JP2023139105A - ミエリン形成を促進する化合物および方法 - Google Patents

ミエリン形成を促進する化合物および方法 Download PDF

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Allimuthu Dharmaraja
ランドー，スティーブン・ビー
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Abstract

【課題】希突起膠細胞（oligodendrocyte）の生成を強化する方法を提供する。【解決手段】方法は、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する薬剤を、希突起膠細胞前駆体細胞（oligodendrocyte precursor cell）（ＯＰＣ）に投与することを含む。【選択図】図１－１

Description

関連出願
[0001]本出願は、２０１６年７月２７日に出願された米国特許仮出願第６２／３６７，４１６号、および２０１７年１月３０日に出願された同第６２／４５２，２０４号の優先権を主張するものであり、これらの発明の主題は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。
政府財政支援
[0002]本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＮＳ０９５２８０を受けて政府支援で行った。合衆国政府は本発明に対して特定の権利を有する。
[0003]多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリンの変質によって特徴付けられる複雑な神経疾患である。この絶縁物質は、その大部分が脂質（７０％脂質、３０％タンパク質）によって構成され、軸索を保護し、かつ軸索性電気インパルスを加速する跳躍性伝導を可能にする。慢性ＭＳにおける軸索のミエリン脱落は、軸索変性および神経細胞死をもたらす場合があるが、より具体的には、ＭＳが、ミエリンを生成しかつ維持する高度に分化したＣＮＳ細胞である希突起膠細胞（oligodendrocyte）を破壊する。
[0004]未成熟希突起膠細胞である希突起膠細胞前駆体（ＰＤＧＦＲα＋、ＮＧ２－プロテオグリカン＋）は、発生中の脳の腹側領域において、共通のグリアプロジェニターから生成され、活発に移動しかつ増殖し、ＣＮＳに集合し、最終的にミエリン形成前希突起膠細胞（Ｏ４＋）へ分化する。この成熟段階では、希突起膠細胞は、軸索に沿ってミエリン鞘の標的化および伸長の両方を行うか、消滅する。しかし、内因性の希突起膠細胞前駆体または移植細胞のいずれかによってミエリン形成および／または再ミエリン形成が強化されるという仮説についてはそれほど研究されていない。
[0005]内因性希突起膠細胞プロジェニターの成熟中に、分化を誘発しかつ／または生存を促進すると、新規の希突起膠細胞の生成および内因性のミエリン形成および／または再ミエリン形成を刺激しかつ強化することができる。したがって、新規の希突起膠細胞の生成を強化することができる化合物および治療的方法が必要とされている。
[0006]本明細書で述べる実施形態は、全体的に、希突起膠細胞前駆体細胞の分化、増殖および／または成熟を誘発、促進、および／または調節することによって、希突起膠細胞の生成を強化するための薬剤、化合物、および方法、ならびにミエリン形成または再ミエリン形成が対象にとって有益な場合に、対象における疾患または障害を処置するための方法に関する。
[0007]希突起膠細胞プロジェニター細胞（ＯＰＣ）におけるコレステロール生合成経路のΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化しかつ／または誘発すると、希突起膠細胞生成を誘発できることが見い出された。Δ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積の強化および／または誘発は、Δ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を阻害するおよび／またはΔ８，９－不飽和ステロール中間体が基質である、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路内の酵素を調節および／または阻害すること、ならびにΔ８，９－不飽和ス
テロール中間体をＯＰＣに直接的におよび／または間接的に投与することによって得ることができる。Δ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化しかつ／または誘発すると、ＯＰＣの分化、生存、増殖および／または成熟を促進し、かつミエリン形成または再ミエリン形成が対象にとって有益な場合に、対象における疾患および／または障害を処置することができる。
[0008]いくつかの実施形態において、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する薬剤は、ＯＰＣの分化、増殖および／または成熟、ならびに希突起膠細胞の生成を促進するおよび／または誘発するために効果的な量で、対象および／またはＯＰＣに投与することができる。１つの例において、薬剤としては、ＯＰＣのコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体の酵素媒介性合成を阻害する、および／またはΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を促進する、少なくとも１つの化合物があり得る。
[0009]いくつかの実施形態において、化合物は、ＯＰＣの、ラノステロールからコレステロールへの、例えばラノステロールおよび／またはラソステロール間のコレステロール生合成経路のうちの１つまたは複数の酵素媒介性変換ステップを調節しおよび／または阻害し、希突起膠細胞生成を促進するおよび／または誘発することができる。例えば、化合物は、コレステロール生合成経路におけるステロール中間体の、ＣＹＰ５１、ステロール１４－レダクターゼ、および／またはＥＢＰ酵素媒介性合成を阻害することができる。さらに別の実施形態において、化合物は、ラノステロールの４，４－ジメチルコレスタ－８（９），１４，２４－トリエン－３β－オールへの、４，４－ジメチルコレスタ－８（９），１４，２４－トリエン－３β－オールのザイモステノールへの、および／またはザイモステノールのラソステロールへの酵素媒介性変換を調節しかつ／または阻害し、希突起膠細胞生成を強化することができる。
[0010]いくつかの実施形態において、化合物は、ラノステロールからデヒドロラソステロールまたはラソステロールへのコレステロール生合成経路のうちの１つまたは複数の酵素媒介性変換ステップを調節するおよび／または阻害することができる。
[0011]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法において使用する化合物は、エモパミル結合タンパク質（ＥＢＰ）イソメラーゼ酵素活性の阻害を通して、ザイモステノールのラソステロールへの酵素媒介性変換を阻害することができる。あるいは、本明細書で述べる方法において使用する化合物は、コレステロール生合成経路におけるステロールＣ１４レダクターゼ酵素活性またはＣＹＰ５１酵素活性を阻害することができる。
[0012]いくつかの実施形態において、化合物は、ビホナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、ブトコナゾール、ケトコナゾール、フルベストラント、アモロルフィン、イフェンプロジル、ジプラシドン、Ｔａｓｉｎ－１、タモキシフェン、ベンズトロピン、クレマスチン、トランス－Ｕ５０４８８、ＥＰＺ００５６８７、ラロキシフェン、ヒドロキシジン、ベサミコール、Ｌ－７４５，８７０、ＴＭＢ－８、シス－Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ－エチル－３－（３－クロロ－４－シクロヘキシルフェニル）プロパ－２－エニルアミン、ｐフルオロヘキサヒドロ－シラジフェニドール、プラモキシン、トレミフェン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
[0013]別の実施形態において、化合物としては、ＯＰＣのコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体を合成する酵素の発現を阻害するｓｉＲＮＡなどの干渉ＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼがあり得る。例えば、干渉ＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ＣＹＰ５１、ステロール１４－レダクターゼ、および／またはＥＢＰ酵素の発現を阻害することができる。
[0014]別の実施形態において、薬剤は、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のうちの少なくとも１つのΔ８，９－不飽和ステロール中間体またはその誘導体であって、ＯＰＣからの希突起膠細胞の生成を強化するΔ８，９－不飽和ステロール中間体またはその誘導体を含むことができる。Δ８，９－不飽和ステロール中間体としては、ラノステロール、１４－デヒドロザイモステノール、ＦＦ－ＭＡＳ、ＭＡＳ－４１２、ザイモステロール、ザイモステノールおよびこれらの誘導体のうちの少なくとも１つがあり得る。
[0015]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる化合物を使用し、それを必要とする対象における神経変性疾患および障害を処置することができる。いくつかの実施形態において、神経変性疾患または障害は、ミエリン関連障害である。ミエリン関連疾患または障害としては、対象の神経細胞、例えば、ＣＮＳニューロンにおけるミエリン発育不全形成またはミエリン脱落と関連する疾患、障害または損傷がある。ミエリン関連疾患および障害の例は、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心ミエリン崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー疾患、ペリツェウスメルツバッハー疾患（ＰＭＤ）、白質消失疾患、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン疾患、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線後損傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、単独性ビタミンＥ欠乏症症候群、バッセンコーンツバイク症候群、マルキアファーバビニャーミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、急性散在性脳炎、ギランバレー症候群、シャルコーマリートゥース疾患、ベル麻痺、および統合失調症などの精神的健康障害である。
[0016] 図１（Ａ～Ｊ）は、ＣＹＰ５１は機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示す構造、プロット、グラフ、および画像を例示する。Ａ）哺乳動物ＣＹＰ５１阻害に関して様々な程度の効力を有するアゾール分子の図である。 図１（Ａ～Ｊ）は、ＣＹＰ５１は機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示す構造、プロット、グラフ、および画像を例示する。Ｂ）アゾールで処置した後、ＣＹＰ５１産生物質ＦＦ－ＭＡＳ（４，４－ジメチル－５ａ－コレスタ－８，１４，２４－トリエン－３β－オール）のＬＣ／ＭＳベースの定量化によって測定したときの、ラットＣＹＰ５１酵素活性の図である。ｎ＝２の独立した酵素アッセイ。 図１（Ａ～Ｊ）は、ＣＹＰ５１は機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示す構造、プロット、グラフ、および画像を例示する。Ｃ）アゾールで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図１（Ａ～Ｊ）は、ＣＹＰ５１は機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示す構造、プロット、グラフ、および画像を例示する。Ｄ）表示されたイミダゾール抗真菌剤で７２時間処置したＯＰＣの代表的な画像の図である。 図１（Ａ～Ｊ）は、ＣＹＰ５１は機能的標的であり、それによてイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示す構造、プロット、グラフ、および画像を例示する。Ｅ）２．５μＭの表示されたアゾールを用いて２４時間処置したＯＰＣにおけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。 図１（Ａ～Ｊ）は、ＣＹＰ５１は機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示す構造、プロット、グラフ、および画像を例示する。Ｆ）表示された用量のケトコナゾールで２４時間処置したＯＰＣにおけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。 図１（Ａ～Ｊ）は、ＣＹＰ５１は機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示す構造、プロット、グラフ、および画像を例示する。Ｇ）細胞透過性ｓｉＲＮＡの非標的化またはＣＹＰ５１標的化プールで４日処置した後の、ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されたＣＹＰ５１ｍＲＮＡレベルの図である。ｎ＝２で反復し、１反復あたりｑＰＣＲ測定を４回行う。Ｈ）表示された試薬で９６時間処置したＯＰＣにおけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する、ケトコナゾール、２．５μＭ。Ｉ）表示された試薬で処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。ｎ＝２の独立した実験、１条件あたり４回反復し、１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。両側ｔ検定、その個別の非標的化対照処置群と比較したｓｉＲＮＡ群に関して＊＊Ｐ＜０．０１。Ｊ）外因性ラノステロールで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 [0017]図２（Ａ～Ｄ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子阻害の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示す概略図およびグラフを例示する。Ａ）中間体代謝産物および標識された選択的阻害剤を含む、簡潔なコレステロール生合成経路の図である。 図２（Ａ～Ｄ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子阻害の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示す概略図およびグラフを例示する。Ｂ）表示された経路阻害剤で処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図２（Ａ～Ｄ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子阻害の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示す概略図およびグラフを例示する。Ｃ）表示された用量のアモロルフィンまたはＴＡＳＩＮ－１で２４時間処置したＯＰＣにおける１４－デヒドロザイモステノールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｄ）表示された精製ステロール中間体で処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 [0018] 図３（Ａ～Ｆ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを示すグラフを例示する。Ａ）５μＭの均一な用量の、ケトコナゾール、生物活性スクリーニングによって同定された９種類の分子、および無作為に選択された９種類のライブラリーメンバーで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｂ）２μＭの表示されたスクリーニングヒット化合物（ｈｉｔ）および無作為に選択されたライブラリーメンバーで２４時間処置したＯＰＣにおけるザイモステロール、ザイモステノール、および１４－デヒドロザイモステノールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたり１回反復し、かつ結果は第二のＯＰＣ誘導で確認した（図９Ｂ）。分子は、標的化される酵素によって分類する（上位を標識する（ｔｏｐ ｌａｂｅｌｓ））。 図３（Ａ～Ｆ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを示すグラフを例示する。Ｃ）表示されたすでに報告済みの希突起膠細胞形成エンハンサーで２４時間処置したＯＰＣにおけるザイモステノールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。特に注記されていない限り、以下の濃度を使用した：ベンズトロピン、２μＭ；クレマスチン１μＭ；タモキシフェン１００ｎＭ；Ｕ５０４８８ ５μＭ；ベキサロテン、１μＭ；リオチロニン、３μＭ。Ｄ）表示されたすでに報告済みの希突起膠細胞形成エンハンサーで２４時間処置したＯＰＣにおけるコレステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。 図３（Ａ～Ｆ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを示すグラフを例示する。Ｅ）ＯＰＣにおいてＥＢＰを阻害するまたはＯＰＣにおいてＥＢＰを阻害しない小分子（１０μＭ）で処置した後の、生化学的アッセイにおけるＥＢＰ酵素活性のＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。ｎ＝３。Ｆ）希突起膠細胞形成エンハンサーの表示された組合せで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１回の処置条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｋｅｔｏ＝ケトコナゾール、２．５μＭ。 [0019] 図４（Ａ～Ｄ）は、ステロール中間体の蓄積およびｉｎ ｖｉｖｏでの再ミエリン形成の強化に対する小分子の効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ａ）ミコナゾール（１ｋｇあたり１０ｍｇ）、イフェンプロジル（１ｋｇあたり１０ｍｇ）、およびタモキシフェン（１ｋｇあたり２ｍｇ）を３日間毎日投薬した後のマウス脳におけるステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１群あたりｎ＝動物４匹。Ｂ）パネルａで示した用量の分子で８日処置したマウスからのＬＰＣ病変脊髄のトルイジンブルーで染色された断片内の再ミエリン化軸索の定量化の図である。ビヒクルｎ＝４を除き、１群あたりｎ＝動物６匹。データは平均＋／－Ｓ．Ｅ．Ｍとして示す。 図４（Ａ～Ｄ）は、ステロール中間体の蓄積およびｉｎ ｖｉｖｏでの再ミエリン形成の強化に対する小分子の効果を示すグラフおよび画像を例示するＣ）パネルａで示した用量の分子で８日処置したマウスからのＬＰＣ病変背側脊髄のトルイジンブルーで染色された断片内の代表的な画像の図である。スケールバー、２０μｍ。 図４（Ａ～Ｄ）は、ステロール中間体の蓄積およびｉｎ ｖｉｖｏでの再ミエリン形成の強化に対する小分子の効果を示すグラフおよび画像を例示するＤ）パネルａで示した用量の分子で８日処置したマウスからのＬＰＣ病変背側脊髄の断片の代表的な電子顕微鏡画像の図である。スケールバー、５μｍ。マンホイットニー、その個別のビヒクル処置群と比較した薬物処置群に関して＊Ｕ＜０．０５および＊＊Ｕ＜０．０１。 [0020] 図５（Ａ～Ｎ）は、ＣＹＰ５１が機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示すグラフおよび画像を例示する。Ａ）２．５μＭの表示されたアゾールで２４時間処置したＯＰＣ（ＯＰＣ－５）におけるコレステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｂ）表示された濃度のアゾールで処置してから７２時間目のＯＰＣの第二の独立した誘導（ＯＰＣ－１）から得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図５（Ａ～Ｎ）は、ＣＹＰ５１が機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示すグラフおよび画像を例示する。Ｃ）２．５μＭの表示されたアゾールで２４時間処置したＯＰＣ（ＯＰＣ－１）の第二の誘導におけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｄ）２．５μＭの表示されたアゾールで２４時間処置したＯＰＣ（ＯＰＣ－１）におけるコレステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。 図５（Ａ～Ｎ）は、ＣＹＰ５１が機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示すグラフおよび画像を例示する。Ｅ）３μＭの表示されたイミダゾール抗真菌剤で処置してから７２時間目のマウス一次ＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｆ）３μＭの表示されたイミダゾール抗真菌剤で２４時間処置したマウス一次ＯＰＣにおけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｇ）代替の画像定量測定法である神経突起全長における増加倍数を使用した希突起膠細胞形成の評価の図である。パネルは図１Ｃに示すデータの再分析である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図５（Ａ～Ｎ）は、ＣＹＰ５１が機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示すグラフおよび画像を例示する。Ｈ）表示された濃度のアゾールで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成された希突起膠細胞の、ＰＬＰ１免疫染色によって測定したときの百分率の図である。左、ＯＰＣ－５；右、ＯＰＣ－１。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｉ）表示された用量のケトコナゾールで２４時間処置したＯＰＣの第二の独立バッチにおけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。パネルｉで示される濃度は、パネルｂで示されるものを反映する。Ｊ）表示されたｓｉＲＮＡ試薬で７２時間処置したＯＰＣ－５細胞の代表的な画像の図である。核は、ＤＡＰＩで標識し（青色）、かつ希突起膠細胞は、ミエリン塩基性タンパク質を免疫染色する（緑色）ことによって示される。スケールバー、１００μｍ。 図５（Ａ～Ｎ）は、ＣＹＰ５１が機能的標的であり、それによってイミダゾール抗真菌剤が希突起膠細胞形成を強化することを示すグラフおよび画像を例示する。Ｋ）表示のプールされたｓｉＲＮＡ試薬で９６時間処置されたＯＰＣ（ＯＰＣ－１）の第二の独立バッチにおけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｌ）表示された試薬で処置してから７２時間目のＯＰＣ（ＯＰＣ－１）の第二の独立バッチから得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。両側ｔ検定、その個別の非標的化対照処置群と比較したｓｉＲＮＡ群に関して＊＊Ｐ＜０．０１。Ｍ）ラノステロール（４７μＭ）で７２時間処置したＯＰＣ－５ ＯＰＣの代表的な画像の図である。核は、ＤＡＰＩで標識し、かつ希突起膠細胞は、ミエリン塩基性タンパク質を免疫染色することによって表示した。 [0021]図６は、拡大されたコレステロール合成経路ダイアグラムを示す概略図を例示する。スクアレンエポキシド環化のカスケードは、ラノステロールシンターゼ（ＬＳＳ）によって触媒され、第１のステロール、ラノステロールを提供する。ラノステロールのコレステロールへのプロセシングは、Ｋａｎｄｕｔｓｃｈ－ＲｕｓｓｅｌｌまたはＢｌｏｃｈ経路のいずれかを介して進行することができる。これらの経路は同じ酵素およびプロセス基質を使用し、Ｃ２４二重結合が存在するか存在しないかの点のみが異なる。青色の中間体は、真性標準を使用した本発明者らのＧＣ／ＭＳベースのステロールプロファイリングアッセイで確認されている。マウスにおけるステロール１４－レダクターゼ活性は、ＴＭ７ＳＦ２およびＬＢＲの２つの遺伝子によって共有される。 [0022] 図７（Ａ－Ｋ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子標的化の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ａ）表示されたコレステロール生合成阻害剤で２４時間処置したＯＰＣにおける基本的なステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、コレステロール；右、デスモステロール。１条件あたりｎ＝２で反復する。阻害剤は、特に注記されていない限り、以下の用量で使用した：メバスタチン、ケトコナゾール、ＭＧＩ－３９、２．５μＭ；ＹＭ５３６０１、２μＭ；Ｒｏ４８－８０７１、アモロルフィン、ＴＡＳＩＮ－１、１００ｎＭ；ＡＹ９９４４、２００ｎＭ。Ｂ）ＯＰＣ（ＯＰＣ－１）の第二のバッチにおける基本的なステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、コレステロール；右、デスモステロール。１条件あたりｎ＝２で反復する。 図７（Ａ－Ｋ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子標的化の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｃ）表示されたコレステロール生合成阻害剤でＯＰＣを２４時間処置後、蓄積することが予想されるステロール中間体のＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｄ）表示されたコレステロール生合成阻害剤でＯＰＣ（ＯＰＣ－１）の第二の誘導を２４時間処置後、蓄積することが予想されるステロール中間体のＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。ＣおよびＤでは、コレステロール経路内のオフターゲット効果の指標である他のステロール中間体の蓄積は観察されなかった。 図７（Ａ－Ｋ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子標的化の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｅ）表示された小分子で７２時間処置したＯＰＣ－５細胞の代表的な画像の図である。すべての処置は、図２で示す最高濃度で行う。スケールバー、１００μｍ。 図７（Ａ－Ｋ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子標的化の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｆ）表示されたコレステロール経路阻害剤で処置してから７２時間目の第二のバッチＯＰＣ（ＯＰＣ－１）から得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図７（Ａ－Ｋ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子標的化の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｇ）３００ｎＭの表示されたコレステロール経路阻害剤で処置してから７２時間目のマウス一次ＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｈ）３００ｎＭの表示されたコレステロール生合成阻害剤で２４時間処置したマウス一次ＯＰＣにおける、ステロール中間体レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、アモロルフィンで処置した後の１４－デヒドロザイモステノールレベル；右、ＴＡＳＩＮ－１で処置した後のザイモステノールレベル。１条件あたりｎ＝２で反復する。 図７（Ａ－Ｋ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子標的化の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｉ）表示された用量のコレステロール生合成阻害剤で２４時間処置したＯＰＣ－１ ＯＰＣにおけるステロール中間体レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、アモロルフィンで処置した後の１４－デヒドロザイモステノールレベル；右、ＴＡＳＩＮ－１で処置した後のザイモステノールレベル。１条件あたりｎ＝２で反復する。パネルｉで示す濃度は、パネルｆで示すものを反映する。 