JP2023523237A - snRNA構成要素を使用する組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
ヌクレオチドミスマッチを含有し得る標的RNAとハイブリダイズするために使用することができる操作されたポリヌクレオチドを含む、組成物、薬学的組成物、及び使用方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される組成物及び方法を使用して、RNAを編集して、対象における疾患又は状態を軽減するか、又は治療することができる。【選択図】図4B
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年4月22日に出願された仮出願番号第63/013,744号、2020年5月26日に出願された仮出願番号第63/030,118号、2020年10月1日に出願された仮出願番号第63/086,434号、2020年11月11日に出願された仮出願番号第63/112,486号、2020年12月1日に出願された仮出願番号第63/119,878号、及び2021年2月25日に出願された仮出願番号第63/153,817号に対する米国特許法第119条に基づく優先権を請求し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2020年4月22日に出願された仮出願番号第63/013,744号、2020年5月26日に出願された仮出願番号第63/030,118号、2020年10月1日に出願された仮出願番号第63/086,434号、2020年11月11日に出願された仮出願番号第63/112,486号、2020年12月1日に出願された仮出願番号第63/119,878号、及び2021年2月25日に出願された仮出願番号第63/153,817号に対する米国特許法第119条に基づく優先権を請求し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
内因性及び外因性のRNA編集酵素によるRNA編集を容易にするガイドRNAは、広範囲の疾患に対処する可能性を有する。しかしながら、これらのガイドRNAの効力を定量的及び定性的に増加させるためには、RNAの安定性及び保持性を増強する組成物及び方法が必要である。
スプライシング活性の調節による治療の機会が可能であるが、このアプローチの効率、特異性、及び送達は、臨床現場では十分に機能していない。本開示は、スプライシング活性の調節及びRNA塩基編集の効率、特異性、及び送達の顕著な改善を提供する、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
ここで、本願発明者らは、所望の遺伝子標的に対して内因性ADARデアミナーゼ活性をもたらすためのガイドRNAを発現するための新規なシャーシを操作するようにU7 snRNA遺伝子を適応させる。このRNA塩基編集は、コード配列、5’若しくは3’非翻訳領域、イントロン、分岐点アデノシン、又はスプライスアクセプター部位内で生じ得る。このようなRNA塩基編集によって、タンパク質コード配列を変更し、変異した早期停止コドンを除去し、RNAの安定性を調節し、又はプレmRNAのスプライシングを変更することができる。
本開示は、操作されたポリヌクレオチドであって、標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含有する、標的化配列と、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はそのバリアントと、を含む、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、操作されたポリヌクレオチドであって、標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、少なくとも1つのアデニン-グアニン(A-G)ミスマッチ、少なくとも1つのアデニン-アデニン(A-A)ミスマッチ、又は少なくとも1つのアデニン-シトシン(A-C)ミスマッチを含有する、標的化配列と、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はそのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、RNA編集エンティティによる標的RNAの塩基の編集を容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
ミスマッチは、少なくとも1つのアデニン-グアニン(A-G)ミスマッチ、少なくとも1つのアデニン-アデニン(A-A)ミスマッチ、又は少なくとも1つのアデニン-シトシン(A-C)であり得る。標的化配列は、少なくとも30~300又は50~100塩基長であり得る。操作されたポリヌクレオチドは、RNAポリメラーゼII型プロモーターに作動可能に連結され得る。RNAポリメラーゼII型プロモーターは、U1プロモーターである。RNAポリメラーゼII型プロモーターは、U7プロモーターである。操作されたポリヌクレオチドは、U6プロモーターに作動可能に連結される。Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントは、SmOPT配列である。SmOPT配列は、AAUUUUUGGAG又は配列番号41に対して少なくとも80%の配列同一性を有する。SmOPT配列は、AAUUUUUGGAG又は配列番号41である。ヘアピンは、マウスU7 snRNA、ヒトU7 snRNA、又はヒトU1 snRNA由来である。ヘアピンは、マウスU7 snRNA、ヒトU7 snRNA、ヒトU1 snRNAのうちの1つ以上のキメラヘアピンである。ヘアピンは、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つの中のヘアピン配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む。ヘアピンは、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つのヘアピン配列を有する。ヘアピンは、配列番号43の配列を有する。操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの3’末端にU7ボックスターミネーターを更に含み得る。5’から3’の標的化配列は、標的化配列と、Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、ヘアピンと、を含む。操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティによる標的RNAの塩基の編集を容易にするように構成されている。RNA編集は、ADARタンパク質、APOBECタンパク質、又は両方を含む。RNA編集エンティティは、ADARを含み、ADARは、ADAR1又はADAR2を含む。標的化配列は、疾患又は状態において実行される標的RNAに少なくとも部分的に結合する。標的RNAは、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894 G>A、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、又はテイ・サックス病を含む、疾患又は状態。操作されたポリヌクレオチドは、snRNA由来の追加の配列を更に含む。snRNA由来の追加の配列は、少なくとも部分的にU1、U2、U4、U5、U6、又はU7 snRNA配列を含み得る。snRNA配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも80%の同一性を有し得る。標的化配列は、標的RNAの配列に対してミスマッチを含む。ミスマッチは、A/Cミスマッチであってもよく、標的化配列は、A/CミスマッチのCを含み、標的RNAの配列は、A/CミスマッチのAを含む。A/Cミスマッチは、デアミナーゼ存在下でプレmRNAと会合したときに、プレmRNAにおいて編集を促進するように構成されてもよい。ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から少なくとも45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、又は55塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から10~30塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から約20塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から正確に20塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から約70~90塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から約80塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から正確に80塩基に位置する。snRNAプロモーターは、少なくとも部分的にU1、U2、U4、U5、U6、又はU7 snRNAプロモーターを含む。
標的化配列は、標的RNA内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、(a)標的RNA内のエクソンの上流にある分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であるか、又は(b)標的化配列が、標的RNA内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的である。
操作されたポリヌクレオチドは、インビトロで測定される場合に、Sm若しくはSm様結合ドメイン、又はそのバリアントを含まないか、ヘアピンを含まないか、あるいはSm若しくはSm様結合ドメイン、又はそのバリアント及びヘアピンを含まない、同等のエクソンスキッピング構築物と比較して、改善されたエクソンスキッピングの効率を有し得る。効率は、ミスマッチヌクレオチドを含まない編集構築物を含む細胞と比較して、編集構築物によってトランスフェクトされた細胞におけるエクソンスキッピングガイドRNA構築物によってスキッピングされたエクソンのスキッピングの割合を検出するために、液滴デジタルPCRアッセイを行うことによって決定することができる。操作されたポリヌクレオチドは、スプライスシグナル内の塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集は、エクソンのスキッピングを促進するように構成され得る。操作されたポリヌクレオチドは、インビトロアッセイによって測定される場合、少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は少なくとも50%、エクソンスキッピングの効率が増加する。プレmRNAを標的とする領域内のプレmRNAに対して相補的ではないヌクレオチドは、標的mRNAと会合したときに、操作されたポリヌクレオチドがデアミナーゼを動員するように構成する。標的化配列は、プレmRNAに結合したときに、デアミナーゼと会合して、デアミナーゼによるプレmRNAのポリヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にする。操作されたポリヌクレオチドは、デアミナーゼ動員ドメインを更に含む。
デアミナーゼ動員ドメインは、GluR2、Aluのうちの少なくとも一部分、これらのいずれかのバリアント、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。デアミナーゼ動員ドメインは、ステムループを含む。ステムループは、左巻きのステムループ又は右巻きのステムループである。ステムループは、GluR2ドメインに対して少なくとも約80%の配列同一性を含む。操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも1つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。化学修飾は、表1に提供される操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の少なくとも1つの修飾を含む。
操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的RNAに結合していないときに、ヘアピン、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとものうちのいずれか1つを欠いている。例えば、上述の構造的特徴の1つであるヘアピン、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせは、本開示の操作されたポリヌクレオチドを標的RNAに結合することによって形成される二本鎖RNA中に形成されてもよい。構造的特徴は、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを含む。構造的特徴は、バルジである。バルジは、非対称バルジである。バルジは、対称バルジである。構造的特徴は、内部ループである。内部ループは、非対称ループである。内部ループは、対称ループである。操作されたポリヌクレオチドは、構造的なループ安定化骨格を含む。構造的なループ安定化骨格は、標的化配列を更に含み、これが標的RNAと会合して、RNA編集酵素を動員し、RNA編集酵素は、標的RNAのヌクレオチドの塩基を化学修飾し、標的化配列は、約4個より多く、又は約4個の連続したヌクレオチドを含む。操作されたポリヌクレオチドは、標的化配列に隣接する第1のスペーサードメイン及び第2のスペーサードメインを更に含み、操作されたポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における転写の後に自己環化するように構成されている。操作されたポリヌクレオチドは、第1のスペーサードメインに対して5’に、又は第2のスペーサードメインに対して3’にリボザイムドメインを含む。操作されたポリヌクレオチドは、リボザイムドメインと第1のスペーサードメインとの間に、又はリボザイムドメインと第2のスペーサードメインとの間にライゲーションドメインを含む。ポリヌクレオチド配列が二次元的に表される場合、操作されたポリヌクレオチドは、線形である。ポリヌクレオチド配列が二次元的に表される場合、操作されたポリヌクレオチドは、環状である。操作されたポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で、系内で環化するように構成されている。標的化配列は、アプタマーを含まない。操作されたポリヌクレオチドは、RNA干渉(RNAi)のために構成された配列をコードする配列を含まないか、又はそれをコードしない。標的化配列は、標的RNAの3’又は5’非翻訳領域(UTR)の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている。標的化配列は、標的RNAのイントロン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている。標的化配列は、標的RNAのエクソン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている。操作されたポリヌクレオチドは、約80ヌクレオチド~約600ヌクレオチドである。操作されたポリヌクレオチドは、標的化配列に対して5’に第1のスペーサードメインを含む。操作されたポリヌクレオチドは、第1のスペーサードメインとは異なるか、又は同一である第2のスペーサードメインを含む。第1のスペーサードメイン、第2のスペーサードメイン、又は両方は、AUAUA(配列番号53)のポリヌクレオチド配列を含む。第1のスペーサードメイン、第2のスペーサードメイン、又は両方は、AUAAU(配列番号52)のポリヌクレオチド配列を含む。操作されたポリヌクレオチドは、5’末端に第1のリボザイムドメインと、3’末端に第2のリボザイムドメインと、を含む。第1又は第2のリボザイムは、独立して、ハンマーヘッドリボザイム、glmSリボザイム、HDV様リボザイム、R2エレメント、ペプチジルトランスフェラーゼ23S rRNA、GIR1分岐リボザイム、リードザイム、II群イントロン、ヘアピンリボザイム、VSリボザイム、CPEB3リボザイム、CoTCリボザイム、及びI群イントロンからなる群から選択される。
本開示の操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクターが本明細書で提供される。ベクターは、リポソーム、ナノ粒子、又はデンドリマーを含む。ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。AAVベクターは、AAV2ベクター、AAV5ベクター、AAV8ベクター、AAV9ベクター、又はこれらのいずれかのハイブリッドである。ウイルスベクターは、自己相補的アデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターである。ウイルスベクターは、一本鎖AAVベクターである。
本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は本開示のベクターを含む、単離された細胞が本明細書で提供される。単離された細胞は、T細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞等であり得る。
本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は本開示のベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、単位剤形での薬学的組成物が本明細書で提供される。
本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、本開示のベクター、又は本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において状態を治療又は予防する方法が本明細書で提供される。状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、パーキンソン病、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症、又はスターガルト病であり得る。状態は、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894 G>A、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質中の変異と関連する。投与は、非経口であり得る。投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、筋肉内注射、脳室内(ICV)投与、皮下注射、経口投与、粘膜投与、舌下投与、口腔内投与、直腸投与、眼投与、耳投与、経鼻投与、局所投与、皮膚投与、経皮投与、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。
本開示の方法は、追加の治療を行うことを更に含み得る。追加の治療は、同時に、又は連続的に行われ得る。投与は、少なくとも週に1回行うことができる。対象は、投与前にインビトロ診断によって疾患又は状態を有すると診断されている。対象は、ヒトであってもよく、任意選択的に、対象は、男性又は女性であり、対象は、任意選択的に、成人であるか、又は対象は、任意選択的に、18歳未満である。
本開示の操作されたポリヌクレオチドを容器中に含むか、又は本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを容器中に含むか、又は本開示のベクターを容器中に含むか、又は本開示の薬学的組成物を容器中に含む、キットが本明細書で提供される。
薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を、本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は本開示のベクターのうちの少なくとも1つと接触させることを含む、薬学的組成物を作製する方法が本明細書で提供される。
1)本開示の操作されたポリヌクレオチド、2)本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、3)本開示のベクター、又は4)本開示の薬学的組成物を容器内に少なくとも部分的に配置することを含む、キットを作製する方法が本明細書で提供される。
「a」及び「an」という用語は、文法的な物品の目的語の1つ、又は1つより多く(例えば、少なくとも1つ)を指す。例として、「要素(an element)」は、1つの要素又は1つより多くの要素を意味する。
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、量又は濃度等の測定可能な値を指す場合、指定された量の20%、10%、5%、1%、0.5%、又は更には0.1%の変動を包含することを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における実践によれば、プラス又はマイナス10%を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値のプラス若しくはマイナス20%、プラス若しくはマイナス10%、プラス若しくはマイナス5%、又はプラス若しくはマイナス1%の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的な系又はプロセスに関して、この用語は、ある値の最大5倍まで、又は最大2倍までの倍数の範囲内を意味し得る。特定の値を、本出願及び特許請求の範囲に記載することができる場合、別途記載のない限り、「約」という用語は、その特定の値について許容可能な誤差範囲までを意味すると考えるべきである。また、値の範囲、部分範囲、又はその両方を提供することができる場合、その範囲又は部分範囲は、その範囲又は部分範囲の端点を含むことができる。「実質的に」、「実質的にない」、「実質的に含まない」、及び「およそ」という用語は、記載されている値が、最大で合理的な期待値の範囲であり得ることを示す、大きさ、位置、又は両方を説明するときに使用することができる。例えば、ある数値は、述べられている値(又は値の範囲)の±0.1%、述べられている値(又は値の範囲)の±1%、述べられている値(又は値の範囲)の±2%、述べられている値(又は値の範囲)の±5%、述べられている値(又は値の範囲)の±10%等であり得る値を有していてもよい。本明細書に引用される任意の数値範囲は、その中に属する全ての部分範囲を含むことを意図し得る。
本明細書で使用される場合、「部分的に」、「少なくとも部分的に」という用語、又は本明細書に使用される場合は、所与の値の100%に近い値を指すことができる。いくつかの場合において、この用語は、総量の少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、又は99.99%であり得る量を指すことができる。いくつかの場合において、この用語は、総量の約100%であり得る量を指すことができる。
本明細書で「A及び/又はB」等の語句で使用される「及び/又は」という用語は、A及びBの両方、A又はB、A(単独)、並びにB(単独)を含むことを意図している。同様に、「A、B、及び/又はC」等の語句で使用される「及び/又は」という用語は、以下の実施形態の各々を包含することが意図される。A、B、及びC;A、B、又はC;A又はC;A又はB;B又はC;A及びC;A及びB;B及びC;A(単独);B(単独);並びにC(単独)。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「~から本質的になる」とは、意図された使用のための組み合わせに対する任意の本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法からの微量汚染物質、並びに薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存剤等を除外しない。「~からなる」とは、他の成分の微量元素、及び本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップより多くを除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「対象」、「宿主」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において動物、典型的には哺乳動物を指すために相互に置き換え可能に使用される。任意の好適な哺乳動物は、本明細書に記載される方法、細胞又は組成物によって治療され得る。哺乳動物は、本明細書に記載されるように、ベクター、操作されたポリヌクレオチド、前駆体ガイドRNA、核酸、又は薬学的組成物を投与され得る。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等)、家畜動物(例えば、イヌ及びネコ)、農場動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ)、並びに実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢、又は任意の発達段階(例えば、成人、十代、子供、乳児、又は子宮内の哺乳動物)であり得る。哺乳動物は、雄又は雌であり得る。哺乳動物は、妊娠中の雌であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、神経変性疾患等の疾患を有するか、又は有することが疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、がん、又は新生物性障害を有するか、又は有することが疑われ得る。他の実施形態において、対象は、異常なタンパク質発現に関連する疾患又は障害を有するか、又は有することが疑われ得る。いくつかの場合において、ヒトは、約1日齢~約10ヶ月齢、約9ヶ月齢~約24ヶ月齢、約1歳~約8歳、約5歳~約25歳、約20歳~約50歳、約1歳~約130歳、又は約30歳~約100歳より上であってもよい。ヒトは、約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、又は120歳より上であってもよい。ヒトは、約1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、又は130歳より下であってもよい。
「対象」、「宿主」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において動物、典型的には哺乳動物を指すために相互に置き換え可能に使用される。任意の好適な哺乳動物は、本明細書に記載の組成物(例えば、操作されたポリヌクレオチド)を投与され得るか、又は本明細書に記載の方法によって治療され得る。対象は、脊椎動物又は無脊椎動物であり得る。対象は、実験動物であり得る。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等)、家畜動物(例えば、イヌ及びネコ)、農場動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ)、並びに実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢、又は任意の発達段階(例えば、成人、十代、子供、乳児、又は子宮内の哺乳動物)であり得る。哺乳動物は、雄又は雌であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得る。対象は、疾患を患っていてもよい。対象は、疾患の症状を呈していてもよい。対象は、疾患の症状を呈していないが、それでも疾患を有していてもよい。対象は、介護者の医療ケアの下にあってもよい(例えば、対象は、入院し、医師によって治療される)。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、2つのペプチド間又は2つの核酸分子間の配列類似性を指し得る。相同性は、比較の目的のためにアラインメントすることができる各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が、同じ塩基又はアミノ酸によって占有され得る場合、その分子は、その位置で相同性であり得る。配列間の相同性の程度は、複数の配列によって共有されるマッチする位置又は相同性の位置の数の関数であり得る。「無関係」又は「非相同性の」配列は、本開示の配列のうちの1つと40%未満の同一性、又は代替的に25%未満の同一性を共有する。配列相同性は、参照配列に対する配列の同一性%を指し得る。実用的な問題として、任意の特定の配列が、本明細書に記載の任意の配列(本明細書に記載の特定の核酸配列と対応し得る)に対して少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であり得るかどうかにかかわらず、このような特定のポリペプチド配列は、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575 Science Drive,Madison,Wis.53711)等の既知のコンピュータプログラムを使用して、簡便に決定され得る。Bestfit又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、参照配列に対して95%同一であるかどうかを決定する場合、同一性パーセントを参照配列の全長にわたって計算することができるように、かつ全参照配列の最大5%の配列相同性中のギャップを許容することができるように、パラメータを設定することができる。
いくつかの場合において、参照配列(クエリ配列、例えば、本開示の配列)と主題配列との間の同一性は、グローバル配列アラインメントとも称され、FASTDBコンピュータプログラムを使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、同一性が狭義に解釈され得る特定の実施形態のパラメータは、FASTDBアミノ酸アラインメントに使用され、Scoring Scheme=PAM(許容される変異率)0、k-tuple=2、Mismatch Penalty=1、Joining Penalty=20、Randomization Group Length=0、Cutoff Score=1、Window Size=配列長さ、Gap Penalty=5、Gap Size Penalty=0.05、Window Size=500又は主題配列の長さのいずれか短い方、を含み得る。この実施形態によれば、主題配列が、内部欠失のためではなく、N末端又はC末端の欠失に起因してクエリ配列より短い可能性がある場合、FASTDBプログラムが、グローバル同一性パーセントを計算する場合に主題配列のN末端及びC末端の切断を考慮していないという事実を考慮するために、結果に対して手動の修正を行うことができる。クエリ配列と比較する、N末端及びC末端で切断された主題配列に関して、同一性パーセントは、対応する主題の残基とマッチ/アラインメントし得ない、主題配列のN末端及びC末端に対して横方向であり得るクエリ配列の残基の数を、クエリ配列の全塩基に対するパーセントとして計算することによって修正することができる。残基がマッチ/アラインメントされ得るかどうかの決定は、FASTDB配列アラインメントの結果によって決定することができる。次いで、このパーセンテージを、同一性パーセントから引き算し、指定されたパラメータを使用してFASTDBプログラムによって計算し、最終的な同一性パーセントスコアに到達することができる。この最終的な同一性パーセントスコアを、この実施形態の目的のために使用することができる。いくつかの場合において、クエリ配列とマッチ/アラインメントし得ない、主題配列のN末端及びC末端に対する残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調節する目的のために考慮され得る。すなわち、主題配列の最も遠いN末端残基及びC末端残基の外側にあるクエリ残基位置のみが、この手動の修正のために考慮され得る。例えば、90残基の主題配列を、100残基のクエリ配列とアラインメントし、同一性パーセントを決定することができる。欠失は、主題配列のN末端で生じ、したがって、FASTDBアラインメントは、N末端における最初の10個の残基のマッチング/アラインメントを示さない。この10個の対形成していない残基は、配列の10%(マッチしていないN末端及びC末端での残基の数/クエリ配列中の残基の総数)を表し、そのため、FASTDBプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから10%を引き算することができる。残りの90個の残基が完全にマッチした場合、最終的な同一性パーセントは、90%であり得る。別の例において、90残基の主題配列を、100残基のクエリ配列と比較することができる。このとき、欠失は、内部欠失である可能性があり、そのため、クエリとマッチ/アラインメントし得ない残基は主題配列のN末端又はC末端に存在し得ない。この場合において、FASTDBによって計算された同一性パーセントを、手動で修正することはできない。繰り返しになるが、クエリ配列とマッチ/アラインメントし得ない、主題配列のN末端及びC末端の外側にある残基位置のみを、FASTDBアラインメントで示されるように、手動で修正することができる。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互に置き換え可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、既知又は未知の任意の機能を発揮してもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子若しくは遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、EST若しくはSAGEタグ)、エクソン、イントロン、遺伝子間DNA(ヘテロクロマチンDNAを含むが、これらに限定されない)、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、配列の単離されたDNA、配列の単離されたRNA、sgRNA、ガイドRNA、核酸プローブ、プライマー、snRNA、長い非コードRNA、snoRNA、siRNA、miRNA、tRNA由来の小さなRNA(tsRNA)、アンチセンスRNA、shRNA、又は小さなrDNA由来のRNA(srRNA)。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの組み立ての前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーション等により、重合後に更に修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。例えば、ホスホロチオエート骨格を有する核酸を含む核酸は、1つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介して、別の分子、例えば核酸又はポリペプチドと反応可能な任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介して、タンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。別途指定されない限り、又は必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるか、又は予測される2つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
「ガイドRNA」という用語は、本開示のポリヌクレオチドを指すために、「操作されたポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」等の用語と相互に置き換え可能に使用することができる。
本開示の方法で有用なポリヌクレオチドは、天然核酸配列及びそのバリアント、人工核酸配列、又はこのような配列の組み合わせを含み得る。
ポリヌクレオチドは、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、及びポリヌクレオチドがRNAの場合にはチミンの代わりにウラシル(U)の4つのヌクレオチド塩基の特異的配列で構成される。本明細書に記載される任意の配列は、DNAであってもよく、配列がRNAに転写される場合、チミン(T)をウラシル(U)で置き換えることができる。いくつかの場合において、本明細書に記載のRNA配列は、Uの代わりにTを有するDNA配列として表すことができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、1つ以上の他のヌクレオチド塩基(例えば、イノシン(I))、ヒポキサンチンがβ-N9-グリコシド結合を介してリボフラノースに接続するときに形成されるヌクレオシドを含んでいてもよく、以下の化学構造が得られる。
イノシンは、翻訳機構によってグアニン(G)と読まれる。
「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースに入力され、機能ゲノミクス及び相同性検索等のバイオインフォマティクス用途に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写されるプロセス、及び/又は転写されたmRNAが、その後にペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質内で翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核細胞におけるmRNAのスプライシングを含み得る。
「等価物」又は「生物学的等価物」という用語は、特定の分子、生物学的材料、又は細胞材料を指す場合に相互に置き換え可能に使用され、所望の構造又は機能性を依然として維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。
「液滴デジタルPCR」(ddPCR)は、PCR増幅を裏付ける別個の、体積的に定義された油中水滴分画に封入された核酸分子を計数することによる、絶対量を測定するデジタルPCRアッセイを指す。単一のddPCR反応は、ウェル当たり少なくとも20,000個の分画液滴を含有し得る。
「液滴」又は「油中水滴」は、液滴デジタルPCRアッセイの個々の分画を指す。液滴は、リアルタイムPCR用途に広く使用されているものと同様の均質なアッセイ化学及びワークフローを使用して、テンプレート分子のPCR増幅を裏付ける。
液滴デジタルPCRは、PCR増幅を裏付ける別個の、体積的に定義された油中水滴分画に封入された核酸分子を計数することによる、絶対量を測定するデジタルPCRアッセイを行う任意のプラットフォームを使用して行われてもよい。液滴デジタルPCRの戦略は、以下のようにまとめられてもよい。試料を希釈し、各々が目的の核酸分子のコピーを1つ含有するか、又は含有しないように、数千~数百万の別個の反応チャンバ(油中水滴)に分画する。標的アンプリコン(例えば、目的の核酸分子)を含有する、検出された「陽性」液滴の数と、標的アンプリコン(例えば、目的の核酸分子)を含有しない、「陰性」液滴の数を使用して、元々の試料中にあった目的の核酸分子のコピーの数を決定してもよい。液滴デジタルPCRシステムの例としては、核酸テンプレートを含有する試料を20,000個のナノリットルサイズの液滴に分画するBio-Rad製のQX100(商標)Droplet Digital PCR System、及び核酸テンプレートを含有する試料を1,000,000~10,000,000個のピコリットルサイズの液滴に分画するRainDance製のRainDrop(商標)デジタルPCRシステムが挙げられる。
本明細書で使用される「変異」という用語は、タンパク質のコンセンサス配列と比較して、上述のタンパク質をコードする核酸配列に対する変化を指す。「ミスセンス」変異は、1つのコドンを別のコドンに置換する。「ナンセンス」変異は、コドンを特定のアミノ酸をコードするものから停止コドンに変化させる。ナンセンス変異は、タンパク質の切断翻訳をもたらすことが多い。「サイレント」変異は、結果として生じるタンパク質に影響を及ぼさないものである。本明細書で使用される場合、「点変異」という用語は、遺伝子配列中の1つのヌクレオチドのみに影響を与える変異を指す。「スプライス部位変異」は、(イントロンを除去するための処理の前に)プレmRNAに存在する変異であって、スプライス部位の誤った描写からのタンパク質の誤訳を引き起こし、多くは切断を引き起こす、変異である。変異は、単一ヌクレオチド変異(SNV)を含み得る。変異は、配列バリアント、配列変動、配列変化、又は対立遺伝子変異を含み得る。参照DNA配列は、参照データベースから得ることができる。変異は、機能に影響を及ぼすことがある。変異は、機能に影響を及ぼさないことがある。変異は、1つ以上のヌクレオチド中のDNAレベル、1つ以上のヌクレオチド中のリボ核酸(RNA)レベル、1つ以上のアミノ酸中のタンパク質レベル、又はこれらの任意の組み合わせで生じ得る。参照配列は、NCBI Reference Sequence Database(RefSeq)データベース等のデータベースから得ることができる。変異を構成することができる特定の変化としては、1つ以上のヌクレオチド又は1つ以上のアミノ酸における置換、欠失、挿入、反転、又は変換が挙げられ得る。変異は、点変異であり得る。変異は、融合遺伝子であり得る。融合対又は融合遺伝子は、変異、例えば、転座、中間部欠失、染色体反転、又はそれらの任意の組み合わせから生じ得る。変異は、三重化、四重化等の反復配列の数の変動を構成し得る。例えば、変異は、所与の配列と関連付けられたコピー数の増加又は減少(すなわち、コピー数変動、又はCNV)であり得る。変異は、異なる対立遺伝子における2つ以上の配列変化、又は1つの対立遺伝子における2つ以上の配列変化を含み得る。変異は、モザイク等の1つの対立遺伝子の1つの位置に2つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、キメラ等の1つの対立遺伝子の1つの位置に2つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、悪性組織中に存在し得る。変異の存在又は不存在は、ある疾患又は状態を発症するリスクの増加を示し得る。変異の存在又は不存在は、ある疾患又は状態の存在を示し得る。変異は、良性組織中に存在し得る。変異の不存在は、組織又は試料が良性であることを示す場合がある。代替として、変異の不存在は、組織又は試料が良性であることを示さない場合がある。本明細書に記載の方法は、試料において変異の存在を特定することを含み得る。
DNAは、RNAポリメラーゼによって転写され、RNAの安定性及び調節機能にとって重要である配列を含有するプレmRNA転写産物を合成する。コードRNA(mRNA)の場合において、プレmRNAは、エクソンの選択的スプライシングを通じて、プレmRNAを成熟mRNAに変換するために、RNAプロセシングに供される。成熟mRNAはその後、リボソームによってタンパク質に翻訳される。ゲノムDNA中の変異が存在し、プレmRNA転写産物中に変異が生じ、上述のタンパク質のタンパク質機能又は発現に影響を及ぼし得る。これらの変異は、スプライシング部位に存在する場合、影響を受けるエクソンの選択に影響を与えることによって、適切な選択的スプライシングを防止することができる。具体的には、プレmRNAスプライシング部位は、保存されたスプライスアクセプター及びスプライスドナー部位を含有する。スプライスドナー部位は、ヌクレオチドモチーフであるN/GTを特徴とし、Nは、任意のヌクレオチドであり、「/」は、エクソン-イントロン接合部を表す。スプライスアクセプター部位は、モチーフであるNAG/NNを特徴とし、Nは、任意のヌクレオチドを表し、「/」は、エクソン-イントロン接合部を示す。イントロン及びエクソンの接合部にこのモチーフを除去又は導入する変異は、異常なmRNAスプライシングを引き起こし、不適切なタンパク質産生をもたらす可能性がある。
デアミナーゼを介した標的RNAの編集を容易にすることができるポリヌクレオチドエクソンスキッピング構築物を使用したmRNAの編集のための組成物及び方法が本明細書に開示される。
RNAスプライシングは、哺乳動物におけるRNAプロセシングに参加するために多くのタンパク質を必要とする高度に調節されたプロセスである。RNAスプライシングは、エクソンの接続及び介在するエクソンの除去を介して、プレmRNA転写産物が成熟mRNAにスプライシングされるRNAプロセシングの一形態である。次いで、成熟mRNAは、リボソーム機構による翻訳に向けられる。プレmRNA転写産物における異なる塩基配列は、適切なスプライシング及びその後のタンパク質及びそれらのアイソフォームの発現を容易にするために、エクソン及びイントロンの境界を画定する。しかしながら、ゲノムDNA中に存在する変異は、プレmRNA転写産物中に存在する場合があり、プレmRNAから機能的タンパク質産物への適切なスプライシングを妨げる。これらの変異は、エクソンの誤った接合を引き起こし、非機能性タンパク質を生じさせ、潜在的に疾患を引き起こす可能性がある。代替的に、ゲノムDNA中に存在する変異は、プレmRNAの適切なスプライシングを保持し得るが、その代わりに、エクソンの誤った接合をもたらす介入によってレスキューされ得る。このような疾患の例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ベータサラセミア(β-グロビン)、ハーラー症候群、及びドラベ症候群が挙げられる。
リボ核酸(RNA)は、細胞核中のゲノムDNAから転写される。核から運び出された後、RNAは、リボソームによって翻訳され、生物学的プロセスを実行するための機能的タンパク質を産生する。真核生物系において、RNAは、最初にプレmRNAとして合成され、プレmRNAは、リボソームによる翻訳の準備ができた成熟RNAを産生するために、選択的スプライシング等のRNA処理を受ける。
選択的スプライシングは、成熟RNAを生成するためにプレmRNAが処理されるプロセスである。プレmRNAは、エクソン及びイントロン、並びに他の非翻訳領域(3’及び5’UTR)で構成される。選択的スプライシングの間、プレmRNAのエクソン及びイントロンを区切るスプライシングシグナルは、スプライセオソームを複数のエクソンと一緒に接続して機能的タンパク質を形成し、それによって、介在するイントロンを除去することができる。
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、多くの場合、組換え転写産物のより高いレベルの発現をもたらす。スプライシングシグナルは、一次RNA転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー及びアクセプター部位からなる。
最近の研究は、タンパク質コード転写産物のエクソンスキッピングを誘導するための方法を利用する可能性を強調している。多くの場合において、アルファ-シヌクレイン及びDMD等のいくつかのタンパク質は、異なるスプライスバリアントとして発現することができ、そのいくつかは、疾患に関与する可能性がある。エクソンスキッピング事象を促進することによって、ある疾患に関与する変異を含有するエクソンを迂回し、又はコドンリーディングフレームを回復させ、それによって、ある疾患若しくは障害を修正するか、又はある疾患若しくは障害の症状を緩和するのに十分なバリアントの翻訳を容易にすることができる。
ガイドRNAは、ヒト又はマウスU6 snRNAプロモーターを使用して発現させることができる。RNAポリメラーゼIII型プロモーターは、U6と同様に、典型的には、短い「ハウスキーピング」RNAを転写する。U6プロモーターを使用して、Crispr/Cas9ヌクレアーゼのための単一ガイドRNA、及びRNA干渉のための短いヘアピンRNAを発現させることもできる。
SnRNAプロモーター(U6以外)は、RNAポリメラーゼII型プロモーターである。mRNA発現に使用されるものと同様に、snRNA転写産物は、mRNAとは異なって処理され得る(ポリアデニル化なし、異なる5’キャッピング)。ポリメラーゼを、インテグレーター複合体を会合させることができる。いくつかの場合において、プロモーター及び3’ターミネーターの両方の配列エレメントを認識する必要があるだろう。
SmOPT配列は、AAUUUUUGGAG、又はウラシルの代わりにチミンを用いて表される場合にはAATTTTTGGAG(配列番号41)として表すことができる。U7 snRNAの特定のヌクレオチド(ヒストンプレmRNAのスペーサー要素と天然でハイブリダイズする)は、アンチセンス配列(例えば、ベータ-グロビンプレmRNA)で置き換えられている。
内因性U7 snRNAは、細胞当たりおよそ2~15×103個の分子の低レベルで発現され得る。しかしながら、U7 snRNAの発現レベル及び核濃度は、野生型U7 Sm結合部位(AAUUUGUCUAG)を、本明細書に記載の主要なスプライセオソームsnRNP(SmOPT、AAUUUUUGGAG)に由来するコンセンサスSm結合配列に変換することによって、顕著に増加させることができる。更に、本明細書に記載のU7 snRNAのこのSmOPT修飾によって、ヒストンプレmRNA処理を低減することができる。このことには、以下の潜在的に2つの有益な効果がある。(i)標的RNAが、ヒストン3’末端処理機構によって切断されなくてもよく、(ii)RNAが、U7特異的タンパク質を潜在的に制限するために、内因性U7 snRNPと競合しなくてもよい。最後に、本明細書に記載のSmOPT修飾を有するガイドRNAは、プレmRNAスプライシングの部位にリダイレクトされ得る。
いくつかの場合において、U1プロモーター下で、修飾されたU7 snRNA構築物を使用してもよい(すなわち、U1プロモーター及びターミネーター配列の制御下での修飾されたU7 snRNA遺伝子を有するハイブリッド)。
修飾されたSmOPT U7 snRNAシャーシを、他の遺伝子のアンチセンス配列とともに使用して、本明細書に記載される他の疾患のためにRNAスプライシングを修飾してもよい。例えば、エクソンスキッピングのためのU7アンチセンスオリゴ構築物は、hnRNP A1のための結合部位を含み得る。hnRNP A1がスプライス部位に動員されると、スプライシング機構をブロックし、エクソンスキッピングを促進することができる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)等のいくつかの疾患において、タンパク質のエクソンは、発現したときに疾患を引き起こす変異を保有し得る。疾患を引き起こす変異を有するエクソンを含めることは、治療的介入のために検討されてきた。エクソンスキッピングは、選択的スプライシング事象の間に、変異したエクソンが選択されることを防止する方法として探究されてきた。フレーム内のエクソン71及び74は、それぞれ、ベッカー型及びデュシェンヌ型の変異を含有し得る。
エクソンをスキッピングする能力は、疾患を引き起こすエクソンの使用を防止するための魅力的な解決策であることが証明されている。エクソンスキッピングを使用する以前の試みは、治療目的のためにエクソン排除又はエクソン包含を容易にするために、スプライシングシグナルをマスキングする試薬を利用している。
RNA編集のための操作されたポリヌクレオチド構築物
天然に存在するデアミナーゼ酵素によるプレmRNAの編集を媒介することができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドを使用してmRNAを編集するための組成物及び方法が、本明細書に開示される。いくつかの場合において、そのような操作されたポリヌクレオチドを使用して、選択的スプライシング中のエクソンの使用に影響を及ぼすことができる。本開示は、いくつかの実施形態において、RNA編集を容易にするために使用することができる操作されたポリヌクレオチドを記載する。いくつかの場合において、RNA編集は、エクソンスキッピングを媒介することができる。
天然に存在するデアミナーゼ酵素によるプレmRNAの編集を媒介することができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドを使用してmRNAを編集するための組成物及び方法が、本明細書に開示される。いくつかの場合において、そのような操作されたポリヌクレオチドを使用して、選択的スプライシング中のエクソンの使用に影響を及ぼすことができる。本開示は、いくつかの実施形態において、RNA編集を容易にするために使用することができる操作されたポリヌクレオチドを記載する。いくつかの場合において、RNA編集は、エクソンスキッピングを媒介することができる。
snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、環状であってもよく、又は細胞中で環状であるように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、線形である。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドが二次元で表される場合、操作されたポリヌクレオチドは、線形又は環状である。操作されたポリヌクレオチドは、操作されたガイドRNAをコードする。操作されたガイドRNAは、標的化配列(又は「標的化領域」又は「標的化ドメイン」)及び動員ドメイン(又は「動員領域」)を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドRNAは、ちょうど標的化配列である。
