JP2023506679A - IgEのリバースLFIA - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年10月27日に米国特許商標庁に出願された「抗原特異的IgEの測定のためのリバースラテラルフローイムノアッセイ方法」と題された米国仮特許出願第62/926,528号に基づき、その利益を主張し、その出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
a.ラテラルフローアッセイの形で、吸湿性ストリップ上の反応領域の表示を可能にするプラスチック又は紙のハウジングと、
b.サンプル(尿、全血、血漿、血清、唾液、又は他の体液)を追加でき、ハウジングの一端にある開口部と、
c.抗原又は抗体と反応し得る固定化特異的結合部材を有する吸湿性材料と、
d.サンプルポートの反対側の一端で囲まれ、横に流れるサンプル、緩衝液及びコロイドを吸収するために使用される、吸収力のある吸湿性材料のパッド、例えば、吸収性パッドと、
e.適用されたサンプルを最初に吸収するためにサンプルポートの一端で使用される吸湿性材料のストリップと、
f.サンプルポート材料及びラテラルフローストリップと接触し、乾燥した着色固相試薬、抗体又は他のタンパク質でコーティングされた固相を含む、吸湿性材料のストリップとを含む。
1)着色固相又はナノ粒子は、ヒトIgG抗体と反応するタンパク質又はレクチン[タンパク質A、タンパク質G、レンチルレクチン、ジャカリン、コンカナビリンA、マンナン結合タンパク質、小麦胚芽レクチン、ピーナッツレクチンなど]とコンジュゲートされる。固相は、分析対象のサンプルに含まれるIgG、IgM及びIgAと特異的に反応する抗免疫グロブリンでコーティングされ得る。この場合、吸湿性ストリップは、サンプルに含まれる特定の抗体が反応する対象の分析物を含む。
1.サンプルパッド、
2.コンジュゲートパッド、
3.代替としてサンプルパッドとコンジュゲートパッドとの両方の目的を果たす複合パッド(図1A)、
4.コンジュゲートパッドまで乾燥された抗原又はアレルゲンと結合した金ナノ粒子を含むコンジュゲート、
5.試験線の位置に抗ヒトIgE抗体が事前に分注されたタンパク質結合膜、及び対照線の位置に事前に分注された抗抗原抗体、
6.吸収性パッド、
7.上記全ての部材は、裏当て支持体に取り付けられ、
8.サンプルパッドとコンジュゲートパッドとの間、コンジュゲートパッドとタンパク質結合膜との間、及びタンパク質結合膜と吸収性パッドとの間には重なりがある。
1.希釈又は非希釈の試験サンプルを、0.1uLから1uLの容量で、又は1uLから50uLの容量で、0.1uL間隔でサンプルポートに直接適用するステップと、
2.サンプルポートへのサンプルの追加に続いて、ランニング緩衝液をすぐに滴加し、又はサンプルポートに1秒間間隔で1秒間~60秒間、及び60秒間~120秒間の設計された時間枠を待つステップと、
3.あるいは、試験される様々な量のサンプル(希釈又は非希釈)をランニング緩衝液と事前に混合してから、ラテラルフロー装置のサンプルポートに適用し得るステップと、
4.サンプル中の分析物の濃度に応じて、色濃度で示される試験結果を、5秒間~10分間、又は10分間より長く視覚化し得るステップと、
5.設計されたラテラルフローリーダによって色濃度を視覚化し又は読み取ることができるステップとを含む。
同じピーナッツアレルギーサンプル(PL14231)を使用したR-LFIAとC-LFIAの検出感度の比較。アスタリスク記号は、それぞれの方法で検出される最終希釈を表す(図4)。最適なドット条件で、R-LFIAは1:300希釈から陽性シグナルを検出することができるが、C-LFIAは1:10希釈で陽性シグナルを検出することができ、ピーナッツ特異的IgE検出に関してC-LFIAよりもR-LFIAの感度が30倍高いことを示す。
3個(PA2、PA3、PA6)のピーナッツアレルギー血漿サンプルからR-LFIAによって検出された最終希釈。ImmunoCAPメソッドで測定された対応するIUレベルは、R-LFIA感度限界を決定するための比較に使用される(図5)。一連の2倍希釈試験により、R-LFIAはImmunoCAP(0.35IU/ml、又は0.35kUA/L)の感度限界と同等又はそれ以下のシグナルレベルを検出できることが明らかになり、ImmunoCAPIgE試験と同等又はそれ以上の感度を示す。
