６３２５変異体の構造およびコロイド安定性をＵＮｃｌｅ機器（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ、プレザントン、カリフォルニア）を使用して蛍光分光法および静的光散乱（ＳＬＳ）によってそれぞれ調査した。各抗体の熱変性は、蛍光の明瞭な変化を伴っており、これを重心平均（ＢＣＭ）法でモニターし、フィッティングして、融解温度１（Ｔ_ｍ１）値を決定することができた。これに続いて、変性タンパク質分子の凝集を指し示すＳＬＳの大幅な増加が高温で生じ、これから、２６６ｎｍ（Ｔ_ａｇｇ２６６）または４７３ｎｍ（Ｔ_ａｇｇ４７３）のいずれかでモニタリングすることにより、凝集開始温度（Ｔ_ａｇｇ）を決定できる。

データを表２８に示す。

野生型ＢＭＳ－９８６３２５のＴ_ｍおよびＴ_ａｇｇ値（３回の測定の平均±標準偏差）は、Ｔ_ｍ１＝６５．８±０．３℃、Ｔ_ａｇｇ２６６＝７９．７±０．１℃、およびＴ_ａｇｇ４７３＝７９．８±０．４℃であった。全ての抗体変異体のＴ_ｍ１値は６５．１～６７．６℃であり、Ｍ３７を除く全ての変異体が野生型ＢＭＳ－９８６３２５と比較して同等（標準偏差以内）またはわずかに高いＴ_ｍ１を有していた。対照的に、Ｔ_ａｇｇは、Ｔ_ａｇｇ２６６（７０．６～７９．９℃）とＴ_ａｇｇ４７３（７０．６～８０．３℃）で、より広い範囲で変動し、Ｍ３３を除く全ての変異体が野生型よりも低いＴ_ａｇｇ値を有していた。

この抗体のセットについて、突然変異の数とＴ_ａｇｇ値との間に直接的な相関は観察されず、これは、突然変異の位置とアミノ酸変化のアイデンティティが抗体の熱安定性を維持するために科学的に重要であることを示唆している。例えば、Ｍ６２（合計４つの突然変異）のＴ_ａｇｇは、１、２または３つの突然変異しか持たないいくつかの突然変異体（Ｍ４、Ｍ１０、Ｍ１３、Ｍ３６、Ｍ４７、Ｍ４９、Ｍ８０、Ｍ８１）のものよりも高かったのに対し、Ｍ１０では単一の変異が、Ｔ_ａｇｇ２６６＝７２．６℃およびＴ_ａｇｇ４７３＝７２．２℃という著しい不安定化を引き起こしていた。

［実施例１０］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体のＥＣＭ ＥＬＩＳＡ分析
正に荷電したＢＭＳ－９８６３２５表面パッチの酸性表面への非特異的結合の可能性、およびそれらの相互作用に対する突然変異の影響を評価するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）結合ＥＬＩＳＡアッセイを利用した。データを表２９に示す。

野生型ＢＭＳ－９８６３２５（Ｍ１）は、１μＭ濃度で２３．５のＥＣＭスコアという強いＥＣＭ結合反応を生じた。予想されたとおり、Ｅ４６Ｋ－Ｅ６２Ｋ二重突然変異により正電荷パッチが追加導入された概念実証対照分子Ｍ１３は、１μＭ濃度で７２．０のＥＣＭスコアという野生型ＢＭＳ－９８６３２５よりもはるかに強いＥＣＭ結合反応を示すことが見出された。単一のＨＣ－Ｒ６７Ｅ突然変異（Ｍ１０）は、野生型抗体と比較してＥＣＭスコアへの影響が最も小さく、ＥＣＭスコアは１μＭ濃度で２１．７であった。Ｍ４、Ｍ８０およびＭ８１は、ＥＣＭ結合がいくらか減少したが、測定可能なＥＣＭ結合を維持していた（１μＭでＥＣＭスコア＝８．１～１４．０）。他の全ての変異体（Ｍ３３、Ｍ３６、Ｍ３７、Ｍ３８、Ｍ４７、Ｍ４９、Ｍ５３、Ｍ５４、Ｍ６２、Ｍ６３）は、大幅に減少したＥＣＭ結合反応を示し、ＥＣＭスコアは１μＭで１．４～３．１であった。

［実施例１１］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体のＣＤ４０結合ＳＰＲ解析
ＢＭＳ－９８６３２５および１５の精製変異体のＣＤ４０標的結合動態および親和性は、上清スクリーニング実験において２つの分析物濃度だけではなく、６つのＣＤ４０分析物濃度の完全なセットを精製抗体についてテストしたことを除いて、９６個の小規模発現上清のスクリーニングに以前に用いたＳＰＲ法と同様なＳＰＲ法を用いて評価した。さらに、解離速度（ｋｄ）をより正確に定義するために、上清スクリーニング実験で使用された、より短い１８０秒の解離とは対照的に、３６０秒（ｓ）のより長い解離時間を使用した。

データを表３０に示す。

精製された抗体へのＣＤ４０結合に対する突然変異の観察された影響は、上清で観察されたものと同様であり、Ｍ１３は野生型ＢＭＳ－９８６３２５より著しく低い親和性を有し、他の変異体は同様またはわずかに高い親和性を有していた。

