KR101226629B1 - 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 포함하여 구성되는 손상된 조직 재생용 패치 - Google Patents

Abstract

본 발명은 손상된 조직의 재생용 세포 또는 약물이 지지체 내에 시딩되어 있고, 상기 손상된 조직이 존재하는 장기에 직접 부착이 가능한, 생분해성 고분자 재질의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 포함하여 구성되는 손상된 조직 재생용 패치에 관한 것이다.
본 발명에 따른 손상된 조직 재생용 패치는 조작(handling)이 쉽고, 이식 후 세포 생존 잔류성이 높아 세포이식이 필요한 질환 부위에서 세포 치료제의 치료 효능을 제고할 수 있다. 따라서 손상된 조직의 치료를 위하여 세포 또는 약물이 시딩된 생분해성 고분자 재질의 다공성 삼차원 지지체를 손상된 조직이 존재하는 장기에 직접 부착한 경우, 세포 전달 성공률을 높이고 세포가 허혈 부위로 이동함으로써 손상된 조직의 혈관생성을 증가시키며 조직 재생을 촉진시키는 효과가 있다.

Description

섬유형 다공성 삼차원 지지체를 포함하여 구성되는 손상된 조직 재생용 패치{Patch for tissue regeneration comprising fibrous 3-dimensional scaffold}

본 발명은 손상된 조직의 재생용 세포 또는 약물이 지지체 내에 시딩되어 있고, 상기 손상된 조직이 존재하는 장기에 직접 부착이 가능한, 생분해성 고분자 재질의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 포함하여 구성되는 손상된 조직 재생용 패치에 관한 것이다.

사고나 질병에 의한 조직 및 장기 손상의 완벽한 회복을 위하여, 해당 조직과 장기를 자기신체의 일부 혹은 타조직을 이용하여 그 기능을 복원시키는 것이 필요하다. 하지만 수요에 비하여 턱없이 부족한 공급 상의 문제와 면역 거부반응, 질환의 오염, 사회적 문제 등을 야기하여 적용에 많은 제약이 따르고 있다.

특히 심장의 경우 한번 손상을 입으면 회복이 불가능한 조직으로 알려져 있었다. 최근 정상심장에서도 심근세포의 교체로서 심근세포의 분열과 소실이 느리기는 하지만 일어나고 있음이 보고되고 있으나, 기존의 내과 치료법으로는 손상 받은 심근세포의 수를 늘릴 수 있는 방법이 없다. 더욱이 중증 말기 심부전 환자의 경우는 이미 심장의 기능을 회복시킬 수 없기 때문에 심장이식술(heart transplant)이나 심실 보조 장치(ventricular assist device)를 사용하는 방법밖에 없다. 이에, 손상 조직의 회복을 위하여 세포를 이용한 세포이식 치료제가 대안으로 떠오르고 있다.

세포 이식 치료제를 사용하여 세포 이식에 성공하기 위해서는 이식 후 세포의 생착률을 극대화하는 것이 중요하다. 이미 분화가 완료된 세포보다는 최종 분화까지 진행되지 않아 분열능력을 갖고 있는 세포가 이식 후 생착력, 적응력이 좋다고 알려져 있다. 또한, 심근세포의 경우는 주변 조직과의 전기적 신호전달을 통해 일관성 있게 움직이는 특징을 갖고 있어, 심근에 세포를 이식하고 심기능 개선을 유도하기 위해서는 이식된 세포가 기존의 조직과 잘 융합하여 동일한 신호전달 체계로 움직이는 것이 필요하다.

세포이식에 사용되는 세포는 성체줄기세포로부터 분리된 근모세포(myoblasts), 심근세포(cardiomyocytes), 내피세포(endothelial cells), 섬유아세포(fibroblasts), 또는 심혈관 형성을 유도하는 줄기세포 등이다.

근육 아세포(skeletal myoblast) 또는 근육세포(skeletal myocyte)를 이용하여 죽은 심장조직을 대체하고자 하는 연구들이 진행 중에 있다. 이는 환자의 근육조직을 일부 채취하여 근육 아세포를 분리하고 증식시켜 심장에 이식하는 것인데, 이들 세포는 세포간 갭정션(intercellular gap junction)을 형성하지 못하므로 부정맥을 유발할 위험을 갖는다.

최근 줄기세포의 연구가 활성화되면서, 손상된 조직의 치료를 위해 미분화 상태의 줄기세포를 심근 손상 부위에 이식한 결과 심장기능이 개선되는 것이 보고되고 있다. 심장 재생이 가능한 세포군 개발의 목적으로 심근경색 이후 치료를 위해 자가 골수 유래 세포를 이용하는 것을 테스트하는 임상 시험이 진행 중이다(Perin et al., Circulation 107:2294, 2003; Strauer et al., Circulation 106:1913, 2002; Zeiher et al.,Circulation 106:3009, 2002; Tse et al., Lancet 361:47, 2003; Stamm et al., Lancet 3661:45, 2003). 상기 시험에서는 세포가 심장 조직의 혈액 관류를 개선하는 정화 기능을 가질 수 있다고 가정하였다.

또한, 심장 치료를 위해 자가 골격근 근모세포의 사용을 테스트하기 위한 임상 시험도 진행중이다(Menasche et al., J. Am. Coll.Cardiol. 41:1078, 2003; Pagani et al., J. Am. Coll. Cardiol. 41:879, 2003; Hagege et al., Lancet361:491, 2003). 그러나, 줄무늬근 세포의 수축이 심박동과 적당하게 함께 기능할 수 있는지는 분명하지 않다.

상기와 같은 줄기세포를 투여하는 방법으로는 심장병 환자의 심장내 주입(intramyocardial delivery)과 외과 시술적으로 심근에 직접 주사하는 방법, 카테터를 이용해 관동맥 등으로 주입하는 방법과 정맥혈관주사 같이 전신 투여하는 방법 등이 있다. 하지만 주입된 세포의 생착률(bioretention)은 매우 낮은 상황이며, 보고에 의하면 심장의 특수성으로 인해 주입된 심근세포의 약 10% 정도만이 심근조직 재생에 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. 따라서 지속적인 심근조직 재생을 위해서는 환자에게 심근세포의 주입빈도를 높일 수밖에 없으며 환자의 고통도 커지는 상황에 처하게 된다. 또한 실제 이식되는 세포의 수가 매우 적어 이식 시 고농도의 세포 수를 사용해야 하는 문제점이 있으며, 고농도의 세포를 이식하여도 이식된 부위에서 분화할 때까지 세포가 머물러 있기에 열악한 환경 조건이므로 기대이상의 치료 효과를 보기에 한계가 있다.

