JP2023523237A - ｓｎＲＮＡ構成要素を使用する組成物及び方法 - Google Patents

ｓｎＲＮＡ構成要素を使用する組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

ヌクレオチドミスマッチを含有し得る標的ＲＮＡとハイブリダイズするために使用することができる操作されたポリヌクレオチドを含む、組成物、薬学的組成物、及び使用方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される組成物及び方法を使用して、ＲＮＡを編集して、対象における疾患又は状態を軽減するか、又は治療することができる。【選択図】図４Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月２２日に出願された仮出願番号第６３／０１３，７４４号、２０２０年５月２６日に出願された仮出願番号第６３／０３０，１１８号、２０２０年１０月１日に出願された仮出願番号第６３／０８６，４３４号、２０２０年１１月１１日に出願された仮出願番号第６３／１１２，４８６号、２０２０年１２月１日に出願された仮出願番号第６３／１１９，８７８号、及び２０２１年２月２５日に出願された仮出願番号第６３／１５３，８１７号に対する米国特許法第１１９条に基づく優先権を請求し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
内因性及び外因性のＲＮＡ編集酵素によるＲＮＡ編集を容易にするガイドＲＮＡは、広範囲の疾患に対処する可能性を有する。しかしながら、これらのガイドＲＮＡの効力を定量的及び定性的に増加させるためには、ＲＮＡの安定性及び保持性を増強する組成物及び方法が必要である。
スプライシング活性の調節による治療の機会が可能であるが、このアプローチの効率、特異性、及び送達は、臨床現場では十分に機能していない。本開示は、スプライシング活性の調節及びＲＮＡ塩基編集の効率、特異性、及び送達の顕著な改善を提供する、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
ここで、本願発明者らは、所望の遺伝子標的に対して内因性ＡＤＡＲデアミナーゼ活性をもたらすためのガイドＲＮＡを発現するための新規なシャーシを操作するようにＵ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子を適応させる。このＲＮＡ塩基編集は、コード配列、５’若しくは３’非翻訳領域、イントロン、分岐点アデノシン、又はスプライスアクセプター部位内で生じ得る。このようなＲＮＡ塩基編集によって、タンパク質コード配列を変更し、変異した早期停止コドンを除去し、ＲＮＡの安定性を調節し、又はプレｍＲＮＡのスプライシングを変更することができる。
本開示は、操作されたポリヌクレオチドであって、標的ＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含有する、標的化配列と、スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソーム核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）由来のＳｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のヘアピン、又はそのバリアントと、を含む、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示はまた、操作されたポリヌクレオチドであって、標的ＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、少なくとも１つのアデニン－グアニン（Ａ－Ｇ）ミスマッチ、少なくとも１つのアデニン－アデニン（Ａ－Ａ）ミスマッチ、又は少なくとも１つのアデニン－シトシン（Ａ－Ｃ）ミスマッチを含有する、標的化配列と、スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソーム核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）由来のＳｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のヘアピン、又はそのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡの塩基の編集を容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチドを提供する。
ミスマッチは、少なくとも１つのアデニン－グアニン（Ａ－Ｇ）ミスマッチ、少なくとも１つのアデニン－アデニン（Ａ－Ａ）ミスマッチ、又は少なくとも１つのアデニン－シトシン（Ａ－Ｃ）であり得る。標的化配列は、少なくとも３０～３００又は５０～１００塩基長であり得る。操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターに作動可能に連結され得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターは、Ｕ１プロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターは、Ｕ７プロモーターである。操作されたポリヌクレオチドは、Ｕ６プロモーターに作動可能に連結される。Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントは、ＳｍＯＰＴ配列である。ＳｍＯＰＴ配列は、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ又は配列番号４１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。ＳｍＯＰＴ配列は、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ又は配列番号４１である。ヘアピンは、マウスＵ７ ｓｎＲＮＡ、ヒトＵ７ ｓｎＲＮＡ、又はヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ由来である。ヘアピンは、マウスＵ７ ｓｎＲＮＡ、ヒトＵ７ ｓｎＲＮＡ、ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡのうちの１つ以上のキメラヘアピンである。ヘアピンは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つの中のヘアピン配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。ヘアピンは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つのヘアピン配列を有する。ヘアピンは、配列番号４３の配列を有する。操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの３’末端にＵ７ボックスターミネーターを更に含み得る。５’から３’の標的化配列は、標的化配列と、Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、ヘアピンと、を含む。操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡの塩基の編集を容易にするように構成されている。ＲＮＡ編集は、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、又は両方を含む。ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２を含む。標的化配列は、疾患又は状態において実行される標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合する。標的ＲＮＡは、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、又はテイ・サックス病を含む、疾患又は状態。操作されたポリヌクレオチドは、ｓｎＲＮＡ由来の追加の配列を更に含む。ｓｎＲＮＡ由来の追加の配列は、少なくとも部分的にＵ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、又はＵ７ ｓｎＲＮＡ配列を含み得る。ｓｎＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１～配列番号３３のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも８０％の同一性を有し得る。標的化配列は、標的ＲＮＡの配列に対してミスマッチを含む。ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチであってもよく、標的化配列は、Ａ／ＣミスマッチのＣを含み、標的ＲＮＡの配列は、Ａ／ＣミスマッチのＡを含む。Ａ／Ｃミスマッチは、デアミナーゼ存在下でプレｍＲＮＡと会合したときに、プレｍＲＮＡにおいて編集を促進するように構成されてもよい。ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から１０～３０塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から約２０塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から正確に２０塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から約７０～９０塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から約８０塩基に位置する。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から正確に８０塩基に位置する。ｓｎＲＮＡプロモーターは、少なくとも部分的にＵ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、又はＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含む。
標的化配列は、標的ＲＮＡ内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、（ａ）標的ＲＮＡ内のエクソンの上流にある分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であるか、又は（ｂ）標的化配列が、標的ＲＮＡ内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的である。
操作されたポリヌクレオチドは、インビトロで測定される場合に、Ｓｍ若しくはＳｍ様結合ドメイン、又はそのバリアントを含まないか、ヘアピンを含まないか、あるいはＳｍ若しくはＳｍ様結合ドメイン、又はそのバリアント及びヘアピンを含まない、同等のエクソンスキッピング構築物と比較して、改善されたエクソンスキッピングの効率を有し得る。効率は、ミスマッチヌクレオチドを含まない編集構築物を含む細胞と比較して、編集構築物によってトランスフェクトされた細胞におけるエクソンスキッピングガイドＲＮＡ構築物によってスキッピングされたエクソンのスキッピングの割合を検出するために、液滴デジタルＰＣＲアッセイを行うことによって決定することができる。操作されたポリヌクレオチドは、スプライスシグナル内の塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集は、エクソンのスキッピングを促進するように構成され得る。操作されたポリヌクレオチドは、インビトロアッセイによって測定される場合、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、エクソンスキッピングの効率が増加する。プレｍＲＮＡを標的とする領域内のプレｍＲＮＡに対して相補的ではないヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと会合したときに、操作されたポリヌクレオチドがデアミナーゼを動員するように構成する。標的化配列は、プレｍＲＮＡに結合したときに、デアミナーゼと会合して、デアミナーゼによるプレｍＲＮＡのポリヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にする。操作されたポリヌクレオチドは、デアミナーゼ動員ドメインを更に含む。
デアミナーゼ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２、Ａｌｕのうちの少なくとも一部分、これらのいずれかのバリアント、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。デアミナーゼ動員ドメインは、ステムループを含む。ステムループは、左巻きのステムループ又は右巻きのステムループである。ステムループは、ＧｌｕＲ２ドメインに対して少なくとも約８０％の配列同一性を含む。操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドを含む。化学修飾は、表１に提供される操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の少なくとも１つの修飾を含む。
操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡに結合していないときに、ヘアピン、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとものうちのいずれか１つを欠いている。例えば、上述の構造的特徴の１つであるヘアピン、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせは、本開示の操作されたポリヌクレオチドを標的ＲＮＡに結合することによって形成される二本鎖ＲＮＡ中に形成されてもよい。構造的特徴は、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを含む。構造的特徴は、バルジである。バルジは、非対称バルジである。バルジは、対称バルジである。構造的特徴は、内部ループである。内部ループは、非対称ループである。内部ループは、対称ループである。操作されたポリヌクレオチドは、構造的なループ安定化骨格を含む。構造的なループ安定化骨格は、標的化配列を更に含み、これが標的ＲＮＡと会合して、ＲＮＡ編集酵素を動員し、ＲＮＡ編集酵素は、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を化学修飾し、標的化配列は、約４個より多く、又は約４個の連続したヌクレオチドを含む。操作されたポリヌクレオチドは、標的化配列に隣接する第１のスペーサードメイン及び第２のスペーサードメインを更に含み、操作されたポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における転写の後に自己環化するように構成されている。操作されたポリヌクレオチドは、第１のスペーサードメインに対して５’に、又は第２のスペーサードメインに対して３’にリボザイムドメインを含む。操作されたポリヌクレオチドは、リボザイムドメインと第１のスペーサードメインとの間に、又はリボザイムドメインと第２のスペーサードメインとの間にライゲーションドメインを含む。ポリヌクレオチド配列が二次元的に表される場合、操作されたポリヌクレオチドは、線形である。ポリヌクレオチド配列が二次元的に表される場合、操作されたポリヌクレオチドは、環状である。操作されたポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で、系内で環化するように構成されている。標的化配列は、アプタマーを含まない。操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まないか、又はそれをコードしない。標的化配列は、標的ＲＮＡの３’又は５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている。標的化配列は、標的ＲＮＡのイントロン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている。標的化配列は、標的ＲＮＡのエクソン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている。操作されたポリヌクレオチドは、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチドである。操作されたポリヌクレオチドは、標的化配列に対して５’に第１のスペーサードメインを含む。操作されたポリヌクレオチドは、第１のスペーサードメインとは異なるか、又は同一である第２のスペーサードメインを含む。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、又は両方は、ＡＵＡＵＡ（配列番号５３）のポリヌクレオチド配列を含む。第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、又は両方は、ＡＵＡＡＵ（配列番号５２）のポリヌクレオチド配列を含む。操作されたポリヌクレオチドは、５’末端に第１のリボザイムドメインと、３’末端に第２のリボザイムドメインと、を含む。第１又は第２のリボザイムは、独立して、ハンマーヘッドリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＨＤＶ様リボザイム、Ｒ２エレメント、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ ｒＲＮＡ、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、ＩＩ群イントロン、ヘアピンリボザイム、ＶＳリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、及びＩ群イントロンからなる群から選択される。
本開示の操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクターが本明細書で提供される。ベクターは、リポソーム、ナノ粒子、又はデンドリマーを含む。ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、又はこれらのいずれかのハイブリッドである。ウイルスベクターは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。ウイルスベクターは、一本鎖ＡＡＶベクターである。
本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は本開示のベクターを含む、単離された細胞が本明細書で提供される。単離された細胞は、Ｔ細胞、ニューロン、筋細胞、肝細胞等であり得る。
本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は本開示のベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、単位剤形での薬学的組成物が本明細書で提供される。
本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、本開示のベクター、又は本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において状態を治療又は予防する方法が本明細書で提供される。状態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、パーキンソン病、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、又はスターガルト病であり得る。状態は、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質中の変異と関連する。投与は、非経口であり得る。投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、筋肉内注射、脳室内（ＩＣＶ）投与、皮下注射、経口投与、粘膜投与、舌下投与、口腔内投与、直腸投与、眼投与、耳投与、経鼻投与、局所投与、皮膚投与、経皮投与、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。
本開示の方法は、追加の治療を行うことを更に含み得る。追加の治療は、同時に、又は連続的に行われ得る。投与は、少なくとも週に１回行うことができる。対象は、投与前にインビトロ診断によって疾患又は状態を有すると診断されている。対象は、ヒトであってもよく、任意選択的に、対象は、男性又は女性であり、対象は、任意選択的に、成人であるか、又は対象は、任意選択的に、１８歳未満である。
本開示の操作されたポリヌクレオチドを容器中に含むか、又は本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを容器中に含むか、又は本開示のベクターを容器中に含むか、又は本開示の薬学的組成物を容器中に含む、キットが本明細書で提供される。
薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を、本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は本開示のベクターのうちの少なくとも１つと接触させることを含む、薬学的組成物を作製する方法が本明細書で提供される。
１）本開示の操作されたポリヌクレオチド、２）本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、３）本開示のベクター、又は４）本開示の薬学的組成物を容器内に少なくとも部分的に配置することを含む、キットを作製する方法が本明細書で提供される。
図１は、ＤＭＤエクソン７１及びエクソン７４のエクソンスキッピングの評価のためのアッセイの例を示す。矢印は、定量的ＰＣＲ又は液滴デジタルＰＣＲのいずれかで使用するためのプライマーを示し、実線は、プローブを示す。下のパネルは、ヒト骨格筋に由来する抽出されたｃＤＮＡに対して行われる液滴デジタルＰＣＲエクソンスキッピングアッセイの代表的なデータを示す。 図２Ａ～２Ｂは、Ｕ７／Ｕ１プロモーターが、３’ヘアピンと組み合わせて特異的ガイドＲＮＡ編集を増強することを示す。ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、対応する３’ヘアピンを有するか、又は有しない、ｈＵ６、ｍＵ７、ｈＵ７、又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。３８時間後にＲＮＡを測定した。図２Ａは、ＲＡＢ７Ａ ＡＤＡＲ編集及びＤＭＤエクソン７１又は７４スキッピング（ｄｄＰＣＲによって測定される）に影響を及ぼす、３’ヘアピン（ＳｍＯＰＴ Ｕ７又はｈＵ１）と組み合わせてプロモーター配列（Ｕ７又はＵ１）を有する操作されたポリヌクレオチドを示す。白色の棒グラフは、細胞がＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトされた実験を示し、一方で、黒色の棒グラフは、ＡＤＡＲ２過剰発現ベクターでのトランスフェクションを示す。点は、２つの独立した実験を示し、棒グラフは、２つの実験の平均を表している。図２Ｂは、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ中の標的アデノシンにおける特異的編集のＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（ボックス）。配列決定のために逆方向プライマーを使用したため、Ａ＞Ｇ編集は、Ｔ＞Ｃとして現れる。 図２Ａ～２Ｂは、Ｕ７／Ｕ１プロモーターが、３’ヘアピンと組み合わせて特異的ガイドＲＮＡ編集を増強することを示す。ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、対応する３’ヘアピンを有するか、又は有しない、ｈＵ６、ｍＵ７、ｈＵ７、又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。３８時間後にＲＮＡを測定した。図２Ａは、ＲＡＢ７Ａ ＡＤＡＲ編集及びＤＭＤエクソン７１又は７４スキッピング（ｄｄＰＣＲによって測定される）に影響を及ぼす、３’ヘアピン（ＳｍＯＰＴ Ｕ７又はｈＵ１）と組み合わせてプロモーター配列（Ｕ７又はＵ１）を有する操作されたポリヌクレオチドを示す。白色の棒グラフは、細胞がＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトされた実験を示し、一方で、黒色の棒グラフは、ＡＤＡＲ２過剰発現ベクターでのトランスフェクションを示す。点は、２つの独立した実験を示し、棒グラフは、２つの実験の平均を表している。図２Ｂは、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ中の標的アデノシンにおける特異的編集のＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（ボックス）。配列決定のために逆方向プライマーを使用したため、Ａ＞Ｇ編集は、Ｔ＞Ｃとして現れる。 図３Ａ～３Ｄは、３’ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する操作されたポリヌクレオチドのＵ７プロモーターによって駆動される発現が、意図しないエクソンスキッピングを最小限にしつつ、追加の遺伝子標的での特異的ガイドＲＮＡ編集を増強することを示す。図３Ａは、ヒトＲＡＢ７Ａ及びＳＮＣＡのエクソン構造を示す。エクソンは、灰色のセグメントで示され、コード領域は、その上の黒色の線として示される。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置が示され、ＰＣＲプライマーも示されている。図３Ｂは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集を示す（Ｓａｎｇｅｒ配列決定により測定される）。図３Ｃは、上のプライマーを使用してＰＣＲ増幅され、アガロースゲル上で分析された、編集された転写産物からのｃＤＮＡを示す。ＰＣＲアンプリコンは、正しくスプライシングされたエクソンの予測サイズを示した。図３Ｄは、示されている転写産物の標的アデノシンでの特異的編集を明らかにするＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（赤色のボックス）。 図３Ａ～３Ｄは、３’ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する操作されたポリヌクレオチドのＵ７プロモーターによって駆動される発現が、意図しないエクソンスキッピングを最小限にしつつ、追加の遺伝子標的での特異的ガイドＲＮＡ編集を増強することを示す。図３Ａは、ヒトＲＡＢ７Ａ及びＳＮＣＡのエクソン構造を示す。エクソンは、灰色のセグメントで示され、コード領域は、その上の黒色の線として示される。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置が示され、ＰＣＲプライマーも示されている。図３Ｂは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集を示す（Ｓａｎｇｅｒ配列決定により測定される）。図３Ｃは、上のプライマーを使用してＰＣＲ増幅され、アガロースゲル上で分析された、編集された転写産物からのｃＤＮＡを示す。ＰＣＲアンプリコンは、正しくスプライシングされたエクソンの予測サイズを示した。図３Ｄは、示されている転写産物の標的アデノシンでの特異的編集を明らかにするＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（赤色のボックス）。 図３Ａ～３Ｄは、３’ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する操作されたポリヌクレオチドのＵ７プロモーターによって駆動される発現が、意図しないエクソンスキッピングを最小限にしつつ、追加の遺伝子標的での特異的ガイドＲＮＡ編集を増強することを示す。図３Ａは、ヒトＲＡＢ７Ａ及びＳＮＣＡのエクソン構造を示す。エクソンは、灰色のセグメントで示され、コード領域は、その上の黒色の線として示される。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置が示され、ＰＣＲプライマーも示されている。図３Ｂは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集を示す（Ｓａｎｇｅｒ配列決定により測定される）。図３Ｃは、上のプライマーを使用してＰＣＲ増幅され、アガロースゲル上で分析された、編集された転写産物からのｃＤＮＡを示す。ＰＣＲアンプリコンは、正しくスプライシングされたエクソンの予測サイズを示した。図３Ｄは、示されている転写産物の標的アデノシンでの特異的編集を明らかにするＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（赤色のボックス）。 図３Ａ～３Ｄは、３’ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する操作されたポリヌクレオチドのＵ７プロモーターによって駆動される発現が、意図しないエクソンスキッピングを最小限にしつつ、追加の遺伝子標的での特異的ガイドＲＮＡ編集を増強することを示す。図３Ａは、ヒトＲＡＢ７Ａ及びＳＮＣＡのエクソン構造を示す。エクソンは、灰色のセグメントで示され、コード領域は、その上の黒色の線として示される。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置が示され、ＰＣＲプライマーも示されている。図３Ｂは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集を示す（Ｓａｎｇｅｒ配列決定により測定される）。図３Ｃは、上のプライマーを使用してＰＣＲ増幅され、アガロースゲル上で分析された、編集された転写産物からのｃＤＮＡを示す。ＰＣＲアンプリコンは、正しくスプライシングされたエクソンの予測サイズを示した。図３Ｄは、示されている転写産物の標的アデノシンでの特異的編集を明らかにするＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（赤色のボックス）。 図４は、複数の時間点での追加の細胞型におけるＳＮＣＡ開始コドン（翻訳開始部位）及びＳＮＣＡ ３’ＵＴＲの編集を示す。ヒトＳＮＣＡ開始コドン又はヒトＳＮＣＡ ３’ＵＴＲを標的とする操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンを有しないｈＵ６プロモーター、３’ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｍＵ７プロモーター、３’ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するｈＵ７プロモーター、又は３’ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｈＵ１プロモーターを使用して発現された。図４Ａは、ＡＤＡＲ２過剰発現を伴うか、又は伴わない、追加のオフターゲット編集部位とともに、オンターゲット部位（赤色のボックス）でのＨＥＫ ２９３細胞における塩基編集を明らかにするＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す。編集率は、各ピークに下に示されている。図４Ｂは、指示された時間点での異なるトランスフェクション条件（ヌクレオフェクション、Ｌｏｎｚａ）下、ＳＮＣＡを過剰発現するＫ５６２細胞におけるＳＮＣＡ ３’ＵＴＲの編集率を示す。細胞を、ＧＦＰ発現ベクター（内因性ＡＤＡＲ、色抜きの記号）、又はＡＤＡＲ２過剰発現ベクター（黒塗りの記号）でトランスフェクトした。 図４は、複数の時間点での追加の細胞型におけるＳＮＣＡ開始コドン（翻訳開始部位）及びＳＮＣＡ ３’ＵＴＲの編集を示す。ヒトＳＮＣＡ開始コドン又はヒトＳＮＣＡ ３’ＵＴＲを標的とする操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンを有しないｈＵ６プロモーター、３’ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｍＵ７プロモーター、３’ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するｈＵ７プロモーター、又は３’ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｈＵ１プロモーターを使用して発現された。図４Ａは、ＡＤＡＲ２過剰発現を伴うか、又は伴わない、追加のオフターゲット編集部位とともに、オンターゲット部位（赤色のボックス）でのＨＥＫ ２９３細胞における塩基編集を明らかにするＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す。編集率は、各ピークに下に示されている。図４Ｂは、指示された時間点での異なるトランスフェクション条件（ヌクレオフェクション、Ｌｏｎｚａ）下、ＳＮＣＡを過剰発現するＫ５６２細胞におけるＳＮＣＡ ３’ＵＴＲの編集率を示す。細胞を、ＧＦＰ発現ベクター（内因性ＡＤＡＲ、色抜きの記号）、又はＡＤＡＲ２過剰発現ベクター（黒塗りの記号）でトランスフェクトした。 図５は、ヒトＵ１プロモーターが、転写産物レベルのノックダウンを最小限にしつつ、ガイドＲＮＡ編集のための３’ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンと対形成することができることを示す。ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とするガイドＲＮＡは、３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン及びＵ７終止配列を有する、ｈＵ６、ｍＵ７、ｈＵ７、又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。代替的に、これらの１００ｎｔのガイドＲＮＡは、Ｌｉｔｋｅ ａｎｄ Ｊａｆｆｒｅｙ ２０１９からの環化しているＲｔｃＢリボザイム部位を有する（ＳｍＯＰＴ又はＵ７ヘアピンを有しない）、ｈＵ６、ｍＵ７、ｈＵ７、又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。ＲＮＡを、ｄｄＰＣＲによって、トランスフェクション後の指示された時間点で測定した。 図６は、３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンに対向するガイドＲＮＡの５’末端にｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン［ＵＡＧＧＧＷ］を付加することが、ＲＡＢ７Ａ編集及びＤＭＤエクソン７４スキッピングに影響を及ぼすことを示す。ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とするガイドＲＮＡは、３’ ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン及びｍＵ７終止配列を有する、ｍＵ７又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。代替的に、これらの１００ｎｔのガイドＲＮＡは、Ｌｉｔｋｅ ａｎｄ Ｊａｆｆｒｅｙ ２０１９からの環化しているＲｔｃＢリボザイム部位を有する（ＳｍＯＰＴ又はＵ７ヘアピンを有しない）、ｈＵ６プロモーターを使用して発現された。ガイドＲＮＡの５’末端に、タグなし、三重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン（Ｄｉｃｋｓｏｎ ２００８）、二重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン、又は陰性対照としてのｈｎＲＮＰ Ａ１に結合しない変異したドメインのいずれかを付加した。４２時間後にＲＮＡを測定した。図６Ａは、ｈｎＲＮＰ結合ドメインが、Ｕ７／Ｕ１プロモーター及び３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンと組み合わせた場合に、ＲＡＢ７Ａ ＡＤＡＲ編集及びＤＭＤエクソン７４スキッピング（ｄｄＰＣＲによって測定される）を増加させたことを示す。図６Ｂは、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ中の標的アデノシンにおける特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（ボックス）。配列決定のために逆方向プライマーを使用したため、Ａ＞Ｇ編集は、Ｔ＞Ｃとして現れる。 図６は、３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンに対向するガイドＲＮＡの５’末端にｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン［ＵＡＧＧＧＷ］を付加することが、ＲＡＢ７Ａ編集及びＤＭＤエクソン７４スキッピングに影響を及ぼすことを示す。ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とするガイドＲＮＡは、３’ ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン及びｍＵ７終止配列を有する、ｍＵ７又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。代替的に、これらの１００ｎｔのガイドＲＮＡは、Ｌｉｔｋｅ ａｎｄ Ｊａｆｆｒｅｙ ２０１９からの環化しているＲｔｃＢリボザイム部位を有する（ＳｍＯＰＴ又はＵ７ヘアピンを有しない）、ｈＵ６プロモーターを使用して発現された。ガイドＲＮＡの５’末端に、タグなし、三重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン（Ｄｉｃｋｓｏｎ ２００８）、二重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン、又は陰性対照としてのｈｎＲＮＰ Ａ１に結合しない変異したドメインのいずれかを付加した。４２時間後にＲＮＡを測定した。図６Ａは、ｈｎＲＮＰ結合ドメインが、Ｕ７／Ｕ１プロモーター及び３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンと組み合わせた場合に、ＲＡＢ７Ａ ＡＤＡＲ編集及びＤＭＤエクソン７４スキッピング（ｄｄＰＣＲによって測定される）を増加させたことを示す。図６Ｂは、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ中の標的アデノシンにおける特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（ボックス）。配列決定のために逆方向プライマーを使用したため、Ａ＞Ｇ編集は、Ｔ＞Ｃとして現れる。 図７は、完全編集にはＳｍＯＰＴ配列が必要であるが、マウス、ヒト、又はハイブリッドマウス／ヒト組み合わせ由来のＵ７ヘアピンが、編集にとって十分であり得ることを示す。ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターの１００ｎｔを標的とするガイドＲＮＡは、ｍＵ７終止配列とともに、ＳｍＯＰＴドメインの変動又はＵ７ヘアピンの変動を有するｍＵ７プロモーターを使用して発現された。図７Ａは、Ｓｍドメイン及びＵ７ヘアピンの配列変動を列挙する。ＳｍＯＰＴ配列は、Ｕ１若しくはＵ７ ｓｎＲＮＡ由来の天然Ｓｍ結合ドメイン、又はＳｍに結合しない変異態様によって置き換えられた。代替的に、ｍＵ７ヘアピンは、ｈＵ７ヘアピン又はハイブリッドマウス／ヒト組み合わせによって置き換えられた。図７Ｂは、ＳｍＯＰＴ配列を含有するガイドＲＮＡが、変動ではなく、強固な編集をもたらすことができることを示す。図７Ｃは、示されている転写産物の標的アデノシンでの特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（赤色のボックス）。 図７は、完全編集にはＳｍＯＰＴ配列が必要であるが、マウス、ヒト、又はハイブリッドマウス／ヒト組み合わせ由来のＵ７ヘアピンが、編集にとって十分であり得ることを示す。ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターの１００ｎｔを標的とするガイドＲＮＡは、ｍＵ７終止配列とともに、ＳｍＯＰＴドメインの変動又はＵ７ヘアピンの変動を有するｍＵ７プロモーターを使用して発現された。図７Ａは、Ｓｍドメイン及びＵ７ヘアピンの配列変動を列挙する。ＳｍＯＰＴ配列は、Ｕ１若しくはＵ７ ｓｎＲＮＡ由来の天然Ｓｍ結合ドメイン、又はＳｍに結合しない変異態様によって置き換えられた。代替的に、ｍＵ７ヘアピンは、ｈＵ７ヘアピン又はハイブリッドマウス／ヒト組み合わせによって置き換えられた。図７Ｂは、ＳｍＯＰＴ配列を含有するガイドＲＮＡが、変動ではなく、強固な編集をもたらすことができることを示す。図７Ｃは、示されている転写産物の標的アデノシンでの特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（赤色のボックス）。 図７は、完全編集にはＳｍＯＰＴ配列が必要であるが、マウス、ヒト、又はハイブリッドマウス／ヒト組み合わせ由来のＵ７ヘアピンが、編集にとって十分であり得ることを示す。ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターの１００ｎｔを標的とするガイドＲＮＡは、ｍＵ７終止配列とともに、ＳｍＯＰＴドメインの変動又はＵ７ヘアピンの変動を有するｍＵ７プロモーターを使用して発現された。図７Ａは、Ｓｍドメイン及びＵ７ヘアピンの配列変動を列挙する。ＳｍＯＰＴ配列は、Ｕ１若しくはＵ７ ｓｎＲＮＡ由来の天然Ｓｍ結合ドメイン、又はＳｍに結合しない変異態様によって置き換えられた。代替的に、ｍＵ７ヘアピンは、ｈＵ７ヘアピン又はハイブリッドマウス／ヒト組み合わせによって置き換えられた。図７Ｂは、ＳｍＯＰＴ配列を含有するガイドＲＮＡが、変動ではなく、強固な編集をもたらすことができることを示す。図７Ｃは、示されている転写産物の標的アデノシンでの特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（赤色のボックス）。 図８は、Ｇ２０１９Ｓ変異及びｍＣｈｅｒｒｙを有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を保有する（上側）か、又はＧ２０１９Ｓ変異、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＣＭＶ、及びＡＤＡＲ２を有するＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を保有する（下側）、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターの構築物を示す。 図９Ａは、２つのガイドＲＮＡ及び対照（ＧＦＰプラスミド）の投与後のＡＤＡＲ１によるＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異のインビトロでのオンターゲット編集及びオフターゲット編集を示す。 図９Ｂは、２つのガイドＲＮＡ及び対照（ＧＦＰプラスミド）の投与後のＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２によるＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異のインビトロでのオンターゲット編集及びオフターゲット編集を示す。 図１０は、３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを含有するガイドＲＮＡが、環化し、Ｕ７又はＵ６プロモーターによって発現してＡＤＡＲ編集をもたらすことができることを示す。図１０Ａは、ＲｔｃＢ環状リボザイム部位によって隣接される３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを含むか、又は含まない、１００ｎｔのガイドＲＮＡを示す。ガイド特異的プライマーによるＳａｎｇｅｒ配列決定（黒色）は、リボザイム部位が、環状ＲＮＡの内側に存在するガイドＲＮＡ及び３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを用いて、一緒に首尾よく接続されていることを示す。図１０Ｂは、ｍＵ７又はｈＵ６プロモーター、異なるＳｍ結合ドメイン及びＵ７ヘアピン、並びにＵ７ヘアピンとＰ１環状リボザイムとの間の様々な長さのリンカーのいずれかを使用して、ＳｍＯＰＴ Ｕ７環状ガイドＲＮＡの異なる変動を比較する（上側パネル）。上述のように、３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する線形の１００ｎｔのガイドＲＮＡは、ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターの６つの遺伝子標的全てを編集するＡＤＡＲ ＲＮＡを生じさせることができた（中央のパネル）。３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する１００ｎｔのガイドＲＮＡの環状変動もまた、ｍＵ７又はｈＵ６プロモーターによって発現されるかどうかにかかわらず、実質的な編集をもたらすことができた。標的転写産物ノックダウン又は偶発的なエクソンスキッピングの副作用は、最小限であった（下側パネル）。 図１０は、３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを含有するガイドＲＮＡが、環化し、Ｕ７又はＵ６プロモーターによって発現してＡＤＡＲ編集をもたらすことができることを示す。図１０Ａは、ＲｔｃＢ環状リボザイム部位によって隣接される３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを含むか、又は含まない、１００ｎｔのガイドＲＮＡを示す。ガイド特異的プライマーによるＳａｎｇｅｒ配列決定（黒色）は、リボザイム部位が、環状ＲＮＡの内側に存在するガイドＲＮＡ及び３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを用いて、一緒に首尾よく接続されていることを示す。図１０Ｂは、ｍＵ７又はｈＵ６プロモーター、異なるＳｍ結合ドメイン及びＵ７ヘアピン、並びにＵ７ヘアピンとＰ１環状リボザイムとの間の様々な長さのリンカーのいずれかを使用して、ＳｍＯＰＴ Ｕ７環状ガイドＲＮＡの異なる変動を比較する（上側パネル）。上述のように、３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する線形の１００ｎｔのガイドＲＮＡは、ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターの６つの遺伝子標的全てを編集するＡＤＡＲ ＲＮＡを生じさせることができた（中央のパネル）。３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する１００ｎｔのガイドＲＮＡの環状変動もまた、ｍＵ７又はｈＵ６プロモーターによって発現されるかどうかにかかわらず、実質的な編集をもたらすことができた。標的転写産物ノックダウン又は偶発的なエクソンスキッピングの副作用は、最小限であった（下側パネル）。 図１１Ａは、ＡＢＣＡ４、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンにおける変異を標的とするガイドＲＮＡをコードする構築物のＲＮＡ編集率を示し、発現は、Ｕ１プロモーターによって駆動される。 図１１Ｂは、図１１Ａに示される様々な構築物のＳａｎｇｅｒ配列決定トレースを示す。 図１２Ａは、ＡＢＣＡ４、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンにおける変異を標的とするガイドＲＮＡをコードする複数用量の構築物について、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２による細胞におけるＲＮＡ編集率を示し、発現は、Ｕ１プロモーターによって駆動される。 図１２Ｂは、ＡＢＣＡ４、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンにおける変異を標的とするガイドＲＮＡをコードする複数用量の構築物について、ＡＤＡＲ１による細胞におけるＲＮＡ編集率を示し、発現は、Ｕ１プロモーターによって駆動される。 図１３は、編集される標的Ａ（ｘ軸上の「０」）での配列番号３１として列挙されるガイドＲＮＡのＲＮＡ編集、及びオフターゲット位置でのＲＮＡ編集（「０」ではない位置にある黒色の棒グラフとして表される）のプロットを示す。 図１４は、編集される標的Ａ（ｘ軸上の「０」）での配列番号３２として列挙されるガイドＲＮＡのＲＮＡ編集、及びオフターゲット位置でのＲＮＡ編集（「０」ではない位置にある黒色の棒グラフとして表される）のプロットを示す。 図１５は、編集される標的Ａ（ｘ軸上の「０」）での配列番号３３として列挙されるガイドＲＮＡのＲＮＡ編集、及びオフターゲット位置でのＲＮＡ編集（「０」ではない位置にある黒色の棒グラフとして表される）のプロットを示す。 図１６は、操作されたポリヌクレオチド発現構築物がプラスミドの一過性トランスフェクションによってＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に送達されたか、又は単一コピーとしてゲノムに組み込まれた、ヒトＳＯＤ１開始コドンの編集を示す。ヒトＳＯＤ１開始コドンを標的とする操作されたポリヌクレオチドは、環化しているＲｔｃＢリボザイム部位を有する（ＳｍＯＰＴ又はＵ７ヘアピンを有しない）ｈＵ６プロモーター、３’ ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｍＵ７プロモーター、又は５’二重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン及び３’ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するｍＵ７プロモーターを使用して発現された。 図１７は、３’ ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するｈＵ１プロモーターを使用して発現されたガイドＲＮＡを使用した、筋肉細胞におけるＲＡＢ７Ａの編集を示す。 図１８は、３’ ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するＵ６又はＵ７プロモーターを使用して発現されたガイドＲＮＡを使用した、ＳＥＲＰＩＮＡ１ミニ遺伝子１及び２の編集を示す。 図１９は、編集される標的Ａ（ｘ軸上の「０」）での配列番号２６及び配列番号２７として列挙されるガイドＲＮＡについてのＳＥＲＰＩＮＡ１のＲＮＡ編集、及びオフターゲット位置でのＲＮＡ編集（「０」ではない位置にある黒色の棒グラフとして表される）のプロットを示す。 図２０は、３’ ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するガイドＲＮＡを使用した、ＬＨＣＮ筋肉細胞におけるＲＡＢ７Ａの編集を示す。 図２１Ａ及び図２１Ｂは、９日間の分化後の、ｄｄＰＣＲによって決定される場合の用量の関数としてＡＡＶベクターを使用して発現されるガイドＲＮＡを使用したＲａｂ７ａの編集を示し（図２１Ａ）、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を示す（図２１Ｂ）。 図２１Ａ及び図２１Ｂは、９日間の分化後の、ｄｄＰＣＲによって決定される場合の用量の関数としてＡＡＶベクターを使用して発現されるガイドＲＮＡを使用したＲａｂ７ａの編集を示し（図２１Ａ）、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を示す（図２１Ｂ）。 図２１Ｃは、１７日間以上の分化後の、ｄｄＰＣＲによって決定される場合の用量の関数としてＡＡＶベクターを使用して発現されるガイドＲＮＡを使用したＲａｂ７ａの編集を示す。 図２２Ａは、９日間の分化後のＲａｂ７編集効率に対してプロットされた形質導入％を示す。 図２２Ｂは、様々な日数の分化後に採取した細胞におけるＲａｂ７編集効率に対してプロットされた形質導入％を示す。 図２３は、対照に対するＵ７ ｓｍＯＰＴ線形ガイドのオフターゲット編集プロファイルを示す。
