JP2023526335A - 免疫賦活活性を有する融合タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、融合タンパク質、そのような融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、アジュバント又はワクチンとしてのその使用に関する。融合タンパク質は、細菌外毒素、及び抗原提示細胞上の表面マーカに特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。融合タンパク質は、有利には、鼻腔内、経口又は肺内に投与される。

Description

本発明は、一般に、免疫賦活活性を有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、そのような融合タンパク質、及びアジュバント又はワクチンとしてのその使用に関する。

ほとんどの市販のワクチンは注射され、生きている弱毒化又は死滅した全生物からなる。しかし、将来のワクチンをより合理的に設計するには、どの成分を含むか、製剤、送達経路及び使用する免疫増強剤又はアジュバントを検討する必要がある可能性がある。例えば、注射ワクチンとは対照的な粘膜ワクチン接種の利点は、局所免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体及び組織常在性メモリーＴ細胞がより効果的に誘導されることである。これは、コレラ、結核、ロタウイルス及びインフルエンザウイルスワクチンについて観察されているように、感染に対する免疫防御を刺激するために絶対的に重要であり得る。サブユニット又はコンジュゲートワクチンにおけるカスタマイズされたタンパク質を使用することにより、ワクチン製剤及び誘発された免疫応答に対する制御を増加させることができる。しかし、粘膜ワクチンの潜在的な問題は、それらが比較的大量の抗原及び有効で安全かつ非毒性の粘膜アジュバントを必要とすることである。

これは、粘膜ワクチンに一般的な用途を見出すことができる粘膜アジュバントを同定する目的で研究を促した。強力な粘膜アジュバントは、非毒性であり、免疫原性を大幅に改善し、ワクチン抗原に対する免疫学的記憶を生成すべきである。ほとんどの抗原は、経口投与又は鼻腔内投与された場合、通常、免疫原が不十分であり、これがアジュバントが必要とされる理由である。粘膜送達ワクチン抗原の免疫原性を改善するために、２つの主に異なるアプローチがとられている。１つ目は、米国特許第７，４５２，９８２号に開示されているような、カプセル化されたマイクロ粒子、ナノ粒子又は免疫刺激複合体（イスコム）などの経口抗原のための強力な送達系の構築に焦点を当てている。この米国特許は、イスコム複合体又はマトリックスに組み込まれた少なくとも１つのグリコシド及び少なくとも１つの脂質と、イスコム複合体に組み込まれた、又はイスコム複合体若しくはイスコムマトリックス複合体に結合された、又はそれと混合された少なくとも１つの抗原とを含む免疫原性複合体を開示している。第２のアプローチは、粘膜送達ワクチン抗原に対する免疫応答を調節し、大幅に増強するアジュバントを構築することである。これは、ワクチン特異的ＩｇＡ及びＴ細胞免疫の増強、並びに粘膜及びリンパ節及び脾臓における全身的な免疫記憶の発達をもたらす。米国特許第５，９１７，０２６号は、混合ワクチン抗原に対する免疫応答を増強することができ、それによって補助タンパク質として有用な融合タンパク質をコードするデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列を開示している。ＤＮＡ配列は、（ｉ）コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニットをコードする第１のＤＮＡ配列、及び（ｉｉ）主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ又はクラスＩＩ抗原を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に発現される受容体に特異的に結合するペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列を含む。ＡＰＣは、リンパ球、マクロファージ、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞及び他の可能性のある細胞からなる群から選択される。融合タンパク質は水溶性であり、第２のＤＮＡ配列によってコードされるペプチドによって認識される細胞受容体に特異的に結合する。融合タンパク質は、受容体を発現するか、又は何らかの他の方法でアジュバントに結合することができるＡＰＣによって内在化される。

アジュバント効果、特に粘膜ワクチン接種に関連して使用される粘膜アジュバントを改善する必要性が依然として存在する。

特に粘膜ワクチン接種に関連して、改善されたアジュバント効果及び／又はワクチン接種効果を提供することが一般的な目的である。

この目的及び他の目的は、本明細書に開示される実施形態によって満たされる。

本発明は、独立請求項に定義されている。本発明の更なる実施形態は、従属請求項に定義されている。

本発明の一態様は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。ヌクレオチド配列は、細菌外毒素をコードする第１のヌクレオチド配列、及び抗原提示細胞上の表面マーカに特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

本発明はまた、医薬品として使用するための、ワクチンアジュバントとして使用するための、又はヌクレオチド配列が少なくとも１つのウイルス若しくは細菌エピトープをコードする第３のヌクレオチド配列を含む場合、ワクチンとして使用するための上記のヌクレオチド配列に関する。

本発明は更に、上記のヌクレオチド配列を含む発現ベクター、並びに上記のヌクレオチド配列及び／又は発現ベクターを含む細胞に関する。

本発明の別の態様は、細菌外毒素、及び抗原提示細胞上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖを含む融合タンパク質に関する。

本発明はまた、上記の融合タンパク質と薬学的に許容される担体とを含むアジュバント組成物、並びに細菌外毒素、抗原提示細胞上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖ、及び薬学的に許容される担体中の少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープを含む融合タンパク質を含むワクチン組成物に関する。

本発明の更なる態様は、医薬品として使用するための、アジュバントとして使用するための、又はワクチンとして使用するための上記の融合タンパク質に関する。

本発明の一態様はまた、ウイルス又は細菌の感染又は疾患に対して対象にワクチン接種する方法に関する。方法は、本発明によるワクチン組成物を対象に投与することを含む。

実施形態の融合タンパク質は、免疫賦活活性を有し、ワクチン組成物中のアジュバントとして、又は実際にそれ自体ワクチンとして有用である。融合タンパク質は、粘膜アジュバントとして、及び粘膜ワクチン接種に特に適している。

実施形態は、その更なる目的及び利点と共に、添付の図面と共に以下の説明を参照することによって最もよく理解することができる。

アジュバント活性融合タンパク質のインシリコクローニング戦略の概略図であり、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））発現系におけるＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－３Ｅα－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｐ３２３－ＣＤ１０３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ及び真核細胞系（バキュロウイルス）におけるＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－３Ｅα－ＣＤ１０３－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓを示す図である。 発現及び精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ、濃度描写図及び抗ＦＬＡＧ染色による対応するウエスタンブロットを示す図である。 ＣＴＡ１－ＤＤ構築物対ＣＴＡ１－ＣＤ１０３構築物におけるＣＴＡ１からのアラインメント。 ＣＴＡ１－ＩＩ－ＤＤ（１）、ＣＴＡ１（Ｒ７Ｋ）－ＩＩ－ＤＤ（２）、ＣＴＡ１－ＩＩ－ＣＤ１０３（３）及びＣＴＡ（Ｒ７Ｋ）－ＩＩ－ＣＤ１０３（４）分子のウエスタンブロット分析を示す図である。 アグマチンインビトロ試験によって評価したそれぞれの融合タンパク質におけるＣＴＡ１－酵素のＡＤＰリボース化（ＡＤＰ ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ）活性、及び変異ＣＴＡ１Ｒ９Ｋ融合タンパク質を使用した場合のＡＤＰ－リボース化に対する失敗を示す図である。 ５μｇのＮＰ－ＣＧＧ及び／又はＴＴを混合したＣＴＡ１－ＩＩ－ＤＤ及びＣＴＡ１－ＩＩ－ＣＤ１０３融合タンパク質のアジュバント能力の比較分析を示す図である。特異的抗体応答をＥＬＩＳＡによって決定し、値を、Ａ）気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中のＩｇＡ及びＢ）血清中のＩｇＧ２ｃ又はＣ）血清中の総ＩｇＧにおける示されたアイソタイプのｌｏｇ_１０力価±ＳＤで示す。統計学的有意性はｐ値として与えられ、^＊はｐ＜０．０５、^＊＊はｐ＜０．０１、^＊＊＊はｐ＜０．００１、^＊＊＊＊はｐ＜０．０００１である。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ＣＤ４５．２＋）におけるＣＤ４Ｔ細胞プライミングを増強する、ＣＴＡ１－Ｉ／ＩＩ－ＤＤ及びＣＴＡ１－Ｉ／ＩＩ－ＣＤ１０３の能力の比較を示す図である。ＣＦＳＥ標識ＣＤ４５．１＋ＯＴ－ＩＩ ＴＣＲ Ｔｇ ＣＤ４ Ｔ細胞を静脈内養子移入した後、翌日、５μＭのＯＶＡ（ｐ３２３用量と等モル用量）、ＣＴＡ１－Ｉ／ＩＩ－ＤＤ又はＣＴＡ１－Ｉ／ＩＩ－ＣＤ１０３でマウスを鼻腔内免疫した。５日目に、排出ｍＬＮ中のＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞増殖についてマウスを分析し（ＦＡＣＳによる希釈ｏｐｆ ＣＦＳＥ標識）、増殖しているＯＴ－ＩＩ細胞の比率を異なる群で評価した（５匹のマウスの平均±ＳＤ）。 ｍＬＮにおけるＤＣのプライミング能力の寿命の評価を示す図であり、実験プロトコルは、ＣＦＳＥ標識ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞を融合タンパク質による免疫後１日目又は４日目に静脈内養子移入したことを除いて、Ａと同じであった。ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞応答（ＣＦＳＥ希釈）を評価し、全ＯＴ－ＩＩ細胞に対する分裂中の細胞の％として示した。 Ａのプロトコルを使用することによって、鼻腔内投与されたＤＤ又はＣＤ１０３標的化アジュバントの使用から生じるＣＤ４ Ｔ細胞サブセット分化の評価を示す図である。ＣＤ４ Ｔ細胞応答をＥＬＩＳＰＯＴ試験（ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ）によって決定し、ＩＦＮγ（矢印でマークしたドット）又はＩＬ－１７（マークしていないドット）の単一細胞産生を分析し、図をＳＦＣ／１０^５ ＯＴ－ＩＩ細胞として示す。 融合タンパク質の増強効果に対するＣＴＡ１酵素の役割の評価を示す図である。Ａと同じプロトコルを使用し、ＯＴ－ＩＩ増殖をＣＦＳＥの希釈によって評価した。排出ｍＬＮにおけるＣＤ４ Ｔ細胞の増殖は、変異した不活性なＣＴＡ１部分では観察されず（値は、全てのＣＤ４ Ｔ細胞の平均％±ＳＤとして（左パネル）又は応答性ＯＴ－ＩＩ細胞として（右パネル）示される）、ｐ値は、^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１、^＊＊＊＊がｐ＜０．０００１である。 ｓｃＦｖ ＣＤ１０３融合タンパク質の細胞結合効率を、樹状細胞（ＤＣ）の様々なサブセットにおいて測定した図である。ＤＣ標的集団は、ＣＤ１０３^－／－（ＤＣ上にＣＤ１０３なし）又はＷＴマウスのｍＬＮから単離された移動性ＤＣ（ＭＨＣＩＩ^ｈｉｇｈ ＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈ）において定義された。フローサイトメトリー及び特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用してＤＣサブセットを検出し、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂを使用して融合タンパク質を検出した。ｓｃＦｖＣＤ１０３融合タンパク質は、ＣＤ１０３^－／－細胞中のどのＤＣサブセットにも結合できなかったが、ＤＤ融合タンパク質は全てのＤＣサブセットに結合した。 条件はＡの条件と同様であったが、野生型ｍＬＮ由来の移動性ＤＣは、ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｂ^－マーカ、ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｂ^＋マーカ又はＣＤ１０３^－ＣＤ１１ｂ^＋マーカによって定義される異なるＤＣサブセットを示した図である。ＣＤ１０３^＋ＤＣへのｓｃＦｖＣＤ１０３融合タンパク質の選択的結合が説得力のある形で示されたが、ＤＤは３つ全てのＤＣサブセットに結合した。 ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントによる鼻腔内免疫後のインビボ標的化ＤＣサブセットのプライミング能力の調査を示す図である。それらのＤＣサブセットレパートリーにおける異なる制限（特定のＤＣサブセットを欠く）を有するマウスを鼻腔内免疫し、その後、ＣＦＳＥ標識ＯＴ－ＩＩ細胞（ＣＤ４５．１＋）を養子移入した。本発明者らは、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＤ１０３^－／－又はＢＡＴＦ３^－／－（ｃＤＣ１細胞なし）マウス（５μＭ）ＣＴＡ１－ＩＩ－ＤＤ又はＣＴＡ１－ＩＩ－ＣＤ１０３における応答を比較した。２４時間後、移動性ＤＣ（ＭＨＣ^ｈｉｇｈ、ＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈ）及びＯＴ－ＩＩ細胞（４日後）を単離し、フローサイトメトリーによって分析した。ｃＤＣ１（ＸＣＲ１＋）、ＣＤ１１ｂ^＋（ＣＤ１０３^－）、ＣＤ１０３^＋（ＣＤ１１ｂ^－）及びＤＰ（ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｂ^＋）ＤＣの平均比率を、各群の５匹のマウスの％ＤＣサブセットとして示す（左パネル）。ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞増殖（右パネル）は、ＣＤ１０３アジュバントによる鼻腔内免疫後のｃＤＣ１細胞（Ｂａｔｆ３^－／－では消失）の存在に依存することが見出されたが、この依存性はＤＤ構築物では見られなかった。Ｔｈ１７分化への極性化（下のパネル）が、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのｍＬＮ由来のＣＤ１０３融合タンパク質で鼻腔内免疫した後、マウスｍＬＮ由来の新たに単離されたｃＤＣ１細胞で見られた。統計学的有意性は、スチューデントｔ検定（Ａ、Ｂ）又はダネットの事後検定を用いた分散分析（Ｃ、Ｄ）で示す。統計学的有意性は、^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１、^＊＊＊＊がｐ＜０．０００１である。 生きているインフルエンザＡウイルス感染に対する免疫防御の誘導についてのｓｃＦｖＣＤ１０３標的化ＣＴＡ１－ＣＤ１０３融合タンパク質の増強された能力を示す図である。ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＣＤ１０３及びＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＤＤによって免疫防御能の比較を決定した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、５μＭ／用量で、それぞれの融合タンパク質を３回鼻腔内免疫し、攻撃感染に対する免疫防御を、４×ＬＤ_５０用量のマウス適合ＰＲ８インフルエンザＡウイルス株による最終免疫の３週間後に評価した。生存動物の割合、体重減少及びプラーク形成単位（ＰＦＵ）における肺ウイルス力価を示す。 示されるように、攻撃感染後の免疫又はナイーブ対照マウスから単離されたＭ２ｅ－四量体（Ｍ２ｅ－テトラマー）特異的肺ＣＤ４ Ｔ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット（下のパネル）を示す図である。肺における常在性メモリーｒｏｒγｔ＋Ｍ２ｅ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞（Ｔｈ１７細胞）の比率の分析。ダネットのＴ３試験後分析を用いた分散分析は、ｎｓが有意でなく、ｐ値は^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１、^＊＊＊＊がｐ＜０．０００１である。 ＣＤ１０３標的化アジュバントが、インビボでＣＤ８ Ｔ細胞をプライミングするｃＤＣ１細胞の交差提示能を探索する図である。養子移入モデルを、Ｃ５７Ｂｌ／６（ＣＤ４５．２＋）レシピエントマウスに注射したＣＦＳＥ標識ＣＤ４５．１＋ＯＴ－Ｉ ＴＣＲ ＴｇドナーＣＤ８ Ｔ細胞と共に使用した。オボアルブミン（ＯＶＡ）、ＣＴＡ１－Ｉ－ＩＩ－ＤＤ又はＣＴＡ１－Ｉ－ＩＩ－ＣＤ１０３を用いた鼻腔内免疫のＣＤ８Ｔ細胞プライミング効果免疫化をＦＡＣＳによって評価した。値は増殖中のＯＴ－Ｉ細胞の％及びＳＤで示す。 ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＩＦＮγ－ＥＬＩＳＰＯＴ ＯＴ－Ｉ細胞の交差提示及びプライミングを刺激する能力についてのＣＤ１０３構築物とＤＤ構築物との比較を示す図である。養子移入モデルにおける融合タンパク質を用いた鼻腔内免疫後５日目。 細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）を、５μＭ用量のＯＶＡ、ＣＴＡ１－ＩＩ－ＤＤ、ＣＴＡ１－Ｉ－ＩＩ－ＤＤ又はＣＴＡ１－Ｉ－ＩＩ－ＣＤ１０３融合タンパク質を用いて、Ｃ５７ＢＬ６マウスの鼻腔内免疫により刺激した図である。１週間後、１μＭのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドでパルスしたＣＦＳＥ標識脾細胞（標的細胞）又はＦａｒ Ｒｅｄ標識非パルス対照脾細胞（バイスタンダー細胞）をマウスに静脈内注射した。標的細胞の静脈内注射の２０時間後、ｍＬＮをＣＴＬ活性について分析した。 転移性メラノーマがん（Ｂ１６Ｆ１ＯＶＡ細胞株）に対する防御を示す、ｓｃＦｖＣＤ１０３標的化に基づく予防がんワクチンを評価した図である。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、５μＭ／用量のＣＴＡ１－Ｉ－ＩＩ－ＣＤ１０３又はＣＴＡ１－Ｉ－ＩＩ－ＤＤ融合タンパク質で２回鼻腔内免疫した。免疫後７日目に、マウスに１００，０００個のＢ１６Ｆ１ＯＶＡ細胞を静脈内投与し、４週間維持した。肺を、それらの表面上のがん転移（黒色転移）ドットについて検査した。単離したＣ５７Ｂｌ／６マウスｃＤＣ１細胞に１００，０００個のＢ１６Ｆ１ＯＶＡを移入し、腫瘍増殖表面積及び生存率を経時的に評価することによって行ったがん治療ワクチン評価を監視した。統計的有意性は、ダネットの事後検定（Ａ、Ｂ、Ｃ）又はスチューデントのｔ検定（Ｄ）を用いた分散分析を用いて計算した。ｎｓは有意でない、ｐ値は^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１、^＊＊＊＊がｐ＜０．０００１である。 例７で使用した脂質の分子構造表示を示す図であり、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を示す。 本試験で使用した異なるワクチン製剤の概略図を示す図であり、共有結合したＦＰを有するリポソーム（ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ）及びリポソームと混合された遊離ＦＰ（ＤＯＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰ）を示す。 ＮＴＡによって決定された、表１に提示された異なる粒子製剤（図のラベルを参照）の粒度分布を示す図である。 左から右への抗原提示アッセイに使用したゲーティング戦略を示す図であり、ｉ）ＳＳＣ対ＦＳＣプロットにおいて細胞片を除外し、ｉｉ）７ＡＡＤ陰性細胞に対するゲーティングは死細胞を除外し、ｉｉｉ）樹状細胞マーカＭＨＣＩＩ及びＣＤ１１ｃについて陽性の細胞を選択した。 遊離ＦＰ、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰの代表的なＹＡｅヒストグラムを示す図である。 フローサイトメトリーによって測定される時間の関数としての標識ＹＡｅの蛍光強度中央値を示す図である。データを、実験開始時には０に、２４時間では遊離ＦＰの値で１に正規化した。 ２４時間後のＹＡｅ蛍光強度中央値を示す図である。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。統計学的有意性は、^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１である。 ２４時間後の正規化ＭＨＣＩＩ蛍光強度中央値比を示す図である。 ＭＨＣＩＩに対するＹＡｅの蛍光強度中央値比を示す図である。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。統計学的有意性は、^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１である。 異なる製剤に対するＹＡｅ＋集団の代表的なＣＤ８６及びＣＤ８０ヒストグラムを示す図である。 遊離ＦＰと比較した２４時間でのＣＤ８６蛍光強度中央値の変化を示す図である。 遊離ＦＰと比較した２４時間でのＣＤ８０蛍光強度中央値の変化を示す図である。Ｃ及びＤでは、蛍光強度の中央値を、刺激されていない細胞については０に、遊離融合タンパク質の値で１に正規化した。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。統計学的有意性は、^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１である。 ワクチン製剤で２４時間活性化した後の上清中の放出されたサイトカインのＥＬＩＳＡによる定量を示す図である。 ワクチン製剤で２４時間活性化した後の上清中の放出されたサイトカインのＥＬＩＳＡによる定量を示す図である。調査したサイトカインは、Ａ）ＩＬ－６及びＢ）ＩＬ－１βであった。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。統計学的有意性は、^＊がｐ＜０．０５、^＊＊がｐ＜０．０１、^＊＊＊がｐ＜０．００１である。

