KR20240054878A - 3d 심장 세포 스페로이드 - Google Patents
3d 심장 세포 스페로이드 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240054878A KR20240054878A KR1020230125687A KR20230125687A KR20240054878A KR 20240054878 A KR20240054878 A KR 20240054878A KR 1020230125687 A KR1020230125687 A KR 1020230125687A KR 20230125687 A KR20230125687 A KR 20230125687A KR 20240054878 A KR20240054878 A KR 20240054878A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell
- cardiac
- spheroid
- cardiomyocytes
- cells
- Prior art date
Links
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 title claims description 5
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 title description 21
- 210000001054 cardiac fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 144
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 139
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 108
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 59
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000009787 cardiac fibrosis Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 111
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 26
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 14
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 11
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 11
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 claims description 10
- 102100025323 Integrin alpha-1 Human genes 0.000 claims description 8
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 claims description 8
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 7
- 101000584590 Homo sapiens Receptor activity-modifying protein 2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102100030696 Receptor activity-modifying protein 2 Human genes 0.000 claims description 6
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 5
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 claims description 5
- 101000803709 Homo sapiens Vitronectin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091008803 APLNR Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016555 Apelin receptors Human genes 0.000 claims description 4
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 claims description 4
- 102100028726 Bone morphogenetic protein 10 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 claims description 4
- 102100033553 Delta-like protein 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 101000695367 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 10 Proteins 0.000 claims description 4
- 101000872077 Homo sapiens Delta-like protein 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001078158 Homo sapiens Integrin alpha-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 101001094868 Homo sapiens Plexin-D1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102000048238 Neuregulin-1 Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100035380 Plexin-D1 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 claims description 4
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 208000006029 Cardiomegaly Diseases 0.000 claims description 2
- 201000006306 Cor pulmonale Diseases 0.000 claims description 2
- 102000019149 MAP kinase activity proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108040008097 MAP kinase activity proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 208000004186 Pulmonary Heart Disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010053648 Vascular occlusion Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 208000021331 vascular occlusion disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000003663 ventricular fibrillation Diseases 0.000 claims description 2
- 102000012335 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Human genes 0.000 claims 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 1
- 208000018578 heart valve disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 28
- 230000004217 heart function Effects 0.000 abstract description 19
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 abstract description 12
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 24
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 17
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 15
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 13
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 12
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 9
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 9
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 9
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 8
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 6
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 6
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 6
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 5
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 4
- 102100021337 Gap junction alpha-1 protein Human genes 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108010041341 Integrin alpha1 Proteins 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 4
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000002660 stem cell treatment Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- -1 taffy Polymers 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 3
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 3
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 3
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 3
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- 101100173617 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) FGM3 gene Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 2
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 2
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 2
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006491 Acacia senegal Nutrition 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102100033601 Collagen alpha-1(I) chain Human genes 0.000 description 1
- 102100031611 Collagen alpha-1(III) chain Human genes 0.000 description 1
- 244000180278 Copernicia prunifera Species 0.000 description 1
- 235000010919 Copernicia prunifera Nutrition 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100021083 Forkhead box protein C2 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000993285 Homo sapiens Collagen alpha-1(III) chain Proteins 0.000 description 1
- 101000818305 Homo sapiens Forkhead box protein C2 Proteins 0.000 description 1
- 101000894966 Homo sapiens Gap junction alpha-1 protein Proteins 0.000 description 1
- 101001013150 Homo sapiens Interstitial collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101000972489 Homo sapiens Laminin subunit alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 102100022746 Laminin subunit alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 101150018665 MAPK3 gene Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000881 Modified starch Polymers 0.000 description 1
- 208000021908 Myocardial disease Diseases 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 229920000463 Poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 201000001068 Prinzmetal angina Diseases 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 208000007718 Stable Angina Diseases 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 1
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 1
- 102100026893 Troponin T, cardiac muscle Human genes 0.000 description 1
- 101710165323 Troponin T, cardiac muscle Proteins 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229940023476 agar Drugs 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 108010029483 alpha 1 Chain Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- SNAAJJQQZSMGQD-UHFFFAOYSA-N aluminum magnesium Chemical compound [Mg].[Al] SNAAJJQQZSMGQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003510 anti-fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 1
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 1
- FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L calcium hydrogenphosphate Chemical compound [Ca+2].OP([O-])([O-])=O FUFJGUQYACFECW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000347 cyanoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000019700 dicalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 1
- 238000002592 echocardiography Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000014818 extracellular matrix organization Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000011087 fumaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000000174 gluconic acid Substances 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000012835 hanging drop method Methods 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007654 ischemic lesion Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N n-propan-2-ylprop-2-enamide Chemical compound CC(C)NC(=O)C=C QNILTEGFHQSKFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000002745 poly(ortho ester) Substances 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005594 polymer fiber Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006509 positive regulation of blood vessel endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000012587 positive regulation of cell migration involved in sprouting angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 229920003124 powdered cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019814 powdered cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000002235 sarcomere Anatomy 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 238000000807 solvent casting Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002145 thermally induced phase separation Methods 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/34—Muscles; Smooth muscle cells; Heart; Cardiac stem cells; Myoblasts; Myocytes; Cardiomyocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/069—Vascular Endothelial cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 역할이 다른 복합세포를 활용하여 세포간 상호작용을 극대화시킨 3D 심장 세포 스페로이드에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면, 심근세포와 기질세포를 이용하여 제조한 3D 심장 세포 스페로이드의 대량 생산이 가능하며, 3D 심장 세포 스페로이드들 중 특히, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포로 이루어진 3D 심장 세포 스페로이드가 단일 심근세포로 이루어진 스페로이드에 비해 조직재생능 및 이식 특성이 우수하고, 높은 수준으로 동기화된 박동성을 나타내며, 이식 영역이 넓고, in vivo에서도 심기능을 개선시키고 심장 섬유화를 억제하며 이식 세포의 생착이 우수하여 조직 재생을 촉진하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 역할이 다른 복합세포를 활용하여 세포간 상호작용을 극대화시킨 3D 심장 세포 스페로이드에 관한 것이다.
허혈성 심장질환(Ischemic heart disease)은 심장에 혈액을 공급해주는 혈관(관상동맥)이 좁아져 심장 근육의 일부에 혈액 공급이 부족하여 발생하는 질환이다. 혈액 공급이 부족하여 심장에 필요한 산소와 영양소가 제대로 공급되지 않게 되어 심장에 이상이 생기는 것이 특징이며, 허혈성 심장질환의 종류로는 안정성 협심증(Stable angina), 불안정성 협심증(Unstable angina), 이형 협심증(Variant angina), 급성 심근경색증(Acute myocardial infarction) 등이 있다. 심근 경색증 (Myocardial infarction, MI)은 심근 세포(cardiomyocytes, CM)의 괴사와 섬유화 조직 형성으로 인해 영구적인 손실을 초래하는 치명적인 질환으로 심부전으로 인한 심장 기능에 돌이킬 수 없는 손상을 초래한다. 허혈성 심장질환의 치료방법으로 기질적 협착에 의한 질환을 막기위해 심근의 산소 소모를 감소하는 약물을 사용하거나, 연축을 억제하는 약물을 사용하여 기능적 연축에 의한 질환을 감소시키는 방법이 있으나, 혈액 공급의 부족으로 이미 괴사한 조직에 대해서는 약물의 효과가 없어 새로운 허혈성 심장질환의 치료 방법이 필요한 실정이다. 또한, 심장은 심근과 혈관으로 구성된 기관이기 때문에 심근경색증 후에는 심근과 혈관 구조가 모두 심하게 손상되므로, 심근경색증의 성공적인 치료전략은 완전한 심장기능 회복을 달성하기 위해 심근과 혈관을 동시에 재생시키는데 초점을 맞추어야 한다.
줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제 (Cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 줄기세포 치료제는 이 중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게는 잘 이루어지지 않는 경우에서 활발하게 개발이 진행되고 있다. 최근 줄기세포 치료제와 관련하여, 신경질환, 심장질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게 회복이 진행되지 않는 경우에 대한 세포 및 조직의 기능을 복원시키는 것이 가능해졌고, 이와 관련된 추가적인 연구가 활발하게 진행되고 있다 (Segers, Vincent FM, and Richard T. Lee. Nature 451.7181 (2008): 937-942.). 허혈성 질환 또한 지방, 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포 치료제가 사용될 수 있고, 혈관을 재생시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, 현재 심장의 재생은 현재의 의료 옵션으로는 불가능한 것으로 간주되지만 축적된 증거 동물 모델 및 임상 시험에서 줄기세포가 심근 경색 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있음이 연구되고 있다. 지방, 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포치료제가 허혈성 질환 치료에 사용될 수 있고, 혈관을 재생시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 경우 줄기세포를 2차원 배양접시에서 배양하고, 부착되어 있는 배양한 세포를 트립신 처리에 의해 수거한 후 수거된 세포를 단일 세포(single cell)의 형태로 환자의 허혈성 병변부위에 이식하는 방법이 일반적으로 사용된다. Stamm C, Westphal B, et al., Lancet (2003년)에는 골수 유래 줄기세포를 배양하지 않고 또는 2차원적 배양접시에서 배양하여 단일 세포 형태로 허혈성 심근 질환 부위에 이식함으로써 심장 기능 회복 및 조직 재생의 효율을 높이는 내용을 보고하였다. 또한, 인간 배아 줄기세포(hESCs)와 인간 유도 만능줄기세포(hiPSC)를 모두 포함하는 인간만능줄기세포(human pluripotent stem cell, hPSC-CMs)에서 유래된 심근세포는 인간의 심장을 구성하는 심근세포와 유사하여, 심근경색증 동물모델에서 시행한 전임상 열구 결과에 따르면 이식한 hPSC-CMs은 숙주의 심근과 정렬, 결합 및 동기화하여 심장기능을 성공적으로 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
이와 같이, 줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 허혈부위에 이식된 줄기세포의 대부분은 사멸되어 세포치료제의 치료효능이 크지 않은 문제점이 있어왔다. 특히 트립신 처리를 통해 수거된 세포들은 트립신에 의해 세포가 해를 받거나, 세포에 붙어있는 세포외기질(extracellular matrix)가 트립신 효소에 의해 세포로부터 이탈되어, 세포외기질에 포함된 성분들이 소실되어 환자에 이식 후 세포 생존율이 낮아진다. 임상시험 결과들을 살펴보면 약 2~4%의 심구혈률 개선으로 미흡한 효과를 보여주고 중간엽 줄기세포는 그 태생적인 한계로서 (Stem cell hierarchy) 특정한 환경에서 운명이 정해진 세포로만 분화가 가능하기 때문에 기대와는 다르게 소실된 심근세포의 대체가 사실상 어려운 것으로 보고되었다. 또한, 심근경색 발생 직후 심근세포의 25% 가량이 단시간에 사멸하지만, 분화가 끝난 성체의 심근세포는 세포주기가 정지되어 있고, 발생 초기 이배성(Diploid) 핵형에서 4n 이상의 다배수(Polyploid) 핵형을 이루기 때문에 세포 분열이 어려우며, 심장 내 심장전구세포의 존재와 재생 측면에서의 역할이 모호하여, 내재적 심장전구세포의 활성화를 통해 심근세포를 단기간에 증가시키는 전략은 현실적으로 어려움이 있는 실정이다. 심근세포를 기반으로 한 치료시도는 허혈 손상 등으로 인한 척박한 심장내 미세환경을 극복하지 못하며, 활발히 분열하거나(Proliferation) 제한된 세포의 이동(Migration)능을 가진 심근세포의 특성상 효과적인 체내 이식이 이루어지지 못하고, 미성숙한 특성을 가진 만능줄기세포 유래 심근세포의 이식으로 인한 부정맥 유발의 가능성 등으로 인해 임상적용의 큰 어려움이 있어왔다. 아울러, 2차원 배양접시를 이용한 세포 배양은 대량 배양이 어려워 많은 수의 세포가 요구되는 임상 치료에 적합하지 않아 세포치료제의 임상 적용에 어려움이 있었다.
본 발명의 목적은 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 3D 심장 세포 스페로이드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 심근 재생용 세포 치료제 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 조직공학용 지지체를 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 3D 심장 세포 스페로이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드를 포함하는 심근 재생용 세포 치료제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 심근세포와 기질세포를 이용하여 제조한 3D 심장 세포 스페로이드의 대량 생산이 가능하며, 3D 심장 세포 스페로이드들 중 특히, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포로 이루어진 3D 심장 세포 스페로이드가 단일 심근세포로 이루어진 스페로이드에 비해 조직재생능 및 이식 특성이 우수하고, 높은 수준으로 동기화된 박동성을 나타내며, 이식 영역이 넓고, in vivo에서도 심기능을 개선시키고 심장 섬유화를 억제하며 이식 세포의 생착이 우수하여 조직 재생을 촉진하는 효과가 있다.
도 1은 유도만능줄기세포로부터 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포의 분화를 확인한 도이다:
CM: 심근세포;
EC: 혈관내피세포; 및
CF: 심장섬유아세포.
도 2는 세포 조합별 복합-세포 심장 스페로이드의 형성 양상을 나타낸 도이다:
CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF); 및
CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF).
도 3은 세포 조합별 복합-세포 심장 스페로이드의 최종 크기를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 방법으로 제작된 iPSC-유래 삼중 세포 심장 스페로이드의 형성을 나타낸 도이다.
도 5는 종래의 방법으로 복합 세포 스페로이드 형성시 발생하는 비정상적 세포 융합을 나타낸 도이다.
도 6은 세포 조합별 스페로이드내 포함되어 있는 심근세포의 구조적 상태를 나타낸 도이다.
도 7은 세포 조합별 스페로이드의 박동성을 분석한 도이다.
도 8은 CM+EC 조합의 스페로이드 및 CM+CF 조합의 스페로이드에서 관찰된 이상 박동 현상을 나타낸 도이다.
도 9는 세포 조합별 스페로이드를 분주(plating)하였을 때 이식 형성 양상을 나타낸 도이다:
CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF); 및
CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF).
도 10은 삼중 세포 심장 스페로이드의 분주 후 배양 초기의 CF 이동 및 CM 확장을 나타낸 도이다.
도 11은 collagen matrix 환경 및 배양 첨가제가 제한된 환경으로 심근경색 이후 심화된 심장섬유화 상황을 모사한 체외배양 환경에서 세포 조합별 스페로이드 (CM, CM+EC 및 CM+EC+CF)의 이식 형성 양상을 나타낸 도이다.
도 12는 이식 형성 과정에서 스페로이드를 구성하는 세포별로 동역학(Dynamics)을 확인한 도이다:
RFP: CM;
Cyan: EC; 및
GFP: CF.
도 13은 MEA 분석을 통해 세포 조합별 스페로이드 (CS-M, CS-ME, CS-MF 및 CS-MEF)의 박동성 활성 여부(Active electrodes) 및 강도(Spike amplitude)를 정상 배양 환경과, 심근경색 이후 상황을 가정하여 세포 배양 첨가제를 감소시킨 환경 (25%)에서 비교 분석한 도이다:
3D-CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
3D-CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
3D-CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF); 및
3D-CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF).
도 14는 MEA 분석을 통해 세포 조합별 스페로이드 CS-M, CS-ME, CS-MF, CS-MEF)의 Field potential 동기화 여부를 정상 배양환경과, 심근경색 이후 상황을 가정하여 세포 배양 첨가제를 감소시킨 환경 (25%)에서 비교 분석한 도이다:
3D-CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
3D-CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
3D-CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF);
3D-CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF);
Spike within bursts (%) : 박동 동기화 정도; 및
Interspike intervals (ms) : 1회 박동시 구성 세포간 박동 간격.
도 15는 CM+CF 조합의 스페로이드 및 CM+EC+CF 조합의 스페로이드 그룹 간 이식 형성 속도를 비교한 도이다:
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드.
도 16은 EC의 포함 여부에 따른 Collagen matrix 내부로의 심근세포 (RFP 표지)의 침투 가속화를 확인한 도이다.
도 17은 스페로이드 형성시 세포의 조합에 따른 영향 인자 및 특이적 전사체를 RNA 시퀀싱하여 GO & KEGG 분석한 도이다.
도 18은 스페로이드 형성시 세포의 조합에 따른 영향 인자인 Integrin α1, MMP1 및 ERK1/2의 발현을 나타낸 도이다.
도 19는 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 후 8주(8W) 간의 심장 기능 추적 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 후 초기 심장 기능 개선 효과를 확인한 도이다.