「ａ」及び「ａｎ」という用語は、文法的な物品の目的語の１つ、又は１つより多く（例えば、少なくとも１つ）を指す。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は１つより多くの要素を意味する。
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、量又は濃度等の測定可能な値を指す場合、指定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、又は更には０．１％の変動を包含することを意味する。例えば、「約」は、当該技術分野における実践によれば、プラス又はマイナス１０％を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値のプラス若しくはマイナス２０％、プラス若しくはマイナス１０％、プラス若しくはマイナス５％、又はプラス若しくはマイナス１％の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的な系又はプロセスに関して、この用語は、ある値の最大５倍まで、又は最大２倍までの倍数の範囲内を意味し得る。特定の値を、本出願及び特許請求の範囲に記載することができる場合、別途記載のない限り、「約」という用語は、その特定の値について許容可能な誤差範囲までを意味すると考えるべきである。また、値の範囲、部分範囲、又はその両方を提供することができる場合、その範囲又は部分範囲は、その範囲又は部分範囲の端点を含むことができる。「実質的に」、「実質的にない」、「実質的に含まない」、及び「およそ」という用語は、記載されている値が、最大で合理的な期待値の範囲であり得ることを示す、大きさ、位置、又は両方を説明するときに使用することができる。例えば、ある数値は、述べられている値（又は値の範囲）の±０．１％、述べられている値（又は値の範囲）の±１％、述べられている値（又は値の範囲）の±２％、述べられている値（又は値の範囲）の±５％、述べられている値（又は値の範囲）の±１０％等であり得る値を有していてもよい。本明細書に引用される任意の数値範囲は、その中に属する全ての部分範囲を含むことを意図し得る。
本明細書で使用される場合、「部分的に」、「少なくとも部分的に」という用語、又は本明細書に使用される場合は、所与の値の１００％に近い値を指すことができる。いくつかの場合において、この用語は、総量の少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、又は９９．９９％であり得る量を指すことができる。いくつかの場合において、この用語は、総量の約１００％であり得る量を指すことができる。
本明細書で「Ａ及び／又はＢ」等の語句で使用される「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢの両方、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、並びにＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」等の語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の実施形態の各々を包含することが意図される。Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物及び方法が列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することが意図される。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「～から本質的になる」とは、意図された使用のための組み合わせに対する任意の本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法からの微量汚染物質、並びに薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存剤等を除外しない。「～からなる」とは、他の成分の微量元素、及び本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップより多くを除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「対象」、「宿主」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において動物、典型的には哺乳動物を指すために相互に置き換え可能に使用される。任意の好適な哺乳動物は、本明細書に記載される方法、細胞又は組成物によって治療され得る。哺乳動物は、本明細書に記載されるように、ベクター、操作されたポリヌクレオチド、前駆体ガイドＲＮＡ、核酸、又は薬学的組成物を投与され得る。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等）、家畜動物（例えば、イヌ及びネコ）、農場動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、並びに実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢、又は任意の発達段階（例えば、成人、十代、子供、乳児、又は子宮内の哺乳動物）であり得る。哺乳動物は、雄又は雌であり得る。哺乳動物は、妊娠中の雌であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、神経変性疾患等の疾患を有するか、又は有することが疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、がん、又は新生物性障害を有するか、又は有することが疑われ得る。他の実施形態において、対象は、異常なタンパク質発現に関連する疾患又は障害を有するか、又は有することが疑われ得る。いくつかの場合において、ヒトは、約１日齢～約１０ヶ月齢、約９ヶ月齢～約２４ヶ月齢、約１歳～約８歳、約５歳～約２５歳、約２０歳～約５０歳、約１歳～約１３０歳、又は約３０歳～約１００歳より上であってもよい。ヒトは、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、又は１２０歳より上であってもよい。ヒトは、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、又は１３０歳より下であってもよい。
「対象」、「宿主」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において動物、典型的には哺乳動物を指すために相互に置き換え可能に使用される。任意の好適な哺乳動物は、本明細書に記載の組成物（例えば、操作されたポリヌクレオチド）を投与され得るか、又は本明細書に記載の方法によって治療され得る。対象は、脊椎動物又は無脊椎動物であり得る。対象は、実験動物であり得る。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカク等）、家畜動物（例えば、イヌ及びネコ）、農場動物（例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、並びに実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。哺乳動物は、任意の年齢、又は任意の発達段階（例えば、成人、十代、子供、乳児、又は子宮内の哺乳動物）であり得る。哺乳動物は、雄又は雌であり得る。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得る。対象は、疾患を患っていてもよい。対象は、疾患の症状を呈していてもよい。対象は、疾患の症状を呈していないが、それでも疾患を有していてもよい。対象は、介護者の医療ケアの下にあってもよい（例えば、対象は、入院し、医師によって治療される）。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つのペプチド間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指し得る。相同性は、比較の目的のためにアラインメントすることができる各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が、同じ塩基又はアミノ酸によって占有され得る場合、その分子は、その位置で相同性であり得る。配列間の相同性の程度は、複数の配列によって共有されるマッチする位置又は相同性の位置の数の関数であり得る。「無関係」又は「非相同性の」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、又は代替的に２５％未満の同一性を共有する。配列相同性は、参照配列に対する配列の同一性％を指し得る。実用的な問題として、任意の特定の配列が、本明細書に記載の任意の配列（本明細書に記載の特定の核酸配列と対応し得る）に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得るかどうかにかかわらず、このような特定のポリペプチド配列は、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）等の既知のコンピュータプログラムを使用して、簡便に決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔ又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、参照配列に対して９５％同一であるかどうかを決定する場合、同一性パーセントを参照配列の全長にわたって計算することができるように、かつ全参照配列の最大５％の配列相同性中のギャップを許容することができるように、パラメータを設定することができる。
いくつかの場合において、参照配列（クエリ配列、例えば、本開示の配列）と主題配列との間の同一性は、グローバル配列アラインメントとも称され、ＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。いくつかの実施形態において、同一性が狭義に解釈され得る特定の実施形態のパラメータは、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントに使用され、Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｃｈｅｍｅ＝ＰＡＭ（許容される変異率）０、ｋ－ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００又は主題配列の長さのいずれか短い方、を含み得る。この実施形態によれば、主題配列が、内部欠失のためではなく、Ｎ末端又はＣ末端の欠失に起因してクエリ配列より短い可能性がある場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバル同一性パーセントを計算する場合に主題配列のＮ末端及びＣ末端の切断を考慮していないという事実を考慮するために、結果に対して手動の修正を行うことができる。クエリ配列と比較する、Ｎ末端及びＣ末端で切断された主題配列に関して、同一性パーセントは、対応する主題の残基とマッチ／アラインメントし得ない、主題配列のＮ末端及びＣ末端に対して横方向であり得るクエリ配列の残基の数を、クエリ配列の全塩基に対するパーセントとして計算することによって修正することができる。残基がマッチ／アラインメントされ得るかどうかの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定することができる。次いで、このパーセンテージを、同一性パーセントから引き算し、指定されたパラメータを使用してＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算し、最終的な同一性パーセントスコアに到達することができる。この最終的な同一性パーセントスコアを、この実施形態の目的のために使用することができる。いくつかの場合において、クエリ配列とマッチ／アラインメントし得ない、主題配列のＮ末端及びＣ末端に対する残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調節する目的のために考慮され得る。すなわち、主題配列の最も遠いＮ末端残基及びＣ末端残基の外側にあるクエリ残基位置のみが、この手動の修正のために考慮され得る。例えば、９０残基の主題配列を、１００残基のクエリ配列とアラインメントし、同一性パーセントを決定することができる。欠失は、主題配列のＮ末端で生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端における最初の１０個の残基のマッチング／アラインメントを示さない。この１０個の対形成していない残基は、配列の１０％（マッチしていないＮ末端及びＣ末端での残基の数／クエリ配列中の残基の総数）を表し、そのため、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから１０％を引き算することができる。残りの９０個の残基が完全にマッチした場合、最終的な同一性パーセントは、９０％であり得る。別の例において、９０残基の主題配列を、１００残基のクエリ配列と比較することができる。このとき、欠失は、内部欠失である可能性があり、そのため、クエリとマッチ／アラインメントし得ない残基は主題配列のＮ末端又はＣ末端に存在し得ない。この場合において、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントを、手動で修正することはできない。繰り返しになるが、クエリ配列とマッチ／アラインメントし得ない、主題配列のＮ末端及びＣ末端の外側にある残基位置のみを、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示されるように、手動で修正することができる。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、相互に置き換え可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてもよく、既知又は未知の任意の機能を発揮してもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子若しくは遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ若しくはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（ヘテロクロマチンＤＮＡを含むが、これらに限定されない）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、配列の単離されたＤＮＡ、配列の単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、ｓｎＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の小さなＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は小さなｒＤＮＡ由来のＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの組み立ての前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーション等により、重合後に更に修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子及び一本鎖分子の両方を指す。例えば、ホスホロチオエート骨格を有する核酸を含む核酸は、１つ以上の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介して、別の分子、例えば核酸又はポリペプチドと反応可能な任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合、非共有結合、又は他の相互作用を介して、タンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸と反応するアミノ酸反応性部分を含み得る。別途指定されない限り、又は必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本開示の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが既知であるか、又は予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
「ガイドＲＮＡ」という用語は、本開示のポリヌクレオチドを指すために、「操作されたポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」等の用語と相互に置き換え可能に使用することができる。
本開示の方法で有用なポリヌクレオチドは、天然核酸配列及びそのバリアント、人工核酸配列、又はこのような配列の組み合わせを含み得る。
ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びポリヌクレオチドがＲＮＡの場合にはチミンの代わりにウラシル（Ｕ）の４つのヌクレオチド塩基の特異的配列で構成される。本明細書に記載される任意の配列は、ＤＮＡであってもよく、配列がＲＮＡに転写される場合、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）で置き換えることができる。いくつかの場合において、本明細書に記載のＲＮＡ配列は、Ｕの代わりにＴを有するＤＮＡ配列として表すことができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の他のヌクレオチド塩基（例えば、イノシン（Ｉ））、ヒポキサンチンがβ－Ｎ９－グリコシド結合を介してリボフラノースに接続するときに形成されるヌクレオシドを含んでいてもよく、以下の化学構造が得られる。
Figure 2023523237000002
イノシンは、翻訳機構によってグアニン（Ｇ）と読まれる。
「ポリヌクレオチド配列」という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースに入力され、機能ゲノミクス及び相同性検索等のバイオインフォマティクス用途に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが、その後にペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質内で翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
「等価物」又は「生物学的等価物」という用語は、特定の分子、生物学的材料、又は細胞材料を指す場合に相互に置き換え可能に使用され、所望の構造又は機能性を依然として維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。
「液滴デジタルＰＣＲ」（ｄｄＰＣＲ）は、ＰＣＲ増幅を裏付ける別個の、体積的に定義された油中水滴分画に封入された核酸分子を計数することによる、絶対量を測定するデジタルＰＣＲアッセイを指す。単一のｄｄＰＣＲ反応は、ウェル当たり少なくとも２０，０００個の分画液滴を含有し得る。
「液滴」又は「油中水滴」は、液滴デジタルＰＣＲアッセイの個々の分画を指す。液滴は、リアルタイムＰＣＲ用途に広く使用されているものと同様の均質なアッセイ化学及びワークフローを使用して、テンプレート分子のＰＣＲ増幅を裏付ける。
液滴デジタルＰＣＲは、ＰＣＲ増幅を裏付ける別個の、体積的に定義された油中水滴分画に封入された核酸分子を計数することによる、絶対量を測定するデジタルＰＣＲアッセイを行う任意のプラットフォームを使用して行われてもよい。液滴デジタルＰＣＲの戦略は、以下のようにまとめられてもよい。試料を希釈し、各々が目的の核酸分子のコピーを１つ含有するか、又は含有しないように、数千～数百万の別個の反応チャンバ（油中水滴）に分画する。標的アンプリコン（例えば、目的の核酸分子）を含有する、検出された「陽性」液滴の数と、標的アンプリコン（例えば、目的の核酸分子）を含有しない、「陰性」液滴の数を使用して、元々の試料中にあった目的の核酸分子のコピーの数を決定してもよい。液滴デジタルＰＣＲシステムの例としては、核酸テンプレートを含有する試料を２０，０００個のナノリットルサイズの液滴に分画するＢｉｏ－Ｒａｄ製のＱＸ１００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、及び核酸テンプレートを含有する試料を１，０００，０００～１０，０００，０００個のピコリットルサイズの液滴に分画するＲａｉｎＤａｎｃｅ製のＲａｉｎＤｒｏｐ（商標）デジタルＰＣＲシステムが挙げられる。
本明細書で使用される「変異」という用語は、タンパク質のコンセンサス配列と比較して、上述のタンパク質をコードする核酸配列に対する変化を指す。「ミスセンス」変異は、１つのコドンを別のコドンに置換する。「ナンセンス」変異は、コドンを特定のアミノ酸をコードするものから停止コドンに変化させる。ナンセンス変異は、タンパク質の切断翻訳をもたらすことが多い。「サイレント」変異は、結果として生じるタンパク質に影響を及ぼさないものである。本明細書で使用される場合、「点変異」という用語は、遺伝子配列中の１つのヌクレオチドのみに影響を与える変異を指す。「スプライス部位変異」は、（イントロンを除去するための処理の前に）プレｍＲＮＡに存在する変異であって、スプライス部位の誤った描写からのタンパク質の誤訳を引き起こし、多くは切断を引き起こす、変異である。変異は、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を含み得る。変異は、配列バリアント、配列変動、配列変化、又は対立遺伝子変異を含み得る。参照ＤＮＡ配列は、参照データベースから得ることができる。変異は、機能に影響を及ぼすことがある。変異は、機能に影響を及ぼさないことがある。変異は、１つ以上のヌクレオチド中のＤＮＡレベル、１つ以上のヌクレオチド中のリボ核酸（ＲＮＡ）レベル、１つ以上のアミノ酸中のタンパク質レベル、又はこれらの任意の組み合わせで生じ得る。参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース等のデータベースから得ることができる。変異を構成することができる特定の変化としては、１つ以上のヌクレオチド又は１つ以上のアミノ酸における置換、欠失、挿入、反転、又は変換が挙げられ得る。変異は、点変異であり得る。変異は、融合遺伝子であり得る。融合対又は融合遺伝子は、変異、例えば、転座、中間部欠失、染色体反転、又はそれらの任意の組み合わせから生じ得る。変異は、三重化、四重化等の反復配列の数の変動を構成し得る。例えば、変異は、所与の配列と関連付けられたコピー数の増加又は減少（すなわち、コピー数変動、又はＣＮＶ）であり得る。変異は、異なる対立遺伝子における２つ以上の配列変化、又は１つの対立遺伝子における２つ以上の配列変化を含み得る。変異は、モザイク等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、キメラ等の１つの対立遺伝子の１つの位置に２つの異なるヌクレオチドを含み得る。変異は、悪性組織中に存在し得る。変異の存在又は不存在は、ある疾患又は状態を発症するリスクの増加を示し得る。変異の存在又は不存在は、ある疾患又は状態の存在を示し得る。変異は、良性組織中に存在し得る。変異の不存在は、組織又は試料が良性であることを示す場合がある。代替として、変異の不存在は、組織又は試料が良性であることを示さない場合がある。本明細書に記載の方法は、試料において変異の存在を特定することを含み得る。
ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写され、ＲＮＡの安定性及び調節機能にとって重要である配列を含有するプレｍＲＮＡ転写産物を合成する。コードＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の場合において、プレｍＲＮＡは、エクソンの選択的スプライシングを通じて、プレｍＲＮＡを成熟ｍＲＮＡに変換するために、ＲＮＡプロセシングに供される。成熟ｍＲＮＡはその後、リボソームによってタンパク質に翻訳される。ゲノムＤＮＡ中の変異が存在し、プレｍＲＮＡ転写産物中に変異が生じ、上述のタンパク質のタンパク質機能又は発現に影響を及ぼし得る。これらの変異は、スプライシング部位に存在する場合、影響を受けるエクソンの選択に影響を与えることによって、適切な選択的スプライシングを防止することができる。具体的には、プレｍＲＮＡスプライシング部位は、保存されたスプライスアクセプター及びスプライスドナー部位を含有する。スプライスドナー部位は、ヌクレオチドモチーフであるＮ／ＧＴを特徴とし、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、「／」は、エクソン－イントロン接合部を表す。スプライスアクセプター部位は、モチーフであるＮＡＧ／ＮＮを特徴とし、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、「／」は、エクソン－イントロン接合部を示す。イントロン及びエクソンの接合部にこのモチーフを除去又は導入する変異は、異常なｍＲＮＡスプライシングを引き起こし、不適切なタンパク質産生をもたらす可能性がある。
デアミナーゼを介した標的ＲＮＡの編集を容易にすることができるポリヌクレオチドエクソンスキッピング構築物を使用したｍＲＮＡの編集のための組成物及び方法が本明細書に開示される。
ＲＮＡスプライシングは、哺乳動物におけるＲＮＡプロセシングに参加するために多くのタンパク質を必要とする高度に調節されたプロセスである。ＲＮＡスプライシングは、エクソンの接続及び介在するエクソンの除去を介して、プレｍＲＮＡ転写産物が成熟ｍＲＮＡにスプライシングされるＲＮＡプロセシングの一形態である。次いで、成熟ｍＲＮＡは、リボソーム機構による翻訳に向けられる。プレｍＲＮＡ転写産物における異なる塩基配列は、適切なスプライシング及びその後のタンパク質及びそれらのアイソフォームの発現を容易にするために、エクソン及びイントロンの境界を画定する。しかしながら、ゲノムＤＮＡ中に存在する変異は、プレｍＲＮＡ転写産物中に存在する場合があり、プレｍＲＮＡから機能的タンパク質産物への適切なスプライシングを妨げる。これらの変異は、エクソンの誤った接合を引き起こし、非機能性タンパク質を生じさせ、潜在的に疾患を引き起こす可能性がある。代替的に、ゲノムＤＮＡ中に存在する変異は、プレｍＲＮＡの適切なスプライシングを保持し得るが、その代わりに、エクソンの誤った接合をもたらす介入によってレスキューされ得る。このような疾患の例としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、嚢胞性線維症、ベータサラセミア（β－グロビン）、ハーラー症候群、及びドラベ症候群が挙げられる。
リボ核酸（ＲＮＡ）は、細胞核中のゲノムＤＮＡから転写される。核から運び出された後、ＲＮＡは、リボソームによって翻訳され、生物学的プロセスを実行するための機能的タンパク質を産生する。真核生物系において、ＲＮＡは、最初にプレｍＲＮＡとして合成され、プレｍＲＮＡは、リボソームによる翻訳の準備ができた成熟ＲＮＡを産生するために、選択的スプライシング等のＲＮＡ処理を受ける。
選択的スプライシングは、成熟ＲＮＡを生成するためにプレｍＲＮＡが処理されるプロセスである。プレｍＲＮＡは、エクソン及びイントロン、並びに他の非翻訳領域（３’及び５’ＵＴＲ）で構成される。選択的スプライシングの間、プレｍＲＮＡのエクソン及びイントロンを区切るスプライシングシグナルは、スプライセオソームを複数のエクソンと一緒に接続して機能的タンパク質を形成し、それによって、介在するイントロンを除去することができる。
発現ベクター上の「スプライシングシグナル」の存在は、多くの場合、組換え転写産物のより高いレベルの発現をもたらす。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー及びアクセプター部位からなる。
最近の研究は、タンパク質コード転写産物のエクソンスキッピングを誘導するための方法を利用する可能性を強調している。多くの場合において、アルファ－シヌクレイン及びＤＭＤ等のいくつかのタンパク質は、異なるスプライスバリアントとして発現することができ、そのいくつかは、疾患に関与する可能性がある。エクソンスキッピング事象を促進することによって、ある疾患に関与する変異を含有するエクソンを迂回し、又はコドンリーディングフレームを回復させ、それによって、ある疾患若しくは障害を修正するか、又はある疾患若しくは障害の症状を緩和するのに十分なバリアントの翻訳を容易にすることができる。
ガイドＲＮＡは、ヒト又はマウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーターを使用して発現させることができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターは、Ｕ６と同様に、典型的には、短い「ハウスキーピング」ＲＮＡを転写する。Ｕ６プロモーターを使用して、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼのための単一ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡ干渉のための短いヘアピンＲＮＡを発現させることもできる。
ＳｎＲＮＡプロモーター（Ｕ６以外）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターである。ｍＲＮＡ発現に使用されるものと同様に、ｓｎＲＮＡ転写産物は、ｍＲＮＡとは異なって処理され得る（ポリアデニル化なし、異なる５’キャッピング）。ポリメラーゼを、インテグレーター複合体を会合させることができる。いくつかの場合において、プロモーター及び３’ターミネーターの両方の配列エレメントを認識する必要があるだろう。
ＳｍＯＰＴ配列は、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ、又はウラシルの代わりにチミンを用いて表される場合にはＡＡＴＴＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号４１）として表すことができる。Ｕ７ ｓｎＲＮＡの特定のヌクレオチド（ヒストンプレｍＲＮＡのスペーサー要素と天然でハイブリダイズする）は、アンチセンス配列（例えば、ベータ－グロビンプレｍＲＮＡ）で置き換えられている。
内因性Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、細胞当たりおよそ２～１５×１０３個の分子の低レベルで発現され得る。しかしながら、Ｕ７ ｓｎＲＮＡの発現レベル及び核濃度は、野生型Ｕ７ Ｓｍ結合部位（ＡＡＵＵＵＧＵＣＵＡＧ）を、本明細書に記載の主要なスプライセオソームｓｎＲＮＰ（ＳｍＯＰＴ、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧＡＧ）に由来するコンセンサスＳｍ結合配列に変換することによって、顕著に増加させることができる。更に、本明細書に記載のＵ７ ｓｎＲＮＡのこのＳｍＯＰＴ修飾によって、ヒストンプレｍＲＮＡ処理を低減することができる。このことには、以下の潜在的に２つの有益な効果がある。（ｉ）標的ＲＮＡが、ヒストン３’末端処理機構によって切断されなくてもよく、（ｉｉ）ＲＮＡが、Ｕ７特異的タンパク質を潜在的に制限するために、内因性Ｕ７ ｓｎＲＮＰと競合しなくてもよい。最後に、本明細書に記載のＳｍＯＰＴ修飾を有するガイドＲＮＡは、プレｍＲＮＡスプライシングの部位にリダイレクトされ得る。
いくつかの場合において、Ｕ１プロモーター下で、修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡ構築物を使用してもよい（すなわち、Ｕ１プロモーター及びターミネーター配列の制御下での修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡ遺伝子を有するハイブリッド）。
修飾されたＳｍＯＰＴ Ｕ７ ｓｎＲＮＡシャーシを、他の遺伝子のアンチセンス配列とともに使用して、本明細書に記載される他の疾患のためにＲＮＡスプライシングを修飾してもよい。例えば、エクソンスキッピングのためのＵ７アンチセンスオリゴ構築物は、ｈｎＲＮＰ Ａ１のための結合部位を含み得る。ｈｎＲＮＰ Ａ１がスプライス部位に動員されると、スプライシング機構をブロックし、エクソンスキッピングを促進することができる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）等のいくつかの疾患において、タンパク質のエクソンは、発現したときに疾患を引き起こす変異を保有し得る。疾患を引き起こす変異を有するエクソンを含めることは、治療的介入のために検討されてきた。エクソンスキッピングは、選択的スプライシング事象の間に、変異したエクソンが選択されることを防止する方法として探究されてきた。フレーム内のエクソン７１及び７４は、それぞれ、ベッカー型及びデュシェンヌ型の変異を含有し得る。
エクソンをスキッピングする能力は、疾患を引き起こすエクソンの使用を防止するための魅力的な解決策であることが証明されている。エクソンスキッピングを使用する以前の試みは、治療目的のためにエクソン排除又はエクソン包含を容易にするために、スプライシングシグナルをマスキングする試薬を利用している。
ＲＮＡ編集のための操作されたポリヌクレオチド構築物
天然に存在するデアミナーゼ酵素によるプレｍＲＮＡの編集を媒介することができる、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドを使用してｍＲＮＡを編集するための組成物及び方法が、本明細書に開示される。いくつかの場合において、そのような操作されたポリヌクレオチドを使用して、選択的スプライシング中のエクソンの使用に影響を及ぼすことができる。本開示は、いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集を容易にするために使用することができる操作されたポリヌクレオチドを記載する。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集は、エクソンスキッピングを媒介することができる。
ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドは、環状であってもよく、又は細胞中で環状であるように構成されてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、線形である。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドが二次元で表される場合、操作されたポリヌクレオチドは、線形又は環状である。操作されたポリヌクレオチドは、操作されたガイドＲＮＡをコードする。操作されたガイドＲＮＡは、標的化配列（又は「標的化領域」又は「標的化ドメイン」）及び動員ドメイン（又は「動員領域」）を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたガイドＲＮＡは、ちょうど標的化配列である。
核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）
本開示の組成物及び方法は、核内低分子リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）配列の一部分に作動可能に連結される、ガイドＲＮＡをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。操作されたポリヌクレオチドは、核内低分子リボ核酸（ｓｎＲＮＡ）配列の少なくとも一部分を含み得る。Ｕ７及びＵ１核内低分子ＲＮＡは、その天然の役割がプレｍＲＮＡのスプライセオソーム処理における役割であり、数十年にわたって、所望の疾患標的でのスプライシングを変更するように再操作されてきた。（ヒストンプレｍＲＮＡのスペーサー要素に天然でハイブリダイズする）Ｕ７ ｓｎＲＮＡの最初の１８ｎｔを、疾患遺伝子の短い標的化（又はアンチセンス）配列と置き換えることで、スプライシング機構をリダイレクトして、その標的部位の周囲のスプライシングを変化させる。更に、野生型Ｕ７ Ｓｍドメイン結合部位を、最適化されたコンセンサスＳｍ結合配列（ＳｍＯＰＴ）に変換することで、人工のアンチセンス操作されたＵ７ ｓｎＲＮＡの発現レベル、活性、及び細胞内局在化を増加させることができる。多くのその後の群は、他の遺伝子のアンチセンス配列を有するこの修飾されたＵ７ ＳｍＯＰＴ ｓｎＲＮＡシャーシに適合され、スプライセオソーム要素を動員し、追加の疾患標的のためのＲＮＡスプライシングを修飾する。
ｓｎＲＮＡは、真核生物の核内に見られる小さなＲＮＡ分子の一種である。これらは、ＲＮＡスプライシング（プレｍＲＮＡからのイントロンの除去）、転写因子（７ＳＫ ＲＮＡ）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｂ２ ＲＮＡ）の調節、及びテロメアの維持等の様々な重要なプロセスに関与する。それらは常に特定のタンパク質と会合し、得られるＲＮＡ－タンパク質複合体は、核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）、又は時にスナープと称される。Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、及びＵ１０と呼ばれる多くのｓｎＲＮＡが存在する。
Ｕ７型のｓｎＲＮＡは、通常、ヒストンｍＲＮＡの成熟に関与する。このｓｎＲＮＡは、多数の真核生物種で特定されており（これまでに５６種）、これらの種の各々のＵ７ ｓｎＲＮＡは、本発明にとって同様に好都合であるとみなされるべきである。
野生型Ｕ７ ｓｎＲＮＡは、ステムループ構造と、Ｕ７特異的Ｓｍ配列と、ヒストンプレｍＲＮＡの３’末端に対する配列アンチセンスと、を含む。
Ｕ７は、ＳｍＯＰＴドメインに加えて、ヒストンプレｍＲＮＡの３’末端に対する配列アンチセンスを含む。この配列が、別の標的プレｍＲＮＡに対してアンチセンスである標的化配列によって置き換えられる場合、Ｕ７は、新しい標的プレｍＲＮＡにリダイレクトされる。したがって、ＳｍＯＰＴドメインと標的化アンチセンス配列とを含有する修飾されたＵ７ ｓｎＲＮＡの安定な発現は、ｍＲＮＡスプライシングの特異的な変更を引き起こした。その天然のプロモーター及び３’要素とともに、適切に修飾されたマウスＵ７遺伝子を発現するＡＡＶ－２／１系ベクターは、マウスＤｍｄエクソン２３を覆い、スキッピングすることによって、骨格筋への高効率の遺伝子移行及び完全なジストロフィンレスキューを可能にしているが、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは（直接的に投与されるか、又は例えばＡＡＶベクターを介して投与されるかにかかわらず）、デアミナーゼによる標的ＲＮＡの編集を容易にすることができる。
操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも部分的にｓｎＲＮＡ配列を含み得る。ｓｎＲＮＡ配列は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ９、又はＵ１０ ｓｎＲＮＡ配列であり得る。
いくつかの場合において、ｓｎＲＮＡ配列の少なくとも一部分（例えば、ｓｎＲＮＡプロモーター、ｓｎＲＮＡヘアピン等）を含む操作されたポリヌクレオチドは、このような特徴を欠く同等のポリヌクレオチドと比較して、ある疾患又は状態を治療又は予防する優れた特性を有することができる。例えば、本明細書に記載されるように、ｓｎＲＮＡ配列の少なくとも一部分を含む操作されたポリヌクレオチドは、このような特徴を欠く同等のポリヌクレオチドと比較して、より高い効率でエクソンのエクソンスキッピングを容易にすることができる。更に、本明細書に記載されるように、ｓｎＲＮＡ配列の少なくとも一部分を含む操作されたポリヌクレオチドは、このような特徴を欠く同等のポリヌクレオチドと比較して、より高い効率で標的ＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡ又は成熟ＲＮＡ）におけるヌクレオチドの塩基の編集を容易にすることができる。
ｓｎＲＮＡプロモーター
本開示の組成物及び方法は、ｓｎＲＮＡプロモーターも含み得る、ガイドＲＮＡをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドの転写を促進することができる。プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。例えば、プロモーターは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列の５’末端又は３’末端に連結され得る。
プロモーターは、転写を開始する前にＲＮＡポリメラーゼが結合する、関連するコード配列に対して通常は上流（５’）の非コードゲノムＤＮＡ配列である。この結合は、特定の転写開始部位で転写が開始するように、ＲＮＡポリメラーゼをアラインメントする。プロモーターは、別の核酸断片の転写を制御することができる核酸断片を含む。プロモーターは、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができる。機能的ＲＮＡとしては、限定されないが、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。特定のプロモーターは、他のプロモーターよりも高い速度で、ＲＮＡ合成を指示することができることが示されている。これらは、「強いプロモーター」と呼ばれている。特定の他のプロモーターは、特定の種類の細胞又は組織のみで、より高いレベルでＲＮＡ合成を指示することが示されており、プロモーターが、好ましくは特定の組織においてＲＮＡ合成を指示するが、他の組織において低いレベルで指示する場合には、「組織特異的プロモーター」又は「組織の好ましいプロモーター」と称されることが多い。生物に導入されたキメラ遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現のパターンが、プロモーターを使用して制御されるため、特定の組織型又は特定の発達段階において特定のレベルでキメラ遺伝子又は（複数の遺伝子）の発現を制御することができる新規なプロモーターの単離に継続的な関心がある。
特定のプロモーターは、全ての組織にわたって比較的類似したレベルでＲＮＡ合成を指示することができる。これらは、「構成的プロモーター」又は「組織非依存的」プロモーターと呼ばれる。構成的プロモーターは、それらの有効性に応じて、強いプロモーター、中程度のプロモーター、及び弱いプロモーターに分割されて、直接的なＲＮＡ合成を行うことができる。多くの場合、キメラ遺伝子（又は複数の遺伝子）の所望の機能を得るために、キメラ遺伝子（又は複数の遺伝子）を異なる組織中で同時に発現させる必要があるため、構成的プロモーターは、この考察において特に有用である。
プロモーター配列は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、及びＵ７プロモーター配列からなる群から選択されるプロモーター配列に対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。プロモーター配列は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、又はＵ７プロモーター配列であり得る。
ｓｎＲＮＡヘアピン及び追加の二次構造
本開示の組成物及び方法は、ヘアピン又は他の二次構造を含み得る、ガイドＲＮＡをコードする操作されたポリヌクレオチドを提供する。ＲＮＡ中に存在するヘアピン及び他の二次構造は、ＲＮＡ分子の安定性を増加させることができる。
本明細書に開示されるように、ヘアピンは、単一のＲＮＡ鎖がそれ自体で折り畳まれてＲＮＡ二本鎖を形成する、ＲＮＡ二本鎖である。一本鎖ＲＮＡ鎖は、互いに対して折り畳み領域塩基対の上流及び下流にヌクレオチド配列を有することに起因して、それ自体で折り畳まれる。ヘアピンは、二本鎖構造全体が１０～５００ヌクレオチド長を有し得る。ヘアピンのステムループ構造は、３～１５ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡのいずれかに存在し得る。本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、１～１０個のヘアピンを有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、１個のヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたガイドＲＮＡは、２個のヘアピンを有する。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピン又はヘアピン又は非動員ヘアピンを指し得る。ヘアピンは、本開示の操作されたガイドＲＮＡ内の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘアピンは、本開示の操作されたガイドＲＮＡの３’末端に、本開示の操作されたガイドＲＮＡの５’末端に、又は本開示の操作されたガイドＲＮＡの標的化配列内に、又はこれらの任意の組み合わせに存在する。
動員ヘアピンは、本明細書に開示されるように、ＡＤＡＲ等のＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメイン又はそのバリアントである。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメイン又はそのバリアントである。
非動員ヘアピンは、本明細書に開示されるように、標的ＲＮＡに対する操作されたガイドＲＮＡの局在化を改善する機能性を示し得る。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、核保持性を改善する。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピンを含む。
ヘアピン及び他のＲＮＡ二次構造は、ＲＮＡ塩基の分子内相互作用によって形成され、ワトソン－クリック塩基対形成によって塩基対形成を形成する。
「ヘアピンループ」という用語は、それ自体が戻ってループ形成し、ドメインの相補的結合によって閉じられる一本鎖領域を指す。
ヘアピンは、スプライセオソームｓｎＲＮＡ、非スプライセオソームｓｎＲＮＡ配列、又はこれらの任意の組み合わせに由来する配列を含み得る。ヘアピンは、スプライセオソーム又は非スプライセオソームｓｎＲＮＡ配列に対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