本発明は、一般に、免疫賦活活性又は免疫増強活性を有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、そのような融合タンパク質、及びアジュバント又はワクチンとしてのその使用に関する。

本発明は、アジュバント又はワクチンとして、特に粘膜ワクチン接種に関連して有用な融合タンパク質に関する。そのような粘膜ワクチン接種は、局所ＩｇＡ抗体並びに組織常在性メモリーＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞がより効果的に誘導されるという点で、従来の注射ワクチンを超える利点を有する。例えば、インフルエンザウイルス感染に対する鼻腔内（ｉ．ｎ．）ワクチンは、ＩｇＡ及び肺組織常在性記憶Ｔ細胞の誘導に対して効果が劇的に増強されるため、ワクチンの筋肉内注射よりも優れている。

粘膜ワクチンは、効果的であるために比較的大量の抗原を必要とする。これは、有効で安全で非毒性の粘膜アジュバントを使用することによって少なくとも部分的に解決することができる。本発明は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び粘膜ワクチンなどのアジュバントとして使用することができるそのような融合タンパク質、すなわち、アジュバントタンパク質に関する。融合タンパク質は、安全かつ非毒性であり、樹状細胞（ＤＣ）並びに濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）に作用し、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞応答、胚中心（ＧＣ）反応並びにメモリーＢ細胞及び形質細胞の発生を大幅に増強する強力な免疫増強剤であるアジュバント活性成分を含む。融合タンパク質はまた、流入領域リンパ節においてＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞をプライミングすることが知られている細胞サブセットに融合タンパク質及びワクチンを標的化する細胞結合成分を含む。それにより、この細胞結合成分は、アジュバント又はワクチンの特異性を有意に改善し、それにより、非常に低濃度であってもその有効性を改善する。特に、細胞結合成分は、流入領域リンパ節において、組織常在性メモリーＴ細胞を含むエフェクターＴ細胞をプライミング及び刺激するために重要である、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、好ましくはＤＣの別個の１つ又は複数のサブセットを標的とする。

本発明の一態様は、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。ヌクレオチド配列は、細菌外毒素をコードする第１のヌクレオチド配列、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）に特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。

ヌクレオチド配列は、典型的には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列の形態である。しかし、ヌクレオチド配列は、代わりに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列などのリボ核酸（ＲＮＡ）配列の形態であってもよい。

ヌクレオチド配列は、細菌外毒素及びｓｃＦｖをそれぞれコードする、部分配列とも呼ばれる少なくとも２つのヌクレオチド配列を含む。

哺乳動物細胞において強い酵素活性を発揮する細菌外毒素の群が存在する。これらの外毒素としては、細菌エンテロキシン及び百日咳毒素が挙げられる。

コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）を含むこれらの細菌外毒素は、標的細胞の細胞膜中のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合タンパク質のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）リボシル化によって作用する。ＡＤＰ－リボース化反応では、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ^＋）が遊離ニコチンアミドと、刺激Ｇタンパク質（Ｇ_ｓ）のαサブユニット（α_ｓ）中のアルギニンのグアニジニウム基に結合しているＡＤＰ－リボース部分とに分割される。Ｇ_ｓタンパク質は永続的に活性化され、アデニル酸シクラーゼを刺激し、大量の細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の形成をもたらす。次いで、ｃＡＭＰの増加は、Ｂリンパ球分化の増加、ＡＰＣの共刺激の増強、様々なＴ細胞機能の阻害若しくは促進、及び／又はリンパ球細胞のアポトーシスの調節など、多くの多様な免疫反応を免疫調節するように作用することができる。ｃＡＭＰがその機能を発揮する機構は多面的であり、細胞内ｃＡＭＰの増加は異なる方法で異なる細胞に影響を及ぼす可能性がある。また、特定の細胞系統の細胞は、分化の１つの段階でｃＡＭＰに対して阻害された機能で応答し得るが、異なる段階で強力な増強効果が観察され得る。この効果はｃＡＭＰに依存しない場合もある。細菌外毒素はまた、Ｈ^＋ポンプに対する酵素効果による酸性化の増強を伴って、肝臓エンドソームプロセシングに対する効果を増強する。実際、これらの細菌外毒素は、ＡＴＰ依存性の定常状態の血管内Ｈ^＋濃度を最大数１００％増加させることが示されている。この機序は、小胞イオン輸送体の大きな変化を反映する可能性は低いが、むしろエンドソームあたりのＨ^＋ポンプの数の増加及び／又はｃＡＭＰに応答した初期エンドサイトーシス小胞の融合、再構築及び成熟の変化を示す。細菌外毒素はまた、液胞Ｈ^＋ポンプの再分布又は活性化を引き起こす可能性があり、その結果、毒素処理エンドソーム膜は、小胞の幾何学的形状に他の変化を伴うことなく、より多くの数（又は密度）の活性ポンプを含有する。これは、特にＤＣだけでなく他のＡＰＣにおいても、タンパク質分解のためのエンドソーム機構の機能の増加、典型的にはＡＰＣ機能及び共刺激の増強をもたらす可能性がある。

ＣＴは、分子のＡ２サブユニット又はフラグメント（ＣＴＡ２）及び毒性で酵素的に活性なＡ１サブユニット又はフラグメント（ＣＴＡ１）を介して、五量体へのリンカーを含む単一のＡサブユニットを取り囲む五量体構造に一緒に保持された５つの酵素的に不活性な非毒性のＢサブユニット（ＣＴＢ）から構成される。毒性ＣＴＡ１は強力なＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ活性を有し、いくつかのＧタンパク質に作用すると考えられており、その活性はＧ_ｓに対して最も強い。これは、アデニル酸シクラーゼの活性化及びその後のｃＡＭＰの細胞内増加をもたらす。ＣＴＢは、リンパ球及び腸上皮細胞を含むほとんどの哺乳動物細胞に存在するガングリオシドモノシアロテトラヘキソシルガングリオシド（ＧＭ１）受容体に結合し、その後、ＣＴＡは、ＣＴＡ１及びＣＴＡ２が解離している細胞の細胞膜／サイトゾルに移行する。コレラにおける大量の下痢応答は、腸上皮におけるＣＴＡ１誘導性のｃＡＭＰレベルの増加と、その後の電解質及び水の喪失に起因すると考えられる。

一実施形態では、細菌外毒素は、細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニット及び百日咳毒素からなる群から選択される。

細菌エンテロトキシンは、好ましくは、コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される。百日咳毒素は、好ましくは百日咳毒素サブユニットＳ１である。

百日咳毒素（ＰＴ）は、百日咳を引き起こす百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）によって産生されるタンパク質系ＡＢ_５型外毒素である。ＰＴは、不活性形態で百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）から放出される。ＰＴが細胞膜受容体に結合した後、エンドソームに取り込まれ、その後、トランスゴルジ網及び小胞体への逆行輸送を受ける。この輸送中のある時点で、Ａサブユニット（Ｓ１サブユニット）が活性化される。実際、ＰＴは、小胞体内で酵素的に活性なＡサブユニット（Ｓ１サブユニット）と細胞結合Ｂサブユニットの２つの部分に解離することが知られている。ＰＴは、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のα_ｉサブユニットのＡＤＰ－リボース化を触媒する。これにより、Ｇタンパク質が細胞膜上のＧタンパク質共役受容体と相互作用するのを防ぎ、したがって細胞内コミュニケーションが妨害される。Ｇ_ｉサブユニットは、それらのＧＤＰ結合不活性状態に固定されたままであり、したがってアデニル酸シクラーゼ活性を阻害することができず、ｃＡＭＰの細胞内濃度の増加をもたらし、受容体媒介性シグナル伝達を含む正常な細胞機能と相互作用する。

一実施形態では、細菌外毒素が細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニットである場合、第１のヌクレオチド配列は、Ａ１サブユニット以外の細菌エンテロトキシンの任意のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を欠く。これに対応して、細菌外毒素がＰＴのＳ１サブユニットである場合、第１のヌクレオチド配列は、好ましくは、Ｓ１サブユニット以外のＰＴの任意のサブユニットをコードするヌクレオチド配列を欠く。

一実施形態では、第１のヌクレオチド配列はＣＴＡ１をコードする。特定の実施形態では、ＣＴＡ１をコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１を含み、好ましくはそれからなる。

別の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ（ＬＴＡ１）のＡ１サブユニットをコードする。特定の実施形態では、ＬＴＡ１をコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号２を含み、好ましくはそれからなる。

更なる実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＰＴ Ｓ１サブユニット（ＰＴＳ１）をコードする。特定の実施形態では、ＰＴＳ１をコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号３を含み、好ましくはそれからなる。

一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＴＡ１の複数の、すなわち少なくとも２つのコピー、ＬＴＡ１の複数のコピー、ＰＴＳ１の複数のコピー、ＣＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＬＴＡ１の少なくとも１つのコピー、ＣＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＰＴＳ１の少なくとも１つのコピー、ＬＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＰＴＳ１の少なくとも１つのコピー、又はＣＴＡ１の少なくとも１つのコピー、ＬＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＰＴＳ１の少なくとも１つのコピーをコードする。

第２のヌクレオチド配列は、ＡＰＣ上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされ、細菌外毒素に加えてｓｃＦｖを含む融合タンパク質は、ＡＰＣを特異的に標的化し、それによって正確な標的化及び改善された免疫増強効果を達成する。

一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、樹状細胞（ＤＣ）上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。したがって、この実施形態では、標的とされるＡＰＣはＤＣである。

標的とされる特定のＡＰＣ、好ましくはＤＣが定義され、それに基づいて、ｓｃＦｖが特異的に結合する樹状細胞上の分子又は表面マーカが定義される。したがって、表面マーカは、ＡＰＣ、好ましくはＤＣの細胞膜に固定されているか、そうでなければ付着しているタンパク質であり、それによってｓｃＦｖがタンパク質中のエピトープに結合するためにアクセス可能となる。そのような表面マーカは、細胞外部分又はドメイン、膜貫通部分又はドメイン、及び場合により細胞内部分又はドメインを含むことが多い。そのような表面マーカについて、ｓｃＦｖは、好ましくは、細胞外ドメイン中のエピトープ又は表面マーカの一部に特異的に結合する。

一実施形態では、表面マーカは、ＡＰＣ、好ましくはＤＣによって発現されることが好ましく、ＡＰＣ、好ましくはＤＣの外側からアクセス可能であることが好ましい受容体、膜結合タンパク質又は他の分子である。

ｓｃＦｖの特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づいて決定することができる。抗原とｓｃＦｖとの解離（Ｋ_Ｄ）の平衡定数によって表される親和性は、抗原決定基とｓｃＦｖ上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度である。Ｋ_Ｄの値が小さいほど、抗原決定基とｓｃＦｖとの間の結合強度が強くなる。或いは、親和性は、１／Ｋ_Ｄである親和定数（Ｋ_Ａ）として表すこともできる。当業者に明らかなように、親和性は、目的の特異的抗原に応じて、それ自体公知の方法で決定することができる。

結合活性は、ｓｃＦｖと関連抗原との間の結合の強さの尺度である。結合活性は、抗原決定基とｓｃＦｖ上のその抗原結合部位との間の親和性と、ｓｃＦｖ上に存在する適切な結合部位の数の両方に関連する。

典型的には、ｓｃＦｖは、１０^－５～１０^－１２モル／リットル（Ｍ）以下、好ましくは１０^－７～１０^－１２Ｍ以下、より好ましくは１０^－８～１０^－１２Ｍの解離定数（Ｋ_Ｄ）で、すなわち１０^５～１０^１２Ｍ^－１以上、好ましくは１０^７～１０^１２Ｍ^－１以上、より好ましくは１０^８～１０^１２Ｍ^－１の会合定数（Ｋ_Ａ）でそれらの抗原に結合する。

一般に、１０^－４Ｍより大きい任意のＫ_Ｄ値（又は１０^４Ｍ^－１より低い任意のＫ_Ａ値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。

エピトープ又は抗原決定基へのｓｃＦｖの特異的結合は、例えばスキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ、並びに当技術分野でそれ自体公知のその異なる変形を含む、それ自体公知の任意の適切な方法で決定することができる。

樹状細胞は、伝統的に、以前は骨髄性樹状細胞（ｍＤＣ）と呼ばれていたいわゆる従来の又は古典的な樹状細胞（ｃＤＣ）と、以前はインターフェロン産生細胞と呼ばれていた形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）とに分けられる。ＤＣはまた、血液及びリンパＤＣ、皮膚組織ＤＣ又は炎症性／単球由来ＤＣに分けることができる。ｃＤＣは骨髄中の共通の単球－ＤＣ前駆細胞から生じるが、ｐＤＣは共通のリンパ系前駆細胞から生じる。

ｃＤＣは、それぞれＣＤ４ Ｔｈ１又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び細胞傷害性リンパ球（ＣＤ８）をもたらすＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の主要刺激因子である従来の又は古典的な１型樹状細胞（ｃＤＣ１又はｍＤＣ－１）、並びにＣＤ４ Ｔ細胞活性化、特に濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）、ＴＨ１７及びＴｈ２型細胞の発達に重要な従来の又は古典的な２型樹状細胞（ｃＤＣ２又はｍＤＣ－２）の少なくとも２つのサブセットで構成される。ｃＤＣは、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びケモカインを分泌し、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を発現する。ｐＤＣは、表面マーカＢ２２０を発現し、形質細胞に類似し、ＴＬＲを発現し、大量のインターフェロン－α（ＩＦＮα）を産生することができる。ｃＤＣは、ｐＤＣとは対照的に、ＣＤ１１ｃ表面インテグリンαＸ（補体成分３受容体４サブユニット）（ＩＴＧＡＸ）を発現する。インテグリンは、α鎖及びβ鎖から構成されるヘテロ二量体内在性膜タンパク質である。このタンパク質は、β２鎖（ＩＴＧＢ２）と結合して、不活性化Ｃ３ｂ（ｉＣ３ｂ）受容体４（ＣＲ４）と呼ばれる白血球特異的インテグリンを形成する。ＣＤ１１ｃは、ヒト樹状細胞上に高レベルで見出されるＩ型膜貫通タンパク質である。ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞は、組織及びリンパ節に見られるｃＤＣである。遊走ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞は、高レベルのＣＤ１１ｃ及びＭＨＣクラスＩＩを発現する。組織における活性化の後、これらの細胞は、それらがＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞のプライミングの中心である流入領域リンパ節に移動する。

一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ｃＤＣ１及びｃＤＣ２型の両方の従来の又は古典的な樹状細胞（ｃＤＣ）上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。

特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ｃＤＣ１ｓ上の表面マーカである、分化抗原群１４１（ＣＤ１４１）又はＢＤＣＡ－３とも呼ばれるトロンボモジュリン（ＴＭ）に特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。

ＴＭは、内皮細胞の表面上に発現される内在性膜タンパク質であり、トロンビンの補因子として働く。ＴＭは、トロンビンを凝固促進酵素から抗凝固酵素に変換することによって血液凝固を減少させる。トロンボモジュリンはまた、ヒト中皮細胞、単球及びｃＤＣ上に発現する。

一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ｃＤＣ１ｓ上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦＶをコードする。したがって、この実施形態では、融合タンパク質はｃＤＣ１ｓを特異的に標的化する。

特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ｃＤＣ１ｓの表面マーカである、ＣＤ１０３、ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）、ＸＣＲ１、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）（ＣＤ２０５）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、Ｂリンパ球及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）、並びにＣＤ２２６からなる群から選択される表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。

インテグリンαＥ（ＩＴＧＡＥ）とも呼ばれるＣＤ１０３は、ヒトにおいてＩＴＧＡＥ遺伝子によってコードされるインテグリンタンパク質である。ＣＤ１０３はインテグリンβ７（β７又はＩＴＧＢ７）に結合して、完全なヘテロ二量体インテグリン分子αＥβ７を形成する。ＣＤ１０３^＋は、ｃＤＣ１並びに二重陽性ｃＤＣ２（ＣＤ１０３^＋ＣＤ１１ｂ^＋）ＤＣによって保持され、これらは、流入領域リンパ節におけるＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞のプライミング並びに組織常在性メモリーＴ細胞の刺激のための重要な細胞である。

Ｃｌｅｃ９Ａは、活性化受容体として機能し、ｃＤＣ１ｓを含む骨髄系列細胞上に発現されるＶ群Ｃ型レクチン様受容体（ＣＴＬＲ）である。ＣＬＥＣ９Ａ^＋ｃＤＣ１ｓは、ＣＤ８ Ｔ細胞応答及びＣＤ４ Ｔｈ１又はＴｒｅｇ型の応答を交差提示して活性化することができる。

ＸＣＲ１はＧＰＲ５とも呼ばれる。ＸＣＲ１^＋ｃＤＣ１細胞は、ＣＤ８ Ｔ細胞とＣＤ４ Ｔｈ１又はＴｒｅｇ型の応答とを交差提示して活性化することができる。

ＬＹ７５は、ＣＤ２０５又はＤＥＣ２０５とも呼ばれ、ｐＨ依存的に死細胞を認識する樹状細胞上のエンドサイトーシス受容体である。

ＣＡＤＭ１は、ネクチン様タンパク質２（ＮＥＣＬ２）と呼ばれることもある細胞接着分子である。ＣＡＤＭ１はｐｒｅ－ｃＤＣ１ｓ上に主に発現する。

ＢＴＬＡは、ＣＤ２７２とも呼ばれ、Ｔ細胞の活性化中に誘導され、ＢＴＬＡ＋樹状細胞は末梢Ｔｒｅｇ細胞を誘導する。

ＤＰＰ４は、アデノシンデアミナーゼ複合体化タンパク質２又はＣＤ２６とも呼ばれ、免疫調節、シグナル伝達、及びアポトーシスに関連する。ＤＤＰ４^＋ＤＣは炎症に関与し得る。

ＣＤ２２６は、ＰＴＡ１血小板及びＴ細胞活性化抗原１（ＰＴＡ１）又はＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＭ－１）とも呼ばれ、ｃＤＣ上で発現する。

一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ＣＤ１０３、ＸＣＲ１及びＣｌｅｃ９Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。

ヒトｃＤＣ１は、ＣＤ１４１^＋（ＢＤＣＡ３^＋）樹状細胞として定義され、ＸＣＲ１、ＣＡＤＭ１、Ｃｌｅｃ９Ａ及びＣＤ１０３の発現を含む多くの類似性をマウスｃＤＣ１と共有する。

特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ＣＤ１０３に特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。この実施形態では、樹状細胞のサブセットは、ＣＤ１０３発現樹状細胞（ＣＤ１０３^＋ＤＣ）である。そのようなＣＤ１０３^＋ＤＣは、ｃＤＣ１サブセット又は二重陽性ｃＤＣ２ ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１１ｂ^＋）サブセットに属する。

一実施形態では、ＣＤ１０３結合ｓｃＦｖをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号４を含み、好ましくはそれからなる。

