JP2023514080A - 幹細胞を含む心膜内注入用組成物およびその用途 - Google Patents
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Abstract
【課題】幹細胞の治療効果を向上させるための、幹細胞を有効成分として含む心膜内注入用組成物およびその用途などを提供する。【解決手段】本発明は、幹細胞を含む心膜内注入用組成物およびその用途などに関し、より詳しくは、幹細胞を心膜内に効果的に移植して、幹細胞の治療効果を向上させることができる組成物に関する。【選択図】図１
Description
本発明は、幹細胞を含む心膜内注入用組成物およびその用途などに関する。
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、生物組織を構成する多様な細胞に分化できる細胞であり、胚芽、胎児、および成体の各組織で得ることができる分化する前の未分化細胞を総称する。多様な種類の幹細胞のうち、心臓幹細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、心臓内に常駐する細胞であり、心臓を構成するすべての細胞に分化できる多機能性を有する幹細胞を指す。
一方、虚血性心疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）とは、心臓に血液を供給する血管（冠状動脈）が狭くなって、心臓筋肉の一部に血液供給が不足して発生する疾患であり、最近、高齢化社会への急進的変化に起因して発病率が顕著に増加している疾患の一つである。虚血性心疾患としては、狭心症（ａｎｇｉｎａ ｐｅｃｔｏｒｉｓ）、心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）などがあり、これを治療するために、薬物治療、血管成形術、心臓移植などを含む多様な治療方法が試みられているが、まだ心疾患を効果的に治療できる方法は不足しているのが現状である。
最近では、このような限界点を克服するために、幹細胞を用いて心臓および心筋の再生を可能にする細胞治療（ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）に関する研究が活発に行われているが、幹細胞を体内に移植した後に、心臓組織への分化効率が顕著に低いだけでなく、移植された幹細胞の体内生存率が低いため、実質的な治療方法として使用されるには限界がある（韓国特許登録１０－１９１５３６７号）。
したがって、幹細胞を用いて心筋への分化効率を増加させることができるだけでなく、血管の新生を促進させることができる効果的な方法が開発される場合、幹細胞を用いた虚血性心疾患の治療効果を顕著に増加させることができることが期待される。
本発明は、前記のような従来技術上の問題点を解決するためになされたもので、幹細胞の治療効果を向上させるための、幹細胞を有効成分として含む心膜内注入用組成物およびその用途などを提供することをその目的とする。
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、以下の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が明確に理解できる。
本発明は、幹細胞を有効成分として含む心膜内注入用組成物を提供する。
本発明の一具体例において、前記幹細胞は、幹細胞微小球であってもよく、前記幹細胞微小球は、好ましくは、１０～５００μｍの直径を有していてもよく、より好ましくは、５０～３００μｍ以下であることが好ましい。また、前記幹細胞微小球は、好ましくは、１個当たり１００～５０００個の細胞を含んでもよく、より好ましくは、３００～３０００個の細胞を含んでもよい。
本発明の他の具体例において、前記心膜内注入用組成物は、ヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）をさらに含んでもよく、前記ヒドロゲルは、好ましくは、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、マトリゲル（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、フィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）、ＰＧＡ（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）などであってもよく、前記高分子物質を一つ以上混合して製造することもできる。しかし、一般的に、心膜内に注射するための容易な形態のヒドロゲルであれば、これに制限されない。
本発明のさらに他の具体例において、前記フィブリンゲルは、トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）およびフィブリノゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）を混合して製造することができ、前記トロンビンは、好ましくは、０．０５～５ＩＵ／ｍＬの濃度で使用することができ、より好ましくは、０．１～２ＩＵ／ｍＬであってもよく、前記フィブリノゲンは、好ましくは、０．０１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度で使用することができ、より好ましくは、０．０５～５ｍｇ／ｍＬの濃度で使用することができるが、一般的に、フィブリノゲンを作るのに使用される濃度であれば、制限されない。また、前記フィブリノゲンは、ヒト由来フィブリノゲン濃縮物を使用することもできる。
本発明のさらに他の具体例において、前記幹細胞は、好ましくは、心筋由来幹細胞（心臓幹細胞または心臓前駆細胞）、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、逆分化幹細胞、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などであってもよいが、虚血性疾患の治療用途に使用できる幹細胞であれば、これに制限されない。
また、本発明は、前記心膜内注入用組成物を有効成分として含む虚血性心疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記心膜内注入用組成物を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む虚血性疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、前記心膜内注入用組成物を有効成分として含む組成物の虚血性疾患の予防または治療用途を提供する。
また、本発明は、前記心膜内注入用組成物の虚血性疾患に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明の一具体例において、前記虚血性心疾患は、好ましくは、心筋梗塞、狭心症などであってもよいが、心筋細胞への分化促進、心臓血管形成促進などによって治療できる心疾患であれば、これに制限されない。