도 21은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실의 혈역학적 압력과 부피를 측정한 도이다.
도 22는 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실 내 섬유화 진행을 Masson's trichrome stain로 평가한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 23은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실 내 혈관 (CD31)의 보존 또는 증진 정도를 면역형광염색으로 확인한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 24는 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실내 잔존 심근세포 (cTNT) 및 섬유화 심화 (CHP) 정도를 면역형광염색으로 확인한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 25는 심근경색 질환 동물모델의 경색 영역내 이식한 스페로이드를 통해 생착된 인간 심근세포 (RFP, iPSC-CM)의 수 및 조직내 성숙정도 (CX43)를 확인한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 26은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 후 조직내 심근세포의 증식 (Ki67) 촉진 효과를 확인한 도이다.
CM: 심근세포;
EC: 혈관내피세포; 및
CF: 심장섬유아세포.
도 2는 세포 조합별 복합-세포 심장 스페로이드의 형성 양상을 나타낸 도이다:
CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF); 및
CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF).
도 3은 세포 조합별 복합-세포 심장 스페로이드의 최종 크기를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 방법으로 제작된 iPSC-유래 삼중 세포 심장 스페로이드의 형성을 나타낸 도이다.
도 5는 종래의 방법으로 복합 세포 스페로이드 형성시 발생하는 비정상적 세포 융합을 나타낸 도이다.
도 6은 세포 조합별 스페로이드내 포함되어 있는 심근세포의 구조적 상태를 나타낸 도이다.
도 7은 세포 조합별 스페로이드의 박동성을 분석한 도이다.
도 8은 CM+EC 조합의 스페로이드 및 CM+CF 조합의 스페로이드에서 관찰된 이상 박동 현상을 나타낸 도이다.
도 9는 세포 조합별 스페로이드를 분주(plating)하였을 때 이식 형성 양상을 나타낸 도이다:
CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF); 및
CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF).
도 10은 삼중 세포 심장 스페로이드의 분주 후 배양 초기의 CF 이동 및 CM 확장을 나타낸 도이다.
도 11은 collagen matrix 환경 및 배양 첨가제가 제한된 환경으로 심근경색 이후 심화된 심장섬유화 상황을 모사한 체외배양 환경에서 세포 조합별 스페로이드 (CM, CM+EC 및 CM+EC+CF)의 이식 형성 양상을 나타낸 도이다.
도 12는 이식 형성 과정에서 스페로이드를 구성하는 세포별로 동역학(Dynamics)을 확인한 도이다:
RFP: CM;
Cyan: EC; 및
GFP: CF.
도 13은 MEA 분석을 통해 세포 조합별 스페로이드 (CS-M, CS-ME, CS-MF 및 CS-MEF)의 박동성 활성 여부(Active electrodes) 및 강도(Spike amplitude)를 정상 배양 환경과, 심근경색 이후 상황을 가정하여 세포 배양 첨가제를 감소시킨 환경 (25%)에서 비교 분석한 도이다:
3D-CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
3D-CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
3D-CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF); 및
3D-CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF).
도 14는 MEA 분석을 통해 세포 조합별 스페로이드 CS-M, CS-ME, CS-MF, CS-MEF)의 Field potential 동기화 여부를 정상 배양환경과, 심근경색 이후 상황을 가정하여 세포 배양 첨가제를 감소시킨 환경 (25%)에서 비교 분석한 도이다:
3D-CS-M: 단일 심근세포 스페로이드 (CM);
3D-CS-ME: 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC)
3D-CS-MF: CF가 포함된 심근-섬유아세포 스페로이드 (CM+CF);
3D-CS-MEF: 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF);
Spike within bursts (%) : 박동 동기화 정도; 및
Interspike intervals (ms) : 1회 박동시 구성 세포간 박동 간격.
도 15는 CM+CF 조합의 스페로이드 및 CM+EC+CF 조합의 스페로이드 그룹 간 이식 형성 속도를 비교한 도이다:
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드.
도 16은 EC의 포함 여부에 따른 Collagen matrix 내부로의 심근세포 (RFP 표지)의 침투 가속화를 확인한 도이다.
도 17은 스페로이드 형성시 세포의 조합에 따른 영향 인자 및 특이적 전사체를 RNA 시퀀싱하여 GO & KEGG 분석한 도이다.
도 18은 스페로이드 형성시 세포의 조합에 따른 영향 인자인 Integrin α1, MMP1 및 ERK1/2의 발현을 나타낸 도이다.
도 19는 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 후 8주(8W) 간의 심장 기능 추적 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 후 초기 심장 기능 개선 효과를 확인한 도이다.
도 21은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실의 혈역학적 압력과 부피를 측정한 도이다.
도 22는 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실 내 섬유화 진행을 Masson's trichrome stain로 평가한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 23은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실 내 혈관 (CD31)의 보존 또는 증진 정도를 면역형광염색으로 확인한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 24는 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 8주 후 좌심실내 잔존 심근세포 (cTNT) 및 섬유화 심화 (CHP) 정도를 면역형광염색으로 확인한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 25는 심근경색 질환 동물모델의 경색 영역내 이식한 스페로이드를 통해 생착된 인간 심근세포 (RFP, iPSC-CM)의 수 및 조직내 성숙정도 (CX43)를 확인한 도이다:
C: CM 스페로이드 투여 그룹;
C+E: CM+EC 조합의 스페로이드 투여 그룹;
C+F: CM+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹; 및
C+E+F: CM+EC+CF 조합의 스페로이드 투여 그룹.
도 26은 심근경색 질환 동물모델에 스페로이드 투여 후 조직내 심근세포의 증식 (Ki67) 촉진 효과를 확인한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 유도만능줄기세포를 심근세포 (Cardiomyocyte, CM) 및 기질세포로로 분화시키는 단계; 심근세포 및 기질세포를 혼합하는 단계; 및 배양하여 스페로이드를 형성하는 단계를 포함하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 심근세포 및 기질세포를 5:1 내지 1:1의 세포수 비율로 혼합할 수 있으며, 기질세포는 혈관내피세포(endothelial cells, EC) 또는 심장섬유아세포(cardiac fibroblast, CF)일 수 있다.
일 구현예에서, 심근세포 및 기질세포를 4:1 내지 4:3의 세포수 비율로 혼합할 수 있
일 구현예에서, 심근세포 및 혈관내피세포를 2:1의 세포수 비율로 혼합할 수 있다.
일 구현예에서, 심근세포 및 심장섬유아세포를 4:1의 세포수 비율로 혼합할 수 있다.
일 구현예에서, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포를 4:2:1의 세포수 비율로 혼합할 수 있으며, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포를 포함하여 제작된 스페로이드는 복합-세포(다세포) 스페로이드(Multi-cellular spheroid)일 수 있다.
일 구현예에서, 배양은 ULA(Ultra-Low Attachment) 미세공동 플레이트(microcavity plate)에서 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 미세공동은 직경(Diameter)이 300 내지 700μm이고 깊이(Depth)가 200 내지 600 μm일 수 있다.
일 구현예에서, 미세공동당 심근세포 300 내지 800 개, 혈관내피세포 200 내지 400 개 또는 심장섬유아세포 100 내지 200 개의 세포를 분주하여 배양될 수 있다.
일 구현예에서, 6-well의 미세공동 플레이트의 웰당 심근세포는 1X106 내지 2.6X106 개, 혈관내피세포는 8X105 내지 1X106 개 또는 심장섬유아세포는 4X105 내지 5X105 개의 세포를, 24-well 규격의 미세공동 플레이트의 웰당 심근세포는 3X105 내지 3.9X105 개, 혈관내피세포는 1.5X105 내지 1.95X105 개 또는 심장섬유아세포는 8X104 내지 9X104 개의 세포를 분주하여 배양될 수 있고, 6-well의 미세공동 플레이트의 웰당 2885개의 미세공동을, 24-well의 미세공동 플레이트의 웰당 554 개의 미세공동을 포함할 수 있다.
6-well의 미세공동 플레이트의 웰당 심근세포는 1X106 내지 2.6X106 개, 혈관내피세포는 8X105 내지 1X106 개 또는 심장섬유아세포는 4X105 내지 5X105 개의 세포를, 24-well 규격의 미세공동 플레이트의 웰당 심근세포는 3X105 내지 3.9X105 개, 혈관내피세포는 1.5X105 내지 1.95X105 개 또는 심장섬유아세포는 8X104 내지 9X104 개의 세포를 분주하여 배양
일 구현예에서, 미세공동 플레이트의 웰당 심근세포는 1X106 내지 2.6X106 개, 혈관내피세포는 8X105 내지 1X106 개 또는 심장섬유아세포는 4X105 내지 5X105 개의 세포수로 분주하여 배양될 수 있다.
