JP2023139189A - 濃度依存性自己相互作用ナノ粒子分光法を用いて、タンパク質が自己会合する可能性を決定するアッセイ - Google Patents

Abstract

【課題】高濃度タンパク質を容易に実現できる可能性が高く、それに付随する凝集体が形成される可能性が低いタンパク質の選択方法を提供する。【解決手段】（ａ）タンパク質、ナノ粒子、及び緩衝塩を組み合わせて試料を作製する工程；（ｂ）前記試料を光で励起する工程；（ｃ）前記試料を透過した光を測定する工程；（ｄ）前記試料の吸収強度比を算出する工程；を含み、前記吸収強度比が閾値を超える場合、前記タンパク質が高濃度で安定である、タンパク質が自己会合する可能性を決定するための方法。【選択図】なし

Description

分野
本発明は概して、開発及び製品化のための治療用タンパク質の選択に関し、より具体的には、高濃度タンパク質を容易に実現できる可能性が高く、それに付随する凝集体が形成される可能性が低いタンパク質の選択に関する。本発明は特に、タンパク質のコロイド相互作用の評価、及び高濃度で製剤化するためのタンパク質の選択に関する。

背景
大きな生物学的分子、すなわち「バイオ治療薬」は重要な薬物種である。例えばモノクローナル抗体は、優れた治療特異性、長い生物学的半減期、及び高い安全性プロファイルを示す。

バイオ治療薬は、その大きさ及び複雑さから、製造及び製剤化が困難である。ほとんどのバイオ治療薬は凍結乾燥固体または液体製剤として製剤化されており、その分子の安定性は重要な問題である。安定性は最終製品の保存期間だけではなく製造工程にも影響を与える。

定義によれば大きな分子は分子量が大きい。したがって、数モルの薬物でも比較的大きな質量を含んでいる。例えば、アトルバスタチンなどの小分子薬の分子量が１モルあたり約５６０グラムであるのに対して、抗体の分子量は１モルあたり約１５０，０００グラムである。したがって、有効量を得るには高質量のタンパク質薬が必要とされる。より多くの薬物を皮下注射用に製剤化するためには、大きな質量を少ない体積に収める必要がある。バイオ治療薬の皮下製剤は、治療有効量を収めるために、あくまでも処理しやすいレベルの粘度を維持しつつ、高濃度（約５０ｍｇ／ｍＬ以上）または非常に高濃度（約１００～２５０ｍｇ／ｍＬ）を達成する必要がある。

大きな分子が小さな空間に詰め込まれ、タンパク質分子間の距離が減少するにつれて、コロイド相互作用の頻度、すなわち１つの分子の別の分子に対するスルースペース効果が増加する。タンパク質の自己相互作用（コロイド相互作用）は一般にエネルギーが弱く、通常、可逆的で非特異的である。この相互作用はタンパク質依存性であり、ｐＨ、塩、及び他の添加剤の影響を受ける。場合によって、相互作用は正味の引力性、斥力性、または中性であり得る。相互作用の性質及び規模は、タンパク質の濃度に応じて異なる可能性がある。

コロイド相互作用は広範囲の相互作用（位置エネルギー）に及び、ビリアル係数で定量化される。Ｂ_２２は２成分の相互作用を表し、Ｂ_２２２は３成分の相互作用を表し、Ｂ_２２２２は４成分の相互作用を表し、以下同様である。正のビリアル係数値は斥力相互作用を表し、負のビリアル係数は引力相互作用を表し、ビリアル係数ゼロは理想状態を表す。

コロイド相互作用は一般に、約２ｍｇ／ｍＬを超えるタンパク質溶液中に存在し、約４０ｍｇ／ｍＬを超える溶液中で顕著になる。低濃度では、立体力及び静電気力が優勢になる傾向がある。タンパク質濃度が増加すると、状況はより複雑になる。製造時及び製剤化時のタンパク質濃度が増加するにつれ、コロイド相互作用が問題になる。

コロイド相互作用はタンパク質の産生時に種々の下流工程に影響を与える。相互作用の性質及び規模に応じて、このような力が有益である場合もあれば、有害である場合もある。コロイド相互作用は、クロマトグラフィーの性能、限外濾過及びダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）、透析、粘度及び溶液の取り扱い、ならびに溶液中のタンパク質の安定性に影響を与える。コロイド相互作用はまた、オリゴマー及びマルチマー、ならびにタンパク質凝集体が形成される可能性のある保存中の長期安定性にも影響を与える。したがって、タンパク質のビリアル係数を評価すると、特定のタンパク質治療薬の開発に資源を投入する前に重要な情報が得られる。

ビリアル係数分析は確立された非常に活発な研究分野である。特定のタンパク質に関するビリアル係数（Ｂ_２２、または密接に関連するＡ_２）を評価する現行方法として、膜浸透圧法、沈降平衡分析超遠心分離法、自己相互作用クロマトグラフィー、静的光散乱法（ＳＬＳ）、拡散または沈降相互作用のパラメーター、及び自己相互作用ナノ粒子分光法（ＳＩＮＳ）が挙げられる。

例えば、Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｋ（ＵＳ４０８０２６４Ａ、１９７８年３月３日公開）（特許文献1）は、抗原または抗体の凝集を測定するための準弾性光散乱分光法について記載している。Ｐｕｂｌｉｃｏｖｅｒ ａｎｄ Ｖｉｎｃｚｅ（ＵＳ７５１４９３８Ｂ２、２００９年４月７日公開）（特許文献2）は、抗体を含むタンパク質で被覆されたミクロン及びサブミクロン規模の粒子の相互作用及び凝集を調べるための誘電緩和分光法（ＤＲＳ）の使用について記載している。Ｈｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ２００７０２９１２６５Ａ１、２００７年１２月２０日公開）（特許文献3）は、光散乱シグナル及び濃度シグナルを測定して巨大分子の凝集を測定するための分岐型光ファイバー系について記載している。Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（ｍＡｂｓ，７（２）：３５２－３６３，２０１５）（非特許文献1）は、５００を超える抗体の凝集傾向を系統的に測定するためのサイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）及びオリゴマー検出アッセイ（光学密度マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイである）の使用について記載している。Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｍＡｂｓ，８（５）：９４１－９５０，２０１６）（非特許文献2）は、モノクローナル抗体の自己相互作用、粘度及び安定性を測定するための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）保持時間、親和性捕捉ＳＩＮＳ、及び動的光散乱法の使用について記載している。コロイド状タンパク質の相互作用の評価に使用される現行方法の概説は、Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，１０３（１１）：３３５６－３３６３，２０１４）（非特許文献3）によって記載されている。

モノクローナル抗体の自己会合を評価するための自己相互作用ナノ粒子分光法（ＳＩＮＳ）が、Ｓｕｌｅ ａｔ ａｌ．（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１０１：１７４９－１７５７，２０１１）（非特許文献4）によって記載されている。簡潔には、抗体を金ナノ粒子表面に吸着させた後、これを９６ウェルマイクロタイタープレート中の緩衝液と混合する。ナノ粒子が付着抗体の自己会合により凝集すると、ナノ粒子の吸収スペクトルが変化する。この表面プラズモン共鳴の変化は粒子会合と相関する。このアッセイでは、吸収ピークがシフトするか、または吸収ピークの振幅が変化するかに基づいて、「自己会合」または「非自己会合」の２値読み取りを提供する。Ｓｕｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１０：１３２２－１３３１，２０１３）（非特許文献5）は、親和性捕捉自己相互作用ナノ粒子分光法（ＡＣ－ＳＩＮＳ）と呼ばれる、改良されたＳＩＮＳ法について記載している。この文献では、最初にヒトポリクローナル抗体をナノ粒子に固定した後、この被覆粒子を低濃度／低純度の抗体試料と接触させて、これを抗ヒト被覆物によって捕捉する。ＡＣ－ＳＩＮＳは、大規模な抗体精製を必要とせずに細胞上清を迅速にスクリーニングすることができる。ＡＣ－ＳＩＮＳは、ＳＩＮＳと同様に、対象抗体が正の自己会合であるか、または非自己会合であるかの２値評価を提供する。

タンパク質は複雑な分子であり、条件が変化すると予測不能な挙動を示すことが多い。最新技術では、タンパク質の自己会合を観察するための手段がいくつか提供されているが、無数の異なった条件下でタンパク質が自己会合を行う傾向を決定するための迅速かつ正確な手段は提供されていない。タンパク質によっては、ある条件下では安定だが他の条件下では不安定なものもある。変化する条件下でタンパク質の引力及び斥力の動的範囲を決定するためのアッセイが、当技術分野で引き続き必要とされている。

Ｃｏｈｅｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｄｅｋ（ＵＳ４０８０２６４Ａ、１９７８年３月３日公開） Ｐｕｂｌｉｃｏｖｅｒ ａｎｄ Ｖｉｎｃｚｅ（ＵＳ７５１４９３８Ｂ２、２００９年４月７日公開） Ｈｏｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ＵＳ２００７０２９１２６５Ａ１、２００７年１２月２０日公開）

Ｏｂｒｅｚａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（ｍＡｂｓ，７（２）：３５２－３６３，２０１５） Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｍＡｂｓ，８（５）：９４１－９５０，２０１６） Ｇｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，１０３（１１）：３３５６－３３６３，２０１４） Ｓｕｌｅ ａｔ ａｌ．（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１０１：１７４９－１７５７，２０１１） Ｓｕｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１０：１３２２－１３３１，２０１３）

概要
本発明者らは、動的な条件範囲にわたって、タンパク質が自己集合する可能性（すなわち、タンパク質の固有の斥力または引力）を決定するための方法を開発した。したがって、この方法は、自己会合タンパク質の安定性を決定するための方法、または凝集タンパク質の安定性を決定するための方法であると理解することができる。本明細書でさらに詳述するように、タンパク質とは、タンパク質が１種類だけであっても、または異なる起源の任意のタンパク質の組み合わせであってもよい。濃度依存性自己相互作用ナノ粒子分光法（ＣＤ－ＳＩＮＳ）と呼ぶ、この方法は、変化する濃度及び様々なイオン強度及びｐＨ条件下でタンパク質が自己集合する傾向を測定する。この方法は、高濃度または非常に高濃度の条件下でのタンパク質の予測を可能にし、商用開発用タンパク質の選択に関する情報を提供する。この方法はまた、高濃度の１種以上のバイオ医薬を含む医薬組成物を、１種または複数種のバイオ医薬の会合を伴わずに長い保存期間を維持しつつ製剤化する方法についての情報も提供する。この方法はまた、特定の望ましい投与経路を可能にする物理的特性、例えば好適なレオロジー／粘度などに関して要求される仕様を満たす組成物の製剤化方法についての情報にも有効である。本発明はまた、少量の材料を使用してバイオ医薬を迅速にスクリーニングし好適な製剤に到達すること、またはその後の薬品開発に適した候補を選択することを可能にする。

第１の態様では、本発明は、複数のナノ粒子、タンパク質、及び緩衝塩を含む生物分析用混合物を提供する。タンパク質は混合物の少なくとも２つの相、すなわち付着相と可溶性相に存在する。付着相は、ナノ粒子に付着する（すなわち、被覆する）タンパク質を含む。可溶性相は緩衝塩溶液に溶解しているタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、凝集した被覆ナノ粒子を含む、二量体、三量体、四量体、またはより高次の多量体としてタンパク質が自己会合する第３相にタンパク質が存在する。

一実施形態では、ナノ粒子は金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子の直径は約２０ｎｍ～約１００ｎｍである。特定の実施形態では、ナノ粒子は、直径約２０ｎｍの金ナノ粒子である。

一実施形態では、各ナノ粒子はタンパク質で被覆されている。いくつかの実施形態では、ナノ粒子表面の大部分または全体がタンパク質で飽和されており、これは表面が完全にタンパク質に占有されており、タンパク質が付着する露出表面が残っていないことを意味する。いくつかの実施形態では、好適な塩または緩衝塩などの他の成分を混合物に添加する前に、ナノ粒子表面の大部分または全体がタンパク質で飽和されている。

一実施形態では、混合物は、混合物１ミリリットルあたり約６×１０^１１～約７×１０^１１ナノ粒子を含有する。特定の実施形態では、混合物は約６．３×１０^１１ナノ粒子／ｍＬを含有する。理論に束縛されるものではないが、平均的なタンパク質を１０ｎｍ球としてモデル化できると仮定した場合、２０ｎｍ球を被覆するのに必要とされる１０ｎｍ球の理論的上限数は約３０である。単一の２０ｎｍナノ粒子に約１５～２０個の抗体分子が結合すると推定することができる。したがって、抗体約２．５μｇ／ｍＬが、６．３×１０^１１ナノ粒子（２０ｎｍ）／ｍＬを完全に被覆するのに必要な最小濃度であると推定される。いくつかの実施形態では、混合物は約２μｇ／ｍＬ～約５１２μｇ／ｍＬのタンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、混合物に含まれるタンパク質は治療用抗体である。いくつかの実施形態では、タンパク質は免疫グロブリンＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は抗原結合タンパク質である。抗原結合タンパク質としては、抗体、抗体断片、抗体誘導体、Ｆｃ融合タンパク質、及び受容体－Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、タンパク質はモノクローナル抗体である。より具体的な実施形態では、モノクローナル抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は単一特異性抗体または二重特異性抗体であり得る。

いくつかの実施形態では、緩衝塩は緩衝液と塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液はイオン強度を与える。いくつかの実施形態では、塩は混合物を緩衝する。塩は原則として、当技術分野で公知の任意の好適な塩であればよく、例えば、任意の塩化物塩、臭化物塩、リン酸塩、硫酸塩もしくはアンモニウム塩、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。非限定的な例は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、塩化アンモニウムなどである。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムを含む。塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約２ｍＭ～約３００ｍＭの濃度で存在し得る。特定の実施形態では、塩は混合物中に約２ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２００ｍＭの濃度で存在する。

一実施形態では、緩衝液は２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む。特定の実施形態では、ＭＥＳは混合物中に濃度約１０ｍＭ及びｐＨ約６で存在する。

第２の態様では、本発明は、タンパク質が自己会合する可能性を決定するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、タンパク質、複数のナノ粒子、及び緩衝塩を組み合わせて試料を作製する工程、試料を光で励起する工程、試料を透過した光を測定する工程、ならびに試料の初回の吸収強度比を算出する工程を含む。この過程は少なくとももう１回繰り返され、各回１つ以上のパラメーターを変更し、第２、第３などの吸光度比を得る。所与のタンパク質から得た複数の吸収強度比をプロットして分析することができる。このようなパラメーターとして、塩の種類（すなわち、中性、カオトロピック、コスモトロピック）、塩濃度、ｐＨ、タンパク質濃度、追加成分の包含または除外が挙げられる。吸収強度比が閾値を超えると、そのタンパク質は高濃度での調剤に有利であると考えられる。高濃度での調剤に有利であると考えられるタンパク質は、高濃度でも安定したままであり、凝集しにくいと予想されるものである。