核内低分子RNA(snRNA)
本開示の組成物及び方法は、核内低分子リボ核酸(snRNA)配列の一部分に作動可能に連結される、ガイドRNAをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。操作されたポリヌクレオチドは、核内低分子リボ核酸(snRNA)配列の少なくとも一部分を含み得る。U7及びU1核内低分子RNAは、その天然の役割がプレmRNAのスプライセオソーム処理における役割であり、数十年にわたって、所望の疾患標的でのスプライシングを変更するように再操作されてきた。(ヒストンプレmRNAのスペーサー要素に天然でハイブリダイズする)U7 snRNAの最初の18ntを、疾患遺伝子の短い標的化(又はアンチセンス)配列と置き換えることで、スプライシング機構をリダイレクトして、その標的部位の周囲のスプライシングを変化させる。更に、野生型U7 Smドメイン結合部位を、最適化されたコンセンサスSm結合配列(SmOPT)に変換することで、人工のアンチセンス操作されたU7 snRNAの発現レベル、活性、及び細胞内局在化を増加させることができる。多くのその後の群は、他の遺伝子のアンチセンス配列を有するこの修飾されたU7 SmOPT snRNAシャーシに適合され、スプライセオソーム要素を動員し、追加の疾患標的のためのRNAスプライシングを修飾する。
本開示の組成物及び方法は、核内低分子リボ核酸(snRNA)配列の一部分に作動可能に連結される、ガイドRNAをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。操作されたポリヌクレオチドは、核内低分子リボ核酸(snRNA)配列の少なくとも一部分を含み得る。U7及びU1核内低分子RNAは、その天然の役割がプレmRNAのスプライセオソーム処理における役割であり、数十年にわたって、所望の疾患標的でのスプライシングを変更するように再操作されてきた。(ヒストンプレmRNAのスペーサー要素に天然でハイブリダイズする)U7 snRNAの最初の18ntを、疾患遺伝子の短い標的化(又はアンチセンス)配列と置き換えることで、スプライシング機構をリダイレクトして、その標的部位の周囲のスプライシングを変化させる。更に、野生型U7 Smドメイン結合部位を、最適化されたコンセンサスSm結合配列(SmOPT)に変換することで、人工のアンチセンス操作されたU7 snRNAの発現レベル、活性、及び細胞内局在化を増加させることができる。多くのその後の群は、他の遺伝子のアンチセンス配列を有するこの修飾されたU7 SmOPT snRNAシャーシに適合され、スプライセオソーム要素を動員し、追加の疾患標的のためのRNAスプライシングを修飾する。
snRNAは、真核生物の核内に見られる小さなRNA分子の一種である。これらは、RNAスプライシング(プレmRNAからのイントロンの除去)、転写因子(7SK RNA)又はRNAポリメラーゼII(B2 RNA)の調節、及びテロメアの維持等の様々な重要なプロセスに関与する。それらは常に特定のタンパク質と会合し、得られるRNA-タンパク質複合体は、核内低分子リボ核タンパク質(snRNP)、又は時にスナープと称される。U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、及びU10と呼ばれる多くのsnRNAが存在する。
U7型のsnRNAは、通常、ヒストンmRNAの成熟に関与する。このsnRNAは、多数の真核生物種で特定されており(これまでに56種)、これらの種の各々のU7 snRNAは、本発明にとって同様に好都合であるとみなされるべきである。
野生型U7 snRNAは、ステムループ構造と、U7特異的Sm配列と、ヒストンプレmRNAの3’末端に対する配列アンチセンスと、を含む。
U7は、SmOPTドメインに加えて、ヒストンプレmRNAの3’末端に対する配列アンチセンスを含む。この配列が、別の標的プレmRNAに対してアンチセンスである標的化配列によって置き換えられる場合、U7は、新しい標的プレmRNAにリダイレクトされる。したがって、SmOPTドメインと標的化アンチセンス配列とを含有する修飾されたU7 snRNAの安定な発現は、mRNAスプライシングの特異的な変更を引き起こした。その天然のプロモーター及び3’要素とともに、適切に修飾されたマウスU7遺伝子を発現するAAV-2/1系ベクターは、マウスDmdエクソン23を覆い、スキッピングすることによって、骨格筋への高効率の遺伝子移行及び完全なジストロフィンレスキューを可能にしているが、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは(直接的に投与されるか、又は例えばAAVベクターを介して投与されるかにかかわらず)、デアミナーゼによる標的RNAの編集を容易にすることができる。
操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも部分的にsnRNA配列を含み得る。snRNA配列は、U1、U2、U3、U4、U5、U6、U7、U8、U9、又はU10 snRNA配列であり得る。
いくつかの場合において、snRNA配列の少なくとも一部分(例えば、snRNAプロモーター、snRNAヘアピン等)を含む操作されたポリヌクレオチドは、このような特徴を欠く同等のポリヌクレオチドと比較して、ある疾患又は状態を治療又は予防する優れた特性を有することができる。例えば、本明細書に記載されるように、snRNA配列の少なくとも一部分を含む操作されたポリヌクレオチドは、このような特徴を欠く同等のポリヌクレオチドと比較して、より高い効率でエクソンのエクソンスキッピングを容易にすることができる。更に、本明細書に記載されるように、snRNA配列の少なくとも一部分を含む操作されたポリヌクレオチドは、このような特徴を欠く同等のポリヌクレオチドと比較して、より高い効率で標的RNA(例えば、プレmRNA又は成熟RNA)におけるヌクレオチドの塩基の編集を容易にすることができる。
snRNAプロモーター
本開示の組成物及び方法は、snRNAプロモーターも含み得る、ガイドRNAをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドの転写を促進することができる。プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。例えば、プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列の5’末端又は3’末端に連結され得る。
本開示の組成物及び方法は、snRNAプロモーターも含み得る、ガイドRNAをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドの転写を促進することができる。プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。例えば、プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列の5’末端又は3’末端に連結され得る。
プロモーターは、転写を開始する前にRNAポリメラーゼが結合する、関連するコード配列に対して通常は上流(5’)の非コードゲノムDNA配列である。この結合は、特定の転写開始部位で転写が開始するように、RNAポリメラーゼをアラインメントする。プロモーターは、別の核酸断片の転写を制御することができる核酸断片を含む。プロモーターは、コード配列又は機能的RNAの発現を制御することができる。機能的RNAとしては、限定されないが、crRNA、tracrRNA、トランスファーRNA(tRNA)及びリボソームRNA(rRNA)が挙げられる。特定のプロモーターは、他のプロモーターよりも高い速度で、RNA合成を指示することができることが示されている。これらは、「強いプロモーター」と呼ばれている。特定の他のプロモーターは、特定の種類の細胞又は組織のみで、より高いレベルでRNA合成を指示することが示されており、プロモーターが、好ましくは特定の組織においてRNA合成を指示するが、他の組織において低いレベルで指示する場合には、「組織特異的プロモーター」又は「組織の好ましいプロモーター」と称されることが多い。生物に導入されたキメラ遺伝子(又は複数の遺伝子)の発現のパターンが、プロモーターを使用して制御されるため、特定の組織型又は特定の発達段階において特定のレベルでキメラ遺伝子又は(複数の遺伝子)の発現を制御することができる新規なプロモーターの単離に継続的な関心がある。
特定のプロモーターは、全ての組織にわたって比較的類似したレベルでRNA合成を指示することができる。これらは、「構成的プロモーター」又は「組織非依存的」プロモーターと呼ばれる。構成的プロモーターは、それらの有効性に応じて、強いプロモーター、中程度のプロモーター、及び弱いプロモーターに分割されて、直接的なRNA合成を行うことができる。多くの場合、キメラ遺伝子(又は複数の遺伝子)の所望の機能を得るために、キメラ遺伝子(又は複数の遺伝子)を異なる組織中で同時に発現させる必要があるため、構成的プロモーターは、この考察において特に有用である。
プロモーター配列は、U1、U2、U3、U4、U5、U6、及びU7プロモーター配列からなる群から選択されるプロモーター配列に対して少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有し得る。プロモーター配列は、U1、U2、U3、U4、U5、U6、又はU7プロモーター配列であり得る。
snRNAヘアピン及び追加の二次構造
本開示の組成物及び方法は、ヘアピン又は他の二次構造を含み得る、ガイドRNAをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。RNA中に存在するヘアピン及び他の二次構造は、RNA分子の安定性を増加させることができる。
本開示の組成物及び方法は、ヘアピン又は他の二次構造を含み得る、ガイドRNAをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。RNA中に存在するヘアピン及び他の二次構造は、RNA分子の安定性を増加させることができる。
本明細書に開示されるように、ヘアピンは、単一のRNA鎖がそれ自体で折り畳まれてRNA二本鎖を形成する、RNA二本鎖である。一本鎖RNA鎖は、互いに対して折り畳み領域塩基対の上流及び下流にヌクレオチド配列を有することに起因して、それ自体で折り畳まれる。ヘアピンは、二本鎖構造全体が10~500ヌクレオチド長を有し得る。ヘアピンのステムループ構造は、3~15ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたガイドRNAのいずれかに存在し得る。本明細書に開示される操作されたガイドRNAは、1~10個のヘアピンを有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドRNAは、1個のヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドRNAは、2個のヘアピンを有する。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピン又はヘアピン又は非動員ヘアピンを指し得る。ヘアピンは、本開示の操作されたガイドRNA内の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態において、1つ以上のヘアピンは、本開示の操作されたガイドRNAの3’末端に、本開示の操作されたガイドRNAの5’末端に、又は本開示の操作されたガイドRNAの標的化配列内に、又はこれらの任意の組み合わせに存在する。
動員ヘアピンは、本明細書に開示されるように、ADAR等のRNA編集エンティティを動員し得る。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、GluR2ドメイン又はそのバリアントである。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、Aluドメイン又はそのバリアントである。
非動員ヘアピンは、本明細書に開示されるように、標的RNAに対する操作されたガイドRNAの局在化を改善する機能性を示し得る。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、核保持性を改善する。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、U7 snRNA由来のヘアピンを含む。
ヘアピン及び他のRNA二次構造は、RNA塩基の分子内相互作用によって形成され、ワトソン-クリック塩基対形成によって塩基対形成を形成する。
「ヘアピンループ」という用語は、それ自体が戻ってループ形成し、ドメインの相補的結合によって閉じられる一本鎖領域を指す。
ヘアピンは、スプライセオソームsnRNA、非スプライセオソームsnRNA配列、又はこれらの任意の組み合わせに由来する配列を含み得る。ヘアピンは、スプライセオソーム又は非スプライセオソームsnRNA配列に対して少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含み得る。
スプライセオソーム又は非スプライセオソームsnRNA配列は、U1、U2、U4、U5、U6、U7、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも一部分を含み得る。snRNAは、配列番号34~配列番号39のプロモーター配列のうちのいずれか1つに対して少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有し得る。
snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピン二次構造を形成する配列を含み得る。いくつかの場合において、配列は、U7ヘアピンの配列に対して少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を有し得る。
他の二次構造は、操作されたポリヌクレオチドに付加され得る。付加される二次構造は、限定されないが、hnRNPA1及びその変異態様、SIRLOIN核タグ、MALAT1 MG断片、及び追加の不活性二次構造を含むCas9 gRNAであり得る。
標的化配列
本開示のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、目的の領域に対して上述の構築物を向かわせる標的化配列を含む。標的化配列は、目的の配列に対して少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチドの配列を含んでいてもよく、それによって、標的配列に対してハイブリダイズする手段を提供する。
本開示のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、目的の領域に対して上述の構築物を向かわせる標的化配列を含む。標的化配列は、目的の配列に対して少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチドの配列を含んでいてもよく、それによって、標的配列に対してハイブリダイズする手段を提供する。
ポリヌクレオチド、及びそれを含む組成物が本明細書で提供される。ある態様において、ポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集のために、例えば、疾患又は状態を予防又は治療するために利用され得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドを、主題のRNA編集エンティティと会合した状態で使用して、標的RNAを編集するか、又は標的RNAによってコードされるポリペプチドの発現を調節することができる。ある実施形態において、本明細書に開示される組成物は、ADAR若しくはADATポリペプチド等の主題のRNA編集エンティティ、又はそれらの生物学的に活性な断片によって、編集を容易にすることができる操作されたポリヌクレオチドを含み得る。
操作されたポリヌクレオチドは、RNA標的化に好適な任意の方法で操作され得る。ある態様において、操作されたポリヌクレオチドは、一般に、標的RNAの領域に対してハイブリダイズすることが可能な標的化配列を少なくとも含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的化ドメイン又は標的化領域とも称され得る。
ある態様において、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列は、操作されたポリヌクレオチドに、ワトソンークリック塩基対形成等の塩基対形成によってRNA配列を標的とすることを可能にする。ある実施形態において、標的化配列は、操作されたポリヌクレオチドのN末端又はC末端のいずれかに位置し得る。いくつかの場合において、標的化配列は、両端に位置する。標的化配列は、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、標的化配列は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、又は最大約200ヌクレオチド長である。ある実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、約25~200、50~150、75~100、80~110、90~120、又は95~115ヌクレオチド長である標的化配列を含む。ある実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、約100ヌクレオチド長である標的化配列を含む。
いくつかの場合において、主題の標的化配列は、主題のポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的RNAの領域に対して少なくとも部分的な配列相補性を含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNAに対して95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の配列相補性を含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNA配列に対して100%未満の相補性を含む。例えば、標的化配列、及び標的化配列によって結合され得る標的RNAの領域は、単一塩基ミスマッチを有し得る。他の場合において、主題の操作されたポリヌクレオチドの標的化配列は、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、30、40、又は最大約50塩基ミスマッチを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチドミスマッチは、本明細書で提供される構造的特徴と関連し得る。いくつかの態様において、標的化配列は、主題の標的RNAの野生型RNAと相補性が異なる少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は最大約15ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNA配列に対して相補性を有する少なくとも50ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNA配列に対して相補性を有する50~150ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNA配列に対して相補性を有する50~200ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNA配列に対して相補性を有する50~250ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNA配列に対して相補性を有する50~300ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的RNAに対して相補性を有する50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、又は300ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で50より多いヌクレオチドを含み、標的RNA配列に対して相補性を有する少なくとも50のヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で50~400ヌクレオチドを含み、標的RNA配列に対して相補性を有する50~150ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で50~400ヌクレオチドを含み、標的RNA配列に対して相補性を有する50~200ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で50~400ヌクレオチドを含み、標的RNA配列に対して相補性を有する50~250ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で50~400ヌクレオチドを含み、標的RNA配列に対して相補性を有する50~300ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的RNAに対して相補性を有する少なくとも50ヌクレオチドは、1つ以上のミスマッチ、1つ以上のバルジ、又は1つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的RNAに対して相補性を有する50~150ヌクレオチドは、1つ以上のミスマッチ、1つ以上のバルジ、又は1つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的RNAに対して相補性を有する50~200ヌクレオチドは、1つ以上のミスマッチ、1つ以上のバルジ、又は1つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的RNAに対して相補性を有する50~250ヌクレオチドは、1つ以上のミスマッチ、1つ以上のバルジ、又は1つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的RNAに対して相補性を有する50~300ヌクレオチドは、1つ以上のミスマッチ、1つ以上のバルジ、又は1つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。例えば、標的化配列は、合計で54ヌクレオチドを含み、連続して、25ヌクレオチドが、標的RNAに対して相補的であり、4ヌクレオチドがバルジを形成し、25ヌクレオチドが、標的RNAに対して相補的である。別の例として、標的化配列は、合計で118ヌクレオチドを含み、連続して、25ヌクレオチドが、標的RNAに対して相補的であり、4ヌクレオチドがバルジを形成し、25ヌクレオチドが、標的RNAに対して相補的であり、14ヌクレオチドがループを形成し、50ヌクレオチドが、標的RNAに対して相補的である。
いくつかの場合において、標的RNAに結合した本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ADARを動員し、それ自体がADARのための基質である二本鎖RNAを形成する。
いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、複数の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド中の1つ以上の標的配列ドメインは、標的RNAの1つ以上の領域に結合し得る。例えば、第1の標的化配列は、標的RNAの第1の領域(例えば、プレmRNAの第1のエクソン)に対して少なくとも部分的に相補的であるように構成されていてもよく、一方で、第2の標的化配列は、標的RNAの第2の領域(例えば、プレmRNAの第2のエクソン)に対して少なくとも部分的に相補的であるように構成されていてもよい。いくつかの場合において、複数の標的領域を操作可能に連結して、標的RNAの複数の領域の連続ハイブリダイゼーションを提供することができる。いくつかの場合において、複数の標的領域は、標的RNAの複数の領域の非連続ハイブリダイゼーションを提供することができる。「非連続」オーバーラップ又はハイブリダイゼーションは、第2の標的化配列による標的RNAの第2の領域のハイブリダイゼーションとともに、第1の標的化配列による標的RNAの第1の領域のハイブリダイゼーションであって、標的RNAの第1の領域及び第2の領域が非連続である(例えば、標的RNAの第1の領域と第2の領域との間に介在配列が存在する)ものを指すことができる。例えば、標的化配列は、第1のエクソンの一部分に結合するように構成されてもよく、第2のエクソンの一部分に結合するように構成される第2の標的化配列を含んでいてもよく、一方で、エクソン1の一部分とエクソン2の一部分との間の介在配列が、標的化配列又はオリゴテザーのいずれかによってハイブリダイズされない。非連続ハイブリダイゼーションのために構成される本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドの使用は、多くの利点を提供することができる。例えば、このようなガイドは、転写中(又はその後すぐに)プレmRNAを潜在的に標的とすることができ、次いでデアミナーゼ(例えば、ADAR)を共転写的に使用する化学修飾を容易にし、したがって、化学修飾の全体的な効率を増加させることができる。更に、介在配列をスキッピングしつつ、非連続ハイブリダイゼーションを有するポリヌクレオチドを使用して、オフターゲット編集がより少ない、より短く、より特異的なガイドRNAを得ることができる。
いくつかの場合において、標的RNAに対する非連続ハイブリダイゼーションのために構成された操作されたポリヌクレオチドは、介在配列によって分離された別個の領域又は標的RNAに結合するように構成され得る。いくつかの場合では、介在配列は、少なくとも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、又は10000塩基であり得る。いくつかの場合において、標的化配列は、同じイントロン又はエクソンの別個の非連続領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、標的化配列は、隣接するエクソン又はイントロンの別個の非連続領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、標的化配列は、遠位のエクソン又はイントロンの別個の非連続領域を標的とすることができる。
動員領域
ある態様において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティ動員ドメインを含む。RNA編集エンティティは、操作されたポリヌクレオチド上のRNA編集エンティティ動員ドメインによって動員され得る。いくつかの場合において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、主題の標的RNAの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、主題の標的RNAによってコードされるポリペプチドの調節発現、又はその両方を容易にするように構成される。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、主題のRNA編集エンティティによるRNAの領域のヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集を容易にするために、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティを動員し得る。特定の実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティ動員ドメインを欠いている。いずれにせよ、主題の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティに結合するか、又はRNA編集エンティティによって結合されることが可能であり、主題の標的RNAの編集を容易にする。
ある態様において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティ動員ドメインを含む。RNA編集エンティティは、操作されたポリヌクレオチド上のRNA編集エンティティ動員ドメインによって動員され得る。いくつかの場合において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、主題の標的RNAの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、主題の標的RNAによってコードされるポリペプチドの調節発現、又はその両方を容易にするように構成される。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、主題のRNA編集エンティティによるRNAの領域のヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集を容易にするために、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティを動員し得る。特定の実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティ動員ドメインを欠いている。いずれにせよ、主題の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティに結合するか、又はRNA編集エンティティによって結合されることが可能であり、主題の標的RNAの編集を容易にする。
いくつかの例において、主題の標的化配列は、RNA編集エンティティ動員ドメインを含む。RNA編集エンティティは、操作されたポリヌクレオチド上のRNA編集エンティティ動員ドメインによって動員され得る。いくつかの例において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、主題の標的RNAの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、主題の標的RNAによってコードされるポリペプチドの調節発現、又はその両方を容易にするように構成される。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、主題のRNA編集エンティティによるRNAの領域のヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集を容易にするために、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、RNA編集エンティティを動員し得る。
様々なRNA編集エンティティ動員ドメインを利用することができる。いくつかの例において、動員ドメインは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体AMPA型サブユニット2(GluR2)、APOBEC、MS2-バクテリオファージコートタンパク質動員ドメイン、Alu、TALEN動員ドメイン、Zn-フィンガーポリペプチド動員ドメイン、メガ-TAL動員ドメイン、又はCas13動員ドメイン、これらの組み合わせ、又はこれらの修飾された態様を含む。いくつかの例において、1つより多い動員ドメインが、本開示の操作されたポリヌクレオチド中に含まれ得る。動員配列が存在する例において、動員配列を利用して、標的化配列(例えば、標的RNAに対して少なくとも部分的に相補的である標的化配列の一部分)の後の主題の標的RNAと効果的に反応させるようにRNA編集エンティティを配置し、標的RNAにハイブリダイズすることができる。いくつかの場合において、動員配列は、操作されたポリヌクレオチドに対するRNA編集エンティティの一過性の結合を可能にし得る。いくつかの例において、動員配列は、操作されたポリヌクレオチドに対するRNA編集エンティティの永続的結合を可能にする。動員配列は、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、動員配列は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、最大約80ヌクレオチド長である。いくつかの場合において、動員配列は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、又は80ヌクレオチド長以下である。いくつかの場合において、動員配列は、約45ヌクレオチド長である。いくつかの場合において、動員配列の少なくとも一部分は、少なくとも1~約75ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、動員配列の少なくとも一部分は、約45ヌクレオチド~約60ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、RNA編集エンティティ動員ドメインは、GluR2配列、そのバリアント、又は機能的断片を含む。いくつかの場合において、GluR2配列は、RNA編集エンティティ、例えば、ADAR又はその生物学的に活性な断片によって認識することができる。いくつかの実施形態において、GluR2配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの場合において、GluR2配列は、例えば、増強された動員のために修飾され得る。いくつかの実施形態において、GluR2配列は、天然に存在するGluR2配列及び合成配列の一部分を含み得る。
いくつかの例において、動員ドメインは、GluR2配列、又はGUGGAAUAGUAUAACAAUAUGCUAAAUGUUGUUAUAGUAUCCCAC(配列番号49)に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、98%、99%、又は100%の同一性を有する配列を含む。いくつかの例において、動員ドメインは、配列番号49の少なくとも約10、15、20、25、又は30ヌクレオチドに対して少なくとも約80%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、動員ドメインは、配列番号49に対して少なくとも約90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列相同性を含み得る。
いくつかの例において、動員ドメインは、CRISPR関連動員ドメイン配列を含む。例えば、CRISPR関連動員配列は、Casタンパク質配列を含み得る。いくつかの場合において、Cas13動員ドメインは、Cas13a動員ドメイン、Cas13b動員ドメイン、Cas13c動員ドメイン、又はCas13d動員ドメインを含み得る。いくつかの例において、RNA編集エンティティ動員ドメインは、Cas13b動員ドメインの少なくとも約20核酸に対して少なくとも約80%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、RNA編集エンティティ動員ドメインは、Cas13bドメインコード配列に対して少なくとも約80%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、RNA編集エンティティ動員ドメインは、Cas13b動員ドメインの少なくとも約15、20、25、30、又は35核酸に対して少なくとも約80%、85%、90%、又は95%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、RNA編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Cas13bドメインコード配列に対して少なくとも約80%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、RNA編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Cas13bドメインコード配列に対して少なくとも約85%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、RNA編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Cas13bドメインコード配列に対して少なくとも約90%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、RNA編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Cas13bドメインコード配列に対して少なくとも約95%の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、Cas13bドメインコード配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの例において、Cas13bドメインコード配列は、修飾された部分を含み得る。いくつかの例において、Cas13bドメインコード配列は、天然に存在するCas13bドメインコード配列の一部分を含み得る。
任意の数の動員配列は、本開示の操作されたポリヌクレオチド中に見出され得る。いくつかの例において、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は最大約10の動員配列が、操作されたポリヌクレオチド中に含まれる。動員配列は、主題のポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得る。いくつかの場合において、動員配列は、ポリヌクレオチドのN末端、中央、又はC末端上にある。動員配列は、標的化配列の上流又は下流であり得る。いくつかの場合において、動員配列は、主題のポリヌクレオチドの標的化配列に隣接する。動員配列は、全てのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含み得るが、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを両方とも含む動員配列は、除外されない。
いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、動員領域を欠いており、RNA編集エンティティの動員は、操作されたポリヌクレオチド及び標的RNAによって形成される二本鎖基質によって実現される。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的RNA分子に結合していないときに、RNA編集エンティティを動員しない。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的RNA分子に結合していないときに、RNA編集エンティティに結合する場合、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、約500nM以上の解離定数で結合する。いくつかの例において、解離定数は、約22nMである。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的RNA分子に結合していないときに、構造的特徴を欠いている。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的RNA分子に結合していないときに、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを欠いている。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的RNA分子に結合していないときに、線形であり、任意の構造的特徴を含まない。
動員配列が存在しない場合、操作されたポリヌクレオチドは、標的RNAの編集を容易にし、及び/又は主題の標的RNAによってコードされるポリペプチドの発現を調節するために、主題のRNA編集エンティティ(例えば、ADAR)と依然として会合することが可能である。このことは、構造的特徴によって達成され得る。構造的特徴は、ミスマッチ、対称バルジ、非対称バルジ、対称内部ループ、非対称内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、構造化モチーフ、環状化RNA、化学修飾、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つを含み得る。ある態様において、二本鎖RNA(dsRNA)基質、例えば、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖は、標的RNAに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成し得る。本開示のdsRNA基質中に存在し得るいくつかの構造的特徴の1つに対応する特徴が本明細書に記載される。特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ(対称バルジ若しくは非対称バルジ)、内部ループ(対称内部ループ若しくは非対称内部ループ)、又はヘアピン(動員ヘアピン若しくは非標的化ドメインを含むヘアピン)が挙げられる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、1~50個の特徴を有し得る。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、1~5、5~10、10~15、15~20、20~25、25~30、30~35、35~40、40~45、45~50、5~20、1~3、4~5、2~10、20~40、10~40、20~50、30~50、4~7、又は8~10個の特徴を有し得る。
本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、dsRNA基質中に2つ以上の特徴を含む。
二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたガイドRNAのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書で開示されるように、ミスマッチは、dsRNA内の標的RNA中の対向するヌクレオチドに対して対形成していないガイドRNA中のヌクレオチドを指す。ミスマッチは、塩基対を形成しないか、相補的ではないか、又は両方である任意の2つのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、A/Cミスマッチである。A/Cミスマッチは、標的RNA中のAと対向する本開示の操作されたガイドRNA中にCを含み得る。A/Cミスマッチは、標的RNA中のCと対向する本開示の操作されたガイドRNA中にAを含み得る。ある実施形態において、G/Gミスマッチは、標的RNA中のGと対向する本開示の操作されたガイドRNA中にGを含み得る。いくつかの実施形態において、編集部位の5’に配置されるミスマッチは、編集される標的Aの塩基フリッピングを容易にし得る。ミスマッチは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。ある実施形態において、ミスマッチは、G/Gミスマッチを含む。ある実施形態において、ミスマッチは、A/Cミスマッチを含み、Aは標的RNA中にあり、Cは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列中にある。別の実施形態において、A/Cミスマッチ中のAは、主題のRNA編集エンティティによって編集される標的RNA中のヌクレオチドの塩基である。
本明細書に記載されるミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端に対して近位の距離に位置し得る。いくつかの場合において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端に対して、約1塩基~約200塩基、約2塩基~約200塩基、約3塩基~約200塩基、約4塩基~約200塩基、約5塩基~約200塩基、約6塩基~約200塩基、約7塩基~約200塩基、約8塩基~約200塩基、約9塩基~約200塩基、約10塩基~約200塩基、約11塩基~約200塩基、約12塩基~約200塩基、約13塩基~約200塩基、約14塩基~約200塩基、約15塩基~約200塩基、約16塩基~約200塩基、約17塩基~約200塩基、約18塩基~約200塩基、約19塩基~約200塩基、約20塩基~約200塩基、約21塩基~約200塩基、約22塩基~約200塩基、約23塩基~約200塩基、約24塩基~約200塩基、約25塩基~約200塩基、約26塩基~約200塩基、約27塩基~約200塩基、約28塩基~約200塩基、約29塩基~約200塩基、約30塩基~約200塩基、約31塩基~約200塩基、約32塩基~約200塩基、約33塩基~約200塩基、約34塩基~約200塩基、約35塩基~約200塩基、約36塩基~約200塩基、約37塩基~約200塩基、約38塩基~約200塩基、約39塩基~約200塩基、約40塩基~約200塩基、約41塩基~約200塩基、約42塩基~約200塩基、約43塩基~約200塩基、約44塩基~約200塩基、約45塩基~約200塩基、約46塩基~約200塩基、約47塩基~約200塩基、約48塩基~約200塩基、約49塩基~約200塩基、約50塩基~約200塩基、約51塩基~約200塩基、約52塩基~約200塩基、約53塩基~約200塩基、約54塩基~約200塩基、約55塩基~約200塩基、約56塩基~約200塩基、約57塩基~約200塩基、約58塩基~約200塩基、約59塩基~約200塩基、約60塩基~約200塩基、約61塩基~約200塩基、約62塩基~約200塩基、約63塩基~約200塩基、約64塩基~約200塩基、約65塩基~約200塩基、約66塩基~約200塩基、約67塩基~約200塩基、約68塩基~約200塩基、約69塩基~約200塩基、約70塩基~約200塩基、約71塩基~約200塩基、約72塩基~約200塩基、約73塩基~約200塩基、約74塩基~約200塩基、約75塩基~約200塩基、約76塩基~約200塩基、約77塩基~約200塩基、約78塩基~約200塩基、約79塩基~約200塩基、約80塩基~約200塩基、約81塩基~約200塩基、約82塩基~約200塩基、約83塩基~約200塩基、約84塩基~約200塩基、約85塩基~約200塩基、約86塩基~約200塩基、約87塩基~約200塩基、約88塩基~約200塩基、約89塩基~約200塩基、約90塩基~約200塩基、約91塩基~約200塩基、約92塩基~約200塩基、約93塩基~約200塩基、約94塩基~約200塩基、約95塩基~約200塩基、約96塩基~約200塩基、約97塩基~約200塩基、約98塩基~約200塩基、約99塩基~約200塩基、約100塩基~約200塩基、約101塩基~約200塩基、約102塩基~約200塩基、約103塩基~約200塩基、約104塩基~約200塩基、約105塩基~約200塩基、約106塩基~約200塩基、約107塩基~約200塩基、約108塩基~約200塩基、約109塩基~約200塩基、約110塩基~約200塩基、約111塩基~約200塩基、約112塩基~約200塩基、約113塩基~約200塩基、約114塩基~約200塩基、約115塩基~約200塩基、約116塩基~約200塩基、約117塩基~約200塩基、約118塩基~約200塩基、約119塩基~約200塩基、約120塩基~約200塩基、約121塩基~約200塩基、約122塩基~約200塩基、約123塩基~約200塩基、約124塩基~約200塩基、約125塩基~約200塩基、約126塩基~約200塩基、約127塩基~約200塩基、約128塩基~約200塩基、約129塩基~約200塩基、約130塩基~約200塩基、約131塩基~約200塩基、約132塩基~約200塩基、約133塩基~約200塩基、約134塩基~約200塩基、約135塩基~約200塩基、約136塩基~約200塩基、約137塩基~約200塩基、約138塩基~約200塩基、約139塩基~約200塩基、約140塩基~約200塩基、約141塩基~約200塩基、約142塩基~約200塩基、約143塩基~約200塩基、約144塩基~約200塩基、約145塩基~約200塩基、約146塩基~約200塩基、約147塩基~約200塩基、約148塩基~約200塩基、約149塩基~約200塩基、約150塩基~約200塩基、約151塩基~約200塩基、約152塩基~約200塩基、約153塩基~約200塩基、約154塩基~約200塩基、約155塩基~約200塩基、約156塩基~約200塩基、約157塩基~約200塩基、約158塩基~約200塩基、約159塩基~約200塩基、約160塩基~約200塩基、約161塩基~約200塩基、約162塩基~約200塩基、約163塩基~約200塩基、約164塩基~約200塩基、約165塩基~約200塩基、約166塩基~約200塩基、約167塩基~約200塩基、約168塩基~約200塩基、約169塩基~約200塩基、約170塩基~約200塩基、約171塩基~約200塩基、約172塩基~約200塩基、約173塩基~約200塩基、約174塩基~約200塩基、約175塩基~約200塩基、約176塩基~約200塩基、約177塩基~約200塩基、約178塩基~約200塩基、約179塩基~約200塩基、約180塩基~約200塩基、約181塩基~約200塩基、約182塩基~約200塩基、約183塩基~約200塩基、約184塩基~約200塩基、約185塩基~約200塩基、約186塩基~約200塩基、約187塩基~約200塩基、約188塩基~約200塩基、約189塩基~約200塩基、約190塩基~約200塩基、約191塩基~約200塩基、約192塩基~約200塩基、約193塩基~約200塩基、約194塩基~約200塩基、約195塩基~約200塩基、約196塩基~約200塩基、約197塩基~約200塩基、約198塩基~約200塩基、又は約199塩基~約200塩基の距離に位置し得る。いくつかの場合において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から少なくとも1塩基、少なくとも2塩基、少なくとも3塩基、少なくとも4塩基、少なくとも5塩基、少なくとも6塩基、少なくとも7塩基、少なくとも8塩基、少なくとも9塩基、少なくとも10塩基、少なくとも11塩基、少なくとも12塩基、少なくとも13塩基、少なくとも14塩基、少なくとも15塩基、少なくとも16塩基、少なくとも17塩基、少なくとも18塩基、少なくとも19塩基、少なくとも20塩基、少なくとも21塩基、少なくとも22塩基、少なくとも23塩基、少なくとも24塩基、少なくとも25塩基、少なくとも26塩基、少なくとも27塩基、少なくとも28塩基、少なくとも29塩基、少なくとも30塩基、少なくとも31塩基、少なくとも32塩基、少なくとも33塩基、少なくとも34塩基、少なくとも35塩基、少なくとも36塩基、少なくとも37塩基、少なくとも38塩基、少なくとも39塩基、少なくとも40塩基、少なくとも41塩基、少なくとも42塩基、少なくとも43塩基、少なくとも44塩基、少なくとも45塩基、少なくとも46塩基、少なくとも47塩基、少なくとも48塩基、少なくとも49塩基、少なくとも50塩基、少なくとも51塩基、少なくとも52塩基、少なくとも53塩基、少なくとも54塩基、少なくとも55塩基、少なくとも56塩基、少なくとも57塩基、少なくとも58塩基、少なくとも59塩基、少なくとも60塩基、少なくとも61塩基、少なくとも62塩基、少なくとも63塩基、少なくとも64塩基、少なくとも65塩基、少なくとも66塩基、少なくとも67塩基、少なくとも68塩基、少なくとも69塩基、少なくとも70塩基、少なくとも71塩基、少なくとも72塩基、少なくとも73塩基、少なくとも74塩基、少なくとも75塩基、少なくとも76塩基、少なくとも77塩基、少なくとも78塩基、少なくとも79塩基、少なくとも80塩基、少なくとも81塩基、少なくとも82塩基、少なくとも83塩基、少なくとも84塩基、少なくとも85塩基、少なくとも86塩基、少なくとも87塩基、少なくとも88塩基、少なくとも89塩基、少なくとも90塩基、少なくとも91塩基、少なくとも92塩基、少なくとも93塩基、少なくとも94塩基、少なくとも95塩基、少なくとも96塩基、少なくとも97塩基、少なくとも98塩基、少なくとも99塩基、少なくとも100塩基、少なくとも101塩基、少なくとも102塩基、少なくとも103塩基、少なくとも104塩基、少なくとも105塩基、少なくとも106塩基、少なくとも107塩基、少なくとも108塩基、少なくとも109塩基、少なくとも110塩基、少なくとも111塩基、少なくとも112塩基、少なくとも113塩基、少なくとも114塩基、少なくとも115塩基、少なくとも116塩基、少なくとも117塩基、少なくとも118塩基、少なくとも119塩基、少なくとも120塩基、少なくとも121塩基、少なくとも122塩基、少なくとも123塩基、少なくとも124塩基、少なくとも125塩基、少なくとも126塩基、少なくとも127塩基、少なくとも128塩基、少なくとも129塩基、少なくとも130塩基、少なくとも131塩基、少なくとも132塩基、少なくとも133塩基、少なくとも134塩基、少なくとも135塩基、少なくとも136塩基、少なくとも137塩基、少なくとも138塩基、少なくとも139塩基、少なくとも140塩基、少なくとも141塩基、少なくとも142塩基、少なくとも143塩基、少なくとも144塩基、少なくとも145塩基、少なくとも146塩基、少なくとも147塩基、少なくとも148塩基、少なくとも149塩基、少なくとも150塩基、少なくとも151塩基、少なくとも152塩基、少なくとも153塩基、少なくとも154塩基、少なくとも155塩基、少なくとも156塩基、少なくとも157塩基、少なくとも158塩基、少なくとも159塩基、少なくとも160塩基、少なくとも161塩基、少なくとも162塩基、少なくとも163塩基、少なくとも164塩基、少なくとも165塩基、少なくとも166塩基、少なくとも167塩基、少なくとも168塩基、少なくとも169塩基、少なくとも170塩基、少なくとも171塩基、少なくとも172塩基、少なくとも173塩基、少なくとも174塩基、少なくとも175塩基、少なくとも176塩基、少なくとも177塩基、少なくとも178塩基、少なくとも179塩基、少なくとも180塩基、少なくとも181塩基、少なくとも182塩基、少なくとも183塩基、少なくとも184塩基、少なくとも185塩基、少なくとも186塩基、少なくとも187塩基、少なくとも188塩基、少なくとも189塩基、少なくとも190塩基、少なくとも191塩基、少なくとも192塩基、少なくとも193塩基、少なくとも194塩基、少なくとも195塩基、少なくとも196塩基、少なくとも197塩基、少なくとも198塩基、少なくとも199塩基、又は少なくとも200塩基の距離に位置し得る。