本発明による心膜内注入用組成物を用いて幹細胞を移植した場合には、動物モデルの生存率、幹細胞の生着程度、移植された幹細胞の心筋細胞および血管細胞への分化などが促進されるだけでなく、心筋梗塞に起因して損傷した心臓組織が移植された幹細胞により効果的に再生され、血管形成が促進されて、心臓機能を効果的に回復させることができる。したがって、本発明の心膜内注入用組成物を用いて幹細胞を多様な虚血性心疾患の治療剤として効果的に使用できることが期待される。
本発明の幹細胞心膜内注入用組成物を用いて幹細胞を移植する場合、動物モデルの生存率、幹細胞の生着程度、移植された幹細胞の心筋細胞および血管細胞への分化が促進されるだけでなく、心筋梗塞によって損傷した心臓組織が移植された幹細胞により効果的に再生され、血管形成が促進されて、心臓機能が顕著に向上することを確認した。したがって、多様な虚血性心疾患の細胞治療剤として効果的に使用できることを確認することができた。
本明細書において、「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、様々な種類の身体組織細胞に分化できる能力、すなわち、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を有する未分化細胞を総称する広義の概念をいう。このような幹細胞は、大きく、胚芽を用いて製造できる胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、生殖細胞（ｇａｍｅｔｅ）、がん幹細胞（ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などに分けられる。これらのうち、心臓幹細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、心臓内に存在する幹細胞であり、心臓を構成するすべての細胞に分化できる多機能性を有する幹細胞を指す。
本明細書において、「微小球（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）」とは、心臓幹細胞を立体培養（３Ｄ培養）して製造された球体形態の細胞塊を総称する。
本明細書において、「虚血性心疾患（Ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、心臓に血液を供給する血管（冠状動脈）が狭くなって、心臓筋肉の一部に血液供給が不足して発生する疾患である。血液供給が不足して心臓に必要な酸素と栄養素が十分に供給できにくくなり、心臓に異常が生じることが特徴であり、虚血性心疾患の種類としては、心筋梗塞および狭心症、具体的に安定狭心症（Ｓｔａｂｌｅ ａｎｇｉｎａ）、不安定狭心症（Ｕｎｓｔａｂｌｅ ａｎｇｉｎａ）、異型狭心症（Ｖａｒｉａｎｔ ａｎｇｉｎａ）、急性心筋梗塞症（Ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）などがある。
本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明による組成物の投与によって虚血性心疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。
本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明による組成物の投与によって虚血性心疾患の症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味する。
本明細書において、「個体（ ｓｕｂjｅｃｔ ）」とは、本発明の組成物が投与される対象をいい、その対象には制限がない。
本明細書において、「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とは、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学的組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とする。本発明の薬学的組成物は、製薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。薬剤学的に許容可能な担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩解剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用でき、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用でき、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などが使用できる。本発明の薬学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容可能な担体と混合して多様に製造することができる。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクシール（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェハーなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多回投薬形態で製造することができる。その他、糖衣錠、ゲル、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤、外用剤、溶液、懸濁液、徐放性製剤、スラリーなどに剤形化して使用することもできる。一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、マグネシウムステアレート、鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。
本発明による薬学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、心膜内投与が好ましく、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮内、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下、直腸、胸骨内、病巣内、頭蓋骨内などが含まれる。
本発明の薬学的組成物の投与量は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含む様々な要因によって多様に変わることができて、患者の状態、体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されることができ、１日に０．０００１～５００ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量は、いかなる面においても、本発明の範囲を限定するものではない。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、ただ本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例］