이에 심장 조직에 이식할 때, 세포 시트의 형태로 이식되는 것이 고려되고 있다. 세포시트는 단일 세포(single cell)층을 의미하는 것으로서, 신생아의 심근 세포를 단층의 시트로 만들고 이 시트를 시험관내에서 최대 3층으로 중첩시킬 수 있는 것으로 알려져 있다(비특허 문헌 11: FASEB J. 2006 Apr; 20(6): 708-10). 최근 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) (PIAAm)를 시판되는 폴리스티렌 배양접시 표면에 전자선을 사용하여 도포한 온도 감응성 배양접시를 사용함으로써, 각종 세포시트를 제작하는 것에 성공하였다. 또한, 세포시트를 적층화 함으로써 이식편으로서 이용 가능한 심근조직 덩어리를 개발한 것이 이미 보고되어 있다(일본 공개특허공보 제2003-38170호, 국제 공개공보 제01/068799호, Shimizu et. Al. : Fabrication of pulsatile cardiac tissue grafts using a novel 3-dimensional cell sheet manipulation technique and temperature-responsive cell culture surface : CircRes. 2002 ; 90 : e40-e48). 이렇게 제조된 심근조직 덩어리는 생체외(in vitro) 및 생체내 (in vivo)에서 정상 심근조직과 동일한 전기활동을 하는 것이 확인되어 있다.

그런데 상기 온도감응성 배양접시를 사용한 세포시트의 제작법은, 본 특수 배양접시에서의 배양에 최적상태가 되도록 엄격한 방법으로 초대 배양했을 때에는 비교적 안정적으로 세포시트를 제작하는 것이 가능하지만, 각 시설에서 관례적으로 실시되어 온 방법을 그대로 적용하였을 때에는 세포의 시트화는 곤란하였다. 또한, 세포시트를 적층하는 방법을 이용함으로써 세포가 눌리는 현상이 발생하여 세포 생존율이 낮은 문제와, 산소 투과성의 한계로 인해 혈관의 신생 없이는 세포 시트를 그 이상의 두께로 만들 수 없는 문제점이 있다. 또한, 심장의 환부 조직의 크기에 맞게 임의의 세포 시트를 제조하는 것은 아직 불가능한 실정이다.

따라서 세포를 다량으로 이식하고 산소투과성을 개선하기 위하여 지지체를 사용하여 세포를 이식하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 지지체의 성질은 심장과 같은 장기에 세포를 전달하기 위해 우선 세포를 파종하고 배양할 터전으로서 충분한 기능, 그리고 어느 정도의 기계적 강도를 갖는 것이 중요하다. 즉, 배양 시에 세포를 균일한 분포상태로 안정되게 보유·생착시키고, 양호한 증식 생존성을 확보할 수 있는 것이 팔요하며, 부가하여 배양 후 환부에 이식 시 봉합 등의 고정처리가 가능해야 한다. 또한, 심장의 박동(beating)에 따른 압축을 견디는 기계적 강도를 가진 지지체를 이용하는 것이 필요하다.

지지체를 이용한 세포이식 기술은 많이 보고되고 있다. 세포를 고분자물질에 혼합하여, 지지체 형태로 세포의 생착을 높이려는 시도의 일환으로 Leor 등은 심근조직 재생을 위해 사용될 수 있는 고분자 지지체가 가져야 할 물성으로써 비독성, 생분해성, 생활성(bioactive), 유연성 등을 제시하였으며 (Pharmacology & Therapeutics. 2005;105:151-163), Cannizzaro등은 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 세포점착을 유도하는 RGD 펩티드 시퀀스를 도입하여 폴리에틸렌글리콜 공중합체에 대한 내피세포의 점착성을 증대시킴으로써 심근조직 재생을 도우려는 시도를 보고하였다(Biotechnol Bioeng. 1998;58:529-535).

또한, Piao 등은 실험쥐에 심근경색(myocardial infaction, MI)을 유도한 후 생체적합성을 보유한 글리콜리드와 카프로락톤계의 공중합체상에서 골수유래세포를 배양한 후, 골수유래세포를 함유하는 고분자 중합체를 심근경색부위에 이식하여 향상된 심장기능을 얻음을 보고하였다(Biomaterials.2007;28:641-649).

그러나, 상기 연구는 고분자 중합체 및 고분자 지지체의 초기 단계를 기술한 것으로 심화된 연구가 필요하다. 상기 연구에서 사용되었던 지지체들은 열린 구조를 위한 공극을 갖지 못하는 등 단층의 멤브레인(membrane) 형태로서, 2차원의 메트릭스 지지체를 사용하여 세포 생존율에 문제가 있으며, 신체 내 장기에 부착하기 위해 수술적인 방법을 사용하였을 경우 찢어지는 등 조작(handling)에 문제가 있다. 또한, 심장과 같은 경우 고밀도의 세포가 이식되어야하기 때문에 지지체의 공극이 크고 공극률이 90% 이상이 되어야 하므로 적용하는데 문제가 있었다.

특히 Piao등이 실험에 사용한 지지체는 스폰지 타입(sponge type)의 지지체로서, 공극률이 작으며 지지체 내부까지 세포 이식이 어려운 문제가 있었다. 또한, 이는 형태가 일정하기 때문에 심장과 같은 장기의 곡면 표면을 갖는 재료에 직접 적용하기 어려운 문제가 있다.