ある態様において、構造的特徴は、独立して、操作されたポリヌクレオチド中に形成し得る。他の場合において、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的RNAに結合するときに形成し得る。構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが、ペプチド、ヌクレオチド、又は小分子等の他の分子と会合するときにも形成し得る。特定の実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの構造的特徴は、標的RNAとは独立して形成することができ、その構造は、標的RNA領域との操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として変化し得る。特定の実施形態において、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的RNAと会合しているときに存在する。
いくつかの場合において、構造的特徴は、ヘアピンである。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインを欠いていてもよい。他の場合において、操作されたポリヌクレオチドは、1個のヘアピンドメイン、又は1個より多いヘアピンドメインを含有し得る。ヘアピンは、ポリヌクレオチド中の任意の場所に位置し得る。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、単一のRNA鎖がそれ自体で折り畳まれてRNA二本鎖を形成する、RNA二本鎖である。一本鎖RNA鎖は、互いに対して折り畳み領域塩基対の上流及び下流にヌクレオチド配列を有することに起因して、それ自体で折り畳まれる。ヘアピンは、二本鎖構造全体が10~500ヌクレオチド長を有し得る。ヘアピンのステムループ構造は、3~15ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドのいずれかに存在し得る。本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、1~10個のヘアピンを有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、1個のヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、2個のヘアピンを有する。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピン又はヘアピン又は非動員ヘアピンを指し得る。ヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチド内の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態において、1つ以上のヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチドの3’末端に、本開示の操作されたポリヌクレオチドの5’末端に、又は本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内に、又はこれらの任意の組み合わせに存在する。
一態様において、構造的特徴は、本明細書に開示されるように、動員ヘアピンを含む。動員ヘアピンは、ADAR等のRNA編集エンティティを動員し得る。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、GluR2ドメイン又はそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、Aluドメイン又はそのバリアントを含む。
更に別の態様において、構造的特徴は、非動員ヘアピンを含む。非動員ヘアピンは、本明細書に開示されるように、標的RNAに対する操作されたポリヌクレオチドの局在化を改善する機能性を示し得る。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、核保持性を改善する。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、U7 snRNA由来のヘアピンを含む。
別の態様において、構造的特徴は、ゆらぎ塩基を含む。ゆらぎ塩基対は、弱く対形成する2つの塩基を指す。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Uと対形成したGを指してもよい。
本開示のヘアピンは、任意の長さのものであり得る。ある態様において、ヘアピンは、約5~200個、又はそれより多くのヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、ヘアピンは、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、又は400個、又はそれより多くのヌクレオチドを含み得る。他の場合において、ヘアピンはまた、5~10、5~20、5~30、5~40、5~50、5~60、5~70、5~80、5~90、5~100、5~110、5~120、5~130、5~140、5~150、5~160、5~170、5~180、5~190、5~200、5~210、5~220、5~230、5~240、5~250、5~260、5~270、5~280、5~290、5~300、5~310、5~320、5~330、5~340、5~350、5~360、5~370、5~380、5~390、又は5~400個のヌクレオチドを含み得る。ヘアピンは、ヌクレオチドループによって分離された二本鎖ハイブリダイズされたRNAからなる二本鎖RNAモチーフ/構造へとハイブリダイズするために、自身に対して十分な相補性を有するRNAの一本鎖から形成される構造的特徴である。
いくつかの場合において、構造的特徴は、バルジである。バルジは、標的鎖と操作されたポリヌクレオチド鎖との間の単一の(意図的な)核酸ミスマッチを含み得る。他の場合において、鎖間の1個より多い連続ミスマッチは、バルジ領域(塩基のミスマッチ伸長部)が、ハイブリダイズされた相補的dsRNA領域の両側に隣接している限り、バルジを構成する。バルジは、ポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得る。いくつかの場合において、バルジは、5’ヒドロキシル又は3’ヒドロキシルから約30~約70ヌクレオチドに位置する。
ある実施形態において、二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、バルジは、dsRNA基質の形成時に形成される構造を指し、操作されたポリヌクレオチド又は標的RNAのいずれかの中のヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではない。バルジは、dsRNA基質の二次構造又は三次構造を変化させ得る。バルジは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側、又はdsRNA基質の標的RNA側に1~4個のヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、2個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、3個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、4個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、dsRNA基質中のバルジの存在は、標的RNA中の標的Aを選択的に編集し、非標的のオフターゲット編集を低減するようにADARを配置し得る。いくつかの実施形態において、dsRNA基質中のバルジの存在は、追加のADARを動員し得る。本明細書に開示されるdsRNA基質中のバルジは、他のRNA編集エンティティ等の他のタンパク質を動員し得る。いくつかの実施形態において、編集部位の5’に配置されるバルジは、編集される標的Aの塩基フリッピングを容易にし得る。バルジは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。バルジは、標的Aの選択的な編集をもたらす方向に制約することによって、ADAR編集を指示するのに役立ち得る。
ある態様において、二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。バルジは、対称バルジ又は非対称バルジであり得る。バルジは、dsRNA基質のガイドRNA側又は標的RNA側のいずれかにある1~4個の参加するヌクレオチドによって形成され得る。対称バルジは、バルジの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。対称バルジは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側、又はdsRNA基質の標的RNA側に2~4個のヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のdsRNA基質中の対称バルジは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的RNA側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称バルジは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある2個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある2個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある3個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある3個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある4個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。
二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたガイドRNAのハイブリダイゼーション時に形成される。バルジは、対称バルジ又は非対称バルジであり得る。非対称バルジは、バルジの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。非対称バルジは、dsRNA基質のガイドRNA側又は標的RNA側のいずれかに1~4個の参加するヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のdsRNA基質中の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側又は標的RNA側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある1個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある1個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある2個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある2個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある3個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある3個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある0個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある1個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある2個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある1個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある2個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある1個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある3個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある1個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある3個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある1個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある1個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある2個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある3個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある2個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある3個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある2個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある2個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある3個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、dsRNA基質の標的RNA側にある3個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたガイドRNA側にある4個のヌクレオチドとによって形成され得る。
ある態様において、二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、内部ループは、dsRNA基質の形成時に形成される構造を指し、操作されたポリヌクレオチド又は標的RNAのいずれかの中のヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではなく、dsRNA基質の標的RNA側又は操作されたポリヌクレオチド側のいずれかにある、内部ループの一方の側は、5個より多いヌクレオチドを有する。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的RNA中の標的Aの塩基フリッピングに役立ち得る。二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。対称内部ループは、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のdsRNA基質中の対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的RNA側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある6個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある7個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある8個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある8個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある9個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある9個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある10個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある10個のヌクレオチドとによって形成され得る。dsRNA基質の標的RNA側又は操作されたポリヌクレオチド側のいずれかにある、内部ループの一方の側は、5~150個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、120、135、140、145、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、又は1000個のヌクレオチド、又はその間の任意の数のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、5個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、10個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、15個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、20個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、25個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、30個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、35個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、40個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、45個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、50個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、55個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、60個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、65個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、70個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、75個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、80個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、85個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、90個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、95個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、100個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、110個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、120個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、130個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、140個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、150個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、200個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、250個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、300個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、350個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、400個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、450個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、500個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、600個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、700個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、800個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、900個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、1000個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的RNA中の標的Aの塩基フリッピングに役立ち得る。二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。対称内部ループは、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のdsRNA基質中の対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的RNA側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある5~150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある5~150個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、dsRNA標的の操作された側及びdsRNA基質の標的RNA側で同じである。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある5~1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある5~1000個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、dsRNA標的の操作された側及びdsRNA基質の標的RNA側で同じである。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある6個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある7個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある8個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある8個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある9個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある9個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある10個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある10個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある15個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある15個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある20個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある20個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある30個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある30個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある40個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある40個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある60個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある60個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある70個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある70個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある80個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある80個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある90個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある90個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある110個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある110個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある120個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある120個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある130個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある130個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある140個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある140個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA
側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある250個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある250個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある350個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある350個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある450個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある450個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある600個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある600個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある700個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある700個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある800個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある800個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある900個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある900個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。
側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある250個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある250個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある350個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある350個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある450個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある450個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある600個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある600個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある700個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある700個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある800個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある800個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある900個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある900個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、dsRNA標的の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。
ある態様において、二本鎖RNA(dsRNA)基質は、標的RNAに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。非対称内部ループは、内部ループの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のdsRNA基質中の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的RNA側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5~150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある5~150個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、dsRNA標的の操作された側で、dsRNA基質の標的RNA側でのヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5~1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある5~1000個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、dsRNA標的の操作された側で、dsRNA基質の標的RNA側でのヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある6個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある6個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある7個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある7個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある8個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある8個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある9個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある9個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある10個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある10個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある7個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある7個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある8個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある8個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある9個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある9個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある10個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある6個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある10個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある8個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある8個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある9個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある9個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある10個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある7個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある10個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある8個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある9個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある8個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある9個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある8個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある10個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある8個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある10個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある9個のヌクレオチドと、dsRNA基質の標的RNA側にある10個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある9個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある10個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある5個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある
400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。
400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある50個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある50個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある100個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある100個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある150個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある5個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある150個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある200個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある200個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある300個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある300個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある400個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある400個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある500個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある1000個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、dsRNA基質の標的RNA側にある1000個のヌクレオチドと、dsRNA基質の操作されたポリヌクレオチド側にある500個のヌクレオチドとによって形成され得る。
バルジ又はループを含む構造的特徴は、任意のサイズのものであり得る。いくつかの実施形態において、バルジ又はループは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、又は1000個の塩基を含む。いくつかの場合において、バルジ又はループは、全体で少なくとも約1~10、5~15、10~20、15~25、20~30、1~30、1~40、1~50、1~60、1~70、1~80、1~90、1~100、1~110、1~120、1~130、1~140、1~150、1~200、1~250、1~300、1~350、1~400、1~450、1~500、1~600、1~700、1~800、1~900、1~1000、20~50、20~60、20~70、20~80、20~90、20~100、20~110、20~120、20~130、20~140、20~150、1~200、1~250、1~300、1~350、1~400、1~450、1~500、1~600、1~700、1~800、1~900、1~1000、30~40、30~50、30~60、30~70、30~80、30~90、30~100、30~110、30~120、30~130、30~140、30~150、30~200、30~250、30~300、30~350、30~400、30~450、30~500、30~600、30~700、30~800、30~900、30~1000、40~50、40~60、40~70、40~80、40~90、40~100、40~110、40~120、40~130、40~140、40~150、40~200、40~250、40~300、40~350、40~400、40~450、40~500、40~600、40~700、40~800、40~900、40~1000、50~60、50~70、50~80、50~90、50~100、50~110、50~120、50~130、50~140、50~150、50~200、50~250、50~300、50~350、50~400、50~450、50~500、50~600、50~700、50~800、50~900、50~1000、60~70、60~80、60~90、60~100、60~110、60~120、60~130、60~140、60~150、60~200、60~250、60~300、60~350、60~400、60~450、60~500、60~600、60~700、60~800、60~900、60~1000、70~80、70~90、70~100、70~110、70~120、70~130、70~140、70~150、70~200、70~250、70~300、70~350、70~400、70~450、70~500、70~600、70~700、70~800、70~900、70~1000、80~90、80~100、80~110、80~120、80~130、80~140、80~150、80~200、80~250、80~300、80~350、80~400、80~450、80~500、80~600、80~700、80~800、80~900、80~1000、90~100、90~110、90~120、90~130、90~140、90~150、90~200、90~250、90~300、90~350、90~400、90~450、90~500、90~600、90~700、90~800、90~900、90~1000、100~110、100~120、100~130、100~140、100~150、100~200、100~250、100~300、100~350、100~400、100~450、100~500、100~600、100~700、100~800、100~900、100~1000、110~120、110~130、110~140、110~150、110~200、110~250、110~300、110~350、110~400、110~450、110~500、110~600、110~700、110~800、110~900、110~1000、120~130、120~140、120~150、120~200、120~250、120~300、120~350、120~400、120~450、120~500、120~600、120~700、120~800、120~900、120~1000、130~140、130~150、130~200、130~250、130~300、130~350、130~400、130~450、130~500、130~600、130~700、130~800、130~900、130~1000、140~150、140~200、140~250、140~300、140~350、140~400、140~450、140~500、140~600、140~700、140~800、140~900、140~1000、150~200、150~250、150~300、150~350、150~400、150~450、150~500、150~600、150~700、150~800、150~900、150~1000、200~250、200~300、200~350、200~400、200~450、200~500、200~600、200~700、200~800、200~900、200~1000、250~300、250~350、250~400、250~450、250~500、250~600、250~700、250~800、250~900、250~1000、300~350、300~400、300~450、300~500、300~600、300~700、300~800、300~900、300~1000、350~400、350~450、350~500、350~600、350~700、350~800、350~900、350~1000、400~450、400~500、400~600、400~700、400~800、400~900、400~1000、500~600、500~700、500~800、500~900、500~1000、600~700、600~800、600~900、600~1000、700~800、700~900、700~1000、800~900、800~1000、又は900~1000個の塩基を含む。
いくつかの場合において、構造的特徴は、構造化モチーフである。本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、dsRNA基質中に2つ以上の構造的特徴を含む。構造化モチーフは、正確な位置でのADAR編集のための理想的な基質を生成するために、上述の請求項等の構造的特徴の任意の組み合わせを含み得る。これらの構造モチーフは、最大化されたADAR編集のために人工的に操作することができ、及び/又はこれらの構造モチーフは、既知のADAR基質を反復するようにモデル化することができる。
いくつかの場合において、構造的特徴は、ポリヌクレオチドの少なくとも部分的な環化を含む。いくつかの場合において、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、環化されてもよく、又は環状構成であってもよい。いくつかの態様において、少なくとも部分的に環状のポリヌクレオチドは、5’ヒドロキシル又は3’ヒドロキシルを欠いている。
いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、RNA干渉(RNAi)のために構成された配列をコードする配列を含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、RNAiのために構成された配列を含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、RNAiのために構成された配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、短い干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、又はダイサー基質をコードする配列を含まなくてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、短い干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、又はダイサー基質をコードする配列を含み得る。
snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作されたポリヌクレオチドから産生され得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作された線形ポリヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、線形であり得る。例えば、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、プラスミドから転写された線形RNAであり得る。別の例において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、細胞における環化を可能にするリボザイムドメイン及びライゲーションドメイン等のドメインを有する線形ポリヌクレオチドであるように構築することができる。ライゲーションドメイン及びリボザイムドメインを有する線形ポリヌクレオチドを、細胞へトランスフェクトすることができ、内因性細胞酵素を介して環化することができる。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、環状であり得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、DNA、RNA、又は両方を含み得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作されたガイドRNAを含み得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたガイドRNAを使用して、操作されたガイドRNAを産生することができる。
本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、スペーサードメインを含み得る。いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、スペーサードメインを含まなくてもよい。いくつかの場合において、例えば、ケルビンプローブフォース顕微鏡(KPFM)によって決定される場合、スペーサードメインは、標的RNAに対する操作されたポリヌクレオチドの結合のギブズ自由エネルギー(ΔG)を、スペーサードメインを欠く対応する操作されたポリヌクレオチドの結合のΔGと比較して、下げる。いくつかの実施形態において、標的化配列が、標的RNAに少なくとも部分的に結合する場合、スペーサードメインは、少なくとも1個のヌクレオチドによって標的化配列から分離することができ、スペーサードメインが、標的RNAに結合する場合、スペーサードメインの結合は、スペーサードメインに結合する標的RNAの一部分で、標的RNAの編集を引き起こさない場合がある。いくつかの場合において、スペーサードメインが、標的化配列の5’末端又は3’末端に隣接し得る場合、スペーサードメインは、標的RNAに対して相補的でなくてもよい。
いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2500、又は5000ヌクレオチド長よりも長くてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド(例えば、操作されたガイドポリヌクレオチド)、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、約20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2500、又は5000ヌクレオチド長よりも短くてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド(例えば、操作されたガイドポリヌクレオチド)、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、約20ヌクレオチド~約5000ヌクレオチド、20ヌクレオチド~約50ヌクレオチド、40ヌクレオチド~約80ヌクレオチド、70ヌクレオチド~約140ヌクレオチド、80ヌクレオチド~約160ヌクレオチド、90ヌクレオチド~約200ヌクレオチド、100ヌクレオチド~約250ヌクレオチド、150ヌクレオチド~約350ヌクレオチド、200ヌクレオチド~約500ヌクレオチド、450ヌクレオチド~約800ヌクレオチド、750ヌクレオチド~約1250ヌクレオチド、1000ヌクレオチド~約2000ヌクレオチド、又は約2000ヌクレオチド~約5000ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、標的化配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、又は500ヌクレオチドだけ分離されていてもよい。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、溶媒に曝露することができる、5’還元ヒドロキシル、3’還元ヒドロキシル、又は両方を含んでいなくてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ヒト細胞中に天然に存在するmRNAよりも加水分解の影響を受けにくい可能性がある二次構造を含み得る。
スペーサードメインは、標的RNAに対する少なくとも部分的な結合を容易にする立体配座を採用する操作されたポリヌクレオチドを容易にするように構成され得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、ポリヌクレオチドの標的化配列が実質的に線形であり得るように、ポリヌクレオチドの標的化配列の幾何学形状を変更することができる。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、操作されたポリヌクレオチドの合成を容易にし得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、前駆体の操作されたポリヌクレオチドの溶媒露出末端の連結を容易にし得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、スペーサードメインを欠くものよりも、前駆体の操作されたポリヌクレオチドの2つのライゲーション末端を近づけることができる。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド中の連結は、共有結合性又は非共有結合性であり得る。いくつかの場合において、連結は、ライゲーション反応によって形成することができる。いくつかの実施形態において、連結は、相同組換え反応によって形成することができる。
スペーサードメインを含むsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの結合特異性に対して、複数の他のRNAの中で、標的RNAに対する結合特異性を増加させ得る。いくつかの実施形態において、標的RNAに対する結合特異性の増加は、スペーサードメインを含む操作されたポリヌクレオチド、又はスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触した後の標的RNA及び複数の他のRNAの配列決定によって決定することができる。いくつかの場合において、スペーサードメインは、標的RNAに対する操作されたポリヌクレオチドの結合のより低いエントロピー(ΔS)を容易にするように構成され得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの編集効率に対して、標的RNAに対する操作されたポリヌクレオチドの編集効率を少なくとも維持するように構成され得る。いくつかの場合において、編集効率は、スペーサードメインを有する操作されたポリヌクレオチド、又はスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触した後の標的RNAの配列決定によって決定することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも維持することは、増加を含み得る。いくつかの場合において、編集効率は、スペーサードメインを有する操作されたポリヌクレオチド、又はスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触した後の標的RNAの質量分析によって決定することができる。
操作されたガイドRNA、操作されたポリヌクレオチド、又はsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドをコードする前駆体の操作された線形ポリヌクレオチドは、標的RNAの編集を、例えばRNA編集エンティティを介して容易にすることができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、標的RNAの編集を容易にしなくてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、5’還元ヒドロキシル、3’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドと比較して、標的RNAに対する編集効率を少なくとも約90%増加させることができる。いくつかの実施形態において、編集効率は、(i)標的RNAを初代細胞株へトランスフェクトすること、(ii)操作されたポリヌクレオチド、及び5’還元ヒドロキシル、3’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株へトランスフェクトすること、並びに(iii)標的RNAを配列決定することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、編集効率は、(i)標的RNAを初代細胞株へトランスフェクトすること、(ii)操作されたポリヌクレオチド、及び5’還元ヒドロキシル、3’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株へトランスフェクトすること、並びに(iii)標的RNAの質量分析によって決定することができる。いくつかの実施形態において、RNA編集エンティティによる標的RNAのヌクレオチドの塩基の編集は、(i)標的RNAを初代細胞株に直接的若しくは間接的に導入する(例えば、トランスフェクトする)ことと、(ii)操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的若しくは間接的に導入する(例えば、トランスフェクトする)ことと、(iii)標的RNAを配列決定することと、を含むインビトロアッセイで決定することができる。いくつかの場合において、標的RNAを初代細胞株にトランスフェクトすることは、標的RNAをコードするプラスミドを初代細胞株にトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株にトランスフェクトすることは、前駆体の操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株内にコードするポリヌクレオチド(例えば、プラスミド)をトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合において、配列決定することは、標的RNAが逆転写酵素によってcDNAに変換された後に、標的RNAのSanger配列決定することを含み得る。いくつかの場合において、初代細胞株は、ニューロン、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、筋芽細胞、筋管細胞、肝細胞、肺上皮細胞、又は線維芽細胞を含み得る。
いくつかの場合において、スペーサードメインは、約1ヌクレオチド~約1,000ヌクレオチド、2ヌクレオチド~約20ヌクレオチド、10ヌクレオチド~約100ヌクレオチド、50ヌクレオチド~約500ヌクレオチド、又は約400ヌクレオチド~約1000ヌクレオチド長の配列長さを有し得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインのヌクレオチドの約80%は、標的RNAに対して非相補的であり得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約5ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約10ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約15ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約20ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、ATATA(配列番号50)、ATAAT(配列番号51)のポリヌクレオチド配列、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、AUAAU(配列番号52)、AUAUA(配列番号53)、又はUAAUA(配列番号54)の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、A、T、G、C又はU等の少なくとも単一ヌクレオチドであり得る。
スペーサードメインは、標的化配列に対して近位、ライゲーションドメインに対して近位、リボザイムドメインに対して近位、RNA編集動員ドメインに対して近位、又は別のスペーサードメインに対して近位に位置していてもよく、近位は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、又は500ヌクレオチドだけ分離されていることを意味し得る。
操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、単一スペーサードメインを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、複数のスペーサードメイン、例えば、2、3、4、5、6、7、又は8個のスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、1個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、1個より多い標的化配列を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、2個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、同じ標的RNAを標的とする2個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、異なる標的RNAを標的とする2個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド配列同一性を含む2個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチド配列同一性を含む2個の標的化配列を含み得る。
スペーサードメインを有する、操作されたガイドRNA、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドのインビトロ半減期は、スペーサードメインを欠く実質的に同等のRNA又は同等のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも約1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、10倍、20倍、又はそれより長くてもよい。スペーサードメインを有する、操作されたガイドRNA、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドのインビボ半減期は、スペーサードメインを欠く実質的に同等のRNA又は同等のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも約1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、10倍、20倍、又はそれより長くてもよい。それを必要とする対象に投与される、スペーサードメインを有する、操作されたガイドRNA、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物の投薬量は、それを必要とする対象に投与される、スペーサードメインを欠く実質的に同等のRNA又は同等のポリヌクレオチドを含む組成物と比較して、少なくとも約1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、10倍、20倍少なくてもよく、又はそれより少なくてもよい。それを必要とする対象に投与される、スペーサードメインを有する、操作されたガイドRNA、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物は、2回又はそれより多い治療として与えられる、スペーサードメインを欠く実質的に同等のRNA又は同等のポリヌクレオチドを含む組成物と比較して、単回治療として与えることができる。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200個、又はそれより多くの化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、又は200個以下の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの5’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの3’末端に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端の両方に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列中に少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、標的化配列に隣接するヌクレオチド塩基中に少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも1個の化学修飾を分子内二次構造内に導入することができる。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方に対する少なくとも1個の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの少なくとも1つの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子の1つ以上に対する化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖に対する少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、少なくとも1つのロックド核酸(LNA)を含む操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖に対する少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、少なくとも1つのアンロックド核酸(UNA)を含む操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖に対する少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、糖の構成成分の修飾を含む糖に対する少なくとも1個の化学修飾を含んでいてもよく、糖は、リボース糖である。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、2’-O-メチル基を含む操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドのリボース糖の構成成分に対する少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、デホスホリンカーを有する操作されたポリヌクレオチドのホスフェート部分の置き換えを含む少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのホスフェート骨格の少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオチドの非天然塩基を含む少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸(PNA)ヌクレオシド代理物を含む少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、少なくとも1つの立体化学的に純粋な核酸を含む少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも1個の化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの5’末端の近位に配置され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも1個の化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの3’末端の近位に配置され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも1個の化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの5’末端及び3’末端の両方の近位に配置され得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、一緒に共有結合された複数の糖及びホスフェート部分を含む骨格を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、DNA中のデオキシリボース又はRNA中のリボースの5’炭素上のホスフェート基中の第1のヒドロキシル基と、DNA中のデオキシリボース又はRNA中のリボースの3’炭素上の第2のヒドロキシル基との間にホスホジエステル結合連結を含み得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、溶媒に曝露することができる、5’還元ヒドロキシル、3’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、ヌクレアーゼに曝露することができる、5’還元ヒドロキシル、3’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、加水分解酵素に曝露することができる、5’還元ヒドロキシル、3’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、他方のヌクレオチドの後に一方のヌクレオチドを有する環状二次元形式でのポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、他方のヌクレオチドの後に一方のヌクレオチドを有するループ状二次元形式でのポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合において、5’ヒドロキシル、3’ヒドロキシル、又はその両方が、リン-酸素結合によって連結される。いくつかの場合において、5’ヒドロキシル、3’ヒドロキシル、又はその両方が、リン含有部分を有するホスホエステルへと修飾される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも1個の化学修飾を含み得る。化学修飾は、置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合において、修飾は、化学修飾である。好適な化学修飾は、5’アデニレート、5’グアノシン-トリホスフェートキャップ、5’N7-メチルグアノシン-トリホスフェートキャップ、5’トリホスフェートキャップ、3’ホスフェート、3’チオホスフェート、5’ホスフェート、5’チオホスフェート、Cis-Synチミジン二量体、三量体、C12スペーサー、C3スペーサー、C6スペーサー、dスペーサー、PCスペーサー、rスペーサー、スペーサー18、スペーサー9,3’-3’修飾、5’-5’修飾、非塩基部位、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンBB、ビオチンTEG、コレステリルTEG、デスチオビオチンTEG、DNP TEG、DNP-X、DOTA、dT-ビオチン、二重ビオチン、PCビオチン、ソラレンC2、ソラレンC6、TINA、3’DABCYL、ブラックホールクエンチャー1、ブラックホールクエンチャー2、DABCYL SE、dT-DABCYL、IRDye QC-1、QSY-21、QSY-35、QSY-7、QSY-9、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、2’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、2’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、2’-O-メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾された類似体、ゆらぎ/ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、2’フルオロRNA、2’O-メチルRNA、メチルホスホネート、ホスホジエステルDNA、ホスホジエステルRNA、ホスホロチオエートDNA、ホスホロチオエートRNA、UNA、シュードウリジン-5’-トリホスフェート、5-メチルシチジン-5’-トリホスフェート、2-O-メチル3ホスホロチオエート、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つを含む。
化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの任意の位置で行われ得る。いくつかの場合において、修飾は、5’末端又は3’末端に位置する。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、又は150から選択される塩基での修飾を含む。操作されたポリヌクレオチドに対して、1つより多い修飾を行うことができる。いくつかの場合において、修飾は、永続的であり得る。他の場合において、修飾は、一過性であり得る。いくつかの場合において、複数の修飾は、操作されたポリヌクレオチドに対して行われる。操作されたポリヌクレオチド修飾は、ヌクレオチドの立体配座、極性、疎水性、化学反応性、塩基対相互作用、又はこれらの任意の組み合わせ等のヌクレオチドの物理化学的特性を変更することができる。
化学修飾は、ホスホロチオエート置換体でもあり得る。いくつかの場合において、天然ホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによる迅速な分解を受けやすい場合があり、ホスホロチオエート(PS)結合置換体を使用したヌクレオチド間連結の修飾は、細胞分解による加水分解に対して、より安定であり得る。修飾は、ポリ核酸における安定性を増加させることができる。修飾はまた、生物学的活性を増強することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエートによって増強されたRNAポリ核酸は、RNase A、RNase T1、子ウシ血清ヌクレアーゼ、又はこれらの任意の組み合わせを阻害することができる。これらの特性は、ヌクレアーゼへの曝露がインビボ又はインビトロでの高い可能性である用途において、使用されるべきPS-RNAポリ核酸の使用を可能にすることができる。例えば、ホスホロチオエート(PS)結合を、エクソヌクレアーゼ分解を阻害することができるポリ核酸の5’末端又は3’末端の最後の3~5ヌクレオチド間に導入することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエート結合を、ポリ核酸全体にわたって付加し、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減することができる。
本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、任意の頻度の塩基を有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、1~5%、3~8%、5~12%、10~15%、8~20%、15~25%、20~30%、25~35%、又は最大で約30~40%のアデニン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、1~5%、3~8%、5~12%、10~15%、8~20%、15~25%、20~30%、25~35%、又は最大で約30~40%のシトシン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、1~5%、3~8%、5~12%、10~15%、8~20%、15~25%、20~30%、25~35%、又は最大で約30~40%のチミン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、1~5%、3~8%、5~12%、10~15%、8~20%、15~25%、20~30%、25~35%、又は最大で約30~40%のグアニン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、1~5%、3~8%、5~12%、10~15%、8~20%、15~25%、20~30%、25~35%、又は最大で約30~40%のウラシル率を有し得る。
いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、修飾後に品質管理を受けることができる。いくつかの場合において、品質管理は、PAGE、HPLC、MS、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドの質量を決定することができる。質量は、LC-MSアッセイによって決定することができる。質量は、30,000amu、50,000amu、70,000amu、90,000amu、100,000amu、120,000amu、150,000amu、175,000amu、200,000amu、250,000amu、300,000amu、350,000amu、400,000amuから、約500,000amuまでであり得る。質量は、ポリヌクレオチドのナトリウム塩の質量であってもよい。
いくつかの場合において、ポリヌクレオチドのエンドトキシンレベルを決定することができる。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、3EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、10EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、8EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、5EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、4EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、3EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、2EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、1EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床的/治療的に許容されるレベルは、0.5EU/mL未満であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも1個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、50、100、又はそれより多くの化学修飾を含む。
いくつかの実施形態において、化学修飾は、3’OH基、5’OH基で、骨格で、糖構成要素で、又はヌクレオチド塩基で生じ得る。化学修飾には、鎖間架橋又は鎖内架橋の天然に存在しないリンカー分子が含まれ得る。一態様において、化学修飾された核酸は、3’OH若しくは5’OH基、骨格、糖構成要素、又はヌクレオチド塩基のうちの1つ以上の修飾、又は天然に存在しないリンカー分子の付加を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾された骨格は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖は、デオキシリボース以外の糖(修飾DNAにおいて)、又はリボース以外の糖(修飾RNAにおいて)を含む。いくつかの実施形態において、修飾された塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシル以外の塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも1個の化学修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20個、又はそれより多くの修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、塩基部分に対する化学修飾としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシル、及びプリン又はピリミジン塩基の天然及び合成の修飾が挙げられる。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の片方若しくは両方の修飾、ホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素のうちの1つ以上の修飾、リボース糖の構成成分の修飾、「デホスホ」リンカーによるホスフェート部分の置き換え、天然に存在する核酸塩基の修飾若しくは置き換え、リボース-ホスフェート骨格の修飾、ポリヌクレオチドの5’末端の修飾、ポリヌクレオチドの3’末端の修飾、デオキシリボースホスフェート骨格の修飾、ホスフェート基の置換、リボホスフェート骨格の修飾、ヌクレオチドの糖に対する修飾、ヌクレオチドの塩基に対する修飾、又はヌクレオチドの立体化学的に純粋なもののうちのいずれか1つ、又は任意の組み合わせの修飾を含み得る。操作されたポリヌクレオチドの例示的な化学修飾を、表1に見ることができる。
いくつかの実施形態において、化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の片方若しくは両方の修飾、又はホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの1つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖又は分枝鎖である飽和炭化水素基を指すことを意味する。例示的なアルキル基としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(例えば、n-プロピル若しくはイソプロピル)、ブチル(例えば、n-ブチル、イソブチル、若しくはt-ブチル)、又はペンチル(例えば、n-ペンチル、イソペンチル、若しくはネオペンチル)が挙げられる。アルキル基は、1~約20、2~約20、1~約12、1~約8、1~約6、1~約4、又は1~約3個の炭素原子を含有し得る。本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環式若しくは多環式(例えば、2、3、若しくは4個の縮合環を有する)芳香族炭化水素、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、又はインデニルを指す。いくつかの実施形態において、アリール基は、6~約20個の炭素原子を有する。本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも1つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、2~12個の炭素原子を含有し、1つ以上の三重結合を有することを特徴とする、直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、又は3-ヘキシニルを挙げることができる。「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置き換えられたアルキル部分を指す。アラルキルは、1個より多い水素原子がアリール基によって置き換えられた基を含む。「アリールアルキル」又は「アラルキル」の例としては、ベンジル、2-フェニルエチル、3-フェニルプロピル、9-フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基が挙げられる。「シクロアルキル」は、3~12個の炭素を有する、環式、二環式、三環式、又は多環式の非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。「ヘテロシクリル」は、複素環式環系の一価のラジカルを指す。代表的なヘテロシクリルとしては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、及びモルホリニルが挙げられる。「ヘテロアリール」は、複素芳香族環系の一価のラジカルを指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピローリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、及びプテリジニルが挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドのホスフェート基は、酸素のうちの1つ以上を別の置換基で置き換えることによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分を、本明細書に記載の修飾されたホスフェートで置き換えることを含み得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格の修飾は、帯電していないリンカー、又は非対称電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす変化を含み得る。修飾されたホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホノチオアセテート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の1つが、以下の基のいずれかによって置き換えられ得る。硫黄(S)、セレン(Se)、BR3(Rは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る)、C(例えば、アルキル基、アリール基等)、H、NR2(ここで、Rは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る)か、又は(Rは、例えば、アルキル又はアリールであり得る)。修飾されていないホスフェート基のリン原子は、アキラルであり得る。しかしながら、非架橋酸素のうちの1つの、上述の原子又は原子群のうちの1つによる置き換えによって、リン原子をキラルにすることができる。このように修飾されたリン酸基中のリン原子は、立体中心である。立体中心のリン原子は、「R」立体配置(本明細書ではRp)又は「S」立体配置(本明細書ではSp)のいずれかを有し得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ホスホロチオエートのS立体配座又はホスホロチオエートのR立体配座を含む立体化学的に純粋なヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、50%、60%、70%、80%、90%、又はそれより多いジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、95%のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、96%のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、97%のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、98%のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、99%のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、ホスホロジチオエートの非架橋酸素を両方とも硫黄によって置き換えることができる。ホスホロジチオエートのリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるアキラルであり得る。いくつかの実施形態において、一方又は両方の非架橋酸素に対する修飾は、非架橋酸素を、S、Se、B、C、H、N、及びOR(Rは、例えば、アルキル又はアリールであり得る)から独立して選択される基で置き換えることも含むことができる。いくつかの実施形態において、ホスフェートリンカーは、架橋酸素(例えば、ホスフェートをヌクレオシドに連結する酸素)、窒素(架橋したホスホロアミデート)、硫黄(架橋したホスホロチオエート)、及び炭素(架橋したメチレンホスホネート)の置き換えによっても修飾することができる。置き換えは、連結酸素のいずれか又は両方で生じ得る。
操作されたポリヌクレオチドは、プレmRNA標的化配列を含み得る。プレmRNA標的化配列は、標的プレmRNAに対して完全に相補的ではない場合がある。標的化配列は、プレmRNA配列に対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、プレmRNA内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、プレmRNAに対して相補的ではない少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個のヌクレオチドを含み得る。
標的化配列は、プレmRNA内のエクソンの上流の分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、プレmRNA内のエクソンの下流のドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、二次構造は、ヘアピンを含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、マウス又はヒトU7 snRNAのステムループヘアピンに対して少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約92%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、又は少なくとも約99%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、マウス又はヒトU7 snRNAのステムループヘアピンである。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号1に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号1である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号2に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号2である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号3に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号3である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号5に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号5である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号6に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号6である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号7に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号7である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号8に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号8である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号9に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号9である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号10に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号10である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号11に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号11である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号12に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号12である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号13に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号13である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号14に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号14である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号15に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号15である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号16に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号16である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号17に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号17である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号18に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号18である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号19に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号19である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号20に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号20である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号21に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号21である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号22に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号22である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号23に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号23である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号24に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号24である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号25に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号25である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号26に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号26である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号27に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号27である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号29に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号29である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号30に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号30である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号31に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号31である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号32に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号32である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号33に対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号33である。
プレmRNAのRNA編集は、標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドの標的化によって容易になる。標的化配列は、プレmRNAの少なくとも部分的に相補的な標的領域に結合することができる。
標的領域は、スプライスシグナルを含み得る。標的領域は、エクソン、イントロン、又はプロモーターに対して近位であり得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、疾患又は状態に関与する遺伝子の領域を標的とする。領域は、エクソンである。いくつかの実施形態において、領域は、イントロンである。本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、疾患又は状態を治療するために対象に投与され得る。このような疾患又は状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼障害(例えば、眼疾患)、がん、肝臓疾患(アルファ-1-アンチトリプシン(AAT)欠乏症)、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患又は状態は、嚢胞性線維症、アルビノ、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β-サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、認知症、遠位脊髄筋萎縮症(DSMA)、デュシェンヌ/ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第V因子ライデン関連障害、家族性大腸、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性へモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患(IBD)、遺伝性汎血球凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィーI型及びII型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病A型、B型、及びC型、NY-eso1関連がん、パーキンソン病、ポイツ・イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛運動不全症、プロトロンビン変異関連障害、例えば、プロトロンビンG20210A変異、肺動脈性肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群(SCID)、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、X連鎖免疫不全症、がんの様々な形態(例えば、BRCA1及び2に関連する乳がん及び卵巣がん)を含み得る。いくつかの場合において、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病)等の疾患又は状態の治療は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、tau、アルファ-シヌクレイン、又はこれらの任意の組み合わせの編集、ノックダウン、又はその両方をもたらすことを含み得る。いくつかの場合において、APP、tau、及びアルファ-シヌクレインは、病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合において、APPは、A673V変異又はA673T変異等の病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合において、神経変性疾患(パーキンソン病)等の疾患又は状態の治療は、LRRK2の病原性バリアントの編集、ノックダウン、又はその両方をもたらすことを含み得る。いくつかの場合において、LRRKの病原性バリアントは、G2019S変異を含み得る。疾患又は状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、網膜色素変性症、乳がん、卵巣がん、アルツハイマー病、疼痛、スターガルト黄斑ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、レット症候群、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、Rettを有する患者において、ミスセンス変異を修正する(例えば、Trpをコードするように停止コドンを変異させる)ことができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、パーキンソン病を有する患者において、ミスセンス変異を修正するか、又はノックダウンを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、アルツハイマー病を有する患者において、変異を誘導することができ、APPにおける切断部位でのタンパク質による切断を低減することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、筋ジストロフィーを有する患者において、エクソンスキッピングを生成することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、テイ・サックス病を有する患者において、HexAの変異を修正することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、テイ・サックス病を有する患者において、HexAの変異を修正することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、AAT欠乏症を有する患者において、変異を修正する(例えば、SERPINA1を編集する)ことができる。いくつかの場合において、組成物の投与は、(a)投与前の遺伝子の発現と比較して、遺伝子の発現を減少させ、(b)対象(例えばそれを必要とする対象)において少なくとも1つの点変異を編集し、(c)対象において少なくとも1つの停止コドンを編集して、停止コドンのリードスルーをもたらし、(d)対象においてエクソンスキップをもたらし、又は(e)これらの任意の組み合わせにとって十分なものであり得る。疾患又は状態は、筋ジストロフィーを含み得る。筋ジストロフィーとしては、筋緊張性、デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯、顔面肩甲上腕型、先天性、眼咽頭型、遠位、エメリー・ドレイフス、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。疾患又は状態は、慢性疼痛等の疼痛を含み得る。疼痛には、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。侵害受容性疼痛には、内臓疼痛、体性疼痛、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。標的化配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、又は配列番号17のうちのいずれか1つに対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、又は配列番号17の標的配列に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも99%、又は100%相補的である。