別の特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ＬＹ７５（ＣＤ２０５）に特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。この実施形態では、樹状細胞のサブセットは、ＬＹ７５^＋発現樹状細胞（ＬＹ７５^＋ＤＣ又はＣＤ２０５^＋ＤＣ）である。

一実施形態では、ＣＤ２０５結合ｓｃＦｖをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号５を含み、好ましくはそれからなる。

ＸＣＲ１、Ｃｌｅｃ９Ａ及び／又はＣＤ１０３の細胞表面発現によって同定されるｃＤＣ１ｓは、インターフェロンコンセンサス配列結合タンパク質（ＩＣＳＢＰ）としても知られるインターフェロン調節因子８（ＩＲＦ８）、及び塩基性ロイシンジッパー転写因子ＡＴＦ様３（ＢＡＴＦ３）に発達的に依存する。ｃＤＣ１ｓは、抗原を交差提示し、細胞内病原体に対する細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞応答をプライミングし、それらはまた、Ｔｈ１又はＴｒｅｇ機能のＣＤ４ Ｔ細胞のプライミングに関連する。ｃＤＣ１ｓは、比較的均一な集団である。

別の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ｃＤＣ２ｓ上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。

ｃＤＣ２ｓは、ＣＤ１１ｂの細胞表面発現によって定義され、ＩＲＦ４及びＮｏｔｃｈシグナル伝達に対する可変依存性を示す細胞の異種集団を含み、特にＴｆｈ、Ｔｈ２及びＴｈ１７型のＣＤ４ Ｔ細胞応答のプライミングにおいて異なる機能的役割を有する。

一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ｃＤＣ２ｓ上の表面マーカである、ＣＤ１ｃ／ＢＤＣＡ－１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）／ＣＤ１７２ａ、ＦｃεＲＩ（ＦＣＥＲ１）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＡ（Ｃｌｅｃ４Ａ）及びＣｌｅｃ１０Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。

ＣＤ１ｃ／ＢＤＣＡ－１は、ヒト抗原提示細胞の表面上に発現される糖タンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞への脂質抗原の提示に関与している。ＣＤ１ｃ＋樹状細胞はヒトの血液及び組織に存在し、ＣＤ４ Ｔ細胞を効率的にプライミングすることが見出されている。

ＣＤ１１ｂはインテグリンαＭ（ＩＴＧＡＭ）とも呼ばれる。ＣＤ１１ｂ^＋ＤＣは、組織ｃＤＣとマクロファージとの混合物からなる。

ＣＤ２は、Ｔ細胞表面抗原Ｔ１１／Ｌｅｕ－５、ＬＦＡ－２、ＬＦＡ－３受容体、赤血球受容体又はロゼットレセプターとも呼ばれる。

ＦＣＥＲ１は、高親和性ＩｇＥ受容体又はＦｃεＲＩとも呼ばれる。ＦＣＥＲ１は、ＩｇＥに結合した抗原に対してこれらの活性を集中させることによって、樹状細胞が抗原を内在化し、処理し、提示する能力を強化する。

ＬＩＬＲＡ１は、ＩＬＴ１又はＣＤ８５ｈとも呼ばれ、Ｃｌｅｃ４Ａは、ＤＣＩＲとも呼ばれる。

一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ｓｃＦｖの複数のコピーをコードするか、又は第１のｓｃＦＶの少なくとも１つのコピー及び第２の異なるｓｃＦｖの少なくとも１つのコピーをコードする。

ｓｃＦｖが特異的に結合する表面マーカは、樹状細胞の表面マーカであり、好ましくは樹状細胞のサブセット、例えばｃＤＣ、すなわちｃＤＣ１及びｃＤＣ２、ｃＤＣ１又はｃＤＣ２、より好ましくはｃＤＣ１である。樹状細胞上に存在する表面マーカは、他の種類の細胞、又は非ＤＣ、又は樹状細胞の他のサブタイプにも存在することができる。しかし、樹状細胞の所与のサブセットに対する表面マーカは、典型的には、樹状細胞の他のサブセットと比較して、樹状細胞の所与のサブセットの細胞表面においてより高い量及び密度で存在する。例えば、ＣＤ１０３^＋樹状細胞は、ＣＤ１０３^－樹状細胞と比較して有意により多くのＣＤ１０３分子を含む。

一実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープをコードする第３のヌクレオチド配列を含む。したがって、この実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも３つの部分配列を含む。少なくとも１つのウイルスエピトープは、好ましくはウイルス感染又は疾患に関連する、すなわち、ウイルス感染又は疾患を引き起こすウイルスによって発現される。これは、少なくとも１つのウイルスエピトープが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）によってプロセシング及び認識され得るワクチン抗原として機能することを意味する。これに対応して、少なくとも１つの細菌エピトープは、好ましくは細菌感染又は疾患に関連し、すなわち細菌感染又は疾患を引き起こす細菌によって発現される。これは、少なくとも１つの細菌エピトープが、ＴＣＲ又はＢＣＲによってプロセシング及び認識され得るワクチン抗原として機能することを意味する。

樹状細胞はＡＰＣとして作用し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子又は複合体（ＭＣＳ）上にペプチドの形態でプロセシングされた抗原を提示する。ＴＣＲは、ＭＨＣ分子との複合体中のユニークなワクチン抗原ペプチドを認識し、活性化される、すなわちプライミングされる。

ＴＣＲ認識のために、抗原は、ＡＰＣ内で小さなフラグメント、すなわちペプチドにプロセシングされ、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子によって提示される。これらの複合体は、ほとんどの場合、免疫応答を誘発するのに十分ではなく、したがって、免疫増強剤、すなわち「助ける」と言う意味のラテン語であるアジュバントが必要である。第１のヌクレオチド配列によってコードされる細菌外毒素は、そのような免疫増強剤として作用する。

一実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、少なくとも１つのウイルスエピトープ、好ましくはインフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質２（Ｍ２ｅ）エピトープの少なくとも１つの外部ドメインをコードする。Ｍ２ｅタンパク質の細胞外ドメインは、インフルエンザＡウイルスにおいて進化的に保存された領域であり、ユニバーサルインフルエンザワクチンを設計するための有望なエピトープである。Ｍ２は、９７個のアミノ酸を含む四量体型ＩＩＩ型膜タンパク質である。Ｍ２タンパク質は、３つの部分である細胞外Ｎ末端ドメイン（Ｍ２ｅ、位置１～２４）、膜貫通（ＴＭ）ドメイン（位置２５～４６）及び細胞内Ｃ末端ドメイン（位置４７～９７）に分けることができる。

一実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、複数のＭ２ｅエピトープをコードする。例えば、第３のヌクレオチド配列は、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のＭ２ｅエピトープ、好ましくは３つのＭ２ｅエピトープをコードすることができる。一実施形態では、第３のヌクレオチド配列によってコードされる複数のＭ２ｅエピトープは、場合により、リンカー、例えばＭ２ｅ－リンカー－Ｍ２ｅ－リンカー－Ｍ２ｅによって相互接続されてもよい。一実施形態では、任意のリンカーは、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）、少なくとも１つのセリン（Ｓ）、及びそれらの組み合わせ、好ましくはＧＳからなる群から選択される。

一実施形態では、Ｍ２ｅエピトープは、以下のアミノ酸配列、配列番号６（ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＳ）、配列番号７（ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ）及び配列番号８（ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＥＣＲＣＳＤＳＳ）のいずれかを含む、好ましくはそれらからなる。

一実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、配列番号９（ＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＧＧＣＡＧＣ）、配列番号１０（ＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＡＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣ）、及び配列番号１１（ＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＧＣ）を含み、好ましくはそれからなる。

しかし、実施形態は、Ｍ２ｅエピトープの使用に限定されず、代わりに、他のエピトープ、例えば、インフルエンザＡ若しくはＢウイルス株由来の核タンパク質及び他の内部タンパク質（ＰＢ１、Ｍ１）由来の保護エピトープ、又はノロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス若しくはＨＩＶなどの他のウイルス由来の関連する保護エピトープを使用することができる。実施形態は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）由来のエピトープなどの細菌エピトープと共に使用することもできる。

例えば、コロナウイルス保存Ｓ表面糖タンパク質及び／又はＯＲＦ１ａｂポリタンパク質（ＯＲＦ１ａｂ）、又はその１つ又は複数の部分を、Ｍ２ｅエピトープの代わりに、又はＭ２ｅエピトープと一緒にエピトープとして使用することができる。そのような場合、エピトープは、以下のアミノ酸配列、配列番号１７（ＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩ）、配列番号１８（ＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫ）及び配列番号１９ ＯＲＦ１ａｂ（ＭＭＩＳＡＧＦＳＬ）のうちの１つ又は複数の中から選択することができた。

特定の実施形態では、第３のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）エピトープ及び／又は少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１エピトープをコードする。例えば、スパイク（Ｓ）グリコールタンパク質のステムドメインは、全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスにおいて進化的に保存された領域である。Ｓは、１５００個のアミノ酸を含む三量体タンパク質である。一実施形態では、第３のヌクレオチド配列が少なくとも１つのＳエピトープをコードし、好ましくは第３のヌクレオチド配列が、配列番号２０と配列番号２１との組み合わせの１つ又は複数のコピーを含む、配列番号２０（ＴＴＴＧＧＣＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴＴＧＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＴＣＧＣＴＴＴＡＡＣ）、配列番号２１（ＣＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＣＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＴＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡ）のヌクレオチド配列の１つ又は複数のコピーを含む。或いは、又は更に、各配列の第３のヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＯＲＦ１ａｂなどのコロナウイルスＯＲＦ１ａｂの少なくとも１つのエピトープをコードする。ＯＲＦ１ａｂは、主にウイルスのポリメラーゼ酵素を産生し、７０００個のアミノ酸からなる。そのような場合、第３のヌクレオチド配列は、配列番号２２（ＡＴＧＡＴＧＡＴＴＡＧＣＧＣＧＧＧＣＴＴＴＡＧＣＣＴＧ）の１つ又は複数のコピーを含む。

いくつかの場合、ウイルス又は細菌エピトープは、ＡＰＣ、好ましくはＤＣで切断することができ、それによって抗原としてあまり効率的ではない。このような問題は、第３のヌクレオチド配列に余分な切断部位を付加することによって解決することができる。したがって、これは、ヌクレオチド配列によってコードされる融合タンパク質が、ＡＰＣ、好ましくはＤＣ中のプロテアーゼによって標的化され得る余分な切断部位を含むことを意味する。したがって、タンパク質切断は、これらの専用の余分な切断部位を標的とし、ウイルス又は細菌エピトープの望ましくない切断のリスクを低減する。そのような任意の余分な切断部位の特定のタイプ及び数は、関連するＡＰＣ、好ましくはＤＣに存在するプロテアーゼのタイプの情報に基づいて選択することができる。

一実施形態では、ヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端に、第１のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされる融合タンパク質は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端に、細菌外毒素（例えばＣＴＡ１、ＬＴＡ１及び／又はＰＴＳ１）、少なくとも１つのウイルスエピトープ（少なくとも１つのＭ２ｅエピトープなど）及びｓｃＦｖを含む。

一実施形態では、ヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端に、ＣＴＡ１をコードする第１のヌクレオチド配列、Ｍ２ｅエピトープの３つのコピーをコードする第３のヌクレオチド配列、及びＣＤ１０３結合ｓｃＦｖをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、配列番号１２を含み、好ましくはその配列からなる。

本発明はまた、薬剤として使用するための上記のヌクレオチド配列にも関する。本発明は更に、ワクチンアジュバントとして使用するための、又はヌクレオチド配列が少なくとも１つのウイルス若しくは細菌エピトープをコードする第３のヌクレオチド配列を含む場合、ワクチンとして使用するための上記のヌクレオチド配列に関する。

本発明はまた、本発明によるヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。

ヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞中で発現、すなわち転写及び翻訳することができる。一実施形態では、発現ベクターは、プラスミド、エピソーマルプラスミド及びウイルスベクターの中から選択される。

一実施形態では、発現ベクターはウイルスベクターである。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びハイブリッドベクターからなる群から選択される。

レンチウイルスはレトロウイルスのサブクラスである。それらは、非分裂細胞のゲノムに組み込まれる能力のおかげで遺伝子送達ビヒクル（ベクター）として適合され、これは、他のレトロウイルスが分裂細胞のみに感染することができるため、レンチウイルスの固有の特徴である。ＲＮＡの形態のウイルスゲノムは、ウイルスが細胞に侵入してＤＮＡを産生すると逆転写され、次いでこれがウイルスインテグラーゼ酵素によってある位置でゲノムに挿入される。ここではプロウイルスと呼ばれるベクターは、ゲノム内に留まり、細胞が分裂する場合、細胞の子孫に伝えられる。安全上の理由から、レンチウイルスベクターは、典型的には、それらの複製に必要な遺伝子を決して保有しない。レンチウイルスを作製するために、いくつかのプラスミドをいわゆるパッケージング細胞株、一般的にはＨＥＫ２９３にトランスフェクトする。一般にパッケージングプラスミドと呼ばれる１つ又は複数のプラスミドは、キャプシド及び逆転写酵素などのビリオンタンパク質をコードする。別のプラスミドは、ベクターによって送達されるべき遺伝物質を含有する。遺伝物質は転写されて一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムを生成し、ψ（プシー）配列の存在によってマークされる。この配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするために使用される。

レトロウイルスは、現在の遺伝子治療アプローチの主流の１つである。モロニーマウス白血病ウイルスなどの組換えレトロウイルスは、安定した様式で宿主ゲノムに一体化する能力を有する。それらは、宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含有する。レトロウイルスベクターは、複製適格性又は複製欠損性のいずれかであってもよい。ウイルスは、ビリオン複製及びパッケージングの更なるラウンドに必要な遺伝子のコード領域が他の遺伝子で置き換えられているか、又は欠失されているので、複製欠損ベクターが最も一般的な選択肢である。これらのウイルスは、様々な細胞に感染し、それらのウイルスペイロードを送達することができるが、その後、細胞溶解及び細胞死をもたらす典型的な溶解経路を継続することができない。

発現ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである場合、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくはＲＮＡ配列である。

本明細書で使用されるアデノウイルスベクターには、アデノウイルスベクター及びアデノウイルス由来ウイルスベクターが含まれる。アデノウイルスＤＮＡはゲノムに組み込まれず、細胞分裂中に複製されない。アデノ由来ウイルスベクターは、アデノウイルスに基づくが、複製タンパク質、調節タンパク質、ウイルス表面タンパク質などをコードするヌクレオチド配列に関連するなど、様々な修飾が行われている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染する小型ウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。更に、ＡＡＶはほとんどがエピソームとして留まり、長く安定した発現を行う。ＡＡＶはＤＮＡの一本鎖をパッケージングし、第２鎖合成のプロセスを必要とするが、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）は、二本鎖ＤＮＡを形成するために一緒にアニーリングする両方の鎖をパッケージングする。第２鎖合成をスキップすることによって、ｓｃＡＡＶは細胞における迅速な発現を可能にする。発現ベクターがアデノウイルスベクターである場合、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、好ましくはＤＮＡ配列である。

ハイブリッドベクターは、２つ以上のベクターの性質を有するように遺伝子操作されたベクターウイルスである。例えば、ハイブリッドベクターは、アデノウイルスとレンチウイルスの組み合わせであってもよい。

発現ベクターはまた、ヌクレオチド配列の発現を制御するプロモータを含むことができる。したがって、そのような実施形態では、ヌクレオチド配列は、宿主細胞などの細胞におけるヌクレオチド配列の発現を指示するためにプロモータによって作動可能に制御される。プロモータは、発現ベクターの内因性プロモータ、例えばウイルスベクターの場合はウイルスプロモータであってもよい。別の実施形態では、対象において活性又は誘導的に活性な外因性プロモータ、誘導性プロモータ又は構成的プロモータを含む他のプロモータを使用することができる。

本発明は更に、本発明による核酸配列及び／又は本発明による発現ベクターを含む細胞に関する。

細胞は、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞などの動物細胞、例えばヒト細胞であってもよい。細胞は、例えば、インビトロで増殖させることができるヒト起源の細胞又は細胞株であってもよい。

細胞は、培養培地中への融合タンパク質の産生及び好ましくは放出のためにインビトロで有利に培養することができる。例えば、細胞は、バイオリアクター、発酵槽又は他の、好ましくは大規模なタンパク質産生設備において培養及び融合タンパク質産生のために選択された細菌細胞、真菌細胞又は酵母細胞であってもよい。

本発明の別の態様は、細菌外毒素、抗原提示細胞上の表面マーカに特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む融合タンパク質に関する。

一実施形態では、細菌外毒素は、細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニット及び百日咳毒素からなる群から選択される。

特定の実施形態では、細菌エンテロトキシンは、コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される。

一実施形態では、細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニットは、コレラ毒素のＡ１サブユニット（ＣＴＡ１）である。特定の実施形態では、ＣＴＡ１は、配列番号１３のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

別の実施形態では、細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニットは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴＡ１）のＡ１サブユニットである。特定の実施形態では、ＬＴＡ１は、配列番号１４のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

一実施形態では、百日咳毒素は、百日咳毒素サブユニットＳ１（ＰＴＳ１）である。特定の実施形態では、ＰＴＳ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

一実施形態では、融合タンパク質は、細菌外毒素が細菌エンテロトキシンである場合、Ａ１サブユニット以外の細菌エンテロトキシンの任意のサブユニットを欠き、細菌外毒素が百日咳毒素である場合、Ｓ１サブユニット以外の百日咳毒素の任意のサブユニットを欠く。

融合タンパク質は、ＣＴＡ１の複数のコピー、ＬＴＡ１の複数のコピー、ＰＴＳ１の複数のコピー、ＣＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＬＴＡ１の少なくとも１つのコピー、ＣＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＰＴＳ１の少なくとも１つのコピー、ＬＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＰＴＳ１の少なくとも１つのコピー、又はＣＴＡ１の少なくとも１つのコピー、ＬＴＡ１の少なくとも１つのコピー及びＰＴＳ１の少なくとも１つのコピーを含むことができる。

一実施形態では、ｓｃＦｖは、樹状細胞（ｃＤＣ）上の表面マーカに特異的に結合する。

特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、従来の又は古典的な樹状細胞（ｃＤＣ）上の表面マーカに特異的に結合する。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ｃＤＣ上の表面マーカであるトロンボモジュリン（ＴＭ）に特異的に結合する。したがって、そのような実施形態では、ｓｃＦｖは樹状細胞のｃＤＣサブタイプに特異的に結合する。

別の実施形態では、ｓｃＦｖは、従来の又は古典的な１型樹状細胞（ｃＤＣ１）上の表面マーカに特異的に結合する。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、分化抗原群１０３（ＣＤ１０３）、ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）、ＸＣＲ１、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）／ＣＤ２５０、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、Ｂリンパ球及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）、並びにＣＤ２２６からなる群から選択される表面マーカに特異的に結合し、好ましくは、第２のヌクレオチド配列は、ＣＤ１０３、ＸＣＲ１及びＣｌｅｃ９Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。これらのタンパク質は、ｃＤＣ１上の表面マーカである。したがって、この実施形態では、ｓｃＦｖは、樹状細胞のｃＤＣ１サブタイプに特異的に結合する。

更なる実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、従来の又は古典的な２型樹状細胞（ｃＤＣ２）上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、分化抗原群１ｃ（ＣＤ１ｃ／ＢＤＣＡ－１）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２、ＦｃεＲＩ（ＦＣＥＲ１）、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）／ＣＤ１７２ａ、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＡ（Ｃｌｅｃ４Ａ）及びＣｌｅｃ１０Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合する。これらのタンパク質は、ｃＤＣ２の表面マーカである。したがって、この実施形態では、ｓｃＦｖは、樹状細胞のｃＤＣ２サブタイプに特異的に結合する。