スプライセオソーム又は非スプライセオソームｓｎＲＮＡ配列は、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも一部分を含み得る。ｓｎＲＮＡは、配列番号３４～配列番号３９のプロモーター配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピン二次構造を形成する配列を含み得る。いくつかの場合において、配列は、Ｕ７ヘアピンの配列に対して少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
他の二次構造は、操作されたポリヌクレオチドに付加され得る。付加される二次構造は、限定されないが、ｈｎＲＮＰＡ１及びその変異態様、ＳＩＲＬＯＩＮ核タグ、ＭＡＬＡＴ１ ＭＧ断片、及び追加の不活性二次構造を含むＣａｓ９ ｇＲＮＡであり得る。
標的化配列
本開示のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドは、目的の領域に対して上述の構築物を向かわせる標的化配列を含む。標的化配列は、目的の配列に対して少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチドの配列を含んでいてもよく、それによって、標的配列に対してハイブリダイズする手段を提供する。
ポリヌクレオチド、及びそれを含む組成物が本明細書で提供される。ある態様において、ポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集のために、例えば、疾患又は状態を予防又は治療するために利用され得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドを、主題のＲＮＡ編集エンティティと会合した状態で使用して、標的ＲＮＡを編集するか、又は標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を調節することができる。ある実施形態において、本明細書に開示される組成物は、ＡＤＡＲ若しくはＡＤＡＴポリペプチド等の主題のＲＮＡ編集エンティティ、又はそれらの生物学的に活性な断片によって、編集を容易にすることができる操作されたポリヌクレオチドを含み得る。
操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ標的化に好適な任意の方法で操作され得る。ある態様において、操作されたポリヌクレオチドは、一般に、標的ＲＮＡの領域に対してハイブリダイズすることが可能な標的化配列を少なくとも含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的化ドメイン又は標的化領域とも称され得る。
ある態様において、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列は、操作されたポリヌクレオチドに、ワトソンークリック塩基対形成等の塩基対形成によってＲＮＡ配列を標的とすることを可能にする。ある実施形態において、標的化配列は、操作されたポリヌクレオチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに位置し得る。いくつかの場合において、標的化配列は、両端に位置する。標的化配列は、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、標的化配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、又は最大約２００ヌクレオチド長である。ある実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、約２５～２００、５０～１５０、７５～１００、８０～１１０、９０～１２０、又は９５～１１５ヌクレオチド長である標的化配列を含む。ある実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、約１００ヌクレオチド長である標的化配列を含む。
いくつかの場合において、主題の標的化配列は、主題のポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域に対して少なくとも部分的な配列相補性を含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡに対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列相補性を含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％未満の相補性を含む。例えば、標的化配列、及び標的化配列によって結合され得る標的ＲＮＡの領域は、単一塩基ミスマッチを有し得る。他の場合において、主題の操作されたポリヌクレオチドの標的化配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、３０、４０、又は最大約５０塩基ミスマッチを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチドミスマッチは、本明細書で提供される構造的特徴と関連し得る。いくつかの態様において、標的化配列は、主題の標的ＲＮＡの野生型ＲＮＡと相補性が異なる少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は最大約１５ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する少なくとも５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～３００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、又は３００ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０より多いヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する少なくとも５０のヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２００ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的化配列は、合計で５０～４００ヌクレオチドを含み、標的ＲＮＡ配列に対して相補性を有する５０～３００ヌクレオチドを有する。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する少なくとも５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～１５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～２００ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～２５０ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対して相補性を有する５０～３００ヌクレオチドは、１つ以上のミスマッチ、１つ以上のバルジ、又は１つ以上のループ、又はこれらの任意の組み合わせによって分離される。例えば、標的化配列は、合計で５４ヌクレオチドを含み、連続して、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的であり、４ヌクレオチドがバルジを形成し、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的である。別の例として、標的化配列は、合計で１１８ヌクレオチドを含み、連続して、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的であり、４ヌクレオチドがバルジを形成し、２５ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的であり、１４ヌクレオチドがループを形成し、５０ヌクレオチドが、標的ＲＮＡに対して相補的である。
いくつかの場合において、標的ＲＮＡに結合した本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ＡＤＡＲを動員し、それ自体がＡＤＡＲのための基質である二本鎖ＲＮＡを形成する。
いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、複数の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド中の１つ以上の標的配列ドメインは、標的ＲＮＡの１つ以上の領域に結合し得る。例えば、第１の標的化配列は、標的ＲＮＡの第１の領域（例えば、プレｍＲＮＡの第１のエクソン）に対して少なくとも部分的に相補的であるように構成されていてもよく、一方で、第２の標的化配列は、標的ＲＮＡの第２の領域（例えば、プレｍＲＮＡの第２のエクソン）に対して少なくとも部分的に相補的であるように構成されていてもよい。いくつかの場合において、複数の標的領域を操作可能に連結して、標的ＲＮＡの複数の領域の連続ハイブリダイゼーションを提供することができる。いくつかの場合において、複数の標的領域は、標的ＲＮＡの複数の領域の非連続ハイブリダイゼーションを提供することができる。「非連続」オーバーラップ又はハイブリダイゼーションは、第２の標的化配列による標的ＲＮＡの第２の領域のハイブリダイゼーションとともに、第１の標的化配列による標的ＲＮＡの第１の領域のハイブリダイゼーションであって、標的ＲＮＡの第１の領域及び第２の領域が非連続である（例えば、標的ＲＮＡの第１の領域と第２の領域との間に介在配列が存在する）ものを指すことができる。例えば、標的化配列は、第１のエクソンの一部分に結合するように構成されてもよく、第２のエクソンの一部分に結合するように構成される第２の標的化配列を含んでいてもよく、一方で、エクソン１の一部分とエクソン２の一部分との間の介在配列が、標的化配列又はオリゴテザーのいずれかによってハイブリダイズされない。非連続ハイブリダイゼーションのために構成される本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドの使用は、多くの利点を提供することができる。例えば、このようなガイドは、転写中（又はその後すぐに）プレｍＲＮＡを潜在的に標的とすることができ、次いでデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ）を共転写的に使用する化学修飾を容易にし、したがって、化学修飾の全体的な効率を増加させることができる。更に、介在配列をスキッピングしつつ、非連続ハイブリダイゼーションを有するポリヌクレオチドを使用して、オフターゲット編集がより少ない、より短く、より特異的なガイドＲＮＡを得ることができる。
いくつかの場合において、標的ＲＮＡに対する非連続ハイブリダイゼーションのために構成された操作されたポリヌクレオチドは、介在配列によって分離された別個の領域又は標的ＲＮＡに結合するように構成され得る。いくつかの場合では、介在配列は、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、又は１００００塩基であり得る。いくつかの場合において、標的化配列は、同じイントロン又はエクソンの別個の非連続領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、標的化配列は、隣接するエクソン又はイントロンの別個の非連続領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、標的化配列は、遠位のエクソン又はイントロンの別個の非連続領域を標的とすることができる。
動員領域
ある態様において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。ＲＮＡ編集エンティティは、操作されたポリヌクレオチド上のＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインによって動員され得る。いくつかの場合において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、主題の標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、主題の標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの調節発現、又はその両方を容易にするように構成される。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、主題のＲＮＡ編集エンティティによるＲＮＡの領域のヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集を容易にするために、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。特定の実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを欠いている。いずれにせよ、主題の操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティに結合するか、又はＲＮＡ編集エンティティによって結合されることが可能であり、主題の標的ＲＮＡの編集を容易にする。
いくつかの例において、主題の標的化配列は、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを含む。ＲＮＡ編集エンティティは、操作されたポリヌクレオチド上のＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインによって動員され得る。いくつかの例において、主題の操作されたポリヌクレオチドは、主題の標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、主題の標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの調節発現、又はその両方を容易にするように構成される。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、主題のＲＮＡ編集エンティティによるＲＮＡの領域のヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成され得る。編集を容易にするために、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。
様々なＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインを利用することができる。いくつかの例において、動員ドメインは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）、ＡＰＯＢＥＣ、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメイン、Ａｌｕ、ＴＡＬＥＮ動員ドメイン、Ｚｎ－フィンガーポリペプチド動員ドメイン、メガ－ＴＡＬ動員ドメイン、又はＣａｓ１３動員ドメイン、これらの組み合わせ、又はこれらの修飾された態様を含む。いくつかの例において、１つより多い動員ドメインが、本開示の操作されたポリヌクレオチド中に含まれ得る。動員配列が存在する例において、動員配列を利用して、標的化配列（例えば、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である標的化配列の一部分）の後の主題の標的ＲＮＡと効果的に反応させるようにＲＮＡ編集エンティティを配置し、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができる。いくつかの場合において、動員配列は、操作されたポリヌクレオチドに対するＲＮＡ編集エンティティの一過性の結合を可能にし得る。いくつかの例において、動員配列は、操作されたポリヌクレオチドに対するＲＮＡ編集エンティティの永続的結合を可能にする。動員配列は、任意の長さのものであり得る。いくつかの場合において、動員配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、最大約８０ヌクレオチド長である。いくつかの場合において、動員配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、又は８０ヌクレオチド長以下である。いくつかの場合において、動員配列は、約４５ヌクレオチド長である。いくつかの場合において、動員配列の少なくとも一部分は、少なくとも１～約７５ヌクレオチドを含む。いくつかの場合において、動員配列の少なくとも一部分は、約４５ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドを含む。
ある実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列、そのバリアント、又は機能的断片を含む。いくつかの場合において、ＧｌｕＲ２配列は、ＲＮＡ編集エンティティ、例えば、ＡＤＡＲ又はその生物学的に活性な断片によって認識することができる。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの場合において、ＧｌｕＲ２配列は、例えば、増強された動員のために修飾され得る。いくつかの実施形態において、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在するＧｌｕＲ２配列及び合成配列の一部分を含み得る。
いくつかの例において、動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列、又はＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号４９）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。いくつかの例において、動員ドメインは、配列番号４９の少なくとも約１０、１５、２０、２５、又は３０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、動員ドメインは、配列番号４９に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相同性を含み得る。
いくつかの例において、動員ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連動員ドメイン配列を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連動員配列は、Ｃａｓタンパク質配列を含み得る。いくつかの場合において、Ｃａｓ１３動員ドメインは、Ｃａｓ１３ａ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメイン、Ｃａｓ１３ｃ動員ドメイン、又はＣａｓ１３ｄ動員ドメインを含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインの少なくとも約２０核酸に対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインは、Ｃａｓ１３ｂ動員ドメインの少なくとも約１５、２０、２５、３０、又は３５核酸に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列に対して少なくとも約８０％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列に対して少なくとも約８５％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列に対して少なくとも約９０％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、ＲＮＡ編集エンティティ動員ドメインの少なくとも一部分は、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列に対して少なくとも約９５％の配列相同性を含み得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列は、天然に存在しない配列であり得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列は、修飾された部分を含み得る。いくつかの例において、Ｃａｓ１３ｂドメインコード配列は、天然に存在するＣａｓ１３ｂドメインコード配列の一部分を含み得る。
任意の数の動員配列は、本開示の操作されたポリヌクレオチド中に見出され得る。いくつかの例において、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大約１０の動員配列が、操作されたポリヌクレオチド中に含まれる。動員配列は、主題のポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得る。いくつかの場合において、動員配列は、ポリヌクレオチドのＮ末端、中央、又はＣ末端上にある。動員配列は、標的化配列の上流又は下流であり得る。いくつかの場合において、動員配列は、主題のポリヌクレオチドの標的化配列に隣接する。動員配列は、全てのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含み得るが、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドを両方とも含む動員配列は、除外されない。
いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、動員領域を欠いており、ＲＮＡ編集エンティティの動員は、操作されたポリヌクレオチド及び標的ＲＮＡによって形成される二本鎖基質によって実現される。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡ分子に結合していないときに、ＲＮＡ編集エンティティを動員しない。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡ分子に結合していないときに、ＲＮＡ編集エンティティに結合する場合、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、約５００ｎＭ以上の解離定数で結合する。いくつかの例において、解離定数は、約２２ｎＭである。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡ分子に結合していないときに、構造的特徴を欠いている。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡ分子に結合していないときに、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを欠いている。いくつかの例において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡ分子に結合していないときに、線形であり、任意の構造的特徴を含まない。
動員配列が存在しない場合、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの編集を容易にし、及び／又は主題の標的ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を調節するために、主題のＲＮＡ編集エンティティ（例えば、ＡＤＡＲ）と依然として会合することが可能である。このことは、構造的特徴によって達成され得る。構造的特徴は、ミスマッチ、対称バルジ、非対称バルジ、対称内部ループ、非対称内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、構造化モチーフ、環状化ＲＮＡ、化学修飾、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含み得る。ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質、例えば、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド鎖は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成し得る。本開示のｄｓＲＮＡ基質中に存在し得るいくつかの構造的特徴の１つに対応する特徴が本明細書に記載される。特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ（対称バルジ若しくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループ若しくは非対称内部ループ）、又はヘアピン（動員ヘアピン若しくは非標的化ドメインを含むヘアピン）が挙げられる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５０個の特徴を有し得る。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、又は８～１０個の特徴を有し得る。
本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質中に２つ以上の特徴を含む。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書で開示されるように、ミスマッチは、ｄｓＲＮＡ内の標的ＲＮＡ中の対向するヌクレオチドに対して対形成していないガイドＲＮＡ中のヌクレオチドを指す。ミスマッチは、塩基対を形成しないか、相補的ではないか、又は両方である任意の２つのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチである。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＡと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＣを含み得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＣと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＡを含み得る。ある実施形態において、Ｇ／Ｇミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＧと対向する本開示の操作されたガイドＲＮＡ中にＧを含み得る。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるミスマッチは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを容易にし得る。ミスマッチは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。ある実施形態において、ミスマッチは、Ｇ／Ｇミスマッチを含む。ある実施形態において、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、Ａは標的ＲＮＡ中にあり、Ｃは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列中にある。別の実施形態において、Ａ／Ｃミスマッチ中のＡは、主題のＲＮＡ編集エンティティによって編集される標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基である。
本明細書に記載されるミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端に対して近位の距離に位置し得る。いくつかの場合において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端に対して、約１塩基～約２００塩基、約２塩基～約２００塩基、約３塩基～約２００塩基、約４塩基～約２００塩基、約５塩基～約２００塩基、約６塩基～約２００塩基、約７塩基～約２００塩基、約８塩基～約２００塩基、約９塩基～約２００塩基、約１０塩基～約２００塩基、約１１塩基～約２００塩基、約１２塩基～約２００塩基、約１３塩基～約２００塩基、約１４塩基～約２００塩基、約１５塩基～約２００塩基、約１６塩基～約２００塩基、約１７塩基～約２００塩基、約１８塩基～約２００塩基、約１９塩基～約２００塩基、約２０塩基～約２００塩基、約２１塩基～約２００塩基、約２２塩基～約２００塩基、約２３塩基～約２００塩基、約２４塩基～約２００塩基、約２５塩基～約２００塩基、約２６塩基～約２００塩基、約２７塩基～約２００塩基、約２８塩基～約２００塩基、約２９塩基～約２００塩基、約３０塩基～約２００塩基、約３１塩基～約２００塩基、約３２塩基～約２００塩基、約３３塩基～約２００塩基、約３４塩基～約２００塩基、約３５塩基～約２００塩基、約３６塩基～約２００塩基、約３７塩基～約２００塩基、約３８塩基～約２００塩基、約３９塩基～約２００塩基、約４０塩基～約２００塩基、約４１塩基～約２００塩基、約４２塩基～約２００塩基、約４３塩基～約２００塩基、約４４塩基～約２００塩基、約４５塩基～約２００塩基、約４６塩基～約２００塩基、約４７塩基～約２００塩基、約４８塩基～約２００塩基、約４９塩基～約２００塩基、約５０塩基～約２００塩基、約５１塩基～約２００塩基、約５２塩基～約２００塩基、約５３塩基～約２００塩基、約５４塩基～約２００塩基、約５５塩基～約２００塩基、約５６塩基～約２００塩基、約５７塩基～約２００塩基、約５８塩基～約２００塩基、約５９塩基～約２００塩基、約６０塩基～約２００塩基、約６１塩基～約２００塩基、約６２塩基～約２００塩基、約６３塩基～約２００塩基、約６４塩基～約２００塩基、約６５塩基～約２００塩基、約６６塩基～約２００塩基、約６７塩基～約２００塩基、約６８塩基～約２００塩基、約６９塩基～約２００塩基、約７０塩基～約２００塩基、約７１塩基～約２００塩基、約７２塩基～約２００塩基、約７３塩基～約２００塩基、約７４塩基～約２００塩基、約７５塩基～約２００塩基、約７６塩基～約２００塩基、約７７塩基～約２００塩基、約７８塩基～約２００塩基、約７９塩基～約２００塩基、約８０塩基～約２００塩基、約８１塩基～約２００塩基、約８２塩基～約２００塩基、約８３塩基～約２００塩基、約８４塩基～約２００塩基、約８５塩基～約２００塩基、約８６塩基～約２００塩基、約８７塩基～約２００塩基、約８８塩基～約２００塩基、約８９塩基～約２００塩基、約９０塩基～約２００塩基、約９１塩基～約２００塩基、約９２塩基～約２００塩基、約９３塩基～約２００塩基、約９４塩基～約２００塩基、約９５塩基～約２００塩基、約９６塩基～約２００塩基、約９７塩基～約２００塩基、約９８塩基～約２００塩基、約９９塩基～約２００塩基、約１００塩基～約２００塩基、約１０１塩基～約２００塩基、約１０２塩基～約２００塩基、約１０３塩基～約２００塩基、約１０４塩基～約２００塩基、約１０５塩基～約２００塩基、約１０６塩基～約２００塩基、約１０７塩基～約２００塩基、約１０８塩基～約２００塩基、約１０９塩基～約２００塩基、約１１０塩基～約２００塩基、約１１１塩基～約２００塩基、約１１２塩基～約２００塩基、約１１３塩基～約２００塩基、約１１４塩基～約２００塩基、約１１５塩基～約２００塩基、約１１６塩基～約２００塩基、約１１７塩基～約２００塩基、約１１８塩基～約２００塩基、約１１９塩基～約２００塩基、約１２０塩基～約２００塩基、約１２１塩基～約２００塩基、約１２２塩基～約２００塩基、約１２３塩基～約２００塩基、約１２４塩基～約２００塩基、約１２５塩基～約２００塩基、約１２６塩基～約２００塩基、約１２７塩基～約２００塩基、約１２８塩基～約２００塩基、約１２９塩基～約２００塩基、約１３０塩基～約２００塩基、約１３１塩基～約２００塩基、約１３２塩基～約２００塩基、約１３３塩基～約２００塩基、約１３４塩基～約２００塩基、約１３５塩基～約２００塩基、約１３６塩基～約２００塩基、約１３７塩基～約２００塩基、約１３８塩基～約２００塩基、約１３９塩基～約２００塩基、約１４０塩基～約２００塩基、約１４１塩基～約２００塩基、約１４２塩基～約２００塩基、約１４３塩基～約２００塩基、約１４４塩基～約２００塩基、約１４５塩基～約２００塩基、約１４６塩基～約２００塩基、約１４７塩基～約２００塩基、約１４８塩基～約２００塩基、約１４９塩基～約２００塩基、約１５０塩基～約２００塩基、約１５１塩基～約２００塩基、約１５２塩基～約２００塩基、約１５３塩基～約２００塩基、約１５４塩基～約２００塩基、約１５５塩基～約２００塩基、約１５６塩基～約２００塩基、約１５７塩基～約２００塩基、約１５８塩基～約２００塩基、約１５９塩基～約２００塩基、約１６０塩基～約２００塩基、約１６１塩基～約２００塩基、約１６２塩基～約２００塩基、約１６３塩基～約２００塩基、約１６４塩基～約２００塩基、約１６５塩基～約２００塩基、約１６６塩基～約２００塩基、約１６７塩基～約２００塩基、約１６８塩基～約２００塩基、約１６９塩基～約２００塩基、約１７０塩基～約２００塩基、約１７１塩基～約２００塩基、約１７２塩基～約２００塩基、約１７３塩基～約２００塩基、約１７４塩基～約２００塩基、約１７５塩基～約２００塩基、約１７６塩基～約２００塩基、約１７７塩基～約２００塩基、約１７８塩基～約２００塩基、約１７９塩基～約２００塩基、約１８０塩基～約２００塩基、約１８１塩基～約２００塩基、約１８２塩基～約２００塩基、約１８３塩基～約２００塩基、約１８４塩基～約２００塩基、約１８５塩基～約２００塩基、約１８６塩基～約２００塩基、約１８７塩基～約２００塩基、約１８８塩基～約２００塩基、約１８９塩基～約２００塩基、約１９０塩基～約２００塩基、約１９１塩基～約２００塩基、約１９２塩基～約２００塩基、約１９３塩基～約２００塩基、約１９４塩基～約２００塩基、約１９５塩基～約２００塩基、約１９６塩基～約２００塩基、約１９７塩基～約２００塩基、約１９８塩基～約２００塩基、又は約１９９塩基～約２００塩基の距離に位置し得る。いくつかの場合において、ミスマッチは、標的化配列のいずれかの末端から少なくとも１塩基、少なくとも２塩基、少なくとも３塩基、少なくとも４塩基、少なくとも５塩基、少なくとも６塩基、少なくとも７塩基、少なくとも８塩基、少なくとも９塩基、少なくとも１０塩基、少なくとも１１塩基、少なくとも１２塩基、少なくとも１３塩基、少なくとも１４塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも１６塩基、少なくとも１７塩基、少なくとも１８塩基、少なくとも１９塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも２１塩基、少なくとも２２塩基、少なくとも２３塩基、少なくとも２４塩基、少なくとも２５塩基、少なくとも２６塩基、少なくとも２７塩基、少なくとも２８塩基、少なくとも２９塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも３１塩基、少なくとも３２塩基、少なくとも３３塩基、少なくとも３４塩基、少なくとも３５塩基、少なくとも３６塩基、少なくとも３７塩基、少なくとも３８塩基、少なくとも３９塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも４１塩基、少なくとも４２塩基、少なくとも４３塩基、少なくとも４４塩基、少なくとも４５塩基、少なくとも４６塩基、少なくとも４７塩基、少なくとも４８塩基、少なくとも４９塩基、少なくとも５０塩基、少なくとも５１塩基、少なくとも５２塩基、少なくとも５３塩基、少なくとも５４塩基、少なくとも５５塩基、少なくとも５６塩基、少なくとも５７塩基、少なくとも５８塩基、少なくとも５９塩基、少なくとも６０塩基、少なくとも６１塩基、少なくとも６２塩基、少なくとも６３塩基、少なくとも６４塩基、少なくとも６５塩基、少なくとも６６塩基、少なくとも６７塩基、少なくとも６８塩基、少なくとも６９塩基、少なくとも７０塩基、少なくとも７１塩基、少なくとも７２塩基、少なくとも７３塩基、少なくとも７４塩基、少なくとも７５塩基、少なくとも７６塩基、少なくとも７７塩基、少なくとも７８塩基、少なくとも７９塩基、少なくとも８０塩基、少なくとも８１塩基、少なくとも８２塩基、少なくとも８３塩基、少なくとも８４塩基、少なくとも８５塩基、少なくとも８６塩基、少なくとも８７塩基、少なくとも８８塩基、少なくとも８９塩基、少なくとも９０塩基、少なくとも９１塩基、少なくとも９２塩基、少なくとも９３塩基、少なくとも９４塩基、少なくとも９５塩基、少なくとも９６塩基、少なくとも９７塩基、少なくとも９８塩基、少なくとも９９塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも１０１塩基、少なくとも１０２塩基、少なくとも１０３塩基、少なくとも１０４塩基、少なくとも１０５塩基、少なくとも１０６塩基、少なくとも１０７塩基、少なくとも１０８塩基、少なくとも１０９塩基、少なくとも１１０塩基、少なくとも１１１塩基、少なくとも１１２塩基、少なくとも１１３塩基、少なくとも１１４塩基、少なくとも１１５塩基、少なくとも１１６塩基、少なくとも１１７塩基、少なくとも１１８塩基、少なくとも１１９塩基、少なくとも１２０塩基、少なくとも１２１塩基、少なくとも１２２塩基、少なくとも１２３塩基、少なくとも１２４塩基、少なくとも１２５塩基、少なくとも１２６塩基、少なくとも１２７塩基、少なくとも１２８塩基、少なくとも１２９塩基、少なくとも１３０塩基、少なくとも１３１塩基、少なくとも１３２塩基、少なくとも１３３塩基、少なくとも１３４塩基、少なくとも１３５塩基、少なくとも１３６塩基、少なくとも１３７塩基、少なくとも１３８塩基、少なくとも１３９塩基、少なくとも１４０塩基、少なくとも１４１塩基、少なくとも１４２塩基、少なくとも１４３塩基、少なくとも１４４塩基、少なくとも１４５塩基、少なくとも１４６塩基、少なくとも１４７塩基、少なくとも１４８塩基、少なくとも１４９塩基、少なくとも１５０塩基、少なくとも１５１塩基、少なくとも１５２塩基、少なくとも１５３塩基、少なくとも１５４塩基、少なくとも１５５塩基、少なくとも１５６塩基、少なくとも１５７塩基、少なくとも１５８塩基、少なくとも１５９塩基、少なくとも１６０塩基、少なくとも１６１塩基、少なくとも１６２塩基、少なくとも１６３塩基、少なくとも１６４塩基、少なくとも１６５塩基、少なくとも１６６塩基、少なくとも１６７塩基、少なくとも１６８塩基、少なくとも１６９塩基、少なくとも１７０塩基、少なくとも１７１塩基、少なくとも１７２塩基、少なくとも１７３塩基、少なくとも１７４塩基、少なくとも１７５塩基、少なくとも１７６塩基、少なくとも１７７塩基、少なくとも１７８塩基、少なくとも１７９塩基、少なくとも１８０塩基、少なくとも１８１塩基、少なくとも１８２塩基、少なくとも１８３塩基、少なくとも１８４塩基、少なくとも１８５塩基、少なくとも１８６塩基、少なくとも１８７塩基、少なくとも１８８塩基、少なくとも１８９塩基、少なくとも１９０塩基、少なくとも１９１塩基、少なくとも１９２塩基、少なくとも１９３塩基、少なくとも１９４塩基、少なくとも１９５塩基、少なくとも１９６塩基、少なくとも１９７塩基、少なくとも１９８塩基、少なくとも１９９塩基、又は少なくとも２００塩基の距離に位置し得る。
ある態様において、構造的特徴は、独立して、操作されたポリヌクレオチド中に形成し得る。他の場合において、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡに結合するときに形成し得る。構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが、ペプチド、ヌクレオチド、又は小分子等の他の分子と会合するときにも形成し得る。特定の実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの構造的特徴は、標的ＲＮＡとは独立して形成することができ、その構造は、標的ＲＮＡ領域との操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として変化し得る。特定の実施形態において、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと会合しているときに存在する。
いくつかの場合において、構造的特徴は、ヘアピンである。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインを欠いていてもよい。他の場合において、操作されたポリヌクレオチドは、１個のヘアピンドメイン、又は１個より多いヘアピンドメインを含有し得る。ヘアピンは、ポリヌクレオチド中の任意の場所に位置し得る。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、単一のＲＮＡ鎖がそれ自体で折り畳まれてＲＮＡ二本鎖を形成する、ＲＮＡ二本鎖である。一本鎖ＲＮＡ鎖は、互いに対して折り畳み領域塩基対の上流及び下流にヌクレオチド配列を有することに起因して、それ自体で折り畳まれる。ヘアピンは、二本鎖構造全体が１０～５００ヌクレオチド長を有し得る。ヘアピンのステムループ構造は、３～１５ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドのいずれかに存在し得る。本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、１～１０個のヘアピンを有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、１個のヘアピンを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、２個のヘアピンを有する。本明細書に開示されるように、ヘアピンは、動員ヘアピン又はヘアピン又は非動員ヘアピンを指し得る。ヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチド内の任意の場所に位置し得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチドの３’末端に、本開示の操作されたポリヌクレオチドの５’末端に、又は本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内に、又はこれらの任意の組み合わせに存在する。
一態様において、構造的特徴は、本明細書に開示されるように、動員ヘアピンを含む。動員ヘアピンは、ＡＤＡＲ等のＲＮＡ編集エンティティを動員し得る。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメイン又はそのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメイン又はそのバリアントを含む。
更に別の態様において、構造的特徴は、非動員ヘアピンを含む。非動員ヘアピンは、本明細書に開示されるように、標的ＲＮＡに対する操作されたポリヌクレオチドの局在化を改善する機能性を示し得る。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、核保持性を改善する。いくつかの実施形態において、非動員ヘアピンは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡ由来のヘアピンを含む。
別の態様において、構造的特徴は、ゆらぎ塩基を含む。ゆらぎ塩基対は、弱く対形成する２つの塩基を指す。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対形成したＧを指してもよい。
本開示のヘアピンは、任意の長さのものであり得る。ある態様において、ヘアピンは、約５～２００個、又はそれより多くのヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、ヘアピンは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、又は４００個、又はそれより多くのヌクレオチドを含み得る。他の場合において、ヘアピンはまた、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～６０、５～７０、５～８０、５～９０、５～１００、５～１１０、５～１２０、５～１３０、５～１４０、５～１５０、５～１６０、５～１７０、５～１８０、５～１９０、５～２００、５～２１０、５～２２０、５～２３０、５～２４０、５～２５０、５～２６０、５～２７０、５～２８０、５～２９０、５～３００、５～３１０、５～３２０、５～３３０、５～３４０、５～３５０、５～３６０、５～３７０、５～３８０、５～３９０、又は５～４００個のヌクレオチドを含み得る。ヘアピンは、ヌクレオチドループによって分離された二本鎖ハイブリダイズされたＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡモチーフ／構造へとハイブリダイズするために、自身に対して十分な相補性を有するＲＮＡの一本鎖から形成される構造的特徴である。
いくつかの場合において、構造的特徴は、バルジである。バルジは、標的鎖と操作されたポリヌクレオチド鎖との間の単一の（意図的な）核酸ミスマッチを含み得る。他の場合において、鎖間の１個より多い連続ミスマッチは、バルジ領域（塩基のミスマッチ伸長部）が、ハイブリダイズされた相補的ｄｓＲＮＡ領域の両側に隣接している限り、バルジを構成する。バルジは、ポリヌクレオチドの任意の位置に位置し得る。いくつかの場合において、バルジは、５’ヒドロキシル又は３’ヒドロキシルから約３０～約７０ヌクレオチドに位置する。
ある実施形態において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の形成時に形成される構造を指し、操作されたポリヌクレオチド又は標的ＲＮＡのいずれかの中のヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではない。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の二次構造又は三次構造を変化させ得る。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側、又はｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側に１～４個のヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、２個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、３個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、４個のバルジを有する。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、標的ＲＮＡ中の標的Ａを選択的に編集し、非標的のオフターゲット編集を低減するようにＡＤＡＲを配置し得る。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、追加のＡＤＡＲを動員し得る。本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ基質中のバルジは、他のＲＮＡ編集エンティティ等の他のタンパク質を動員し得る。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるバルジは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを容易にし得る。バルジは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。バルジは、標的Ａの選択的な編集をもたらす方向に制約することによって、ＡＤＡＲ編集を指示するのに役立ち得る。
ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。バルジは、対称バルジ又は非対称バルジであり得る。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側又は標的ＲＮＡ側のいずれかにある１～４個の参加するヌクレオチドによって形成され得る。対称バルジは、バルジの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側、又はｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側に２～４個のヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたガイドＲＮＡのハイブリダイゼーション時に形成される。バルジは、対称バルジ又は非対称バルジであり得る。非対称バルジは、バルジの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質のガイドＲＮＡ側又は標的ＲＮＡ側のいずれかに１～４個の参加するヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側又は標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたガイドＲＮＡ側にある４個のヌクレオチドとによって形成され得る。
ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。本明細書に開示されるように、内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の形成時に形成される構造を指し、操作されたポリヌクレオチド又は標的ＲＮＡのいずれかの中のヌクレオチドは、対向する鎖上のそれらの位置的な対応物に対して相補的ではなく、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側又は操作されたポリヌクレオチド側のいずれかにある、内部ループの一方の側は、５個より多いヌクレオチドを有する。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的ＲＮＡ中の標的Ａの塩基フリッピングに役立ち得る。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。対称内部ループは、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側又は操作されたポリヌクレオチド側のいずれかにある、内部ループの一方の側は、５～１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１２０、１３５、１４０、１４５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個のヌクレオチド、又はその間の任意の数のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、６０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、６５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、７０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、７５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、８０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、８５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、９０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、９５個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１１０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１２０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１３０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１４０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、２５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、３５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、４５０個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、５００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、６００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、７００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、８００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、９００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループの一方の側は、１０００個のヌクレオチドによって形成され得る。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。編集部位の近傍に存在する内部ループは、編集される標的ＲＮＡ中の標的Ａの塩基フリッピングに役立ち得る。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。対称内部ループは、内部ループの各々の側に同数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１５０個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側で同じである。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１０００個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側及びｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側で同じである。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１１０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１２０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１２０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１３０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１３０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１４０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１４０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ

側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある２５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある３５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある４５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある６００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある７００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある８００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある９００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。
ある態様において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、標的ＲＮＡに対する本開示の操作されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション時に形成される。内部ループは、対称内部ループ又は非対称内部ループであり得る。非対称内部ループは、内部ループの各々の側に異なる数のヌクレオチドが存在するときに形成される。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側及び標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１５０個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側で、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側でのヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５～１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５～１０００個のヌクレオチドとによって形成されてもよく、ヌクレオチドの数は、ｄｓＲＮＡ標的の操作された側で、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側でのヌクレオチドの数とは異なる。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある６個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある７個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある８個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０個のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある９個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある

４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１５０個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１５０個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある２００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある２００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある３００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある３００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある４００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある４００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある５００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある１０００個のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側にある１０００個のヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側にある５００個のヌクレオチドとによって形成され得る。
バルジ又はループを含む構造的特徴は、任意のサイズのものであり得る。いくつかの実施形態において、バルジ又はループは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個の塩基を含む。いくつかの場合において、バルジ又はループは、全体で少なくとも約１～１０、５～１５、１０～２０、１５～２５、２０～３０、１～３０、１～４０、１～５０、１～６０、１～７０、１～８０、１～９０、１～１００、１～１１０、１～１２０、１～１３０、１～１４０、１～１５０、１～２００、１～２５０、１～３００、１～３５０、１～４００、１～４５０、１～５００、１～６００、１～７００、１～８００、１～９００、１～１０００、２０～５０、２０～６０、２０～７０、２０～８０、２０～９０、２０～１００、２０～１１０、２０～１２０、２０～１３０、２０～１４０、２０～１５０、１～２００、１～２５０、１～３００、１～３５０、１～４００、１～４５０、１～５００、１～６００、１～７００、１～８００、１～９００、１～１０００、３０～４０、３０～５０、３０～６０、３０～７０、３０～８０、３０～９０、３０～１００、３０～１１０、３０～１２０、３０～１３０、３０～１４０、３０～１５０、３０～２００、３０～２５０、３０～３００、３０～３５０、３０～４００、３０～４５０、３０～５００、３０～６００、３０～７００、３０～８００、３０～９００、３０～１０００、４０～５０、４０～６０、４０～７０、４０～８０、４０～９０、４０～１００、４０～１１０、４０～１２０、４０～１３０、４０～１４０、４０～１５０、４０～２００、４０～２５０、４０～３００、４０～３５０、４０～４００、４０～４５０、４０～５００、４０～６００、４０～７００、４０～８００、４０～９００、４０～１０００、５０～６０、５０～７０、５０～８０、５０～９０、５０～１００、５０～１１０、５０～１２０、５０～１３０、５０～１４０、５０～１５０、５０～２００、５０～２５０、５０～３００、５０～３５０、５０～４００、５０～４５０、５０～５００、５０～６００、５０～７００、５０～８００、５０～９００、５０～１０００、６０～７０、６０～８０、６０～９０、６０～１００、６０～１１０、６０～１２０、６０～１３０、６０～１４０、６０～１５０、６０～２００、６０～２５０、６０～３００、６０～３５０、６０～４００、６０～４５０、６０～５００、６０～６００、６０～７００、６０～８００、６０～９００、６０～１０００、７０～８０、７０～９０、７０～１００、７０～１１０、７０～１２０、７０～１３０、７０～１４０、７０～１５０、７０～２００、７０～２５０、７０～３００、７０～３５０、７０～４００、７０～４５０、７０～５００、７０～６００、７０～７００、７０～８００、７０～９００、７０～１０００、８０～９０、８０～１００、８０～１１０、８０～１２０、８０～１３０、８０～１４０、８０～１５０、８０～２００、８０～２５０、８０～３００、８０～３５０、８０～４００、８０～４５０、８０～５００、８０～６００、８０～７００、８０～８００、８０～９００、８０～１０００、９０～１００、９０～１１０、９０～１２０、９０～１３０、９０～１４０、９０～１５０、９０～２００、９０～２５０、９０～３００、９０～３５０、９０～４００、９０～４５０、９０～５００、９０～６００、９０～７００、９０～８００、９０～９００、９０～１０００、１００～１１０、１００～１２０、１００～１３０、１００～１４０、１００～１５０、１００～２００、１００～２５０、１００～３００、１００～３５０、１００～４００、１００～４５０、１００～５００、１００～６００、１００～７００、１００～８００、１００～９００、１００～１０００、１１０～１２０、１１０～１３０、１１０～１４０、１１０～１５０、１１０～２００、１１０～２５０、１１０～３００、１１０～３５０、１１０～４００、１１０～４５０、１１０～５００、１１０～６００、１１０～７００、１１０～８００、１１０～９００、１１０～１０００、１２０～１３０、１２０～１４０、１２０～１５０、１２０～２００、１２０～２５０、１２０～３００、１２０～３５０、１２０～４００、１２０～４５０、１２０～５００、１２０～６００、１２０～７００、１２０～８００、１２０～９００、１２０～１０００、１３０～１４０、１３０～１５０、１３０～２００、１３０～２５０、１３０～３００、１３０～３５０、１３０～４００、１３０～４５０、１３０～５００、１３０～６００、１３０～７００、１３０～８００、１３０～９００、１３０～１０００、１４０～１５０、１４０～２００、１４０～２５０、１４０～３００、１４０～３５０、１４０～４００、１４０～４５０、１４０～５００、１４０～６００、１４０～７００、１４０～８００、１４０～９００、１４０～１０００、１５０～２００、１５０～２５０、１５０～３００、１５０～３５０、１５０～４００、１５０～４５０、１５０～５００、１５０～６００、１５０～７００、１５０～８００、１５０～９００、１５０～１０００、２００～２５０、２００～３００、２００～３５０、２００～４００、２００～４５０、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、２００～９００、２００～１０００、２５０～３００、２５０～３５０、２５０～４００、２５０～４５０、２５０～５００、２５０～６００、２５０～７００、２５０～８００、２５０～９００、２５０～１０００、３００～３５０、３００～４００、３００～４５０、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、３００～９００、３００～１０００、３５０～４００、３５０～４５０、３５０～５００、３５０～６００、３５０～７００、３５０～８００、３５０～９００、３５０～１０００、４００～４５０、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、４００～９００、４００～１０００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、５００～９００、５００～１０００、６００～７００、６００～８００、６００～９００、６００～１０００、７００～８００、７００～９００、７００～１０００、８００～９００、８００～１０００、又は９００～１０００個の塩基を含む。
いくつかの場合において、構造的特徴は、構造化モチーフである。本明細書に開示されるように、構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質中に２つ以上の構造的特徴を含む。構造化モチーフは、正確な位置でのＡＤＡＲ編集のための理想的な基質を生成するために、上述の請求項等の構造的特徴の任意の組み合わせを含み得る。これらの構造モチーフは、最大化されたＡＤＡＲ編集のために人工的に操作することができ、及び／又はこれらの構造モチーフは、既知のＡＤＡＲ基質を反復するようにモデル化することができる。
いくつかの場合において、構造的特徴は、ポリヌクレオチドの少なくとも部分的な環化を含む。いくつかの場合において、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、環化されてもよく、又は環状構成であってもよい。いくつかの態様において、少なくとも部分的に環状のポリヌクレオチドは、５’ヒドロキシル又は３’ヒドロキシルを欠いている。
いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉのために構成された配列を含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉのために構成された配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はダイサー基質をコードする配列を含まなくてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はダイサー基質をコードする配列を含み得る。
ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作されたポリヌクレオチドから産生され得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作された線形ポリヌクレオチドであり得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、線形であり得る。例えば、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、プラスミドから転写された線形ＲＮＡであり得る。別の例において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、細胞における環化を可能にするリボザイムドメイン及びライゲーションドメイン等のドメインを有する線形ポリヌクレオチドであるように構築することができる。ライゲーションドメイン及びリボザイムドメインを有する線形ポリヌクレオチドを、細胞へトランスフェクトすることができ、内因性細胞酵素を介して環化することができる。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、環状であり得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含み得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、前駆体の操作されたガイドＲＮＡを含み得る。いくつかの場合において、前駆体の操作されたガイドＲＮＡを使用して、操作されたガイドＲＮＡを産生することができる。
本明細書に記載のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、スペーサードメインを含み得る。いくつかの場合において、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、スペーサードメインを含まなくてもよい。いくつかの場合において、例えば、ケルビンプローブフォース顕微鏡（ＫＰＦＭ）によって決定される場合、スペーサードメインは、標的ＲＮＡに対する操作されたポリヌクレオチドの結合のギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を、スペーサードメインを欠く対応する操作されたポリヌクレオチドの結合のΔＧと比較して、下げる。いくつかの実施形態において、標的化配列が、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合する場合、スペーサードメインは、少なくとも１個のヌクレオチドによって標的化配列から分離することができ、スペーサードメインが、標的ＲＮＡに結合する場合、スペーサードメインの結合は、スペーサードメインに結合する標的ＲＮＡの一部分で、標的ＲＮＡの編集を引き起こさない場合がある。いくつかの場合において、スペーサードメインが、標的化配列の５’末端又は３’末端に隣接し得る場合、スペーサードメインは、標的ＲＮＡに対して相補的でなくてもよい。
いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２５００、又は５０００ヌクレオチド長よりも長くてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド（例えば、操作されたガイドポリヌクレオチド）、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２５００、又は５０００ヌクレオチド長よりも短くてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド（例えば、操作されたガイドポリヌクレオチド）、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド、２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、７０ヌクレオチド～約１４０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド～約１６０ヌクレオチド、９０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド～約３５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、４５０ヌクレオチド～約８００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド～約１２５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド～約２０００ヌクレオチド、又は約２０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、標的化配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、又は５００ヌクレオチドだけ分離されていてもよい。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、溶媒に曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含んでいなくてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ヒト細胞中に天然に存在するｍＲＮＡよりも加水分解の影響を受けにくい可能性がある二次構造を含み得る。
スペーサードメインは、標的ＲＮＡに対する少なくとも部分的な結合を容易にする立体配座を採用する操作されたポリヌクレオチドを容易にするように構成され得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、ポリヌクレオチドの標的化配列が実質的に線形であり得るように、ポリヌクレオチドの標的化配列の幾何学形状を変更することができる。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、操作されたポリヌクレオチドの合成を容易にし得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、前駆体の操作されたポリヌクレオチドの溶媒露出末端の連結を容易にし得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、スペーサードメインを欠くものよりも、前駆体の操作されたポリヌクレオチドの２つのライゲーション末端を近づけることができる。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド中の連結は、共有結合性又は非共有結合性であり得る。いくつかの場合において、連結は、ライゲーション反応によって形成することができる。いくつかの実施形態において、連結は、相同組換え反応によって形成することができる。
スペーサードメインを含むｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの結合特異性に対して、複数の他のＲＮＡの中で、標的ＲＮＡに対する結合特異性を増加させ得る。いくつかの実施形態において、標的ＲＮＡに対する結合特異性の増加は、スペーサードメインを含む操作されたポリヌクレオチド、又はスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触した後の標的ＲＮＡ及び複数の他のＲＮＡの配列決定によって決定することができる。いくつかの場合において、スペーサードメインは、標的ＲＮＡに対する操作されたポリヌクレオチドの結合のより低いエントロピー（ΔＳ）を容易にするように構成され得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、スペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドの編集効率に対して、標的ＲＮＡに対する操作されたポリヌクレオチドの編集効率を少なくとも維持するように構成され得る。いくつかの場合において、編集効率は、スペーサードメインを有する操作されたポリヌクレオチド、又はスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触した後の標的ＲＮＡの配列決定によって決定することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも維持することは、増加を含み得る。いくつかの場合において、編集効率は、スペーサードメインを有する操作されたポリヌクレオチド、又はスペーサードメインを欠く対応するポリヌクレオチドと接触した後の標的ＲＮＡの質量分析によって決定することができる。
操作されたガイドＲＮＡ、操作されたポリヌクレオチド、又はｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドをコードする前駆体の操作された線形ポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの編集を、例えばＲＮＡ編集エンティティを介して容易にすることができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの編集を容易にしなくてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドと比較して、標的ＲＮＡに対する編集効率を少なくとも約９０％増加させることができる。いくつかの実施形態において、編集効率は、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株へトランスフェクトすること、（ｉｉ）操作されたポリヌクレオチド、及び５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株へトランスフェクトすること、並びに（ｉｉｉ）標的ＲＮＡを配列決定することによって決定することができる。いくつかの実施形態において、編集効率は、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株へトランスフェクトすること、（ｉｉ）操作されたポリヌクレオチド、及び５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を含み得ること以外は同等のポリヌクレオチドを初代細胞株へトランスフェクトすること、並びに（ｉｉｉ）標的ＲＮＡの質量分析によって決定することができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、（ｉ）標的ＲＮＡを初代細胞株に直接的若しくは間接的に導入する（例えば、トランスフェクトする）ことと、（ｉｉ）操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株に直接的若しくは間接的に導入する（例えば、トランスフェクトする）ことと、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡを配列決定することと、を含むインビトロアッセイで決定することができる。いくつかの場合において、標的ＲＮＡを初代細胞株にトランスフェクトすることは、標的ＲＮＡをコードするプラスミドを初代細胞株にトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株にトランスフェクトすることは、前駆体の操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドを初代細胞株内にコードするポリヌクレオチド（例えば、プラスミド）をトランスフェクトすることを含み得る。いくつかの場合において、配列決定することは、標的ＲＮＡが逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換された後に、標的ＲＮＡのＳａｎｇｅｒ配列決定することを含み得る。いくつかの場合において、初代細胞株は、ニューロン、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、グリア細胞、筋芽細胞、筋管細胞、肝細胞、肺上皮細胞、又は線維芽細胞を含み得る。
いくつかの場合において、スペーサードメインは、約１ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド、２ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、５０ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、又は約４００ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長の配列長さを有し得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインのヌクレオチドの約８０％は、標的ＲＮＡに対して非相補的であり得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約５ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約１０ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約１５ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、約２０ヌクレオチドの配列長さを有し得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、ＡＴＡＴＡ（配列番号５０）、ＡＴＡＡＴ（配列番号５１）のポリヌクレオチド配列、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、スペーサードメインは、ＡＵＡＡＵ（配列番号５２）、ＡＵＡＵＡ（配列番号５３）、又はＵＡＡＵＡ（配列番号５４）の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、スペーサードメインは、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ又はＵ等の少なくとも単一ヌクレオチドであり得る。
スペーサードメインは、標的化配列に対して近位、ライゲーションドメインに対して近位、リボザイムドメインに対して近位、ＲＮＡ編集動員ドメインに対して近位、又は別のスペーサードメインに対して近位に位置していてもよく、近位は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、又は５００ヌクレオチドだけ分離されていることを意味し得る。
操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、単一スペーサードメインを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、複数のスペーサードメイン、例えば、２、３、４、５、６、７、又は８個のスペーサードメインを含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、１個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、１個より多い標的化配列を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、２個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、同じ標的ＲＮＡを標的とする２個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、異なる標的ＲＮＡを標的とする２個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチド配列同一性を含む２個の標的化配列を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチド配列同一性を含む２個の標的化配列を含み得る。
スペーサードメインを有する、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドのインビトロ半減期は、スペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡ又は同等のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、又はそれより長くてもよい。スペーサードメインを有する、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドのインビボ半減期は、スペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡ又は同等のポリヌクレオチドと比較して、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、又はそれより長くてもよい。それを必要とする対象に投与される、スペーサードメインを有する、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物の投薬量は、それを必要とする対象に投与される、スペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡ又は同等のポリヌクレオチドを含む組成物と比較して、少なくとも約１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍少なくてもよく、又はそれより少なくてもよい。それを必要とする対象に投与される、スペーサードメインを有する、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたポリヌクレオチド、又は前駆体の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物は、２回又はそれより多い治療として与えられる、スペーサードメインを欠く実質的に同等のＲＮＡ又は同等のポリヌクレオチドを含む組成物と比較して、単回治療として与えることができる。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００個、又はそれより多くの化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、又は２００個以下の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの５’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端の両方に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００個、又はそれより多くの化学修飾されたヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列中に少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、標的化配列に隣接するヌクレオチド塩基中に少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾を分子内二次構造内に導入することができる。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方に対する少なくとも１個の修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの少なくとも１つの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子の１つ以上に対する化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含む操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、少なくとも１つのアンロックド核酸（ＵＮＡ）を含む操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、糖の構成成分の修飾を含む糖に対する少なくとも１個の化学修飾を含んでいてもよく、糖は、リボース糖である。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、２’－Ｏ－メチル基を含む操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドのリボース糖の構成成分に対する少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、デホスホリンカーを有する操作されたポリヌクレオチドのホスフェート部分の置き換えを含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのホスフェート骨格の少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基に対する修飾を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、ヌクレオチドの非天然塩基を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、モルホリノ基、シクロブチル基、ピロリジン基、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代理物を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、少なくとも１つの立体化学的に純粋な核酸を含む少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの５’末端の近位に配置され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの３’末端の近位に配置され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端の両方の近位に配置され得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、一緒に共有結合された複数の糖及びホスフェート部分を含む骨格を含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、ＤＮＡ中のデオキシリボース又はＲＮＡ中のリボースの５’炭素上のホスフェート基中の第１のヒドロキシル基と、ＤＮＡ中のデオキシリボース又はＲＮＡ中のリボースの３’炭素上の第２のヒドロキシル基との間にホスホジエステル結合連結を含み得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、溶媒に曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、ヌクレアーゼに曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、加水分解酵素に曝露することができる、５’還元ヒドロキシル、３’還元ヒドロキシル、又は両方を欠いていてもよい。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、他方のヌクレオチドの後に一方のヌクレオチドを有する環状二次元形式でのポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、他方のヌクレオチドの後に一方のヌクレオチドを有するループ状二次元形式でのポリヌクレオチド配列として表すことができる。いくつかの場合において、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、又はその両方が、リン－酸素結合によって連結される。いくつかの場合において、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、又はその両方が、リン含有部分を有するホスホエステルへと修飾される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも１個の化学修飾を含み得る。化学修飾は、置換、挿入、欠失、化学修飾、物理修飾、安定化、精製、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合において、修飾は、化学修飾である。好適な化学修飾は、５’アデニレート、５’グアノシン－トリホスフェートキャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－トリホスフェートキャップ、５’トリホスフェートキャップ、３’ホスフェート、３’チオホスフェート、５’ホスフェート、５’チオホスフェート、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９，３’－３’修飾、５’－５’修飾、非塩基部位、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾された類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－トリホスフェート、５－メチルシチジン－５’－トリホスフェート、２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエート、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つを含む。
化学修飾は、操作されたポリヌクレオチドの任意の位置で行われ得る。いくつかの場合において、修飾は、５’末端又は３’末端に位置する。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、又は１５０から選択される塩基での修飾を含む。操作されたポリヌクレオチドに対して、１つより多い修飾を行うことができる。いくつかの場合において、修飾は、永続的であり得る。他の場合において、修飾は、一過性であり得る。いくつかの場合において、複数の修飾は、操作されたポリヌクレオチドに対して行われる。操作されたポリヌクレオチド修飾は、ヌクレオチドの立体配座、極性、疎水性、化学反応性、塩基対相互作用、又はこれらの任意の組み合わせ等のヌクレオチドの物理化学的特性を変更することができる。
化学修飾は、ホスホロチオエート置換体でもあり得る。いくつかの場合において、天然ホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによる迅速な分解を受けやすい場合があり、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換体を使用したヌクレオチド間連結の修飾は、細胞分解による加水分解に対して、より安定であり得る。修飾は、ポリ核酸における安定性を増加させることができる。修飾はまた、生物学的活性を増強することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエートによって増強されたＲＮＡポリ核酸は、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、子ウシ血清ヌクレアーゼ、又はこれらの任意の組み合わせを阻害することができる。これらの特性は、ヌクレアーゼへの曝露がインビボ又はインビトロでの高い可能性である用途において、使用されるべきＰＳ－ＲＮＡポリ核酸の使用を可能にすることができる。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を、エクソヌクレアーゼ分解を阻害することができるポリ核酸の５’末端又は３’末端の最後の３～５ヌクレオチド間に導入することができる。いくつかの場合において、ホスホロチオエート結合を、ポリ核酸全体にわたって付加し、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減することができる。
本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、任意の頻度の塩基を有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のアデニン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のシトシン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のチミン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のグアニン率を有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、又は最大で約３０～４０％のウラシル率を有し得る。
いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、修飾後に品質管理を受けることができる。いくつかの場合において、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドの質量を決定することができる。質量は、ＬＣ－ＭＳアッセイによって決定することができる。質量は、３０，０００ａｍｕ、５０，０００ａｍｕ、７０，０００ａｍｕ、９０，０００ａｍｕ、１００，０００ａｍｕ、１２０，０００ａｍｕ、１５０，０００ａｍｕ、１７５，０００ａｍｕ、２００，０００ａｍｕ、２５０，０００ａｍｕ、３００，０００ａｍｕ、３５０，０００ａｍｕ、４００，０００ａｍｕから、約５００，０００ａｍｕまでであり得る。質量は、ポリヌクレオチドのナトリウム塩の質量であってもよい。
いくつかの場合において、ポリヌクレオチドのエンドトキシンレベルを決定することができる。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、１０ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、８ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、４ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、２ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、１ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、０．５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも１個の化学修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、５０、１００、又はそれより多くの化学修飾を含む。
