JP2023182391A - 形質転換体及びそれを用いるメチルアントラニレートの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 メチルアントラニレートを製造できる形質転換体、及び、当該形質転換体を用いたメチルアントラニレートの製造方法の提供。【解決手段】一態様において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、アントラニレートメチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）が発現可能に導入されて得られる、メチルアントラニレートを製造するための形質転換体。【選択図】図１

Description

本開示は、メチルアントラニレート生産技術に関する。
本開示は、一態様において、特定の遺伝子操作が施された形質転換体、及びこの形質転換体を用いたメチルアントラニレートの製造技術に関する。

メチルアントラニレート（ＣＡＳ番号：１３４－２０－３。アントラニル酸メチル、メチルアントラニル酸なども同義）は、アントラニル酸（ＣＡＳ番号：１１８－９２－３。アントラニレート、２－アミノ安息香酸なども同義）のカルボキシル基がＯ－メチル化されたアントラニル酸エステルである。

メチルアントラニレートは、ブドウ、ネロリ、ジャスミン、イランイランなどの天然植物由来の香気成分として天然に存在する。メチルアントラニレートは、ブドウや橙花（ダイダイの花）様の甘くフルーティな香気を有している。メチルアントラニレートは、安全な香料の原料として化学合成されており、５０％以上含有するものは、向精神薬原料として扱われることがある。メチルアントラニレートは、鳥類忌避剤（ｎａｔｕｒａｌ ｒｅｐｅｌｌｅｎｔｓ）としての効能も研究されている。メチルアントラニレートの精製品は、淡黄色の液体として存在し、多くの花様調合香料に用いられることがある。メチルアントラニレートは、水に微溶で、エタノールに易溶である。メチルアントラニレートの用途としては、ブドウフレーバー、石鹸香料、及び人造調合橙花油などが挙げられる。

メチルアントラニレートの前駆体であるアントラニル酸は、微生物による発酵法により、糖類から生産することもできる（例えば、特許文献１、特許文献２など）。

アントラニル酸からメチルアントラニレートを生成する代謝経路として、アントラニル酸のＣｏＡ化を介する２段階の反応経路（以下、「ＣｏＡ経路」と記載する場合もある）が存在する。当該ＣｏＡ経路では、アントラニル酸－ＣｏＡリガーゼの作用によって、アントラニル酸のカルボキシル基がＣｏＡ化されてアンスラニロイル－ＣｏＡが生成する（例えば、非特許文献１、非特許文献２など）。その後、メタノールをメチル基供与体としてアンスラニロイル－ＣｏＡ：メタノールアシルトランスフェラーゼ（ＡＭＡＴ）活性によって、ＣｏＡがメチル基に置換されてメチルアントラニレートが生成する（例えば、非特許文献３など）。
前記ＣｏＡ経路においては、２種の異種酵素の機能を発現させる必要があったり、また、副原料として、メタノールが必要となるなどの問題があった。

特開平５－９４号公報 特表平６－５００６９５号公報

Coleman, J.P., Hudson, L.L., McKnight, S.L., Farrow, J.M., 3rd, Calfee, M.W., Lindsey, C.A., Pesci, E.C. 2008. Pseudomonas aeruginosa PqsA is an anthranilate-coenzyme A ligase. J Bacteriol, 190(4), 1247-1255. Schuhle, K., Gescher, J., Feil, U., Paul, M., Jahn, M., Schagger, H., Fuchs, G. 2003. Benzoate-coenzyme A ligase from Thauera aromatica: an enzyme acting in anaerobic and aerobic pathways. J Bacteriol, 185(16), 4920-4929. Wang, J., De Luca, V. 2005. The biosynthesis and regulation of biosynthesis of Concord grape fruit esters, including 'foxy' methylanthranilate. Plant J, 44(4), 606-619.

本開示は、効率よくメチルアントラニレートを製造できる形質転換体、及び、当該形質転換体を用いて効率よくメチルアントラニレートを製造する方法を提供することを課題とする。

本開示は、一態様において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、アントラニレートメチルトランスフェラーゼ（ＡＡＭＴ：ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）が発現可能に導入されて得られる、メチルアントラニレートを製造するための形質転換体に関する。

本開示は、その他の一態様において、本開示の形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養してメチルアントラニレートを生産させる工程を含む、メチルアントラニレートの製造方法に関する。

本開示によれば、一態様において、糖類を原料としてメチルアントラニレートを生産できる形質転換体を提供できる。本開示によれば、その他の一態様において、この形質転換体を用いてメチルアントラニレートを生物学的に製造（生産）できる。

図１は、本開示の形質転換体におけるメチルアントラニレート生成を模式的に示す。 図２は、本開示の形質転換体の一形態におけるメチルアントラニレートの生合成経路を説明するための全体代謝経路図である。

本開示は、メチルアントラニレートを製造するための形質転換体に関する。
詳しくは、本開示に係る形質転換体は、一態様において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、ＡＡＭＴ活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）が発現可能に導入されて得られうる、メチルアントラニレートを製造するための形質転換体である。図１に示すように、本開示に係る形質転換体は、該形質転換体の生体内において、糖類からアントラニル酸を生成し、アントラニレートメチルトランスフェラーゼによってアントラニル酸からメチルアントラニレートを生成する。

［アントラニル酸産生能を有する微生物宿主］
本開示における「アントラニル酸産生能を有する微生物宿主」とは、少なくとも、アントラニレートシンターゼ活性を有する微生物宿主をいう。本開示に係る微生物宿主は、野生菌のみならず、ある程度、人工的に形質転換された菌であってもよい。アントラニル酸産生能を有する微生物宿主は、一又は複数の実施形態において、メチルアントラニレートの生産性向上の点から、遺伝子改変によってアントラニレートシンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入された菌であってもよい。アントラニレートシンターゼ活性を有する酵素とは、コリスミ酸からアントラニレートを合成する反応を触媒する活性を有する酵素をいう。アントラニレートシンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｔｒｐＥＧ遺伝子等が挙げられる。
本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、さらに、アントラニレートシンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入されていてもよい。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｔｒｐＥＧ遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、配列番号２５の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。アントラニレートシンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列番号２５に対する同一性が、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％である塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
本開示において、遺伝子の導入とは、一又は複数の実施形態において、該遺伝子が宿主内で発現可能に導入することをいう。宿主への遺伝子導入は、一又は複数の実施形態において、一般的な遺伝子組換え技術（例えば、Michael R. Green & Joseph Sambrook, Molecular cloning, Cold spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法）を用いて行うことができ、プラスミドベクターを用いた遺伝子導入、又は微生物宿主の染色体へ組み込む形態で実施することができる。