일 구현예에서, 세포는 심근세포의 배양액 및 기질세포의 배양액을 세포수의 비율로 혼합한 배양액으로 배양될 수 있으며, 복합-세포 스페로이드를 제조할 경우 CM 배양액 RPMI1640+B27 (with insulin), EC 배양액 EGM2 및 CF 배양액 FGM3을 세포수의 비율로 혼합하여 배양액으로 이용할 수 있다.
일 구현예에서, 배양은 4일 내지 10일 동안 실시할 수 있으며, 48시간이 주기로 배양액을 교체하면서 배양될 수 있다.
본 발명에서 용어, "유도 만능 줄기 세포"(iPSC)는 비만능 세포로부터 인위적으로 유도된 만능 줄기세포의 한 유형이다. CiPSC는 iPSC이나, 그것들은 만능성을 부여하기 위해 유전자 공학에 의해 생성된 것이 아니라는 점에서 iPSC와는 일부 상이하다.
본 발명에서 용어, "스페로이드(spheroid)"는 세포가 응집되어 대체적으로 단면이 원형 또는 타원형으로 보일 수 있을 정도로 형성된 입체 구조를 의미한다.
본 발명에서 용어, "분화(differentiation)"란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제조 방법으로 제조된, 3D 심장 세포 스페로이드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 심근세포 및 기질세포를 포함할 수 있으며, 기질세포는 혈관내피세포(endothelial cells, EC) 또는 심장섬유아세포(cardiac fibroblast, CF)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포를 포함하는 복합-세포(다세포) 스페로이드(Multi-cellular spheroid)일 수 있으며, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포를 4:2:1의 세포수 비율로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 복합-세포 스페로이드는 NRG1, VTN, BMP10, RAMP2, FN1, ITGA1, PLXND1, APLNR, DLL4 및 SERPINE1의 발현이 단일 심근세포 스페로이드에 비해 증가될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 심근세포 및 혈관내피세포를 포함할 수 있으며, 포함된 혈관내피세포에 의해 NRG1, VTN, BMP10, RAMP2, FN1, ITGA1, PLXND1, APLNR, DLL4 또는 SERPINE1의 발현이 단일 심근세포로 구성된 스페로이드에 비해 증가될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 심근세포 및 심장섬유아세포를 포함할 수 있으며, 포함된 심장섬유아세포에 의해 NRG1, VTN, BMP10, RAMP2, FN1, ITGA1, PLXND1, APLNR, DLL4 또는 SERPINE1의 발현이 단일 심근세포로 구성된 스페로이드에 비해 증가될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 150 내지 220 μm의 직경을 가질 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 스페로이드 당 500 내지 3000 개의 세포를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 심기능을 개선시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 심장의 섬유화 진행 및 심화를 억제할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 이식 후 조직내 미세환경을 개선하여 장기적인 조직 재생을 촉진시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드는 단일 심근세포 스페로이드에 비해 높은 동기화된 박동성을 가질 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드를 포함하는 심근 재생용 세포 치료제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 세포 치료제 조성물은 개체의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스 콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있다. 상기 제제에는 유효성분인 3D 심장 세포 스페로이드 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 포함될 수 있으며, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 치료제 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 세포 치료제 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 세포 치료제 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 치료제 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하다. 본 발명의 세포 치료제 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, 심장질환은 심부전, 심장 비대증, 심장 섬유화, 심장판막증, 폐성심, 부정맥, 심실세동, 심낭염, 심내막염, 허혈성 심장질환, 동맥경화증 또는 혈관 폐색일 수 있으며, 허혈성 심장질환은 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 허혈성 심부전증 또는 심근비대증일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학적 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드를 포함하는 조직공학용 지지체에 관한 것이다.
발명에 따른 조직공학용 지지체는 생분해성 고분자를 성형하여 만든 지지체에 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드가 로딩(loading)되어 있는 형태로 구성될 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 생체적합성, 혈액친화성, 항석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 말한다. 이러한 생분해성 고분자의 종류는 이에 제한되지 않으나, 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 포함된다.
본 발명에 따른 조직공학용 지지체 내에서, 생분해성 고분자의 함량은 5 내지 99 중량%인 것이 바람직하다. 만약 상기 생분해성 고분자의 함량이 5 중량% 미만이면 조직공학용 지지체의 성형이 잘 이루어지지 않아 지지체의 기계적 강도가 약해지는 반면, 이의 함량이 99 중량%를 초과하면 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드의 로딩이 어려워지는 문제점이 발생할 수 있다.
상기 조직공학용 지지체는 기존의 공지된 방법, 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등에 따라 생분해성 고분자를 성형하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 3D 심장 세포 스페로이드를 포함하는 심근 재생용 패치에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 심근 재생용 패치는 심장 손상부위에서의 혈관신생 촉진, 항-염증 및 항-섬유화 효과를 가질 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. iPSC-유래 복합 세포 3D 심장 스페로이드 제작
1-1. 세포 분화 및 조합
유도만능줄기세포를 각각 심근세포(Cardiomyocyte, CM), 혈관내피세포(endothelial cells, EC) 및 심장섬유아세포(cardiac fibroblast, CF)로 분화시킨 후 (도 1), 세포치료제로서 조직재생능의 극대화를 위한 세포 조합 탐색을 위해 CM와 기질세포 (EC 및 CF)를 다양한 비율로 혼합하였다 (CM:EC=2:1; CM:CF=4:1 및 CM:EC:CF=4:2:1).
1-2. 스페로이드 형성
복합 세포/다세포 스페로이드(Multi-cellular spheroid)를 형성하고, 최소한의 침습으로 심근내 직접투여하기 위한 스페로이드의 크기 (180 μm 내외)로 스페로이드를 형성하고, 소구경 스페로이드 구성시 심근세포 치료제로서의 유효 세포수인 Rat 기준 개체당 최소 2X106 개의 심근세포가 포함되도록 하기 위해, Microcavities 기반의 ULA(Ultra-Low Attachment) surface plate (Corning ®Elplasia® Round Bottom Plates)를 이용하였다. 본 발명에서 사용한 ULA microcavities plate는 직경(Diameter)/깊이(Depth)가 500/400 μm의 크기로 1개의 웰당 2885 개의 소구경 웰이 구성되어 있는 형태였으므로, 웰당 CM: 1.8X106 개, EC: 9X105 개 및 CF: 4.5X105 개의 세포를 혼입하여 분주하였다. 스페로이드의 형성 및 유지를 위해 CM 배양액 (RPMI1640 + B27 with insulin):EC 배양액 (EGM2):CF 배양액 (FGM3)을 4:2:1의 비율로 혼합하여 배양액으로 이용하였으며, 48시간의 주기로 배양액을 교체하면서 1주일 동안 배양하였다. EC 및 CF를 위한 배양액 내 포함되어 있는 여러 성장인자(Growth factor)들에 의한 영향을 최소화하기 위해 스페로이드 생성 과정 중 세포 조합에 관계 없이 동일한 배양액을 사용하였다.
그 결과, 복합-세포 심장 스페로이드가 형성되었으며 (도 2), CM (CS-M), CM+EC (CS-ME), CM+CF (CS-MF) 및 CM+EC+CF (CS-MEF) 그룹을 각각 상기 유효 세포수로 1주일 동안 배양하여 형성된 스페로이드의 크기는 평균 178~186 μm인 것으로 나타났고, 심근세포와 기질세포의 공배양에 따라, 1개 스페로이드당 구성 세포수가 증가되더라도 최종 직경이 작아지는 것으로 나타났다 (도 2 및 3). 이를 통해, 스페로이드의 크기에 가장 큰 영향을 미치는 인자는 심근세포의 수이며, CF와의 공배양시 EC와의 공배양시보다 상대적으로 더 응집이 촉진되어 CF가 포함된 세포 조합 그룹에서 스페로이드의 직경이 작아지는 것을 확인하였다.