実施例１：心筋梗塞動物モデルの製作および心臓幹細胞の移植
すべての動物の取り扱いおよび手続きは、韓国の梨花女子大学校の動物管理および使用委員会の承認を得た研究プロトコルによって行った（ＩＡＣＵＣ番号：１８－０７３）。心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＭＩ）動物モデルを製作するために、１０～１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを３％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて麻酔させた。また、開胸術を通じて心臓を確認し、近位左前下行冠動脈（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｌｅｆｔ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ）を７－０ Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させて、心筋梗塞動物モデルを製作した。
実施例１：心筋梗塞動物モデルの製作および心臓幹細胞の移植
すべての動物の取り扱いおよび手続きは、韓国の梨花女子大学校の動物管理および使用委員会の承認を得た研究プロトコルによって行った（ＩＡＣＵＣ番号：１８－０７３）。心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＭＩ）動物モデルを製作するために、１０～１２週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを３％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）を用いて麻酔させた。また、開胸術を通じて心臓を確認し、近位左前下行冠動脈（ｐｒｏｘｉｍａｌ ｌｅｆｔ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ）を７－０ Ｐｒｏｌｅｎｅ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を用いて結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）させて、心筋梗塞動物モデルを製作した。
また、心臓幹細胞を移植するために、動物モデルの心筋（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ，ＩＭ）または心膜腔（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｃａｖｉｔｙ，ＩＰ）に２７ゲージのハミルトンシリンジを用いて心臓幹細胞を注射した。より詳しくは、１５μＬの塩類溶液に添加された５×１０５ ｃｅｌｌｓの心臓幹細胞を心筋または心膜内注入し、対照群としては、塩類溶液を同量注射した。
移植が完了した後、胸および皮膚を閉じ、鎮痛剤として２～５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃのケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）を提供して、手術後の痛みを軽減させて回復させた。また、虚血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）の有無は、移植手術後、１週間から心電図（ＥＣＧ）上でＳＴ ｓｅｇｍｅｎｔが増加し、心臓チアノーゼ（ｃｙａｎｏｓｉｓ）が現れることを通じて確認した。
心臓幹細胞移植方法による治療効果を確認するために、心臓の機能を心超音波を用いて確認した。より詳しくは、移植後２週間後にマウスを麻酔させ、３７℃のｈｅａｔｉｎｇ ｐａｄの上に載置し、ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｏｂｅ（ＭＳ－４００）が装着されたＶＥＶＯ２１００ｍｉｃｒｏ－ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて心超音波を実施した。左心室（ＬＶ）は、ｐａｒａｓｔｅｒｎａｌ ｌｏｎｇ－ａｘｉｓおよびＭ－ｍｏｄｅ ｔｒａｃｉｎｇｓを全部イメージ化し、２次元心超音波のｃｉｎｅ ｌｏｏｐｓを記録した。駆出率（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ＥＦ）、短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ，ＦＳ）値をそれぞれ測定した。その結果は、図１に示した。
図１に示されたように、黒色バーは心筋に注射した結果であり、灰色バーは心膜内注射した結果であり、心臓幹細胞を心筋に注射した場合と比較して、心膜内注射した場合に有意的に心臓の機能が回復したことを確認し、これを通じて、心臓幹細胞を心膜内注入することによって、心筋梗塞の治療効果を向上させることができることを確認することができた。
実施例２：心臓幹細胞微小球の製作
心臓幹細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＣＳＣｓ）の微小球（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を製造するために、一次的にヒト由来心臓幹細胞を培養液（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、２ｎｇ／ｍｌ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１（ＩＧＦ－１）および１％（ｖ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ－ａｎｔｉｍｙｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ（ＡＡ）がＤＭＥＭ：Ｆ－１２（１：１ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ））が収容されたＴ－７５フラスコに接種し、５％ＣＯ２、３７℃培養器で密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が８０％に到達するまで培養した後、継代培養した。１１回継代培養した心臓幹細胞をそれぞれ２．５×１０５、５×１０５、７．５×１０５、１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように、１％（ｖ／ｖ）子牛の血清（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ，ＣＳ）、０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、および５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）が添加されたＤＭＥＭ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅが収容されているＵｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｕｒｆａｃｅ ６ ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種し、３日間培養して、心臓幹細胞微小球を製作した。それぞれの細胞数によって生成された微小球のサイズは、光学顕微鏡で生成された微小球の直径を測定して示した。その結果は、図２Ｃおよび図２Ｄに示した。また、形成された微小球をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓＴＭ）を用いて染色した後、微小球内に含まれている細胞の数による細胞の生存程度を確認した。その結果は、図２Ａおよび図２Ｂに示した。
