JP2023514392A - アジュバントを伴わない免疫反応の誘導のためのIgG変異体 - Google Patents
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Abstract
本開示は、多様な病原体に対するワクチン接種設計に有用である免疫グロブリン変異体、ならびにこの変異体の産生法および使用法に関する。いくつかの側面において、免疫グロブリン変異体は、IgG、例えば6D8抗体の変異体である。【選択図】図1-1
Description
関連出願
[0001]本出願は、「アジュバントを伴わない中和免疫反応の誘導のためのIgG変異体」と題される、2020年2月21日出願の米国仮特許出願第62/980,012号の恩典を請求し、該出願の開示の全体が本明細書に援用される。
[0001]本出願は、「アジュバントを伴わない中和免疫反応の誘導のためのIgG変異体」と題される、2020年2月21日出願の米国仮特許出願第62/980,012号の恩典を請求し、該出願の開示の全体が本明細書に援用される。
電子的に提出された資料の援用
[0002]本明細書と同時に提出され、そして以下のように同定されるコンピュータ読み取り可能ヌクレオチド/アミノ酸配列表は、その全体が本明細書に援用される:2021年2月21日に作成された「SeqList」と名付けられた1つの416,572バイトASCII(テキスト)ファイル。
[0002]本明細書と同時に提出され、そして以下のように同定されるコンピュータ読み取り可能ヌクレオチド/アミノ酸配列表は、その全体が本明細書に援用される:2021年2月21日に作成された「SeqList」と名付けられた1つの416,572バイトASCII(テキスト)ファイル。
技術分野
[0003]本開示は、アジュバントを伴わずに強力な免疫反応を誘導する免疫グロブリン変異体、および植物においてこうした変異体を産生するためのベクターに関する。
[0003]本開示は、アジュバントを伴わずに強力な免疫反応を誘導する免疫グロブリン変異体、および植物においてこうした変異体を産生するためのベクターに関する。
[0004]組換えタンパク質抗原からなるサブユニットワクチンは、その安全性、産生の容易さ、および所望のエピトープに合わせて仕立てられたターゲティング免疫反応を誘発する能力のため、非常に有望である。しかし、単独で送達される際、これらの抗原はしばしば、ロバストで長期持続性の免疫反応を生成することに失敗し、その免疫原性を増進させる戦略が必要となる。したがって、組換えタンパク質抗原が、療法的使用のための候補であった。免疫グロブリンFcドメインに対するタンパク質融合体は、療法候補として非常に高い潜在能力を示してきている。Fcへの関心対象のタンパク質の融合は、融合パートナーの可溶性および安定性を増進させうる一方、また、プロテインA/Gアフィニティクロマトグラフィを通じた、単純でそして費用効率的な精製も可能にする。さらに、体内で新生Fc受容体(FcRn)と相互作用することによって、Fc融合体は、リソソーム分解を回避可能であり、それによって、Fc融合体の血清半減期は延長しうる。
[0005]Fc融合体を用いた研究の多くは、その療法的潜在能力を改善することに重点が置かれてきたが、より少ない研究は、抗原免疫原性を増進させるための戦略として、Fc融合体を調べてきた。Fcγ受容体および補体受容体C1qを含有する抗原提示細胞は、IgGに結合した抗原を取り込み、そしてプロセシングすることも可能である。しかし、これらの相互作用は、活性化のために高いアビディティの結合を必要とし、そしてしたがって、一価Fc抗原融合体は、これらの経路を効率的に利用しえない。他方で、多価Fcドメインを含む、より大きい抗原-抗体免疫複合体は、Fc受容体を架橋して、そして効率的にC1qに結合可能であり、樹状細胞による非常に改善された取り込みおよび提示、ならびにT細胞の改善された活性化を生じる。抗体と抗原を混合することによって生成される免疫複合体は、しばしば、一致しない結果を生じる:免疫反応は、好ましい抗原部位に向かうよう傾斜しうるが、全体の免疫原性は顕著には改善されない可能性もある。
[0006]対照的に、組換え免疫複合体(RIC)は、破傷風菌(Clostridium tetani)、エボラウイルス、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、デングウイルス、ヒトパピローマウイルスのワクチン候補を産生するために使用されてきている。RICは、その同族(cognate)抗原に遺伝子融合されたIgGであり、天然感染中に見られるものを模倣する、より大きな高免疫原性の抗原-抗体クラスターの形成を可能にする。
[0007]本開示は、免疫グロブリン変異体、例えば免疫グロブリンG(IgG)変異体である組換えタンパク質、ならびにその産生法および使用法に関する。いくつかの側面において、IgG変異体は6D8抗体に基づく。組換えタンパク質中の抗体部分が6D8抗体である特定の態様において、抗体のCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc融合体は、置換突然変異E345R、E430G、およびS440Yを含む。
[0008]いくつかの態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc融合体のユニット、IgGの可変重鎖(VH)ドメインのユニット、IgGのCH1ドメインのユニット;ならびにIgGの軽鎖可変(VL)ドメインのユニットを含む。抗原のユニットは、IgGのエピトープではなく、そしてこのユニットは、N末端でIgGのVHドメインのユニットに、またはC末端でIgGのCH3ドメインに連結される。IgGのCH1ドメインのユニットは、IgGのCH2ドメインに連結される一方、IgGのVLドメインのユニットは、IgGのVHドメインのユニットに、そしてIgGのCH1ドメインに融合される。いくつかの実施において、組換えタンパク質は、エピトープタグがIgGのエピトープである、エピトープタグのユニットをさらに含む。
[0009]いくつかの側面において、組換えタンパク質は、抗原の2つのユニット、Fc融合体の2つのユニット、IgGのCH1ドメインの2つのユニット、IgGのVHドメインの2つのユニット、およびIgGのVLドメインの2つのユニットを含む。IgGのCH2ドメインおよびCH1ドメインの連結で形成されるジスルフィド結合は、Fc融合体の2つのユニットを連結する。いくつかの側面において、IgGのVLドメインの各ユニットは、IgGのVHドメインのユニットおよびIgGのCH1ドメインに連結される。特定の実施において、組換えタンパク質は、IgGのいかなる軽鎖定常(CL)ドメインも含まない。抗原の2つのユニット、Fc融合体の2つのユニット、IgGのCH1ドメインの2つのユニット、IgGのVHドメインの2つのユニット、およびIgGの軽鎖可変(VL)ドメインの2つのユニットを含む組換えタンパク質のいくつかの態様において、組換えタンパク質は、エピトープタグの2つのユニットをさらに含み、ここでこのエピトープタグはIgGのエピトープである。いくつかの実施において、エピトープタグの2つのユニットは、IgGのCH3ドメインのC末端でFc融合体の2つのユニットに連結される一方、抗原の2つのユニットは、IgGのVHドメインの2つのユニットに連結される。他の実施において、エピトープタグの2つのユニットは、抗原の2つのユニットに連結される一方、抗原の2つのユニットは、IgGのCH3ドメインのC末端でFc融合体の2つのユニットに連結される。特定の態様において、抗体は6D8抗体であり、そしてエピトープタグは、ペプチド配列YKLDIS(配列番号1)を含む。
[0010]他の態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc融合体のユニット、IgGのVHドメインのユニット、IgGのCH1ドメインのユニット、IgGのVLドメインのユニット;ならびにIgGのCLドメインのユニットを含む。こうした態様において、IgGは6D8抗体であり、そしてFc融合体は、置換突然変異E345R、E430G、およびS440Yを含む。抗原のユニットは、6D8抗体のエピトープではなく、そしてこのユニットは、C末端でIgGのCH3ドメインに連結される。IgGのVLドメインのユニットは、IgGのCLドメインのユニットに連結され、そしてIgGのCLドメインのユニットは、IgGのCH1ドメインに連結される。次いでIgGのCH1ドメインのユニットは、IgGのCH2ドメインに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、6D8抗体のエピトープタグをさらに含み、例えばペプチド配列YKLDIS(配列番号1)を含む。
[0011]いくつかの側面において、組換えタンパク質中のエピトープタグは、配列VYKLDISEA(配列番号2)を含む。他の側面において、エピトープタグは、配列YKLDIS(配列番号1)からなる。
[0012]組換えタンパク質のさらに他の態様において、IgG変異体は、抗原の2つのユニット、Fc融合体の2つのユニット、IgGのVHドメインの2つのユニット、およびIgGのCH1ドメインの2つのユニットを含む。抗原は、IgGのエピトープではなく、そして抗原の2つのユニットは、N末端でIgGのVHドメインの2つのユニットに連結される。IgGのCH1ドメインの2つのユニットは、IgGのCH2ドメインで、Fc融合体の2つのユニットに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、IgGのCLドメインを含まず、そしてIgGのVLドメインを含まない。
[0013]特定の実施において、組換えタンパク質の抗原は、ジカウイルス由来であり、例えば抗原のユニットは、寄託番号第AMC13911.1号のK301~T406を含む。他の実施において、組換えタンパク質の抗原は、ノロウイルス由来であり、例えば抗原のユニットは、ノロウイルスの主要カプシドタンパク質由来の少なくとも1つの部分および/またはノロウイルスの非構造タンパク質1(NS1)由来の少なくとも1つの部分を含む。いくつかの態様において、抗原のユニットは、ノロウイルス主要カプシドタンパク質の突出ドメイン由来の少なくとも1つの長さ5~500残基の部分、ノロウイルス主要カプシドタンパク質のシェルドメイン、またはノロウイルスのNS1由来の部分を含む。いくつかの側面において、組換えタンパク質の抗原は、複数の抗原性ペプチドを含んでもよい。例えば、いくつかの実施において、抗原のユニットは、主要カプシドタンパク質由来の少なくとも1つの部分、あるいは複数のノロウイルス株または種のNS1由来の、例えばヒトノロウイルスGI.3、ヒトノロウイルスGII.4、およびネズミノロウイルス(MNV)由来の少なくとも1つの部分を含む。いくつかの態様において、抗原のユニットは、配列番号34~72に示される少なくとも1つの配列を含む。
[0014]本明細書記載の産生法は、植物において組換えタンパク質を発現する工程を含む。言い換えると、組換えタンパク質は、トランスジェニック植物において産生される。特定の実施において、組換えタンパク質は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされているトランスジェニック植物において発現される。いくつかの側面において、本明細書記載の組換えタンパク質を産生する方法は:pBYR11eM-h6D8ZE3、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371、pBYR11eMa-BAZE3-H、pBYKEMd-HZE3、pBYKEMd-ZE3H、pBYKEMd-ZE3Hx、pBYKEMd-HVLZe、pBYKEMd2-HVL-Hx、pBYKEMd2-HVLZnt、pBYKEMd2-ZHVLnt、pBYKEMd2-ZHVLe、pBYKEMd2-ZHVLhx、pBYKEAM-N12MHd、pBYKEAM-NPHd、pBYKEAM-NSHd、pBYKEAM-NTHd、pBYKEHM-CPHd、pBYKEHM-CSHd、およびpBYKEHM-CTHdからなる群より選択されるベクターをアグロバクテリウム内に導入し、そして該ベクターを含有するアグロバクテリウムを植物部分に浸潤させて、形質転換植物部分を産生する工程を含む。次いで、形質転換植物から未精製タンパク質を抽出し、その後、組換えタンパク質に関して精製する。アグロバクテリウム内に導入するベクターが:pBYR11eM-h6D8ZE3、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371、pBYR11eMa-BAZE3-H、およびpBYKEMd-HZE3からなる群より選択される産生法に関しては、方法は、pBYKEMd-6D8Kを含有するアグロバクテリウムおよび該ベクターを含有するアグロバクテリウムとの共浸潤をさらに含む。
[0015]本明細書記載の使用法には、組換えタンパク質中の抗原に対して、被験体において免疫反応を誘導する方法が含まれる。該方法は、被験体に、記載される組換えタンパク質を投与する工程を含む。特定の態様において、方法は、被験体において、ジカウイルスに対する免疫反応を誘導する。こうした態様において、組換えタンパク質は、寄託番号第AMC13911.1号のK301~T406を含むアミノ酸配列を含む抗原を含む。他の態様において、方法は、被験体において、ヒトノロウイルスおよびMNVを含むノロウイルスに対する免疫反応を誘導する。こうした態様において、組換えタンパク質は、ノロウイルスのVP1由来の、例えばその突出ドメインまたはシェルドメイン由来の、あるいはノロウイルスのNS1由来の抗原を含む。
[0016]いくつかの実施において、被験体は、複数のノロウイルスのVP1由来の抗原を含む組換えタンパク質、および複数のノロウイルスのNS1由来の抗原を含む組換えタンパク質を含む組成物を投与される。さらに他の実施において、組換えタンパク質は、トランスジェニック植物中で産生される。いくつかの側面において、トランスジェニック植物は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされる。
[0037]本開示の詳細な側面および適用を、以下の図および技術の詳細な説明において、以下に記載する。明記しない限り、本明細書および請求項中の単語および句は、単純で、一般的な、そして適用可能な分野の一般の当業者が慣れ親しんだ意味を与えることが意図される。
[0038]以下の記載において、そして説明の目的のため、本開示の多様な側面の完全な理解を提供するために、多くの特定の詳細が示される。しかし、関連する分野の当業者によって、本明細書に開示する技術の態様は、これらの特定の詳細なしに実施されうることが理解されるであろう。開示される技術が適用されうる多くの異なるおよび別の配置、デバイスおよび技術があることに留意しなければならない。本明細書に開示する技術の完全な範囲は、以下に記載される例に限定されない。
[0039]単数形「a」、「an」、および「the」には、背景が明らかに別に示さない限り、複数形が含まれる。したがって、例えば「1つの工程(a step)」への言及は、1つまたはそれより多くのこうした工程への言及を含む。
[0040]本明細書において、用語「6D8抗体」は、エボラウイルスのGP1タンパク質に対するモノクローナル抗体を指す(Wilsonら、2000に記載される;植物に最適化された配列は、Huangら、2010に記載される)。いくつかの態様において、6D8抗体のCH1ドメインは、