いくつかの実施形態では、タンパク質は治療用抗体である。いくつかの実施形態では、タンパク質は免疫グロブリンＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は抗原結合タンパク質である。抗原結合タンパク質としては、抗体、抗体断片、抗体誘導体、Ｆｃ融合タンパク質、及び受容体－Ｆｃ融合タンパク質が挙げられる。一実施形態では、タンパク質はモノクローナル抗体である。より具体的な実施形態では、モノクローナル抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は単一特異性抗体または二重特異性抗体であり得る。

いくつかの実施形態では、試料に添加されるタンパク質は、最終濃度約２μｇ／ｍＬ～約５１２μｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子は金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子の直径は約２０ｎｍ～約１００ｎｍである。一実施形態では、金ナノ粒子の直径は約２０ｎｍである。

いくつかの実施形態では、試料に添加されるナノ粒子の最終濃度は、約５×１０^１１～約８×１０^１１ナノ粒子／ｍＬ、約６×１０^１１～約６．５×１０^１１ナノ粒子／ｍＬ、約６．３×１０^１１ナノ粒子／ｍＬである。

緩衝塩は、緩衝液、イオン強度を付与する緩衝液、塩、緩衝能を有する塩、または塩と緩衝液を含み得る。一実施形態では、塩は塩化ナトリウムを含む。塩（例えば、塩化ナトリウム）は、約２ｍＭ～約３００ｍＭの濃度で存在し得る。いくつかの特定の実施形態では、塩は混合物中に約２ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、または約３００ｍＭの濃度で存在する。

一実施形態では、緩衝液は２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含む。特定の実施形態では、ＭＥＳは混合物中に濃度約１０ｍＭ及びｐＨ約６で存在する。

いくつかの実施形態では、励起光は、可視スペクトル範囲の波長を含む白色光である。いくつかの実施形態では、透過光は、約４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で測定される。

吸収強度比は、標準または対照と比較した吸光度の相対強度の尺度である。対照は外部対照でも内部対照でもよい。一実施形態では、吸収強度比は、試料のピーク吸収波長の最大強度（光学密度または吸光度）を実測の初期吸収強度で除算して算出する。一実施形態では、最初に計測された吸収強度は、４５０ｎｍでの実測の吸収強度である。その実施形態では、吸収強度比は、ピーク吸光度（Ａ_ピーク）／４５０ｎｍでの吸光度（Ａ_４５０またはＡ_初期）である。その実施形態では、吸収強度比の閾値は約１．５～約２である。特定の実施形態では、吸収強度比の閾値は約１．７である。

一実施形態では、高濃度での調剤に有利と考えられるタンパク質を賦形剤と組み合わせて、製剤化した原薬（ＦＤＳ）または医薬品（ＤＰ）を作製する。一実施形態では、タンパク質は、約５０ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように製剤化される。

一実施形態では、賦形剤は、等張化剤、緩衝液、界面活性剤、安定剤、またはそれらの２つ以上の任意の組み合わせを含む。一実施形態では、等張化剤は塩である。特定の実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。一実施形態では、緩衝液は約ｐＨ６～約ｐＨ７に緩衝する。特定の実施形態では、緩衝液はヒスチジンである。別の特定の実施形態では、緩衝液はリン酸塩である。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベートである。一実施形態では、安定剤はスクロースまたはトレハロースなどの糖である。別の実施形態では、安定剤は、プロリンまたはアルギニンなどのアミノ酸である。

第３の態様では、本発明は治療用タンパク質の製造方法を提供する。一実施形態では、この方法は、異なる未知のコロイド安定性を有する複数の異なるタンパク質から、コロイド安定性の高いタンパク質を選択する工程；選択したタンパク質を宿主細胞中で産生する工程；タンパク質を精製する工程；及び高濃度のタンパク質を賦形剤と組み合わせて、タンパク質が安定である製剤化した原薬または医薬品を作製する工程を含む。一実施形態では、製剤化された原薬または医薬品中でのタンパク質の凝集が１０％未満である。

一実施形態では、コロイド安定性の高いタンパク質を選択する工程は、タンパク質をナノ粒子及び緩衝塩と混合して試料を作製する工程；試料を光で励起する工程、試料を透過した光を測定する工程、ならびに試料の吸収強度比を算出する工程を含む。この選択工程は、１つ以上のパラメーターを変更して１回以上繰り返される。変更されるパラメーターとして、塩の種類、塩濃度、ｐＨ、タンパク質濃度、及び追加成分の包含または除外が挙げられる。吸収強度比が閾値を超えると、そのタンパク質はコロイド安定性が高いものとして選択される。

いくつかの実施形態では、励起光は、可視スペクトル範囲の波長を含む白色光である。いくつかの実施形態では、透過光は、約４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で測定される。

吸収強度比は、標準または対照と比較した吸光度の相対強度の尺度である。対照は外部対照でも内部対照でもよい。いくつかの実施形態では、吸収強度比は、試料のピーク吸収波長の最大強度（光学密度または吸光度）を、（１）その試料中の実測の初期吸収強度（内部）、または（２）タンパク質が存在しないナノ粒子の試料での実測の初期吸収強度（外部）によって除算して算出される。一実施形態では、最初に計測された吸収強度は、４５０ｎｍでの実測の吸収強度である。その実施形態では、吸収強度比は、ピーク吸光度（Ａ_ピーク）／４５０ｎｍでの吸光度（Ａ_４５０またはＡ_初期）である。その実施形態では、吸収強度比の閾値は約１．５～約２である。特定の実施形態では、吸収強度比の閾値は約１．７である。

さらなる実施形態では、本発明は、高濃度のバイオ治療薬（例えばタンパク質または抗体など）を含む組成物に関する。具体的には、この組成物は、全タンパク質種の約１０％以下が、バイオ治療薬の濃度で不可逆な凝集体として存在するようなものであり得る。あるいは、組成物は、例えば本明細書で述べる閾値が、例えば約１．５～約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）の範囲内にあるようなものである。さらなる代替形態では、閾値が、例えば約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、または約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）である。いくつかの実施形態では、閾値は約０．７～約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）の範囲内である。さらなる代替形態では、閾値が、例えば約０．７、約０．８、約０．９、または約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）である。さらに別の実施形態では、この組成物は、全タンパク質種の約１０％以下が、バイオ治療薬の濃度で不可逆な凝集体として存在するようなもの、ならびに、例えば本明細書で述べる閾値が、例えば約１．５～約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）の範囲内にある、すなわち閾値が、例えば約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、もしくは約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）である、及び／または閾値が約０．７～約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）の範囲内である、すなわち閾値が、例えば約０．７、約０．８、約０．９、もしくは約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）であるような組成物である。バイオ医薬の濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ以上であり得る。あるいは、バイオ医薬の濃度は、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬの範囲内、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約１００ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬなどであり得る。

一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される、タンパク質が自己集合する可能性を決定するための方法によって得られる組成物に関する。

さらに別の態様では、本発明は、医療に使用される高濃度のバイオ治療薬（例えばタンパク質または抗体など）を含む組成物に関する。当業者は、薬物に応じて、それを必要とする対象に組成物を投与することによって、どの臨床病態または何の臨床病態が治療可能であるかを理解している。この組成物は、全タンパク質種の約１０％以下が、バイオ治療薬の濃度で不可逆な凝集体として存在するようなものであり得る。あるいは、組成物は、例えば本明細書で述べる閾値が、例えば約１．５～約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）の範囲内にあるようなものである。さらなる代替形態では、閾値が、例えば約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、または約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）である。いくつかの実施形態では、閾値は約０．７～約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）の範囲内である。さらなる代替形態では、閾値が、例えば約０．７、約０．８、約０．９、または約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）である。さらに別の実施形態では、この組成物は、全タンパク質種の約１０％以下が、バイオ治療薬の濃度で不可逆な凝集体として存在するようなもの、ならびに、例えば本明細書で述べる閾値が、例えば約１．５～約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）の範囲内にある、すなわち閾値が、例えば約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、もしくは約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）である、及び／または閾値が約０．７～約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）の範囲内である、すなわち閾値が、例えば約０．７、約０．８、約０．９、もしくは約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）であるような組成物である。バイオ医薬の濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ以上であり得る。あるいは、バイオ医薬の濃度は、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬの範囲内、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬ、例えば約１００ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬなどであり得る。組成物は、治療で望ましい結果を得るために必要であると考えられる場合に、単回投与または複数回投与として投与することができる。あるいは、本発明は、バイオ治療薬によって治療可能または治癒可能な１種または複数種の疾患を治療する医薬品の製造において、上記バイオ治療薬（例えばタンパク質または抗体など）を高濃度で含む組成物に関する。

一実施形態では、本発明は、得られた組成物が適切なレオロジーを有するようにバイオ医薬組成物（例えばタンパク質または抗体など）を調製する方法を提供する。具体的には、本明細書に開示されるタンパク質が自己集合する可能性を決定するための方法は、多数供給される中から高濃度のバイオ医薬を含む安定な組成物を決定することを可能にする。そのような組成物の重要な特性のひとつが粘度である。したがって、本発明の方法は、望ましい投与経路または投与様式によって組成物を投与できるように、望ましい物理特性を有する組成物の調製を可能にする。ある例示的な投与経路は注射による投与であり得る。したがって、そのような場合、調製済み組成物が、例えばシリンジ及びカニューレによる注射が可能である粘度を有することが重要である。そのようなカニューレは、例えば６Ｇ、８Ｇ、９Ｇ、１０Ｇ、１１Ｇ、１２Ｇ、１３Ｇ、１４Ｇ、１６Ｇ、１９Ｇ、２０Ｇ、２１Ｇ、２２Ｇ、２３Ｇ、２４Ｇ、または２６Ｇなどのサイズのカニューレであり得る。用語「粘度」とは、せん断応力または伸張応力のいずれかによって変形する流体の抵抗の尺度である動的粘度または絶対粘度（２０℃及び常圧で）を指す。したがって、「粘度」は、流体の流動に対する内部抵抗を表し、流体摩擦の尺度とみなすことができる。したがって、粘性が低いものほど、移動しやすさ（流動性）が高くなる。本文脈では、適切な範囲の粘度は、約１０～１０，０００ｍＰａ・ｓ、例えば約２０～９０００ｍＰａ・ｓ、例えば約３０～８０００ｍＰａ・ｓ、例えば約４０～７０００ｍＰａ・ｓ、例えば約５０～６０００ｍＰａ・ｓ、例えば約７０～５０００ｍＰａ・ｓ、例えば約９０～４０００ｍＰａ・ｓ、例えば約１００～３０００ｍＰａ・ｓ、または約１０ｍＰａ・ｓ、もしくは約２０ｍＰａ・ｓ、もしくは約３０ｍＰａ・ｓ、もしくは約４０ｍＰａ・ｓ、もしくは約５０ｍＰａ・ｓ、またはこれに代わり約１ｍＰａ・ｓ～約２０ｍＰａ・ｓ、例えば約２ｍＰａ・ｓ、例えば約３ｍＰａ・ｓ、例えば約４ｍＰａ・ｓ、例えば約５ｍＰａ・ｓ、例えば約６ｍＰａ・ｓ、例えば約７ｍＰａ・ｓ、例えば約１０ｍＰａ・ｓ、約１３ｍＰａ・ｓ、約１５ｍＰａ・ｓ、例えば約２０ｍＰａ・ｓなどである。

その他の粘度測定単位が周知であり、例えば、１センチポアズは１ｍＰａ・ｓに相当する。特定の理論に束縛されるものではないが、低濃度（すなわち１０ｍｇ／ｍＬ以下）の一般的なタンパク質は約１０ｃＰの粘度を示す。このように、約１０センチポアズ未満（約１０ｍＰａ・ｓ未満）の粘度を示す高濃度のタンパク質組成物、例えば抗体組成物は、バイオ医薬組成物としての使用に極めて適している。約１０～約１５センチポアズ（約１０ｍＰａ・ｓ～約１５ｍＰａ・ｓ）の粘度を有する（高濃度の）タンパク質組成物は、製造及び薬品開発プロセスの進行が確実になる。約１５～約２０センチポアズ（約１５ｍＰａ・ｓ～約２０ｍＰａ・ｓ）の粘度を有する（高濃度の）タンパク質組成物は、製造及び薬品開発プロセスにおいて進行に慎重を要することを表す。約２０センチポアズ超（約２０ｍＰａ・ｓ超）の粘度を有する（高濃度の）タンパク質組成物は、製造及び薬品開発プロセスで問題が生じることを表す。粘度は、本明細書に開示される様々な成分及び材料によって操作することができる。「可溶性」及び「高可溶性」もまた、タンパク質が、本明細書に開示される用途のいずれか、例えばバイオ医薬組成物の作製及び使用にとって適した粘度を有することを意味する。

一実施形態では、タンパク質は抗原結合タンパク質、例えば抗体、抗体断片、または受容体－Ｆｃ融合タンパク質である。

一実施形態では、タンパク質を産生する宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＨＯ細胞の誘導体、例えばＣＨＯ－Ｋ１細胞またはＥＥＳＹＲ（登録商標）細胞である（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＵＳ７７１９９７Ｂ２、２０１０年８月１０日公開を参照）。

一実施形態では、タンパク質を精製する工程は、（１）アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのうちの１つ以上の工程、ならびに（２）限外濾過及びダイアフィルトレーション両方のいずれかにタンパク質を供することを含む。

一実施形態では、タンパク質は、最終濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍＬであるように製剤化される。一実施形態では、タンパク質の濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬである。