本開示に係る微生物宿主は、特に限定されず、例えば、コリネ型細菌、大腸菌（エシェリヒア属細菌、特に、エシェリヒア コリ）、溶媒耐性菌、又は酵母などであってもよい。
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。コリネ型細菌としては、一又は複数の実施形態において、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。
溶媒耐性菌としては、一又は複数の実施形態において、Pseudomonas putida S12、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas paucimobilis、Pseudomonas alcaligenes 、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas fragi、Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas sp. 、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus opacus、Burkholderia cepacia、及びPaenibacillus illinoisensis等が挙げられる。

本開示に係る微生物宿主は、特に限定されず、例えば、コリネバクテリウム属細菌であってもよい。コリネバクテリウム属細菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｃｅ）、及びコリネバクテリウム アルカノリティカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）等が挙げられる。

本開示に係る微生物宿主は、特に限定されず、例えば、コリネバクテリウム グルタミカムであってもよい。

本開示に係る微生物宿主は、特に限定されず、例えば、コリネバクテリウム グルタミカムＲ（ＦＥＲＭ ＢＰ－１８９７６）、ＡＴＣＣ１３０３２、又は、ＡＴＣＣ１３８６９などであってもよい。

［ＡＡＭＴ活性を有する酵素］
本開示に係る遺伝子（Ａ）は、特に限定されず、例えば、Ｏｒｙｚａ属、Ｖｉｔｉｓ属、Ｃｌａｒｋｉａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属、又はＬａｂｒｅｎｚｉａ属などのうち、少なくともいずれか一の属由来の遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有する酵素をコードする遺伝子であってもよい。なお、本開示における「遺伝子」という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含みうる。

本開示において、ＡＡＭＴ活性を有する酵素は、一又は複数の実施形態において、ＥＣ２．１．１．２７７のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）である。

本開示に係るＯｒｙｚａ属は、特に限定されず、例えば、Oryza sativa、Oryza sativa japonica、Oryza glaberrima、Oryza barthii、Oryza longistaminata、Oryza rufipogon、Oryza meridionalis、Oryza officinalis、Oryza minuta、Oryza rhizomatis、Oryza eichingeri、Oryza punctata、Oryza latifolia、Oryza alta、Oryza grandiglumis、Oryza australiensis、Oryza ridleyi、Oryza longiglumis、Oryza granulata、Oryza meyeriana、Oryza brachyantha、及びOryza schlechteri等が挙げられ、中でもOryza sativa又はOryza sativa japonicaであってもよい。

本開示に係るＶｉｔｉｓ属は、特に限定されず、例えば、Vitis vinifera、Vitis labrusca、Vitis amurensis、Vitis coignetiae、Vitis ficifolia、Vitis flexuosa、Vitis quinqueangularis、Vitis rupestris、Vitis saccharifera、及びVitis thunbergii等が挙げられ、Vitis viniferaであってもよい。

本開示に係るＣｌａｒｋｉａ属は、特に限定されず、例えば、Clarkia breweri、Clarkia amoena、Clarkia pulchella、Clarkia conccinna、Clarkia purprea、Clarkia rubisunda、Clarkia speciosa、Clarkia tenella、Clarkia unguiculata、Clarkia affinis、及びClarkia lassenensis等が挙げられ、Clarkia breweriであってもよい。

本開示に係るＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属は、特に限定されず、例えば、Arabidopsis thaliana、Arabidopsis arenicola、Arabidopsis arenosa、Arabidopsis cebennensis、Arabidopsis croatica、Arabidopsis halleri、Arabidopsis lyrata、Arabidopsis neglecta、Arabidopsis pedemontana、及びArabidopsis suecica等が挙げられ、Arabidopsis thalianaであってもよい。

本開示に係るＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属は、特に限定されず、例えば、Pectobacterium parmentieri、Pectobacterium carotovorum、Pectobacterium odoriferum、及びPectobacterium brasiliense等が挙げられ、Pectobacterium parmentieriであってもよい。

本開示に係るＳｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属は、特に限定されず、例えば、Sphingobium sp.、Sphingobium sp. SYK-6、Sphingobium japonicum、Sphingobium fuliginis、Sphingobium barthaii、Sphingobium cloacae、Sphingobium abikonense、Sphingobium limneticum、Sphingobium chlorophenolicum、Sphingobium chungbukense、Sphingobium naphthae、Sphingobium terrigena、及びSphingobium yanoikuyae等が挙げられ、Sphingobium sp.であってもよい。

本開示に係るＬａｂｒｅｎｚｉａ属は、特に限定されず、例えば、Labrenzia sp.、Labrenzia aggregata、Labrenzia callyspongiae、Labrenzia polysiphoniae、Labrenzia alexandrii、及びLabrenzia salina等が挙げられ、Labrenzia sp.であってもよい。