［実施例１２］
ＢＭＳ－９８６３２５変異体の機能的効力解析
初代ヒト扁桃Ｂ細胞に対するＣＤ４０Ｌ刺激活性を阻害するＢＭＳ－９８６３２５の機能的効力に対する突然変異の影響をテストした。データは表３１に提供されている。

全ての突然変異体が、可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体（ＩＺ－ｈＣＤ４０Ｌ）により刺激されるＢ細胞増殖の強力な阻害を示し、ほとんどの突然変異体が、ＢＭＳ－９８６３２５と同様の効力を示し、ＩＣ５０値は２～３倍以内（典型的に、突然変異体Ｍ４の２つのロットにより示されるように、これらのアッセイにおけるドナーの変動の範囲）であった。例外には、いくつかの突然変異体、Ｍ６２、Ｍ８０９、Ｍ１０、およびＭ３８が含まれ、これらはわずかに低い効力を示した。

同様に、全ての突然変異体が、細胞表面のＣＤ４０Ｌ（ＣＨＯ－ＣＤ４０Ｌ）によって刺激されるＢ細胞の増殖を阻害したが、これは典型的には、阻害するのがより困難である。これらの実験において、いくつかの突然変異体はわずかに効力が弱くなっていたが、テストした２つのドナー間で高い変動が見られた（Ｍ６２、Ｍ８０、Ｍ１０、Ｍ６３、Ｍ３７、Ｍ３８、Ｍ５４）；残りの突然変異体は、ＢＭＳ－９８６３２５で観察された効力の３倍以内であった。まとめると、このデータは、ほとんどの突然変異はＣＤ４０の効力に最小限の影響しか与えず、選択された数の突然変異が効力のわずかなシフトを示すのみであることを示唆している。

アゴニスト活性を有する可能性があると記載されている先行技術のＣＤ４０抗体が存在する。対照的に、ＢＭＳ－９８６３２５は純粋なアンタゴニストであり、単独でも、Ｂ細胞を増殖および活性化シグナルに感作するＩＬ－４と組み合わせても、Ｂ細胞に対して受容体活性化作用を示さない。潜在的な受容体活性化作用に影響を与える突然変異の可能性についても、増殖およびサイトカイン産生をアッセイすることによってＢ細胞刺激をモニタリングすることによりテストした。図２～７は、ＢＭＳ－９８６３２５のアゴニスト活性の可能性を、ＩＬ－４刺激ヒトＢ細胞を用いて増殖（図２～４）およびサイトカイン分泌（図５～７）を測定して評価したデータを示している。Ｂ細胞において各分子を合計２つのドナーでテストしたところ、１つ（Ｍ８１）を除いて、突然変異体のいずれも、受容体活性化作用を引き起こさなかった。Ｍ８１突然変異体は、テストした２つのドナーの１つでＩＬ－４の存在下でのみ増殖の弱い増加を示し、テストした両方のドナーでＩＬ－４の存在下でのみＩＬ－６の産生を示した。これらのデータは、この突然変異が、結果として得られる抗体の構造を変化させ、ある程度の受容体活性化作用を可能にすることを示唆している。

［実施例１３］
ＢＭＳ－９８６３２５および変異体の固有の薬物動態
ＢＭＳ－９８６３２５とその変異体の「固有」のＰＫを図８に示し、計算された「固有」のＰＫパラメーターを表３２に示す。

マウスへのＢＭＳ－９８６３２５の静脈内（ＩＶ）投与（単回１ｍｇ／ｋｇ用量）の後、ＢＭＳ－９８６３２５は０．５６ｍＬ／ｈ／ｋｇという低い平均総血清クリアランス「ＣＬ」、０．１４Ｌ／ｋｇの限定的な定常状態分布容積Ｖｓｓ、および１６８時間（約７日間）の見かけの排泄半減期Ｔ－Ｈａｌｆを示した。変動性の範囲内で、Ｍ１３を除く全ての変異体（Ｍ３９、Ｍ３３、Ｍ４７、Ｍ４、Ｍ３６、およびＭ５３）が、ＷＴと同等またはそれ以上のＰＫを有している（２倍以内のＣＬおよび度－時間曲線下面積「ＡＵＣ」）。対照的に、この用量では、変動の範囲内で、Ｍ１３変異体のＰＫはＷＴのＰＫよりも悪い（ＡＵＣが３．２倍低く、ＣＬが５．３倍高い）。Ｍ３９、Ｍ３３、Ｍ４７、Ｍ４、Ｍ３６およびＭ５３のそれぞれで、これらのＰＫパラメーターの少なくとも１つの値が改善され、ほとんどの変異体で、これらのＰＫパラメーターの少なくとも２つの値が改善されていた。

したがって、この用量では、変動の範囲内で、Ｍ１３を除く全ての変異体の全体的なＰＫが、野生型ＢＭＳ－９８６３２５のそれと同等か、わずかに優れている。つまり、この用量では、変動の範囲内で、Ｍ１３は野生型ＢＭＳ－９８６３２５よりもＰＫが悪い（ＡＵＣが低く、クリアランスが高い）のに対し、他の全ての変異体のＰＫは野生型ＢＭＳ－９８６３２５と同等か、または改善されている。

