JP2023514392A - アジュバントを伴わない免疫反応の誘導のためのＩｇＧ変異体 - Google Patents

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Abstract

本開示は、多様な病原体に対するワクチン接種設計に有用である免疫グロブリン変異体、ならびにこの変異体の産生法および使用法に関する。いくつかの側面において、免疫グロブリン変異体は、ＩｇＧ、例えば６Ｄ８抗体の変異体である。【選択図】図１－１

Description

関連出願
［０００１］本出願は、「アジュバントを伴わない中和免疫反応の誘導のためのＩｇＧ変異体」と題される、２０２０年２月２１日出願の米国仮特許出願第６２／９８０，０１２号の恩典を請求し、該出願の開示の全体が本明細書に援用される。
電子的に提出された資料の援用
［０００２］本明細書と同時に提出され、そして以下のように同定されるコンピュータ読み取り可能ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が本明細書に援用される：２０２１年２月２１日に作成された「ＳｅｑＬｉｓｔ」と名付けられた１つの４１６，５７２バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
技術分野
［０００３］本開示は、アジュバントを伴わずに強力な免疫反応を誘導する免疫グロブリン変異体、および植物においてこうした変異体を産生するためのベクターに関する。
［０００４］組換えタンパク質抗原からなるサブユニットワクチンは、その安全性、産生の容易さ、および所望のエピトープに合わせて仕立てられたターゲティング免疫反応を誘発する能力のため、非常に有望である。しかし、単独で送達される際、これらの抗原はしばしば、ロバストで長期持続性の免疫反応を生成することに失敗し、その免疫原性を増進させる戦略が必要となる。したがって、組換えタンパク質抗原が、療法的使用のための候補であった。免疫グロブリンＦｃドメインに対するタンパク質融合体は、療法候補として非常に高い潜在能力を示してきている。Ｆｃへの関心対象のタンパク質の融合は、融合パートナーの可溶性および安定性を増進させうる一方、また、プロテインＡ／Ｇアフィニティクロマトグラフィを通じた、単純でそして費用効率的な精製も可能にする。さらに、体内で新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用することによって、Ｆｃ融合体は、リソソーム分解を回避可能であり、それによって、Ｆｃ融合体の血清半減期は延長しうる。
［０００５］Ｆｃ融合体を用いた研究の多くは、その療法的潜在能力を改善することに重点が置かれてきたが、より少ない研究は、抗原免疫原性を増進させるための戦略として、Ｆｃ融合体を調べてきた。Ｆｃγ受容体および補体受容体Ｃ１ｑを含有する抗原提示細胞は、ＩｇＧに結合した抗原を取り込み、そしてプロセシングすることも可能である。しかし、これらの相互作用は、活性化のために高いアビディティの結合を必要とし、そしてしたがって、一価Ｆｃ抗原融合体は、これらの経路を効率的に利用しえない。他方で、多価Ｆｃドメインを含む、より大きい抗原－抗体免疫複合体は、Ｆｃ受容体を架橋して、そして効率的にＣ１ｑに結合可能であり、樹状細胞による非常に改善された取り込みおよび提示、ならびにＴ細胞の改善された活性化を生じる。抗体と抗原を混合することによって生成される免疫複合体は、しばしば、一致しない結果を生じる：免疫反応は、好ましい抗原部位に向かうよう傾斜しうるが、全体の免疫原性は顕著には改善されない可能性もある。
［０００６］対照的に、組換え免疫複合体（ＲＩＣ）は、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、エボラウイルス、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、デングウイルス、ヒトパピローマウイルスのワクチン候補を産生するために使用されてきている。ＲＩＣは、その同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原に遺伝子融合されたＩｇＧであり、天然感染中に見られるものを模倣する、より大きな高免疫原性の抗原－抗体クラスターの形成を可能にする。
［０００７］本開示は、免疫グロブリン変異体、例えば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）変異体である組換えタンパク質、ならびにその産生法および使用法に関する。いくつかの側面において、ＩｇＧ変異体は６Ｄ８抗体に基づく。組換えタンパク質中の抗体部分が６Ｄ８抗体である特定の態様において、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ融合体は、置換突然変異Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙを含む。
［０００８］いくつかの態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ融合体のユニット、ＩｇＧの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニット；ならびにＩｇＧの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのユニットを含む。抗原のユニットは、ＩｇＧのエピトープではなく、そしてこのユニットは、Ｎ末端でＩｇＧのＶＨドメインのユニットに、またはＣ末端でＩｇＧのＣＨ３ドメインに連結される。ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインに連結される一方、ＩｇＧのＶＬドメインのユニットは、ＩｇＧのＶＨドメインのユニットに、そしてＩｇＧのＣＨ１ドメインに融合される。いくつかの実施において、組換えタンパク質は、エピトープタグがＩｇＧのエピトープである、エピトープタグのユニットをさらに含む。
［０００９］いくつかの側面において、組換えタンパク質は、抗原の２つのユニット、Ｆｃ融合体の２つのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニット、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット、およびＩｇＧのＶＬドメインの２つのユニットを含む。ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ１ドメインの連結で形成されるジスルフィド結合は、Ｆｃ融合体の２つのユニットを連結する。いくつかの側面において、ＩｇＧのＶＬドメインの各ユニットは、ＩｇＧのＶＨドメインのユニットおよびＩｇＧのＣＨ１ドメインに連結される。特定の実施において、組換えタンパク質は、ＩｇＧのいかなる軽鎖定常（ＣＬ）ドメインも含まない。抗原の２つのユニット、Ｆｃ融合体の２つのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニット、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット、およびＩｇＧの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインの２つのユニットを含む組換えタンパク質のいくつかの態様において、組換えタンパク質は、エピトープタグの２つのユニットをさらに含み、ここでこのエピトープタグはＩｇＧのエピトープである。いくつかの実施において、エピトープタグの２つのユニットは、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端でＦｃ融合体の２つのユニットに連結される一方、抗原の２つのユニットは、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニットに連結される。他の実施において、エピトープタグの２つのユニットは、抗原の２つのユニットに連結される一方、抗原の２つのユニットは、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端でＦｃ融合体の２つのユニットに連結される。特定の態様において、抗体は６Ｄ８抗体であり、そしてエピトープタグは、ペプチド配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）を含む。
［００１０］他の態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ融合体のユニット、ＩｇＧのＶＨドメインのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニット、ＩｇＧのＶＬドメインのユニット；ならびにＩｇＧのＣＬドメインのユニットを含む。こうした態様において、ＩｇＧは６Ｄ８抗体であり、そしてＦｃ融合体は、置換突然変異Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙを含む。抗原のユニットは、６Ｄ８抗体のエピトープではなく、そしてこのユニットは、Ｃ末端でＩｇＧのＣＨ３ドメインに連結される。ＩｇＧのＶＬドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＬドメインのユニットに連結され、そしてＩｇＧのＣＬドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＨ１ドメインに連結される。次いでＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、６Ｄ８抗体のエピトープタグをさらに含み、例えばペプチド配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）を含む。
［００１１］いくつかの側面において、組換えタンパク質中のエピトープタグは、配列ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）を含む。他の側面において、エピトープタグは、配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなる。
［００１２］組換えタンパク質のさらに他の態様において、ＩｇＧ変異体は、抗原の２つのユニット、Ｆｃ融合体の２つのユニット、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット、およびＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニットを含む。抗原は、ＩｇＧのエピトープではなく、そして抗原の２つのユニットは、Ｎ末端でＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニットに連結される。ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニットは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインで、Ｆｃ融合体の２つのユニットに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、ＩｇＧのＣＬドメインを含まず、そしてＩｇＧのＶＬドメインを含まない。
［００１３］特定の実施において、組換えタンパク質の抗原は、ジカウイルス由来であり、例えば抗原のユニットは、寄託番号第ＡＭＣ１３９１１．１号のＫ３０１～Ｔ４０６を含む。他の実施において、組換えタンパク質の抗原は、ノロウイルス由来であり、例えば抗原のユニットは、ノロウイルスの主要カプシドタンパク質由来の少なくとも１つの部分および／またはノロウイルスの非構造タンパク質１（ＮＳ１）由来の少なくとも１つの部分を含む。いくつかの態様において、抗原のユニットは、ノロウイルス主要カプシドタンパク質の突出ドメイン由来の少なくとも１つの長さ５～５００残基の部分、ノロウイルス主要カプシドタンパク質のシェルドメイン、またはノロウイルスのＮＳ１由来の部分を含む。いくつかの側面において、組換えタンパク質の抗原は、複数の抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、いくつかの実施において、抗原のユニットは、主要カプシドタンパク質由来の少なくとも１つの部分、あるいは複数のノロウイルス株または種のＮＳ１由来の、例えばヒトノロウイルスＧＩ．３、ヒトノロウイルスＧＩＩ．４、およびネズミノロウイルス（ＭＮＶ）由来の少なくとも１つの部分を含む。いくつかの態様において、抗原のユニットは、配列番号３４～７２に示される少なくとも１つの配列を含む。
［００１４］本明細書記載の産生法は、植物において組換えタンパク質を発現する工程を含む。言い換えると、組換えタンパク質は、トランスジェニック植物において産生される。特定の実施において、組換えタンパク質は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされているトランスジェニック植物において発現される。いくつかの側面において、本明細書記載の組換えタンパク質を産生する方法は：ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄからなる群より選択されるベクターをアグロバクテリウム内に導入し、そして該ベクターを含有するアグロバクテリウムを植物部分に浸潤させて、形質転換植物部分を産生する工程を含む。次いで、形質転換植物から未精製タンパク質を抽出し、その後、組換えタンパク質に関して精製する。アグロバクテリウム内に導入するベクターが：ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、およびｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３からなる群より選択される産生法に関しては、方法は、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋを含有するアグロバクテリウムおよび該ベクターを含有するアグロバクテリウムとの共浸潤をさらに含む。
［００１５］本明細書記載の使用法には、組換えタンパク質中の抗原に対して、被験体において免疫反応を誘導する方法が含まれる。該方法は、被験体に、記載される組換えタンパク質を投与する工程を含む。特定の態様において、方法は、被験体において、ジカウイルスに対する免疫反応を誘導する。こうした態様において、組換えタンパク質は、寄託番号第ＡＭＣ１３９１１．１号のＫ３０１～Ｔ４０６を含むアミノ酸配列を含む抗原を含む。他の態様において、方法は、被験体において、ヒトノロウイルスおよびＭＮＶを含むノロウイルスに対する免疫反応を誘導する。こうした態様において、組換えタンパク質は、ノロウイルスのＶＰ１由来の、例えばその突出ドメインまたはシェルドメイン由来の、あるいはノロウイルスのＮＳ１由来の抗原を含む。
［００１６］いくつかの実施において、被験体は、複数のノロウイルスのＶＰ１由来の抗原を含む組換えタンパク質、および複数のノロウイルスのＮＳ１由来の抗原を含む組換えタンパク質を含む組成物を投与される。さらに他の実施において、組換えタンパク質は、トランスジェニック植物中で産生される。いくつかの側面において、トランスジェニック植物は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされる。