Vitis vinifera由来のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２７７の）のアミノ酸配列の例（配列番号５６）：MEVVQVLCMKGGNGDTSYAKNSLVQKKVISLTKPIIEEAITNLYCNKFPTSLCIADLGCSSGPNTLFAVLEVVTTVDRVGKKMGRQLPEIQVFLNDLPGNDFNTIFKSLPRFQKDLEKRMGAGAESCFINGVPGSFYGRLFPSKSLHFIHSSYSLQWLSQVPQGLESNKGNIYMASSSPPCVLKVYYEQFRTDFSMFLRCRSEELLEGGSMVLTFLGRRSEDPSSKECCYIWELLAVALNDMVAEGLIEEEKMDSFNIPQYTPSPAEVKCEVEKEGSFTISKLEVSEVNWNAYHGEFCPSDAHKDGGYNVAKLMRAVAEPLLVSHFGDGIIEEVFSRYQKIVADRMSREKTEFVNVTVSMTKRG
Oryza sativa japonica由来のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２７７の）のアミノ酸配列の例（配列番号５７）：
MKVEQDLHMSRGDGETSYAANSRLQEKAILKTRPLLHKAVEEAHASLSGLSRAPAGGKMVVADLGCSSGPNTLLVVSEVLSAVANRSSCDHKSSLVADVQFFLNDLPGNDFNLVFQSLELFKKLAEMEFGKALPPYYIAGLPGSFYTRLFPDRSVHLFHSSYCLMWRSKVPDKLASGEVLNAGNMYIWETTPPSVVKLYQRQFQEDFSQFLALRHDELVSGGQMVLTFLGRKNRDVLRGEVSYMYGLLAQALQSLVQEGRVEEEKLDSFNLPFYSPSVDEVKAVIRQSGLFDISHIQLFESNWDPQDDSDDDDVATLDSVRSGVNVARCIRAVLEPLIARHFGRCIVDDLFDMYARNVAQHLEQVKTKYPVIVLSLKARR
Arabidopsis thaliana由来のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２７７の）のアミノ酸配列の例（配列番号５８）：
MDPRFINTIPSLRYDDDKCDDEYAFVKALCMSGGDGANSYSANSRLQKKVLSMAKPVLVRNTEEMMMNLDFPTYIKVAELGCSSGQNSFLAIFEIINTINVLCQHVNKNSPEIDCCLNDLPENDFNTTFKFVPFFNKELMITNKSSCFVYGAPGSFYSRLFSRNSLHLIHSSYALHWLSKVPEKLENNKGNLYITSSSPQSAYKAYLNQFQKDFTMFLRLRSEEIVSNGRMVLTFIGRNTLNDPLYRDCCHFWTLLSNSLRDLVFEGLVSESKLDAFNMPFYDPNVQELKEVIQKEGSFEINELESHGFDLGHYYEEDDFEAGRNEANGIRAVSEPMLIAHFGEEIIDTLFDKYAYHVTQHANCRNKTTVSLVVSLTKK
Sphingobium sp.由来のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２７７の）のアミノ酸配列の例（配列番号５９）：
MADSTAVAAMAGGGLYNRHSGLQQANLQSALPLLEDAARAIGDASVGPVTIVDYGASQGRNSMAPMATAIDLVRANDARRPVQVVHTDLPSNDFTSLFGLLDQDPASYLNGRQGVFPSAIGRSYFDAILPPGSVDLGWSSNALHWMSRNPVDVADHGWAIFSRSAQARAAVDAVLAEDWLRFLKARVIELRPGGRLICQFMGRGPDSHGFEWMAGNFWQSIVDMEGEGLLSADETLKMTAPSAGRSPDQVRAPFDAGLVPDLVLEHLAAIPSPDPYWEGYQQTGNAAELGRQWAAMMGAANGPNFLARVAASRDRDALLASLVQRVAARVEADPQRSRAFILILSIRKPA
Labrenzia sp.由来のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２７７の）のアミノ酸配列の例（配列番号６０）：
MEPPPKPVHPFAQPVSHATTTGMSGGGFYNANSAAQWSAIEKILPLLEEAIASLPIEGSGPVGIADYGCSEGRNSVAVMKHALPALLARTERPIQTIHSDLPTNDFSELFRSLRPDGGSVFGSERVYSAAIGGSMYDQLCPLQSLHLATTFNAIGFLSCRPVDRLPGYILPNGPSVARANGYVSEEDRHAFAEQAKNDIARFLTVRARELVPGGKLLVQVFGSKGLARTCDGLYDLLNDAVLDFVEAGDISRDVYDRHYQPVYMRDLQELADPVTNDTYGAAGLYSLDRSMEYEIAVPFVDRFKQDGDLDRYARDYVNFFRAFTEAVLRAALPESPSRKDLINRIFARAEDRLKADTSLYPFRYAAVAMLLTRNG
Pectobacterium parmentieri由来のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２７７の）のアミノ酸配列の例（配列番号６１）：
MEDSVYCQGIMESRGIYNQHAKVQASGNFFAMPILDGIVDDMSVFIEGKYISIADYGSSQGKNSLLPIGKIIHSIRSRFPSHPIFVMHTDQINNDYSTLFNVLENDSESYTSHKDVFYCAIGRSFYSPILPSNSILLGWSAYAAMWLSYVSINQWDHIVPYKTSSNIQRQLAQQGEQDWRRFLAARATELQVGGKLVLLLAGIDNENRSGFDVIIDNAAQVLDEMVIDGYFSSDERAVMKIATYMRRSEEVLAPFTHQISYCGLRVVHFSVDVLSDPAWQHYLAHNDVKEMAAQQVSFFRSTFMPSLLSALEITYSAIALQNITRIFEEKLTERCASCPVPMEQRAQILVLEKIES
Clarkia breweri由来のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．２７７の）のアミノ酸配列の例（配列番号６２）：
MDVRQVLHMKGGAGENSYAMNSFIQRQVISITKPITEAAITALYSGDTVTTRLAIADLGCSSGPNALFAVTELIKTVEELRKKMGRENSPEYQIFLNDLPGNDFNAIFRSLPIENDVDGVCFINGVPGSFYGRLFPRNTLHFIHSSYSLMWLSQVPIGIESNKGNIYMANTCPQSVLNAYYKQFQEDHALFLRCRAQEVVPGGRMVLTILGRRSEDRASTECCLIWQLLAMALNQMVSEGLIEEEKMDKFNIPQYTPSPTEVEAEILKEGSFLIDHIEASEIYWSSCTKDGDGGGSVEEEGYNVARCMRAVAEPLLLDHFGEAIIEDVFHRYKLLIIERMSKEKTKFINVIVSLIRKSD

本開示に係る遺伝子（Ａ）は、特に限定されず、例えば、下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかの遺伝子からなるものであってもよい。
（ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子、又は配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、又は配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、又は配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

本開示に係る遺伝子（Ａ）は、特に限定されず、例えば、下記の（ｄ）、（ｅ）又は（ｆ）のいずれかの遺伝子からなるものであってもよい。
（ｄ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列を有する遺伝子、又は配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列からなる遺伝子。
（ｅ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、又は配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｆ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、又は配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

本開示に係る形質転換体は、必須の構成では無いものの、一態様において、任意に、例えば、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性（ｍｅｔＫ活性）、アデノシルホモシステインシンターゼ活性（ｓａｈＨ活性）及びグルタミンシンターゼ活性（ｇｌｎＡ活性）のうち、少なくとも一つの酵素活性が強化されていてもよく、一又は複数の実施形態において、これらの酵素活性のうち１つ、２つ又は３つ（全部）の酵素活性が強化されていてもよい（図２）。なお、当該酵素活性の強化は、特に限定されず、例えば、当該酵素をコードする遺伝子の発現増強などによって、強化されていてもよい。
本開示に係る形質転換体は、メチルアントラニレート生産性向上の点から、一又は複数の実施形態において、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、アデノシルホモシステインシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子、及びグルタミンシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子の少なくとも一つが導入されていてもよく、一又は複数の実施形態において、これらの遺伝子のうち１つ、２つ又は３つ（全部）の遺伝子が導入されていてもよい。

アデノシルメチオニンシンテターゼ活性（ｍｅｔＫ活性）を有する酵素とは、アデノシン及びメチオニンからＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を合成する反応を触媒する活性を有する酵素をいう。アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＫ遺伝子等が挙げられる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＫ遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、配列番号３１の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列番号３１に対する同一性が、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％である塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。

アデノシルホモシステインシンターゼ活性（ｓａｈＨ活性）を有する酵素とは、Ｓ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（ＳＡＨ）からホモシステインを合成する反応を触媒する活性を有する酵素をいう。アデノシルホモシステインシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｓａｈＨ遺伝子等が挙げられる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｓａｈＨ遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、配列番号３４の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。アデノシルホモシステインシンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列番号３４に対する同一性が、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％である塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。