1-3. 종래의 스페로이드 형성 방법과의 비교
종래의 스페로이드 형성 방법으로는 ULA 가공이 된 96-웰 규격의 단일 웰 방식 또는 세포부유액의 Droplet 형성을 통한 Hanging drop 법이 있으나, 종래의 방법을 이용하여 본 발명과 같이 최소 침습을 위한 180 μm 크기 내외의 소구경 스페로이드를 제작하기 위해서는 1개의 웰당 최대 630 여개의 심근세포로 스페로이드를 제작하여야 하며, 1개의 플레이트에서 최대 96개의 스페로이드만을 생산할 수 있으므로, 실험동물 1 개체당 유효 세포수인 ~ 2X106 개의 심근세포를 이용하기 위해서는, 약 30여 장의 플레이트를 사용하거나 3400개의 개별 Droplet을 형성하여야 하기 때문에 현실적으로 대량 생산이 불가능하다 (세포 630 개 X 96-well X 33개 Plate = 1.99 X106 개). 또한, 종래의 ULA 가공된 96-웰 규격의 단일 웰 방법을 통해 제작된 스페로이드와 본 발명의 ULA microcavities plate를 이용한 스페로이드 제작 방법으로 제작된 스페로이드의 특성을 비교한 결과, 종래의 방법을 이용하여 소구경 복합 세포 심장 스페로이드를 형성한 경우 분주된 세포 수 대비 넓은 배양 공간으로 (5~6 mm) 인해 세포의 응집이 빠르게 촉진되지 못하며, 상대적으로 빠른 응집을 보이는 CF가 먼저 응집을 이루어 심근세포와 완전히 융합되지 못하는 것으로 나타났다 (도 5).
따라서, 본 발명의 ULA microcavities plate를 이용한 스페로이드 형성 방법이 소구경의 복합 세포 심장 스페로이드에 적합하며, 대량 생산이 가능하고, 스페로이드 형성시 단일 배양 웰에 대량의 스페로이드가 공배양 되기에 세포들이 분비하는 다양한 분비 인자(Secretion factor) 등을 공유하는 장점이 있음을 알 수 있다.
실시예 2. iPSC-유래 복합 세포 3D 심장 스페로이드의 특성 분석
2-1. 구조적 특성 분석
본 발명의 방법으로 제작된 복합 세포(다세포) 스페로이드 (CM+EC, CM+CF 및 CM+EC+CF)와 단일 심근세포 스페로이드 (CM)의 조성을 통해 포함하는 심근세포의 구조적 특성을 분석하기 위해, Cardiac troponin T (Green) 면역형광염색을 수행하여 약 ~12μm depth의 영역을 시각화 하였다.
그 결과, CM 단일의 경우 일반적인 2D 에서 배양되는 미성숙한 CM 들과 같이 상대적으로 뚜렷하게 확인되지 못한 섬유구조와 방향성을 가지고 뭉쳐 있는 반면에, 본 발명으로 제작된 복합 세포 스페로이드 그룹들은 단일 심근세포 조성과 비교하여 상대적으로 두껍고 뚜렷한 근섬유 구조를 확인할 수 있었다 (도 6).
2-2. 박동 특성 분석
본 발명의 방법으로 제작된 복합 세포(다세포) 스페로이드 (CM+EC, CM+CF 및 CM+EC+CF)와 단일 심근세포 스페로이드 (CM)의 박동 특성을 분석하기 위해, 영상기반 박동성 분석 기법을 도입하고 실험 그룹별 총 50개의 스페로이드를 무작위 선별하여 분석하였다.
그 결과, 심근-혈관내피세포 (CM+EC)를 조합하여 제작한 스페로이드의 경우 단일 심근세포 스페로이드에 비해 분당 박동성 (Beating rate)이 감소하였지만 (P=0.001), 수축/이완 능력을 나타내는 Mean velocity 및 Peak velocity 지표가 증가된 것으로 나타났다 (Mean velocity : P=0.05 / Peak velocity : P=0.18) (도 7). 반면, 심근-심장섬유아세포 (CM+CF)를 조합하여 제작한 스페로이드의 경우 단일 심근세포 스페로이드와 유의미한 차이가 발생하지 않았다 (Beating rate / Mean velocity / Peak velocity : P=0.53 / P=0.97 / P=>0.99). 그러나, CM+EC+CF를 조합하여 제작한 스페로이드의 경우 박동성 및 수축/이완능력이 다른 스페로이드들과 비교하여 모두 유의적으로 향상되어 있는 것으로 나타났다 (도 7). 또한, 실험 그룹당 50개의 분석 샘플 중 CM+EC 그룹에서 2개 및 CM+CF 그룹에서 5개의 비정상적인 박동성이 측정되었지만, CM 단독 그룹 및 3종의 세포를 혼합한 그룹에서는 모든 샘플이 정상적인 박동성을 보유하는 것으로 나타났다 (도 8).
실시예 3. iPSC-유래 복합 세포 3D 심장 스페로이드의
in vitro
조직재생능 확인
3-1. 체외 배양 특성 확인
본 발명의 방법으로 제작된 복합 세포(다세포) 스페로이드의 조직재생능을 확인하기 위해, 심근경색 이후 심화된 심장 섬유화 상황을 가정한 Type 1 collagen matrix (3mg/mL 농도)의 체외배양 환경을 조성하고, 조합별 스페로이드 (CM, CM+EC, CM+CF 및 CM+EC+CF)를 동일 수로 분주하여 배양 실험을 진행하였다.
그 결과, 분주된 단일 심근세포 스페로이드 (CM, CS-M) 및 심근-혈관내피세포를 조합하여 제작한 스페로이드 (CM+EC, CS-ME)들이 Matrix 위에 부착되어 생존하지만, 구형의 Aggregation 형태에서 큰폭의 변화없이 유지되는 것으로 나타났다 (도 9). 반면, CF가 포함된 심근-섬유아세포 (CM+CF, CS-MF) 및 삼중-세포(Tri-cellular) 스페로이드 (CM+EC+CF, CS-MEF)는 배양 진행 과정에서 응집을 이루고 있는 스페로이드 내부에서 구성 세포들이 활발히 이동(Migration)하여 Collagen matrix에 부착(Adhesion) 및 침투(Invasion)되고, 이를 매개로 심근세포의 Outgrowth가 촉진되는 것으로 나타났으며 (도 10 및 도 11), 배양된 스페로이드가 서로 융합되어 조직 형태의 세포 이식(Cell graft)을 이루고 다른 그룹의 스페로이드에 비해 높은 박동성을 보유하는 것을 확인하였다.
3-2. 이식 특성 확인
세포 배양을 위한 보충제(Supplement)을 제한한 (Basal media with 1% FBS) 환경을 조성하여 이식 상황을 가정하고, 각 그룹의 스페로이드를 각각 2885개 분주하여 배양 실험을 진행하여 세포 이식 영역을 확인하였으며, RFP를 발현하는 심근세포를 활용하여 세포 사멸이 진행되면 형광 발현이 소실되도록하였다.
그 결과, 삼중 세포 스페로이드 그룹 (CM+EC+CF)은 Collagen matrix 위에서도 빠르게 융합되고 지속적으로 세포 이식 영역을 형성하는 것으로 나타났다. 반면, 단일 심근세포 스페로이드 그룹 (CM) 및 심근-혈관내피세포 스페로이드 그룹 (CM+EC)의 경우 Collagen matrix 위에서 정상적 부착 배양이 진행되지 않았으며, 원형의 Aggregation 형태에서 변화하지 못한 채 심근세포의 사멸이 진행되는 것으로 나타났다 (도 11).
3-3. CF 매개 이식화 확인
심근세포의 이식화가 어떠한 구성 세포의 매개로 진행되는지 확인하기 위해, 각 세포별로 형광을 표지하고 (CM = RFP, EC = Cyan 및 CF = GFP) 배양 과정에서 Cellular dynamics를 관찰하였다.
그 결과, 이식 배양이 진행되는 과정에서 스페로이드의 구성 세포들 중 CF가 응집되어 있는 스페로이드 내부에서 가장 빠르게 빠져나와(Escape) Collagen matrix 위에서 활발히 이동(Migration)하는 것으로 나타났다 (도 10 및 도 12의 CF channel). 그 과정에서 Collagen matrix에 심근세포의 부착이 발생되고, 응집 형태에서 변화가 일어나며, 주변 스페로이드의 심근세포들 간에 융합이 촉진되는 것을 확인하였다 (도 9 및 12).