図７（Ａ－Ｋ）は、コレステロール生合成経路における酵素の小分子標的化の、希突起膠細胞形成の強化に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｊ）表示された精製ステロール中間体で処置してから７２時間目のＯＰＣ－１ ＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。緑色の囲みは、パネルｅにおいて希突起膠細胞形成を強化する処置後に蓄積する代謝産物を強調する。Ｋ）表示された濃度のコレステロールで処置してから７２時間目のＯＰＣ－５およびＯＰＣ－１ ＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 [0023] 図８（Ａ～Ｉ）は、ＥＰＺ００５６８７および関連するＥＺＨ２阻害剤の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すプロット、グラフ、および画像を例示する。Ａ）３，０００種類の生物活性小分子のライブラリーを各２μＭで処置してから７２時間目のＯＰＣ（ＯＰＣ－１誘導）から得た（ＤＭＳＯ対照反復に対する）ＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。Ｂ）パネルａでスクリーニングされた生物活性ライブラリー中に含まれる４種類の構造類似体ＥＺＨ２阻害剤の図である。 図８（Ａ～Ｉ）は、ＥＰＺ００５６８７および関連するＥＺＨ２阻害剤の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すプロット、グラフ、および画像を例示する。Ｃ）表示された構造類似体ＥＺＨ２阻害剤で処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｄ）表示された構造類似体ＥＺＨ２阻害剤で処置してから７２時間目のＯＰＣの第二のバッチから得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｅ）ＥＰＺ００５６８７で処置してから７２時間目のマウス一次ＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図８（Ａ～Ｉ）は、ＥＰＺ００５６８７および関連するＥＺＨ２阻害剤の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すプロット、グラフ、および画像を例示する。Ｆ）表示されたＥＺＨ２阻害剤で７２時間処置したＯＰＣの代表的な画像の図である。すべての処置は、２μＭで行う。スケールバー、１００μｍ。 図８（Ａ～Ｉ）は、ＥＰＺ００５６８７および関連するＥＺＨ２阻害剤の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すプロット、グラフ、および画像を例示する。Ｇ）ＯＰＣを、１μＭの表示されたＥＺＨ２阻害剤で２４時間処置した後の２種類のステロール中間体のＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ザイモステノール；右、ザイモステロール。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｈ）ＯＰＣの第二の誘導を、１μＭの表示されたＥＺＨ２阻害剤で２４時間処置した後の２種類のステロール中間体のＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ザイモステノール；右、ザイモステロール。１条件あたりｎ＝２で反復する。 図８（Ａ～Ｉ）は、ＥＰＺ００５６８７および関連するＥＺＨ２阻害剤の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すプロット、グラフ、および画像を例示する。Ｉ）マウス一次ＯＰＣを２μＭのＥＰＺ００５６８７で２４時間処置した後の２種類のステロール中間体のＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ザイモステノール；右、ザイモステロール。１条件あたりｎ＝２で反復する。 [0024] 図９（Ａ～Ｈ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを例示する。Ａ）５μＭの均一な用量のケトコナゾール、生物活性スクリーニングによって同定された９種類の分子、および無作為に選択された９種類のライブラリーメンバーで処置してから７２時間目のＯＰＣの第二の誘導から得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図９（Ａ～Ｈ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを例示する。Ｂ）２μＭの、表示されたスクリーニングヒット化合物および無作為に選択されたライブラリーメンバーで２４時間処置したＯＰＣの第二のバッチにおけるザイモステロール、ザイモステノール、および１４－デヒドロザイモステノールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。分子は、標的化される酵素によって分類する（上位を標識する）。Ｃ）表示された用量のフルベストラントで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図９（Ａ～Ｈ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを例示する。Ｄ）２μＭのフルベストラントで２４時間処置したＯＰＣにおけるラノステロールレベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。Ｅ）表示されたすでに報告済みの希突起膠細胞形成エンハンサーで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ＞１反復あたり１，０００細胞を分析する。 図９（Ａ～Ｈ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを例示する。Ｆ）表示されたすでに報告済みの希突起膠細胞形成エンハンサーで処置してから７２時間目のＯＰＣの第二の誘導から得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｇ）表示された小分子で７２時間処置したＯＰＣの代表的な画像の図である。Ｇにおけるすべての処置は、パネルＥで示す最高濃度で行う。スケールバー、１００μｍ。 図９（Ａ～Ｈ）は、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間の阻害ステップは、ハイスループットスクリーニングによって同定された希突起膠細胞形成の多くの小エンハンサーに関する統一されたメカニズムであることを例示する。Ｈ）以下の用量の、表示されたすでに報告済みの希突起膠細胞形成エンハンサーで２４時間処置したＯＰＣの第二の誘導における２種類の代謝産物レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。ベンズトロピン、２μＭ；クレマスチン１μＭ；タモキシフェン１００ｎＭ；Ｕ５０４８８ ５μＭ；ベキサロテン、１μＭ；リオチロニン、３μＭ。左、ザイモステノール；右、コレステロール。 [0025] 図１０（Ａ～Ｍ）は、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節薬の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ａ）本研究において使用するムスカリン受容体拮抗薬の構造の図である。Ｂ）スクリーニング中に使用した濃度である２μＭのケトコナゾールまたは表示されたムスカリン受容体調節薬で処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図１０（Ａ～Ｍ）は、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節薬の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｃ）スクリーニング中に使用した濃度である２μＭのケトコナゾールまたは表示されたムスカリン受容体調節薬で処置してから７２時間目のＯＰＣの第二の独立バッチから得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｄ）遺伝子ＢＬＡｚｅｒＮＦＡＴ－ｂｌａＣＨＯ－Ｋ１細胞を使用してアッセイされた、表示された小分子（２μＭ）によるムスカリン受容体アイソフォームＭ１、Ｍ３、およびＭ５の阻害を示すヒートマップの図である。１条件あたりｎ＝２で反復する。 図１０（Ａ～Ｍ）は、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節薬の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｅ）Ｕ５０４８８（５μＭ）または表示されたムスカリン受容体調節薬（２μＭ）で２４時間処置されたＯＰＣ－５ ＯＰＣにおける３種類の代謝産物レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ザイモステノール；中央、コレステロール；右、デスモステロール。Ｆ）クレマスチン（１μＭ）または２μＭの表示されたムスカリン受容体調節薬で２４時間処置されたＯＰＣ－１ ＯＰＣにおける３種類の代謝産物レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ザイモステノール；中央、ザイモステロール；右、コレステロール。 図１０（Ａ～Ｍ）は、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節薬の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｇ）本研究において使用した２種類の選択的エストロゲン受容体調節薬の構造の図である。Ｈ）オスペミフェンおよびトレミフェンで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。 図１０（Ａ～Ｍ）は、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節薬の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｉ）オスペミフェンおよびトレミフェンで処置してから７２時間目のＯＰＣの第二の誘導から得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｊ）表示された小分子で７２時間処置したＯＰＣの代表的な画像の図である。すべての分子は３００ｎＭで処置した。スケールバー、１００μｍ。 図１０（Ａ～Ｍ）は、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節薬の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｋ）３００ｎＭのオスペミフェンおよびトレミフェンで２４時間処置されたＯＰＣにおける２種類の代謝産物レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ザイモステノール；右、コレステロール。Ｌ）３００ｎＭのオスペミフェンおよびトレミフェンで２４時間処置したＯＰＣの第二の誘導における２種類の代謝産物レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ザイモステノール；右、コレステロール。 [0025] 図１０（Ａ～Ｍ）は、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節薬の、細胞ＥＢＰ機能および希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｍ）Ｔ４７Ｄ細胞のエストロゲン依存的成長に対するオスペミフェンおよびトレミフェンの効果の図である。１条件あたりｎ＝３で反復する。すべてのグラフは、平均＋／－標準偏差を示す。 [0026] 図１１（Ａ～Ｄ）は、小分子処置の組合せの、希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像例示する。Ａ）リオチロニンおよび希突起膠細胞形成エンハンサーの表示された組合せで処置してから７２時間目のＯＰＣから生成されたＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。注記されていない限り、以下の濃度を使用した：ケトコナゾール、２．５μＭ；ベンズトロピン、２μＭ；クレマスチン２μＭ；タモキシフェン２００ｎＭ；リオチロニン、３μＭ。１回の処置条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｌｉｏ＝リオチロニン。 図１１（Ａ～Ｄ）は、小分子処置の組合せの、希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像例示する。Ｂ）リオチロニンおよび希突起膠細胞形成エンハンサーの表示された組合せで処置してから７２時間目のＯＰＣの第二のバッチから得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１回の処置条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｌｉｏ＝リオチロニン。Ｃ）ケトコナゾールおよび希突起膠細胞形成エンハンサーの表示された組合せで処置してから７２時間目のＯＰＣの第二の独立した誘導から得たＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率の図である。１回の処置条件あたりｎ＝４で反復し、かつ１反復あたり＞１，０００細胞を分析する。Ｋｅｔｏ＝ケトコナゾール。 図１１（Ａ～Ｄ）は、小分子処置の組合せの、希突起膠細胞形成に対する効果を示すグラフおよび画像例示する。Ｄ）表示された小分子で７２時間処置したＯＰＣの代表的な画像の図である。小分子濃度は、パネルａのままである。スケールバー、１００μｍ。 [0027] 図１２（Ａ～Ｄ）は、エレクトロスパンマイクロファイバーに沿って追跡しかつそれを包む希突起膠細胞の能力に対するステロール調節小分子の効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ａ）ＯＰＣをマイクロファイバー上に蒔き、表示された経路調節薬で１４日間処置した後のＭＢＰ＋希突起膠細胞の増加倍数の図である。ｎ＝２。スケールバー、５００μｍ。Ｂ）パネルａにおける処置に関するマイクロファイバー領域の大部分を表す低倍数画像の図である。緑色、ＭＢＰ；青色、ＤＡＰＩ。 図１２（Ａ～Ｄ）は、エレクトロスパンマイクロファイバーに沿って追跡しかつそれを包む希突起膠細胞の能力に対するステロール調節小分子の効果を示すグラフおよび画像を例示する。Ｃ）マイクロファイバーに沿って追跡するＭＢＰ＋希突起膠細胞の高分解画像の図である。緑色、ＭＢＰ；青色、ＤＡＰＩ。ケトコナゾール、２．５μＭ。スケールバー、５０μｍ。Ｄ）整列したマイクロファイバー上に播種し、ケトコナゾール（２．５μＭ）で１４日処置したＯＰＣの共焦点画像の図である。 [0028] 図１３（Ａ～Ｂ）は、希突起膠細胞強化小分子の、ヒト細胞およびヒト皮質スフェロイドにおけるステロールレベルに対する効果を示すグラフを例示する。Ａ）以下の濃度の表示された小分子で２４時間処置したヒト神経膠腫細胞（ＧＢＭ５２８）における３種類の代謝産物レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。タモキシフェン、１００ｎＭ、クレマスチン２μＭ、イフェンプロジル２μＭ、ケトコナゾール２．５μＭ、アモロルフィン１００ｎＭ。左、ラノステロール；中央、ザイモステノール；右、１４－デヒドロザイモステノール。１条件あたりｎ＝２で反復する。 [0028] 図１３（Ａ～Ｂ）は、希突起膠細胞強化小分子の、ヒト細胞およびヒト皮質スフェロイドにおけるステロールレベルに対する効果を示すグラフを例示する。Ｂ）２μＭの表示された小分子で２４時間処置したヒト皮質スフェロイドの２種類の独立したバッチにおける３種類の代謝産物レベルのＧＣ／ＭＳベースの定量化の図である。左、ラノステロール；中央、ザイモステノール；右、ザイモステロール。１条件あたりｎ＝３で反復する。 [0029]希突起膠細胞の形成を強化し、かつＯＰＣにおけるステロールレベルを調節することを示す小分子の構造を例示する。分子は、阻害された酵素によって分類される：ＣＹＰ５１、上；ステロール１４－レダクターゼ、中央；ＥＢＰ、下。 [0030]ＧＣＭＳアッセイで検証された生物活性スクリーニングによるヒット化合物は、少なくともコレステロール合成の３つのステップを阻害し、ＯＰＣの分化をもたらすことを例示する。 [0031]ベンゼン誘導体シス－Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ－エチル－３－（３－クロロ－４－シクロヘキシルフェニル）プロパ－２－エニルアミンの、希突起膠細胞形成およびＥＢＰ阻害に対する効果を示すグラフを例示する。
[0032]便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で用いられる特定の用語をここにまとめる。別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。
[0033]冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的語のうちの１つまたは１超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つのエレメントまたは１つを超えるエレメントを意味する。
[0034]「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包含的なオープンセンスで使用され、追加の要素を含んでいてもよいことを意味する。本明細書において使用される「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」、「例えば（ｅ．ｇ．）」という用語は非限定的であり、かつ例示目的のためのものにすぎない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「これらに限定されないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」は、区別せずに使用される。
[0035]本明細書において使用される「または」という用語は、文脈上明らかに別の意味を示さない限り、「および／または」を意味すると理解されたい。
[0036]本明細書において使用される「約」または「およそ」という用語は、言及される量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％ほど異なる量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。１つの実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、言及される量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
[0037]本出願の化合物のいくつかの構造は、不斉（キラル）炭素または硫黄原子を含むことに留意されたい。したがって、そのような非対称性から生じる異性体は、特に指示がない限り本明細書において含まれると理解されたい。このような異性体は、古典的な分離
技術によって、かつ立体化学的に制御された合成によって、実質的に純粋な形態で得ることができる。本出願の化合物は、立体異性体の形態で存在していてもよく、したがって、個々の立体異性体としてまたは混合物として生成することができる。
[0038]「異性」という用語は、同一の分子式を有するが、それらの原子の結合の性質もしくは配列、または空間におけるその原子の配置が異なる化合物を意味する。空間においてそれらの原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と称する。互いの鏡像ではない立体異性体は、「ジアステレオ異性体」と称し、重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は、「鏡像異性体」またはときに光学異性体と称する。同一ではない４個の置換基に結合した炭素原子は、「キラル中心」と称し、一方、異なる３個または４個の置換基に結合した硫黄、例えば、スルホキシドまたはスルフィンイミドは、同様に「キラル中心」と称する。
[0039]「キラル異性体」という用語は、少なくとも１つのキラル中心を有する化合物を意味する。それは、逆のキラリティーの２つの鏡像異性体の形態を有し、かつ個々の鏡像異性体としてまたは鏡像異性体の混合物としてのいずれかで存在していてもよい。逆のキラリティーの個々の鏡像異性体の形態を等量で含む混合物は、「ラセミ混合物」と称する。１つを超えるキラル中心を有する化合物は、２ｎ－１個の鏡像異性体対を有し、式中、ｎはキラル中心の数である。１つを超えるキラル中心を有する化合物は、個々のジアステレオマーとして、または「ジアステレオマー混合物」と称するジアステレオマーの混合物としてのいずれかで存在していてもよい。１つのキラル中心が存在するときに、立体異性体は、そのキラル中心の絶対配置（ＲまたはＳ）によって特徴付けられてもよい。あるいは、１つまたは複数のキラル中心が存在するときに、立体異性体は、（＋）または（－）として特徴付けられてもよい。絶対配置は、キラル中心に結合した置換基の空間における配置を指す。検討中のキラル中心へ結合した置換基は、Ｃａｈｎ、ＩｎｇｏｌｄおよびＰｒｅｌｏｇの配列規則に従ってランク付けされる（Ｃａｈｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒ．Ｅｄｉｔ．１９６６年、５、３８５頁；訂正５１１頁；Ｃａｈｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９６６、７８、４１３頁；ＣａｈｎおよびＩｎｇｏｌｄ、ＪＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５１（Ｌｏｎｄｏｎ）、６１２頁；Ｃａｈｎら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ １９５６年、１２、８１頁；Ｃａｈｎ、Ｊ．、Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃ．１９６４年、４１、１１６頁）。
[0040]「幾何異性体」という用語は、その存在が二重結合の周囲の妨害された回転に起因するジアステレオマーを意味する。これらの配置は、その名称で、接頭辞のシスおよびトランス、またはＺおよびＥによって区別され、これらの接頭辞は、基が、Ｃａｈｎ－Ｉｎｇｏｌｄ－Ｐｒｅｌｏｇ規則に従って、分子の二重結合の同側または反対側にあることを示す。さらに、本出願で検討される構造体および他の化合物としては、そのすべてのアトロプ異性体がある。
[0041]「アトロプ異性体」という用語は、あるタイプの立体異性体であり、その中で、２種類の異性体の原子は、空間において異なって配列されている。アトロプ異性体は、その存在が、中心結合の周囲の大きな基の回転が妨害されることによって引き起こされる制限された回転に起因する。このようなアトロプ異性体は、典型的には混合物として存在するが、クロマトグラフィー技術における近年の進歩の結果、選択する場合、２つのアトロプ異性体混合物を分離することが可能になった。
[0042]「結晶多形」または「多形」または「結晶形態」という用語は、化合物（またはその塩もしくは溶媒和物）が、そのすべてが同じ元素組成を有する異なる結晶充填配置に結晶化できる結晶構造を意味する。異なる結晶形態は、通常異なるＸ線回折パターン、赤外線スペクトル、融点、密度硬度、結晶形状、光学的および電気的特性、安定性ならびに
溶解度を有する。再結晶化溶媒、結晶化速度、貯蔵温度、および他の因子が、１つの結晶形態を優位にする場合がある。化合物の結晶多形は、異なる条件下で結晶化することによって調製することができる。
[0043]「誘導体」という用語は、共通のコア構造を有し、かつ本明細書において述べるような様々な基で置換された化合物を指す。
[0044]「バイオアイソスター」という用語は、原子のまたは原子群の、他の広範に類似した原子または原子群との交換より生じる化合物を指す。バイオアイソステリックな置換えの目的は、親化合物と類似する生物学的特性を有する新規の化合物を生成することである。バイオアイソステリックな置換えは、物理化学にまたは位相幾何学に基づいていてもよい。カルボン酸バイオアイソスターの例としては、アシルスルホンイミド、テトラゾール、スルホネート、およびホスホネートがある。例えば、ＰａｔａｎｉおよびＬａＶｏｉｅ、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６、３１４７～３１７６頁（１９９６年）を参照のこと。
[0045]「非経口投与」および「非経口的に投与する」という句は、当技術分野において認識されている用語であり、かつ経腸投与および局所投与、例えば注射以外の投与様式を含み、かつ限定するものではないが、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内および幹内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）の注射および点滴を含む。
[0046]「処置する」という用語は、当技術分野において認識されており、かつ対象における疾患、障害または状態を阻害すること、例えば、その進行を妨げること；かつ疾患、障害または状態を軽減すること、例えば、疾患、障害および／または状態の退行をもたらすことを含む。疾患または状態を処置することは、たとえ根本的な病態生理が影響を受けなくても、特定の疾患または状態のうちの少なくとも１つの症状を改善することを含む。
[0047]「防止する」という用語は、当技術分野において認識されており、かつ疾患、障害および／または状態に罹りやすい場合があるが、まだそれを呈すると診断されていない疾患、障害または状態が対象において発生するのを停止することを含む。疾患と関連する状態を防止することは、疾患が診断された後であるが、状態が診断される前に状態が発生するのを停止することを含む。
[0048]「医薬組成物」という用語は、対象に投与するために好適な形態の、開示された薬剤を含む配合剤を指す。好ましい実施形態において、医薬組成物は、バルクでまたは単位剤型で存在する。単位剤型は、様々な形態のうちのいずれかであり、例えば、カプセル剤、ＩＶバッグ、錠剤、単一ポンプのエアロゾル吸入器（ｓｉｎｇｌｅ ｐｕｍｐ ｏｎ
ａｎ ａｅｒｏｓｏｌｉｎｈａｌｅｒ）、またはバイアルを含む。組成物の単位用量中の活性成分（例えば、開示された化合物またはその塩の配合剤）の量は、効果的な量であり、かつ関与する特定の処置に従って変化する。当業者であれば、患者の年齢および状態によって投薬量に所定の変更を行うことがときとして必要であることを理解するであろう。投薬量もまた、投与経路に依存することになる。様々な経路が検討され、経口、経肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、吸入などが含まれる。本明細書において述べる化合物の局所または経皮投与のための剤型としては、粉末剤、噴霧剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、霧状化化合物、および吸入剤がある。好ましい実施形態において、活性化合物は、薬学的に許容される担体と、かつ必要とされる任意の保存料、緩衝液、または噴射剤と、滅菌条件下で混合される。
[0049]「フラッシュドーズ（ｆｌａｓｈ ｄｏｓｅ）」という用語は、剤型を急速に分散する化合物配合剤を指す。
[0050]「即時放出」という用語は、比較的短い時間での、一般的に最大約６０分での剤型からの化合物の放出として定義される。「調節放出」という用語は、遅延放出、持続放出、およびパルス放出を含むと定義される。「パルス放出」という用語は、剤型からの薬物の一連の放出として定義される。「徐放」または「持続放出」という用語は、剤型からの化合物の長時間にわたる連続的な放出として定義される。
[0051]「薬学的に許容される」という句は、当技術分野において認識されている。特定の実施形態において、その用語は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当な利点／リスク比率に見合った、組成物、ポリマーおよび別の材料および／または剤型を含む。
[0052]「薬学的に許容される担体」という句は、当技術分野において認識されており、例えば、薬学的に許容される材料、組成物、または液体もしくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくは任意の対象組成物を一方の臓器もしくは身体の一部から他方の臓器もしくは身体の一部へ送達または輸送することに関与する封入材料などのビヒクルが含まれる。各担体は、対象組成物の他の成分に適合し、かつ患者に対して有害ではないという意味で「許容され」なければならない。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、非発熱性である。薬学的に許容される担体として役割を果たし得る材料のいくつかの例としては、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）トラガカント末；（５）モルト；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；（９）落花生油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱因子不含水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝液；および（２１）医薬配合剤で用いられる他の非毒性適合物質がある。