이에 본 발명자들은, 종래 사용되던 방법인 2차원적인 세포 배양 결과물을 이식하는 방법 대신 3차원적 배양을 통하여 세포가 시딩된 섬유형 지지체를 이용하여 일정한 두께의 패치 형태를 생성하고 세포를 시딩한 후, 이를 심장에 직접 부착한 결과 조작(handling)의 어려움 없이 장기에 부착이 가능하며 염증성 세포의 침윤을 막고, 주변 조직과의 적합성이 있는 생체 본래의 조직에 가까운 성질을 가질뿐만 아니라, 세포이식의 치료효과가 유의하게 개선되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 손상된 조직의 치료를 위하여, 세포 전달 성공률을 높이고 세포가 허혈 부위로 이동함으로써 손상된 조직의 혈관생성을 증가시키며 조직 재생을 촉진시키는 손상된 조직 재생용 패치를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 손상된 조직의 재생용 세포 또는 약물이 지지체 내에 시딩되어 있고, 상기 손상된 조직이 존재하는 장기에 직접 부착이 가능한, 생분해성 고분자 재질의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 포함하여 구성되는 손상된 조직 재생용 패치를 제공한다.

본 발명에 따른 손상된 조직 재생용 패치는 주사방법, 단일 세포(single cee) 및 2차원적 지지체 형태로 세포를 적용하는 방법에 비하여 조작(handling)이 쉽고, 이식 후 세포 생존 잔류성이 높아 세포이식이 필요한 질환 부위에서 세포 치료제의 치료 효능을 제고할 수 있다.

따라서 손상된 조직의 치료를 위하여 세포 또는 약물이 시딩된 생분해성 고분자 재질의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 손상된 조직이 존재하는 장기에 직접 부착한 경우, 세포 전달 성공률을 높이고 세포가 허혈 부위로 이동함으로써 손상된 조직의 혈관생성을 증가시키며 조직 재생을 촉진시키는 효과가 있다.

도 1은 실시예 1에 의해 제조된 PLLA 섬유형 다공성 삼차원 지지체 패치의 (a) 실사이미지와 (b) 시차주사현미경 사진이고;
도 2는 배향성을 갖도록 제조된 PLLA 섬유형 다공성 삼차원 지지체 패치의 시차주사현미경 사진이고;
도3은 (a) 실시예 1에 따라 제조된 랜덤하게 방사된 비배향성 패치에 심장 줄기세포가 부착된 시차주사현미경 사진, (b) 실시예 2에 따라 제조된 배향성을 갖는 패치에 심장 줄기세포가 부착된 시차주사현미경 사진이고;
도 4는 배향성을 갖는 섬유형 다공성 삼차원 지지체 패치에 세포를 이식하고, 48시간 후 H&E 염색하여 (a) 가로 절단면을 현미경으로 관찰한 사진, (b) 단면을 현미경으로 관찰한 사진이고;
도 5는 실험예 2에 따라 1일, 4일, 7일 및 14일에 측정된 세포 수이고;
도 6은 실험예 3에 따라 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 (a) 증식배지 조성과 (b) 분화배지 조성에서 체외에서 2주간 배양하여 H&E, αSA, MHC, TnT 면역 염색 사진이고;
도 7의 (a)와 (b)는 실험예 4에 따라 정상 심장 조직의 외심막 표면에 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식하고 4일 후의 조직을 H&E로 염색한 현미경 사진이고;
도 8은 (a) 심근경색 부분에 비교예 1의 줄기세포가 시딩되지 않은 패치를 이식한 직후의 사진, (b) 14일 후의 조직사진, (c) 심근경색 부분에 실시예 1의 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식한 직후의 사진과 (d) 14일 후 조직사진이고;
도 9는 실험예 5에 따라 14일 후 얻어진 조직을 H&E로 염색한 사진으로서 (a) 심장 줄기세포가 시딩된 실시예 1의 패치를 이식한 사진, (b) 심장 줄기세포가 없는 비교예 1의 패치를 이식한 사진이고;
도 10은 실험예 5에 따라 14일 후 얻어진 조직을 (a) αSA 면역 염색한 조직 사진, (b) 핵을 DAPI 염색한 사진, (c) (a) 와 (b)를 중첩시킨 사진이고;
도 11은 실험예 5에 따라 14일 후 얻어진 조직을 (a) TnT 면역 염색한 조직 사진, (b) 핵을 DAPI 염색한 사진과 (c) (a) 와 (b)를 중첩시킨 사진이고;
도 12은 실험예 5에 따라 14일 후 얻어진 조직에 대해 (a) SMA 면역 염색시킨 소동맥/정맥 사진, (b) 핵을 DAPI 염색한 사진, (c) (a) 와 (b)를 중첩시킨 사진이고;
도 13은 실험예 5에 따라 14일 후 얻어진 조직에 대해 (a) CD34 면역 염색시킨 모세혈관 사진, (b) 핵을 DAPI 염색한 사진, (c) (a) 와 (b)를 중첩시킨 사진이고;
도 14는 실험예 5에 따라 이식 14일 후 패치와 심장 조직의 전체적인 저배율 사진으로서 (a) 이식된 DiI-표지 심장 줄기세포가 붉은색 형광으로 나타난 사진, (b) 핵의 DAPI 염색한 사진, (c) (a) 와 (b)를 중첩시킨 사진이고;
도 15는 심근 경색 쥐의 심근층에서 이식된 심장 줄기 세포의 위치를 보여주는 심근조직의 고배율 현미경 사진으로서, 위쪽은 부착한 패치부분이며 아래로 내려갈수록 심근 안쪽을 나타내어 (a)의 붉은색 형광은 DiI-표지 심장 줄기세포를 나타내고, (b)의 파란색 형광은 DAPI로 표지된 핵을 나타내며, (c)는 (a)와 (b)를 중첩시킨 사진이고;
도 16은 실험예 6에 따라 28일 후 얻어진 조직을 H&E로 염색한 사진으로서 (a) 심장 줄기세포가 시딩된 실시예 1의 패치를 이식한 사진, (b) 심장 줄기세포가 없는 비교예 1의 패치를 이식한 사진이고;
도 17은 실험예 6에 따라 28일 후 얻어진 조직의 조직학적 분석으로서 실시예 1의 패치를 이식한 경우와 줄기세포가 없는 비교예 1의 패치를 이식한 경우의 (a) 섬유화 면적 측정 결과, (b) 심장 두께 측정 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 손상된 조직의 재생용 세포 또는 약물이 지지체 내에 시딩되어 있고, 상기 손상된 조직이 존재하는 장기에 직접 부착이 가능한, 생분해성 고분자 재질의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 포함하여 구성되는 손상된 조직 재생용 패치를 제공한다.