特定の実施形態では、ｓｃＦｖはＣＤ１０３に特異的に結合し、樹状細胞のサブセットは、ｃＤＣ１サブタイプ及び二重陽性ｃＤＣ２（ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１１ｂ^＋）サブタイプを含むＣＤ１０３発現樹状細胞（ＣＤ１０３^＋樹状細胞）である。別の特定の実施形態では、ｓｃＦｖはＬＹ７５（ＣＤ２０５）に特異的に結合し、樹状細胞のサブセットは、ＬＹ７５（ＣＤ２０５）発現樹状細胞（ＬＹ７５^＋又はＣＤ２０５^＋樹状細胞）である。更なる特定の実施形態では、ｓｃＦｖはＸＣＲ１に特異的に結合し、樹状細胞のサブセットはＸＣＲ１発現樹状細胞（ＸＣＲ１^＋樹状細胞）である。更に別の特定の実施形態では、ｓｃＦｖはＣｌｅｃ９Ａに特異的に結合し、樹状細胞のサブセットは、Ｃｌｅｃ９Ａ発現樹状細胞（Ｃｌｅｃ９Ａ^＋樹状細胞）である。特定の実施形態では、ｓｃＦｖはＣＤ１１ｃに特異的に結合し、樹状細胞のサブセットは、ＣＤ１１ｃ発現樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋樹状細胞）、ｃＤＣ１及びｃＤＣ２細胞である。

一実施形態では、ｓｃＦＶは、配列番号１６のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。

ｓｃＦｖは、ファージディスプレイ技術を含むがこれに限定されない、当技術分野で周知の様々な技術に従って製造することができる。クローニングされると、免疫応答中に体細胞高頻度変異を模倣することによって抗原結合の親和性及び特異性を高めることが可能である。ファージディスプレイ技術は、ほぼあらゆる抗原に対して実質的に無制限の量の抗体を合成及び発現することができる細菌系を介して、動物免疫化及びハイブリドーマ開発の既存の慣行を置き換えることさえ可能にする。

ｓｃＦｖ抗体フラグメントを得るために、ｍＲＮＡを最初にハイブリドーマ（又は脾臓、リンパ細胞、及び骨芽細胞）から単離し、続いてｃＤＮＡに逆転写して、ＰＣＲを用いた抗体遺伝子増幅のための鋳型として働く。この技術により、多様な範囲の抗体ＶＨ及びＶＬ遺伝子を有する大きなライブラリーを作製することができる。バイオパニング工程を使用して、最良の親和性及び特異性を有するｓｃＦｖ抗体フラグメントを得る。ｓｃＦｖの構築において、ドメインの順序は、ＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのいずれかであってもよい。

ｓｃＦｖ抗体フラグメントの発現及び産生は、抗体ライブラリーを用いた抗体発見を支援するための日常的な研究である。抗体遺伝子が首尾よくクローニング及び配列決定されると、ｓｃＦｖフラグメントは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物発現系で容易に発現することができる。一過性トランスフェクションによって哺乳動物系（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）で発現させることもできる。

適切な精製タグは、典型的には、抗体ｓｃＦｖフラグメントタンパク質のＣ末端に付加される。一般的に使用される精製タグは、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、及びＭｙｃタグである。プロテアーゼ切断部位をタグとｓｃＦｖとの間に含めて、精製後のタグ除去を可能にすることができる。

本発明に従って使用することができるｓｃＦｖは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）４２（８）：９７９－９８５、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１２）７（９）：ｅ４５１０２、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００９），１５：４６１２－４６２１、Ｂｌｏｏｄ（２０１０）１１６（１３）：２２７７－２２８５、並びに米国特許出願第２００４／０１４６９４８号及び第２０２０／０３４７１３８号に開示されている。

一実施形態では、融合タンパク質は、複数のｓｃＦｖ、例えば少なくとも１つの第１のｓｃＦｖ及び少なくとも１つの第２の異なるｓｃＦｖ又は同じｓｃＦｖの複数のコピーを含む。

一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープを含む。様々なそのようなウイルスエピトープ、例えば、インフルエンザＡ若しくはＢウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス又はＨＩＶ由来のエピトープ又は抗原を、本明細書で前述した実施形態に従って使用することができる。細菌エピトープの例は、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のエピトープである。

一実施形態では、少なくとも１つのウイルスエピトープは、インフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質２（Ｍ２ｅ）エピトープの少なくとも１つの外部ドメインである。

特定の実施形態では、Ｍ２ｅエピトープは、以下のアミノ酸配列、配列番号６（ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＳ）、配列番号７（ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ）及び配列番号８（ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＥＷＥＣＲＣＳＤＳＳ）のいずれかを含む、好ましくはそれらからなる。

別の特定の実施形態では、少なくとも１つのウイルスエピトープは、好ましくは配列番号１７（ＦＧＡＧＡＡＬＱＩＰＦＡＭＱＭＡＹＲＦＮＧＩ）、配列番号１８（ＱＬＩＲＡＡＥＩＲＡＳＡＮＬＡＡＴＫ）及び配列番号１９（ＭＭＩＳＡＧＦＳＬ）からなる群から選択される少なくとも１つのコロナウイルスのエピトープである。

融合タンパク質は、単一のウイルス若しくは細菌エピトープ、同じウイルス若しくは細菌エピトープの複数のコピー、又は同じ若しくは異なるウイルス若しくは細菌からの実際には異なるウイルスエピトープを含むことができる。例えば、融合タンパク質は、複数のＭ２ｅエピトープ、好ましくは３つのＭ２ｅエピトープを含むことができる。そのような場合、複数のウイルスエピトープ、例えばＭ２ｅエピトープは、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）、少なくとも１つのセリン（Ｓ）、及びそれらの組み合わせ、好ましくはＧＳからなる群から選択されるリンカーによって相互接続されてもよい。融合タンパク質は、複数のコロナウイルスのエピトープ又は少なくとも１つのコロナウイルスのエピトープ、例えば、Ｓ糖タンパク質及び／又はＯＲＦ１ａｂからの少なくとも１つのエピトープ、及び少なくとも１つのＭ２ｅエピトープを含むことができる。

一般に、融合タンパク質がウイルス又は細菌エピトープの複数のコピーを含む場合、単にウイルス又は細菌エピトープの単一のコピーを含む場合と比較して、融合タンパク質、又はむしろその中のウイルス若しくは細菌エピトープは、より免疫原性である。したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、好ましくはウイルス又は細菌エピトープのＮ個のタンデムリピートとして、ウイルス又は細菌エピトープのＮ個のコピーを含み、Ｎは２以上であり、好ましくは２～１０の範囲内、好ましくは２～８の範囲内、より好ましくは２～６の範囲内、例えば２～４の範囲内、例えばＮ＝３である。したがって、融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のコピーのウイルス又は細菌エピトープを含むことができる。

一実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニット、少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープ及びｓｃＦｖを含む。融合タンパク質の異なるサブユニットは、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）、少なくとも１つのセリン（Ｓ）、及びそれらの組み合わせ、好ましくはＧＳからなる群から選択されるリンカーによって相互接続されてもよい。

一実施形態では、融合タンパク質は水溶性である。ＣＴＡ１及びＬＴＡ１単独では、一般に生理学的水溶液への溶解度が低い。しかし、ＣＴＡ１及び／又はＬＴＡ１に加えて、少なくともｓｃＦｖ及び場合により少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープも含む実施形態の融合タンパク質は、ＣＴＡ１及びＬＴＡ１単独と比較して高い溶解度を有する。したがって、融合タンパク質は水溶性であることが好ましい。

一実施形態では、融合タンパク質は、樹状細胞のサブセットに特異的に結合する。したがって、融合タンパク質中のｓｃＦｖの存在は、融合タンパク質が、ｓｃＦｖが特異性を有し、特異的に結合する、膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質などの分子を発現する樹状細胞の特定のサブセットを特異的に標的として結合することができることを意味する。ｓｃＦｖの存在による融合タンパク質のこの標的化効果は、アジュバントとして、又は少なくとも１つのウイルスエピトープを含む場合、ワクチンとしての融合タンパク質の有効性を増加させる。例えば、ＣＤ１０３に特異的に結合するｓｃＦｖは、粘膜樹状細胞のＣＤ１０３^＋サブセットを特異的に標的とする。樹状細胞のこのサブセットは、エフェクター及び中枢並びに組織常在性メモリーＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の刺激に重要である。Ｔ細胞のこれらの集団は、他のリンパ球を補助し、これにはＢ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、並びに細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞及びマクロファージ並びに自然免疫系に属する多くの他の細胞の活性化が含まれる。ＣＤ４ Ｔ細胞がＣＤ１０３^＋樹状細胞によって活性化されると、それらは急速に分裂し、免疫応答を調節及び補助する特異的サイトカインを分泌する機能的サブセットに発達する。

樹状細胞のこのサブセットは、エフェクター及び中枢並びに組織常在性メモリーＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞の刺激に重要である。Ｔ細胞のこれらの集団は、他のリンパ球を補助し、これにはＢ細胞の形質細胞及びメモリーＢ細胞への成熟、並びに細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞及びマクロファージ並びに自然免疫系に属する多くの他の細胞の活性化が含まれる。ＣＤ４ Ｔ細胞がＣＤ１０３^＋樹状細胞によって活性化されると、それらは急速に分裂し、免疫応答を調節及び補助する特異的サイトカインを分泌する機能的サブセットに発達する。

したがって、少なくともＭ２ｅエピトープを含む融合タンパク質の実施形態は、対象、好ましくはヒト対象に投与された場合、Ｔｈ１７細胞を誘導することができる。

一実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質のｓｃＦｖ部分が樹状細胞上の表面マーカに結合することによって、樹状細胞に特異的に結合する。融合タンパク質は、樹状細胞によって内在化されることが好ましい。したがって、実施形態の融合タンパク質は、好ましくは、標的樹状細胞によって取り込まれ、内在化されてもよい。次いで、樹状細胞は、融合タンパク質を処理し、融合タンパク質が少なくとも１つのウイルスエピトープを含む場合、少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープを処理し、ＭＨＣ分子と共に細胞表面に提示することができる。

実施形態の融合タンパク質は、ワクチン、特に粘膜ワクチンのためのアジュバントとして使用することができる。したがって、本発明の一態様は、本発明による融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、アジュバント組成物に関する。

実施形態の融合タンパク質は、様々なワクチン、特に粘膜ワクチンのためのアジュバントとして使用することができる。次いで、融合タンパク質を、特定の疾患に対する能動獲得免疫を提供する薬剤と組み合わせて使用することができる。この薬剤は、例えば、疾患を引き起こす微生物、その毒素及び／又は疾患を引き起こす微生物の界面活性剤内部タンパク質の脆弱形態又は死滅形態であってもよい。

そのような場合、薬剤は、融合タンパク質及び薬学的に許容される担体と混合されて、ワクチン組成物を達成することができる。したがって、そのような実施形態では、薬剤及び融合タンパク質は、対象に一緒に投与される。或いは、薬剤と融合タンパク質又はアジュバント組成物とを、同じ又は異なる投与経路を使用して、任意の順序で対象に別々に投与してもよい。

しかし、ワクチン抗原の免疫原性に対する融合タンパク質のアジュバント効果は、免疫保護ウイルス又は細菌エピトープが融合タンパク質に含まれる場合に改善される。そのような場合、少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープは、分離された融合タンパク質（アジュバント）及びウイルス又は細菌エピトープ（薬剤）を有する場合と比較して、はるかに免疫原性及び保護性である。

したがって、本発明の別の態様は、本発明による融合タンパク質を含み、少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープ及び薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物に関する。

アジュバント又はワクチン組成物の薬学的に許容される担体は、特定の投与経路に基づいて選択することができる。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、水又は水溶液、例えば生理食塩水、又は緩衝水溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、リポソーム、ポリマーミセル、ミクロスフェア、ナノ粒子及びナノファイバーからなる群から選択される。

ワクチン、特に粘膜ワクチンの潜在的な問題は、粘膜投与が、粘膜表面でのワクチンの免疫原性を低下させる、酵素分解及び迅速なクリアランスからの抗原の保護を必要とすることである。したがって、薬学的に許容される担体は、ワクチンの免疫原性及び分解に対する耐性を高めるために使用することができる。例えば、脂質ベースのナノ粒子（ＬＮＰ）は、特にそれらの物理化学的特性が容易かつ大幅にカスタマイズ可能であるため、有望で汎用性のある選択肢である。これらのナノ粒子は、ワクチンの送達を増強することによって機能することができるが、アジュバント特性をワクチンに加えることによって免疫原性を増大させることもでき、この現象は、ワクチン投与とＬＮＰ投与とを最大４８時間までに分離した場合、増強されたワクチン免疫原性が依然として記録されていることを示す研究によって支持されている。

したがって、一実施形態では、アジュバント又はワクチン組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。

ＬＮＰは、タンパク質又はプラスミドの負荷を可能にするそれらの比較的単純さ、安全性及び柔軟性のためにワクチンアジュバントとして有効である。脂質組成を変化させることによって、ナノスケールのディスク形状のより剛性の脂質－タンパク質複合体を含む、より複雑な粒子形態、例えば、立方体、六角形、又はスポンジ相構造を作成することができる。ＬＮＰは、アジュバント及びワクチン抗原を分解から保護し、酵素活性の喪失を防止することも公知である。しかし、ＬＮＰはインビボで免疫応答をプライムすることができるが、異なるＤＣサブセットに対する選択性を示さず、Ｂ細胞及びマクロファージなどの非ＤＣによっても取り込まれる。したがって、ＤＣの異なるサブセットへのＬＮＰの標的化は、ワクチンエピトープ担体及び強力な免疫増強剤としても機能することができる本発明の融合タンパク質によって達成することができる。

本発明の融合タンパク質は、薬学的に許容される担体に負荷され、薬学的に許容される担体の表面に吸着又は吸収され、及び／又は薬学的に許容される担体に共有結合することができる。

実施形態では、融合タンパク質は、場合によりスペーサ又はリンカーを使用して、ＬＮＰに共有結合される。例えば、融合タンパク質は、ポリマーリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、グリカン、ポリペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるリンカーによってＬＮＰに共有結合することができる。

特定の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧリンカー又はＰＥＧスペーサ、例えばＰＥＧ（２０００）－スペーサである。

一実施形態では、融合タンパク質は、トラウト試薬（２－イミノチオラン塩酸塩）を使用して第一級アミンをチオール基に変換した後、チオール－マレイミド反応を使用してＬＮＰに共有結合される。簡単に説明すると、トラウト試薬（ＨＢＳ中０．０２ｍｇ／ｍｌ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む、ｐＨ＝７．８）及び融合タンパク質（１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．１６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中１．６ｍｇ／ｍｌ）を５：３の体積比に混合し、４℃で２０分間インキュベートする。４ｍＭの脂質濃度の粒子を、５：４の体積比で、新たにチオール化した融合タンパク質に添加し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートする。未反応の融合タンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００ｋＤａカットオフ遠心フィルター（ＶＷＲ、スウェーデン）を以下のように使用して、１２５μｌのＮａＡｃ生理食塩水及び約２９０μｌのＬＮＰ懸濁液を各フィルターに添加し、遠心分離し（５分又は約２５０μｌの溶液が残るまで、８０００×ｇ、１０℃）、続いて各フィルター中の１５０μｌのＮａＡｃ生理食塩水で更に希釈し、別の遠心分離（５分又は約２５０μｌの溶液が残るまで、８０００×ｇ、１０℃）を行い、除去することができる。懸濁液は、フィルターを反転させ、遠心分離（１分、８０００×ｇ、１０℃）することによって回収することができる。

一実施形態では、ＬＮＰは、平均で少なくとも５０個の共有結合した融合タンパク質、好ましくは少なくとも７５個の共有結合した融合タンパク質、より好ましくは少なくとも１００個の共有結合した融合タンパク質を含む。

一実施形態では、ＬＮＰは、５０ｎｍ～２５０ｎｍの範囲内、好ましくは７５ｎｍ～２００ｎｍの範囲内、より好ましくは１００～１５０ｎｍの範囲内の平均直径を有する。

一実施形態では、ＬＮＰはゲル相である。それらの液相対応物と比較して、ゲル相ＬＮＰは抗原提示を改善するのにより効率的である。それらはまた、共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御、並びにサイトカインＩＬ－６及びＩＬ－１βの放出の増加においても優れている。特定の実施形態では、ＬＮＰは、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）を含むリポソームである。そのようなＤＳＰＣリポソームは、ゲル相であるＬＮＰを形成する。

実施形態に従って使用することができるＬＮＰの他の例としては、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）が挙げられる。これらのＤＯＰＣ ＬＮＰは液相である。

実施形態の更なる態様は、医薬品として使用するための、アジュバントとして使用するための、及び／又はワクチンとして使用するための本発明による融合タンパク質を含む。後者の使用では、すなわちワクチンとして、融合タンパク質は少なくとも１つのワクチンエピトープを含む。これに対応して、本発明は、医薬品を製造するための、アジュバントを製造するための、又はワクチンを製造するための本発明による融合タンパク質の使用に関する。

本発明の実施形態は、ウイルスによって引き起こされる感染性疾患、すなわちウイルス性疾患、又は細菌によって引き起こされる感染性疾患、すなわち細菌性疾患、及びがん疾患を含むがこれらに限定されない様々な疾患に対するワクチンとして使用することができる。特に興味深いのは、粘膜を介して身体にアクセスするウイルス又は細菌によって引き起こされる感染症である。このカテゴリーには、呼吸器、胃腸及び生殖管に感染するものが含まれる。例示的な例としては、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、インフルエンザＡ若しくはＢウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス又はＨＩＶによって引き起こされる疾患が挙げられる。

本発明はまた、アジュバントとして使用するためのリポソーム又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）製のＬＮＰに関する。そのような場合、リポソーム又はＬＮＰはゲル状態である。

一実施形態では、ＬＮＰは、５０ｎｍ～２５０ｎｍの範囲内、好ましくは７５ｎｍ～２００ｎｍの範囲内、より好ましくは１００～１５０ｎｍの範囲内の平均直径を有する。

一実施形態では、リポソーム又はＬＮＰは、生理学的温度、好ましくは３７℃でゲル状態又はゲル相状態である。

一実施形態では、リポソーム又はＬＮＰは、場合によりスペーサ又はリンカーを使用して、リポソーム又はＬＮＰに共有結合した少なくとも１つのタンパク質を含む。一実施形態では、リンカー又はスペーサは、ポリマーリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、グリカン、ポリペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態では、リンカー又はスペーサは、ＰＥＧリンカー又はスペーサ、例えばＰＥＧ（２０００）－スペーサである。

一実施形態では、少なくとも１つのタンパク質は、トラウト試薬（２－イミノチオラン塩酸塩）を使用して第一級アミンをチオール基に変換した後、チオール－マレイミド反応を使用して、リポソーム又はＬＮＰに共有結合される。簡単に説明すると、トラウト試薬（ＨＢＳ中０．０２ｍｇ／ｍｌ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む、ｐＨ＝７．８）及びタンパク質（１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、０．１６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中１．６ｍｇ／ｍｌ）を５：３の体積比に混合し、４℃で２０分間インキュベートする。４ｍＭの脂質濃度のリポソーム又はＬＮＰを、５：４の体積比で、新たにチオール化したタンパク質に添加し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートする。未反応のタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００ｋＤａカットオフ遠心フィルター（ＶＷＲ、スウェーデン）を以下のように使用して、１２５μｌのＮａＡｃ生理食塩水及び約２９０μｌのＬＮＰ懸濁液を各フィルターに添加し、遠心分離し（５分又は約２５０μｌの溶液が残るまで、８０００×ｇ、１０℃）、続いて各フィルター中の１５０μｌのＮａＡｃ生理食塩水で更に希釈し、別の遠心分離（５分又は約２５０μｌの溶液が残るまで、８０００×ｇ、１０℃）を行い、除去することができる。懸濁液は、フィルターを反転させ、遠心分離（１分、８０００×ｇ、１０℃）することによって回収することができる。