一実施形態では、タンパク質と組み合わされて、製剤化した原薬または医薬品を形成する賦形剤は、１種以上の等張化剤、緩衝液、界面活性剤、及び安定剤を含む。一実施形態では、等張化剤は塩である。特定の実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。一実施形態では、緩衝液は約ｐＨ６～約ｐＨ７に緩衝する。特定の実施形態では、緩衝液はヒスチジンである。別の特定の実施形態では、緩衝液はリン酸塩である。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベートである。一実施形態では、安定剤はスクロースまたはトレハロースなどの糖である。別の実施形態では、安定剤は、プロリンまたはアルギニンなどのアミノ酸である。
[本発明1001]
（ａ）タンパク質、ナノ粒子、及び緩衝塩を組み合わせて試料を作製する工程；
（ｂ）前記試料を光で励起する工程；
（ｃ）前記試料を透過した光を測定する工程；
（ｄ）前記試料の吸収強度比を算出する工程
を含み、
前記吸収強度比が閾値を超える場合、前記タンパク質が高濃度で安定である、
タンパク質が自己会合する可能性を決定するための方法。
[本発明1002]
前記タンパク質が抗原結合タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体断片、または受容体－Ｆｃ融合タンパク質である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記抗原結合タンパク質がヒトモノクローナル抗体である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記タンパク質が、前記試料中に約2μｇ／ｍＬ～約512μｇ／ｍＬの濃度で存在する、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記ナノ粒子が金ナノ粒子である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記金ナノ粒子が、直径約20ｎｍ～約100ｎｍを有する、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記金ナノ粒子の直径が約20ｎｍである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記試料が約5×10¹¹～約8×10¹¹ナノ粒子／ｍＬを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記試料が約6～6．5×10¹¹ナノ粒子／ｍＬを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記塩が前記試料中に約2ｍＭ～約250ｍＭの濃度で存在する、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記塩が塩化ナトリウムである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記塩濃度が、約2ｍＭ、約20ｍＭ、または約200ｍＭである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記透過光が、約450ｎｍ～約750ｎｍの範囲の複数の波長で測定される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記吸収強度比が、最大吸光度と初期吸光度の比である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記吸収強度比の閾値が約1．7である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記試料において異なる濃度のタンパク質を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、本発明1001～1017のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記試料において異なる濃度の塩を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1019]
異なるｐＨの前記試料を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、本発明1001～1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
（ｅ）高濃度の高可溶性タンパク質を賦形剤と組み合わせて、製剤化した原薬を作製する工程
をさらに含む、本発明1001～1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記タンパク質の濃度が約50ｍｇ／ｍＬ～約500ｍｇ／ｍＬである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記賦形剤が、等張化剤、緩衝液、界面活性剤、安定剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記等張化剤が塩である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記塩がＮａＣｌである、本発明1023の方法。
[本発明1026]
（ａ）少なくとも2種のナノ粒子；
（ｂ）少なくとも2相のタンパク質；及び
（ｃ）塩または緩衝液
を含む、生物分析用混合物。
[本発明1027]
前記少なくとも2相のタンパク質の第1相が可溶性相である、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1028]
前記少なくとも2相のタンパク質の第2相が付着相であり、前記タンパク質が前記少なくとも2種のナノ粒子のそれぞれの表面に付着する、本発明1037の生物分析用混合物。
[本発明1029]
前記少なくとも2相のタンパク質の第3相が凝集相であり、前記タンパク質が自己会合して凝集体を形成する、本発明1038の生物分析用混合物。
[本発明1030]
1種以上の前記凝集タンパク質がまた、ナノ粒子の表面に付着する、本発明1039の生物分析用混合物。
[本発明1031]
前記少なくとも2種のナノ粒子のそれぞれが金を含む、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1032]
前記少なくとも2種のナノ粒子のそれぞれが約20ｎｍ～約100ｎｍの直径を備える、本発明1041の生物分析用混合物。
[本発明1033]
前記直径が約20ｎｍである、本発明1042の生物分析用混合物。
[本発明1034]
前記少なくとも2種のナノ粒子のそれぞれが前記タンパク質で飽和されている、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1035]
前記ナノ粒子が、混合物1ミリリットルあたり約6×10¹¹～約7×10¹¹微小粒子の密度で存在する、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1036]
前記タンパク質が約2μｇ／ｍＬ～約512μｇ／ｍＬの濃度で存在する、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1037]
前記タンパク質が抗原結合性タンパク質である、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1038]
前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体断片、アプタマー、及び受容体－Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、本発明1047の生物分析用混合物。
[本発明1039]
前記抗原結合タンパク質が抗体である、本発明1048の生物分析用混合物。
[本発明1040]
前記抗体がヒトモノクローナル抗体である、本発明1049の生物分析用混合物。
[本発明1041]
前記塩が、約2ｍＭ～約300ｍＭの濃度で存在する、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1042]
前記塩が、約2ｍＭ、約20ｍＭ、または約200ｍＭの濃度で存在する、本発明1051の生物分析用混合物。
[本発明1043]
前記塩がＮａＣｌを含む、本発明1036の生物分析用混合物。
[本発明1044]
（ａ）本発明1001～1024のいずれかの方法に従って、タンパク質が自己会合する可能性を決定する工程；
（ｂ）粘度降下賦形剤を前記タンパク質と組み合わせる工程；
（ｃ）前記粘度降下賦形剤の存在下で、本発明1001～1024のいずれかの方法に従って、前記タンパク質が自己会合する可能性を決定する工程；及び
（ｄ）前記粘度降下賦形剤を含まない場合よりも前記タンパク質溶液の粘度を少なくとも50％低下させるレベルで前記粘度降下賦形剤を加えて前記タンパク質を製剤化する工程
を含む、タンパク質を含む低粘度医薬製剤を製造する方法。
[本発明1045]
前記粘度降下賦形剤がパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）である、本発明1044の方法。

分散した２０ｎｍ金ナノ粒子（線Ａ）及び凝集した２０ｎｍ金ナノ粒子（線Ｂ）の吸収プロファイルを示す。Ｙ軸は任意の吸光度単位での光学密度を表し、Ｘ軸は透過光波長をナノメートル（ｎｍ）で表している。 ２ｍＭの塩（丸）、２０ｍＭの塩（四角）、及び２００ｍＭの塩（三角）における、濃度の異なるモノクローナル抗体２（ｍＡｂ２）及び２０ｎｍ金ナノ粒子の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ２濃度を表す。 ２ｍＭの塩（四角）、２０ｍＭの塩（三角）、及び２００ｍＭの塩（丸）における、２０ｎｍ金ナノ粒子の存在下での濃度の異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）１（白抜き記号）及びｍＡｂ５（黒塗り記号）の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ１の濃度を表す。左側の囲み領域（Ａ）は、優れた選択値を有する、高斥力コロイド状態の条件を表す。中央の囲み領域（Ｂ）は、慎重を要するか、または混在する選択値を有する、斥力状態と引力状態の混在する条件を表す。ならびに、右側のボックス領域（Ｃ）は、問題があるか、または低い選択値を有する、引力性の条件を表す。 様々な濃度（曲線右端［７５０ｎｍ］部分の上から下へ順に３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬ）のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合させた、分散した２０ｎｍ金ナノ粒子の複数の吸収プロファイルの重ね合わせを示す。Ｙ軸は任意の単位での任意の吸光度を表し、Ｘ軸は透過光波長をナノメートル（ｎｍ）で表している。 ２ｍＭの塩（丸）、２０ｍＭの塩（四角）、及び２００ｍＭの塩（三角）における、図４に示す未処理の吸収スペクトルから導出された濃度の異なるＨＳＡ、及び２０ｎｍ金ナノ粒子の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのＨＳＡの濃度を表す。 ２ｍＭの塩（丸）、２０ｍＭの塩（四角）、及び２００ｍＭの塩（三角）における、濃度の異なるモノクローナル抗体１（ｍＡｂ１）及び２０ｎｍ金ナノ粒子の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ１の濃度を表す。 異なる濃度及びイオン性塩濃度：２ｍＭ ＮａＣｌ（丸）、２０ｍＭ ＮａＣｌ（四角）、及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（三角）でのｍＡｂ１溶液の散乱光強度の散布図を示す。Ｙ軸は任意の吸光度単位での光散乱強度を表し、Ｘ軸は１リットルあたりのグラム数でのｍＡｂ１の濃度を表している。実線は、直径が同等である理想的な剛体球を表す。 ２ｍＭの塩（丸）、２０ｍＭの塩（四角）、及び２００ｍＭの塩（三角）における、濃度の異なるモノクローナル抗体６（ｍＡｂ６）及び２０ｎｍ金ナノ粒子の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ６の濃度を表す。 異なる濃度及びイオン性塩濃度：２ｍＭ ＮａＣｌ（丸）、２０ｍＭ ＮａＣｌ（四角）、及び２００ｍＭ ＮａＣｌ（三角）でのｍＡｂ６溶液の散乱光強度の散布図を示す。Ｙ軸は任意の吸光度単位での光散乱強度を表し、Ｘ軸は１リットルあたりのグラム数でのｍＡｂ６の濃度を表している。実線は、直径が同等である理想的な剛体球を表す。 ２ｍＭの塩（丸）、２０ｍＭの塩（四角）、及び２００ｍＭの塩（三角）における、濃度の異なるモノクローナル抗体３（ｍＡｂ３）及び２０ｎｍ金ナノ粒子の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ３の濃度を表す。 ２ｍＭの塩（丸）、２０ｍＭの塩（四角）、及び２００ｍＭの塩（三角）における、濃度の異なるモノクローナル抗体４（ｍＡｂ４）及び２０ｎｍ金ナノ粒子の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ４の濃度を表す。 ２ｍＭの塩（丸）、２０ｍＭの塩（四角）、及び２００ｍＭの塩（三角）における、濃度の異なるモノクローナル抗体５（ｍＡｂ５）及び２０ｎｍ金ナノ粒子の吸収強度比の散布図を示す。Ｙ軸は、初期吸収強度に対する各試料条件のピーク吸収強度の比を表す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ５の濃度を表す。 様々な緩衝液、ｐＨ、及びイオン強度での、製剤化された異なる濃度のモノクローナル抗体７（ｍＡｂ７）の吸収強度比のＣＤ－ＳＩＮＳ散布図を示す。各記号は、ｍＡｂ７濃度（Ｘ軸）の変化に応じた、様々な緩衝液、ｐＨ、及びイオン強度の製剤を表す。 様々な糖類、糖の濃度、及び／またはアミノ酸の存在下での、製剤化された異なる濃度のモノクローナル抗体７（ｍＡｂ７）の吸収強度比のＣＤ－ＳＩＮＳ散布図を示す。各記号は、ｍＡｂ７濃度（Ｘ軸）の変化に応じた、様々な糖／アミノ酸製剤を表す。 異なる安息香酸化合物と組み合わせた、異なる濃度のモノクローナル抗体７（ｍＡｂ７）（８μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬ、１２８μＬ／ｍＬ、及び５１２μｇ／ｍＬのｍＡｂ７）の吸収強度比のＣＤ－ＳＩＮＳ散布図を示す。ｐ－アミノ安息香酸［ＰＡＢＡ（－ｏ－）、白丸］と組み合わせると、ｍＡｂ７は吸収強度比（Ｙ軸）が１．６を上回る好ましい動的コロイド相互作用プロファイルを示した。 様々な濃度のｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）の存在下での、異なる濃度のモノクローナル抗体７（ｍＡｂ７）の吸収強度比のＣＤ－ＳＩＮＳ散布図を示す。Ｘ軸は、１ミリリットルあたりのマイクログラム数でのｍＡｂ７濃度のｌｏｇ２を表す。Ｙ軸は吸収強度比を表す。白丸（－ｏ－）はＰＡＢＡなしを表し、白四角（－□－）は１２ｍＭ ＰＡＢＡを表し、白三角（－Δ－）は１８ｍＭ ＰＡＢＡを表し、黒丸（－●－）は２４ｍＭ ＰＡＢＡを表し、黒四角（－■－）は３０ｍＭ ＰＡＢＡを表し、黒三角（－▲－）は３６ｍＭ ＰＡＢＡを表す。 ＰＡＢＡを含まない（黒丸［－●－］）または２０ｍＭ ＰＡＢＡ（黒三角［－▲－］）のｍＡｂ７溶液の定常せん断粘度（ｍＰａ^＊ｓ換算）を、ｇ／Ｌ単位のｍＡｂ７濃度の関数で表すドットプロットを示す。白抜き記号は、１００ｇ／ＬのｍＡｂ７を含有する溶液に予想される外挿粘度を表す。

詳細な説明
本発明を記載するにあたり、本発明は記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、よって方法及び条件は変更できるものと理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は特定の実施形態の記載のみを目的としており、限定を意図しないものと理解されるべきである。

特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙値から１５％以下で変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現には、８５及び１１５、ならびにその間のすべての整数値及び非整数値（例えば、８６、８６．００１、８７、８８、８８．３、８９など）を包含する。

賦形剤、成分、及び他の材料の絶対量及び相対量は、質量またはモル数で表される場合がある。質量の単位は、グラム、ミリグラム、マイクログラムなどで表すことができる。「重量／体積」すなわち「ｗ／ｖ」におけるような「重量」という用語は、「質量」を意味する。相対量は、重量パーセント（すなわち、質量パーセント）で表すことができ、その場合、１重量体積パーセント（ｗ／ｖ）は、体積１００ミリリットルあたり物質１グラムであることを意味する。また、例えば、１重量部の成分「Ｂ」あたり１重量部の成分「Ａ」とは、例えば、１グラムの成分「Ａ」に対して１グラムの成分「Ｂ」が存在することを意味する。また、例えば、１重量パーセント（１重量％）の成分「Ａ」とは、例えば、粒子の総質量１００グラムに対して１グラムの成分「Ａ」が存在することを意味する。成分の相対量はまた、所与の体積あたりのモル数または分子数換算、例えば１リットルあたりのミリモル（ミリモル（ｍＭ））で表すことも、または他の成分あたりのモル数または分子数換算で表すこともでき、例えばＹモル部の成分「Ｂ」あたりのＸモル部の成分「Ａ」とは、Ｘモルの「Ａ」に対してＹモルの「Ｂ」が存在することを意味する。

本明細書に記載するものと同様または同等であるいかなる方法及び材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法及び材料を後述する。本明細書で述べる全ての刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

動的コロイド安定性を決定するアッセイ：濃度依存性自己相互作用ナノ粒子分光法（ＣＤ－ＳＩＮＳ）
タンパク質の動的ビリアル範囲を決定するための簡易なＳＩＮＳ系アッセイを提供する。タンパク質は複雑な挙動を示すが、これはタンパク質が化学的物理的環境の影響を極めて受けやすいためである。したがって、ある特定された環境状況下でタンパク質のビリアル係数を評価しても、他の環境におけるそのタンパク質のビリアル係数を決定するには不十分である。無数の条件下で所与のタンパク質に関する多数のビリアルを得るのは労力と時間を要する。本発明者らは本明細書で、タンパク質の動的コロイド安定性を決定するハイスループットアッセイを開示している。これは、凝集に付随する問題を伴わずに、または少なくとも凝集の潜在的な問題を最小限にして、高濃度での製剤化またはそれ以外の高濃度での維持が可能なタンパク質を選択する情報を提供する。