［００１７］図１Ａ～Ｂは、特定の態様にしたがって、ＩｇＧ融合構築物、およびＣ１ｑに結合するそれぞれの能力の比較を示す。図１Ａは、本明細書に開示される特定のＩｇＧ融合構築物の模式図である。この図で用いられる際、ＺＥ３はアミノ酸Ｋ３０１～Ｔ４０６を含有するジカエンベロープドメインＩＩＩを指し；ｅは組換え免疫複合体（ＲＩＣ）形成のための６Ｄ８結合モチーフである、ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）からなるペプチド配列を含むエピトープタグを指し；稲妻付きのｅは、ＲＩＣ形成を減少させるため、ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなるペプチド配列を含むエピトープタグを指し；ＶＨは可変重鎖ドメインを指し；ＶＬは可変軽鎖ドメインを指し；Ｈは重鎖定常ＣＨ１ドメインを指し；Ｌは軽鎖定常ドメインを指し；Ｆｃは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる重鎖定常領域の部分を指し；そして稲妻付きのＦｃは、Ｆｃと同じだが、六量体形成を誘導するため、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙ突然変異を含むものを指す。図１Ｂは、ＩｇＧ融合構築物がｍＡｂ ６Ｄ８ヒトＩｇＧ１主鎖上で構築されている、精製ＩｇＧ融合構築物のＣ１ｑ結合ＥＬＩＳＡを示す。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌヒトＣ１ｑでコーティングし、そして陰性対照として融合体を含まない６Ｄ８抗体を用い、１０μｇ／ｍｌの各融合体とインキュベーションした。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いて、構築物を検出した。示される群間での比較を伴い、一方向ＡＮＯＶＡによって測定されるように、ｐ＜０．０５を示す１つの星印（＊）およびｐ＜０．００１を示す３つの星印（＊＊＊）とともに、３つの試料由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示す。 図１Ａ～Ｂは、特定の態様にしたがって、ＩｇＧ融合構築物、およびＣ１ｑに結合するそれぞれの能力の比較を示す。図１Ａは、本明細書に開示される特定のＩｇＧ融合構築物の模式図である。この図で用いられる際、ＺＥ３はアミノ酸Ｋ３０１～Ｔ４０６を含有するジカエンベロープドメインＩＩＩを指し；ｅは組換え免疫複合体（ＲＩＣ）形成のための６Ｄ８結合モチーフである、ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）からなるペプチド配列を含むエピトープタグを指し；稲妻付きのｅは、ＲＩＣ形成を減少させるため、ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなるペプチド配列を含むエピトープタグを指し；ＶＨは可変重鎖ドメインを指し；ＶＬは可変軽鎖ドメインを指し；Ｈは重鎖定常ＣＨ１ドメインを指し；Ｌは軽鎖定常ドメインを指し；Ｆｃは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる重鎖定常領域の部分を指し；そして稲妻付きのＦｃは、Ｆｃと同じだが、六量体形成を誘導するため、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙ突然変異を含むものを指す。図１Ｂは、ＩｇＧ融合構築物がｍＡｂ ６Ｄ８ヒトＩｇＧ１主鎖上で構築されている、精製ＩｇＧ融合構築物のＣ１ｑ結合ＥＬＩＳＡを示す。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌヒトＣ１ｑでコーティングし、そして陰性対照として融合体を含まない６Ｄ８抗体を用い、１０μｇ／ｍｌの各融合体とインキュベーションした。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いて、構築物を検出した。示される群間での比較を伴い、一方向ＡＮＯＶＡによって測定されるように、ｐ＜０．０５を示す１つの星印（＊）およびｐ＜０．００１を示す３つの星印（＊＊＊）とともに、３つの試料由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示す。 ［００１８］図２Ａ～Ｂは、特定の態様にしたがって、６Ｄ８抗体主鎖上に構築されたＩｇＧ融合体の発現を示す。図２Ａは、ＩｇＧ融合構築物発現のＥＬＩＳＡおよびゲル定量化を示す。各ＩｇＧ融合構築物でアグロインフィルトレーションされた葉の斑点からの清澄化タンパク質抽出物を、ＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥ、その後、ゲル定量化によって分析した。ＺＥ３ ＥＬＩＳＡに関しては、プレートをポリクローナルマウス抗ＺＥ３でコーティングし、標準として精製ＨＬＺを用いて、各ＩｇＧ融合体からの抽出物の連続希釈とインキュベーションし、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰで探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。ＩｇＧ ＥＬＩＳＡに関しては、プレートを抽出物の連続希釈またはヒトＩｇＧ標準でコーティングし、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰで探査した。ゲル定量化のため、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、標準として精製６Ｄ８を用い、無染色ポリアクリルアミドゲル上で視覚化されたＩｇＧ融合バンド強度を比較した。カラムは、独立の３つの浸潤葉試料由来の平均±標準誤差を示す。図２Ｂは、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離された清澄化葉抽出物の代表的なゲル画像を示す。それぞれの重鎖／ＺＥ３融合体各々に対応するバンド位置を、「ＺＨ／ＨＺ」で示す。ＨＬＺｅおよびＨＬＺｄ中のサイズの小さいシフトは、エピトープタグ存在のためである。Ｒｕｂｉｓｃｏの大サブユニット「ＲｂｃＬ」を、ＺＦｃおよびＦｃバンドと共に示す。 ［００１９］図３は、特定の態様にしたがって、６Ｄ８抗体主鎖上で構築されたＩｇＧ融合体の精製を示す。構築物あたり、１～３つの植物由来のアグロインフィルトレーションされた葉の材料をホモジナイズし、清澄化し、そしてプロテインＧアフィニティクロマトグラフィによって精製した。ピーク溶出をプールし、そして無染色ポリアクリルアミドゲルを用いて、非還元および還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した。各構築物に関する代表的なレーンを示す。 ［００２０］図４Ａ～Ｂは、特定の態様にしたがって、６Ｄ８抗体主鎖上に構築されたＩｇＧ融合体のスクロース勾配密度遠心分離を示す。精製ＩｇＧ融合体は、５／１０／１５／２０／２５％不連続スクロース層を用いたスクロース勾配遠心分離によって分離された。勾配分画をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、そして代表的な結果を示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて相対バンド強度を定量化し、そしてピークバンドに恣意的に１の値を割り当てた。 ［００２１］図５Ａ～Ｂは、特定の態様にしたがって、６Ｄ８抗体主鎖上に構築された精製ＩｇＧ融合体の安定性およびＣ１ｑ結合を示す。精製ＩｇＧ融合体の試料を、精製後、１回、凍結および融解する（最初）か、またはさらに５回の凍結／融解サイクルに供するかいずれか、４℃で２週間インキュベーションするか、または室温で２週間インキュベーションした。図５Ａは、各処理に関する完全集合産物（ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析）の相対比率を示す。処理後、試料を還元および非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離した。図５Ｂは、各処理後のＩｇＧ構築物のＣ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ結果を示す。カラムは、３つの試料由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示す。 ［００２２］図６Ａ～６Ｂは、特定の態様にしたがって、ＩｇＧ融合体でのマウス免疫および血清力価の結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたり６匹）を、各ＩｇＧ融合体に関して８μｇのＺＥ３を送達するであろう用量、または対照としてのＰＢＳで、２週間間隔を空けて２回、皮下的に免疫した。マウス血清試料を最終用量の２週間後に収集した。図６Ａに関しては、連続希釈マウス血清を、ＥＬＩＳＡによって総ＩｇＧ産生に関して分析した。バックグラウンドの少なくとも２倍のＯＤ４５０読み取り値を生じる最大希釈の逆数として、終点を取った。３つの星印（＊＊＊）は、ＺＥ３に、示されるカラムを比較するＡＮＯＶＡによる、ｐ＜０．０１を示す。図６Ｂに関しては、マウス血清試料を１：１００に希釈し、そしてＥＬＩＳＡによってＩｇＧ２ａ産生を分析した。ＨＬＺに、示されるカラムを比較するＡＮＯＶＡにより、（＊＊）はｐ＜０．０５を示し、そして（＊＊＊）はｐ＜０．０１を示す。 ［００２３］図７は、特定の態様にしたがって、一本鎖抗体（ＨＶＬ）およびＨＶＬ関連構築物を示す。示される一本鎖抗体は、６Ｄ８抗体重鎖に直接融合された可変軽鎖領域に連結された、６Ｄ８抗体可変重鎖領域を含有する。この図で用いられる際、ＺＥ３はアミノ酸Ｋ３０１～Ｔ４０６を含有するジカエンベロープドメインＩＩＩを指し；ｅはＲＩＣ形成のための６Ｄ８結合モチーフである、ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）からなるペプチド配列を含むエピトープタグを指し；ＶＨは６Ｄ８抗体由来の可変重鎖ドメインを指し；ＶＬは６Ｄ８抗体由来の可変軽鎖ドメインを指し；Ｈは６Ｄ８抗体由来の重鎖定常領域ＣＨ１ドメインを指し；Ｆｃは、６Ｄ８抗体由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる重鎖定常領域を指し；そして稲妻付きのＦｃは、Ｆｃと同じだが、六量体形成を誘導するため、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙ突然変異を含むものを指す。 ［００２４］図８は、特定の態様にしたがって、ＨＶＬおよびＨＶＬ融合構築物の精製およびウェスタンブロット分析を示す。ＨＶＬ、ＨＶＬＺｅ、およびＺＨＶＬＨｘ構築物のプロテインＧ精製後、ピーク溶出由来の試料を、４～１５％ポリアクリルアミド、無染色ゲル上で分離した。遠心分離によって清澄化されている、小規模葉試料を含有するウェスタンブロットを通じて、ＨＶＬＨＸおよびＨＶＬＺｎｔ構築物の分析を行った。試料を４～１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、そしてＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。 ［００２５］図９は、特定の態様にしたがって、野生型および糖操作された植物において産生されるＩｇＧ融合構築物のＣ１ｑ結合比較を示す。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌヒトＣ１ｑでコーティングし、そして５μｇ／ｍｌの各精製構築物とインキュベーションした。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いて、構築物を検出した。３つの複製物由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示し、２つの星印は、示される群間の比較を伴う一方向ＡＮＯＶＡによって測定された際のｐ＜０．０１を示す。この図で用いられる場合、ｗｔは、野生型ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物において作製された構築物を指し、一方、ＧｎＧｎは、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされた糖操作植物において作製された構築物を指す。 ［００２６］図１０は、特定の態様にしたがって、６Ｄ８抗体主鎖上で構築されたＩｇＧ融合体間のＣ１ｑ結合比較を示す。ＥＬＩＳＡプレートを１０μｇ／ｍｌヒトＣ１ｑでコーティングし、そして５０μｇ／ｍｌから出発して各精製構築物の１０倍連続希釈とインキュベーションした。ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いて、構築物を検出した。３つの複製物からの平均ＯＤ４５０値を示す。この図で用いられる際、ｗｔは野生型ベンサミアナタバコ植物で作製された構築物を指し；ＧｎＧｎはキシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされた糖操作植物で作製された構築物を指し；Ａｇは６Ｄ８エピトープでタグ付けされたデングコンセンサス、デングＥタンパク質ドメインＩＩＩ（ｃＥ）を指し；そしてＺＨＬは、ＨＬと同じであるが、６Ｄ８重鎖のＮ末端に融合されたＺＥ３を含むものを指す。 ［００２７］図１１は、特定の態様にしたがって、野生型６Ｄ８抗体のものに比較した、６Ｄ８抗体主鎖上に構築された一本鎖抗体（ＨＶＬ）のエピトープ結合を示す。９００ｎｇの精製エピトープタグ付けタンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、ＨＶＬ（６Ｄ８重鎖に融合された可変軽鎖領域に連結された可変重鎖を含む一本鎖抗体）または全長６Ｄ８抗体のいずれかの連続希釈とインキュベーションした。 ［００２８］図１２は、特定の態様にしたがって、ＲＩＣ不溶性を示す代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。示される構築物でアグロインフィルトレーションされたベンサミアナタバコの葉からタンパク質を抽出し、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥ、その後ウェスタンブロッティングによって、非還元条件下で分離した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを用いて構築物を検出した。可溶性（Ｓ）は、清澄化未精製葉抽出物を指し、一方、不溶性（ＩＳ）は、清澄化の後、ペレットであり、ＳＤＳ試料緩衝液中に再懸濁されているものを指す。 ［００２９］図１３Ａ～Ｃは、特定の態様にしたがって、６Ｄ８エピトープタグ突然変異体の可溶性および結合に関する研究を示す。図１３Ａ～Ｂに関しては、示される構築物でアグロインフィルトレーションされたベンサミアナタバコの葉からタンパク質を抽出し、そして非還元条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、その後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰをプローブとして用いたウェスタンブロッティングによって分離した。可溶性は、清澄化未精製葉抽出物を指し、一方、不溶性は、清澄化の後、ペレットであり、ＳＤＳ試料緩衝液中に再懸濁されているものを指す。「ａ」と示されるエピトープ突然変異体は、ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）からなるペプチド配列を有する。「ｂ」と示されるエピトープ突然変異体は、ＶＹＫＬＤＩＳＥ（配列番号３）からなるペプチド配列を有する。「ｃ」と示されるエピトープ突然変異体は、ＹＫＬＤＩＳＥ（配列番号４）からなるペプチド配列を有する。「ｄ」と示されるエピトープ突然変異体は、ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなるペプチド配列を有する。 図１３Ａ～Ｃは、特定の態様にしたがって、６Ｄ８エピトープタグ突然変異体の可溶性および結合に関する研究を示す。図１３Ｃに関しては、示されるエピトープタグ突然変異体を含有する精製重鎖の連続希釈でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、全長６Ｄ８で、その後、ヤギ抗ヒトカッパＨＲＰで探査した。３つの複製物由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示す。 ［００３０］図１４Ａおよび１４Ｂは、特定の態様にしたがって、それぞれ、ノロウイルス（ＮｏＶ）をターゲティングする組換え免疫複合体（ＲＩＣ）構築物の模式図、および精製ＲＩＣ構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。図１４Ｂにおいて、ＶＰ１突出ドメインの保存されるエピトープをターゲティングするＲＩＣ構築物は、Ｐ－ＲＩＣと表示され（抗原のユニットは、配列番号３４～４２のタンデム連結配列を含む）；ＶＰ１シェルドメインをターゲティングするものは、Ｓ－ＲＩＣと表示され（抗原のユニットは、配列番号４５～５３のタンデム連結配列を含む）；Ｔ細胞エピトープをターゲティングするものは、Ｔ－ＲＩＣと表示され（抗原のユニットは配列番号５８～７２のタンデム連結配列を含む）；そしてヒトノロウイルスＧＩ．３、ヒトノロウイルスＧＩＩ．４、およびネズミノロウイルス（ＭＮＶ）の非構造タンパク質１（ＮＳ１）由来のエピトープを含む抗原のユニットを含有するものは、Ｎ－ＲＩＣと表示される（抗原のユニットは、配列番号５５～５７の配列のタンデム連結配列を含む）。ＲＩＣを精製し、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、そして無染色２，２，２－トリクロロエタノール（ＴＣＥ）画像化を通じてＵＶ下で視覚化した。「＋阻害剤」は、Ｎ－ＲＩＣの分解を減少させる植物プロテアーゼ阻害剤カクテルの添加を指す。 ［００３１］図１５は、特定の態様にしたがって、ノロウイルスをターゲティングする精製ＲＩＣ構築物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左図）およびウェスタンブロット（右図）を示す。精製ＲＩＣを、非還元（ＮＲ）または還元（Ｒ）条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、そして無染色２，２，２－トリクロロエタノール（ＴＣＥ）画像化を通じてＵＶ下で視覚化した（左図）。抗ネズミノロウイルス１（ＭＮＶ）ＮＳ１／２抗体、または抗ＭＮＶカプシド抗体で、ウェスタンブロットを行った。Ｐ、Ｐ－ＲＩＣ；Ｓ、Ｓ－ＲＩＣ；Ｔ、Ｔ－ＲＩＣ；Ｎ－ＲＩＣ。 ［００３２］図１６は、特定の態様にしたがって、ネズミノロウイルスへの血清結合を示す。ＲＩＣ構築物を通じて送達される２μｇ総量の抗原３用量で、あるいはヒトノロウイルスＧＩ．Ｉ（ノーウォークウイルス）／ヒトノロウイルスＧＩＩ．４（ミネルバウイルス）ＶＬＰ混合（「ＶＬＰ」と表示）で免疫されたマウス由来の血清を、ＥＬＩＳＡによって、ネズミノロウイルス１（ＭＮＶ－１）ウイルスへの結合に関して試験した。ポリスチレン９６ウェルプレートを、ウサギ抗ＭＮＶカプシドでコーティングし、５％ＰＢＳＴＭでブロッキングし、そして次いでＭＮＶ－１に感染したＲＡＷ２６７．４細胞由来の溶解物とインキュベーションした。インキュベーション後、マウス血清の連続希釈をプレートに添加し、そして次いで、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。２つの技術的複製物を含有するプールされたマウス血清由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示す。