KR20120125196A

KR20120125196A - 허혈성 질환에서 신생혈관형성을 위한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법

Info

Publication number: KR20120125196A
Application number: KR1020120048126A
Authority: KR
Inventors: 권상모; 이상훈
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2012-11-14

Abstract

본 발명은 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 (hybrid spheroid)의 제조방법, 이에 의해 제조된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 세포 치료제 및 조직공학용 지지체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체는, 동물모델에 이식 시 주변 세포와의 상호작용으로 줄기세포 생체 적합환경 조성을 통해, 줄기세포의 생존율 및 혈관세포로의 분화능력을 획기적으로 증가시키고, 면역 거부반응이 없어, 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제 및 조직공학용 지지체로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

허혈성 질환에서 신생혈관형성을 위한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법 {Method for preparing 3-dimentional stem cell hybrid spheroid for neovascularization in ischemic disease}

본 발명은 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 (hybrid spheroid)의 제조방법, 이에 의해 제조된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 세포 치료제 및 조직공학용 지지체에 관한 것이다.

줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제 (Cell therapy product)란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위(최소한 이상의 조작: more-than-minimal manipulation)를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 세포치료제를 이용한 세포치료 이식술에서는 신체 내 정상적 혹은 건강한 상태와 유사한 조직으로서 형질 발현된 신체 내를 구성하는 각종의 조직을 대신 할 수 있는 다수의 세포들로 구성되는 각 세포 재료를 분리, 준비하고, 체외 환경 (in vitro)에서 배양과정을 통해, 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 가하여, 이식물을 수령할 개체에게 주입하거나, 이들 세포로 인체조직을 만듦으로써 치료용으로 쓰이게 된다.

줄기세포 치료제는 세포치료제 중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심장질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게는 잘 이루어지지 않는 경우에서 활발하게 연구가 진행되고 있다.

줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다.

일반적으로, 줄기세포는 주변의 세포 (니치 세포, Niche cell)에 둘려 싸여져 성장하며, 이러한 니치 세포는 줄기세포를 지지하고, 다양한 사이토카인 분비를 통해 줄기세포의 성장을 돕는다. 이러한 환경을 줄기세포 생체적합환경 (stem cell niche condition) 이라고 명명하고 있다.

종래 연구를 통하여, 지방, 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포치료제가 허혈성 질환 치료에 사용될 수 있고, 혈관을 재생시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 경우 줄기세포를 2차원 배양접시에서 배양하고, 부착되어 있는 배양한 세포를 트립신 처리에 의해 수거한 후 수거된 세포를 단일 세포(single cell)의 형태로 환자의 허혈성 병변부위에 이식하는 방법이 일반적으로 사용된다. Rosova I et al. Stem Cells. (2008)에는 골수 유래 줄기세포를 저산소 조건인 2차원적 배양접시에서 배양하여 단일 세포 형태로 하지 허혈 마우스 모델에 이식함으로써 혈류 흐름 회복 및 조직 재생의 효율을 높이는 내용을 보고하였다. 그러나, 이 경우 허혈 부위에 이식된 줄기세포의 대부분이 사멸되어 세포치료제로서의 치료효능이 크지 않은 문제점이 있어 왔다. 특히 트립신 처리를 통해 수거된 세포들은 트립신에 의해 세포가 해를 받거나, 세포에 붙어있는 세포 외 기질(extracellular matrix)이 트립신 효소에 의해 세포로부터 이탈되어 세포 외 기질에 포함된 성분들이 소실되어 환자에 이식 후 세포 생존율이 낮아졌다. 또한, 2차원 배양접시를 이용한 세포 배양은 대량 배양이 어려워 많은 수의 세포가 요구되는 임상 치료에 적합하지 않기 때문에 세포치료제의 임상 적용에 어려움이 있었다.