様々な量のピーナッツアレルギー血漿を使用したR-LFIA検出結果。わずか0.5lのPA3サンプルは、R-LFIAで測定された視覚化可能な陽性シグナルを十分にもたらす(図6)。従って、サンプル量を0.5ul~9ulに段階的に増やすと、特にAU値が正規化された場合、陽性シグナルレベルがほぼ直線的に増加する。これらのデータにより、R-LFIAは高感度、診断試験用の幅広いサンプル量に対応できる実用的に柔軟なPA診断ツールであることを示す。
既知のピーナッツアレルギーのないランダムな正規母集団におけるピーナッツ特異的IgEレベル。90%のランダムな正規母集団では、検出可能なピーナッツ特異的IgEは示されないが、約10%は、AU<6.0の弱い陽性を示す(例えば、サンプルNS45、図7)。これらの弱陽性サンプルは、1lの100g/ml粗ピーナッツ抽出物によって完全に阻害され得、R-LFIAがランダム集団から低レベルのピーナッツ特異的IgEを検出することを示す。
ピーナッツ特異的IgE検出のためのR-LFIAの特異性。ピーナッツIgER-LFIAは、Ara h1及びAra h2に特異的な組み換えIgEとのみ反応するが、100IU/mlのアレルゲン特異的IgEと牛乳(Bos d5及びBos d8)、エビ(Pen a1)、卵(Gal d1)、魚(Gad m1)、樺花粉(Bet v1)及びハウスダニ(Der p1)と交差反応しない。陽性対照として、PAサンプルPL 26259は強い陽性反応性を示す(図8)。
R-LFIA IgE試験結果と好塩基球活性化試験(BAT)の結果との相関。BATで確認された11個のピーナッツアレルギーサンプルは全てピーナッツIgE R-LFIAを使用して高いAUレベルを示す(図9)。
ピーナッツIgER-LFIAの診断カットオフ値。この予備研究から得られたデータを使用し、カットオフ値がAU=6に設定される場合、R-LFIAはピーナッツアレルギー診断に対して100%(11/11)の陽性の予測値と100%(251/251)の陰性の予測値を表す(図10)。
ピーナッツ特異的IgEレベルが17.5IU/mlを超える血漿サンプルのR-LFIAIgE試験結果(ImmunoCAP分類のクラスIV以上)(図11)。これらのデータは、ImmunoCAPによって決定されたクラスIVレベルのPS-IgEのサンプルの21.5%(6/28)に、R-LFIAで測定されたAUが含まれないか非常に低いことをまとめて示す。
3つのエビアレルギー血漿サンプルからR-LFIAによって検出された最終希釈。ImmunoCAPメソッドで測定された対応するIUレベルは、R-LFIA感度限界を決定するための比較に使用される(図12)。一連の2倍希釈試験により、R-LFIAはImmunoCAP(0.35IU/ml、又は0.35kUA/L)の感度限界と同等又はそれ以下のシグナルレベルを検出できることが明らかになり、ImmunoCAPIgE試験と同等又はそれ以上の感度を示す。
エビ特異的IgEレベルが17.5IU/mlを超える血漿サンプルのR-LFIAIgE試験結果(ImmunoCAP分類のクラスIV以上)(図13)。これらのデータは、ImmunoCAPによって決定されたクラスIVレベルのPS-IgEのサンプルの15.8%(3/19)に、R-LFIAで測定されたAUが含まれないか非常に低いことをまとめて示す。
Claims (13)
- ヒト抗原特異的免疫グロブリンE(IgE)を検出するために特別に設計されたリバースラテラルフローイムノアッセイ方法であって、前記リバースラテラルフローイムノアッセイは、以下の部材及び手順を含み、
a.前記リバースラテラルフローイムノアッセイ方法は、サンプルパッドと、コンジュゲートパッド、又は前記サンプルパッドと前記コンジュゲートパッドとの両方の目的を代替として果たす組み合わせパッドと、タンパク質結合膜と、裏当て支持体に取り付けられた吸収性パッドとを含む試験ストリップであり、前記サンプルパッドと前記コンジュゲートパッドとの間、前記コンジュゲートパッドと前記タンパク質結合膜との間、及び前記タンパク質結合膜と前記吸収性パッドとの間には重なりがあり、
b.接合体,を事前に分注し、前記コンジュゲートパッドまで乾燥し、あるいは、前記コンジュゲートを、液体の形で試験すべきサンプルと混合し、次にラテラルフロー装置の前記サンプルポートに適用し得、
c.抗ヒトIgE抗体を前記タンパク質結合膜の試験線の位置に事前に分注し、
d.抗抗原(例えば、抗ピーナッツ)抗体を前記タンパク質結合膜の対照線の位置に事前に分注し、
e.試験ストリップはカセットに収容し得、又はディップスティックの形であり得、