グルタミンシンターゼ活性を有する酵素（ｇｌｎＡ活性）とは、グルタミン酸からグルタミンを合成する反応を触媒する活性を有する酵素をいう。グルタミンシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｌｎＡ遺伝子等が挙げられる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｌｎＡ遺伝子としては、一又は複数の実施形態において、配列番号２８の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。グルタミンシンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子は、一又は複数の実施形態において、配列番号２８に対する同一性が、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、又は１００％である塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。

本開示に係る形質転換体は、メチルアントラニレート生産性のさらなる向上の点から、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子及びアデノシルホモシステインシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子が導入されているか、又はグルタミンシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子が導入されていることが好ましく、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子及びアデノシルホモシステインシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子が導入されていることがより好ましい。

本開示に係る形質転換体は、必須の構成では無いものの、一態様において、任意に、例えば、グルタミンシンターゼアデニリルトランスフェラーゼ活性（ｇｌｎＥ活性）、グルタミナーゼ活性（ｇｌｓＡ活性）、及びアントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性（ｔｒｐＤ活性）のうち、少なくとも一つの活性を有する酵素の機能が、低下又は欠損しているものであってもよく、一又は複数の実施形態において、これらの酵素のうち１つ、２つ又は３つ（全部）の酵素の機能が低下又は欠損していてもよい。
本開示に係る形質転換体は、メチルアントラニレート生産性向上の点から、一又は複数の実施形態において、グルタミンシンターゼアデニリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｇｌｎＥ遺伝子）、グルタミナーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｇｌｓＡ遺伝子）、及びアントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｔｒｐＤ遺伝子）の少なくとも一つの遺伝子が破壊又は欠失していてもよく、一又は複数の実施形態において、これらの遺伝子のうち１つ、２つ又は３つ（全部）の遺伝子が破壊又は欠失していてもよい。
グルタミンシンターゼアデニリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素とは、グルタミンシンターゼ－Ｌ－チロシンホスホリラーゼからアデニル基を除去する反応を触媒する活性を有する酵素をいう。グルタミナーゼ活性を有する酵素とは、グルタミンからグルタミン酸を合成する反応を触媒する活性を有する酵素をいう。アントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素とは、アントラニル酸からＮ－（５－ホスホ－β－Ｄ－リボシル）アントラニル酸を合成する反応を触媒する活性を有する酵素をいう

本開示に係る形質転換体は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、メチルアントラニレート生産性向上の点から、グルタミンシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｇｌｎＡ遺伝子）が導入され、かつグルタミンシンターゼアデニリルトランスフェラーゼ活性（例えば、ｇｌｎＥ遺伝子）、グルタミナーゼ活性（例えば、ｇｌｓＡ遺伝子）、及びアントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ｔｒｐＤ遺伝子）が低下又は欠損しているものであってもよい。
本開示に係る形質転換体は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、メチルアントラニレート生産性向上の点から、グルタミンシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｇｌｎＡ遺伝子）及びアントラニレートシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｔｒｐＥＧ遺伝子）が導入され、かつグルタミンシンターゼアデニリルトランスフェラーゼ活性（例えば、ｇｌｎＥ遺伝子）、グルタミナーゼ活性（例えば、ｇｌｓＡ遺伝子）、及びアントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ｔｒｐＤ遺伝子）が低下又は欠損しているものであってもよい。

本開示に係る形質転換体は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、メチルアントラニレート生産性向上の点から、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｍｅｔＫ遺伝子）及びアデノシルホモシステインシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｓａｈＨ遺伝子）が導入され、かつアントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ｔｒｐＤ遺伝子）が低下又は欠損しているものであってもよい。
本開示に係る形質転換体は、特に限定されない一又は複数の実施形態において、メチルアントラニレート生産性向上の点から、アントラニレートシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｔｒｐＥＧ遺伝子）、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｍｅｔＫ遺伝子）及びアデノシルホモシステインシンターゼ活性を有する酵素がコードされた遺伝子（例えば、ｓａｈＨ遺伝子）が導入され、かつアントラニレートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性（例えば、ｔｒｐＤ遺伝子）が低下又は欠損しているものであってもよい。

本開示に係る形質転換体は、一態様において、コリネバクテリウム グルタミカムＭＡＴ１４株（受託番号：NITE BP-03633）コリネ型細菌形質転換体であってもよい。

本開示に係る遺伝子の同一性については、特に限定されず、例えば、８０％以上、８５％以上又は９０％以上であってもよく、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上又は９５％以上であってもよく、若しくは９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は１００％であってもよい。

そのような同一性を有し、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列を有する遺伝子も、本開示に係る遺伝子（Ａ）に含まれることは言うまでもない。

前記ストリンジェントな条件としては、一般的な条件、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol2, p11.45に記載された条件であってもよい。具体的には、完全ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５～１０℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合であってもよい。

また、本開示に係る形質転換体は、一態様において、遺伝子導入したＡＡＭＴの反応基質としての内因性前駆体であるアントラニル酸の生産を高めることにより、糖からのメチルアントラニレート生産を増強されていてもよい。

本開示に係る形質転換体は、必須の構成では無いものの、一態様において、任意に、例えば、シキミ酸経路、糖代謝経路（ｉｏｌＴ１－ｐｐｇｋ）、非酸化的ペントース・リン酸経路のうち、少なくとも一の経路に含まれるの酵素の活性が強化されていてもよい。なお、当該酵素活性の強化は、特に限定されず、例えば、当該酵素をコードする遺伝子の発現増強などによって、強化されていてもよい。

アントラニル酸は、芳香族アミノ酸の一つであるトリプトファンの生合成中間体であり、芳香族アミノ酸生産に関わる共通代謝経路であるシキミ酸経路で生成するコリスミ酸を基質としてアントラニル酸合成酵素による触媒反応により生成する。このことから、メチルアントラニレートの高生産のため、シキミ酸経路の代謝フラックスを高めてもよい。図２に、糖類を原料とするメチルアントラニレートの代謝経路を示す全体糖代謝経路の一例を模式的に図示する。本開示における糖代謝経路は、グルコース等の糖類を、各種化合物の生合成のための原料等にするために分解及び変換するための種々の生体内反応系を意味し、一又は複数の実施形態において、シキミ酸経路、糖代謝経路（ｉｏｌＴ１－ｐｐｇｋ）、非酸化的ペントース・リン酸経路、及びＴＣＡ回路等を含みうる。但し、本開示における糖代謝経路は、図２に示すメチルアントラニレートの生合成経路は、本開示における改変の一例を説明するものであって、本開示はこれに限定されるものではない。