또한, 치료용 성체 줄기세포의 수급이 용이하지 않고, 줄기세포 치료제를 필요로 하는 환자의 고령화에 따른 위험인자 (당뇨, 흡연) 등의 요인으로 인해 줄기세포의 기능적 저하가 문제로 대두 되고 있다. 따라서 최근 줄기세포 치료제의 수급의 대부분은 건강한 사람의 골수에서 추출하며, 이로 인한 타인에게 이식 시의 면역거부반응이 피해갈 수 없는 난제로 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포를 이용한 세포치료제에 관한 연구를 계속하던 중, 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 형성하기 위한 새로운 방법을 개발하였으며, 이를 통해 형성된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 동물 모델에 이식 시, 줄기세포의 생존율 및 혈관세포로의 분화능력 등을 획기적으로 증가시키며, 면역 거부반응이 없어 면역 적합성 세포 치료제 및 조직공학용 지지체로 이용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 통해 제조된 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제 또는 면역적합성 세포 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 통해 제조된 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법을 통해 제조된 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제 또는 면역적합성 세포 치료제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법을 통해 제조된 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.

본 발명에 따른 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체는, 동물모델에 이식 시 주변 세포와의 상호작용으로 줄기세포 생체 적합환경 조성을 통해, 줄기세포의 생존율 및 혈관세포로의 분화능력을 획기적으로 증가시키고, 면역 거부반응이 없어, 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제 및 조직공학용 지지체로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 환자 자신의 지방에서 추출한 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화 시킨 후 이를 지지세포 (niche cell)로 이용하고, 건강한 타인의 줄기세포를 이용하여 형성한 면역 적합성 줄기세포 융합세포체는 면역 거부반응이 없어 면역적합성 줄기세포 치료제로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 1차 구상체를 형성하기 위한 구상체 형성 전용 배양용기를 나타낸 도이다 (1: 배양용기 덮개, 2: 배양 용기, 3: 마그네틱 바, 4: 교반기).
도 2는 본 발명에서 2차 구상체를 형성하기 위한 지지세포가 있는 구상체 형성 배양 접시를 나타낸 도이다 (5: 배양용기, 6: 지지세포, 7: 쉐이커).
도 3은 본 발명의 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 초기 EPC 구상체 (early EPC spheroid) 및 후기 EPC 구상체를 위상차 현미경을 이용하여 관찰한 도이다.
도 5는 인간 또는 마우스의 연골세포 (chondrocyte) 및 마우스 근모세포 (myoblast)를 니체 세포로 첨가하여 제조된 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 위상차 현미경을 이용하여 관찰한 도이다.
도 6은 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 다양한 종류의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 형태를 관찰한 것으로, 지지세포를 PKH26(Red)로 염색하고 줄기세포를 PKH67(Green)으로 염색하여, 줄기세포가 지지세포 안쪽에 위치하는 형태의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 형태를 형광 주사현미경을 이용하여 관찰한 도이다.
도 7은 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 줄기세포 하이브리드 융합 세포체에서 niche component를 면역염색을 이용하여 관찰한 도이다.
도 8은 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 줄기세포 하이브리드 융합 세포체에서 혈관 형성 사이토카인의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스에 이식한 후, 이식 부위를 생검하여, 항-세포사멸 단백질(anti-apoptic protein)의 발현 정도를 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스에 이식하고 28일 후 이식 부위를 생검하여, 혈관신생 마커인 CD31의 발현을 관찰한 도이다.
도 11은 본 발명의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스에 이식하고 28일 후 이식 부위를 생검하여, 모세혈관 및 동맥의 형성 정도를 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스에 이식하고, 이식 부위를 생검한 후, HNA(human anti-nuclear antibody)염색을 통해 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 생존율을 확인한 도이다.
도 13은 본 발명의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 이식 전, 후 마우스의 양측 하지에서 레이저 도플러(Moor Instruments, Devon, UK)로 혈류량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 도 13의 결과를 그래프로 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 하지 허혈 마우스에 이식한 후, 면역관용 (immune tolerance) 능력을 유세포 분석기를 이용하여 확인한 도이다.