(配列番号5)を含むペプチド配列、あるいは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの態様において、6D8抗体のCH2ドメインは、
(配列番号6)を含むペプチド配列、あるいは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの態様において、6D8抗体のCH3ドメインは、
(配列番号7)を含むペプチド配列を指す。いくつかの態様において、6D8抗体の可変重鎖ドメインは、GenBank寄託番号第AEB96146号を含むペプチド配列、あるいは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの態様において、6D8抗体の可変軽鎖ドメインは、GenBank寄託番号第AEB96146号を含むペプチド配列、あるいは少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列類似性を有するペプチド配列を指す。いくつかの側面において、軽鎖変異体ドメインをコードする核酸は、GenBank寄託番号第HQ407546号に示される。いくつかの側面において、重鎖変異体ドメインをコードする核酸は、GenBank寄託番号第AEB96148号に示される。
[0041]本明細書において、用語「連結される」は、タンパク質構造またはタンパク質ドメインの配置を記載するために用いられる際、2つのドメインまたは構造部分の間の連結を指し、この場合、好ましくはリンカーを除いて、他の介在するドメインまたは構造部分はない。いくつかの側面において、用語「リンカー」は、本明細書において、唯一の機能がタンパク質ドメインまたは構造部分を連結することである、タンパク質ドメインまたは構造部分間のアミノ酸配列を指す。例えば、リンカーは、グリシン、バリン、および/またはスレオニン残基からなる配列である。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン、バリン、スレオニン、アラニン、および/またはセリン残基からなる配列である。いくつかの側面において、リンカーは、長さ1~50アミノ酸、例えば長さ3、4、6、10、12、14、または16アミノ酸からなる。特定の態様において、リンカーは柔軟性リンカーである。
[0042]本明細書において、用語「ユニット」は、より大きな多構成要素タンパク質の機能的断片である単一のペプチドを指す。単一ペプチドは、抗原性断片またはタンパク質のドメイン、例えば免疫グロブリンのドメインであってもよい。したがって、本明細書において、ペプチドの2つのユニットを含む組換えタンパク質の記載は、ともに連結されていてもまたはいなくてもよい、2つのこうした機能的断片、例えばペプチドの二量体を有する組換えタンパク質を指す。
[0043]本明細書において、用語「免疫複合体」は、その同族抗原に結合した、免疫グロブリン分子またはその断片を含む複合体を指す。本明細書において、用語「組換え免疫複合体」または「RIC」は、免疫複合体中で免疫グロブリン分子を天然に産生する元来の種によっては産生されない、免疫複合体を指す。例えば、例示的な組換え免疫複合体は、植物において合成されたヒト免疫グロブリンを含む。
[0044]本開示は、免疫グロブリン変異体に関する。特に好ましい態様において、本開示は、本明細書においてIgG融合体とも称される、免疫グロブリンGの変異体である組換えタンパク質に関する。免疫グロブリンの天然構造からの逸脱にもかかわらず、記載される組換えタンパク質は、免疫原性潜在能力を有する。実際、該組換えタンパク質によって誘導される免疫反応は、組換えタンパク質中の抗原の予期される免疫反応と同様である。本明細書に記載される組換えタンパク質は、多様な病原体、例えばジカウイルスおよびノロウイルスをターゲティングするワクチンを生成するために適している。
[0045]免疫グロブリン構造の変動にかかわらず、Fcのグリコシル化状態は、その機能を強く制御する。Fcの安定性、コンホメーション、および凝集を調節することによって、グリコシル化は、Fcγ受容体、FcRn、およびC1qへの結合を増進または阻害しうる。これらの改変は、抗体依存性細胞性細胞傷害(ADCC)、抗体依存性細胞仲介性食作用(ADCP)、補体依存性細胞傷害(CDC)、およびウイルス感染の抗体依存性増進(ADE)を含む、抗体エフェクター機能に重要な相違を生じる。糖操作の進歩によって、多様な組換え発現系において、Fcグリコシル化状態のターゲティングされた最適化が可能になっている。コアキシロースおよびフコースN-グリカンを欠く糖操作植物を用いると、FcγRI、FcγRIIIa、およびC1qへの結合が改善された抗CD20抗体が産生された。該抗体は、哺乳動物細胞において産生された商業的抗CD20抗体に比較して、増進されたADCCおよびCDCを有した。同様に、糖操作植物において産生された抗DENV抗体は、そのADE活性を控えることが示されてきており、そしてその結果、哺乳動物細胞で産生された対応物よりも優れた有効性および安全性プロファイルを有する。糖操作植物において作製された抗体療法剤は、エボラ、HIV、およびチクングニヤウイルス疾患を有するアカゲザル(rhesus macaque)およびヒトを治療するために用いられてきている。
[0046]望ましい特性を抗体に与える、Fc領域における突然変異が同定されてきている。M252Y、S254T、およびT256E突然変異の導入は、低pH条件下で、FcRnとの相互作用を改善することによって、ヒトにおいて、抗呼吸器合胞体ウイルス抗体の血清半減期を、20日から60日に増加させた。H237Y突然変異は、ヒンジ領域の有害な切断を減少させる一方、FcγRIII結合およびADCC活性を改善した。さらなるジスルフィド結合の操作が、Fc融合体のアンフォールディングおよび凝集を防止することが報告されてきている。S239DおよびI332E突然変異は、CD37抗体のFcγRIII結合およびADCC活性を改善した。IgG1ヒンジ領域を、IgG3由来またはラクダ科(camelid)抗体由来のより長いヒンジ領域で置き換えると、上皮増殖因子受容体抗体のADCCが増加した。E345R、E430G、およびS440Y突然変異を含むIgG1は六量体を形成し、これはC1q結合および補体活性化を非常に増進させた。突然変異T437RおよびK248Eはまた、多量体化を促進し、そしてOX40受容体抗体のエフェクター機能を改善した。
[0047]本明細書記載のIgG変異体は、ヒト様グリコシル化で適切に集合可能であり、そして植物において非常に高レベルで発現されうる。これらの構築物は、植物において効率的に作製され、適切に集合し、そしてプロテインGカラムクロマトグラフィを通じて精製されうる。実施例に示すように、精製組換えタンパク質は、強力に免疫原性である。
[0048]本明細書記載の実施例に示されるように、記載される免疫グロブリン変異体を産生するために、抗体設計の多様な側面、例えば複合体サイズを最適化すると、植物において最適化された発現レベル、ならびに改善された安定性、可溶性、および免疫受容体結合が生じる。抗原としてジカウイルスエンベロープタンパク質ドメインIIIの部分を含む免疫グロブリン変異体を設計する特定の態様において、免疫グロブリン変異体の投与によって生じる総IgG力価は、抗原単独の投与によって生じる総IgG力価に比較して、150倍高かった。実際、終点力価は、いかなるアジュバントも伴わず、免疫グロブリン変異体の2回のみの用量の投与で、>1:500,000であった。組換えタンパク質は、抗体療法剤の商業的実行可能性に関して概算される閾値を超えるレベルで産生可能であった。
組換えタンパク質
[0049]本明細書記載の組換えタンパク質は、抗原のユニット、Fc融合体のユニット、IgGの可変重鎖(VH)ドメインのユニット、およびIgGのCH1ドメインのユニットを含む、変異体免疫グロブリン構造である。Fc融合体は、IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。免疫グロブリンFcドメインへのタンパク質融合体は、非常に成功した療法剤である。これらは、融合パートナーの可溶性および安定性を増進させうる一方、単純でそして費用効率的な精製のための手段も提供する。さらに、体内で新生Fc受容体(FcRn)と相互作用することによって、Fc融合体は、リソソーム分解を回避可能であり、それによってFc融合体の血清半減期は延長される。組換えタンパク質は、抗原単独よりも、組換えタンパク質に付着した抗原に対して、より大きい免疫反応を誘導する。したがって、組換えタンパク質は、抗原の免疫原性を増加させる。
[0049]本明細書記載の組換えタンパク質は、抗原のユニット、Fc融合体のユニット、IgGの可変重鎖(VH)ドメインのユニット、およびIgGのCH1ドメインのユニットを含む、変異体免疫グロブリン構造である。Fc融合体は、IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。免疫グロブリンFcドメインへのタンパク質融合体は、非常に成功した療法剤である。これらは、融合パートナーの可溶性および安定性を増進させうる一方、単純でそして費用効率的な精製のための手段も提供する。さらに、体内で新生Fc受容体(FcRn)と相互作用することによって、Fc融合体は、リソソーム分解を回避可能であり、それによってFc融合体の血清半減期は延長される。組換えタンパク質は、抗原単独よりも、組換えタンパク質に付着した抗原に対して、より大きい免疫反応を誘導する。したがって、組換えタンパク質は、抗原の免疫原性を増加させる。
[0050]抗原のユニットは、IgGのエピトープではない。特定の態様において、抗原のユニットは、IgGのエピトープとは異なる生物に由来する。抗原のユニットのアミノ酸配列は、長さ5~500残基の間である。特定の態様において、抗原のユニットは、長さ5~400残基の間である。例えば、抗原のユニットは、長さ5~300残基の間、5~250残基の間、5~200残基の間、5~100残基の間、9~300残基の間、9~250残基の間、9~200残基の間、9~100残基の間、10~300残基の間、10~250残基の間、10~200残基の間、10~100残基の間、20~300残基の間、20~250残基の間、20~200残基の間、20~100残基の間、30~300残基の間、30~250残基の間、30~200残基の間、30~100残基の間、50~300残基の間、50~250残基の間、50~200残基の間、または50~100残基の間である。いくつかの側面において、抗原のユニットはタンデム連結エピトープを含む。
[0051]いくつかの側面において、タンデム連結エピトープは、同じまたは類似の抗原タンパク質であってもまたはなくてもよい、異なるエピトープを含む。例えば、多様な遺伝子型のノロウイルスに対処するために、複数のノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質は、複数のノロウイルス由来の同じターゲット抗原上のエピトープを含んでもよい(図15~19で研究される組換え免疫複合体を参照されたい)。したがって、タンデム連結エピトープは、同じ抗原性タンパク質由来のエピトープを含んでもよい。他の側面において、タンデム連結エピトープは、単一エピトープの反復である。
[0052]抗原のユニットは、N末端でIgGのVHドメインのユニットに、またはC末端でIgGのCH3ドメインに連結される。IgGのCH1ドメインのユニットは、IgGのCH2ドメインに連結される。いくつかの側面において、抗原のユニット、Fc融合体のユニット、IgGのVHドメインのユニット、およびIgGのCH1ドメインのユニットは、組換えタンパク質の半分を形成する。例えば、組換えタンパク質は、産生に際して自己集合し、ここで、Fc融合体の2つのユニットを連結する、CH2ドメインおよびCH1ドメインの連結で、ジスルフィド結合が形成される(図1Aおよび7を参照されたい)。したがって、いくつかの態様において、組換えタンパク質は、抗原の2つのユニット、Fc融合体の2つのユニット、IgGのVHドメインの2つのユニット、およびIgGのCH1ドメインの2つのユニットを含む。特定の態様において、抗体は6D8抗体である。
[0053]特定の態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc融合体のユニット、IgGのVHドメインのユニット、IgGのCH1ドメインのユニット;ならびにIgGの軽鎖可変(VL)ドメインのユニットを含む。抗原のユニットは、IgGのエピトープではなく、そしてN末端でIgGのVHドメインのユニットに、またはC末端でIgGのCH3ドメインに連結される。IgGのCH1ドメインのユニットは、IgGのCH2ドメインに連結される一方、IgGのVLドメインのユニットは、IgGのVHドメインのユニットに、そしてIgGのCH1ドメインに融合される。
[0054]いくつかの側面において、組換えタンパク質は、産生に際して自己集合し、そしてIgGのCH2ドメインおよびCH1ドメインの連結で形成されるジスルフィド結合が、Fc融合体の2つのユニットを連結する。したがって、組換えタンパク質は、抗原の2つのユニット、Fc融合体の2つのユニット、IgGのCH1ドメインの2つのユニット、IgGのVHドメインの2つのユニット、およびIgGのVLドメインの2つのユニットを含む。いくつかの側面において、IgGのVLドメインの各ユニットは、IgGのVHドメインのユニットおよびIgGのCH1ドメインに連結される。特定の実施において、組換えタンパク質は、IgGのいかなる軽鎖定常(CL)ドメインも含まない。こうした態様の組換えタンパク質は、一本鎖抗体変異体である(例えば図7を参照されたい)。図8に示されるように、一本鎖抗体変異体は、植物中で産生されてもよく、そして効率的に精製されうる。IgGが6D8抗体である一本鎖抗体変異体はまた、6D8エピトープに結合する能力も保持する(図11)。
[0055]抗原の2つのユニット、Fc融合体の2つのユニット、IgGのCH1ドメインの2つのユニット、IgGのVHドメインの2つのユニット、およびIgGのVLドメインの2つのユニットを含む組換えタンパク質のいくつかの態様において、組換えタンパク質はさらにエピトープタグの2つのユニットを含み、ここで、エピトープタグはIgGのエピトープである。いくつかの実施において、エピトープタグの2つのユニットは、IgGのCH3ドメインのC末端でFc融合体の2つのユニットに連結され、そして抗原の2つのユニットは、IgGのVHドメインの2つのユニットに連結される。他の実施において、エピトープタグの2つのユニットは、抗原の2つのユニットに連結され、そして抗原の2つのユニットは、IgGのCH3ドメインのC末端でFc融合体の2つのユニットに連結される。抗体が6D8抗体である場合、エピトープタグは、ペプチド配列YKLDIS(配列番号1)を含む。いくつかの側面において、エピトープタグは、配列VYKLDISEA(配列番号2)を含む。他の側面において、エピトープタグは、配列YKLDIS(配列番号1)からなる。