略語：Ｐ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｓ－ＲＩＣ：Ｓ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｔ－ＲＩＣ：Ｔ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｎ－ＲＩＣ：Ｎ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；ＰＳＴＮ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣ、Ｓ－ＲＩＣ、Ｔ－ＲＩＣおよびＮ－ＲＩＣで免疫されたが、個々の実験で用いられた用量の４分の１を用いた、マウス由来の血清。 ［００３３］図１７は、特定の態様にしたがって、ＧＩ．Ｉ ＶＬＰへの血清結合を示す。ＲＩＣ構築物を通じて送達される２μｇ総量の抗原３用量で免疫されたマウス由来の血清を、ＥＬＩＳＡによって、ＧＩ．ＩノロウイルスＶＬＰへの結合に関して試験した。ポリスチレン９６ウェルプレートを、植物で作製したノーウォークウイルスＶＬＰとインキュベーションし、ブロッキングし、そして次いでマウス血清の連続希釈とインキュベーションした。結合した抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。２つの技術的複製物を含有する６つの試料由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示す。略語：Ｐ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｓ－ＲＩＣ：Ｓ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｔ－ＲＩＣ：Ｔ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｎ－ＲＩＣ：Ｎ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；ＰＳＴＮ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣ、Ｓ－ＲＩＣ、Ｔ－ＲＩＣおよびＮ－ＲＩＣで免疫されたが、個々の実験で用いられた用量の４分の１を用いた、マウス由来の血清。 ［００３４］図１８は、特定の態様にしたがって、ヒトノロウイルスＧＩＩ．２ ＶＬＰへの血清結合を示す。ＲＩＣ構築物を通じて送達される２μｇ総量の抗原３用量で免疫されたマウス由来の血清を、ＥＬＩＳＡによって、ヒトノロウイルスＧＩＩ．２（スノーマウンテンウイルス）ＶＬＰへの結合に関して試験した。ポリスチレン９６ウェルプレートを、植物で作製したＧＩＩ．２ ＶＬＰとインキュベーションし、ブロッキングし、そして次いでマウス血清の連続希釈とインキュベーションした。結合した抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートで検出した。２つの技術的複製物を含有するプールされた血清試料由来の平均ＯＤ４５０値±標準誤差を示す。略語：Ｐ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｓ－ＲＩＣ：Ｓ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｔ－ＲＩＣ：Ｔ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｎ－ＲＩＣ：Ｎ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；ＰＳＴＮ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣ、Ｓ－ＲＩＣ、Ｔ－ＲＩＣおよびＮ－ＲＩＣで免疫されたが、個々の実験で用いられた用量の４分の１を用いた、マウス由来の血清。 ［００３５］図１９は、特定の態様にしたがって、ノロウイルスをターゲティングするＶＬＰまたはＲＩＣ構築物で免疫されたマウス由来のＩＦＮ－γ産生を示す。脾臓細胞を免疫マウスから採取し、そして対応する抗原で７２時間刺激した。刺激および未刺激脾臓細胞由来の上清を収集し、そしてＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γ産生をアッセイした。ポリスチレン９６ウェルプレートを、連続希釈脾臓細胞上清または組換えマウスＩＦＮ－γ標準でコーティングし、５％ＰＢＳＴＭでブロッキングし、そして次いで、ラット抗マウスＩＦＮ－γおよびヤギ抗ラットＩｇＧセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼコンジュゲートで探査した。ＯＤ４５０値を用いて標準曲線を構築し、そして各々２つの技術的複製物を含有する６つの試料由来の平均ＩＦＮ－γ産生±標準誤差を示す。略語：Ｐ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｓ－ＲＩＣ：Ｓ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｔ－ＲＩＣ：Ｔ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；Ｎ－ＲＩＣ：Ｎ－ＲＩＣで免疫されたマウス由来の血清；ＰＳＴＮ－ＲＩＣ：Ｐ－ＲＩＣ、Ｓ－ＲＩＣ、Ｔ－ＲＩＣおよびＮ－ＲＩＣで免疫されたが、個々の実験で用いられた用量の４分の１を用いた、マウス由来の血清。 ［００３６］図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。 図２０～３９は、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄのマップを示す。
［００３７］本開示の詳細な側面および適用を、以下の図および技術の詳細な説明において、以下に記載する。明記しない限り、本明細書および請求項中の単語および句は、単純で、一般的な、そして適用可能な分野の一般の当業者が慣れ親しんだ意味を与えることが意図される。
［００３８］以下の記載において、そして説明の目的のため、本開示の多様な側面の完全な理解を提供するために、多くの特定の詳細が示される。しかし、関連する分野の当業者によって、本明細書に開示する技術の態様は、これらの特定の詳細なしに実施されうることが理解されるであろう。開示される技術が適用されうる多くの異なるおよび別の配置、デバイスおよび技術があることに留意しなければならない。本明細書に開示する技術の完全な範囲は、以下に記載される例に限定されない。
［００３９］単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、背景が明らかに別に示さない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば「１つの工程（ａ ｓｔｅｐ）」への言及は、１つまたはそれより多くのこうした工程への言及を含む。
［００４０］本明細書において、用語「６Ｄ８抗体」は、エボラウイルスのＧＰ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を指す（Ｗｉｌｓｏｎら、２０００に記載される；植物に最適化された配列は、Ｈｕａｎｇら、２０１０に記載される）。いくつかの態様において、６Ｄ８抗体のＣＨ１ドメインは、
Figure 2023514392000002
（配列番号５）を含むペプチド配列、あるいは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの態様において、６Ｄ８抗体のＣＨ２ドメインは、
Figure 2023514392000003
（配列番号６）を含むペプチド配列、あるいは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの態様において、６Ｄ８抗体のＣＨ３ドメインは、
Figure 2023514392000004
（配列番号７）を含むペプチド配列を指す。いくつかの態様において、６Ｄ８抗体の可変重鎖ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＥＢ９６１４６号を含むペプチド配列、あるいは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの態様において、６Ｄ８抗体の可変軽鎖ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＥＢ９６１４６号を含むペプチド配列、あるいは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの側面において、軽鎖変異体ドメインをコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＨＱ４０７５４６号に示される。いくつかの側面において、重鎖変異体ドメインをコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＥＢ９６１４８号に示される。
［００４１］本明細書において、用語「連結される」は、タンパク質構造またはタンパク質ドメインの配置を記載するために用いられる際、２つのドメインまたは構造部分の間の連結を指し、この場合、好ましくはリンカーを除いて、他の介在するドメインまたは構造部分はない。いくつかの側面において、用語「リンカー」は、本明細書において、唯一の機能がタンパク質ドメインまたは構造部分を連結することである、タンパク質ドメインまたは構造部分間のアミノ酸配列を指す。例えば、リンカーは、グリシン、バリン、および／またはスレオニン残基からなる配列である。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン、バリン、スレオニン、アラニン、および／またはセリン残基からなる配列である。いくつかの側面において、リンカーは、長さ１～５０アミノ酸、例えば長さ３、４、６、１０、１２、１４、または１６アミノ酸からなる。特定の態様において、リンカーは柔軟性リンカーである。
［００４２］本明細書において、用語「ユニット」は、より大きな多構成要素タンパク質の機能的断片である単一のペプチドを指す。単一ペプチドは、抗原性断片またはタンパク質のドメイン、例えば免疫グロブリンのドメインであってもよい。したがって、本明細書において、ペプチドの２つのユニットを含む組換えタンパク質の記載は、ともに連結されていてもまたはいなくてもよい、２つのこうした機能的断片、例えばペプチドの二量体を有する組換えタンパク質を指す。
［００４３］本明細書において、用語「免疫複合体」は、その同族抗原に結合した、免疫グロブリン分子またはその断片を含む複合体を指す。本明細書において、用語「組換え免疫複合体」または「ＲＩＣ」は、免疫複合体中で免疫グロブリン分子を天然に産生する元来の種によっては産生されない、免疫複合体を指す。例えば、例示的な組換え免疫複合体は、植物において合成されたヒト免疫グロブリンを含む。
［００４４］本開示は、免疫グロブリン変異体に関する。特に好ましい態様において、本開示は、本明細書においてＩｇＧ融合体とも称される、免疫グロブリンＧの変異体である組換えタンパク質に関する。免疫グロブリンの天然構造からの逸脱にもかかわらず、記載される組換えタンパク質は、免疫原性潜在能力を有する。実際、該組換えタンパク質によって誘導される免疫反応は、組換えタンパク質中の抗原の予期される免疫反応と同様である。本明細書に記載される組換えタンパク質は、多様な病原体、例えばジカウイルスおよびノロウイルスをターゲティングするワクチンを生成するために適している。
［００４５］免疫グロブリン構造の変動にかかわらず、Ｆｃのグリコシル化状態は、その機能を強く制御する。Ｆｃの安定性、コンホメーション、および凝集を調節することによって、グリコシル化は、Ｆｃγ受容体、ＦｃＲｎ、およびＣ１ｑへの結合を増進または阻害しうる。これらの改変は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞仲介性食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、およびウイルス感染の抗体依存性増進（ＡＤＥ）を含む、抗体エフェクター機能に重要な相違を生じる。糖操作の進歩によって、多様な組換え発現系において、Ｆｃグリコシル化状態のターゲティングされた最適化が可能になっている。コアキシロースおよびフコースＮ－グリカンを欠く糖操作植物を用いると、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＣ１ｑへの結合が改善された抗ＣＤ２０抗体が産生された。該抗体は、哺乳動物細胞において産生された商業的抗ＣＤ２０抗体に比較して、増進されたＡＤＣＣおよびＣＤＣを有した。同様に、糖操作植物において産生された抗ＤＥＮＶ抗体は、そのＡＤＥ活性を控えることが示されてきており、そしてその結果、哺乳動物細胞で産生された対応物よりも優れた有効性および安全性プロファイルを有する。糖操作植物において作製された抗体療法剤は、エボラ、ＨＩＶ、およびチクングニヤウイルス疾患を有するアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）およびヒトを治療するために用いられてきている。
［００４６］望ましい特性を抗体に与える、Ｆｃ領域における突然変異が同定されてきている。Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ突然変異の導入は、低ｐＨ条件下で、ＦｃＲｎとの相互作用を改善することによって、ヒトにおいて、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体の血清半減期を、２０日から６０日に増加させた。Ｈ２３７Ｙ突然変異は、ヒンジ領域の有害な切断を減少させる一方、ＦｃγＲＩＩＩ結合およびＡＤＣＣ活性を改善した。さらなるジスルフィド結合の操作が、Ｆｃ融合体のアンフォールディングおよび凝集を防止することが報告されてきている。Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅ突然変異は、ＣＤ３７抗体のＦｃγＲＩＩＩ結合およびＡＤＣＣ活性を改善した。ＩｇＧ１ヒンジ領域を、ＩｇＧ３由来またはラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体由来のより長いヒンジ領域で置き換えると、上皮増殖因子受容体抗体のＡＤＣＣが増加した。Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙ突然変異を含むＩｇＧ１は六量体を形成し、これはＣ１ｑ結合および補体活性化を非常に増進させた。突然変異Ｔ４３７ＲおよびＫ２４８Ｅはまた、多量体化を促進し、そしてＯＸ４０受容体抗体のエフェクター機能を改善した。
［００４７］本明細書記載のＩｇＧ変異体は、ヒト様グリコシル化で適切に集合可能であり、そして植物において非常に高レベルで発現されうる。これらの構築物は、植物において効率的に作製され、適切に集合し、そしてプロテインＧカラムクロマトグラフィを通じて精製されうる。実施例に示すように、精製組換えタンパク質は、強力に免疫原性である。
［００４８］本明細書記載の実施例に示されるように、記載される免疫グロブリン変異体を産生するために、抗体設計の多様な側面、例えば複合体サイズを最適化すると、植物において最適化された発現レベル、ならびに改善された安定性、可溶性、および免疫受容体結合が生じる。抗原としてジカウイルスエンベロープタンパク質ドメインＩＩＩの部分を含む免疫グロブリン変異体を設計する特定の態様において、免疫グロブリン変異体の投与によって生じる総ＩｇＧ力価は、抗原単独の投与によって生じる総ＩｇＧ力価に比較して、１５０倍高かった。実際、終点力価は、いかなるアジュバントも伴わず、免疫グロブリン変異体の２回のみの用量の投与で、＞１：５００，０００であった。組換えタンパク質は、抗体療法剤の商業的実行可能性に関して概算される閾値を超えるレベルで産生可能であった。
組換えタンパク質
［００４９］本明細書記載の組換えタンパク質は、抗原のユニット、Ｆｃ融合体のユニット、ＩｇＧの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのユニット、およびＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットを含む、変異体免疫グロブリン構造である。Ｆｃ融合体は、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。免疫グロブリンＦｃドメインへのタンパク質融合体は、非常に成功した療法剤である。これらは、融合パートナーの可溶性および安定性を増進させうる一方、単純でそして費用効率的な精製のための手段も提供する。さらに、体内で新生Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）と相互作用することによって、Ｆｃ融合体は、リソソーム分解を回避可能であり、それによってＦｃ融合体の血清半減期は延長される。組換えタンパク質は、抗原単独よりも、組換えタンパク質に付着した抗原に対して、より大きい免疫反応を誘導する。したがって、組換えタンパク質は、抗原の免疫原性を増加させる。
［００５０］抗原のユニットは、ＩｇＧのエピトープではない。特定の態様において、抗原のユニットは、ＩｇＧのエピトープとは異なる生物に由来する。抗原のユニットのアミノ酸配列は、長さ５～５００残基の間である。特定の態様において、抗原のユニットは、長さ５～４００残基の間である。例えば、抗原のユニットは、長さ５～３００残基の間、５～２５０残基の間、５～２００残基の間、５～１００残基の間、９～３００残基の間、９～２５０残基の間、９～２００残基の間、９～１００残基の間、１０～３００残基の間、１０～２５０残基の間、１０～２００残基の間、１０～１００残基の間、２０～３００残基の間、２０～２５０残基の間、２０～２００残基の間、２０～１００残基の間、３０～３００残基の間、３０～２５０残基の間、３０～２００残基の間、３０～１００残基の間、５０～３００残基の間、５０～２５０残基の間、５０～２００残基の間、または５０～１００残基の間である。いくつかの側面において、抗原のユニットはタンデム連結エピトープを含む。