シキミ酸経路の代謝フラックスを高めるための代謝改変手法は、特に限られず、一態様において、以下の（１）ないし（３）などであってもよい。
（１）シキミ酸経路を構成する各酵素遺伝子（aroG、aroB、aroD、aroE、aroK、aroA、及びaroC：それぞれ、３－デオキシ－Ｄ－アラビノ－ヘプツロソネート－７－リン酸（DAHP）シンターゼ、３－デヒドロキナ酸シンターゼ、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、シキミ酸キナーゼ、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼ、及びコリスミ酸シンターゼをコード）の発現増強や異種・変異遺伝子の利用等による高活性化。
（２）野生型株での糖輸送体として通常利用されているホスホエノールピルビン酸：糖 ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）とは異なる代替糖輸送・代謝経路である非PTS糖輸送経路を構成する各遺伝子（ｍｙｏ－イノシトール／グルコース輸送体をコードするiolT1遺伝子及びiolT2遺伝子、グルコキナーゼをコードするglk遺伝子、及びポリリン酸グルコキナーゼをコードするppgk遺伝子）の発現増強等による高活性化。
（３）非酸化的ペントース・リン酸経路を構成する各酵素遺伝子（tkt及びtal:それぞれ、トランスケトラーゼ、及びトランスアルドラーゼをコード）の発現増強等による高活性化。

本開示に係る形質転換体は、必須の構成では無いものの、一態様において、任意に、例えば、３－デヒドロシキメートデヒドラターゼをコードする遺伝子（例えばｑｓｕＢ遺伝子）、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（例えばｑｓｕＤ遺伝子）、及び乳酸デヒドロゲナーゼ（例えばｌｄｈＡ遺伝子）の機能が、低下又は欠損していてもよい。本開示に係る形質転換体は、メチルアントラニレート生産性向上の点から、宿主におけるｑｓｕＢ遺伝子、ｑｓｕＤ遺伝子及びｌｄｈＡ遺伝子の一部が破壊又は欠損していてもよい。

また、本開示に係る形質転換体は、一態様において、上記の各種代謝経路遺伝子の発現増強や異種（変異）遺伝子利用等による酵素機能の高活性化による各代謝経路の強化が施されていてもよい。

［形質転換体の作製］
形質転換
形質転換方法は、公知の方法を制限無く使用できる。このような公知の方法として、一又は複数の実施形態において、塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン介在トランスフェクション、及び電気穿孔法等が挙げられる。微生物宿主がコリネ型細菌である場合、電気パルス法が好適である。電気パルス法は、公知の方法〔例えば、Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447（1990）〕及び〔Vertes A. A. et al., Presence of mrr- and mcr- like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185(1993)〕により行うことができる。

宿主染色体遺伝子の破壊又は変異導入
微生物宿主がコリネ型細菌である場合、必要に応じて生合成の競合経路や生合成経路の抑制因子又は排出系トランスポーター等をコードする遺伝子が破壊され、又は欠失させてもよい。染色体上への変異導入によって特定の遺伝子がコードする酵素タンパク質の機能を向上させてもよい。標的遺伝子前後のＤＮＡ断片を連結することで標的遺伝子全長が欠失したＤＮＡ断片を作製し、該ＤＮＡで細菌を形質転換して染色体上で相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を完全に欠失させることができる。或いは標的遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能する酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで細菌を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の標的遺伝子を欠失型又は破壊型の遺伝子に置換することができる。欠失型又は破壊型の遺伝子によってコードされる酵素タンパク質は、生成したとしても、野生型酵素タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失している。また、特定の変異が導入された遺伝子断片を当該染色体領域と相同組み換えを起こさせることにより、染色体上の特定の位置に変異導入させることができる。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子欠失又は破壊は既に確立しており、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で複製起点を持たないスイサイドベクターを利用する方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、コリネバクテリウム グルタミカムR内で複製不能なプラスミドである。プラスミドpCRA725に導入した染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性とを示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。

プロモーターとしては、一又は複数の実施形態において、コリネバクテリウム グルタミカムＲ由来のグリセルアルデヒド３－フォスフェートデヒドロゲナーゼ（「グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ」とも言う）をコードするｇａｐＡ遺伝子のプロモーター（ＰｇａｐＡ）、マレートデヒドロゲナーゼをコードするｍｄｈ遺伝子のプロモーター（Ｐｍｄｈ）、及びラクテートデヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ遺伝子のプロモーター（ＰｌｄｈＡ）等が挙げられ、中でも、ＰｇａｐＡが好ましい。

微生物の増殖
本開示に係る形質転換体は、一又は複数の実施形態において、反応液中での反応に先立ち、好気条件下で培養して増殖させることが好ましい。培養条件は、一又は複数の実施形態において、温度が約２５～３８℃であり、時間が約１２～４８時間である。
好気的培養に用いる培地は、一又は複数の実施形態において、炭素源、窒素源、無機塩類及びその他の栄養物質等を含有する天然培地又は合成培地が挙げられる。培地のｐＨは、一又は複数の実施形態において、約５～８が好ましい。

コリネ型細菌用培地としては、例えば、Ａ培地〔Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196(2004)〕、及びＢＴ培地〔Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103(2004)〕等が挙げられる。
大腸菌用培地としては、一又は複数の実施形態において、ＬＢ培地等が挙げられる。

炭素源としては、一又は複数の実施形態において、グルコース、フルクトース、スクロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、アラビノース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトール、グリセリン等の糖質又は糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸又はグルコン酸等の有機酸；エタノール又はプロパノール等のアルコール等が挙げられる。所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。増殖用培地中のこれら炭素源の濃度は、一又は複数の実施形態において、約０．１～１０（ｗ／ｖ％）である。

窒素源としては、一又は複数の実施形態において、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、又は硝酸カリウム等が挙げられる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ベプトン、ＮＺ－アミン、蛋白質加水分解物、又はアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用できる。窒素源は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。増殖用培地中の窒素源濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、一又は複数の実施形態において、約０．１～１０（ｗ／ｖ％）である。

無機塩類としては、一又は複数の実施形態において、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸アンモニウム、又は炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種を単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。増殖用培地中の無機塩類濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、一又は複数の実施形態において、約０．０１～１（ｗ／ｖ％）である。

その他の栄養物質としては、一又は複数の実施形態において、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、又は動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、一又は複数の実施形態において、約０．１～１０（ｗ／ｖ％）である。必要に応じて、ビタミン類を添加してもよい。ビタミン類としては、一又は複数の実施形態において、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、又はニコチン酸等が挙げられる。

［メチルアントラニレートの製造方法］
本開示は、メチルアントラニレートの製造方法に関する。
詳しくは、本開示に係るメチルアントラニレートの製造方法にあっては、一態様において、本開示に係る形質転換体を、糖類を含む反応液中で培養してメチルアントラニレートを生産させる工程を含む製造方法であってもよい。

反応液は、糖類を含有していればよく、特に限定されない一又は複数の実施形態において、糖類を含有する水、緩衝液又は無機塩培地等を用いることができる。反応液は、一又は複数の実施形態において、ビタミン類、酵母エキス及び乾燥酵母等の糖類以外のその他の栄養物質を含んでいてもよい。

