JP2023500674A - ウシ乳汁単離粉末状エクソソーム、栄養組成物および方法 - Google Patents

Abstract

ウシ乳汁単離粉末状エクソソームは無損傷のエクソソームを含む。栄養組成物は、蛋白質、炭水化物、および／または脂肪、ならびにウシ乳汁から単離したエクソソームを含む。粉末状エクソソームを調製する方法は：ウシ乳汁を遠心分離して上層の脂質画分、中間層の乳清画分、ならびに細胞および細胞破片の第１の沈殿を形成させること；その乳清画分を分離し、分離した乳清画分を遠心分離することによって、脂肪、カゼイン凝集物および細胞破片をさらに除去し、実質的に透明な乳清画分を形成させること；実質的に透明な乳清画分を精密濾過することによって、残留する細胞破片を除去すること；精密濾過した乳清画分を遠心分離することによって、エクソソームを含む沈殿を取得すること；水性媒体中でそのエクソソームを含む沈殿をインキュベートすることにより、エクソソーム膜を破壊することなく、沈殿を溶解し、エクソソーム懸濁液を提供すること；およびその懸濁液を乾燥することによって、粉末状エクソソームを取得することを含む。対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を発症するリスクを低減する、またはそれらの病態を治療する方法は、ウシ乳汁から単離したエクソソームを利用する。【選択図】図６

Description

本発明は、ウシ乳汁単離粉末状エクソソームに関するものであり、また蛋白質、炭水化物、および／または脂肪、およびウシ乳汁から単離したエクソソームを含む栄養組成物に関するものである。本発明はまた、ウシ乳汁単離粉末状エクソソームを調製する方法、栄養組成物を調製する方法、および粉末状エクソソームまたは粉末状栄養組成物を投与することによって、対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を発症するリスクを低減する、またはそれらの病態を治療する方法に関する。

ウシの乳汁は、細胞外二重膜性小胞であるエクソソームを含む。ウシ乳汁エクソソームは、健康と疾患の制御に役割を担うことが知られている生物活性物質（酵素および非酵素蛋白質（特に、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＭＨＣクラスＩＩ、ラクトアドヘリン、ＴＳＧ１０１およびＨｓｃ７０）、核酸（多量のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む）および脂質類（特に、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリン）など）を含む。乳汁エクソソームは、その内容物送達のために細胞による活発な取り込みが可能であるが、取り込みには乳汁エクソソーム二重膜が保存されていることが必要となる。エクソソーム構造によって生物活性物質が保護されるのだが、乳汁からエクソソームを単離する公知の方法は、エクソソーム膜を損傷させることもあり、そのためエクソソームの取り込みが損なわれて、生物活性物質の放出と生物活性の低下が起こる。例えば、エクソソームに含まれるｍｉＲＮＡおよびその他の生物活性物質などの化学物質は、二重膜の損傷が起こると、極端に不安定で露出から数秒以内に分解する。同様に、乳汁および／または単離エクソソームの加工、および／または単離エクソソームの長期保存は、エクソソーム膜の損傷または生物活性の低下を引き起こすことがある。したがって、ウシ乳汁エクソソームの改良単離法および安定性の改善されたエクソソームが望まれるのである。

インスリン耐性、前糖尿病、および糖尿病は、グルコース調節不全の病態である。生活様式の改善およびインスリン増感剤は、利用可能な治療方略のうちの一つであるが、これらが有効ではないことも多いため、インスリン療法が必要になることもある。食事の管理によって、代謝的な健康を改善することができ、体重を減らすことができる。長期にわたる体重維持の計画を立て、筋肉量を維持および改善し、またビタミン類およびミネラル類を摂取することによって、生活の質を改善し得る。多くの場合、残念なことに、上記のような病態を完全に治療するために、生活様式改善が適切であるとはいえない。したがって、インスリン感受性を改善する新規の組成物および方法が必要となるのである。

一実施態様において、本発明は、無損傷のエクソソームを含むウシ乳汁単離粉末状エクソソームを対象とする。無損傷のエクソソームとは、二重膜に損傷がなく、エクソソームの内容物がエクソソーム内に保持されているものである。

別の一実施態様において、本発明は、蛋白質、炭水化物、および／または脂肪、およびウシ乳汁から単離したエクソソームを含む栄養組成物を対象とするが、ここでエクソソームは、本発明の粉末状エクソソームを添加することによって提供される。特定の実施態様において、該栄養組成物は粉末状形態であるが、別の特定の実施態様においては、該栄養組成物は液状形態である。さらなる実施態様においては、該栄養組成物は、蛋白質、炭水化物、脂肪、およびウシ乳汁から単離したエクソソームを含み、ここで該エクソソームは、本発明の粉末状エクソソームを添加することによって提供される。

別の一実施態様において、本発明は、粉末状エクソソームを調製する方法を対象とする。該方法は、ウシ乳汁を遠心分離して、上層の脂質画分、中間層の乳清画分、および細胞および細胞破片の第１の沈殿を形成させること；乳清画分を分離して、分離した乳清画分を遠心分離することにより、脂肪、カゼイン凝集物および細胞破片をさらに除去して実質的に透明な乳清画分を形成させること；実質的に透明な乳清画分を精密濾過して残留する細胞破片を除去すること；精密濾過した乳清画分を遠心分離してエクソソームを含む沈殿を取得すること；水性媒体中でエクソソームを含む沈殿をインキュベートすることにより、エクソソーム二重膜を破壊することなく、沈殿を溶解し、エクソソーム懸濁液を提供すること；および懸濁液を乾燥して粉末状エクソソームを取得することを含む。

別の一実施態様において、本発明は、粉末状栄養組成物を調製する方法を対象とする。該方法は、蛋白質、脂肪、および炭水化物を含む粉末状組成物を、ウシ乳汁から単離した粉末状エクソソームと乾式混合することを含む。

さらなる実施態様において、本発明は、対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を発症するリスクを低減する、あるいは対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を治療する方法を対象とする。該方法は、インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を発症するリスクを有する、またはそれらの病態を有する対象に、本発明のエクソソームまたは本発明の栄養組成物を投与することを含むが、ここでエクソソームの投与量は、それぞれ、インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病の発症リスクを低減する、またはそれらの病態を治療するのに有効な量である。

本発明のウシ乳汁単離エクソソームは、利用し易く安定した形態で生物活性物質を提供し、特定の実施態様においては、栄養組成物として提供するという点において利点を有している。したがって、治療上有益な生物活性物質の利用が容易になる。本発明のこれらの目的と利点、およびその他の目的と利点については、後述の詳しい説明に基づけば、より詳細に理解されるであろう。

図面で説明する実施態様は、本発明の特定の局面について実例を示すものであり、本来、例示を目的としており、特許請求の範囲で特定される本発明を限定する意図ではない。

倍率８８０倍の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図１Ａ～１Ｃ）、倍率１０，０００倍の像（図１Ｄ～１Ｆ）、および倍率２５，０００倍の像（図１Ｇ～１Ｉ）を示している。図１Ａ、１Ｄおよび１Ｇは本発明の実施態様の新鮮エクソソーム、図１Ｂ、１Ｅおよび１Ｈは凍結・解凍したエクソソーム、ならびに図１Ｃ、１Ｆおよび１Ｉは粉末状エクソソームである；実施例１で説明するように、いずれも酢酸ウラニルで染色したものである。 実施例１に記載するように、本発明の実施態様の新鮮エクソソームおよび粉末状エクソソームのそれぞれにおけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の相対発現を示すものである。 実施例１に記載するように、本発明の実施態様の凍結乾燥生乳および凍結乾燥粉末状エクソソームのそれぞれを含む栄養組成物中におけるインスリン制御に関連する複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）内容物を示すものである。 実施例２に記載するように、凍結乾燥エクソソームまたは超音波処理エクソソームの濃度をそれぞれ増加させ、それらと共に２４時間インキュベートした筋肉細胞におけるグルコース取り込みを示すものである。 実施例２に記載するように、それぞれ凍結乾燥エクソソームまたは超音波処理したエクソソームと共に２４時間インキュベートした筋肉細胞におけるＧＬＵＴ－４トランスポーター蛋白質のレベルを示すものである。 実施例２に記載するように、それぞれ凍結乾燥エクソソームまたは超音波処理したエクソソームと共に２４時間インキュベートした筋肉細胞におけるＧＬＵＴ－４ ｍＲＮＡレベルを示すものである。 実施例２に記載するように、凍結乾燥エクソソームまたは超音波処理したエクソソームの濃度をそれぞれ増加させ、それらと共に２４時間インキュベートした筋肉細胞におけるＧＬＵＴ－４遺伝子プロモーター活性を示すものである。