본 발명은,

(a) 줄기세포를 진탕배양하여 1차 구상체를 형성하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 1차 구상체를 지지세포와 함께 진탕배양하여 2차 구상체를 형성하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 2차 구상체에 니치 세포 (niche cell)를 첨가하는 단계;를 포함하는 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 과정을 통해 형성된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제 또는 면역적합성 세포 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 과정을 통해 형성된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체는 줄기세포를 진탕배양하여 1차 구상체를 형성하고, 상기 1차 구상체를 지지세포와 진탕배양하여 2차 구상체를 형성하고, 상기 2차 구상체의 형성 과정에서 니치 세포를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 (a) 단계는 1차 구상체를 형성하는 단계로, 마그네틱바가 있는 배양 용기를 이용하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 줄기세포를 단일 세포로 분리 한 뒤, 10⁴내지 10⁸여개의 세포를 구상체 형성 전용 배양용기에 옮긴 후, 1~3일 동안 40 내지 80 rpm으로 마그네틱바를 회전시켜가며 배양한다. 이때, 접종되는 줄기세포의 농도가 1× 10⁴세포/㎠ 미만일 경우에는 구상체의 크기가 재현성을 얻을 수 없고, 이의 농도가 1× 10⁸세포/㎠를 초과하는 경우에는 과다한 세포의 접종으로 세포사가 일어나는 문제점이 발생할 수 있다. 접종되는 줄기세포의 초기 농도에 따라 형성되는 구상체의 크기가 달라질 수 있다.

상기 줄기세포의 종류는 이에 제한되지 않으나, 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells), 혈관내피전구세포(endothelial Progenitor Cell), 배아줄기세포(embryonic stem cell), 근모세포(myoblast), 심장줄기세포(cardiac stem cell) 등이 이용될 수 있으며, 이들 세포는 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물 형태로 사용될 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 이에 제한되지 않으나 골수, 근육, 지방, 제대혈, 양막, 또는 양수로부터 분리될 수 있다. 상기 혈관내피전구세포는 이에 제한되지 않으나 혈액, 제대혈, 배아 또는 골수로부터 분리될 수 있다.

상기 (b) 단계는 2차 구상체를 형성하는 단계로, 상기 (a) 단계에서 형성된 1차 구상체를 지지세포가 있는 배양 접시에 옮겨 수행하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 상기 (a) 단계에서 형성된 1차 구상체를 구상체 형성 배양 접시에 옮기고, 1 내지 5일 동안 1차 구상체가 부유 성장할 수 있도록 30 내지 70rpm으로 쉐이커에서 배양한다.

상기 지지세포의 종류는 이에 제한되지 않으나, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells), 혈관내피전구세포(endothelial Progenitor Cell), 근모세포(myoblast), 연골세포(chodrocyte) 등이 이용될 수 있다. 상기 (b) 단계에서 1차 구상체를 (a) 단계와는 상이한 지지세포가 있는 배양 접시로 옮겨 배양할 경우, 구상체가 배양 접시에 침착되는 것을 방지할 수 있고, 지지세포로부터 다양한 사이토카인을 공급받을 수 있으며, 외부로부터 새로운 배양액 공급이 원활하여, 건강한 세포를 수득할 수 있다.

상기 (c) 단계는 하이브리드 융합 세포체를 제조하기 위하여, (b) 단계의 2차 구상체의 형성 과정에서 니치 세포를 첨가하는 단계이다.

상기 니치 세포의 종류는 이에 제한되지 않으나, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells), 연골세포 (chondrocyte), 근모세포 (myoblast)등이 이용될 수 있다.