[0053]本出願の化合物は、さらに塩を形成することができる。これらの形態のすべてがまた、本明細書において検討される。
[0054]化合物の「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、かつ親化合物の所望の薬理学的活性を有する塩を意味する。例えば、塩は、酸付加物塩とすることができる。酸付加物塩の１つの実施形態は、塩酸塩である。薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。一般的に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸または遊離塩基形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水中でまたは有機溶媒中で、または２つの混合物中で反応させることによって調製することができ；一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）で見い出される。
[0055]本明細書で述べる化合物はまた、エステル、例えば、薬学的に許容されるエステルとして調製することができる。例えば、化合物中のカルボン酸官能基は、その対応するエステル、例えば、メチル、エチル、または他のエステルへ変換することができる。また、化合物中のアルコール基を、その対応するエステル、例えば、アセテート、プロピオネート、または他のエステルへ変換することができる。
[0056]本明細書で述べる化合物はまた、プロドラッグ、例えば、薬学的に許容されるプロドラッグとして調製することができる。「プロ－ドラッグ」および「プロドラッグ」という用語は、本明細書において区別せずに使用され、ｉｎ ｖｉｖｏで活性親薬物を放出する任意の化合物を指す。プロドラッグは、医薬品の多くの所望の品質（例えば、溶解度、バイオアベイラビリティ、製造など）を強化することが既知であるため、化合物はプロドラッグの形態で送達することができる。したがって、本明細書で述べる化合物は、ここで主張される化合物のプロドラッグ、それを送達する方法、およびそれを含む組成物を含むことを意図する。「プロドラッグ」は、そのようなプロドラッグを対象に投与したときに、ｉｎ ｖｉｖｏで活性親薬物を放出する任意の共有結合された担体を含むことを意図する。プロドラッグは、修飾が、所定の操作またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで切断され、親化合物になるような方法で、化合物に存在する官能基を修飾することによって調製される。プロドラッグとしては、ヒドロキシ、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ、またはカルボニル基が、ｉｎ ｖｉｖｏで切断され、遊離ヒドロキシル、遊離アミノ、遊離スルフヒドリル、遊離カルボキシまたは遊離カルボニル基をそれぞれ形成し得る任意の基に結合された化合物がある。
[0057]プロドラッグの例としては、これらに限定されるものではないが、式Ｉの化合物中のヒドロキシ官能基のエステル（例えば、アセテート、ジアルキルアミノアセテート、ホルメート、ホスフェート、スルフェート、およびベンゾエート誘導体）およびカルバメート（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノカルボニル）、カルボキシル官能基のエステル基（例えば、エチルエステル、モルホリノエタノールエステル）、アミノ官能基のＮ－アシル誘導体（例えば、Ｎ－アセチル）Ｎ－マンニッヒ塩基、シッフ塩基およびエナミノン、ケトンおよびアルデヒド官能基のオキシム、アセタール、ケタールおよびエノールエステルなどがある。Ｂｕｎｄｅｇａａｒｄ、Ｈ．「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」１～９２頁、Ｅｌｅｓｅｖｉｅｒ、ＮｅｗＹｏｒｋ－Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５年）を参照のこと。
[0058]「保護基」という用語は、分子の反応性基へ結合するときに、その反応性をマスクし、減少させまたは防ぐ原子集団を指す。保護基の例は、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｙ、（Ｗｉｌｅｙ、第２版 １９９１年）；ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＨａｒｒｉｓｏｎら、Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１～８巻（Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９７１～１９９６年）；およびＫｏｃｉｅｎｓｋｉ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ、（Ｖｅｒｌａｇ、第３版 ２００３年）で見い出すことができる。
[0059]「アミン保護基」という用語は、アミン、アミド、または他の窒素含有部分を、特定の化学反応の条件に対して実質的に不活性である異なる化学基へ変換する官能基を意味することを意図する。アミン保護基は、好ましくは、良好な収率で、分子の他の官能基に影響を与えない条件下で、容易にかつ選択的に除去される。アミン保護基の例としては、これらに限定されるものではないが、ホルミル、アセチル、ベンジル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ－メトキシベンジル、メトキシメチル、トシル、トリフルオロアセチル、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、フルオレニル－メチルオキシカルボニル、２－トリメチルシリル－エチオキシカルボニル（ｅｔｈｙｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、１－メチル－１－（４－ビフェニリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、２－トリメチルシリル－エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換トリチル基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロ－ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）などがある。当業者であれば、他の好適なアミン保護基を同定することができる。
[0060]代表的なヒドロキシ保護基としては、ベンジルなどのヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化のいずれかをされたもの、およびトリチルエーテル、ならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルがある。
[0061]さらに、本明細書において述べる化合物の塩は、水和または非水和（無水）のいずれかの形態でまたは他の溶媒分子との溶媒和物として存在することができる。水和物の非限定的な例としては、一水和物、二水和物などがある。溶媒和物の非限定的な例としては、エタノール溶媒和物、アセトン溶媒和物などがある。
[0062]「溶媒和物」という用語は、化学量論量のまたは非化学量論量のいずれかの溶媒を含む溶媒付加形態を意味する。いくつかの化合物は、結晶質固体状態中に一定のモル比の溶媒分子を捕捉し、こうして、溶媒和物を形成する傾向を有する。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物であり、溶媒がアルコールであるとき、形成される溶媒和物はアルコレートである。水和物は、１つまたは複数の水分子の、物質のうちの１つとの組合せによって形成され、その中で水はＨ２Ｏとしてその分子状態を保持しており、そのような組合せが１つまたは複数の水和物を形成することができる。
[0063]本明細書で述べる化合物、塩およびプロドラッグは、いくつかの互変異性体形態で存在することができ、エノールおよびイミン形態、ならびにケトおよびエナミン形態、ならびに幾何異性体、ならびにこれらの混合物を含む。互変異性体は、溶液中に互変異性体セットの混合物として存在する。固体形態では、通常、１つの互変異性体が優位を占める。１つの互変異性体が記載される場合があっても、本出願は、本発明の化合物のすべての互変異性体を含む。互変異性体は、平衡状態で存在し、かつ一方の異性体形態から他方の異性体形態へ容易に変換される２つ以上の構造異性体のうちの１つである。この反応によって、水素原子が形式上移動し、同時に隣接する共役二重結合の転移が起こる。互変異性化が可能な溶液において、互変異性体の化学的平衡状態が達成されるはずである。互変異性体の正確な比率は、いくつかの因子に依存し、その因子としては、温度、溶媒、およびｐＨがある。互変異性化によって相互交換可能である互変異性体の概念は、互変異性と称される。
[0064]可能である様々なタイプの互変異性のうち、２つが一般的に観察される。ケト－エノール互変異性では、電子および水素原子の同時シフトが起こる。
[0065]互変異性化は、塩基：１．脱プロトン化；２．非局在化陰イオンの形成（例えば、エノレート）；３．異なる位置の陰イオンでのプロトン化；酸：１．プロトン化；２．非局在化陽イオンの形成；３．陽イオンに近接した異なる位置での脱プロトン化によって触媒することができる。
[0066]「類似体」という用語は、他の化学的化合物と構造的に類似しているが、組成がわずかに異なる化学的化合物を指す（１つの原子が異なる元素の原子で置き換えられた、または特定の官能基の存在下の、または一方の官能基が他方の官能基で置き換えられた場合）。したがって、類似体は、参照化合物に対して、機能および外観の点で類似しているまたはこれらに相当するが、構造または起源の点ではそうではない化合物である。
[0067]本明細書において使用される「希突起膠細胞前駆体細胞」（oligodendrocyte precursor cell）または「ＯＰＣ」という用語は、新規の希突起膠細胞を生成することができる神経プロジェニター細胞を指す。希突起膠細胞前駆体細胞は、多数の表面抗原の発現によって同定することができる。例えば、血小板由来成長因子アルファ受容体サブユニット（ＰＤＧＦＲα）、ＮＧ２コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、およびガングリオシドＧＤ３として既知の表面抗原を通常使用し、希突起膠細胞前駆体細胞を同定する。
[0068]未成熟希突起膠細胞前駆体は、発生中の脳の腹側領域で、共通のグリアプロジェニターから生成される。未成熟細胞は活発に移動し、増殖し、ＣＮＳに集合し、ミエリン形成前希突起膠細胞（Ｏ４＋）へ最終的に分化する。希突起膠細胞前駆体の分化および成熟は、複数のプロセスの延長、細胞体サイズの増加、およびミエリンの形成によって特徴付けられる。
[0069]対象の方法によって処置される「患者」、「対象」、または「宿主」は、ヒトまたは哺乳動物、魚類、鳥類、爬虫類、または両生類などの非ヒト動物のいずれかを意味していてもよい。したがって、本明細書において開示される方法の対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、モルモットまたは齧歯動物とすることができる。その用語は特定の年齢または性別を示さない。したがって、雄であっても雌であっても、成体および新生仔対象ならびに胎仔が含まれることを意図する。１つの態様において、対象は哺乳動物である。患者は、疾患または障害に罹患している対象を指す。
[0070]「予防的」または「治療的」処置という用語は、当技術分野において認識されており、かつ対象組成物のうちの１つまたは複数の宿主への投与を含む。望ましくない状態の臨床的兆候（例えば、これらに限定されないが、ミエリン形成撹乱、ミエリン欠損、ミエリン損失および無効なミエリン修復などの宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の前に投与する場合、処置は予防的である、すなわち、望ましくない状態の発症に対して宿主を保護するが、望ましくない状態の兆候の後に投与する場合、処置は治療的である（すなわち、その現存する望ましくない状態または副作用を低減する、改善する、または安定化させることを意図する）。
[0071]「治療剤」、「薬物」、「医薬」および「生物活性物質」という用語は、当技術分野において認識されており、かつ患者または対象において局所的にまたは全身的に作用し、疾患または状態を処置する、生物学的、生理学的、または薬理学的活性物質である分子および他の薬剤を含む。その用語としては、限定するものではないが、これらの薬学的に許容される塩およびプロドラッグを含む。このような薬剤は、酸性、塩基性、または塩であってもよく；これらは、水素結合することができる中性分子、極性分子、または分子複合体であってもよく；これらは、患者または対象に投与したときに、生物学的に活性化されるエーテル、エステル、アミドなどの形態のプロドラッグであってもよい。
[0072]「治療有効量」または「薬学的に効果的な量」という句は、当技術分野において認識されている用語である。特定の実施形態において、その用語は、任意の内科的治療に適用可能な妥当な利点／リスク比率でいくつかの所望の効果を生成する治療剤の量を指す。特定の実施形態において、その用語は、特定の治療レジメンの標的を削除、減少または維持するために必要なまたは十分な量を指す。効果的な量は、治療される疾患または状態、投与される特定の標的化構築物、対象のサイズまたは疾患もしくは状態の重症度などの因子によって変更してもよい。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定してもよい。特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏで使用するための治療剤の治療有効量は、おそらく多数の因子に依存することになり、ポリマーの化学的および物理的特性の一部に依存するであろう薬剤のポリマーマトリックスからの放出速度；薬剤本体；投与の様式および方法；ならびに薬剤に加えてポリマーマトリックスに組み込まれた任意の他の材料が含まれる。
[0073]「ＥＤ５０」という用語は、当技術分野において認識されている。特定の実施形
態において、ＥＤ５０は、その最大応答または効果の５０％をもたらす薬物の用量、あるいは、試験対象または製剤のあらかじめ決定された応答を５０％でもたらす用量を意味する。「ＬＤ５０」という用語は、当技術分野において認識されている。特定の実施形態において、ＬＤ５０は、試験対象の５０％で致死的である薬物の用量を意味する。「治療インデックス」という用語は当技術分野において認識されている用語であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０として定義される薬物の治療インデックスを指す。
[0074]「ＩＣ５０」または「５０％最大阻害濃度」という用語は、生物学的プロセス、またはタンパク質、サブユニット、細胞小器官、リボヌクレオタンパク質などを含むプロセスの構成成分を５０％阻害するために必要とされる物質（例えば、化合物または薬物）の濃度を指すことを意図する。
[0075]任意の化学的化合物に関しては、本出願は、本発明の化合物において出現する原子のすべての同位体を含むことを意図する。同位体としては、同じ原子番号であるが異なる質量数を有する原子のものがある。一般的な例として、かつ限定するものではないが、水素の同位体としては、トリチウムおよびジューテリウムがあり、炭素の同位体としては、Ｃ－１３およびＣ－１４がある。
[0076]置換基への結合が、環内の２個の原子を連結する結合を横切るように示されるときに、そのような置換基は、環内の任意の原子に結合することができる。置換基が、そのような置換基が所与の式の化合物の残りの部分にそれを介して結合する原子を示すことなく列挙されるとき、そのような置換基は、そのような置換基における任意の原子を介して結合することができる。置換基および／または可変基の組合せが許容されるが、そのような組合せが安定な化合物をもたらす場合に限る。
[0077]原子または化学的部分に続いて下付き文字の数値範囲（例えば、Ｃ１～６）があるときに、その範囲ならびにすべての中間範囲内の各数字を包含することを意味する。例えば、「Ｃ１～６アルキル」は、１、２、３、４、５、６、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、および５～６個の炭素を有するアルキル基を含むことを意味する。
[0078]「アルキル」という用語は、分岐鎖（例えば、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル）と直鎖（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル）の両方、ならびにシクロアルキル（例えば、脂環式）基（例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル）、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含むことを意図する。このような脂肪族炭化水素基は、特定数の炭素原子を有する。例えば、Ｃ１～６アルキルは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、およびＣ６アルキル基を含むことを意図する。本明細書において使用される「低級アルキル」は、炭素鎖の骨格中に１～６個の炭素原子を有するアルキル基を指す。「アルキル」は、１つまたは複数の炭化水素骨格の炭素原子に代わって酸素、窒素、硫黄またはリン原子を有するアルキル基をさらに含む。特定の実施形態において、直鎖または分岐鎖アルキルは、その骨格内に６個以下、例えば４個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖に関してはＣ１～Ｃ６、分岐鎖に関してはＣ３～Ｃ６）。同様に、特定のシクロアルキルは、環構造中に５個または６個の炭素など、その環構造中に、３～８個の炭素原子を有する。
[0079]「アルケニル」という用語は、エテニル、ｎ－プロペニル、イソプロペニル、ｎ－ブテニル、イソブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロオクテニルなどの、少なくとも１つの二重結合を含む、２～約２４個の炭素原子の直鎖状、分岐状
または環状の炭化水素基を指す。全体的に、この場合もやはり必要とされるわけではないが、アルケニル基は、２～約１８個の炭素原子、より詳細には２～１２個の炭素原子を含むことができる。「低級アルケニル」という用語は、２～６個の炭素原子のアルケニル基指し、かつ「シクロアルケニル」という特定の用語は、好ましくは５～８個の炭素原子を有する環状アルケニル基を意図する。「置換アルケニル」という用語は、１つまたは複数の置換基で置換されたアルケニルを指し、かつ「ヘテロ原子含有アルケニル」および「ヘテロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアルケニルまたはヘテロシクロアルケニル（例えば、ヘテロシクロヘキセニル）を指す。特に指示がない限り、「アルケニル」および「低級アルケニル」という用語は、直鎖状、分岐状、環状、非置換、置換、および／またはヘテロ原子含有のアルケニルおよび低級アルケニルをそれぞれ含む。
[0080]「アルキニル」という用語は、エチニル、ｎ－プロピニルなどの少なくとも１つの三重結合を含む２～２４個の炭素原子の直鎖状または分岐状の炭化水素基を指す。全体的に、この場合もやはり必要とされるわけではないが、アルキニル基は、２～約１８個の炭素原子を含むことができ、より詳細には２～１２個の炭素原子を含むことができる。「低級アルキニル」という用語は、２～６個の炭素原子のアルキニル基を意図する。「置換アルキニル」という用語は、１つまたは複数の置換基で置換されたアルキニルを指し、かつ「ヘテロ原子含有アルキニル」および「ヘテロアルキニル」という用語は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置き換えられたアルキニルを指す。特に指示がない限り、「アルキニル」および「低級アルキニル」という用語は、直鎖状、分岐状、非置換、置換、および／またはヘテロ原子含有のアルキニルおよび低級アルキニルをそれぞれ含む。
[0081]「アルキル」、「アルケニル」、および「アルキニル」という用語は、ジラジカルである、すなわち２つの結合点を有する部分を含むことを意図する。そのようなアルキル部分、すなわちジラジカルの非限定的な例は、－－ＣＨ２ＣＨ２－－、すなわち、各末端の炭素原子を介して残りの分子に共有結合されるＣ２アルキル基である。
[0082]「アルコキシ」という用語は、単一の末端エーテル結合を通して結合されるアルキル基を指す；すなわち、「アルコキシ」基は、－－Ｏ－アルキルとして表されていてもよく、式中、アルキルは上記で定義されたとおりである。「低級アルコキシ」基は、１～６個の炭素原子を含むアルコキシ基を意図し、かつ例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシ、ｔ－ブチルオキシなどを含む。本明細書において「Ｃ１～Ｃ６アルコキシ」または「低級アルコキシ」として同定された好ましい置換基は、１～３個の炭素原子を含み、特に好ましいそのような置換基は、１個または２個の炭素原子を含む（すなわち、メトキシおよびエトキシ）。
[0083]「アリール」という用語は、単一の芳香環、または（異なる芳香環が、メチレンまたはエチレン部分などの共通の基に結合するように）一緒に縮合した、直接的に結合した、もしくは間接的に結合した複数の芳香環を含む芳香族置換基を指す。アリール基は、５～２０個の炭素原子を含むことができ、特に好ましいアリール基は、５～１４個の炭素原子を含むことができる。アリール基の例としては、ベンゼン、フェニル、ピロール、フラン、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、およびピリミジンなどがある。さらに、「アリール」という用語は、多環式アリール基、例えば、三環式、二環式、例えば、ナフタレン、ベンズオキサゾール、ベンゾジオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチオフェン、メチレンジオキシフェニル、キノリン、イソキノリン、ナフトリジン（ｎａｐｔｈｒｉｄｉｎｅ）、インドール、ベンゾフラン、プリン、ベンゾフラン、デアザプリン、またはインドリジンを含む。環構造中にヘテロ原子を有するこれらのアリール基はまた、「アリール複素環」、「
複素環」、「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と称してもよい。芳香環は、１つまたは複数の環の位置において、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、アルキルスルフィニル、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの上述のような置換基で置換することができる。アリール基をまた、芳香族ではない脂環式環または複素環で縮合または橋掛けし、その結果、多環式系（例えば、テトラリン、メチレンジオキシフェニル）を形成することができる。特に指示がない限り、「アリール」という用語は、非置換、置換、および／またはヘテロ原子含有の芳香族置換基を含む。
[0084]「アルカリル」という用語は、アルキル置換基を有するアリール基を指し、「アラルキル」という用語は、アリール置換基を有するアルキル基を指し、ここで、「アリール」および「アルキル」は、上記で定義されたとおりである。例示的なアラルキル基は、６～２４個の炭素原子を含み、特に好ましいアラルキル基は、６～１６個の炭素原子を含む。アラルキル基の例としては、限定するものではないが、ベンジル、２－フェニル－エチル、３－フェニル－プロピル、４－フェニル－ブチル、５－フェニル－ペンチル、４－フェニルシクロヘキシル、４－ベンジルシクロヘキシル、４－フェニルシクロヘキシルメチル、４－ベンジルシクロヘキシルメチルなどがある。アルカリル基としては、例えば、ｐ－メチルフェニル、２，４－ジメチルフェニル、ｐ－シクロヘキシルフェニル、２，７－ジメチルナフチル、７－シクロオクチルナフチル、３－エチル－シクロペンタ－１，４－ジエンなどがある。
[0085]「ヘテロシクリル」または「複素環式基」という用語は、１つまたは複数のヘテロ原子を含む、閉環構造、例えば３～１０員または４～７員環構造を含む。「ヘテロ原子」は、炭素または水素以外の任意の元素の原子を含む。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄およびリンがある。
[0086]ヘテロシクリル基は、飽和または不飽和とすることができ、かつピロリジン、オキソラン、チオラン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノンおよびピロリジノンなどのラクタム、スルタム、およびスルトンを含む。ピロールおよびフランなどの複素環式基は、芳香族特性を有することができる。これらとしては、キノリンおよびイソキノリンなどの縮合環構造がある。複素環式基の別の例としては、ピリジンおよびプリンがある。複素環は１つまたは複数の位置において、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェート、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェート、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、または芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの上述のような置換基で置換することができる。複素環式基はまた、１つまたは複数の構成成分原子において、例えば、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルアミノ、低級アルキルカルボキシル、ニトロ、ヒドロキシル、－－ＣＦ３、または－－ＣＮなどで置換することができる。
[0087]「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。「対イオン」は、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、水酸化物、アセテート、およびスルフェートなどの小さな負電荷種を表すために使用される。
[0088]「置換アルキル」、「置換アリール」などにあるような「置換」という用語は、前述の定義のうちのいくつかで示唆されるように、アルキル、アリール、または別の部分において、炭素（または他の）原子に結合した少なくとも１つの水素原子が、１つまたは複数の非水素置換基で置き換えられることを意味する。そのような置換基の例としては、限定するものではないが：ハロ、ヒドロキシル、シリル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、モノ－（Ｃ１～Ｃ２４アルキル）置換カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、ジ－（Ｃ１～Ｃ４アルキル）置換カルバモイル（－（ＣＯ）－－Ｎ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル）２）、モノ置換アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－ＣＮ）、イソシアノ（－Ｎ＋Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－－ＣＮ）、イソシアナト（－ＯＮ＋Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－ＣＮ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－（ＣＯ）－－Ｈ）、チオホルミル（－（ＣＳ）－Ｈ）、アミノ（－ＮＨ２）、モノ－およびジ－（Ｃ１～Ｃ２４アルキル）置換アミノ、モノ－およびジ－（Ｃ５～Ｃ２０アリール）置換アミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イミノ（－ＣＲ＝ＮＨ、式中、Ｒ＝水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキルなど）、アルキルイミノ（－－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）、およびホスフィノ（－ＰＨ２）；およびヒドロカルビル部分Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、およびＣ６～Ｃ２４アラルキルなどの官能基がある。
[0089]さらに、前述の官能基は、特定の基が認められる場合、１つまたは複数の追加の官能基でまたは上記で特に列挙されたものなどの１つまたは複数のヒドロカルビル部分で
さらに置換してもよい。同様に、上述のヒドロカルビル部分は、１つまたは複数の官能基または特に列挙されたものなどの追加のヒドロカルビル部分でさらに置換してもよい。
[0090]「置換」という用語が、可能な置換基のリストの前に出現するときに、それは、その用語がその基のすべてのメンバーに適用されることを意図する。例えば、「置換アルキル、アルケニル、およびアリール」という句は、「置換アルキル、置換アルケニル、および置換アリール」として判断されたい。同様に、「ヘテロ原子含有」という用語が、可能なヘテロ原子含有基のリストの前に出現するときに、それは、その用語がその基のすべてのメンバーに適用されることを意図する。例えば、「ヘテロ原子含有アルキル、アルケニル、およびアリール」という句は、「ヘテロ原子含有アルキル、置換アルケニル、および置換アリール」として判断されたい。