糖類としては、一又は複数の実施形態において、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロース、又はマンニトール等が挙げられる。反応液中の糖類の濃度としては、一又は複数の実施形態において、約０．１～２０（ｗ／ｖ％）であり、１～２０（ｗ／ｖ％）又は５～２０（ｗ／ｖ％）が好ましい。

緩衝液としては、一又は複数の実施形態において、リン酸バッフアー、卜リスバッファー、及び炭酸バッファー等が挙げられる。緩衝液の濃度は、一又は複数の実施形態において、約１０～１５０ｍＭが挙げられる。

無機塩培地としては、一又は複数の実施形態において、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム、尿素、硫酸アンモニウム、及び硫酸第一鉄等の無機塩の１種又は２種以上を含む培地が挙げられる。中でも、尿素、硫酸アンモニウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム及び硫酸第一鉄等を含む培地が好ましい。無機塩培地として、具体的にはＢＴ培地及びＡ培地等が挙げられる。無機塩類の培地中の濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、、一又は複数の実施形態において、約０．０１～１（ｗ／ｖ％）が挙げられる。

反応条件
反応は、一又は複数の実施形態において、還元条件及び微好気的条件（例えば、溶存酸素濃度を制御した条件）等が挙げられる。特に限定されない一又は複数の実施形態において、微生物宿主がコリネバクテリウム グルタミ力ムである場合、還元条件及び微好気的条件のいずれにおいてもコリネバクテリウム グルタミ力ムは実質的に増殖しない反応で行われるため、一層効率的にメチルアントラニレートを生産させることができる。

反応温度（反応中の形質転換体の生存温度）は、一又は複数の実施形態において、約２０～５０℃であり、約２５～４７℃が好ましい。上記温度範囲であれば効率良くメチルアントラニレートを製造できる。

反応液のｐＨは、一又は複数の実施形態において、約６～８が好ましい。反応中は、アンモニア水溶液及び水酸化ナトリウム水溶液などを用いて、ｐＨコントローラー（例えば、エイブル株式会社製、型式：ＤＴ－１０２３）で、反応液のｐＨを中性付近、特に約７にコントロールしながら反応させることが好ましい。

反応時間は、一又は複数の実施形態において、約１～７日間であり、約１～３日間が好ましい。培養は、一又は複数の実施形態において、バッチ式、流加式及び連続式のいずれでもよく、中でもバッチ式が好ましい。

［ベクター・プラスミド］
本開示は、本開示に係る遺伝子（Ａ）を、微生物に導入する、ベクターに関する。
本開示に係るベクターは、特に限定されず、例えば、プラスミドなどであってもよい。

本開示はさらに以下の一又は複数の実施形態に関する。
［１］ アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、
アントラニレートメチルトランスフェラーゼ（ＡＡＭＴ：ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）が発現可能に導入されて得られる、
メチルアントラニレートを製造するための形質転換体。
［２］ 前記ＡＡＭＴ活性を有する酵素は、Ｏｒｙｚａ属、Ｖｉｔｉｓ属、Ｃｌａｒｋｉａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属、及びＬａｂｒｅｎｚｉａ属からなる群から選択される少なくとも一つの由来のものである、［１］に記載の形質転換体。
［３］ 前記遺伝子（Ａ）は、少なくとも、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択される遺伝子である、［１］又は［２］に記載の形質転換体。
（ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｂ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｃ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
［４］ 前記遺伝子（Ａ）は、少なくとも、下記の（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）からなる群から選択される遺伝子である、［１］から［３］のいずれかに記載の形質転換体。
（ｄ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列を有する遺伝子。
（ｅ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
（ｆ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
［５］ 前記ＡＡＭＴ活性を有する酵素は、ＥＣ２．１．１．２７７のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼである、［１］から［４］のいずれかに記載の形質転換体。
［６］ さらに、グルタミナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子及びグルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一方が破壊されている、［１］から［５］のいずれかに記載の形質転換体。
［７］ さらに、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入されている、［１］から［６］のいずれかに記載の形質転換体。
［８］ 前記微生物宿主は、コリネバクテリウム グルタミカムである、［１］から［７］のいずれかに記載の形質転換体。
［９］ 前記微生物宿主は、コリネバクテリウム グルタミカムＲ（ＦＥＲＭ ＢＰ－１８９７６）である、［１］から［８］のいずれかに記載の形質転換体。
［１０］ コリネバクテリウム グルタミカムＭＡＴ１４株（受託番号：NITE BP-03633）コリネ型細菌形質転換体。
［１１］ ［１］から［１０］のいずれかに記載の形質転換体を、
糖類を含む反応液中で培養してメチルアントラニレートを生産させる工程を含む、
メチルアントラニレートの製造方法。
［１２］ ［１］から［４］のいずれかで規定された遺伝子（Ａ）を、微生物に導入する、ベクター。

以下、実施例を用いて本開示をさらに説明する。ただし、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。

［実施例１］
［メチルアントラニレート生産株の構築］
（１）染色体ＤＮＡの調整・入手
微生物宿主の染色体ＤＮＡは、菌株入手機関の情報に従って培養後、ＤＮＡゲノム抽出キット（illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit、Cytiva）を用いて調製した。また、Zea属、Vitis属、Oryza属、Arabidopsis属、Sphingobium属、Labrenzia属、Pectobacterium属及びClarkia属のaamt遺伝子は、当該微生物宿主における発現のためコドン最適化した遺伝子を人工合成により作成した。
微生物宿主は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Corynebacterium属（特に限られず、一例として、本実施例においては、Corynebacterium glutamicum R（FERM P-18976））を用いた。
Vitis属は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Vitis viniferaを用いた。
Oryza属は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Oryza sativaを用いた。
Arabidopsis属は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Arabidopsis thalianaを用いた。
Sphingobium属は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Sphingobium sp.を用いた。
Labrenzia属は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Labrenzia sp.を用いた。
Pectobacterium属は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Pectobacterium parmentieriを用いた。
Clarkia属は、特に限られず、一例として、本実施例においては、Clarkia breweriを用いた。
Zea属は、Zea maysを用いた。

（２）メチルアントラニレート生産関連遺伝子発現プラスミドの構築
目的の酵素遺伝子を単離するために用いたプライマー配列を表１に示す。PCRは、VeritiProサーマルサイクラー（Thermo Fisher Scientific株式会社）を用い、反応試薬としてPrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社）を用いた。

PCR増幅したDNA断片をPgapAプロモーターを含有するクローニングベクターpCRC666に導入した。trpEG遺伝子においては、コリネバクテリウム グルタミカム内で共存可能なプラスミドpCRB1[NCBI GenBank:AB444682]にPgapAプロモーター融合遺伝子断片を導入した。導入したクローニングベクターと得られたプラスミド名を表２に示す。