本発明の特定の実施態様を本明細書中で説明する。しかしながら、本発明は異なる形態でも具現化することができるので、本発明が本明細書に記載の実施態様のみに限定されるものと解釈すべきではない。それよりもむしろ、これらの実施態様は、本発明の特定局面のより具体的な特徴を当業者に例示する目的で提供するものである。

本明細書中の専門用語は、実施態様の説明のみを目的としており、本開示を全体として限定するものと解釈すべきではない。本開示の単数形の特徴または限定についての言及はすべて、他で特定しない限り、またはその言及が成される文脈によって、そうではないことが明確に示されるのでない限り、対応する複数形の特徴または限定を内包するものであり、またその逆も同様である。他で特段に明示しない限り、「不定冠詞ａ」、「不定冠詞ａｎ」、「定冠詞ｔｈｅ」および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」は、同義語として用いられる。さらに、本明細書中の説明、および付属の特許請求項において用いられる単数形の「不定冠詞ａ」、「不定冠詞ａｎ」、「定冠詞ｔｈｅ」は、文脈によってそうではないことが明確に示されるのでない限り、その複数形をも含むものである。

用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」が、本明細書中の説明または特許請求項において用いられる場合に限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が請求項の移行部として用いられるときのこの用語の解釈のように、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」もまた用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と同様に付加的要素または工程を含むものであることが意図される。さらに、用語「または（ｏｒ）」（例えば、Ａまたは（ｏｒ）Ｂ）が用いられる場合に限り、「Ａまたは（ｏｒ）Ｂまたは（ｏｒ）両方」を意味することが意図される。「Ａまたは（ｏｒ）Ｂのみであって、その両方ではない」ことが意図される場合には、「Ａまたは（ｏｒ）Ｂのみであって、その両方ではない」という表現が用いられる。したがって、本明細書中における用語「または（ｏｒ）」の使用は包括的ではあるが、排他的ではない。「Ａおよび／または（ａｎｄ／ｏｒ）Ｂ」のように、用語「および（ａｎｄ）」ならびに「または（ｏｒ）」が一緒に用いられる場合には、Ａまたは（ｏｒ）ＢならびにＡおよび（ａｎｄ）Ｂを意味するものである。

本開示に記載の粉末状エクソソーム、栄養組成物、および方法は、本明細書中に記載の要素および工程の任意のものを含み得る、それらの任意のものから成るものであり得る、または本質的にそれらの任意のものから成るものであり得る。

本明細書に開示される範囲およびパラメーター（割合（％）、部分、および比率を含むが、これらのみに限定されるものではない）は全て、そこに内包される任意および全ての小範囲、ならびに終点間の全ての数を含むものであることを理解されたい。例えば、「１～１０」という範囲について言及する場合には、それは、最小値である１またはそれより大きな数で始まり、かつ最大値である１０またはそれ未満の数で終わる任意および全ての小範囲（例えば、１から６．１まで、または２．３から９．４まで）、ならびにその範囲内に含まれる各整数（１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０）までを含むものと見なすべきである。

本明細書中に記載の方法または処理工程のいずれの組み合わせも、他で特定しない限り、あるいは組み合わせについて言及が成された文脈によって、そうではないことが明確に示されるのでない限り、任意の順序で実施することができる。

他で特段の記載がない限り、割合（％）は全て重量の割合（％）である。

本明細書中の用語「ウシ乳汁単離エクソソーム」は、他で特定しない限り、その他のウシ乳汁成分（脂質類、細胞、および細胞破片など）から実質的に分離されており、ウシ乳汁に存在する場合よりも多い量に濃縮されているエクソソームを指す。乳汁エクソソームは、ウシ乳汁に「溶解した」小型の固形粒子であり、全固形分中でそれが占める割合は微量である。本明細書中に記載するようなエクソソームの単離によって、元々は乳汁に存在しているエクソソームが濃縮された液体が調製される。明白ではあるが、該粉末状エクソソームは、乳汁エクソソームと同一サイズであって、エクソソームと一緒に単離される他の乳汁固形物（すなわち、カゼインおよびその他の乳清蛋白質）をも含んでいることがある。

本明細書中の用語「粉末状エクソソーム」は、他で特定しない限り、ウシ乳汁から単離されているエクソソームを含む乾燥粉末を指す。エクソソームを乾燥させて乾燥粉末にする。具体例としては、単離エクソソームは凍結乾燥によって粉末状エクソソームになっている。上記のように、エクソソームを含む単離液体が同時に単離される乳汁固形物をも含む場合には、粉末状エクソソームもその得られた粉末中にそのような他の乳汁固形物を含む。

重要なことは、本発明の粉末状エクソソームが無損傷のエクソソームを含むということである。無損傷のエクソソームとは、二重膜が損傷しておらず、エクソソームの内容物がエクソソーム内に保持されているものである。

上述のように、乳汁は、健康を改善し得る生物活性物質を含むエクソソームを含んでいる。さらに具体的には、ウシ乳汁は、例えば、筋肉から骨および脂肪から皮膚、脳、肝臓、胃腸、および脈管構造に至るまで、さまざまな臓器、組織、および系の健康的機能を促進する複数種類のｍｉＲＮＡを含んでいる。しかし、ｍｉＲＮＡなどの因子は急速に分解する傾向があるので、そのような有益な機能が失われる。乳汁エクソソームは、ｍｉＲＮＡに保護的環境を提供するが、エクソソームを単離する現在の技術ではエクソソーム膜を損傷することも多い。それとは対照的に、本発明は無損傷の単離エクソソームを粉末形態で提供する。

一般的に、ウシ乳汁単離粉末状エクソソームは、エクソソーム二重膜を破壊しない穏和な処理を用いてウシ乳汁から取得するので、エクソソームは無損傷であり、生物活性物質がエクソソーム構造内に含まれたままである。一実施態様においては、単離濃縮エクソソームが懸濁液の形態で提供され、その懸濁液を乾燥することによって粉末状のエクソソームが提供される。様々な方法を用いて、二重膜を破壊しないように注意を払いながらエクソソームを単離することもできる。新鮮ウシ乳汁および／または解凍した凍結ウシ乳汁をエクソソーム供給源として用いてもよい。特定の実施態様において、エクソソームを単離する工程は、乳汁をウシから取得後直ぐに単離を行うことを含む。別の実施態様において、エクソソームを単離する工程は、乳汁をウシから取得した時点から約１日以内、または約２日以内、または約３日以内、または約４日以内、または約５日以内、または約６日以内、または約７日以内に単離を行うことを含む。特定の実施態様においては、乳汁をウシから取得した時点から約１０日以内、または約１４日以内に、エクソソームを単離する。別の実施態様においては、ウシ乳汁を凍結し、その後、本明細書中に記載のようなエクソソーム単離処理を実施するために、乳汁をウシから取得した時点から、好ましくは約１日以内、または約２日以内、または約３日以内、または約４日以内、または約５日以内、または約６日以内、または約７日以内に、凍結したウシ乳汁を解凍するのであってもよい。解凍した乳汁は、好ましくは解凍後直ぐに処理を行う。特定の実施態様においては、乳汁をウシから取得して約５日以内に、新鮮ウシ乳汁を本明細書中に記載のような処理に供するか、あるいは本明細書中に記載のような処理に供する解凍ウシ乳汁は、乳汁をウシから取得して約５日以内に凍結したウシ乳汁を解凍したものである。