본 발명의 손상된 조직 재생용 패치에 있어서, 상기 지지체 내에 시딩되어 있는 손상된 조직의 재생용 세포는 줄기세포인 것이 바람직하다.

성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포 등을 사용할 수 있다. 특히 손상된 심장조직의 재생을 위해 심장세포로 분화가 잘 되고 심장 재생 효과가 있으며, 심장 조직 내로 이동이 가능한 심장 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명에서는 쥐 심장의 심근 줄기세포를 이용하고 있으나, 이에 한정되지 않고, 인간, 래트(rat), 마우스(mouse), 원숭이 등을 포함하는 모든 종류의 포유류 종에서 채취한 줄기 세포에 유사하게 적용된다.

줄기세포를 시딩한 패치를 손상된 조직에 이식하면, 줄기세포가 해당 조직의 세포로 분화됨을 확인할 수 있다. 특히 심장 줄기세포를 사용한 경우 심장 특이적 마커를 이용하여 분화 가능하다. 이 마커들은 MHC(myosin heavy chain), cTnI(cardiac troponin I), cTnT(cardiac troponin T), α-cardiac actin, α-actinin 그리고 MLC2(myosin light chain) 등을 포함하며 이들만으로 제한되지는 않는다. 이런 세포의 표현형으로는 리듬감 있는 수축, 심장과 연관된 마커의 발현으로 평가될 수 있다.

또한, 본 발명의 손상된 조직 재생용 패치에 있어서, 손상 조직의 빠른 회복을 위하여 패치내에 약물을 적용할 수 있다. 상기 약물은 조직 재생에 관여하는 유전자, 줄기세포의 성능을 개선시키는 유전자 또는 재생 단백질을 사용할 수 있다.

특히, 상기 재생 단백질은 혈관 내피 성장 인자인 (VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, 뉴로필린 , (FGF)-1, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 에리쓰로포이에틴, BMP-2,BMP-4, BMP-7, TGF-베타 , IGF-1, 오스테오폰틴, 플레이오트로핀, 액티빈, 엔도쎌린-1으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 혈관 내피 성장 인자는 독립적으로 또는 서로 조합되어 작용할 수 있는데, 조합 시 혈관신생인자는 상승적으로 작용하여 별도의 개개 인자의 효과의 총합보다 효과가 크다.

이와 같이 약물을 지지체 내에 시딩하여 약물 전달이 가능한 바, 조직 재생효과를 극대화 시킬 수 있으며, 특히 재생 기간 동안 서서히 방출 시킴으로써 효과를 높힐 수 있다.

본 발명의 손상된 조직 재생용 패치는, 손상된 조직이 존재하여 세포전달이 요구되는 대부분의 장기에 직접 부착하여 조직 재생이 가능하며, 패치 형태로 부착 가능한 장기이면 어느 장기이든 가능하다. 특히 손상된 조직이 존재하는 심장 또는 간에 부착하여 손상된 조직을 재생시킬 수 있다.

예를 들어, 심장 줄기세포가 함유된 패치를 심장에 부착시킬 경우 심장 줄기세포는 심근세포로 분화되며 이식 세포는 심근세포가 손상된 주변 심근경색 부위 등 주변 심장조직으로 이동하여 손상된 조직을 재생 가능하다.

본 발명의 손상된 조직 재생용 패치에 있어서, 생분해성 고분자 재질의 다공성 삼차원 지지체는 가공성, 멸균성, 감염성의 점에서 가수분해에 의해 분해할 수 있는 합성 폴리머로 제조되는 것이 바람직하고, 특히 α 및 β-히드록시카르복실산의 가수분해성 폴리머로 제조되는게 바람직하다.

이에, 상기 생분해성 고분자는 폴리락트산(PLA), 폴리엘-락트산(PLLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactide-co-glycolide); PLGA), 폴리(카프로락톤), 디올/디애시드계 지방족 폴리에스테르, 폴리에스테르-아미드/폴리에스테르-우레탄 등의 생분해성 지방족 폴리에스테르, 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 합성 고분자를 사용하는 것이 바람직하고, 분자량이 10만 내지 35만 kD의 폴리락트산(PLA)을 사용하는 것이 더욱 바람직하고, 폴리엘-락트산(PLLA)을 사용하는 것이 가장 바람직하나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 손상된 조직 재생용 패치에 있어서, 다공성 삼차원 지지체는 전기방사법을 이용하여 세미마이크로 ∼ 나노 사이의 직경을 갖는 섬유형태로 방사하여 제작할 수 있다. 방사된 형태는 섬유가 얽힌 그물 형태를 가지며, 적당한 공극을 함유한 삼차원 지지체를 제공한다. 공극의 크기와 분포는 세포 성장을 결정짓는 매우 중요한 요소이며, 공극이 서로 연결된(inter-connecting) 구조이어야 영양액이 지지체 내부까지 고르게 침투하여 세포가 잘 성장한다.

상기 공극의 직경은 50 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하인 것이 바람직하며, 100㎛ 이상인 것이 가장 바람직하다. 이는 세포의 침투, 영양분과 노폐물의 배출이 원활히 이뤄질 수 있는 크기로 이식된 세포의 성장을 돕고 이식후 혈관이 쉽게 자라 들어올 수 있는 구조이다.

또한, 본 발명의 손상된 조직 재생용 패치에 있어서, 상기 다공성 삼차원 지지체는 90 ∼ 99%의 공극률을 보유하여 3차원 지지체를 유지함으로써 조직 재생용 세포의 성장을 향상시키는 것이 바람직하다.

이와 같은 손상된 조직 재생용 패치는, 손상된 조직이 있는 장기에 수술적인 방법으로 쉽게 부착이 가능하며, 심장 줄기세포의 경우 심근세포로 분화되어 허혈부위의 혈관생성이 늘고 이식 조직에도 혈관이 생성된다. 또한, 이식세포가 주변 심장조직으로 이동하여 심근세포가 결여된 심근경색 부위의 조직 재생에 효과가 있다.