본 발명의 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법을 통해 수득된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체는 동물모델에 이식 시 주변 세포와의 상호작용으로 줄기세포 생체 적합환경 조성을 통해, 줄기세포의 생존율 및 혈관세포로의 분화능력을 획기적으로 증가시키고, 면역 거부반응이 없어, 이를 이용하여 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제 및 조직공학용 지지체로 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 허혈성 질환은 심근경색, 뇌경색, 허혈성 급성신부전증, 허혈성 급성간부전증, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 신증, 외과수술 부작용에 기인한 허혈성 질환 또는 기관 조직 손상등을 포함한다.

본 발명에 따른 세포 치료제는 세포 단독 혹은 필름상에서 배양된 상태로 개체의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스 콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있다. 상기 제제에는 유효성분인 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 포함될 수 있으며, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 세포치료제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 세포 치료제에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 치료제는 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하다. 본 발명의 세포 치료제의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 세포 치료제의 투여량은 바람직하게는 1회 (1Ⅹ10⁶) ~ (3Ⅹ10⁶) 세포이며, 통상적으로 1 회 또는 수 회 투여된다.

본 발명에 따른 조직공학용 지지체는 생분해성 고분자를 성형하여 만든 지지체에 본 발명의 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체가 파종(loading)되어 있는 형태로 구성될 수 있다.

상기 생분해성 고분자는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 생체적합성, 혈액친화성, 항석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 말한다. 이러한 생분해성 고분자의 종류는 이에 제한되지 않으나, 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 이들의 혼합물 등이 포함된다.

본 발명에 따른 조직공학용 지지체 내에서, 생분해성 고분자의 함량은 5 내지 99 중량%인 것이 바람직하다. 만약 상기 생분해성 고분자의 함량이 5 중량% 미만이면 조직공학용 지지체의 성형이 잘 이루어지지 않아 지지체의 기계적 강도가 약해지는 반면, 이의 함량이 99 중량%를 초과하면 본 발명의 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 파종이 어려워지는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 조직공학용 지지체는 기존의 공지된 방법, 예를 들어, 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method), 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion) 등에 따라 생분해성 고분자를 성형하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 혈관내피전구세포를 이용한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조

혈관내피전구세포를 이용하여 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 제조하기 위하여, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

먼저, 도 1의 구상체 (spheroid) 형성 전용 배양용기를 이용하여, 줄기세포 (초기 혈관내피전구세포 (early ehdothelial progenitor cell, early EPC), 후기 혈관내피전구세포 (late ehdothelial progenitor cell)의 1차 구상체를 형성하였다. 본 발명의 구상체 형성 전용 배양용기는, 배양 용기 내에 마그네틱바가 있는 구조로써, 교반기(stirrer) 작동에 의해 마그네틱바가 회전하며 줄기세포가 용기 바닥에 침착 되지 않고 부유하여 1차 구상체를 형성한다. 보다 구체적으로는, 줄기세포를 단일 세포 (single cell)로 분리한 뒤, 10⁶ 여개의 세포를 도 1의 구상체 형성 전용 배양용기에 옮겼다. 그 후 1~2일 동안 60 rpm으로 마그네틱바를 회전시켜, 줄기세포가 서로 응집하면서 1차 구상체를 형성하도록 하였다. 상기 과정을 통해 형성된 1차 구상체를 지지세포가 있는 구상체 형성 배양 접시에 옮기고, 옮겨진 1차 구상체가 부유 성장할 수 있도록 50rpm으로 쉐이커에서 3일간 배양하여 2차 구상체를 형성하였다. 이와 같이, 본 발명의 2차 구상체를 형성하기 위한 지지세포가 있는 구상체 형성 배양 접시를 이용할 경우 (도 2 참조), 구상체가 배양 접시에 침착되는 것을 방지할 수 있고, 지지세포로부터 다양한 사이토카인을 공급받을 수 있으며, 외부로부터 새로운 배양액 공급이 원활하여, 건강한 세포를 수득할 수 있다. 상기 2차 배양체의 형성 시에 다양한 종류 (human chondrocyte, mouse chondrocyte, mouse myoblast)의 니치 세포 (niche cell)를 첨가하였으며, 최종적으로 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 수득하였다. 이상의 실험 과정을 도 3에 모식도로 나타내었다.