一実施態様においては、ウシ乳汁を遠心分離し、上層の脂質画分、中間層の乳清画分、および細胞および細胞破片の第１の沈殿を形成させて、エクソソームをウシ乳汁から単離する。脂質画分および第１の沈殿から乳清画分を分離し、実質的に透明な乳清画分を得るためにさらに遠心分離する。例えば、脂肪、カゼイン凝集物、および細胞破片をさらに除去して、実質的に透明な乳清画分を得る。次いで、実質的に透明な乳清画分を精密濾過して、残留する細胞破片を除去する。次に、精密濾過した乳清画分をもう一度、遠心分離して、エクソソームを含む第２の沈殿を得る。次いで、この第２の沈殿を水性媒体に懸濁して、それに含まれるエクソソーム二重膜を破壊することなく第２の沈殿を溶解して、エクソソーム懸濁液を得る。エクソソーム膜を破壊することのない穏和な方法で第２の沈殿を懸濁することが重要である。特定の一実施態様においては、第２の沈殿を、滅菌リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）または分子生物学グレードの滅菌水などの水性媒体中で、長時間、例えば、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間または少なくとも１２時間、および最長１８時間、２４時間、３０時間または３６時間以上の時間、インキュベートする。例えば、低速度、すなわち、５００ｒｐｍ以下の旋回振盪機を用いてもよい。沈殿が完全に懸濁したら、懸濁液を乾燥処理して粉末状エクソソームを取得する。この乾燥工程もまた、エクソソーム二重膜を破壊しないように注意を払いながら実施しなければならない。特定の一実施態様においては、該乾燥工程は凍結乾燥することを含む。

本発明の特定の実施態様において、エクソソームの単離は、特定の速度、時間および／または温度で遠心分離することを含む。強すぎる力で実施した場合には遠心分離がエクソソーム膜の損傷を引き起こし得るが、本明細書中に記載のような遠心分離時間と速度であれば、無損傷のエクソソームが単離される。特定の実施態様においては、約１５，０００Ｇ未満、例えば、約１２，０００Ｇの速度で、例えば、約１５分間、約４℃でウシ乳汁を遠心して、上層の脂肪（脂質）と細胞破片沈殿物の間に形成した乳清層を取得する。特定の実施態様においては、この乳清画分をさらに２回、やはりエクソソームの無損傷形態を維持する条件の下で、例えば、１回につき、約１２，０００Ｇ、約４℃で約３０分間、遠心分離して、脂肪および／または細胞破片をさらに除去する。実質的に透明な乳清画分が得られる。この実質的に透明な乳清画分を、例えば、親水性材料の０．２２μｍフィルター（蛋白質低残留性のポリエーテルスルホンなど）を用いて精密濾過し、次いで、この精密濾過した乳清を１００，０００Ｇ、４℃で約６０分間遠心分離してエクソソームを含む沈殿を形成させる。特定の実施態様においては、少なくとも約１２時間、または約１２時間～約３６時間、または約１５時間～約３０時間、または約１８時間～約２４時間、旋回振盪機でインキュベーションすることにより、このエクソソーム含有沈殿を溶解する。エクソソームの無損傷形態を維持する（すなわち、二重膜が損傷せず、エクソソームに含まれる内容物が内部に維持される）条件の下で、この溶解を行う。

次いで、やはりエクソソームの無損傷形態を維持する条件の下で、エクソソームを乾燥させる。本発明の特定の実施態様においては、単離したエクソソームを凍結乾燥によって乾燥させ、エクソソームの無損傷形態を維持する条件の下で粉末状エクソソームを形成させる。本発明の特定の実施態様において、該凍結乾燥工程は、－８０℃の温度および０．３ミリバール未満の真空にエクソソーム懸濁液を充分な時間曝露することを含む。特定の実施態様においては、凍結乾燥する液体の量および凍結乾燥設備の性質に応じて、その時間は約５時間～約４０時間、より具体的には、約１０時間～約３０時間、または約１５時間～約２５時間の間で変化し得る。重要なことは、この処理でエクソソームを完全に乾燥させることが必要だということである。実施例に説明するような特定の実施態様において、－８０℃の温度で０．３ミリバール未満の真空の場合には、凍結乾燥時間は２４時間以上であった。

該方法の別の実施態様は、凍結乾燥の時間、温度および圧力における変更を含む。該方法の別の実施態様においては、乳汁エクソソームを：
少なくとも約－５０℃、または少なくとも約－６０℃、または少なくとも約－７０℃、または少なくとも約－８０℃の温度に保ち；
約０．３ミリバール未満、または約０．２ミリバール未満、または約０．１ミリバール未満の真空に保ち；
および
少なくとも約５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間または４０時間の間、これらの条件下に置く。

そのような方法で作成された粉末状エクソソームは、無損傷のエクソソーム、すなわち、二重膜が破裂および／または劣化することなく、エクソソームの内容物がそのまま保持されるエクソソームを含む。特定の実施態様においては、粉末中の少なくとも約５０ｗｔ％のエクソソームが無損傷である。さらなる実施態様においては、粉末中の少なくとも約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ｗｔ％のエクソソームが無損傷である。特定の実施態様においては、該組成物を２０℃の温度で少なくとも２ヶ月保存した後でも、粉末中の少なくとも５０ｗｔ％のエクソソームが無損傷のままである。さらなる実施態様においては、該組成物を２０℃の温度で少なくとも２ヶ月保存した後でも、粉末中の少なくとも約５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ｗｔ％のエクソソームが無損傷のままである。さらに、特定の実施態様において、粉末状エクソソームはより高温条件で良好な安定性を示す。例えば、特定の実施態様において、３７℃で３週間保存した後、ウシ乳汁から単離した粉末状エクソソームは、３７℃で３週間保存した新鮮乳汁エクソソームよりも多量のｍｉＲＮＡを含み、このことは、新鮮乳汁エクソソームと比較した場合に、そのような保存条件下では、二重膜破裂および／またはその他の分解に対してより抵抗性であることを実証するものである。別の特定の一実施態様においては、５５℃で１週間保存した後、ウシ乳汁から単離した粉末状エクソソームは、５５℃で１週間保存した新鮮乳汁エクソソームよりも多量のｍｉＲＮＡを含み、このことはさらに、新鮮乳汁エクソソームと比較した場合に、そのような保存条件下では、膜破裂および／またはその他の分解に対してより抵抗性であることを実証するものである。消費者への販売と消費に関して、粉末状エクソソームのこの安定性は、製品に含まれるエクソソーム中の活性物質（複数可）の利点を提供する際の重要な改善である。

特定の実施態様においては、単離エクソソームの９０％超が、直径約１０ナノメートル～約２５０ナノメートル、または直径約２０～２００ｎｍ、または直径約５０～１５０ｎｍである。

本発明の粉末状エクソソームは栄養組成物の成分としての用途に特に好適である。該栄養組成物は粉末状形態であっても液体形態であってもよく、本明細書中に記載のような本発明の粉末状エクソソームを添加することによって提供されるウシ乳汁単離エクソソームを含んでいてもよい。粉末状栄養組成物の一実施態様において、該粉末状エクソソームは、栄養組成物の１種類以上の乾燥成分と乾式混合される。本発明の栄養組成物の別の実施態様において、液状栄養組成物は、本明細書中に記載のような粉末状栄養組成物から再構成される液体を含む。別の実施態様において、液状栄養組成物は、製造プロセスで１種類以上の別の栄養組成物成分と組み合わせて粉末状エクソソームを含むすぐに飲める形態の、例えば、乳剤として製造される。粉末形態または液体形態のそのような組成物は、エクソソーム中の生物活性物質（複数可）の利点を得るために、経口で簡単に投与することができる。

本明細書中に記載の栄養組成物の特定の実施態様は、蛋白質、炭水化物、および／または脂肪、およびウシ乳汁単離エクソソームを含むが、ここで該エクソソームは、本発明の粉末状エクソソームを添加することによって提供される。該ウシ乳汁単離エクソソームは、栄養上の利点または治療上の利点を提供するために、所望の有効量で栄養組成物に含有させることもできる。特定の実施態様においては、該栄養組成物は組成物の重量に基づいて、約０．００１～約１０ｗｔ％のウシ乳汁単離エクソソーム、またはより具体的には、約０．１～約５ｗｔ％のウシ乳汁単離エクソソームを含む。