心臓幹細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＣＳＣｓ）の微小球（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）を製造するために、一次的にヒト由来心臓幹細胞を培養液（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、２ｎｇ／ｍｌ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、１０ｎｇ／ｍｌ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－１（ＩＧＦ－１）および１％（ｖ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ－ａｎｔｉｍｙｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅａｇｅｎｔ（ＡＡ）がＤＭＥＭ：Ｆ－１２（１：１ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ））が収容されたＴ－７５フラスコに接種し、５％ＣＯ２、３７℃培養器で密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が８０％に到達するまで培養した後、継代培養した。１１回継代培養した心臓幹細胞をそれぞれ２．５×１０５、５×１０５、７．５×１０５、１×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように、１％（ｖ／ｖ）子牛の血清（ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ，ＣＳ）、０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、および５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）が添加されたＤＭＥＭ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅが収容されているＵｌｔｒａ－Ｌｏｗ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｕｒｆａｃｅ ６ ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種し、３日間培養して、心臓幹細胞微小球を製作した。それぞれの細胞数によって生成された微小球のサイズは、光学顕微鏡で生成された微小球の直径を測定して示した。その結果は、図２Ｃおよび図２Ｄに示した。また、形成された微小球をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓＴＭ）を用いて染色した後、微小球内に含まれている細胞の数による細胞の生存程度を確認した。その結果は、図２Ａおよび図２Ｂに示した。
図２Ｃおよび図２Ｄに示されたように、平均直径が３００μｍ程度の均一なサイズの心臓幹細胞微小球が製作されたことを確認した。また、図２Ａおよび図２Ｂに示されたように、微小球に５０００個の細胞が含まれた場合、また、直径が５００μｍ以上になった場合、微小球内部の細胞が死滅が誘導されることを確認した。前記結果を通じて、微小球それぞれに２００ｃｅｌｌｓ以上、かつ、５０００ｃｅｌｌｓ未満で含まれた場合、または、微小球の直径が１０～５００μｍである場合、細胞死滅が誘導されない最も効果的な心臓幹細胞微小球であることを確認することができた。
実施例３：ヒドロゲルを用いた微小球心膜内注入用組成物の製作
ヒドロゲルを用いた心膜内注入用組成物を製造するために、７．５μＬのトロンビン溶液（０．５ＩＵ／ｍＬ）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞または５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞を用いて製造された心臓幹細胞微小球を懸濁し、前記懸濁液に７．５μＬのフィブリノゲン濃縮物（０．２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、反応させて、ゲル形態の心臓幹細胞微小球心膜内注入用組成物を製作した。
ヒドロゲルを用いた心膜内注入用組成物を製造するために、７．５μＬのトロンビン溶液（０．５ＩＵ／ｍＬ）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞または５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞を用いて製造された心臓幹細胞微小球を懸濁し、前記懸濁液に７．５μＬのフィブリノゲン濃縮物（０．２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、反応させて、ゲル形態の心臓幹細胞微小球心膜内注入用組成物を製作した。
実施例４：心臓幹細胞、心臓幹細胞微小球、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞、またはヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球の移植