いくつかの実施形態において、化学修飾は、３’ＯＨ基、５’ＯＨ基で、骨格で、糖構成要素で、又はヌクレオチド塩基で生じ得る。化学修飾には、鎖間架橋又は鎖内架橋の天然に存在しないリンカー分子が含まれ得る。一態様において、化学修飾された核酸は、３’ＯＨ若しくは５’ＯＨ基、骨格、糖構成要素、又はヌクレオチド塩基のうちの１つ以上の修飾、又は天然に存在しないリンカー分子の付加を含む。いくつかの実施形態において、化学修飾された骨格は、ホスホジエステル骨格以外の骨格を含む。いくつかの実施形態において、修飾された糖は、デオキシリボース以外の糖（修飾ＤＮＡにおいて）、又はリボース以外の糖（修飾ＲＮＡにおいて）を含む。いくつかの実施形態において、修飾された塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシル以外の塩基を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、少なくとも１個の化学修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個、又はそれより多くの修飾された塩基を含む。いくつかの場合において、塩基部分に対する化学修飾としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、又はウラシル、及びプリン又はピリミジン塩基の天然及び合成の修飾が挙げられる。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドの化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の片方若しくは両方の修飾、ホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素のうちの１つ以上の修飾、リボース糖の構成成分の修飾、「デホスホ」リンカーによるホスフェート部分の置き換え、天然に存在する核酸塩基の修飾若しくは置き換え、リボース－ホスフェート骨格の修飾、ポリヌクレオチドの５’末端の修飾、ポリヌクレオチドの３’末端の修飾、デオキシリボースホスフェート骨格の修飾、ホスフェート基の置換、リボホスフェート骨格の修飾、ヌクレオチドの糖に対する修飾、ヌクレオチドの塩基に対する修飾、又はヌクレオチドの立体化学的に純粋なもののうちのいずれか１つ、又は任意の組み合わせの修飾を含み得る。操作されたポリヌクレオチドの例示的な化学修飾を、表１に見ることができる。
Figure 2023523237000003
Figure 2023523237000004
いくつかの実施形態において、化学修飾は、ホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素の片方若しくは両方の修飾、又はホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素原子のうちの１つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖又は分枝鎖である飽和炭化水素基を指すことを意味する。例示的なアルキル基としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ－プロピル若しくはイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ－ブチル、イソブチル、若しくはｔ－ブチル）、又はペンチル（例えば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、若しくはネオペンチル）が挙げられる。アルキル基は、１～約２０、２～約２０、１～約１２、１～約８、１～約６、１～約４、又は１～約３個の炭素原子を含有し得る。本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環式若しくは多環式（例えば、２、３、若しくは４個の縮合環を有する）芳香族炭化水素、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、又はインデニルを指す。いくつかの実施形態において、アリール基は、６～約２０個の炭素原子を有する。本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、２～１２個の炭素原子を含有し、１つ以上の三重結合を有することを特徴とする、直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、プロパルギル、又は３－ヘキシニルを挙げることができる。「アリールアルキル」又は「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置き換えられたアルキル部分を指す。アラルキルは、１個より多い水素原子がアリール基によって置き換えられた基を含む。「アリールアルキル」又は「アラルキル」の例としては、ベンジル、２－フェニルエチル、３－フェニルプロピル、９－フルオレニル、ベンズヒドリル、及びトリチル基が挙げられる。「シクロアルキル」は、３～１２個の炭素を有する、環式、二環式、三環式、又は多環式の非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルが挙げられる。「ヘテロシクリル」は、複素環式環系の一価のラジカルを指す。代表的なヘテロシクリルとしては、限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、及びモルホリニルが挙げられる。「ヘテロアリール」は、複素芳香族環系の一価のラジカルを指す。ヘテロアリール部分の例としては、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピローリル、フラニル、インドリル、チオフェニルピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、及びプテリジニルが挙げられ得る。
いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドのホスフェート基は、酸素のうちの１つ以上を別の置換基で置き換えることによって修飾され得る。いくつかの実施形態において、化学修飾されたヌクレオチドは、修飾されていないホスフェート部分を、本明細書に記載の修飾されたホスフェートで置き換えることを含み得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格の修飾は、帯電していないリンカー、又は非対称電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす変化を含み得る。修飾されたホスフェート基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホノチオアセテート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられ得る。いくつかの実施形態において、ホスフェート骨格部分中の非架橋リン酸酸素原子の１つが、以下の基のいずれかによって置き換えられ得る。硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基等）、Ｈ、ＮＲ２（ここで、Ｒは、例えば、水素、アルキル、又はアリールであり得る）か、又は（Ｒは、例えば、アルキル又はアリールであり得る）。修飾されていないホスフェート基のリン原子は、アキラルであり得る。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子又は原子群のうちの１つによる置き換えによって、リン原子をキラルにすることができる。このように修飾されたリン酸基中のリン原子は、立体中心である。立体中心のリン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書ではＲｐ）又は「Ｓ」立体配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ホスホロチオエートのＳ立体配座又はホスホロチオエートのＲ立体配座を含む立体化学的に純粋なヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれより多いジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９５％のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９６％のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９７％のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９８％のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、キラルホスフェート生成物は、９９％のジアステレオマー過剰で存在する。いくつかの実施形態において、ホスホロジチオエートの非架橋酸素を両方とも硫黄によって置き換えることができる。ホスホロジチオエートのリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるアキラルであり得る。いくつかの実施形態において、一方又は両方の非架橋酸素に対する修飾は、非架橋酸素を、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、及びＯＲ（Ｒは、例えば、アルキル又はアリールであり得る）から独立して選択される基で置き換えることも含むことができる。いくつかの実施形態において、ホスフェートリンカーは、架橋酸素（例えば、ホスフェートをヌクレオシドに連結する酸素）、窒素（架橋したホスホロアミデート）、硫黄（架橋したホスホロチオエート）、及び炭素（架橋したメチレンホスホネート）の置き換えによっても修飾することができる。置き換えは、連結酸素のいずれか又は両方で生じ得る。
操作されたポリヌクレオチドは、プレｍＲＮＡ標的化配列を含み得る。プレｍＲＮＡ標的化配列は、標的プレｍＲＮＡに対して完全に相補的ではない場合がある。標的化配列は、プレｍＲＮＡ配列に対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、プレｍＲＮＡ内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、プレｍＲＮＡに対して相補的ではない少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個のヌクレオチドを含み得る。
標的化配列は、プレｍＲＮＡ内のエクソンの上流の分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であり得る。標的化配列は、プレｍＲＮＡ内のエクソンの下流のドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、二次構造は、ヘアピンを含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、マウス又はヒトＵ７ ｓｎＲＮＡのステムループヘアピンに対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ヘアピンは、マウス又はヒトＵ７ ｓｎＲＮＡのステムループヘアピンである。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号３である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号５である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号６に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号６である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号７である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号８である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号９である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１０である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１１である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１２である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１３である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１４である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１５である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１６に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１６である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１７である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１８である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号１９である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２０である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２１である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２２である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２３である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２４に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２４である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２５に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２５である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２６に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２６である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２７に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２７である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号２９に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号２９である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３０に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号３０である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３１に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号３１である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３２に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号３２である。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３３に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号３３である。
プレｍＲＮＡのＲＮＡ編集は、標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドの標的化によって容易になる。標的化配列は、プレｍＲＮＡの少なくとも部分的に相補的な標的領域に結合することができる。
標的領域は、スプライスシグナルを含み得る。標的領域は、エクソン、イントロン、又はプロモーターに対して近位であり得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、疾患又は状態に関与する遺伝子の領域を標的とする。領域は、エクソンである。いくつかの実施形態において、領域は、イントロンである。本明細書に記載のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドは、疾患又は状態を治療するために対象に投与され得る。このような疾患又は状態は、神経変性疾患、筋肉障害、代謝障害、眼障害（例えば、眼疾患）、がん、肝臓疾患（アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症）、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。疾患又は状態は、嚢胞性線維症、アルビノ、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、喘息、β－サラセミア、カダシル症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、認知症、遠位脊髄筋萎縮症（ＤＳＭＡ）、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、栄養障害型表皮水疱症、表皮水疱症、ファブリー病、第Ｖ因子ライデン関連障害、家族性大腸、ポリポーシス、ガラクトース血症、ゴーシェ病、グルコース－６－ホスフェートデヒドロゲナーゼ、血友病、遺伝性へモクロマトーシス、ハンター症候群、ハンチントン病、ハーラー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、遺伝性汎血球凝集症候群、レーバー先天性黒内障、レッシュ・ナイハン症候群、リンチ症候群、マルファン症候群、ムコ多糖症、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィーＩ型及びＩＩ型、神経線維腫症、ニーマン・ピック病Ａ型、Ｂ型、及びＣ型、ＮＹ－ｅｓｏ１関連がん、パーキンソン病、ポイツ・イェガース症候群、フェニルケトン尿症、ポンペ病、原発性線毛運動不全症、プロトロンビン変異関連障害、例えば、プロトロンビンＧ２０２１０Ａ変異、肺動脈性肺高血圧症、網膜色素変性症、サンドホフ病、重症複合免疫不全症候群（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、スターガルト病、テイ・サックス病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖免疫不全症、がんの様々な形態（例えば、ＢＲＣＡ１及び２に関連する乳がん及び卵巣がん）を含み得る。いくつかの場合において、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）等の疾患又は状態の治療は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｔａｕ、アルファ－シヌクレイン、又はこれらの任意の組み合わせの編集、ノックダウン、又はその両方をもたらすことを含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＰ、ｔａｕ、及びアルファ－シヌクレインは、病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合において、ＡＰＰは、Ａ６７３Ｖ変異又はＡ６７３Ｔ変異等の病原性バリアントを含み得る。いくつかの場合において、神経変性疾患（パーキンソン病）等の疾患又は状態の治療は、ＬＲＲＫ２の病原性バリアントの編集、ノックダウン、又はその両方をもたらすことを含み得る。いくつかの場合において、ＬＲＲＫの病原性バリアントは、Ｇ２０１９Ｓ変異を含み得る。疾患又は状態は、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、網膜色素変性症、乳がん、卵巣がん、アルツハイマー病、疼痛、スターガルト黄斑ジストロフィー、シャルコー・マリー・トゥース病、レット症候群、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、Ｒｅｔｔを有する患者において、ミスセンス変異を修正する（例えば、Ｔｒｐをコードするように停止コドンを変異させる）ことができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、パーキンソン病を有する患者において、ミスセンス変異を修正するか、又はノックダウンを誘導することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、アルツハイマー病を有する患者において、変異を誘導することができ、ＡＰＰにおける切断部位でのタンパク質による切断を低減することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、筋ジストロフィーを有する患者において、エクソンスキッピングを生成することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、テイ・サックス病を有する患者において、ＨｅｘＡの変異を修正することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、テイ・サックス病を有する患者において、ＨｅｘＡの変異を修正することができる。いくつかの場合において、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＡＴ欠乏症を有する患者において、変異を修正する（例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１を編集する）ことができる。いくつかの場合において、組成物の投与は、（ａ）投与前の遺伝子の発現と比較して、遺伝子の発現を減少させ、（ｂ）対象（例えばそれを必要とする対象）において少なくとも１つの点変異を編集し、（ｃ）対象において少なくとも１つの停止コドンを編集して、停止コドンのリードスルーをもたらし、（ｄ）対象においてエクソンスキップをもたらし、又は（ｅ）これらの任意の組み合わせにとって十分なものであり得る。疾患又は状態は、筋ジストロフィーを含み得る。筋ジストロフィーとしては、筋緊張性、デュシェンヌ型、ベッカー型、肢帯、顔面肩甲上腕型、先天性、眼咽頭型、遠位、エメリー・ドレイフス、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。疾患又は状態は、慢性疼痛等の疼痛を含み得る。疼痛には、神経障害性疼痛、侵害受容性疼痛、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。侵害受容性疼痛には、内臓疼痛、体性疼痛、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。標的化配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７のうちのいずれか１つに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、又は配列番号１７の標的配列に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％相補的である。
ＲＮＡ編集
本開示は、目的の標的ＲＮＡ編集中の塩基のＲＮＡ編集を容易にするｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する操作されたポリヌクレオチドの組成物を提供する。例えば、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化等の塩基の化学修飾を含むＲＮＡ編集を容易にする。イノシンは、グアノシン（Ｇ）と読まれる。このように、ＲＮＡ編集の本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチド及びそれを使用する方法は、ある疾患又は疾患経路に関与し得る遺伝子におけるＧからＡへの点変異を修正するために使用することができる。したがって、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドは、治療方法における治療薬として使用され得る。
いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、標的ＲＮＡ中の標的Ａを選択的に編集し、標的ＲＮＡ中の非標的Ａのオフターゲット編集を低減するようにＡＤＡＲを配置し得る。いくつかの実施形態において、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、追加のＡＤＡＲを動員し得る。本明細書に開示されるｄｓＲＮＡ基質中のバルジは、他のＲＮＡ編集エンティティ等の他のタンパク質を動員し得る。いくつかの実施形態において、編集部位の５’に配置されるバルジは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを容易にし得る。バルジは、配列特異性を付与するのにも役立ち得る。バルジは、標的Ａの選択的な編集をもたらす方向に制約することによって、ＡＤＡＲ編集を指示するのに役立ち得る。
ＲＮＡ編集エンティティは、ＡＤＡＲタンパク質（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、若しくはこれらの任意の組み合わせ）、任意のＡＰＯＢＥＣタンパク質（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、若しくはこれらの任意の組み合わせ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、又はこれらの組み合わせのうちのいずれか１つであり得る。いくつかの場合において、動員されるＡＤＡＲ又はＡＰＯＢＥＣタンパク質は、哺乳動物タンパク質であり得る。いくつかの場合において、動員されるＡＤＡＲ又はＡＰＯＢＥＣタンパク質は、ヒトタンパク質であり得る。いくつかの場合において、動員されるＡＤＡＲ又はＡＰＯＢＥＣタンパク質は、組換え（例えば、外因性送達されたＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ）、修飾された（例えば、外因性送達されたＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ）、内因性（例えば、内因性ＡＤＡＲ若しくはＡＰＯＢＥＣ）、又はこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、融合タンパク質、例えば、本明細書で提供されるＲＮＡ編集エンティティのいずれかであり得る。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、ＲＮＡ編集エンティティ、例えば、本明細書で提供されるＲＮＡ編集エンティティのいずれかの機能的部分であり得る。上述のＲＮＡ編集エンティティのいずれかは、本明細書で提供される組成物及び／又は方法とともに使用するように適合され得る。
ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、及びそれらの生物学的に活性な断片は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質におけるアデノシンからイノシンへの化学的変換を触媒する酵素であり得る。イノシンの特性は、グアノシンの特性を模倣するため（イノシンは、例えば、シトシンとの２つの水素結合を形成する）、イノシンは、翻訳細胞機構によってグアノシンとして認識され得る。したがって、アデノシンからイノシン（ＡからＩ）へのＲＮＡ編集は、ＲＮＡ標的の一次配列を効果的に変化させる。ＡＤＡＲ酵素は、様々な数のアミノ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）及びカルボキシ末端触媒デアミナーゼドメインを含む共通のドメインアーキテクチャを共有する。ヒトＡＤＡＲは、２つ又は３つのｄｓＲＢＤを保有する。
３つのヒトＡＤＡＲ遺伝子が特定されており（ＡＤＡＲ１～３）、ＡＤＡＲ１（公式の記号ＡＤＡＲ）及びＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲＢ１）タンパク質は、十分に特性決定されたアデノシン脱アミノ化活性を有する。ＡＤＡＲは、そのＮ末端領域にｄｓＲＮＡ結合ドメインの少なくとも２つのコピー（ｄｓＲＢＤ、３つのｄｓＲＢＤを有するＡＤＡＲ１、２つのコピーを有するＡＤＡＲ２及びＡＤＡＲ３）、その後にＣ末端脱アミナーゼドメインを含む典型的なモジュールドメイン組織を有する。
ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２は、インビボでのｍＲＮＡ編集に関与するＡＤＡＲの２つの例示的な種である。ＡＤＡＲ１の非限定的な例示的な配列は、以下の参照番号：ＨＧＮＣ：２２５、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ ０００００１６０７１０、ＯＭＩＭ：１４６９２０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ５５２６５、及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＧＣ０１Ｍ１５４５５４、並びにこれらの生物学的等価物で見出され得る。ＡＤＡＲ２の非限定的な例示的な配列は、以下の参照番号：ＨＧＮＣ：２２６、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０４、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７３８１、ＯＭＩＭ：６０１２１８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ７８５６３、及びＧｅｎｅＣａｒｄｓ：ＧＣ２１Ｐ０４５０７３、並びにこれらの生物学的等価物で見出され得る。ＡＤＡＲの生物学的に活性な断片も本明細書で提供され、ＡＤＡＲを指す場合に含まれ得る。
本開示は、内因性ＡＤＡＲ１発現を増加させる手段としてのインターフェロンαの使用を企図する。単離されたか、又は組換えインターフェロンαの商業的供給源としては、限定されないが、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｃａｍ、及びＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが挙げられる。代替的に、インターフェロンαは、既知のベクター及び所与のタンパク質配列、例えば、Ｑ６ＱＮＢ６（ヒトＩＦＮＡ）を使用して産生され得る。
ＡＰＯＢＥＣ及びそれらの生物学的に活性な断片は、任意のタンパク質、例えば、ｍＲＮＡ編集に関与する進化的に保存されたシチジンデアミナーゼ（ＣからＵへの変換を触媒する）のファミリー内に含まれる例示的なＲＮＡ編集エンティティ、及びそれらの等価物を指すことができる。いくつかの観点において、ＡＰＯＢＥＣという用語は、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４、又はそれらの各々の等価物のうちのいずれか１つを指す。ＡＤＡＲドメインに融合されるか、又はＲＮＡ編集系において使用するのに好適なものにするために代替ドメインに融合されるかの両方で、１つ以上のＡＰＯＢＥＣドメインを含む融合タンパク質の非限定的な例示的な配列が、本明細書で提供される。この目的のために、ＡＰＯＢＥＣは、異なる変換による任意の編集を触媒する、ＡＤＡＲの等価物と考えることができる。したがって、理論によって束縛されないように、ＡＤＡＲに基づく編集系とともに使用するために本明細書で企図される実施形態は、ＡＰＯＢＥＣに基づくＲＮＡ編集系において使用するために適合され得る。
いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティは、ステムループを含む二次構造を形成しない。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティの少なくとも一部分は、ステムループを含む二次構造を形成する。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティの一部分は、ステムループを含まない二次構造を形成する。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティの一部分は、線形部分を含む二次構造を形成する。いくつかの場合において、ＲＮＡ編集エンティティの一部分は、十字型又はその一部分を含む二次構造を形成する。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡの編集は、遺伝子発現に影響を及ぼす。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、不安定化する。いくつかの実施形態において、遺伝子は、発現されない。いくつかの実施形態において、選択的スプライシングが影響を受ける。いくつかの実施形態において、遺伝子の異なるアイソフォームが発現される。
標的配列に対するＡＤＡＲタンパク質の動員は、操作されたポリヌクレオチド及び標的配列で構成されるＲＮＡ二本鎖を接触させることを伴っていてもよく、標的配列は、標的化配列に対して１００％相補的ではなく、したがって、少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、標的化配列は、プレｍＲＮＡに結合するとき、プレｍＲＮＡに対して相補的ではない少なくとも１つのヌクレオチドを含み、バルジを生成する。いくつかの実施形態において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５個のヌクレオチドは、プレｍＲＮＡに対して相補的ではなく、バルジを生成する。
ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドは、デアミナーゼ存在下でプレｍＲＮＡと会合したときに、プレｍＲＮＡにおいて編集を促進し、それによってデアミナーゼ動員ドメインを形成するように構成され得る。いくつかの場合において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンを有する本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡとのデアミナーゼの親和性を改善することができる非相補的ヌクレオチドを含み得る。デアミナーゼは、プレｍＲＮＡのポリヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にすることができる。いくつかの場合において、プレｍＲＮＡに対して相補的ではない少なくとも１つのヌクレオチドによって生成される少なくとも１つのミスマッチは、デアミナーゼと少なくとも部分的に会合する。
いくつかの実施形態において、デアミナーゼ動員ドメインは、少なくとも１つのステムループを含み得る。ステムループは、右巻き又は左巻きのステムループのいずれかであり得る。ステムループは、ＧｌｕＲ２ドメインに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を含み得る。
プレｍＲＮＡを標的化する領域内のプレｍＲＮＡに対する１つの非相補的ヌクレオチドは、標的化配列のいずれかの末端から４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５塩基に位置する。
編集は、プレｍＲＮＡ内で生じるように構成され得る。編集は、イントロン又はエクソン内で生じるように構成され得る。編集は、スプライスシグナル内で生じるように構成される。編集は、非翻訳領域中で生じるように構成され得る。編集は、エクソンのスキッピングを促進するように構成され得る。
操作されたポリヌクレオチドによるＲＮＡ編集の活性は、所望の活性の成功を決定するために測定することができる。いくつかの実施形態において、所望の活性は、エクソンスキッピングである。
ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン、又はそのバリアント）を有する操作されたポリヌクレオチドの編集効率は、インビトロアッセイ、例えば、液滴デジタルＰＣＲドロップオフアッセイによって測定し、参照試料と比較して、編集（複数の配列挿入、欠失又は変異）を検出することができる。このアッセイにおいて、試料中の変異ホットスポットを評価するために、少なくとも２つのプローブが使用される。プローブは、変異ホットスポットに対して少なくとも部分的に相補的である。フルオロフォアコンジュゲート化ドロップオフプローブは、編集されていない標的配列にアニーリングするが、塩基編集された標的配列にはアニーリングしないように設計することができる。異なるフルオロフォアにコンジュゲート化された第２の参照プローブは、ドロップオフプローブ標的配列の次にアニーリングし、編集に関係なく標的転写産物を検出するように設計することができる。両方のプローブに隣接するプライマーは、液滴デジタルＰＣＲ反応において標的転写産物を増幅する。次いで、編集率は、ドロップオフプローブについて陰性であるが、参照プローブについて陽性の全転写産物と比較して、参照プローブについて陽性の転写産物として報告することができる。
エクソンスキッピング
いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングを引き起こすＲＮＡ編集（例えば、ＡＤＡＲによる）を容易にする。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ｓｎＲＮＡ要素及び／又はミスマッチを含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンは、その機能を変更する変異を含有し得る。操作されたポリヌクレオチドは、インビトロで測定される場合、ｓｎＲＮＡ要素及び／又はミスマッチを含有しないポリヌクレオチド構築物と比較して、エクソンスキッピングを改善することができる。エクソンスキッピングの効率は、定量的ＰＣＲ、液滴デジタルＰＣＲ、又はＲＮＡ配列決定によって測定することができる。
操作されたポリヌクレオチドのエクソンスキッピング効率は、インビトロアッセイ、例えば、定量的ＰＣＲアッセイ又は液滴デジタルＰＣＲアッセイによって測定し、スキッピングされていない転写産物の割合に対して、エクソンスキッピングされた転写産物の割合を検出することができる。このアッセイにおいて、少なくとも２つのフルオロフォアコンジュゲート化プローブを使用し、１つは、エクソンスキッピングされた転写産物に特異的にアニーリングし、別のものは、スキッピングされていない転写産物に特異的にアニーリングする。ｄｄＰＣＲ増幅を行った。
本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ｄｄＰＣＲによって測定される場合、エクソンスキッピングの効率を少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は最大１００％増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を約１％～約５０％増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を少なくとも約１％増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を最大で約５０％増加させることができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、エクソンスキッピングの効率を約１％～約５％、約１％～約１０％、約１％～約２０％、約１％～約３０％、約１％～約４０％、約１％～約５０％、約５％～約１０％、約５％～約２０％、約５％～約３０％、約５％～約４０％、約５％～約５０％、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、又は約４０％～約５０％増加させることができる。
治療用途
ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドを治療薬として使用することができる。一態様において、本明細書では、状態を治療又は予防する方法であって、ＲＮＡの編集を容易にする治療薬を投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態において、ＲＮＡの編集は、変異の修正を容易にし得る。変異は、ミスセンス変異又はナンセンス変異であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ編集は、目的の標的ＲＮＡに変異を導入することを伴っていてもよい。いくつかの実施形態において、本開示のガイドは、標的ＲＮＡの複数のＲＮＡ編集を容易にする。
ＡＰＰ。いくつかの実施形態において、本開示は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＲＮＡ編集を容易にすることができる、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。例えば、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡは、ＡＰＰ中の切断部位の編集を容易にすることができ、その結果、ベータ／ガンマセクレターゼは、ＡＰＰの切断の低減を示すか、又はもはやＡＰＰを切断することができず、したがって、Ａｂｅｔａ ４０／４２のレベルが低減するか、又はＡｂｅｔａを産生することができない。いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集のためのＡＰＰにおける以下の部位のうちのいずれか１つ、又は任意の組み合わせを標的とし得る。Ｋ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ａ６７３Ｖ、Ａ６７３Ｔ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、又はＫ６８７Ｇ、Ｉ７１２Ｘ、又はＴ７１４Ｘ。ＡＰＰ中の部位を標的とする、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する上述のガイドＲＮＡは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つの配列を有し得る。本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、又はＵ７）は、上述のガイドＲＮＡの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され（例えば、コードされ、ＡＡＶを介して送達され）てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルツハイマー病を発症するリスクがあってもよく、又はアルツハイマー病を発症している。対象は、ヒトであってもよく、ＡＰＰが疾患の病態に影響を及ぼす神経性疾患を発症するリスクがあってもよく、又はその神経性疾患を発症している。したがって、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡを、神経性疾患（例えば、アルツハイマー病）の治療方法で使用してもよい。
アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）
アルファ－シヌクレイン遺伝子は、５個のエクソンで構成され、予測分子量が約１４．５ｋＤａの１４０アミノ酸タンパク質をコードする。コードされた産物は、機能が未知の本質的に無秩序なタンパク質である。通常、アルファ－シヌクレインは、単量体である。特定のストレス条件又は他の未知の原因の下で、α－シヌクレインは、自己凝集してオリゴマーになる。レビー小体に関連する病態（ＬＲＰ）は、主に、解剖学的に確認されたアルツハイマー病患者の脳の５０％より多くにおけるアルファ－シヌクレインで構成されていた。アルファ－シヌクレインがアルツハイマー病の発症にどのように影響を与えるかの分子機構は不明であるが、実験的証拠は、アルファ－シヌクレインが、Ｔａｕ－ｐと相互作用し、Ｔａｕ－ｐの細胞内凝集の種となり得ることを示している。更に、アルファ－シヌクレインは、Ｔａｕ高リン酸化を媒介することができる、ＧＳＫ３βの活性を調節することができる。アルファ－シヌクレインは、自己組織化して、病原性凝集体（レビー体）ともなり得る。Ｔａｕ及びα－シヌクレインの両方が、細胞外空間に放出され、他の細胞に拡散され得る。血管異常は、栄養素の共有及び代謝副産物の除去を損ない、微小梗塞を引き起こし、グリア細胞の活性化を促進する。したがって、Ｔａｕ形成、アルファ－シヌクレイン形成、又はこれらの組み合わせを実質的に低減するための多重戦略は、神経変性疾患を効果的に治療する際に重要であり得る。
アルファ－シヌクレインのドメイン構造は、Ｎ末端Ａ２脂質結合アルファらせんドメインと、非アミロイドβ構成要素（ＮＡＣ）ドメインと、Ｃ末端酸性ドメインと、を含む。脂質結合ドメインは、５つのＫＸＫＥＧＶ不完全リピートからなる。ＮＡＣドメインは、ＶＧＧＡＶＶＴＧＶコンセンサス配列及び３つのＧＸＸＸサブモチーフを有するＧＡＶモチーフからなり、Ｘは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、又はＭｅｔのうちのいずれかである。Ｃ末端酸性ドメインは、ＤＰＤＮＥＡコンセンサス配列を有する銅結合モチーフを含有する。分子学的には、アルファ－シヌクレインは、ニューロン伝達及びＤＮＡ修復において役割を果たすことが示唆されている。
いくつかの場合において、本明細書で提供される組成物を利用して、アルファ－シヌクレインの領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、ノックダウンのために本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを用い、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡの領域を標的とすることができる。いくつかの場合において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡのエクソン又はイントロンの領域を標的とすることができる。いくつかの実施形態において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡの非コード配列の領域（例えば、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ）を標的とすることができる。他の場合において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡのコード配列の領域を標的とすることができる。好適な領域としては、限定されないが、Ｎ末端Ａ２脂質結合アルファらせんドメイン、非アミロイドβ構成要素（ＮＡＣ）ドメイン、又はＣ末端酸性ドメインが挙げられる。
いくつかの態様において、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡ配列が標的とされる。いくつかの場合において、配列の３，１７７残基のうちのいずれか１つは、本明細書で提供される組成物及び方法を利用して標的とされ得る。いくつかの場合において、標的残基は、残基１～１００、１０１～２００、２０１～３００、３０１～４００、４０１～５００、５０１～６００、６０１～７００、７０１～８００、８０１～９００、９０１～１０００、１００１～１１００、１１０１～１２００、１２０１～１３００、１３０１～１４００、１４０１～１５００、１５０１～１６００、１６０１～１７００、１７０１～１８００、１８０１～１９００、１９０１～２０００、２００１～２１００、２１０１～２２００、２２０１～２３００、２３０１～２４００、２４０１～２５００、２５０１～２６００、２６０１～２７００、２７０１～２８００、２８０１～２９００、２９０１～３０００、３００１～３１００、及び／又は３１０１～３１７７の中に位置し得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＳＮＣＡのＲＮＡ編集を容易にすることができる、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡの発現を、例えばＳＮＣＡ遺伝子の３’ＵＴＲでの編集を容易にすることによって、ノックダウンすることができる。ＳＮＣＡ中の部位を標的とする、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する上述のガイドＲＮＡは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つの配列を有し得る。ＳＮＣＡ遺伝子を標的とするために使用され得る操作されたポリヌクレオチドの例示的な配列としては、配列番号７、及び配列番号８が挙げられ、一方で、ＳＮＣＡ遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号１７が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、又はＵ７）は、上述のガイドＲＮＡの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され（例えば、コードされ、ＡＡＶを介して送達され）てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルツハイマー病又はパーキンソン病を発症するリスクがあってもよく、又はアルツハイマー病又はパーキンソン病を発症している。対象は、ヒトであってもよく、ＳＮＣＡの過剰発現が疾患の病態に影響を及ぼす神経性疾患を発症するリスクがあってもよく、又はその神経性疾患を発症している。したがって、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡを、神経性疾患（例えば、アルツハイマー病）の治療方法で使用してもよい。