[0056]他の態様において、組換えタンパク質は、抗原のユニット、IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc融合体のユニット、IgGのVHドメインのユニット、IgGのCH1ドメインのユニット、IgGのVLドメインのユニット;ならびにIgGのCLドメインのユニットを含む。こうした態様において、IgGは6D8抗体であり、そしてFc融合体は:E345R、E430G、およびS440Yからなる群より選択される少なくとも1つの置換突然変異を含む。特定の態様において、Fc融合体は置換突然変異、E345R、E430G、およびS440Yを含む。抗原のユニットは、6D8抗体のエピトープではなく、そしてC末端でIgGのCH3ドメインに連結される。IgGのVLドメインのユニットは、IgGのCLドメインのユニットに連結され、そしてIgGのCLドメインのユニットは、IgGのCH1ドメインに連結される。IgGのCH1ドメインのユニットは次いで、IgGのCH2ドメインに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、6D8抗体のエピトープタグをさらに含み、例えばペプチド配列YKLDIS(配列番号1)を含むものである。いくつかの側面において、組換えタンパク質中のエピトープタグは、配列VYKLDISEA(配列番号2)を含む。他の側面において、エピトープタグは、配列YKLDIS(配列番号1)からなる。
[0057]組換えタンパク質のさらに他の態様において、IgG変異体は、抗原の2つのユニット、Fc融合体の2つのユニット、IgGのVHドメインの2つのユニット、およびIgGのCH1ドメインの2つのユニットを含む。抗原はIgGのエピトープではなく、そして抗原の2つのユニットは、N末端でIgGのVHドメインの2つのユニットに連結される。IgGのCH1ドメインの2つのユニットは、IgGのCH2ドメインでFc融合体の2つのユニットに連結される。いくつかの側面において、組換えタンパク質は、IgGのCLドメインを含まず、そしてIgGのVLドメインを含まない。
ジカウイルス
[0058]ジカウイルス(ZIKV)は、実質的な世界規模の健康上の脅威であり、安全で入手可能、そして効果的なワクチンを欠いている。その広範囲の療法的価値に加えて、IgG融合体は、その安全性および自己アジュバント性質のため、有望なワクチン候補である。
[0058]ジカウイルス(ZIKV)は、実質的な世界規模の健康上の脅威であり、安全で入手可能、そして効果的なワクチンを欠いている。その広範囲の療法的価値に加えて、IgG融合体は、その安全性および自己アジュバント性質のため、有望なワクチン候補である。
[0059]例示的な態様において、いくつかのIgG変異体は、ZIKVに対する免疫反応を生成するよう設計された。したがって、組換えタンパク質中の抗原は、ZIKVをターゲティングする抗原である。いくつかの側面において、抗原は、ジカウイルスエンベロープドメインIII(ZE3)をターゲティングする。これらのIgG変異体は、非常に安定であり、そして植物において高発現された。したがって、本明細書記載の組換えタンパク質は、例えばZIKVに対するワクチン候補である。
[0060]いくつかの側面において、ZE3をターゲティングする抗原は、寄託番号第AMC13911.1号のK301~T406を含む。他の側面において、ZE3をターゲティングする抗原は、寄託番号第AMC13911.1号のK301~T406に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列類似性を有するペプチド配列を含む。さらに他の側面において、ZE3をターゲティングする抗原は、ジカウイルスの他の株由来のGenBank寄託番号第AMC13911号の対応する領域の機能的同等型である配列、例えばGenBank寄託番号第AY632535号、第KU321639号、第KJ776791号、第KF383115号、第KF383116号、第KF383117号、第KF383118号、第KF383119号、第KF268948号、第KF268949号、第KF268950号、第EU545988号、第KF993678号、第JN860885号、第HQ234499号、第KU501215号、第KU501216号、第KU501217号中のZE3の対応する配列を含む。
[0061]ZIKVをターゲティングする本明細書記載の組換えタンパク質は、アジュバントを伴わず、そしてわずか2回の用量で、ZIKVに対して強い免疫反応を引き起こした(図6A、6B)。組換えタンパク質の多くは、植物において高レベルで産生され(0.5~1.5mg/g LFW)(図2)、そして反復凍結融解および保存に際して安定であった(図5)。ZE抗原単独に比較して、最適なIgG融合群は、100倍より高い抗体反応を生じた。これは、ZE3またはZIKV Eの免疫原性がそれ自体では弱く、アジュバントおよび3~4回の用量を必要とすることを示す、以前の研究と一致する。
[0062]ポリマー構造を形成すると予期される構築物は、分解に対して最も抵抗性であり、そして最高の全体収量を有した。RICの分子内結合を最適化することによって、可溶性が非常に改善された、より小さい複合体が生成され、葉の新鮮重量1グラムあたり、1.5ミリグラムのIgG融合体が生じ(mg/g LFW)、そして免疫原性特性は同等であるかまたは改善されていた。マウスを免疫するために用いた際、IgG融合体は、アジュバントを伴わず、2回のみの用量を用いて、高力価のジカ特異的抗体を誘発し、ZE3単独によって生じる力価を20倍~150倍超え、そしてジカウイルスを強力に中和した。IgG融合体はまた、C1q結合と相関した方式で、非融合ZE3抗原に比較して、IgG2a産生を強く増進することも見出された。これらの知見は、植物において効率的に作製可能である、ジカウイルスに対する自己アジュバントサブユニットワクチンとしてのIgG融合体の優れた潜在能力を示す。
[0063]ZIKVをターゲティングするIgG融合体のC1q結合は、IgG N末端へのZE3融合によって増進された。IgG軽鎖の除去(HVLおよびHVL関連構築物)またはFab領域の除去もまた、C1q結合を増進させた。IgG Fc領域における六量体誘導突然変異の付加もまた、C1q結合を増進させた。C1q結合はまた、RICを生成するための自己結合性エピトープタグの付加、または植物特異的β1,2-連結キシロースおよびα1,3-連結フコースN-グリカンを欠く植物(例えばキシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼのサイレンシングによって。図9および10を参照されたい)におけるIgG融合体の産生によっても増進された。RIC構築物(HLZe)および一本鎖抗体変異体に基づく修飾免疫複合体(HVLZe)はどちらも、非複合体化IgGに比較して、有意に改善されたC1q結合を有する(図1、9、および10)。免疫後の結果は、HVLZe構築物が、全長重鎖および軽鎖を含有する伝統的なRICのものと類似の抗体力価を生じることを示した(図6Aおよび6B)。
[0064]いくつかの側面において、大きな複合体サイズが抽出に際して可溶性が劣り(図2Aおよび10)、そして高濃度であると保存中に沈殿しうるため、RIC構築物は好ましくない。非常に大きいRICはまた、注射部位からリンパ節に効率的に排出されるには大きすぎる可能性があり、排出には、<200nmの粒子が好ましい。六量体サイズのIgGは、効率的なC1q結合に最適な基質であることが見出されてきている。また、6D8エピトープタグを突然変異させても(構築物HLZd)、RIC構築物での問題が軽減されうる。特に、RICと比較して、HLZdは、有意により可溶性であり(図13B)、中程度の密度を有し(図4A)、より高いC1q結合を示し(図1B)、より高い発現レベルに到達し(1.5mg/g LFW)(図2A)、そしてより高いIgG2a力価を誘発した(図6Aおよび6B)。RICワクチン候補の設計に対するこれらの改善は、他の抗原にも適用可能である。
[0065]HVLZe融合体は、伝統的なRICよりもわずかにより高いC1q結合を有し(図1B)、そして試験した条件で高い安定性を有した(図5A)。この一本鎖配置は、完全6D8抗体と比較した際、エピトープタグへの結合が減少したため、HVLZeは、より小さい複合体を形成した(図4A中、HLZeに比較して、減少した密度を示すスクロース勾配データ)。しかし、構築物HLZdとは異なり、ある程度の非常に高密度の物質が残った。可溶性は、HVLZeのエピトープ結合を減少させることによって改善可能であった。
[0066]表1は、組換えタンパク質、ZIKVをターゲティングする抗原の特性を要約する。発現に関しては、完全に集合した産物の収量(mg/g LFW)のみを示す。より多数の「+」記号は、その特性に関する平均値の統計的に有意な増加(C1q、IgG、およびIgG2aに関して)、または繰り返し観察される相違(密度に関して)を示す。ZHx(*)に関しては、低密度および高密度物質の両方のピークが観察された。
表1.
ノロウイルス
[0067]ヒトノロウイルス(HNoV)感染の広範囲の発生は、甚大な経済的損失および疾患負荷を引き起こすが、認可されたワクチンまたは特異的な治療は利用可能ではない。HNoVを制御しようとする努力は、これらのウイルスの大きな遺伝的多様性によって妨害されており、これらは自然免疫を逃れるように進化し続けている。大量の公開されている抗体マッピングおよびT細胞データによって、広く保存されたHNoV B細胞およびT細胞エピトープの存在が示されており、重要なことに、これらはヒト免疫系によってターゲティング可能である。したがって、広く保存されたHNoV抗原性ターゲットに対する免疫反応を誘発する目的のため、組換えタンパク質を設計することが可能であろう。
[0067]ヒトノロウイルス(HNoV)感染の広範囲の発生は、甚大な経済的損失および疾患負荷を引き起こすが、認可されたワクチンまたは特異的な治療は利用可能ではない。HNoVを制御しようとする努力は、これらのウイルスの大きな遺伝的多様性によって妨害されており、これらは自然免疫を逃れるように進化し続けている。大量の公開されている抗体マッピングおよびT細胞データによって、広く保存されたHNoV B細胞およびT細胞エピトープの存在が示されており、重要なことに、これらはヒト免疫系によってターゲティング可能である。したがって、広く保存されたHNoV抗原性ターゲットに対する免疫反応を誘発する目的のため、組換えタンパク質を設計することが可能であろう。
[0068]例示的な態様において、IgG変異体は、ノロウイルス(NoV)に対する免疫反応を生じるように設計された。いくつかの側面において、組換えタンパク質の抗原は、複数のノロウイルス由来、例えばヒトノロウイルスGI.3、ヒトノロウイルスGII.4、および/またはネズミノロウイルス(MNV)由来のエピトープを含む。ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質中の抗原は、NoVの主要カプシドタンパク質(VP1)またはNoVの非構造タンパク質由来の少なくとも1つのエピトープを含む。いくつかの側面において、抗原は、VP1の突出ドメインまたはシェルドメインをターゲティングする。こうした組換えタンパク質は、NoVに対するワクチン候補である。
[0069]特定の実施において、NoVをターゲティングする組換えタンパク質を、ワクチン接種組成物と組み合わせて用いてもよい。実施例および図16~19に示されるように、これらの抗原は、異なる遺伝子群および遺伝子型由来の多様なNoVパネルに広く結合し、これらをブロッキングし、そして中和することが可能な免疫グロブリン変異体の産生に、成功裡に用いられてきている。
[0070]いくつかの側面において、VP1をターゲティングする抗原は、VP1および/またはNS1の長さ5~500残基の部分を含む。いくつかの態様において、抗原のユニットは、配列番号34~72に示される、少なくとも1つの配列、少なくとも3つの配列、少なくとも6つの配列、少なくとも9つの配列、少なくとも12の配列、または少なくとも15の配列を含む。例えば、VP1をターゲティングする組換えタンパク質において、抗原のユニットは、配列番号34~54に示される、少なくとも1つの配列、少なくとも2つの配列、少なくとも3つの配列、少なくとも4つの配列、少なくとも5つの配列、少なくとも6つの配列、少なくとも7つの配列、少なくとも8つの配列、または少なくとも9つの配列を含む。特定の態様において、VP1の突出ドメインをターゲティングする抗原のユニットは、配列番号34~44に示される、少なくとも1つの配列、少なくとも2つの配列、少なくとも3つの配列、少なくとも4つの配列、少なくとも5つの配列、少なくとも6つの配列、少なくとも7つの配列、少なくとも8つの配列、または少なくとも9つの配列を含む。特定の態様において、ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号34~42に示される配列を含む。別の特定の態様において、VP1のシェルドメインをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号45~54より選択される、少なくとも1つの配列、少なくとも2つの配列、少なくとも3つの配列、少なくとも4つの配列、少なくとも5つの配列、少なくとも6つの配列、少なくとも7つの配列、少なくとも8つの配列、または少なくとも9つの配列を含む。いくつかの側面において、ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号45~53に示される配列を含む。さらに別の特定の態様において、NS1をターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号55~57より選択される少なくとも1つの配列または少なくとも2つの配列を含む。いくつかの側面において、ノロウイルスをターゲティングする組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号55~57に示される配列を含む。さらに別の特定の態様において、T細胞仲介性免疫反応を生成するために設計される組換えタンパク質の抗原のユニットは、配列番号58~72より選択される、少なくとも1つの配列、少なくとも2つの配列、少なくとも3つの配列、少なくとも4つの配列、少なくとも5つの配列、少なくとも6つの配列、少なくとも7つの配列、少なくとも8つの配列、または少なくとも9つの配列を含み、例えば、抗原のユニットのペプチド配列は、配列番号58~72の配列を含む。
産生法
[0071]植物組換え発現系は、哺乳動物細胞系に比較して、本質的な安全性、高い拡張可能性、および低い産生コストを有し、このため、これらはIgG融合ワクチンを作製するために特によく適している。以前の研究によって、いくつかのIgG融合ワクチンは抗原免疫原性を増進させうることが示されてきているが、開発されている多くの融合戦略は、直接比較することが出来ず、最適なワクチン候補を生成する際に関与する重要な特性を決定することが困難になっている。
[0071]植物組換え発現系は、哺乳動物細胞系に比較して、本質的な安全性、高い拡張可能性、および低い産生コストを有し、このため、これらはIgG融合ワクチンを作製するために特によく適している。以前の研究によって、いくつかのIgG融合ワクチンは抗原免疫原性を増進させうることが示されてきているが、開発されている多くの融合戦略は、直接比較することが出来ず、最適なワクチン候補を生成する際に関与する重要な特性を決定することが困難になっている。