実施例１～１３の材料および方法
ＢＭＳ－９８６３２５変異体のクローニング：ＣＤ４０ ｍＡｂ重鎖ＢＭＳ－９８６３２５－ＩｇＧ１ａ－Ｐ２３８Ｋ－Ｋ１２Ｑ－Ｋ１３ＱおよびＢＭＳ－９８６３２５－ＩｇＧ１ａ－Ｐ２３８Ｋ－Ｒ６３Ｑのコード配列は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）発現用に最適化されたコドンであり、合成ＤＮＡフラグメントを改変ｐＴＴ５哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。残りのＣＤ４０ ｍＡｂ重鎖は、テンプレートとして上記の２つのコンストラクトの１つを使用して突然変異誘発によって生成した。

ＣＤ４０ ｍＡｂ軽鎖ＢＭＳ－９８６３２５－Ｖｋ－Ｋ４５Ｑ－ｈＬＣのコード配列もＣＨＯ発現用に最適化されたコドンであり、合成ＤＮＡフラグメントを同じｐＴＴ５ベクター中にクローニングした。残りのＣＤ４０ ｍＡｂ軽鎖は、上記の軽鎖コンストラクトをテンプレートとして用いた突然変異誘発によって生成した。

ＢＭＳ－９８６３２５およびＢＭＳ－９８６３２５変異体の発現：最初のスクリーニング実験では、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ）を使用して、抗体を３ｍｌ規模で発現させた。ＤＮＡ／Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）の比率は１：２．７であった；ＤＮＡ量は０．５ｍｇ／Ｌであった。細胞播種密度は２．７×１０^６（トランスフェクション後の細胞密度は２．５×１０^６）であった。トランスフェクションの２４時間後に細胞に０．５Ｍバルプロ酸を最終濃度２ｍＭまで、また、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）からのＣＨＯ ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｂ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ；カタログ番号Ａ１０２４０－０２）を最終容量５％まで供給した。培養増殖条件は３７℃、加湿した８％のＣＯ_２であった。５日目に遠心分離によって上清を回収した。より大規模な発現は、０．５Ｌ規模で行った。

ＢＭＳ－９８６３２５およびＢＭＳ－９８６３２５変異体の精製：清澄化した抗体が豊富な上清を５ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）（Ｃｙｔｉｖａ、マールボロ、マサチューセッツ）カラムに結合させ、ベースラインに達するまで５カラム容量の１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で洗浄した。抗体を５０ｍＭ酢酸ｐＨ３．０で溶出させ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２６／１０脱塩カラムにかけてバッファーをＰＢＳ ｐＨ７．２に交換した。全てのサンプルには５％を超える不純物が含まれており、これらの不純物を除去するためにＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００２６／６００プレップグレード（ｐｇ）調製用ＳＥＣ（ｐＳＥＣ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ、イリノイ）にかけた。次に、サンプルを少なくとも１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、凍結する前に０．２μｍフィルターで濾過した。

Ｏｃｔｅｔ ＢＬＩ力価分析：抗体力価は、ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４およびプロテインＡセンサーチップを使用して決定した。ＰＢＳ－Ｔバッファー中の濃度範囲１５０～１．１７μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１ｆアイソタイプ標準抗体を使用して、８点の標準曲線を作成した。標準曲線は三重に作成した。サンプル上清をＰＢＳ－Ｔバッファー（１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン３０（ＰＢＳ－Ｔ）ｐＨ７．２）で１：２倍に希釈した。標準曲線とサンプルを黒色平底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れ、ウェルの最終容量を１００μＬとした。プロテインＡセンサーチップは、実行開始前に約１０分間ＰＢＳ－Ｔバッファーで水和させた。結合は３０μＬ／分で１８０秒であり、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５を使用してプロテインＡセンサーチップを再生させた。データは、Ｏｃｔｅｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓを使用して取得した。

抗体上清のＣＤ４０結合ＳＰＲ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）試験は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ、イリノイ）で実施した。シリーズＳプロテインＡセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ、イリノイ）を１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳ－Ｔ）ｐＨ７．２、２５℃のＳＰＲランニングバッファーで平衡化させた。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＪＡＮＵＳ（登録商標）Ｇ３システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、アクロン、オハイオ）を使用して、ＰＢＳ－Ｔで希釈することにより９６個の抗体上清を３μｇ／ｍｌの濃度に標準化した。システムをプライミングした後、３μｇ／ｍｌの抗体サンプルをプロテインＡ表面に１０μｌ／分で３０秒間捕捉させた。５０ｎＭおよび５００ｎＭのヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（自社製造）の結合を、３０μｌ／分で１８０秒の結合時間とそれに続く３０μｌ／分で１８０秒の解離時間を使用して評価した。サイクル間の再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の２回の１５秒間の注入を使用して達成した。野生型ＢＭＳ－９８６３２５は、合計９回の測定のために、３つの独立したフローセルのそれぞれで３回別々にテストした。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、１：１ラングミュアモデルにフィッティングさせることにより、データを分析した。