본 발명의 손상된 조직 재생용 패치는 하기와 같은 제조방법에 의해 제조된 것을 사용할 수 있다.

생분해성 고분자를 단독 또는 혼합하여 유기용매에 용해시켜 방사액을 제조하는 단계(단계 1); 상기 고분자 용액을 전기 방사기를 이용하여 방사함과 동시에 상기 유기용매를 휘발시켜 고분자 섬유를 두께가 50 ㎛ 이상 1 cm 이하인 삼차원 구조의 네트워크 형태의 패치로 형성시키는 단계(단계 2); 및 상기 패치에 약물 또는 세포를 시딩하는 단계(단계 3).

상기 단계 1에서, 고분자 용액인 방사액을 제조하기 위해 사용되는 유기용매로는 낮은 비등점을 갖는 휘발성 유기용매이기만 하면 어느 것이라도 사용가능하며, 클로로포름, 디클로로메탄, 디메칠 포름 아미드, 디옥산, 아세톤, 테트라 하이드로퓨란, 트리플루오르에낱, 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오르 이소프필 프로판올을 사용하는 것이 바람직하며, 디클로로 메탄을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 단계 2는, 상기 방사액을 전기방사기를 이용하여 섬유를 제조하는 단계로서, 전기방사기를 이용한 방사 과정은 다음과 같다. 전압 발생장치에서 일정 전류를 흘려서 노즐과 컬렉터 사이의 전기장을 형성후 방사액 저장소에 충전되 고분자 용액을 전기장의 힘과 펌프의 압력에 의하여 방사한다. 전기 방사기의 조건은 방사거리 10∼20 cm 이며 전압 10∼20 kv, 방출속도 0.05∼0.15 ml/min 이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.

고분자 용액 방사시 컬렉터 상에 집적될 때 용매가 전부 휘발되고, 정전기적 반발력이 작용하면서 섬유와 섬유사이가 붙지 않고 각각 분리된 형태로 집적되어 세미 마이크로 ~ 나노 크기의 다양한 직경을 갖는 섬유를 제조할 수 있고, 방사된 형태는 섬유가 얽힌 그물 형태로 적당한 공극을 함유하며 두께가 50 ㎛ ∼ 1 cm 이하인 삼차원 형상을 갖도록 제조할 수 있다.

또한, 방사에 영향을 미치는 온도 및 습도, 용액의 점도, 용매의 휘발성이 각 상호간에 최적의 조건을 갖추었을 때 각각의 섬유가 분리된 형태로 집적되어 그 자체만으로도 간단히 삼차원 지지체로 제조 가능하다. 특히 휘발성이 높은 디클로로메탄과 용해도가 매우 낮은 아세톤의 공용매가 적당하다. 컬렉터에 집적된 네트워크 형태의 패치를 떼어내어 적절한 물리적 방법으로 확장하여 공극을 크게 할 수 있다.

또한, 상기 단계 2의 패치 형성단계에서 삼차원 구조의 네트워크 형태의 패치는 배향성을 갖도록 제조될 수 있다.

심장 근육은 방향성을 갖고 있고, 압력을 견뎌야 하기 때문에 일반적인 스테인레스스틸 판의 컬렉터 대신에 원통형 드럼의 컬렉터로 교체하고 회전 속도를 1000 rpm 이상으로 한다면 한 방향으로 배향된 네트워크 형태의 패치 얻을 수 있다.

상기 단계 3은, 상기 단계 2의 패치에 약물 또는 세포를 시딩하는 단계로서 사용 가능한 세포로는 조직 재생을 유도할 수 있는 줄기세포, 분화유도 가능한 세포 등이 있으며 약물로는 조직 재생에 관여하는 유전자, 줄기세포의 성능을 개선시키는 유전자, 재생 단백질 등이 있다.

상기 패치를 제조하는 과정에서 고분자 용액에 수상의 약물용액을 에멀젼 방법으로 혼합하고 혼합용액을 방사하여 적층시킴으로써 약물 함임 패치를 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 에멀젼 단계에서 생분해성 고분자 용액에 분산되는 약물은 당업계에서 알려져있는 계면활성제, 예를 들면 스판 80등을 사용하여 생분해성 고분자 용액에 치료학적 유효량으로 유화시켜 유중 수형 에멀젼 형태로 균일하게 분산시킬 수 있다.

약물이 시딩된 패치를 손상된 조직에 이식하고 수성환경에 노출되면 함유하고 있는 단백질을 방출하게 된다. 방출 초기에는 패치로부터 확산되어 방출 되고, 지지체 자체의 분해가 시작되면 그 손실된 틈으로부터 방출량이 증가된다. 방출 속도와 양상은 단백질의 농도, 유/수 비율, 적용부위 등에 따라 다양하게 조절될 수 있다.

이와 같이 전기방사법으로 제조된 본 발명의 패치는 세포의 보유, 생육성이 뛰어나고, 또한, 이 지지체를 이용해서 조직 유래의 세포 또는 전구세포를 인공환경내 및(또는) 생체내에서 배양함으로써, 생체이식 시에 염증성 세포의 침윤을 막고, 주변조직과의 적합성이 있는 생체 본래의 조직에 가까운 성질을 가지는 3차원 세포 결합체를 제작하는 것이 가능해진다.

또한, 본 발명의 손상된 조직 재생용 패치에 있어서, 본 발명의 패치는 두께를 적절히 설정하고, 환부를 보충하기 위해 필요한 사이즈로 할 수 있다. 본 발명의 패치 두께는 50 ㎛ 내지 1 cm인 것이 바람직하며. 심장에 적용할 경우에는 1 내지 3 mm의 두께인 것이 바람직하다. 상기 지지체의 형상 및 면적에 대해서는 특별히 한정은 없고, 허혈부위를 덮기 위해 충분한 사이즈의 것을 제조할 수 있다.

나아가, 종래 삼차원 지지체들의 경우 스폰지 형태로 제조되는 바 손상된 조직에 부착시 원상태로 회복되는 성질로 인하여 부착력이 저하되었으나, 본 발명에 따른 패치는 다공성 삼차원 지지체각 섬유 형태인 바 손상된 부위에 대한 부착력이 우수하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 줄기세포가 함유된 섬유형 다공성 삼차원 지지체 패치 제조 1

1) 섬유형 다공성 삼차원 지지체 패치의 제조

폴리엘-락트산(PLLA)를 디클로로메탄/아세톤(아세톤 부피비 10%~40%, 정확히 실험한 부피비 20%)의 용매에 녹여 고분자의 농도가 14~20% (정확히 실험한 농도 15%)가 되도록 용액을 제조하였다.