心臓幹細胞微小球を移植するために、一次的に実施例１と同じ方法で心筋梗塞動物モデルを製作した。また、製作された心筋梗塞動物モデルに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞を用いて製造された心臓幹細胞微小球（ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、または実施例３と同じ方法で製造されたヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞（ＣＳＣ＋ｇｅｌ）、またはヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球（ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ－Ｇｅｌ）をそれぞれ１５μＬずつ心膜腔（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｃａｖｉｔｙ）に２７ゲージのハミルトンシリンジを用いて試料を注射した。以下、すべての実験において「Ｓｈａｍ」グループは、何らの処置もしない正常マウスであり、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」グループは、心筋梗塞動物モデルであり、「Ｓａｌｉｎｅ」グループは、塩類溶液を同量注射した対照群であり、「ＣＳＣ」グループは、心臓幹細胞を注射した実験群であり、「ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ」グループは、心臓幹細胞微小球を同量注射した実験群であり、「ＣＳＣ＋ｇｅｌ」グループは、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞を同量注射した実験群であり、「ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ－Ｇｅｌ」グループは、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を同量注射した実験群を示す。
心臓幹細胞微小球を移植するために、一次的に実施例１と同じ方法で心筋梗塞動物モデルを製作した。また、製作された心筋梗塞動物モデルに５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞、５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの心臓幹細胞を用いて製造された心臓幹細胞微小球（ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）、または実施例３と同じ方法で製造されたヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞（ＣＳＣ＋ｇｅｌ）、またはヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球（ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ－Ｇｅｌ）をそれぞれ１５μＬずつ心膜腔（ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ ｃａｖｉｔｙ）に２７ゲージのハミルトンシリンジを用いて試料を注射した。以下、すべての実験において「Ｓｈａｍ」グループは、何らの処置もしない正常マウスであり、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」グループは、心筋梗塞動物モデルであり、「Ｓａｌｉｎｅ」グループは、塩類溶液を同量注射した対照群であり、「ＣＳＣ」グループは、心臓幹細胞を注射した実験群であり、「ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ」グループは、心臓幹細胞微小球を同量注射した実験群であり、「ＣＳＣ＋ｇｅｌ」グループは、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞を同量注射した実験群であり、「ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ－Ｇｅｌ」グループは、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を同量注射した実験群を示す。
また、移植が完了した後、胸および皮膚を閉じ、鎮痛剤として２～５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃのケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）を提供して、手術後の痛みを軽減させて回復させた。
実施例５：心臓幹細胞微小球心膜内注入用組成物の治療効果の確認
５．１．動物モデルの生存率の確認
実施例４と同じ方法で移植された心筋梗塞動物モデルの生存率をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒカーブで確認した。以後、すべての実験は、最小３回以上繰り返し行い、結果は、平均値±標準偏差で示した。統計的有意性は、２つのグループ間には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで確認し、３つ以上のグループ間には、ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔを用いて確認した。ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意性があると判断した。その結果は、図３に示した。
５．１．動物モデルの生存率の確認
実施例４と同じ方法で移植された心筋梗塞動物モデルの生存率をＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒカーブで確認した。以後、すべての実験は、最小３回以上繰り返し行い、結果は、平均値±標準偏差で示した。統計的有意性は、２つのグループ間には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔで確認し、３つ以上のグループ間には、ｔｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔを用いて確認した。ｐ＜０．０５であれば、統計的に有意性があると判断した。その結果は、図３に示した。
図３に示されたように、４週目にＣｏｎｔｒｏｌグループは、４８％程度の生存率を示し、Ｓａｌｉｎｅグループは、Ｃｏｎｔｒｏｌグループより低い４０％程度の生存率を示し、心臓幹細胞微小球を移植した場合には、５９％程度の生存率を示す反面、心臓幹細胞微小球の心膜内注入用組成物を移植した場合には、初めて移植した１週目から生存率が減少せず、６７％程度の生存率を維持することを確認した（ｐ＜０．０１）。前記結果を通じて、心筋梗塞が誘導されるにつれて減少した生存率（１週目）が心臓幹細胞微小球またはヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を移植した場合に心筋梗塞治療効果を示して、生存率が維持されることを確認することができた。
５．２．移植された心臓幹細胞微小球の生着有無の確認
移植された心臓幹細胞微小球による虚血性心疾患の治療効果を確認するために、移植された細胞の生着有無をＤｉＲを用いて確認した。より詳しくは、ＩＶＩＳ－１００ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて生きている動物モデルの蛍光を観察した。蛍光強度は、ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２ ｐｅｒ ｓｅｃｏｎｄで算出した。また、心臓組織の染色のために、心臓幹細胞微小球を移植した動物モデルを４週後に安楽死させた後に心臓組織を抽出した。また、抽出された心臓組織は、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定させ、パラフィンを用いてｅｍｂｅｄｄｉｎｇさせた後、０．４μｍの厚さに切って、心臓組織切片を製造して使用した。その結果は、図４～図６に示した。