3-4. 전기 생리학적 동기화 확인
이식된 심근세포 기반 스페로이드들의 전기생리학적 동기화 여부를 확인하기 위해, MEA chip에 각 스페로이드 그룹 (CM, CM+EC, CM+CF 및 CM+EC+CF)당 각각 약 554 개의 스페로이드들을 분주하고 정상 배양 조건(Normal growth condition) 및 정상 배양 조건에서 세포 배양 보충제를 25% 수준으로 감소시킨 조건(Low supplement condition)에서 7일간 MEA를 통한 Field potential 분석을 수행하였다 (MaxOne Single-Well MEA, MaxWell Biosystems).
Collagen matrix에서의 배양 실험 양상과 유사하게, CF가 포함된 CS-MF 그룹 및 삼중 세포 스페로이드 CS-MEF 그룹에서 상대적으로 높은 박동 영역(Active electrodes) 및 박동 강도(Spike amplitude)가 나타나, 보충제가 제한된 환경에서 세포의 박동성 회복이 상대적으로 저하되어 있는 심근세포 단독 (CS-M) 및 CS-ME 그룹에 비해 지속적으로 높은 박동성을 보유하는 것을 확인하였다 (도 13). 또한, CS-MF 그룹과 비교하여 CS-MEF 그룹이 유의적으로 높은 박동 강도를 나타내, 심근세포의 기능적 능력이 상대적으로 더 개선되어 있음을 확인하였다. 또한 배양 과정에서 부착되지 못한 스페로이드가 소실되고, 상대적으로 적은 수의 부착 스페로이드들이 영역내에서 융합되지 못하여 개별적 박동성을 나타내는 (Raster plot) 다른 그룹에 비해, CF가 포함된 CS-MF 및 CS-MEF 그룹은 세포의 빠른 활성과 더불어 배양 영역내 이식을 이룬 심근세포가 상대적으로 높은 수준으로 동기화된 박동(Spike within bursts, Interspike interval)을 나타냈다 (도 14).
이를 통해, 스페로이드를 체내 이식하였을 때 삼중 세포 스페로이드 (CS-MEF)는 상대적으로 높은 기능성을 보유한 심근 세포들이 빠르게 개별 응집체 형태에서 벗어나 활성을 가지며 인접 세포들과 동기화될 수 있으므로, 박동성을 보유한 심근세포 기반 세포치료시 이식 세포로 인한 부정맥 유발의 위험성을 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 4. iPSC-유래 복합 세포 3D 심장 스페로이드에서 EC의 기능 확인
4-1. EC에 의한 탈응집 및 이식 촉진 확인
상기 실시예에서 Collagen matrix 위에서 개별 응집체 형태를 벗어나고 심근세포 기반의 이식을 이루는 과정이 CF가 포함되어 있는 경우 촉진된 것을 확인하였으므로, 형성된 스페로이드를 배양/이식하는 경우 형성 과정에서 포함된 EC의 영향력을 확인하기 위해, 3mg/mL type 1 collagen matrix를 형성하고 심근-심장섬유아세포를 조합하여 제작한 스페로이드 그룹 (CM+CF)과 삼중 세포 스페로이드 그룹 (CM+EC+CF)을 각각 580여개 분주한 뒤 배양하였다.
그 결과, 동등한 Collagen matrix 배양 조건에서 CF 기반의 탈응집 및 CM의 이식 과정이 EC가 포함되어 있는 삼중 세포 스페로이드 그룹 (CM+EC+CF)에서 상대적으로 더 촉진되는 것으로 나타났다 (도 15)
4-2. EC에 의한 세포 이식 확인
Collage matrix 내부로 침투된 심근세포를 확인하기 위해 Cryo-section을 통해 배양 단면을 절단하여 세포의 거동을 확인한 결과, EC가 포함되어 있는 스페로이드 그룹에서 Collagen matrix 내부로 CM (RFP)의 침투가 상대적으로 증가되어 있는 것으로 나타났다 (도 16).
실시예 5. iPSC-유래 복합 세포 3D 심장 스페로이드의 세포 조합에 따른 영향 인자 확인
iPSC-유래 3D 심장 스페로이드를 구성하는 세포들의 조합 (CM, CM+EC, CM+CF 및 CM+EC+CF)에 따른 영향 인자 및 특이적 전사체(Transcriptome) 발굴을 위해 RNA sequencing을 수행하였다. 구체적으로, 각 그룹의 스페로이드를 형성한 이후 1주일 간 배양하고 RNA 추출을 위해 그룹당 약 2885개의 스페로이드 샘플을 Duplicate로 구성하여 분석을 수행하고 GO & KEGG 분석을 수행하였다.
그 결과, CF 의 유무에 따라 전반적인 유전자 발현양상의 차이가 있다는 점을 확인 하였으며, CM 및 CM+EC 그룹이 유사한 발현 패턴을 CM+CF 와 CM+EC+CF 그룹이 유사한 발현 패턴을 나타내었다 (도 17).
CF가 포함된 그룹들 (CM+CF 및 CM+EC+CF)에서 유의미하게 변동이 있었던 Group 3 및 Group 5의 Biological process GO term은 Extracellular matrix (ECM)에 관여된 요소들로서 gene list에는 다양한 형태의 collagen들과 fibronectin, vitronectin 및 laminin (FN1, COL1A1, COL3A1, VTN, LAMA1)이 포함되어 있었다 (도 17).
심근세포는 ECM을 분비하는 능력이 타 기질세포등 매우 낮기에 배양을 위해 Matrigel, Fibronectin 또는 Gelatin 등의 ECM 단백질이 처리된 배양 환경이 요구된다. 기존의 단일 심근세포만을 활용하여 형성한 스페로이드 및 본 발명의 복합 스페로이드 (CM+EC, CM+CF, CM+EC+CF)를 대상으로 세포와 ECM의 상호작용의 매개체인 Integrin의 발현을 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 확인해본 결과, CM 단독 그룹은 integrin α1 의 발현이 확인되지 않았으며, CM+EC 그룹은 미약한 발현이 있었다. 하지만 CF 가 포함된 CM+CF 와 CM+EC+CF 그룹은 상대적으로 높은 Integrin α1 발현을 보유함을 확인하였다 (도 18). 이 같은 결과는 복합스페로이드 생산을 위한 기질세포로서의 EC 및 CF의 첨가, 특히 CF가 세포 자체적인 ECM 분비를 통해 지지체 없는(Scaffold-free) 3D 배양 환경에서 세포와 ECM의 상호작용을 활성화시킬 수 있으며, CM 단독의 경우 이와 같은 상호작용을 기대할 수 없다는 의미가 될 것이다. RNA 시퀀싱 데이터(sequencing data)에서도 CF가 포함되어 있는 Group 5에서 Extracellular matrix assembly, Cell adhesion mediated by integrin, Regulation of extracellular matrix organization 등의 GO term이 확인되어 (도 17), CF가 스페로이드를 구성할 때 필요한 핵심 인자임을 확인할 수 있었다.
또한, CM+EC+CF의 삼중 스페로이드의 구성은 CM+EC의 구성과 비교하여 더 향상된 혈관 재생능(Angiogenesis)을 보유함을 확인하였는데, 삼중 스페로이드에서 발현이 높은 Group 4의 GO term은 positive regulation of cell migration involved in sprouting angiogenesis와 positive regulation of blood vessel endothelial cell migration 등으로 KDR, FOXC2 및 RAMP2가 CM+EC+CF 그룹에서 상향조절(upregulation)되어 있었다 (도 17). RAMP2는 EC의 기능을 조절하는 핵심 인자로 EC의 항상성이나 기능을 조절 및 투과성에 역할이 있음이 보고되었다.
아울러, Cell-ECM interaction의 하부 신호전달체계로 다양한 세포의 생존, 부착, 이동, 증식 등을 조절하는 대표적 신호전달체계인 Erk1/2(Extracellular signal-regulated kinases)의 활성을 나타내는 인산화(Phosphorylation)가 삼중 스페로이드 (CM+EC+CF)에서 타 그룹 대비 증가되어 있음을 확인하여, 이식 이후 생존이나 부착 빠른 성장에 긍정적인 영향을 가질수 있음을 확인 하였다 (도 18).