一実施形態では、単一のタイプのタンパク質がリポソーム又はＬＮＰに共有結合している。別の実施形態では、複数の異なるタンパク質の混合物をリポソーム又はＬＮＰに共有結合させる。

リポソーム又はＬＮＰに共有結合した少なくとも１つのタンパク質は、好ましくは上記のように、リポソーム又はＬＮＰに共有結合することができる任意のタンパク質又はペプチドであってもよい。そのようなタンパク質の例示的であるが非限定的な例としては、タンパク質薬、抗体、酵素、融合タンパク質、無細胞タンパク質ワクチン、タンパク質標識などが挙げられる。

本発明はまた、細菌又はウイルスの感染又は疾患に対して対象にワクチン接種する方法に関する。方法は、本発明によるワクチン組成物を対象に投与することを含む。

一実施形態では、ワクチン組成物の投与としては、ワクチン組成物の鼻腔内、経口、直腸、膣内又は肺内投与が挙げられる。特定の実施形態では、ワクチン組成物は、エアロゾル又はスプレーとして投与される。

対象は、好ましくはヒト対象である。しかし、本発明は、対象が動物、好ましくは哺乳動物、例えばネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット又はマウスである獣医学目的にも使用することができる。

本発明はまた、本明細書に提示されるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列と相同体であるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を包含する。ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の「ホモログ」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列と実質的な配列同一性、すなわち少なくとも約７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び／又は１００％の配列同一性を有する。

特に、本発明は、特定の宿主細胞又は種に基づいてコドン適合又は最適化することができるヌクレオチド配列を包含する。したがって、本発明はまた、本明細書に開示されるヌクレオチド配列のコドン適合バージョン又は最適化バージョンを包含する。そのようなコドン適合ヌクレオチド配列は、好ましくは、元のヌクレオチド配列と同じアミノ酸配列をコードするが、少なくとも１つのコドンが元のヌクレオチド配列中の対応するコドンとは異なる。一般に、ほとんどのタンパク質のアミノ酸配列は、遺伝暗号の縮重性のためにいくつかの異なるヌクレオチド配列によってコードされ得る。異なるコドン割り当てを介して同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、異なる宿主細胞で発現されるタンパク質の量が劇的に異なり得る。

本明細書で使用される場合、「配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされたヌクレオチド酸又はアミノ酸配列が、成分、例えばヌクレオチド又はアミノ酸のアラインメントのウィンドウ全体にわたって不変である程度を指す。「同一性」は、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されているものを含む公知の方法によって容易に計算することができる。

本明細書で使用される場合、「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」という用語は、２つの配列が最適にアラインメントされた場合、試験（「対象」）核酸分子（又はその相補鎖）と比較した、参照（「クエリ」）核酸分子（又はその相補鎖）の直鎖核酸配列中の同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、「同一性パーセント」は、アミノ酸配列中の同一のアミノ酸のパーセンテージを指すことができる。

本明細書で使用される場合、２つの核酸分子、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の文脈における「実質的に同一」という語句は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定される場合、最大一致について比較及びアラインメントされたとき、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基～約１５０残基の長さである配列の領域にわたって存在する。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、実質的な同一性は、長さが少なくとも約１６、少なくとも約１８、少なくとも約２２、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、又はそれ以上の残基、及びその中の任意の範囲である配列の領域にわたって存在する。

配列比較のために、典型的には、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアラインメントは、当業者に周知であり、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性法の検索などのツールによって、並びに場合により、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）の一部として入手可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施態様によって行うことができる。試験配列及び参照配列のアラインメントされたセグメントに対する「同一性割合」は、２つのアラインメントされた配列によって共有される同一の構成要素の数を、参照配列セグメントにおける構成要素の総数、すなわち、参照配列全体又は参照配列のより小さい定義された部分で割ったものである。パーセント配列同一性は、１００を掛けた同一性割合として表される。１つ又は複数のポリヌクレオチド配列の比較は、完全長ポリヌクレオチド配列若しくはその一部、又はより長いポリヌクレオチド配列に対するものであってもよい。本発明の目的のために、「同一性パーセント」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して決定することができる。

ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリ配列中の長さＷの短いワードを識別することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含み、これは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントされたときにいくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するか又はそれを満たす。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるために検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチング残差に対する報酬スコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残差に対するペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアマトリックスを使用して累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１つ又は複数の負スコア残基アラインメントの蓄積により０以下になるか、又はいずれかの配列の末端に達すると停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）をデフォルトとして使用する。

配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列は、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小和確率が約０．１未満～約０．００１未満である場合、参照配列と類似していると見なされる。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との比較における最小和確率は、約０．００１未満である。

２つのヌクレオチド配列は、２つの配列がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする場合、実質的に同一であると見なすこともできる。いくつかの代表的な実施形態では、実質的に同一であると考えられる２つのヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする。

サザンハイブリダイゼーション及びノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメータの下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ ｐａｒｔ Ｉ ｃｈａｐｔｅｒ ２’’Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ’’Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）に見られる。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨでの特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。

Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（規定のイオン強度及びｐＨの下での）温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。サザンブロット又はノーザンブロットにおいてフィルター上に１００個を超える相補的残基を有する相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは一晩実施される。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、７２℃で約１５分間の０．１５Ｍ ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、下記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。）。多くの場合、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄が行われる。例えば１００個を超えるヌクレオチドの二本鎖に対する中ストリンジェンシー洗浄の例は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００個を超えるヌクレオチドの二本鎖に対する低ストリンジェンシー洗浄の例は、４０℃で１５分間の４～６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的には、ｐＨ７．０～８．３で約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度（又は他の塩）を伴い、温度は典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成することができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比よりも２倍（又はそれを超える）のシグナル対ノイズ比は、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしないヌクレオチド配列は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重を使用してヌクレオチド配列のコピーが作成される場合に起こり得る。

以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用することができるハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である。一実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で２×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄する、５０℃で７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。別の実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄する、５０℃で７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、又は５０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で洗浄する、５０℃７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。なお更なる実施形態では、参照ヌクレオチド配列は、５０℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄する、５０℃で７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、又は６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で洗浄する、５０℃７％ＳＤＳ、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で「試験」ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。

特定の実施形態では、２つのヌクレオチド配列又は２つのアミノ酸配列が実質的に同一であるという更なる指標は、ペプチド又は第１の核酸によってコードされるペプチドが、第２の核酸によってコードされるペプチドタンパクと免疫学的に交差反応性であるか、又は特異的に結合することであってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、例えば、２つのポリペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一であってもよい。

そのような保存的置換の例としては、脂肪族アミノ酸、すなわちグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンの間の置換、ヒドロキシル又は硫黄含有アミノ酸、すなわちセリン、システイン、トレオニン及びメチオニンの間の置換、芳香族アミノ酸、すなわちフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンの間の置換、塩基性アミノ酸、すなわちヒスチジン、リジン及びアルギニンの間の置換、並びに酸性アミノ酸及びそれらのアミド、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン及びグルタミンの間の置換が挙げられる。

例１：
ＣＴＡ１－ＣＤ１０３融合分子を有する異なるエピトープのＤＮＡ構築、発現及び精製は、原核生物である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及び真核生物である昆虫細胞系の両方で行った。

ＤＮＡ構築
Ｍ２９０ハイブリドーマからの全細胞ＲＮＡを、ＲＮＡ ｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。Ｐｈｕｓｉｏｎ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ－ＰＣＲ）Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｆ－５４６Ｓ）を用いて、抽出したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に対する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）合成を、鋳型ＲＮＡ ５μｌ（１μｇ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰミックス１μｌ、オリゴ（ｄＴ）プライマー１μｌ、１０μｌになるようにＲＮａｓｅフリーＨ_２Ｏを添加して行った。プライマー伸長を２５℃で１０分、ｃＤＮＡ合成を４０℃で３０分、反応停止を８５℃で５分行った。

増幅産物を配列決定した。
＞４－ＶＬ＿ＨＢＳ－ｒｃｋ（配列の３４～５０１）（配列番号２３）

＞８－ＶＨ＿ＨＢＳ－ｒＧ２ａ（配列の７～５７０）（配列番号２４）

重鎖及び軽鎖の可変領域の第２セットのネステッドＰＣＲ増幅を反応マスターミックスである、Ｈ_２Ｏ ５０μｌ、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＨＦ緩衝液１０μｌ １×、１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ（それぞれ２００μＭ）、プライマーペア（重鎖についてはＭ２９０＿ＶＨフォワードプライマー１μｌ（０．５μＭ）及びＭ２９０＿ＶＨリバースプライマー１μｌ（０．５μＭ）、（軽鎖についてはＭ２９０＿ＶＬフォワードプライマー１μｌ（０．５μＭ）及びＭ２９０＿ＶＬフォワードプライマー１μｌ（０．５μＭ）、ｃＤＮＡ合成反応混合物５μｌ及びＰｈｕｓｉｏｎホットスタートＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（０．０２Ｕ／μｌ）中で行った。

９８℃で３０秒の初期変性、続いて４０サイクルの（変性９８℃で１００秒、アニーリング６５℃（重鎖）又は６０℃（軽鎖）で１０秒、及び長７２℃で４０秒）。

次いで、生成されたＰＣＲ産物を配列決定して、配列の妥当性を確認した。
＞制限部位及びプライマーを有する最終ＶＨ配列（配列番号２９）

＞制限部位及びプライマーを有する最終ＶＬ配列（配列番号３０）

ＧＳリンカー生成
以下のフォワードプライマー及びバックワードプライマーを使用して、ＧＳリンカーに対応するヌクレオチド配列を合成して、ＶＨ配列の末端の１５ｂｐと、それに続くＧＳリンカーと、それに続くＶＬ配列の開始部の１５ｂｐとを含む構築物を形成した。
ＧＳ－Ｍ２９０フォワード（配列番号３１）
ｇｔｃ ａｃｃ ｇｔｇ ｔｃｃ ｔｃａ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＧＴ ａａｃ ａｔｃ ｃａｇ ａｔｇ ａｃｃ

ＧＳ－Ｍ２９０リバース（配列番号３２）
ｇｇｔ ｃａｔ ｃｔｇ ｇａｔ ｇｔｔ ＡＣＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＴ ＣＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ｔｇａ ｇｇａ ｃａｃ ｇｇｔ ｇａｃ

生成したＶＨ及びＶＬとＧＳリンカーとの混合物を用いたアニーリング及び増幅により、以下の完成した配列がもたらされた。
完全なＣＤ１０３フラグメント＝ＶＨ－ＧＳ－ＶＬ（配列番号３３）

最終コアＣＤ１０３ ｓｃＦｖアミノ酸配列（配列番号１６）

上記のコアＣＤ１０３（Ｍ２９０）ｓｃＦｖを使用して、ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ配列に続いてＨｉｓタグ及びＦＬＡＧタグ配列が続くＡｒｇ７Ｌｙｓ変異（ＣＴＡ１（Ｒ７Ｋ））－Ｘ）を有するＣＴＡ１－Ｘ又はＣＴＡ１を含む融合タンパク質を産生し、最終的な以下のＤＮＡ配列産物を作製した。

細菌発現用ＤＮＡ構築物
以下の構築物を、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅクローニングシステムを使用して、Ｐ_Ｔｒｃプロモータの制御下で標準的なｐＴｒｃ－ＢｓａＩ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター骨格に作製した。全ての配列を、ＧｅｎｅＡｒｔのツールを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のために最適化した。また、最初Ｍの後に挿入されたアミノ酸ＫＮをコードするＤＮＡ配列を、より良好なタンパク質発現プロファイルのために含めた。

ｐＴｒｃ－ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－ｐ３２３－ｓｃＦｖＣＤ１０３－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓ：
＞ＣＴＡ１（配列番号３４）：

＞３Ｍ２ｅ－３Ｅａ－ＳＩＩＮ－ｐ３２３（配列番号３５）

＞ｓｃＦｖＣＤ１０３－ＦＬＡＧ Ｈｉｓ（配列番号３６）：

＞ｐＴｔｃ－ＢｓａＩ（配列番号３７）：

上記のＤＮＡ鎖をＨ_２Ｏに再懸濁して、約１００ｎｇ／μｌの濃度にした。これらのＤＮＡ鎖＋ｐＴｒｃ－ＢｓａＩ（ｐＴＯＬ１００２）を表２に従って混合した。

以下の反応条件である３７℃で４０分間、続いて５５℃で５分間のインキュベートを使用した。各反応物２μｌを使用して、２０μｌのコンピテントライブラリーＤＨ５ａ細胞を形質転換した。

以下の配列を合成し、Ｅｕｒｏｐｈｉｎｇｅｎｏｍｉｃｓにより、ＡａｒＩクローニング部位を介して標準的なｐＳＹ－ＢｓａＩ（５）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター骨格にクローニングした。これにより、ｐＳＹ－ＣＴＡ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｉ）－Ｐ２３２（ＩＩ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ、ＣＴＡ１－Ｐ２３２（ＩＩ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ及びｐＳＹ－ＣＴＡ１（Ｒ７ｋ）－Ｐ３２３－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグが得られた。全ての配列を、ＧｅｎｅＡｒｔのツールを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のために最適化した。
ＣＴＡ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｉ）－Ｐ２３２（ＩＩ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ（配列番号３８）

ＣＴＡ１－Ｐ２３２（ＩＩ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ（配列番号３９）

ＣＴＡ１（Ｒ７ｋ）－Ｐ３２３－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ（配列番号４０）

ｐＳＹ－ＡａＲＩ（配列番号４１）

昆虫細胞における発現のためのＤＮＡ構築設計
融合タンパク質の正常発現を、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現系公開番号ＭＡＮ００００４１４のプロトコルに従って、バキュロウイルス発現（ＢＥＶ）系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。手短に言えば、６３ｂｐのメリチン分泌シグナル配列（ＭＳＳ）で始まるＭＳＳ－ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－Ｆｌａｇタグ－Ｈｉｓタグ配列を合成し、ポリヒドリンプロモータ（Ｐ_ＰＨ）ＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩ部位下で、Ｅｕｒｏｐｈｉｎｇｅｎｏｍｉｃｓにより、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１バキュロウイルス標準発現シャトルベクターにクローニングした。
ｍＳＳ－ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ（配列番号４２）

生成したｐＦＡＳＴＢＡＣ１－ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグドナープラスミドを標準ＤＨ５ａ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換し、増幅し、Ｑｉａｇｅｎミニプラスミド精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。次いで、ｐＦＡＳＴＢＡＣ１－ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓドナープラスミドを使用して、ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグをバキュロウイルスゲノム（バクミド）に、ＢＡＣ－ＴＯ－ＢＡＣとして知られる部位特異的転移事象においてＢａｃｍｉｄを含有するＭＡＸ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ＤＨ１０ ＢＡＣ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に移入した。バクミドをＤＨ１０Ｂａｃ単一クローンから精製し、プロトコルに従ってＰＵＣ／Ｍ１３フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いた特異的ＰＣＲで４１６３ｂｐのバンドを有することによって、ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ遺伝子を保有していることを確認した。抽出した組換えバクミドを、ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製し、組換えＢａｃｕｌｏベクター産生及びタンパク質発現の次の工程で使用した。重量（６４．４３ＫＤａ）を有する以下の成熟タンパク質配列は、ＳＳ切断後に発現すると（ＳｉｇｎａｌＰ ５．０による予測に従って）予想された（配列番号４３）：

図１Ａは、アジュバント活性融合タンパク質のインシリコクローニング戦略の概略図であり、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））発現系におけるＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－３Ｅα－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｐ３２３－ＣＤ１０３－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓ及び真核細胞系（バキュロウイルス）におけるＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－３Ｅα－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｐ３２３－ＣＤ１０３－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓを示す図である。

タンパク質発現
原核生物系
ｐＴｃｒ構築物を形質転換し、グリセロールストックから大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ中で凍結した。グリセロール中のＤＨ５ａ中のＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－３Ｅａ－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－Ｏｖａ－ＣＤ１０３－ＦＬＡＧ－Ｈｉｓを含む５００ｍｌ振盪フラスコに、５０ｍｌの２ｘＹＴ（＋５０μｌのカナマイシン（１μｇ／μＬ））を接種した。３７℃、２６０ｒｐｍで一晩インキュベートした。２×１ＬのＳＹＰＰＧ培地＋１ｍｌのカナマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）を、５Ｌの振盪フラスコ中で種培養物と共に１／１０の比率で接種した。３７℃、２６０ｒｐｍでのインキュベーションの２時間後、プロセスは１ｍｌの１Ｍ ＩＰＴＧ／Ｌとのインキュベーションによって進行する。培養物を一晩維持し、次いで、７０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２０ ＸＰ、ロータＪＬＡ８．１０００）で４℃で２５分間の遠心分離によって回収した。ペレットを５０ｍｌファルコンチューブに移し、溶解、可溶化及び再形成工程まで－２０℃で保存した。

ｐＳＹ構築物を形質転換し、グリセロールストックＬＢ＋Ｃｂからの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１中で凍結した。グリセロールストックからのコロニーを５０ｍＬの２×ＹＴ培地＋Ｃｂ、１００μｇ／Ｌに移し、シェーカ中３７℃で７．５時間インキュベートし、次いで４℃で一晩保存した。フラスコ中２Ｌの２×ＹＴ培地＋ＡＭＰ、１００μｇ／ｍＬに、前培養物からの１６ｍＬ／２Ｌを接種し、３７℃のシェーカでインキュベートした。培養物を７０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２０ ＸＰ、ロータＪＬＡ ８．１０００）で４℃で２５分間の遠心分離によって回収した。上清を廃棄し、ペレットを回収し、溶解、可溶化及び再形成工程まで－２０℃で凍結した。

真核生物系
組換えバキュロウイルスを、Ｓｙｓｔｅｍ ＢＥＶ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＭＡＮ００００４１４プロトコルに従って作製した。要約すると、対数期中期増殖の８×１０^５個の接着性ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｒａ ｆｅｒａｇｉｐｅｄｒａ）（ＳＦ９）細胞（生存率＞９８％）を６ウェル培養プレート（ｎｕｎｃ）のウェルに播種し、５００ｎｇの精製組換えバクミドを、補充されていないＧｒａｃｅ培地中でセルフェクチンＩＩトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトした。Ｇｒａｃｅ培地を無血清培地ＳＦ－９００ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０９０２－０８８）に置き換え、プレートを２７℃で十分に曝気しながらインキュベートした。ウイルス特異的細胞病理効果（ＣＰＥ）についてトランスフェクションの７２時間後に細胞を調べた。ＣＰＥ陽性培養物から上清を回収し、ウイルス力価をプラークアッセイによって５×１０^６プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍＬと決定した。上清を第１世代の組換えバキュロウイルスベクターシード（Ｐ１）として使用した。２ｍＬのＰ１を使用して、１００ｒｐｍの速度で、バッフルボトム１２５ｍＬコーニングベントキャップ細胞培養三角フラスコ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｇｈｔ）中の５０ｍＬ懸濁培養物中の新鮮な中間対数期ＳＦ９ ２×１０^６細胞／ｍＬを形質導入した。第２世代のウイルスストックシード（Ｐ２）を作製するために感染多重度（ＭＯＩ）＝０．１に達する最終接種量は、以下の式を使用して計算される。