[0091]「任意の」または「任意選択で」は、その後述べられる状況が起きても起きなくてもよいことを意味し、したがって、記載には、状況が起きた場合およびそれが起きなかった場合が含まれる。例えば、「任意選択で置換された」という句は、非水素置換基が所与の原子に存在しても存在しなくてもよいことを意味し、したがって、記載には、非水素置換基が存在する構造および非水素置換基が存在しない構造が含まれる。
[0092]「安定な化合物」および「安定な構造」という用語は、単離、および必要に応じて反応混合物からの精製、および有効な治療剤への配合の中、残存するのに十分に頑強である化合物を示すことを意味する。
[0093]「遊離化合物」という用語は、非結合状態にある化合物を述べるために本明細書において使用される。
[0094]全体にわたって、記載において、組成物が、特定の構成成分を有する（ｈａｖｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として述べられる場合、組成物はまた、列挙された構成成分から実質的になる、またはこれらからなることが考慮される。同様に、方法またはプロセスが特定の方法ステップを有する（ｈａｖｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として述べられる場合、プロセスはまた、列挙されたプロセシングステップから実質的になる、またはこれらからなる。さらに、本明細書で述べる組成物および方法が操作可能なままである限りは、ステップの順序または特定の作用を実施するための順序は、重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上のステップまたは作用は、同時に実施することができる。
[0095]「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを通して、配列特異的様式で、ＤＮＡへ結合したタンパク質、またはさらに大きいタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略されることが多い。
[0096]「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥの、その同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には、３３～３５個のアミノ酸長であり、かつ天然発生的ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と、少なくともいくつかの配列相同性を示す。
[0097]ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、「遺伝子操作」し、例えば、天然発生的なジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の遺伝子
操作（１つまたは複数のアミノ酸を変化させる）を介して所定のヌクレオチド配列に結合することができる。したがって、遺伝子操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然発生的であるタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、自然には存在しないタンパク質であり、その設計／組成は主に合理的基準から生じる。設計のための合理的基準としては、置換規則ならびに現存するＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を保存しているデータベース内の情報をプロセシングするためのコンピュータ化アルゴリズムの適用がある。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号および同第８，５８５，５２６号を参照のこと；また、国際公開第９８／５３０５８号；国際公開第９８／５３０５９号；国際公開第９８／５３０６０号；国際公開第０２／０１６５３６号および国際公開第０３／０１６４９６号を参照のこと。
[0098]「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験的方法から主に生じる、自然では認められないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；同第８，５８６，５２６号；国際公開第９５／１９４３１号；国際公開第９６／０６１６６号；国際公開第９８／５３０５７号；国際公開第９８／５４３１１号；国際公開第００／２７８７８号；国際公開第０１／６０９７０号、国際公開第０１／８８１９７号、国際公開第０２／０９９０８４号を参照のこと。
[0099]一般的に、「ＣＲＩＳＰＲ」（クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の繰り返し（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ
Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ））は、ＳＰＩＤＲ（スペーサー散在型直接反復（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓ））としても知られ、特定の細菌性種に対して通常特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを指す。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｓｈｉｎｏら（１９８７年）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６９：５４２９～５４３３頁；およびＮａｋａｔａら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８９年）１７１：３５５３～３５５６頁）および関連遺伝子で認識された散在型短鎖配列反復（ＳＳＲ）の異なるクラスを含む。類似の散在ＳＳＲは、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、およびヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で同定されている（Ｇｒｏｅｎｅｎら（１９９３年）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１０：１０５７～１０６５頁；Ｈｏｅら（１９９９年）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５：２５４～２６３頁；Ｍａｓｅｐｏｈｌら（１９９６年）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６～３０頁；およびＭｏｊｉｃａら（１９９５年）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１７：８５～９３頁を参照のこと）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、反復構造が他のＳＳＲと異なり、これは短鎖規則的間隔反復（ＳＲＳＲ）と称されている（Ｊａｎｓｓｅｎら（２００２年）ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．、６：２３～３３頁；およびＭｏｊｉｃａら（２０００年）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３６：２４４～２４６）。一般的に、反復は、実質的に一定の長さを有する特有の媒介配列によって規則的に空間が空いたクラスターで生じる短鎖エレメントである（Ｍｏｊｉｃａら（２０００年）、上記を参照のこと）。反復配列は、株間で高度に保存されるが、散在型反復の数およびスペーサー領域の配列は、典型的には株間で異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００２年）１８２：２３９３～２４０１頁）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０種類を超える原核生物で同定されており、これらに限定されないが、アエロピュルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルカエオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアオーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルキナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ属（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス属（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミロコッカス属（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびテルモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含む。
[00100]「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺
伝子の活性の発現または指示に関与する転写産物および他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「直接反復」およびｔｒａｃｒＲＮＡ加工部分直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈において「ｓｐａｃｅｒ」とも称される）、または他の配列およびＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの転写産物を含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムのうちの１つまたは複数のエレメントは、クラス１タイプＩまたはタイプＩＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムのうちの１つまたは複数のエレメントは、クラス２タイプＩＩまたはタイプＶ ＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムのうちの１つまたは複数のエレメントは、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの内因性ＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物に由来する。一般的に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の位置においてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの文脈においてプロトスペーサーとも称される）。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する場合には、ガイド配列が相補性を有するように設計された配列を指す。ハイブリダイゼーションをもたらしかつＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する十分な相補性が存在するという条件で、完全相補性は必ずしも必要ではない。標的配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。標的配列を含む標的遺伝子座へ遺伝子組み換えするために使用してもよい配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の態様において、外因性鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型と称してもよい。本発明の態様において遺伝子組換えは、相同的組換えである。
[00101]「ＮｇＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核生
物のアルゴノートタンパク質である。ＮｇＡｇｏは、古細菌ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）に由来する（例えば、Ｇａｏら（２０１６年）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４、７６８～７７３頁を参照のこと）。「ＮｇＡｇｏ系」は、必要とされる構成成分のすべてであり、その系としては、例えば、ＮｇＡｇｏ酵素を切断するための短鎖ストランドガイドＤＮＡを含む。
[00102]「小分子」という用語は、当技術分野において認識されている用語である。特
定の実施形態において、この用語は、約２０００ａｍｕ未満、または約１０００ａｍｕ未満、さらに約５００ａｍｕ未満の分子量を有する分子を指す。
[00103]本明細書において使用されるすべての百分率および比率は、別段指示がない限
り、重量による。
[00104]本明細書で述べる実施形態は、全体的に、希突起膠細胞前駆体細胞の分化、増
殖および／または成熟を誘発、促進、および／または調節することによって、希突起膠細胞の生成を強化するための薬剤、化合物、および方法、ならびにミエリン形成または再ミエリン形成が対象にとって有益な場合に、対象における疾患または障害を処置するための方法に関する。
[00105]希突起膠細胞プロジェニター細胞（ＯＰＣ）におけるコレステロール生合成経
路のΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化しかつ／または誘発すると、希突起膠細胞生成を誘発できることが見出された。Δ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積の強化および／または誘発は、Δ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を阻害するおよび／またはΔ８，９－不飽和ステロール中間体が基質である、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路内の酵素を調節および／または阻害すること、ならびにΔ８，９－不飽和ステロール中間体をＯＰＣに直接的におよび／または間接的に投与することによって得ることができる。Δ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化しかつ／または誘発すると、ＯＰＣの分化、生存、増殖および／または成熟を促進し、かつミエリン形成または再ミエリン形成が対象にとって有益な場合に、対象における疾患および／または障害を処置することができる。
[00106]いくつかの実施形態において、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ
８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する薬剤は、ＯＰＣの分化、増殖および／または成熟、ならびに希突起膠細胞の生成を促進するおよび／または誘発するために効果的な量で、対象および／またはＯＰＣに投与することができる。１つの例において、薬剤としては、ＯＰＣのコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体の酵素媒介性合成を阻害する、および／またはΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を促進する、少なくとも１つの化合物があり得る。
[00107]いくつかの実施形態において、化合物は、ＯＰＣの、ラノステロールからコレ
ステロールへの、例えばラノステロールおよび／またはラソステロール間のコレステロール生合成経路のうちの１つまたは複数の酵素媒介性変換ステップを調節しおよび／または阻害し、希突起膠細胞生成を促進するおよび／または誘発することができる。例えば、化合物は、コレステロール生合成経路におけるステロール中間体の、ＣＹＰ５１、ステロール１４－レダクターゼ、および／またはＥＢＰ酵素媒介性合成を阻害することができる。さらに別の実施形態において、化合物は、ラノステロールの４，４－ジメチルコレスタ－
８（９），１４，２４－トリエン－３β－オールへの、４，４－ジメチルコレスタ－８（９），１４，２４－トリエン－３β－オールのザイモステノールへの、および／またはザイモステノールのラソステロールへの酵素媒介性変換を調節しかつ／または阻害し、希突起膠細胞生成を強化することができる。
[00108]いくつかの実施形態において、化合物は、ラノステロールからデヒドロラソス
テロールまたはラソステロールへのコレステロール生合成経路のうちの１つまたは複数の酵素媒介性変換ステップを調節するおよび／または阻害することができる。
[00109]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法において使用する化合物
は、エモパミル結合タンパク質（ＥＢＰ）イソメラーゼ酵素活性の阻害を通して、ザイモステノールのラソステロールへの酵素媒介性変換を阻害することができる。あるいは、本明細書で述べる方法において使用する化合物は、コレステロール生合成経路におけるステロールＣ１４レダクターゼ酵素活性またはＣＹＰ５１酵素活性を阻害することができる。
[00110]コレステロール生合成経路の調節および／または阻害を介したＯＰＣの分化に
よって希突起膠細胞生成を強化することができる化合物は、スクリーニングされた化合物が投与されたＯＰＣにおけるコレステロールおよび上流代謝産物のレベルを測定することによって同定することができる。いくつかの実施形態において、コレステロール生合成経路の調節および／または阻害を介したＯＰＣの分化を強化できる化合物は、哺乳動物対象において高い効力と低い毒性の両方を有し、かつ希突起膠細胞前駆体の分化を促進することができる化合物を選択する傾向があるハイスループット小分子スクリーニング（ＨＴＳ）を使用して同定することができる。本明細書において使用される「小分子」という用語は、生体膜を通過しかつ細胞内プロセスを調節し得る低分子量（例えば＜５５０ｋＤａ）の生物学的活性有機化合物を指す。
[00111]ＨＴＳには、小型薬物様有機化合物（２５０～５５０ｋＤａ）を添加し、細胞
を播種し、９６または３８４ウェルプレートでインキュベートする、一次スクリーニングを含むことができる。次いで、細胞を、希突起膠細胞前駆体の形態学的変化に関して視覚的にスクリーニングすることができる。二次スクリーニングにおいて、選択された化合物によって誘発された分化および増殖を、蛍光顕微鏡によってさらに検証することができる。次いでさらに、選択された化合物に反応した希突起膠細胞前駆体増殖および成熟は、例えば、免疫細胞化学およびウエスタンブロットによって判定されるようなミエリンタンパク質発現を誘発することによって評価できる。一次および二次スクリーニングに使用することができるアッセイの例は、Ｎａｊｍら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１年９月２５日；８（１１）：９５７～６２頁；Ｂａｉら Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｂｕｌｌ．２０１３年４月；２９（２）：２３９～５０頁；Ｙａｎｇら Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１１年２月１日；３５０（１）：１２７～３８頁；、およびＣｈｏら Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７年３月；５（１）：１９～３３頁に記載されている。
[00112]化合物は、さらにＧＣＭＳアッセイを使用してスクリーニングし、コレステロ
ール、およびスクアレン、スクアレンエポキシド、ラノステロール、ＦＦ－ＭＡＳ、Ｔ－ＭＡＳ、他の減数分裂活性化ステロール、ザイモステロール、ザイモステノール、ラソステロール、デヒドロラソステロールデヒドロデスモステロール、デスモステロール、７－ＤＨＣ、８－ＤＨＣなどを含む、コレステロールまでの途中の中間体のレベルをモニターすることができる。このようなアッセイはとりわけ、Ｋｏｒａｄｅら Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２０１６年 ５９（３）、１１０２～１１１５頁に記載されている。簡潔には、細胞を様々な分子で処置し、次いで、メタノールまたはクロロホルムなどの有機溶媒を使用して溶解し、親油性代謝産物を抽出することができる。ＢＴＭＳＡまたは同等のシリル化試薬を使用してシリル化した後、サンプルをＧＣ－ＭＳへ注入し、積分したピーク強度
を、真のステロール参照標準と比較することによってステロール存在量を測定する。
[00113]いくつかの実施形態において、化合物は、哺乳動物（例えば、ラットおよびマ
ウス）の脳のミエリン形成を評価する脳切片アッセイを使用してさらにスクリーニングすることができる。このようなアッセイは、例えば、Ｂａｉら Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｂｕｌｌ．２０１３年４月；２９（２）：２３９～５０頁、Ｙａｎｇら Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１１年２月１日；３５０（１）：１２７～３８頁、およびＣｈｏら Ｃｕｒｒ Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７年３月；５（１）：１９～３３頁に記載されている。
[00114]別の実施形態において、化合物は、多発性硬化症のＭＯＧ３５－５５誘発慢性
実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）齧歯動物モデルにおける再ミエリン形成および臨床的重症度の減少を評価するｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイを使用してスクリーニングすることができる。
[00115]別の実施形態において、化合物は、リゾレシチン誘発ミエリン局所脱落マウス
モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのミエリン形成を評価するアッセイを使用してスクリーニングすることができる。このようなアッセイは、例えば、Ｍｉら，Ｓら、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６５、３０４～３２５頁（２００９年）に記載されている。
[00116]特定の実施形態において、ＯＰＣの分化を強化することができる同定された化
合物は、ＯＰＣのコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体の酵素媒介性合成を調節するおよび／または阻害することができる（例えば図１５を参照のこと）。いくつかの実施形態において、化合物は、希突起膠細胞前駆体細胞の分化、増殖および／または成熟を促進および／または誘発するために効果的な量で、ＯＰＣのコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体の酵素媒介性合成を調節するおよび／または阻害することができる。例えば、化合物は、ＯＰＣのコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体の酵素媒介性合成を、未処置のＯＰＣまたは対象のコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体の酵素媒介性合成の量と比較した場合に、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害することができる。
[00117]ステロール中間体であるラノステロールの上流ステップでコレステロール生合
成を阻害すると、ＯＰＣの分化に対する効果はほとんどないかまったくないことが示されている。したがって、いくつかの実施形態において、ＯＰＣ ＨＴＳおよびＧＣＭＳによって同定された化合物としては、希突起膠細胞前駆体細胞の分化、増殖および／または成熟を促進するおよび／または誘発するために効果的な量で、ラノステロールからコレステロールまでのおよび／またはラノステロールとラソステロールとの間のコレステロール生合成経路の１つまたは複数の酵素媒介性変換ステップを調節および／または阻害することができる化合物があり得る。例えば、化合物は、ラノステロールからコレステロールまでおよび／またはラノステロールとラソステロールとの間のコレステロール生合成経路の１つまたは複数の酵素媒介性変換ステップを、未処置のＯＰＣまたは対象のラノステロールからコレステロールまでのコレステロール生合成経路における１つまたは複数のステロール中間体の酵素媒介性合成の量と比較した場合に、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害することができる。
[00118]特定の実施形態において、ＯＰＣ ＨＴＳスクリーニングおよびＧＣＭＳによ
って同定された化合物としては、希突起膠細胞前駆体細胞の分化、増殖および／または成熟を促進および／または誘発するために効果的な量で、コレステロール生合成経路におけ
るラノステロールのＦＦ－ＭＡＳへの、ＦＦ－ＭＡＳのＴ－ＭＡＳへの、ザイモステノールのラソステロールへの、Ｔ－ＭＡＳのザイモステロールへの、ザイモステロールのデヒドロラソステロールへの、および／またはデスモステロールのコレステロールへの酵素媒介性変換を調節および／または阻害することができる化合物があり得る。例えば、化合物は、コレステロール生合成経路における、ラノステロールのＦＦ－ＭＡＳへの、ＦＦ－ＭＡＳのＴ－ＭＡＳへの、ザイモステノールのラソステロールへの、Ｔ－ＭＡＳのザイモステロールへの、ザイモステロールのデヒドロラソステロールへの、および／またはデスモステロールのコレステロールへの酵素媒介性変換を、未処置のＯＰＣまたは対象におけるラノステロールのＦＦ－ＭＡＳへの、ＦＦ－ＭＡＳのＴ－ＭＡＳへの、ザイモステノールのラソステロールへの、Ｔ－ＭＡＳのザイモステロールへの、ザイモステロールのデヒドロラソステロールへの、および／またはデスモステロールのコレステロールへの酵素媒介性変換の量と比較した場合に、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害することができる。コレステロール生合成経路における、ラノステロールのＦＦ－ＭＡＳへの、ＦＦ－ＭＡＳのＴ－ＭＡＳへの、ザイモステノールのラソステロールへの、Ｔ－ＭＡＳのザイモステロールへの、ザイモステロールのデヒドロラソステロールへの、および／またはデスモステロールのコレステロールへの酵素媒介性変換を阻害することができる化合物の例としては、ケトコナゾール、２－メチルケトコナゾール、アモロルフィン、ＡＹ９９４４、ＥＰＺ００５６８７、タモキシフェン、ベンズトロピン、ベキサロテン、クレマスチン、ＦＲ１７１４５６、シス－Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ－エチル－３－（３－クロロ－４－シクロヘキシルフェニル）プロパ－２－エニルアミンおよびイフェンプロジルがある。
[00119]いくつかの実施形態において、化合物は、ザイモステノールのラソステロール
への酵素（例えば、エモパミル結合タンパク質）媒介性変換を調節および／または阻害することができる。エモパミル結合タンパク質（ＥＢＰ、Δ８Δ７イソメラーゼ、３－ベータ－ヒドロキシステロイド－デルタ（８），デルタ（７）－イソメラーゼ、ＣＤＰＸ２、ＣＨＯ２、ＣＰＸ、またはＣＰＸＤとも称される）は、コレステロールの産生における最終ステップのうちの１つを担う酵素である。特に、それはザイモステノールをラソステロールへ変換し、次いで、他の酵素がラソステロールを修飾し、コレステロールを産生する（例えば、図１５を参照のこと）。したがって、いくつかの実施形態において、ＯＰＣのコレステロール生合成経路におけるザイモステノールのラソステロールへのＥＢＰ媒介性変換を阻害することができる化合物は、希突起膠細胞前駆体細胞の分化、増殖および／または成熟を促進するおよび／または誘発することができる。例えば、化合物は、コレステロール生合成経路におけるザイモステノールのラソステロールへのＥＢＰ媒介性酵素変換を、未処置のＯＰＣまたは対象における、デスモステロールのコレステロールへのＥＢＰ媒介性変換の量と比較した場合に、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害することができる。
[00120]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法において使用されるＥＢ
Ｐ阻害化合物は式（Ｉ）を有することができる
Figure 2023139105000002
（式中、（ａ）Ｘ１は、置換または非置換アリール、ヘテロアリール、シクリルまたはヘテロシクリルであり；
（ｂ）Ｙ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６直鎖状または分岐状アルキルであり；
（ｃ）Ｚ１は、ＣＲ’Ｒ”、ＮＲ’またはＯＲ’であり；かつ