ＣＤ４０結合ＳＰＲ：精製した抗体のＳＰＲ試験は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ、イリノイ）で実施した。シリーズＳプロテインＡセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、シカゴ、イリノイ）を１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳ－Ｔ）ｐＨ７．２、２５℃のＳＰＲランニングバッファーで平衡化させた。精製した抗体サンプルをＰＢＳ－Ｔで３μｇ／ｍｌに希釈し、１０μｌ／分で３０秒間、プロテインＡ表面に捕捉させた。３．９１、７．８１、１５．６、３１．３、６２．５および１２５ｎＭのヒトＣＤ４０細胞外ドメイン（自社製造）との結合は、３０μｌ／分で１８０秒の結合時間とそれに続く３０μｌ／分で３６０秒の解離時間を使用して評価した。サイクル間の再生は、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の２回の１５秒間の注入を使用して達成した。野生型ＢＭＳ－９８６３２５は、３つの独立したフローセルのそれぞれで１回ずつテストした。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して、１：１ラングミュアモデルにフィッティングさせることにより、データを分析した。

ａＳＥＣ分析：Ｓｈｏｄｅｘ（商標）Ｋ４０３－４Ｆカラム（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、ニューヨーク）をＡｇｉｌｅｎｔ１２６０シリーズＨＰＬＣシステムに接続し、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７．３（０．１μｍ濾過）を含むバッファー中、０．３ｍＬ／分でアイソクラティック分離を行った。２０μｇの抗体の注入は、Ａｇｉｌｅｎｔオートサンプラーを使用して行い、Ａｇｉｌｅｎｔダイオードアレイ検出器を使用して２８０ｎｍ、２６０ｎｍ、２１４ｎｍ、２５４ｎｍで読み取りを行い、３６０ｎｍのリファレンス減算を使用して、データを取得した。データはＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ソフトウェアを使用して分析した。

ｉｃＩＥＦ分析：画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）実験は、Ｍａｕｒｉｃｅ機器（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、サンノゼ、カリフォルニア）で実行した。機器の設定には、１５００Ｖで１分間のプリフォーカスと３０００Ｖで１０分間のフォーカスが含まれる。抗体サンプルをまず、二重蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で最終濃度２ｍｇ／ｍＬに希釈した。最終的なプレートでは、サンプル２０μＬを１８０μＬのマスターミックス（ＭＭ）と混合し、最終濃度を０．３５％メチルセルロース（ＭＣ）、２．０Ｍ尿素、１％ ｖ／ｖ％ Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（登録商標）５－８、および３％ ｖ／ｖ％ Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（登録商標）８－１０．５とした。ＭＭには、サンプルごとに１．０％ ＭＣ溶液（７０μＬ）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（登録商標）５－８（２μＬ）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（登録商標）８－１０．５（６μＬ）、８Ｍ尿素（５０μＬ）、アルギニン（１００×）、ｄｄ水（５０μＬ）、ｐＩマーカー５．８５（１μＬ）、およびｐＩマーケット１０．１０（１μＬ）（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（登録商標）、Ｃｙｔｉｖａ、マールボロ、マサチューセッツ）が含まれている。データはＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅのＣｏｍｐａｓｓ ｆｏｒ ｉＣＥを使用して取得、解析した。

ａＨＩＣ分析：高性能分析疎水性相互作用クロマトグラフィー（ａＨＩＣ）法は、Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０シリーズＨＰＬＣで実行した。データは２８０ｎｍで収集し、３６０ｎｍで参照減算を行った。分離には、寸法４．６ｍｍ×３．５ｃｍ、粒子径２．５μｍ、流速１ｍＬ／分のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌブチルＮＰＲカラムを使用した。０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中、１．８Ｍから０．０Ｍの範囲の硫酸アンモニウムの２０分間の直線勾配。カラムとオートサンプラーの温度は、それぞれ２５℃と４℃に設定した。カラムローディングは１０μｇであった。データはＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ソフトウェアを使用して分析した。

熱安定性解析：融解開始温度および凝集開始温度の決定は、ＵＮｃｌｅ機器（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を利用して実行した。簡単に説明すると、１ｍｇ／ｍＬのサンプル９μＬをサンプルＵｎｉキュベットに装填し、密閉して、機器に配置した。サンプルに０．５℃／分で２５℃から９０℃までの温度勾配を適用した。フルスペクトルのＵＶ吸光度（２５０ｎｍ～７２５ｎｍ）、および２６６ｎｍと４７３ｎｍにおける静的光散乱発光を各時点で取得した。結果として得られたＴ_ｍ／Ｔ_ａｇｇのフィッティングは、ＵＮＣＬＥ解析ソフトウェア（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）を用いて行った。