실시예 2. 중간엽 줄기세포를 이용한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조

먼저, 마우스 복강에서 지방 조직을 추출하여 중간엽 줄기세포를 분리한 후, 초대 배양하였다. 상기 중간엽 줄기세포를 연골세포로 분화시킨 후 이를 니치 세포로 이용하였다. 그 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 제조하였다.

실험예 1. 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 관찰

상기 실시예 1에서 수득한 혈관내피전구세포의 2차 구상체 (니치 세포가 첨가되지 않은 경우) 및 다양한 종류 (human chondrocyte, mouse chondrocyte, mouse myoblast)의 니치 세포를 첨가하여 수득한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 각각 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 상시 실시예 1의 과정을 거쳐 형성된 줄기세포 구상체 및 줄기세포 하이브리드 융합 세포체는 구형을 나타냄을 확인하였다.

또한, 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 구조를 보다 자세히 관찰하기 위하여, 줄기세포를 단일세포로 분리하고 PKH67(Green)으로 염색한 후, 실시예 1과 동일한 과정을 통해 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 형성하고, 이의 실질세포를 PKH26(Red)으로 염색하여, 형광 주사 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 실질세포가 줄기세포 주위를 감싸는 형태의 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체가 형성된 것을 확인하였다.

또한, 상기 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체에서 면역염색법을 이용하여 N-카데린 (Cadherin), 인테그린 (Integrin, Inβ), 피브로넥틴 (Fibronectin, FN), 콜라겐 (Collagen, Col l, III, IV) 의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체에서 niche component가 확인되었으며, 이를 통해 ECM(extracellular matrix)의 발현의 증가로 줄기세포와 니치 세포 간의 신호전달이 활발히 일어나며, 실시예 1의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체가 niche condition임을 확인하였다.

또한, 상기 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 내에서 혈관형성 사이토카인의 발현을 웨스턴 블럿을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 내에서 다양한 혈관형성 사이토카인의 발현이 유의성 있게 증가함을 확인하였다. 이를 통해, 실시예 1의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 이식할 경우, 혈관 재생에 관여하는 사이토카인의 양적인 증가로 인해, 혈관형성에 직접적으로 관여할 수 있을 것이라는 가정을 세울 수 있게 되었다.

실험예 2. 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 이식 시 혈관 재생 효과 검증

실시예 1에서 수득한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 동물 모델에 이식할 경우, 혈관 재생 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 하기와 같이 실험을 수행하였다.

먼저, 마우스의 복강 내에 케타민(ketamine HCI) 60 mg/kg을 투여하여 전신 마취를 실시하였다. 마우스 왼쪽 하지의 피부를 약 2 cm가량 절개하여 혈관을 확인한 후, 아래배벽동맥 (inferior epigastric artery)의 아래 부분부터 표재대퇴동맥 (superficial femoral artery)의 중간 지점까지 결찰 후 분리하였다. 수술 후, 단층의 EPC (monolayer EPC), EPC 구상체 (spheroid), 및 상기 실시예 1에서 수득한 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 수술 부위에 이식하였다. 이식 후, 3, 12, 24, 72, 시간 및 7일 후 이식 부위의 근육을 생검하였다.

상기 마우스의 근육에서 항-세포사멸 단백질(anti-apoptic protein)의 발현 정도를 관찰하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 이식 초기에 비하여, 이식 7일 후에는 항-세포사멸 단백질의 발현이 크게 감소한 것을 확인하였다.

또한, 이식 28일 후, 이식 부위의 근육을 생검하여, 혈관신생 마커인 CD31의 발현 정도를 관찰하였으며, 마우스 내 모세혈관 및 동맥의 형성 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 각각 나타내었다.

도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스의 수술 부위에 이식하였을 때, CD31의 발현이 증가하며, 뛰어난 혈관신생 효과를 가짐을 확인하였다.