（ｄ）Ｒ’、Ｒ”、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、またはＲ４はそれぞれ独立に、水素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６個の環原子（ここで、１～３個の環原子は、独立に、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、Ｏ、およびＳから選択される）を含むヘテロシクロアルケニル、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－ＣＮ）、イソシアノ（－Ｎ＋Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－ＣＮ）、イソシアナト（－Ｏ－Ｎ＋＝Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－ＣＮ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－－（ＣＯ）－－Ｈ）、チオホルミル（－－（ＣＳ）－－Ｈ）、アミノ（－－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イミノ（－ＣＲ＝ＮＨ、式中、Ｒは、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキルなどである）、アルキルイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなど）、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＹ２（式中、Ｙは、独立に、Ｈ、アリルまたはアルキルである）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）、ホスフィノ（－－ＰＨ２）、ポリアルキルエーテル、ホスフェート、ホスフェートエステル、アミノ酸または生理学的ｐＨで陽または負電荷を有することが予想される別の部分を組み込んだ
基、これらの組合せからなる群から選択され、かつここで、Ｒ’およびＲ”は、結合し、環式または多環式環を形成してもよく、ここで、環は、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクリルである）。
[00121]いくつかの実施形態において、式（Ｉ）を有する化合物としては、式（ＩＩ）
を有する化合物があり得る
Figure 2023139105000003
（式中、（ａ）Ｙ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６直鎖状または分岐状アルキルであり；
（ｂ）Ｚ１は、ＣＲ’Ｒ”、ＮＲ’またはＯＲ’であり；
（ｃ）Ｒ’、Ｒ”、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６個の環原子（ここで、１～３個の環原子は、独立にＮ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、Ｏ、およびＳから選択される）を含むヘテロシクロアルケニル、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－ＣＮ）、イソシアノ（－Ｎ＋Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－ＣＮ）、イソシアナト（－Ｏ－Ｎ＋＝Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－ＣＮ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－－（ＣＯ）－－Ｈ）、チオホルミル（－－（ＣＳ）－－Ｈ）、アミノ（－－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イミノ（－ＣＲ＝ＮＨ、式中、Ｒは、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキルなどである）、アルキルイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなど）、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ
５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＹ２（式中、Ｙは、独立に、Ｈ、アリルまたはアルキルである）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）、ホスフィノ（－－ＰＨ２）、ポリアルキルエーテル、ホスフェート、ホスフェートエステル、アミノ酸または生理学的ｐＨで陽または負電荷を有することが予想される別の部分を組み込んだ基、これらの組合せからなる群から選択され、かつここで、Ｒ’およびＲ”は、結合し、環式または多環式環を形成してもよく、ここで、環は、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換シクロアルキル、および置換または非置換ヘテロシクリルであり；かつ
（ｄ）ここで、ｎは１～５である）。
[00122]別の実施形態において、式（Ｉ）を有する化合物としては、式（ＩＩＩａ）を
有する化合物があり得る
Figure 2023139105000004
（式中、（ａ）Ｙ１は、置換または非置換Ｃ１～Ｃ６直鎖状または分岐状アルキルであり；
（ｂ）Ｚ２およびＺ３は、それぞれ独立に、ＮＲ’または（ＣＨＲ’）ｎ１からなる群から選択され、ここで、Ｚ２またはＺ３のいずれかがＮＲ’であり；
（ｃ）Ｒ’、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、水素、酸素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６個の環原子（ここで、１～３個の環原子は、独立に、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、Ｏ、およびＳから選択される）を含むヘテロシクロアルケニル、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－ＣＮ）、イソシアノ（－Ｎ＋Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－ＣＮ）、イソシアナト（－Ｏ－Ｎ＋＝Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－ＣＮ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－－（ＣＯ）－－Ｈ）、チオホルミル（－－（ＣＳ）－－Ｈ）、アミノ（－－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イ
ミノ（－ＣＲ＝ＮＨ、式中、Ｒは、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキルなどである）、アルキルイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなど）、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＹ２（式中、Ｙは、独立に、Ｈ、アリルまたはアルキルである）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）、ホスフィノ（－－ＰＨ２）、ポリアルキルエーテル、ホスフェート、ホスフェートエステル、アミノ酸または生理学的ｐＨで陽または負電荷を有することが予想される別の部分を組み込んだ基、これらの組合せからなる群から選択され；
（ｄ）ここで、ｎは１～５であり、かつｎ１は１～４であり；かつ
（ｅ）破線は、各存在で独立に、二重結合または単結合となる）。
[00123]さらに別の実施形態において、式（Ｉ）を有する化合物としては、式（ＩＩＩ
ｂ）を有する化合物があり得る
Figure 2023139105000005
（式中、（ａ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ８、およびＲ９は、それぞれ独立に、水素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６個の環原子（ここで、１～３個の環原子は、独立に、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、Ｏ、およびＳから選択される）を含むヘテロシクロアルケニル、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－ＣＮ）、イソシアノ（－Ｎ＋Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－ＣＮ）、イソシアナト（－Ｏ－Ｎ＋＝Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－ＣＮ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－－（ＣＯ
）－－Ｈ）、チオホルミル（－－（ＣＳ）－－Ｈ）、アミノ（－－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イミノ（－ＣＲ＝ＮＨ、式中、Ｒは、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキルなどである）、アルキルイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなど）、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＹ２（式中、Ｙは、独立にＨ、アリルまたはアルキルである）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）、ホスフィノ（－－ＰＨ２）、ポリアルキルエーテル、ホスフェート、ホスフェートエステル、アミノ酸または生理学的ｐＨで陽または負電荷を有することが予想される別の部分を組み込んだ基、これらの組合せからなる群から選択され；かつ
（ｂ）ｎは、１～５であり、かつｍは１～３である）。
[00124]式（Ｉ）の化合物の例は、以下の式を有する。
Figure 2023139105000006
[00125]式（Ｉ）を有する化合物の別の実施形態としては、式（ＩＶａ）を有する化合
物がある
Figure 2023139105000007
（式中、（ａ）；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６個の環原子（ここで、１～３個の環原子は、独立に、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、Ｏ、およびＳから選択される）を含むヘテロシクロアルケニル、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒド
ロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－ＣＮ）、イソシアノ（－Ｎ＋Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－ＣＮ）、イソシアナト（－Ｏ－Ｎ＋＝Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－ＣＮ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－－（ＣＯ）－－Ｈ）、チオホルミル（－－（ＣＳ）－－Ｈ）、アミノ（－－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イミノ（－ＣＲ＝ＮＨ、式中、Ｒは、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキルなどである）、アルキルイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなど）、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＹ２（式中、Ｙは、独立にＨ、アリルまたはアルキルである）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）、ホスフィノ（－－ＰＨ２）、ポリアルキルエーテル、ホスフェート、ホスフェートエステル、アミノ酸または生理学的ｐＨで陽または負電荷を有することが予想される別の部分を組み込んだ基、これらの組合せからなる群から選択され；かつ
（ｂ）ｎは、１～５であり、かつｍは１～３である）。
[00126]式（Ｉ）を有する化合物のさらに別の実施形態としては、式（ＩＶｂ）を有す
る化合物がある
Figure 2023139105000008
（式中、（ａ）；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ１０は、それぞれ独立に、水素、置換または非置換Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ２～Ｃ２４アルケニル、Ｃ２～Ｃ２４アルキニル、Ｃ３～Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、５～６個の環原子（ここで、１～３個の環原子は、独立に、Ｎ、ＮＨ、Ｎ（Ｃ１～Ｃ６アルキル）、ＮＣ（Ｏ）（Ｃ１～Ｃ６アルキ
ル）、Ｏ、およびＳから選択される）を含むヘテロシクロアルケニル、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキル、ハロ、－Ｓｉ（Ｃ１～Ｃ３アルキル）３、ヒドロキシル、スルフヒドリル、Ｃ１～Ｃ２４アルコキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルケニルオキシ、Ｃ２～Ｃ２４アルキニルオキシ、Ｃ５～Ｃ２０アリールオキシ、アシル（Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボニル（－－ＣＯ－アルキル）およびＣ６～Ｃ２０アリールカルボニル（－ＣＯ－アリール）を含む）、アシルオキシ（－Ｏ－アシル）、Ｃ２～Ｃ２４アルコキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールオキシカルボニル（－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、Ｃ２～Ｃ２４アルキルカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールカルボナト（－Ｏ－（ＣＯ）－Ｏ－アリール）、カルボキシ（－ＣＯＯＨ）、カルボキシラト（－ＣＯＯ－）、カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキル－カルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ（Ｃ１～Ｃ２４アルキル））、アリールカルバモイル（－（ＣＯ）－ＮＨ－アリール）、チオカルバモイル（－（ＣＳ）－ＮＨ２）、カルバミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－ＮＨ２）、シアノ（－ＣＮ）、イソシアノ（－Ｎ＋Ｃ－）、シアナト（－Ｏ－ＣＮ）、イソシアナト（－Ｏ－Ｎ＋＝Ｃ－）、イソチオシアナト（－Ｓ－ＣＮ）、アジド（－Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ－）、ホルミル（－－（ＣＯ）－－Ｈ）、チオホルミル（－－（ＣＳ）－－Ｈ）、アミノ（－－ＮＨ２）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルアミノ、Ｃ５～Ｃ２０アリールアミノ、Ｃ２～Ｃ２４アルキルアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アルキル）、Ｃ６～Ｃ２０アリールアミド（－ＮＨ－（ＣＯ）－アリール）、イミノ（－ＣＲ＝ＮＨ、式中、Ｒは、水素、Ｃ１～Ｃ２４アルキル、Ｃ５～Ｃ２０アリール、Ｃ６～Ｃ２４アルカリル、Ｃ６～Ｃ２４アラルキルなどである）、アルキルイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アルキル）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリル、アラルキルなど）、アリールイミノ（－ＣＲ＝Ｎ（アリール）、式中、Ｒ＝水素、アルキル、アリール、アルカリルなど）、ニトロ（－ＮＯ２）、ニトロソ（－ＮＯ）、スルホ（－ＳＯ２－ＯＨ）、スルホナト（－ＳＯ２－Ｏ－）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルファニル（－Ｓ－アルキル；「アルキルチオ」とも称される）、アリールスルファニル（－Ｓ－アリール；「アリールチオ」とも称される）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルフィニル（－（ＳＯ）－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルフィニル（－（ＳＯ）－アリール）、Ｃ１～Ｃ２４アルキルスルホニル（－ＳＯ２－アルキル）、Ｃ５～Ｃ２０アリールスルホニル（－ＳＯ２－アリール）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ２、－ＳＯ２ＮＹ２（式中、Ｙは、独立にＨ、アリルまたはアルキルである）、ホスホノ（－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ホスホナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－）２）、ホスフィナト（－Ｐ（Ｏ）（Ｏ－））、ホスホ（－ＰＯ２）、ホスフィノ（－－ＰＨ２）、ポリアルキルエーテル、ホスフェート、ホスフェートエステル、アミノ酸または生理学的ｐＨで陽または負電荷を有することが予想される別の部分を組み込んだ基、これらの組合せからなる群から選択され；かつ
（ｂ）ｎは、１～５であり、かつｍは１～３である）。
[00127]式（Ｉ）の化合物の例は、以下の式を有する。
Figure 2023139105000009
[00128]いくつかの態様において、本明細書で述べる方法において使用するためにＯＰ
Ｃスクリーニングおよび／またはＧＣＭＳによって同定されたＥＢＰ阻害化合物としては
、ＥＰＺ００５６８７、タモキシフェン、ベンズトロピン、クレマスチン、およびイフェンプロジルがあり得る。
[00129]本明細書で述べる方法において使用するためのＥＢＰ阻害化合物の追加の例と
しては、
Figure 2023139105000010
ヒドロキシジン、ｐ－フルオロヘキサヒドロ－シラジフェニドール、エンクロミフェン、ラロキシフェン、ナフォキシジン、レボルメロキシフェン、クロミフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、バゼドキシフェン、ラソフォキシフェン、ペルフェナジン、フルフェナジン、トリフルオペラジン、プロクロルペラジン、ヒドラジン、トリパラノール、ドロロキシフェン、イドキシフェン、ミクスプロキシフェン（ｍｉｘｐｒｏｘｉｆｅｎｅ）（ＴＡＴ５９）、クロザピン、プラモキシン、ＴＭＢ－８、ベサミコール、ジフェニドール類似体、Ｌ－７４５，８７０、７－ケト－コレステロール、および７－ヒドロキシ－コレステロールがあり得る。
[00130]別の実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するためのＥＢＰ
阻害化合物としては、ベンゼン誘導体化合物があり得る。本明細書で述べる方法において使用するためのベンゼン誘導体としては、例えば、米国特許第５，３５４，７８１号に記載のものがあり、その発明の主題は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。このようなベンゼン誘導体化合物は、一般式：
Figure 2023139105000011
（式中、Ｒ１は、水素またはハロゲン原子であり；
Ｒ２は、シクロヘキシルまたはフェニルであり；
Ｒ３は、（Ｃ３～Ｃ６）シクロアルキルであり；
Ｒ４は、水素、（Ｃ１～Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ３～Ｃ６）シクロアルキルであり；
Ａは、－ＣＯ－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＣＩ）－ＣＨ２－、－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ＝ＣＨ－および－Ｃ≡Ｃ－である）
、またはその薬学的塩を有することができる。
[00131]いくつかの実施形態において、ベンゼン誘導体としては、式
Figure 2023139105000012
（シス－Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ－エチル－３－（３－クロロ－４－シクロヘキシルフェニル）プロパ－２－エニルアミン）、ならびに類似体、誘導体およびその薬学的塩を有する小分子があり得る。
[00132]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するための
ＥＢＰ阻害化合物としては、式：
Figure 2023139105000013
を有する化合物のシスおよびトランス異性体があり得る。
[00133]特定の実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するためのＥＢ
Ｐ阻害化合物としては、式：
Figure 2023139105000014
を有する化合物のシス異性体があり得る。
[00134]本明細書で述べる方法において使用するためのＥＢＰ阻害化合物としてはまた
、
Figure 2023139105000015
およびその類似体があり得る。
[00135]Ｔａｓｉｎ－１類似体の例としては、式：
Figure 2023139105000016
Figure 2023139105000017
Figure 2023139105000018
Figure 2023139105000019
Figure 2023139105000020
Figure 2023139105000021
Figure 2023139105000022
Figure 2023139105000023
を有する化合物があり得る。
[00136]本明細書で述べる方法において使用するための別のＥＢＰ阻害化合物としては
、ピリジルエタノール（フェニルエチル）アミン誘導体があり得る。本明細書で述べる方法において使用するためのピリジルエタノール（フェニルエチル）アミン誘導体としては、例えば、米国特許第７，５６０，４７４Ｂ２号に記載のものがあり、その発明の主題は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。このような化合物は、一般式（Ｉ）：
Figure 2023139105000024
（式中、ｎは、１～４の整数であり、Ｒ１は、水素原子、ヒドロキシル基または低級Ｃ１～６アルコキシ基であり、Ｒ２は、水素原子または直鎖状または分岐状低級Ｃ１～６アルキル基であり、Ｘは、水素、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル基、トリフルオロメチル基、３，４－ジ－Ｃｌ，２，４－ジ－Ｃｌまたは低級Ｃ１～６アルコキシ基である）、その鏡像異性体、ジアステレオ異性体もしくはラセミ化合物、またはこれらの生理学的に許容される酸付加物塩を有することができる。
[00137]ピリジルエタノール（フェニルエチル）アミン誘導体の例としては：
式ＩＩの１－（３－ピリジル）－２－（Ｎ－（２－フェニルエチル）－Ｎプロピルアミノ）エタノールおよび二臭化水素酸塩：
Figure 2023139105000025
式ＩＩＩの１－（３－ピリジル）－２－（Ｎ－（２－（３，４ジクロロフェニル）エチル）－Ｎ－メチルアミノ）エタノールおよび二臭化水素酸塩：
Figure 2023139105000026
式ＩＶの１－（３－ピリジル）－２－（Ｎ－（２－（３，４ジクロロフェニル）エチル）－Ｎ－プロピルアミノ）エタノールおよび二臭化水素酸塩：
Figure 2023139105000027
および
式Ｖの１－（４－ピリジル）－２－（Ｎ－（２－（３，４ジクロロフェニル）エチル）－Ｎ－メチルアミノ）エタノールおよび二臭化水素酸塩：
Figure 2023139105000028
がある。
[00138]本明細書で述べる方法において使用するためのＥＢＰ阻害化合物の追加の例と
しては、以下の式を有する化合物があり得る
Figure 2023139105000029
（式中、Ｒは、ベンジル、（５－ヨードフラン－２イル）メチル、３－クロロベンジル、（フラン－３－イル）メチル、ペンタ－４－エン－１イル、２，４－ジクロロベンジル、および２，３－ジクロロベンジルから選択される）；
Figure 2023139105000030
（式中、Ｒは、メチル、ベンジルおよびペンタ－４－エン－１イルから選択される）；および
Figure 2023139105000031
。
[00139]本明細書で述べる方法において使用するための追加のＥＢＰ阻害剤としては、
以下の式を有する化合物があり得る
Figure 2023139105000032
。
[00140]本明細書で述べる方法において使用するためのＥＢＰ阻害化合物の別の例とし
ては、米国特許第６，４８９，４８１Ｂ１号に記載のものがあり得、その発明の主題は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるものとする。
[00141]特定の実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するための化合
物としては、ＥＢＰおよびステロールＣ１４レダクターゼを調節および／または阻害することができる化合物（ＤＨＣＲ１４、ＡＮＧ１；ＤＨＣＲ１４Ａ；ＮＥＴ４７；デルタ（１４）－ステロールレダクターゼとしても知られている）、コレステロール生合成中にステロール中間体のザイモステノールへの還元を触媒する酵素があり得る。ＥＢＰおよびステロールＣ１４レダクターゼの両方を調節および／または阻害することができる化合物の例としては：
Figure 2023139105000033
およびこれらの類似体がある。
[00142]本明細書で述べる方法において使用するための追加の化合物であって、ステロ
ールＣ１４レダクターゼを調節および／または阻害することができる化合物としては、ジプラシドン、イフェンプロジル、２－メチルケトコナゾールおよびＡＹ９９４４がある。
[00143]本明細書で述べる方法において使用するためのステロールＣ１４レダクターゼ
阻害剤としてはまた、エンゴサク（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ Ｔｕｒｔｓｃｈａｎｉｎｏｗｉｉ Ｂｅｓｓｅｒ）抽出物誘導体があり得る。例示的なエンゴサク（Ｃｏｒｙｄａｌｉｓ
Ｔｕｒｔｓｃｈａｎｉｎｏｗｉｉ Ｂｅｓｓｅｒ）は、米国特許第６，２５５，３１７Ｂ１号に記載されており、その発明の主題は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるものとし、一般式：
Figure 2023139105000034
（式中、Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであっても異なっていてもよく、ヒドロキシル基もしくは１～４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し、またはＲ１およびＲ２の両方がメチレンジオキシ基を表し；Ｒ３は、水素原子を表し；Ｒ４およびＲ５は、互いに同じであっても異なっていてもよく、ヒドロキシル基、ヒドロキシエチルアミノ基または１～４個の炭素原子を有するアルコキシ基を表し；Ｒ６は、水素原子、１～８個の炭素原子を有するアルキル基、３～８個の炭素原子を有するアルケニル基、１～７個の炭素原子を有
するシクロアルキルアルキル基、１～４個の炭素原子を有するハロアルキル基、エトキシカルボニル基、エトキシカルボニルメチル基、ヒドロキシカルボニルメチル基、１エトキシカルボニルエチル基、または２－バレノラクトニル（２－ｖａｌｅｒｏｌａｃｔｏｎｙｌ）基を表し；かつＺは、ハロゲン原子を表す）を有する。
[00144]本明細書で述べる方法において使用するためのステロールＣ１４レダクターゼ
阻害剤としてはまた、５，６－ジヒドロジベンゼノ［ａ，ｇ］キノリジニウム誘導体およびその塩があり得る。このような化合物は、米国特許第６，０３０，９７９号に記載されており、その発明の主題は、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれるものとし、一般式：
Figure 2023139105000035
（式中、Ｒ１およびＲ２は、互いに同じであっても異なっていてもよく、ヒドロキシル基もしくは１～４個の炭素を有するアルコキシ基を表し、またはＲ１およびＲ２は、一緒になって、メチレンジオキシ基を表し；Ｒ３は、ヒドロキシル基または１～４個の炭素を有するアルコキシ基を表し；Ｒ４は、水素原子、１～８個の炭素を有するアルキル基、または３～８個の炭素を有するアルケニル基を表し；Ｘは、無機酸イオン、有機酸イオンまたはハロゲン化物、より詳細には、ニトレート、スルフェート、アセテート、タータレート、マレエート、スクシネート、シトレート、フマレート、アスパルテート、サリシレート、グリセレート、アスコルベート、フッ化物、塩化物、ヨウ化物または臭化物を表し；Ｚは、５～１２個の炭素を有するアルキル基、または４～６個の炭素を有するアルケニル基、Ｎ－ベンゾトリアゾリル基、キノリニル基、フリル基、置換フリル基、または式
Figure 2023139105000036
によって表される基（式中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、およびＺ５は、互いに同じであっても異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン、１～５個の炭素を有するアルキル基、トリフルオロメチル基、フェニル基、置換フェニル基、ニトロ基、１～４個の炭素を有するアルコキシ基、メチレンジオキシ基、トリフルオロ－メトキシ基、ヒドロキシル基、ベンジルオキシ基、フェノキシ基、ビニル基、ベンゼンスルホニルメチル基またはメトキシカルボニル基を表す）を表し；かつＡおよびＢは、互いに同じであっても異なっていてもよく、炭素または窒素を表す）を有する。
[00145]特定の実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するための化合