[0072]本明細書記載の産生法は、トランスジェニック植物において、組換えタンパク質を発現させる工程を含む。特定の実施において、組換えタンパク質は、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされたトランスジェニック植物において発現される。いくつかの側面において、例えば組換えタンパク質がRICである場合、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼがサイレンシングされた植物を用いて、タンパク質を産生することが好ましい。方法は、アグロバクテリウム内に、抗原のユニット、Fc融合体のユニット、IgGのVHドメインのユニット;およびIgGのCH1ドメインのユニットを発現するバイナリーベクターを導入する工程を含む。したがって、このバイナリーベクターは、IgGの重鎖ドメインをコードする。次に、植物部分に、バイナリーベクターを含有するアグロバクテリウムを浸潤させて、形質転換植物部分を産生する。植物部分から未精製タンパク質を抽出し、そして次いで、組換えタンパク質に関して精製する。いくつかの側面において、当該技術分野でよく確立された方法、例えば、プロテインGアフィニティクロマトグラフィまたは金属アフィニティクロマトグラフィを用いて、組換えタンパク質を精製する。
[0073]組換えタンパク質がIgGのVLドメインのユニットおよびIgGのCLドメインのユニットを含む場合、方法は、アグロバクテリウム内に、IgGの軽鎖ドメイン、すなわちIgGのVLドメインのユニットおよびIgGのCLドメインのユニットをコードする、異なるバイナリーベクターを導入する工程をさらに含む。植物部分の形質転換は、植物部分に、IgGの重鎖ドメインをコードするバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム、およびIgGの軽鎖ドメインをコードするバイナリーベクターを含有するアグロバクテリウムを共浸潤させる工程を含む。
[0074]特定の実施において、本明細書記載の組換えタンパク質を産生する方法は、アグロバクテリウム内に:pBYR11eM-h6D8ZE3、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371、pBYR11eMa-BAZE3-H、pBYKEMd-HZE3、pBYKEMd-ZE3H、pBYKEMd-ZE3Hx、pBYKEMd-HVLZe、pBYKEMd2-HVL-Hx、pBYKEMd2-HVLZnt、pBYKEMd2-ZHVLnt、pBYKEMd2-ZHVLe、pBYKEMd2-ZHVLhx、pBYKEAM-N12MHd、pBYKEAM-NPHd、pBYKEAM-NSHd、pBYKEAM-NTHd、pBYKEHM-CPHd、pBYKEHM-CSHd、およびpBYKEHM-CTHdからなる群より選択されるベクターを導入し、そして植物部分に、ベクターを含有するアグロバクテリウムを浸潤させて、形質転換植物部分を産生する工程を含む。次いで、未精製タンパク質を形質転換植物から抽出した後、組換えタンパク質に関して精製する。アグロバクテリウム内に導入されるベクターが:pBYR11eM-h6D8ZE3、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371、pBYR11eMa-BAZE3-H、およびpBYKEMd-HZE3からなる群より選択される産生法に関しては、方法は、pBYKEMd-6D8Kを含有するアグロバクテリウムおよび該ベクターを含有するアグロバクテリウムを共浸潤させる工程をさらに含む。
特定の態様にしたがった、例示的な限定されない実施例
[0075]本開示は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは限定と見なされてはならない。本出願全体で引用されるすべての参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに図の内容は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
[0075]本開示は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは限定と見なされてはならない。本出願全体で引用されるすべての参考文献、特許、および公開特許出願、ならびに図の内容は、すべての目的のため、その全体が本明細書に援用される。
A. ZIKVエンベロープドメインIIIを含むIgG-融合体の設計およびC1q結合
[0076]ZE3は、有望なサブユニットワクチン候補であるが、それ自体、強く免疫原性ではなく、アジュバントを伴う高い抗原用量および反復免疫を必要とする。ZE3に融合されたヒト化エボラモノクローナル抗体6D8に基づいて、ヒトIgG1変異体パネルを設計した(図1A)。柔軟なリンカーを通じて、ZE3を、6D8重鎖のC末端に融合させることによって、RIC構築物を生成した。ZE3に6D8エピトープ結合部位をタグ付けして、免疫複合体形成を可能にした。この構築物は、重鎖、軽鎖、C末端ZE3融合体、およびエピトープタグを含有するため、「HLZe」と称される。免疫複合体形成に関する対照として、エピトープタグを含まず(構築物「HLZ」)、そしてしたがって免疫複合体を形成しないと予期される以外は同一の構築物を生成した。最初に、IgG変異体によるC1q結合を研究した。免疫受容体結合を改善するため、すべての構築物を糖操作ベンサミアナタバコにおいて発現させた。糖操作植物において作製された6D8抗体またはRICは、野生型植物において発現された構築物に比較して、非常に改善されたC1q結合を示した(図9)。RICは、高密度クラスター化抗原-抗体複合体であるため、高アビディティでC1qと会合すると考えられ、そして予期されるように、HLZeは、HLZに比較して、非常に改善されたC1q結合を示した(p<0.001)(図1B)。HLに比較して、HLZでC1q結合のわずかな増加もまた見られたが、これはおそらく、構築物の低レベルの凝集を示唆する(p<0.05)(図1B)。
[0076]ZE3は、有望なサブユニットワクチン候補であるが、それ自体、強く免疫原性ではなく、アジュバントを伴う高い抗原用量および反復免疫を必要とする。ZE3に融合されたヒト化エボラモノクローナル抗体6D8に基づいて、ヒトIgG1変異体パネルを設計した(図1A)。柔軟なリンカーを通じて、ZE3を、6D8重鎖のC末端に融合させることによって、RIC構築物を生成した。ZE3に6D8エピトープ結合部位をタグ付けして、免疫複合体形成を可能にした。この構築物は、重鎖、軽鎖、C末端ZE3融合体、およびエピトープタグを含有するため、「HLZe」と称される。免疫複合体形成に関する対照として、エピトープタグを含まず(構築物「HLZ」)、そしてしたがって免疫複合体を形成しないと予期される以外は同一の構築物を生成した。最初に、IgG変異体によるC1q結合を研究した。免疫受容体結合を改善するため、すべての構築物を糖操作ベンサミアナタバコにおいて発現させた。糖操作植物において作製された6D8抗体またはRICは、野生型植物において発現された構築物に比較して、非常に改善されたC1q結合を示した(図9)。RICは、高密度クラスター化抗原-抗体複合体であるため、高アビディティでC1qと会合すると考えられ、そして予期されるように、HLZeは、HLZに比較して、非常に改善されたC1q結合を示した(p<0.001)(図1B)。HLに比較して、HLZでC1q結合のわずかな増加もまた見られたが、これはおそらく、構築物の低レベルの凝集を示唆する(p<0.05)(図1B)。
[0077]同族抗原が抗体によって結合されない限り、抗体Fabアームは、C1q結合を阻害することによって、補体活性化において制御性の役割を果たしうることが報告されてきている。これらのデータと一致して、6D8エピトープタグを所持する可溶性抗原の添加は、C1q結合を改善し(図10、HL対HL+Agを比較されたい)、そしてC1q結合は、6D8軽鎖の除去によって、または興味深いことに6D8重鎖N末端への抗原融合によってのいずれかで非常に増進された(図10、HL、H、およびZHLを比較されたい)。したがって、軽鎖の非存在下で6D8のN末端に融合したZE3を含む構築物(構築物「ZH」)を生成し、そしてこれはC1qに効率的に結合することが見出された(図1B)。C1qとの相互作用をさらに改善するため、六量体形成を支持する、E345R、E430G、およびS440Y突然変異が6D8 Fc領域に導入されたことを除いて、ZHに同一である構築物を生成した。この構築物(ZHx)は、ZHに比較して、C1q結合をさらに改善した(p<0.001)(図1B)。興味深いことに、IgG1-Fc融合体は、可変性C1q結合を有することが示されてきているが、6D8 Fcに融合されたZE3(構築物「ZFc」)は、非常に強いC1q結合を示した(図1B)。軽鎖定常領域もまた欠く、単純化RICを構築するため、6D8の可変軽鎖(VL)ドメインが6D8の可変重鎖(VH)およびCH1ドメインの間に挿入されているような第一の構築物を作製し、構築物HVLを得た。この構築物は、非改変6D8に比較して、幾分減少したレベルではあるが、6D8エピトープでタグ付けされた抗原に結合することが見出された(図11)。この配置をHLZe内に挿入して、強力なC1q結合を示す、一本鎖RIC HVLZeを生成した(図1B)。
[0078]理論的に単量体である構築物HLZ(いかなるエピトープタグも含まず、6D8のC末端に融合されたZE3からなる)が、C1q結合において小さいが反復可能な改善を生じたことに注目すると興味深い(図1B)。これは、ZE3融合のため、低レベルのある程度の凝集があることを示唆しうる(図4A、HLおよびHLZを比較されたい)。さらに、IgG Fabアームの欠失が、未知の機構によってオリゴマー形成を誘導し、そしてさらにC1q結合を増進させるため、Fab仲介性事象はC1q結合に影響を及ぼすことが報告されてきている。HLZの発現は、一般的に低く、C末端ZE3融合は、フォールディングに干渉するかまたは別の方式で不安定性を引き起こしうると示唆される(図2A)。多くの分解産物が、精製後のSDS-PAGEによって可視であり(図3)、そして興味深いことに、HLZのC1q結合は、室温で2週間インキュベーションするかまたは反復凍結融解サイクルを行うことによるさらなる分解に際して、増加し続けた(図5B)。これらのデータは、分解産物が、元来の構築物よりもより高い免疫原性を有しうることを示唆し、この知見は、HLZによって産生される比較的高い総IgG力価を説明しうる(図6A)。しかし、HLZ IgG2a力価は、他の構築物に比較して減少した(図6B)。IgG2aは、Th1反応の一般的な指標であるため、HLZはなお、T細胞活性化を導く、損なわれたエフェクター機能、例えば補体活性化の減少を有しうる。特に、すべてのIgG融合体は、非融合ZE3に比較して、IgG2a産生を強く増進した(図6B)。ヒト抗体は、マウス抗体に比較して、マウスFc受容体に類似の結合アフィニティを有することが近年示されてきている一方、ヒトIgG1は、低アフィニティマウスFcγRIII/CD16への結合減少を有した。また、ポリマー性デングIgG融合ワクチンが、同じIgG融合体の単量体型に比較して、ヒト腺扁桃腺(adenotonsillar)組織において、増進された免疫原性を示すが、どちらも、ヒトFcγRI/CD64を発現しているマウスにおいては、同等の免疫原性を示すこともまた示された。したがって、これらの構築物の免疫原性をより完全に評価するには、他の動物モデルにおけるさらなる試験が必要である。
[0079]抗原結合は、IgGにおいてコンホメーション変化を誘導する可能性もあり、これがC1q結合を改善しうる。6D8エピトープを含有する抗原と6D8の混合は、C1q結合のわずかな増加しか生じず(図10)、そしてRIC構築物に比較して劣った免疫原性であることが見出された(データは別の箇所で提示される)。しかし、N末端抗原融合体は、C1q結合に対して、より顕著な影響を有し(図1B)、これはおそらく、抗原結合と類似のコンホメーション変化を強く誘導することによる。一般的に、6D8 N末端への抗原融合は、多様な大きい抗原および小さい抗原に関して、C1q結合を非常に増進させる。さらに、6D8軽鎖の欠失(構築物ZH)もまた、C1q結合を実質的に増進させた(図1B)。これらの知見は、抗体のFab部分がC1q結合において制御性の役割を果たすという仮説と一致する。さらに、軽鎖の除去もまた、グリコシル化に、そしてしたがってC1q結合に影響を及ぼしうる。構築物ZHxは、軽鎖除去および六量体誘導性突然変異を含むN末端ZE3融合の影響を相乗的に組み合わせて、C1q結合のさらにより強力な増進(図1B)、ならびに高い総IgGおよびIgG2a力価を生じた(図6B)。強い免疫原性にもかかわらず、ZHxは、ZHに比較して、減少した収量を有した(図2A)。さらに、ZHxは、構築物ZHには見られない、スクロース勾配の非常に底に近い部分に見られる何らかの非常に大きな物質を有するようであり(図4B)、六量体突然変異が凝集に寄与しうることが示唆された。これらの構築物の可溶性を最適化するために、さらなる研究が必要である。。
[0080]6D8 CH1ドメインへのN末端ZE3融合(構築物ZFc)は、C1q結合を非常に改善し(図1B)、非常に高い抗体力価を誘発した(図6A)。C1q結合を含むFc融合体の多くの特性は、個々の融合パートナーに基づいて非常に多様であるようであり、そしてしたがって、各融合体に関して実験的に決定する必要がある。興味深いことに、いくつかのFc融合構築物は六量体を形成することが示されてきており、これは、ここで観察されるZFcの強い免疫原性を説明する可能性もある。強い免疫原性にもかかわらず、ZFcは、顕著に不安定であった:ZE3の50%が抽出前または抽出中に切断され(図2A、2B)、これは、SDS試料緩衝液中に直接抽出された場合であってもそうであり、そして、反復凍結融解または保存に際して損なわれていない(intact)ままであるのは、完全サイズZFc分子の25%未満であった(図5A)。HLZとは異なり、この分解は、C1q結合の損失と関連し(図5B)、Fc受容体結合ドメインが損なわれていることが示唆された。ZFcは、完全IgGよりも少ないジスルフィド結合を有し、そして一般的に、Fc融合体は、しばしば、不安定性または望ましくない凝集の問題がある。ZFcは高い力価を誘発する一方、8μgのZE3(IgG融合パートナーの重量を引く)を送達するため、免疫に用いられる精製試料の総量は、ZE3融合体の高い分解および生じる損失を考慮して、ほぼ3倍でなければならなかった。非融合Fcならびに他のありうる分解産物のこの増加した送達が、高い免疫原性に寄与しうるかどうかは不明である。対照的に、より大きく、そしてより高次にオリゴマー性である構築物HLZe、HLZd、ZHx、およびHVLZe(図4Aおよび4B)は、抽出前および抽出中の両方で、それとともに保存に際してもより安定であった(図5A)。ELISA中の抗体プローブへのアクセス不能性と一致して(図2A)、これらの構築物の分子内および分子間会合は、タンパク質分解または他の分解性プロセスからこれらを保護しうる。
B. HVL融合構築物の発現および特徴付け