そのアッセイは新たな方法でＳＩＮＳを用い、様々なタンパク質濃度、様々なイオン強度、様々なｐＨの条件下、及び他の条件下でナノ粒子の凝集を評価する。上記及びＳｕｌｅｓ（２０１１）に記載されているように、金ナノ粒子をタンパク質で被覆して、緩衝溶液に入れる。タンパク質の自己会合によりナノ粒子が凝集すると、粒子の表面プラズモン共鳴が変化する。つまり、最大吸光度は高波長側へシフトし（レッドシフト）、吸光度の強度は低くなる、すなわち吸収プロファイルが広がり、左に移動する（図１）。この図では、被覆されていない２０ｎｍ金ナノ粒子は、約５２０～５３０ｎｍにピーク吸光度を有する。

従来のＳＩＮＳを、Ｂ_２２またはＡ_２を決定する十分に確立された静的光散乱（ＳＬＳ）方法と比較したところ、試験されたほとんどの抗体について概ね一致を示している。表１は、ＳＩＮＳアッセイ下で特異的な異なるモノクローナル抗体及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で被覆されたビーズのピーク吸光度を、ＳＬＳによって決定された同じタンパク質についてのＡ_２ビリアルと比較している。表１に示すように、ＳＩＮＳ分析では引力（負のＡ_２）系が斥力（正のＡ_２）系と容易に区別される。しかしながら、従来のＳＩＮＳ及びＳＬＳアッセイは、動的な斥力条件範囲が示されない。また、タンパク質によっては、従来のＳＩＮＳとＳＬＳとの間にわずかな相違があり、複雑な挙動を示している。

本発明者らは、一部のタンパク質は高濃度で安定的であり得るが、負のＡ２またはレッドシフトした最大吸収スペクトル（λ_最大）を示すことを確認した。例えば、ｍＡｂ５はおよそ約２００ｇ／Ｌの濃度に容易に到達でき、安定したままであるが、Ａ_２は負であり、λ_最大は低イオン強度でレッドシフトする。同様に、ｍＡｂ２はおよそ約１７５ｇ／Ｌの濃度に容易に到達でき、安定したままであるが、低塩濃度でＡ_２は負であり、λ_最大は低イオン強度でレッドシフトする。

本明細書ではＳＩＮＳの改良方法を開示する。この方法は、大量のタンパク質を必要とせずに、開発スケジュールの早期にタンパク質特異的現象を評価するためのタンパク質の動的コロイド安定性データを提供する。この方法は、ナノ粒子の被覆に必要とされるよりも過剰量の溶液中にて、様々な量のタンパク質の存在下での被覆ナノ粒子の表面プラズモン共鳴を用いる。吸収プロファイルを計測し、各変異型試料について吸収強度比を算出し、プロットして動的コロイド安定性を決定する。

一実施形態では、所与の対象タンパク質に対する複数の個々の吸収強度比の値を決定するために使用される複数の試料の各試料に関して、ナノ粒子を完全に被覆するのに必要な最少量のタンパク質を超える様々な量のタンパク質と、ナノ粒子を結合させる。使用されるタンパク質の最少量は、タンパク質の分子量（すなわち、その流体力学的半径）、ナノ粒子のサイズ（表面積）、及びナノ粒子の濃度に応じて異なる。例えば、２０ｎｍの金ナノ粒子を約６～６．５×１０^１１粒子／ｍＬで使用する場合、ナノ粒子を完全に被覆するには、約５０～１５０ｋＤａのタンパク質約２．５μｇ／ｍＬで十分である。したがって、この条件下では、複数の試料の各試料に対して２．５μｇ／ｍＬを超えるタンパク質が使用される。本明細書では、例えばタンパク質は試料中に、約２．６μｇ／ｍＬ～約５１２μｇ／ｍＬ以上、約３±１μｇ／ｍＬ、約４±１μｇ／ｍＬ、約５±１μｇ／ｍＬ、約６±１μｇ／ｍＬ、約７±１μｇ／ｍＬ、約８±１μｇ／ｍＬ、約９±１μｇ／ｍＬ、約１０±１μｇ／ｍＬ、約１５±５μｇ／ｍＬ、約２０±５μｇ／ｍＬ、約２５±５μｇ／ｍＬ、約３０±５μｇ／ｍＬ、約４０±５μｇ／ｍＬ、約５０±１０μｇ／ｍＬ、約６０±１０μｇ／ｍＬ、約７０±１０μｇ／ｍＬ、約８０±１０μｇ／ｍＬ、約９０±１０μｇ／ｍＬ、約１００±１０μｇ／ｍＬ、約１２５±１５μｇ／ｍＬ、約１５０±２５μｇ／ｍＬ、１７５±２５μｇ／ｍＬ、２００±２５μｇ／ｍＬ、２２５±２５μｇ／ｍＬ、２５０±２５μｇ／ｍＬ、３００±５０μｇ／ｍＬ、３５０±５０μｇ／ｍＬ、４００±５０μｇ／ｍＬ、４５０±５０μｇ／ｍＬ、５００±５０μｇ／ｍＬ、または５１２±５０μｇ／ｍＬ含まれる。いくつかの実施形態では、複数の試料は、異なるタンパク質濃度で構成される２試料、３試料、４試料、５試料、６試料、７試料、８試料、９試料、１０試料、またはそれ以上を含む。

例えば、一実施形態における複数の試料は、６．３×１０^１１粒子／ｍＬの２０ｎｍ金ナノ粒子と、第１の濃度が約３．１２５μｇ／ｍＬ、第２の濃度が６．２５μｇ／ｍＬ、第３の濃度が約１２．５μｇ／ｍＬ、第４の濃度が約２５μｇ／ｍＬ、第５の濃度が約５０μｇ／ｍＬ、第６の濃度が約１００μｇ／ｍＬ、第７の濃度が約２００μｇ／ｍＬ、及び第８の濃度が約４００μｇ／ｍＬの抗体を含む。

一実施形態では、所与の対象タンパク質に対する複数の個々の吸収強度比の値を決定するために使用される複数の試料の各試料に関して、各ナノ粒子／タンパク質の組み合わせを、塩濃度を変化させて結合させる。例えば、試料は、塩化ナトリウムのような中性塩タンパク質を、約１μＭ、約１０μＭ、約１００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約４ｍＭ、約６ｍＭ、約８ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、または約３００ｍＭ以上の濃度で含み得る。別の実施形態では、塩は、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウムなどのカオトロピック塩であり得る。試料はまた、カオトロピック塩に加えて、またはその代わりに、ブタノール、エタノール、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、または尿素などの別のカオトロピック剤を含んでもよい。別の実施形態では、試料は、炭酸塩、硫酸塩、またはリン酸塩などのコスモトロピック塩、例えば硫酸アンモニウムなどを含んでもよい。

複数の試料は、塩濃度の異なる２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上のサブセット試料を含んでもよい。したがって、例えば、複数の試料は、塩濃度が３種類で、タンパク質濃度が１０種類である合計３０の試料を含み得る。特定の実施形態では、複数の試料のうちの１つのサブセットが約２ｍＭの塩化ナトリウムを含み、複数の試料のうちの別のセットが約２０ｍＭの塩化ナトリウムを含み、複数の試料のうちの別のセットが約２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む。２ｍＭの塩を低イオン強度とみなし、２００ｍＭを高イオン強度とみなす。ほとんどのタンパク質治療製剤には該当しないものの、３００ｍＭ以下である高張性の塩が、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムによる精製を行うタンパク質調製に関連して使用される。したがって、本発明は、高濃度塩条件の高濃度タンパク質がＨＩＣ精製などに適しているかどうかを決定する際に有用である。

各試料に白色光を照射し、その吸収スペクトルを取得する。複数の各試料から吸収強度比を算出してプロットする。ナノ粒子が凝集しないか、または凝集が少ない、すなわちタンパク質が斥力または低い凝集の可能性を示す試料では、吸収ピーク波長及び吸収強度は、対照の被覆されていないナノ粒子と同様である。ナノ粒子が凝集する、すなわちタンパク質が引力または高い凝集の可能性を示す試料では、吸収ピーク波長が赤色側にシフトし、吸収プロファイルはピーク吸収強度が減少するにつれて対照の被覆されていないナノ粒子と比較して平坦になる。所与のタンパク質に関する複数の試料の各試料が、異なる吸収プロファイル（すなわち、異なる吸収強度比）を示す可能性があり、引力を示す場合もあれば、斥力を示す場合もある。このようなタンパク質は、コロイド安定性の範囲が動的であり、特定の条件下ではコロイド安定性であり得る。タンパク質によっては、タンパク質がすべてのパラメーター（試料）にわたって斥力を示すことがある。そのようなタンパク質は、強固であるかまたは強固な動的コロイド安定性を有すると考えられる。他のタンパク質では、タンパク質がすべての試験されたパラメーター条件下で引力を示すことがある。そのようなタンパク質は、コロイド不安定性であると考えられる。

（少なくとも１つの試料において）少なくとも１つの試験条件下で斥力を示すこのようなタンパク質は、大規模な製造及び製剤化に適した安定な原薬として選択することができる。このようなタンパク質は製造時及び保存時に凝集体を形成する可能性が低い。さらに、タンパク質が斥力を示す、これらの条件から、原薬であるタンパク質の製造工程及び製剤用賦形剤を知ることができる。例えば、本明細書に記載の濃度依存性ＳＩＮＳ（ＣＤ－ＳＩＮＳ）を利用すると、例えば下流の限外濾過及びダイアフィルトレーション工程でのタンパク質の製造可能性を決定することができる。大規模製造に適した低粘度タンパク質溶液の選択により、バイオプロセシングにおける効率向上及びコスト削減が可能である（Ｓｈｉｒｅ ＳＪ，２００９，“Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ．” Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（６）：７０８－１４）。ＣＤ－ＳＩＮＳはまた、一般に、広範囲の賦形剤（従来的及び非従来的の両方）に適用することができる。ＣＤ－ＳＩＮＳは、タンパク質原薬の製剤化に使用される一連の異なる化学物質間の構造活性相関の導出に利用することも、自己会合を逆転させる賦形剤を選択するために利用することもできる（実施例１１ならびに図１３及び図１４を参照）。

許容可能なコロイド安定性動態を有する分子及び条件を選択する一般的基準を図３に示している。これは、３つのイオン強度条件下での２つのタンパク質、ｍＡｂ１及びｍＡｂ５の吸収強度比をプロットしたものである。以下の３つのバケットが示されている：（Ａ）確実に進行する。高濃度での安定性が期待される強固な分子が該当する；（Ｂ）進行に慎重を要する。いくつかの条件下で閾値レベルを超える吸収強度比（例えば、Ａ_ピーク／Ａ_４５０≧１．７）を示す分子が該当する；及び（Ｃ）潜在的に問題がある。いかなる条件下でも吸収強度比の閾値を達成できない分子が該当する。例えば、ｍＡｂ１（白抜き記号）はコロイド安定性の点で強固であり、低塩条件下（２ｍＭ ＮａＣｌ、白四角；２０ｍＭ ＮａＣｌ、白三角）では「確実に進行する」のバケットに分類され、高塩条件下（２００ｍＭ ＮａＣｌ、白丸）では「進行に慎重を要する」のカテゴリに分類される。逆に、ｍＡｂ５（黒丸）はあまり強固ではなく、低塩条件下では「潜在的に問題がある」のカテゴリに、高塩条件下では「進行に慎重を要する」のバケットに分類される。

濃度依存性ＳＩＮＳ（ＣＤ－ＳＩＮＳ）は、タンパク質濃度が増加するにつれてタンパク質／溶媒系がどのように「展開」するかを実証する。これは、様々なタンパク質が高タンパク質濃度で示す、斥力性から理想状態（中性）、引力性から理想状態、理想状態から引力性、及び無反応といった無数のコロイド相互作用を取得する。電荷を介した斥力または引力などのコロイド相互作用の様々な局面を数多く取得し、静電遮蔽を誘導し、かなり広い動的範囲を定性的に提供する。ＣＤ－ＳＩＮＳは、疎水性が介在して起こり得る問題を明らかにし、一般的に問題のある分子を警告する。この方法は、非常に最小限のタンパク質しか必要とせずに高タンパク質濃度での開発可能性を評価する分析ツールを提供することから、自動化に適している。

引力性または混在型コロイドタンパク質の粘度低下
好ましくない動的コロイド相互作用プロファイルを有するタンパク質、すなわち自己会合する傾向のあるタンパク質は一般に、高濃度では粘度が高くなる可能性がある。そのような高濃度での粘度の高さは、タンパク質を非経口注射に望ましくないものにする可能性がある。本明細書に記載のＣＤ－ＳＩＮＳアッセイは、粘度降下賦形剤の選別に有用である。一態様では、減粘性タンパク質製剤の製造方法を提供する。一実施形態は、粘度降下能のある賦形剤である。

いくつかの実施形態では、粘度降下賦形剤は、粘度降下賦形剤を含まないタンパク質溶液の粘度と比較してタンパク質溶液の粘度を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、または５倍超低減する。

いくつかの実施形態では、粘度降下賦形剤はアミノ酸またはアミノ酸の塩である。いくつかの実施形態では、粘度降下賦形剤は、炭化水素、アルカン、アルケン、及びアルキン、脂肪酸、脂肪酸尾部、ベンゼン含有構造、安息香酸、置換炭化水素、置換アルカン、置換アルケン、置換アルキン、置換脂肪酸、置換脂肪酸尾部、置換ベンゼン含有構造、置換安息香酸、スルホン酸、アミノ安息香酸、アルキル化安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、または安息香酸のアンモニウム塩である。一実施形態では、粘度降下賦形剤はパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）である。一実施形態では、ＰＡＢＡは、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、または２５ｍＭの濃度でタンパク質製剤に含まれる。一実施形態では、粘度降下賦形剤は、１２ｍＭ超の濃度または２０ｍＭの濃度でタンパク質溶液に混合されたＰＡＢＡである。

定義
本明細書で使用される場合、用語「コロイド安定性」は、「自己会合する傾向」または「凝集する傾向」と同義に使用することができ、タンパク質の引力性、中性、または斥力性の相互作用の能力をもたらし得るスルースペース分子力、例えば、静電気力、ファンデルワールス力などの正味（全体的）効果を意味する。