物としては、コレステロール生合成中にラノステロールの４，４－ジメチルコレスタ－８（９），１４，２４－トリエン－３β－オールへの変換を触媒する酵素であるＣＹＰ５１
（またはラノステロール１４α－メチル基分解酵素）を調節および／または阻害することができる化合物があり得る。ＣＹＰ５１を調節および／または阻害することができる化合物の例としては、（ＬＫ－９３５）
Figure 2023139105000037
などの非イミダゾールＣＹＰ５１阻害剤、および一般式
Figure 2023139105000038
（式中、Ｒ１は、１～３個の炭素原子を有するアルキル基を表し；かつＲ２は、水素、（３，４）－ジＣＬ、（３，４）－ジＦ、（３，４）－ジＯＭｅ、（３，４）－ジＯＨ、４－ＮＯ２、４－ＣＦ３、または３－ＣＦ３を表す）を有する類似体がある。追加のＣＹＰ５１阻害剤としては、ケトコナゾールおよびその誘導体、エコナゾール、イソコナゾール、ビホナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、ブトコナゾール、酢酸メドロキシプロゲステロンおよびフルベストラントがあり得る。
[00146]特定の実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するための小分
子化合物としては、ＣＹＰ５１からＥＢＰに及ぶコレステロール生合成酵素の狭い治療域を阻害することによってステロール中間体レベルを上昇させることができ、また希突起膠細胞およびミエリンの形成を強化することができるものとして同定された化合物がある。ＣＹＰ５１からＥＢＰに及ぶコレステロール生合成酵素を阻害することによってステロール中間体レベルを上昇させることも、ミエリン形成を強化することもできる化合物の例としては、ＣＹＰ５１阻害剤のビホナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、ブトコナゾール、ケトコナゾール、フルベストラント；ステロール１４－レダクターゼ（ＴＭ７ＳＦ２／ＬＢＲ）阻害剤のアモロルフィン、イフェンプロジル、およびジプラシドン；ならびにＥＢＰ阻害剤のＴａｓｉｎ－１、タモキシフェン、ベンズトロピン、クレマスチン、トランス－Ｕ５０４８８、ＥＰＺ００５６８７、ラロキシフェン、ヒドロキシジン、ベサミコール、Ｌ－７４５，８７０、ＴＭＢ－８、シス－Ｎ－シクロヘキシル－Ｎ－エチル－３－（３－クロロ－４－シクロヘキシルフェニル）プロパ－２－エニルアミン、ｐフルオロヘキサヒドロ－シラジフェニドール、プラモキシン、およびトレミフェンがある（図１４を参照のこと）。
[00147]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するための
化合物としては、ＮＡＤ（Ｐ）依存的ステロイド脱水素酵素様（ＮＳＤＨＬまたは３β－ヒドロキシステロイド脱水素酵素／Ｃ４脱炭酸酵素としても知られている）を調節および／または阻害することができる化合物があり得る。ＮＳＤＨＬは、コレステロール経路中
にあり、ラノステロールシンターゼに遠位にあり、ステロール前駆体のＣ－４脱メチル化プロセスを伴う４α－カルボキシステロール中間体のＮＡＤ＋依存的酸化的脱カルボキシル化を触媒し、対応する３－ケト、Ｃ－４脱炭酸化産生物質を産生する。特定の実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するためのＮＳＤＨＬ阻害化合物としては、式
Figure 2023139105000039
を有する化合物（ＦＲ１７１４５６）、ならびにその類似体、誘導体およびこれらの薬学的塩があり得る。
[00148]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる方法において使用するための
化合物としては、コレステロール生合成中にステロール中間体のデルタ－２４二重結合の還元を触媒する酵素であるＤＨＣＲ２４（２４－デヒドロコレステロールレダクターゼ）を調節および／または阻害することができる化合物がある。例えば、本明細書で述べる方法において使用するための化合物としては、希突起膠細胞前駆体細胞の分化、増殖および／または成熟を促進するおよび／または誘発するために効果的な量で、コレステロール生合成経路におけるデスモステロールのコレステロールへのＤＨＣＲ２４媒介性変換を阻害することができる化合物がある。例えば、化合物は、コレステロール生合成経路におけるデスモステロールのコレステロールへのＤＨＣＲ２４媒介性変換を、未処置のＯＰＣまたは対象におけるデスモステロールのコレステロールへのＤＨＣＲ２４媒介性変換の量と比較した場合に、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害することができる。
[00149]本明細書で述べる化合物は、当業者に既知の標準的な合成技術を使用してまた
は本明細書において述べる方法と組み合わせた当技術分野で既知の方法を使用して合成してもよい。さらに、溶媒、温度および本明細書において提示される他の反応条件を、当業者の慣行および知識に従って変更してもよい。
[00150]本明細書で述べる化合物を合成するために使用する出発材料は、Ａｌｄｒｉｃ
ｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）などの市販の供給源から得ることができる、または出発材料は、合成することができる。本明細書において述べる化合物、および異なる置換基を有する他の関連化合物は、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ 第４版、（Ｗｉｌｅｙ １９９２年）；Ｃａｒｅｙ
ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
第４版、ＡおよびＢ巻（Ｐｌｅｎｕｍ ２０００年、２００１年）、およびＧｒｅｅｎ
ａｎｄ Ｗｕｔｓ、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ 第３版、（Ｗｉｌｅｙ １９９９年）に記載されているような、当業者に既知の技術および材料を使用して合成することができる（これらすべてが、これらの全体を参照することにより組み込まれるものとする）。
[00151]別の実施形態において、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ８，９
－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する少なくとも１つの薬剤としては、組織またはそれを必要とする対象の細胞におけるＥＢＰ、Ｃ１４レダクターゼ、またはＣＹＰ５１発現などのコレステロール生合成経路内の酵素の発現を減少させるまたは阻害する薬剤があり得る。「発現」は、遺伝子から遺伝子産物（典型的には、任意選択で翻訳後に修飾されたタンパク質、または機能的／構造的ＲＮＡ）を産生するまでの情報の全体的な流れを意味する。
[00152]いくつかの実施形態において、薬剤としては、細胞中のＥＢＰ、Ｃ１４レダク
ターゼの発現またはＣＹＰ５１発現を阻害するまたは低下させるＲＮＡｉ構築物があり得る。ＲＮＡｉ構築物は、標的遺伝子の発現を特異的にブロックすることができる二本鎖ストランドＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、植物および虫で観察された現象へ最初に適用された用語であり、ここでは、二本鎖ストランドＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的なかつ転写後の様式で遺伝子発現をブロックする。
[00153]本明細書において使用される「ｄｓＲＮＡ」という用語は、ｓｉＲＮＡ分子、
または二本鎖ストランドの特徴を含み、かつ細胞においてｓｉＲＮＡに加工することができる、ヘアピンＲＮＡ部分などの他のＲＮＡ分子を指す。
[00154]「機能の損失」という用語は、それが対象ＲＮＡｉ法によって阻害される遺伝
子を指す場合に、ＲＮＡｉ構築物の非存在下でのレベルと比較して、遺伝子発現レベルが減少することを指す。
[00155]本明細書において使用される「ＲＮＡｉを媒介する」という句は、どのＲＮＡ
がＲＮＡｉプロセスによって分解されるべきかを識別する能力を指し（示し）、例えば、分解が、配列非依存的ｄｓＲＮＡ応答、例えば、ＰＫＲ応答によってよりはむしろ、配列特異的様式によって生じる。
[00156]本明細書において使用される「ＲＮＡｉ構築物」という用語は、本明細書を通
して使用される総称であり、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、およびｉｎ ｖｉｖｏで切断し、ｓｉＲＮＡを形成することができる他のＲＮＡ種を含む。本明細書におけるＲＮＡｉ構築物としてはまた、細胞でｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡを形成する転写産物、および／またはｉｎ ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを産生することができる転写産物をもたらすことができる発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも称される）がある。
[00157]「ＲＮＡｉ発現ベクター」（本明細書において「ｄｓＲＮＡコードプラスミド
」とも称される）は、構築物が発現される細胞のｓｉＲＮＡ部分を産生するＲＮＡを発現する（転写する）ために使用される複製可能な核酸構築物を指す。このようなベクターとしては、（１）（２）へ操作可能に結合された、遺伝子発現において制御的役割を有する遺伝的エレメント、例えば、プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、（２）転写され、二本鎖ストランドＲＮＡ（細胞でアニールし、ｓｉＲＮＡを形成する２本のＲＮＡ部分、またはｓｉＲＮＡ加工することができる単一のヘアピンＲＮＡ）を産生する「コード」配列、および（３）適切な転写開始および終止配列のアセンブリを含む転写単位がある。
[00158]プロモーターおよび他の制御エレメントの選択は、一般的に、ＯＰＣなどの目
的とする宿主細胞によって変わる。一般的に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、「プラスミド」の形態であることが多く、環状二本鎖ストランドＤＮＡループを指し、そのベクター形態では染色体へ結合しない。本明細書において、プラスミドは最も一般的に使用されるベクターの形態であるために、「プラスミド」および「ベクター」は、区別せずに使用される。しかし、本出願は、同等の機能を果たし、ここに、この後、当技術分野で既知となる発現ベクターの他の形態についてを述べる。
[00159]ＲＮＡｉ構築物は、阻害する遺伝子（すなわち、「標的」遺伝子）に関するｍ
ＲＮＡ転写産物の少なくとも一部のヌクレオチド配列へ、細胞の生理学的条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。二本鎖ストランドＲＮＡは、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する天然ＲＮＡと十分に類似していることのみを必要とする。したがって、本実施形態は、遺伝的突然変異、株多型または進化的分岐に起因して予測され得る配列変動を許容する。標的配列とＲＮＡｉ構築物配列との間の許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１個以下、または１０塩基対中１個以下、または２０塩基対中１個以下、または５０塩基対中１個以下である。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心におけるミスマッチは、最も重大であり、かつ標的ＲＮＡの切断を実質的に無効にし得る。対照的に、標的ＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡストランドの３’末端におけるヌクレオチドは、標的認識の特異性の著しい一因とはならない。
[00160]配列同一性は、配列比較および当技術分野で既知のアラインメントアルゴリズ
ムによって最適化し、例えば、デフォルトパラメーターを使用したＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラム（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）で行われるようにＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムによってヌクレオチド配列間のパーセントの差を計算してもよい。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の一部との間の９０％超の配列同一性、またはさらに１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＲＮＡの二本鎖領域は、標的遺伝子転写産物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として機能的に定義してもよい。
[00161]ＲＮＡｉ構築物の産生は、化学的合成方法によってまたは組換え核酸技術によ
って行うことができる。処置された細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ ｖｉｖｏでの転写を媒介していてもよい、またはクローン化ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写のために使用することができる。ＲＮＡｉ構築物は、例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性が低下するように、バイオアベイラビリティが改善するように、配合剤特性が改善するように、および／または他の薬物動態特性が変化するように、ホスフェート－糖骨格またはヌクレオシドのいずれかの修飾を含んでいてもよい。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル結合は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾されていてもよい。ＲＮＡ構造における修飾は、特異的な遺伝的阻害を可能にし、同時にｄｓＲＮＡに対する一般的な応答を回避するように調整してもよい。同様に、塩基は、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックするように修飾されていてもよい。ＲＮＡｉ構築物は、酵素的にまたは部分的に／全体的に有機合成することによって産生してもよく、修飾されたリボヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酵素または有機合成によって導入することができる。
[00162]化学的にＲＮＡ分子を修飾する方法は、ＲＮＡｉ構築物を修飾するために適応
することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：７７６～７８０頁；Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇ ７：８９～９８頁；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：２６６１～２６６８頁；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ７：５５～６１頁を参照のこと）。例示にすぎないが、ＲＮＡｉ構築物の骨格は、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、キメラメチルホスホネート－ホスホジエステル、ペプチド核酸、５－プロピニル－ピリミジン含有オリゴマーまたは糖修飾で修飾することができる（例えば、２’－置換リボヌクレオシド、ａ－配置）。
[00163]二本鎖ストランドの構造は、単一の自己相補的ＲＮＡストランドまたは２本の
相補的ＲＮＡストランドによって形成されていてもよい。ＲＮＡ二本鎖形成は、細胞の内側または外側のいずれかで開始されてもよい。ＲＮＡは、１細胞あたり少なくとも１個のコピーを送達することを可能にする量で導入されてもよい。二本鎖ストランド物質の用量が高いほど（例えば、１細胞あたり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００個のコピー）、より効果的な阻害が得られ得るが、用量が低いほど、特定の適用にも有用であり得る。阻害は、ＲＮＡの二本鎖領域に対応するヌクレオチド配列が遺伝的阻害の標的であるという点において、配列特異的である。
[00164]特定の実施形態において、対象ＲＮＡｉ構築物は、「低分子干渉ＲＮＡ」また
は「ｓｉＲＮＡ」である。これらの核酸は、およそ１９～３０個のヌクレオチド長、さらにより好ましくは２１～２３個のヌクレオチド長であり、例えば、長さの点で、より長い二本鎖ストランドＲＮＡのヌクレアーゼ「ダイシング」によって生じる断片に対応する。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体をまとめ、特異的配列を対にすることによって複合体を標的ｍＲＮＡへとガイドすると理解される。結果的に、標的ｍＲＮＡは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の実施形態において、２１－２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。
[00165]本明細書で述べるｓｉＲＮＡ分子は、当業者に既知の多くの技術を使用して得
ることができる。例えば、ｓｉＲＮＡは、当技術分野で既知の方法を使用して、化学的に合成すること、または遺伝子組換えで産生することができる。例えば、短いセンスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーを合成し、アニールし、２－ヌクレオチドオーバーハングを各末端に有する二本鎖ストランドＲＮＡ構造を形成することができる（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８：９７４２～９７４７頁；ＥＭＢＯ Ｊ、２０：６８７７～８８頁）。次いで、これらの二本鎖ストランドのｓｉＲＮＡ構造は、受動的取り込みまたは以下に述べるような選択肢の送達系のいずれかによって細胞へ直接的に導入することができる。
[00166]特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ構築物は、より長い二本鎖ストランドＲ
ＮＡをプロセシングすることによって、例えば、酵素ダイサーの存在下で生成することができる。１つの実施形態において、キイロショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）がｉｎ ｖｉｔｒｏ系で使用される。この実施形態では、ｄｓＲＮＡを、キイロショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚由来の可溶性抽出物と合わせ、その結果、組合せを産生する。組合せは、ｄｓＲＮＡが約２１～約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子へ加工される条件下で維持する。
[00167]ｓｉＲＮＡ分子は、当業者に既知の多くの技術を使用して精製することができ
る。例えば、ゲル電気泳動を使用し、ｓｉＲＮＡを精製することができる。あるいは、非変性カラムクロマトグラフィーなどの非変性法を使用し、ｓｉＲＮＡを精製することができる。さらに、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いたアフィニティー精製を使用し、ｓｉＲＮＡを精製することができる。
[00168]特定の実施形態において、ＲＮＡｉ構築物は、ヘアピン構造（ヘアピンＲＮＡ
と呼ばれる）の形態である。ヘアピンＲＮＡは、外因的に合成することができる、またはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成することができる。哺乳動物細胞において遺伝子サイレンシングを行うためのそのようなヘアピンＲＮＡの作製および使用の例は、例えば、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、２００２年、１６：９４８～５８頁；Ｎａｔｕｒｅ、２００２年、４１８：３８～９頁；ＲＮＡ、２００２年、８：８４２～５０頁；およびＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、２００２年、９９：６０４７～５２頁に記載されている。好ましくは、そのようなヘアピンＲＮＡは、細胞中でまたは動物中で遺伝子操作し、所望の遺伝子を連続的にかつ安定に抑制することを確実にする。ｓｉＲＮＡは、細胞中のヘアピンＲＮＡをプロセシングすることによって生成できることは当技術分野で既知である。
[00169]さらに別の実施形態において、プラスミドを使用し、二本鎖ストランドＲＮＡ
を、例えば、転写産物として送達する。そのような実施形態において、プラスミドは、ＲＮＡｉ構築物のセンスおよびアンチセンスストランドのそれぞれに関する「コード配列」を含むように設計される。コード配列は、例えば、逆位プロモーターによって隣接した同じ配列とすることができ、または個別のプロモーターの転写コントロール下でそれぞれ２個の個別の配列とすることができる。コード配列が転写された後に、相補的ＲＮＡが塩基対を転写し、二本鎖ストランドＲＮＡを形成する。
[00170]ＰＣＴ出願国際公開第０１／７７３５０号では、真核細胞において同じ導入遺
伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ転写産物の両方を得るための、導入遺伝子の二方向性転写用のベクターの例が記載されている。したがって、特定の実施形態は、以下の特有の特性を有する組換えベクターを提供する。その組換えベクターは、対向方向で配列された２つの重複転写単位を有し、かつ目的のＲＮＡｉ構築物に対して導入遺伝子が隣接したウイルス性レプリコンを含み、ここで２つの重複転写単位は、宿主細胞の同じ導入遺伝子断片からセンスおよびアンチセンスＲＮＡ転写の両方をもたらす。
[00171]いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターを使用して、ショート
ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）などのｓｉＲＮＡを長期発現し、がん細胞中のＲＰＴＰの発現をノックダウンすることができる。遺伝子療法のためのレンチウイルスベクターの使用についていくつかの安全性の問題が存在するが、自己不活性化レンチウイルスベクターは、容易に哺乳動物細胞に対してトランスフェクションを起こすので、遺伝子療法のための優れた候補と考えられる。
[00172]例として、ＡＫＲ１Ａ１発現のショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の下方
制御は、ＯｌｉｇｏＥｎｇｅｎｅソフトウェア（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を使用して作製し、ｓｉＲＮＡの標的として配列を同定することができる。オリゴ配列は、アニールし、線形化ｐＳＵＰＥＲ ＲＮＡｉベクター（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）へライゲーションし、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞へ形質転換することができる。陽性クローンを選択した後に、プラスミドを、カルシウム沈殿によって２９３Ｔ細胞中へトランスフェクションすることができる。次いで、ｓｈＲＮＡを含む収集したウイルス上澄みを使用し、哺乳動物細胞に感染させて、ＥＢＰ、Ｃ１４レダクターゼ、またはＣＹＰ５１酵素を下方制御することができる。
[00173]別の実施形態において、ＥＢＰ、Ｃ１４レダクターゼ、またはＣＹＰ５１阻害
剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡのコードストランド（センスストランド）に対して相補的（またはアンチセンス）である比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、ＲＮＡベースであるが、これらはまた、ＤＮＡベースとすることもできる。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾され、その安定性が高められていることが多い。
[00174]これらの比較的短いオリゴヌクレオチドがｍＲＮＡへ結合すると、二本鎖スト
ランドＲＮＡの伸展が誘発され、内因性ＲＮＡ分解酵素によってメッセージの分解が誘発されると考えられている。さらに、時にはオリゴヌクレオチドは、メッセージのプロモー
ター付近に結合するよう特別に設計され、かつこれらの状況下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、メッセージの翻訳にさらに干渉する。アンチセンスオリゴヌクレオチド機能による特異的メカニズムにもかかわらず、それを細胞または組織に投与すると、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの分解を可能にする。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のタンパク質（例えば、ＥＢＰ、Ｃ１４レダクターゼ、またはＣＹＰ５１）の発現および／または活性を低下させる。
[00175]オリゴヌクレオチドは、一本鎖ストランドまたは二本鎖ストランドの、ＤＮＡ
またはＲＮＡまたはこれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾された変形物とすることができる。オリゴヌクレオチドを、塩基部分、糖部分、またはホスフェート骨格で修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善することができる。オリゴヌクレオチドとしては、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体を標的化するための）、または細胞膜（例えば、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８６：６５５３～６５５６頁；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８４：６４８～６５２頁；１９８８年１２月１５日に発表されたＰＣＴ出願国際公開第８８／０９８１０号を参照のこと）または血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に発表されたＰＣＴ出願国際公開第８９／１０１３４号を参照のこと）を超える輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発切断薬剤（例えば、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８～９７６頁を参照のこと）またはインターカレート薬剤（例えば、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ５：５３９～５４９頁を参照のこと）などの他の付属のグループがあり得る。この目的を達成するために、オリゴヌクレオチドは、他の分子とコンジュゲートまたは結合してもよい。
[00176]本明細書で述べるオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の標準的な方法に
よって、例えば、自動ＤＮＡシンセサイザー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから入手可能なものなど）を使用することによって合成してもよい。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法によって合成してもよく（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９頁）、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、調節多孔ガラスポリマー支持体を使用することによって調製することができる（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ８５：７４４８～７４５１頁）。
[00177]適切なオリゴヌクレオチドの選択は、当業者によって行うことができる。特定
のタンパク質をコードする核酸配列が与えられると、当業者であれば、タンパク質に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、かつｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏ系でこれらのオリゴヌクレオチドを試験し、これらが特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡに結合し、分解を媒介することを確認することができる。特定のタンパク質に特異的に結合し、分解を媒介するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するために、オリゴヌクレオチドによって認識される配列は、その特定のタンパク質に特有であるまたは実質的に特有であることが重要である。例えば、タンパク質にわたって頻繁に繰り返される配列は、特定のメッセージを特異的に認識し、分解するオリゴヌクレオチドを設計するための理想的な選択肢にすることはできない。当業者であればオリゴヌクレオチドを設計し、そのオリゴヌクレオチドの配列を、公的に利用可能なデータベースに寄託された核酸配列と比較し、配列が特定のタンパク質に特異的または実質的に特異的であることを確認することができる。