本明細書中に記載の栄養組成物の実施態様において、多様な供給源および種類の蛋白質、炭水化物、および脂肪を用いることができる。

該栄養組成物の特定の実施態様において、蛋白質は栄養組成物の約１ｗｔ％～約３０ｗｔ％を占める。より具体的な実施態様では、蛋白質は該栄養組成物の約１ｗｔ％～約２５ｗｔ％を占め、栄養組成物の約１ｗｔ％～約２０ｗｔ％、約１ｗｔ％～約１５ｗｔ％、約１ｗｔ％～約１０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約１０ｗｔ％、または約１０ｗｔ％～約２０ｗｔ％を占める。別の特定の実施態様において、蛋白質は該栄養組成物の約１ｗｔ％～約５ｗｔ％を占める。さらなる特定の実施態様においては、該蛋白質は該栄養組成物の約２０ｗｔ％～約３０ｗｔ％を占める。

特定の実施態様においては、該栄養組成物に１種類以上の蛋白質供給源を用いる。蛋白質供給源としては、例えば、乳汁（例えば、カゼイン、乳清）、動物（例えば、肉、魚）、穀物（例えば、コメ、トウモロコシ）、野菜（例えば、大豆、エンドウ豆）、およびそれらの組み合わせなどの好適な供給源に由来するものであってもよい、無損傷の蛋白質、加水分解蛋白質および／または部分加水分解蛋白質が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。該栄養組成物の特定の実施態様において用いられる蛋白質供給源のより具体的な例としては、乳清蛋白質濃縮物、乳清蛋白質単離物、乳清蛋白質加水分解物、酸カゼイン、カゼイン酸ナトリウム、カゼインカルシウム、カゼイン酸カリウム、カゼイン加水分解物、乳蛋白質濃縮物、乳蛋白質単離物、乳蛋白質加水分解物、脱脂粉乳、濃縮脱脂粉乳、大豆蛋白質濃縮物、大豆蛋白質単離物、大豆蛋白質加水分解物、エンドウ豆蛋白質濃縮物、エンドウ豆蛋白質単離物、エンドウ豆蛋白質加水分解物、コラーゲン蛋白質、コラーゲン蛋白質単離物、コメ蛋白質、ジャガイモ蛋白質、ミミズ蛋白質、および／または昆虫蛋白質、およびそれらの２種類以上の組み合わせが挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。より具体的な実施態様は、乳蛋白質濃縮物および／または大豆蛋白質単離物を含む。

蛋白質供給源はまた、栄養製品の用途として知られているアミノ酸混合物（遊離アミノ酸と記載されることも多い）またはそのようなアミノ酸と本明細書中に記載の無損傷の蛋白質、加水分解蛋白質、および／または部分加水分解蛋白質との組み合わせを含むものであってもよい。該アミノ酸は天然アミノ酸であっても合成アミノ酸であってもよい。

特定の実施態様において、該栄養組成物はβ－ヒドロキシ－β－メチル酪酸（ＨＭＢ）を含む。ＨＭＢは、ロイシンの天然短鎖脂肪酸代謝産物であり、各種の栄養製品およびサプリメントにおける用途で知られている。いずれのＨＭＢ供給源も本明細書に記載の用途に好適であり、そのようなものとしては、遊離酸、無水塩を含む塩、エステル、ラクトン、または該栄養組成物においてＨＭＢの生体利用可能形態を提供するその他の産物形態が挙げられるが、これらにのみに限定されるものではない。本明細書に記載の用途に好適なＨＭＢの塩の非限定的な例としては、水和または無水の、ＨＭＢのナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、クロム塩、カルシウム塩、またはその他の非毒性塩の形態が挙げられる。特定の実施態様において、ＨＭＢはカルシウムＨＭＢ一水和物として提供される。特定の実施態様において、該栄養組成物は約０．０１～約１０ｗｔ％のＨＭＢを含んでいてもよい。より具体的な実施態様において、該栄養組成物は、ＨＭＢを約０．１％～約７．０％、あるいはより具体的には、約０．１％～約５．０％含む。さらなる実施態様において、該栄養組成物は、２３７ｍｌの１回利用量当たりＨＭＢを約１～３グラム、あるいはより具体的には、約１．５～３グラム提供する。

該栄養組成物の特定の実施態様において、炭水化物は該栄養組成物中に約５ｗｔ％～約７５ｗｔ％の量で存在する。より具体的な実施態様において、炭水化物は該栄養組成物中に約５ｗｔ％～約７０ｗｔ％の量で存在する（該栄養組成物中に約５ｗｔ％～約６５ｗｔ％、約５ｗｔ％～約５０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約４０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約３０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約２５ｗｔ％、約１０ｗｔ％～約６５ｗｔ％、約２０ｗｔ％～約６５ｗｔ％、約３０ｗｔ％～約６５ｗｔ％、約４０ｗｔ％～約６５ｗｔ％、または約１５ｗｔ％～約２５ｗｔ％で存在することを含む）。

栄養組成物の特定の実施態様に用いる炭水化物は、単炭水化物、複合炭水化物、またはそれらの組み合わせである。本明細書中に記載の栄養組成物の特定の実施態様に用いる好適な炭水化物供給源の非限定的な例としては、ヒト乳汁オリゴ糖類（ＨＭＯ）、マルトデキストリン、加水分解デンプン、グルコースポリマー、コーンシロップ、コーンシロップ固形物、コメ由来炭水化物、スクロース、グルコース、乳糖、ハチミツ、糖アルコール類、イソマルツロース、スクロマルト（ｓｕｃｒｏｍａｌｔ）、プルラン、ジャガイモでんぷん、ガラクトオリゴ糖類、オート麦繊維、大豆繊維、トウモロコシ繊維、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム、メチルセルロース、グアーガム、ジェランガム、ローカストビーンゴム、コンニャク粉、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、トラガントゴム、カラヤゴム、アカシアゴム、キトサン、アラビノガラクタン類、グルコマンナン、キサンタンゴム、アルギン酸、ペクチン、低メトキシペクチン、高メトキシペクチン、穀物β－グルカン類、カラギーナン、オオバコ、消化抵抗性炭水化物（消化抵抗性マルトデキストリン類、消化抵抗性デンプン、ゆっくりとした速度で消化可能な炭水化物など）、イヌリン、フラクトオリゴ糖類、およびそれらの２種類の以上の組み合わせが挙げられる。

特定の実施態様においては、該栄養組成物は、該栄養組成物の約０．５ｗｔ％～約３０ｗｔ％の量の脂肪を含む。ある特定の実施態様においては、脂肪は、該栄養組成物の約１ｗｔ％～約３０ｗｔ％を占める（該栄養組成物の約１ｗｔ％～約２０ｗｔ％、約１ｗｔ％～約１５ｗｔ％、約１ｗｔ％～約１０ｗｔ％、約１ｗｔ％～約５ｗｔ％、約３ｗｔ％～約３０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約３０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約２５ｗｔ％、約５ｗｔ％～約２０ｗｔ％、約５ｗｔ％～約１０ｗｔ％、または約１０ｗｔ％～約２０ｗｔ％を占めることを含む）。

特定の実施態様において、該栄養組成物の脂肪は、ココナツオイル、分画ココナッツオイル、大豆油（例えば、高オレイン酸大豆油）、コーンオイル、オリーブ油、ベニバナ油（例えば、高オレイン酸ベニバナ油）、中鎖脂肪酸トリグリセリド油脂（ＭＣＴ油脂）、高ガンマリノレン（ＧＬＡ）ベニバナ油、ひまわり油（例えば、高オレイン酸ヒマワリ油）、パーム油、パーム核油、パームオレイン、キャノーラ油（例えば、高オレイン酸キャノーラ油）、魚油（ｍａｒｉｎｅ ｏｉｌ）、魚油（ｆｉｓｈ ｏｉｌ）（例えば、マグロ油）、藻類油、ルリヂサ油、綿実油、真菌油、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＲＡ）、共役リノール酸（ＣＬＡ）、α－リノレン酸、エステル交換油脂（ｉｎｔｅｒｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ｏｉｌ）、エステル交換油脂（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｅｄ ｏｉｌ）、構造脂質類、およびそれらの組み合わせのうちの１種類以上を含む。脂肪供給源は、トリグリセリド類、ジグリセリド類、モノグリセリド類、リン脂質類（例えば、レシチン）および／または遊離脂肪酸類を含むものであってもよい。脂肪酸としては、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、アラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、および／またはドコサヘキサン酸（ＤＨＡ）を挙げることができるが、これらのみに限定されるものではない。本開示の組成物の特定の実施態様は、上記に列挙した様々な脂肪供給源のうちの個々の脂肪供給源または２種類以上の組み合わせを含む。より具体的な実施態様は、キャノーラ油、高オレイン酸ヒマワリ油、中鎖脂肪酸トリグリセリド類および／またはリノール酸、α－リノレン酸、ＡＲＡ、ＥＰＡ、および／またはＤＨＡなどの１種類以上の脂肪酸を含む。