[0081]RICは、免疫原性であることが知られる;が、これらは完全に集合した産物を形成するために、重鎖および軽鎖の共発現を必要とする。このプロセスは、一本鎖抗体融合体を生成することによって、単純化されうる。一本鎖抗体融合体の利点は、完全抗体-抗原融合体が、単一のコード配列で産生可能であり、それによって重鎖および軽鎖の共発現の必要性が排除されることである。さらに、新規構築物は、重鎖および軽鎖両方の可変領域をなお保持するであろう。コア一本鎖抗体は、抗体重鎖に直接融合されている可変軽鎖領域に連結された可変重鎖領域を含有する(図7)。ベンサミアナタバコ植物で発現された類似の構築物が、以前特徴づけられそして公表されているが、コア一本鎖抗体が関心対象の抗原に融合された、一本鎖抗体融合体の潜在能力を調査する研究はほとんどない。いくつかの一本鎖抗体融合体を生成し、そして試験した(図7)。精製構築物からの結果を、植物中で発現させてもよく、そしてこれは、SDS-PAGEゲル上で、非還元条件下で泳動した際、正しいサイズに現れる。
[0081]RICは、免疫原性であることが知られる;が、これらは完全に集合した産物を形成するために、重鎖および軽鎖の共発現を必要とする。このプロセスは、一本鎖抗体融合体を生成することによって、単純化されうる。一本鎖抗体融合体の利点は、完全抗体-抗原融合体が、単一のコード配列で産生可能であり、それによって重鎖および軽鎖の共発現の必要性が排除されることである。さらに、新規構築物は、重鎖および軽鎖両方の可変領域をなお保持するであろう。コア一本鎖抗体は、抗体重鎖に直接融合されている可変軽鎖領域に連結された可変重鎖領域を含有する(図7)。ベンサミアナタバコ植物で発現された類似の構築物が、以前特徴づけられそして公表されているが、コア一本鎖抗体が関心対象の抗原に融合された、一本鎖抗体融合体の潜在能力を調査する研究はほとんどない。いくつかの一本鎖抗体融合体を生成し、そして試験した(図7)。精製構築物からの結果を、植物中で発現させてもよく、そしてこれは、SDS-PAGEゲル上で、非還元条件下で泳動した際、正しいサイズに現れる。
C. IgG融合構築物の発現
[0082]RICには、可溶性産物が低収量である問題がある。6D8エピトープタグを6D8のC末端に付加すると、抗体が大部分不溶性になるが、これは、軽鎖を除去することによって防止され、不溶性は、エピトープタグに結合した抗体の大きな複合体から生じることが示唆される(図12)。RIC可溶性を改善するため、6D8エピトープタグを突然変異させて、抗体結合を減少させた。HLZe上のエピトープタグを、6D8に関する最少の報告される結合領域(Wilsonら、2000)(構築物「HLa」、エピトープ配列VYKLDISEA、配列番号2)に減らしたが、可溶性の改善は示されず、また3’端からの単一アミノ酸の除去(構築物「HLb」、VYKLDISE、配列番号3)も改善を示さなかった(図13A)。しかし、5’端からの単一アミノ酸のさらなる除去(構築物「HLc」、YKLDISE、配列番号4)および構築物「HLd」中のさらなる一部切除(truncation)(YKLDIS、配列番号1)は、非常に改善された可溶性を生じた(図13B)。この突然変異をHLZeに導入し(構築物HLZd)、そして特徴づけた。ELISAによると、およそ25倍エピトープ結合が減少するにもかかわらず(図13C)、HLZdは、なお非常に強いC1q結合を維持し(図1B)、効率的な複合体形成活性が残っていることが示唆された。
[0082]RICには、可溶性産物が低収量である問題がある。6D8エピトープタグを6D8のC末端に付加すると、抗体が大部分不溶性になるが、これは、軽鎖を除去することによって防止され、不溶性は、エピトープタグに結合した抗体の大きな複合体から生じることが示唆される(図12)。RIC可溶性を改善するため、6D8エピトープタグを突然変異させて、抗体結合を減少させた。HLZe上のエピトープタグを、6D8に関する最少の報告される結合領域(Wilsonら、2000)(構築物「HLa」、エピトープ配列VYKLDISEA、配列番号2)に減らしたが、可溶性の改善は示されず、また3’端からの単一アミノ酸の除去(構築物「HLb」、VYKLDISE、配列番号3)も改善を示さなかった(図13A)。しかし、5’端からの単一アミノ酸のさらなる除去(構築物「HLc」、YKLDISE、配列番号4)および構築物「HLd」中のさらなる一部切除(truncation)(YKLDIS、配列番号1)は、非常に改善された可溶性を生じた(図13B)。この突然変異をHLZeに導入し(構築物HLZd)、そして特徴づけた。ELISAによると、およそ25倍エピトープ結合が減少するにもかかわらず(図13C)、HLZdは、なお非常に強いC1q結合を維持し(図1B)、効率的な複合体形成活性が残っていることが示唆された。
[0083]完全に集合したIgG融合体の収量を測定するため、まずZE3を捕捉し、そして次いでヒトIgGを検出するELISAアッセイを使用した。ZE3の切断を検出するため、総IgGのみを測定するELISAもまた、比較として用いた。ZE3およびIgGの両方に関して探査した際、非常に可溶性の単量体構築物ZHは、新鮮葉重量1グラム当たり0.83mgの完全形成産物を生じ(mg/g LFW)、そして類似のZFcは、0.58mg/g LFWを生じた(図2A)。しかし、総IgG含量を測定した際、ZHの収量はおよそ20%より高く、そしてZFcに関しては、2.5倍より高く、ZHおよび特にZFcは、おそらくZE3リンカーのタンパク質分解的切断に感受性であることが示唆される(図2A)。この知見は、SDS-PAGE上のZFc切断産物の視覚化によって確認された(図2B)。HLZは、0.17mg/g LFWの完全集合産物のみを集積させ、およそ40%のZE3が切断で失われ、構築物の一般的な不安定性が示唆された(図2A、2B)。ELISAによって、RIC構築物は、単量体構築物よりも性能が劣っているようであり;HLZeおよびHLZdは、それぞれ、わずかに0.04mg/g LFWおよび0.30mg/g LFWのみを集積させ、そして六量体ZHxは、0.08mg/g LFWのみを集積した(図2A)。しかし、還元SDS-PAGE条件下で視覚化した際、HLZdは、最高の発現構築物であり、概算1.5mg/g LFWが集積した(図2A、2B)。この矛盾は、複合体化したHLZdが、ELISAによる抗体プローブに対してアクセス不能になるため、生じる可能性がある。同様に、HLZeおよびZHxの総収量もまた、ゲル定量化によって測定された際、より高かった(図2A、2B)。低い可溶性にもかかわらず、HLZeは、HLZと類似の収量を有し、そしてHLZdは、HLZの収量を大きく超えた。この知見は、細胞内部または抽出中のいずれかで、複合体形成がHLZeおよびHLZdを保護しうることを示唆するが、短いエピトープタグがHLZeおよびHLZdの安定性増進において何らかの他の役割を果たす可能性は排除できない。HVLZeは、ELISAによると、わずか0.02mg/g LFW可溶性産物のみを生じ、そしてSDS-PAGEによっては検出不能であった(図2A);が、7.5M尿素で抽出した際、非常に高レベルで集積し、これは、不溶性であることが低収量を生じたことを示唆する。
D. IgG融合体の精製、凝集、および安定性
[0084]プロテインGアフィニティクロマトグラフィを通じた単純な一工程精製を用いて、IgG融合体を>95%均一性まで精製した。発現データと一致して、より高次のオリゴマー構築物は、他の構築物よりも少ない分解を示し、そしてZFc融合体は、特に高レベルの分解を有した(図3)。各構築物の凝集特性を調べるため、スクロース勾配遠心分離によって、精製IgG融合体を分析した。巨大免疫複合体の形成と一致して、HLZeおよびHVLZeは、勾配の最も底部で見られる一方、HLZ、ZH、およびZFcは、大部分、勾配の最上部で見られた(図4Aおよび4B)。ZHxの溶液は、低密度物質ならびにある程度の非常に高密度の物質の両方を含有した(図4B)。HLZdの溶液は、HLZおよびHLZeに比較して中程度の密度を示し(図4A)、これは、発現データおよびC1q結合とともに解釈すると、HLZdが、HLZeに比較して、より小さい、より可溶性の免疫複合体を形成することと一致する。
[0084]プロテインGアフィニティクロマトグラフィを通じた単純な一工程精製を用いて、IgG融合体を>95%均一性まで精製した。発現データと一致して、より高次のオリゴマー構築物は、他の構築物よりも少ない分解を示し、そしてZFc融合体は、特に高レベルの分解を有した(図3)。各構築物の凝集特性を調べるため、スクロース勾配遠心分離によって、精製IgG融合体を分析した。巨大免疫複合体の形成と一致して、HLZeおよびHVLZeは、勾配の最も底部で見られる一方、HLZ、ZH、およびZFcは、大部分、勾配の最上部で見られた(図4Aおよび4B)。ZHxの溶液は、低密度物質ならびにある程度の非常に高密度の物質の両方を含有した(図4B)。HLZdの溶液は、HLZおよびHLZeに比較して中程度の密度を示し(図4A)、これは、発現データおよびC1q結合とともに解釈すると、HLZdが、HLZeに比較して、より小さい、より可溶性の免疫複合体を形成することと一致する。
[0085]多様な温度条件で処理した後、SDS-PAGE上で完全に形成された産物および分解産物を比較することによって、各構築物の安定性を分析した。5回の凍結融解サイクル後または4℃で2週間置いた後、すべての構築物で、少量の分解が観察された(図5A)。高濃度(>1mg/ml)のHLZeおよびHVLZeは、4℃で数日置いた後、沈殿することが見出された。室温では、大部分の構築物は、2週間後、10~15%の分解を有した(図5A)。総合すると、オリゴマー化構築物は、最高の安定性を保持する一方、単量体構築物、および特にFc融合体は、より迅速に分解した(図5A)。大部分の構築物は、保存後、強いC1q結合を保持したが、構築物HLZは、4℃の保存ではなく、室温保存または反復凍結融解後、増加したC1q結合を示した(図5B)。これは、SDS-PAGE上で分解産物が可視である(図3)ため、Fab領域の分解または軽鎖の損失、あるいは凝集による可能性がある。逆に、構築物ZFcは、より分解されると、C1q結合能を失い、これはおそらく、C1q結合領域の分解によるものである(図5B)。
E. マウス免疫、力価、IgG2a、サイトカイン
[0086]IgG融合体の免疫原性を調べるため、BALB/cマウス(n=6)を、アジュバントを伴わず、各IgG変異体の2回の用量で皮下免疫し、送達されるZE3の総用量が8μgであるようにした。対照として、マウスをまた、8μgの非融合植物発現ZE3でも免疫した。すべてのIgG融合体は、ZE3特異的抗体の産生を非常に強く増進し、ZE3単独よりも20倍~150倍より高い総IgG力価を生じた(図6A、ZE3に比較してp<0.01)。すべてのIgG融合体は、ZE3単独に比較して、IgG2aの産生を有意に増進した(図6B、ZE3に比較してp<0.01)。IgG融合体間で、総力価産生の有意な相違は観察されなかったが、構築物HLZは、HLZeを除くすべての他の融合体に比較して、IgG2aの有意に減少した産生を有した(図6B、HLZに比較してp<0.05)。構築物ZHxおよびZFcは、最高レベルの総IgGおよびIgG2aを生じた(図6A、図6B)。
[0086]IgG融合体の免疫原性を調べるため、BALB/cマウス(n=6)を、アジュバントを伴わず、各IgG変異体の2回の用量で皮下免疫し、送達されるZE3の総用量が8μgであるようにした。対照として、マウスをまた、8μgの非融合植物発現ZE3でも免疫した。すべてのIgG融合体は、ZE3特異的抗体の産生を非常に強く増進し、ZE3単独よりも20倍~150倍より高い総IgG力価を生じた(図6A、ZE3に比較してp<0.01)。すべてのIgG融合体は、ZE3単独に比較して、IgG2aの産生を有意に増進した(図6B、ZE3に比較してp<0.01)。IgG融合体間で、総力価産生の有意な相違は観察されなかったが、構築物HLZは、HLZeを除くすべての他の融合体に比較して、IgG2aの有意に減少した産生を有した(図6B、HLZに比較してp<0.05)。構築物ZHxおよびZFcは、最高レベルの総IgGおよびIgG2aを生じた(図6A、図6B)。
F. ノロウイルスエピトープを含むIgG融合体の設計、発現、および精製
[0087]ノロウイルス(NoV)カプシドタンパク質VP1は、ウイルスゲノムを取り巻くコアを形成する内部シェルドメイン(S)、ならびにさらにP1およびP2サブドメインに分けられる突出ドメイン(P)からなる。伝統的なヒトノロウイルス(HNoV)ワクチンアプローチ、ならびに自然感染は、ほとんど保存されていないウイルスカプシド上の免疫優性エピトープを主にターゲティングする免疫反応を誘発し、新規株に対して、そして異なる遺伝子型由来の関連ウイルスに対して、限定された保護しか生じない。ほぼすべてのHNoVワクチン候補は、VP1カプシドタンパク質から作製されたウイルス様粒子(VLP)に重点を置いてきている。主要カプシドタンパク質VP1の配列多様性に基づいて、40を超えるNoVの遺伝子型を含有する10の遺伝子群(GI~GX)が同定されてきている。これらの10の遺伝子群のうち、GIおよびGIIが大部分のヒト疾患を引き起こす。しかし、保存されたVLPを生成する最適な試みでさえも、ヒト臨床試験において、疾患重症度の中程度の減少しか生じず、そして一般的に、広く保護性の免疫を誘導するために苦心している。
[0087]ノロウイルス(NoV)カプシドタンパク質VP1は、ウイルスゲノムを取り巻くコアを形成する内部シェルドメイン(S)、ならびにさらにP1およびP2サブドメインに分けられる突出ドメイン(P)からなる。伝統的なヒトノロウイルス(HNoV)ワクチンアプローチ、ならびに自然感染は、ほとんど保存されていないウイルスカプシド上の免疫優性エピトープを主にターゲティングする免疫反応を誘発し、新規株に対して、そして異なる遺伝子型由来の関連ウイルスに対して、限定された保護しか生じない。ほぼすべてのHNoVワクチン候補は、VP1カプシドタンパク質から作製されたウイルス様粒子(VLP)に重点を置いてきている。主要カプシドタンパク質VP1の配列多様性に基づいて、40を超えるNoVの遺伝子型を含有する10の遺伝子群(GI~GX)が同定されてきている。これらの10の遺伝子群のうち、GIおよびGIIが大部分のヒト疾患を引き起こす。しかし、保存されたVLPを生成する最適な試みでさえも、ヒト臨床試験において、疾患重症度の中程度の減少しか生じず、そして一般的に、広く保護性の免疫を誘導するために苦心している。
[0088]1つの広く反応性である抗体は、P1の基部の非常に保存されたエピトープ:LPQEWVQYFYQEAAPA(配列番号34)にマッピングされる。非常に重要なことに、この抗体は、P1の直鎖エピトープに結合し、そしてしたがって、天然VP1コンホメーションは、機能抗体を誘発する必要がない。このエピトープをターゲティングする抗体は、8つのGI、13のGII、および1つのGIV遺伝子型由来のVLPに高アフィニティで結合する。第二の広く反応性である直鎖エピトープ(ALLRFVNPDTGRVLFE、配列番号37)に対して向けられる抗体は、少なくとも3つのGIおよび7つのGII遺伝子群由来のVLPに結合する。P1ドメインの基部で広く保存される第三の直鎖エピトープは、DSWVNQFYTLAP(配列番号41)である。Sドメインは、VP1の最も保存される領域である。強く保存された直鎖エピトープQNVIDPWIRNNF(配列番号45)、QAPGGEFTVSPRNAPGE(配列番号46)、およびKVIFAAVPP(配列番号47)をターゲティングする抗体は、NoV遺伝子群に広い交差反応性があることが同定されてきている。保存されたHNoV T細胞エピトープが、ヒト13、すなわちVP1 Sドメイン中のエピトープTMFPHIIVDV(配列番号54)で同定され、GIおよびGII HNoVの両方に対する広いT細胞活性化を誘発した。さらに、HNoVを含むすべてのNoV遺伝子群間で非常に保存されている、P1 C末端ドメイン中の優性T細胞エピトープ(SWVSRFYQL、配列番号64)は、NoV感染マウスにおけるウイルスクリアランスに決定的であった。この領域は、カプシド集合において、必須の役割を果たし、そしてしたがって、構造制約は、突然変異回避の潜在能力を限定する。NS1-2からタンパク質分解的に切断される非構造タンパク質NS1は、ネズミNoVに感染した細胞(GV)またはHuNoV NS1-2でトランスフェクションされた細胞から分泌される。分泌されたNS1は、マウスの腸管において、IFN-λ産生を抑制する。重要なことに、NS1単独でのワクチン接種は、Pドメインでのワクチン接種よりもより優れてマウスを保護し、ワクチンターゲットとしてのNS1を強調する。NS1-2でのワクチン接種は、NS1に対して向けられる抗体を生じた。