ＳＥＲＰＩＮＡ１。いくつかの実施形態において、本開示は、セルピンファミリーＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）のＲＮＡ編集を容易にすることができる、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。例えば、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のヌクレオチド位置９９８９でＧからＡへの変異の修正を容易にし得る。いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡは、例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＥ３４２を標的とし得る。ＳＥＲＰＩＮＡ１中の部位を標的とする、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する上述のガイドＲＮＡは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つの配列を有し得る。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号２６又は配列番号２７が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、又はＵ７）は、上述のガイドＲＮＡの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され（例えば、コードされ、ＡＡＶを介して送達され）てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を発症するリスクがあってもよく、又はアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症を発症している。このようなアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＳＥＲＰＩＮＡ１における編集を容易にし、したがって、ＳＥＲＰＩＮＡ１における変異を修正し、対象におけるアルファ－１－アンチトリプシン欠乏症の発生を低減することができる。したがって、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡを、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症の治療方法で使用してもよい。
ＡＢＣＡ４。いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）のＲＮＡ編集を容易にすることができる、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。例えば、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡは、ＡＢＣＡ４遺伝子のヌクレオチド位置５７１４、５８８２、又は６３２０でＧからＡへの変異の修正を容易にし得る。ＡＢＣＡ４中の部位を標的とする、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する上述のガイドＲＮＡは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つの配列を有し得る。ＡＢＣＡ４遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、又はＵ７）は、上述のガイドＲＮＡの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され（例えば、コードされ、ＡＡＶを介して送達され）てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、スターガルト黄斑変性（又はスターガルト病）を発症するリスクがあってもよく、又はそれを発症している。このようなスターガルト黄斑変性は、ＡＢＣＡ４の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＡＢＣＡ４における編集を容易にし、したがって、ＡＢＣＡ４における変異を修正し、対象におけるスターガルト黄斑変性の発生を低減することができる。したがって、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡを、スターガルト黄斑変性の治療方法で使用してもよい。
ＬＲＲＫ２。ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）は、パーキンソン病、及びクローン病等の免疫関連障害の家族性及び孤発性の症例と関連がある。その別名には、ＬＲＲＫ２、ＡＵＲＡ１７、ＤＡＲＤＡＲＩＮ、ＰＡＲＫ８、ＲＩＰＫ７、ＲＯＣＯ２、又はロイシンリッチリピートキナーゼ２が含まれる。ＬＲＲＫ２遺伝子は、５１個のエクソンで構成され、予測分子量が約２８６ｋＤａの２５２７アミノ酸タンパク質をコードする。コードされた産物は、キナーゼ及びＧＴＰアーゼ活性を有するマルチドメインタンパク質である。ＬＲＲＫ２は、限定されないが、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸、十二指腸、子宮内膜、食道、脂肪、胆嚢、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣、甲状腺、及び膀胱を含む様々な組織及び臓器において見出され得る。ＬＲＲＫ２は、普遍的に発現可能であるが、一般的に、脳、腎臓、及び肺組織中により豊富に存在する。細胞学的に、ＬＲＲＫ２は、アストロサイト、内皮細胞、ミクログリア、ニューロン、及び末梢免疫細胞において見出されている。
ＬＲＲＫ２には１００を超える変異が特定されており、そのうちの６つ（Ｇ２０１９Ｓ、Ｒ１４４１Ｃ／Ｇ／Ｈ、Ｙ１６９９Ｃ、及びＩ２０２０Ｔ）は、分離分析によって、パーキンソン病を引き起こすことが示されている。Ｇ２０１９Ｓ及びＲ１４４１Ｃは、遺伝性の症例において、最も一般的な疾患を引き起こす変異である。孤発性の症例において、これらの変異は、年齢依存性の浸透率を示している。疾患を発症するＧ２０１９Ｓ変異を保有する個人の割合は、年齢が５０歳から７０歳まで増加すると、１７％から８５％まで跳ね上がる。いくつかの場合において、変異を保有する個人は、疾患を発症することはない。
ＬＲＲＫ２は、その触媒コアに、複合タンパク質（Ｒｏｃ）のＲａｓ、ＲＯＣのＣ末端（ＣＯＲ）、及びキナーゼドメインを含有する。このコアに隣接する複数のタンパク質－タンパク質相互作用ドメインである、アルマジロ反復（ＡＲＭ）領域、アンキリン反復（ＡＮＫ）領域、ロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）ドメインは、Ｃ末端ＷＤ４０ドメインによって接合されたＮ末端に見出される。Ｇ２０１９Ｓ変異は、キナーゼドメイン内に位置する。それがキナーゼ活性を増加させることが示されている。Ｒ１４４１Ｃ／Ｇ／Ｈ及びＹ１６９９Ｃについて、これらの変異はＲｏｃドメインのＧＴＰａｓｅ活性を低下させ得る。ゲノムワイド関連研究は、ＬＲＲＫ２における共通の変動が、孤発性パーキンソン病を発症するリスクを増加させることを発見した。これらの変動のいくつかは、タンパク質の結合又は触媒活性に影響を与える非保存的変異であるが、その他は、その発現を調節する。これらの結果は、特定の対立遺伝子又はハプロタイプが、ＬＲＲＫ２発現を調節することができることを示唆している。
炎症促進シグナルは、様々な免疫細胞型においてＬＲＲＫ２発現を上方調節し、このことは、ＬＲＲＫ２が、免疫応答における重要な調節因子であることを示唆している。研究から、全身及び中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症が両方とも、パーキンソン病の症状に関与することを発見した。更に、パーキンソン病に関連するＬＲＲＫ２変異は、炎症性刺激に応答して、その発現レベルを調節する。ＬＲＲＫ２の多くの変異は、炎症性腸疾患（例えばクローン病）等の免疫関連障害と関連している。例えば、Ｇ２０１９Ｓ及びＮ２０８１Ｄは両方とも、ＬＲＲＫ２のキナーゼ活性を増加させ、特定の集団内のクローン病患者において過剰に表される。これらの障害におけるその重要な役割のため、ＬＲＲＫ２は、パーキンソン病及びクローン病の重要な治療標的である。特に、Ｇ２０１９Ｓを含む点変異等の多くの変異は、これらの疾患の発症において役割を果たし、ＬＲＲＫ２を、ＲＮＡ編集等の治療戦略にとって魅力的なものとする。
いくつかの実施形態において、本開示は、ＬＲＲＫ２のＲＮＡ編集を容易にすることができる、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡの組成物、及びそれを使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡは、ＬＲＲＫ２における以下の変異を標的とし得る。Ｅ１０Ｌ、Ａ３０Ｐ、Ｓ５２Ｆ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｌ１１９Ｐ、Ａ２１１Ｖ、Ｃ２２８Ｓ、Ｅ３３４Ｋ、Ｎ３６３Ｓ、Ｖ３６６Ｍ、Ａ４１９Ｖ、Ｒ５０６Ｑ、Ｎ５４４Ｅ、Ｎ５５１Ｋ、Ａ７１６Ｖ、Ｍ７１２Ｖ、Ｉ７２３Ｖ、Ｐ７５５Ｌ、Ｒ７９３Ｍ、Ｉ８１０Ｖ、Ｋ８７１Ｅ、Ｑ９２３Ｈ、Ｑ９３０Ｒ、Ｒ１０６７Ｑ、Ｓ１０９６Ｃ、Ｑ１１１１Ｈ、Ｉ１１２２Ｖ、Ａ１１５１Ｔ、Ｌ１１６５Ｐ、Ｉ１１９２Ｖ、Ｈ１２１６Ｒ、Ｓ１２２８Ｔ、Ｐ１２６２Ａ、Ｒ１３２５Ｑ、Ｉ１３７１Ｖ、Ｒ１３９８Ｈ、Ｔ１４１０Ｍ、Ｄ１４２０Ｎ、Ｒ１４４１Ｇ、Ｒ１４４１Ｈ、Ａ１４４２Ｐ、Ｐ１４４６Ｌ、Ｖ１４５０Ｉ、Ｋ１４６８Ｅ、Ｒ１４８３Ｑ、Ｒ１５１４Ｑ、Ｐ１５４２Ｓ、Ｖ１６１３Ａ、Ｒ１６２８Ｐ、Ｍ１６４６Ｔ、Ｓ１６４７Ｔ、Ｙ１６９９Ｃ、Ｒ１７２８Ｈ、Ｒ１７２８Ｌ、Ｌ１７９５Ｆ、Ｍ１８６９Ｖ、Ｍ１８６９Ｔ、Ｌ１８７０Ｆ、Ｅ１８７４Ｘ、Ｒ１９４１Ｈ、Ｙ２００６Ｈ、Ｉ２０１２Ｔ、Ｇ２０１９Ｓ、Ｉ２０２０Ｔ、Ｔ２０３１Ｓ、Ｎ２０８１Ｄ、Ｔ２１４１Ｍ、Ｒ２１４３Ｈ、Ｙ２１８９Ｃ、Ｔ２３５６Ｉ、Ｇ２３８５Ｒ、Ｖ２３９０Ｍ、Ｅ２３９５Ｋ、Ｍ２３９７Ｔ、Ｌ２４６６Ｈ、又はＱ２４９０ＮｆｓＸ３。ＬＲＲＫ２中の部位を標的とする、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する上述のガイドＲＮＡは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つの配列を有し得る。ＬＲＲＫ２遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号１８及び配列番号１９が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、又はＵ７）は、上述のガイドＲＮＡの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され（例えば、コードされ、ＡＡＶを介して送達され）てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、ＬＲＲＫ２中の変異に関連する疾患又は状態（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）又は胃腸（ＧＩ）管の疾患）を発症するリスクがあってもよく、又はそれを発症している。例えば、このような状態の疾患としては、クローン病又はパーキンソン病が挙げられる。このようなＣＮＳ又はＧＩ管疾患（例えば、クローン病又はパーキンソン病）は、ＬＲＲＫ２の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＬＲＲＫ２における編集を容易にし、したがって、ＬＲＲＫ２における変異を修正し、対象におけるＣＮＳ又はＧＩ管疾患の発生を低減することができる。したがって、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡを、クローン病又はパーキンソン病等の疾患の治療方法で使用してもよい。
ＤＭＤ。いくつかの実施形態において、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）遺伝子のＲＮＡ編集を容易にすることができる、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有するガイドＲＮＡの組成物、及びそれを使用する方法を提供する）。いくつかの実施形態において、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡは、ジストロフィンタンパク質を少なくとも部分的にコードするＤＭＤ遺伝子プレｍＲＮＡ中のエクソン５１、４５、５３、４４、４６、５２、５０、４３、６、７、８、５５、２、１１、１７、１９、２１、５７、５９、６２、６３、６５、６６、６９、７４、及び／又は７５等のＤＭＤ遺伝子のエクソンを標的とし得る。ＤＭＤ遺伝子中の部位を標的とする、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する上述のガイドＲＮＡは、本開示の操作されたポリヌクレオチド構築物によってコードされ得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。上述のガイドＲＮＡ中のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピンの配列は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つの配列を有し得る。ＤＭＤ遺伝子を標的とし得る例示的な標的化配列としては、配列番号１３及び配列番号１４が挙げられる。本明細書に開示される任意のプロモーター（例えば、Ｕ１、Ｕ６、又はＵ７）は、上述のガイドＲＮＡの発現を駆動するように組み込まれ得る。上述の操作されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるウイルスベクターによって送達され（例えば、コードされ、ＡＡＶを介して送達され）てもよく、それを必要とする対象に、本明細書に開示される任意の投与経路によって投与され得る。対象は、ヒトであってもよく、ＤＭＤ遺伝子中の変異に関連する疾患又は状態（例えばＤＭＤ）を発症するリスクがあってもよく、又はその神経性疾患を発症している。ＤＭＤは、ＤＭＤ遺伝子の変異によって少なくとも部分的に引き起こされる可能性があり、このために、本明細書に記載の操作されたポリヌクレオチド配列は、ＤＭＤ遺伝子における編集を容易にし、したがって、ＤＭＤ遺伝子における変異を修正し、対象におけるＤＭＤの発生を低減することができる。したがって、ｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピン）を有する本開示のガイドＲＮＡを、ＤＭＤ等の疾患の治療方法で使用してもよい。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、変異が、挿入、欠失、ミスセンス、又はナンセンス変異である変異を有するエクソンを標的とし得る。変異は、本明細書に記載される任意の標的をコードする遺伝子中に存在し得る。編集されたＲＮＡは、編集されたスプライスシグナルを含み、改善されたポリヌクレオチド構築物を用いない治療と比較して、エクソンスキッピングを増加させる。本明細書の別の態様において、治療薬を投与することを含む、ある状態を治療又は予防する方法は、本明細書に記載の標的を少なくとも部分的にコードするＲＮＡの編集を増強する、ｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、本開示のＵ７ヘアピン）、ｓｎＲＮＡ配列（例えば、本開示のＳｍＯＰＴ配列）、又は両方を更に含み、編集されたＲＮＡは、編集されたスプライスシグナルを含み、ヘアピンを含まない同等のアンチセンスエクソンスキッピング構築物による治療と比較して、エクソンスキッピングを増加させる。
方法は、ある疾患に関与するポリペプチドの少なくとも一部分をコードする、標的配列を編集するための操作されたポリヌクレオチドの使用を含み得る。疾患としては、限定されないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、パーキンソン病、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。いくつかの場合において、疾患又は状態は、ＡＢＣＡ４、ＡＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、ＲＡＢ７Ａ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードするＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子中の変異に関連する。いくつかの例において、ＡＢＣＡ４、ＡＡＴ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＧＢＡ、ＰＩＮＫ１、ＲＡＢ７Ａ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせをコードする変異したＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質は、ある疾患の病因又は進行に少なくとも部分的に寄与する。いくつかの例において、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子中の変異は、それ以外は同一の参照ＤＮＡ又はＲＮＡ分子に対するものである。
多重化
いくつかの場合において、本開示は、複数の標的ＲＮＡの標的化された多重編集、標的ＲＮＡ内の複数の標的部位の標的化された編集、ＲＮＡの標的化された編集及びノックダウン、又はこれらの任意の組み合わせを含む、多重化された療法を包含する。したがって、本明細書に記載のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ及びＵ７）を有する操作されたポリヌクレオチドを多重化し、多重療法を行うことができる。１つより覆い標的ＲＮＡを同時に標的化することが重要な場合があり、ＴａｕノックダウンとＡＰＰにおける切断部位（例えば、β切断部位）の編集との組み合わせが相乗的に機能する場合がある。いくつかの場合において、（切断部位を単に編集するのではなく）ＡＰＰの発現をノックダウンするためのｍＲＮＡ塩基編集の使用は、Ａｂｅｔａ生成を減少させるための別のアプローチであり得る。組成物を、遺伝子発現ノックダウンに適用することができるため、それらはまた、発現を低減するための開始部位編集、ガイドがリボソーム活性をブロックすることができることからの立体障害、標的化されたｍＲＮＡの分解の増加の組み合わせ、又はこれらの任意の組み合わせも含み得る。したがって、本明細書に開示される組成物及び方法は、ＡＤＡＲ依存性及びＡＤＡＲ非依存性の様式で発現を抑制し得る。
複数のペイロードの送達
いくつかの実施形態において、本開示のベクターは、複数の標的ＲＮＡを標的とする、本明細書に記載のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ及びＵ７）を有する操作されたガイドポリヌクレオチドの複数のコピーを含有し得るベクターであってもよい。例えば、ベクターは、本明細書に記載のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ及びＵ７）を有する操作されたポリヌクレオチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のコピーを含有し得る。いくつかの場合において、ベクターは、全てが同じである本明細書に記載のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ及びＵ７）を有する操作されたポリヌクレオチドのコピーを含有し得る。いくつかの場合において、ベクターは、異なる本明細書に記載のｓｎＲＮＡ配列及びｓｎＲＮＡヘアピン（例えば、ＳｍＯＰＴ及びＵ７）を有する操作されたポリヌクレオチドのコピーを含有し得る。このようなベクターは、複数のコピーが本明細書に記載の単一プロモーターに対して多シストロン性に作動可能に連結されるように構築され得る。いくつかの場合において、複数のコピーは、独立して本明細書に記載のプロモーターに連結され得る。
ベクター
本開示はまた、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクターを提供する。
本明細書で提供される組成物は、任意の好適な手段によって送達され得る。いくつかの場合において、好適な手段は、ベクターを含む。限定されないが、プラスミドベクター、ミニサークルベクター、線状ＤＮＡベクター、ドギーボーンベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、細胞外小胞、ナノメッシュ、それらの修飾された態様、それらの良好な製造慣行態様、それらのキメラ、並びにこれらの任意の組み合わせを含む、任意のベクター系を使用し、利用することができる。いくつかの場合において、ベクターを使用して、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを導入することができる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるＲＮＡの領域に対してハイブリダイズする標的化配列を含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子ベクターは、ポリマー系ナノ粒子、アミノ脂質系ナノ粒子、金属ナノ粒子（例えば、金系ナノ粒子）、これらのうちのいずれかの一部分、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書で提供されるベクターを使用して、本明細書で提供されるポリヌクレオチド組成物を送達することができる。いくつかの場合において、少なくとも約２、３、４、又は最大５つの異なるポリヌクレオチドが、単一ベクターを使用して送達される。いくつかの場合において、複数のベクターが送達される。いくつかの場合において、複数のベクター送達は、同時又は連続的であり得る。いくつかの場合において、少なくとも２つの操作されたポリヌクレオチドが、単一ベクターにおいて送達される。他の場合において、少なくとも２つの操作されたポリヌクレオチドが、別個のベクターで送達される。操作されたポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドとして送達されてもよい。ベクター及び／又は非ベクターアプローチの任意の組み合わせを行ってもよい。
ベクターを使用して、核酸を送達することができる。ベクターは、二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ等のＤＮＡを含み得る。ベクターは、ＲＮＡを含み得る。いくつかの場合において、ＲＮＡは、塩基修飾を含み得る。ベクターは、組換えベクターを含み得る。ベクターは、天然に存在するベクターから修飾されるベクターであり得る。ベクターは、天然に存在しないベクターの少なくとも一部分を含み得る。任意のベクターを利用することができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、これらのうちのいずれかの一部、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、ベクターは、ＡＡＶベクターを含み得る。ベクターは、修飾されたＶＰ１タンパク質を含むように修飾され得る（例えば、ＶＰ１タンパク質を含むように修飾されたＡＡＶベクター）。ある態様において、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）で見られるのと実質的に類似したカプシド配列及び構造で構成され得る。しかしながら、ｒＡＡＶは、ＡＡＶタンパク質コード配列を実質的に有さず、それらの代わりに設計された対象ポリヌクレオチド等の治療用遺伝子発現カセットを有するゲノムを封入する。いくつかの場合において、ウイルス起源の配列は、ＩＴＲであってもよく、ベクター産生中のゲノム複製及びパッケージングを導くことが必要な場合がある。好適なＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型、又は血清型の組み合わせから選択することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はこれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つであり得る。いくつかの場合において、ベクターは、その天然の向性に基づいて選択される。いくつかの場合において、ベクター血清型は、血液脳関門を通過するその能力に基づいて選択される。ＡＡＶ９及びＡＡＶ１０は、血液脳関門を通過して、ニューロン及びグリアを形質導入することが示されている。ある態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９である。いくつかの場合において、ＡＡＶベクターは、少なくとも２つの血清型のキメラである。ある態様において、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ９のベクターである。いくつかの場合において、キメラＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のｒｅｐ及びＩＴＲ配列と、ＡＡＶ５由来のｃａｐ配列と、を含む。いくつかの場合において、ｒｅｐ、ｃａｐ、及びＩＴＲ配列を混合し、本明細書で提供される異なるＡＡＶ血清型の全てからマッチングすることができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであり、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、それらの一部分、それらの融合産物、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される血清型のものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のｒｅｐ及びＩＴＲ配列と、ＡＡＶ５由来のｃａｐ配列と、を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、自己相補的ＩＴＲであるＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたポリヌクレオチドをコードするＡＡＶベクターは、自己相補的である。
いくつかの場合において、好適なＡＡＶベクターは、カプシド又はｒｅｐタンパク質等の修飾を包含するように更に修飾され得る。修飾には、欠失、挿入、変異、及びこれらの組み合わせも含まれ得る。いくつかの場合において、ベクターに対する修飾が行われ、反復投与を可能にするために、免疫原性を低減する。いくつかの場合において、免疫原性を低減及び／又は除外するために反復投与が実施されるときに、利用されるベクターの血清型が変化する。
レトロウイルスベクターは、真核細胞へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入を媒介する薬剤として有用である。レトロウイルスベクターは、一般的に、ウイルスの構造遺伝子をコードする配列の大部分が欠失し、目的の遺伝子によって置き換えられるように構築される。ほとんどの場合、構造遺伝子（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）は、当該技術分野において既知の遺伝子操作技術を使用して、レトロウイルス骨格から除去される。これには、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化、又はいくつかの場合において、Ｂａｌ ３１エクソヌクレアーゼによる消化が含まれ、パッケージングシグナルの適切な部分を含有する断片を生成し得る。
これらの新しい遺伝子は、いくつかの一般的な方法でプロウイルス骨格に組み込まれている。最も単純な構築は、レトロウイルスの構造遺伝子が単一遺伝子によって置き換えられ、その後、長い末端反復（ＬＴＲ）内のウイルス調節配列の制御下で転写されるものである。レトロウイルスベクターも構築されており、１つより多い遺伝子を標的細胞に導入することができる。通常、そのようなベクターにおいて、１つの遺伝子がウイルスＬＴＲの調節制御下にあり、一方で、第２の遺伝子は、スプライシングされたメッセージから外れて発現されるか、又は独自の内部プロモーターの調節下にある。
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、２５ｎｍのカプシドを有する小さなノンエンベロープウイルスである。野生型ウイルスに関連することが知られているか、又は既に示されている疾患は存在しない。ＡＡＶは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する。ＡＡＶは、長期間のエピソーム導入遺伝子発現を示すことが示されており、ＡＡＶは、脳、特にニューロンにおいて優れた導入遺伝子発現を示している。わずか３００塩基対のＡＡＶを含有するベクターをパッケージングすることができ、統合することができる。外因性ＤＮＡのための空間は、約４．７ｋｂに制限される。ＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞に導入することができる。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入されてきた。多くの代替的ＡＡＶバリアントが存在し（１００を超えるものがクローニングされている）、ＡＡＶバリアントは、所望の特徴に基づいて特定されている。例えば、ＡＡＶ９は、血液脳関門を効率的に通過することが示されている。更に、ＡＡＶカプシドは、形質導入効率及び選択性を増加させるように遺伝的に操作することができる（例えば、ビオチン化ＡＡＶベクター、指向性の分子進化、自己相補的ＡＡＶゲノム等）。祖先配列に基づくＡＡＶを含め、修飾されたＡＡＶも記載されている。記載されている他の修飾されたＡＡＶとしては、埋め込まれたアンチセンスオリゴヌクレオチドを有する酸不安定性ポリマーの層によって囲まれている導入遺伝子を発現するＡＡＶコアを有するキメラナノ粒子（ＣｈＮＰ）が挙げられる。本明細書に開示される組成物及び方法は、プラットフォーム技術であり、したがって、本明細書に開示される組成物及び方法は、ＣｈＮＰ等の文献に記載される修飾されたＡＡＶを含む、全ての既知のＡＡＶとともに使用することができる。
別の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス由来のベクターである。アデノウイルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコードし、発現するが、正常な溶解性ウイルスライフサイクルで複製する能力の観点では不活性化されるように、操作することができる。アデノウイルス株Ａｄ型５ ｄｌ３２４又はアデノウイルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、若しくはＡｄ７等）に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者に既知である。組換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができず、上皮細胞を含む多種多様な細胞型に感染するために使用することができるという点で、特定の状況において有利であり得る。更に、ウイルス粒子は、比較的安定しており、精製及び濃縮に適しており、上述のように、感染性のスペクトルに影響を及ぼすように修飾することができる。加えて、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びそれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、エピソームのままであり、それによって、系中での挿入突然変異の結果として生じ得る潜在的な問題を回避し、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれるようになる（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）。更に、外来ＤＮＡについてのアデノウイルスゲノムの保有能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して、大きい（最大８キロ塩基）。アルファウイルスも使用することができる。アルファウイルスは、広範な宿主範囲を有するエンベロープ一本鎖ＲＮＡウイルスであり、ウイルス遺伝子療法プロトコルで使用される場合、アルファウイルスは、高レベルの一過性の遺伝子発現を提供することができる。例示的なアルファウイルスとしては、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、及びベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスが挙げられ、これらは全て、効率的な複製欠損及び複製能力のある発現ベクターを提供するように遺伝子操作されている。アルファウイルスは、顕著な神経向性を示すため、ＣＮＳ関連疾患に有用である。
ベクターを使用して、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドと、治療標的を標的とする追加のポリヌクレオチド（例えば、第２のポリヌクレオチド）とを送達することができる。いくつかの場合において、ベクターは、第２のポリヌクレオチド（例えば、追加の治療標的）と会合する追加のＲＮＡポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする。このようなベクターを使用して、複数の治療標的を同時に標的とする多重療法、例えば、アルツハイマー病及び他の神経変性疾患の場合には、アミロイド前駆体タンパク質、及びＴａｕタンパク質等の疾患に関与する追加の標的（例えば、ＭＡＰＴ遺伝子からコードされる微小管関連タンパク質Ｔａｕ（ＭＡＰＴ）、又はアルファ－シヌクレインタンパク質を送達することができる。代替的に、又はこれに加えて、追加の標的は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド上（例えば、同じポリヌクレオチド上）の更なる編集部位であり得る。操作されたポリヌクレオチドをコードするベクターポリヌクレオチド、及び追加のＲＮＡポリヌクレオチドをコードする第２のベクターポリヌクレオチドは、連続していてもよく、又は連続していなくてもよい。第１及び第２のベクターポリヌクレオチドが互いに連続している場合、それらは同じプロモーター配列に作動可能に連結され得る。
非ウイルスベクターアプローチ
いくつかの場合において、ベクターは、ウイルスベクターでなくてもよい。非ウイルス方法は、ポリヌクレオチドを含む組成物等の裸の送達を含み得る。いくつかの場合において、本明細書で提供される修飾をポリヌクレオチドに組み込み、裸のポリヌクレオチドとして送達される場合に、安定性を増加させ、分解と戦うことができる。他の場合において、非ウイルスアプローチは、ナノ粒子、リポソーム等の使用を利用することができる。
薬学的組成物
組成物は、本明細書に記載の任意の編集エンティティを含み得る。薬学的組成物は、第１の活性成分を含み得る。第１の活性成分は、本明細書に記載のウイルスベクター、本明細書に記載の天然に存在しないＲＮＡ、又は本明細書に記載の核酸を含み得る。薬学的組成物は、単位剤形で製剤化され得る。薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を含み得る。薬学的組成物は、例えば、疾患又は状態に関与する遺伝子のエクソンスキッピングの増強を容易にする等のために、第２、第３、又は第４の活性成分を含み得る。
本明細書に記載の組成物は、賦形剤を損ない得る。賦形剤は、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、又はこれらの任意の組み合わせ等の凍結保存剤を含み得る。賦形剤は、スクロース、トレハロース、デンプン、これらのいずれかの塩、これらのいずれかの誘導体、又はこれらの任意の組み合わせ等の凍結保存剤を含み得る。賦形剤は、ｐＨ剤（組成物の構成要素の酸化若しくは分解を最小限に抑えるため）、安定化剤（組成物の構成要素の修飾若しくは分解を防止するため）、緩衝剤（温度安定性を増強するため）、可溶化剤（タンパク質溶解性を増加させるため）、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、界面活性剤、糖、アミノ酸、抗酸化剤、塩、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、トリグリセリド、アルコール、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。賦形剤は、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ポリソルベート８０、リン酸ナトリウム、スクロース、リン酸二ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート２０、ヒスチジン、クエン酸塩、アルブミン、水酸化ナトリウム、グリシン、クエン酸ナトリウム、トレハロース、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸塩、ＨＣｌ、エデト酸二ナトリウム、レシチン、グリセリン、キサンタンゴム、大豆イソフラボン、ポリソルベート８０、エチルアルコール、水、テプレノン、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書に開示される組成物及び方法は、ｍＲＮＡ塩基編集アプローチを介して標的化することを含み得る。これらのベクターは、ＳＮＣＡ又はＲａｂ７Ａを標的とする操作されたポリヌクレオチドをコードして（編集されたスプライスシグナルのエクソンスキッピングを促進し）、神経変性疾患又は状態と関連する１つ以上の追加のタンパク質をコードする本明細書に開示される１つ以上の追加の操作されたポリヌクレオチド又は他の治療剤をコードし得る。
組成物は、プレｍＲＮＡを編集し、ｉｉ）スプライスシグナルを編集し、エクソンスキッピングを誘導するか、又はこれらの任意の組み合わせのためのｍＲＮＡ塩基編集を含み得る。編集によって、エクソンスキッピングが起こり得る（例えば、開始部位を含有し得るエクソン）。
本開示の組成物は、標的ＲＮＡポリヌクレオチド配列においてヌクレオチドを編集するための操作されたポリヌクレオチドを含み得る。組成物は、ＡＤＡＲ依存的又はＡＤＡＲ非依存的な様式で編集を用いることができる。組成物は、ＲＮＡ編集エンティティを介した標的ＲＮＡの編集を容易にする動員ドメインを含み得る。
本明細書に提供される組成物及び方法は、薬学的組成物を利用することができる。全体を通して記載される組成物が、医薬品へと製剤化され、これを使用して、それを必要とし、疾患を有すると診断されたヒト又は哺乳動物を治療することができる。いくつかの場合において、薬学的組成物を予防的に使用することができる。
本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される方法に利用され得る。本明細書で提供される、提供される組成物のいずれかは、本明細書で提供される方法に利用され得る。いくつかの場合において、方法は、疾患若しくは状態、又は疾患若しくは状態の症状を少なくとも部分的に予防し、低減し、軽減し、及び／又は治療することを含む。対象は、ヒト又は非ヒトであり得る。対象は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ）であり得る。対象は、脊椎動物又は無脊椎動物であり得る。対象は、実験動物であり得る。対象は、患者であり得る。対象は、疾患を患っていてもよい。対象は、疾患の症状を呈していてもよい。対象は、疾患の症状を呈していないが、それでも疾患を有していてもよい。対象は、介護者の医療ケアの下にあってもよい（例えば、対象は、入院し、医師によって治療される）。
投与経路及び投薬量
本明細書に記載される組成物は、対象への送達のためにＡＡＶ（ＩＶ／ＣＮＳ）ベクターを用いることができる。ＡＡＶベクター送達は、単回用量で長期的な利益を達成することができ、多重化された標的化の機会を提供することができる。方法は、ＣＮＳ／ＩＶ投薬を用いて中枢神経細胞向性及び生体内分布を促進することができるＡＡＶ血清型を特定することを含み得る。
いくつかの場合において、投与は、生物学的作用を有する所望の部位への化合物又は組成物の送達を可能にするために使用され得る方法を指すことができる。送達は、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接的な適用を含み得る。送達は、血液脳関門を通過することを許容するものを含み得る。送達は、体の組織又は領域に影響を及ぼすような直接的な適用を含み得る。本明細書で提供される組成物は、任意の方法によって投与され得る。投与方法は、吸入、耳、口腔内、結膜、歯、子宮頸管内、洞内（ｅｎｄｏｓｉｎｕｓｉａｌ）、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、嚢内、心腔内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄腔内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、髄腔内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸郭内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、鞘内、心室内、定位的、又はこれらの任意の組み合わせによるものであり得る。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、又は注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚等の表面の外表面に対する局所投与（ローション、クリーム、軟膏）を含み得る。いくつかの場合において、投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、若しくは経鼻投与、又はこれらの任意の組み合わせによるものである。いくつかの場合において、対象は、監督のない状態で組成物を投与され得る。いくつかの場合において、対象は、医療専門家（例えば、医師、看護師、医療助手、雑役係、ホスピスワーカー等）の監督下で組成物を投与され得る。医療専門家は、組成物を投与し得る。いくつかの場合において、化粧品専門家は、組成物を投与し得る。
本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物の投与又は適用は、少なくとも約少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００日間の連続した日数又は非連続の日数の治療期間にわたって行うことができる。治療期間は、約１～約３０日間、約２～約３０日間、約３～約３０日間、約４～約３０日間、約５～約３０日間、約６～約３０日間、約７～約３０日間、約８～約３０日間、約９～約３０日間、約１０～約３０日間、約１１～約３０日間、約１２～約３０日間、約１３～約３０日間、約１４～約３０日間、約１５～約３０日間、約１６～約３０日間、約１７～約３０日間、約１８～約３０日間、約１９～約３０日間、約２０～約３０日間、約２１～約３０日間、約２２～約３０日間、約２３～約３０日間、約２４～約３０日間、約２５～約３０日間、約２６～約３０日間、約２７～約３０日間、約２８～約３０日間、又は約２９～約３０日間であり得る。
本明細書に開示される任意の操作されたポリヌクレオチドエクソンスキッピング構築物を含む組成物の投与又は適用は、少なくとも約１週間、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、少なくとも約５年、少なくとも約６年、少なくとも約７年、少なくとも約８年、少なくとも約９年、少なくとも約１０年、少なくとも約１５年、少なくとも約２０年、又はそれより長い治療期間にわたって行うことができる。投与は、対象の生涯にわたって、例えば、対象の生涯にわたって、月に１回又は年に１回、繰り返し実施することができる。投与は、対象の生涯のかなりの期間にわたって、例えば、少なくとも約１年、５年、１０年、１５年、２０年、２５年、３０年、又はそれより長い期間にわたって、月に１回又は年に１回、繰り返し実施することができる。
いくつかの場合において、薬学的組成物を含め、本明細書で提供される任意の組成物の投与は、例えば、ある疾患若しくは状態の症状を低減するため、及び／又はある疾患若しくは状態を低減するための有効量であり得る。有効量は、所望の効果を達成するのに十分なものであり得る。治療的用途又は予防的用途の文脈で、有効量は、問題としている状態の種類及び重症度、並びに個々の対象の特徴、例えば、一般的な健康、年齢、性別、体重、及び薬学的組成物に対する忍容性に依存する。免疫原性組成物の文脈では、いくつかの実施形態において、有効量は、病原体に対する保護応答をもたらすのに十分な量である。他の実施形態において、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、それを必要とする対象に受動免疫を付与するために必要な量である。免疫原性組成物に関して、いくつかの実施形態において、有効量は、上述の因子に加えて、意図される使用、特定の抗原性化合物の免疫原性の程度、及び対象の免疫系の健康／応答性に依存する。
操作されたポリヌクレオチドのいずれかを含む、本明細書に開示される組成物の投与又は適用は、１日に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４回行うことができる。いくつかの場合において、本明細書に開示される組成物の投与又は適用は、１週間に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１回行うことができる。いくつかの場合において、本明細書に開示される組成物の投与又は適用は、１ヶ月に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、又は９０回行うことができる。
操作されたポリヌクレオチドのいずれかを含む本開示の組成物は、単回用量として、又は分割された用量として投与／適用することができる。いくつかの場合において、本明細書に記載の組成物は、第１の時間点及び第２の時間点で投与され得る。いくつかの場合において、組成物は、第１の投与が他の投与の前に投与され、投与時間の差が１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、１日間、２日間、４日間、７日間、２週間、４週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１年間、又はそれより長いように投与され得る。