실시예 6. iPSC-유래 복합 세포 3D 심장 스페로이드의
in vivo
이식 효과 확인
6-1. 심기능 확인
체외실험 결과를 바탕으로 구성한 복합 세포 스페로이드가 질환 동물모델을 대상으로 심근세포 이식 기반 치료의 효과 및 조직 재생능을 개선시킬 수 있는지 확인하기 위해, Fisher 344 래트에 허혈-재관류 (Ischemia-reperfusion, IR) 손상을 유도한 후 1주일차에 하기의 표 1의 세포수의 단일 심근세포 스페로이드 (CM), 심근-혈관내피세포 스페로이드 (CM+EC), 심근-심장섬유아세포 스페로이드 (CM+CF) 및 삼중 세포 스페로이드 (CM+EC+CF)를 각각 약 3400 개씩 심근내 직접 주입 방식으로 투여 (이식)하였다. 이 때, 그룹의 세포 조합에 따라 스페로이드 개당 총 세포수는 다르지만 이식되는 스페로이드의 크기는 약 ~180μm이고 스페로이드의 수는 약 3400 개로 동일하게 투여하였다. 이 후, 심초음파를 이용하여 이식 후 1주부터 8주까지 좌심실 전벽/후벽 두께, 좌심실 이완기 말/수축기 말 직경, 심박출률 및 구획단축률 등의 심기능을 측정하였다.
| CM 그룹 | CM 2X106 개 |
| CM+EC 그룹 | CM 2X106 개, EC 1X106 개 |
| CM+CF 그룹 | CM 2X106 개, CF 5X105 개 |
| CM+EC+CF 그룹 | CM 2X106 개, EC 1X106 개 및 CF = 5X105 개 |
그 결과, CM 그룹 및 CM+EC 그룹의 경우 대조군 (심근경색 대조군 : -13.4%) 대비 증가된 심박출률을 보이나, 8주간 지속적인 심기능 하락을 나타냈다 (CM : -10.3% / CM+EC : -4.97%). 반면, CF가 포함되어 있는 CM+CF 그룹 및 CM+EC+CF 그룹의 경우 대조군 대비 심기능이 유의적으로 개선되는 것으로 나타났다 (CM+CF : 7.7% / CM+EC+CF : 13.8%) (도 19). 또한, 3가지 세포가 모두 포함된 CM+EC+CF 그룹만이 세포 이식 초기 (이식 후 1주)부터 심장 기능이 유의적으로 상승하였으며 (대조군 : -4.13% / CM : -1.75% / CM+EC : 1.26% / CM+CF : 4.35% / CM+EC+CF : 12.5%), 2종의 세포군을 조합한 그룹의 경우 (CM+EC / CM+CF) 초기 (이식 2주차) 심기능 증가폭이 3종의 세포를 조합한 그룹에 미치지 못하는 것으로 나타나 (대조군 : -9.34% / CM : -4.25% / CM+EC : -3.09% / CM+CF : -2.79% / CM+EC+CF : 12.4%), 삼중 세포 스페로이드가 이식 초기 (~2주)부터 심장기능 개선에 효과적임을 확인하였다 (도 20).
6-2. 혈역학적 분석
상기 실시예 6-1에서와 같이 각 스페로이드 그룹을 투여 후 심근경색 후 8주차에 치료에 따른 심장 기능을 더욱 정밀하게 평가하기 위해, 좌심실의 혈역학적 압력 및 부피를 측정할 수 있는 침습적 압력-볼륨 (PV) 카테터를 통해 좌심실의 혈역학적 분석을 수행하였다. 이를 위해 개흉 후 심장 좌심실 정점을 26-게이지 바늘로 뚫고 2F 전도도 카테터 (SPR- 838, Millar)를 좌심실에 삽입하였다. 분석 파라미터는 디지털 컨버터(PowerLab 16/35, ADInstruments, Colorado Springs, CO)와 결합된 PV 전도도 시스템 (MPVS Ultra, emka TECHNOLOGIES, Paris, France)을 사용하여 실시간 기록되었다. 또한, 수축기 말 압력 체적 관계 (ESPVR) 및 이완기 말 압력 체적 관계 (EDPVR)의 기울기를 포함하는 심장 기능 부하의 독립적 측정을 수행하였으며, 혈역학적 측정 후 평행 전도도를 계산하기 위해 50μl의 고혈압 식염수 (20% NaCl)를 왼쪽 경정맥에 주입하였다. 혈액을 좌심실에서 헤파린 처리된 주사기로 채취하고 큐벳에 배치하여 카테터를 사용하여 전도 신호를 부피로 변환하였다.
심근경색 이후 8주차에 PV 루프 측정한 결과, 복합 스페로이드 그룹들은 심근세포 단독 그룹 (CM)에 비해 심근경색 이후 발생하는 불리한 리모델링으로부터 심장을 보호하는 것으로 나타났으며, CM+EC+CF 그룹에서 다른 그룹에 비해 심장 기능이 크게 개선되는 것을 확인하였다 (도 21). 또한 CM+EC+CF 그룹에서 일회 박출량 (Stroke volume, SV) 및 심박출량 (Cardiac output, CO)과 같은 일반적인 심장 기능의 두 가지 파라미터가 타 그룹 대비 유의적으로 높았으며, 최대 확장기에서 측정된 심장 재형성 지수인 최대 용적 (V max)의 경우 타 그룹 대비 유의적으로 낮은 수치를 기록하였다. 최대 압력 변화율(dP/dt max)과 LV의 압력 변화를 나타내는 최소 압력 변화율 (dP/dt min) 역시 CM+EC+CF 투여군에서 타그룹 대비 유의적으로 증가하였다 (도 21).
6-3. 심장 섬유화 및 혈관 밀도 분석
상기 실시예 6-1에서와 같이 각 스페로이드 그룹을 투여한 심근경색 후 8주차 조직을 Masson's trichrome 염색하여 심근경색 유발 이후 좌심실내 섬유화(Fibrosis) 진행 정도를 평가하였다. 또한, 면역 형광 염색을 통해 좌심실 경색 및 경계영역을 각각 구분하여 섬유화 심화 여부 (Denatured collagen)를 평가할 수 있는 CHP(Collagen hybridizing peptide) 염색을 수행하고, 잔존된 심근세포 영역을 평가하였으며, 보존 또는 신생된 혈관 (CD31)의 수를 비교 분석하였다.
그 결과, 삼중 세포 스페로이드 (CM+EC+CF) 그룹에서 유의적으로 낮은 섬유화 진행 정도가 확인되었다 (대조군 : 39.4% / CM : 38.3% / CM+EC : 28.8% / CM+CF : 26.2% / CM+EC+CF : 16.4%) (도 22). 또한, 면역형광염색을 통한 검증에서도 삼중 세포 스페로이드 (CM+EC+CF) 그룹은 경색영역(Infarct zone)에서 유의적으로 낮은 CHP 염색 점유율을 나타냈으며, 잔존된 심근세포의 수 역시 유의적으로 높았다 (도 24). 또한 경색 영역 및 경색 경계영역의 혈관 밀도 역시 CM+EC+CF 그룹에서 가장 높은 수치를 기록하였다 (도 23).
6-4. 이식 세포 생착 확인
이식된 세포의 상태 확인을 위해, 이식 8주차 조직을 대상으로 RFP로 표지된 심근세포를 추적하고, 이를 대상으로 면역 형광 염색을 수행함으로써 그 상태를 확인하였다.
그 결과, 경색 영역에서 RFP를 발현하는 이식된 인간 CM (RFP 발현으로 항체염색을 한 GFP (cTnT)와 Merge되어 노란색 계통으로 관찰됨)과 Host의 심근세포 (항체염색을 통한 GFP만 발현)를 각각 구별하여 확인할 수 있었다. CM 단독 그룹의 경우 소수의 세포만이 경색 영역내 이식 (RFP 발현)되어 있는 것으로 나타났고, 심한 섬유화 (CHP)가 동반되어 있었으며, 심근세포의 이식으로 기대하는 경색 수복을 위한 효과적인 심장근육 증대가 발생되지 못한다는 점을 확인하였다. 하지만, 복합 세포 스페로이드 그룹들은 심근세포 기반 이식 영역이 상대적으로 증대되어 있었으며, 체외 배양 실험 결과와 같이 삼중 세포 스페로이드 (CM+EC+CF)를 이식한 경우 유의적으로 많은 수의 심근세포가 경색 영역내에 생착되어 있는 것으로 나타났다 (도 25). 이를 통해 복합 세포 스페로이드 치료 전략은 심근경색이 발생된 경색영역에 이식된 심근세포의 생착을 촉진하여 재근육화를 유도하는 본질적인 치료 효과를 보유한다는 점을 확인하였다.