移植された心臓幹細胞微小球による虚血性心疾患の治療効果を確認するために、移植された細胞の生着有無をＤｉＲを用いて確認した。より詳しくは、ＩＶＩＳ－１００ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて生きている動物モデルの蛍光を観察した。蛍光強度は、ｐｈｏｔｏｎｓ／ｃｍ２ ｐｅｒ ｓｅｃｏｎｄで算出した。また、心臓組織の染色のために、心臓幹細胞微小球を移植した動物モデルを４週後に安楽死させた後に心臓組織を抽出した。また、抽出された心臓組織は、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて固定させ、パラフィンを用いてｅｍｂｅｄｄｉｎｇさせた後、０．４μｍの厚さに切って、心臓組織切片を製造して使用した。その結果は、図４～図６に示した。
図４は、ＤｉＲ－ｌａｂｅｌｅｄ心臓幹細胞微小球の蛍光を確認した蛍光顕微鏡写真であり、蛍光シグナルが心臓においてのみ観察され、肺、肝など他の組織では観察されないことを確認した。前記結果を通じて、心臓幹細胞微小球が正常に心臓に移植されたことを確認した。
図５Ａは、ＤｉＲ蛍光強度による細胞数を測定したグラフであり、図５Ｂは、動物モデルの心臓で測定された蛍光強度を用いて心臓内に存在するＤｉＲ－ｌａｂｅｌｅｄ心臓幹細胞の保持率（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｒａｔｅ）を定量化したものであり、移植されたＤｉＲ－ｌａｂｅｌｅｄ心臓幹細胞が次第に減少して、移植後４週目には全く観察されないことを確認した。
図６は、心臓組織切片をＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いて細胞核を染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した結果であり、心臓幹細胞微小球を直接移植した動物モデル（ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）とヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を移植した動物モデル（ＣＳＣ ｓｐｈｅｒｏｉｄ－Ｇｅｌ）を比較したとき、心臓幹細胞微小球またはヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を移植した場合、全部ＤｉＲ ｌａｂｅｌｅｄ心臓幹細胞が観察され、これを通じて、３週以上移植された心臓幹細胞が生存していることを確認することができた。
５．３．移植された心臓幹細胞微小球の分化有無の確認
移植された心臓幹細胞微小球による虚血性心疾患の治療効果を確認するために、移植された細胞の心血管分化効率を確認した。心血管分化効率を確認するために、前記実施例５．２と同じ方法で準備した心臓組織切片をα－ＳＡ（α－ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ ａｃｔｉｎｉｎ）抗体（Ａｂｃａｍ）またはα－ＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）抗体（Ａｂｃａｍ）、そして、ＤＡＰＩを用いて染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果は、図７に示した。
移植された心臓幹細胞微小球による虚血性心疾患の治療効果を確認するために、移植された細胞の心血管分化効率を確認した。心血管分化効率を確認するために、前記実施例５．２と同じ方法で準備した心臓組織切片をα－ＳＡ（α－ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ ａｃｔｉｎｉｎ）抗体（Ａｂｃａｍ）またはα－ＳＭＡ（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ）抗体（Ａｂｃａｍ）、そして、ＤＡＰＩを用いて染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果は、図７に示した。
図７に示されたように、ＤｉＲ ｌａｂｅｌｅｄ心臓幹細胞と同じ部分でα－ＳＡとα－ＳＭＡが観察されることを確認した。α－ＳＡは、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）に分化したことを示し、α－ＳＭＡは、血管平滑筋細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）に分化したことを意味する。前記結果を通じて、移植された心臓幹細胞が心臓内に安定的に生着して、心臓筋肉細胞および血管平滑筋細胞に分化したことを確認することができた。
５．４．心臓幹細胞微小球の移植による心臓再生効果の確認
心臓幹細胞微小球の移植による心臓再生効果を確認するために、前記実施例５．２と同じ方法で準備した心臓組織切片をｃＴｎＩ（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ）抗体（Ａｂｃａｍ）、α－ＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ）、そして、ＤＡＰＩを用いて染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果を図８および図９に示した。
心臓幹細胞微小球の移植による心臓再生効果を確認するために、前記実施例５．２と同じ方法で準備した心臓組織切片をｃＴｎＩ（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ）抗体（Ａｂｃａｍ）、α－ＳＭＡ抗体（Ａｂｃａｍ）、そして、ＤＡＰＩを用いて染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。その結果を図８および図９に示した。
図８に示されたように、心臓幹細胞微小球を心膜内注入方式で移植した場合に、ｃＴｎＩにより染色された面積が有意的に増加することを確認した。特に、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を心膜内移植した場合に、ｃＴｎＩにより染色された面積が２１．７％と顕著に増加することを確認した。前記結果を通じて、心臓幹細胞微小球を心膜内移植した場合に、心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌ）の再生性が顕著に促進されることを確認し、これを通じて、虚血性心疾患において心筋細胞の生成を促進させて治療効果を向上させることができることを確認することができた。
図９に示されたように、心臓幹細胞微小球自体を移植した場合にも、α－ＳＭＡ陽性細胞がＣｏｎｔｒｏｌグループと比較して増加するが、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を心膜内注入した場合に、α－ＳＭＡ陽性細胞が顕著に増加することを確認した。前記結果を通じて、本発明の心臓幹細胞微小球を心膜内注入することによって心臓血管の生成を促進させることができ、これを通じて、虚血性心疾患において心臓血管の再生性を促進させて治療効果を向上させることができることを確認することができた。