Ｐ２力価は１０^８ＰＦＵ／ｍＬであった。ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグを発現させるために、対数期中期に１ＬのＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ昆虫細胞（１×１０^６細胞／ｍＬ）（生存率＞９８％）を、バッフルボトム２Ｌコーニングベントキャップ細胞培養三角フラスコ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｇｈｔ）中で、５μｇ／ｍＬのＥ－６４システイン阻害剤（Ｓｅｌｅｃｃｈｅｍカタログ番号Ｓ７３７９）を補充した無血清Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。１０ｍＬのＰ２接種材料を培養物に添加し、２７℃で十分に曝気しながら８０ｒｐｍの速度でインキュベートした。ウイルスベクター接種の７２時間後、４℃で１５分間、５６０×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２０ ＸＰ、ロータＪＬＡ ８．１０００）で遠心分離することによって培養物を回収した。上清を分離し、４℃で２５分間、７０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２０ ＸＰ、ロータＪＬＡ ８．１０００）で遠心分離した。上清を分離し、精製工程に進んだ。

溶解、可溶化及びリフォールディング工程
溶解
ペレットを１２０ｍｌの溶解緩衝液（０．１Ｍトリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）＋１２０μｌのリゾチーム（３０ｍｇ／ｍｌ）に再懸濁し、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、ビーカ中室温で１５分インキュベートした。細胞再懸濁液をオークリッジチューブに４×３０ｍｌに分割した。各チューブを氷上で３×２分間（１５秒オン５秒オフ、７０％振幅）超音波処理した。チューブをＪＡ２５．５０、２２０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離した。上清を捨て、ペレットを＋４℃で保存した。

洗浄
各ペレットを３０ｍｌの洗浄緩衝液（０．１Ｍトリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ｐＨ７．４）－合計４×３０ｍｌに再懸濁し、氷上で３×２分間（１５秒オン、５秒オフ、６５％振幅）超音波処理した。チューブをＪＡ２５．５０、２２０００×ｇ、３０分、４℃で遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄手順を３回行い、最終ペレットを－２０℃で保存した。

可溶化
溶解調製物からの１つのペレットを３０ｍｌの総可溶化緩衝液（２０ｍＭトリス、６ＭグアニジニウムＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、室温で１０分間放置し、氷上で２分間（１５秒オン、５秒オフ、６５％振幅）超音波処理した。次いで、チューブを室温で２時間２０分間放置した後、ＪＡ２５．５０、３８０００×ｇ、１時間３０分、２０℃で遠心分離した。上清を５０ｍｌファルコンチューブに移し、可溶化したタンパク質濃度を決定した。

リフォールディング
溶解したタンパク質を、蠕動ポンプ（スピード０．５ １×流速）を用いて約６℃で２Ｌのリフォールディング緩衝液（２０ｍＭトリス、２Ｍ尿素、１０％グリセロール、５％スクロース、２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）に滴下した。緩衝液を６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディングを可能にするために緩衝液を添加した後、融合タンパク質を、以下の工程においてＨｉｓタグ親和性カラムを使用する親和性クロマトグラフィーによって精製した。

精製工程
リフォールディングしたタンパク質を、緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス、６ＭグアニジニウムＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐＦＦ粗５ｍｌカラムに一晩負荷した。タンパク質を緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＮａＰ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）と緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＮａＰ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールｐＨ７．４）との間の段階で溶出した。

２．５ｍｌ／分の流量で３５０ｍｌ ＳＥＣ緩衝液（１０ｍＭ ＮａＰ、１６０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４）によるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム精製。次いで、以下の方法でサンプルをスーパーループに負荷した。
１．０．００ ベースボリューム
２．０．００ 勾配０．００｛％Ｂ｝０．００｛ベース｝
３．０．００ 流量２．５｛ｍｌ／分｝
４．０．００ 注入バルブ 注入
５．１２．００ 注入バルブ 負荷
６．３５０．００ 終了＿方法

精製された融合タンパク質の純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって９３～９７％であると決定された。融合タンパク質の同一性を、ウエスタンブロットＡＰ抗ＦＬＡＧタグ（Ｓｉｇｍａ）によって確認した（１：１０，０００希釈）。タンパク質収率は、ＢＣＬ法によって決定された場合、担持タンパク質沈殿物材料の１０～１５％の範囲であった（図１Ｂ）。

使用するまで、タンパク質を中性ｐＨでＰＢＳ中に－８０℃で保存した。調製物を、ＮＡＤ－アグマチンアッセイを使用してＡＤＰ－リボース化について試験した。簡潔には、融合タンパク質のＡＤＰ－リボシルトランスフェラーゼ活性を、［Ｕ－^１４Ｃ］アデニンの取り込みを評価することによって決定した。６０分間のインキュベーション後、［Ｕ－^１４Ｃ］アデニン標識ＡＤＰ－リボシル－アグマチンを含有するＡＧ１－Ｘ４カラムから回収した溶出液を放射能の測定のために収集した。融合タンパク質のｃｐｍ活性を、インタクトなＣＴ（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州キャンベル）の希釈によって生成された標準曲線から計算した（図１Ｅ）。

図１Ｃは、ＣＴＡ１－ＤＤ構築物対ＣＴＡ１－ＣＤ１０３構築物におけるＣＴＡ１からのアラインメントを示し、図１Ｄは、ＣＴＡ１－ＩＩ－ＤＤ（１）、ＣＴＡ１（Ｒ７Ｋ）－ＩＩ－ＤＤ（２）、ＣＴＡ１－ＩＩ－ＣＤ１０３（３）及びＣＴＡ（Ｒ７Ｋ）－ＩＩ－ＣＤ１０３（４）分子のウエスタンブロット分析である。

例２
抗体応答の誘導に対するＣＤ１０３標的化融合タンパク質のアジュバント能力をＤＤ構築物のアジュバント能力と比較した。この目的のために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（６～１２週齢の雌マウス）を、破傷風トキソイド（ＴＴ）（５ｍｇ）又はニワトリガンマグロブリン（ＮＰ－ＣＧＧ）にコンジュゲートさせたＮＰ－ハプテン（５ｍｇ）で３回鼻腔内（ｉ．ｎ．）免役し（２０ｍｌ）、異なる用量（ｍＭ）のＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバント構築物（例１）又はＣＴＡ１－ＤＤアジュバント構築物（Ａｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ １５８（８）：３９３６－３９４６）と混合した。粘膜での免疫保護は分泌型ＩｇＡ（ＳＩｇＡ）の局所産生によって媒介されるので、本発明者らは、気管支洗浄（ＢＡＬ）を用いて、ＥＬＩＳＡを使用して最後の免疫化の７日後に抗ＴＴ又はＮＰ特異的ＳＩｇＡのｌｏｇ_１０力価の存在について評価した。ＣＤ１０３標的化アジュバントは、ＢＡＬにおける特異的ＳＩｇＡ応答の促進において有意により効果的であった（図２Ａ）。ＳＩｇＡの局所産生とは別に、インフルエンザなどのウイルス感染に対する保護は、血清ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ２ａ（Ｂａｌｂ／ｃマウス）／ＩｇＧ２ｃ（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス）抗体によって媒介される。鼻腔内免疫に対する血清抗体応答は、ＥＬＩＳＡによって評価されるように、ＣＴＡ１－ＤＤアジュバントを使用した免疫化と比較して、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバント免疫化後に明らかにはるかに強かった（図２Ｂ）。実際、ＩｇＧ２ｃ血清応答はＣＴＡ１－ＣＤ１０３群では強力であったが、ＣＴＡ１－ＤＤ群では０．０５ｍＭアジュバントの用量では検出不能であり、同等の力価は５ｍＭの用量、すなわち１００倍高用量のＣＴＡ１－ＤＤでのみ達成された。ＣＴＡ１－ＤＤの用量を１００倍増加させるための同様の要件は、ＢＡＬのＳＩｇＡ応答にも適用された（図２Ｃ）。したがって、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３は、鼻腔内アジュバントとしてＣＴＡ１－ＤＤよりも非常に強力であり、実際には、鼻腔内免疫後の血清ＩｇＧ応答の検出に必要な用量は０．０１４ｍＭ以下であり、これは、鼻腔内免疫で使用される標準的なＣＴＡ１－ＤＤアジュバント用量（５ｍＭ）よりも３５０倍超低い。これは、同様の結果を有する３つの独立した実験の代表的な実験である。各群は５匹のマウスを宿主とし、値は平均ｌｏｇ_１０力価±ＳＤである。統計的有意性は、ダネットの事後検定を用いた分散分析を用いて計算し、ｐ＜０．００１^＊＊＊であった。

例３
ＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激するＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバント系の能力を、鼻腔内免疫後のＣ５７Ｂｌ／６マウス（６～１２週齢の雌マウス）で分析した。ＣＴＡ１－ＣＤ１０３とＣＴＡ１－ＤＤの両方を５ｍＭの飽和用量で使用し、ＣＦＳＥ標識ＯＴＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞（１０^６個の細胞）を養子移入したマウスに単回免疫し、それぞれ、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３及びＣＴＡ１－ｐ３２３－ＤＤのアジュバント構築物にも組み込まれたオボアルブミン由来のｐ３２３ペプチドを特異的に認識させた。このようにして、本発明者らは、このＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドによるＣＤ４ Ｔ細胞の免疫プライミング有効性を評価することができた。鼻腔内免疫により、流入領域縦隔リンパ節（ｍＬＮ）における４日後のＣＤ４ Ｔ細胞応答（ＯＴＩＩ細胞）を評価し、等モル用量のアジュバントを比較した。対照目的のために、１群のマウスに等モル用量の卵白アルブミンを鼻腔内投与し、別の群のマウスを免疫しなかった。ＣＤ４ Ｔ細胞（ＯＴＩＩ細胞）増殖は、ＦＡＣＳによる各細胞からのＣＦＳＥシグナルの希釈によって評価されるように細胞分裂を監視することによって検出した。応答はまた、増殖しているＣＤ４ Ｔ細胞（ＯＴＩＩ細胞）を、それぞれＩＦＮγ及びＩＬ－１７を産生するＴｈ１サブセット及びＴｈ１７サブセットなどの異なる機能的サブグループに分化させることについて、ＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。ＣＴＡ１－酵素がアジュバント作用に必要であるかどうかを評価するために、ＣＴＡ１部分のＲ９Ｋ変異に起因してＡＤＰリボシル化酵素活性を欠く融合タンパク質ＣＴＡ１Ｒ９Ｋ－ｐ３２３－ＣＤ１０３を操作した（アグマチンアッセイによって評価した）。この融合タンパク質の効果を、等モル投与量のインタクトなＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３の効果と比較した。

飽和５ｍＭ用量の鼻腔内投与でのＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３及びＣＴＡ１－ｐ３２３－ＤＤの両方は、ＦＡＣＳ及び特異的抗体によって評価されるように、ＣＤ４ Ｔ細胞活性化及び細胞分裂を刺激するのに有効であった（図３Ａ）。しかし、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３は、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＤＤと比較して、特に鼻腔内投与でプライミングしたマウスに４日後にＯＴＩＩ細胞を与えた場合、ＯＴＩＩ増殖を刺激するのに有意に有効であった（図３Ｂ）。また、サイトカイン産生への分化は、鼻腔内免疫後にＯＴＩＩ ＣＤ４ Ｔ細胞がＩＦＮγ（Ｔｈ１）又はＩＬ－１７（Ｔｈ１７）を産生する能力によって決定されるように、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＤＤ融合タンパク質と比較して、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３構築物でより良好であった（図３Ｃ）。特に、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３はＴｈ１７細胞の促進に有効であった。ＣＴＡ１の酵素活性は、ＦＡＣＳによって決定されるように、特異的抗体を使用して、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３構築物のアジュバント効果にとって絶対的に重要であった（図３Ｄ）。これらは、同様の結果を有する各カテゴリーにおける３つの独立した実験の代表的な実験である。各群は５匹のマウスを宿主とし、Ｔ細胞応答をＦＡＣＳによって分析し、値は、ＯＴＩＩ細胞の免疫化又は養子移入の４日後に評価した平均±ＳＤである。ＥＬＩＳＰＯＴ値は、スポット形成細胞（ＳＦＣ／１０^６細胞）として与えられる。統計的有意性は、ダネットの事後検定を用いた分散分析を用いて計算し、ｐ＜０．００１^＊＊＊であった。

例４
ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントは、樹状細胞（ＤＣ）、特に、インビボでアジュバント機能の効果を決定的に媒介するｃＤＣ１サブセットを標的とする。ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバント構築物によって特異的に標的化されたＤＣサブセットを実証するために、流入領域縦隔リンパ節（ｍＬＮ）からの移動性ＤＣ（ＭＨＣ^ｈｉｇｈ／ＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈ）細胞を単離し、特異的抗体を使用するＦＡＣＳによってアジュバントとの結合について調べた。等モル用量（１ｍＭ）のＣＴＡ１－ＤＤを比較のために使用した。ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントは、ＣＤ１０３を発現するＤＣサブセットに排他的に結合し、ＣＤ１０３が遺伝的に欠損したマウス（ＣＤ１０３^－／－マウス）を使用した場合、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントはＤＣに完全には結合しなかった（図４Ａ）。ＣＴＡ１－ＣＤ１０３構築物は、ＣＤ１０３^＋ＤＣ、特にｃＤＣ１細胞（ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１１ｂ^－）を特異的に標的としたが、いくらかのアジュバントはｃＤＣ２細胞（ＣＤ１０３^＋、ＣＤ１１ｂ^＋）にも結合した。しかし、より低い濃度（０．１ｍＭ）では、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントはｃＤＣ１細胞のみに結合した（図４Ｂ）。これは、単一の陽性ｃＤＣ２サブセット（ＣＤ１０３^－、ＣＤ１１ｂ^＋）を含む３つ全てのＤＣ集団に結合したＣＴＡ１－ＤＤとは対照的であった（図４Ｂ）。したがって、ＣＴＡ１－ＤＤは、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントと比較して、ＤＣに対するより広い結合レパートリーを有していた。これは、明確な欠損を有するマウスを免疫化に使用し、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントの効果をＣＴＡ１－ＤＤ構築物の効果と比較した場合にインビボで確認された。ＣＤ１０３発現ＤＣを完全に欠いている（ＣＤ１０３^－／－）か、又はｃＤＣ１細胞を有しない（Ｂａｔｆ３^－／－）マウスは、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３（５ｍＭ）の単回鼻腔内免疫に対してＦＡＣＳで評価したＣＤ４ Ｔ細胞の活性化／増殖（ＯＴＩＩ細胞及びＣＦＳＥ－希釈）で反応しなかったが、等モル投与量のＣＴＡ１－ＤＤに対する反応は、無傷であったか（ＣＤ１０３^－／－）検出することができた（Ｂａｔｆ３^－／－）（図４Ｃ）。興味深いことに、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞（ＯＴＩＩ細胞）は、ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３アジュバント（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｋｉｔ）の鼻腔内投与後２４時間、新たに単離したｃＤＣ１細胞と共培養すると、強い増殖（ＣＦＳＥ希釈）とＴｈ１７表現型（ｒｏｒｇｔ^＋）への分化を示した（図４Ｄ）。重要なことに、以前のデータは、ｃＤＣ１細胞がＴｈ１７分化を促進することができることを裏付けておらず、したがって、この発見は予想外で新規である（図４Ｄ）。ＣＴＡ１－ｐ３２３－ＣＤ１０３で鼻腔内免疫した後、ｍＬＮから移動性ｃＤＣ１細胞を単離し、ＤＣ（１０，０００個のＤＣ）及びナイーブＣＤ４ Ｔ細胞（各ウェルに１００，０００個のＯＴＩＩ細胞）の共培養を試験した。これは、ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡによって評価されるように、インビトロでのＣＤ４ Ｔ細胞のＴｈ１７分化（ｒｏｒｇｔ＋）及びＩＬ－１７産生をもたらした（図４Ｄ）。これらは、同様の結果を与える各カテゴリーにおける３つの独立した実験の代表的な実験である。インビトロ培養を３連で行い、値を平均±ＳＤとして示す。インビボ実験のために、各群は５匹のマウスを宿主とし、Ｔ細胞（ＯＴＩＩ細胞）応答をＦＡＣＳによって分析し、値は免疫化の４日後に評価した平均±ＳＤである。統計的有意性は、ダネットの事後検定を使用した分散分析を用いて計算し、ｐ＜０．００１^＊＊＊であった。

例５
ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントは、生ウイルス感染に対する防御免疫を刺激する際に、ＣＴＡ１－ＤＤアジュバントと比較して有意に有効である。防御免疫を刺激する能力を、インフルエンザウイルスマウスモデルにおいて試験した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、インフルエンザＡウイルスに特異的なワクチンエピトープ（Ｍ２ｅ）を有するＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＣＤ１０３又はＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＤＤ（５ｍＭ）で免疫し、インフルエンザウイルスによる生攻撃感染に対する免疫防御を刺激する能力を評価した。Ｍ２ｅペプチドは、ＣＤ４ Ｔ細胞拘束性エピトープである。飽和及び等モル投与量（５ｍＭ）の融合タンパク質を３回鼻腔内免疫した後、最後の免疫化の３週間後に、４×ＬＤ_５０のＰＲ８異種変異型ウイルスによる生攻撃感染を行った。次いで、チャレンジ後２週間、マウスの体重減少及び生存を監視した。ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＣＤ１０３で免疫した全てのマウスは攻撃感染から生き残ったが、ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＤＤ免疫群では５０％を超えるマウスが死亡した（図５Ａ）。ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＣＤ１０３で免疫したマウスは、肺のウイルス力価が有意に低下していた（図５Ａ）。ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＣＤ１０３融合タンパク質は、Ｍ２ｅ特異的四量体及びＦＡＣＳによって同定されるように、Ｍ２ｅ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を刺激するのにはるかに有効であった（図５Ｂ）。ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＣＤ１０３で免疫したマウスでは、ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＤＤ構築物と比較して、肺常在性Ｍ２ｅ特異的メモリーＣＤ４ Ｔ細胞がはるかに高頻度であった（図５Ｂ）。肺におけるＭ２ｅ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞のほとんどはＴｈ１７型（ｒｏｒｇｔ＋）であった。したがって、ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバント系は、Ｍ２ｅ特異的Ｔｈ１７応答の増強と相関する機構であるインフルエンザウイルス感染に対する完全な防御を刺激することにおいて優れていた。これらは、同様の結果を与える各カテゴリーにおける３つの独立した実験の代表的な実験である。１０匹のマウスを収容した各群及びＭ２ｅ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞をＦＡＣＳによって分析し、値は攻撃感染の１０日後に評価した平均±ＳＤである。統計的有意性は、ダネットの事後検定を使用した分散分析を用いて計算し、ｐ＜０．００１^＊＊＊であった。