該栄養組成物の別の特定の実施態様は、該栄養組成物の物理学的、化学的、審美的、または処理上の特徴を改善する１種類以上の成分または付加的な栄養成分として作用する１種類以上の成分を含む。付加的な成分の非限定的な例としては、防腐剤、乳化剤（例えば、レシチン）、緩衝剤、人工甘味料を含む甘味料（例えば、サッカリン、アスパルテーム、アセサルフェームＫ、スクラロース）、着色剤、香味料、増粘剤、安定化剤などが挙げられる。

該栄養組成物の特定の実施態様は、任意選択的に１種類以上のプレバイオティクスおよび／またはプロバイオティクスを含む。本明細書中の用語「プレバイオティクス」は、他で特定しない限り、対象の消化（ＧＩ）管における細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することにより、対象に有益な効果をもたらす非消化性食品成分を指す。非消化性の発酵性多糖類は、本明細書中に記載の栄養組成物に含めることのできるプレバイオティクスの例である。本明細書中の用語「プロバイオティクス」は、他で特定しない限り、消化過程で生存し宿主に健康上の利点を提供する細菌または酵母菌などの微生物を指す。本明細書中に記載の栄養組成物に含めることのできるプロバイオティクスの例としては、以下のうちのいずれか１種類のみ、またはそれらの組み合わせが挙げられる：
ビフィドバクテリウム・ブレーべ（Ｂ． ｂｒｅｖｅ）Ｍ－１６Ｖ、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ）Ｂｂ０２、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ）Ｍ－６３、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ． ｉｎｆａｎｔｉｓ）３５６２４、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂ． ｌａｃｔｉｓ）ＨＮ０１９、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂ． ｌａｃｔｉｓ）Ｂｉ０７、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）ＢＢ５３６、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）ＡＨ１２０５、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）ＡＨ１２０６、およびビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂ． ａｎｉｍａｌｉｓ）などのビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｂ．））；およびラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＧＧ、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＨＮ００１、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）（ＬＡ－５）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＦＭ、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ． ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＥＣＴ５７１６、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ５５７３０、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ ＰＴＡ－６４７５、およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ １７９３８などのラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｌ．））、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｈ４）、アッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フィーカリバクテリウム属（Ｆｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、および／またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）。

該栄養組成物の特定の実施態様は、ビタミンおよび／または関連する栄養素を含んでいてもよく、その非限定的例としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、ナイアシン、葉酸、パントテン酸、ビオチン、コリン、イノシトール、および／またはそれらの塩および誘導体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。

該栄養組成物の特定の実施態様は、ミネラルを含み、その非限定的例としては、カルシウム、リン、マグネシウム、亜鉛、マンガン、ナトリウム、カリウム、モリブデン、クロム、鉄、銅、および／または塩素、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

本発明の栄養組成物についての他の特定の実施態様は、蛋白質として、乳蛋白質濃縮物および／または大豆蛋白質単離物；脂肪として、キャノーラ油、ひまわり油、中鎖脂肪酸トリグリセリド類および／またはＤＨＡ；ならびに炭水化物として、加水分解コーンスターチ、スクロースおよび／またはマルトデキストリンを含む。さらなる特定の実施態様において、これらの栄養組成物は、オリゴフルクトース、混合トコフェロール類、および／またはラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）をも含む。

別の特定の一実施態様において、該栄養組成物は、蛋白質として、乳蛋白質濃縮物、カゼイン酸ナトリウム、カゼインカルシウム、および／または大豆蛋白質単離物；炭水化物として、コーンシロップ、トウモロコシマルトデキストリンおよび／または糖；ならびに脂肪として、コーンオイルおよび／またはキャノーラ油を含む。別の特定の一実施態様において、該栄養組成物は、蛋白質として乳蛋白質濃縮物；炭水化物としてトウモロコシマルトデキストリン、フルクトース、および／またはグリセリン；および脂肪として高オレイン酸ベニバナ油を含む。

特定の実施態様においては、該栄養組成物が液体状である場合、例えば、本明細書中に記載のように粉末から再構成された、あるいはすぐに飲める製品として製造された場合には、１回利用量は約１ｍｌ～約５００ｍｌの範囲である（約１１０ｍｌ～約５００ｍｌ、約１１０ｍｌ～約４１７ｍｌ、約１２０ｍｌ～約５００ｍｌ、約１２０ｍｌ～約４１７ｍｌ、約１７７ｍｌ～約４１７ｍｌ、約２０７ｍｌ～約２９６ｍｌ、約２３０ｍｌ～約２４５ｍｌ、約１１０ｍｌ～約２３７ｍｌ、約１２０ｍｌ～約２４５ｍｌ、約１１０ｍｌ～約１５０ｍｌ、および約１２０ｍｌ～約１５０ｍｌの範囲であることを含む）。特定の実施態様においては、該１回利用量は、約１ｍｌ、または約１００ｍｌ、または約２２５ｍｌ、または約２３７ｍｌ、または約５００ｍｌである。

特定の実施態様において、該栄養組成物が粉末の場合には、例えば、１回利用重量は、粉末として投与される、あるいは約１ｍｌ～約５００ｍｌ（約２２５ｍｌ、または約２３０ｍｌ～約２４５ｍｌなど）の液体として再構成される約４０ｇ～約６０ｇ（４５ｇ、または４８．６ｇ、または５０ｇなど）である。

特定の実施態様においては、該栄養組成物は、該栄養組成物の１回利用量当たり最大で約５００ｋｃａｌ（該栄養組成物の１回利用量当たり約２０ｋｃａｌ～約５００ｋｃａｌ、約７５ｋｃａｌ～約５００ｋｃａｌ、約１５０ｋｃａｌ～約５００ｋｃａｌ、約２５０ｋｃａｌ～約５００ｋｃａｌ、約３００ｋｃａｌ～約５００ｋｃａｌ、または約４００ｋｃａｌ～約５００ｋｃａｌであることを含む）のエネルギーを提供する。

特定の実施態様において、該栄養組成物は、約０．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約３ｋｃａｌ／ｍｌのカロリー密度を有する。特定の実施態様において、該栄養組成物は、約０．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約２．５ｋｃａｌ／ｍｌ（約０．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約２ｋｃａｌ／ｍｌ、約０．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約１．５ｋｃａｌ／ｍｌ、約０．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約１ｋｃａｌ／ｍｌ、または約０．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約０．８ｋｃａｌ／ｍｌであることを含む）のカロリー密度を有する。特定の実施態様において、該栄養組成物は、約１ｋｃａｌ／ｍｌ～約３ｋｃａｌ／ｍｌ（約１．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約３ｋｃａｌ／ｍｌ、約２ｋｃａｌ／ｍｌ～約３ｋｃａｌ／ｍｌ、または約２．５ｋｃａｌ／ｍｌ～約３ｋｃａｌ／ｍｌであることを含む）のカロリー密度を有する。

特定の実施態様において、該栄養組成物は、約１ｋｃａｌ／ｇ～約１０ｋｃａｌ／ｇ（約４．６ｋｃａｌ／ｇなど）のカロリー密度を有する。特定の実施態様においては、該栄養組成物は、約２ｋｃａｌ／ｇ～約８ｋｃａｌ／ｇ、または約３ｋｃａｌ／ｇ～約６ｋｃａｌ／ｇのカロリー密度を有する。