本開示のベクターは、任意の好適な用量で対象に投与され得る。好適な用量は、少なくとも約５×１０７～５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１０×１０７、１１×１０７、１５×１０７、２０×１０７、２５×１０７、３０×１０７、又は５０×１０７ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０７～６×１０７、６×１０７～７×１０７、７×１０７～８×１０７、８×１０７～９×１０７、９×１０７～１０×１０７、１０×１０７～１１×１０７、１１×１０７～１５×１０７、１５×１０７～２０×１０７、２０×１０７～２５×１０７、２５×１０７～３０×１０７、３０×１０７～５０×１０７、又は５０×１０７～１００×１０７ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０７～１０×１０７、１０×１０７～２５×１０７、又は２５×１０７～５０×１０７ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１０×１０８、１１×１０８、１５×１０８、２０×１０８、２５×１０８、３０×１０８、又は５０×１０８ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０８～６×１０８、６×１０８～７×１０８、７×１０８～８×１０８、８×１０８～９×１０８、９×１０８～１０×１０８、１０×１０８～１１×１０８、１１×１０８～１５×１０８、１５×１０８～２０×１０８、２０×１０８～２５×１０８、２５×１０８～３０×１０８、３０×１０８～５０×１０８、又は５０×１０８～１００×１０８ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０８～１０×１０８、１０×１０８～２５×１０８、又は２５×１０８～５０×１０８ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、又は５０×１０９ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約５×１０９～６×１０９、６×１０９～７×１０９、７×１０９～８×１０９、８×１０９～９×１０９、９×１０９～１０×１０９、１０×１０９～１１×１０９、１１×１０９～１５×１０９、１５×１０９～２０×１０９、２０×１０９～２５×１０９、２５×１０９～３０×１０９、３０×１０９～５０×１０９、又は５０×１０９～１００×１０９ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０９～１０×１０９、１０×１０９～２５×１０９、又は２５×１０９～５０×１０９ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０、又は５０×１０１０ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約５×１０１０～６×１０１０、６×１０１０～７×１０１０、７×１０１０～８×１０１０、８×１０１０～９×１０１０、９×１０１０～１０×１０１０、１０×１０１０～１１×１０１０、１０×１０１０～１５×１０１０、１５×１０１０～２０×１０１０、２０×１０１０～２５×１０１０、２５×１０１０～３０×１０１０、３０×１０１０～５０×１０１０、又は５０×１０１０～１００×１０１０ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０１０～１０×１０１０、１０×１０１０～２５×１０１０、又は２５×１０１０～５０×１０１０ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１０×１０１１、１１×１０１１、１５×１０１１、２０×１０１１、２５×１０１１、３０×１０１１、又は５０×１０１１ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約５×１０１１～６×１０１１、６×１０１１～７×１０１１、７×１０１１～８×１０１１、８×１０１１～９×１０１１、９×１０１１～１０×１０１１、１０×１０１１～１１×１０１１、１１×１０１１～１５×１０１１、１５×１０１１～２０×１０１１、２０×１０１１～２５×１０１１、２５×１０１１～３０×１０１１、３０×１０１１～５０×１０１１、又は５０×１０１１～１００×１０１１ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０１１～１０×１０１１、１０×１０１１～２５×１０１１、又は２５×１０１１～５０×１０１１ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、又は５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約５×１０１２～６×１０１２、６×１０１２～７×１０１２、７×１０１２～８×１０１２、８×１０１２～９×１０１２、９×１０１２～１０×１０１２、１０×１０１２～１１×１０１２、１１×１０１２～１５×１０１２、１５×１０１２～２０×１０１２、２０×１０１２～２５×１０１２、２５×１０１２～３０×１０１２、３０×１０１２～５０×１０１２、又は５０×１０１２～１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０１２～１０×１０１２、１０×１０１２～２５×１０１２、又は２５×１０１２～５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３、１０×１０１３、１１×１０１３、１５×１０１３、２０×１０１３、２５×１０１３、３０×１０１３、又は５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約５×１０１３～６×１０１３、６×１０１３～７×１０１３、７×１０１３～８×１０１３、８×１０１３～９×１０１３、９×１０１３～１０×１０１３、１０×１０１３～１１×１０１３、１１×１０１３～１５×１０１３、１５×１０１３～２０×１０１３、２０×１０１３～２５×１０１３、２５×１０１３～３０×１０１３、３０×１０１３～５０×１０１３、又は５０×１０１３～１００×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０１３～１０×１０１３、１０×１０１３～２５×１０１３、又は２５×１０１３～５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、少なくとも約５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３、１０×１０１３、１１×１０１３、１５×１０１３、２０×１０１３、２５×１０１３、３０×１０１３、又は５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、好適な用量は、約５×１０１３～６×１０１３、６×１０１３～７×１０１３、７×１０１３～８×１０１３、８×１０１３～９×１０１３、９×１０１３～１０×１０１３、１０×１０１３～１１×１０１３、１１×１０１３～１５×１０１３、１５×１０１３～２０×１０１３、２０×１０１３～２５×１０１３、２５×１０１３～３０×１０１３、３０×１０１３

～５０×１０１３、又は５０×１０１３～１００×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。いくつかの場合において、好適な用量は、約５×１０１３～１０×１０１３、１０×１０１３～２５×１０１３、又は２５×１０１３～５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。
いくつかの場合において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、少なくとも約１×１０７～約１×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ体重のいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、又は９×１０７ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、又は９×１０８ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、又は９×１０９ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、又は９×１０１０ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。
キット
また、本開示の操作されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、本開示の操作されたポリヌクレオチドを発現するベクター、本開示の操作されたポリヌクレオチドを発現する組換え細胞、又は本明細書に開示される組成物と、使用のための説明書とを含むか、又は代替的にそれらから本質的になるか、又は更にそれらからなるキットが本明細書に開示される。一態様において、説明書は、本明細書に開示される操作されたポリヌクレオチドを使用する方法を列挙する。
キットは、ウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、容器中に包装されてもよい。キットは、天然に存在しないＲＮＡを含み得る。天然に存在しないＲＮＡは、容器中に包装されてもよい。キットは、シリンジを含み得る。キットは、本明細書に記載の薬学的組成物を含み得る。キットは、本明細書に記載のウイルスベクター、天然に存在しないＲＮＡ、薬学的組成物の投与のための説明書を含み得る。
付番された実施形態
いくつかの組成物、及び方法が、本明細書で開示される。これらの組成物及び方法の具体的な例示的な実施形態を以下に開示する。以下の実施形態は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も企図される。特に、これらの付番された実施形態の各々は、列挙されるようなそれらの順序とは無関係に、あらゆる前又は後続の付番された実施形態に依存するか、又は関連するものとして企図される。
実施形態１．操作されたポリヌクレオチドであって、標的ＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ標的ＲＮＡの一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズするときに、少なくとも１つのミスマッチを含有する、標的化配列と、スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソーム核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）由来のＳｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡの塩基の編集を容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２．操作されたポリヌクレオチドであって、標的ＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含有する標的化配列であって、標的ＲＮＡが、疾患又は状態に関与するエクソン中に変位を含む、標的化配列と、スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソーム核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）由来のＳｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、スプライセオソームｓｎＲＮＡ、非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、操作されたポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡ中のエクソンのエクソンスキッピングを容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３．ミスマッチが、少なくとも１つのアデニン－グアニン（Ａ－Ｇ）ミスマッチ、少なくとも１つのアデニン－アデニン（Ａ－Ａ）ミスマッチ、又は少なくとも１つのアデニン－シトシン（Ａ－Ｃ）を含む、実施形態１又は２の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４．ミスマッチが、Ａ－Ｃミスマッチを含む、実施形態３の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５．Ａ／Ｃミスマッチが、デアミナーゼ存在下で標的ＲＮＡと会合したときに、デアミナーゼによって標的ＲＮＡにおいて編集を促進するように構成される、実施形態４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６．Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアント、及びヘアピンが、操作されたポリヌクレオチドの３’末端上にある、実施形態１～５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７．操作されたポリヌクレオチドが、複数のＳｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、複数のヘアピンと、を含む、実施形態１～６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８．標的化配列が、約２５塩基～約２００塩基長である、実施形態１～７のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態９．標的化配列が、少なくとも約３０塩基長である、実施形態１～７のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１０．操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１～９のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１１．ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターが、Ｕ１プロモーターを含む、実施形態１０の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１２．ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターが、Ｕ７プロモーターを含む、実施形態１０の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１３．操作されたポリヌクレオチドが、Ｕ６プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１～１２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１４．Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントが、ＳｍＯＰＴ配列である、実施形態１～１３のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１５．ＳｍＯＰＴ配列が、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧ又は配列番号４１に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１６．ＳｍＯＰＴ配列が、ＡＡＵＵＵＵＵＧＧ又は配列番号４１を含む、実施形態１４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１７．ヘアピンが、マウスＵ７ ｓｎＲＮＡ、ヒトＵ７ ｓｎＲＮＡ、又はヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ由来である、実施形態１～１６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１８．ヘアピンが、マウスＵ７ ｓｎＲＮＡ、ヒトＵ７ ｓｎＲＮＡ、ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡのうちの１つ以上のキメラヘアピンである、実施形態１～１７のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１９．ヘアピンが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つのヘアピン配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、実施形態１～１８のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２０．ヘアピンが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つのヘアピン配列を含む、実施形態１９のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２１．ヘアピンが、配列番号４３のヘアピン配列を含む、実施形態１～２０のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２２．操作されたポリヌクレオチドの３’末端にＵ７ボックスターミネーターを更に含む、実施形態１～２１のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２３．５’から３’の標的化配列が、標的化配列と、Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、ヘアピンと、を含む、実施形態１～２２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２４．操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集エンティティによる標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成されている、実施形態２の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２５．ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、又は両方を含む、実施形態１～２４のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２６．ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲを含み、ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２を含む、実施形態１～２４のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２７．標的化配列が、疾患又は状態において実行される標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合する、実施形態１～２６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２８．標的ＲＮＡが、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態２７の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２９．標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１であり、ＳＥＲＰＩＮＡ１が、Ｅ３４２Ｋ変異を含む、実施形態２８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３０．標的ＲＮＡが、ＬＲＲＫ２であり、ＬＲＲＫ２が、Ｇ２０１９Ｓ変異を含む、実施形態２８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３１．疾患又は状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、又はテイ・サックス病を含む、実施形態１～３０のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３２．操作されたポリヌクレオチドが、ｓｎＲＮＡ由来の追加の配列を更に含む、実施形態１～３１のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３３．ｓｎＲＮＡ配列が、少なくとも部分的にＵ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、又はＵ７ ｓｎＲＮＡ配列を含む、実施形態１～３２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３４．操作されたポリヌクレオチドが、配列番号１～配列番号３３のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～３３のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３５．ｓｎＲＮＡ配列が、配列番号１～配列番号３３のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態３４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３６．ｓｎＲＮＡプロモーターが、少なくとも部分的にＵ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、又はＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含む、実施形態４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３７．標的化配列が、標的ＲＮＡ内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的である、実施形態１～３６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３８．標的化配列が、
（ａ）標的ＲＮＡ内のエクソンの上流にある分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であるか、又は
（ｂ）標的化配列が、標的ＲＮＡ内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的である、実施形態３７の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３９．操作されたポリヌクレオチドが、インビトロで測定される場合に、Ｓｍ若しくはＳｍ様結合ドメイン、又はそのバリアントを含まないか、ヘアピンを含まないか、あるいはＳｍ若しくはＳｍ様結合ドメイン、又はそのバリアント及びヘアピンを含まない、同等のエクソンスキッピング構築物と比較して、改善されたエクソンスキッピングの効率を有する、実施形態１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４０．効率が、少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含まない同等のエクソンスキッピング構築物を含む細胞と比較して、操作されたポリヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞における、操作されたポリヌクレオチドによってスキッピングされたエクソンのスキッピングの割合を検出するために、デジタル液滴ＰＣＲアッセイを行うことによって決定される、実施形態３９の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４１．操作されたポリヌクレオチドが、スプライスシグナル内の塩基の編集を容易にするように構成される、実施形態３７～４０のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４２．編集が、エクソンのスキッピングを少なくとも部分的に促進するように構成される、実施形態４１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４３．操作されたポリヌクレオチドが、インビトロアッセイによって測定される場合、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、エクソンスキッピングの効率が増加する、実施形態３９～４２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４４．少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドが、標的ＲＮＡと会合したときに、操作されたポリヌクレオチドを、デアミナーゼを介する標的ＲＮＡの塩基の編集を容易にするように少なくとも部分的に構成する、実施形態１～４３のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４５．標的化配列が、標的ＲＮＡに結合したときに、デアミナーゼと会合して、デアミナーゼによる標的ＲＮＡのポリヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にする、実施形態４４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４６．ミスマッチが、標的化配列のいずれかの末端から約１～約２００塩基に位置する、実施形態１～４５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４７．ミスマッチが、標的化配列のいずれかの末端から少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５塩基に位置する、実施形態１～４５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４８．デアミナーゼ動員ドメインを更に含む、実施形態１～４７のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４９．デアミナーゼ動員ドメインが、ＧｌｕＲ２、Ａｌｕ、これらのいずれかの一部分、これらのいずれかのバリアント、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態４７の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５０．デアミナーゼ動員ドメインが、ステムループを含む、実施形態４７又は４８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５１．ステムループが、左巻きのステムループ又は右巻きのステムループである、実施形態４９の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５２．ステムループが、ＧｌｕＲ２ドメインに対して少なくとも約８０％の配列同一性を含む、実施形態５０の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５３．操作されたポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドを含む、実施形態１～５１のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５４．少なくとも１つの化学修飾が、表１に提供される操作されたポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格連結中の非連結リン酸酸素原子の片方又は両方の修飾を含む、実施形態１～５２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５５．操作されたポリヌクレオチドが、水溶液中に存在し、標的ＲＮＡに結合していないときに、バルジ、ポリヌクレオチドループ、構造化ドメイン、又はこれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを欠いている、実施形態１～５３のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５６．操作されたポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、バルジ、内部ループ、ヘアピン、又はこれらの任意の組み合わせを含む、実施形態１～５４のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５７．操作されたポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、バルジを含む、実施形態１～５５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５８．バルジが、非対称バルジである、実施形態５６の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５９．バルジが、対称バルジである、実施形態５６の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６０．操作されたポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、内部ループを含む、実施形態５５～５８のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６１．内部ループが、非対称ループである、実施形態５９の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６２．内部ループが、対称ループである、実施形態５９の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６３．操作されたポリヌクレオチドが、構造的なループ安定化骨格を含む、実施形態１～５３のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６４．構造的なループ安定化骨格が、標的化配列を更に含み、標的ＲＮＡに少なくとも部分的にハイブリダイズするとき、ＲＮＡ編集酵素による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の化学修飾を容易にし、標的化配列が、少なくとも約４個の連続したヌクレオチドを含む、実施形態６２の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６５．操作されたポリヌクレオチドが、標的化配列に隣接する第１のスペーサードメイン及び第２のスペーサードメインを更に含み、操作されたポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞における転写の後に自己環化するように構成されている、実施形態１～６３のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６６．操作されたポリヌクレオチドが、第１のスペーサードメインに対して５’に、又は第２のスペーサードメインに対して３’に、又は両方に、リボザイムドメインを含む、実施形態６４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６７．操作されたポリヌクレオチドが、リボザイムドメインと第１のスペーサードメインとの間に、又はリボザイムドメインと第２のスペーサードメインとの間にライゲーションドメインを含む、実施形態６５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６８．ポリヌクレオチド配列が二次元的に表される場合、操作されたポリヌクレオチドが、線形である、実施形態１～６６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６９．操作されたポリヌクレオチドが、溶媒に曝露される３’還元ヒドロキシルを欠いている、実施形態１～６６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７０．操作されたポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞へトランスフェクトされる場合に化学変化を受けるように構成され、その結果、化学変化の後、操作された化学修飾が、溶媒に曝露された３’還元ヒドロキシルを欠いている、実施形態１～６６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７１．標的化配列が、アプタマーを含まない、実施形態６４～６９のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７２．操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のために構成された配列をコードする配列を含まないか、又はそれをコードしない、実施形態１～６６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７３．標的化配列が、標的ＲＮＡの３’又は５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態１～７２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７４．標的化配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態１～７２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７５．標的化配列が、標的ＲＮＡのイントロン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態１～７２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７６．標的化配列が、標的ＲＮＡのエクソン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、実施形態１～７２のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７７．操作されたポリヌクレオチドが、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチドである、実施形態１～７６のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７８．操作されたポリヌクレオチドが、配列番号１～配列番号３３のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～７７のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７９．ｓｎＲＮＡ配列が、配列番号１～配列番号３３のうちのいずれか１つ、又はそのバリアントに対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態７８の操作されたポリヌクレオチド。ｄ
実施形態８０．操作されたポリヌクレオチドが、標的化配列に対して５’に第１のスペーサードメインを含む、実施形態１～７９のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８１．操作されたポリヌクレオチドが、第１のスペーサードメインとは異なるか、又は同一である第２のスペーサードメインを含む、実施形態８０の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８２．第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、又は両方が、５’ ＡＵＡＵＡ ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態８０又は８１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８３．第１のスペーサードメイン、第２のスペーサードメイン、又は両方が、５’ ＡＵＡＡＵ ３’のポリヌクレオチド配列を含む、実施形態８０又は８１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８４．操作されたポリヌクレオチドが、５’末端に第１のリボザイムドメインと、３’末端に第２のリボザイムドメインと、を含む、実施形態７０～８３のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８５．第１又は第２のリボザイムが、独立して、ハンマーヘッドリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＨＤＶ様リボザイム、Ｒ２エレメント、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ ｒＲＮＡ、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、ＩＩ群イントロン、ヘアピンリボザイム、ＶＳリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、及びＩ群イントロンからなる群から選択される、実施形態８４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８６．実施形態１～８５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクター。
実施形態８７．ベクターが、リポソーム、ナノ粒子、又はデンドリマーを含む、実施形態８６のベクター。
実施形態８８．ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態８６のベクター。
実施形態８９．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、実施形態８８のベクター。
実施形態９０．ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、又はこれらのいずれかのハイブリッドである、実施形態８９のベクター。
実施形態９１．ウイルスベクターが、自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターである、実施形態８９又は９０のベクター。
実施形態９２．ウイルスベクターが、一本鎖ＡＡＶベクターである、実施形態８９～９０のうちのいずれか１つのベクター。
実施形態９３．実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態８６～９２のうちのいずれか１つのベクターを含む、単離された細胞。
実施形態９４．単離された細胞が、Ｔ細胞である、実施形態９３の単離された細胞。
実施形態９５．実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態８６～９２のうちのいずれか１つのベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、単位剤形での薬学的組成物。
実施形態９６．状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、有効量の実施形態１～８５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド、実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、実施形態８６～９２のうちのいずれか１つのベクター、又は実施形態９５の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
実施形態９７．状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、又はスターガルト病である、実施形態９６の方法。
実施形態９８．状態が、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子中の変異と関連する、実施形態９６の方法。
実施形態９９．投与することが、吸入、耳、口腔内、結膜、歯、子宮頸管内、洞内（ｅｎｄｏｓｉｎｕｓｉａｌ）、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、嚢内、心腔内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄腔内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、髄腔内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸郭内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、鞘内、心室内、定位的、又はこれらの任意の組み合わせである、実施形態９６～９８のうちのいずれか１つの方法。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、又は注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚等の表面の外表面に対する局所投与（ローション、クリーム、軟膏）を含み得る。いくつかの場合において、投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、若しくは経鼻投与、又はこれらの任意の組み合わせによるものである。
実施形態１００．追加の治療を行うことを更に含む、実施形態９６～９９のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０１．追加の治療が、同時に、又は連続的に行われる、実施形態１００の方法。
実施形態１０２．投与が、少なくとも週に１回行われる、実施形態９６～１０１のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０３．対象は、投与前にインビトロ診断によって疾患又は状態を有すると診断されている、実施形態９６～１０２のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０４．対象が、ヒトである、実施形態９６～１０３のうちのいずれか１つの方法。
実施形態１０５．実施形態１～８５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチドを容器中に含むか、実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを容器中に含むか、実施形態８６～９２のうちのいずれか１つのベクターを容器中に含むか、又は実施形態９５の薬学的組成物を容器中に含む、キット。
実施形態１０６．薬学的組成物を作製する方法であって、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を、本開示の操作されたポリヌクレオチド、実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチド、実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は実施形態８６～９２のうちのいずれか１つのベクターのうちの少なくとも１つとを接触させることを含む、方法。
実施形態１０７．キットを作製する方法であって、容器内に少なくとも部分的に、
（ａ）実施形態１～８５のうちのいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド、
（ｂ）実施形態１～８５のうちのいずれかの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）実施形態８６～９２のうちのいずれか１つのベクター、又は
（ｄ）実施形態９５の薬学的組成物を配置することを含む、方法。
以下の実施例は、本開示を説明することを意図するが、本開示を限定するものではない。それらは、使用され得るものの典型であるが、代替的に、当業者に既知の他の手順を使用してもよい。
実施例１：特異的ガイドＲＮＡ編集に対するｓｎＲＮＡプロモーター及び３’ヘアピンの効果の評価
この実施例において、ガイドＲＮＡがエクソンスキップを編集するか、又は実行する能力をもたらす能力について、ガイドＲＮＡに付加される追加の特徴を試験した。図１は、エクソンスキッピング活性の存在を評価するために使用されるエクソンスキッピングｄｄＰＣＲアッセイの例を示す。
ガイドＲＮＡの３’末端に対するＵ７及びＵ１ヘアピンの付加
この試験において、異なるｓｎＲＮＡプロモーター下で発現したガイドＲＮＡを、その特異的ガイドＲＮＡ編集について試験した。
ｓｎＲＮＡプロモーターによって駆動されるガイドＲＮＡ発現が編集に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１のスプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４のスプライスアクセプターを標的とする１００ヌクレオチドのガイドＲＮＡを、対応する３’ヘアピン（ＳｍＯＰＴ ｍＵ７、ＳｍＯＰＴ ｈＵ７、又はｈＵ１ヘアピン）を有するか、又は有しない、ｈＵ６、ｈＵ７、又はｈＵ１プロモーターを使用して発現させた。使用される終止配列は、プロモーターのものと一致する。２９３Ｔ細胞を、ヒトＡＤＡＲ２過剰発現を伴うか、又は伴わないガイドＲＮＡ構築物を発現する１μｇのプラスミドでトランスフェクトした。
図２Ａにおいて、Ｕ７又はＵ１プロモーターは、３’ヘアピンと組み合わせて、ＲＡＢ７Ａ ＡＤＡＲ編集及びＤＭＤエクソン７１又はエクソン７４スキッピングを増強した（ｄｄＰＣＲによって測定される場合）。これらの構築物は、ＡＤＡＲ２過剰発現がない場合でも同様の編集を示した。図２Ｂは、ボックスによって示されるように、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ中のアデノシンの標識での特異性を示すためのＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す。逆方向プライマーをＳａｎｇｅｒ配列決定に使用する。したがって、ＡからＧへの編集は、ＴからＣへの変異として現れる。
実施例２：ガイドＲＮＡを含有するＵ７プロモーターを用いるＲＡＢ７Ａ及びＳＮＣＡの編集
この実施例において、ＲＡＢ７Ａ及びアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）に沿った異なる領域を、異なるガイドＲＮＡ構築物を使用して編集した。ＲＡＢ７Ａについては、エクソン１、３、及び３’ＵＴＲを編集のために標的とし、一方で、ＳＮＣＡについては、開始コドン及び３’ＵＴＲを標的とした。図３Ａは、ヒトＲＡＢ７Ａ及びＳＮＣＡのエクソン構造の概略図を示す。エクソンは、灰色のセグメントで示され、コード領域は、その上の黒色の線として示される。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置が示され、ＰＣＲプライマーも示されている。
ヒトＲＡＢ７Ａエクソン１、エクソン３、若しくは３’ＵＴＲ、又はヒトＳＮＣＡ開始コドン若しくは３’ＵＴＲを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、３’ヘアピンを有しないｈＵ６プロモーター、又は３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを有するｍＵ７若しくはｈＵ７プロモーターを使用して発現された。図３Ｂは、ＡＤＡＲ２過剰発現の存在下又は非存在下で、異なるガイドＲＮＡ構築物を使用した編集の結果をまとめたものである。３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンと組み合わせたＵ７プロモーターは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集を増強した（Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって測定される）。３’ＵＴＲを標的とする構築物は、内因性ＡＤＡＲレベルと、過剰発現したＡＤＡＲレベルで、等しく良好に機能したが、他の領域を標的とする構築物は、依然としてＡＤＡＲ２過剰発現から利益を受けていた。
差次的なエクソンスキッピングが生じたかどうかを確認するために、編集された転写産物に由来するｃＤＮＡを単離し、示されたプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅させた。ＲＡＢ７Ａプライマーは、ＲＡＢ７Ａのコード決定配列の一部分にわたっており、エクソン構造が維持されている場合には、４３７ｂｐのアンプリコンを生成する。ＲＡＢ７Ａのエクソン３がスキップされる場合、３１０ｂｐのアンプリコンが予想される。ＳＮＣＡプライマーを使用すると、３２３ｂｐのＰＣＲアンプリコンが予想される。図３Ｃは、最小のＲＡＢ７Ａエクソン３スキッピングと、ＲＡＢ７Ａエクソン１又はＳＮＣＡ開始コドンを標的とするガイドＲＮＡからの検出不可能なエクソンスキッピングを示す。
図３Ｄは、示されている転写産物の標的アデノシンにおける特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す。ボックスは、オンターゲット編集部位を示す。
実施例３：ＨＥＫ ２９３及びＫ５６２細胞におけるヒトＳＮＣＡ開始コドン及び３’ＵＴＲのオンターゲット編集及びオフターゲット編集
この実施例において、異なる細胞株及びトランスフェクション方法を使用して、ＳＮＣＡの異なる領域を編集した。ヒトＳＮＣＡ開始コドン又はヒトＳＮＣＡ ３’ＵＴＲを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、ヘアピンを有しないｈＵ６プロモーター、３’ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｍＵ７プロモーター、３’ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するｈＵ７プロモーター、又は３’ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｈＵ１プロモーターを使用して発現された。Ｕ７又はＵ１プロモーター下で、ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン配列も含む、操作されたポリヌクレオチドの組成物が本明細書に開示される。上述の操作されたポリヌクレオチドは、ＳＮＣＡに対応する標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、アデノシンのＡＤＡＲ媒介性編集を容易にすることができる。
図４Ａは、ＳＮＣＡの異なる部位をプロファイリングし、ＡＤＡＲ媒介性編集効率を測定する効果を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ガイド配列を含有するプラスミドでトランスフェクトし、２日後に、ＲＮＡ編集をＳａｎｇｅｒ配列決定によって測定した。いくつかの場合において、ＡＤＡＲ２が過剰発現された。Ａ／Ｃミスマッチ部位（赤色のボックス）の評価を評価し、各々の条件において編集効率を決定した。いくつかの場合において、５％未満の編集効率は、バックグランドレベルより低い場合がある。