本明細書で使用される場合、用語「吸収強度比」とは、ベースラインの吸収強度に対する試料のピーク吸収強度の比を意味する。ベースライン強度は、予想される吸収波長よりも十分に短いかまたは長い任意の波長における試料の吸光度から得ることができる。いくつかの実施形態では、２０ｎｍ金ナノ粒子に関して予想される吸収波長は、約５００～６００ｎｍの範囲であり、ピークは約５３０ｎｍである。したがって、ベースラインの吸収強度は、５００未満または６００超の波長での試料の吸収強度であり得る。例えば、ベースラインの吸収強度は、４５０ｎｍでの試料の吸収強度であり得る。本明細書で吸収強度比は、試料のピーク吸収波長での吸収強度（Ａ_ピーク）を４５０ｎｍでの吸収強度（Ａ_４５０またはＡ_初期）で除算したものである。

他の実施形態では、ベースラインの吸収強度は、被覆されていないナノ粒子（対照ナノ粒子）のピーク吸収の強度であり得る。本明細書では、そのナノ粒子はタンパク質を含まないが、実験用の被覆ナノ粒子をサンプリングしたものと同じ緩衝塩中で吸光度分析に供する。被覆されていない対照ナノ粒子のピーク吸収強度（Ａ_対照）は、ベースラインの吸収強度の役割を果たす。ここで吸収強度比はＡ_ピーク／Ａ_対照で算出される。

吸光度は一般に任意の単位で表され、単位は比率を計算するときに相殺される。吸光度は、試料に白色光源を通過させることによって測定される。試料は、その試料の光学特性に応じて、一定の強度で一定の波長の光を吸収する。試料を通過する光、すなわち「透過光」の強度を複数の波長で測定し、「吸収光」の強度を算出する。

金ナノ粒子の吸収スペクトルは、粒子の表面プラズモン共鳴によって決定される。入射光で生じる電場は金粒子表面の自由電子と相互作用し、可視領域での強い吸収をもたらす。この光学特性は、ナノ粒子の大きさ、形状、及び凝集状態によって異なる。例えば、小さい粒子（直径２０ｎｍ）は大きい粒子よりも短波長（約５２２ｎｍ）を吸収し、狭くかつ強いピーク（Ａ＝約０．６）をもつ（例えば、２５０ｎｍ粒子は５７０～６６０ｎｍを最も強く吸収し、２０ｎｍ粒子の強度の約４０％の強度を有する）。不規則な形状の粒子は、球状の粒子と比較してレッドシフトした強度の低い広いピークを示す。同様に、凝集粒子は、個別に分散した球状の粒子と比較してレッドシフトした強度の低い広いピークを示す（図１）。

本明細書で使用される場合、用語「閾値」とは、それを超えるとタンパク質が溶液中で安定した高濃度を達成するのに適すると考えられる吸収強度比を意味する。吸光度比が閾値未満であるタンパク質試料は、少なくとも実験時のｐＨ、イオン強度、及びタンパク質密度の条件下で、タンパク質が溶液中で安定した高濃度を達成するには適さない可能性があることを示す。タンパク質が溶液中で高濃度を達成するのに適するかどうかは、タンパク質の「引力」すなわち自己会合する能力と逆相関し、タンパク質の「斥力」と正相関する。いくつかの実施形態では、閾値は約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）である。いくつかの実施形態では、閾値は約０．７、０．８、０．９、または１（Ａ_ピーク／Ａ_対照）である。

本明細書で使用される場合、用語「動的範囲」とは、タンパク質が自己会合する可能性が、ある範囲の条件にわたることを指す。自己相互作用ナノ粒子分光法（ＳＩＮＳ）を用いる従来技術の自己会合アッセイは、１セットだけの条件下でタンパク質が自己会合する可能性を決定するだけである。シングルポイントアッセイでは、「引力性」とみなされたタンパク質を不合格にでき、そのアッセイで「斥力性」とみなされたタンパク質は、高濃度の製剤化及び製造に適するとして残すことができる。本明細書では、様々な実験条件下で一連の吸収強度比を取得してプロットし、ある特定のタンパク質についての「動的範囲」プロファイルを作成する。条件によって、そのタンパク質が閾値未満の吸収強度比を有する場合もあるが、他の条件下で、そのタンパク質が閾値を超える吸収強度比を有する場合もある。そのようなタンパク質は、こうした条件下で許容される程度の斥力を有することになり、その条件から、選択すべきタンパク質の製造プロセス及び製剤用賦形剤及び濃度を知ることができる。例えば、モノクローナル抗体２（ｍＡｂ２）は、高濃度／高イオン強度（例えば、２００ｍＭ ＮａＣｌ）条件下で許容可能な程度の斥力を示すが、低イオン強度条件下では許容できない引力を示す（図２）。

動的範囲のタンパク質を決定するために使用される実験条件として、タンパク質の濃度；ナノ粒子のサイズ、形状、数；ナノ粒子を作製する材料；ナノ粒子をタンパク質で被覆する方法；緩衝液または溶媒中の成分の性質及び量；ｐＨ；ならびに溶液のイオン強度が挙げられる。例えば、緩衝液のｐＨは、タンパク質の等電点（ｐＩ）によってタンパク質の総電荷に影響を与え、その結果、電荷がタンパク質の２次ビリアル係数に影響を与える可能性がある（負のＢ_２２は引力、正のＢ_２２は斥力）。イオン強度（すなわち塩含量）は一般に、タンパク質の自己引力に影響を与えることが知られており、イオン強度が増加すると、タンパク質は電荷による斥力から遮蔽され、引力が増強する。

いくつかの実施形態では、異なる塩濃度で、または塩を全く含まない状態でデータポイント（すなわち吸収強度比）が取得される。例えば、塩、例えば塩化ナトリウムは、微量から過飽和までの範囲の任意の濃度で含まれていてよい。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウムは、約０．１ｍＭ～約１Ｍ、１ｍＭ～５００ｍＭ、または２ｍＭ～３００ｍＭの濃度で「緩衝塩」に含まれる。いくつかの実施形態では、データポイントは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる塩濃度条件で取得される。一実施形態では、少なくとも３つの塩濃度条件、例えば２ｍＭ、２０ｍＭ、及び２００ｍＭの塩化ナトリウムを使用する。別の実施形態では、少なくとも５つの塩濃度条件を使用する。５つの塩濃度条件の非限定的な例として、１ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ、２００ｎＭ、及び３００ｍＭの塩化ナトリウム、または１ｍＭ、５ｍＭ、２０ｍＭ、１００ｎＭ、及び３００ｍＭの塩化ナトリウムを含み得る。当業者は、目的とするタンパク質の実験的または治療的用途の性質に基づいて、様々な塩及び／または塩条件を使用することによってアッセイを容易に応用することができる。

本明細書で使用される場合、用語「緩衝塩」は、緩衝液及び塩を含有する水溶液を意味する。塩は任意の濃度であってよく、緩衝液は任意の範囲のｐＨで緩衝能を有していればよい。いくつかの実施形態では、塩及び緩衝液は、炭酸カルシウムなど、全く同一のものであってよい。塩はタンパク質相互作用に影響を与えることが知られており、タンパク質の沈殿、タンパク質の折り畳みへの作用、医薬製剤の安定化、張度の付与、及びクロマトグラフィーの際のタンパク質挙動の調節に使用されることが多い。塩は、コスモトロピック（水素結合の正の自由エネルギー）剤であっても、カオトロピック（水素結合の負の自由エネルギー）剤であってもよい。コスモトロピック剤は、水と水の相互作用を促進し、タンパク質の塩析によく使用される。コスモトロピックイオンの例として、炭酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マグネシウム、リチウム、亜鉛、及びアルミニウムが挙げられる。カオトロープは水素結合を破壊して疎水効果を弱め、それによってタンパク質変性を促進する。カオトロピック塩の例として、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、及び塩化マグネシウムが挙げられる。塩化ナトリウムのような塩はホフマイスター系列のほぼ中間に位置し、これは塩溶にも塩析にも効果がないことを意味する。タンパク質の自己会合アッセイの目的に応じて、塩の機能が生理学的濃度で塩溶、塩析であるか、または事実上中性のままであるかによって、緩衝塩の塩を選択することができる。

「緩衝液」は、ｐＨを制御し、それによってタンパク質の電荷特性、ならびにそれに続く構造及び機能に影響を与えるために含まれている。タンパク質の自己会合アッセイの目的に応じて、例えばタンパク質精製を増強できるか、長期にタンパク質安定性を促進できるか、または治療用タンパク質の投与時に患者の快適性が見込み得るかによって、緩衝液を選択することができる。有用な緩衝液は当技術分野において周知であり、ＭＥＳ、ＴＲＩＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、リン酸塩、クエン酸塩－リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、炭酸塩－重炭酸塩、ヒスチジン、イミダゾールなどが挙げられる。特定の一実施形態では、タンパク質の自己会合アッセイに使用される緩衝液はＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）であり、これは約ｐＨ５．５～６．７の範囲で有用な緩衝液である。特定の実施形態では、ＭＥＳは約１０ｍＭ、ｐＨ６で緩衝塩に含まれる。

緩衝液は、アッセイ系及び試薬の緩衝塩成分として使用される。緩衝液はまた、アッセイ以外でタンパク質を含む溶液のｐＨを制御するためにも使用される。緩衝液は、タンパク質の産生に使用される細胞培養産生培地に使用される。緩衝液はまた、タンパク質の精製時及びその間に展開される様々な単位操作時に用いる溶液にも使用される。緩衝液は、製剤化された原薬及び最終的な医薬品製剤に使用される。

タンパク質の製剤化に有用な緩衝液は当技術分野において周知であり、ヒスチジン、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩などが挙げられる。緩衝液は、製剤化された原薬（ＦＤＳ）または医薬品（ＤＰ）に１ｍＭ～１００ｍＭの濃度で含まれ得る。いくつかの特定の実施形態では、緩衝液は約１０ｍＭで含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝液は、５ｍＭ±０．７５ｍＭ～１５ｍＭ±２．２５ｍＭ；６ｍＭ±０．９ｍＭ～１４ｍＭ±２．１ｍＭ；７ｍＭ±１．０５ｍＭ～１３ｍＭ±１．９５ｍＭ；８ｍＭ±１．２ｍＭ～１２ｍＭ±１．８ｍＭ；９ｍＭ±１．３５ｍＭ～１１ｍＭ±１．６５ｍＭ；１０ｍＭ±１．５ｍＭ；または約１０ｍＭの濃度で存在する。いくつかの特定の実施形態では、ＦＤＳまたはＤＰの緩衝液系は、１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、リン酸塩、及び／または酢酸塩を含む。

いくつかの実施形態では、緩衝液は、約３～約９のｐＨ範囲内、または約３．７～約８．０のｐＨ範囲内のどこかで緩衝能を有する化学物質から選択される。例えば、凍結乾燥前の溶液は、約３．４、約３．６、約３．８、約４．０、約４．２、約４．４、約４．６、約４．８、約５．０、約５．２、約５．４、約５．６、約５．８、約６．０、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、または約８．０のｐＨを有し得る。

緩衝液は、例えばヒスチジンと酢酸塩の組み合わせ（ｈｉｓ－酢酸塩緩衝液）のように個別の緩衝液の組み合わせであり得る。一実施形態では、緩衝液の緩衝範囲は、例えば酢酸塩によって緩衝される範囲のような約３．５～約６、または約３．７～約５．６である。一実施形態では、緩衝液の緩衝範囲は、リン酸塩によって緩衝される範囲のような約５．５～約８．５、または約５．８～約８．０である。一実施形態では、緩衝液の緩衝範囲は、ヒスチジンによって緩衝される範囲のような約５．０～約８．０、または約５．５～約７．４である。

本明細書で使用される場合、用語「ナノ粒子」とは、１０^－９Ｍ（０．００１ミクロン）～１０^－６Ｍ（１ミクロン）の規模の直径を有する、球状、ほぼ球状、または回転楕円体の粒子を指す。ナノ粒子は、有機ポリマー、金属、半導体材料、磁性材料、及び複数材料の組み合わせを含む任意の材料を含み得る。金属球体は、入射光で生じる電場と相互作用できる自由電子を表面に有し、強い吸収スペクトルが得られるため、金属ナノ粒子は表面プラズモン共鳴によるアッセイに特に適している。金ナノ粒子及び銀ナノ粒子は、プラズモン共鳴の変化を測定するのに有用な金属ナノ粒子の例である。ナノ粒子のサイズ、形状、及び材料は、最大吸収の強度及び波長に影響を与える。直径２０ｎｍ～４００ｎｍの金ナノ粒子が有用である。いくつかの実施形態では、自己会合の動的範囲アッセイに使用されるナノ粒子は、直径約２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、８０ｎｍ、または１００ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）である。

本明細書で使用される場合、用語「光」は電磁放射線（ＥＭＲ）を意味する。光は、単波長のもの、波長の範囲が狭いもの、波長の範囲が広いもの（例えば「白色光」）、波長の集合体であり得る。光はレーザービームの形態で、または拡散光として存在し得る。自己凝集アッセイは、試料が光に与える影響を測定する分光光度アッセイである。したがって、光を試料に照射すると（すなわち、「入射光」）、プラズモンの生成及び特定の光の波長の吸収（すなわち吸収光）など、試料は光と相互作用し、光の一部が試料を透過して検出器へと進む（すなわち、「透過光」）。いくつかの実施形態では、入射光は、４００ｎｍ～８００ｎｍの波長を有するＥＭＲを含む白色光である。いくつかの実施形態では、４００ｎｍ～８００ｎｍに及ぶ波長の透過光を検出及び測定し、そこから吸収強度を決定する。

本明細書で使用される場合、用語「自己会合」とは、ある特定のタンパク質が同じ種の別のタンパク質と非特異的に結合することを指す。非特異的とは、会合が、非生物学的な力によると考えられる弱い力によるものであることを意味する。非特異的相互作用を特異的相互作用と区別する際には、２等分された同一抗体の会合による無傷抗体の形成を特異的相互作用とみなす。逆に、可逆的または不可逆的である二量体、三量体、またはより高次の多量体を形成する、ファンデルワールス力または疎水性相互作用を介した２つ以上の同一の無傷抗体の会合は「非特異的」である。

本明細書で使用される場合、用語「安定な」または「安定性」とは、タンパク質もしくはその他の生体高分子の経時的な物理的構造（熱力学的安定性）、化学構造（速度論的安定性）、または生物学的機能（機能的安定性）が許容される程度に保持されることを指す。一定期間保存した後、物理的構造、化学構造、または生物学的機能を１００％維持していない場合でもタンパク質は安定であり得る。一定の状況下で、ある特定期間保存した後、タンパク質の構造または機能が約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％維持されれば「安定」とみなすことができる。

安定性は、試料中に残存する天然タンパク質のパーセンテージを決定することによって測定することができる。天然型を保持するタンパク質のパーセンテージは、タンパク質の高分子量凝集体を低分子量天然タンパク質から分離するサイズ排除クロマトグラフィーによって決定することができる。安定なタンパク質は、その天然構造の９０％以上を経時的に保持する。安定なタンパク質は、全タンパク質種の１０％以下を不可逆的な凝集体として含有する。