RNA編集
本開示は、目的の標的RNA編集中の塩基のRNA編集を容易にするsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する操作されたポリヌクレオチドの組成物を提供する。例えば、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、アデノシン(A)からイノシン(I)への脱アミノ化等の塩基の化学修飾を含むRNA編集を容易にする。イノシンは、グアノシン(G)と読まれる。このように、RNA編集の本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチド及びそれを使用する方法は、ある疾患又は疾患経路に関与し得る遺伝子におけるGからAへの点変異を修正するために使用することができる。したがって、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、治療方法における治療薬として使用され得る。
本開示は、目的の標的RNA編集中の塩基のRNA編集を容易にするsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する操作されたポリヌクレオチドの組成物を提供する。例えば、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、アデノシン(A)からイノシン(I)への脱アミノ化等の塩基の化学修飾を含むRNA編集を容易にする。イノシンは、グアノシン(G)と読まれる。このように、RNA編集の本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチド及びそれを使用する方法は、ある疾患又は疾患経路に関与し得る遺伝子におけるGからAへの点変異を修正するために使用することができる。したがって、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、治療方法における治療薬として使用され得る。
いくつかの実施形態において、dsRNA基質中のバルジの存在は、標的RNA中の標的Aを選択的に編集し、標的RNA中の非標的Aのオフターゲット編集を低減するようにADARを配置し得る。いくつかの実施形態において、dsRNA基質中のバルジの存在は、追加のADARを動員し得る。本明細書に開示されるdsRNA基質中のバルジは、他のRNA編集エンティティ等の他のタンパク質を動員し得る。いくつかの実施形態において、編集部位の5’に配置されるバルジは、編集される標的Aの塩基フリッピングを容易にし得る。バルジは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。バルジは、標的Aの選択的な編集をもたらす方向に制約することによって、ADAR編集を指示するのに役立ち得る。
RNA編集エンティティは、ADARタンパク質(例えば、ADAR1、ADAR2、ADAR3、若しくはこれらの任意の組み合わせ)、任意のAPOBECタンパク質(例えば、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、若しくはこれらの任意の組み合わせ)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、メガヌクレアーゼ、又はこれらの組み合わせのうちのいずれか1つであり得る。いくつかの場合において、動員されるADAR又はAPOBECタンパク質は、哺乳動物タンパク質であり得る。いくつかの場合において、動員されるADAR又はAPOBECタンパク質は、ヒトタンパク質であり得る。いくつかの場合において、動員されるADAR又はAPOBECタンパク質は、組換え(例えば、外因性送達されたADAR若しくはAPOBEC)、修飾された(例えば、外因性送達されたADAR若しくはAPOBEC)、内因性(例えば、内因性ADAR若しくはAPOBEC)、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合において、RNA編集エンティティは、融合タンパク質、例えば、本明細書で提供されるRNA編集エンティティのいずれかであり得る。いくつかの場合において、RNA編集エンティティは、RNA編集エンティティ、例えば、本明細書で提供されるRNA編集エンティティのいずれかの機能的部分であり得る。上述のRNA編集エンティティのいずれかは、本明細書で提供される組成物及び/又は方法とともに使用するように適合され得る。
RNA上で作用するアデノシンデアミナーゼ(ADAR)、及びそれらの生物学的に活性な断片は、二本鎖RNA(dsRNA)基質におけるアデノシンからイノシンへの化学的変換を触媒する酵素であり得る。イノシンの特性は、グアノシンの特性を模倣するため(イノシンは、例えば、シトシンとの2つの水素結合を形成する)、イノシンは、翻訳細胞機構によってグアノシンとして認識され得る。したがって、アデノシンからイノシン(AからI)へのRNA編集は、RNA標的の一次配列を効果的に変化させる。ADAR酵素は、様々な数のアミノ末端dsRNA結合ドメイン(dsRBD)及びカルボキシ末端触媒デアミナーゼドメインを含む共通のドメインアーキテクチャを共有する。ヒトADARは、2つ又は3つのdsRBDを保有する。
3つのヒトADAR遺伝子が特定されており(ADAR1~3)、ADAR1(公式の記号ADAR)及びADAR2(ADARB1)タンパク質は、十分に特性決定されたアデノシン脱アミノ化活性を有する。ADARは、そのN末端領域にdsRNA結合ドメインの少なくとも2つのコピー(dsRBD、3つのdsRBDを有するADAR1、2つのコピーを有するADAR2及びADAR3)、その後にC末端脱アミナーゼドメインを含む典型的なモジュールドメイン組織を有する。
ADAR1及びADAR2は、インビボでのmRNA編集に関与するADARの2つの例示的な種である。ADAR1の非限定的な例示的な配列は、以下の参照番号:HGNC:225、Entrez Gene:103、Ensembl:ENSG 00000160710、OMIM:146920、UniProtKB:P55265、及びGeneCards:GC01M154554、並びにこれらの生物学的等価物で見出され得る。ADAR2の非限定的な例示的な配列は、以下の参照番号:HGNC:226、Entrez Gene:104、Ensembl:ENSG00000197381、OMIM:601218、UniProtKB:P78563、及びGeneCards:GC21P045073、並びにこれらの生物学的等価物で見出され得る。ADARの生物学的に活性な断片も本明細書で提供され、ADARを指す場合に含まれ得る。
本開示は、内因性ADAR1発現を増加させる手段としてのインターフェロンαの使用を企図する。単離されたか、又は組換えインターフェロンαの商業的供給源としては、限定されないが、Sigma-Aldrich、R&D Systems、Abcam、及びThermo Fisher Scientificが挙げられる。代替的に、インターフェロンαは、既知のベクター及び所与のタンパク質配列、例えば、Q6QNB6(ヒトIFNA)を使用して産生され得る。
APOBEC及びそれらの生物学的に活性な断片は、任意のタンパク質、例えば、mRNA編集に関与する進化的に保存されたシチジンデアミナーゼ(CからUへの変換を触媒する)のファミリー内に含まれる例示的なRNA編集エンティティ、及びそれらの等価物を指すことができる。いくつかの観点において、APOBECという用語は、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3E、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、APOBEC4、又はそれらの各々の等価物のうちのいずれか1つを指す。ADARドメインに融合されるか、又はRNA編集系において使用するのに好適なものにするために代替ドメインに融合されるかの両方で、1つ以上のAPOBECドメインを含む融合タンパク質の非限定的な例示的な配列が、本明細書で提供される。この目的のために、APOBECは、異なる変換による任意の編集を触媒する、ADARの等価物と考えることができる。したがって、理論によって束縛されないように、ADARに基づく編集系とともに使用するために本明細書で企図される実施形態は、APOBECに基づくRNA編集系において使用するために適合され得る。
いくつかの場合において、RNA編集エンティティは、ステムループを含む二次構造を形成しない。いくつかの場合において、RNA編集エンティティの少なくとも一部分は、ステムループを含む二次構造を形成する。いくつかの場合において、RNA編集エンティティの一部分は、ステムループを含まない二次構造を形成する。いくつかの場合において、RNA編集エンティティの一部分は、線形部分を含む二次構造を形成する。いくつかの場合において、RNA編集エンティティの一部分は、十字型又はその一部分を含む二次構造を形成する。
いくつかの実施形態において、RNAの編集は、遺伝子発現に影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、RNAは、不安定化する。いくつかの実施形態において、遺伝子は、発現されない。いくつかの実施形態において、選択的スプライシングが影響を受ける。いくつかの実施形態において、遺伝子の異なるアイソフォームが発現される。
標的配列に対するADARタンパク質の動員は、操作されたポリヌクレオチド及び標的配列で構成されるRNA二本鎖を接触させることを伴っていてもよく、標的配列は、標的化配列に対して100%相補的ではなく、したがって、少なくとも1つである。いくつかの実施形態において、標的化配列は、プレmRNAに結合するとき、プレmRNAに対して相補的ではない少なくとも1つのヌクレオチドを含み、バルジを生成する。いくつかの実施形態において、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5個のヌクレオチドは、プレmRNAに対して相補的ではなく、バルジを生成する。
snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドは、デアミナーゼ存在下でプレmRNAと会合したときに、プレmRNAにおいて編集を促進し、それによってデアミナーゼ動員ドメインを形成するように構成され得る。いくつかの場合において、snRNA配列及びsnRNAヘアピンを有する本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、標的mRNAとのデアミナーゼの親和性を改善することができる非相補的ヌクレオチドを含み得る。デアミナーゼは、プレmRNAのポリヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にすることができる。いくつかの場合において、プレmRNAに対して相補的ではない少なくとも1つのヌクレオチドによって生成される少なくとも1つのミスマッチは、デアミナーゼと少なくとも部分的に会合する。
いくつかの実施形態において、デアミナーゼ動員ドメインは、少なくとも1つのステムループを含み得る。ステムループは、右巻き又は左巻きのステムループのいずれかであり得る。ステムループは、GluR2ドメインに対して少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%の配列同一性を含み得る。
プレmRNAを標的化する領域内のプレmRNAに対する1つの非相補的ヌクレオチドは、標的化配列のいずれかの末端から45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、又は55塩基に位置する。
編集は、プレmRNA内で生じるように構成され得る。編集は、イントロン又はエクソン内で生じるように構成され得る。編集は、スプライスシグナル内で生じるように構成される。編集は、非翻訳領域中で生じるように構成され得る。編集は、エクソンのスキッピングを促進するように構成され得る。
操作されたポリヌクレオチドによるRNA編集の活性は、所望の活性の成功を決定するために測定することができる。いくつかの実施形態において、所望の活性は、エクソンスキッピングである。
snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン、又はそのバリアント)を有する操作されたポリヌクレオチドの編集効率は、インビトロアッセイ、例えば、液滴デジタルPCRドロップオフアッセイによって測定し、参照試料と比較して、編集(複数の配列挿入、欠失又は変異)を検出することができる。このアッセイにおいて、試料中の変異ホットスポットを評価するために、少なくとも2つのプローブが使用される。プローブは、変異ホットスポットに対して少なくとも部分的に相補的である。フルオロフォアコンジュゲート化ドロップオフプローブは、編集されていない標的配列にアニーリングするが、塩基編集された標的配列にはアニーリングしないように設計することができる。異なるフルオロフォアにコンジュゲート化された第2の参照プローブは、ドロップオフプローブ標的配列の次にアニーリングし、編集に関係なく標的転写産物を検出するように設計することができる。両方のプローブに隣接するプライマーは、液滴デジタルPCR反応において標的転写産物を増幅する。次いで、編集率は、ドロップオフプローブについて陰性であるが、参照プローブについて陽性の全転写産物と比較して、参照プローブについて陽性の転写産物として報告することができる。
エクソンスキッピング
いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングを引き起こすRNA編集(例えば、ADARによる)を容易にする。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、snRNA要素及び/又はミスマッチを含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンは、その機能を変更する変異を含有し得る。操作されたポリヌクレオチドは、インビトロで測定される場合、snRNA要素及び/又はミスマッチを含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンスキッピングの効率は、定量的PCR、液滴デジタルPCR、又はRNA配列決定によって測定することができる。
いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングを引き起こすRNA編集(例えば、ADARによる)を容易にする。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、snRNA要素及び/又はミスマッチを含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンは、その機能を変更する変異を含有し得る。操作されたポリヌクレオチドは、インビトロで測定される場合、snRNA要素及び/又はミスマッチを含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンスキッピングの効率は、定量的PCR、液滴デジタルPCR、又はRNA配列決定によって測定することができる。
操作されたポリヌクレオチドのエクソンスキッピング効率は、インビトロアッセイ、例えば、定量的PCRアッセイ又は液滴デジタルPCRアッセイによって測定し、スキッピングされていない転写産物の割合に対して、エクソンスキッピングされた転写産物の割合を検出することができる。このアッセイにおいて、少なくとも2つのフルオロフォアコンジュゲート化プローブを使用し、1つは、エクソンスキッピングされた転写産物に特異的にアニーリングし、別のものは、スキッピングされていない転写産物に特異的にアニーリングする。ddPCR増幅を行った。
本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ddPCRによって測定される場合、エクソンスキッピングの効率を少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は最大100%増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を約1%~約50%増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を少なくとも約1%増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を最大で約50%増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を約1%~約5%、約1%~約10%、約1%~約20%、約1%~約30%、約1%~約40%、約1%~約50%、約5%~約10%、約5%~約20%、約5%~約30%、約5%~約40%、約5%~約50%、約10%~約20%、約10%~約30%、約10%~約40%、約10%~約50%、約20%~約30%、約20%~約40%、約20%~約50%、約30%~約40%、約30%~約50%、又は約40%~約50%増加させることができる。
治療用途
snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドを治療薬として使用することができる。一態様において、本明細書では、状態を治療又は予防する方法であって、RNAの編集を容易にする治療薬を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、RNAの編集は、変異の修正を容易にし得る。変異は、ミスセンス変異又はナンセンス変異であり得る。いくつかの実施形態において、RNA編集は、目的の標的RNAに変異を導入することを伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のガイドは、標的RNAの複数のRNA編集を容易にする。
snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドを治療薬として使用することができる。一態様において、本明細書では、状態を治療又は予防する方法であって、RNAの編集を容易にする治療薬を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、RNAの編集は、変異の修正を容易にし得る。変異は、ミスセンス変異又はナンセンス変異であり得る。いくつかの実施形態において、RNA編集は、目的の標的RNAに変異を導入することを伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のガイドは、標的RNAの複数のRNA編集を容易にする。
APP。いくつかの実施形態において、本開示は、アミロイド前駆体タンパク質(APP)のRNA編集を容易にすることができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。例えば、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAは、APP中の切断部位の編集を容易にすることができ、その結果、ベータ/ガンマセクレターゼは、APPの切断の低減を示すか、又はもはやAPPを切断することができず、したがって、Abeta 40/42のレベルが低減するか、又はAbetaを産生することができない。いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAは、RNA編集のためのAPPにおける以下の部位のうちのいずれか1つ、又は任意の組み合わせを標的とし得る。K670E、K670R、K670G、M671V、A673V、A673T、D672G、E682G、H684R、K687R、K687E、又はK687G、I712X、又はT714X。APP中の部位を標的とする、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する上述のガイドRNAは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有し得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つの配列を有し得る。本明細書に開示される任意のプロモーター(例えば、U1、U6、又はU7)は、上述のガイドRNAの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され(例えば、コードされ、AAVを介して送達され)てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルツハイマー病を発症するリスクがあってもよく、又はアルツハイマー病を発症している。対象は、ヒトであってもよく、APPが疾患の病態に影響を及ぼす神経性疾患を発症するリスクがあってもよく、又はその神経性疾患を発症している。したがって、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAを、神経性疾患(例えば、アルツハイマー病)の治療方法で使用してもよい。
アルファ-シヌクレイン(SNCA)
アルファ-シヌクレイン遺伝子は、5個のエクソンで構成され、予測分子量が約14.5kDaの140アミノ酸タンパク質をコードする。コードされた産物は、機能が未知の本質的に無秩序なタンパク質である。通常、アルファ-シヌクレインは、単量体である。特定のストレス条件又は他の未知の原因の下で、α-シヌクレインは、自己凝集してオリゴマーになる。レビー小体に関連する病態(LRP)は、主に、解剖学的に確認されたアルツハイマー病患者の脳の50%より多くにおけるアルファ-シヌクレインで構成されていた。アルファ-シヌクレインがアルツハイマー病の発症にどのように影響を与えるかの分子機構は不明であるが、実験的証拠は、アルファ-シヌクレインが、Tau-pと相互作用し、Tau-pの細胞内凝集の種となり得ることを示している。更に、アルファ-シヌクレインは、Tau高リン酸化を媒介することができる、GSK3βの活性を調節することができる。アルファ-シヌクレインは、自己組織化して、病原性凝集体(レビー体)ともなり得る。Tau及びα-シヌクレインの両方が、細胞外空間に放出され、他の細胞に拡散され得る。血管異常は、栄養素の共有及び代謝副産物の除去を損ない、微小梗塞を引き起こし、グリア細胞の活性化を促進する。したがって、Tau形成、アルファ-シヌクレイン形成、又はこれらの組み合わせを実質的に低減するための多重戦略は、神経変性疾患を効果的に治療する際に重要であり得る。
アルファ-シヌクレイン遺伝子は、5個のエクソンで構成され、予測分子量が約14.5kDaの140アミノ酸タンパク質をコードする。コードされた産物は、機能が未知の本質的に無秩序なタンパク質である。通常、アルファ-シヌクレインは、単量体である。特定のストレス条件又は他の未知の原因の下で、α-シヌクレインは、自己凝集してオリゴマーになる。レビー小体に関連する病態(LRP)は、主に、解剖学的に確認されたアルツハイマー病患者の脳の50%より多くにおけるアルファ-シヌクレインで構成されていた。アルファ-シヌクレインがアルツハイマー病の発症にどのように影響を与えるかの分子機構は不明であるが、実験的証拠は、アルファ-シヌクレインが、Tau-pと相互作用し、Tau-pの細胞内凝集の種となり得ることを示している。更に、アルファ-シヌクレインは、Tau高リン酸化を媒介することができる、GSK3βの活性を調節することができる。アルファ-シヌクレインは、自己組織化して、病原性凝集体(レビー体)ともなり得る。Tau及びα-シヌクレインの両方が、細胞外空間に放出され、他の細胞に拡散され得る。血管異常は、栄養素の共有及び代謝副産物の除去を損ない、微小梗塞を引き起こし、グリア細胞の活性化を促進する。したがって、Tau形成、アルファ-シヌクレイン形成、又はこれらの組み合わせを実質的に低減するための多重戦略は、神経変性疾患を効果的に治療する際に重要であり得る。
アルファ-シヌクレインのドメイン構造は、N末端A2脂質結合アルファらせんドメインと、非アミロイドβ構成要素(NAC)ドメインと、C末端酸性ドメインと、を含む。脂質結合ドメインは、5つのKXKEGV不完全リピートからなる。NACドメインは、VGGAVVTGVコンセンサス配列及び3つのGXXXサブモチーフを有するGAVモチーフからなり、Xは、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser、又はMetのうちのいずれかである。C末端酸性ドメインは、DPDNEAコンセンサス配列を有する銅結合モチーフを含有する。分子学的には、アルファ-シヌクレインは、ニューロン伝達及びDNA修復において役割を果たすことが示唆されている。
いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物を利用して、アルファ-シヌクレインの領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、ノックダウンのために本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを用い、アルファ-シヌクレインmRNAの領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、アルファ-シヌクレインmRNAのエクソン又はイントロンの領域を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、アルファ-シヌクレインmRNAの非コード配列の領域(例えば、5’UTR及び3’UTR)を標的とすることができる。他の場合において、アルファ-シヌクレインmRNAのコード配列の領域を標的とすることができる。好適な領域としては、限定されないが、N末端A2脂質結合アルファらせんドメイン、非アミロイドβ構成要素(NAC)ドメイン、又はC末端酸性ドメインが挙げられる。
いくつかの態様において、アルファ-シヌクレインmRNA配列が標的とされる。いくつかの場合において、配列の3,177残基のうちのいずれか1つは、本明細書で提供される組成物及び方法を利用して標的とされ得る。いくつかの場合において、標的残基は、残基1~100、101~200、201~300、301~400、401~500、501~600、601~700、701~800、801~900、901~1000、1001~1100、1101~1200、1201~1300、1301~1400、1401~1500、1501~1600、1601~1700、1701~1800、1801~1900、1901~2000、2001~2100、2101~2200、2201~2300、2301~2400、2401~2500、2501~2600、2601~2700、2701~2800、2801~2900、2901~3000、3001~3100、及び/又は3101~3177の中に位置し得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、SNCAのRNA編集を容易にすることができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAは、SNCAの発現を、例えばSNCA遺伝子の3’UTRでの編集を容易にすることによって、ノックダウンすることができる。SNCA中の部位を標的とする、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する上述のガイドRNAは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有し得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つの配列を有し得る。SNCA遺伝子を標的とするために使用され得る操作されたポリヌクレオチドの例示的な配列としては、配列番号7、及び配列番号8が挙げられ、一方で、SNCA遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター(例えば、U1、U6、又はU7)は、上述のガイドRNAの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され(例えば、コードされ、AAVを介して送達され)てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルツハイマー病又はパーキンソン病を発症するリスクがあってもよく、又はアルツハイマー病又はパーキンソン病を発症している。対象は、ヒトであってもよく、SNCAの過剰発現が疾患の病態に影響を及ぼす神経性疾患を発症するリスクがあってもよく、又はその神経性疾患を発症している。したがって、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAを、神経性疾患(例えば、アルツハイマー病)の治療方法で使用してもよい。
SERPINA1。いくつかの実施形態において、本開示は、セルピンファミリーAメンバー1(SERPINA1)のRNA編集を容易にすることができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。例えば、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAは、SERPINA1遺伝子のヌクレオチド位置9989でGからAへの変異の修正を容易にし得る。いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAは、例えば、SERPINA1のE342を標的とし得る。SERPINA1中の部位を標的とする、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する上述のガイドRNAは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有し得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つの配列を有し得る。SERPINA1遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号26又は配列番号27が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター(例えば、U1、U6、又はU7)は、上述のガイドRNAの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され(例えば、コードされ、AAVを介して送達され)てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症を発症するリスクがあってもよく、又はアルファ-1-アンチトリプシン欠乏症を発症している。このようなアルファ-1-アンチトリプシン欠乏症は、SERPINA1の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、SERPINA1における編集を容易にし、したがって、SERPINA1における変異を修正し、対象におけるアルファ-1-アンチトリプシン欠乏症の発生を低減することができる。したがって、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAを、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症の治療方法で使用してもよい。
ABCA4。いくつかの実施形態において、本開示は、ATP結合カセットサブファミリーAメンバー4(ABCA4)のRNA編集を容易にすることができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。例えば、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAは、ABCA4遺伝子のヌクレオチド位置5714、5882、又は6320でGからAへの変異の修正を容易にし得る。ABCA4中の部位を標的とする、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する上述のガイドRNAは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有し得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つの配列を有し得る。ABCA4遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号20、配列番号21、及び配列番号22が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター(例えば、U1、U6、又はU7)は、上述のガイドRNAの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され(例えば、コードされ、AAVを介して送達され)てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、スターガルト黄斑変性(又はスターガルト病)を発症するリスクがあってもよく、又はそれを発症している。このようなスターガルト黄斑変性は、ABCA4の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ABCA4における編集を容易にし、したがって、ABCA4における変異を修正し、対象におけるスターガルト黄斑変性の発生を低減することができる。したがって、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAを、スターガルト黄斑変性の治療方法で使用してもよい。
LRRK2。ロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)は、パーキンソン病、及びクローン病等の免疫関連障害の家族性及び孤発性の症例と関連がある。その別名には、LRRK2、AURA17、DARDARIN、PARK8、RIPK7、ROCO2、又はロイシンリッチリピートキナーゼ2が含まれる。LRRK2遺伝子は、51個のエクソンで構成され、予測分子量が約286kDaの2527アミノ酸タンパク質をコードする。コードされた産物は、キナーゼ及びGTPアーゼ活性を有するマルチドメインタンパク質である。LRRK2は、限定されないが、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸、十二指腸、子宮内膜、食道、脂肪、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、及び膀胱を含む様々な組織及び臓器において見出され得る。LRRK2は、普遍的に発現可能であるが、一般的に、脳、腎臓、及び肺組織中により豊富に存在する。細胞学的に、LRRK2は、アストロサイト、内皮細胞、ミクログリア、ニューロン、及び末梢免疫細胞において見出されている。
LRRK2には100を超える変異が特定されており、そのうちの6つ(G2019S、R1441C/G/H、Y1699C、及びI2020T)は、分離分析によって、パーキンソン病を引き起こすことが示されている。G2019S及びR1441Cは、遺伝性の症例において、最も一般的な疾患を引き起こす変異である。孤発性の症例において、これらの変異は、年齢依存性の浸透率を示している。疾患を発症するG2019S変異を保有する個人の割合は、年齢が50歳から70歳まで増加すると、17%から85%まで跳ね上がる。いくつかの場合において、変異を保有する個人は、疾患を発症することはない。
LRRK2は、その触媒コアに、複合タンパク質(Roc)のRas、ROCのC末端(COR)、及びキナーゼドメインを含有する。このコアに隣接する複数のタンパク質-タンパク質相互作用ドメインである、アルマジロ反復(ARM)領域、アンキリン反復(ANK)領域、ロイシンリッチ反復(LRR)ドメインは、C末端WD40ドメインによって接合されたN末端に見出される。G2019S変異は、キナーゼドメイン内に位置する。それがキナーゼ活性を増加させることが示されている。R1441C/G/H及びY1699Cについて、これらの変異はRocドメインのGTPase活性を低下させ得る。ゲノムワイド関連研究は、LRRK2における共通の変動が、孤発性パーキンソン病を発症するリスクを増加させることを発見した。これらの変動のいくつかは、タンパク質の結合又は触媒活性に影響を与える非保存的変異であるが、その他は、その発現を調節する。これらの結果は、特定の対立遺伝子又はハプロタイプが、LRRK2発現を調節することができることを示唆している。
炎症促進シグナルは、様々な免疫細胞型においてLRRK2発現を上方調節し、このことは、LRRK2が、免疫応答における重要な調節因子であることを示唆している。研究から、全身及び中枢神経系(CNS)の炎症が両方とも、パーキンソン病の症状に関与することを発見した。更に、パーキンソン病に関連するLRRK2変異は、炎症性刺激に応答して、その発現レベルを調節する。LRRK2の多くの変異は、炎症性腸疾患(例えばクローン病)等の免疫関連障害と関連している。例えば、G2019S及びN2081Dは両方とも、LRRK2のキナーゼ活性を増加させ、特定の集団内のクローン病患者において過剰に表される。これらの障害におけるその重要な役割のため、LRRK2は、パーキンソン病及びクローン病の重要な治療標的である。特に、G2019Sを含む点変異等の多くの変異は、これらの疾患の発症において役割を果たし、LRRK2を、RNA編集等の治療戦略にとって魅力的なものとする。
いくつかの実施形態において、本開示は、LRRK2のRNA編集を容易にすることができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAは、LRRK2における以下の変異を標的とし得る。E10L、A30P、S52F、E46K、A53T、L119P、A211V、C228S、E334K、N363S、V366M、A419V、R506Q、N544E、N551K、A716V、M712V、I723V、P755L、R793M、I810V、K871E、Q923H、Q930R、R1067Q、S1096C、Q1111H、I1122V、A1151T、L1165P、I1192V、H1216R、S1228T、P1262A、R1325Q、I1371V、R1398H、T1410M、D1420N、R1441G、R1441H、A1442P、P1446L、V1450I、K1468E、R1483Q、R1514Q、P1542S、V1613A、R1628P、M1646T、S1647T、Y1699C、R1728H、R1728L、L1795F、M1869V、M1869T、L1870F、E1874X、R1941H、Y2006H、I2012T、G2019S、I2020T、T2031S、N2081D、T2141M、R2143H、Y2189C、T2356I、G2385R、V2390M、E2395K、M2397T、L2466H、又はQ2490NfsX3。LRRK2中の部位を標的とする、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する上述のガイドRNAは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有し得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つの配列を有し得る。LRRK2遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号18及び配列番号19が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター(例えば、U1、U6、又はU7)は、上述のガイドRNAの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され(例えば、コードされ、AAVを介して送達され)てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、LRRK2中の変異に関連する疾患又は状態(例えば、中枢神経系(CNS)又は胃腸(GI)管の疾患)を発症するリスクがあってもよく、又はそれを発症している。例えば、このような状態の疾患としては、クローン病又はパーキンソン病が挙げられる。このようなCNS又はGI管疾患(例えば、クローン病又はパーキンソン病)は、LRRK2の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、LRRK2における編集を容易にし、したがって、LRRK2における変異を修正し、対象におけるCNS又はGI管疾患の発生を低減することができる。したがって、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAを、クローン病又はパーキンソン病等の疾患の治療方法で使用してもよい。
DMD。いくつかの実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)遺伝子のRNA編集を容易にすることができる、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有するガイドRNAの組成物、及びそれを使用する方法を提供する)。いくつかの実施形態において、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAは、ジストロフィンタンパク質を少なくとも部分的にコードするDMD遺伝子プレmRNA中のエクソン51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8、55、2、11、17、19、21、57、59、62、63、65、66、69、74、及び/又は75等のDMD遺伝子のエクソンを標的とし得る。DMD遺伝子中の部位を標的とする、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する上述のガイドRNAは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つに対して少なくとも80%の配列同一性を有し得る。上述のガイドRNA中のsnRNA配列及びsnRNAヘアピンの配列は、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つの配列を有し得る。DMD遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号13及び配列番号14が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター(例えば、U1、U6、又はU7)は、上述のガイドRNAの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され(例えば、コードされ、AAVを介して送達され)てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、DMD遺伝子中の変異に関連する疾患又は状態(例えばDMD)を発症するリスクがあってもよく、又はその神経性疾患を発症している。DMDは、DMD遺伝子の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、DMD遺伝子における編集を容易にし、したがって、DMD遺伝子における変異を修正し、対象におけるDMDの発生を低減することができる。したがって、snRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT配列及びU7ヘアピン)を有する本開示のガイドRNAを、DMD等の疾患の治療方法で使用してもよい。
いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、変異が、挿入、欠失、ミスセンス、又はナンセンス変異である変異を有するエクソンを標的とし得る。変異は、本明細書に記載される任意の標的をコードする遺伝子中に存在し得る。編集されたRNAは、編集されたスプライスシグナルを含み、改善されたポリヌクレオチド構築物を用いない治療と比較して、エクソンスキッピングを増加させる。本明細書の別の態様において、治療薬を投与することを含む、ある状態を治療又は予防する方法は、本明細書に記載の標的を少なくとも部分的にコードするRNAの編集を増強する、snRNAヘアピン(例えば、本開示のU7ヘアピン)、snRNA配列(例えば、本開示のSmOPT配列)、又は両方を更に含み、編集されたRNAは、編集されたスプライスシグナルを含み、ヘアピンを含まない同等のアンチセンスエクソンスキッピング構築物による治療と比較して、エクソンスキッピングを増加させる。
方法は、ある疾患に関与するポリペプチドの少なくとも一部分をコードする、標的配列を編集するための操作されたポリヌクレオチドの使用を含み得る。疾患としては、限定されないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、パーキンソン病、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの場合において、疾患又は状態は、ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894 G>A、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードするDNA分子又はRNA分子中の変異に関連する。いくつかの例において、ABCA4、AAT、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、GBA、PINK1、RAB7A、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894 G>A、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードする変異したDNA分子又はRNA分子によってコードされるタンパク質は、ある疾患の病因又は進行に少なくとも部分的に寄与する。いくつかの例において、DNA又はRNA分子中の変異は、それ以外は同一の参照DNA又はRNA分子に対するものである。
多重化
いくつかの場合において、本開示は、複数の標的RNAの標的化された多重編集、標的RNA内の複数の標的部位の標的化された編集、RNAの標的化された編集及びノックダウン、又はこれらの任意の組み合わせを含む、多重化された療法を包含する。したがって、本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドを多重化し、多重療法を行うことができる。1つより覆い標的RNAを同時に標的化することが重要な場合があり、TauノックダウンとAPPにおける切断部位(例えば、β切断部位)の編集との組み合わせが相乗的に機能する場合がある。いくつかの場合において、(切断部位を単に編集するのではなく)APPの発現をノックダウンするためのmRNA塩基編集の使用は、Abeta生成を減少させるための別のアプローチであり得る。組成物を、遺伝子発現ノックダウンに適用することができるため、それらはまた、発現を低減するための開始部位編集、ガイドがリボソーム活性をブロックすることができることからの立体障害、標的化されたmRNAの分解の増加の組み合わせ、又はこれらの任意の組み合わせも含み得る。したがって、本明細書に開示される組成物及び方法は、ADAR依存性及びADAR非依存性の様式で発現を抑制し得る。
いくつかの場合において、本開示は、複数の標的RNAの標的化された多重編集、標的RNA内の複数の標的部位の標的化された編集、RNAの標的化された編集及びノックダウン、又はこれらの任意の組み合わせを含む、多重化された療法を包含する。したがって、本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドを多重化し、多重療法を行うことができる。1つより覆い標的RNAを同時に標的化することが重要な場合があり、TauノックダウンとAPPにおける切断部位(例えば、β切断部位)の編集との組み合わせが相乗的に機能する場合がある。いくつかの場合において、(切断部位を単に編集するのではなく)APPの発現をノックダウンするためのmRNA塩基編集の使用は、Abeta生成を減少させるための別のアプローチであり得る。組成物を、遺伝子発現ノックダウンに適用することができるため、それらはまた、発現を低減するための開始部位編集、ガイドがリボソーム活性をブロックすることができることからの立体障害、標的化されたmRNAの分解の増加の組み合わせ、又はこれらの任意の組み合わせも含み得る。したがって、本明細書に開示される組成物及び方法は、ADAR依存性及びADAR非依存性の様式で発現を抑制し得る。
複数のペイロードの送達
いくつかの実施形態において、本開示のベクターは、複数の標的RNAを標的とする、本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたガイドポリヌクレオチドの複数のコピーを含有し得るベクターであってもよい。例えば、ベクターは、本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のコピーを含有し得る。いくつかの場合において、ベクターは、全てが同じである本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドのコピーを含有し得る。いくつかの場合において、ベクターは、異なる本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドのコピーを含有し得る。このようなベクターは、複数のコピーが本明細書に記載の単一プロモーターに対して多シストロン性に作動可能に連結されるように構築され得る。いくつかの場合において、複数のコピーは、独立して本明細書に記載のプロモーターに連結され得る。
いくつかの実施形態において、本開示のベクターは、複数の標的RNAを標的とする、本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたガイドポリヌクレオチドの複数のコピーを含有し得るベクターであってもよい。例えば、ベクターは、本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、又は10個のコピーを含有し得る。いくつかの場合において、ベクターは、全てが同じである本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドのコピーを含有し得る。いくつかの場合において、ベクターは、異なる本明細書に記載のsnRNA配列及びsnRNAヘアピン(例えば、SmOPT及びU7)を有する操作されたポリヌクレオチドのコピーを含有し得る。このようなベクターは、複数のコピーが本明細書に記載の単一プロモーターに対して多シストロン性に作動可能に連結されるように構築され得る。いくつかの場合において、複数のコピーは、独立して本明細書に記載のプロモーターに連結され得る。
ベクター
本開示はまた、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクターを提供する。
本開示はまた、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクターを提供する。