また、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）ｓｔａｉｎ（Ａｂｃａｍ）を用いて心臓組織切片を染色した。その結果を図１０に示した。
図１０に示されたように、Ｓｈａｍグループの場合には、筋原線維（ｍｙｏｆｉｂｒｉｌ）と隣接して縞があり、分岐した形態の正常な心臓組織の形態を示すが、Ｃｏｎｔｒｏｌグループでは、心筋梗塞が誘導されて、心臓組織が損傷して、正常な心臓組織の形態でないことを確認した。また、炎症性細胞（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ）が浸透（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、核が凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）し、心筋細胞でｎｅｃｒｏｓｉｓが観察された。しかしながら、心臓幹細胞微小球またはヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞微小球を心膜内注入した場合には、Ｓｈａｍグループと類似した形態の心臓組織が現れることを確認した。前記結果を通じて、心臓幹細胞微小球を心膜内注入することによって、正常マウスと類似した程度に心臓が回復することを確認することができた。さらに、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｄｒｕｇ）を使用しなくとも、免疫拒否反応（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）が現れないことを確認した。
また、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（ＭＴ）ｓｔａｉｎ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて心臓組織切片を染色して、線維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）程度と左心室（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ，ＬＶ）の壁厚さ（ｗａｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を定量した。顕微鏡イメージにおいて青色は、コラーゲンファイバー（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｅｒ）を示し、赤色は、筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）を示す。その結果を図１１に示した。
図１１に示されたように、心筋梗塞が誘導された動物モデルの場合には、心臓組織の周辺に線維症が誘発されて、ほとんど青色を帯び、左心室の壁厚さが０．５ｍｍ程度と減少したが、心臓幹細胞微小球自体を移植した場合には、線維症の誘発程度が減少し、左心室の壁厚さがさらに増加したことを確認した。また、心臓幹細胞微小球の心膜内注入用組成物を用いて心臓幹細胞微小球を移植した場合には、線維症の誘発程度が半分以上に減少し、左心室の壁厚さも、１．２ｍｍ程度と２倍以上増加したことを確認した。
前記結果を通じて、本発明の心臓幹細胞微小球の心膜内注入用組成物を用いて心筋梗塞動物モデルに心臓幹細胞微小球を移植した場合には、心臓幹細胞微小球が正常に心臓に生着して、安定的に心臓筋肉細胞または血管平滑筋細胞に分化されるだけでなく、周辺に損傷した心臓組織内でも心筋細胞の生成と血管生成を促進させて、損傷した心臓を効果的に再生させることができ、これを通じて、虚血性心疾患の治療効果を顕著に増加させることができることを確認することができた。
５．５．心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球の移植による心臓機能の確認
心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球の移植による治療効果を確認するために、心臓機能を心超音波を用いて確認した。より詳しくは、マウスを麻酔させ、３７℃のｈｅａｔｉｎｇ ｐａｄの上に載置し、ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｏｂｅ（ＭＳ－４００）が装着されたＶＥＶＯ２１００ｍｉｃｒｏ－ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて心超音波を実施した。左心室（ＬＶ）は、ｐａｒａｓｔｅｒｎａｌ ｌｏｎｇ－ａｘｉｓおよびＭ－ｍｏｄｅ ｔｒａｃｉｎｇｓを全部イメージ化し、２次元心超音波のｃｉｎｅ ｌｏｏｐｓを記録した。駆出率（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ＥＦ）、短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ，ＦＳ）、左心室拡張末期径（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＶＥＤＤ）、および左心室収縮末期径（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＶＥＳＤ）値をそれぞれ測定し、測定時期は、心筋梗塞の誘導前、心筋梗塞の誘導後、そして、心臓幹細胞の移植後１週間後、２週間後、３週間後および４週間後それぞれに測定した。その結果を図１２に示した。
心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球の移植による治療効果を確認するために、心臓機能を心超音波を用いて確認した。より詳しくは、マウスを麻酔させ、３７℃のｈｅａｔｉｎｇ ｐａｄの上に載置し、ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｏｂｅ（ＭＳ－４００）が装着されたＶＥＶＯ２１００ｍｉｃｒｏ－ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）を用いて心超音波を実施した。左心室（ＬＶ）は、ｐａｒａｓｔｅｒｎａｌ ｌｏｎｇ－ａｘｉｓおよびＭ－ｍｏｄｅ ｔｒａｃｉｎｇｓを全部イメージ化し、２次元心超音波のｃｉｎｅ ｌｏｏｐｓを記録した。駆出率（ｅｊｅｃｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ，ＥＦ）、短縮率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ，ＦＳ）、左心室拡張末期径（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｅｎｄ ｄｉａｓｔｏｌｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＶＥＤＤ）、および左心室収縮末期径（ｌｅｆｔ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｅｎｄ ｓｙｓｔｏｌｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ，ＬＶＥＳＤ）値をそれぞれ測定し、測定時期は、心筋梗塞の誘導前、心筋梗塞の誘導後、そして、心臓幹細胞の移植後１週間後、２週間後、３週間後および４週間後それぞれに測定した。その結果を図１２に示した。