安定なタンパク質は、凝集体形成率が低い。安定なタンパク質は、約５℃～約２５℃で、最大７か月、最大８か月、最大９か月、最大１０か月、最大１１か月、最大１２か月、最大１３か月、最大１４か月、最大１５か月、最大１６か月、最大１７か月、最大１８か月、最大１９か月、最大２０か月、最大２１か月、最大２２か月、最大２３か月、または最大２４か月保存する間に受ける高分子量種の形成、すなわち凝集の増加が、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満である。

タンパク質の安定性評価に他の方法を使用することができ、例えば、熱安定性を決定する示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、機械的安定性を決定する制御撹拌、及び溶液の濁度を決定する約３５０ｎｍまたは約４０５ｎｍでの吸光度などである。一実施形態では、約５℃～約２５℃で６か月以上保存した後、時間ゼロでのタンパク質のＯＤ４０５からの製剤のＯＤ４０５の変化が約０．０５未満（例えば、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１以下）である場合、タンパク質は安定であるとみなし得る。

本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」とは、アミド結合を介して共有結合された約５０超のアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを意味する。タンパク質には、当技術分野で「ポリペプチド」として知られる１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖が含まれる。タンパク質は１つ以上のポリペプチドを含み、単一の機能性生体分子を形成することができる。「ポリペプチド」は一般に５０超のアミノ酸を含み、対して「ペプチド」は一般に５０以下のアミノ酸を含む。タンパク質は、１つ以上の共有結合修飾及び非共有結合修飾を含み得る。タンパク質によってはジスルフィド架橋（すなわち、システイン残基間でシスチンを形成する）が存在し得る。これらの共有結合は、単一のポリペプチド鎖内にあっても、または２つの個別のポリペプチド鎖間にあってもよい。例えば、ジスルフィド結合はインスリン、免疫グロブリン、プロタミンなどの適切な構造及び機能に不可欠である。ジスルフィド結合形成の最近の概説については、Ｏｋａ ａｎｄ Ｂｕｌｌｅｉｄ，“Ｆｏｒｍｉｎｇ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ，”１８３３（１１）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２４２５－９（２０１３）を参照のこと。

ジスルフィド結合形成に加え、タンパク質は他の翻訳後修飾を受ける場合がある。このような修飾としては、脂質化（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化、及びグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成）、アルキル化（例えば、メチル化）、アシル化、アミド化、グリコシル化（例えば、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシン、及び／またはトリプトファンへのグリコシル基の付加）、及びリン酸化（すなわち、セリン、スレオニン、チロシン、及び／またはヒスチジンへのリン酸基の付加）が挙げられる。真核生物に産生されるタンパク質の翻訳後修飾に関する最近の概説については、Ｍｏｗｅｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ，“Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”１５（６）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５１２－２０（２０１４）；及びＢｌｉｘｔ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄ，“Ａｒｒａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ（ＰＴＧ），”１８ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．６２－９（２０１４）を参照のこと。

タンパク質の例として、治療用タンパク質、研究または治療に使用される組換えタンパク質、捕捉タンパク質及びその他の受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどが挙げられる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの、組換え細胞を用いた産生系を使用して産生することができる。治療用タンパク質及びその産生について考察している最近の概説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”２８ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｒｅｖ．１４７－７５（２０１２）を参照のこと。

本明細書で使用される場合、用語「抗原結合タンパク質」とは、別の分子実体に結合する任意のタンパク質を意味する。分子実体は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、エピトープ、ハプテン、抗原、または生物学的分子であり得る。例えば、抗原結合タンパク質は、リガンドに結合する受容体分子を含み、その場合のリガンドは抗原である。抗原結合タンパク質としては、抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ）、一本鎖抗体、ＳｃＦｖ分子、受容体及び受容体の一部を含む組換えタンパク質、リガンド分子、リガンドまたはリガンドの一部を含む組換えタンパク質、複数の受容体または受容体断片を含む組換え分子（例えば、受容体－Ｆｃ融合タンパク質）などが挙げられる。

「抗体」または「免疫グロブリン分子」は、抗原結合タンパク質のサブセットまたはサブタイプである。標準免疫グロブリンタンパク質（例えば、ＩｇＧ）は、ジスルフィド結合によって相互連結された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと略記）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと略記）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存的である領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配列される、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３と略記される場合があり、軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３と略記される場合がある）。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」とは単に、単一抗体を産生する親細胞のクローンによって通常は産生される一分子実体の抗体を意味する。ポリクローナル抗体は異なる細胞によって作製された抗体の集合体を表すという点で、モノクローナル抗体はポリクローナル抗体と区別される。モノクローナル抗体は一価の親和性を有することができ、これは抗体の両半分が同一であり同じエピトープに結合することを意味する。あるいは、モノクローナル抗体は「二重特異性抗体」のように二価の親和性を有する場合があり、これは抗体の一方の半分が抗体のもう半分とは異なるエピトープに結合することを意味する。

「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる任意の抗体を含む。二重特異性抗体は一般に２つの異なる重鎖を含み、それぞれの重鎖が、２種類の分子（例えば、抗原）または同じ分子（例えば、同じ抗原）いずれかの異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合できる場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は一般に、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性よりも少なくとも１～２桁または３桁または４桁低く、その逆もまた同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じかまたは異なる標的（例えば、同じかまたは異なるタンパク質）に存在し得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列を、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列と融合することができ、そのような配列を、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞に発現させることができる。一般的な二重特異性抗体は、それぞれが３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖と、（Ｎ末端からＣ末端方向に）続くＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、ならびに、いずれも抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合することができるか、または各重鎖と会合でき、重鎖抗原結合領域が結合するエピトープの１つ以上に結合することができるか、または各重鎖と会合でき、重鎖の一方もしくは両方をエピトープの一方もしくは両方と結合することができる免疫グロブリン軽鎖を有する。

「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」という語句には、任意の生物由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を包含し、特に明記しない限り、重鎖可変ドメインを含む。重鎖可変ドメインには、特に明記しない限り、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲとＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端方向に）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片は、抗原を特異的に認識できる（例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモルの範囲のＫＤで抗原を認識する）断片、細胞から発現及び分泌することができる断片、ならびに少なくとも１つのＣＤＲを含む断片を含む。

語句「軽鎖」は、任意の生物由来の免疫グロブリン軽鎖定常領域配列を包含し、特に明記しない限り、ヒトのカッパ軽鎖及びラムダ軽鎖を含む。軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには一般的に、特に明記しない限り、３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれる。一般に全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端方向に、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含むＶＬドメイン、及び軽鎖定常ドメインを含む。本発明と共に使用することができる軽鎖は、例えば、抗原結合タンパク質が選択的に結合する第１または第２の抗原のいずれとも選択的に結合しないものを含む。好適な軽鎖は、既存の抗体ライブラリ（ウェットライブラリまたはインシリコ）にて、最もよく使用される軽鎖をスクリーニングすることによって同定できるものであり、抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインの親和性及び／または選択性を実質的に妨害しない軽鎖を含む。好適な軽鎖は、抗原結合タンパク質の抗原結合領域が結合する一方または両方のエピトープに結合できるものを含む。

語句「可変ドメイン」は、（特に明記されない限り）Ｎ末端からＣ末端へ、順にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４のアミノ酸領域を含む、免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列（必要に応じて修飾される）を含む。「可変ドメイン」は、各ベータシートが第１のベータシートの残基と第２のベータシートの残基との間のジスルフィド結合によって連結される二重ベータシート構造を有する標準ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）への折り畳みが可能であるアミノ酸配列を含む。

語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」は、通常（すなわち野生型動物において）、免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域内の２つのフレームワーク領域間に出現する、生物の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。ＣＤＲは、例えば生殖系列配列または再配列されたもしくは再配列されていない配列によって、及び例えばナイーブＢ細胞もしくはＴ細胞または成熟Ｂ細胞もしくはＴ細胞によってコードされ得る。状況によっては（例えば、ＣＤＲ３の場合）、ＣＤＲは、（例えば、再配列されていない核酸配列においては）連続していないが、Ｂ細胞核酸配列においては、例えば配列のスプライシングまたは結合（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するＶ－Ｄ－Ｊ組換え）の結果として連続している２つ以上の配列（例えば生殖系列配列）によってコードされ得る。

Ｆｃ含有タンパク質としては、抗体、二重特異性抗体、イムノアドヘシン、「受容体－Ｆｃ融合タンパク質」、ならびに免疫グロブリンＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも機能的部分を含む他の結合タンパク質が挙げられる。「機能的部分」とは、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲ、またはＦｃＲｎ、すなわち胎児性Ｆｃ受容体）に結合することができる、及び／または補体の活性化に関与することができるＣＨ２及びＣＨ３領域を指す。ＣＨ２及びＣＨ３領域が、いかなるＦｃ受容体にも結合できず、また補体の活性化もできなくなる欠失、置換、及び／または挿入、または他の修飾を含む場合、ＣＨ２及びＣＨ３領域は機能的ではない。

Ｆｃ含有タンパク質は免疫グロブリンドメインでの修飾を含み得るが、これは、結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響を与える修飾を含む（例えば、ＦｃγＲ結合、ＦｃＲｎ結合とそれによる半減期、及び／またはＣＤＣ活性に影響を及ぼす修飾）。そのような修飾として、免疫グロブリン定常領域のＥＵナンバリングに基づいた以下の修飾及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８，２８０，２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、及び４３９。

例えば、限定するものではないが、結合タンパク質はＦｃ含有タンパク質であり、（列挙された修飾（複数可）を含まない同じＦｃ含有タンパク質と比較して）改善された血清半減期を示し、位置２５０（例えば、ＥまたはＱ）；２５０及び４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）、及び２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）の修飾；または４２８及び／または４３３（例えば、Ｌ／Ｒ／ＳＩ／Ｐ／ＱまたはＫ）及び／または４３４（例えば、Ｈ／ＦまたはＹ）の修飾；または２５０及び／または４２８の修飾；または３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）及び４３４の修飾を有する。別の例では、修飾は、４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；３０７及び／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含み得る。

組換えＦｃ含有タンパク質によっては、生体系において同種の結合パートナーを有する受容体または受容体断片、リガンドまたはリガンド断片を含有する。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」とは、免疫グロブリンＦｃドメインに融合した可溶性受容体を含む組換え分子を指す。受容体Ｆｃ融合タンパク質によっては、複数の異なる受容体のリガンド結合ドメインを含み得る。この受容体Ｆｃ融合タンパク質は、「捕捉体」または「捕捉分子」として知られる。リロナセプト及びアフリベルセプトは、それぞれ、ＩＬ１Ｒ（米国特許第７，９２７，５８３号を参照）及びＶＥＧＦ（米国特許第７，０８７，４１１号を参照）に拮抗する市販の捕捉体の例である。他の組換えＦｃ含有タンパク質は、Ｆｃドメインに融合したペプチドを含む組換えタンパク質を含み、例えばＣｅｎｔｏｃｏｒのＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ（商標）技術がある。組換えＦｃ含有タンパク質については、Ｃ．Ｈｕａｎｇ，“Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｔｒａｐｓ，ａｎｄ ＭＩＭＥＴＩＢＯＤＹ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”２０（６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９２－９（２００９）に記載されている。

本明細書で使用される場合、用語「等張化剤」または「張度調整剤」とは、製剤または溶液に張度または浸透圧を付与する物質または物質の組み合わせである。製剤は、溶媒１キログラムあたりの溶質が約０．２９オスモルである（２９０ｍＯｓｍ）生理的浸透圧を必要とする可能性がある。生理的浸透圧を有する製剤は一般に、生理的に等張性であると称される。製剤は、２９０ｍＯｓｍより低い（生理的低張性）または２９０ｍＯｓｍより高い（生理的高張性）浸透圧を有し得る。製剤を適切な張度に調整するには等張化剤を製剤に添加する。用語「張度」は、重量モル浸透圧濃度または容積モル浸透圧濃度と同義に使用することができる。

等張化剤には、イオン強度または伝導度を調整するために添加される塩、及び塩以外の等張化剤が含まれる。よく使用される塩として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、及び塩化カルシウムが挙げられる。塩以外の等張化剤としては、糖、糖アルコール、単糖類、及び二糖類が挙げられ、その例として、ソルビトール、マンニトール、スクロース、トレハロース、グリセロール、マルトース、及びラクトースがある。

本明細書で使用される場合、用語「界面活性剤」は、界面表面張力を低下させる添加剤または賦形剤を意味する。界面活性剤によっては親油性部分と親水性部分を有する。界面活性剤は、タンパク質－タンパク質の疎水性相互作用及びその結果として生じる高分子量種（すなわち凝集体）の形成を減少させることによって付加的な安定性をもたらすと考えられる。ＦＤＳ、ＤＰ、タンパク質を処理及び製造する溶液、ならびにタンパク質自己会合アッセイ溶液を含む、タンパク質含有溶液に、１種以上の界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤はイオン性であっても非イオン性であってもよい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルポリグルコシド（例えば、オクチルグルコシド及びデシルマルトシド）、セチルアルコール及びオレイルアルコールなどの脂肪族アルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、ならびにコカミドＴＥＡが挙げられる。具体的な非イオン性界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート２８、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、及びポリソルベート８５などのポリオキシエチレンソルビタンエステル（別名ポリソルベート）；ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７などのポロキサマー；ポリエチレンポリプロピレングリコール；またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ポリソルベート２０は、ＴＷＥＥＮ ２０、ソルビタンモノラウレート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしても知られている。ポリソルベート８０は、ＴＷＥＥＮ ８０、ソルビタンモノオレエート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても知られている。