特定の実施態様において、該栄養組成物は液体形態であり、粉末状栄養組成物から再構成されたものであって、そのｐＨは約３～約９、または約６～約８である。

本明細書中に記載の方法の特定の実施態様においては、蛋白質、脂肪、および炭水化物の１種類以上を含む粉末を、該粉末状エクソソームと乾式混合することにより、該粉末状栄養組成物を形成させて常温保存可能粉末状栄養組成物を調製する。該粉末状栄養組成物は、粉末形態で投与してもよく、または水性液体で再構成して液状栄養組成物としてもよい。

粉末状形態のエクソソームが無損傷性であることから、該エクソソーム、および該粉末状エクソソームが添加されている組成物は、エクソソーム中の生物活性物質（無損傷のエクソソームに含まれる各種のｍｉＲＮＡを含む）による栄養上の利点または治療上の利点を提供する用途に好適である。特定の実施態様においては、該粉末状エクソソーム、および粉末状エクソソームが添加されている組成物は、インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病のリスクを低減する、および／またはインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を治療する用途に好適である。インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病の発症に関するリスク因子としては、太り過ぎであること、身体を動かすことが少ないこと、または週３回未満しか身体を動かすことのないこと、以前に妊娠性糖尿病に罹患していたこと、あるいは免疫障害を有していることを挙げることができる。インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を有する対象は、肥満、高血圧であることも多く、脂質異常症を有している、および／またはサルコペニア（筋肉減弱症）を有していることも多い。

本明細書中に記載の方法の特定の実施態様においては、経口または経管栄養法によって、該栄養組成物を投与する。特定の実施態様において、該投与が経管栄養法によって行われる場合には、対象の鼻から、あるいは対象の腹部の切開部分から直接、対象の胃または小腸に注入することによって経管栄養を実施する。

特定の実施態様においては、インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病のリスクを低減する方法、またはこれらの病態を治療する方法は、本明細書中に記載のようなウシ乳汁単離粉末状エクソソームまたは本明細書中に記載のようなウシ乳汁単離粉末状エクソソームが添加されている栄養組成物を対象に投与することを含む。該栄養組成物は、所望に応じて粉末形態で投与してもよく、または液体形態で投与してもよい。特定の実施態様においては、該ウシ乳汁単離粉末状エクソソームまたは本明細書中に記載のようなウシ乳汁単離粉末状エクソソームが添加されている栄養組成物は、毎日または毎週、１回または複数回、対象に投与する。特定の実施態様においては、１日または１週当たり約１回～約６回、あるいは１日または１週当たり約１回～約５回、あるいは１日または１週当たり約１回～約４回、あるいは１日または１週当たり約１回～約３回、該栄養組成物を対象に投与する。

特定の実施態様においては、インスリン抵抗性、前糖尿病および／または糖尿病のうちの１種類以上を発症するリスクを有する対象において、そのような病態のリスクを低減するための有効量で、本発明の粉末状エクソソームを、直接的に、または栄養組成物に添加することによって、投与する。別の特定の実施態様においては、インスリン抵抗性、前糖尿病および／または糖尿病のうちの１種類以上を有すると診断される対象において、そのような病態を治療するための有効量で、本発明の粉末状エクソソームを、直接的に、または栄養組成物によって、投与する。本明細書中に記載の方法についての特定の実施態様においては、約０．０１～約１０ｇの用量の粉末状エクソソームを、直接的に、あるいは栄養組成物に添加することによって、対象に投与する。別の実施態様においては、約０．１～約１０ｇ、または約１～約５ｇの用量の粉末状エクソソームを、直接的に、あるいは栄養組成物に添加することによって、対象に投与する。

以下の実施例によって本発明の様々な局面を具体的に示す。

実施例
実施例１：粉末状エクソソームの調製
本実施例では、粉末状エクソソームおよびエクソソームを含む粉末状栄養組成物の調製について説明する。まず、エクソソームをウシ乳汁から単離し、次いで乾燥した。以下の処理を用いて、ウシ乳汁からエクソソームを単離した。未処理のウシ生乳を分注して、直ぐに－８０℃で凍結した。分注標品を氷上で解凍し、約１２，０００Ｇ、約４℃で約１５分間、最初の遠心分離を行い、上層の脂肪（脂質）と細胞破片沈殿物との間の乳清層を得た。乳清画分を清潔なチューブに移して、さらに２回遠心分離を行った。各回は、エクソソームの無損傷形態を維持し、脂肪および細胞破片をさらに除去する条件である、約１２，０００Ｇ、約４℃で約３０分間の条件で行った。実質的に透明な乳清画分を得た。この実質的に透明な乳清画分を、０．２２μｍの親水性ポリエーテルスルホン・フィルターを用いて精密濾過し、次いで、精密濾過した乳清を１００，０００Ｇ、４℃で約６０分間、遠心分離してエクソソームを含む沈殿を得た。エクソソームを含む沈殿を、遠心分離チューブ中で滅菌ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４、および２ｍＭ ＫＨ２Ｐ０４；ｐＨ７．４）または分子生物学グレードの滅菌水に懸濁し、次いで、旋回振盪機を用いて４℃、１５０ｒｐｍで１２～３６時間インキュベートした。注目すべきは、旋回振盪工程を利用しない場合には、凝集がおこり、それをほぐすために徹底的なピペッティングが必要であったが、それによってエクソソーム二重膜の損傷が起こった。

エクソソームはまず、－８０℃で少なくとも２時間凍結し、次いで、エクソソームの無損傷形態を維持する条件の下で、凍結エクソソームを凍結乾燥した。具体的には、凍結乾燥工程は、低含水率にするために、凍結エクソソームを充分な時間（約２４時間）、－８０℃の温度および０．３ミリバール未満の真空の状態に置くことを含むものであった。

重要なことは、凍結乾燥の真空段階前にエクソソームを解凍すると、乳汁エクソソームの膜損傷が起こったということである。したがって、本明細書中に記載の方法の実施態様は、乳汁エクソソームを凍結し、凍結乾燥が完了して粉末乳汁エクソソームが得られるまで、乳汁エクソソームを凍結状態に保つことを含むものである。本明細書中に記載の単離および乾燥の条件によって、エクソソーム二重膜の完全性とエクソソームの内容物が維持される。

乳汁エクソソーム試料をＴＥＭによって視覚化したが、図１Ａ～１Ｃでは倍率８００倍、図１Ｄ～１Ｆでは倍率１０，０００倍、および図１Ｇ～１Ｉでは倍率２５，０００倍で行った。比較のために、新鮮乳汁エクソソーム（図１Ａ、１Ｄおよび１Ｇ）、－８０℃で２時間凍結し氷上で解凍した乳汁エクソソーム（図１Ｂ、１Ｅおよび１Ｈ）、および本発明の特定の実施態様にしたがい粉末化した凍結乾燥乳汁エクソソーム（図１Ｃ、１Ｆおよび１Ｉ）を、ＴＥＭで分析した。ＴＥＭ像を得るために、高電子密度化合物である酢酸ウラニルで各試料を染色した。エクソソーム膜が損傷している場合には、酢酸ウラニルが浸透して内部区画が染まる。図１Ｇおよび図１Ｉの比較から容易に分かるが、粉末状エクソソームのエクソソーム構造（形態、サイズまたは膜完全性）（図１Ｉ）は、新鮮エクソソーム（図１Ｇ）と比較して凍結乾燥による変化は起こっていなかった。これらの図から、酢酸ウラニルがエクソソームを覆い小胞の輪郭が暗い影によって強調されており、一方、小胞内部は淡色のままであることから、膜完全性が失われていないことは明白である。しかし、エクソソームを凍結し解凍することによって、エクソソーム膜には重度の損傷が起こり（図１Ｈ）、酢酸ウラニルが浸透して損傷した膜を通過し、エクソソームの内部区画が染まる。このように、粉末状エクソソームは、乳汁エクソソームの膜構造が保存されている産物を提供するのである。