ＥＣＭ結合ＥＬＩＳＡ分析：細胞外マトリックス（ＥＣＭ）結合ＥＬＩＳＡアッセイは、９６ウェルのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｔｈｉｎ－Ｌａｙｅｒ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ＭａｔｒｉｘプレコートＥＣＭプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、テュークスベリー、マサチューセッツ）を使用して実行した。プレートを３００μｌのブロッキングバッファー（ＴＢＳ中の１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ））と共に室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、１μＭ、０．３３μＭ、および０．１１μＭの抗体サンプルと共に１００μｌの新鮮なブロッキングバッファーを添加した。６つのウェルには、バックグラウンドとＥＣＭスコアの計算のためにサンプルを加えなかった。１時間のサンプルインキュベーションの後、サンプルを取り出し、プレートをＰＢＳ－Ｔ洗浄バッファーで３回洗浄した。１０ｎｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）結合検出抗体を全てのウェルに１００μｌ添加した。室温でさらに１時間インキュベーションした後、ウェルをＰＢＳ－Ｔ洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄後、１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’－メチルベンジジン）基質を各ウェルに添加し、１５分間反応させた後、１００μｌの１Ｍリン酸停止溶液を添加した。次に、マイクロプレートリーダーで６２０ｎｍを基準として４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

ヒトＢ細胞アッセイにおけるＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体のインビトロ活性評価：簡単に説明すると、ヒト扁桃Ｂ細胞を日常的な扁桃切除術の際に小児患者から取得した。組織を穏やかにすりつぶした後、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）－Ｈ分離培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ、バーリントン、オンタリオ、カナダ）を用いた密度勾配分離によって単核細胞を分離し、洗浄し、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｅｒｕｍ Ｃｏｍｐａｎｙ；デンバー、コロラド）でロゼット化した後、密度勾配分離を行ってＴ細胞を除去した。細胞を洗浄し、１０％ウシ胎児血清（カタログ番号２６１４０）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（カタログ番号１５７５０）および１％抗生物質－抗菌剤（カタログ番号１５２４０）で補充した２ｍＭ Ｌ－グルタミン（カタログ番号１１８７５）を含むＲＰＭＩ－１６４０からなる完全培地に再懸濁させた（全てＧｉｂｃｏ；カールズバッド、カリフォルニアから購入）。

可溶型または膜結合型のＣＤ４０Ｌ刺激によるヒトＢ細胞増殖の阻害：イソロイシンジッパーヒトＣＤ４０Ｌ三量体（ＩＺ－ｈＣＤ４０Ｌ）またはヒトＣＤ４０Ｌで安定的にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－ｈＣＤ４０Ｌ）をＣＤ４０活性化の刺激および陽性対照として使用した。ＣＤ４０アゴニストｍＡｂ２１４１－ｈＨＣＤ－ＩｇＧ２－ｐｕＣＯＥｇａｔｅ－ＳＰ５を、アゴニスト抗体によるＣＤ４０経路活性化の陽性対照として使用した。ＢＭＳ－９８６３２５抗体を完全培地中で滴定し、３連で９６ウェル丸底プレートにピペッティングした。１×１０^５個の扁桃Ｂ細胞を加え、可溶性ＩＺ－ｈＣＤ４０Ｌ（３μｇ／ｍｌ）または１０，０００ラッドを照射したＣＨＯ－ｈＣＤ４０Ｌのいずれかで刺激し、最終容量２００μｌ／ウェル中に２×１０^３細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター中で７２時間インキュベートした。インキュベーションの最後の７時間の間に、細胞を１ウェルあたり０．５μＣｉの［メチル－^３Ｈ］－チミジンで標識し、ガラス繊維フィルタープレート上に回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）ＮＸＴ（商標）カウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、シェルトン、コネチカット）で液体シンチレーションにより計数した。Ｂ細胞の増殖は、チミジンの取り込みに基づいて定量化した。分析には、３連の値から４パラメーター曲線を作成し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いてフィッティングした。

ＢＭＳ－９８６３２５およびＢＭＳ－９８６３２５変異体によるヒトＢ細胞に対する潜在的な受容体活性化作用の評価：ＢＭＳ－９８６３２５および変異体抗体を完全培地中で滴定し、９６ウェル丸底プレートに２連でピペッティングした。２×１０^５個の扁桃Ｂ細胞を加え、可溶性ｈＩＬ－４（２０ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、抗体のみ、または抗体プラスＩＬ－４および可溶性ＩＺ－ｈＣＤ４０Ｌ（３μｇ／ｍｌ）で刺激した。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター中で７２時間インキュベートした。

メーカーの指示に従い、ＡｌｐｈａＬｉｓａ（登録商標）（カタログ番号ＡＬ３０２５Ｃ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ）によるＩＬ－６の測定のために４８時間の時点で培地をサンプリングし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）２１０５マルチモードプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ）で読み取った。ＩＬ－６の産生については、対照の２倍を超える誘導を、受容体活性化作用の陽性の指標とみなした。

インキュベーションの最後の７時間の間に、細胞を１ウェル当たり０．５μＣｉの［メチル－^３Ｈ］－チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ）で標識し、ガラス繊維フィルタープレート上に回収し、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）ＮＸＴ（商標）カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ）で液体シンチレーションにより計数した。Ｂ細胞の増殖は、チミジンの取り込みに基づいて定量化した。分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いて、２連の値を平均化し、定量した。対照、非刺激、またはＩＬ－４単独の２倍を超える誘導を、受容体活性化作用について陽性であるとみなした。

ＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体の１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける単回投与薬物動態の試験：ＢＭＳ－９８６３２５とその変異体のいずれもマウスＣＤ４０とは交差反応しないため、このようにして収集されたＰＫは、抗ＣＤ４０抗体に典型的な標的媒介薬物処分（ＴＭＤＤ）の影響のない抗体の「固有のＰＫ」であった。簡単に説明すると、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにリン酸バッファー（ＰＢＳ）中の抗体１ｍｇ／ｋｇを静脈内投与し、９０μＬのＲｅｘｘｉｐ（登録商標）Ａ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ツーソン、アリゾナ）を含むチューブに１０μＬの全血を６週間にわたって経時的に採取した。十分に混合した後、チューブを生物分析まで凍結させた。

Ｇｙｒｏｓイムノアッセイによるマウス微量試料中のＢＭＳ－９８６３２５およびその変異体の分析：解凍後、血液サンプルを遠心分離し、Ｇｙｒｏｌａｂ（登録商標）ｘＰ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ツーソン、アリゾナ）上で適格な自動のマイクロ流体蛍光免疫測定法を用いて、抗体について上清を分析した。簡単に説明すると、１００μｇ／ｍｌのビオチン化ｈｕＣＤ４０マウスＩｇＧ２ｂを「活性／遊離」抗体の捕捉分子として使用した。サンプルは、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％ツイーン（登録商標）２０（ＰＴＢ；Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、エジソン、ニュージャージー）中の１０％最小必要希釈で分析した。標準サンプル、ＱＣサンプル、および試験サンプルは、Ｒｅｘｘｉｐ（登録商標）Ａ Ｂｕｆｆｅｒで１０％のマウス血液の最終マトリックス濃度に調整して、Ｇｙｒｏｌａｂに装填した。Ｇｙｒｏｌａｂ（登録商標）Ｂｉｏａｆｆｙ ２００ ＣＤを用いた３ステップのウィザード法を使用した。最後の洗浄ステップの後、捕捉された「活性／遊離」抗体は、Ａｌｅｘａ ６４標識サル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ｍＡｂクローン１６２８．３３７９．１０Ｃ７．Ｄ１２を使用して検出した。血液サンプル中の抗体の濃度（「活性／遊離」）は、４ＰＬ（パラメーターロジスティック）回帰標準検量線を使用して、Ｇｙｒｏｌａｂによって測定された対応する蛍光強度に基づいて計算した。アッセイ性能は許容範囲内であり、標準およびＱＣの％ＣＶは２０％未満で、ＱＣ回収率は公称値の±２０％以内であった。

これらのデータは、単に抗体の総電荷を改変するのではなく、表面電荷パッチを改変する突然変異の特定の部位または位置が、抗体ＰＫを改善するために重要であるという仮説と一致している。例えば、戦略的に配置された１つまたは２つの突然変異を有し、－２（Ｍ３３）または－３（Ｍ４７）の全体的な電荷の変化が少ない変異体は、６個の突然変異を有し、－８（Ｍ５３）という大きな電荷の変化を有する変異体と比較して同等以上のＰＫを有している。

本実施形態は、上記の実施例を参照して詳細に説明されたが、これらの実施形態の精神から逸脱することなく様々な改変を行うことができ、当業者には容易に知られるであろうことが理解される。

本明細書に記載された例示的な特定の処置方法、医薬、および用途を含む、本明細書に開示されたこれらおよび他の態様は、本明細書に含まれる教示から明らかとなるであろう。

Claims (39)

1. ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、
   （ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ２（配列番号５９）、ＨＣ３（配列番号６０）、ＨＣ４（配列番号４４）、ＨＣ５（配列番号４６）、ＨＣ６（配列番号６１）、ＨＣ７（配列番号６２）、ＨＣ８（配列番号６３）、ＨＣ９（配列番号６４）、ＨＣ１６（配列番号６５）、ＨＣ１０（配列番号６６）、ＨＣ１５（配列番号４３）、ＨＣ１１（配列番号６７）、ＨＣ１２（配列番号６８）、およびＨＣ１４（配列番号６９）から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ１（配列番号４５）を含むか；
   （ｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４０）、ＨＣ２（配列番号５９）、ＨＣ３（配列番号６０）、ＨＣ４（配列番号４４）、ＨＣ５（配列番号４６）、ＨＣ６（配列番号６１）、ＨＣ７（配列番号６２）、ＨＣ８（配列番号６３）、ＨＣ９（配列番号６４）、ＨＣ１６（配列番号６５）、ＨＣ１０（配列番号６６）、ＨＣ１５（配列番号４３）、ＨＣ１１（配列番号６７）、ＨＣ１２（配列番号６８）、およびＨＣ１４（配列番号６９）、およびＨ１３（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ２（配列番号７０）を含むか；
   （ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４０）、ＨＣ２（配列番号５９）、ＨＣ３（配列番号６０）、ＨＣ４（配列番号４４）、ＨＣ５（配列番号４６）、ＨＣ６（配列番号６１）、ＨＣ７（配列番号６２）、ＨＣ８（配列番号６３）、ＨＣ９（配列番号６４）、ＨＣ１６（配列番号６５）、ＨＣ１０（配列番号６６）、ＨＣ１５（配列番号４３）、ＨＣ１１（配列番号６７）、ＨＣ１２（配列番号６８）、およびＨ１４（配列番号６９）、ならびにＨ１３（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号４２）を含むか；
   （ｉｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４０）、ＨＣ２（配列番号５９）、ＨＣ３（配列番号６０）、ＨＣ４（配列番号４４）、ＨＣ５（配列番号４６）、ＨＣ６（配列番号６１）、ＨＣ７（配列番号６２）、ＨＣ８（配列番号６３）、ＨＣ９（配列番号６４）、ＨＣ１６（配列番号６５）、ＨＣ１０（配列番号６６）、ＨＣ１５（配列番号４３）、ＨＣ１１（配列番号６７）、ＨＣ１２（配列番号６８）、およびＨＣ１４（配列番号６９）、ならびにＨ１３（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（配列番号４１）を含むか；
   （ｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４０）、ＨＣ２（配列番号５９）、ＨＣ３（配列番号６０）、ＨＣ４（配列番号４４）、ＨＣ５（配列番号４６）、ＨＣ６（配列番号６１）、ＨＣ７（配列番号６２）、ＨＣ８（配列番号６３）、ＨＣ９（配列番号６４）、ＨＣ１６（配列番号６５）、ＨＣ１０（配列番号６６）、ＨＣ１５（配列番号４３）、ＨＣ１１（配列番号６７）、ＨＣ１２（配列番号６８）、およびＨＣ１４（配列番号６９）、ならびにＨ１３（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ５（配列番号９０）を含むか；
   または
   （ｖｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４０）、ＨＣ２（配列番号５９）、ＨＣ３（配列番号６０）、ＨＣ４（配列番号４４）、ＨＣ５（配列番号４６）、ＨＣ６（配列番号６１）、ＨＣ７（配列番号６２）、ＨＣ８（配列番号６３）、ＨＣ９（配列番号６４）、ＨＣ１６（配列番号６５）、ＨＣ１０（配列番号６６）、ＨＣ１５（配列番号４３）、ＨＣ１１（配列番号６７）、ＨＣ１２（配列番号６８）、およびＨＣ１４（配列番号６９）、ならびにＨ１３（配列番号７１）から選択されるアミノ酸配列を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ６（配列番号７２）を含む、
   単離された抗体またはその抗原結合部分。
2. ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、
   （ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４０）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（配列番号４１）を含むか；
   （ｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４０）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号４２）を含むか；
   （ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１５（配列番号４３）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号４２）を含むか；
   （ｉｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４（配列番号４４）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ１（配列番号４５）を含むか；
   （ｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４（配列番号４４）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号４２）を含むか；
   または
   （ｖｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ５（配列番号４６）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（配列番号４１）を含む、
   単離された抗体またはその抗原結合部分。
3. 前記抗体が、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、
   （ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４７）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（配列番号２０）を含むか；
   （ｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号４７）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号１９）を含むか；
   （ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１５（配列番号８６）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号１９）を含むか；
   （ｉｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４（配列番号４９）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ１（配列番号１７）を含むか；
   （ｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４（配列番号４９）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号１９）を含むか；
   または
   （ｖｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ５（配列番号５０）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（配列番号２０）を含む、
   請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
4. 前記第１のポリペプチド部分が、
   （ｉ）配列番号９１；
   （ｉｉ）配列番号８４；
   （ｉｉｉ）配列番号８５
   からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
5. 前記抗体が、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、
   （ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号５６）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（配列番号２０）を含むか；
   （ｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１（配列番号５６）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号１９）を含むか；
   （ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１５（配列番号８４）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号１９）を含むか；
   （ｉｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４（配列番号８４）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ１（配列番号１７）を含むか；
   （ｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４（配列番号８４）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３（配列番号１９）を含むか；
   または
   （ｖｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ５（配列番号８５）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４（配列番号２０）を含む、
   請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
6. 前記重鎖可変領域が、ＨＣ１（配列番号４０）を含み；前記軽鎖可変領域が、ＬＣ４（配列番号４１）を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