タンパク質含有溶液内に含まれる界面活性剤の量は、その溶液に望まれる具体的な特性及び目的に応じて異なる場合がある。ある特定の実施形態では、溶液は、約０．００１％（ｗ／ｖ）～約０．５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）を含み得る。例えば、溶液は、約０．００１％；約０．００１５％；約０．００２％；約０．００２５％；約０．００３％；約０．００３５％；約０．００４％；約０．００４５％；約０．００５％；約０．００５５％；約０．００６％；約０．００６５％；約０．００７％；約０．００７５％；約０．００８％；約０．００８５％；約０．００９％；約０．００９５％；約０．０１％；約０．０１５％；約０．０１６％；約０．０１７％；約０．０１８％；約０．０１９％；約０．０２％；約０．０２１％；約０．０２２％；約０．０２３％；約０．０２４％；約０．０２５％；約０．０２６％；約０．０２７％；約０．０２８％；約０．０２９％；約０．０３％；約０．０３１％；約０．０３２％；約０．０３３％；約０．０３４％；約０．０３５％；約０．０３６％；約０．０３７％；約０．０３８％；約０．０３９％；約０．０４％；約０．０４１％；約０．０４２％；約０．０４３％；約０．０４４％；約０．０４５％；約０．０４６％；約０．０４７％；約０．０４８％；約０．０４９％；約０．０５％；約０．０５１％；約０．０５２％；約０．０５３％；約０．０５４％；約０．０５５％；約０．０５６％；約０．０５７％；約０．０５８％；約０．０５９％；約０．０６％；約０．０６１％；約０．０６２％；約０．０６３％；約０．０６４％；約０．０６５％；約０．０６６％；約０．０６７％；約０．０６８％；約０．０６９％；約０．０７％；約０．０７１％；約０．０７２％；約０．０７３％；約０．０７４％；約０．０７５％；約０．０７６％；約０．０７７％；約０．０７８％；約０．０７９％；約０．０８％；約０．０８１％；約０．０８２％；約０．０８３％；約０．０８４％；約０．０８５％；約０．０８６％；約０．０８７％；約０．０８８％；約０．０８９％；約０．０９％；約０．０９１％；約０．０９２％；約０．０９３％；約０．０９４％；約０．０９５％；約０．０９６％；約０．０９７％；約０．０９８％；約０．０９９％；約０．１０％；約０．１５％；約０．２０％；約０．２５％；約０．３０％；約０．３５％；約０．４０％；約０．４５％；または約０．５０％の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）を含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「安定剤」とは、タンパク質の天然の立体構造を安定化させる役割をする分子もしくは化合物、または化学物質の組み合わせ（すなわち、２種以上の化学物質）を意味する。安定剤は、以下のメカニズムのうちの１つ以上によって溶液中のタンパク質を安定化させる：（１）水の表面張力の増加、（２）タンパク質の周囲に水の層を形成するタンパク質－賦形剤の除去、（３）負のペプチド結合相互作用、及び（４）タンパク質表面との斥力相互作用。特定のメカニズムを問わず、安定剤は、タンパク質表面から優先的に除去されることで、タンパク質表面の水を濃縮する。また、好ましくないタンパク質－賦形剤相互作用は、変性時にタンパク質の表面積を増加させるため、熱力学的に好ましくないタンパク質のアンフォールディングを生じさせる。安定剤としては、例えば、ポリオール、糖、アミノ酸、塩析塩、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。有用な安定剤の例としては、ポリエチレングリコール、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、トレハロース、スクロース、アルギニン、アラニン、プロリン、グリシン、塩化ナトリウム、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。スクロース及びトレハロースは最も頻繁に使用される糖である。

以下の非限定的な条項によって、本発明をさらに記載する。

条項１．
（ａ）タンパク質、ナノ粒子、及び緩衝塩を組み合わせて試料を作製する工程；
（ｂ）前記試料を光で励起する工程；
（ｃ）前記試料を透過した光を測定する工程；
（ｄ）前記試料の吸収強度比を算出する工程
を含み、
前記吸収強度比が閾値を超える場合、前記タンパク質が高濃度で安定である、
タンパク質が自己会合する可能性を決定するための方法。

条項２．前記タンパク質が抗原結合タンパク質である、条項１に記載の方法。

条項３．前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体断片、または受容体－Ｆｃ融合タンパク質である、条項２に記載の方法。

条項４．前記抗原結合タンパク質がヒトモノクローナル抗体である、条項３に記載の方法。

条項５．前記タンパク質が、前記試料中に約２μｇ／ｍＬ～約５１２μｇ／ｍＬの濃度で存在する、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項６．前記ナノ粒子が金ナノ粒子である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項７．前記金ナノ粒子の直径が約２０ｎｍ～約１００ｎｍである、条項６に記載の方法。

条項８．前記金ナノ粒子の直径が約２０ｎｍである、条項７に記載の方法。

条項９．前記試料が約５×１０^１１～約８×１０^１１ナノ粒子／ｍＬを含む、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１０．前記試料が約６～６．５×１０^１１ナノ粒子／ｍＬを含む、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１１．前記塩が前記試料中に約２ｍＭ～約２５０ｍＭの濃度で存在する、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１２．前記塩が塩化ナトリウムである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１３．前記塩濃度が、約２ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２００ｍＭである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１４．前記透過光が、約４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で測定される、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１５．前記吸収強度比が、最大吸光度と初期吸光度の比である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１６．前記吸収強度比の閾値が約１．７である、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１７．前記試料において異なる濃度のタンパク質を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１８．前記試料において異なる濃度の塩を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項１９．異なるｐＨの前記試料を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項２０．
（ｅ）高濃度の高可溶性タンパク質を賦形剤と組み合わせて、製剤化した原薬を作製する工程
をさらに含む、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項２１．前記タンパク質の濃度が約５０ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項２２．前記賦形剤が、等張化剤、緩衝液、界面活性剤、安定剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項２０または２１のいずれかに記載の方法。

条項２３．前記等張化剤が塩である、条項２２に記載の方法。

条項２４．前記塩がＮａＣｌである、先行条項のいずれか１項に記載の方法。

条項２５．先行条項のいずれかに記載の方法によって得られるバイオ治療薬を含む、組成物。

条項２６．前記バイオ治療薬種の合計の約１０％以下が、前記バイオ治療薬の濃度で不可逆的な凝集体として存在する、条項２５に記載の組成物。

条項２７．前記閾値が例えば約１．５～約２．０（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）の範囲内にあるような、条項２５～２６のいずれかに記載の組成物。

条項２８．前記閾値が約０．７～約１．０（Ａ_ピーク／Ａ_対照）の範囲内である、条項２５～２７のいずれかに記載の組成物。

条項２９．前記バイオ医薬の濃度が、例えば約５０ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬの範囲内である、条項２５～２８のいずれかに記載の組成物。

条項３０．医療に使用される、条項２５～２９のいずれかに記載の得られる組成物。

条項３１．バイオ医薬を含む組成物を調製するための条項１～２４のいずれかに記載の方法であって、前記組成物が、約１０～１０，０００ｍＰａｓ、約２０～９０００ｍＰａｓ、約３０～８０００ｍＰａｓ、約４０～７０００ｍＰａｓ、約５０～６０００ｍＰａｓ、約７０～５０００ｍＰａｓ、約９０～４０００ｍＰａｓ、約１００～３０００ｍＰａｓ、または約１０ｍＰａｓ、もしくは約２０ｍＰａｓ、もしくは約３０ｍＰａｓ、もしくは約４０ｍＰａｓ、もしくは約５０ｍＰａｓ、またはこれに代わり約１ｍＰａｓ～約２０ｍＰａｓ、約２ｍＰａｓ、約３ｍＰａｓ、約４ｍＰａｓ、約５ｍＰａｓ、約６ｍＰａｓ、約７ｍＰａｓ、約１０ｍＰａｓ、１３ｍＰａｓ、１５ｍＰ、もしくは約２０ｍＰａｓの粘度を有する、前記方法。

条項３２．前記バイオ医薬が、１つ以上のタンパク質もしくは１つ以上の抗体、またはそれらの任意の混合物である、条項３１に記載の方法。

条項３３．前記抗体が、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはそれらの組み合わせである、条項３１～３２のいずれかに記載の方法。

条項３４．
（ａ）少なくとも２種のナノ粒子；
（ｂ）少なくとも２相のタンパク質；及び
（ｃ）塩または緩衝液
を含む、生物分析用混合物。

条項３５．前記少なくとも２相のタンパク質の第１相が可溶性相である、条項３４に記載の生物分析用混合物。

条項３６．前記少なくとも２相のタンパク質の第２相が付着相であり、前記タンパク質が前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれの表面に付着する、条項３４または３５に記載の生物分析用混合物。

条項３７．前記少なくとも２相のタンパク質の第３相が凝集相であり、前記タンパク質が自己会合して凝集体を形成する、先行条項３４～３６のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項３８．１種以上の前記凝集タンパク質がまた、ナノ粒子の表面に付着する、先行条項３４～３７のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項３９．前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれが金を含む、先行条項３４～３８のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４０．前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれが約２０ｎｍ～約１００ｎｍの直径を備える、先行条項３４～３９のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４１．前記直径が約２０ｎｍである、先行条項３４～４０のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４２．前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれが前記タンパク質で飽和されている、先行条項３４～４１のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４３．前記ナノ粒子が、混合物１ミリリットルあたり約６×１０^１１～約７×１０^１１ナノ粒子の密度で存在する、先行条項３４～４２のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４４．前記タンパク質が約２μｇ／ｍＬ～約５１２μｇ／ｍＬの濃度で存在する、先行条項３４～４３のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４５．前記タンパク質が抗原結合性タンパク質である、先行条項３４～４４のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４６．前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体断片、アプタマー、及び受容体－Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、条項３４～４５のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４７．前記抗原結合タンパク質が抗体である、先行条項３４～４６のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４８．前記抗体がヒトモノクローナル抗体である、先行条項３４～４７のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項４９．前記塩が、約２ｍＭ～約３００ｍＭの濃度で存在する、先行条項３４～４８のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項５０．前記塩が、約２ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２００ｍＭの濃度で存在する、先行条項３４～４９のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

条項５１．前記塩がＮａＣｌを含む、先行条項３４～５０のいずれか１項に記載の生物分析用混合物。

以下の実施例は、本発明の方法をさらに例示するために提供する。以下の実施例は単に例示的なものであり、いかなる場合にも本発明の範囲を限定することを意図しない。

実施例１：材料
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＥＥＳＹＲ（登録商標）細胞によって産生し、プロテインＡクロマトグラフィー及び陰イオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィーの研磨ステップによって精製した。緩衝液成分は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＶＷＲ、またはＪＴ－Ｂａｋｅｒから入手したものであり、入手可能な最高等級のものであった。Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰカラム（カタログ番号１７－０８５３－０２）及びＸＫ２６／１００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（カタログ番号９０－１００２－７３）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルターユニット（カタログ番号ＵＦＣ９０５０２４）は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２透析カセット（カタログ番号８７７３２）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。２０ｎｍ金ナノ粒子（カタログ番号ＨＤ．ＧＣ２０）は、ＢＢＩ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから購入した。吸収スペクトルを取得する際の反応容器として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｎｕｎｃ（商標）Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ（商標）９６ウェルマイクロプレート（カタログ番号１２－５６５－６６）を使用した。

実施例２：高濃度静的光散乱法（ＨＣ－ＳＬＳ）
濃縮した（１００ｇ／Ｌ）モノクローナル抗体（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、及びｍＡｂ６）を、Ａｋｔａ ａｖａｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ塩化ナトリウムでＸＫ２６／１００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラムを通して、それぞれ精製した。単量体ｍＡｂ画分を回収し、３０，０００ＭＷＣＯ ＨＹ膜搭載のＶｉｖａＦｌｏｗ ２００と直列に連結したＥａｓｙ－Ｌｏａｄ ＭＡｓｔｅｒＦｌｅｘ Ｌ／Ｓ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）ポンプを使用して濃縮した。１５０ｍＬの各濃縮抗体を３つの画分に分割し、１０，０００ＭＷＣＯの透析カセットに装填し、２Ｌの１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、２５０ｍＭ塩化ナトリウム；１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、５０ｍＭ塩化ナトリウム；及び１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、１０ｍＭ塩化ナトリウムと交換した。５０，０００ＭＷＣＯ搭載の遠心フィルターユニットを使用して、それぞれの対応する緩衝液中で最終容量約１５ｍＬまで溶液を濃縮した。ＳｏｌｏＶＰＥ（Ｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して濃度を測定した。１０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０、１０ｍＭ塩化ナトリウム中では、抗体は公称６０ｇ／Ｌを上回って濃縮することはできなかった。他の２つの塩濃度（２５０ｍＭ及び５０ｍＭ塩化ナトリウム）を公称８０ｇ／Ｌに調整した。３つの条件から得たアリコートを採取し、１０ｇ／Ｌに希釈した。８０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌの試料及び緩衝液をＣＧ－ＭＡＬＳ装置（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に加え、光散乱シグナルをｍＡｂ濃度の関数として測定した。

実施例３：標準自己相互作用ナノ粒子分光法（ＳＩＮＳ）
異なる塩条件下の各抗体（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、及びｍＡｂ６）のサブアリコートを、別々の１５ｍＬファルコンチューブに加えた。光学密度１（１ＯＤ）の２０ｎｍ金ナノ粒子溶液５ｍＬを溶液に添加し、得られる最終タンパク質濃度を５０μｇ／ｍＬにした。３０分待機した後、吸収スペクトル及びλ_最大をＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録した。

濃度依存性自己相互作用ナノ粒子分光法（ＣＤ－ＳＩＮＳ）
１００ｍＭ緩衝溶液を適切なｐＨに調製した。Ｉｌｌｕｓｔｒａ ＮＡＰカラムを、２．４ｍＬの１００ｍＭ緩衝溶液（例えば、目標ｐＨに応じてＭＥＳまたはリン酸ナトリウム）で平衡化した。濃縮された（５０～７５ｇ／Ｌ）ｍＡｂ原液を、平衡化した脱塩カラムを使用して緩衝液交換した。得られた濃度を、ＳｏｌｏＶＰＥを使用して測定した。続いて各抗体を１００ｍＭ緩衝液で５．１２ｍｇ／ｍＬに希釈した。次いで、ｍＡｂをマイクロウェルプレートの列１に添加し、１００ｍＭ緩衝液で０．０４ｍｇ／ｍＬまで順次希釈した。８０μＬの金ナノ粒子を９６マイクロウェルプレートの列２、３、及び４に添加した。列１の順次希釈を続行しながら、順次希釈したｍＡｂ４０μＬを、マルチチャネルピペットを使用して、金ナノ粒子を入れた各列に添加した。続いて、３５７ｍＭ、７１ｍＭ、及び１４ｍＭの塩化ナトリウム塩原液２８０ｍＬを、マルチチャネルピペットを使用してそれぞれ列２、３、及び４に添加した。得られた溶液を３０分間平衡化した後、吸収スペクトルをＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ３４０ＰＣで記録した。最大吸収強度は、４５０ｎｍでの吸光度に対して正規化した。この比を抗体の最終濃度の関数としてプロットする。

実施例４：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の動的コロイド安定性
１ミリリットルあたり約６．３×１０^１１粒子の２０ｎｍ金ナノ粒子を、２ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、または２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で様々な濃度のヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）と結合させた。３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬを含んだ個々の試料に吸光度分光法を行った。これらのスペクトログラムをプロットし（図４、２００ｍＭ ＮａＣｌの試料に関するスペクトルを示す）、４５０ｎｍでの初期吸光度に対する最大吸光度（λ_最大）の吸収強度の比を各タンパク質濃度について算出し、プロットした（図５）。