［００５１］いくつかの側面において、タンデム連結エピトープは、同じまたは類似の抗原タンパク質であってもまたはなくてもよい、異なるエピトープを含む。例えば、多様な遺伝子型のノロウイルスに対処するために、複数のノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質は、複数のノロウイルス由来の同じターゲット抗原上のエピトープを含んでもよい（図１５～１９で研究される組換え免疫複合体を参照されたい）。したがって、タンデム連結エピトープは、同じ抗原性タンパク質由来のエピトープを含んでもよい。他の側面において、タンデム連結エピトープは、単一エピトープの反復である。
［００５２］抗原のユニットは、Ｎ末端でＩｇＧのＶＨドメインのユニットに、またはＣ末端でＩｇＧのＣＨ３ドメインに連結される。ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインに連結される。いくつかの側面において、抗原のユニット、Ｆｃ融合体のユニット、ＩｇＧのＶＨドメインのユニット、およびＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットは、組換えタンパク質の半分を形成する。例えば、組換えタンパク質は、産生に際して自己集合し、ここで、Ｆｃ融合体の２つのユニットを連結する、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ１ドメインの連結で、ジスルフィド結合が形成される（図１Ａおよび７を参照されたい）。したがって、いくつかの態様において、組換えタンパク質は、抗原の２つのユニット、Ｆｃ融合体の２つのユニット、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット、およびＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニットを含む。特定の態様において、抗体は６Ｄ８抗体である。
［００５３］特定の態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ融合体のユニット、ＩｇＧのＶＨドメインのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニット；ならびにＩｇＧの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのユニットを含む。抗原のユニットは、ＩｇＧのエピトープではなく、そしてＮ末端でＩｇＧのＶＨドメインのユニットに、またはＣ末端でＩｇＧのＣＨ３ドメインに連結される。ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインに連結される一方、ＩｇＧのＶＬドメインのユニットは、ＩｇＧのＶＨドメインのユニットに、そしてＩｇＧのＣＨ１ドメインに融合される。
［００５４］いくつかの側面において、組換えタンパク質は、産生に際して自己集合し、そしてＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ１ドメインの連結で形成されるジスルフィド結合が、Ｆｃ融合体の２つのユニットを連結する。したがって、組換えタンパク質は、抗原の２つのユニット、Ｆｃ融合体の２つのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニット、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット、およびＩｇＧのＶＬドメインの２つのユニットを含む。いくつかの側面において、ＩｇＧのＶＬドメインの各ユニットは、ＩｇＧのＶＨドメインのユニットおよびＩｇＧのＣＨ１ドメインに連結される。特定の実施において、組換えタンパク質は、ＩｇＧのいかなる軽鎖定常（ＣＬ）ドメインも含まない。こうした態様の組換えタンパク質は、一本鎖抗体変異体である（例えば図７を参照されたい）。図８に示されるように、一本鎖抗体変異体は、植物中で産生されてもよく、そして効率的に精製されうる。ＩｇＧが６Ｄ８抗体である一本鎖抗体変異体はまた、６Ｄ８エピトープに結合する能力も保持する（図１１）。
［００５５］抗原の２つのユニット、Ｆｃ融合体の２つのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニット、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット、およびＩｇＧのＶＬドメインの２つのユニットを含む組換えタンパク質のいくつかの態様において、組換えタンパク質はさらにエピトープタグの２つのユニットを含み、ここで、エピトープタグはＩｇＧのエピトープである。いくつかの実施において、エピトープタグの２つのユニットは、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端でＦｃ融合体の２つのユニットに連結され、そして抗原の２つのユニットは、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニットに連結される。他の実施において、エピトープタグの２つのユニットは、抗原の２つのユニットに連結され、そして抗原の２つのユニットは、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端でＦｃ融合体の２つのユニットに連結される。抗体が６Ｄ８抗体である場合、エピトープタグは、ペプチド配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）を含む。いくつかの側面において、エピトープタグは、配列ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）を含む。他の側面において、エピトープタグは、配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなる。
［００５６］他の態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ融合体のユニット、ＩｇＧのＶＨドメインのユニット、ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニット、ＩｇＧのＶＬドメインのユニット；ならびにＩｇＧのＣＬドメインのユニットを含む。こうした態様において、ＩｇＧは６Ｄ８抗体であり、そしてＦｃ融合体は：Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙからなる群より選択される少なくとも１つの置換突然変異を含む。特定の態様において、Ｆｃ融合体は置換突然変異、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙを含む。抗原のユニットは、６Ｄ８抗体のエピトープではなく、そしてＣ末端でＩｇＧのＣＨ３ドメインに連結される。ＩｇＧのＶＬドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＬドメインのユニットに連結され、そしてＩｇＧのＣＬドメインのユニットは、ＩｇＧのＣＨ１ドメインに連結される。ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットは次いで、ＩｇＧのＣＨ２ドメインに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、６Ｄ８抗体のエピトープタグをさらに含み、例えばペプチド配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）を含むものである。いくつかの側面において、組換えタンパク質中のエピトープタグは、配列ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）を含む。他の側面において、エピトープタグは、配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなる。
［００５７］組換えタンパク質のさらに他の態様において、ＩｇＧ変異体は、抗原の２つのユニット、Ｆｃ融合体の２つのユニット、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット、およびＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニットを含む。抗原はＩｇＧのエピトープではなく、そして抗原の２つのユニットは、Ｎ末端でＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニットに連結される。ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニットは、ＩｇＧのＣＨ２ドメインでＦｃ融合体の２つのユニットに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、ＩｇＧのＣＬドメインを含まず、そしてＩｇＧのＶＬドメインを含まない。
ジカウイルス
［００５８］ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、実質的な世界規模の健康上の脅威であり、安全で入手可能、そして効果的なワクチンを欠いている。その広範囲の療法的価値に加えて、ＩｇＧ融合体は、その安全性および自己アジュバント性質のため、有望なワクチン候補である。
［００５９］例示的な態様において、いくつかのＩｇＧ変異体は、ＺＩＫＶに対する免疫反応を生成するよう設計された。したがって、組換えタンパク質中の抗原は、ＺＩＫＶをターゲティングする抗原である。いくつかの側面において、抗原は、ジカウイルスエンベロープドメインＩＩＩ（ＺＥ３）をターゲティングする。これらのＩｇＧ変異体は、非常に安定であり、そして植物において高発現された。したがって、本明細書記載の組換えタンパク質は、例えばＺＩＫＶに対するワクチン候補である。
［００６０］いくつかの側面において、ＺＥ３をターゲティングする抗原は、寄託番号第ＡＭＣ１３９１１．１号のＫ３０１～Ｔ４０６を含む。他の側面において、ＺＥ３をターゲティングする抗原は、寄託番号第ＡＭＣ１３９１１．１号のＫ３０１～Ｔ４０６に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列類似性を有するペプチド配列を含む。さらに他の側面において、ＺＥ３をターゲティングする抗原は、ジカウイルスの他の株由来のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＭＣ１３９１１号の対応する領域の機能的同等型である配列、例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号第ＡＹ６３２５３５号、第ＫＵ３２１６３９号、第ＫＪ７７６７９１号、第ＫＦ３８３１１５号、第ＫＦ３８３１１６号、第ＫＦ３８３１１７号、第ＫＦ３８３１１８号、第ＫＦ３８３１１９号、第ＫＦ２６８９４８号、第ＫＦ２６８９４９号、第ＫＦ２６８９５０号、第ＥＵ５４５９８８号、第ＫＦ９９３６７８号、第ＪＮ８６０８８５号、第ＨＱ２３４４９９号、第ＫＵ５０１２１５号、第ＫＵ５０１２１６号、第ＫＵ５０１２１７号中のＺＥ３の対応する配列を含む。
［００６１］ＺＩＫＶをターゲティングする本明細書記載の組換えタンパク質は、アジュバントを伴わず、そしてわずか２回の用量で、ＺＩＫＶに対して強い免疫反応を引き起こした（図６Ａ、６Ｂ）。組換えタンパク質の多くは、植物において高レベルで産生され（０．５～１．５ｍｇ／ｇ ＬＦＷ）（図２）、そして反復凍結融解および保存に際して安定であった（図５）。ＺＥ抗原単独に比較して、最適なＩｇＧ融合群は、１００倍より高い抗体反応を生じた。これは、ＺＥ３またはＺＩＫＶ Ｅの免疫原性がそれ自体では弱く、アジュバントおよび３～４回の用量を必要とすることを示す、以前の研究と一致する。
［００６２］ポリマー構造を形成すると予期される構築物は、分解に対して最も抵抗性であり、そして最高の全体収量を有した。ＲＩＣの分子内結合を最適化することによって、可溶性が非常に改善された、より小さい複合体が生成され、葉の新鮮重量１グラムあたり、１．５ミリグラムのＩｇＧ融合体が生じ（ｍｇ／ｇ ＬＦＷ）、そして免疫原性特性は同等であるかまたは改善されていた。マウスを免疫するために用いた際、ＩｇＧ融合体は、アジュバントを伴わず、２回のみの用量を用いて、高力価のジカ特異的抗体を誘発し、ＺＥ３単独によって生じる力価を２０倍～１５０倍超え、そしてジカウイルスを強力に中和した。ＩｇＧ融合体はまた、Ｃ１ｑ結合と相関した方式で、非融合ＺＥ３抗原に比較して、ＩｇＧ２ａ産生を強く増進することも見出された。これらの知見は、植物において効率的に作製可能である、ジカウイルスに対する自己アジュバントサブユニットワクチンとしてのＩｇＧ融合体の優れた潜在能力を示す。
［００６３］ＺＩＫＶをターゲティングするＩｇＧ融合体のＣ１ｑ結合は、ＩｇＧ Ｎ末端へのＺＥ３融合によって増進された。ＩｇＧ軽鎖の除去（ＨＶＬおよびＨＶＬ関連構築物）またはＦａｂ領域の除去もまた、Ｃ１ｑ結合を増進させた。ＩｇＧ Ｆｃ領域における六量体誘導突然変異の付加もまた、Ｃ１ｑ結合を増進させた。Ｃ１ｑ結合はまた、ＲＩＣを生成するための自己結合性エピトープタグの付加、または植物特異的β１，２－連結キシロースおよびα１，３－連結フコースＮ－グリカンを欠く植物（例えばキシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼのサイレンシングによって。図９および１０を参照されたい）におけるＩｇＧ融合体の産生によっても増進された。ＲＩＣ構築物（ＨＬＺｅ）および一本鎖抗体変異体に基づく修飾免疫複合体（ＨＶＬＺｅ）はどちらも、非複合体化ＩｇＧに比較して、有意に改善されたＣ１ｑ結合を有する（図１、９、および１０）。免疫後の結果は、ＨＶＬＺｅ構築物が、全長重鎖および軽鎖を含有する伝統的なＲＩＣのものと類似の抗体力価を生じることを示した（図６Ａおよび６Ｂ）。
［００６４］いくつかの側面において、大きな複合体サイズが抽出に際して可溶性が劣り（図２Ａおよび１０）、そして高濃度であると保存中に沈殿しうるため、ＲＩＣ構築物は好ましくない。非常に大きいＲＩＣはまた、注射部位からリンパ節に効率的に排出されるには大きすぎる可能性があり、排出には、＜２００ｎｍの粒子が好ましい。六量体サイズのＩｇＧは、効率的なＣ１ｑ結合に最適な基質であることが見出されてきている。また、６Ｄ８エピトープタグを突然変異させても（構築物ＨＬＺｄ）、ＲＩＣ構築物での問題が軽減されうる。特に、ＲＩＣと比較して、ＨＬＺｄは、有意により可溶性であり（図１３Ｂ）、中程度の密度を有し（図４Ａ）、より高いＣ１ｑ結合を示し（図１Ｂ）、より高い発現レベルに到達し（１．５ｍｇ／ｇ ＬＦＷ）（図２Ａ）、そしてより高いＩｇＧ２ａ力価を誘発した（図６Ａおよび６Ｂ）。ＲＩＣワクチン候補の設計に対するこれらの改善は、他の抗原にも適用可能である。
［００６５］ＨＶＬＺｅ融合体は、伝統的なＲＩＣよりもわずかにより高いＣ１ｑ結合を有し（図１Ｂ）、そして試験した条件で高い安定性を有した（図５Ａ）。この一本鎖配置は、完全６Ｄ８抗体と比較した際、エピトープタグへの結合が減少したため、ＨＶＬＺｅは、より小さい複合体を形成した（図４Ａ中、ＨＬＺｅに比較して、減少した密度を示すスクロース勾配データ）。しかし、構築物ＨＬＺｄとは異なり、ある程度の非常に高密度の物質が残った。可溶性は、ＨＶＬＺｅのエピトープ結合を減少させることによって改善可能であった。
［００６６］表１は、組換えタンパク質、ＺＩＫＶをターゲティングする抗原の特性を要約する。発現に関しては、完全に集合した産物の収量（ｍｇ／ｇ ＬＦＷ）のみを示す。より多数の「＋」記号は、その特性に関する平均値の統計的に有意な増加（Ｃ１ｑ、ＩｇＧ、およびＩｇＧ２ａに関して）、または繰り返し観察される相違（密度に関して）を示す。ＺＨｘ（＊）に関しては、低密度および高密度物質の両方のピークが観察された。
表１．
Figure 2023514392000005
ノロウイルス
［００６７］ヒトノロウイルス（ＨＮｏＶ）感染の広範囲の発生は、甚大な経済的損失および疾患負荷を引き起こすが、認可されたワクチンまたは特異的な治療は利用可能ではない。ＨＮｏＶを制御しようとする努力は、これらのウイルスの大きな遺伝的多様性によって妨害されており、これらは自然免疫を逃れるように進化し続けている。大量の公開されている抗体マッピングおよびＴ細胞データによって、広く保存されたＨＮｏＶ Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープの存在が示されており、重要なことに、これらはヒト免疫系によってターゲティング可能である。したがって、広く保存されたＨＮｏＶ抗原性ターゲットに対する免疫反応を誘発する目的のため、組換えタンパク質を設計することが可能であろう。
［００６８］例示的な態様において、ＩｇＧ変異体は、ノロウイルス（ＮｏＶ）に対する免疫反応を生じるように設計された。いくつかの側面において、組換えタンパク質の抗原は、複数のノロウイルス由来、例えばヒトノロウイルスＧＩ．３、ヒトノロウイルスＧＩＩ．４、および／またはネズミノロウイルス（ＭＮＶ）由来のエピトープを含む。ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質中の抗原は、ＮｏＶの主要カプシドタンパク質（ＶＰ１）またはＮｏＶの非構造タンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを含む。いくつかの側面において、抗原は、ＶＰ１の突出ドメインまたはシェルドメインをターゲティングする。こうした組換えタンパク質は、ＮｏＶに対するワクチン候補である。