[00178]多くの方法が、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞へ送達するために開発
されてきた。例えば、アンチセンス分子は組織部位に直接注射することができ、または所望の細胞を標的とするように設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス）は、全身的に投与することができる。
[00179]しかし、特定の場合において、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分な細
胞内濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを達成することは困難な場合がある。したがって、別のアプローチでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターのコントロール下に置かれた組換えＤＮＡ構築物を利用する。例えば、ベクターをｉｎ ｖｉｖｏで導入し、それが細胞によって取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を指示するようにすることができる。このようなベクターは、それを転写し、所望のアンチセンスＲＮＡを生成することができる限りは、エピソームのままとすることができる、または染色体に取り込まれるようにすることができる。このようなベクターは、当技術分野で標準的な組換えＤＮＡの工学的方法によって構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳動物細胞における複製および発現のために使用される、当技術分野で既知の他のものとすることができる。
[00180]アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細
胞で作用するための当技術分野で既知のプロモーターによるものとすることができる。このようなプロモーターは、誘導可能なものであっても、または構成的なものであってもよい。このようなプロモーターとしては、これらに限定されるものではないが：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４～３１０頁）、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｃｅｌｌ ２２：７８７～７９７頁）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７８：１４４１～１４４５頁）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９～４２頁）などがある。あるタイプのプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを使用し、組織部位へ直接導入することができる組換えＤＮＡ構築物を調製することができる。あるいは、投与を別の経路によって（例えば、全身的に）達成してもよい場合、ウイルスベクターを使用し、所望の組織を選択的に感染させることができる。
[00181]いくつかの実施形態において、ＯＰＣ細胞のコレステロール生合成経路におけ
る１つまたは複数のステロール中間体を合成する酵素の内因的発現は、ヌクレアーゼを使用し、酵素またはその遺伝的制御エレメントをコードする遺伝子を編集する（例えば、突然変異させる）ことを通して、ＯＰＣにおいて減少させることができる。ヌクレアーゼおよび本明細書で述べる方法において使用するための関連システムとしては、これらに限定されるものではないが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥエフェクター（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムまたはＮｇＡｇｏシステムがあり得る。いくつかの実施形態において、ＥＢＰ、Ｃ１４レダクターゼ、および／もしくはＣＹＰ５１酵素、またはこれらの遺伝的制御エレメントをコードする内因性遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを使用して編集することができる。特定の態様において、ヌクレアーゼとしては、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムがあり得る。例えば、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとしては、タイプＩＩ Ｃａｓ９系ＣＲＩＳＰＲシステムまたはタイプＶ Ｃｐｆ１系ＣＲＩＳＰＲシステムがあり得る。
[00182]さらなる実施形態において、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ８
，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する薬剤は、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のうちの少なくとも１つのΔ８，９－不飽和ステロール中間体またはその誘導体であって、ＯＰＣからの希突起膠細胞の生成を強化するΔ８，９－不飽和ステロール中間体またはその誘導体を含むことができる。いくつかの実施形態において、Δ８，９－不飽和ステロール中間体としては、ラノステロール、１４－デヒドロザイモステノール、ＦＦ－ＭＡＳ、ＭＡＳ－４１２、ザイモステロール、ザイモステノールおよびこれらの誘導体のうちの少なくとも１つがある。
[00183]本明細書において述べるＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ８，９
－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する薬剤は、医薬組成物の形態で提供して、かつ投与してｉｎ ｖｉｖｏでの希突起膠細胞前駆体の分化および／または成熟を促進することができる。医薬組成物は、本発明の希突起膠細胞前駆体の分化および／または成熟化合物の有益な効果を感じることができる任意の対象に投与することができる。そのような動物のうち最も主要なものは、ヒトであるが、本発明はそのように限定することを意図しない。
[00184]本発明の方法において使用するための医薬組成物は、好ましくは、治療有効量
の化合物またはその塩を、０．０１～１，０００ｍｇ／ｋｇ対象体重の範囲の、より好ましくは約１０～１００ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲の投薬量で有する。
[00185]全体的な投薬量は、対象の健康全般、対象の病態、状態の重症度、改善の所見
、および配合剤、および選択された薬剤の投与経路を含むいくつかの因子に依存する治療有効量であろう。治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。正確な配合剤、投与経路および投薬量は、個々の医師により、対象の状態を考慮して選択することができる。
[00186]本発明は、対象における希突起膠細胞前駆体の分化および／または増殖を促進
することによって、対象における疾患を処置する方法を提供する。方法は、本発明による治療有効量の医薬化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む。上述のように、化合物のうちの１つまたは複数は、１つまたは複数の非毒性の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバント、ならびに必要に応じて他の活性成分を伴って投与することができる。
[00187]本発明の方法において使用される「治療有効量」の化合物およびその塩は、投
与様式、対象の年齢および体重、ならびに処置する対象の状態に依存して変化し、最終的に当業者によって決定されることになる。「治療有効量」という用語は、例えば、神経変性疾患（例えば多発性硬化症）を有する対象の処置に効果的な量（用量）を指す。
[00188]特定の実施形態において、本明細書で述べる化合物は、未処置のＣＮＳニュー
ロンまたは対象におけるミエリンタンパク質レベルと比較した場合に、ミエリンタンパク質（例えば、ＭＢＰ）の量を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％増加させることによって、対象におけるＣＮＳニューロンのミエリン形成を促進するために効果的な量で投与してもよい。
[00189]別の実施形態において、本明細書で述べる化合物は、未処置のＣＮＳニューロ
ンまたは対象における生存ニューロン数と比較した場合に、生存ニューロンの数を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％増加させることによって、対象におけるＣＮＳニューロンの生存を促進するために効果的な量で投与してもよい。
[00190]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる化合物は、未処置のＯＰＣま
たは対象におけるＯＰＣ生成量と比較した場合に、ＯＰＣ生成量を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％増加させることによって、対象の中枢神経系におけるＯＰＣの生成を強化するのに効果的な量で投与してもよい。
[00191]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる化合物は、未処置のＯＰＣま
たは対象におけるＯＰＣ分化の量と比較した場合に、ＯＰＣ分化の量を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％増加させることによって、対象の中枢神経系における内因性希突起膠細胞前駆体細胞（ＯＰＣ）分化を誘発するために効果的な量で投与してもよい。
[00192]いくつかの実施形態において、本明細書で述べる化合物は、未処置のＯＰＣま
たは対象におけるコレステロールおよび／または１つまたは複数のステロール中間体合成の量と比較した場合に、ＯＰＣにおけるコレステロールおよび／または１つまたは複数のステロール中間体合成の量を少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％低下させることによって、対象のＯＰＣ細胞におけるコレステロール生合成経路を調節するために効果的な量で投与してもよい。
[00193]本明細書において使用される「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または処置（
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、重症度および／または症状の頻度の減少、症状および／または基本的な原因の消失、症状および／またはこれらの基本的な原因の発生の予防、ならびに疾患の改善または矯正を指す。このような処置は、疾患が完全に改善することを必要としない。例えば、本発明の希突起膠細胞前駆体分化化合物を投与することによる、神経変性疾患を呈する対象の処置は、疾患を阻害することまたは退行をもたらすことを包含することができる。さらに、そのような処置は、当業者に既知の神経変性疾患のための他の従来の処置とともに使用することができる。
[00194]本発明の医薬組成物は、その意図する目的を達成する任意の手段によって対象
に投与することができる。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、関節内、鞘内、筋肉内、腹腔内、または皮内注射によって、または経皮、経頬、経舌、眼球経路によって、または吸入を介して行うことができる。あるいは、または同時に、投与は、経口経路によって行うことができる。
[00195]上記（および他の）の投与様式における使用のための医薬化合物の配合剤は、
当技術分野で既知であり、かつ例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（例えば、Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｈｂｏｎｅ編、Ｏｒａｌ Ｍｕｃｏｓａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９６年；Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｈｂｏｎｅら編、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００３年；Ｇｈｏｓｈら編、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｏｒａｌ Ｃａｖｉｔｙ、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００５；およびＭａｔｈｉｏｗｉｔｚら編、Ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９９も参照のこと）に記載されている。本発明の化合物は、薬学的に許容される非毒性賦形剤および担体を含む医薬組成物中に配合することができる。賦形剤は、医薬配合剤に存在する活性成分または成分以外の全構成成分である。本発明において有用である好適な賦形剤および担体は、安全かつ効果的であると考えられ、かつ望ましくない生物学的副作用を、または他の医薬との望ましくない相互作用をもたらすことなく個体へ投与してもよい材料から構成される。好適な賦形剤および担体は、薬剤のバイオアベイラビリティおよび性能に影響を与えることはないであろう材料から構成されるものである。本明細書において全体的に使用される「賦形剤」としては、これらに限定するものではないが、界面活性剤、乳化剤、エマルション、安定化剤、皮膚軟化剤、緩衝液、溶媒、色素、香味料、結合剤、フィラー、滑沢剤、および保存料がある。好適な賦形剤としては、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第４版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、２００３年などの当技術分野で一般的に既知のものがある。
[00196]化合物は、神経変性疾患および障害を処置するために対象に投与することがで
きる。神経変性疾患は、本発明の方法によって処置することが考慮される場合に、これらに限定するものではないが遺伝性の遺伝子異常、脳卒中、熱性ストレス、頭部および脊髄外傷（鈍的または感染性病状）、および／または脳内で生じる出血に起因する場合がある。
[00197]本発明のいくつかの態様による処置が考慮される神経変性疾患としては、ミエ
リン関連障害があり得る。ミエリン障害としては、任意の疾患、状態（例えば、外傷性の脊髄損傷および脳梗塞から生じるもの）、またはミエリン脱落、不十分なミエリン形成および再ミエリン形成と関連する障害、または対象におけるミエリン発育不全形成があり得る。本明細書において使用されるミエリン関連障害は、ミエリン形成関連障害または様々な神経毒性傷害から生じるミエリン脱落に起因する。本明細書において使用される「ミエリン脱落」は、脱髄の作用、または神経を絶縁するミエリン鞘の損失を指し、かついくつかの神経変性自己免疫疾患の象徴であり、多発性硬化症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄多発神経障害、およびギランバレー症候群を含む。白質ジストロフィーは、ＣＮＳ白質内でのミエリン鞘の異常形成、破壊、および／または異常代謝回転を引き起こす遺伝性酵素欠損によって生じる。後天的ミエリン障害も遺伝的ミエリン障害も予後不良を共有し、重度障害をもたらす。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、対象における神経変性自己免疫疾患を処置するための方法を含み得る。ニューロンの再ミエリン形成には希突起膠細胞が必要とされる。本明細書において使用される「再ミエリン形成」という用語は、ミエリン産生細胞を置き換えるまたはその機能を回復させることによって神経のミエリン鞘を再生成することを指す。
[00198]本発明の方法によって処置してもまたは改善してもよいミエリン関連疾患また
は障害としては、対象の脳細胞、例えばＣＮＳニューロンにおけるミエリン発育不全形成またはミエリン脱落に関連する、疾患、障害または損傷がある。このような疾患としては、これらに限定されるものではないが、ニューロンを囲むミエリンが、不存在である、不完全である、適切に形成されていない、または劣化している疾患および障害がある。このような疾患としては、これらに限定されないが、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心ミエリン崩壊症（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー疾患、ペリツェウスメルツバッハー疾患（ＰＭＤ）、白質消失疾患、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン疾患、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、脊髄損傷、外傷性脳損傷、放射線後損傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、単独性ビタミンＥ欠乏症症候群、バッセンコーンツバイク症候群、マルキアファーバビニャーミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、急性散在性脳炎、ギランバレー症候群、シャルコーマリートゥース疾患、ベル麻痺、および統合失調症などの精神的健康障害がある。
[00199]いくつかの実施形態において、本発明の方法によって処置してもまたは改善し
てもよいミエリン関連疾患または障害としては、白質ジストロフィーがある。白質ジストロフィーは、あるグループの進行性代謝性遺伝的疾患であり、脳、脊髄に影響を与え、かつ末梢神経に影響を与えることが多い。各タイプの白質ジストロフィーが、脳のミエリン鞘の異常発生または破壊をもたらす特定の遺伝子の異常によって生じる。各タイプの白質ジストロフィーが、ミエリン鞘の異なる部分に影響を与え、様々な神経学的問題をもたらす。本発明の方法によって処置してもまたは改善してもよい例示的な白質ジストロフィーとしては、これらに限定されるものではないが、成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、エカルディグティエール症候群、アレキサンダー疾患、ＣＡＤＡＳＩＬ、カナバン疾患、ＣＡＲＡＳＩＬ、脳腱黄色腫症、小児運動失調および大脳髄鞘低形成（ＣＡＣＨ）／白質消失疾患（ＶＷＭＤ）、ファブリー疾患、フコシドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ疾患、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症、皮質下嚢胞を有する大頭型白質脳症、異染性白質ジストロフィー、多発性のスルファターゼ欠損症、ペリツェウスメルツバッハー疾患（ＰＭＤ）、ＰｏｌＩＩＩ－関連白質ジストロフィー、レフサム疾患、サラ疾患（遊離シアル酸貯蔵疾患）、シェーングレンラルソン症候群、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、およびツェルウェーガー症候群スペクトラム障害がある。
[00200]本発明の方法によって処置してもまたは改善してもよいミエリン関連疾患また
は障害としては、ミエリン欠損によって特徴付けられる疾患または障害がある。中枢神経系における不十分なミエリン形成は、広範囲の神経学的障害に関与している。これらの中の１つは、脳室周囲白質軟化を呈する小児における前脳ミエリン形成の先天性欠損が、神経学的病態の一因となる脳性麻痺の形態である（Ｇｏｌｄｍａｎら、２００８年）。Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｓ．Ａ．、Ｓｃｈａｎｚ、Ｓ．、およびＷｉｎｄｒｅｍ、Ｍ．Ｓ．（２００８年）。Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．１７、Ｒ７６～８３頁。年代スペクトルのもう一端で（Ａｔ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｅｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ａｇｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、ミエリン損失および無効な修復は、老化と関連する認知機能の低下の一因となる場合がある（Ｋｏｈａｍａら、２０１１年）。Ｋｏｈａｍａ、Ｓ．Ｇ．、Ｒｏｓｅｎｅ、Ｄ．Ｌ．、およびＳｈｅｒｍａｎ、Ｌ．Ｓ．（２０１１年）Ａｇｅ（Ｄｏｒｄｒ）。Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｗｈｉｔｅ ｍａｔｔｅｒ：ｆｒｏｍ ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ ｔｏ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ。したがって、ミエリン形成および／または再ミエリン形成を強化する効果的な化合物および方法は、ＭＳにおけるかつ広範囲の神経学的障害における疾患の進行および回復機能を食い止める点で実質的な治療的利点を有し得ることが検討される。
[00201]いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、ミエリン関連障害を呈さな
い、および／または呈する疑いがない対象に投与して、ミエリン依存的プロセスを強化するまたは促進することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で述べる化合物
を対象に投与し、ＣＮＳニューロンのミエリン形成を促進して、ミエリン依存的プロセスであることが既知である認知健常対象における認知を強化することができる。特定の実施形態において、本明細書で述べる化合物は、認知的強化（向知性）剤と組み合わせて投与することができる。例示的な薬剤としては、任意の薬物、サプリメント、または認知機能、特に、健常個体における実行機能、記憶、創造力、または意欲を改善する他の物質がある。非限定的な例としては、ラセタム（例えば、ピラセタム、オキシラセタム、およびアニラセタム）、栄養補助食品（例えば、オトメアゼナ（ｂａｃｏｐａ ｍｏｎｎｉｅｒｉ）、チョウセンニンジン（ｐａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇ）、ギンコビローバ（ｇｉｎｋｏ ｂｉｌｏｂａ）、およびＧＡＢＡ）、刺激薬（例えば、アンフェタミン医薬品、メチルフェニデート、ユージェロイック、キサンチン、およびニコチン）、Ｌ－テアニン、トルカポン、レボドパ、アトモキセチン、およびデシプラミンがある。
[00202]本発明の１つの特定の態様では、対象における多発性硬化症の処置が検討され
る。その方法は、治療有効量の、上述の１つまたは複数の希突起膠細胞分化促進化合物を対象に投与することを含む。
[00203]多発性硬化症（ＭＳ）は、最も一般的な脱髄疾患である。多発性硬化症におい
て、身体がミエリンを修復できないと、神経損傷がもたらされ、多発性硬化症関連症状が引き起こされ、かつ能力障害が増加されると考えられている。ＭＳにおいて観察されるミエリン脱落は、必ずしも永続的とは限らず、かつ再ミエリン形成が、疾患の初期段階で立証されてきた。本発明の方法は、対象における希突起膠細胞前駆体細胞の分化を促進することができ、したがって内因性の再ミエリン形成を引き起こすことが考えられる。
[00204]本発明の別の特定の態様では、対象におけるミエリンの損失（ミエリン脱落）
に起因する遺伝的ミエリン障害の処置が検討される。方法は、上述のＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する治療有効量の１つまたは複数の薬剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、遺伝的ミエリン障害は、これらに限定されないが、ペリツェウスメルツバッハー疾患（ＰＭＤ）などの白質ジストロフィーである。
[00205]神経変性疾患または障害に罹患した対象を処置するための別の戦略は、治療有
効量の本明細書で述べる化合物を、治療有効量の追加の希突起膠細胞分化および／または増殖誘発剤および／または抗神経変性疾患剤とともに投与することである。抗神経変性疾患剤の例としては、Ｌ－ドパ、コリンエステラーゼ阻害剤、抗コリン作動薬、ドーパミン作動薬、ステロイド、ならびにインターフェロン、モノクローナル抗体、および酢酸グラチラマーを含む免疫調節薬がある。
[00206]したがって、本発明のさらなる態様において、本明細書で述べる希突起膠細胞
前駆体の分化および／または増殖誘発化合物は、組合せ療法の一部として、神経変性およびミエリン関連障害を処置するための補助療法とともに投与することができる。
[00207]「組合せ療法」という句は、本明細書で述べる希突起膠細胞前駆体分化誘発化
合物、およびこれらの治療剤の共同作用から有益な効果を提供することを意図する特定の治療レジメンの一部としての治療剤の投与を包含する。組合せとして投与するときに、希突起膠細胞前駆体分化誘発化合物および治療剤は、個別の組成物として配合することができる。典型的な組合せでのこれらの治療剤の投与は、規定の期間（通常は、選択した組合せによって、分、時間、日または週）にわたって行われる。
[00208]「組合せ療法」は、連続的様式でのこれらの治療剤の投与、すなわち、各治療
剤を異なる時間で投与すること、ならびに実質的に同時的様式でのこれらの治療剤、また
は治療剤のうちの少なくとも２つの投与を包含することを意図する。実質的同時投与は、例えば、固定比率の各治療剤を有する単一のカプセル剤、または治療剤ごとの、複数の単一のカプセル剤を対象に投与することによって達成することができる。各治療剤の連続的または実質的な同時投与は、任意の適切な経路によって達成することができ、これらに限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通した直接吸収を含む。治療剤は、同じ経路によってまたは異なる経路によって投与することができる。例えば、選択された組合せの第１の治療剤は、静脈内注射によって投与してもよく、同時に組合せのもう一方の治療剤を経口で投与してもよい。あるいは、例えばすべての治療剤を経口で投与してもよい、またはすべての治療剤を静脈内注射によって投与してもよい。治療剤を投与する順序は、かろうじて重要ではない。「組合せ療法」も、他の生物学的活性成分（これらに限定されないが、第２のおよび異なる治療剤など）および非薬物療法（例えば手術）とさらに組み合わせた、上述のような治療剤の投与を包含することができる。
[00209]本発明の別の態様において、本明細書で述べる希突起膠細胞分化および／また
は増殖誘発化合物との組合せ療法で投与される治療剤としては、これらに限定されないが、免疫療法剤などの少なくとも１つの抗神経変性薬剤があり得る。
[00210]本発明の方法において使用するための免疫療法剤としては、疾患の免疫構成成
分および／または再発寛解型多発性硬化症における急性発作中の根拠となる急性炎症性応答を標的とする治療法があり得る。例としては、これらに限定されるものではないがインターフェロンベータ－ｌａおよびベータ－ｌｂ（それぞれＡｖｏｎｅｘおよびＢｅｔａｓｅｒｏｎ）、ナタリズマブ（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、酢酸グラチラマー（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）またはミトキサントロンなどの免疫調節薬がある。
[00211]本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、この実施例は特許請求の範
囲を限定することを意図しない。
[00212]この実施例では、ミエリン再生は、ＣＮＳにおける豊富な幹細胞母集団であり
、新規のミエリン形成希突起膠細胞の主要供給源である希突起膠細胞プロジェニター細胞（ＯＰＣ）によって媒介されることを示す。中枢神経系（ＣＮＳ）におけるミエリン産生希突起膠細胞の損失が、多発性硬化症および多様な遺伝的疾患を含む多数の神経疾患の根底にある。本発明者らは、ハイスループット化学スクリーニングアプローチを使用して、希突起膠細胞形成を刺激することによってＯＰＣからミエリン形成を促進する、かつｉｎ
ｖｉｖｏで再ミエリン形成を機能的に強化する小分子を同定した。ここでは、本発明者らは、広範囲なこれらのミエリン形成促進分子（ｐｒｏ－ｍｙｅｌｉｎａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）が、それらの標準的な標的を通してではなく、コレステロール生合成経路内の狭い範囲の酵素であるＣＹＰ５１、ステロール１４－レダクターゼ、およびＥＢＰを直接的に阻害することによって機能することを実証する。本発明者らは、これらの酵素を化学的または遺伝的に阻害すると、Δ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積がもたらされ、これをＯＰＣへ独立に供給するときに、新規の希突起膠細胞の形成が強化されたことを見い出した。機能的研究によって、ＣＹＰ５１、ステロール１４－レダクターゼ、およびＥＢＰの小分子阻害剤が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト脳組織およびｉｎ ｖｉｖｏでのマウス脳組織におけるΔ８，９－不飽和ステロールの蓄積を誘発することが示された。同じ用量で、これらの分子はまた、リゾレシチン誘発ミエリン局所脱落マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏでのミエリン形成の速度を強化する。まとめると、本発明者らの結果より、既知のほとんどの、希突起膠細胞形成の小分子エンハンサーに関する統一された作用メカニズム、および最適なミエリン再形成療法の開発に関する主要な特定の標的が提供される。