[0089]ノロウイルスをターゲティングする免疫グロブリン変異体を作製するための抗原を開発するため、ヒトノロウイルスGI.3、ヒトノロウイルスGII.4、およびネズミノロウイルス(MNV)のVP1の突出ドメイン由来のエピトープが同定されてきている(配列番号34~44)。GI.3、GII.4、およびMNVのシェルドメイン由来のエピトープもまた同定されてきている(配列番号45~54)。MNVのNS1エピトープを配列番号55に示す。GI.3のNS1エピトープを配列番号56に示す。GII.4のNS1エピトープを配列番号57に示す。T細胞反応エピトープを配列番号58~72に示す。
[0090]したがって、NoV突出ドメイン(P-RIC)、シェルドメイン(S-RIC)、T細胞エピトープ(T-RIC)、またはネズミノロウイルス由来のタンデム連結非構造タンパク質1(NS1)を含有するもの(N-RIC)の保存エピトープをターゲティングするRIC構築物を設計し、そして産生した。P-RICに関する抗原のユニットは、GI.3、GII.4、およびMNVのVP1の突出ドメイン由来の9つのタンデム連結エピトープから形成される。P-RICに関する抗原のユニットは、GI.3、GII.4、およびMNV由来のVP1の突出ドメイン由来の9つのタンデム連結エピトープから形成される。S-RICに関する抗原のユニットは、GI.3、GII.4、およびMNVのVP1のシェルドメイン由来の9つのタンデム連結エピトープから形成される。T-RICに関する抗原のユニットは、GI.3、GII.4、およびMNVに対するT細胞仲介性免疫反応を引き起こすことが見出されてきている、15のタンデム連結エピトープから形成される。N-RICに関する抗原のユニットは、GI.3、GII.4、およびMNVのNS1由来のタンデム連結エピトープから形成される。これらのRIC構築物を産生するための植物発現ベクターは、pBYKEAM-N12MHd、pBYKEAM-NPHd、pBYKEAM-NSHd、pBYKEAM-NTHd、pBYKEHM-CPHd、pBYKEHM-CSHd、およびpBYKEHM-CTHdである。
[0091]各エピトープに関して、エピトープがN末端またはC末端に連結されているRIC構築物は、植物において成功裡に発現可能であった(図14A)。これらのRIC構築物はすべて精製可能であった(図14Bおよび図15)。これらのRIC構築物で免疫されたマウス由来の血清は、マウスノロウイルス(図16)、ならびにGI.3およびGII.2ノロウイルスをモデリングするVLP(図17および18)に結合可能であった。RICで免疫されたマウスの脾臓によって産生されたIFN-γ産生の増加(図19)は、RICが成功裡にノロウイルスに対する免疫を誘導したことを示唆する。
G. 方法
1. ベクター構築
[0092]ZE3のためのBeYDV植物発現ベクター、ならびに本明細書において構築物「HLZe」と称される、6D8 C末端へのその融合体(pBYR11eM-h6D8ZE3)、あるいはエピトープタグを含む(pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371)またはエピトープタグを含まない(pBYR11eMa-BAZE3-H)N末端への融合体の構築が、Diamosら、2019に記載された。ZE3融合体を含まずに全長6D8 mAbを発現するベクターpBYKEMd2-6D8(構築物「HL」)もまた、Diamosら、2019に記載された。6D8の軽鎖のみを発現するベクターを生成するため、pBYKEMd2-6D8をXhoIで消化し、そしてベクターを自己連結して、pBYKEMd-6D8Kを得た。pBYKEMd2-6D8をSacIで消化し、そしてベクターを自己連結して、pBYKEMd-6D8Hを生じることによって、6D8の重鎖のみを発現するベクター(構築物「H」)を生成した。pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371をBsaI-SacIで消化し、そしてタグ含有断片を、BsaI-SacIで消化したpBYKEMd-6D8H内に挿入して、pBYKEMd-6D8Hgp371を生じることによって、6D8エピトープ結合タグをpBYKEMd-6D8Hに付加した(軽鎖と共発現された際には、構築物「HLe」)。HLZeからエピトープタグを除去するため、pBYR11eM-h6D8ZE3をBamHI-SacIで消化し、そしてプライマーZE3-Bam-F(5’-gcgggatccaagggcgtgtcatactcc、配列番号8)およびZE3-Sac-R(5’-acagagctcttaagtgctaccactcctgtg、配列番号9)での増幅およびそれに続くBamHI-SacIでの消化を通じて得られた、ZE3を含有する断片と連結した。生じたベクター、pBYKEMd-HZE3を、pBYKEMd-6D8Kと共浸潤させて、構築物「HLZ」を産生した。軽鎖を含まず、6D8 N末端に融合されたZE3を産生するため、pBYR11eMa-BAZE3-HをSacIで消化し、そしてベクターを自己連結し、pBYKEMd-ZE3H(構築物「ZH」)を得た。六量体突然変異を導入するため、E345R、E430G、およびS440Y突然変異を含有する6D8重鎖定常領域の領域を合成し(Integrated DNA Technologies、米国アイオワ州)、次いでBsaI-SacIで消化し、そしてpBYKEMd-ZE3H中の6D8のBsaI-SacI領域を置換するために用いて、pBYKEMd-ZE3Hx(構築物「ZHx」)を得た。オリゴ6D89-F(5’-ctagtgtttacaagctggacatatctgaggcataagagct、配列番号10)および6D89-R(5’-cttatgcctcagatatgtccagcttgtaaaca、配列番号11)をアニーリングさせて、そしてSpeI-SacIで消化されたpBYR11eM-h6D8ZE3内にこれらを連結することによって、RICエピトープタグ突然変異体「a」を生成し;まず突然変異体「a」を、プライマーgpDISE-Sac-R:(5’-tttgagctcttactcagatatgtccagcttgtaaac、配列番号12)および35S-F(5’aatcccactatccttcgc、配列番号13)で増幅し、次いでその産物をSpeI-SacIで消化し、そしてこれをSpeI-SacIで消化されたpBYR11eM-h6D8ZE3内に連結することによって、突然変異体「b」を生成した。「c」に関しては重複オリゴ6D87-F(5’-ctagttacaagctggacatatctgagtaagagct、配列番号14)および6D87-R(5’-cttactcagatatgtccagcttgtaa、配列番号15)を、そして6D86-F(5’-ctagttacaagctggacatatcttaagagct、配列番号16)および6D86-R(5’-cttaagatatgtccagcttgtaa、配列番号17)を用いて、突然変異体「a」と同様に、突然変異体「c」および「d」を生成した。
1. ベクター構築
[0092]ZE3のためのBeYDV植物発現ベクター、ならびに本明細書において構築物「HLZe」と称される、6D8 C末端へのその融合体(pBYR11eM-h6D8ZE3)、あるいはエピトープタグを含む(pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371)またはエピトープタグを含まない(pBYR11eMa-BAZE3-H)N末端への融合体の構築が、Diamosら、2019に記載された。ZE3融合体を含まずに全長6D8 mAbを発現するベクターpBYKEMd2-6D8(構築物「HL」)もまた、Diamosら、2019に記載された。6D8の軽鎖のみを発現するベクターを生成するため、pBYKEMd2-6D8をXhoIで消化し、そしてベクターを自己連結して、pBYKEMd-6D8Kを得た。pBYKEMd2-6D8をSacIで消化し、そしてベクターを自己連結して、pBYKEMd-6D8Hを生じることによって、6D8の重鎖のみを発現するベクター(構築物「H」)を生成した。pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371をBsaI-SacIで消化し、そしてタグ含有断片を、BsaI-SacIで消化したpBYKEMd-6D8H内に挿入して、pBYKEMd-6D8Hgp371を生じることによって、6D8エピトープ結合タグをpBYKEMd-6D8Hに付加した(軽鎖と共発現された際には、構築物「HLe」)。HLZeからエピトープタグを除去するため、pBYR11eM-h6D8ZE3をBamHI-SacIで消化し、そしてプライマーZE3-Bam-F(5’-gcgggatccaagggcgtgtcatactcc、配列番号8)およびZE3-Sac-R(5’-acagagctcttaagtgctaccactcctgtg、配列番号9)での増幅およびそれに続くBamHI-SacIでの消化を通じて得られた、ZE3を含有する断片と連結した。生じたベクター、pBYKEMd-HZE3を、pBYKEMd-6D8Kと共浸潤させて、構築物「HLZ」を産生した。軽鎖を含まず、6D8 N末端に融合されたZE3を産生するため、pBYR11eMa-BAZE3-HをSacIで消化し、そしてベクターを自己連結し、pBYKEMd-ZE3H(構築物「ZH」)を得た。六量体突然変異を導入するため、E345R、E430G、およびS440Y突然変異を含有する6D8重鎖定常領域の領域を合成し(Integrated DNA Technologies、米国アイオワ州)、次いでBsaI-SacIで消化し、そしてpBYKEMd-ZE3H中の6D8のBsaI-SacI領域を置換するために用いて、pBYKEMd-ZE3Hx(構築物「ZHx」)を得た。オリゴ6D89-F(5’-ctagtgtttacaagctggacatatctgaggcataagagct、配列番号10)および6D89-R(5’-cttatgcctcagatatgtccagcttgtaaaca、配列番号11)をアニーリングさせて、そしてSpeI-SacIで消化されたpBYR11eM-h6D8ZE3内にこれらを連結することによって、RICエピトープタグ突然変異体「a」を生成し;まず突然変異体「a」を、プライマーgpDISE-Sac-R:(5’-tttgagctcttactcagatatgtccagcttgtaaac、配列番号12)および35S-F(5’aatcccactatccttcgc、配列番号13)で増幅し、次いでその産物をSpeI-SacIで消化し、そしてこれをSpeI-SacIで消化されたpBYR11eM-h6D8ZE3内に連結することによって、突然変異体「b」を生成した。「c」に関しては重複オリゴ6D87-F(5’-ctagttacaagctggacatatctgagtaagagct、配列番号14)および6D87-R(5’-cttactcagatatgtccagcttgtaa、配列番号15)を、そして6D86-F(5’-ctagttacaagctggacatatcttaagagct、配列番号16)および6D86-R(5’-cttaagatatgtccagcttgtaa、配列番号17)を用いて、突然変異体「a」と同様に、突然変異体「c」および「d」を生成した。
[0093]可変重鎖(VH)ドメインが可変軽鎖(VL)ドメインに連結され、次いで、6D8抗体の定常領域に直接融合されている構築物を作製するため、pBYR11eM-h6D8ZEからPCR増幅およびセグメントの末端仕立て(tailoring)を通じて、まず可変領域を得た。VHドメインに関しては、プライマーLIR-H3A(5’-aagcttgttgttgtgactccgag、配列番号18)および6D8VH-Spe-R(5’-cggactagtagctgaagacactgtgac、配列番号19)を用いた。プライマー35S-F(5’-aatcccactatccttcgc、配列番号13)および6D8VK-Nhe-R(5’-cgtgctagccttgatctccactttggtc、配列番号20)でpBYR11eM-h6D8ZE3をPCR増幅することによって、VL領域を得た。ヒトIgG抗体の定常領域にVL領域を融合させるため、PCR断片をXhoI-NheIで消化し、そして6D8重鎖を含有するベクター、pKS-HH-gp371内に挿入することによって、サブクローンを生成した。このサブクローンをpKS-VLと名付けた。次に、pBYKEM-6D8KをSbfI-SacIで消化し、可変重鎖断片を増幅したPCR産物を、SbfI-SpeIで消化し、そして可変軽鎖サブクローンをSpeI-SacIで消化した。これらの断片を集合させて、pBYKEMd2-VHLVK(HVL)を生成した。最後に、この構築物を用いて、2断片連結によりpBYKEMd2-HVLZeを生成した。pBYKEMd2-VHLVK構築物をBsaIおよびSacIで消化して、重鎖および軽鎖の可変領域とともにベクター断片を得た。ZE3抗原セグメントおよびエピトープタグを得るため、pBYR11eM-h6D8ZE3もまたBsaI-SacIで消化した。HVLZeを産生するために用いられる生じた構築物をpBYKEMd-HVLZeと名付けた。
[0094]構築物のHVLパネルを以下のように生成した。一本鎖六量体の形成を容易にするため、Fc領域中に3つの点突然変異を含む一本鎖抗体を含有する構築物HVL-Hxを、2断片連結によって生成した。主鎖は、pBYKEMd2-VHLVKのBsaI-SacI消化によって得られ、そして六量体形成のための突然変異を含有する挿入物は、pBYKEMd-ZE3HxのBsaI-SacI消化から得られた。最終構築物は、pBYKEMd2-HVL-Hxと称された。
[0095]pBYKEMd2-VHLVK由来のBsaI-SacI消化主鎖を、pBYKEMd-HZE3由来の挿入物に連結することによって、C末端にZE3抗原を含むがエピトープタグを含まない一本鎖融合体、HVLZntが生成された。この構築物は、pBYKEMd2-HVLZntと称された。
[0096]抗体N末端に連結され、そしてエピトープタグを含まない、ZE3抗原を含む一本鎖RIC、ZHVLntを以下の連結によって生成した。ZE3抗原およびVHセグメントを含有する挿入断片を、35S-FおよびVH-BsaS-Rプライマーを用いて、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371から増幅した。VH-BsaS-Rプライマーは、5’端の末端を仕立てて、BsaIでの消化に際してSpeIオーバーハングを生じるであろうBsaI部位を含めた。このPCR断片をXhoI-BsaIで消化し、そしてpBYKEMd2-VHLVKから得られる主鎖XhoI-SpeI断片と連結された。最終構築物は、pBYKEMd2-ZHVLntと称される。