［００６９］特定の実施において、ＮｏＶをターゲティングする組換えタンパク質を、ワクチン接種組成物と組み合わせて用いてもよい。実施例および図１６～１９に示されるように、これらの抗原は、異なる遺伝子群および遺伝子型由来の多様なＮｏＶパネルに広く結合し、これらをブロッキングし、そして中和することが可能な免疫グロブリン変異体の産生に、成功裡に用いられてきている。
［００７０］いくつかの側面において、ＶＰ１をターゲティングする抗原は、ＶＰ１および／またはＮＳ１の長さ５～５００残基の部分を含む。いくつかの態様において、抗原のユニットは、配列番号３４～７２に示される、少なくとも１つの配列、少なくとも３つの配列、少なくとも６つの配列、少なくとも９つの配列、少なくとも１２の配列、または少なくとも１５の配列を含む。例えば、ＶＰ１をターゲティングする組換えタンパク質において、抗原のユニットは、配列番号３４～５４に示される、少なくとも１つの配列、少なくとも２つの配列、少なくとも３つの配列、少なくとも４つの配列、少なくとも５つの配列、少なくとも６つの配列、少なくとも７つの配列、少なくとも８つの配列、または少なくとも９つの配列を含む。特定の態様において、ＶＰ１の突出ドメインをターゲティングする抗原のユニットは、配列番号３４～４４に示される、少なくとも１つの配列、少なくとも２つの配列、少なくとも３つの配列、少なくとも４つの配列、少なくとも５つの配列、少なくとも６つの配列、少なくとも７つの配列、少なくとも８つの配列、または少なくとも９つの配列を含む。特定の態様において、ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号３４～４２に示される配列を含む。別の特定の態様において、ＶＰ１のシェルドメインをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号４５～５４より選択される、少なくとも１つの配列、少なくとも２つの配列、少なくとも３つの配列、少なくとも４つの配列、少なくとも５つの配列、少なくとも６つの配列、少なくとも７つの配列、少なくとも８つの配列、または少なくとも９つの配列を含む。いくつかの側面において、ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号４５～５３に示される配列を含む。さらに別の特定の態様において、ＮＳ１をターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号５５～５７より選択される少なくとも１つの配列または少なくとも２つの配列を含む。いくつかの側面において、ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号５５～５７に示される配列を含む。さらに別の特定の態様において、Ｔ細胞仲介性免疫反応を生成するために設計される組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号５８～７２より選択される、少なくとも１つの配列、少なくとも２つの配列、少なくとも３つの配列、少なくとも４つの配列、少なくとも５つの配列、少なくとも６つの配列、少なくとも７つの配列、少なくとも８つの配列、または少なくとも９つの配列を含み、例えば、抗原のユニットのペプチド配列は、配列番号５８～７２の配列を含む。
産生法
［００７１］植物組換え発現系は、哺乳動物細胞系に比較して、本質的な安全性、高い拡張可能性、および低い産生コストを有し、このため、これらはＩｇＧ融合ワクチンを作製するために特によく適している。以前の研究によって、いくつかのＩｇＧ融合ワクチンは抗原免疫原性を増進させうることが示されてきているが、開発されている多くの融合戦略は、直接比較することが出来ず、最適なワクチン候補を生成する際に関与する重要な特性を決定することが困難になっている。
［００７２］本明細書記載の産生法は、トランスジェニック植物において、組換えタンパク質を発現させる工程を含む。特定の実施において、組換えタンパク質は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされたトランスジェニック植物において発現される。いくつかの側面において、例えば組換えタンパク質がＲＩＣである場合、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼがサイレンシングされた植物を用いて、タンパク質を産生することが好ましい。方法は、アグロバクテリウム内に、抗原のユニット、Ｆｃ融合体のユニット、ＩｇＧのＶＨドメインのユニット；およびＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットを発現するバイナリーベクターを導入する工程を含む。したがって、このバイナリーベクターは、ＩｇＧの重鎖ドメインをコードする。次に、植物部分に、バイナリーベクターを含有するアグロバクテリウムを浸潤させて、形質転換植物部分を産生する。植物部分から未精製タンパク質を抽出し、そして次いで、組換えタンパク質に関して精製する。いくつかの側面において、当該技術分野でよく確立された方法、例えば、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィまたは金属アフィニティクロマトグラフィを用いて、組換えタンパク質を精製する。
［００７３］組換えタンパク質がＩｇＧのＶＬドメインのユニットおよびＩｇＧのＣＬドメインのユニットを含む場合、方法は、アグロバクテリウム内に、ＩｇＧの軽鎖ドメイン、すなわちＩｇＧのＶＬドメインのユニットおよびＩｇＧのＣＬドメインのユニットをコードする、異なるバイナリーベクターを導入する工程をさらに含む。植物部分の形質転換は、植物部分に、ＩｇＧの重鎖ドメインをコードするバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム、およびＩｇＧの軽鎖ドメインをコードするバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウムを共浸潤させる工程を含む。
［００７４］特定の実施において、本明細書記載の組換えタンパク質を産生する方法は、アグロバクテリウム内に：ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄからなる群より選択されるベクターを導入し、そして植物部分に、ベクターを含有するアグロバクテリウムを浸潤させて、形質転換植物部分を産生する工程を含む。次いで、未精製タンパク質を形質転換植物から抽出した後、組換えタンパク質に関して精製する。アグロバクテリウム内に導入されるベクターが：ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、およびｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３からなる群より選択される産生法に関しては、方法は、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋを含有するアグロバクテリウムおよび該ベクターを含有するアグロバクテリウムを共浸潤させる工程をさらに含む。
特定の態様にしたがった、例示的な限定されない実施例
［００７５］本開示は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは限定と見なされてはならない。本出願全体で引用されるすべての参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに図の内容は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
Ａ． ＺＩＫＶエンベロープドメインＩＩＩを含むＩｇＧ－融合体の設計およびＣ１ｑ結合
［００７６］ＺＥ３は、有望なサブユニットワクチン候補であるが、それ自体、強く免疫原性ではなく、アジュバントを伴う高い抗原用量および反復免疫を必要とする。ＺＥ３に融合されたヒト化エボラモノクローナル抗体６Ｄ８に基づいて、ヒトＩｇＧ１変異体パネルを設計した（図１Ａ）。柔軟なリンカーを通じて、ＺＥ３を、６Ｄ８重鎖のＣ末端に融合させることによって、ＲＩＣ構築物を生成した。ＺＥ３に６Ｄ８エピトープ結合部位をタグ付けして、免疫複合体形成を可能にした。この構築物は、重鎖、軽鎖、Ｃ末端ＺＥ３融合体、およびエピトープタグを含有するため、「ＨＬＺｅ」と称される。免疫複合体形成に関する対照として、エピトープタグを含まず（構築物「ＨＬＺ」）、そしてしたがって免疫複合体を形成しないと予期される以外は同一の構築物を生成した。最初に、ＩｇＧ変異体によるＣ１ｑ結合を研究した。免疫受容体結合を改善するため、すべての構築物を糖操作ベンサミアナタバコにおいて発現させた。糖操作植物において作製された６Ｄ８抗体またはＲＩＣは、野生型植物において発現された構築物に比較して、非常に改善されたＣ１ｑ結合を示した（図９）。ＲＩＣは、高密度クラスター化抗原－抗体複合体であるため、高アビディティでＣ１ｑと会合すると考えられ、そして予期されるように、ＨＬＺｅは、ＨＬＺに比較して、非常に改善されたＣ１ｑ結合を示した（ｐ＜０．００１）（図１Ｂ）。ＨＬに比較して、ＨＬＺでＣ１ｑ結合のわずかな増加もまた見られたが、これはおそらく、構築物の低レベルの凝集を示唆する（ｐ＜０．０５）（図１Ｂ）。
［００７７］同族抗原が抗体によって結合されない限り、抗体Ｆａｂアームは、Ｃ１ｑ結合を阻害することによって、補体活性化において制御性の役割を果たしうることが報告されてきている。これらのデータと一致して、６Ｄ８エピトープタグを所持する可溶性抗原の添加は、Ｃ１ｑ結合を改善し（図１０、ＨＬ対ＨＬ＋Ａｇを比較されたい）、そしてＣ１ｑ結合は、６Ｄ８軽鎖の除去によって、または興味深いことに６Ｄ８重鎖Ｎ末端への抗原融合によってのいずれかで非常に増進された（図１０、ＨＬ、Ｈ、およびＺＨＬを比較されたい）。したがって、軽鎖の非存在下で６Ｄ８のＮ末端に融合したＺＥ３を含む構築物（構築物「ＺＨ」）を生成し、そしてこれはＣ１ｑに効率的に結合することが見出された（図１Ｂ）。Ｃ１ｑとの相互作用をさらに改善するため、六量体形成を支持する、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙ突然変異が６Ｄ８ Ｆｃ領域に導入されたことを除いて、ＺＨに同一である構築物を生成した。この構築物（ＺＨｘ）は、ＺＨに比較して、Ｃ１ｑ結合をさらに改善した（ｐ＜０．００１）（図１Ｂ）。興味深いことに、ＩｇＧ１－Ｆｃ融合体は、可変性Ｃ１ｑ結合を有することが示されてきているが、６Ｄ８ Ｆｃに融合されたＺＥ３（構築物「ＺＦｃ」）は、非常に強いＣ１ｑ結合を示した（図１Ｂ）。軽鎖定常領域もまた欠く、単純化ＲＩＣを構築するため、６Ｄ８の可変軽鎖（ＶＬ）ドメインが６Ｄ８の可変重鎖（ＶＨ）およびＣＨ１ドメインの間に挿入されているような第一の構築物を作製し、構築物ＨＶＬを得た。この構築物は、非改変６Ｄ８に比較して、幾分減少したレベルではあるが、６Ｄ８エピトープでタグ付けされた抗原に結合することが見出された（図１１）。この配置をＨＬＺｅ内に挿入して、強力なＣ１ｑ結合を示す、一本鎖ＲＩＣ ＨＶＬＺｅを生成した（図１Ｂ）。
［００７８］理論的に単量体である構築物ＨＬＺ（いかなるエピトープタグも含まず、６Ｄ８のＣ末端に融合されたＺＥ３からなる）が、Ｃ１ｑ結合において小さいが反復可能な改善を生じたことに注目すると興味深い（図１Ｂ）。これは、ＺＥ３融合のため、低レベルのある程度の凝集があることを示唆しうる（図４Ａ、ＨＬおよびＨＬＺを比較されたい）。さらに、ＩｇＧ Ｆａｂアームの欠失が、未知の機構によってオリゴマー形成を誘導し、そしてさらにＣ１ｑ結合を増進させるため、Ｆａｂ仲介性事象はＣ１ｑ結合に影響を及ぼすことが報告されてきている。ＨＬＺの発現は、一般的に低く、Ｃ末端ＺＥ３融合は、フォールディングに干渉するかまたは別の方式で不安定性を引き起こしうると示唆される（図２Ａ）。多くの分解産物が、精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって可視であり（図３）、そして興味深いことに、ＨＬＺのＣ１ｑ結合は、室温で２週間インキュベーションするかまたは反復凍結融解サイクルを行うことによるさらなる分解に際して、増加し続けた（図５Ｂ）。これらのデータは、分解産物が、元来の構築物よりもより高い免疫原性を有しうることを示唆し、この知見は、ＨＬＺによって産生される比較的高い総ＩｇＧ力価を説明しうる（図６Ａ）。しかし、ＨＬＺ ＩｇＧ２ａ力価は、他の構築物に比較して減少した（図６Ｂ）。ＩｇＧ２ａは、Ｔｈ１反応の一般的な指標であるため、ＨＬＺはなお、Ｔ細胞活性化を導く、損なわれたエフェクター機能、例えば補体活性化の減少を有しうる。特に、すべてのＩｇＧ融合体は、非融合ＺＥ３に比較して、ＩｇＧ２ａ産生を強く増進した（図６Ｂ）。ヒト抗体は、マウス抗体に比較して、マウスＦｃ受容体に類似の結合アフィニティを有することが近年示されてきている一方、ヒトＩｇＧ１は、低アフィニティマウスＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６への結合減少を有した。また、ポリマー性デングＩｇＧ融合ワクチンが、同じＩｇＧ融合体の単量体型に比較して、ヒト腺扁桃腺（ａｄｅｎｏｔｏｎｓｉｌｌａｒ）組織において、増進された免疫原性を示すが、どちらも、ヒトＦｃγＲＩ／ＣＤ６４を発現しているマウスにおいては、同等の免疫原性を示すこともまた示された。したがって、これらの構築物の免疫原性をより完全に評価するには、他の動物モデルにおけるさらなる試験が必要である。
［００７９］抗原結合は、ＩｇＧにおいてコンホメーション変化を誘導する可能性もあり、これがＣ１ｑ結合を改善しうる。６Ｄ８エピトープを含有する抗原と６Ｄ８の混合は、Ｃ１ｑ結合のわずかな増加しか生じず（図１０）、そしてＲＩＣ構築物に比較して劣った免疫原性であることが見出された（データは別の箇所で提示される）。しかし、Ｎ末端抗原融合体は、Ｃ１ｑ結合に対して、より顕著な影響を有し（図１Ｂ）、これはおそらく、抗原結合と類似のコンホメーション変化を強く誘導することによる。一般的に、６Ｄ８ Ｎ末端への抗原融合は、多様な大きい抗原および小さい抗原に関して、Ｃ１ｑ結合を非常に増進させる。さらに、６Ｄ８軽鎖の欠失（構築物ＺＨ）もまた、Ｃ１ｑ結合を実質的に増進させた（図１Ｂ）。これらの知見は、抗体のＦａｂ部分がＣ１ｑ結合において制御性の役割を果たすという仮説と一致する。さらに、軽鎖の除去もまた、グリコシル化に、そしてしたがってＣ１ｑ結合に影響を及ぼしうる。構築物ＺＨｘは、軽鎖除去および六量体誘導性突然変異を含むＮ末端ＺＥ３融合の影響を相乗的に組み合わせて、Ｃ１ｑ結合のさらにより強力な増進（図１Ｂ）、ならびに高い総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａ力価を生じた（図６Ｂ）。強い免疫原性にもかかわらず、ＺＨｘは、ＺＨに比較して、減少した収量を有した（図２Ａ）。さらに、ＺＨｘは、構築物ＺＨには見られない、スクロース勾配の非常に底に近い部分に見られる何らかの非常に大きな物質を有するようであり（図４Ｂ）、六量体突然変異が凝集に寄与しうることが示唆された。これらの構築物の可溶性を最適化するために、さらなる研究が必要である。。
［００８０］６Ｄ８ ＣＨ１ドメインへのＮ末端ＺＥ３融合（構築物ＺＦｃ）は、Ｃ１ｑ結合を非常に改善し（図１Ｂ）、非常に高い抗体力価を誘発した（図６Ａ）。Ｃ１ｑ結合を含むＦｃ融合体の多くの特性は、個々の融合パートナーに基づいて非常に多様であるようであり、そしてしたがって、各融合体に関して実験的に決定する必要がある。興味深いことに、いくつかのＦｃ融合構築物は六量体を形成することが示されてきており、これは、ここで観察されるＺＦｃの強い免疫原性を説明する可能性もある。強い免疫原性にもかかわらず、ＺＦｃは、顕著に不安定であった：ＺＥ３の５０％が抽出前または抽出中に切断され（図２Ａ、２Ｂ）、これは、ＳＤＳ試料緩衝液中に直接抽出された場合であってもそうであり、そして、反復凍結融解または保存に際して損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ままであるのは、完全サイズＺＦｃ分子の２５％未満であった（図５Ａ）。ＨＬＺとは異なり、この分解は、Ｃ１ｑ結合の損失と関連し（図５Ｂ）、Ｆｃ受容体結合ドメインが損なわれていることが示唆された。ＺＦｃは、完全ＩｇＧよりも少ないジスルフィド結合を有し、そして一般的に、Ｆｃ融合体は、しばしば、不安定性または望ましくない凝集の問題がある。ＺＦｃは高い力価を誘発する一方、８μｇのＺＥ３（ＩｇＧ融合パートナーの重量を引く）を送達するため、免疫に用いられる精製試料の総量は、ＺＥ３融合体の高い分解および生じる損失を考慮して、ほぼ３倍でなければならなかった。非融合Ｆｃならびに他のありうる分解産物のこの増加した送達が、高い免疫原性に寄与しうるかどうかは不明である。対照的に、より大きく、そしてより高次にオリゴマー性である構築物ＨＬＺｅ、ＨＬＺｄ、ＺＨｘ、およびＨＶＬＺｅ（図４Ａおよび４Ｂ）は、抽出前および抽出中の両方で、それとともに保存に際してもより安定であった（図５Ａ）。ＥＬＩＳＡ中の抗体プローブへのアクセス不能性と一致して（図２Ａ）、これらの構築物の分子内および分子間会合は、タンパク質分解または他の分解性プロセスからこれらを保護しうる。
Ｂ． ＨＶＬ融合構築物の発現および特徴付け
［００８１］ＲＩＣは、免疫原性であることが知られる；が、これらは完全に集合した産物を形成するために、重鎖および軽鎖の共発現を必要とする。このプロセスは、一本鎖抗体融合体を生成することによって、単純化されうる。一本鎖抗体融合体の利点は、完全抗体－抗原融合体が、単一のコード配列で産生可能であり、それによって重鎖および軽鎖の共発現の必要性が排除されることである。さらに、新規構築物は、重鎖および軽鎖両方の可変領域をなお保持するであろう。コア一本鎖抗体は、抗体重鎖に直接融合されている可変軽鎖領域に連結された可変重鎖領域を含有する（図７）。ベンサミアナタバコ植物で発現された類似の構築物が、以前特徴づけられそして公表されているが、コア一本鎖抗体が関心対象の抗原に融合された、一本鎖抗体融合体の潜在能力を調査する研究はほとんどない。いくつかの一本鎖抗体融合体を生成し、そして試験した（図７）。精製構築物からの結果を、植物中で発現させてもよく、そしてこれは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で、非還元条件下で泳動した際、正しいサイズに現れる。