例６
ＣＤ１０３－ＤＣ標的化ＣＴＡ１－ＣＤ１０３アジュバントは、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞を効果的に刺激し、がん細胞の増殖及び転移を防止する。オボアルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬ由来のＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープを融合タンパク質、ＣＴＡ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－ＣＤ１０３に使用して、アジュバント系がマウスモデルにおいてＣＤ８ Ｔ細胞拘束性細胞傷害性を刺激できるかどうかを決定した。その効果を、等モル投与量（５ｍＭ）のアジュバントによる鼻腔内免疫後のＣＴＡ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－ＤＤの効果と比較した。最初に、本発明者らは、ＳＩＩＮＦＥＫＬなどのＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドの交差提示が標的アジュバント分子によって促進され得ることを確立した。ＣＤ１０３^＋ｃＤＣ１細胞はこの機能について公知なので、これは重要であった（図６Ａ）。ＣＴＡ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬ－ＣＤ１０３は、鼻腔内免疫後のＣＤ８ Ｔ細胞の交差提示及び誘導並びに細胞傷害性を促進する能力について、ＤＤ構築物よりも優れていた（図６Ａ～６Ｃ）。オボアルブミン発現メラノーマＢ１６Ｆ１細胞モデルを用いて、５ｍＭ用量の融合タンパク質により治療的鼻腔内免疫したところ、細胞傷害性の促進、並びに腫瘍増殖及び転移の予防の効果が明らかになった（図６Ｄ）。転移のモデル及び固形腫瘍増殖のモデルの両方を使用し、２００，０００個のＢ１６Ｆ１細胞をレシピエントマウスへ移入すると、転移又は固形腫瘍を確立するのに十分であることが見出された。固形腫瘍を２週間にわたって定着させ、腫瘍が米粒の大きさに達したときに治療的ワクチン接種を行った。細胞傷害性を、１０日間の間に３回、予防的に鼻腔内免疫されたＣ５７Ｂｌ／６マウスへの養子移入後のＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＯＴＩ細胞において評価した。ＦＡＣＳを使用して標識Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞を投与した５～７日後に細胞傷害性を評価した。これらは、同様の結果を与える各カテゴリーにおける３つの独立した実験の代表的な実験である。各群は３～５匹のマウスを宿主とし、ＯＴＩ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞をＦＡＣＳによって分析し、値は平均±ＳＤである。統計的有意性は、ダネットの事後検定を使用した分散分析を用いて計算し、ｐ＜０．００１^＊＊＊であった。

例７
脂質ベースのナノ粒子は、近年、医薬品担体としてますます注目されている。特に、抗原を分解から保護する能力と組み合わされた固有のアジュバント特性を有すると報告されており、ワクチンベクターとして適している。しかし、ワクチン送達のための理想的なナノ粒子の物理化学的プロファイルは、まだ十分に定義されていない。ここで、本発明者らは、インビトロ樹状細胞アッセイを使用して、ワクチン担体及びアジュバントとしての様々なリポソーム製剤の免疫原性を評価した。フローサイトメトリーを使用して、リポソーム支援抗原提示、並びに細胞表面上の関連する共刺激分子の発現を評価した。サイトカイン分泌をＥＬＩＳＡアッセイで更に評価した。本発明者らは、リポソームが、単独で投与されたワクチン融合タンパク質（ＣＴＡ１－３Ｅα－ＤＤ）と比較して、樹状細胞の抗原提示及び成熟を首尾よく高めることができることを示す。特に、膜の脂質相状態は、樹状細胞によるワクチン抗原プロセシングに大きく影響することが分かった。それらの液相対応物と比較して、ゲル相リポソームは、抗原提示の改善においてより効率的であった。それらはまた、共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御、並びにサイトカインＩＬ－６及びＩＬ－１βの放出の増加においても優れていた。まとめると、本発明者らは、ゲル相リポソームが、それ自体は非免疫原性であるが、樹状細胞の抗原提示能力を有意に増強し、ワクチン免疫原性を改善するための有望な方法であると思われることを実証している。

材料及び方法
特に明記しない限り、全ての化学物質はスウェーデンのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから、全ての脂質は米国のＡｖａｎｔｉ ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｓから購入した。使用した脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＤＳＰＥＰＥＧＭＣＣ）であった。融合タンパク質は、スウェーデンのＭＩＶＡＣによって提供された。

粒子の調製
リポソームは、脂質フィルムの再水和及び押出し法によって作成した。メタノール／クロロホルム（１：１ｖ／ｖ％）混合物に溶解した脂質の様々な溶液を丸底フラスコに入れた。溶媒を、温水浴中で減圧下（液相リポソーム）又は窒素流（ゲル相リポソーム）で約３０分間蒸発させ、引き続いて一晩真空にした。

次いで、液相リポソームを作成するために、ＤＯＰＣ及びＤＳＰＥＰＥＧＭＣＣ（９９：１ｍｏｌ％）で構成される薄い脂質膜をＮａＡｃ生理食塩水（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝５．０）中で８ｍＭの脂質濃度に再水和させた。次いで、懸濁液を、液体窒素及び５０℃の水浴を使用して１０回凍結解凍した。懸濁液をＮａＡｃ生理食塩水で４ｍＭの脂質濃度に更に希釈し、小型押出機（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．、米国）及び１バールの圧力を使用して、１００ｎｍのヌクレオポアトラックエッチポリカルボナート膜（ワットマン、英国）を通して２１回押し出した。

ゲル相リポソームを作成するために、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥＰＥＧＭＣＣ（９９：１ｍｏｌ％）で構成される薄い脂質膜をＮａＡｃ生理食塩水で８ｍＭの脂質濃度に再水和させた。再水和を６５℃の水浴中で１分間行い、続いて少なくとも１０サイクルの凍結融解及び穏やかなボルテックスを行った。次いで、リポソーム懸濁液を、小型押出機及び１バールの圧力を使用して、７０℃で１００ｎｍのヌクレオポアトラックエッチドのポリカルボナート膜を通して２１回押し出した。

トラウト試薬（２－イミノチオラン塩酸塩）を使用して第一級アミンをチオール基に変換した後、チオール－マレイミド反応を使用して融合タンパク質をリポソームに共有結合させた。簡単に説明すると、トラウト試薬（ＨＢＳ中０．０２ｍｇ／ｍｌ：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む、ｐＨ＝７．８）及び融合タンパク質（１０ｍＭ ＮａＨ_２ ＰＯ_４、０．１６Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中１．６ｍｇ／ｍｌ）を５：３の体積比に混合し、４℃で２０分間インキュベートした。４ｍＭの脂質濃度の粒子を、５：４の体積比で、新たにチオール化した融合タンパク質に添加し、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。未反応の融合タンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００ｋＤａカットオフ遠心フィルター（ＶＷＲ、スウェーデン）を以下のように使用して、１２５μｌのＮａＡｃ生理食塩水及び約２９０μｌのリポソーム懸濁液を各フィルターに添加し、遠心分離し（５分又は約２５０μｌの溶液が残るまで、８０００×ｇ、１０℃）、続いて各フィルター中の１５０μｌのＮａＡｃ生理食塩水で更に希釈し、別の遠心分離（５分又は約２５０μｌの溶液が残るまで、８０００×ｇ、１０℃）を行い、除去した。懸濁液は、フィルターを反転させ、遠心分離（１分、８０００×ｇ、１０℃）することによって回収した。脂質粒子懸濁液を使用するまで４℃で保存した。

総タンパク質定量
融合タンパク質含量を、ＣＢＱＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、スウェーデン）を製造者の説明書に従って使用して決定した。必要に応じて、融合タンパク質が共有結合していない粒子のタンパク質含有量を測定することによって、カプセル化された抗原の量を決定した。全ての場合において、ＣＢＱＣＡ試薬の５ｍＭストック溶液を使用し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を反応緩衝液に添加した。反応を９６ウェルプレートで行い、蛍光を、ＦＬＵＯｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）（励起：４４０ｎｍ、発光：５２０ｎｍ）を用いて測定した。

粒径及び濃度決定
Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃ１１４４０－５０Ｂ／Ａ１１８９３－０２カメラ及び４８８ｎｍレーザを備えたＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＬＭ１０（Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を使用して、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によってリポソームの流体力学的直径を決定した。測定は、５つの６０秒間映像からなっていた。カメラレベル：１１及び検出閾値：２でＮＴＡソフトウェアバージョン３．２を使用して分析を行った。

リポソーム濃度は、ＮＴＡを使用して、通常１０，０００、２０，０００及び４０，０００倍の３つの異なる希釈液を測定することによって決定した。比較測定は、相対変動を小さく保つために、同じ日に同じプロトコルを使用して、実際の濃度と測定された濃度との間に良好な一致がある範囲内の濃度で行った。

粒子あたりの融合タンパク質の数の推定
ＣＢＱＣＡを介して得られたタンパク質含量値及びＮＴＡで測定された粒子濃度から、リポソームあたりの融合タンパク質の平均数を計算した。

レーザドップラー電気泳動を用いたゼータ電位の測定
粒子のゼータ電位を、ＤＴＳ１０７０折り畳みキャピラリーセルを備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を使用して、２５℃で２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（製造者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、スウェーデン）に従って、ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ Ｓ－２００ ＨＲカラムを使用して緩衝液交換を行った）、ｐＨ＝７．４で測定した。分散剤の粘度は０．８８７２ｃＰとした。分散剤及びリポソームの屈折率をそれぞれ１．３３及び１．４５とし、Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ近似を使用した。

フローサイトメトリーを使用した時間依存性抗原提示
様々なワクチン製剤が樹状細胞の抗原プロセシング能力にどのように影響するかを評価するために、Ｅα／ＹＡｅ系と共にマウス由来樹状細胞株Ｄ１を含むインビトロモデルを使用した。ＭＨＣＩＩに結合した場合、Ｅαペプチドは、モノクローナルＹＡｅ抗体を使用して検出することができ、したがって、機能的に提示された抗原の定量化が可能になる。脾臓起源であり、雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するＤ１細胞株は、Ｐ．Ｒｉｃｃｉａｒｄｉ－Ｃａｓｔａｇｎｏｌｉ（イタリア、ミラノのＭｉｌａｎ－Ｂｉｃｏｃｃａ大学）の好意により提供されたものである。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ドイツ）、５０μＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ドイツ）及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び３０％ＮＩＨ／３Ｔ３上清を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ドイツ）中、３７℃及び５％ＣＯ_２で培養した。細胞を２４ウェルプレートに蒔き、最終タンパク質濃度０．２μＭの融合タンパク質の様々な製剤で活性化する前に、様々な時間付着させた。

フローサイトメトリー分析の前に、Ｄ１細胞を機械的に採取し、洗浄し、Ｉ－Ａｂ分子に結合したＥ５２－６８ペプチドを認識する７ＡＡＤ、ＣＤ１１ｃ－ＰＥ、ＭＨＣＩＩ－ＦＩＴＣ及びＹＡｅ－ビオチンで染色して、機能的抗原提示の量を評価した。４℃で３０分間インキュベートし、続いて洗浄した後、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット４２１による二次染色を、抗体インキュベーションと同じ実験パラメータを使用して行った。全ての抗体は、米国のｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。細胞を再度洗浄し、ＢＤ－ＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いて分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、米国）を使用してデータ分析を行った。

フローサイトメトリーを使用した２４時間での抗原提示及び共刺激分子の定量
Ｄ１細胞を前述のように培養し、異なる脂質粒子製剤である、融合タンパク質に結合した１％のＤＳＰＥＰＥＧＭＣＣを含有するＤＯＰＣ及びＤＳＰＣリポソーム（ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ）、遊離融合タンパク質と同時投与された１％のＤＳＰＥＰＥＧＭＣＣを含有するＤＯＰＣ及びＤＳＰＣリポソーム（ＤＯＰＣ－ＰＥＧ＋遊離ＦＰ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋遊離ＦＰ）、並びに融合タンパク質なしで与えられた１％のＤＳＰＥＰＥＧＭＣＣを含有するＤＯＰＣ及びＤＳＰＣリポソーム（ＤＯＰＣ－ＰＥＧ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ）で活性化した。２４時間のインキュベーション後、上清を破棄し、サイトカイン定量のためにサイトカイン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が行われるまで－２０℃で保存した。

Ｄ１細胞を機械的に採取し、洗浄し、７ＡＡＤ、ＣＤ１１ｃ－ＢＶ４２１、ＭＨＣＩＩ－ＰＥ、ＣＤ８０－Ａ６４７、ＣＤ８６－ＢＶ６０５及びＹＡｅ－ビオチンで４℃にて３０分間染色した。細胞を洗浄し、ストレプトアビジン－ＡＰＣ／Ｃｙ７による二次染色を行った。洗浄後、細胞をＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、米国）を使用してデータ分析を行った。

酵素結合免疫吸着アッセイを使用した放出サイトカインの定量
上清中のサイトカインの定量を、ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用して行った。簡単に記載すると、９６ウェルマイクロプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、デンマーク）を５０μｌ／ウェルの捕捉抗体と一緒に加湿チャンバーにおいて室温で一晩インキュベーションした。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで３回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの組換え標準溶液又は２５μｌ／ウェルの上清を二連で添加し、プレートをインキュベートした（２時間、加湿チャンバー、室温）。プレートを洗浄し、５０μｌの捕捉抗体を添加し、インキュベートした（２時間、加湿チャンバー、室温）。プレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼを２０分間インキュベートした（加湿チャンバー、室温）。プレートを洗浄し、５０μｌ／ウェルの基質溶液を添加した。暗所で室温の加湿チャンバー中で２０分間インキュベートした後、２５μｌ／ウェルの停止溶液を添加し、吸着を４５０ｎｍで読み取った。

統計
特に明記しない限り、定量値は平均±平均の標準誤差として示した。一元配置分散分析及びテューキーの事後検定を使用して、累積ＹＡｅ及びＭＨＣＩＩ強度、共刺激受容体、並びにサイトカイン放出量の変化についての統計的比較を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。

結果
ワクチンベクターのどの物理化学的特性がより詳細な調査に値するかを選択するために、６つの異なる組成物を使用した予備スクリーニングを実施した。この調査は、脂質組成、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）含有量、タンパク質負荷及びナノ粒子のサイズ／形状の影響に対処し、ＤＣによる抗原提示の状況において有望であることが証明されたのはゲル相脂質を含有するリポソーム製剤のみであることを示した。しかし、ＤＳＰＣベースのリポソームと同じ相状態を有するリポディスクが効果を有さないという事実は、タンパク質／粒子のサイズ、形状、又は量などの他の要因も役割を果たし得ることを示唆している。相状態の影響を具体的に研究するために、本発明者らは、ここでは、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）のいずれかに基づくリポソーム製剤に焦点を当てている。これらのリン脂質は両方とも、等しい長さ（１８個の炭素）の２つの脂肪酸を有するが、各アシル鎖に１つの不飽和が存在するため、ＤＯＰＣ脂質は－１７℃の相転移温度を有するが、完全飽和変異体であるＤＳＰＣの場合、相転移温度は５５℃である（図７Ａ）。結果として、ＤＯＰＣベースの膜は、生理学的温度にあるとき、流体相状態にあり、一方、ＤＳＰＣベースのリポソームは、ゲル相状態にある。ここで、ＣＴＡ１－３Ｅα－ＤＤ融合タンパク質（本明細書ではＦＰと呼ぶ）を、ＤＳＰＥ固定ＰＥＧ（２０００）スペーサを用いてリポソームに結合させるか、又は単にリポソームと混合した（図７Ｂ）。

粒子特性評価
ワクチン製剤をＦＰ含有量、サイズ及びゼータ電位に関して特性評価した（表３）。粒子あたりのＦＰ結合量を、総タンパク質濃度（材料及び方法を参照）及びナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を使用して推定した総粒子濃度から推定した。表３及び図８に示すように、リポソームの流体力学的直径、半値全幅及びゼータ電位は、それらの組成とは無関係であった。タンパク質負荷量はバッチごとに幾分異なっていたが、各個々の細胞実験内では、タンパク質／粒子の数は同等であった。ゼータ電位の正味の電荷は、生理学的ｐＨで負に帯電している１％の脂質（ＤＳＰＥＰＥＧＭＣＣ）と共に双性イオン性ホスホコリン（ＰＣ）脂質を主に含有する両方のリポソームタイプと、融合タンパク質が生理学的ｐＨで負に帯電しているという事実と一致する。

ゲル相ＤＳＰＣベースのリポソームは、樹状細胞上の抗原提示を増加させる
Ｄ１２７細胞及びＥα／ＹＡｅ ｍＡｂ系を用いた本発明者らのインビトロモデルを使用して、様々なワクチン製剤についてワクチン抗原を処理する能力を分析した。ＹＡｅ ｍＡｂ結合のレベルは、Ｄ１細胞上のＥα－ＭＨＣＩＩ複合体発現を反映し、フローサイトメトリーによって検出された。アッセイは、固定融合タンパク質濃度（０．２μＭ）及び０～２４時間の範囲の様々なインキュベーション時間で行った。図９Ａｉ－ｉｉｉは、フローサイトメトリー分析に使用したゲーティング手順を視覚化している。単独で使用した可溶性ＦＰと比較して、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ製剤についてはペプチド提示の増加を伴うＤＣ集団全体の明確なシフトが見出されたが、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰについては見出されなかった（図９Ｂ）。経時的な抗原提示を評価するために、本発明者らは、ＹＡｅの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）をインキュベーション時間に対してプロットした。抗原提示の主な増加は最初の数時間以内に起こり、その後の時点でプラトーが続いた。このパターンは、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ（図９Ｃ）で最も顕著であり、異なるデータセット及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰの異なるバッチで一貫していた。全期間にわたるペプチド発現の定量的推定値を提供するために、本発明者らは、各個々のデータセットについて遊離可溶性ＦＰと比較して、様々なリポソーム製剤によって誘導されたシグナルの累積値を計算した。ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ値は、遊離可溶性ＦＰの値よりも３．７±０．６倍大きかったが、これは、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰがペプチド提示の統計的に有意な増加を誘導したことを更に確認する。一方、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ製剤は、全期間にわたって有意な増加を示さなかった（０．８±０．０６倍）。

可溶性ＦＰのナノ粒子への結合がＤＣ表面上のより高いペプチド発現レベルを達成するために必要であるかどうかを評価するために、本発明者らは、混合ＤＯＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰ又はＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰによって誘導されたシグナル（２４時間後）を、結合したＦＰを有するリポソームによって生成されたシグナルと比較した。ＦＰをＤＯＰＣ－ＰＥＧではなくＤＳＰＣ－ＰＥＧと一緒に投与すると、リポソームは、ペプチド提示が増加した（ＦＰがナノ粒子に結合した場合よりも少ない程度ではある、約２．５対８．５、図９Ｄ）。この観察は、ＦＰのＤＳＰＣ－ＰＥＧへの結合が有益であったが、ペプチド提示に対するいくつかの増強効果がＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰでも見られたことを実証している。予想通り、ＦＰを含まない対照リポソームは、ＹＡｅ ｍＡｂの検出可能な結合をもたらさなかった（図９Ｄ）。

ゲル相ＤＳＰＣベースのリポソーム担体はペプチド負荷効率を高める
ＭＨＣＩＩ分子に向けられた抗体を使用して、ペプチド提示の増加が、細胞表面に提示されたＭＨＣＩＩ分子のレベルの対応する増加を伴うかどうかを評価した。本発明者らは、２４時間後、ＤＯＰＣ－ＰＥＧベクターではなく、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰ製剤が、ＦＰ単独で見られるペプチド発現と比較して１．８倍のペプチド発現増加をもたらすことを見出した（図１０Ａ）。ペプチド対ＭＨＣＩＩ分子発現のＭＦＩ比は、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰが、可溶性ＦＰ単独について記録されたものと比較して、ペプチド／ＭＨＣＩＩ占有率を６倍増加させるように見えたことを明らかにした（図１０Ｂ）。この増加は経時的に維持され、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰが、ＤＣにおけるＭＨＣＩＩのペプチド負荷効率に影響を及ぼすことが示唆された。しかし、ＤＳＰＣ－ＰＥＧと混合して投与された可溶性ＦＰ（ＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰ）は、改善されたペプチド負荷効率をわずかしか増加させなかったので、この特徴はＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ製剤に限定されたと結論付けることができ、（図１０Ｂ）ナノキャリアへのＦＰ結合が改善されたペプチド負荷効率に必須であることを示している。