[0097]N末端融合ZE3抗原およびエピトープタグを含む一本鎖抗体RIC、ZHVLeを、2断片連結によって生成した。pBYKEMd2-ZHVLntをBsaI-SacIで消化して、N末端ZE3抗原およびHVL構築物を含有するベクターセグメントを産生した。6D8エピトープタグを含有する挿入物は、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371のBsaI-SacI消化由来であった。最終構築物は、pBYKEMd2-ZHVLeと称された。
[0098]N末端融合ZE3抗原および六量体形成を促進する点突然変異を含む一本鎖抗体、ZHVLhxは、2断片消化によって得られた。該ベクター断片は、pBYKEMd2-ZHVLntのBsaI-SacI消化によって得られ、そして挿入断片は、pBYKEMd2-HVL-HxのBsaI-SacI消化によって得られた。最終構築物は、pBYKEMd2-ZHVLhxと称された。
[0099]本明細書記載の特定の構築物を以下に列挙する:
・pBYR11em-h6D8ZE3(配列番号21に示される配列)
・pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371(配列番号22に示される配列)
・pBYR11eMa-BAZE3-H(配列番号23に示される配列)
・pBYKEMd-HZE3(配列番号24に示される配列)
・pBYKEMd-ZE3H(配列番号25に示される配列)
・pBYKEMd-ZE3Hx(配列番号26に示される配列)
・pBYKEMd-HVLZe(配列番号27に示される配列)
・pBYKEMd2-HVL-Hx(配列番号28に示される配列)
・pBYKEMd2-HVLZnt(配列番号29に示される配列)
・pBYKEMd2-ZHVLnt(配列番号30に示される配列)
・pBYKEMd2-ZHVLe(配列番号31に示される配列)
・pBYKEMd2-ZHVLhx(配列番号32に示される配列)
・pBYKEMd-6D8K(配列番号33に示される配列)
2. ベンサミアナタバコ葉のアグロインフィルトレーション
[0100]バイナリーベクターを、エレクトロポレーションによって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)EHA105内に別個に導入した。生じた株を制限消化またはPCRによって検証し、30℃で一晩増殖させ、そして23~25℃に維持した5~6週齢のベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。簡潔には、5,000g、5分間の遠心分離によって細菌をペレットにし、そして次いで、別に明記しない限り、浸潤緩衝液(10mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、pH5.5および10mM MgSO4)にOD600=0.2まで再懸濁した。小さい穿刺を通じて、葉内に針を入れることなく、シリンジを用いることによって、生じた細菌懸濁物を注入した(HuangおよびMason、2004)。グリコシル化の影響を評価するため、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされたトランスジェニック植物を使用した。植物組織を5DPIで採取した。
・pBYR11em-h6D8ZE3(配列番号21に示される配列)
・pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371(配列番号22に示される配列)
・pBYR11eMa-BAZE3-H(配列番号23に示される配列)
・pBYKEMd-HZE3(配列番号24に示される配列)
・pBYKEMd-ZE3H(配列番号25に示される配列)
・pBYKEMd-ZE3Hx(配列番号26に示される配列)
・pBYKEMd-HVLZe(配列番号27に示される配列)
・pBYKEMd2-HVL-Hx(配列番号28に示される配列)
・pBYKEMd2-HVLZnt(配列番号29に示される配列)
・pBYKEMd2-ZHVLnt(配列番号30に示される配列)
・pBYKEMd2-ZHVLe(配列番号31に示される配列)
・pBYKEMd2-ZHVLhx(配列番号32に示される配列)
・pBYKEMd-6D8K(配列番号33に示される配列)
2. ベンサミアナタバコ葉のアグロインフィルトレーション
[0100]バイナリーベクターを、エレクトロポレーションによって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)EHA105内に別個に導入した。生じた株を制限消化またはPCRによって検証し、30℃で一晩増殖させ、そして23~25℃に維持した5~6週齢のベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。簡潔には、5,000g、5分間の遠心分離によって細菌をペレットにし、そして次いで、別に明記しない限り、浸潤緩衝液(10mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、pH5.5および10mM MgSO4)にOD600=0.2まで再懸濁した。小さい穿刺を通じて、葉内に針を入れることなく、シリンジを用いることによって、生じた細菌懸濁物を注入した(HuangおよびMason、2004)。グリコシル化の影響を評価するため、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされたトランスジェニック植物を使用した。植物組織を5DPIで採取した。
3. タンパク質抽出および精製
[0101]製造者の指示にしたがって、Bullet Blender装置(Next Advance、ニューヨーク州アベリルパーク)を用い、1:5(w:v)氷冷抽出緩衝液(25mM Tris-HCl、pH8.0、125mM NaCl、3mM EDTA、0.1% Triton X-100、10mg/mLアスコルビン酸ナトリウム、0.3mg/mLフェニルメチルスルホニルフロリド)で、アグロインフィルトレーションされた葉試料をホモジナイズすることによって、未精製タンパク質を抽出した。ホモジナイズされた組織を、室温または4℃で30分間回転させた。未精製植物抽出物を13,000g、4℃で15分間遠心分離することによって清澄化し、そして上清をSDS-PAGEまたはELISAによって分析した。あるいは、元来のホモジネート中のタンパク質の可溶性を評価するため、ペレットを不溶性分画に指定し、そしてSDS-PAGE上に装填する前に、SDS試料緩衝液で、100℃で10分間処理した。
[0101]製造者の指示にしたがって、Bullet Blender装置(Next Advance、ニューヨーク州アベリルパーク)を用い、1:5(w:v)氷冷抽出緩衝液(25mM Tris-HCl、pH8.0、125mM NaCl、3mM EDTA、0.1% Triton X-100、10mg/mLアスコルビン酸ナトリウム、0.3mg/mLフェニルメチルスルホニルフロリド)で、アグロインフィルトレーションされた葉試料をホモジナイズすることによって、未精製タンパク質を抽出した。ホモジナイズされた組織を、室温または4℃で30分間回転させた。未精製植物抽出物を13,000g、4℃で15分間遠心分離することによって清澄化し、そして上清をSDS-PAGEまたはELISAによって分析した。あるいは、元来のホモジネート中のタンパク質の可溶性を評価するため、ペレットを不溶性分画に指定し、そしてSDS-PAGE上に装填する前に、SDS試料緩衝液で、100℃で10分間処理した。
[0102]HVLZeを含むIgG変異体を、プロテインGアフィニティクロマトグラフィによって精製した。アグロインフィルトレーションされた葉を、1:3(w:v)氷冷抽出緩衝液(25mM Tris-HCl、pH8.0、125mM NaCl、3mM EDTA、0.1% Triton X-100、10mg/mLアスコルビン酸ナトリウム、0.3mg/mLフェニルメチルスルホニルフロリド)とブレンドし、4℃で30分間攪拌し、そしてmiraclothを通じて濾過した。内因性植物タンパク質を沈殿させるため、攪拌しながら1Mリン酸を5分間添加して、pHを4.5に下げ、次いで、2M tris塩基で7.6に上昇させた。16,000gで20分間遠心分離した後、製造者の指示にしたがって、清澄化された抽出物をPierceプロテインGカラム(Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)上に装填した。精製されたタンパク質を、100mMグリシン、pH2.5で溶出させ、1M Tris-HCl pH8.0を含有する収集試験管に直接入れて、溶出緩衝液を中和した。HVLおよびZHVLhx構築物を類似の方式で精製した;が、酸沈殿工程をスキップした。
[0103]pBYe3R2K2Mc-BAZE3から発現されたZE3-Hisを、金属アフィニティクロマトグラフィによって精製した。上述のようにタンパク質を抽出したが、酸沈殿は伴わなかった。製造者の指示にしたがって、清澄化された抽出物を、TALON金属アフィニティ樹脂(BD Clontech、カリフォルニア州マウンテンビュー)上に装填した。カラムをPBSで洗浄し、そして溶出緩衝液(PBS、150mMイミダゾール、pH7.4)で溶出した。ピークZE3溶出をプールし、PBSに対して透析し、そしてSDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析した。
4. SDS-PAGEおよびウェスタンブロット
[0104]植物タンパク質抽出物または精製タンパク質試料をSDS試料緩衝液(50mM Tris-HCl、pH6.8、2%SDS、10%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー)と混合し、そして4~15%無染色ポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュルス)上で分離した。還元条件のため、0.5M DTTを添加し、そして装填前に試料を10分間煮沸した。ポリアクリルアミドゲルを視覚化し、そしてUV光下で画像化し、次いでPVDF膜にトランスファーした。IgG検出のため、タンパク質をトランスファーした膜を、PBST(0.05% Tween-20を含むPBS)中の5%ドライミルクで、4℃で一晩ブロッキングし、そしてヤギ抗ヒトIgG-HRP(Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス、1%PBSTM中、1:5000に希釈)で探査した。結合した抗体をECL試薬(Amersham、英国リトル・チャルフォント)で検出した。
[0104]植物タンパク質抽出物または精製タンパク質試料をSDS試料緩衝液(50mM Tris-HCl、pH6.8、2%SDS、10%グリセロール、0.02%ブロモフェノールブルー)と混合し、そして4~15%無染色ポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュルス)上で分離した。還元条件のため、0.5M DTTを添加し、そして装填前に試料を10分間煮沸した。ポリアクリルアミドゲルを視覚化し、そしてUV光下で画像化し、次いでPVDF膜にトランスファーした。IgG検出のため、タンパク質をトランスファーした膜を、PBST(0.05% Tween-20を含むPBS)中の5%ドライミルクで、4℃で一晩ブロッキングし、そしてヤギ抗ヒトIgG-HRP(Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス、1%PBSTM中、1:5000に希釈)で探査した。結合した抗体をECL試薬(Amersham、英国リトル・チャルフォント)で検出した。
5. C1q結合
[0105]96ウェル高結合ポリスチレンプレート(Corning Inc、米国ニューヨーク州コーニング)を、PBS中の15μg/mlヒト補体C1qで、37℃で2時間コーティングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、そして次いでPBST中の5%ドライミルクで15分間ブロッキングした。PBSTで3回洗浄した後、精製ヒトIgG(Southern Biotech、米国アラバマ州バーミンガム)および精製IgG-ZE3融合体の10倍連続希釈を0.1mg/mlで添加し、そして37℃で1.5時間インキュベーションした。PBSTで3回洗浄した後、1:1000ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG-HRP(Southern Biotech、米国アラバマ州バーミンガム)と37℃で1時間インキュベーションすることによって、結合したIgGを検出した。プレートをPBSTで4回洗浄し、TMB基質(Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)で現像し、1M HClで停止し、そして吸光度を450nmで読み取った。
[0105]96ウェル高結合ポリスチレンプレート(Corning Inc、米国ニューヨーク州コーニング)を、PBS中の15μg/mlヒト補体C1qで、37℃で2時間コーティングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、そして次いでPBST中の5%ドライミルクで15分間ブロッキングした。PBSTで3回洗浄した後、精製ヒトIgG(Southern Biotech、米国アラバマ州バーミンガム)および精製IgG-ZE3融合体の10倍連続希釈を0.1mg/mlで添加し、そして37℃で1.5時間インキュベーションした。PBSTで3回洗浄した後、1:1000ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG-HRP(Southern Biotech、米国アラバマ州バーミンガム)と37℃で1時間インキュベーションすることによって、結合したIgGを検出した。プレートをPBSTで4回洗浄し、TMB基質(Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)で現像し、1M HClで停止し、そして吸光度を450nmで読み取った。
6. 6D8エピトープ結合
[0106]HVLが6D8エピトープタグに結合する能力を試験するため、6D8エピトープでタグ付けされた精製デングコンセンサスエンベロープドメインIII 900ngを96ウェル高結合ポリスチレンプレート(Corning Inc、米国ニューヨーク州コーニング)に結合させた。37℃で1時間インキュベーションした後、プレートをPBSTで3回洗浄し、そしてPBST中、5%ドライミルクで30分間ブロッキングした。次いで、プレートをPBSTで3回洗浄し、そして精製HLVまたは全長6D8抗体の多様な希釈をプレートに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベーションし、PBSTで3回洗浄し、そして1:2000希釈のHRPコンジュゲート化マウス抗ヒトIgG(Fcのみ)(Southern Biotech、米国アラバマ州バーミンガム)抗体で検出した。次いで、プレートをPBSTで完全に洗浄し、そしてTMB基質(Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)で現像した。吸光度を450nmで読み取った。