Ｃ． ＩｇＧ融合構築物の発現
［００８２］ＲＩＣには、可溶性産物が低収量である問題がある。６Ｄ８エピトープタグを６Ｄ８のＣ末端に付加すると、抗体が大部分不溶性になるが、これは、軽鎖を除去することによって防止され、不溶性は、エピトープタグに結合した抗体の大きな複合体から生じることが示唆される（図１２）。ＲＩＣ可溶性を改善するため、６Ｄ８エピトープタグを突然変異させて、抗体結合を減少させた。ＨＬＺｅ上のエピトープタグを、６Ｄ８に関する最少の報告される結合領域（Ｗｉｌｓｏｎら、２０００）（構築物「ＨＬａ」、エピトープ配列ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ、配列番号２）に減らしたが、可溶性の改善は示されず、また３’端からの単一アミノ酸の除去（構築物「ＨＬｂ」、ＶＹＫＬＤＩＳＥ、配列番号３）も改善を示さなかった（図１３Ａ）。しかし、５’端からの単一アミノ酸のさらなる除去（構築物「ＨＬｃ」、ＹＫＬＤＩＳＥ、配列番号４）および構築物「ＨＬｄ」中のさらなる一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）（ＹＫＬＤＩＳ、配列番号１）は、非常に改善された可溶性を生じた（図１３Ｂ）。この突然変異をＨＬＺｅに導入し（構築物ＨＬＺｄ）、そして特徴づけた。ＥＬＩＳＡによると、およそ２５倍エピトープ結合が減少するにもかかわらず（図１３Ｃ）、ＨＬＺｄは、なお非常に強いＣ１ｑ結合を維持し（図１Ｂ）、効率的な複合体形成活性が残っていることが示唆された。
［００８３］完全に集合したＩｇＧ融合体の収量を測定するため、まずＺＥ３を捕捉し、そして次いでヒトＩｇＧを検出するＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ＺＥ３の切断を検出するため、総ＩｇＧのみを測定するＥＬＩＳＡもまた、比較として用いた。ＺＥ３およびＩｇＧの両方に関して探査した際、非常に可溶性の単量体構築物ＺＨは、新鮮葉重量１グラム当たり０．８３ｍｇの完全形成産物を生じ（ｍｇ／ｇ ＬＦＷ）、そして類似のＺＦｃは、０．５８ｍｇ／ｇ ＬＦＷを生じた（図２Ａ）。しかし、総ＩｇＧ含量を測定した際、ＺＨの収量はおよそ２０％より高く、そしてＺＦｃに関しては、２．５倍より高く、ＺＨおよび特にＺＦｃは、おそらくＺＥ３リンカーのタンパク質分解的切断に感受性であることが示唆される（図２Ａ）。この知見は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のＺＦｃ切断産物の視覚化によって確認された（図２Ｂ）。ＨＬＺは、０．１７ｍｇ／ｇ ＬＦＷの完全集合産物のみを集積させ、およそ４０％のＺＥ３が切断で失われ、構築物の一般的な不安定性が示唆された（図２Ａ、２Ｂ）。ＥＬＩＳＡによって、ＲＩＣ構築物は、単量体構築物よりも性能が劣っているようであり；ＨＬＺｅおよびＨＬＺｄは、それぞれ、わずかに０．０４ｍｇ／ｇ ＬＦＷおよび０．３０ｍｇ／ｇ ＬＦＷのみを集積させ、そして六量体ＺＨｘは、０．０８ｍｇ／ｇ ＬＦＷのみを集積した（図２Ａ）。しかし、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ条件下で視覚化した際、ＨＬＺｄは、最高の発現構築物であり、概算１．５ｍｇ／ｇ ＬＦＷが集積した（図２Ａ、２Ｂ）。この矛盾は、複合体化したＨＬＺｄが、ＥＬＩＳＡによる抗体プローブに対してアクセス不能になるため、生じる可能性がある。同様に、ＨＬＺｅおよびＺＨｘの総収量もまた、ゲル定量化によって測定された際、より高かった（図２Ａ、２Ｂ）。低い可溶性にもかかわらず、ＨＬＺｅは、ＨＬＺと類似の収量を有し、そしてＨＬＺｄは、ＨＬＺの収量を大きく超えた。この知見は、細胞内部または抽出中のいずれかで、複合体形成がＨＬＺｅおよびＨＬＺｄを保護しうることを示唆するが、短いエピトープタグがＨＬＺｅおよびＨＬＺｄの安定性増進において何らかの他の役割を果たす可能性は排除できない。ＨＶＬＺｅは、ＥＬＩＳＡによると、わずか０．０２ｍｇ／ｇ ＬＦＷ可溶性産物のみを生じ、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥによっては検出不能であった（図２Ａ）；が、７．５Ｍ尿素で抽出した際、非常に高レベルで集積し、これは、不溶性であることが低収量を生じたことを示唆する。
Ｄ． ＩｇＧ融合体の精製、凝集、および安定性
［００８４］プロテインＧアフィニティクロマトグラフィを通じた単純な一工程精製を用いて、ＩｇＧ融合体を＞９５％均一性まで精製した。発現データと一致して、より高次のオリゴマー構築物は、他の構築物よりも少ない分解を示し、そしてＺＦｃ融合体は、特に高レベルの分解を有した（図３）。各構築物の凝集特性を調べるため、スクロース勾配遠心分離によって、精製ＩｇＧ融合体を分析した。巨大免疫複合体の形成と一致して、ＨＬＺｅおよびＨＶＬＺｅは、勾配の最も底部で見られる一方、ＨＬＺ、ＺＨ、およびＺＦｃは、大部分、勾配の最上部で見られた（図４Ａおよび４Ｂ）。ＺＨｘの溶液は、低密度物質ならびにある程度の非常に高密度の物質の両方を含有した（図４Ｂ）。ＨＬＺｄの溶液は、ＨＬＺおよびＨＬＺｅに比較して中程度の密度を示し（図４Ａ）、これは、発現データおよびＣ１ｑ結合とともに解釈すると、ＨＬＺｄが、ＨＬＺｅに比較して、より小さい、より可溶性の免疫複合体を形成することと一致する。
［００８５］多様な温度条件で処理した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で完全に形成された産物および分解産物を比較することによって、各構築物の安定性を分析した。５回の凍結融解サイクル後または４℃で２週間置いた後、すべての構築物で、少量の分解が観察された（図５Ａ）。高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）のＨＬＺｅおよびＨＶＬＺｅは、４℃で数日置いた後、沈殿することが見出された。室温では、大部分の構築物は、２週間後、１０～１５％の分解を有した（図５Ａ）。総合すると、オリゴマー化構築物は、最高の安定性を保持する一方、単量体構築物、および特にＦｃ融合体は、より迅速に分解した（図５Ａ）。大部分の構築物は、保存後、強いＣ１ｑ結合を保持したが、構築物ＨＬＺは、４℃の保存ではなく、室温保存または反復凍結融解後、増加したＣ１ｑ結合を示した（図５Ｂ）。これは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分解産物が可視である（図３）ため、Ｆａｂ領域の分解または軽鎖の損失、あるいは凝集による可能性がある。逆に、構築物ＺＦｃは、より分解されると、Ｃ１ｑ結合能を失い、これはおそらく、Ｃ１ｑ結合領域の分解によるものである（図５Ｂ）。
Ｅ． マウス免疫、力価、ＩｇＧ２ａ、サイトカイン
［００８６］ＩｇＧ融合体の免疫原性を調べるため、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝６）を、アジュバントを伴わず、各ＩｇＧ変異体の２回の用量で皮下免疫し、送達されるＺＥ３の総用量が８μｇであるようにした。対照として、マウスをまた、８μｇの非融合植物発現ＺＥ３でも免疫した。すべてのＩｇＧ融合体は、ＺＥ３特異的抗体の産生を非常に強く増進し、ＺＥ３単独よりも２０倍～１５０倍より高い総ＩｇＧ力価を生じた（図６Ａ、ＺＥ３に比較してｐ＜０．０１）。すべてのＩｇＧ融合体は、ＺＥ３単独に比較して、ＩｇＧ２ａの産生を有意に増進した（図６Ｂ、ＺＥ３に比較してｐ＜０．０１）。ＩｇＧ融合体間で、総力価産生の有意な相違は観察されなかったが、構築物ＨＬＺは、ＨＬＺｅを除くすべての他の融合体に比較して、ＩｇＧ２ａの有意に減少した産生を有した（図６Ｂ、ＨＬＺに比較してｐ＜０．０５）。構築物ＺＨｘおよびＺＦｃは、最高レベルの総ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａを生じた（図６Ａ、図６Ｂ）。
Ｆ． ノロウイルスエピトープを含むＩｇＧ融合体の設計、発現、および精製
［００８７］ノロウイルス（ＮｏＶ）カプシドタンパク質ＶＰ１は、ウイルスゲノムを取り巻くコアを形成する内部シェルドメイン（Ｓ）、ならびにさらにＰ１およびＰ２サブドメインに分けられる突出ドメイン（Ｐ）からなる。伝統的なヒトノロウイルス（ＨＮｏＶ）ワクチンアプローチ、ならびに自然感染は、ほとんど保存されていないウイルスカプシド上の免疫優性エピトープを主にターゲティングする免疫反応を誘発し、新規株に対して、そして異なる遺伝子型由来の関連ウイルスに対して、限定された保護しか生じない。ほぼすべてのＨＮｏＶワクチン候補は、ＶＰ１カプシドタンパク質から作製されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）に重点を置いてきている。主要カプシドタンパク質ＶＰ１の配列多様性に基づいて、４０を超えるＮｏＶの遺伝子型を含有する１０の遺伝子群（ＧＩ～ＧＸ）が同定されてきている。これらの１０の遺伝子群のうち、ＧＩおよびＧＩＩが大部分のヒト疾患を引き起こす。しかし、保存されたＶＬＰを生成する最適な試みでさえも、ヒト臨床試験において、疾患重症度の中程度の減少しか生じず、そして一般的に、広く保護性の免疫を誘導するために苦心している。
［００８８］１つの広く反応性である抗体は、Ｐ１の基部の非常に保存されたエピトープ：ＬＰＱＥＷＶＱＹＦＹＱＥＡＡＰＡ（配列番号３４）にマッピングされる。非常に重要なことに、この抗体は、Ｐ１の直鎖エピトープに結合し、そしてしたがって、天然ＶＰ１コンホメーションは、機能抗体を誘発する必要がない。このエピトープをターゲティングする抗体は、８つのＧＩ、１３のＧＩＩ、および１つのＧＩＶ遺伝子型由来のＶＬＰに高アフィニティで結合する。第二の広く反応性である直鎖エピトープ（ＡＬＬＲＦＶＮＰＤＴＧＲＶＬＦＥ、配列番号３７）に対して向けられる抗体は、少なくとも３つのＧＩおよび７つのＧＩＩ遺伝子群由来のＶＬＰに結合する。Ｐ１ドメインの基部で広く保存される第三の直鎖エピトープは、ＤＳＷＶＮＱＦＹＴＬＡＰ（配列番号４１）である。Ｓドメインは、ＶＰ１の最も保存される領域である。強く保存された直鎖エピトープＱＮＶＩＤＰＷＩＲＮＮＦ（配列番号４５）、ＱＡＰＧＧＥＦＴＶＳＰＲＮＡＰＧＥ（配列番号４６）、およびＫＶＩＦＡＡＶＰＰ（配列番号４７）をターゲティングする抗体は、ＮｏＶ遺伝子群に広い交差反応性があることが同定されてきている。保存されたＨＮｏＶ Ｔ細胞エピトープが、ヒト１３、すなわちＶＰ１ Ｓドメイン中のエピトープＴＭＦＰＨＩＩＶＤＶ（配列番号５４）で同定され、ＧＩおよびＧＩＩ ＨＮｏＶの両方に対する広いＴ細胞活性化を誘発した。さらに、ＨＮｏＶを含むすべてのＮｏＶ遺伝子群間で非常に保存されている、Ｐ１ Ｃ末端ドメイン中の優性Ｔ細胞エピトープ（ＳＷＶＳＲＦＹＱＬ、配列番号６４）は、ＮｏＶ感染マウスにおけるウイルスクリアランスに決定的であった。この領域は、カプシド集合において、必須の役割を果たし、そしてしたがって、構造制約は、突然変異回避の潜在能力を限定する。ＮＳ１－２からタンパク質分解的に切断される非構造タンパク質ＮＳ１は、ネズミＮｏＶに感染した細胞（ＧＶ）またはＨｕＮｏＶ ＮＳ１－２でトランスフェクションされた細胞から分泌される。分泌されたＮＳ１は、マウスの腸管において、ＩＦＮ－λ産生を抑制する。重要なことに、ＮＳ１単独でのワクチン接種は、Ｐドメインでのワクチン接種よりもより優れてマウスを保護し、ワクチンターゲットとしてのＮＳ１を強調する。ＮＳ１－２でのワクチン接種は、ＮＳ１に対して向けられる抗体を生じた。
［００８９］ノロウイルスをターゲティングする免疫グロブリン変異体を作製するための抗原を開発するため、ヒトノロウイルスＧＩ．３、ヒトノロウイルスＧＩＩ．４、およびネズミノロウイルス（ＭＮＶ）のＶＰ１の突出ドメイン由来のエピトープが同定されてきている（配列番号３４～４４）。ＧＩ．３、ＧＩＩ．４、およびＭＮＶのシェルドメイン由来のエピトープもまた同定されてきている（配列番号４５～５４）。ＭＮＶのＮＳ１エピトープを配列番号５５に示す。ＧＩ．３のＮＳ１エピトープを配列番号５６に示す。ＧＩＩ．４のＮＳ１エピトープを配列番号５７に示す。Ｔ細胞反応エピトープを配列番号５８～７２に示す。
［００９０］したがって、ＮｏＶ突出ドメイン（Ｐ－ＲＩＣ）、シェルドメイン（Ｓ－ＲＩＣ）、Ｔ細胞エピトープ（Ｔ－ＲＩＣ）、またはネズミノロウイルス由来のタンデム連結非構造タンパク質１（ＮＳ１）を含有するもの（Ｎ－ＲＩＣ）の保存エピトープをターゲティングするＲＩＣ構築物を設計し、そして産生した。Ｐ－ＲＩＣに関する抗原のユニットは、ＧＩ．３、ＧＩＩ．４、およびＭＮＶのＶＰ１の突出ドメイン由来の９つのタンデム連結エピトープから形成される。Ｐ－ＲＩＣに関する抗原のユニットは、ＧＩ．３、ＧＩＩ．４、およびＭＮＶ由来のＶＰ１の突出ドメイン由来の９つのタンデム連結エピトープから形成される。Ｓ－ＲＩＣに関する抗原のユニットは、ＧＩ．３、ＧＩＩ．４、およびＭＮＶのＶＰ１のシェルドメイン由来の９つのタンデム連結エピトープから形成される。Ｔ－ＲＩＣに関する抗原のユニットは、ＧＩ．３、ＧＩＩ．４、およびＭＮＶに対するＴ細胞仲介性免疫反応を引き起こすことが見出されてきている、１５のタンデム連結エピトープから形成される。Ｎ－ＲＩＣに関する抗原のユニットは、ＧＩ．３、ＧＩＩ．４、およびＭＮＶのＮＳ１由来のタンデム連結エピトープから形成される。これらのＲＩＣ構築物を産生するための植物発現ベクターは、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄである。
［００９１］各エピトープに関して、エピトープがＮ末端またはＣ末端に連結されているＲＩＣ構築物は、植物において成功裡に発現可能であった（図１４Ａ）。これらのＲＩＣ構築物はすべて精製可能であった（図１４Ｂおよび図１５）。これらのＲＩＣ構築物で免疫されたマウス由来の血清は、マウスノロウイルス（図１６）、ならびにＧＩ．３およびＧＩＩ．２ノロウイルスをモデリングするＶＬＰ（図１７および１８）に結合可能であった。ＲＩＣで免疫されたマウスの脾臓によって産生されたＩＦＮ－γ産生の増加（図１９）は、ＲＩＣが成功裡にノロウイルスに対する免疫を誘導したことを示唆する。
Ｇ． 方法
１． ベクター構築
［００９２］ＺＥ３のためのＢｅＹＤＶ植物発現ベクター、ならびに本明細書において構築物「ＨＬＺｅ」と称される、６Ｄ８ Ｃ末端へのその融合体（ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３）、あるいはエピトープタグを含む（ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１）またはエピトープタグを含まない（ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ）Ｎ末端への融合体の構築が、Ｄｉａｍｏｓら、２０１９に記載された。ＺＥ３融合体を含まずに全長６Ｄ８ ｍＡｂを発現するベクターｐＢＹＫＥＭｄ２－６Ｄ８（構築物「ＨＬ」）もまた、Ｄｉａｍｏｓら、２０１９に記載された。６Ｄ８の軽鎖のみを発現するベクターを生成するため、ｐＢＹＫＥＭｄ２－６Ｄ８をＸｈｏＩで消化し、そしてベクターを自己連結して、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋを得た。ｐＢＹＫＥＭｄ２－６Ｄ８をＳａｃＩで消化し、そしてベクターを自己連結して、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｈを生じることによって、６Ｄ８の重鎖のみを発現するベクター（構築物「Ｈ」）を生成した。ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１をＢｓａＩ－ＳａｃＩで消化し、そしてタグ含有断片を、ＢｓａＩ－ＳａｃＩで消化したｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｈ内に挿入して、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｈｇｐ３７１を生じることによって、６Ｄ８エピトープ結合タグをｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｈに付加した（軽鎖と共発現された際には、構築物「ＨＬｅ」）。ＨＬＺｅからエピトープタグを除去するため、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３をＢａｍＨＩ－ＳａｃＩで消化し、そしてプライマーＺＥ３－Ｂａｍ－Ｆ（５’－ｇｃｇｇｇａｔｃｃａａｇｇｇｃｇｔｇｔｃａｔａｃｔｃｃ、配列番号８）およびＺＥ３－Ｓａｃ－Ｒ（５’－ａｃａｇａｇｃｔｃｔｔａａｇｔｇｃｔａｃｃａｃｔｃｃｔｇｔｇ、配列番号９）での増幅およびそれに続くＢａｍＨＩ－ＳａｃＩでの消化を通じて得られた、ＺＥ３を含有する断片と連結した。生じたベクター、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３を、ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋと共浸潤させて、構築物「ＨＬＺ」を産生した。軽鎖を含まず、６Ｄ８ Ｎ末端に融合されたＺＥ３を産生するため、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－ＨをＳａｃＩで消化し、そしてベクターを自己連結し、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ（構築物「ＺＨ」）を得た。六量体突然変異を導入するため、Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙ突然変異を含有する６Ｄ８重鎖定常領域の領域を合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国アイオワ州）、次いでＢｓａＩ－ＳａｃＩで消化し、そしてｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ中の６Ｄ８のＢｓａＩ－ＳａｃＩ領域を置換するために用いて、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ（構築物「ＺＨｘ」）を得た。オリゴ６Ｄ８９－Ｆ（５’－ｃｔａｇｔｇｔｔｔａｃａａｇｃｔｇｇａｃａｔａｔｃｔｇａｇｇｃａｔａａｇａｇｃｔ、配列番号１０）および６Ｄ８９－Ｒ（５’－ｃｔｔａｔｇｃｃｔｃａｇａｔａｔｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔａａａｃａ、配列番号１１）をアニーリングさせて、そしてＳｐｅＩ－ＳａｃＩで消化されたｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３内にこれらを連結することによって、ＲＩＣエピトープタグ突然変異体「ａ」を生成し；まず突然変異体「ａ」を、プライマーｇｐＤＩＳＥ－Ｓａｃ－Ｒ：（５’－ｔｔｔｇａｇｃｔｃｔｔａｃｔｃａｇａｔａｔｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔａａａｃ、配列番号１２）および３５Ｓ－Ｆ（５’ａａｔｃｃｃａｃｔａｔｃｃｔｔｃｇｃ、配列番号１３）で増幅し、次いでその産物をＳｐｅＩ－ＳａｃＩで消化し、そしてこれをＳｐｅＩ－ＳａｃＩで消化されたｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３内に連結することによって、突然変異体「ｂ」を生成した。「ｃ」に関しては重複オリゴ６Ｄ８７－Ｆ（５’－ｃｔａｇｔｔａｃａａｇｃｔｇｇａｃａｔａｔｃｔｇａｇｔａａｇａｇｃｔ、配列番号１４）および６Ｄ８７－Ｒ（５’－ｃｔｔａｃｔｃａｇａｔａｔｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔａａ、配列番号１５）を、そして６Ｄ８６－Ｆ（５’－ｃｔａｇｔｔａｃａａｇｃｔｇｇａｃａｔａｔｃｔｔａａｇａｇｃｔ、配列番号１６）および６Ｄ８６－Ｒ（５’－ｃｔｔａａｇａｔａｔｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔａａ、配列番号１７）を用いて、突然変異体「ａ」と同様に、突然変異体「ｃ」および「ｄ」を生成した。