ゲル相ＤＳＰＣベースのリポソームはまた、ＤＣ共刺激を増強する
ペプチド提示に加えて、ＤＣは、流入領域リンパ節においてＴ細胞を効果的にプライミングするための共刺激シグナルを提供する。これらの共刺激シグナルは、ＤＣ細胞表面で発現され、及び／又は可溶性因子、すなわちサイトカインとして分泌される。公知の最も重要な細胞表面共刺激分子の中には、ＣＤ８０及びＣＤ８６があり、それらの発現は、ＤＣがナイーブＴ細胞を活性化する能力に大きく影響する。ワクチンリポソーム製剤の存在下又は可溶性ＦＰ単独で２４時間培養した後、本発明者らは、特異的標識ｍＡｂ及びフローサイトメトリーを使用して、それぞれＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を決定した。ここで、追加のゲーティング工程を導入して、ＹＡｅ＋細胞を選択した。本発明者らは、ペプチド提示について見たように、共刺激分子の発現が全体的な傾向に従うことを見出した。したがって、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現は、遊離可溶性ＦＰと比較して、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰによってそれぞれ３．７倍及び２．８倍有意に増加したが、ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰはわずかな効果しか有しなかった（ＣＤ８０及びＣＤ８６についてそれぞれ１．４倍及び１．３倍）。これらの結果は、ＤＳＰＣベースのリポソームを有する製剤が、ＤＯＰＣベースの製剤よりも共刺激に対して強い刺激効果を有することを示している（図１１Ａ）。興味深いことに、ＣＤ８６発現の上方制御は、ＦＰがリポソームに結合した又は混合されたかに関係なく増加するようであった（図１１Ｃ）。これはＣＤ８０発現では見られず、結合したＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰはＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰよりも有意に高いＣＤ８０発現を刺激したが（それぞれＦＰと比較して３．７倍及び２．２倍）、後者は依然として全てのＤＯＰＣ－ＰＥＧ変異体よりもわずかに良好であった（図１１Ｂ）。集団全体を分析したときに非常に類似した傾向が観察され、融合タンパク質を含まないリポソームで処理した細胞ではＣＤ８０又はＣＤ８６の発現の増加は観察されず、単独で投与したＤＳＰＣ－ＰＥＧリポソームの免疫原性が低いことを示した。

次に、本発明者らは、ナノ粒子が、Ｔ細胞プライミングの促進に役立ち得る関連サイトカインの産生に影響を及ぼし得るかどうかを分析した。本発明者らは、ＩＬ－６及びＩＬ－１βの産生が、ＦＰ単独又はＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ（ＩＬ－６のみ）で刺激した培養物と比較して、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰと共にインキュベートしたＤ１細胞からの培養上清において増加したが、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰで刺激した培養物は、遊離ＦＰと比較してＩＬ－６又はＩＬ－１βの有意な増加を示さなかったことを見出した（図１２）。したがって、本発明者らは、ＦＰとＤＳＰＣ－ＰＥＧリポソームとの結合が、サイトカイン産生を誘導するそれらの能力に最も重要であり、全体として、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰが、標的ＤＣにおいて共刺激を誘導するための最も効果的なワクチンベクター製剤であると結論付けることができる。

本発明者らは、ナノ粒子製剤が融合タンパク質の抗原プロセシング及びＴ細胞プライミング能力に影響を及ぼし得るかどうかを解明するために還元論的アプローチを取った。融合タンパク質自体は、強力なアジュバント分子ＣＴＡ１を担持し、ＤＣプライミング機能を促進する高度に免疫原性の分子であることに留意されたい。組み合わせたベクターを使用して、本発明者らは、ナノ粒子の脂質組成がＤＣプライミング能力に増強効果を有するかどうかを見出すことに興味を持った。これを、樹状細胞株を用いてインビトロで調べ、ＤＣ上の抗原提示及び共刺激分子の変化の検出をフローサイトメトリーによって分析した。本発明者らは、ゲル相リポソームが、活性化ＤＣにおいて液相リポソームよりも優れており、抗原プロセシング及び共刺激能力が有意に改善されることを見出した。ゲル相リポソーム（ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ）は、ペプチド提示及び共刺激の両方を刺激するための最も効率的な製剤であった。したがって、リポソームの膜相状態は、標的ＤＣにおける抗原プロセシング及び提示に有意に影響を及ぼす。更に、本発明者らのデータはまた、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ製剤が、ペプチドとＭＨＣＩＩ発現との間の比によって示されるように、ＭＨＣＩＩのペプチド負荷の有意な増加をもたらしたが、細胞表面上のＭＨＣＩＩの総量の増加はより控えめであったことを示している。

ペプチド占有率の増加は、いくつかの細胞変化に関連する可能性がある。第一に、ペプチドの負荷及び提示は非常に動的なプロセスであり、細胞表面でペプチドが結合したＭＨＣＩＩ及び空のＭＨＣＩＩ分子との両方を絶えず交換することを含む。このプロセスでは、ペプチドを含まない新しく産生されたＭＨＣＩＩ分子は、エンドソーム系を介して細胞表面から再循環され、後期エンドソーム中のプロセシングされたペプチドに結合する前にクラスリン依存性エンドサイトーシスによって内在化されると考えられる。次いで、成熟ＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体を細胞表面に輸送することができ、そこでＭＡＲＣＨ１はＭＨＣＩＩβサブユニットの細胞質尾部をユビキチン化し、内在化及び分解のために複合体を標的化する。樹状細胞が成熟すると、ＭＨＣＩＩの輸送が調節され、細胞表面でその半減期が長くなる。成熟時の半減期のこの増加は、ＭＡＲＣＨ１の下方制御を伴う成熟時のエンドサイトーシス活性の全体的な減少に起因し、ＭＨＣＩＩ－ペプチド複合体の内在化の減少を引き起こす。したがって、占有率の観察された増加は、ＭＡＲＣＨ１を介したユビキチン化に関連する、細胞表面からのＭＨＣＩＩのリサイクルの減少に関連する可能性がある、この文脈において、ＭＡＲＣＨ１媒介ユビキチン化がＣＤ８６発現の調節における重要なプロセスであることも興味深い。本発明者らは、リポソームへのＦＰ結合がＣＤ８６発現を増加させるのに必要ではないが（ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ及びＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰは、非常に類似したレベルのＣＤ８６を生じさせた、図１１Ｃ）、この態様が最大抗原提示の中心である（ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰは、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰよりも有意に高いペプチド占有率をもたらす、図１１Ｂ）ことを観察した。これは、ＭＡＲＣＨ１媒介性ＭＨＣＩＩリサイクルの減少が関与する唯一の機構ではない可能性が高いことを示唆している。

ペプチド発現の増加に対する代替的な説明は、エンドソーム輸送の変化に関連する可能性がある。実際、直径約４μｍのカプセルの剛性の増加は、エンドサイトーシス輸送を延長することが示されている。

ＭＨＣＩＩにおけるペプチド占有の増強及びより強い共刺激として観察される抗原プロセシング又は提示の増加はまた、液相ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰ又は遊離ＦＰと比較して、このナノ粒子のより良好な取り込みを反映することができる。この解釈は、剛性粒子のより良好な取り込み、変形した粒子を包み込むのに必要なより高い曲げエネルギー及び接着エネルギーに起因する効果を実証する以前の研究によって支持されており、細胞表面に捕捉されたままになりやすい。更に、液相に特徴的な高いリガンド移動度は、細胞表面への粒子の多価結合及び取り込みを担う生理学的プロセスに大きな影響を及ぼす可能性が高いため、取り込みプロセスは膜流動性によって影響され得る。膜相の更なる効果は、ゲル相ＰＣリポソームが、平滑液相リポソームとは異なり、面のある外観を有し、ＦＰ結合ＰＥＧ－脂質が多価相互作用を助長する高い局所濃度で集まり得る高度に無秩序な粒界によって接続されたゲル相ドメインからなることである。最後に、取り込みプロセスは、ＦＰのリポソームへの結合の安定性によって影響される可能性がある。実際、リポソーム薬物送達文献ではあまり考慮されていなかった態様は、膜相の変化が脂質結合抗原の膜分配の変化にも関連し、液相脂質は、ゲル相脂質と比較して脂質膜中にあまり保持されないことが知られており、この効果はＰＥＧ化ＦＰ－脂質コンジュゲートの親水性によって悪化する可能性があることである。したがって、液相ＤＯＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰの場合、ゲル相ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰよりも大部分のＦＰ－脂質複合体が水溶液中に見られることを排除することはできない。この考えは、不規則な膜からの脂質の抽出が、規則的な膜からの抽出よりも少ない力を必要とすることが証明されていることを示す観察結果と一致しており、これは、取り込みプロセス中に細胞が粒子に及ぼす力が、ゲル相のものよりも液相の膜からＦＰ－脂質複合体を除去する可能性が高いことを意味し得る。ＦＰがＤＯＰＣ－ＰＥＧに結合したか否かにかかわらず（図１１及び１２）、ＣＤ８６及びサイトカインの非常に類似した発現レベルを示すデータは、融合タンパク質がリポソームからより容易に除去され得る可能性があることを示すことができ、このシナリオは、ＦＰ構築物の取り込みの経路及び効率に直接影響を及ぼす可能性が高い。したがって、これは、ゲル相状態のリポソームとそれらの液相対応物との間の本研究で報告された抗原提示の差が、少なくとも部分的に、リポソーム取り込みの差に起因し得ることを示唆している。しかし、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ＋ＦＰもまた、遊離ＦＰ単独と比較して、抗原提示及び樹状細胞活性化の統計学的に有意な増加を引き起こすことは注目に値する。したがって、リポソームに結合したＦＰを維持する能力の違いは明らかに重要であるが、ＤＳＰＣ－ＰＥＧリポソームのアジュバント効果についての唯一の説明ではない可能性が高い。

インビトロモデル系を使用して得られた結果は、ＤＳＰＣ－ＰＥＧ－ＦＰが融合タンパク質の免疫原性を増加させる可能性を有することを示しており、膜流動性、膜剛性及び脂質分配が、担体リポソームが免疫細胞とどのように相互作用し、免疫細胞によって処理されるかに有意に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。例は、ゲル相リポソームが、ナノ粒子ベクター設計に利用されるアジュバント、保護及び送達態様とワクチン抗原を合わせるワクチン製剤を更に改善するための効率的な手段であり得るという説得力のある証拠を提供する。この効果の背後にある機構は、安定した粒子の完全性、取り込みの増加、並びに迅速な樹状細胞の成熟及びペプチド負荷のための好ましい条件の組み合わせに関連し得る。

上記の実施形態は、本発明のいくつかの例示的な例として理解されるべきである。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に様々な修正、組み合わせ、及び変更を加えることができることを理解するであろう。特に、異なる実施形態における異なる部分の解決策は、技術的に可能な場合、他の構成で組み合わせることができる。しかし、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義される。

配列表４ ＜２２３＞ＣＤ１０３結合ｓｃＦｖ
配列表５ ＜２２３＞ＣＤ２０５結合ｓｃＦｖ
配列業１２ ＜２２３＞ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－ＣＤ１０３結合ｓｃＦｖをコードするＮｔ配列
配列表１６ ＜２２３＞ＣＤ１０３結合ｓｃＦｖ
配列表１７～２２ ＜２２３＞ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２
配列表２３～２４ ＜２２３＞Ｍ２９０ハイブリドーマからの増殖されたｃＤＮＡ
配列表２５ ＜２２３＞Ｍ２９０ ＶＨフォワードプライマー
配列表２６ ＜２２３＞Ｍ２９０ ＶＨリバースプライマー
配列表２７ ＜２２３＞Ｍ２９０ ＶＬフォワードプライマー
配列表２８ ＜２２３＞Ｍ２９０ ＶＬリバースプライマー
配列表２９ ＜２２３＞ＶＨ配列
配列表３０ ＜２２３＞ＶＬ配列
配列表３１ ＜２２３＞ＧＳ－Ｍ２９０フォワードプライマー
配列表３２ ＜２２３＞ＧＳ－Ｍ２９０リバースプライマー
配列表３３ ＜２２３＞ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ
配列表３５ ＜２２３＞３Ｍ２ｅ－３Ｅａ－ＳＩＩＮ－ｐ３２３
配列表３６ ＜２２３＞ＦＬＡＧ及びＨｉｓタグを有するＣＤ１０３結合ｓｃＦｖ
配列表３７ ＜２２３＞大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター
配列表３８ ＜２２３＞ＣＴＡ１－ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｉ）－Ｐ２３２（ＩＩ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ
配列表３９ ＜２２３＞ＣＴＡ１－Ｐ２３２（ＩＩ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ
配列表４０ ＜２２３＞ＣＴＡ１（Ｒ７ｋ）－Ｐ３２３－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ
配列表４１ ＜２２３＞ｐＳＹ－ＡａＲＩ
配列表４２ ＜２２３＞ｍＳＳ－ＣＴＡ１－３（Ｍ２ｅ）－３（Ｅａ）－ＣＤ１０３ ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ
配列表４３ ＜２２３＞ＣＴＡ１－３Ｍ２ｅ－３Ｅａ－ＣＤ１０３結合ｓｃＦｖ－ＦＬＡＧタグ－Ｈｉｓタグ

Claims (47)

1. 融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が、
   細菌外毒素をコードする第１のヌクレオチド配列と、
   抗原提示細胞上の表面マーカに特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする第２のヌクレオチド配列と、
   を含む、上記ヌクレオチド配列。
2. 細菌外毒素が、細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニット及び百日咳毒素からなる群から選択される、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
3. 細菌エンテロトキシンが、コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される、請求項２に記載のヌクレオチド配列。
4. 細菌エンテロトキシンが、コレラ毒素のＡ１サブユニット（ＣＴＡ１）である細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニットである、請求項３に記載のヌクレオチド配列。
5. 百日咳毒素が百日咳毒素サブユニットＳ１である、請求項２から４のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
6. 第２のヌクレオチド配列が、樹状細胞上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
7. 第２のヌクレオチド配列が、従来の１型樹状細胞（ｃＤＣ１）上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項６に記載のヌクレオチド配列。
8. 第２のヌクレオチド配列が、分化抗原群１０３（ＣＤ１０３）、ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（Ｃｌｅｃ９Ａ）、ＸＣＲ１、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、Ｂリンパ球及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）、並びにＣＤ２２６からなる群から選択される表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項７に記載のヌクレオチド配列。
9. 第２のヌクレオチド配列が、ＣＤ１０３、ＸＣＲ１及びＣｌｅｃ９Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項８に記載のヌクレオチド配列。
10. 第２のヌクレオチド配列が、従来の樹状細胞（ｃＤＣ）上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項６に記載のヌクレオチド配列。
11. 第２のヌクレオチド配列が、トロンボモジュリン（ＴＭ）に特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項１０に記載のヌクレオチド配列。
12. 第２のヌクレオチド配列が、従来の２型樹状細胞（ｃＤＣ２）上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項６に記載のヌクレオチド配列。
13. 第２のヌクレオチド配列が、分化抗原群１ｃ（ＣＤ１ｃ）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２、ＦｃεＲＩ（ＦＣＥＲ１）、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＡ（Ｃｌｅｃ４Ａ）及びＣｌｅｃ１０Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項１２に記載のヌクレオチド配列。
14. 少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープをコードする第３のヌクレオチド配列を更に含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
15. 第３のヌクレオチド配列が、インフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質２（Ｍ２ｅ）エピトープの少なくとも１つの外部ドメインをコードする、請求項１４に記載のヌクレオチド配列。
16. 第３のヌクレオチド配列が、複数のＭ２ｅエピトープをコードする、請求項１５に記載のヌクレオチド配列。
17. ヌクレオチド配列が、５’末端から３’末端に、第１のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列を含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
18. 医薬品として使用するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
19. ワクチンアジュバントとして使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
20. ワクチンとして使用するための、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
21. 請求項１から１７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
22. 請求項１から１７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列及び／又は請求項２０に記載の発現ベクターを含む細胞。
23. 融合タンパク質であって、
    細菌外毒素と、
    抗原提示細胞上の表面マーカに特異的に結合する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、
    を含む、上記融合タンパク質。
24. 細菌外毒素が、細菌エンテロトキシンのＡ１サブユニット及び百日咳毒素からなる群から選択される、請求項２３に記載の融合タンパク質。
25. 細菌エンテロトキシンが、コレラ毒素（ＣＴ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）からなる群から選択される、請求項２４に記載の融合タンパク質。
26. 細菌エンテロトキシンが、コレラ毒素のＡ１サブユニット（ＣＴＡ１）である、請求項２５に記載の融合タンパク質。
27. 百日咳毒素が百日咳毒素サブユニットＳ１である、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
28. ｓｃＦｖが、樹状細胞上の表面マーカに特異的に結合する、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
29. ｓｃＦｖが、従来の１型樹状細胞（ｃＤＣ１）上の表面マーカに特異的に結合する、請求項２８に記載の融合タンパク質。
30. ｓｃＦｖが、分化抗原群１０３（ＣＤ１０３）、ｃ型レクチンドメインファミリー９メンバーＡ（ＣＬＥＣ９Ａ）、ＸＣＲ１、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）、Ｂリンパ球及びＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、ジペプチジルペプチダーゼ－４（ＤＰＰ４）、並びにＣＤ２２６からなる群から選択される表面マーカに特異的に結合する、請求項２９に記載の融合タンパク質。
31. ｓｃＦｖが、ＣＤ１０３、ＸＣＲ１及びＣＬＥＣ９Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合する、請求項３０に記載の融合タンパク質。
32. ｓｃＦｖが、従来の樹状細胞（ｃＤＣ）上の表面マーカに特異的に結合する、請求項２８に記載の融合タンパク質。
33. ｓｃＦｖが、トロンボモジュリン（ＴＭ）に特異的に結合する、請求項３２に記載の融合タンパク質。
34. 第２のヌクレオチド配列が、従来の２型樹状細胞（ｃＤＣ２）上の表面マーカに特異的に結合するｓｃＦｖをコードする、請求項２８に記載の融合タンパク質。
35. ｓｃＦｖが、分化抗原群１ｃ（ＣＤ１ｃ）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２、ＦｃεＲＩ（ＦＣＥＲ１）、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰＡ）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、Ｃ型レクチンドメインファミリー４メンバーＡ（ＣＬＥＣ４Ａ）及びＣＬＥＣ１０Ａからなる群から選択される表面マーカに特異的に結合する、請求項３４に記載の融合タンパク質。
36. 少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープを更に含む、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
37. 少なくとも１つのウイルスエピトープが、インフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質２（Ｍ２ｅ）エピトープの少なくとも１つの外部ドメインである、請求項３６に記載の融合タンパク質。
38. 融合タンパク質が、複数のＭ２ｅエピトープを含む、請求項３７に記載の融合タンパク質。
39. 融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端に、細菌外毒素、少なくとも１つのウイルス又は細菌エピトープ及びｓｃＦｖを含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
40. 請求項２３から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、アジュバント組成物。
41. 請求項３６から３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む、ワクチン組成物。
42. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を更に含む、請求項４０又は４１に記載の組成物。
43. 融合タンパク質が、ＬＮＰに共有結合しており、好ましくは、融合タンパク質が、ポリマーリンカー、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、グリカン、ポリペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるリンカーによってＬＮＰに共有結合している、請求項４２に記載の組成物。
44. 医薬品として使用するための、請求項２３から３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
45. ワクチンアジュバントとして使用するための、請求項２３から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
46. ワクチンとして使用するための、請求項３６から３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
47. ウイルス感染又は細菌感染又は疾患に対して対象にワクチン接種する方法であって、該方法が、請求項４１から４３のいずれか一項に記載のワクチン組成物を対象に投与することを含む、上記方法。
    
    

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