[0106]HVLが6D8エピトープタグに結合する能力を試験するため、6D8エピトープでタグ付けされた精製デングコンセンサスエンベロープドメインIII 900ngを96ウェル高結合ポリスチレンプレート(Corning Inc、米国ニューヨーク州コーニング)に結合させた。37℃で1時間インキュベーションした後、プレートをPBSTで3回洗浄し、そしてPBST中、5%ドライミルクで30分間ブロッキングした。次いで、プレートをPBSTで3回洗浄し、そして精製HLVまたは全長6D8抗体の多様な希釈をプレートに添加した。プレートを37℃で1時間インキュベーションし、PBSTで3回洗浄し、そして1:2000希釈のHRPコンジュゲート化マウス抗ヒトIgG(Fcのみ)(Southern Biotech、米国アラバマ州バーミンガム)抗体で検出した。次いで、プレートをPBSTで完全に洗浄し、そしてTMB基質(Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)で現像した。吸光度を450nmで読み取った。
7. スクロース勾配密度遠心分離
[0107]各IgG融合体の精製試料(100μl)を、2.0ml微量遠心管中、PBS中で5、10、15、20、および25%スクロースの350μl層からなる不連続スクロース勾配上に装填し、そして21,000g、4℃で16時間遠心分離した。分画を収集し、そしてSDS-PAGE後、無染色ゲル(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュルス)上での視覚化によって分析した。ImageJソフトウェアを用いて、各分画の相対バンド強度を決定し、ピークバンドに恣意的に1の値を割り当てた。
[0107]各IgG融合体の精製試料(100μl)を、2.0ml微量遠心管中、PBS中で5、10、15、20、および25%スクロースの350μl層からなる不連続スクロース勾配上に装填し、そして21,000g、4℃で16時間遠心分離した。分画を収集し、そしてSDS-PAGE後、無染色ゲル(Bio-Rad、米国カリフォルニア州ハーキュルス)上での視覚化によって分析した。ImageJソフトウェアを用いて、各分画の相対バンド強度を決定し、ピークバンドに恣意的に1の値を割り当てた。
8. マウスの免疫および試料収集
[0108]すべての動物を動物福祉法およびアリゾナ州立大学IACUCにしたがって取り扱った。6~8週齢の雌BALB/Cマウスを、精製IgG融合変異体で皮下免疫した。すべての処置群において、抗原の総重量はZE3の同等の8μgが送達されるように設定された。第0日および第14日に用量を投与した。第0日、第14日、および第28日に、顎下出血によって、Santiら、2008に記載されるように、血清収集を行った。
[0108]すべての動物を動物福祉法およびアリゾナ州立大学IACUCにしたがって取り扱った。6~8週齢の雌BALB/Cマウスを、精製IgG融合変異体で皮下免疫した。すべての処置群において、抗原の総重量はZE3の同等の8μgが送達されるように設定された。第0日および第14日に用量を投与した。第0日、第14日、および第28日に、顎下出血によって、Santiら、2008に記載されるように、血清収集を行った。
9. 抗体測定
[0109]マウス抗体力価をELISAによって測定した。植物発現された6-Hisタグ付けZE3を50ng/ウェルで96ウェル高結合ポリスチレンプレート(Corning Inc、米国ニューヨーク州コーニング)に結合させ、そしてプレートをPBST中の5%脱脂粉乳でブロッキングした。ウェルをPBST(0.05% Tween20を含むPBS)で洗浄した後、マウス血清を1% PBSTM(1%脱脂粉乳を含むPBST)で希釈し、そしてインキュベーションした。ポリクローナルヤギ抗マウスIgG-セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)とインキュベーションすることによって、マウス抗体を検出した。プレートをTMB基質(Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)で現像し、1M HClで停止し、そして吸光度を450nmで読み取った。PBSを試料として用いて生じたバックグラウンドの2倍のOD450読み取り値を生じる最低の希釈の逆数を、終点力価とした。1%PBSTM中、1:100に希釈した血清からIgG2a抗体を測定し、そしてIgG2aセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Santa Cruz Biotechnology、米国テキサス州ダラス)を検出した。
引用され、そして援用される参考文献
[0109]マウス抗体力価をELISAによって測定した。植物発現された6-Hisタグ付けZE3を50ng/ウェルで96ウェル高結合ポリスチレンプレート(Corning Inc、米国ニューヨーク州コーニング)に結合させ、そしてプレートをPBST中の5%脱脂粉乳でブロッキングした。ウェルをPBST(0.05% Tween20を含むPBS)で洗浄した後、マウス血清を1% PBSTM(1%脱脂粉乳を含むPBST)で希釈し、そしてインキュベーションした。ポリクローナルヤギ抗マウスIgG-セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス)とインキュベーションすることによって、マウス抗体を検出した。プレートをTMB基質(Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)で現像し、1M HClで停止し、そして吸光度を450nmで読み取った。PBSを試料として用いて生じたバックグラウンドの2倍のOD450読み取り値を生じる最低の希釈の逆数を、終点力価とした。1%PBSTM中、1:100に希釈した血清からIgG2a抗体を測定し、そしてIgG2aセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Santa Cruz Biotechnology、米国テキサス州ダラス)を検出した。
引用され、そして援用される参考文献
Claims (28)
- 抗原のユニット;
IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc融合体のユニット;
IgGの可変重鎖(VH)ドメインのユニット;
IgGのCH1ドメインのユニット;ならびに
IgGの軽鎖可変(VL)ドメインのユニット
を含む、組換えタンパク質であって、
抗原のユニットがIgGのエピトープではなく;
抗原のユニットが、N末端でIgGのVHドメインのユニットに、またはC末端でIgGのCH3ドメインに連結され;
IgGのCH1ドメインのユニットがIgGのCH2ドメインに連結され;そして
IgGのVLドメインのユニットが、IgGのVHドメインのユニットに、そしてIgGのCH1ドメインに融合される
前記組換えタンパク質。 - IgGが6D8抗体である、請求項1の組換えタンパク質。
- Fc融合体が、置換突然変異E345R、E430G、およびS440Yを含む、請求項2の組換えタンパク質。
- 抗原のユニット;
IgGのCH2ドメインおよびCH3ドメインを含むFc融合体のユニット;
IgGの可変重鎖(VH)ドメインのユニット;
IgGのCH1ドメインのユニット;
IgGの軽鎖可変(VL)ドメインのユニット;ならびに
IgGの軽鎖定常(CL)ドメインのユニット
を含む、組換えタンパク質であって、
IgGが6D8抗体であり;
Fc融合体が置換突然変異E345R、E430G、およびS440Yを含み;
抗原のユニットがIgGのエピトープではなく;
IgGのCH1ドメインのユニットがIgGのCH2ドメインに連結され;
IgGのVLドメインのユニットがIgGのCLドメインのユニットに連結され;
IgGのCLドメインのユニットがIgGのCH1ドメインに連結され;そして
抗原のユニットがIgGのCH3ドメインに連結される
前記組換えタンパク質。 - エピトープタグのユニットをさらに含み、該エピトープタグがIgGのエピトープである、請求項1~4のいずれか一項の組換えタンパク質。
- エピトープタグが配列YKLDIS(配列番号1)を含み、そしてエピトープタグのユニットが抗原のユニットに連結される、請求項5の組換えタンパク質。
- エピトープタグが配列VYKLDISEA(配列番号2)を含む、請求項6の組換えタンパク質。
- エピトープタグが配列YKLDIS(配列番号1)からなる、請求項6の組換えタンパク質。
- 抗原の2つのユニット;
Fc融合体の2つのユニット;
IgGのCH1ドメインの2つのユニット;
IgGのVHドメインの2つのユニット;および
IgGの軽鎖可変(VL)ドメインの2つのユニット
を含む、請求項2の組換えタンパク質であって、
IgGのCH2ドメインおよびCH1ドメインの連結で形成されるジスルフィド結合が、Fc融合体の2つのユニットを連結する
前記組換えタンパク質。 - IgGのVLドメインの各ユニットが、IgGのVHドメインのユニットおよびIgGのCH1ドメインに連結される、請求項9の組換えタンパク質。
- 組換えタンパク質がIgGの軽鎖定常(CL)ドメインを含まない、請求項10の組換えタンパク質。
- エピトープタグの2つのユニットをさらに含む、請求項9~11のいずれか一項の組換えタンパク質であって:
エピトープタグの各ユニットが配列YKLDIS(配列番号1)を含み、
エピトープタグの2つのユニットが、IgGのCH3ドメインのC末端で、Fc融合体の2つのユニットに連結され、そして
抗原の2つのユニットが、IgGのVHドメインの2つのユニットに連結される
前記組換えタンパク質。 - エピトープタグの2つのユニットをさらに含む、請求項9~11のいずれか一項の組換えタンパク質であって:
エピトープタグの各ユニットが配列YKLDIS(配列番号1)を含み、
エピトープタグの2つのユニットが抗原の2つのユニットに連結され、そして
抗原の2つのユニットが、IgGのCH3ドメインのC末端で、Fc融合体の2つのユニットに連結される
前記組換えタンパク質。 - エピトープタグが配列VYKLDISEA(配列番号2)を含む、請求項12または13の組換えタンパク質。
- エピトープタグが配列YKLDIS(配列番号1)からなる、請求項12または13の組換えタンパク質。
- 抗原の2つのユニット;
Fc融合体の2つのユニット;
IgGのVHドメインの2つのユニット;および
IgGのCH1ドメインの2つのユニット
を含む、組換えタンパク質であって:
抗原がIgGのエピトープではなく;
抗原の2つのユニットが、N末端でIgGのVHドメインの2つのユニットに連結され;そして
IgGのCH1ドメインの2つのユニットが、IgGのCH2ドメインでFc融合体の2つのユニットに連結される
前記組換えタンパク質。 - 組換えタンパク質が、IgGの軽鎖定常(CL)ドメインを含まず、そしてIgGの軽鎖可変(VL)ドメインを含まない、請求項16の組換えタンパク質。
- 抗原が、寄託番号第AMC13911.1号のK301~T406を含む、請求項1~17のいずれか一項の組換えタンパク質。
- 抗原が、配列番号34~72からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む、請求項1~17のいずれか一項の組換えタンパク質。
- 抗原が、配列番号34~72からなる群より選択される、少なくとも3つの配列、少なくとも6つの配列、または少なくとも9つの配列を含む、請求項19の組換えタンパク質。
- 組換えタンパク質がトランスジェニック植物において産生される、請求項1~20のいずれか一項の組換えタンパク質。
- トランスジェニック植物が、キシロシルトランスフェラーゼおよびフコシルトランスフェラーゼに関してサイレンシングされている、請求項21の組換えタンパク質。
- 請求項1~22のいずれか一項の少なくとも1つの組換えタンパク質、または
請求項1および3~22のいずれか一項の少なくとも1つの組換えタンパク質であって、抗体が6D8抗体である、前記組換えタンパク質
を含む免疫学的組成物。 - 請求項1~22のいずれか一項の組換えタンパク質を産生する方法であって:
pBYR11eM-h6D8ZE3、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371、pBYR11eMa-BAZE3-H、pBYKEMd-HZE3、pBYKEMd-ZE3H、pBYKEMd-ZE3Hx、pBYKEMd-HVLZe、pBYKEMd2-HVL-Hx、pBYKEMd2-HVLZnt、pBYKEMd2-ZHVLnt、pBYKEMd2-ZHVLe、pBYKEMd2-ZHVLhx、pBYKEAM-N12MHd、pBYKEAM-NPHd、pBYKEAM-NSHd、pBYKEAM-NTHd、pBYKEHM-CPHd、pBYKEHM-CSHd、およびpBYKEHM-CTHdからなる群より選択されるバイナリーベクターを、第一のアグロバクテリウム内に導入し;
バイナリーベクターを含有する第一のアグロバクテリウムを植物部分に浸潤させて、形質転換植物部分を産生し;そして
形質転換植物部分から未精製タンパク質を抽出し;そして
抽出された未精製タンパク質を精製する
工程を含む、前記方法。 - アグロバクテリウム内に導入されるバイナリーベクターが:pBYR11eM-h6D8ZE3、pBYR11eMa-BAZE3-Hgp371、pBYR11eMa-BAZE3-H、およびpBYKEMd-HZE3からなる群より選択される、請求項24の方法であって、該方法がさらに:
第二のアグロバクテリウム内にpBYKEMd-6D8Kを導入し;そして
pBYKEMd-6D8Kを含有する第二のアグロバクテリウムを植物部分に浸潤させて、形質転換植物部分を産生する
工程を含み、
pBYKEMd-6D8Kを含有する第二のアグロバクテリウムおよびバイナリーベクターを含有する第一のアグロバクテリウムを、植物部分に共浸潤させる
前記方法。 - 被験体において、抗原に対する免疫反応を誘導する方法であって、請求項1~22のいずれか一項の組換えタンパク質より選択される少なくとも1つの組換えタンパク質または請求項23の免疫学的組成物を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
- 請求項26の方法であって、抗原がジカウイルス由来であり、方法が、請求項18、21、および22のいずれか一項の組換えタンパク質または請求項23の免疫学的組成物を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
- 請求項27の方法であって、抗原がノロウイルス由来であり、方法が、請求項19~22のいずれか一項の組換えタンパク質または請求項23の免疫学的組成物を、被験体に投与する工程を含む、前記方法。
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