本明細書で提供される組成物は、任意の好適な手段によって送達され得る。いくつかの場合において、好適な手段は、ベクターを含む。限定されないが、プラスミドベクター、ミニサークルベクター、線状DNAベクター、ドギーボーンベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、細胞外小胞、ナノメッシュ、それらの修飾された態様、それらの良好な製造慣行態様、それらのキメラ、並びにこれらの任意の組み合わせを含む、任意のベクター系を使用し、利用することができる。いくつかの場合において、ベクターを使用して、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを導入することができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるRNAの領域に対してハイブリダイズする標的化配列を含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子ベクターは、ポリマー系ナノ粒子、アミノ脂質系ナノ粒子、金属ナノ粒子(例えば、金系ナノ粒子)、これらのうちのいずれかの一部分、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書で提供されるベクターを使用して、本明細書で提供されるポリヌクレオチド組成物を送達することができる。いくつかの場合において、少なくとも約2、3、4、又は最大5つの異なるポリヌクレオチドが、単一ベクターを使用して送達される。いくつかの場合において、複数のベクターが送達される。いくつかの場合において、複数のベクター送達は、同時又は連続的であり得る。いくつかの場合において、少なくとも2つの操作されたポリヌクレオチドが、単一ベクターにおいて送達される。他の場合において、少なくとも2つの操作されたポリヌクレオチドが、別個のベクターで送達される。操作されたポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達されてもよい。ベクター及び/又は非ベクターアプローチの任意の組み合わせを行ってもよい。
ベクターを使用して、核酸を送達することができる。ベクターは、二本鎖DNA又は一本鎖DNA等のDNAを含み得る。ベクターは、RNAを含み得る。いくつかの場合において、RNAは、塩基修飾を含み得る。ベクターは、組換えベクターを含み得る。ベクターは、天然に存在するベクターから修飾されるベクターであり得る。ベクターは、天然に存在しないベクターの少なくとも一部分を含み得る。任意のベクターを利用することができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、これらのうちのいずれかの一部、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、ベクターは、AAVベクターを含み得る。ベクターは、修飾されたVP1タンパク質を含むように修飾され得る(例えば、VP1タンパク質を含むように修飾されたAAVベクター)。ある態様において、AAVベクターは、組換えAAV(rAAV)ベクターである。rAAVは、野生型AAV(wtAAV)で見られるのと実質的に類似したカプシド配列及び構造で構成され得る。しかしながら、rAAVは、AAVタンパク質コード配列を実質的に有さず、それらの代わりに設計された対象ポリヌクレオチド等の治療用遺伝子発現カセットを有するゲノムを封入する。いくつかの場合において、ウイルス起源の配列は、ITRであってもよく、ベクター産生中のゲノム複製及びパッケージングを導くことが必要な場合がある。好適なAAVベクターは、任意のAAV血清型、又は血清型の組み合わせから選択することができる。例えば、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか1つであり得る。いくつかの場合において、ベクターは、その天然の向性に基づいて選択される。いくつかの場合において、ベクター血清型は、血液脳関門を通過するその能力に基づいて選択される。AAV9及びAAV10は、血液脳関門を通過して、ニューロン及びグリアを形質導入することが示されている。ある態様において、AAVベクターは、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、又はAAV9である。いくつかの場合において、AAVベクターは、少なくとも2つの血清型のキメラである。ある態様において、AAVベクターは、血清型AAV2、AAV5、及びAAV9のベクターである。いくつかの場合において、キメラAAVベクターは、AAV2由来のrep及びITR配列と、AAV5由来のcap配列と、を含む。いくつかの場合において、rep、cap、及びITR配列を混合し、本明細書で提供される異なるAAV血清型の全てからマッチングすることができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、AAVベクターであり、AAVベクターは、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、それらの一部分、それらの融合産物、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される血清型のものである。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、AAV2由来のrep及びITR配列と、AAV5由来のcap配列と、を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、自己相補的ITRであるITR配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドをコードするAAVベクターは、自己相補的である。
いくつかの場合において、好適なAAVベクターは、カプシド又はrepタンパク質等の修飾を包含するように更に修飾され得る。修飾には、欠失、挿入、変異、及びこれらの組み合わせも含まれ得る。いくつかの場合において、ベクターに対する修飾が行われ、反復投与を可能にするために、免疫原性を低減する。いくつかの場合において、免疫原性を低減及び/又は除外するために反復投与が実施されるときに、利用されるベクターの血清型が変化する。
レトロウイルスベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入を媒介する薬剤として有用である。レトロウイルスベクターは、一般的に、ウイルスの構造遺伝子をコードする配列の大部分が欠失し、目的の遺伝子によって置き換えられるように構築される。ほとんどの場合、構造遺伝子(例えば、gag、pol、及びenv)は、当該技術分野において既知の遺伝子操作技術を使用して、レトロウイルス骨格から除去される。これには、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化、又はいくつかの場合において、Bal 31エクソヌクレアーゼによる消化が含まれ、パッケージングシグナルの適切な部分を含有する断片を生成し得る。
これらの新しい遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルス骨格に組み込まれている。最も単純な構築は、レトロウイルスの構造遺伝子が単一遺伝子によって置き換えられ、その後、長い末端反復(LTR)内のウイルス調節配列の制御下で転写されるものである。レトロウイルスベクターも構築されており、1つより多い遺伝子を標的細胞に導入することができる。通常、そのようなベクターにおいて、1つの遺伝子がウイルスLTRの調節制御下にあり、一方で、第2の遺伝子は、スプライシングされたメッセージから外れて発現されるか、又は独自の内部プロモーターの調節下にある。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)である。AAVは、25nmのカプシドを有する小さなノンエンベロープウイルスである。野生型ウイルスに関連することが知られているか、又は既に示されている疾患は存在しない。AAVは、一本鎖DNA(ssDNA)ゲノムを有する。AAVは、長期間のエピソーム導入遺伝子発現を示すことが示されており、AAVは、脳、特にニューロンにおいて優れた導入遺伝子発現を示している。わずか300塩基対のAAVを含有するベクターをパッケージングすることができ、統合することができる。外因性DNAのための空間は、約4.7kbに制限される。AAVベクターを使用して、DNAを細胞に導入することができる。様々な核酸が、AAVベクターを使用して異なる細胞型に導入されてきた。多くの代替的AAVバリアントが存在し(100を超えるものがクローニングされている)、AAVバリアントは、所望の特徴に基づいて特定されている。例えば、AAV9は、血液脳関門を効率的に通過することが示されている。更に、AAVカプシドは、形質導入効率及び選択性を増加させるように遺伝的に操作することができる(例えば、ビオチン化AAVベクター、指向性の分子進化、自己相補的AAVゲノム等)。祖先配列に基づくAAVを含め、修飾されたAAVも記載されている。記載されている他の修飾されたAAVとしては、埋め込まれたアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する酸不安定性ポリマーの層によって囲まれている導入遺伝子を発現するAAVコアを有するキメラナノ粒子(ChNP)が挙げられる。本明細書に開示される組成物及び方法は、プラットフォーム技術であり、したがって、本明細書に開示される組成物及び方法は、ChNP等の文献に記載される修飾されたAAVを含む、全ての既知のAAVとともに使用することができる。
別の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス由来のベクターである。アデノウイルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコードし、発現するが、正常な溶解性ウイルスライフサイクルで複製する能力の観点では不活性化されるように、操作することができる。アデノウイルス株Ad型5 dl324又はアデノウイルスの他の株(例えば、Ad2、Ad3、若しくはAd7等)に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者に既知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができず、上皮細胞を含む多種多様な細胞型に感染するために使用することができるという点で、特定の状況において有利であり得る。更に、ウイルス粒子は、比較的安定しており、精製及び濃縮に適しており、上述のように、感染性のスペクトルに影響を及ぼすように修飾することができる。加えて、導入されたアデノウイルスDNA(及びそれに含まれる外来DNA)は、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、エピソームのままであり、それによって、系中での挿入突然変異の結果として生じ得る潜在的な問題を回避し、導入されたDNAが宿主ゲノムに組み込まれるようになる(例えば、レトロウイルスDNA)。更に、外来DNAについてのアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して、大きい(最大8キロ塩基)。アルファウイルスも使用することができる。アルファウイルスは、広範な宿主範囲を有するエンベロープ一本鎖RNAウイルスであり、ウイルス遺伝子療法プロトコルで使用される場合、アルファウイルスは、高レベルの一過性の遺伝子発現を提供することができる。例示的なアルファウイルスとしては、セムリキ森林ウイルス(SFV)、シンドビスウイルス(SIN)、及びベネズエラウマ脳炎(VEE)ウイルスが挙げられ、これらは全て、効率的な複製欠損及び複製能力のある発現ベクターを提供するように遺伝子操作されている。アルファウイルスは、顕著な神経向性を示すため、CNS関連疾患に有用である。
ベクターを使用して、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドと、治療標的を標的とする追加のポリヌクレオチド(例えば、第2のポリヌクレオチド)とを送達することができる。いくつかの場合において、ベクターは、第2のポリヌクレオチド(例えば、追加の治療標的)と会合する追加のRNAポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする。このようなベクターを使用して、複数の治療標的を同時に標的とする多重療法、例えば、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患の場合には、アミロイド前駆体タンパク質、及びTauタンパク質等の疾患に関与する追加の標的(例えば、MAPT遺伝子からコードされる微小管関連タンパク質Tau(MAPT)、又はアルファ-シヌクレインタンパク質を送達することができる。代替的に、又はこれに加えて、追加の標的は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド上(例えば、同じポリヌクレオチド上)の更なる編集部位であり得る。操作されたポリヌクレオチドをコードするベクターポリヌクレオチド、及び追加のRNAポリヌクレオチドをコードする第2のベクターポリヌクレオチドは、連続していてもよく、又は連続していなくてもよい。第1及び第2のベクターポリヌクレオチドが互いに連続している場合、それらは同じプロモーター配列に作動可能に連結され得る。
非ウイルスベクターアプローチ
いくつかの場合において、ベクターは、ウイルスベクターでなくてもよい。非ウイルス方法は、ポリヌクレオチドを含む組成物等の裸の送達を含み得る。いくつかの場合において、本明細書で提供される修飾をポリヌクレオチドに組み込み、裸のポリヌクレオチドとして送達される場合に、安定性を増加させ、分解と戦うことができる。他の場合において、非ウイルスアプローチは、ナノ粒子、リポソーム等の使用を利用することができる。
いくつかの場合において、ベクターは、ウイルスベクターでなくてもよい。非ウイルス方法は、ポリヌクレオチドを含む組成物等の裸の送達を含み得る。いくつかの場合において、本明細書で提供される修飾をポリヌクレオチドに組み込み、裸のポリヌクレオチドとして送達される場合に、安定性を増加させ、分解と戦うことができる。他の場合において、非ウイルスアプローチは、ナノ粒子、リポソーム等の使用を利用することができる。
薬学的組成物
組成物は、本明細書に記載の任意の編集エンティティを含み得る。薬学的組成物は、第1の活性成分を含み得る。第1の活性成分は、本明細書に記載のウイルスベクター、本明細書に記載の天然に存在しないRNA、又は本明細書に記載の核酸を含み得る。薬学的組成物は、単位剤形で製剤化され得る。薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を含み得る。薬学的組成物は、例えば、疾患又は状態に関与する遺伝子のエクソンスキッピングの増強を容易にする等のために、第2、第3、又は第4の活性成分を含み得る。
組成物は、本明細書に記載の任意の編集エンティティを含み得る。薬学的組成物は、第1の活性成分を含み得る。第1の活性成分は、本明細書に記載のウイルスベクター、本明細書に記載の天然に存在しないRNA、又は本明細書に記載の核酸を含み得る。薬学的組成物は、単位剤形で製剤化され得る。薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を含み得る。薬学的組成物は、例えば、疾患又は状態に関与する遺伝子のエクソンスキッピングの増強を容易にする等のために、第2、第3、又は第4の活性成分を含み得る。
本明細書に記載の組成物は、賦形剤を損ない得る。賦形剤は、DMSO、グリセロール、ポリビニルピロリドン(PVP)、又はこれらの任意の組み合わせ等の凍結保存剤を含み得る。賦形剤は、スクロース、トレハロース、デンプン、これらのいずれかの塩、これらのいずれかの誘導体、又はこれらの任意の組み合わせ等の凍結保存剤を含み得る。賦形剤は、pH剤(組成物の構成要素の酸化若しくは分解を最小限に抑えるため)、安定化剤(組成物の構成要素の修飾若しくは分解を防止するため)、緩衝剤(温度安定性を増強するため)、可溶化剤(タンパク質溶解性を増加させるため)、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、界面活性剤、糖、アミノ酸、抗酸化剤、塩、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、トリグリセリド、アルコール、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ポリソルベート80、リン酸ナトリウム、スクロース、リン酸二ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート20、ヒスチジン、クエン酸塩、アルブミン、水酸化ナトリウム、グリシン、クエン酸ナトリウム、トレハロース、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸塩、HCl、エデト酸二ナトリウム、レシチン、グリセリン、キサンタンゴム、大豆イソフラボン、ポリソルベート80、エチルアルコール、水、テプレノン、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書に開示される組成物及び方法は、mRNA塩基編集アプローチを介して標的化することを含み得る。これらのベクターは、SNCA又はRab7Aを標的とする操作されたポリヌクレオチドをコードして(編集されたスプライスシグナルのエクソンスキッピングを促進し)、神経変性疾患又は状態と関連する1つ以上の追加のタンパク質をコードする本明細書に開示される1つ以上の追加の操作されたポリヌクレオチド又は他の治療剤をコードし得る。
組成物は、プレmRNAを編集し、ii)スプライスシグナルを編集し、エクソンスキッピングを誘導するか、又はこれらの任意の組み合わせのためのmRNA塩基編集を含み得る。編集によって、エクソンスキッピングが起こり得る(例えば、開始部位を含有し得るエクソン)。
本開示の組成物は、標的RNAポリヌクレオチド配列においてヌクレオチドを編集するための操作されたポリヌクレオチドを含み得る。組成物は、ADAR依存的又はADAR非依存的な様式で編集を用いることができる。組成物は、RNA編集エンティティを介した標的RNAの編集を容易にする動員ドメインを含み得る。
本明細書に提供される組成物及び方法は、薬学的組成物を利用することができる。全体を通して記載される組成物が、医薬品へと製剤化され、これを使用して、それを必要とし、疾患を有すると診断されたヒト又は哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合において、薬学的組成物を予防的に使用することができる。
本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される方法に利用され得る。本明細書で提供される、提供される組成物のいずれかは、本明細書で提供される方法に利用され得る。いくつかの場合において、方法は、疾患若しくは状態、又は疾患若しくは状態の症状を少なくとも部分的に予防し、低減し、軽減し、及び/又は治療することを含む。対象は、ヒト又は非ヒトであり得る。対象は、哺乳動物(例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ)であり得る。対象は、脊椎動物又は無脊椎動物であり得る。対象は、実験動物であり得る。対象は、患者であり得る。対象は、疾患を患っていてもよい。対象は、疾患の症状を呈していてもよい。対象は、疾患の症状を呈していないが、それでも疾患を有していてもよい。対象は、介護者の医療ケアの下にあってもよい(例えば、対象は、入院し、医師によって治療される)。
投与経路及び投薬量
本明細書に記載される組成物は、対象への送達のためにAAV(IV/CNS)ベクターを用いることができる。AAVベクター送達は、単回用量で長期的な利益を達成することができ、多重化された標的化の機会を提供することができる。方法は、CNS/IV投薬を用いて中枢神経細胞向性及び生体内分布を促進することができるAAV血清型を特定することを含み得る。
本明細書に記載される組成物は、対象への送達のためにAAV(IV/CNS)ベクターを用いることができる。AAVベクター送達は、単回用量で長期的な利益を達成することができ、多重化された標的化の機会を提供することができる。方法は、CNS/IV投薬を用いて中枢神経細胞向性及び生体内分布を促進することができるAAV血清型を特定することを含み得る。
いくつかの場合において、投与は、生物学的作用を有する所望の部位への化合物又は組成物の送達を可能にするために使用され得る方法を指すことができる。送達は、中枢神経系(CNS)への直接的な適用を含み得る。送達は、血液脳関門を通過することを許容するものを含み得る。送達は、体の組織又は領域に影響を及ぼすような直接的な適用を含み得る。本明細書で提供される組成物は、任意の方法によって投与され得る。投与方法は、吸入、耳、口腔内、結膜、歯、子宮頸管内、洞内(endosinusial)、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、嚢内、心腔内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内(intraductal)、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄腔内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内(intrasinal)、髄腔内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸郭内、管内(intratubular)、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮(percutaneous)、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮(transdermal)、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、鞘内、心室内、定位的、又はこれらの任意の組み合わせによるものであり得る。送達は、非経口投与(静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、又は注入を含む)、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚等の表面の外表面に対する局所投与(ローション、クリーム、軟膏)を含み得る。いくつかの場合において、投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、若しくは経鼻投与、又はこれらの任意の組み合わせによるものである。いくつかの場合において、対象は、監督のない状態で組成物を投与され得る。いくつかの場合において、対象は、医療専門家(例えば、医師、看護師、医療助手、雑役係、ホスピスワーカー等)の監督下で組成物を投与され得る。医療専門家は、組成物を投与し得る。いくつかの場合において、化粧品専門家は、組成物を投与し得る。
本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物の投与又は適用は、少なくとも約少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、又は100日間の連続した日数又は非連続の日数の治療期間にわたって行うことができる。治療期間は、約1~約30日間、約2~約30日間、約3~約30日間、約4~約30日間、約5~約30日間、約6~約30日間、約7~約30日間、約8~約30日間、約9~約30日間、約10~約30日間、約11~約30日間、約12~約30日間、約13~約30日間、約14~約30日間、約15~約30日間、約16~約30日間、約17~約30日間、約18~約30日間、約19~約30日間、約20~約30日間、約21~約30日間、約22~約30日間、約23~約30日間、約24~約30日間、約25~約30日間、約26~約30日間、約27~約30日間、約28~約30日間、又は約29~約30日間であり得る。
本明細書に開示される任意の操作されたポリヌクレオチドエクソンスキッピング構築物を含む組成物の投与又は適用は、少なくとも約1週間、少なくとも約1ヶ月、少なくとも約1年、少なくとも約2年、少なくとも約3年、少なくとも約4年、少なくとも約5年、少なくとも約6年、少なくとも約7年、少なくとも約8年、少なくとも約9年、少なくとも約10年、少なくとも約15年、少なくとも約20年、又はそれより長い治療期間にわたって行うことができる。投与は、対象の生涯にわたって、例えば、対象の生涯にわたって、月に1回又は年に1回、繰り返し実施することができる。投与は、対象の生涯のかなりの期間にわたって、例えば、少なくとも約1年、5年、10年、15年、20年、25年、30年、又はそれより長い期間にわたって、月に1回又は年に1回、繰り返し実施することができる。
いくつかの場合において、薬学的組成物を含め、本明細書で提供される任意の組成物の投与は、例えば、ある疾患若しくは状態の症状を低減するため、及び/又はある疾患若しくは状態を低減するための有効量であり得る。有効量は、所望の効果を達成するのに十分なものであり得る。治療的用途又は予防的用途の文脈で、有効量は、問題としている状態の種類及び重症度、並びに個々の対象の特徴、例えば、一般的な健康、年齢、性別、体重、及び薬学的組成物に対する忍容性に依存する。免疫原性組成物の文脈では、いくつかの実施形態において、有効量は、病原体に対する保護応答をもたらすのに十分な量である。他の実施形態において、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、それを必要とする対象に受動免疫を付与するために必要な量である。免疫原性組成物に関して、いくつかの実施形態において、有効量は、上述の因子に加えて、意図される使用、特定の抗原性化合物の免疫原性の程度、及び対象の免疫系の健康/応答性に依存する。
操作されたポリヌクレオチドのいずれかを含む、本明細書に開示される組成物の投与又は適用は、1日に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、又は24回行うことができる。いくつかの場合において、本明細書に開示される組成物の投与又は適用は、1週間に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、又は21回行うことができる。いくつかの場合において、本明細書に開示される組成物の投与又は適用は、1ヶ月に少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、又は90回行うことができる。
操作されたポリヌクレオチドのいずれかを含む本開示の組成物は、単回用量として、又は分割された用量として投与/適用することができる。いくつかの場合において、本明細書に記載の組成物は、第1の時間点及び第2の時間点で投与され得る。いくつかの場合において、組成物は、第1の投与が他の投与の前に投与され、投与時間の差が1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、16時間、20時間、1日間、2日間、4日間、7日間、2週間、4週間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、1年間、又はそれより長いように投与され得る。
本開示のベクターは、任意の好適な用量で対象に投与され得る。好適な用量は、少なくとも約5×107~50×1013ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、10×107、11×107、15×107、20×107、25×107、30×107、又は50×107ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×107~6×107、6×107~7×107、7×107~8×107、8×107~9×107、9×107~10×107、10×107~11×107、11×107~15×107、15×107~20×107、20×107~25×107、25×107~30×107、30×107~50×107、又は50×107~100×107ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×107~10×107、10×107~25×107、又は25×107~50×107ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、10×108、11×108、15×108、20×108、25×108、30×108、又は50×108ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×108~6×108、6×108~7×108、7×108~8×108、8×108~9×108、9×108~10×108、10×108~11×108、11×108~15×108、15×108~20×108、20×108~25×108、25×108~30×108、30×108~50×108、又は50×108~100×108ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×108~10×108、10×108~25×108、又は25×108~50×108ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109、又は50×109ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約5×109~6×109、6×109~7×109、7×109~8×109、8×109~9×109、9×109~10×109、10×109~11×109、11×109~15×109、15×109~20×109、20×109~25×109、25×109~30×109、30×109~50×109、又は50×109~100×109ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×109~10×109、10×109~25×109、又は25×109~50×109ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、又は50×1010ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約5×1010~6×1010、6×1010~7×1010、7×1010~8×1010、8×1010~9×1010、9×1010~10×1010、10×1010~11×1010、10×1010~15×1010、15×1010~20×1010、20×1010~25×1010、25×1010~30×1010、30×1010~50×1010、又は50×1010~100×1010ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×1010~10×1010、10×1010~25×1010、又は25×1010~50×1010ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、10×1011、11×1011、15×1011、20×1011、25×1011、30×1011、又は50×1011ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約5×1011~6×1011、6×1011~7×1011、7×1011~8×1011、8×1011~9×1011、9×1011~10×1011、10×1011~11×1011、11×1011~15×1011、15×1011~20×1011、20×1011~25×1011、25×1011~30×1011、30×1011~50×1011、又は50×1011~100×1011ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×1011~10×1011、10×1011~25×1011、又は25×1011~50×1011ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10×1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012、又は50×1012ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約5×1012~6×1012、6×1012~7×1012、7×1012~8×1012、8×1012~9×1012、9×1012~10×1012、10×1012~11×1012、11×1012~15×1012、15×1012~20×1012、20×1012~25×1012、25×1012~30×1012、30×1012~50×1012、又は50×1012~100×1012ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×1012~10×1012、10×1012~25×1012、又は25×1012~50×1012ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×1013、6×1013、7×1013、8×1013、9×1013、10×1013、11×1013、15×1013、20×1013、25×1013、30×1013、又は50×1013ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約5×1013~6×1013、6×1013~7×1013、7×1013~8×1013、8×1013~9×1013、9×1013~10×1013、10×1013~11×1013、11×1013~15×1013、15×1013~20×1013、20×1013~25×1013、25×1013~30×1013、30×1013~50×1013、又は50×1013~100×1013ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×1013~10×1013、10×1013~25×1013、又は25×1013~50×1013ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約5×1013、6×1013、7×1013、8×1013、9×1013、10×1013、11×1013、15×1013、20×1013、25×1013、30×1013、又は50×1013ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約5×1013~6×1013、6×1013~7×1013、7×1013~8×1013、8×1013~9×1013、9×1013~10×1013、10×1013~11×1013、11×1013~15×1013、15×1013~20×1013、20×1013~25×1013、25×1013~30×1013、30×1013
~50×1013、又は50×1013~100×1013ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×1013~10×1013、10×1013~25×1013、又は25×1013~50×1013ゲノムコピー/mLであり得る。
~50×1013、又は50×1013~100×1013ゲノムコピー/mLであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約5×1013~10×1013、10×1013~25×1013、又は25×1013~50×1013ゲノムコピー/mLであり得る。
いくつかの場合において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、少なくとも約1×107~約1×1013ゲノムコピー/kg体重のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、又は9×107ゲノムコピー/kg体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、又は9×108ゲノムコピー/kg体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、又は9×109ゲノムコピー/kg体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、又は9×1010ゲノムコピー/kg体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、又は9×1011ゲノムコピー/kg体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、又は9×1012ゲノムコピー/kg体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013、又は9×1013ゲノムコピー/kg体重であり得る。
キット
また、本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドを発現するベクター、本開示の操作されたポリヌクレオチドを発現する組換え細胞、又は本明細書に開示される組成物と、使用のための説明書とを含むか、又は代替的にそれらから本質的になるか、又は更にそれらからなるキットが本明細書に開示される。一態様において、説明書は、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを使用する方法を列挙する。
また、本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドを発現するベクター、本開示の操作されたポリヌクレオチドを発現する組換え細胞、又は本明細書に開示される組成物と、使用のための説明書とを含むか、又は代替的にそれらから本質的になるか、又は更にそれらからなるキットが本明細書に開示される。一態様において、説明書は、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを使用する方法を列挙する。
キットは、ウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、容器中に包装されてもよい。キットは、天然に存在しないRNAを含み得る。天然に存在しないRNAは、容器中に包装されてもよい。キットは、シリンジを含み得る。キットは、本明細書に記載の薬学的組成物を含み得る。キットは、本明細書に記載のウイルスベクター、天然に存在しないRNA、薬学的組成物の投与のための説明書を含み得る。
付番された実施形態
いくつかの組成物、及び方法が、本明細書で開示される。これらの組成物及び方法の具体的な例示的な実施形態を以下に開示する。以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も企図される。特に、これらの付番された実施形態の各々は、列挙されるようなそれらの順序とは無関係に、あらゆる前又は後続の付番された実施形態に依存するか、又は関連するものとして企図される。
実施形態1.操作されたポリヌクレオチドであって、標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ標的RNAの一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズするときに、少なくとも1つのミスマッチを含有する、標的化配列と、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、RNA編集エンティティによる標的RNAの塩基の編集を容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態2.操作されたポリヌクレオチドであって、標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含有する標的化配列であって、標的RNAが、疾患又は状態に関与するエクソン中に変位を含む、標的化配列と、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームsnRNA、非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、標的RNA中のエクソンのエクソンスキッピングを容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態3.ミスマッチが、少なくとも1つのアデニン-グアニン(A-G)ミスマッチ、少なくとも1つのアデニン-アデニン(A-A)ミスマッチ、又は少なくとも1つのアデニン-シトシン(A-C)を含む、実施形態1又は2の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態4.ミスマッチが、A-Cミスマッチを含む、実施形態3の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態5.A/Cミスマッチが、デアミナーゼ存在下で標的RNAと会合したときに、デアミナーゼによって標的RNAにおいて編集を促進するように構成される、実施形態4の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態6.Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアント、及びヘアピンが、操作されたポリヌクレオチドの3’末端上にある、実施形態1~5のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態7.操作されたポリヌクレオチドが、複数のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、複数のヘアピンと、を含む、実施形態1~6のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態8.標的化配列が、約25塩基~約200塩基長である、実施形態1~7のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態9.標的化配列が、少なくとも約30塩基長である、実施形態1~7のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態10.操作されたポリヌクレオチドが、RNAポリメラーゼII型プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態1~9のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態11.RNAポリメラーゼII型プロモーターが、U1プロモーターを含む、実施形態10の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態12.RNAポリメラーゼII型プロモーターが、U7プロモーターを含む、実施形態10の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態13.操作されたポリヌクレオチドが、U6プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態1~12のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態14.Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントが、SmOPT配列である、実施形態1~13のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態15.SmOPT配列が、AAUUUUUGG又は配列番号41に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態14の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態16.SmOPT配列が、AAUUUUUGG又は配列番号41を含む、実施形態14の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態17.ヘアピンが、マウスU7 snRNA、ヒトU7 snRNA、又はヒトU1 snRNA由来である、実施形態1~16のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態18.ヘアピンが、マウスU7 snRNA、ヒトU7 snRNA、ヒトU1 snRNAのうちの1つ以上のキメラヘアピンである、実施形態1~17のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態19.ヘアピンが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つのヘアピン配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態1~18のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態20.ヘアピンが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つのヘアピン配列を含む、実施形態19のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態21.ヘアピンが、配列番号43のヘアピン配列を含む、実施形態1~20のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態22.操作されたポリヌクレオチドの3’末端にU7ボックスターミネーターを更に含む、実施形態1~21のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態23.5’から3’の標的化配列が、標的化配列と、Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、ヘアピンと、を含む、実施形態1~22のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態24.操作されたポリヌクレオチドが、RNA編集エンティティによる標的RNAのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成されている、実施形態2の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態25.RNA編集エンティティが、ADARタンパク質、APOBECタンパク質、又は両方を含む、実施形態1~24のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態26.RNA編集エンティティが、ADARを含み、ADARが、ADAR1又はADAR2を含む、実施形態1~24のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態27.標的化配列が、疾患又は状態において実行される標的RNAに少なくとも部分的に結合する、実施形態1~26のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態28.標的RNAが、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、HFE、LIPA、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態27の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態29.標的RNAが、SERPINA1であり、SERPINA1が、E342K変異を含む、実施形態28の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態30.標的RNAが、LRRK2であり、LRRK2が、G2019S変異を含む、実施形態28の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態31.疾患又は状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、又はテイ・サックス病を含む、実施形態1~30のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態32.操作されたポリヌクレオチドが、snRNA由来の追加の配列を更に含む、実施形態1~31のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態33.snRNA配列が、少なくとも部分的にU1、U2、U4、U5、U6、又はU7 snRNA配列を含む、実施形態1~32のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態34.操作されたポリヌクレオチドが、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、実施形態1~33のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態35.snRNA配列が、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、実施形態34の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態36.snRNAプロモーターが、少なくとも部分的にU1、U2、U4、U5、U6、又はU7 snRNAプロモーターを含む、実施形態4の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態37.標的化配列が、標的RNA内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的である、実施形態1~36のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態38.標的化配列が、
(a)標的RNA内のエクソンの上流にある分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であるか、又は