［００９３］可変重鎖（ＶＨ）ドメインが可変軽鎖（ＶＬ）ドメインに連結され、次いで、６Ｄ８抗体の定常領域に直接融合されている構築物を作製するため、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥからＰＣＲ増幅およびセグメントの末端仕立て（ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）を通じて、まず可変領域を得た。ＶＨドメインに関しては、プライマーＬＩＲ－Ｈ３Ａ（５’－ａａｇｃｔｔｇｔｔｇｔｔｇｔｇａｃｔｃｃｇａｇ、配列番号１８）および６Ｄ８ＶＨ－Ｓｐｅ－Ｒ（５’－ｃｇｇａｃｔａｇｔａｇｃｔｇａａｇａｃａｃｔｇｔｇａｃ、配列番号１９）を用いた。プライマー３５Ｓ－Ｆ（５’－ａａｔｃｃｃａｃｔａｔｃｃｔｔｃｇｃ、配列番号１３）および６Ｄ８ＶＫ－Ｎｈｅ－Ｒ（５’－ｃｇｔｇｃｔａｇｃｃｔｔｇａｔｃｔｃｃａｃｔｔｔｇｇｔｃ、配列番号２０）でｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３をＰＣＲ増幅することによって、ＶＬ領域を得た。ヒトＩｇＧ抗体の定常領域にＶＬ領域を融合させるため、ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ－ＮｈｅＩで消化し、そして６Ｄ８重鎖を含有するベクター、ｐＫＳ－ＨＨ－ｇｐ３７１内に挿入することによって、サブクローンを生成した。このサブクローンをｐＫＳ－ＶＬと名付けた。次に、ｐＢＹＫＥＭ－６Ｄ８ＫをＳｂｆＩ－ＳａｃＩで消化し、可変重鎖断片を増幅したＰＣＲ産物を、ＳｂｆＩ－ＳｐｅＩで消化し、そして可変軽鎖サブクローンをＳｐｅＩ－ＳａｃＩで消化した。これらの断片を集合させて、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＶＨＬＶＫ（ＨＶＬ）を生成した。最後に、この構築物を用いて、２断片連結によりｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｅを生成した。ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＶＨＬＶＫ構築物をＢｓａＩおよびＳａｃＩで消化して、重鎖および軽鎖の可変領域とともにベクター断片を得た。ＺＥ３抗原セグメントおよびエピトープタグを得るため、ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３もまたＢｓａＩ－ＳａｃＩで消化した。ＨＶＬＺｅを産生するために用いられる生じた構築物をｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅと名付けた。
［００９４］構築物のＨＶＬパネルを以下のように生成した。一本鎖六量体の形成を容易にするため、Ｆｃ領域中に３つの点突然変異を含む一本鎖抗体を含有する構築物ＨＶＬ－Ｈｘを、２断片連結によって生成した。主鎖は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＶＨＬＶＫのＢｓａＩ－ＳａｃＩ消化によって得られ、そして六量体形成のための突然変異を含有する挿入物は、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３ＨｘのＢｓａＩ－ＳａｃＩ消化から得られた。最終構築物は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘと称された。
［００９５］ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＶＨＬＶＫ由来のＢｓａＩ－ＳａｃＩ消化主鎖を、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３由来の挿入物に連結することによって、Ｃ末端にＺＥ３抗原を含むがエピトープタグを含まない一本鎖融合体、ＨＶＬＺｎｔが生成された。この構築物は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔと称された。
［００９６］抗体Ｎ末端に連結され、そしてエピトープタグを含まない、ＺＥ３抗原を含む一本鎖ＲＩＣ、ＺＨＶＬｎｔを以下の連結によって生成した。ＺＥ３抗原およびＶＨセグメントを含有する挿入断片を、３５Ｓ－ＦおよびＶＨ－ＢｓａＳ－Ｒプライマーを用いて、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１から増幅した。ＶＨ－ＢｓａＳ－Ｒプライマーは、５’端の末端を仕立てて、ＢｓａＩでの消化に際してＳｐｅＩオーバーハングを生じるであろうＢｓａＩ部位を含めた。このＰＣＲ断片をＸｈｏＩ－ＢｓａＩで消化し、そしてｐＢＹＫＥＭｄ２－ＶＨＬＶＫから得られる主鎖ＸｈｏＩ－ＳｐｅＩ断片と連結された。最終構築物は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔと称される。
［００９７］Ｎ末端融合ＺＥ３抗原およびエピトープタグを含む一本鎖抗体ＲＩＣ、ＺＨＶＬｅを、２断片連結によって生成した。ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔをＢｓａＩ－ＳａｃＩで消化して、Ｎ末端ＺＥ３抗原およびＨＶＬ構築物を含有するベクターセグメントを産生した。６Ｄ８エピトープタグを含有する挿入物は、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１のＢｓａＩ－ＳａｃＩ消化由来であった。最終構築物は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅと称された。
［００９８］Ｎ末端融合ＺＥ３抗原および六量体形成を促進する点突然変異を含む一本鎖抗体、ＺＨＶＬｈｘは、２断片消化によって得られた。該ベクター断片は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔのＢｓａＩ－ＳａｃＩ消化によって得られ、そして挿入断片は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－ＨｘのＢｓａＩ－ＳａｃＩ消化によって得られた。最終構築物は、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘと称された。
［００９９］本明細書記載の特定の構築物を以下に列挙する：
・ｐＢＹＲ１１ｅｍ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３（配列番号２１に示される配列）
・ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１（配列番号２２に示される配列）
・ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ（配列番号２３に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３（配列番号２４に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ（配列番号２５に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ（配列番号２６に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ（配列番号２７に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ（配列番号２８に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ（配列番号２９に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ（配列番号３０に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ（配列番号３１に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ（配列番号３２に示される配列）
・ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋ（配列番号３３に示される配列）
２． ベンサミアナタバコ葉のアグロインフィルトレーション
［０１００］バイナリーベクターを、エレクトロポレーションによって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５内に別個に導入した。生じた株を制限消化またはＰＣＲによって検証し、３０℃で一晩増殖させ、そして２３～２５℃に維持した５～６週齢のベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。簡潔には、５，０００ｇ、５分間の遠心分離によって細菌をペレットにし、そして次いで、別に明記しない限り、浸潤緩衝液（１０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ｐＨ５．５および１０ｍＭ ＭｇＳＯ４）にＯＤ６００＝０．２まで再懸濁した。小さい穿刺を通じて、葉内に針を入れることなく、シリンジを用いることによって、生じた細菌懸濁物を注入した（ＨｕａｎｇおよびＭａｓｏｎ、２００４）。グリコシル化の影響を評価するため、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされたトランスジェニック植物を使用した。植物組織を５ＤＰＩで採取した。
３． タンパク質抽出および精製
［０１０１］製造者の指示にしたがって、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ装置（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｃｅ、ニューヨーク州アベリルパーク）を用い、１：５（ｗ：ｖ）氷冷抽出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬフェニルメチルスルホニルフロリド）で、アグロインフィルトレーションされた葉試料をホモジナイズすることによって、未精製タンパク質を抽出した。ホモジナイズされた組織を、室温または４℃で３０分間回転させた。未精製植物抽出物を１３，０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離することによって清澄化し、そして上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡによって分析した。あるいは、元来のホモジネート中のタンパク質の可溶性を評価するため、ペレットを不溶性分画に指定し、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥ上に装填する前に、ＳＤＳ試料緩衝液で、１００℃で１０分間処理した。
［０１０２］ＨＶＬＺｅを含むＩｇＧ変異体を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィによって精製した。アグロインフィルトレーションされた葉を、１：３（ｗ：ｖ）氷冷抽出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸ナトリウム、０．３ｍｇ／ｍＬフェニルメチルスルホニルフロリド）とブレンドし、４℃で３０分間攪拌し、そしてｍｉｒａｃｌｏｔｈを通じて濾過した。内因性植物タンパク質を沈殿させるため、攪拌しながら１Ｍリン酸を５分間添加して、ｐＨを４．５に下げ、次いで、２Ｍ ｔｒｉｓ塩基で７．６に上昇させた。１６，０００ｇで２０分間遠心分離した後、製造者の指示にしたがって、清澄化された抽出物をＰｉｅｒｃｅプロテインＧカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）上に装填した。精製されたタンパク質を、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５で溶出させ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０を含有する収集試験管に直接入れて、溶出緩衝液を中和した。ＨＶＬおよびＺＨＶＬｈｘ構築物を類似の方式で精製した；が、酸沈殿工程をスキップした。
［０１０３］ｐＢＹｅ３Ｒ２Ｋ２Ｍｃ－ＢＡＺＥ３から発現されたＺＥ３－Ｈｉｓを、金属アフィニティクロマトグラフィによって精製した。上述のようにタンパク質を抽出したが、酸沈殿は伴わなかった。製造者の指示にしたがって、清澄化された抽出物を、ＴＡＬＯＮ金属アフィニティ樹脂（ＢＤ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州マウンテンビュー）上に装填した。カラムをＰＢＳで洗浄し、そして溶出緩衝液（ＰＢＳ、１５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。ピークＺＥ３溶出をプールし、ＰＢＳに対して透析し、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。
４． ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
［０１０４］植物タンパク質抽出物または精製タンパク質試料をＳＤＳ試料緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー）と混合し、そして４～１５％無染色ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュルス）上で分離した。還元条件のため、０．５Ｍ ＤＴＴを添加し、そして装填前に試料を１０分間煮沸した。ポリアクリルアミドゲルを視覚化し、そしてＵＶ光下で画像化し、次いでＰＶＤＦ膜にトランスファーした。ＩｇＧ検出のため、タンパク質をトランスファーした膜を、ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ）中の５％ドライミルクで、４℃で一晩ブロッキングし、そしてヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス、１％ＰＢＳＴＭ中、１：５０００に希釈）で探査した。結合した抗体をＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国リトル・チャルフォント）で検出した。
５． Ｃ１ｑ結合