凍結乾燥したエクソソームはｍｉＲＮＡも保持していた。ｍｉＲＮＡ含量を分析する目的で、新鮮乳汁エクソソームおよび本発明の粉末状エクソソームを滅菌ＰＢＳに再懸濁し、各試料を６０マイクロリットル用いてｍｉＲＮＡを単離しｍｉＲＮＡ含量を定量した。ｍｉＲＮＡの単離は、市販のキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット、参照番号ＡＭ １５６０）を用いて製造元のプロトコルおよび技術的推奨に準拠して実施した。ｍｉＲＮＡの定量化は、低分子ＲＮＡチップを用いたＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｔｅｍで微小流体電気泳動を行うことにより実施した。図２Ａは、新鮮乳汁エクソソームおよび粉末状エクソソーム中のｍｉＲＮＡ－２００ｃレベルを示している。このＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ－２００ｃ）は、ウシ乳汁中に豊富であり、ほとんどがエクソソームを含む乳清画分に存在する。ｍｉＲＮＡ－２００ｃレベルに関して、新鮮エクソソーム中のレベルと粉末状エクソソームの同レベルとの間に、統計的差異がなかった（ｐ＞０．０５、図２Ａのｎ．ｓ．）。凍結／解凍に供したエクソソームのｍｉＲＮＡ－２００ｃレベルは、既に認識され図１Ｈに示されている重度の損傷のため、提示していない。

さらに、凍結乾燥生乳および本発明の粉末状エクソソームをそれぞれ、液状栄養製品に加えて特定ｍｉＲＮＡのレベルを測定した。具体的には、２０ｍｇの凍結乾燥生乳または本発明の粉末状エクソソームをそれぞれ、市販のＰｅｄｉａＳｕｒｅ（登録商標）ＴｒｉｐｌｅＳｕｒｅ（商標）栄養組成物１ｍＬに添加した。ｍｉＲ－２６ａおよびｍｉＲ－２６ｂのレベルについて分析した。これらのｍｉＲＮＡは、特にグルコース代謝に関連するものである。その結果を図２Ｂに示す；粉末状エクソソームを添加した栄養組成物において、上記のｍｉＲＮＡのレベルが増加したことを示している。粉末状エクソソームでは、その構造と乳汁エクソソーム内容物が保持されていることから、粉末状エクソソームは液状栄養製品中のｍｉＲＮＡレベルを増加させるために好適であり、また粉末状エクソソームの添加は、凍結乾燥生乳の添加よりも高いレベルでｍｉＲＮＡを提供するということを、上記の結果は実証している。

さらなる実験において、本発明の粉末状エクソソームの熱安定性を評価した。上記のように調製した粉末状エクソソームおよび新鮮乳汁エクソソームの両方を、２５℃、３７℃または５５℃のいずれかで、真空包装状態で４週間保存した。試料を１、２、３および４週間の時点で分析して、それぞれに対応する熱処理を行っていない対照と比較した。エクソソーム由来の特定ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－２００ｃ）のエクソソーム中におけるレベルを測定した。ｍｉＲＮＡは高温および分解酵素にとりわけ感受性が高い。アジ化ナトリウム添加がその後の試料分析を妨害せず乳汁エクソソーム構造を破壊することもないことを確認した後、実験の時間経過中における微生物増殖を防ぐために、アジ化ナトリウム（最終濃度＝０．１５％ｗ／ｖ）で新鮮乳汁エクソソームを処理した。ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キットを用いて製造元の指示にしたがい、全低分子ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ抽出効率をモニターする目的で、試料調製中に外部対照ｓｐｉｋｅ－ｉｎオリゴヌクレオチド（ｃｅｌ－ｍｉＲ－３９、ＡＧＣＵＧＡＵＵＵＣＧＵＣＵＵＧＧＵＡＡＵＡ）を添加した。それに加えて、潜在的な試料間変動および技術的変動を正規化するためにｃｅｌ－ｍｉＲ－３９を利用した。

その結果を表１に示す；試験した温度によらず、粉末状エクソソームでは含有ｍｉＲＮＡが保護された。対照的に、新鮮乳汁エクソソームを３７℃および５５℃で保存した場合には、ｍｉＲ－２００ｃのレベルは統計的に減少した。その減少は特に５５℃で顕著であり、１週後では少量のｍｉＲ－２００ｃのみが検出され、２週間後ではｍｉＲ－２００ｃは全く検出されなかった。このｍｉＲ－２００ｃシグナルの減衰は熱損傷によるエクソソーム破損に起因する可能性がある。

アスタリスク（＊）は週数０に対する統計的有意性を示している（ｐ＜０．０５）

表１の結果から、本発明の粉末状エクソソームが高温条件下で良好な安定性を示すことが分かる。この安定性は、直接的あるいは栄養組成物に添加することのいずれかによる簡便な経口投与経路に、粉末状エクソソームが好都合であることを示している。

実施例２：治療結果
本実施例は、上記のように調製し、無損傷であることが示された粉末状エクソソームが、筋肉細胞に取り込まれることを実証するものである。赤色色素でエクソソームを標識し、エクソソームをＬ６．Ｃ１１筋肉細胞と共にインキュベートして顕微鏡により該細胞を観察することにより、それが実証された。同一の赤色色素で標識したＢＳＡと共にインキュベートしたＬ６．Ｃ１１筋肉細胞を含む対照によって、該取り込みが色素自体によって促進されるものではないことを確認した。

粉末状エクソソームは、筋肉細胞によるグルコースの取り込みを増加させた。乳汁エクソソーム濃度がそれぞれ０、２．８、５．６および１４μｇ／ｍｌに達するまで、粉末状エクソソームをＬ６．Ｃ１１筋肉細胞培養物に添加し、その培養物を２４時間インキュベートした。次いで、放射性標識グルコースの取り込みを評価した。これらインキュベーションの結果を、図３に白いバーで示す。濃度が０μｇ／ｍｌの場合（エクソソームが非存在）を、グルコース取り込みが１００％の対照とした。粉末状エクソソーム濃度がそれぞれ５．６および１４μｇ／ｍｌでは、対照と比較して、筋肉細胞によるグルコース取り込みが統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０５）。インキュベーションの前に粉末状エクソソームを超音波処理する比較実験を実施した。図３の黒いバーは、この比較実験の結果を示している。超音波処理は物理的膜破壊を引き起こした。いずれの場合にも、超音波処理はエクソソーム膜を破壊し、粉末状エクソソームの好ましい効果を無効にした。

グルコースの取り込み増加は、部分的にはＧＬＵＴ－４トランスポーター発現の増加に起因するものである。別の実験では、粉末状エクソソームを１４μｇ／ｍｌの濃度でＬ６．Ｃ１１筋肉細胞培養物に添加し、その細胞培養物を２４時間インキュベートした。培養物に添加する前に粉末状エクソソームを超音波処理してから、その粉末状エクソソームを１４μｇ／ｍｌの濃度で添加した培養物を対照としたが、その他に粉末状エクソソームを含まない対照培養も用いた。ウェスタンブロッティングを用いて、ＧＬＵＴ－４トランスポーターの蛋白質発現を評価した。グリセロアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）は解糖に関与する主要な酵素の１つであるが、この酵素を泳動添加量の対照として用い、対照培養（０μｇ／ｍｌ）における発現の相対強度（ＧＬＵＴ－４／ＧＡＤＰＨの値）を１００％と設定した。この結果を図４に示す。粉末状エクソソームを含む培養物においてＧＬＵＴ－４トランスポーター発現が有意に増加したので、対照培養物と粉末状エクソソームを含む培養物との間には統計的有意差があった。また、超音波処理エクソソームを含む培養物と粉末状エクソソームを含む培養物との間にも有意差があったので、上記の効果は超音波処理によって無効化したのである。

同じ実験デザインを利用して、粉末状エクソソームがＰＣＲによって評価されるようなＧＬＵＴ－４ ＲＮＡの増加を引き起こすのか否かについて評価し、また粉末乳汁エクソソームが翻訳および蛋白質レベルに影響を与えるか否かを判定した。その結果を図５に示す。粉末状エクソソームを含む培養物における、ＧＬＵＴ－４ ｍＲＮＡの正規化した相対発現は、対照培養における発現よりもかなり強く、粉末状エクソソームを含む培養物と対照培養との間には統計的有意差があった。エクソソームを超音波処理すると、この好ましい効果が部分的に無効化されるようではあるが、粉末状エクソソームを含む培養物と超音波処理エクソソームを含む培養物との間には統計的有意差はない。