ＨＳＡは、すべてのイオン強度及び高いタンパク質濃度で１．７（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）を上回る吸収強度比を示しており、良好な動的コロイド相互作用プロファイルを示している。静的光散乱実験は、ＣＤ－ＳＩＮＳプロファイルと全体的に一致する正のビリアル（Ａ_２）を示している（表２）。

実施例５：モノクローナル抗体Ｎｏ．１（ｍＡｂ１）
１ミリリットルあたり約６．３×１０^１１粒子の２０ｎｍ金ナノ粒子を、２ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、または２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で様々な濃度のヒトｍＡｂ１と結合させた。３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬを含んだ個々の試料に吸光度分光法を行った。これらのスペクトログラムをプロットし、４５０ｎｍでの初期吸光度に対する最大吸光度（λ_最大）の吸収強度の比を各タンパク質濃度について算出し、プロットした（図６）。

ｍＡｂ１は、すべてのイオン強度及び高いタンパク質濃度で１．７（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）を上回る吸収強度比を示しており、良好な動的コロイド相互作用プロファイルを示している。高濃度静的光散乱実験は、ＣＤ－ＳＩＮＳプロファイルと全体的に一致する正のビリアル（Ａ_２）を示している（表３、図７）。

実施例６：モノクローナル抗体Ｎｏ．６（ｍＡｂ６）
１ミリリットルあたり約６．３×１０^１１粒子の２０ｎｍ金ナノ粒子を、２ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、または２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で様々な濃度のヒトｍＡｂ６と結合させた。３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬを含んだ個々の試料に吸光度分光法を行った。これらのスペクトログラムをプロットし、４５０ｎｍでの初期吸光度に対する最大吸光度（λ_最大）の吸収強度の比を各タンパク質濃度について算出し、プロットした（図８）。

ｍＡｂ６は、低イオン強度及び高いタンパク質濃度で１．７（Ａ_ピーク／Ａ_４５０）を上回る吸収強度比を示しており、この条件下では良好な動的コロイド相互作用プロファイルを示している。ｍＡｂ６は、イオン強度が増加するにつれて引力相互作用の増加を示す。高濃度静的光散乱実験は、ＣＤ－ＳＩＮＳプロファイルと全体的に一致する可変ビリアル（Ａ_２）を示している（図９）。

実施例７：モノクローナル抗体Ｎｏ．２（ｍＡｂ２）
１ミリリットルあたり約６．３×１０^１１粒子の２０ｎｍ金ナノ粒子を、２ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、または２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で様々な濃度のヒトｍＡｂ２と結合させた。３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬを含んだ個々の試料に吸光度分光法を行った。これらのスペクトログラムをプロットし、４５０ｎｍでの初期吸光度に対する最大吸光度（λ_最大）の吸収強度の比を各タンパク質濃度について算出し、プロットした（図２）。

ｍＡｂ２は、条件の変化に応じて正味のタンパク質相互作用に著しい変化を示す。ｍＡｂ２は、低イオン強度では引力相互作用の増加を示す。イオン強度が増加するにつれて、分子は全体的に斥力性になる。２００ｍＭのＮａＣｌで抗体は良好なコロイド安定性を有する。高濃度静的光散乱実験は、従来のＳＩＮＳによる最大吸光度の波長（表１）と全体的に一致する可変ビリアル（Ａ_２）を示している。

実施例８：モノクローナル抗体Ｎｏ．３（ｍＡｂ３）
１ミリリットルあたり約６．３×１０^１１粒子の２０ｎｍ金ナノ粒子を、２ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、または２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で様々な濃度のヒトｍＡｂ３と結合させた。３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬを含んだ個々の試料に吸光度分光法を行った。これらのスペクトログラムをプロットし、４５０ｎｍでの初期吸光度に対する最大吸光度（λ_最大）の吸収強度の比を各タンパク質濃度について算出し、プロットした（図１０）。

ｍＡｂ３は、高濃度の製剤化及び製造に問題が生じる可能性を示唆するコロイド不安定性タンパク質の一例である。すべてのイオン強度及びタンパク質濃度で、ｍＡｂ３は引力相互作用を示す。高濃度静的光散乱実験は、従来のＳＩＮＳによる最大吸光度の波長（表１）と全体的に一致する負のビリアル（Ａ_２）を示している。

実施例９：モノクローナル抗体Ｎｏ．４（ｍＡｂ４）
１ミリリットルあたり約６．３×１０^１１粒子の２０ｎｍ金ナノ粒子を、２ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、または２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で、様々な濃度のヒトｍＡｂ４と結合させた。３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬを含んだ個々の試料に吸光度分光法を行った。これらのスペクトログラムをプロットし、４５０ｎｍでの初期吸光度に対する最大吸光度（λ_最大）の吸収強度の比を、各タンパク質濃度について算出し、プロットした（図１１）。

ｍＡｂ４は、低イオン強度でコロイド安定性のタンパク質の一例であるが、低イオン強度においてタンパク質濃度が高いと低い溶解性を示す。静的光散乱実験は、混在したビリアル（低イオン強度では負、高イオン強度では正）を示し、ｍＡｂ４に関して斥力性プロファイルを示すＣＤ－ＳＩＮＳ生成データ（表１）との不一致がみられる。

実施例１０：モノクローナル抗体Ｎｏ．５（ｍＡｂ５）
１ミリリットルあたり約６．３×１０^１１粒子の２０ｎｍ金ナノ粒子を、２ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、または２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６の１０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液中で、様々な濃度のヒトｍＡｂ５と結合させた。３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、及び４００μｇ／ｍＬを含んだ個々の試料に吸光度分光法を行った。これらのスペクトログラムをプロットし、４５０ｎｍでの初期吸光度に対する最大吸光度（λ_最大）の吸収強度の比を、各タンパク質濃度について算出し、プロットした（図１２）。

ｍＡｂ５は、低イオン強度では引力性であり、イオン強度の増加につれて高タンパク質濃度の挙動に改善を示すコロイド混在性タンパク質の例である。静的光散乱実験は、負のビリアルのみを示し、ｍＡｂ４に関して混在性プロファイルを示すＣＤ－ＳＩＮＳ生成データ（表１）との不一致がみられる。

実施例１１：賦形剤のスクリーニングと選択
製剤化条件によっては好ましくない動的コロイド相互作用プロファイルを有する高粘度の製剤化抗体（ｍＡｂ７）を使用して、追加賦形剤が抗体のＣＧ－ＳＩＮＳプロファイルを改善できるかをスクリーニングした。異なる緩衝液及びイオン強度（図１３）、ならびに糖及び／またはアミノ酸賦形剤（図１４）を含んだ様々な溶液で製剤化したモノクローナル抗体７（ｍＡｂ７）のＣＧ－ＳＩＮＳプロファイルは、高濃度での調剤に好ましい吸光度_最大／吸光度_０の閾値を下回ったままであった（例えば１．７未満）。約１００ｍｇ／ｍＬの製剤化したｍＡｂ７の粘度の実測は約１００ｃＰであった。

ＣＤ－ＳＩＮＳアッセイを用いて、ｍＡｂ７に対する種々の置換安息香酸化合物のコロイド安定化効果をスクリーニングした。置換安息香酸として、ｍ－ヒドロキシ安息香酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、ｍ－メチル安息香酸、ｐ－メチル安息香酸、ｍ－エチル安息香酸、ｐ－エチル安息香酸、ｍ－アミノ安息香酸、ｐ－アミノ安息香酸、スルホン酸、及び安息香酸アンモニウムが挙げられる。図１５は、置換安息香酸のそれぞれを用いて製剤化したｍＡｂ７のＣＤ－ＳＩＮＳ吸光度比の散布図を示す。図１５に示すように、ｐ－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ、図１５中の白丸）を製剤化したｍＡｂ７と組み合わせると、ｍＡｂ７は、高濃度での調剤に有利な閾値を超える、すなわち１．６または１．７超の吸光度比で実証される良好なコロイド安定性を示した。

ＰＡＢＡをｍＡｂ７と用量依存的に組み合わせて、ＣＤ－ＳＩＮＳ分析を行った。ｍＡｂ７に１２ｍＭ超のＰＡＢＡ（例えば、１８ｍＭ、２４ｍＭ、３０ｍＭ、及び３６ｍＭのＰＡＢＡ）を加えた場合、良好な（すなわち、斥力性）コロイド相互作用プロファイルを生成した（図１６）。ＰＡＢＡがｍＡｂ７のコロイド相互作用プロファイルに与える効果は、ＰＡＢＡが約２０ｍＭの時点で飽和すると思われる。

２０ｍＭのＰＡＢＡを、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、及び８０ｇ／ＬのｍＡｂ７と組み合わせ、ねじり型レオメーターを使用してコーンプレート法を用いた粘性分析（Ｐａｔｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１０４（４）：９１３－９２３，２０１３ Ｆｅｂ １９）を行った。結果を図１７に示す。Ｋｒｉｅｇｅｒ－Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙアルゴリズム（例えば、Ｌｕｋｈａｍ ａｎｄ Ｕｋｅｊｅ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．，２２０（２）：３４７－３５６，１９９９ Ｄｅｃ １５を参照）を用いて、これらの結果から１００ｇ／ＬのｍＡｂ７の結果を外挿したところ、２０ｍＭのＰＡＢＡを含んだこのｍＡｂ７製剤において定常せん断粘度に約３倍の減少が認められた。

Claims (44)

1. （ａ）タンパク質、ナノ粒子、及び緩衝塩を組み合わせて試料を作製する工程；
   （ｂ）前記試料を光で励起する工程；
   （ｃ）前記試料を透過した光を測定する工程；
   （ｄ）前記試料の吸収強度比を算出する工程
   を含み、
   前記吸収強度比が閾値を超える場合、前記タンパク質が高濃度で安定である、
   タンパク質が自己会合する可能性を決定するための方法。
2. 前記タンパク質が抗原結合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体断片、または受容体－Ｆｃ融合タンパク質である、請求項２に記載の方法。
4. 前記抗原結合タンパク質がヒトモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
5. 前記タンパク質が、前記試料中に約２μｇ／ｍＬ～約５１２μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
6. 前記ナノ粒子が金ナノ粒子である、請求項１に記載の方法。
7. 前記金ナノ粒子が、直径約２０ｎｍ～約１００ｎｍを有する、請求項６に記載の方法。
8. 前記金ナノ粒子の直径が約２０ｎｍである、請求項７に記載の方法。
9. 前記試料が約５×１０^１１～約８×１０^１１ナノ粒子／ｍＬを含む、請求項１に記載の方法。
10. 前記試料が約６～６．５×１０^１１ナノ粒子／ｍＬを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記塩が前記試料中に約２ｍＭ～約２５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
12. 前記塩が塩化ナトリウムである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記塩濃度が、約２ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２００ｍＭである、請求項１２に記載の方法。
14. 前記透過光が、約４５０ｎｍ～約７５０ｎｍの範囲の複数の波長で測定される、請求項１に記載の方法。
15. 前記吸収強度比が、最大吸光度と初期吸光度の比である、請求項１に記載の方法。
16. 前記吸収強度比の閾値が約１．７である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記試料において異なる濃度のタンパク質を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記試料において異なる濃度の塩を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
19. 異なるｐＨの前記試料を用いて工程（ａ）～（ｄ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. （ｅ）高濃度の高可溶性タンパク質を賦形剤と組み合わせて、製剤化した原薬を作製する工程
    をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記タンパク質の濃度が約５０ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の方法。
22. 前記賦形剤が、等張化剤、緩衝液、界面活性剤、安定剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記等張化剤が塩である、請求項２２に記載の方法。
24. 前記塩がＮａＣｌである、請求項２３に記載の方法。
25. （ａ）少なくとも２種のナノ粒子；
    （ｂ）少なくとも２相のタンパク質；及び
    （ｃ）塩または緩衝液
    を含む、生物分析用混合物。
26. 前記少なくとも２相のタンパク質の第１相が可溶性相である、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
27. 前記少なくとも２相のタンパク質の第２相が付着相であり、前記タンパク質が前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれの表面に付着する、請求項３７に記載の生物分析用混合物。
28. 前記少なくとも２相のタンパク質の第３相が凝集相であり、前記タンパク質が自己会合して凝集体を形成する、請求項３８に記載の生物分析用混合物。
29. １種以上の前記凝集タンパク質がまた、ナノ粒子の表面に付着する、請求項３９に記載の生物分析用混合物。
30. 前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれが金を含む、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
31. 前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれが約２０ｎｍ～約１００ｎｍの直径を備える、請求項４１に記載の生物分析用混合物。
32. 前記直径が約２０ｎｍである、請求項４２に記載の生物分析用混合物。
33. 前記少なくとも２種のナノ粒子のそれぞれが前記タンパク質で飽和されている、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
34. 前記ナノ粒子が、混合物１ミリリットルあたり約６×１０^１１～約７×１０^１１微小粒子の密度で存在する、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
35. 前記タンパク質が約２μｇ／ｍＬ～約５１２μｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
36. 前記タンパク質が抗原結合性タンパク質である、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
37. 前記抗原結合タンパク質が、抗体、抗体断片、アプタマー、及び受容体－Ｆｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項４７に記載の生物分析用混合物。
38. 前記抗原結合タンパク質が抗体である、請求項４８に記載の生物分析用混合物。
39. 前記抗体がヒトモノクローナル抗体である、請求項４９に記載の生物分析用混合物。
40. 前記塩が、約２ｍＭ～約３００ｍＭの濃度で存在する、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
41. 前記塩が、約２ｍＭ、約２０ｍＭ、または約２００ｍＭの濃度で存在する、請求項５１に記載の生物分析用混合物。
42. 前記塩がＮａＣｌを含む、請求項３６に記載の生物分析用混合物。
43. （ａ）請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法に従って、タンパク質が自己会合する可能性を決定する工程；
    （ｂ）粘度降下賦形剤を前記タンパク質と組み合わせる工程；
    （ｃ）前記粘度降下賦形剤の存在下で、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法に従って、前記タンパク質が自己会合する可能性を決定する工程；及び
    （ｄ）前記粘度降下賦形剤を含まない場合よりも前記タンパク質溶液の粘度を少なくとも５０％低下させるレベルで前記粘度降下賦形剤を加えて前記タンパク質を製剤化する工程
    を含む、タンパク質を含む低粘度医薬製剤を製造する方法。
44. 前記粘度降下賦形剤がパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）である、請求項４４に記載の方法。

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