［０１０５］９６ウェル高結合ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、米国ニューヨーク州コーニング）を、ＰＢＳ中の１５μｇ／ｍｌヒト補体Ｃ１ｑで、３７℃で２時間コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、そして次いでＰＢＳＴ中の５％ドライミルクで１５分間ブロッキングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、精製ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国アラバマ州バーミンガム）および精製ＩｇＧ－ＺＥ３融合体の１０倍連続希釈を０．１ｍｇ／ｍｌで添加し、そして３７℃で１．５時間インキュベーションした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１：１０００ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国アラバマ州バーミンガム）と３７℃で１時間インキュベーションすることによって、結合したＩｇＧを検出した。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で現像し、１Ｍ ＨＣｌで停止し、そして吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
６． ６Ｄ８エピトープ結合
［０１０６］ＨＶＬが６Ｄ８エピトープタグに結合する能力を試験するため、６Ｄ８エピトープでタグ付けされた精製デングコンセンサスエンベロープドメインＩＩＩ ９００ｎｇを９６ウェル高結合ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、米国ニューヨーク州コーニング）に結合させた。３７℃で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、そしてＰＢＳＴ中、５％ドライミルクで３０分間ブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、そして精製ＨＬＶまたは全長６Ｄ８抗体の多様な希釈をプレートに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴで３回洗浄し、そして１：２０００希釈のＨＲＰコンジュゲート化マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃのみ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国アラバマ州バーミンガム）抗体で検出した。次いで、プレートをＰＢＳＴで完全に洗浄し、そしてＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で現像した。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
７． スクロース勾配密度遠心分離
［０１０７］各ＩｇＧ融合体の精製試料（１００μｌ）を、２．０ｍｌ微量遠心管中、ＰＢＳ中で５、１０、１５、２０、および２５％スクロースの３５０μｌ層からなる不連続スクロース勾配上に装填し、そして２１，０００ｇ、４℃で１６時間遠心分離した。分画を収集し、そしてＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、無染色ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュルス）上での視覚化によって分析した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、各分画の相対バンド強度を決定し、ピークバンドに恣意的に１の値を割り当てた。
８． マウスの免疫および試料収集
［０１０８］すべての動物を動物福祉法およびアリゾナ州立大学ＩＡＣＵＣにしたがって取り扱った。６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、精製ＩｇＧ融合変異体で皮下免疫した。すべての処置群において、抗原の総重量はＺＥ３の同等の８μｇが送達されるように設定された。第０日および第１４日に用量を投与した。第０日、第１４日、および第２８日に、顎下出血によって、Ｓａｎｔｉら、２００８に記載されるように、血清収集を行った。
９． 抗体測定
［０１０９］マウス抗体力価をＥＬＩＳＡによって測定した。植物発現された６－Ｈｉｓタグ付けＺＥ３を５０ｎｇ／ウェルで９６ウェル高結合ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ、米国ニューヨーク州コーニング）に結合させ、そしてプレートをＰＢＳＴ中の５％脱脂粉乳でブロッキングした。ウェルをＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した後、マウス血清を１％ ＰＢＳＴＭ（１％脱脂粉乳を含むＰＢＳＴ）で希釈し、そしてインキュベーションした。ポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ－セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）とインキュベーションすることによって、マウス抗体を検出した。プレートをＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で現像し、１Ｍ ＨＣｌで停止し、そして吸光度を４５０ｎｍで読み取った。ＰＢＳを試料として用いて生じたバックグラウンドの２倍のＯＤ４５０読み取り値を生じる最低の希釈の逆数を、終点力価とした。１％ＰＢＳＴＭ中、１：１００に希釈した血清からＩｇＧ２ａ抗体を測定し、そしてＩｇＧ２ａセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国テキサス州ダラス）を検出した。
引用され、そして援用される参考文献
Figure 2023514392000006

Claims (28)

  1. 抗原のユニット；
    ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ融合体のユニット；
    ＩｇＧの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのユニット；
    ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニット；ならびに
    ＩｇＧの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのユニット
    を含む、組換えタンパク質であって、
    抗原のユニットがＩｇＧのエピトープではなく；
    抗原のユニットが、Ｎ末端でＩｇＧのＶＨドメインのユニットに、またはＣ末端でＩｇＧのＣＨ３ドメインに連結され；
    ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットがＩｇＧのＣＨ２ドメインに連結され；そして
    ＩｇＧのＶＬドメインのユニットが、ＩｇＧのＶＨドメインのユニットに、そしてＩｇＧのＣＨ１ドメインに融合される
    前記組換えタンパク質。
  2. ＩｇＧが６Ｄ８抗体である、請求項１の組換えタンパク質。
  3. Ｆｃ融合体が、置換突然変異Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙを含む、請求項２の組換えタンパク質。
  4. 抗原のユニット；
    ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むＦｃ融合体のユニット；
    ＩｇＧの可変重鎖（ＶＨ）ドメインのユニット；
    ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニット；
    ＩｇＧの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインのユニット；ならびに
    ＩｇＧの軽鎖定常（ＣＬ）ドメインのユニット
    を含む、組換えタンパク質であって、
    ＩｇＧが６Ｄ８抗体であり；
    Ｆｃ融合体が置換突然変異Ｅ３４５Ｒ、Ｅ４３０Ｇ、およびＳ４４０Ｙを含み；
    抗原のユニットがＩｇＧのエピトープではなく；
    ＩｇＧのＣＨ１ドメインのユニットがＩｇＧのＣＨ２ドメインに連結され；
    ＩｇＧのＶＬドメインのユニットがＩｇＧのＣＬドメインのユニットに連結され；
    ＩｇＧのＣＬドメインのユニットがＩｇＧのＣＨ１ドメインに連結され；そして
    抗原のユニットがＩｇＧのＣＨ３ドメインに連結される
    前記組換えタンパク質。
  5. エピトープタグのユニットをさらに含み、該エピトープタグがＩｇＧのエピトープである、請求項１～４のいずれか一項の組換えタンパク質。
  6. エピトープタグが配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）を含み、そしてエピトープタグのユニットが抗原のユニットに連結される、請求項５の組換えタンパク質。
  7. エピトープタグが配列ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）を含む、請求項６の組換えタンパク質。
  8. エピトープタグが配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなる、請求項６の組換えタンパク質。
  9. 抗原の２つのユニット；
    Ｆｃ融合体の２つのユニット；
    ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニット；
    ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット；および
    ＩｇＧの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインの２つのユニット
    を含む、請求項２の組換えタンパク質であって、
    ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ１ドメインの連結で形成されるジスルフィド結合が、Ｆｃ融合体の２つのユニットを連結する
    前記組換えタンパク質。
  10. ＩｇＧのＶＬドメインの各ユニットが、ＩｇＧのＶＨドメインのユニットおよびＩｇＧのＣＨ１ドメインに連結される、請求項９の組換えタンパク質。
  11. 組換えタンパク質がＩｇＧの軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含まない、請求項１０の組換えタンパク質。
  12. エピトープタグの２つのユニットをさらに含む、請求項９～１１のいずれか一項の組換えタンパク質であって：
    エピトープタグの各ユニットが配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）を含み、
    エピトープタグの２つのユニットが、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端で、Ｆｃ融合体の２つのユニットに連結され、そして
    抗原の２つのユニットが、ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニットに連結される
    前記組換えタンパク質。
  13. エピトープタグの２つのユニットをさらに含む、請求項９～１１のいずれか一項の組換えタンパク質であって：
    エピトープタグの各ユニットが配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）を含み、
    エピトープタグの２つのユニットが抗原の２つのユニットに連結され、そして
    抗原の２つのユニットが、ＩｇＧのＣＨ３ドメインのＣ末端で、Ｆｃ融合体の２つのユニットに連結される
    前記組換えタンパク質。
  14. エピトープタグが配列ＶＹＫＬＤＩＳＥＡ（配列番号２）を含む、請求項１２または１３の組換えタンパク質。
  15. エピトープタグが配列ＹＫＬＤＩＳ（配列番号１）からなる、請求項１２または１３の組換えタンパク質。
  16. 抗原の２つのユニット；
    Ｆｃ融合体の２つのユニット；
    ＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニット；および
    ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニット
    を含む、組換えタンパク質であって：
    抗原がＩｇＧのエピトープではなく；
    抗原の２つのユニットが、Ｎ末端でＩｇＧのＶＨドメインの２つのユニットに連結され；そして
    ＩｇＧのＣＨ１ドメインの２つのユニットが、ＩｇＧのＣＨ２ドメインでＦｃ融合体の２つのユニットに連結される
    前記組換えタンパク質。
  17. 組換えタンパク質が、ＩｇＧの軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含まず、そしてＩｇＧの軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含まない、請求項１６の組換えタンパク質。
  18. 抗原が、寄託番号第ＡＭＣ１３９１１．１号のＫ３０１～Ｔ４０６を含む、請求項１～１７のいずれか一項の組換えタンパク質。
  19. 抗原が、配列番号３４～７２からなる群より選択される少なくとも１つの配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項の組換えタンパク質。
  20. 抗原が、配列番号３４～７２からなる群より選択される、少なくとも３つの配列、少なくとも６つの配列、または少なくとも９つの配列を含む、請求項１９の組換えタンパク質。
  21. 組換えタンパク質がトランスジェニック植物において産生される、請求項１～２０のいずれか一項の組換えタンパク質。
  22. トランスジェニック植物が、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされている、請求項２１の組換えタンパク質。
  23. 請求項１～２２のいずれか一項の少なくとも１つの組換えタンパク質、または
    請求項１および３～２２のいずれか一項の少なくとも１つの組換えタンパク質であって、抗体が６Ｄ８抗体である、前記組換えタンパク質
    を含む免疫学的組成物。
  24. 請求項１～２２のいずれか一項の組換えタンパク質を産生する方法であって：
    ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＺＥ３Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＶＬＺｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬ－Ｈｘ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＨＶＬＺｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｎｔ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｅ、ｐＢＹＫＥＭｄ２－ＺＨＶＬｈｘ、ｐＢＹＫＥＡＭ－Ｎ１２ＭＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＳＨｄ、ｐＢＹＫＥＡＭ－ＮＴＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＰＨｄ、ｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＳＨｄ、およびｐＢＹＫＥＨＭ－ＣＴＨｄからなる群より選択されるバイナリーベクターを、第一のアグロバクテリウム内に導入し；
    バイナリーベクターを含有する第一のアグロバクテリウムを植物部分に浸潤させて、形質転換植物部分を産生し；そして
    形質転換植物部分から未精製タンパク質を抽出し；そして
    抽出された未精製タンパク質を精製する
    工程を含む、前記方法。
  25. アグロバクテリウム内に導入されるバイナリーベクターが：ｐＢＹＲ１１ｅＭ－ｈ６Ｄ８ＺＥ３、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈｇｐ３７１、ｐＢＹＲ１１ｅＭａ－ＢＡＺＥ３－Ｈ、およびｐＢＹＫＥＭｄ－ＨＺＥ３からなる群より選択される、請求項２４の方法であって、該方法がさらに：
    第二のアグロバクテリウム内にｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋを導入し；そして
    ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋを含有する第二のアグロバクテリウムを植物部分に浸潤させて、形質転換植物部分を産生する
    工程を含み、
    ｐＢＹＫＥＭｄ－６Ｄ８Ｋを含有する第二のアグロバクテリウムおよびバイナリーベクターを含有する第一のアグロバクテリウムを、植物部分に共浸潤させる
    前記方法。
  26. 被験体において、抗原に対する免疫反応を誘導する方法であって、請求項１～２２のいずれか一項の組換えタンパク質より選択される少なくとも１つの組換えタンパク質または請求項２３の免疫学的組成物を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
  27. 請求項２６の方法であって、抗原がジカウイルス由来であり、方法が、請求項１８、２１、および２２のいずれか一項の組換えタンパク質または請求項２３の免疫学的組成物を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
  28. 請求項２７の方法であって、抗原がノロウイルス由来であり、方法が、請求項１９～２２のいずれか一項の組換えタンパク質または請求項２３の免疫学的組成物を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
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