図１２に示されたように、４週目の結果を見ると、心筋梗塞が誘導されたＣｏｎｔｒｏｌグループ、ＳａｌｉｎｅグループおよびＧｅｌグループの場合には、心室壁の扁平化によって異常中隔運動（ｓｅｐｔａｌ ｍｏｔｉｏｎ）が観察されるが、心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球を心膜内注入した場合には、中隔運動が回復し、心筋梗塞が誘導されて減少した駆出率と短縮率がさらに増加することを確認した。
前記結果を通じて、心臓幹細胞または心臓幹細胞を心膜内注入方式で移植することによって、心臓機能の回復が顕著に増加することを確認することができた。
５．６．ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球の移植による心臓機能の確認
ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球の移植による治療効果を確認するために、実施例５．５と同じ方法で心臓機能を心超音波を用いて確認した。「Ｇｅｌ」グループは、フィブリンゲルのみを同量注射した対照群である。その結果を図１３に示した。
ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球の移植による治療効果を確認するために、実施例５．５と同じ方法で心臓機能を心超音波を用いて確認した。「Ｇｅｌ」グループは、フィブリンゲルのみを同量注射した対照群である。その結果を図１３に示した。
図１３に示されたように、４週目の結果を見ると、Ｇｅｌグループの場合には、心室壁の扁平化によって異常中隔運動（ｓｅｐｔａｌ ｍｏｔｉｏｎ）が観察されるが、ヒドロゲルに含まれている心臓幹細胞または心臓幹細胞微小球を心膜内注入方式で移植した場合には、中隔運動が心筋梗塞が誘導される前と類似した程度に回復することを確認した。また、心筋梗塞が誘導されて減少した駆出率と短縮率がさらに増加することを確認した。
前記結果を通じて、一般的に幹細胞を移植するために使用される心筋内注射方式と比較して、心膜内注入を通じて心筋梗塞により低下した心臓機能が顕著に向上し、これを通じて、本発明の心臓幹細胞を有効成分として含む心膜内注入用組成物を用いることによって、多様な虚血性心疾患を効果的に治療できることを確認することができた。さらに、心臓幹細胞微小球、またはヒドロゲルを用いることによって、動物モデルの生存率、心臓幹細胞微小球の生着程度、移植された心臓幹細胞微小球の心筋細胞および血管細胞への分化が促進されるだけでなく、心筋梗塞により損傷した心臓組織が移植された心臓幹細胞微小球により効果的に再生され、血管形成が促進されて、心臓機能が顕著に向上することを確認することができた。したがって、本発明の心膜内注入用組成物を用いて多様な虚血性心疾患を効果的に治療できることを確認することができた。
上述した本発明の説明は、例示のためのものであって、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
本発明の幹細胞心膜内注入用組成物は、幹細胞を治療剤として使用するために、心膜内に注入する方式を通じて幹細胞を移植することによって、幹細胞の生着率および分化効率を上げるだけでなく、損傷した心臓組織の回復および心臓機能の回復を顕著に増加させることができるので、多様な虚血性心疾患の治療に適用することによって、治療効率を顕著に増加させることができることが期待される。
Claims (11)
- 幹細胞を有効成分として含む、心膜内注入用組成物。
- 前記幹細胞は、幹細胞微小球であることを特徴とする請求項１に記載の心膜内注入用組成物。
- 前記幹細胞微小球は、１０μｍ～５００μｍの直径を有することを特徴とする請求項２に記載の心膜内注入用組成物。
- 前記幹細胞微小球は、微小球当たり１００～５０００個の細胞を含んでいることを特徴とする請求項２に記載の心膜内注入用組成物。
- 前記心膜内注入用組成物は、ヒドロゲル（ｈｙｄｒｏｇｅｌ）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の心膜内注入用組成物。
- 前記ヒドロゲルは、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ）、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルギン酸（ａｌｇｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、マトリゲル（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）、フィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）、ＰＧＡ（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＬＡ（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）およびポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）からなる群から選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項５に記載の心膜内注入用組成物。
- 前記幹細胞は、心筋由来幹細胞、骨髄由来幹細胞、脂肪由来幹細胞、臍帯血由来幹細胞、逆分化幹細胞、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および心臓前駆細胞からなる群から選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の心膜内注入用組成物。
- 請求項１から７のいずれか１項に記載の心膜内注入用組成物を有効成分として含む、虚血性心疾患の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記虚血性心疾患は、心筋梗塞または狭心症であることを特徴とする請求項８に記載の薬学的組成物。
- 請求項１から７のいずれか１項に記載の心膜内注入用組成物を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む虚血性疾患の予防または治療方法。
- 請求項１から７のいずれか１項に記載の心膜内注入用組成物を有効成分として含む組成物の虚血性疾患の予防または治療用途。
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