（３）メチルアントラニレート生産関連遺伝子染色体導入用プラスミドの構築
メチルアントラニレート生産関連遺伝子をCorynebacterium株の染色体にマーカーレスで導入するために必要なＤＮＡ領域を、Corynebacterium株の生育に必須でないと報告されている配列［Appl. Environ. Microbiol. 71:3369-3372 (2005)］（ＳＳＩ領域）を基に決定した。このＤＮＡ領域をＰＣＲ法により増幅し、得られたＤＮＡ断片をマーカーレス遺伝子導入用プラスミドpCRA725[J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、特開2007-295809]に導入した。プライマー配列と得られたプラスミドを表３に示す。

上記表２で構築したメチルアントラニレート生産関連遺伝子発現プラスミドからPgapAプロモーター融合遺伝子断片を取得し、上述の染色体導入用プラスミドに導入した。得られたプラスミドを表４に示す。

（４） Corynebacterium株染色体遺伝子破壊用プラスミドの構築
Corynebacterium株の染色体遺伝子をマーカーレスで破壊するために必要なDNA領域をPCR法により増幅した。各PCR断片はリン酸化プライマーにより連結可能である。得られたDNA断片をマーカーレス遺伝子破壊用プラスミドpCRA725[J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:243-254（2004）、特開2007-295809]に導入した。得られたプラスミドを表５に示す。

（５） 染色体遺伝子組換えによるメチルアントラニレート生産株の構築
マーカーレス染色体遺伝子導入用ベクターpCRA725は、Corynebacterium内で複製不能なプラスミドである。プラスミドpCRA725に導入した染色体上の相同領域との一重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性と、バチルス サブチルス（Bacillus subtilis）由来のsacR-sacB遺伝子の発現によるスクロース含有培地での致死性を示すのに対し、二重交叉株の場合、pCRA725上のカナマイシン耐性遺伝子の脱落によるカナマイシン感受性と、sacR-sacB遺伝子の脱落によるスクロース含有培地での生育性を示す。従って、マーカーレス染色体遺伝子導入株は、カナマイシン感受性及びスクロース含有培地生育性を示す。

上記方法により、上述したメチルアントラニレート生産関連遺伝子染色体導入用プラスミド及び染色体遺伝子破壊用プラスミドを用いて遺伝子組換え株を構築した。宿主菌株としてCorynebacterium ldhA破壊株CRZ1[Biotechnol Bioeng. Nov;110(11):2938-2948 (2013)]を使用した。また、aroG遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB284[WO2017/169399]、aroD遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB291[WO2017/169399]、aroE遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB293[WO2017/169399]、aroCKB遺伝子染色体導入用プラスミドpCRB286[WO2017/169399]、qsuB遺伝子破壊用プラスミドpCRB229[WO2017/169399]及びqsuD遺伝子破壊用プラスミドpCRB299[WO2017/169399]も使用した。本染色体遺伝子組換えの概要は、表６にまとめて示した。

（６） メチルアントラニレート生産関連遺伝子発現プラスミド導入株の構築
上述の染色体遺伝子組換え株にＡＡＭＴ酵素遺伝子を導入することによりメチルアントラニレート生産株を構築した。本生産株の概要は、表７にまとめて示した。
ＭＡＴ１４株は、Corynebacterium glutamicum MAT14株として、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室（郵便番号292-0818）の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託した（受託日：２０２２年３月２４日、受託番号：NITE BP-03633）。

［実施例２］
糖類からのメチルアントラニレート生産実験例（１）
実施例１で構築したＡＡＭＴ導入菌株を用いてグルコースを炭素源とする栄養培地を用いて試験管培養を行い、各菌株のグルコースからのメチルアントラニレート生産能を調べた。なお、これらの菌株においては、糖からアントラニル酸の前駆体であるコリスミ酸への代謝フラックスを強化するため、シキミ酸経路を構成するaroD、aroE及びaroCKBの各遺伝子が高発現用gapAプロモーターの制御下において染色体導入されている（図２、表４）。各菌株を１０ｍｌのＡＫ－Ｇｌｃ液体培地（Ａ液体培地（（ＮＨ₂）₂ＣＯ ２ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ７ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．５ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ、０．６％（ｗ／ｖ）ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．４２％（ｗ／ｖ）ＭｎＳＯ₄・２Ｈ₂Ｏ １ｍｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ｂｉｏｔｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）ｔｈｉａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １ｍｌ、ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２ｇ、ｖｉｔａｍｉｎ ａｓｓａｙ ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ７ｇを蒸留水１Ｌに溶解）に、グルコース４％、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した液体培地）（試験管内）で終夜前培養後、１０ｍｌの新しいＡＫ－Ｇｌｃ培地に初期ＯＤが０．２になるように植菌し、３３℃で２４時間、振盪培養を行った。試験管培養２４時間後の各菌株の培養上清中に含まれるメチルアントラニレートについて、ＨＰＬＣ分析により定量を行った。その結果、各菌株のメチルアントラニレート生産濃度は、表８に示すように、ＭＡＴ１２株が１．３ｍＭ、ＭＡＴ１４株が１．６ｍＭ、ＭＡＴ１５株が０．９０ｍＭ、ＭＡＴ１６株が０．３５ｍＭ、ＭＡＴ１７株が０．１７ｍＭ、ＭＡＴ１９株が０．７６ｍＭ、ＭＡＴ２８株が０．９９ｍＭであった。この結果より、Ｏｒｙｚａ属由来のＡＡＭＴの導入菌株であるＭＡＴ１４株が最も高いメチルアントラニレート生産濃度をもたらすことが示された。

［実施例３］
糖類からのメチルアントラニレート生産実験例（２）
次に、ＭＡＴ１２、ＭＡＴ１４、及びＭＡＴ１５株を用いて、１００ｍｌ容量ジャーファーメンターで温度、ｐＨ及び溶存酸素濃度を制御した条件で培養を行った際の、各菌株のメチルアントラニレート生産能を調べた。各菌株を１０ｍｌのＡＫ－Ｇｌｃ液体培地（試験管内）に植菌し、３３℃で１６時間、振盪培養を行った。グルコース１０％を添加した８０ｍｌのＡＪ液体培地（０．１％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．１％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０．０５％ＭｇＳＯ₄、１．４％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２００μｇ／Ｌビオチン、２００μｇ／Ｌチアミン、６ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、４．２ｍｇ／Ｌ ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ、０．６％Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ）、０．７％Ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｄｉｆｃｏ）、５０μｇ／ｍｌカナマイシン）に初期ＯＤ６１０が０．３５になるように植菌し、３３℃、ｐＨ７．０（５Ｎ ＮＨ₃の添加により自動調整）、ＤＯ＞１０％（３００－１５００ｒｐｍの攪拌回転数制御により自動制御）、０．５ｖｖｍ（４０ｍｌ ａｉｒ／ｍｉｎ）の条件で４８時間、１００ｍｌ容量ジャーファーメンターで培養を行った。ジャー培養４８時間後の各菌株の培養上清中に含まれるメチルアントラニレートについて、ＨＰＬＣ分析により定量を行った。その結果、各菌株のメチルアントラニレート生産濃度は、表９に示すように、ＭＡＴ１２株が５．１ｍＭ、ＭＡＴ１４株が７．３ｍＭ、ＭＡＴ１５株が５．３ｍＭであった。この結果より、ジャー培養条件においても、Ｏｒｙｚａ属由来のＡＡＭＴの導入菌株であるＭＡＴ１４株が最も高いメチルアントラニレート生産濃度をもたらすことが示された。