(b)標的化配列が、標的RNA内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的である、実施形態37の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態39.操作されたポリヌクレオチドが、インビトロで測定される場合に、Sm若しくはSm様結合ドメイン、又はそのバリアントを含まないか、ヘアピンを含まないか、あるいはSm若しくはSm様結合ドメイン、又はそのバリアント及びヘアピンを含まない、同等のエクソンスキッピング構築物と比較して、改善されたエクソンスキッピングの効率を有する、実施形態1の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態40.効率が、少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含まない同等のエクソンスキッピング構築物を含む細胞と比較して、操作されたポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞における、操作されたポリヌクレオチドによってスキッピングされたエクソンのスキッピングの割合を検出するために、デジタル液滴PCRアッセイを行うことによって決定される、実施形態39の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態41.操作されたポリヌクレオチドが、スプライスシグナル内の塩基の編集を容易にするように構成される、実施形態37~40のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態42.編集が、エクソンのスキッピングを少なくとも部分的に促進するように構成される、実施形態41の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態43.操作されたポリヌクレオチドが、インビトロアッセイによって測定される場合、少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は少なくとも50%、エクソンスキッピングの効率が増加する、実施形態39~42のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態44.少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドが、標的RNAと会合したときに、操作されたポリヌクレオチドを、デアミナーゼを介する標的RNAの塩基の編集を容易にするように少なくとも部分的に構成する、実施形態1~43のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態45.標的化配列が、標的RNAに結合したときに、デアミナーゼと会合して、デアミナーゼによる標的RNAのポリヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にする、実施形態44の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態46.ミスマッチが、標的化配列のいずれかの末端から約1~約200塩基に位置する、実施形態1~45のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態47.ミスマッチが、標的化配列のいずれかの末端から少なくとも45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、又は55塩基に位置する、実施形態1~45のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態48.デアミナーゼ動員ドメインを更に含む、実施形態1~47のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態49.デアミナーゼ動員ドメインが、GluR2、Alu、これらのいずれかの一部分、これらのいずれかのバリアント、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態47の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態50.デアミナーゼ動員ドメインが、ステムループを含む、実施形態47又は48の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態51.ステムループが、左巻きのステムループ又は右巻きのステムループである、実施形態49の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態52.ステムループが、GluR2ドメインに対して少なくとも約80%の配列同一性を含む、実施形態50の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態53.操作されたポリヌクレオチドが、少なくとも1つの化学修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドを含む、実施形態1~51のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態54.少なくとも1つの化学修飾が、表1に提供される操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の修飾を含む、実施形態1~52のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態55.操作されたポリヌクレオチドが、水溶液中に存在し、標的RNAに結合していないときに、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを欠いている、実施形態1~53のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態56.操作されたポリヌクレオチドが、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態1~54のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態57.操作されたポリヌクレオチドが、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、バルジを含む、実施形態1~55のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態58.バルジが、非対称バルジである、実施形態56の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態59.バルジが、対称バルジである、実施形態56の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態60.操作されたポリヌクレオチドが、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、内部ループを含む、実施形態55~58のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態61.内部ループが、非対称ループである、実施形態59の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態62.内部ループが、対称ループである、実施形態59の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態63.操作されたポリヌクレオチドが、構造的なループ安定化骨格を含む、実施形態1~53のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態64.構造的なループ安定化骨格が、標的化配列を更に含み、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、RNA編集酵素による標的RNAのヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にし、標的化配列が、少なくとも約4個の連続したヌクレオチドを含む、実施形態62の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態65.操作されたポリヌクレオチドが、標的化配列に隣接する第1のスペーサードメイン及び第2のスペーサードメインを更に含み、操作されたポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞における転写の後に自己環化するように構成されている、実施形態1~63のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態66.操作されたポリヌクレオチドが、第1のスペーサードメインに対して5’に、又は第2のスペーサードメインに対して3’に、又は両方に、リボザイムドメインを含む、実施形態64の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態67.操作されたポリヌクレオチドが、リボザイムドメインと第1のスペーサードメインとの間に、又はリボザイムドメインと第2のスペーサードメインとの間にライゲーションドメインを含む、実施形態65の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態68.ポリヌクレオチド配列が二次元的に表される場合、操作されたポリヌクレオチドが、線形である、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態69.操作されたポリヌクレオチドが、溶媒に曝露される3’還元ヒドロキシルを欠いている、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態70.操作されたポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞へトランスフェクトされる場合に化学変化を受けるように構成され、その結果、化学変化の後、操作された化学修飾が、溶媒に曝露された3’還元ヒドロキシルを欠いている、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態71.標的化配列が、アプタマーを含まない、実施形態64~69のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態72.操作されたポリヌクレオチドが、RNA干渉(RNAi)のために構成された配列をコードする配列を含まないか、又はそれをコードしない、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態73.標的化配列が、標的RNAの3’又は5’非翻訳領域(UTR)の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態74.標的化配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態75.標的化配列が、標的RNAのイントロン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態76.標的化配列が、標的RNAのエクソン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態77.操作されたポリヌクレオチドが、約80ヌクレオチド~約600ヌクレオチドである、実施形態1~76のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態78.操作されたポリヌクレオチドが、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、実施形態1~77のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態79.snRNA配列が、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、実施形態78の操作されたポリヌクレオチド。d
実施形態80.操作されたポリヌクレオチドが、標的化配列に対して5’に第1のスペーサードメインを含む、実施形態1~79のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態81.操作されたポリヌクレオチドが、第1のスペーサードメインとは異なるか、又は同一である第2のスペーサードメインを含む、実施形態80の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態82.第1のスペーサードメイン、第2のスペーサードメイン、又は両方が、5’ AUAUA 3’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態80又は81の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態83.第1のスペーサードメイン、第2のスペーサードメイン、又は両方が、5’ AUAAU 3’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態80又は81の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態84.操作されたポリヌクレオチドが、5’末端に第1のリボザイムドメインと、3’末端に第2のリボザイムドメインと、を含む、実施形態70~83のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態85.第1又は第2のリボザイムが、独立して、ハンマーヘッドリボザイム、glmSリボザイム、HDV様リボザイム、R2エレメント、ペプチジルトランスフェラーゼ23S rRNA、GIR1分岐リボザイム、リードザイム、II群イントロン、ヘアピンリボザイム、VSリボザイム、CPEB3リボザイム、CoTCリボザイム、及びI群イントロンからなる群から選択される、実施形態84の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態86.実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクター。
実施形態87.ベクターが、リポソーム、ナノ粒子、又はデンドリマーを含む、実施形態86のベクター。
実施形態88.ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態86のベクター。
実施形態89.ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、実施形態88のベクター。
実施形態90.AAVベクターが、AAV2ベクター、AAV5ベクター、AAV8ベクター、AAV9ベクター、又はこれらのいずれかのハイブリッドである、実施形態89のベクター。
実施形態91.ウイルスベクターが、自己相補的アデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターである、実施形態89又は90のベクター。
実施形態92.ウイルスベクターが、一本鎖AAVベクターである、実施形態89~90のうちのいずれか1つのベクター。
実施形態93.実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターを含む、単離された細胞。
実施形態94.単離された細胞が、T細胞である、実施形態93の単離された細胞。
実施形態95.実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、単位剤形での薬学的組成物。
実施形態96.状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、有効量の実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクター、又は実施形態95の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
実施形態97.状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症、又はスターガルト病である、実施形態96の方法。
実施形態98.状態が、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894 G>A、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子中の変異と関連する、実施形態96の方法。
実施形態99.投与することが、吸入、耳、口腔内、結膜、歯、子宮頸管内、洞内(endosinusial)、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、嚢内、心腔内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内(intraductal)、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄腔内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内(intrasinal)、髄腔内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸郭内、管内(intratubular)、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮(percutaneous)、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮(transdermal)、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、鞘内、心室内、定位的、又はこれらの任意の組み合わせである、実施形態96~98のうちのいずれか1つの方法。送達は、非経口投与(静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、又は注入を含む)、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚等の表面の外表面に対する局所投与(ローション、クリーム、軟膏)を含み得る。いくつかの場合において、投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、若しくは経鼻投与、又はこれらの任意の組み合わせによるものである。
実施形態100.追加の治療を行うことを更に含む、実施形態96~99のうちのいずれか1つの方法。
実施形態101.追加の治療が、同時に、又は連続的に行われる、実施形態100の方法。
実施形態102.投与が、少なくとも週に1回行われる、実施形態96~101のうちのいずれか1つの方法。
実施形態103.対象は、投与前にインビトロ診断によって疾患又は状態を有すると診断されている、実施形態96~102のうちのいずれか1つの方法。
実施形態104.対象が、ヒトである、実施形態96~103のうちのいずれか1つの方法。
実施形態105.実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチドを容器中に含むか、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを容器中に含むか、実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターを容器中に含むか、又は実施形態95の薬学的組成物を容器中に含む、キット。
実施形態106.薬学的組成物を作製する方法であって、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を、本開示の操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターのうちの少なくとも1つとを接触させることを含む、方法。
実施形態107.キットを作製する方法であって、容器内に少なくとも部分的に、
(a)実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド、
(b)実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、
(c)実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクター、又は
(d)実施形態95の薬学的組成物を配置することを含む、方法。
いくつかの組成物、及び方法が、本明細書で開示される。これらの組成物及び方法の具体的な例示的な実施形態を以下に開示する。以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も企図される。特に、これらの付番された実施形態の各々は、列挙されるようなそれらの順序とは無関係に、あらゆる前又は後続の付番された実施形態に依存するか、又は関連するものとして企図される。
実施形態1.操作されたポリヌクレオチドであって、標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ標的RNAの一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズするときに、少なくとも1つのミスマッチを含有する、標的化配列と、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、RNA編集エンティティによる標的RNAの塩基の編集を容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態2.操作されたポリヌクレオチドであって、標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含有する標的化配列であって、標的RNAが、疾患又は状態に関与するエクソン中に変位を含む、標的化配列と、スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームsnRNA、非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、標的RNA中のエクソンのエクソンスキッピングを容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態3.ミスマッチが、少なくとも1つのアデニン-グアニン(A-G)ミスマッチ、少なくとも1つのアデニン-アデニン(A-A)ミスマッチ、又は少なくとも1つのアデニン-シトシン(A-C)を含む、実施形態1又は2の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態4.ミスマッチが、A-Cミスマッチを含む、実施形態3の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態5.A/Cミスマッチが、デアミナーゼ存在下で標的RNAと会合したときに、デアミナーゼによって標的RNAにおいて編集を促進するように構成される、実施形態4の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態6.Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアント、及びヘアピンが、操作されたポリヌクレオチドの3’末端上にある、実施形態1~5のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態7.操作されたポリヌクレオチドが、複数のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、複数のヘアピンと、を含む、実施形態1~6のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態8.標的化配列が、約25塩基~約200塩基長である、実施形態1~7のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態9.標的化配列が、少なくとも約30塩基長である、実施形態1~7のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態10.操作されたポリヌクレオチドが、RNAポリメラーゼII型プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態1~9のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態11.RNAポリメラーゼII型プロモーターが、U1プロモーターを含む、実施形態10の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態12.RNAポリメラーゼII型プロモーターが、U7プロモーターを含む、実施形態10の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態13.操作されたポリヌクレオチドが、U6プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態1~12のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態14.Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントが、SmOPT配列である、実施形態1~13のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態15.SmOPT配列が、AAUUUUUGG又は配列番号41に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態14の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態16.SmOPT配列が、AAUUUUUGG又は配列番号41を含む、実施形態14の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態17.ヘアピンが、マウスU7 snRNA、ヒトU7 snRNA、又はヒトU1 snRNA由来である、実施形態1~16のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態18.ヘアピンが、マウスU7 snRNA、ヒトU7 snRNA、ヒトU1 snRNAのうちの1つ以上のキメラヘアピンである、実施形態1~17のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態19.ヘアピンが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つのヘアピン配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、実施形態1~18のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態20.ヘアピンが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つのヘアピン配列を含む、実施形態19のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態21.ヘアピンが、配列番号43のヘアピン配列を含む、実施形態1~20のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態22.操作されたポリヌクレオチドの3’末端にU7ボックスターミネーターを更に含む、実施形態1~21のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態23.5’から3’の標的化配列が、標的化配列と、Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、ヘアピンと、を含む、実施形態1~22のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態24.操作されたポリヌクレオチドが、RNA編集エンティティによる標的RNAのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成されている、実施形態2の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態25.RNA編集エンティティが、ADARタンパク質、APOBECタンパク質、又は両方を含む、実施形態1~24のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態26.RNA編集エンティティが、ADARを含み、ADARが、ADAR1又はADAR2を含む、実施形態1~24のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態27.標的化配列が、疾患又は状態において実行される標的RNAに少なくとも部分的に結合する、実施形態1~26のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態28.標的RNAが、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、HFE、LIPA、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態27の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態29.標的RNAが、SERPINA1であり、SERPINA1が、E342K変異を含む、実施形態28の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態30.標的RNAが、LRRK2であり、LRRK2が、G2019S変異を含む、実施形態28の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態31.疾患又は状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、又はテイ・サックス病を含む、実施形態1~30のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態32.操作されたポリヌクレオチドが、snRNA由来の追加の配列を更に含む、実施形態1~31のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態33.snRNA配列が、少なくとも部分的にU1、U2、U4、U5、U6、又はU7 snRNA配列を含む、実施形態1~32のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態34.操作されたポリヌクレオチドが、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、実施形態1~33のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態35.snRNA配列が、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、実施形態34の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態36.snRNAプロモーターが、少なくとも部分的にU1、U2、U4、U5、U6、又はU7 snRNAプロモーターを含む、実施形態4の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態37.標的化配列が、標的RNA内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的である、実施形態1~36のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態38.標的化配列が、
(a)標的RNA内のエクソンの上流にある分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であるか、又は
(b)標的化配列が、標的RNA内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的である、実施形態37の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態39.操作されたポリヌクレオチドが、インビトロで測定される場合に、Sm若しくはSm様結合ドメイン、又はそのバリアントを含まないか、ヘアピンを含まないか、あるいはSm若しくはSm様結合ドメイン、又はそのバリアント及びヘアピンを含まない、同等のエクソンスキッピング構築物と比較して、改善されたエクソンスキッピングの効率を有する、実施形態1の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態40.効率が、少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含まない同等のエクソンスキッピング構築物を含む細胞と比較して、操作されたポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞における、操作されたポリヌクレオチドによってスキッピングされたエクソンのスキッピングの割合を検出するために、デジタル液滴PCRアッセイを行うことによって決定される、実施形態39の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態41.操作されたポリヌクレオチドが、スプライスシグナル内の塩基の編集を容易にするように構成される、実施形態37~40のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態42.編集が、エクソンのスキッピングを少なくとも部分的に促進するように構成される、実施形態41の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態43.操作されたポリヌクレオチドが、インビトロアッセイによって測定される場合、少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、又は少なくとも50%、エクソンスキッピングの効率が増加する、実施形態39~42のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態44.少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドが、標的RNAと会合したときに、操作されたポリヌクレオチドを、デアミナーゼを介する標的RNAの塩基の編集を容易にするように少なくとも部分的に構成する、実施形態1~43のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態45.標的化配列が、標的RNAに結合したときに、デアミナーゼと会合して、デアミナーゼによる標的RNAのポリヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にする、実施形態44の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態46.ミスマッチが、標的化配列のいずれかの末端から約1~約200塩基に位置する、実施形態1~45のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態47.ミスマッチが、標的化配列のいずれかの末端から少なくとも45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、又は55塩基に位置する、実施形態1~45のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態48.デアミナーゼ動員ドメインを更に含む、実施形態1~47のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態49.デアミナーゼ動員ドメインが、GluR2、Alu、これらのいずれかの一部分、これらのいずれかのバリアント、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態47の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態50.デアミナーゼ動員ドメインが、ステムループを含む、実施形態47又は48の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態51.ステムループが、左巻きのステムループ又は右巻きのステムループである、実施形態49の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態52.ステムループが、GluR2ドメインに対して少なくとも約80%の配列同一性を含む、実施形態50の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態53.操作されたポリヌクレオチドが、少なくとも1つの化学修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドを含む、実施形態1~51のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態54.少なくとも1つの化学修飾が、表1に提供される操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の修飾を含む、実施形態1~52のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態55.操作されたポリヌクレオチドが、水溶液中に存在し、標的RNAに結合していないときに、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも1つを欠いている、実施形態1~53のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態56.操作されたポリヌクレオチドが、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態1~54のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態57.操作されたポリヌクレオチドが、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、バルジを含む、実施形態1~55のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態58.バルジが、非対称バルジである、実施形態56の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態59.バルジが、対称バルジである、実施形態56の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態60.操作されたポリヌクレオチドが、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、内部ループを含む、実施形態55~58のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態61.内部ループが、非対称ループである、実施形態59の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態62.内部ループが、対称ループである、実施形態59の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態63.操作されたポリヌクレオチドが、構造的なループ安定化骨格を含む、実施形態1~53のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態64.構造的なループ安定化骨格が、標的化配列を更に含み、標的RNAに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、RNA編集酵素による標的RNAのヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にし、標的化配列が、少なくとも約4個の連続したヌクレオチドを含む、実施形態62の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態65.操作されたポリヌクレオチドが、標的化配列に隣接する第1のスペーサードメイン及び第2のスペーサードメインを更に含み、操作されたポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞における転写の後に自己環化するように構成されている、実施形態1~63のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態66.操作されたポリヌクレオチドが、第1のスペーサードメインに対して5’に、又は第2のスペーサードメインに対して3’に、又は両方に、リボザイムドメインを含む、実施形態64の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態67.操作されたポリヌクレオチドが、リボザイムドメインと第1のスペーサードメインとの間に、又はリボザイムドメインと第2のスペーサードメインとの間にライゲーションドメインを含む、実施形態65の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態68.ポリヌクレオチド配列が二次元的に表される場合、操作されたポリヌクレオチドが、線形である、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態69.操作されたポリヌクレオチドが、溶媒に曝露される3’還元ヒドロキシルを欠いている、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態70.操作されたポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞へトランスフェクトされる場合に化学変化を受けるように構成され、その結果、化学変化の後、操作された化学修飾が、溶媒に曝露された3’還元ヒドロキシルを欠いている、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態71.標的化配列が、アプタマーを含まない、実施形態64~69のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態72.操作されたポリヌクレオチドが、RNA干渉(RNAi)のために構成された配列をコードする配列を含まないか、又はそれをコードしない、実施形態1~66のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態73.標的化配列が、標的RNAの3’又は5’非翻訳領域(UTR)の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態74.標的化配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態75.標的化配列が、標的RNAのイントロン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態76.標的化配列が、標的RNAのエクソン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態1~72のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態77.操作されたポリヌクレオチドが、約80ヌクレオチド~約600ヌクレオチドである、実施形態1~76のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態78.操作されたポリヌクレオチドが、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも80%の同一性を有する配列を含む、実施形態1~77のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態79.snRNA配列が、配列番号1~配列番号33のうちのいずれか1つ、又はそのバリアントに対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、実施形態78の操作されたポリヌクレオチド。d
実施形態80.操作されたポリヌクレオチドが、標的化配列に対して5’に第1のスペーサードメインを含む、実施形態1~79のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態81.操作されたポリヌクレオチドが、第1のスペーサードメインとは異なるか、又は同一である第2のスペーサードメインを含む、実施形態80の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態82.第1のスペーサードメイン、第2のスペーサードメイン、又は両方が、5’ AUAUA 3’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態80又は81の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態83.第1のスペーサードメイン、第2のスペーサードメイン、又は両方が、5’ AUAAU 3’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態80又は81の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態84.操作されたポリヌクレオチドが、5’末端に第1のリボザイムドメインと、3’末端に第2のリボザイムドメインと、を含む、実施形態70~83のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態85.第1又は第2のリボザイムが、独立して、ハンマーヘッドリボザイム、glmSリボザイム、HDV様リボザイム、R2エレメント、ペプチジルトランスフェラーゼ23S rRNA、GIR1分岐リボザイム、リードザイム、II群イントロン、ヘアピンリボザイム、VSリボザイム、CPEB3リボザイム、CoTCリボザイム、及びI群イントロンからなる群から選択される、実施形態84の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態86.実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクター。
実施形態87.ベクターが、リポソーム、ナノ粒子、又はデンドリマーを含む、実施形態86のベクター。
実施形態88.ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態86のベクター。
実施形態89.ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、実施形態88のベクター。
実施形態90.AAVベクターが、AAV2ベクター、AAV5ベクター、AAV8ベクター、AAV9ベクター、又はこれらのいずれかのハイブリッドである、実施形態89のベクター。
実施形態91.ウイルスベクターが、自己相補的アデノ随伴ウイルス(scAAV)ベクターである、実施形態89又は90のベクター。
実施形態92.ウイルスベクターが、一本鎖AAVベクターである、実施形態89~90のうちのいずれか1つのベクター。
実施形態93.実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターを含む、単離された細胞。
実施形態94.単離された細胞が、T細胞である、実施形態93の単離された細胞。
実施形態95.実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、単位剤形での薬学的組成物。
実施形態96.状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、有効量の実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクター、又は実施形態95の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
実施形態97.状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症、又はスターガルト病である、実施形態96の方法。
実施形態98.状態が、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894 G>A、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子中の変異と関連する、実施形態96の方法。
実施形態99.投与することが、吸入、耳、口腔内、結膜、歯、子宮頸管内、洞内(endosinusial)、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、嚢内、心腔内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内(intraductal)、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄腔内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内(intrasinal)、髄腔内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸郭内、管内(intratubular)、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮(percutaneous)、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮(transdermal)、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、鞘内、心室内、定位的、又はこれらの任意の組み合わせである、実施形態96~98のうちのいずれか1つの方法。送達は、非経口投与(静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、又は注入を含む)、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚等の表面の外表面に対する局所投与(ローション、クリーム、軟膏)を含み得る。いくつかの場合において、投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、若しくは経鼻投与、又はこれらの任意の組み合わせによるものである。
実施形態100.追加の治療を行うことを更に含む、実施形態96~99のうちのいずれか1つの方法。
実施形態101.追加の治療が、同時に、又は連続的に行われる、実施形態100の方法。
実施形態102.投与が、少なくとも週に1回行われる、実施形態96~101のうちのいずれか1つの方法。
実施形態103.対象は、投与前にインビトロ診断によって疾患又は状態を有すると診断されている、実施形態96~102のうちのいずれか1つの方法。
実施形態104.対象が、ヒトである、実施形態96~103のうちのいずれか1つの方法。
実施形態105.実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチドを容器中に含むか、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを容器中に含むか、実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターを容器中に含むか、又は実施形態95の薬学的組成物を容器中に含む、キット。
実施形態106.薬学的組成物を作製する方法であって、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を、本開示の操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクターのうちの少なくとも1つとを接触させることを含む、方法。
実施形態107.キットを作製する方法であって、容器内に少なくとも部分的に、
(a)実施形態1~85のうちのいずれか1つの操作されたポリヌクレオチド、
(b)実施形態1~85のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、
(c)実施形態86~92のうちのいずれか1つのベクター、又は
(d)実施形態95の薬学的組成物を配置することを含む、方法。
以下の実施例は、本開示を説明することを意図するが、本開示を限定するものではない。それらは、使用され得るものの典型であるが、代替的に、当業者に既知の他の手順を使用してもよい。
実施例1:特異的ガイドRNA編集に対するsnRNAプロモーター及び3’ヘアピンの効果の評価
この実施例において、ガイドRNAがエクソンスキップを編集するか、又は実行する能力をもたらす能力について、ガイドRNAに付加される追加の特徴を試験した。図1は、エクソンスキッピング活性の存在を評価するために使用されるエクソンスキッピングddPCRアッセイの例を示す。
この実施例において、ガイドRNAがエクソンスキップを編集するか、又は実行する能力をもたらす能力について、ガイドRNAに付加される追加の特徴を試験した。図1は、エクソンスキッピング活性の存在を評価するために使用されるエクソンスキッピングddPCRアッセイの例を示す。
ガイドRNAの3’末端に対するU7及びU1ヘアピンの付加
この試験において、異なるsnRNAプロモーター下で発現したガイドRNAを、その特異的ガイドRNA編集について試験した。
この試験において、異なるsnRNAプロモーター下で発現したガイドRNAを、その特異的ガイドRNA編集について試験した。
snRNAプロモーターによって駆動されるガイドRNA発現が編集に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ヒトRAB7A 3’UTR、ヒトDMDエクソン71のスプライスアクセプター、又はヒトDMDエクソン74のスプライスアクセプターを標的とする100ヌクレオチドのガイドRNAを、対応する3’ヘアピン(SmOPT mU7、SmOPT hU7、又はhU1ヘアピン)を有するか、又は有しない、hU6、hU7、又はhU1プロモーターを使用して発現させた。使用される終止配列は、プロモーターのものと一致する。293T細胞を、ヒトADAR2過剰発現を伴うか、又は伴わないガイドRNA構築物を発現する1μgのプラスミドでトランスフェクトした。
図2Aにおいて、U7又はU1プロモーターは、3’ヘアピンと組み合わせて、RAB7A ADAR編集及びDMDエクソン71又はエクソン74スキッピングを増強した(ddPCRによって測定される場合)。これらの構築物は、ADAR2過剰発現がない場合でも同様の編集を示した。図2Bは、ボックスによって示されるように、RAB7A 3’UTR中のアデノシンの標識での特異性を示すためのSanger配列決定クロマトグラムを示す。逆方向プライマーをSanger配列決定に使用する。したがって、AからGへの編集は、TからCへの変異として現れる。
実施例2:ガイドRNAを含有するU7プロモーターを用いるRAB7A及びSNCAの編集
この実施例において、RAB7A及びアルファ-シヌクレイン(SNCA)に沿った異なる領域を、異なるガイドRNA構築物を使用して編集した。RAB7Aについては、エクソン1、3、及び3’UTRを編集のために標的とし、一方で、SNCAについては、開始コドン及び3’UTRを標的とした。図3Aは、ヒトRAB7A及びSNCAのエクソン構造の概略図を示す。エクソンは、灰色のセグメントで示され、コード領域は、その上の黒色の線として示される。ガイドRNA標的化部位の位置が示され、PCRプライマーも示されている。