f.前記試験手順は、前記サンプルを前記サンプルパッド、又は前記サンプルパッドと前記コンジュゲートパッドを組み合わせた場合の前記コンジュゲートパッドに直接適用し、続いて、サンプルを追加した後、又は所定の時間間隔で、ランニング緩衝液を前記サンプルパッド/前記コンジュゲートパッドに適用することであり、あるいは、試験する前記サンプルをランニング緩衝液と事前に混合してから、前記ラテラルフロー装置の前記サンプルポートに適用することもでき、
g.前記テスト結果は、設計されたラテラルフローリーダによって視覚化又は機械で読み取ることができる、リバースラテラルフローイムノアッセイ方法。 - 前記ラテラルフローイムノアッセイ方法は、カセットに収容される、又はディップスティックの形の試験ストリップである、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記「リバース」は、具体的には、抗原を直接的又は間接的に、化学的又は物理的に、比色ナノ粒子に結合又はコンジュゲートさせる手順を指す、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記接合体は、具体的には、前記比色ナノ粒子にコンジュゲートされた抗原との複合体を指す、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記比色ナノ粒子は、コロイド金ナノ粒子、銀ナノ粒子、ラテックスナノ粒子、磁性ナノ粒子、蛍光標識ナノ粒子を含むが、それらに限定されない、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記タンパク質結合膜は、タンパク質及び抗体を固定化及び結合することができる固体支持体であり、ニトロセルロース膜、及びフッ化ポリビニリデン(PVDF)膜を含むがそれらに限定されない、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記抗原は、アレルゲン、自然環境抗原、病原性抗原、自己抗原、炭水化物抗原、脂質抗原、合成薬物抗原及びハプテンを含むが、それらに限定されない、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記アレルゲンは、ピーナッツ、牛乳、卵白、貝類、甲殻類、魚、木の実、赤身肉、小麦、大豆、ゴマなどの食物アレルゲン、チリダニ、花粉、ゴキブリ、ペットの鱗屑、カビなどの環境アレルゲン、ハナバチ、カリバチ、スズメバチ、黄蜂、ヒアリの毒などの昆虫アレルゲン、アレルゲン混合物、及びそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない、請求項7に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記自己抗原は、ヒト由来の可溶性タンパク質、細胞表面膜タンパク質、細胞内タンパク質、DNA、RNA、及びDNA/RNAとタンパク質との複合体を含むが、それらに限定されない、請求項7に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記病原性抗原は、蠕虫や他の寄生虫などの寄生虫抗原、細菌抗原、真菌抗原、新規コロナウイルス2019(SARS-CoV-2)スパイク及びヌクレオカプシドタンパク質などのウイルス抗原を含むが、それらに限定されない、請求項7に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記合成薬物抗原及び前記ハプテンは、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗腫瘍薬、並びに他の合成小分子及びハプテンを含むが、それらに限定されない、請求項7に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記抗ヒトIgE抗体は、マウス、ウサギ、ラット、ハムスター、馬、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ラクダ科の動物、リャマ、軟骨魚類、ヒト、ヒト化、組み換え体に由来するヒトIgEFc領域に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を含むが、それらに限定されない、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
- 前記抗抗原抗体は、マウス、ウサギ、ラット、ラクダ科の動物、ヒト、ヒト化、組み換え体に由来する抗原に対するポリクローナル又はモノクローナル抗体を含むが、それらに限定されない、請求項1に記載のリバースラテラルフローイムノアッセイ方法。
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