Chungpa EMT사(한국)에서 제조한 전기방사기인 DH High Voltage Generator(모델명 CPS-40KO3VIT)를 이용하여, 0.06 ml/min의 용액 방출속도, 10 kv의 전압, 전기장의 거리는 15 cm 의 조건으로 전기방사 하였다. 스테인레스스틸 판 컬렉터 상에 섬유가 집적되기 전에 용매가 전부 휘발되도록 15∼25 ℃, 습도 10∼40 %의 조건에서 전기방사법으로 섬유의 굵기가 직경 약 7μm , 두께 약 300μm의 섬유형 네트워크 형태의 패치를 제작하고, 이후 물리적 확장으로 공극을 확대하여 두께를 1 mm의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치를 제작하였다(도 1).

2) 심장 줄기세포의 시딩

제작한 섬유 다공성 삼차원 지지체 패치에 심장 줄기세포를 시딩하기 위하여, 70% 에탄올로 소독한 후 버퍼로 세척과정을 거쳤다. 남아있는 수분을 모두 제거한 후 1×10⁶∼1×10⁸ 개(본 실시예에서는 5×10⁶을 사용)의 심장 줄기세포가 부유된 배지를 지지체에 삽입 후 한 시간 이상 부착하였다. 이후 배지에서 37˚C, 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양하여 세포 부착을 안정화 시켰다. 세포는 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 1% 페니실린, 10% 우태아 혈청, 10 ng/㎖ 인간 EGF를 첨가하여 제조한 배지를 각각 사용하여 5% 탄산가스 농도 하에서 37℃ 포화 습도에서 배양하였다.

실시예 2 : 줄기세포가 함유된 섬유형 다공성 삼차원 지지체 패치 제조 2

컬렉터를 스테인레스스틸 판에서 원통형 드럼으로 교체하고 회전 속도를 2000 rpm으로하여 한 방향으로 배향된 섬유형 네트워크 형태의 패치를 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 줄기세포가 함유된 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치를 제작하였다(도 2).

비교예 1 : 세포가 이식되지 않은 패치

실시예 1에서의 1)과 동일한 방법을 이용하여, 심장 줄기세포를 시딩하지 않은 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치를 사용하였다.

실험예 1 : 심장 줄기세포 부착 실험

48시간 동안 세포부착을 안정화시킨 상기 실시예 1 및 실시예 2의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치의 세포 부착 여부를 관찰하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

부착되지 않은 세포를 세척하여 제거하고 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 20분간 고정하였다. 고정 후 시료는 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올로 순차적으로 각각 10분간 탈수시키고 완전히 진공 건조하였다. 이후 시료를 금으로 코팅하였다.

이를 시차 주사현미경으로 관찰한 결과를 도 3에 나타내었다. 제조된 지지체에 세포가 잘 부착되어 있음을 알 수 있고, 실시예 2의 배향성을 갖는 지지체에 대해서는 배향성을 갖는 섬유를 따라 세포의 배향을 확인 할 수 있었다(도 3의 (b)).

또한, 세포가 고밀도로 시딩 되었음을 확인하기 위하여 48시간 동안 세포부착을 안정화시킨 후, 실시예 2에서 얻어진 삼차원 지지체-세포 집합체를 버퍼로 세척하고 3.7% 포름알데히드 용액으로 하루 고정하였다. 파라핀 포메 후 4 μm 두께의 슬라이드를 제작하고 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색하여 현미경으로 관찰 하였다(도 4).

가로 절단면의 사진에서 세포가 고밀도로 시딩된 것을 확인 할 수 있고(도 4의 (a)), 단면의 사진에서는 세포가 외부에 뿐만 아니라 내부에도 고밀도로 존재함을 알 수 있다(도 4의 (b)). 이는 제조된 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치의 경우 공극의 크기가 크기 때문에 줄기세포의 내부로의 침투가 수월하기 때문이다.

실험예 2 : 체외 세포 증식 관찰

실시예 1 및 실시예 2에서 제조된 줄기 세포가 시딩된 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치를 증식배지 조성하에서 2주간 배양하면서 1일, 4일, 7일 및 14일 동안 정해진 날짜에 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석을 통하여 세포수를 측정하였다(도 5). 도 5에 나타낸 바와 같이, 랜덤하게 방사된 비배향성 패치(실시예 1)와 배향성 패치(실시예 2) 모두 세포증식능력이 뛰어남을 확인하였다.

실험예 3 : 체외 세포 분화 관찰

실시예 1에서 제조된 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 증식배지 조성 및 심장 세포 분화배지 조성에서 체외에서 2주간 배양하였다. 이후 심장세포로 분화를 관찰하기 위하여 파라핀으로 고정하고, 세로로 슬라이드를 제작하여 H&E로 염색하고 이미지를 얻었다(도 6).

특정 방향으로 세포의 배향성을 관찰 할 수 있었고, 해당 세포에서 심근세포 수축에 관여하는 근절(sarcomere) 단백질인 α-사르코어 엑티닌(α-sarcomeric actinin,aSA), 미오신 중사슬(myosin heavy chain ,MHC) 및 트로포닌-T(troponin-T, TnT)의 발현을 확인할 수 있었다.

분화배지에서 배양한 패치에서의 분화정도가 높았고, 증식배지에서 배양한 경우도 심근 세포로의 분화가 확인되었다. 이는 심장에 존재하는 줄기세포를 사용함으로써 나타나는 결과라고 판단된다.

실험예 4: 정상 이식을 통한 조직 융합 및 염증반응 관찰

Sprague-Dawley rats (8-9주)를 이소퓨란(Isofurane)으로 마취하였다. 마취된 쥐는 양압 호흡법(ventilated under positive pressure)로 호흡을 유지하였다. 줄기세포가 시딩된 다공성 참차원 지지체를 이용한 패치의 안정성을 관찰하기 위하여 정상 심장조직의 외심막(epicardium) 표면에 실시예 1에서 제조된 패치를 이식하고 4일후 평가를 진행하였다. H&E 염색 후 조직과의 융합 정도 및 염증 반응 정도를 도 7에 나타내었다.