［実施例４］
糖類からのメチルアントラニレート生産実験例（３）
試験菌株としては以下に示す４株を用い、各菌株のメチルアントラニレート生産能を調べた。ＭＡＴ１４株の他、遺伝子改変を染色体に導入した菌株として、ＭＡＴ２３（遺伝子型：ΔｔｒｐＤ）、ＭＡＴ２４（遺伝子型：ｇｌｎＡ、ΔｔｒｐＤ、ΔｇｌｎＥ、ΔｇｌｓＡ）、及びＭＡＴ２６株（遺伝子型：ｍｅｔＫ、ｓａｈＨ、ΔｔｒｐＤ）を構築して用いた。これらの菌株においては、ＡＡＭＴをプラスミドで高発現させている。また、ＭＡＴ２３、ＭＡＴ２４、及びＭＡＴ２６株においては、メチルアントラニレートの前駆体であるアントラニル酸の生産強化を狙い、トリプトファン生合成経路においてアントラニル酸の代謝変換を触媒するアントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするtrpD遺伝子を破壊するとともに、コリスミ酸のアントラニル酸への変換を触媒する内在性酵素であるアントラニル酸合成酵素のフィードバック阻害耐性型変異遺伝子であるtrpEG遺伝子をプラスミドにより高発現させている。また、ＭＡＴ２４株では、trpD遺伝子の破壊に加え、アントラニル酸の合成基質として用いられるグルタミンの供給強化に関わる遺伝子改変として、グルタミンシンテターゼをコードするglnA遺伝子の染色体導入による高発現と、グルタミンシンテターゼアデニル化酵素をコードするglnE及びL-グルタミナーゼをコードするglsAの両遺伝子を破壊している。一方、ＭＡＴ２６株では、メチルアントラニレート生成反応におけるメチル基供与体として必要とされるＳ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の細胞内供給を強化するための遺伝子改変として、ＳＡＭシンテターゼをコードするmetK遺伝子及びＳ－アデノシルホモシステインシンターゼをコードするsahH遺伝子の両遺伝子を染色体導入（高発現）している。なお、アントラニル酸、及びＳＡＭの供給強化に関わるこれらの遺伝子改変のうち、glnA、metK、及びsahHの染色体導入については、これらのうちのいずれか一種の遺伝子の導入でも良く、また、trpD、glnE、及びglsAの遺伝子破壊についても、これらのうちのいずれか一種の遺伝子の破壊又は欠損としても良い。

これらの菌株を１０ｍｌのＡＫ－Ｇｌｃ液体培地（試験管内、ＭＡＴ２３、ＭＡＴ２４、ＭＡＴ２６の培養に用いる培地には、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールも添加）に植菌し、３３℃で１６時間、振盪培養による前培養を行った後、グルコース１０％を添加した８０ｍｌの前記ＡＪ液体培地（ＭＡＴ２３、ＭＡＴ２４、ＭＡＴ２６の培養に用いる培地には、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールも添加）に初期ＯＤ６１０が０．３５になるように植菌し、３３℃、ｐＨ７．０（５Ｎ ＮＨ₃の添加により自動調整）、ＤＯ＞１０％（３００－１５００ｒｐｍの攪拌回転数制御により自動制御）、０．５ｖｖｍ（４０ｍｌ ａｉｒ／ｍｉｎ）の条件で６７時間、１００ｍｌ容量ジャーファーメンターを用いて培養を行った。培養６７時間後に各菌株の培養上清中に含まれるメチルアントラニレートについて、ＨＰＬＣ分析による定量分析を行った。その結果、各菌株のメチルアントラニレート生産濃度は、それぞれＭＡＴ１４株の生産濃度を１００としたときの相対値として、ＭＡＴ２３株が１１０、ＭＡＴ２４株が１９７、ＭＡＴ２６株が２２３であった。この結果より、ＭＡＴ２４株、及びＭＡＴ２６株に導入した、それぞれ、グルタミン及びＳＡＭの供給強化に関わる遺伝子改変が顕著なメチルアントラニレート生産向上をもたらすことが示された。

本開示によれば、微生物を用いて糖原料からメチルアントラニレートを製造できる。

Claims (8)

1. アントラニル酸産生能を有する微生物宿主に、
   アントラニレートメチルトランスフェラーゼ（ＡＡＭＴ：ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）活性を有する酵素をコードする遺伝子（Ａ）が発現可能に導入されて得られる、
   メチルアントラニレートを製造するための形質転換体。
2. 前記ＡＡＭＴ活性を有する酵素は、Ｏｒｙｚａ属、Ｖｉｔｉｓ属、Ｃｌａｒｋｉａ属、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ属、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ属、及びＬａｂｒｅｎｚｉａ属からなる群から選択される少なくとも一つの由来のものである、
   請求項１に記載の形質転換体。
3. 前記遺伝子（Ａ）は、
   少なくとも、下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択される遺伝子である、
   請求項１に記載の形質転換体。
   （ａ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
   （ｂ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
   （ｃ）配列番号５６、５７、５８、５９、６０、６１、又は６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
4. 前記遺伝子（Ａ）は、
   少なくとも、下記の（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）からなる群から選択される遺伝子である、
   請求項１に記載の形質転換体。
   （ｄ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列を有する遺伝子。
   （ｅ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
   （ｆ）配列番号４、７、１０、１３、１６、１９、又は２２の塩基配列を有する遺伝子と相補的な塩基配列を有する遺伝子と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であって、ＡＡＭＴ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
5. 前記ＡＡＭＴ活性を有する酵素は、ＥＣ２．１．１．２７７のアントラニレートＯ－メチルトランスフェラーゼである、請求項１～４のいずれかに記載の形質転換体。
6. さらに、グルタミナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子及びグルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一方が破壊されている、請求項１～４のいずれかに記載の形質転換体。
7. さらに、アデノシルメチオニンシンテターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子が導入されている、請求項１～４のいずれかに記載の形質転換体。
8. 請求項１～４のいずれかに記載の形質転換体を、
   糖類を含む反応液中で培養してメチルアントラニレートを生産させる工程を含む、
   メチルアントラニレートの製造方法。