この実施例において、RAB7A及びアルファ-シヌクレイン(SNCA)に沿った異なる領域を、異なるガイドRNA構築物を使用して編集した。RAB7Aについては、エクソン1、3、及び3’UTRを編集のために標的とし、一方で、SNCAについては、開始コドン及び3’UTRを標的とした。図3Aは、ヒトRAB7A及びSNCAのエクソン構造の概略図を示す。エクソンは、灰色のセグメントで示され、コード領域は、その上の黒色の線として示される。ガイドRNA標的化部位の位置が示され、PCRプライマーも示されている。
ヒトRAB7Aエクソン1、エクソン3、若しくは3’UTR、又はヒトSNCA開始コドン若しくは3’UTRを標的とする100ntのガイドRNAは、3’ヘアピンを有しないhU6プロモーター、又は3’SmOPT U7ヘアピンを有するmU7若しくはhU7プロモーターを使用して発現された。図3Bは、ADAR2過剰発現の存在下又は非存在下で、異なるガイドRNA構築物を使用した編集の結果をまとめたものである。3’SmOPT U7ヘアピンと組み合わせたU7プロモーターは、各標的部位でのADAR編集を増強した(Sanger配列決定によって測定される)。3’UTRを標的とする構築物は、内因性ADARレベルと、過剰発現したADARレベルで、等しく良好に機能したが、他の領域を標的とする構築物は、依然としてADAR2過剰発現から利益を受けていた。
差次的なエクソンスキッピングが生じたかどうかを確認するために、編集された転写産物に由来するcDNAを単離し、示されたプライマーを使用して、PCR増幅させた。RAB7Aプライマーは、RAB7Aのコード決定配列の一部分にわたっており、エクソン構造が維持されている場合には、437bpのアンプリコンを生成する。RAB7Aのエクソン3がスキップされる場合、310bpのアンプリコンが予想される。SNCAプライマーを使用すると、323bpのPCRアンプリコンが予想される。図3Cは、最小のRAB7Aエクソン3スキッピングと、RAB7Aエクソン1又はSNCA開始コドンを標的とするガイドRNAからの検出不可能なエクソンスキッピングを示す。
図3Dは、示されている転写産物の標的アデノシンにおける特異的編集を示すSanger配列決定クロマトグラムを示す。ボックスは、オンターゲット編集部位を示す。
実施例3:HEK 293及びK562細胞におけるヒトSNCA開始コドン及び3’UTRのオンターゲット編集及びオフターゲット編集
この実施例において、異なる細胞株及びトランスフェクション方法を使用して、SNCAの異なる領域を編集した。ヒトSNCA開始コドン又はヒトSNCA 3’UTRを標的とする100ntのガイドRNAは、ヘアピンを有しないhU6プロモーター、3’SmOPT mU7ヘアピンを有するmU7プロモーター、3’SmOPT hU7ヘアピンを有するhU7プロモーター、又は3’SmOPT mU7ヘアピンを有するhU1プロモーターを使用して発現された。U7又はU1プロモーター下で、SmOPT U7ヘアピン配列も含む、操作されたポリヌクレオチドの組成物が本明細書に開示される。上述の操作されたポリヌクレオチドは、SNCAに対応する標的RNA配列にハイブリダイズし、アデノシンのADAR媒介性編集を容易にすることができる。
この実施例において、異なる細胞株及びトランスフェクション方法を使用して、SNCAの異なる領域を編集した。ヒトSNCA開始コドン又はヒトSNCA 3’UTRを標的とする100ntのガイドRNAは、ヘアピンを有しないhU6プロモーター、3’SmOPT mU7ヘアピンを有するmU7プロモーター、3’SmOPT hU7ヘアピンを有するhU7プロモーター、又は3’SmOPT mU7ヘアピンを有するhU1プロモーターを使用して発現された。U7又はU1プロモーター下で、SmOPT U7ヘアピン配列も含む、操作されたポリヌクレオチドの組成物が本明細書に開示される。上述の操作されたポリヌクレオチドは、SNCAに対応する標的RNA配列にハイブリダイズし、アデノシンのADAR媒介性編集を容易にすることができる。
図4Aは、SNCAの異なる部位をプロファイリングし、ADAR媒介性編集効率を測定する効果を示す。HEK293細胞を、ガイド配列を含有するプラスミドでトランスフェクトし、2日後に、RNA編集をSanger配列決定によって測定した。いくつかの場合において、ADAR2が過剰発現された。A/Cミスマッチ部位(赤色のボックス)の評価を評価し、各々の条件において編集効率を決定した。いくつかの場合において、5%未満の編集効率は、バックグランドレベルより低い場合がある。
図4B SNCA 3’UTRの編集を、SNCAを過剰発現するK562細胞における操作されたポリヌクレオチドのトランスフェクションによって評価した。1.5μgのガイドRNA発現プラスミドを、ヌクレオフェクション(Lonza)によって、2×105個のSNCAを過剰発現するK562細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの40時間後及び72時間後に、RNA編集を測定した。白抜きの記号は、細胞がGFP発現ベクターでトランスフェクトされた実験を示し、一方で、黒塗りの記号は、ADAR2過剰発現ベクターでのトランスフェクションを示す。
実施例4:線形及び環状のガイドRNAを使用したRNA編集
異なる哺乳動物snRNAプロモーターの制御下での操作されたポリヌクレオチドの組成物が本明細書に開示される。これらの構築物は、3’ SmOPT U7ヘアピンを有する線形の操作されたポリヌクレオチド構築物、又はヘアピンを欠く環状ガイドRNA構築物である。図5は、ヒトU1プロモーターが、転写産物レベルのノックダウンを最小限にしつつ、ガイドRNA編集のための3’ SmOPT配列及びU7ヘアピンとも対形成することができることを示す。
異なる哺乳動物snRNAプロモーターの制御下での操作されたポリヌクレオチドの組成物が本明細書に開示される。これらの構築物は、3’ SmOPT U7ヘアピンを有する線形の操作されたポリヌクレオチド構築物、又はヘアピンを欠く環状ガイドRNA構築物である。図5は、ヒトU1プロモーターが、転写産物レベルのノックダウンを最小限にしつつ、ガイドRNA編集のための3’ SmOPT配列及びU7ヘアピンとも対形成することができることを示す。
ヒトRAB7A 3’UTR、ヒトDMDエクソン71スプライスアクセプター、又はヒトDMDエクソン74スプライスアクセプターを標的とする100ntのガイドRNAは、3’ SmOPT U7ヘアピン及びU7終止配列を有する、hU6、mU7、hU7、又はhU1プロモーターを使用して発現された。代替的に、これらの100ntのガイドRNAは、環化しているRtcBリボザイム部位を有する(SmOPT又はU7ヘアピンを有しない)、hU6、mU7、hU7、又はhU1プロモーターを使用して発現された。293T細胞を、ガイドRNA構築物(内因性ADARレベル)を発現するプラスミド1ugでトランスフェクトした。RNAを、ddPCRによって、トランスフェクション後の指示された時間点で測定した。
3’ SmOPT U7ヘアピンを有するガイドRNAを発現するU7又はU1プロモーターによって、高レベルのRAB7A編集及びDMDエクソンスキッピングが得られた。しかしながら、U6プロモーターは、これらの同じガイドRNA構築物を発現する場合には、著しく弱かった。対照的に、環状ガイドRNA(ヘアピンを有しない)を発現するU6プロモーターによって、最も高いレベルのRAB7A編集が得られたが、DMDエクソンスキッピングは、より中程度のレベルが得られた。
実施例5:操作されたポリヌクレオチドの5’末端に対するhnRNP A1結合ドメインの付加
3’ SmOPT U7ヘアピンに対向するガイドRNAの5’末端にhnRNP A1結合ドメイン[UAGGGW](WはA/Uである)を付加することで、RAB7A編集及びDMDエクソン74スキッピングを更に増加させる。
3’ SmOPT U7ヘアピンに対向するガイドRNAの5’末端にhnRNP A1結合ドメイン[UAGGGW](WはA/Uである)を付加することで、RAB7A編集及びDMDエクソン74スキッピングを更に増加させる。
ヒトRAB7A 3’UTR、ヒトDMDエクソン71スプライスアクセプター、又はヒトDMDエクソン74スプライスアクセプターを標的とする100ntのガイドRNAは、3’ SmOPT mU7ヘアピン及びmU7終止配列を有する、mU7又はhU1プロモーターを使用して発現された。代替的に、これらの100ntのガイドRNAは、Litke and Jaffrey 2019からの環化しているRtcBリボザイム部位を有する(SmOPT又はU7ヘアピンを有しない)、hU6プロモーターを使用して発現された。ガイドRNAの5’末端に、タグなし、三重hnRNP A1結合ドメイン、二重hnRNP A1結合ドメイン、又は陰性対照としてのhnRNP A1に結合しない変異したドメインのいずれかを付加した。293T細胞を、ガイドRNA構築物(内因性ADARレベル)を発現するプラスミド1ugでトランスフェクトした。RNAを42時間後に測定した。図6Aは、hnRNP結合ドメインが、U7/U1プロモーター及び3’ SmOPT U7ヘアピンと組み合わせた場合に、RAB7A ADAR編集及びDMDエクソン74スキッピング(ddPCRによって測定される)を増加させたことを示す。残念ながら、hnRNPドメインは、U6環状ガイドRNAを改善しなかった。RAB7A編集は、HPRT1ハウスキーピング遺伝子に対して、転写産物発現レベルを変化させない。DMDエクソン71スキッピングも改善されなかったが、これはおそらく、これらの条件が、(トランスフェクション効率及び転写産物のターンオーバーを考慮して)エクソン71スキッピングの量を既に最大化しているためであろう。図6Bは、RAB7A 3’UTR中の標的アデノシンにおける特異的編集を示すSanger配列決定クロマトグラムを示す(ボックス)。配列決定のために逆方向プライマーを使用したため、A>G編集は、T>Cとして現れる。
実施例6:SmOPT配列及びU7ステムループヘアピンを有するガイドを用いたRNA編集
3’ SmOPT U7ヘアピンのどの特徴が、増強した編集に必要であるかを解析するために、SmOPT配列の変動、及びU7ステムループヘアピンの変動を比較した。ヒトRAB7Aエクソン4、RAB7A 3’UTR、SNCAエクソン4、SNCA 3’UTR、DMDエクソン71スプライスアクセプター、又はDMDエクソン74スプライスアクセプターを標的とする100ntのガイドRNAは、3’ SmOPT mU7ステムループヘアピン配列上の変動とともに、mU7プロモーター及びmU7終止配列を使用して発現された。293T細胞を、ガイドRNA構築物(内因性ADARレベル)を発現するプラスミド1ugでトランスフェクトした。RNAを42時間後に測定した。図7Aは、試験した配列変動を列挙する。図7Bは、天然又は変異した変動のいずれでもないSmOPT配列が、標的転写産物の完全編集に必要であることを示す。図7Bは、マウス若しくはヒトU7ステムループヘアピン、又はハイブリッドマウス/ヒトU7ステムループヘアピンが、編集にとって十分であり得ることも示す。図7Cは、示されている転写産物の標的アデノシンにおける特異的編集を示すSanger配列決定クロマトグラムの例を示す。ボックスは、オンターゲット編集部位を示す。
3’ SmOPT U7ヘアピンのどの特徴が、増強した編集に必要であるかを解析するために、SmOPT配列の変動、及びU7ステムループヘアピンの変動を比較した。ヒトRAB7Aエクソン4、RAB7A 3’UTR、SNCAエクソン4、SNCA 3’UTR、DMDエクソン71スプライスアクセプター、又はDMDエクソン74スプライスアクセプターを標的とする100ntのガイドRNAは、3’ SmOPT mU7ステムループヘアピン配列上の変動とともに、mU7プロモーター及びmU7終止配列を使用して発現された。293T細胞を、ガイドRNA構築物(内因性ADARレベル)を発現するプラスミド1ugでトランスフェクトした。RNAを42時間後に測定した。図7Aは、試験した配列変動を列挙する。図7Bは、天然又は変異した変動のいずれでもないSmOPT配列が、標的転写産物の完全編集に必要であることを示す。図7Bは、マウス若しくはヒトU7ステムループヘアピン、又はハイブリッドマウス/ヒトU7ステムループヘアピンが、編集にとって十分であり得ることも示す。図7Cは、示されている転写産物の標的アデノシンにおける特異的編集を示すSanger配列決定クロマトグラムの例を示す。ボックスは、オンターゲット編集部位を示す。
実施例7:SmOPT及びU7ヘアピンを有する、LRRK2に対するガイドRNA
この実施例は、U1プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、パーキンソン病に関与する遺伝子であるLRRK2を標的とするように設計されている。両方ともSmOPT及びU7ヘアピンを有する、LRRK2 G2019S変異を標的とする2つのガイドRNA設計を試験した。第1のガイドは、配列番号18であった。第2のガイドは、配列番号19であった。ガイドRNAを、LRRK2ミニ遺伝子を保有するpiggyBacベクターでトランスフェクトされたWT HEK293細胞におけるG2019S LRRK2変異のADAR媒介性RNA編集を容易にする能力について試験した。WT HEK293細胞は、ADAR1を天然で発現する。ADAR1及びADAR2を介して媒介されるRNA編集を試験した実験において、ADAR2は、LRRK2ミニ遺伝子を保有する同じpiggyBacベクターによって、細胞において過剰発現された。piggyBac構築物の概略図を図8に示す。ADAR1のみ(図9A)、又はADAR1及びADAR2(図9B)の存在下、実験を行った。対照として、GFPプラスミドを使用した。図9A及び図9Bは、SmOPT及びU7ヘアピンを含有するガイドRNAが、ADAR1のみの存在下ではオンターゲット編集効率8%、ADAR1及びADAR2の存在下では28%まで容易にされたことを示す。図9A及び図9Bは、SmOPT及びU7ヘアピンを含有するガイドRNAが、ADAR1のみの存在下ではオンターゲット編集効率19%、ADAR1及びADAR2の存在下では58%まで容易にされたことを示す。更なる実験は、第1のガイド(配列番号18)が、-161.98kcal/molのギブズ自由エネルギー(ΔG)を有し、第2のガイド(配列番号19)が、-169.44kcal/molのΔGを有することを示した。両方のガイドRNAの構造を、図9A~図9Bのグラフの下に示す。この構造図に見られるように、第2のガイド(配列番号18)は、標的RNAを有する、二本鎖RNAのより長く連続した伸長部を形成した。
この実施例は、U1プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、パーキンソン病に関与する遺伝子であるLRRK2を標的とするように設計されている。両方ともSmOPT及びU7ヘアピンを有する、LRRK2 G2019S変異を標的とする2つのガイドRNA設計を試験した。第1のガイドは、配列番号18であった。第2のガイドは、配列番号19であった。ガイドRNAを、LRRK2ミニ遺伝子を保有するpiggyBacベクターでトランスフェクトされたWT HEK293細胞におけるG2019S LRRK2変異のADAR媒介性RNA編集を容易にする能力について試験した。WT HEK293細胞は、ADAR1を天然で発現する。ADAR1及びADAR2を介して媒介されるRNA編集を試験した実験において、ADAR2は、LRRK2ミニ遺伝子を保有する同じpiggyBacベクターによって、細胞において過剰発現された。piggyBac構築物の概略図を図8に示す。ADAR1のみ(図9A)、又はADAR1及びADAR2(図9B)の存在下、実験を行った。対照として、GFPプラスミドを使用した。図9A及び図9Bは、SmOPT及びU7ヘアピンを含有するガイドRNAが、ADAR1のみの存在下ではオンターゲット編集効率8%、ADAR1及びADAR2の存在下では28%まで容易にされたことを示す。図9A及び図9Bは、SmOPT及びU7ヘアピンを含有するガイドRNAが、ADAR1のみの存在下ではオンターゲット編集効率19%、ADAR1及びADAR2の存在下では58%まで容易にされたことを示す。更なる実験は、第1のガイド(配列番号18)が、-161.98kcal/molのギブズ自由エネルギー(ΔG)を有し、第2のガイド(配列番号19)が、-169.44kcal/molのΔGを有することを示した。両方のガイドRNAの構造を、図9A~図9Bのグラフの下に示す。この構造図に見られるように、第2のガイド(配列番号18)は、標的RNAを有する、二本鎖RNAのより長く連続した伸長部を形成した。
実施例8:3’ SmOPT配列及びU7ヘアピンを含有するガイドRNAは、環化し、U7又はU6プロモーターによって発現してADAR編集をもたらすことができる
3’ SmOPT配列及びU7ヘアピンを有する100ntのアンチセンス(標的化)ガイドRNAを、P3とP1 RtcB環状リボザイム部位との間に挿入し、mU7又はhU6プロモーターを使用して発現させた。293T細胞を、ガイドRNA構築物(内因性ADARレベル)を発現するプラスミド1μgでトランスフェクトした。RNAを41時間後に測定した。図10Aは、環状RNA形態を示す。ガイド特異的プライマーによるSanger配列決定(黒色)は、リボザイム部位が、環状RNAの内側に存在するアンチセンスガイド及び3’ SmOPT U7ヘアピンを用いて、一緒に正確にライゲーションされていることを示す。
3’ SmOPT配列及びU7ヘアピンを有する100ntのアンチセンス(標的化)ガイドRNAを、P3とP1 RtcB環状リボザイム部位との間に挿入し、mU7又はhU6プロモーターを使用して発現させた。293T細胞を、ガイドRNA構築物(内因性ADARレベル)を発現するプラスミド1μgでトランスフェクトした。RNAを41時間後に測定した。図10Aは、環状RNA形態を示す。ガイド特異的プライマーによるSanger配列決定(黒色)は、リボザイム部位が、環状RNAの内側に存在するアンチセンスガイド及び3’ SmOPT U7ヘアピンを用いて、一緒に正確にライゲーションされていることを示す。
図10Bは、Sm結合ドメイン、U7ステムループヘアピン、及びP3とP1 RtcB環状リボザイム部位との間にクローニングされたRNAリンカー配列のいくつかの配列変動を列挙する(上側パネル)。環状RNA内には、Sm結合ドメインの前に、ヒトRAB7Aエクソン4、RAB7A 3’UTR、SNCAエクソン4、SNCA 3’UTR、DMDエクソン71スプライスアクセプター、又はDMDエクソン74スプライスアクセプターを標的とする100ntのアンチセンスガイドRNAが含まれていた。ガイドRNAは、各々がその対応するターミネーター配列を有する、mU7又はhU6プロモーターのいずれかを使用して発現された。線形SmOPT U7ヘアピンガイドRNAに加えて、Sm結合ドメイン及びU7ステムループヘアピンを含有する環化されたガイドRNAもまた、Sanger配列決定によって測定される場合、標的転写産物を編集することができた(中央パネル)。陰性対照として、異なる遺伝子を標的とする線形SmOPT U7ヘアピンガイドRNAを使用した。更に、SmOPT U7ヘアピンガイドRNAの線形形態又は環状形態のいずれも、HPRT1ハウスキーピング遺伝子と比較して、ddPCRによって測定される場合、RAB7A 3’UTR又はSNCA 3’UTR標的転写産物の遺伝子発現レベルを変化させなかった(左下パネル)。線形SmOPT U7ヘアピンガイドRNAは、RAB7Aエクソン4の最小限の偶発的なスキッピングのみを引き起こし、環状SmOPT U7ヘアピンガイドRNAは、PCR及びゲル電気泳動によって測定される場合、検出可能なエクソンスキッピングを示さなかった(右下パネル)。
実施例9:SmOPT及びU7ヘアピンを有する、ABCA4に対するガイドRNA
この実施例は、プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、スターガルト病に関与するABCA4ミスセンス変異を標的とするように設計されている。
この実施例は、プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、スターガルト病に関与するABCA4ミスセンス変異を標的とするように設計されている。
初期の実験のセットは、SmOPT配列及びU7ヘアピンを組み込んだガイドにおいて観察されたABCA4のRNA編集の改善を示した。ADAR1を天然で発現するHEK293細胞を、5882 G→A変異及びADAR2を有するABCA4ミニ遺伝子を保有するpiggyBacベクターでトランスフェクトした。2つのU6によって駆動されるガイドRNA(配列番号20及び配列番号21)、並びにSmOPT配列及びU7ヘアピンを含有する、U1によって駆動されるガイドRNA(配列番号22)を含む、様々なガイドを試験した。陰性対照は、異なる遺伝子(Rab7A)に対する環状ガイドRNA、GFPプラスミドのみ、及びトランスフェクションなしを含んでいた。図11A及び図11Bに示されるように、U7 SmOPT配列及びU7ヘアピンを含むことで、RNA編集が増加した。
その後の実験は、ABCA4 5882 G→A変異を標的とするガイドRNAを評価し、ガイドRNAをコードする操作されたポリヌクレオチドは、SmOPT配列及びU7ヘアピンもコードした。図12Aは、ABCA4、SmOPT配列、及びU7ヘアピンにおける変異を標的とするガイドRNAをコードする複数用量の構築物について、ADAR1及びADAR2による細胞におけるRNA編集率を示し、発現は、U1プロモーターによって駆動される。上述のように、HEK293細胞は、ADAR1を天然で発現する。図12Aについて、HEK293細胞を、5882 G→A変異及びADAR2を有するABCA4ミニ遺伝子を保有するpiggyBacベクターでトランスフェクトした。図12Bは、ABCA4、SmOPT配列、及びU7ヘアピンにおける変異を標的とするガイドRNAをコードする複数用量の構築物について、ADAR1による細胞におけるRNA編集率を示し、発現は、U1プロモーターによって駆動される。HEK293細胞を、5882 G→A変異を有するABCA4ミニ遺伝子をまさに保有するpiggyBacベクターでトランスフェクトした。図12A及び図12Bにおいて、ガイドRNA、SmOPT配列、及びU7ヘアピンをコードするプラスミドを、250ng、500ng、750ng、又は1000ngで投薬した。GFPプラスミド、及びトランスフェクションなしが、陰性対照として機能した。結果は、ABCA4 5882 G→A変異のRNA編集率における用量依存性を示した。ABCA4を標的とする配列としては、配列番号20、配列番号21、及び配列番号22が挙げられる。
実施例10:SmOPT配列及びU7ヘアピンを有する、SNCAに対するガイドRNA
この実施例は、U1プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、SNCA遺伝子における開始部位、又は翻訳開始部位(translation initiation site:TIS)(翻訳開始部位(translation start site:TSS)とも称される)を標的とするように設計されている。ガイド構築物を、エクソン2のヌクレオチド位置26(エクソン1及びエクソン2を含む、ほとんどのSNCAバリアントのヌクレオチド位置264に対応する)のSNCA TISアデノシンを標的とするように設計した。HEK293細胞を、目的のガイドRNAをコードするプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後にRNA編集を評価した。HEK293細胞によって天然で発現するADAR1のみ、並びにADAR1及びADAR2について、RNA編集を評価した。後者の実験において、HEK293細胞を、ADAR2をコードするpiggybacベクターと共トランスフェクトした。RNA編集のレベルをSanger配列決定によって定量化し、配列決定分析スクリプト(EditADAR)を使用して分析した。
この実施例は、U1プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、SNCA遺伝子における開始部位、又は翻訳開始部位(translation initiation site:TIS)(翻訳開始部位(translation start site:TSS)とも称される)を標的とするように設計されている。ガイド構築物を、エクソン2のヌクレオチド位置26(エクソン1及びエクソン2を含む、ほとんどのSNCAバリアントのヌクレオチド位置264に対応する)のSNCA TISアデノシンを標的とするように設計した。HEK293細胞を、目的のガイドRNAをコードするプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後にRNA編集を評価した。HEK293細胞によって天然で発現するADAR1のみ、並びにADAR1及びADAR2について、RNA編集を評価した。後者の実験において、HEK293細胞を、ADAR2をコードするpiggybacベクターと共トランスフェクトした。RNA編集のレベルをSanger配列決定によって定量化し、配列決定分析スクリプト(EditADAR)を使用して分析した。
図13~図15は、編集される標的A(x軸上の「0」)でのRNA編集、及びオフターゲット位置でのRNA編集(「0」ではない位置にある黒色の棒グラフとして表される)のプロットを示す。生物学的複製物を各列に示す。SNCAの高レベルのRNA編集が、いくつかのガイドRNA構築物において観察された。陰性対照の試行には、標的SNCA配列を標的としないガイドRNAが含まれていた。qPCRによるmRNAノックダウンは観察されなかったが、依然としてタンパク質ノックダウンが達成された可能性が高い。図13、図14、及び図15に示されるガイド構築物は、高レベルのRNA編集と、高いオフターゲット編集に対するオンターゲットの比率を示した。図14に示されるガイドは、標的鎖に対して非連続的な相補性を有する標的化配列に隣接するガイドのセグメントである、オリゴテザーを含む。
図13~図15に示されるガイドの配列は、下の表2に記載される。以下の表2はまた、標的RNAに対する所与のガイドのハイブリダイゼーション時に形成される特徴、観察されるオンターゲットRNA編集率、オンターゲットRNA編集である全RNA編集に対する割合としてのオンターゲット編集、並びにコード領域中の開始部位及び開始部位の下流における標的でのRNA編集率としてのオンターゲット編集を記載している。
実施例11:プラスミドの一過性のトランスフェクション、又は構築物の単一コピー組み込みからのSmOPT及びU7ヘアピンを有するヒトSOD1開始コドンに対するガイドRNA
ヒトSOD1開始コドンを標的とする100ntのガイドRNAは、環化しているRtcBリボザイム部位を有する(SmOPT又はU7ヘアピンを有しない)hU6プロモーター、3’ SmOPT mU7ヘアピンを有するmU7プロモーター、又は5’二重hnRNP A1結合ドメイン及び3’SmOPT hU7ヘアピンを有するmU7プロモーターを使用して発現された。上述の操作されたポリヌクレオチドを、SOD1に対応する標的RNA配列にハイブリダイズして、アデノシンのADAR媒介性編集を容易にすることができる。図16は、操作されたポリヌクレオチドがプラスミドの一過性トランスフェクションによってHEK 293T細胞に送達されたか、又は単一コピーとしてゲノムに組み込まれた、ヒトSOD1開始コドンの編集を示す。一過性の送達のために、1ugのプラスミドを、HEK 293T細胞(内因性ADAR)にトランスフェクトし、2日後に編集率を測定した。組み込まれた送達のために、ガイドRNA発現構築物の単一コピーをゲノムに挿入し、抗生物質選択後に1週間後までにわたって編集率を測定した。
ヒトSOD1開始コドンを標的とする100ntのガイドRNAは、環化しているRtcBリボザイム部位を有する(SmOPT又はU7ヘアピンを有しない)hU6プロモーター、3’ SmOPT mU7ヘアピンを有するmU7プロモーター、又は5’二重hnRNP A1結合ドメイン及び3’SmOPT hU7ヘアピンを有するmU7プロモーターを使用して発現された。上述の操作されたポリヌクレオチドを、SOD1に対応する標的RNA配列にハイブリダイズして、アデノシンのADAR媒介性編集を容易にすることができる。図16は、操作されたポリヌクレオチドがプラスミドの一過性トランスフェクションによってHEK 293T細胞に送達されたか、又は単一コピーとしてゲノムに組み込まれた、ヒトSOD1開始コドンの編集を示す。一過性の送達のために、1ugのプラスミドを、HEK 293T細胞(内因性ADAR)にトランスフェクトし、2日後に編集率を測定した。組み込まれた送達のために、ガイドRNA発現構築物の単一コピーをゲノムに挿入し、抗生物質選択後に1週間後までにわたって編集率を測定した。
実施例12:SmOPT及びU7ヘアピンを有する、SERPINA1に対するガイドRNA
この実施例は、プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症に関与するSERPINA1ミスセンス変異(SERPINA1、SERPINA1 E342K変異をもたらす位置9989でのGからAへの変異)を標的とするように設計されている。
この実施例は、プロモーター、SmOPT配列、及びU7ヘアピンの制御下でのガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症に関与するSERPINA1ミスセンス変異(SERPINA1、SERPINA1 E342K変異をもたらす位置9989でのGからAへの変異)を標的とするように設計されている。
簡単に述べると、SERPINA1ミニ遺伝子を、piggyBacベクターを介して、内因性ADAR1を発現するK562細胞にトランスフェクトし、ピューロマイシン選択によって細胞を選択した。K562細胞に組み込まれたSERPINA1ミニ遺伝子は、全長3’ UTRを有するSERPINA1ミニ遺伝子1、又は切断3’ UTRを有するSERPINA1ミニ遺伝子2を含んでいた。両方のミニ遺伝子は、目的のGからAの9989変異を保有していた。K562細胞(2×10^5個の細胞)を、U7ヘアピン及びSmOPT配列に作動可能に連結されたガイドRNAをコードするプラスミドを用いてエレクトロポレーションした。発現を、マウスU7プロモーター下で駆動させた。エレクトロポレーションから24時間後に、RNAを単離し、RT-PCRによってcDNAを合成し、RT-PCR産物をSanger配列決定によって配列決定し、RNA編集率を定量化した。対照ガイドRNAは、U7ヘアピン及びSmOPT配列を欠いており、発現は、U6プロモーター下で駆動された。図18及び図19は、ガイドRNA配列を使用したSERPINA1の編集を示す。利用されるガイドRNA配列としては、配列番号26及び配列番号27が挙げられる。
実施例13:SmOPT及びU7ヘアピンを有する、RAB7Aに対するガイドRNA
この実施例は、5’二重hnRNP A1結合ドメイン、SmOPT配列、及び3’SmOPT hU7ヘアピンを有するhU1プロモーターの制御下でガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、直後に翻訳終止コドンを有する3’UTRでのアデノシンのADAR媒介性編集を容易にするようにRAB7Aの3’UTRを標的とするように設計されている。使用したガイドは、配列番号28~配列番号30のガイドであった。編集を、筋肉細胞において評価した。横紋筋肉腫細胞(RD WT)、2D9細胞(エクソン51スプライス部位にハードワイヤードされた変異を有するRD細胞)、及び4H6細胞(エクソン53スプライス部位にハードワイヤードされた変異を有するRD細胞)を、piggyBacベクターにおいてRAB7A 3’UTRをコードするガイドRNAで安定にトランスフェクトした。ガイドRNAは、以下の表に記載されており、発現は、ヒトU1プロモーターの制御下で駆動された。プラスミドなしを陰性対照として使用した。図20は、配列番号28~30のガイドRNAを使用したRAB7Aの編集を示す。RNA編集率を、播種から48時間後及び細胞分化の10日後に、未分化細胞において評価した。
この実施例は、5’二重hnRNP A1結合ドメイン、SmOPT配列、及び3’SmOPT hU7ヘアピンを有するhU1プロモーターの制御下でガイドRNAをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドRNAは、直後に翻訳終止コドンを有する3’UTRでのアデノシンのADAR媒介性編集を容易にするようにRAB7Aの3’UTRを標的とするように設計されている。使用したガイドは、配列番号28~配列番号30のガイドであった。編集を、筋肉細胞において評価した。横紋筋肉腫細胞(RD WT)、2D9細胞(エクソン51スプライス部位にハードワイヤードされた変異を有するRD細胞)、及び4H6細胞(エクソン53スプライス部位にハードワイヤードされた変異を有するRD細胞)を、piggyBacベクターにおいてRAB7A 3’UTRをコードするガイドRNAで安定にトランスフェクトした。ガイドRNAは、以下の表に記載されており、発現は、ヒトU1プロモーターの制御下で駆動された。プラスミドなしを陰性対照として使用した。図20は、配列番号28~30のガイドRNAを使用したRAB7Aの編集を示す。RNA編集率を、播種から48時間後及び細胞分化の10日後に、未分化細胞において評価した。
全ての細胞及び両方の時間点において、100塩基長の線形ガイドRNA、並びにU7ヘアピン及びSmOPT配列とのA/Cミスマッチは、内因性ADARによる最高レベルのRAB7A 3’UTR編集を容易にした。
次いで、各ガイドを、不死化された骨格筋芽細胞株LHCN-M2においてスクリーニングした。図17に示すように、試験されたガイドは、上に列挙したRD細胞と同様に、7日間の分化の間、持続的な編集を示した。
実施例14:ガイドRNAを用いたRAB7A編集
この実施例は、iPSC由来の神経細胞における本開示のガイドRNAによるRAB7A編集を記載しており、ガイドRNAは、AAVを介して送達された。iPSCは、二重SMAD阻害を使用して、少なくとも6日間、神経系統に誘導された後、GFP(対照)、又は3’ SmOPT hU7ヘアピンを有するか、若しくは有しないRab7ガイドを発現するAAV2/2で感染させた。細胞を、一般的に、24ウェルプレート中、1×10^5個/ウェルの細胞で播種し、指定のvg/細胞で感染させた。感染から48時間後、72時間後、又は7日後にmRNAを単離し、ddPCR及びSanger配列決定によってRab7編集を評価した。形質導入効率を、ImageJを使用して画像を定量化することによって評価した。簡単に述べると、GFP+シグナルを捕捉した各ウェルの画像、並びに同じ視野の明視野画像を撮影した。GFP+シグナルを閾値化し、陽性シグナルの面積を測定した。同様に、細胞を含んでいた明視野画像の面積を閾値化し、陽性シグナルの面積を測定した。GFP+面積を細胞面積で割り算し、形質導入率を得た。
この実施例は、iPSC由来の神経細胞における本開示のガイドRNAによるRAB7A編集を記載しており、ガイドRNAは、AAVを介して送達された。iPSCは、二重SMAD阻害を使用して、少なくとも6日間、神経系統に誘導された後、GFP(対照)、又は3’ SmOPT hU7ヘアピンを有するか、若しくは有しないRab7ガイドを発現するAAV2/2で感染させた。細胞を、一般的に、24ウェルプレート中、1×10^5個/ウェルの細胞で播種し、指定のvg/細胞で感染させた。感染から48時間後、72時間後、又は7日後にmRNAを単離し、ddPCR及びSanger配列決定によってRab7編集を評価した。形質導入効率を、ImageJを使用して画像を定量化することによって評価した。簡単に述べると、GFP+シグナルを捕捉した各ウェルの画像、並びに同じ視野の明視野画像を撮影した。GFP+シグナルを閾値化し、陽性シグナルの面積を測定した。同様に、細胞を含んでいた明視野画像の面積を閾値化し、陽性シグナルの面積を測定した。GFP+面積を細胞面積で割り算し、形質導入率を得た。
iPSCを、様々なvg/細胞で48時間又は72時間形質導入し、8日間又は9日間の分化で採取した。Rab7編集をddPCRによって測定した。図21Aに示されるように、vg/細胞が増加するにつれて、Rab7編集の用量依存的増加が存在する。データは、生物学的複製物の平均±SEMを表す。Rab7編集をSanger配列決定によっても測定した。図21Bに示されるように、vg/細胞が増加するにつれて、Rab7編集の用量依存的増加が存在する。配列決定を定量化するためのddPCR及びSanger配列決定アプローチは、非常に類似した結果をもたらす。データは、生物学的複製物の平均±SEMを表す。図21Cについて、iPSCを、様々なvg/細胞で72時間又は7日間形質導入し、17日間以上の分化で採取した。Rab7編集をddPCRによって測定した。データは、生物学的複製物の平均±SEMを表す。
図22Aは、9日間の分化後、72時間の感染後に採取した細胞におけるRab7編集効率に対してプロットされた形質導入%を示す。ドットの色は、細胞を治療したウイルスの力価を表す。ウイルス力価は、形質導入効率に直接関連する。図22Bは、様々な日数の分化後に採取した細胞におけるRab7編集効率に対してプロットされた形質導入%を示す。ドットの色は、分化の日数を表し、ドットのサイズは、細胞を治療したウイルスの力価を表す。
図23は、対照に対するU7 smOPT線形ガイドのオフターゲット編集プロファイルを示す。
Claims (51)
- 操作されたポリヌクレオチドであって、
標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ前記標的RNAの前記一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズするときに、少なくとも1つのミスマッチを含有する、標的化配列と、
スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、
スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、
前記操作されたポリヌクレオチドが、RNA編集エンティティによる前記標的RNAの塩基の編集を容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。 - 操作されたポリヌクレオチドであって、
標的RNAの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ少なくとも1つのミスマッチヌクレオチドを含有する、標的化配列であって、前記標的RNAが、疾患又は状態に関与するエクソン中に変位を含む、標的化配列と、
スプライセオソームsnRNA若しくは非スプライセオソーム核内低分子RNA(snRNA)由来のSm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、
スプライセオソームsnRNA、非スプライセオソームsnRNA由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、
前記操作されたポリヌクレオチドが、前記標的RNA中のエクソンのエクソンスキッピングを容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。 - 前記ミスマッチが、少なくとも1つのアデニン-グアニン(A-G)ミスマッチ、少なくとも1つのアデニン-アデニン(A-A)ミスマッチ、又は少なくとも1つのアデニン-シトシン(A-C)を含む、請求項1又は2に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記ミスマッチが、A-Cミスマッチを含む、請求項3に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアント、及び前記ヘアピンが、前記操作されたポリヌクレオチドの3’末端上にある、請求項1~4のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、約25塩基~約200塩基長である、請求項1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、少なくとも約30塩基長である、請求項1~5のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記操作されたポリヌクレオチドが、RNAポリメラーゼII型プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1~9のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記RNAポリメラーゼII型プロモーターが、U7プロモーターを含む、請求項10に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記操作されたポリヌクレオチドが、U6プロモーターに作動可能に連結されている、請求項1~12のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントが、SmOPT配列である、請求項1~10のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記SmOPT配列が、配列番号41に対して少なくとも約80%の配列同一性を含む、請求項11に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記SmOPT配列が、配列番号41の配列を含む、請求項11に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記ヘアピンが、マウスU7 snRNA、ヒトU7 snRNA、又はヒトU1 snRNA由来である、請求項1~13のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記ヘアピンが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つのヘアピン配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記ヘアピンが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、又は配列番号46のうちのいずれか1つのヘアピン配列を含む、請求項15に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記ヘアピンが、配列番号43のヘアピン配列を含む、請求項1~16のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記操作されたポリヌクレオチドの前記3’末端にU7ボックスターミネーターを更に含む、請求項1~17のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 5’から3’の前記標的化配列が、前記標的化配列と、前記Sm若しくはSm様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、前記ヘアピンと、を含む、請求項1~18のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記操作されたポリヌクレオチドが、RNA編集エンティティによる前記標的RNAのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成されている、請求項2に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記RNA編集エンティティが、ADARタンパク質、APOBECタンパク質、又は両方を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記RNA編集エンティティが、ADARを含み、前記ADARが、ADAR1又はADAR2を含む、請求項1~20のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、疾患又は状態において実行される標的RNAに少なくとも部分的に結合する、請求項1~22のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的RNAが、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、HFE、LIPA、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項23に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的RNAが、SERPINA1であり、前記SERPINA1が、E342K変異を含む、請求項24に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的RNAが、LRRK2であり、前記LRRK2が、G2019S変異を含む、請求項24に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記疾患又は状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、又はテイ・サックス病を含む、請求項1~26のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、前記標的RNA内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的である、請求項1~27のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、
(a)前記標的RNA内のエクソンの上流にある分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であるか、又は
(b)前記標的化配列が、前記標的RNA内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項28に記載の操作されたポリヌクレオチド。 - 前記ミスマッチが、前記標的化配列のいずれかの末端から約1~約200塩基に位置する、請求項1~29のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記ミスマッチが、前記標的化配列のいずれかの末端から少なくとも45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、又は55塩基に位置する、請求項1~29のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- デアミナーゼ動員ドメインを更に含む、請求項1~31のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記デアミナーゼ動員ドメインが、GluR2、Alu、これらのいずれかの一部分、これらのいずれかのバリアント、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項32に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記デアミナーゼ動員ドメインが、ステムループを含む、請求項32又は33に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記ステムループが、GluR2ドメインに対して少なくとも約80%の配列同一性を含む、請求項34に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、前記標的RNAの3’又は5’非翻訳領域(UTR)の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項1~35のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項1~35のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、前記標的RNAのイントロン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項1~35のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記標的化配列が、前記標的RNAのエクソン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項1~35のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 前記操作されたポリヌクレオチドが、約80ヌクレオチド~約600ヌクレオチドである、請求項1~39のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
- 請求項1~40のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクター。
- 前記ベクターが、リポソーム、ナノ粒子、又はデンドリマーを含む、請求項41に記載のベクター。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項41に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項43に記載のベクター。
- 前記AAVベクターが、AAV2ベクター、AAV5ベクター、AAV8ベクター、AAV9ベクター、又はこれらのいずれかのハイブリッドである、請求項44に記載のベクター。
- 請求項1~40のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド、請求項1~40のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項41~45のいずれか一項に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、単位剤形での薬学的組成物。
- 状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、有効量の請求項1~40のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド、請求項1~40のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、若しくは請求項41~45のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項46に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
- 前記状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ-1-アンチトリプシン欠乏症、又はスターガルト病である、請求項47に記載の方法。
- 前記状態が、RAB7A、ABCA4、SERPINA1、SERPINA1 E342K、HEXA、LRRK2、SNCA、DMD、APP、Tau、CFTR、ALAS1、ATP7B、ATP7B G1226R、HFE C282Y、LIPA c.894 G>A、PCSK9開始部位、又はSCNN1A開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子中の変異と関連する、請求項47に記載の方法。
- 前記投与することが、吸入、耳、口腔内、結膜、歯、子宮頸管内、洞内(endosinusial)、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、嚢内、心腔内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内(intraductal)、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄腔内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内(intrasinal)、髄腔内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸郭内、管内(intratubular)、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮(percutaneous)、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮(transdermal)、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、鞘内、心室内、定位的、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項47~49のいずれか一項に記載の方法。送達は、非経口投与(静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、又は注入を含む)、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚等の表面の外表面に対する局所投与(ローション、クリーム、軟膏)を含み得る。いくつかの場合において、投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、若しくは経鼻投与、又はこれらの任意の組み合わせによるものである。
- 前記対象が、ヒトである、請求項47~50のいずれか一項に記載の方法。
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