도 7의 영역 P(Periphery)에서 원으로 표시된 부분은 혈관을 나타내는데, 이로서 패치 내로 혈관의 성장이 이루어진 것을 알 수 있다. 즉, 패치와 심장조직의 융합이 잘 이루어진 것을 확인할 수 있다. 또한, 세포 분화와 관련하여 정상 심장조직과 패치의 경계면(도 7의 영역 I) 및 주변부(도 7의 영역 P)에서 조직 형성이 관찰되므로 심근 세포와도 융합된 것을 관찰할 수 있다.

실험예 5 : 질병 모델에서 심장 줄기세포가 시딩된 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치 이식을 통한 심장 기능 개선 분석 1

1) 질병모델( myocardial infraction , MI model ) 제조

Sprague-Dawley rats(8-9주)를 이소퓨란(Isofurane)으로 마취하였다. 마취된 쥐는 양압 호흡법(ventilated under positive pressure)으로 호흡을 유지하였다. 왼쪽 갈비뼈 두 번째와 세 번째 사이를 개흉술하였다. 심막을 잘라서 흉곽의 압력에 의해 심장이 외부로 나오게 한 후 좌측 관상 동맥(left coronary artery)을 7-0 플라스틱제 봉합사(prolene)로 묶어 결찰하고 심근경색을 유도하였다.

좌전하행지(Left Anterior Descending, LAD) 결찰(ligation)을 시행하고 허혈부위의 생성을 확인 후, 바로 10x10 mm 크기의 실시예 1의 줄기세포가 시딩된 패치와 비교예 1의 세포가 시딩되지 않은 패치를 7-0 silk로 각각 외심막 표면(epicardial surface)의 경색이 유도된 심근부분(infarcted myocardium zone)과 경색 경계 부분(infarction border zone) 에 부착하였다. 상처가 난 바로 직후 실시예 1과 비교예 1의 패치는 좌심실 전벽(anterior wall of left ventricle)에 이식하였으며, 이식하고 14일 째 희생하고 심장 조직을 10% 버퍼 포름알데하이드(buffered formaldehyde)로 고정하여 파라핀 섹션(paraffin sections)하여 관찰하였다.

도 8의 (a)는 심근경색 부분에 실시예 1의 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식한 직후의 사진을 나타내었고 (b)는 14일 후 조직사진을 나타내었다. (c)는 심근경색 부분에 비교예 1의 줄기세포가 시딩되지 않은 패치를 이식한 직후의 사진을 나타내었고 (d)는 14일 후 조직사진을 나타내었다.

2) 심장기능 개선 결과 분석

(1) 상기 1)에서 제조한 조직을 슬라이드로 제작하여 H&E(hematoxylin and eosin)로 염색하였다(도 9). 관상동맥 결찰(Coronary artery ligation) 14일 후 심근 경색은 성공적으로 유도된 것을 확인하였으며 심근경색 결과 심근소실과 심장의 확장을 관찰할 수 있었다.

도 9에 나타낸 바와 같이 실시예 1 및 비교예 1의 패치는 좌심실 전벽(LV anterior wall)과 융합이 완벽히 이루어진 것을 알 수 있다. 또한, 실시예 1의 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식한 경우(도 9의 (a)) 이식한 패치의 형태가 잘 유지되고, 심장의 좌심실 전벽 두께(LV anterior wall thickness)는 세포 없는 패치를 이식한 비교예 1의 심장보다 두꺼워져 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 실시예 1의 패치를 이식한 심장은 이후 좌심실 팽창(LV dilatation)이 적었으며, 심근의 재생(하얀색 화살표 부위)이 저명하게 관찰되었다.

(2) 상기 1)에 따라 14일 후 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식한 조직을 심근특이 항체로 염색하고 플루오레신 아이소티오사이아네이트 결합된(fluorescein isothiocyanate-conjugated) 이차항체로 염색하였다. 이들은 심근세포 수축에 관여하는 근절(sarcomere) 단백질인 α-사르코어 엑티닌(α-sarcomeric actinin, aSA)과 트로포닌-T(troponin-T, TnT) 심근세포 마커를 나타낸다.

도 10 (a)는 aSA 면역 염색한 사진을 나타내었고 (b)는 DAPI로 표지된 모든 핵을 나타내었다. 도 10의 (c)는 (a) 와 (b)를 중첩시킨 결과로서 패치를 조직에 이식하고 14일 후 패치 내 줄기세포들이 aSA 심근세포로 분화한 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 11 (a)는 TnT 면역 염색한 사진을 나타내었고 (b)는 DAPI로 표지된 모든 핵을 나타내었다. 도 11의 (c)는 (a) 와 (b)를 중첩시킨 결과로서 패치를 조직에 이식하고 14일 후 패치 내 줄기세포들이 TnT 심근세포로 분화한 것을 확인할 수 있다.

(3) 평활근 알파 액틴(smooth muscle alpha actin, SMA)과 CD34 면역염색을 통해 이식 14일 후 실시예 1의 패치를 이식한 허헐 부위에서 혈관 생성이 증가한 것을 확인할 수 있다.

도 12 (a)는 SMA 면역 염색시킨 소동맥/정맥 사진이고 (b)는 DAPI로 표지된 모든 핵을 나타내었다. 도 12의 (c)는 (a) 와 (b)를 중첩시킨 결과로 이식 조직인 패치 내에도 소동맥/정맥이 성장하여 형성된 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 13 (a)는 모세혈관을 CD34 면역 염색 시킨 것이고 (b)는 DAPI로 표지된 모든 핵을 나타내었다. 도 13의 (c)는 (a) 와 (b)를 중첩시킨 결과로서 이식 조직인 패치 내에도 모세혈관이 성장하여 형성된 것을 확인할 수 있다.