또한, 이식 7일 후, 이식 부위의 근육을 생검하여 HNA(Human Anti-nuclear Antibody)염색을 통해, 이식된 세포의 생존율을 확인하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스의 수술 부위에 이식하였을 때, 높은 생존율을 가지는 것을 확인하였다.

또한, 수술 전, 수술 당일, 수술 (이식) 후 3일, 1주, 2주째에 마우스를 케타민을 사용하여 마취하고 털을 제거한 후, 레이저 도플러 (Moor Instruments, Devon, UK)를 이용하여 양측 하지에서의 혈류량을 측정하였다. 수술한 하지의 혈류량과 수술하지 않은 반대쪽 하지(nonischemic limb)의 혈류량의 비율로 표시하였다. 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.

도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스의 수술 부위에 이식하였을 때, 마우스 내에서 우수한 혈관 재생 효과를 나타냄을 확인하였다.

실험예 3. 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 면역관용 효과 검증

실시예 2에서 수득한 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 동물 모델에 이식할 경우, 면역 관용 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 실시예 1의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 대신 실시예 2의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 (MSCD-chondrocyte)를 이용하는 것을 제외하고는, 실험예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 이식 3일 후, 이식 부위의 근육을 생검하여 단일세포로 분리 후 유세포 분석기를 이용하여 근육 내 CD8⁺ 세포 (cytotoxic T cell)의 침투 정도를 평가하였다. 또한, Foxp3 형질전환 마우스 (transgenic mice)를 이용하여 Foxp3⁺세포 (regulatory T cell)의 침투 정도를 평가하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체를 마우스의 수술 부위에 이식하였을 때, CD8⁺, Foxp3⁺ 세포의 수가 정상 마우스의 근육 내 침투와 비슷한 비율로 나타남을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 줄기세포 하이브리드 융합 세포체가 면역 관용을 가지고 있음을 확인하였다.

Claims

(a) 줄기세포를 진탕배양하여 1차 구상체를 형성하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 1차 구상체를 지지세포와 함께 진탕배양하여 2차 구상체를 형성하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 2차 구상체에 니치 세포 (niche cell)를 첨가하는 단계;를 포함하는 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 (hybrid spheroid)의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 혈관내피전구세포, 배아줄기세포, 근모세포 및 심장줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 지지세포는 중간엽 줄기세포, 연골세포 및 근모세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 니치 세포는 중간엽 줄기세포, 연골세포 및 근모세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 3 차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 (hybrid spheroid)를 포함하는 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제.
제 5항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 심근경색, 뇌경색, 허혈성 급성신부전증, 허혈성 급성간부전증, 당뇨성 족부궤양, 당뇨성 신증, 외과수술 부작용에 기인한 허혈성 질환 및 기관 조직 손상으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 허혈성 질환의 치료용 세포 치료제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 (hybrid spheroid)를 포함하는 면역적합성 세포 치료제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체 (hybrid spheroid)를 포함하는 조직공학용 지지체.
제 8항에 있어서, 상기 조직공학용 지지체는 생분해성 고분자를 성형하여 만든 지지체에 3차원적인 줄기세포 하이브리드 융합 세포체가 파종(loading)되어 있는 형태로 구성된 것을 특징으로 하는, 조직공학용 지지체.
제 9항에 있어서, 상기 생분해성 고분자는 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 및 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조직공학용 지지체.
제 8항에 있어서, 상기 조직공학용 지지체는 염 침출법(solvent-casting and particle-leaching technique), 가스발포법(gas forming technique), 고분자 섬유를 부직포로 만들어 고분자 메쉬(mesh)로 제조하는 방법(fiber extrusion and fabric forming process), 상분리법(thermally induced phase separation technique), 유화 동결 건조법(emulsion freeze drying method) 및 고압 기체 팽창법(high pressure gas expansion)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 조직공학용 지지체.