粉末乳汁エクソソームはまた、ＧＬＵＴ－４プロモーター活性も増加させ、筋肉細胞における全体的ＧＬＵＴ－４発現の増加をもたらすのであり、筋肉細胞による全体的なグルコース取り込みを増加させる機構を提供する。このことは以下の実験で示された。天然のＧＬＵＴ－４プロモーターの制御下でルシフェラーゼ（蛍光蛋白質）を発現可能なｐＧＬ３－ＧＬＵＴ－４プラスミドで、筋肉細胞を形質転換した。次いで、０、２．８、５．６および１４μｇ／ｍｌの粉末状エクソソームまたは超音波処理エクソソームの存在下で２４時間、細胞をインキュベートした。インキュベーション終了後に、ＧＬＵＴ－４プロモーター活性に相関する蛍光を測定した。その結果を図６に示す。対照培養（０μｇ／ｍｌ）における相対値（Ｐｇｌ３－ｇｌｕｔ４／対照レポータープラスミドＰｒｌ－ｔｋ）／ＧＡＤＰＨ）を１００％に設定した。粉末状エクソソームは１４μｇ／ｍｌで、ＧＬＵＴ－４プロモーター活性を有意に増加させ、粉末状エクソソームを含む培養物（１４μｇ／ｍｌ）と対照培養物との間には統計的有意差があった。粉末状エクソソームを含む培養物（１４μｇ／ｍｌ）とそれに対応する超音波処理エクソソームを含む培養物との間にも、統計的有意差があった。

まとめると、エクソソームの膜損傷を引き起こす凍結／解凍を行った単離エクソソームに比べて、乳汁エクソソーム二重膜構造を破壊することのない穏やかな処理と乾燥によって調製した本発明の粉末状エクソソームは優れたものである。超音波処理は、粉末状エクソソームの筋肉細胞に対する好ましい効果も無効化する。生物学的効果を得るためには、エクソソーム構造を保存することが重要である。粉末乳汁エクソソームは筋肉細胞によって取り込まれ、ＧＬＵＴ－４遺伝子の転写を促進することによって、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加させる。さらに、筋肉細胞のグルコース取り込みを増加させることは、インスリン感受性の改善を通じて、インスリン耐性対象におけるグルコースレベル制御および筋肉機能を向上させる方法を提供する。そのため、特定の実施態様においては、対象の筋肉におけるＧＬＵＴ－４トランスポーター発現を増加させるために、粉末乳汁エクソソームおよび／または粉末乳汁エクソソームを含む栄養組成物を投与する。さらに、特定の実施態様においては、対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を発症するリスクを低減するため、または対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を治療するために、粉末状エクソソームおよび／または粉末状エクソソームを添加した栄養組成物を対象に投与する。

本明細書中に記載の特定の実施態様および実施例は例示のみを目的としており、特許請求の範囲によって特定される本発明を限定するものではない。

Claims (21)

1. 無損傷のエクソソームを含むウシ乳汁単離粉末状エクソソーム。
2. 請求項１のウシ乳汁単離粉末状エクソソームであって、ここで該無損傷のエクソソームがｍｉＲＮＡを含む、ウシ乳汁単離粉末状エクソソーム。
3. 請求項２のウシ乳汁単離粉末状エクソソームであって、ここで３７℃において３週間保存後の該ウシ乳汁単離粉末状エクソソームが、３７℃において３週間保存した新鮮乳汁エクソソームよりもｍｉＲＮＡを多く含む、ウシ乳汁単離粉末状エクソソーム。
4. 請求項１～３のいずれか１項に記載のウシ乳汁単離粉末状エクソソームであって、ここで該ウシ乳汁から単離した粉末状エクソソームが凍結乾燥した無損傷のエクソソームを含む、ウシ乳汁単離粉末状エクソソーム。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載のウシ乳汁単離粉末状エクソソームであって、ここで該エクソソームの９０％超が直径約１０ナノメートル～約２５０ナノメートルである、ウシ乳汁単離粉末状エクソソーム。
6. 蛋白質、炭水化物、および／または脂肪、ならびにウシ乳汁単離エクソソームを含む栄養組成物であって、ここで該エクソソームが請求項１～５のいずれか１項に記載の粉末状エクソソームの添加によって提供される、栄養組成物。
7. 請求項６の栄養組成物であって、栄養組成物の重量を基準として、約０．００１～約１０ｗｔ％のウシ乳汁単離エクソソームを含む、栄養組成物。
8. 請求項６または７の栄養組成物であって、ここで該蛋白質が乳蛋白質および／または大豆蛋白質を含む、栄養組成物。
9. 請求項６～８のいずれか１項に記載の栄養組成物であって、ここで該炭水化物が繊維を含む、栄養組成物。
10. 請求項６～９のいずれか１項に記載の栄養組成物であって、ここで該脂肪が少なくとも１種類のオメガ－３脂肪酸を含む、栄養組成物。
11. 請求項１０の栄養組成物であって、ここで該組成物の該少なくとも１種類のオメガ－３脂肪酸が、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、およびα－リノレン酸から成る群から選択される、栄養組成物。
12. 請求項６～１１のいずれか１項に記載の栄養組成物であって、ここで該栄養組成物が粉末形態である、栄養組成物。
13. 請求項６～１１のいずれか１項に記載の栄養組成物であって、ここで該栄養組成物が液体形態である、栄養組成物。
14. 粉末状栄養組成物を調製する方法であって、蛋白質、炭水化物、および／または脂肪を含む粉末状組成物を、請求項１～５のいずれか１項に記載の粉末状エクソソームと乾式混合することを含む、方法。
15. ウシ乳汁から単離した粉末状エクソソームを調製する方法であって、該方法が：
    ウシ乳汁を遠心分離して上層の脂質画分、中間層の乳清画分、および細胞および細胞破片の第１の沈殿を形成させること；
    該乳清画分を分離し、該分離した乳清画分を遠心分離することによって、脂肪、カゼイン凝集物および細胞破片をさらに除去し、実質的に透明な乳清画分を形成させること；
    該実質的に透明な乳清画分を精密濾過することによって、残留する細胞破片を除去すること；
    該精密濾過した乳清画分を遠心分離することによって、エクソソームを含む沈殿を取得すること；
    水性媒体中で該エクソソームを含む沈殿をインキュベートすることにより、エクソソーム膜を破壊することなく、該沈殿を溶解し、エクソソーム懸濁液を提供すること；
    および
    該懸濁液を乾燥することによって、該粉末状エクソソームを取得すること、
    を含む、方法。
16. 請求項１５の方法であって、ここで該インキュベーション工程を５００ｒｐｍ以下の遠心分離で約１２～約３６時間実施する、方法。
17. 請求項１５または請求項１６の方法であって、ここで該乾燥工程が凍結乾燥することを含む、方法。
18. 請求項１７の方法であって、ここで該凍結乾燥することが、－８０℃の温度および０．３ミリバール未満の真空にエクソソーム懸濁液を少なくとも２４時間曝露することを含む、方法。
19. 請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法であって、ここで該方法がウシから乳汁を取得して約５日以内に該ウシ乳汁を用いて実施され、またはここで該ウシ乳汁の解凍が、ウシから乳汁を取得して約５日以内に凍結したウシ乳汁の解凍である、方法。
20. 対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を発症するリスクを低減する、または対象におけるインスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を治療する方法であって、該方法が：
    インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病を発症するリスクを有する、またはそれらの病態を有する対象に、請求項１～５のいずれか１項に記載の粉末状エクソソームまたは請求項６～１３のいずれか１項に記載の栄養組成物を投与することであって、ここでエクソソームの投与量が、それぞれ、インスリン抵抗性、前糖尿病、または糖尿病の発症リスクを低減する、またはそれらの病態を治療するのに有効な投与量である、投与することを含む、方法。
21. 請求項２０の方法であって、ここで該対象が肥満である、またはサルコペニア（筋肉減弱症）を有する、方法。

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