6-5. 이식 후 심근세포의 성숙 확인
이식된 심근세포가 Host 조직내에서 성숙된 심근세포의 형태를 가지며 유기적으로 연결되어 전기 생리학적 특성이 개선 될수 있는 성숙된 형태를 보이는지 확인하기 위해, 심근세포간 접합 여부를 GJA1 (CX43) 면역형광염색을 통해 확인하였다.
그 결과, 삼중 세포 스페로이드 (CM+EC+CF)를 이식한 경우 근절이 뚜렷하게 확인되었으며, 개재원반(Intercalated disc) 안에서 발현하는 패턴의 CX43 비율이 다른 그룹에 비해 현저히 높았다 (도 25), 이를 통해 복합 세포 스페로이드 치료 전략이 이식되는 심근세포의 효과적인 숙주와의 동기화 및 그로 인한 전기 생리학적 안전성 증대에 기여할 수 있는 효과적인 치료전략이 될 수 있음을 확인하였다.
6-6. 이식 후 조직 재생 촉진 효과 확인
복합 세포 스페로이드 이식 시 이식되는 심근세포의 직접적인 생착과 함께 포함된 기질 세포가 경색 영역내 Host의 심근세포 증폭에도 영향을 미칠 수 있는지 확인하기 위해, 세포 주기 진행의 표지자인 Ki67를 사용하여 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, EC가 포함되어 있는 CM+EC 그룹 및 CM+EC+CF 그룹에서 유의적으로 높은 비율로 Ki67의 발현을 보유한 Host의 심근세포가 존재하는 것으로 나타나 (도 26), 복합 세포 스페로이드에 의해 경색 이후 조직내 미세환경이 개선되어 장기적인 조직 재생이 촉진될 수 있음을 확인하였다.
Claims (22)
1) 유도만능줄기세포를 심근세포(Cardiomyocyte, CM) 및 기질세포로 분화시키는 단계;
2) 심근세포 및 기질세포를 혼합하는 단계; 및
3) 배양하여 스페로이드를 형성하는 단계를 포함하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
2) 심근세포 및 기질세포를 혼합하는 단계; 및
3) 배양하여 스페로이드를 형성하는 단계를 포함하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 심근세포 및 기질세포를 5:1 내지 1:1의 세포수 비율로 혼합하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 기질세포는 혈관내피세포(endothelial cells, EC) 또는 심장섬유아세포(cardiac fibroblast, CF)인, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 3항에 있어서, 심근세포 및 혈관내피세포를 2:1의 세포수 비율로 혼합하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 3항에 있어서, 심근세포 및 심장섬유아세포를 4:1의 세포수 비율로 혼합하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 3항에 있어서, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포를 4:2:1의 세포수 비율로 혼합하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 배양은 ULA(Ultra-Low Attachment) 미세공동 플레이트(microcavity plate)에서 수행되는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 7항에 있어서, 미세공동은 직경(Diameter)이 300 내지 700μm이고 깊이(Depth)가 200 내지 600 μm인, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 7항에 있어서, 미세공동당 심근세포 300 내지 800 개, 혈관내피세포 200 내지 400 개 또는 심장섬유아세포 100 내지 200 개의 세포를 분주하여 배양하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 심근세포의 배양액 및 기질세포의 배양액을 세포수의 비율로 혼합한 배양액으로 배양하는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 배양은 4일 내지 10일 동안 실시되는, 3D 심장 세포 스페로이드의 제조 방법.
제 1항의 제조 방법으로 제조된, 3D 심장 세포 스페로이드.
제 12항에 있어서, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포를 포함하는 복합-세포(다세포) 스페로이드(Multi-cellular spheroid)인, 3D 심장 세포 스페로이드.
제 13항에 있어서, 심근세포, 혈관내피세포 및 심장섬유아세포를 4:2:1의 세포수 비율로 포함하는, 3D 심장 세포 스페로이드.
제 13항에 있어서, NRG1, VTN, BMP10, RAMP2, FN1, ITGA1, PLXND1, APLNR, DLL4, SERPINE1 또는 pERK1/2(ERK1/2 phosphorylation)의 발현이 단일 심근세포 스페로이드에 비해 증가된, 3D 심장 세포 스페로이드.
제 12항에 있어서, 스페로이드는 150 내지 220 μm의 직경을 가지는, 3D 심장 세포 스페로이드.
제 12항에 있어서, 스페로이드는 스페로이드당 500 내지 3000 개의 세포를 포함하는, 3D 심장 세포 스페로이드.
제 12항의 3D 심장 세포 스페로이드를 포함하는 심근 재생용 세포 치료제 조성물.
제 12항의 3D 심장 세포 스페로이드를 유효성분으로 포함하는 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 19항에 있어서, 심장질환은 심부전, 심장 비대증, 심장 섬유화, 심장판막증, 폐성심, 부정맥, 심실세동, 심낭염, 심내막염, 허혈성 심장질환, 동맥경화증 또는 혈관 폐색인, 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 20항에 있어서, 허혈성 심장질환은 협심증, 심근경색증, 동맥경화증, 허혈성 심부전증 또는 심근비대증인, 심장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제 12항의 3D 심장 세포 스페로이드를 포함하는 조직공학용 지지체.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220134821 | 2022-10-19 | ||
| KR20220134821 | 2022-10-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240054878A true KR20240054878A (ko) | 2024-04-26 |
Family
ID=90883418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020230125687A KR20240054878A (ko) | 2022-10-19 | 2023-09-20 | 3d 심장 세포 스페로이드 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240054878A (ko) |
-
2023
- 2023-09-20 KR KR1020230125687A patent/KR20240054878A/ko unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10456501B2 (en) | Compositions and methods for cardiac therapy | |
| Marsano et al. | The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction | |
| EP1838840B1 (en) | Use of cultured three-dimensional tissue for treating congestive heart failure | |
| Zimmermann et al. | Cardiac tissue engineering for replacement therapy | |
| Jawad et al. | Myocardial tissue engineering: a review | |
| Alcon et al. | Regenerating functional heart tissue for myocardial repair | |
| US20110059059A1 (en) | Methods for Treating Ischemic Tissue | |
| US20060292125A1 (en) | Methods for treating ischemic tissue | |
| Ravichandran et al. | Minimally invasive cell-seeded biomaterial systems for injectable/epicardial implantation in ischemic heart disease | |
| Tang et al. | Cardiac progenitor cells and bone marrow-derived very small embryonic-like stem cells for cardiac repair after myocardial infarction | |
| US20120315252A1 (en) | Methods of Reducing Teratoma Formation During Allogeneic Stem Cell Therapy | |
| Matsuura et al. | Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology | |
| Vu et al. | Myocardial restoration: is it the cell or the architecture or both? | |
| KR20240054878A (ko) | 3d 심장 세포 스페로이드 | |
| KR102088767B1 (ko) | 혼합물 4f를 이용한 줄기세포 생물학적 활성 증가용 조성물 | |
| WO2013123448A1 (en) | Micro-tissue particles and methods for their use in cell therapy | |
| Kuraitis et al. | Cell therapy to regenerate the ischemic heart | |
| EP4101440A1 (en) | Composition for intrapericardial injection comprising stem cells and use thereof | |
| Soler-Botija et al. | Myocardial bioprosthesis: Mimicking nature | |
| Gu et al. | Tissue engineering and stem cell therapy for myocardial repair | |
| KR102545746B1 (ko) | 유도만능줄기세포 유래 혈관세포 및 SDF1a를 발현하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 심장 재생용 조성물 | |
| KR20210099527A (ko) | 줄기세포를 포함하는 심막 내 주입용 조성물 및 이의 용도 | |
| KR20120125196A (ko) | 허혈성 질환에서 신생혈관형성을 위한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법 | |
| Yu et al. | Construction of bone marrow mesenchymal cells-derived engineered hepatic tissue and its therapeutic effect in rats with 90% subtotal hepatectomy | |
| Batty | Pig Induced Pluripotent Stem Cells as a Preclinical Model for Cardiovascular Tissue Engineering |