図４Ｂ ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲの編集を、ＳＮＣＡを過剰発現するＫ５６２細胞における操作されたポリヌクレオチドのトランスフェクションによって評価した。１．５μｇのガイドＲＮＡ発現プラスミドを、ヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）によって、２×１０５個のＳＮＣＡを過剰発現するＫ５６２細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４０時間後及び７２時間後に、ＲＮＡ編集を測定した。白抜きの記号は、細胞がＧＦＰ発現ベクターでトランスフェクトされた実験を示し、一方で、黒塗りの記号は、ＡＤＡＲ２過剰発現ベクターでのトランスフェクションを示す。
実施例４：線形及び環状のガイドＲＮＡを使用したＲＮＡ編集
異なる哺乳動物ｓｎＲＮＡプロモーターの制御下での操作されたポリヌクレオチドの組成物が本明細書に開示される。これらの構築物は、３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを有する線形の操作されたポリヌクレオチド構築物、又はヘアピンを欠く環状ガイドＲＮＡ構築物である。図５は、ヒトＵ１プロモーターが、転写産物レベルのノックダウンを最小限にしつつ、ガイドＲＮＡ編集のための３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンとも対形成することができることを示す。
ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン及びＵ７終止配列を有する、ｈＵ６、ｍＵ７、ｈＵ７、又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。代替的に、これらの１００ｎｔのガイドＲＮＡは、環化しているＲｔｃＢリボザイム部位を有する（ＳｍＯＰＴ又はＵ７ヘアピンを有しない）、ｈＵ６、ｍＵ７、ｈＵ７、又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。２９３Ｔ細胞を、ガイドＲＮＡ構築物（内因性ＡＤＡＲレベル）を発現するプラスミド１ｕｇでトランスフェクトした。ＲＮＡを、ｄｄＰＣＲによって、トランスフェクション後の指示された時間点で測定した。
３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを有するガイドＲＮＡを発現するＵ７又はＵ１プロモーターによって、高レベルのＲＡＢ７Ａ編集及びＤＭＤエクソンスキッピングが得られた。しかしながら、Ｕ６プロモーターは、これらの同じガイドＲＮＡ構築物を発現する場合には、著しく弱かった。対照的に、環状ガイドＲＮＡ（ヘアピンを有しない）を発現するＵ６プロモーターによって、最も高いレベルのＲＡＢ７Ａ編集が得られたが、ＤＭＤエクソンスキッピングは、より中程度のレベルが得られた。
実施例５：操作されたポリヌクレオチドの５’末端に対するｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメインの付加
３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンに対向するガイドＲＮＡの５’末端にｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン［ＵＡＧＧＧＷ］（ＷはＡ／Ｕである）を付加することで、ＲＡＢ７Ａ編集及びＤＭＤエクソン７４スキッピングを更に増加させる。
ヒトＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ヒトＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はヒトＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、３’ ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピン及びｍＵ７終止配列を有する、ｍＵ７又はｈＵ１プロモーターを使用して発現された。代替的に、これらの１００ｎｔのガイドＲＮＡは、Ｌｉｔｋｅ ａｎｄ Ｊａｆｆｒｅｙ ２０１９からの環化しているＲｔｃＢリボザイム部位を有する（ＳｍＯＰＴ又はＵ７ヘアピンを有しない）、ｈＵ６プロモーターを使用して発現された。ガイドＲＮＡの５’末端に、タグなし、三重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン、二重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン、又は陰性対照としてのｈｎＲＮＰ Ａ１に結合しない変異したドメインのいずれかを付加した。２９３Ｔ細胞を、ガイドＲＮＡ構築物（内因性ＡＤＡＲレベル）を発現するプラスミド１ｕｇでトランスフェクトした。ＲＮＡを４２時間後に測定した。図６Ａは、ｈｎＲＮＰ結合ドメインが、Ｕ７／Ｕ１プロモーター及び３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンと組み合わせた場合に、ＲＡＢ７Ａ ＡＤＡＲ編集及びＤＭＤエクソン７４スキッピング（ｄｄＰＣＲによって測定される）を増加させたことを示す。残念ながら、ｈｎＲＮＰドメインは、Ｕ６環状ガイドＲＮＡを改善しなかった。ＲＡＢ７Ａ編集は、ＨＰＲＴ１ハウスキーピング遺伝子に対して、転写産物発現レベルを変化させない。ＤＭＤエクソン７１スキッピングも改善されなかったが、これはおそらく、これらの条件が、（トランスフェクション効率及び転写産物のターンオーバーを考慮して）エクソン７１スキッピングの量を既に最大化しているためであろう。図６Ｂは、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ中の標的アデノシンにおける特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムを示す（ボックス）。配列決定のために逆方向プライマーを使用したため、Ａ＞Ｇ編集は、Ｔ＞Ｃとして現れる。
実施例６：ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ステムループヘアピンを有するガイドを用いたＲＮＡ編集
３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンのどの特徴が、増強した編集に必要であるかを解析するために、ＳｍＯＰＴ配列の変動、及びＵ７ステムループヘアピンの変動を比較した。ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、３’ ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ステムループヘアピン配列上の変動とともに、ｍＵ７プロモーター及びｍＵ７終止配列を使用して発現された。２９３Ｔ細胞を、ガイドＲＮＡ構築物（内因性ＡＤＡＲレベル）を発現するプラスミド１ｕｇでトランスフェクトした。ＲＮＡを４２時間後に測定した。図７Ａは、試験した配列変動を列挙する。図７Ｂは、天然又は変異した変動のいずれでもないＳｍＯＰＴ配列が、標的転写産物の完全編集に必要であることを示す。図７Ｂは、マウス若しくはヒトＵ７ステムループヘアピン、又はハイブリッドマウス／ヒトＵ７ステムループヘアピンが、編集にとって十分であり得ることも示す。図７Ｃは、示されている転写産物の標的アデノシンにおける特異的編集を示すＳａｎｇｅｒ配列決定クロマトグラムの例を示す。ボックスは、オンターゲット編集部位を示す。
実施例７：ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する、ＬＲＲＫ２に対するガイドＲＮＡ
この実施例は、Ｕ１プロモーター、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンの制御下でのガイドＲＮＡをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドＲＮＡは、パーキンソン病に関与する遺伝子であるＬＲＲＫ２を標的とするように設計されている。両方ともＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する、ＬＲＲＫ２ Ｇ２０１９Ｓ変異を標的とする２つのガイドＲＮＡ設計を試験した。第１のガイドは、配列番号１８であった。第２のガイドは、配列番号１９であった。ガイドＲＮＡを、ＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を保有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトされたＷＴ ＨＥＫ２９３細胞におけるＧ２０１９Ｓ ＬＲＲＫ２変異のＡＤＡＲ媒介性ＲＮＡ編集を容易にする能力について試験した。ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＤＡＲ１を天然で発現する。ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２を介して媒介されるＲＮＡ編集を試験した実験において、ＡＤＡＲ２は、ＬＲＲＫ２ミニ遺伝子を保有する同じｐｉｇｇｙＢａｃベクターによって、細胞において過剰発現された。ｐｉｇｇｙＢａｃ構築物の概略図を図８に示す。ＡＤＡＲ１のみ（図９Ａ）、又はＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２（図９Ｂ）の存在下、実験を行った。対照として、ＧＦＰプラスミドを使用した。図９Ａ及び図９Ｂは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを含有するガイドＲＮＡが、ＡＤＡＲ１のみの存在下ではオンターゲット編集効率８％、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２の存在下では２８％まで容易にされたことを示す。図９Ａ及び図９Ｂは、ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを含有するガイドＲＮＡが、ＡＤＡＲ１のみの存在下ではオンターゲット編集効率１９％、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２の存在下では５８％まで容易にされたことを示す。更なる実験は、第１のガイド（配列番号１８）が、－１６１．９８ｋｃａｌ／ｍｏｌのギブズ自由エネルギー（ΔＧ）を有し、第２のガイド（配列番号１９）が、－１６９．４４ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔＧを有することを示した。両方のガイドＲＮＡの構造を、図９Ａ～図９Ｂのグラフの下に示す。この構造図に見られるように、第２のガイド（配列番号１８）は、標的ＲＮＡを有する、二本鎖ＲＮＡのより長く連続した伸長部を形成した。
実施例８：３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを含有するガイドＲＮＡは、環化し、Ｕ７又はＵ６プロモーターによって発現してＡＤＡＲ編集をもたらすことができる
３’ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する１００ｎｔのアンチセンス（標的化）ガイドＲＮＡを、Ｐ３とＰ１ ＲｔｃＢ環状リボザイム部位との間に挿入し、ｍＵ７又はｈＵ６プロモーターを使用して発現させた。２９３Ｔ細胞を、ガイドＲＮＡ構築物（内因性ＡＤＡＲレベル）を発現するプラスミド１μｇでトランスフェクトした。ＲＮＡを４１時間後に測定した。図１０Ａは、環状ＲＮＡ形態を示す。ガイド特異的プライマーによるＳａｎｇｅｒ配列決定（黒色）は、リボザイム部位が、環状ＲＮＡの内側に存在するアンチセンスガイド及び３’ ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを用いて、一緒に正確にライゲーションされていることを示す。
図１０Ｂは、Ｓｍ結合ドメイン、Ｕ７ステムループヘアピン、及びＰ３とＰ１ ＲｔｃＢ環状リボザイム部位との間にクローニングされたＲＮＡリンカー配列のいくつかの配列変動を列挙する（上側パネル）。環状ＲＮＡ内には、Ｓｍ結合ドメインの前に、ヒトＲＡＢ７Ａエクソン４、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ、ＳＮＣＡエクソン４、ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ、ＤＭＤエクソン７１スプライスアクセプター、又はＤＭＤエクソン７４スプライスアクセプターを標的とする１００ｎｔのアンチセンスガイドＲＮＡが含まれていた。ガイドＲＮＡは、各々がその対応するターミネーター配列を有する、ｍＵ７又はｈＵ６プロモーターのいずれかを使用して発現された。線形ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡに加えて、Ｓｍ結合ドメイン及びＵ７ステムループヘアピンを含有する環化されたガイドＲＮＡもまた、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって測定される場合、標的転写産物を編集することができた（中央パネル）。陰性対照として、異なる遺伝子を標的とする線形ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡを使用した。更に、ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡの線形形態又は環状形態のいずれも、ＨＰＲＴ１ハウスキーピング遺伝子と比較して、ｄｄＰＣＲによって測定される場合、ＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ又はＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ標的転写産物の遺伝子発現レベルを変化させなかった（左下パネル）。線形ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡは、ＲＡＢ７Ａエクソン４の最小限の偶発的なスキッピングのみを引き起こし、環状ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンガイドＲＮＡは、ＰＣＲ及びゲル電気泳動によって測定される場合、検出可能なエクソンスキッピングを示さなかった（右下パネル）。
実施例９：ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する、ＡＢＣＡ４に対するガイドＲＮＡ
この実施例は、プロモーター、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンの制御下でのガイドＲＮＡをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドＲＮＡは、スターガルト病に関与するＡＢＣＡ４ミスセンス変異を標的とするように設計されている。
初期の実験のセットは、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを組み込んだガイドにおいて観察されたＡＢＣＡ４のＲＮＡ編集の改善を示した。ＡＤＡＲ１を天然で発現するＨＥＫ２９３細胞を、５８８２ Ｇ→Ａ変異及びＡＤＡＲ２を有するＡＢＣＡ４ミニ遺伝子を保有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトした。２つのＵ６によって駆動されるガイドＲＮＡ（配列番号２０及び配列番号２１）、並びにＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを含有する、Ｕ１によって駆動されるガイドＲＮＡ（配列番号２２）を含む、様々なガイドを試験した。陰性対照は、異なる遺伝子（Ｒａｂ７Ａ）に対する環状ガイドＲＮＡ、ＧＦＰプラスミドのみ、及びトランスフェクションなしを含んでいた。図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、Ｕ７ ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを含むことで、ＲＮＡ編集が増加した。
その後の実験は、ＡＢＣＡ４ ５８８２ Ｇ→Ａ変異を標的とするガイドＲＮＡを評価し、ガイドＲＮＡをコードする操作されたポリヌクレオチドは、ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンもコードした。図１２Ａは、ＡＢＣＡ４、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンにおける変異を標的とするガイドＲＮＡをコードする複数用量の構築物について、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２による細胞におけるＲＮＡ編集率を示し、発現は、Ｕ１プロモーターによって駆動される。上述のように、ＨＥＫ２９３細胞は、ＡＤＡＲ１を天然で発現する。図１２Ａについて、ＨＥＫ２９３細胞を、５８８２ Ｇ→Ａ変異及びＡＤＡＲ２を有するＡＢＣＡ４ミニ遺伝子を保有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトした。図１２Ｂは、ＡＢＣＡ４、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンにおける変異を標的とするガイドＲＮＡをコードする複数用量の構築物について、ＡＤＡＲ１による細胞におけるＲＮＡ編集率を示し、発現は、Ｕ１プロモーターによって駆動される。ＨＥＫ２９３細胞を、５８８２ Ｇ→Ａ変異を有するＡＢＣＡ４ミニ遺伝子をまさに保有するｐｉｇｇｙＢａｃベクターでトランスフェクトした。図１２Ａ及び図１２Ｂにおいて、ガイドＲＮＡ、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンをコードするプラスミドを、２５０ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｎｇ、又は１０００ｎｇで投薬した。ＧＦＰプラスミド、及びトランスフェクションなしが、陰性対照として機能した。結果は、ＡＢＣＡ４ ５８８２ Ｇ→Ａ変異のＲＮＡ編集率における用量依存性を示した。ＡＢＣＡ４を標的とする配列としては、配列番号２０、配列番号２１、及び配列番号２２が挙げられる。
実施例１０：ＳｍＯＰＴ配列及びＵ７ヘアピンを有する、ＳＮＣＡに対するガイドＲＮＡ
この実施例は、Ｕ１プロモーター、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンの制御下でのガイドＲＮＡをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡ遺伝子における開始部位、又は翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ：ＴＩＳ）（翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ：ＴＳＳ）とも称される）を標的とするように設計されている。ガイド構築物を、エクソン２のヌクレオチド位置２６（エクソン１及びエクソン２を含む、ほとんどのＳＮＣＡバリアントのヌクレオチド位置２６４に対応する）のＳＮＣＡ ＴＩＳアデノシンを標的とするように設計した。ＨＥＫ２９３細胞を、目的のガイドＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクションから４８時間後にＲＮＡ編集を評価した。ＨＥＫ２９３細胞によって天然で発現するＡＤＡＲ１のみ、並びにＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２について、ＲＮＡ編集を評価した。後者の実験において、ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＤＡＲ２をコードするｐｉｇｇｙｂａｃベクターと共トランスフェクトした。ＲＮＡ編集のレベルをＳａｎｇｅｒ配列決定によって定量化し、配列決定分析スクリプト（ＥｄｉｔＡＤＡＲ）を使用して分析した。
図１３～図１５は、編集される標的Ａ（ｘ軸上の「０」）でのＲＮＡ編集、及びオフターゲット位置でのＲＮＡ編集（「０」ではない位置にある黒色の棒グラフとして表される）のプロットを示す。生物学的複製物を各列に示す。ＳＮＣＡの高レベルのＲＮＡ編集が、いくつかのガイドＲＮＡ構築物において観察された。陰性対照の試行には、標的ＳＮＣＡ配列を標的としないガイドＲＮＡが含まれていた。ｑＰＣＲによるｍＲＮＡノックダウンは観察されなかったが、依然としてタンパク質ノックダウンが達成された可能性が高い。図１３、図１４、及び図１５に示されるガイド構築物は、高レベルのＲＮＡ編集と、高いオフターゲット編集に対するオンターゲットの比率を示した。図１４に示されるガイドは、標的鎖に対して非連続的な相補性を有する標的化配列に隣接するガイドのセグメントである、オリゴテザーを含む。
図１３～図１５に示されるガイドの配列は、下の表２に記載される。以下の表２はまた、標的ＲＮＡに対する所与のガイドのハイブリダイゼーション時に形成される特徴、観察されるオンターゲットＲＮＡ編集率、オンターゲットＲＮＡ編集である全ＲＮＡ編集に対する割合としてのオンターゲット編集、並びにコード領域中の開始部位及び開始部位の下流における標的でのＲＮＡ編集率としてのオンターゲット編集を記載している。
Figure 2023523237000005
Figure 2023523237000006
実施例１１：プラスミドの一過性のトランスフェクション、又は構築物の単一コピー組み込みからのＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有するヒトＳＯＤ１開始コドンに対するガイドＲＮＡ
ヒトＳＯＤ１開始コドンを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡは、環化しているＲｔｃＢリボザイム部位を有する（ＳｍＯＰＴ又はＵ７ヘアピンを有しない）ｈＵ６プロモーター、３’ ＳｍＯＰＴ ｍＵ７ヘアピンを有するｍＵ７プロモーター、又は５’二重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン及び３’ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するｍＵ７プロモーターを使用して発現された。上述の操作されたポリヌクレオチドを、ＳＯＤ１に対応する標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズして、アデノシンのＡＤＡＲ媒介性編集を容易にすることができる。図１６は、操作されたポリヌクレオチドがプラスミドの一過性トランスフェクションによってＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に送達されたか、又は単一コピーとしてゲノムに組み込まれた、ヒトＳＯＤ１開始コドンの編集を示す。一過性の送達のために、１ｕｇのプラスミドを、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞（内因性ＡＤＡＲ）にトランスフェクトし、２日後に編集率を測定した。組み込まれた送達のために、ガイドＲＮＡ発現構築物の単一コピーをゲノムに挿入し、抗生物質選択後に１週間後までにわたって編集率を測定した。
実施例１２：ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する、ＳＥＲＰＩＮＡ１に対するガイドＲＮＡ
この実施例は、プロモーター、ＳｍＯＰＴ配列、及びＵ７ヘアピンの制御下でのガイドＲＮＡをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドＲＮＡは、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症に関与するＳＥＲＰＩＮＡ１ミスセンス変異（ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ変異をもたらす位置９９８９でのＧからＡへの変異）を標的とするように設計されている。
簡単に述べると、ＳＥＲＰＩＮＡ１ミニ遺伝子を、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターを介して、内因性ＡＤＡＲ１を発現するＫ５６２細胞にトランスフェクトし、ピューロマイシン選択によって細胞を選択した。Ｋ５６２細胞に組み込まれたＳＥＲＰＩＮＡ１ミニ遺伝子は、全長３’ ＵＴＲを有するＳＥＲＰＩＮＡ１ミニ遺伝子１、又は切断３’ ＵＴＲを有するＳＥＲＰＩＮＡ１ミニ遺伝子２を含んでいた。両方のミニ遺伝子は、目的のＧからＡの９９８９変異を保有していた。Ｋ５６２細胞（２×１０＾５個の細胞）を、Ｕ７ヘアピン及びＳｍＯＰＴ配列に作動可能に連結されたガイドＲＮＡをコードするプラスミドを用いてエレクトロポレーションした。発現を、マウスＵ７プロモーター下で駆動させた。エレクトロポレーションから２４時間後に、ＲＮＡを単離し、ＲＴ－ＰＣＲによってｃＤＮＡを合成し、ＲＴ－ＰＣＲ産物をＳａｎｇｅｒ配列決定によって配列決定し、ＲＮＡ編集率を定量化した。対照ガイドＲＮＡは、Ｕ７ヘアピン及びＳｍＯＰＴ配列を欠いており、発現は、Ｕ６プロモーター下で駆動された。図１８及び図１９は、ガイドＲＮＡ配列を使用したＳＥＲＰＩＮＡ１の編集を示す。利用されるガイドＲＮＡ配列としては、配列番号２６及び配列番号２７が挙げられる。
実施例１３：ＳｍＯＰＴ及びＵ７ヘアピンを有する、ＲＡＢ７Ａに対するガイドＲＮＡ
この実施例は、５’二重ｈｎＲＮＰ Ａ１結合ドメイン、ＳｍＯＰＴ配列、及び３’ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するｈＵ１プロモーターの制御下でガイドＲＮＡをコードする本開示の構築物を記載し、ガイドＲＮＡは、直後に翻訳終止コドンを有する３’ＵＴＲでのアデノシンのＡＤＡＲ媒介性編集を容易にするようにＲＡＢ７Ａの３’ＵＴＲを標的とするように設計されている。使用したガイドは、配列番号２８～配列番号３０のガイドであった。編集を、筋肉細胞において評価した。横紋筋肉腫細胞（ＲＤ ＷＴ）、２Ｄ９細胞（エクソン５１スプライス部位にハードワイヤードされた変異を有するＲＤ細胞）、及び４Ｈ６細胞（エクソン５３スプライス部位にハードワイヤードされた変異を有するＲＤ細胞）を、ｐｉｇｇｙＢａｃベクターにおいてＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲをコードするガイドＲＮＡで安定にトランスフェクトした。ガイドＲＮＡは、以下の表に記載されており、発現は、ヒトＵ１プロモーターの制御下で駆動された。プラスミドなしを陰性対照として使用した。図２０は、配列番号２８～３０のガイドＲＮＡを使用したＲＡＢ７Ａの編集を示す。ＲＮＡ編集率を、播種から４８時間後及び細胞分化の１０日後に、未分化細胞において評価した。
全ての細胞及び両方の時間点において、１００塩基長の線形ガイドＲＮＡ、並びにＵ７ヘアピン及びＳｍＯＰＴ配列とのＡ／Ｃミスマッチは、内因性ＡＤＡＲによる最高レベルのＲＡＢ７Ａ ３’ＵＴＲ編集を容易にした。
次いで、各ガイドを、不死化された骨格筋芽細胞株ＬＨＣＮ－Ｍ２においてスクリーニングした。図１７に示すように、試験されたガイドは、上に列挙したＲＤ細胞と同様に、７日間の分化の間、持続的な編集を示した。
実施例１４：ガイドＲＮＡを用いたＲＡＢ７Ａ編集
この実施例は、ｉＰＳＣ由来の神経細胞における本開示のガイドＲＮＡによるＲＡＢ７Ａ編集を記載しており、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達された。ｉＰＳＣは、二重ＳＭＡＤ阻害を使用して、少なくとも６日間、神経系統に誘導された後、ＧＦＰ（対照）、又は３’ ＳｍＯＰＴ ｈＵ７ヘアピンを有するか、若しくは有しないＲａｂ７ガイドを発現するＡＡＶ２／２で感染させた。細胞を、一般的に、２４ウェルプレート中、１×１０＾５個／ウェルの細胞で播種し、指定のｖｇ／細胞で感染させた。感染から４８時間後、７２時間後、又は７日後にｍＲＮＡを単離し、ｄｄＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒ配列決定によってＲａｂ７編集を評価した。形質導入効率を、ＩｍａｇｅＪを使用して画像を定量化することによって評価した。簡単に述べると、ＧＦＰ＋シグナルを捕捉した各ウェルの画像、並びに同じ視野の明視野画像を撮影した。ＧＦＰ＋シグナルを閾値化し、陽性シグナルの面積を測定した。同様に、細胞を含んでいた明視野画像の面積を閾値化し、陽性シグナルの面積を測定した。ＧＦＰ＋面積を細胞面積で割り算し、形質導入率を得た。
ｉＰＳＣを、様々なｖｇ／細胞で４８時間又は７２時間形質導入し、８日間又は９日間の分化で採取した。Ｒａｂ７編集をｄｄＰＣＲによって測定した。図２１Ａに示されるように、ｖｇ／細胞が増加するにつれて、Ｒａｂ７編集の用量依存的増加が存在する。データは、生物学的複製物の平均±ＳＥＭを表す。Ｒａｂ７編集をＳａｎｇｅｒ配列決定によっても測定した。図２１Ｂに示されるように、ｖｇ／細胞が増加するにつれて、Ｒａｂ７編集の用量依存的増加が存在する。配列決定を定量化するためのｄｄＰＣＲ及びＳａｎｇｅｒ配列決定アプローチは、非常に類似した結果をもたらす。データは、生物学的複製物の平均±ＳＥＭを表す。図２１Ｃについて、ｉＰＳＣを、様々なｖｇ／細胞で７２時間又は７日間形質導入し、１７日間以上の分化で採取した。Ｒａｂ７編集をｄｄＰＣＲによって測定した。データは、生物学的複製物の平均±ＳＥＭを表す。
図２２Ａは、９日間の分化後、７２時間の感染後に採取した細胞におけるＲａｂ７編集効率に対してプロットされた形質導入％を示す。ドットの色は、細胞を治療したウイルスの力価を表す。ウイルス力価は、形質導入効率に直接関連する。図２２Ｂは、様々な日数の分化後に採取した細胞におけるＲａｂ７編集効率に対してプロットされた形質導入％を示す。ドットの色は、分化の日数を表し、ドットのサイズは、細胞を治療したウイルスの力価を表す。
図２３は、対照に対するＵ７ ｓｍＯＰＴ線形ガイドのオフターゲット編集プロファイルを示す。
以下の表３は、本開示の様々な配列を示す。配列中の要素のフォーマットは、表３の２列目のフォーマットに従う。
Figure 2023523237000007
Figure 2023523237000008
Figure 2023523237000009
Figure 2023523237000010
Figure 2023523237000011
Figure 2023523237000012
Figure 2023523237000013
Figure 2023523237000014
Figure 2023523237000015
Figure 2023523237000016
Figure 2023523237000017
Figure 2023523237000018
Figure 2023523237000019
Figure 2023523237000020
Figure 2023523237000021
Figure 2023523237000022
Figure 2023523237000023

Claims (51)

  1. 操作されたポリヌクレオチドであって、
    標的ＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ前記標的ＲＮＡの前記一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズするときに、少なくとも１つのミスマッチを含有する、標的化配列と、
    スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソーム核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）由来のＳｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、
    スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、
    前記操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集エンティティによる前記標的ＲＮＡの塩基の編集を容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
  2. 操作されたポリヌクレオチドであって、
    標的ＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的にハイブリダイズし、かつ少なくとも１つのミスマッチヌクレオチドを含有する、標的化配列であって、前記標的ＲＮＡが、疾患又は状態に関与するエクソン中に変位を含む、標的化配列と、
    スプライセオソームｓｎＲＮＡ若しくは非スプライセオソーム核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）由来のＳｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、
    スプライセオソームｓｎＲＮＡ、非スプライセオソームｓｎＲＮＡ由来のヘアピン、又はこれらのいずれかのバリアントと、を含み、
    前記操作されたポリヌクレオチドが、前記標的ＲＮＡ中のエクソンのエクソンスキッピングを容易にするように構成されている、操作されたポリヌクレオチド。
  3. 前記ミスマッチが、少なくとも１つのアデニン－グアニン（Ａ－Ｇ）ミスマッチ、少なくとも１つのアデニン－アデニン（Ａ－Ａ）ミスマッチ、又は少なくとも１つのアデニン－シトシン（Ａ－Ｃ）を含む、請求項１又は２に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  4. 前記ミスマッチが、Ａ－Ｃミスマッチを含む、請求項３に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  5. 前記Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアント、及び前記ヘアピンが、前記操作されたポリヌクレオチドの３’末端上にある、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  6. 前記標的化配列が、約２５塩基～約２００塩基長である、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  7. 前記標的化配列が、少なくとも約３０塩基長である、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  8. 前記操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  9. 前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターが、Ｕ７プロモーターを含む、請求項１０に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  10. 前記操作されたポリヌクレオチドが、Ｕ６プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  11. 前記Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントが、ＳｍＯＰＴ配列である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  12. 前記ＳｍＯＰＴ配列が、配列番号４１に対して少なくとも約８０％の配列同一性を含む、請求項１１に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  13. 前記ＳｍＯＰＴ配列が、配列番号４１の配列を含む、請求項１１に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  14. 前記ヘアピンが、マウスＵ７ ｓｎＲＮＡ、ヒトＵ７ ｓｎＲＮＡ、又はヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ由来である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  15. 前記ヘアピンが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つのヘアピン配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  16. 前記ヘアピンが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、又は配列番号４６のうちのいずれか１つのヘアピン配列を含む、請求項１５に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  17. 前記ヘアピンが、配列番号４３のヘアピン配列を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  18. 前記操作されたポリヌクレオチドの前記３’末端にＵ７ボックスターミネーターを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  19. ５’から３’の前記標的化配列が、前記標的化配列と、前記Ｓｍ若しくはＳｍ様タンパク質結合ドメイン、又はそのバリアントと、前記ヘアピンと、を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  20. 前記操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集エンティティによる前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を容易にするように構成されている、請求項２に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  21. 前記ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲタンパク質、ＡＰＯＢＥＣタンパク質、又は両方を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  22. 前記ＲＮＡ編集エンティティが、ＡＤＡＲを含み、前記ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  23. 前記標的化配列が、疾患又は状態において実行される標的ＲＮＡに少なくとも部分的に結合する、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  24. 前記標的ＲＮＡが、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＨＦＥ、ＬＩＰＡ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  25. 前記標的ＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１であり、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１が、Ｅ３４２Ｋ変異を含む、請求項２４に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  26. 前記標的ＲＮＡが、ＬＲＲＫ２であり、前記ＬＲＲＫ２が、Ｇ２０１９Ｓ変異を含む、請求項２４に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  27. 前記疾患又は状態が、レット症候群、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、又はテイ・サックス病を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  28. 前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡ内のエクソンに対して近位のスプライスシグナルに対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  29. 前記標的化配列が、
    （ａ）前記標的ＲＮＡ内のエクソンの上流にある分岐点に対して少なくとも部分的に相補的であるか、又は
    （ｂ）前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡ内のエクソンの下流にあるドナースプライス部位に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項２８に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  30. 前記ミスマッチが、前記標的化配列のいずれかの末端から約１～約２００塩基に位置する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  31. 前記ミスマッチが、前記標的化配列のいずれかの末端から少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、又は５５塩基に位置する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  32. デアミナーゼ動員ドメインを更に含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  33. 前記デアミナーゼ動員ドメインが、ＧｌｕＲ２、Ａｌｕ、これらのいずれかの一部分、これらのいずれかのバリアント、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３２に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  34. 前記デアミナーゼ動員ドメインが、ステムループを含む、請求項３２又は３３に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  35. 前記ステムループが、ＧｌｕＲ２ドメインに対して少なくとも約８０％の配列同一性を含む、請求項３４に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  36. 前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡの３’又は５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項１～３５のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  37. 前記標的化配列が、翻訳開始部位の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項１～３５のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  38. 前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡのイントロン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項１～３５のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  39. 前記標的化配列が、前記標的ＲＮＡのエクソン領域の少なくとも一部分と少なくとも部分的に会合するように構成されている、請求項１～３５のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  40. 前記操作されたポリヌクレオチドが、約８０ヌクレオチド～約６００ヌクレオチドである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。
  41. 請求項１～４０のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチドを含むか、又はそれをコードする、ベクター。
  42. 前記ベクターが、リポソーム、ナノ粒子、又はデンドリマーを含む、請求項４１に記載のベクター。
  43. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４１に記載のベクター。
  44. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４３に記載のベクター。
  45. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２ベクター、ＡＡＶ５ベクター、ＡＡＶ８ベクター、ＡＡＶ９ベクター、又はこれらのいずれかのハイブリッドである、請求項４４に記載のベクター。
  46. 請求項１～４０のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド、請求項１～４０のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、又は請求項４１～４５のいずれか一項に記載のベクターと、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体と、を含む、単位剤形での薬学的組成物。
  47. 状態を治療又は予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～４０のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド、請求項１～４０のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、若しくは請求項４１～４５のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項４６に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
  48. 前記状態が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、レット症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、又はスターガルト病である、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記状態が、ＲＡＢ７Ａ、ＡＢＣＡ４、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１ Ｅ３４２Ｋ、ＨＥＸＡ、ＬＲＲＫ２、ＳＮＣＡ、ＤＭＤ、ＡＰＰ、Ｔａｕ、ＣＦＴＲ、ＡＬＡＳ１、ＡＴＰ７Ｂ、ＡＴＰ７Ｂ Ｇ１２２６Ｒ、ＨＦＥ Ｃ２８２Ｙ、ＬＩＰＡ ｃ．８９４ Ｇ＞Ａ、ＰＣＳＫ９開始部位、又はＳＣＮＮ１Ａ開始部位、これらのいずれかの断片、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される遺伝子中の変異と関連する、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記投与することが、吸入、耳、口腔内、結膜、歯、子宮頸管内、洞内（ｅｎｄｏｓｉｎｕｓｉａｌ）、気管内、腸内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸透、間質内、腹部内、羊膜内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、嚢内、心腔内、軟骨内、仙骨内、陰茎海綿体内、腔内、脳室内、大槽内、角膜内、歯冠内、冠内、海綿体内、皮内、椎間板内、管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、海馬内、回腸内、病変内、管腔内、リンパ管内、髄腔内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸腔内、前立腺内、肺内、洞内（ｉｎｔｒａｓｉｎａｌ）、髄腔内、滑液嚢内、腱内、精巣内、胸郭内、管内（ｉｎｔｒａｔｕｂｕｌａｒ）、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴、膀胱内、硝子体内、イオントフォレシス、灌注、喉頭、経鼻、経鼻胃、眼内、経口、口腔咽頭、非経口、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、関節周囲、硬膜周囲、神経周囲、歯周、直腸、眼球後方、クモ膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、膣、眼窩下、実質内、鞘内、心室内、定位的、又はこれらの任意の組み合わせである、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の方法。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、鞘内、腹腔内、筋肉内、血管内、又は注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚等の表面の外表面に対する局所投与（ローション、クリーム、軟膏）を含み得る。いくつかの場合において、投与は、実質注射、髄腔内注射、心室内注射、大槽内注射、静脈内注射、若しくは経鼻投与、又はこれらの任意の組み合わせによるものである。
  51. 前記対象が、ヒトである、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の方法。
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