7. 前記重鎖可変領域が、ＨＣ１（配列番号４０）を含み；前記軽鎖可変領域が、ＬＣ３（配列番号４２）を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
8. 前記重鎖可変領域が、ＨＣ１５（配列番号４３）を含み；前記軽鎖可変領域が、ＬＣ３（配列番号４２）を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
9. 前記重鎖可変領域が、ＨＣ４（配列番号４４）を含み；前記軽鎖可変領域が、ＬＣ１（配列番号４５）を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
10. 前記重鎖可変領域が、ＨＣ４（配列番号４４）を含み；前記軽鎖可変領域が、ＬＣ３（配列番号４２）を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
11. 前記重鎖可変領域が、ＨＣ５（配列番号４６）を含み；前記軽鎖可変領域が、ＬＣ４（配列番号４１）を含む、請求項２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
12. 抗原結合部分がｓｃＦｖ－Ｆｃである、請求項２から１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
13. 抗体またはその抗原結合部分が、治療剤に連結されている、請求項２から１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
14. 抗体またはその抗原結合部分が、前記抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結されている、請求項２から１３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
15. 付加的な部分をさらに含む、請求項２から１４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
16. 請求項２から１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を処置または予防する方法。
17. 請求項２から１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における自己免疫疾患または炎症性疾患を処置または予防する方法。
18. 抗体またはその抗原結合部分が、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と共に投与される、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤がＣＴＬＡ４突然変異体分子である、請求項１８に記載の方法。
20. 前記ＣＴＬＡ４突然変異体分子がＬ１０４ＥＡ２９Ｙ－Ｉｇ（ベラタセプト）である、請求項１９に記載の方法。
21. 対象が、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、目の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病、副睾丸炎、糸球体腎炎、バセドウ病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組み換え医薬品（例えば、血友病患者の第ＶＩＩ因子）に対する免疫応答、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される疾患を有する、請求項１６または１７に記載の方法。
22. 単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、
    （ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１フレームワーク（配列番号：７３）を含み、前記軽鎖可変領域は、ＬＣ１フレームワーク（配列番号７４）を含み；
    重鎖可変領域および軽鎖可変領域の少なくとも１つが、塩基性残基における突然変異を含み、重鎖可変領域の突然変異は、配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４の位置、ならびにそれらの組合せからなる群から選択され、ならびに／または軽鎖可変領域の突然変異は、配列番号７４の４５、５４、６１、および１０７の位置、ならびにそれらの組合せからなる群から選択され；
    塩基性残基における少なくとも１つの突然変異は、中性アミノ酸または酸性アミノ酸への突然変異である、単離された抗体またはその抗原結合部分。
23. 中性アミノ酸が、グルタミン、アスパラギン、バリン、セリン、アラニン、およびスレオニンから選択される、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
24. 酸性アミノ酸が、グルタミン酸またはアスパラギン酸から選択される、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
25. 配列番号７４の４５、５４、６１、および１０７、ならびにそれらの組合せからなる群より選択される塩基性残基において、少なくとも２つの突然変異が軽鎖可変領域中に存在する、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
26. 配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４からなる群より選択される塩基性残基において、少なくとも２つの突然変異が重鎖可変領域中に存在する、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
27. 前記軽鎖可変領域が、ＬＣ１フレームワーク（配列番号７５）を含み、４５、５４、６１、１０７、および１０８の位置、ならびにそれらの組合せが突然変異され得る、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
28. ヒトＣＤ４０に特異的に結合するための、請求項２２に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
29. 第１の抗体の少なくとも１つの薬物動態特性を改善するための方法であって、非改変の第１の抗体と比較して、少なくとも１つの突然変異した残基と、少なくとも１つの改善された薬物動態学的特性を有する第１の抗体の変異体を生成するために、配列番号７３の１２、１３、１９、２３、３８、５７、６３、６７、および７４、もしくはそれらの組合せから選択される少なくとも１つの位置、ならびに／または配列番号７４の４５、５４、６１、および１０７、もしくはその組合せから選択される少なくとも１つの位置の残基を突然変異させることを含む、方法。
30. 第１の抗体が、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する、請求項２９に記載の方法。
31. 単離された抗体またはその抗原結合部分であって、前記抗体は、重鎖可変領域を含む第１のポリペプチド部分と、軽鎖可変領域を含む第２のポリペプチド部分とを含み、
    （ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１フレームワーク（配列番号７３）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４フレームワーク（配列番号８０）を含むか；
    （ｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１フレームワーク（配列番号７３）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３フレームワーク（配列番号８１）を含むか；
    （ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ１５フレームワーク（配列番号７６）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３フレームワーク（配列番号８１）を含むか；
    （ｉｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４フレームワーク（配列番号７８）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ１フレームワーク（配列番号７４）を含むか；
    （ｖ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ４フレームワーク（配列番号７８）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ３フレームワーク（配列番号８１）を含むか；
    または
    （ｖｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣ５フレームワーク（配列番号７９）を含み；前記軽鎖可変領域は、ＬＣ４フレームワーク（配列番号８０）を含む、
    単離された抗体またはその抗原結合部分。
32. 前記第１のポリペプチド部分が、ヒト重鎖定常領域を含み；前記第２のポリペプチド部分が、ヒト軽鎖定常領域を含む、請求項３１に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
33. 請求項１から１５、２２から２８、３１、および３２のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子。
34. 請求項３３に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
35. 請求項３４に記載の発現ベクターまたは請求項３３に記載の核酸で形質転換された細胞。
36. 抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を調製するための方法であって、
    ａ）請求項３５に記載の細胞において、抗体またはその抗原結合部分を発現させること；および
    ｂ）細胞から抗体またはその抗原結合部分を単離すること
    を含む方法。
37. ａ）請求項１から１５、２２から２８、３１および３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分；ならびにｂ）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
38. 医薬品として使用するための、請求項１から１５、２２から２８、３１、および３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
39. 処置を必要とする対象の処置に使用するための、請求項１から１５、２２から２８、３１、および３２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。

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