(4) 이식 후 세포의 생존과 진행을 추적하기 위하여, 세포 수집 때 붉은색 형광 표지체인 DiI로 세포를 표지하였으며, 대략 10⁶개의 세포를 패치에 이식하여 심장의 경색 부위에 이식하였다. 이식 후 줄기 세포의 생존 여부는 사후 DiI를 형광 현미경을 통하여 측정하였다. 도 14및 15은 이식 14일 후 심근 경색 쥐의 심근층에서 이식된 심장 줄기세포의 위치를 보여주는 일련의 현미경 사진이다.

도 14는 이식 14일 후 패치와 심장 조직의 전체적인 저배율 사진으로서 도 14의 (a)는 이식된 DiI-표지 심장 줄기세포가 붉은색 형광으로 나타낸 사진이며 (b)는 핵의 DAPI 염색한 사진이다. (c)는 (a) 와 (b)를 중첩시킨 사진으로서 패치 내에 DiI 양성인 세포 집합체가 관찰된다. 이로서 줄기 세포가 장기간 패치 내에 생존해 있고, 이들이 심근 안쪽으로 이동하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 15는 이식 14일 후 심근 경색 쥐의 심근층에서 이식된 심장 줄기 세포의 위치를 보여주는 심근조직의 고배율 현미경 사진으로서, 위쪽은 부착한 패치부분이며 아래로 내려갈수록 심근 안쪽을 나타낸다. (a)의 붉은색 형광은 DiI-표지 심장 줄기세포를 나타내고 (b)의 파란색 형광은 DAPI로 표지된 핵을 나타내며, (c)는 (a)와 (b)를 중첩시킨 사진으로서, DiI로 표지된 줄기세포는 심근층 내부 부위와 심근 세포가 결여된 심근 경색 부위에서도 발견된 것을 확인하여 이식 세포가 주변 심장 조직으로 이동하는 것을 확인하였다.

실험예 6 : 질병 모델에서 심장 줄기세포가 시딩된 다공성 삼차원 지지체를 이용한 패치 이식을 통한 심장 기능 개선 분석 2

1) 질병모델( myocardial infraction , MI model ) 제조

실시예 1과 비교예 1의 패치를 좌심실 전벽(anterior wall of left ventricle)에 이식 후, 28일 째 희생한 것을 제외하고는 실험예 5의 1)과 동일하게 질병모델을 제조하였다.

2) 심장기능 개선 결과 분석

(1) 상기 1)에서 제조한 조직을 슬라이드로 제작하여 H&E(hematoxylin and eosin)로 염색하였다(도 16). 관상동맥 결찰(Coronary artery ligation) 28일 후 심근 경색은 성공적으로 유도된 것을 확인하였으며 심근경색 결과 심근소실과 심장의 확장을 관찰할 수 있었다.

도 16에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식한 경우 이식한 패치의 형태가 잘 유지되고, 심장의 좌심실 전벽 두께(LV anterior wall thickness)는 세포 없는 패치를 이식한 비교예 1의 심장보다 두꺼워져 있는 것을 확인할 수 있다. 또한 실시예 1의 패치를 이식한 심장은 이후 좌심실 팽창(LV dilatation)이 적었으며, 심근의 재생(화살표 부위)이 저명하게 관찰되었다(도 16).

(2) 상기 1)에 따라 28일 후 실시예 1 및 비교예 1의 패치가 이식된 조직의 섬유화 면적 및 심장 두께를 측정하였다. 실시예 1의 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식한 경우 섬유화 면적(fibrotic area)이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있다(도 17의 (a)). 또한, 실시예 1의 심장 줄기세포가 시딩된 패치를 이식한 경우 좌심실 전벽 두께(LV anterior wall thickness)는 세포 없는 패치를 이식한 비교예 1의 심장보다 두꺼워져 있는 것을 확인할 수 있다(도 17의 (b)).

Claims (11)

1. 손상된 조직의 재생용 세포 또는 약물이 지지체 내에 시딩되어 있고, 상기 손상된 조직이 존재하는 장기에 직접 부착이 가능한, 생분해성 고분자 재질의 섬유형 다공성 삼차원 지지체를 포함하여 구성되는 손상된 조직 재생용 패치.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 약물은 조직 재생에 관여하는 유전자, 줄기세포의 성능을 개선시키는 유전자 또는 재생 단백질인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 재생 단백질은 혈관 내피 성장 인자인 (VEGF)-A, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, 뉴로필린, (FGF)-1, FGF-2 (bFGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, 안지오포이에틴 1, 안지오포이에틴 2, 에리쓰로포이에틴, BMP-2,BMP-4, BMP-7, TGF-베타 , IGF-1, 오스테오폰틴, 플레이오트로핀, 액티빈, 엔도쎌린-1으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 장기는 조직 재생을 위한 세포전달이 요구되고 패치의 부착이 가능한 장기인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 장기는 심장 또는 간인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리엘-락트산(PLLA), 폴리(D,L-락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactide-co-glycolide); PLGA), 폴리(카프로락톤), 디올/디애시드계 지방족 폴리에스테르, 폴리에스테르-아미드/폴리에스테르-우레탄 등의 생분해성 지방족 폴리에스테르와 폴리(발레로락톤), 폴리(하이드록시부티레이트) 및 폴리(하이드록시 발러레이트)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 합성 고분자인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다공성 삼차원 지지체는 공극의 직경이 50 ㎛ 이상 300 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 다공성 삼차원 지지체는 90~99%의 공극률을 보유하여 3차원 지지체를 유지함으로써 조직 재생용 세포의 성장을 향상시키는 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
   
10. 제1항에 있어서, 상기 섬유형 다공성 삼차원 지지체는 생분해성 고분자를 단독 또는 혼합하여 유기용매에 용해시켜 방사액을 제조하는 단계(단계 1);
    상기 고분자 용액을 전기 방사기를 이용하여 방사함과 동시에 상기 유기용매를 휘발시켜 고분자 섬유를 두께가 50 ㎛ 이상 1 cm 이하인 삼차원 구조의 네트워크 형태의 패치로 형성시키는 단계(단계 2); 및
    상기 패치에 약물 또는 세포를 시딩하는 단계(단계 3)로 제조되는 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 패치는 두께가 50 ㎛ 이상 1 cm 이하인 것을 특징으로 하는 손상된 조직 재생용 패치.
    

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