方法
[00213]非統計的方法を使用し、サンプルサイズをあらかじめ決定した。
小分子
[00214]小分子の同一性および純度をＬＣ／ＭＳによって証明してから使用した。以下
の化合物：ケトコナゾール、ミコナゾール、クロトリマゾール、フルコナゾール、フルベストラント、イフェンプロジル、ベンズトロピン、リオチロニン、ベキサロテン、タモキシフェン、オスペミフェン、ＧＳＫ３４３、トランス－Ｕ５０４８８およびコレステロールを固形物としてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。以下の化合物：クレマスチン、ＡＹ９９４４、ＹＭ５３６０１およびＲｏ－４８－８０７１を固形物としてＣａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。以下の化合物：Ｒ－トランス－ケトコナゾール、およびＳ－トランス－ケトコナゾールを、固形物としてＪａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手した。メバスタチンを、固形物としてＳｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。以下の化合物：ビホナゾール、ブトコナゾール、アモロルフィン、トレミフェン、ＥＰＺ００５６８７、ＥＰＺ６４３８、ＵＮＣ１９９９、ヒドロキシジン、ジプラシドン、ｐ－フルオロヘキサヒドロ－シラ－ジフェニドール（図ではＳｉｇｍａ Ｈ１２７と省略した）、ベサミコール、ラロキシフェン、Ｌ－７４５，８７０、ＴＭＢ－８、プラモキシン、バレスプラジブ、タンシノン－Ｉ、レボフロキサシン、ナテグリニド、アビラテロン、アロプリノール、デトミジン、リバスチグミン、ベータカロテン、ＢＥＺ－２３５、スコポラミン、およびホマトロピンを、１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液として、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入した。ピレンゼピンおよびテレンゼピンを、１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液としてＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。コレステロール生合成中間体：ラノステロール、ザイモステロール、ザイモステノール、ラソステロール、デスモステロール、７－デヒドロデスモステロールおよびＴ－ＭＡＳを、固形物としてＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入した。１４－デヒドロザイモステノール（コレスタ－８，１４－ジエン－β－オール）は、Ｆｒａｎｚ Ｂｒａｃｈｅｒ、Ｌｕｄｗｉｇ－Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｎｉｃｈより提供された。イミダゾール１２４、ＴＡＳＩＮ－１、およびＭＧＩ３９を報告されたとおりに合成した。
マウスＯＰＣの調製
[00215]ＯＰＣに対する小分子および遺伝的処置の効果を厳密に評価するために、すべ
ての処置を胚盤葉上層幹細胞から誘導されたＯＰＣの２つのバッチでアッセイし、主要な結果を、マウス一次ＯＰＣを使用して確認した。ＯＰＣを、２つの個別のＥｐｉＳＣ株であるＥｐｉＳＣ５（ＯＰＣ－５ＯＰＣをもたらす）および１２９Ｏ１（ＯＰＣ－１ ＯＰＣをもたらす）から生成した。特に注記されていない限り、ＯＰＣ－５細胞の結果は、図１～４に示し、同時にＯＰＣ－１の結果は図５～１１に示す。
[00216]ＥｐｉＳＣから誘導されたＯＰＣを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化手順および前
述の培養条件を使用して得た。すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング実験にわたって均一性を確実にするために、ＥｐｉＳＣから誘導されたＯＰＣを、蛍光活性化細胞ソーティングによって、５継代で、コンジュゲートＣＤ１４０ａ－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１７－１４０１；１：８０）およびＮＧ２－ＡＦ４８８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５３２０Ａ４；１：１００）抗体を用いて純度について選別した。選別されたＯＰＣのバッチを拡大させ、分割して凍結した。ＯＰＣを、成長条件中にて解凍し１回継代してから、さらなるアッセイに使用した。培養物を定期的に試験し、マイコプラズマ不含であることを示した。
[00217]マウス一次ＯＰＣを得るために、出生２日後の麻酔した仔マウスから脳全体を
氷上に取り出した。脳を冷却ＤＭＥＭ／Ｆ１２に入れ、皮質を単離し、髄膜を除去した。皮質を手動で刻み、Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）
を用いて加工し、３７℃で１０分間インキュベートした。細胞懸濁液を、７０μＭフィルターに通してろ過し、２００×ｇ、室温で４分間遠心分離した。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で洗浄し、再び遠心分離し、Ｎ２Ｍａｘ、Ｂ２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、２０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ、および２０ｎｇ／ｍＬ ＰＤＧＦが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２を含むポリオルニチンおよびラミニン処理フラスコに蒔いた。処置前に小分子を１回のパッセージに供した。培地を４８時間ごとに交換した。
ＯＰＣのＩｎ ｖｉｔｒｏ表現型スクリーニング
[00218]ＥｐｉＳＣから誘導されたＯＰＣを成長培地（Ｎ２－ＭＡＸ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ）、Ｂ－２７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、ＦＧＦ２（１０μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３－ＦＢ－０２５）およびＰＤＧＦ－ＡＡ（１０μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、２３３－ＡＡ－０５０）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２）を含むポリオルニチン（ＰＯ）およびラミニン被覆フラスコ中で、成長させ、拡大させてから、採取して、蒔いた。細胞を、ラミニン（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２０２０；１５μｇ／ｍｌ）で被覆されたポリ－Ｄ－リジン９６ウェルＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上に、マルチチャネルピペットを使用して播種した。実験用に、分化培地（Ｎ２－ＭＡＸおよびＢ－２７が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２）中の８００，０００細胞／ｍＬの原液を調製し、氷上で２時間保管した。次いで、１ウェルあたり細胞４０，０００個を分化培地に播種し、３０分間付着させてから、薬物を添加した。ステロールを除くすべての分子の用量反応試験用に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０００×の化合物原液を、０．１μＬソリッドピンマルチブロットレプリケーター（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＶＰ４０９）を有するアッセイプレートへ添加し、１×の最終的な一次スクリーニング濃度を得た。ステロールを、エタノール溶液（０．２％最終エタノール濃度）として細胞に添加した。陽性対照ウェル（ケトコナゾール、２．５μＭ）およびＤＭＳＯビヒクル対照を各アッセイプレートに含めた。細胞を標準的な条件下（３７℃、５％ＣＯ２）で３日間インキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分間固定した。固定したプレートを、ＰＢＳ（１ウェルあたり２００μＬ）で２回洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、ＰＢＳ中の１０％（ｖ／ｖ）ロバ血清で４０分間ブロックした。次いで、細胞を、ＭＢＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ７３４９；１：２００）を用い、４℃で１６時間標識し、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体（１：５００）を用いて４５分間検出した。核を、ＤＡＰＩ染色（Ｓｉｇｍａ；１μｇ／ｍｌ）によって可視化した。洗浄ステップ中に、ＰＢＳを、マルチチャネルピペットを使用して添加し、９６ウェル吸引マニホールドを備えたＢｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６ウォッシャーディスペンサー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して吸引を行った。
ハイコンテンツ画像化および分析
[00219]プレートを、Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツ画像化および分析システム（Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化し、一連の６フィールドを各ウェルから捕捉し、１ウェルあたり平均１２００個の細胞をスコア化した。分析（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｈａｒｍｏｎｙ ａｎｄ Ｃｏｌｕｍｂｕｓソフトウェア）を、ＤＡＰＩによって染色された無傷核；すなわち、表面積が３００μｍ２より大きいトレースされた核を同定することによって開始した。次いで、各トレースされた核領域を、５０％拡大し、成熟ミエリンタンパク質（ＭＢＰ）染色と相互参照し、希突起膠細胞核を同定し、これより希突起膠細胞の百分率を計算した。いくつかの実験において、ＭＢＰ＋希突起膠細胞の全プロセス長を前述のように計算した。
３，０００個の生物活性小分子種類のハイスループットスクリーニング
[00220]ＥｐｉＳＣから誘導されたＯＰＣをポリオルニチンおよびラミニン被覆フラス
コ中で成長させ、拡大させてから、採取して蒔いた。細胞を、ポリ－Ｄ－リジン／ラミニ
ン（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２０２０；４μｇ／ｍｌ）被覆滅菌、３８４ウェル、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ ｕｌｔｒａプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）中に、ノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１００ｎｇ／ｍｌ）、ニューロトロフィン３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１０ｎｇ／ｍｌ）、ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ；５０μＭ）、およびＩＧＦ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１００ｎｇ／ｍｌ））が補充された分化培地中に含めて、５μＬ分注カセット（Ｂｉｏｔｅｋ）を備えたＢｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６マイクロプレートウォッシャーディスペンサー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して分注し、最終密度を１ウェルあたり細胞１２，５００個とし、４５分間付着させてから、薬物を添加した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の３ｍＭの生物活性化合物ライブラリーの原液を、Ａｂｇｅｎｅストレージ３８４ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＡＢ１０５５）中で調製した。これらをアッセイプレートへ、Ｊａｎｕｓ自動ワークステーション（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に取り付けられた５０ｎＬソリッドピンツールを使用して添加し、最終スクリーニング濃度を２μＭとした。細胞を、３７℃で１時間インキュベートし、次いでＴ３（Ｓｉｇｍａ；４０ｎｇ／ｍｌ）を、陰性対照を除くすべてのウェルへ添加し、陰性対照には、ＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を代わりに添加した。陰性対照およびＴ３単独を各アッセイプレート中に入れた。９６ウェルＯＰＣアッセイ手順と同様に、３７℃で７２時間インキュベートした後、細胞を固定し、洗浄し、染色したが、すべての洗浄ステップは、９６ウェル吸引マニホールドを備えたＢｉｏｔｅｋ ＥＬ４０６マイクロプレートウォッシャーディスペンサー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して行った。細胞をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ；１μｇ／ｍｌ）およびＭＢＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ７３４９；１：１００）で染色した。プレートを、Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツ画像化および分析システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化し、一連の４フィールドを各ウェルから捕捉し、１ウェルあたり平均７００個の細胞をスコア化した。上記のハイコンテンツ画像化および分析のように、分析を行った。一次スクリーニング用のすべてのプレートを加工し、同時に分析し、変動を最小限にした。ＤＭＳＯ対照ウェルに対して核数が２０％超で減少した分子を検討から除外し、同じプレート内のＤＭＳＯ対照に対するＭＢＰ＋希突起膠細胞の百分率における最大増加倍数に基づいてヒット化合物を判定した。さらなる実験用にリードヒット化合物を選択するときに、イミダゾール抗真菌剤およびクレマスチンを含む、前回のスクリーニングで得られた分子を除外した。
ＧＣ／ＭＳベースのステロールプロファイリング
[00221]ＥｐｉＳＣから誘導されたＯＰＣを、１ウェルあたり細胞百万個で、分化培地
を含むＰＤＬおよびラミニン被覆６ウェルプレートに蒔いた。２４時間後、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて分離し、生理食塩水ですすぎ、細胞ペレットを凍結した。ステロール分析用に、細胞を、メタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中に３０分間かき混ぜながら溶解し、細胞残屑を、１０，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって除去した。コレステロール－ｄ７標準（２５，２６，２６，２６，２７，２７，２７－２Ｈ７－コレステロール、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加してから、窒素気流下で乾燥し、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド／トリメチルクロロシラン５５μｌで誘導体化し、トリメチルシリル誘導体を形成した。６０℃で２０分間の誘導体化に続いて、６８９０ガスクロマトグラフィーシステムおよびＨＰ－５ＭＳキャピラリーカラム（６０ｍ×０．２５μｍ×０．２５ｍｍ）を備えた、Ａｇｉｌｅｎｔ５９７３ネットワーク質量選択検出器を使用して、１μｌをガスクロマトグラフィー／質量分析法によって分析した。サンプルをスプリットレスモードで注入し、電子衝突電離を使用して分析した。イオン断片ピークを積分し、ステロール存在量を計算し、定量化はコレステロール－ｄ７との比較で行った。以下のｍ／ｚイオン断片：コレステロール－ｄ７（４６５）、ＦＦ－Ｍａｓ（４８２）、コレステロール（３６８）、ザイモステノール（４５８）、ザイモステロール（４５６）、デスモステロール（４５６、３４３）、７－デヒドロコレステロール（４５６、３２５）、ラノステロール（３９３）、ラソステロール（４５８）、１４－デヒドロザイモステノール（４５６）を使用し、各代謝産物を定量化した。異なる濃度のステロール標準を注入し、かつ固定量のコレステロール－Ｄ７を維持することによって、検量線を作成した。ヒト神経膠腫細胞株ＧＢＭ５２８はＪｅｒｅｍｙ Ｒｉｃｈ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃ）から寄贈された。皮質類器官を前述のように作製した。
ＣＹＰ５１酵素アッセイ
[00222]ＣＹＰ５１酵素活性を、報告された方法に以下のわずかな変更を加えて使用し
、測定した。ラットＣＹＰ５１（Ｃｙｐｅｘ、Ｉｎｃ．）を酵素として使用し；反応体積は５００μｌであり；反応時間は３０分であり；ラノステロール濃度５０μＭであり；かつ反応は、イソプロパノール５００μｌでクエンチした。最終的に、各反応／イソプロパノール混合物１５μｌを、ＡＰＣＩイオン源をポジティブイオンモードで使用し、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＦＬＣ－２０ＡＤ ＨＰＬＣおよび４０℃のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｉｘ Ｃ１８ＸＢ５０×２．１×２．６カラムを備えた、ＳＣＩＥＸ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。
ＥＢＰ酵素アッセイ
[00223]ＥＢＰ酵素活性を、報告された方法に以下のわずかな変更を加えて使用し、測
定した。活性ＥＢＰはマウスミクロソームから得、阻害剤を添加し、ザイモステノールを添加し、最終濃度を、最終反応体積５００μｌ中の２５μＭとし、かつ反応物を３７℃で２時間インキュベートした。ステロールをヘキサン３×１ｍｌを使用して抽出し、コレステロール－ｄ７を添加し、定量化ができるようにし、プールした有機物を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、窒素ガス下で蒸発させた。次いで、サンプルをシリル化し、上述のようなＧＣ／ＭＳを使用して分析した。
ｓｉＲＮＡ処置
[00224]細胞透過性ｓｉＲＮＡを、４つの個々のマウスＣＹＰ５１標的化ｓｉＲＮＡま
たは非標的化対照（Ａｃｃｅｌｌ ｓｉＲＮＡｓ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のプールとして得た。分化分析用に、細胞を９６ウェルプレートに蒔き（上述のように）、分化培地で希釈したＲＮＡ分解酵素不含水中に懸濁した１μＭプールｓｉＲＮＡで処置した（上述のように）。ステロール分析用に、細胞を、６ウェルプレートに１ウェルあたり細胞３００，０００個で、ＰＤＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、２０ｎｇ／ｍｌ）、ニューロトロフィン３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１０ｎｇ／ｍｌ）、ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ；５０μＭ）、ＩＧＦ－１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１００ｎｇ／ｍｌ）、ノギン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；１００ｎｇ／ｍｌ）が補充された標準分化培地に蒔いた。２４時間目に、１μＭ ｓｉＲＮＡを培地へ添加した。細胞を、成長因子を４８時間ごとに補充しながら、ｓｉＲＮＡ含有培地でさらに３日間成長させてから、採取し、プロセシングして、上述のようにＧＣ／ＭＳ分析を行った。
ミエリン局所脱落、薬物処置および組織学的分析
[00225]脊髄後索におけるミエリン局所脱落を、１％ＬＰＣ溶液を注射することによっ
て誘発した。１２週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、イソフルレンを使用して麻酔し、Ｔ１０椎弓切除を行った。１％ＬＰＣ１μｌを、後索へ１５μｌ／時間の速度で注入した。４日目に、動物を処置群に割り付けてから処置した（外科的合併症のために動物２匹を除外した）。椎弓切除してから４日目と１１日目との間に、動物に、ビヒクルまたは薬物のいずれかの腹腔内注射を毎日行った。薬物をＤＭＳＯまたはコーン油に溶解し、次いで、注射用滅菌生理食塩水で希釈し、最終用量がタモキシフェンに関しては２ｍｇ／ｋｇおよびイフェンプロジルに関しては１０ｍｇ／ｋｇとなるようにした。この実験を盲検様式で行った：化合物をコード化し、実験を行う研究者に、各動物に投与された処置が知られないことを確実にした。椎弓切除してから１２日後にすべての動物を安楽死させた（１群あたりｎ＝４～６）。マウスを、ケタミン／キシラジン齧歯動物カクテルを使用して麻酔し、次いで４％ＰＦＡ、２％グルタルアルデヒド、および０．１Ｍカコジル酸ナトリウムを用いた経心腔的灌流によって安楽死させた。サンプルをオスミウム化（ｏｓｍｉｃａｔｅｄ）し、酢酸ウラニルで全体的に染色し、ＥＭｂｅｄ ８１２、Ｅｐｏｎ－８１２置換物に包埋した（ＥＭＳ）。１μｍの断片を切り取り、トルイジンブルーで染色し、光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＤＭ５５００Ｂ）で可視化した。単位面積あたりのミエリン化軸索の数を各病変部の中央部における断片から計数し、次いで各処置群を平均化した。マンホイットニー統計分析を行い、統計的有意性を評価した。
マウス脳ステロールレベルの分析
[00226]１０～１２週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、滅菌生理食塩水中の、コーン油
（タモキシフェン）またはＤＭＳＯ（イフェンプロジル、ミコナゾール）に溶解した２ｍｇ／ｋｇタモキシフェン、１０ｍｇ／ｋｇイフェンプロジル、または１０ｍｇ／ｋｇミコナゾールを３日間毎日注射した。マウスをイソフルレンで麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水で灌流し、脳から血液を除去した。脳を収集し、液体窒素を使用して急速冷凍した。サンプルを、粉砕し、組織５０～１００ミリグラムを収集して、さらなるプロセシングを行った。変更したフォルチプロトコールを使用して、ステロールを抽出した。簡潔には、サンプルを、２：１クロロホルム／メタノール混合物中に再懸濁し、ホモジネートした。細胞残屑を遠心分離によって４０００ｇで１０分間除去した。溶液を空気下で乾燥し、ヘキサン中にコレステロール－Ｄ７標準とともに再懸濁し、再び乾燥した。脂質を、ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド７０μｌで誘導体化し；２μｌを注入し、上述のようにＧＣ／ＭＳによって分析した。
エストロゲン依存的細胞増殖アッセイ
[00227]エストロゲン依存的細胞増殖を、わずかな変更を加えて前述のように測定した
。エストロゲン不含培地（１０％活性炭処理済みウシ胎児血清が補充されたフェノールレッド不含ＲＰＭＩ）中で５日間成長させた後、細胞を、９６ウェルプレート中に２，５００細胞／ウェルで播種した。３×の薬物含有培地を、３連のウェルへ添加した日の後に、細胞を、標準的な５％ＣＯ２湿潤インキュベーターで、３７℃でさらに５日間成長させた。ＬａｂａｒｃａおよびＰａｉｇｅｎの方法の適応を使用して１ウェルあたりの全ＤＮＡを測定した。この時点で、培地を除去し、細胞を０．２５×ＰＢＳで１回洗浄し、蒸留水１００ｕｌを添加した。プレートを凍結し、解凍し、細胞溶解を高め、２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．４中の１０μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ．）２００μｌを添加した。室温で２時間インキュベートした後、プレートを、３６０ｎｍでの励起および４６０ｎｍでの放出を用いた、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３蛍光プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）で読み取った。すべての値を、精製サケ試験ＤＮＡ由来の標準曲線を使用して１ウェルあたりのマイクログラムＤＮＡへ変換した。
希突起膠細胞形成およびエレクトロスパンマイクロファイバー上での画像
[00228]Ｍｉｍｅｔｅｘ整列スキャフォールド（マイクロファイバープレート、ＡＭＳ
ＢＩＯ、ＡＭＳ．ＴＥＣＬ－００６－１Ｘ、エレクトロスパンポリ－Ｌ－ラクチドスキャフォールド、２μＭ繊維直径の細胞クラウン挿入物）を含む１２ウェルプレートを前述のように調製した。簡潔には、挿入物を７０％エタノールで滅菌し、ＰＢＳで洗浄してから、ポリオルニチンおよびラミニンで被覆した。ラミニン被覆後、１００，０００細胞／ｍＬのＥｐｉＳＣから誘導されたＯＰＣを分化培地に蒔いた。２４時間後、培地を、小分子処置を含む新鮮な培地に置き換えた。培地を、新鮮な化合物を含有する培地で４８時間ごとに合計１４日間置き換えた。プレートを４％ＰＦＡで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理し、ＰＢＳ中の１０％（ｖ／ｖ）ロバ血清で６０分間ブロックした。プレートをＭＢＰ（Ａｂｃａｍ、ａｂ７３４９；１：１００）およびＤＡＰＩ染色（Ｓｉｇｍａ；５μｇ／ｍｌ）用に染色した。染色後、挿入物を、新規の１２ウェルプレート中に移し、ＰＢＳ２ｍＬで覆ってから、Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツ画像化および分析システムで画像化した。プレートをＯｐｅｒｅｔｔａハイコンテンツ画像化および分析システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化し、一連の８フィールドを各ウェルから捕捉し、１ウェルあたり平均４５，０００個の細胞をスコア化した。分析（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＨａｒｍｏｎｙおよびＣｏｌｕｍｂｕｓソフトウェア）より、ＤＡＰＩによって染色された無傷核が同定され、１ウェルあたり１細胞あたりのＭＢＰシグナル強度が計算された。マイクロファイバー挿入物追跡画像を、２０×Ｄｒｙ／ＮＡ ０．４０対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＤＭｉ８を使用して撮影した。マイクロファイバープレート挿入物を、Ｆｌｏｕｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用して設置し、部分的に硬化してからカバースリップを添加し、挿入リングを除去した。共焦点画像を、４０×油浸／ＮＡ１．３０対物レンズを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点走査型顕微鏡で得た。０．３３６μｍ ｚ－ステップの共焦点スタックを１０２４×１０２４で撮影した。各フルオロフォアを連続的に励起し、すべてのコントラストおよび輝度の変化を画像間に一貫して適用した。
ＣＹＰ５１ｑＰＣＲ
[00229]細胞を、１ウェル当たり細胞５００，０００個で、６ウェルプレートに蒔き、
上述のように、ＰＤＧＦ、ニューロトロフィン３、ｃＡＭＰ、ＩＧＦ－１、およびノギンが補充された標準分化培地で４日間成長させた。２４時間目に、細胞を１μＭ ｓｉＲＮＡで処置した。成長因子を４８時間ごとに添加した。ｓｉＲＮＡ処置をしてから３日後、ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、ｃＤＮＡをＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製した。アクチンＢ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｔａｑｍａｎ、Ｍｍ０２６１９５８０＿ｇ１）およびＣＹＰ５１（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、Ｔａｑｍａｎ、Ｍｍ００４９０９６８＿ｍ１）用のエクソンスパニングプライマーを使用して、定量リアルタイムＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、７３００リアルタイムＰＣＲシステム）により相対的なＲＮＡレベルを検出した。サイクル時間および外れ値を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７３００システム配列検出ソフトウェアバージョン１．４を使用して計算した。
ムスカリン受容体拮抗アッセイ
[00230]ＧｅｎｅＢＬＡｚｅｒＭ１－ＮＦＡＴ－ｂｌａＣＨＯ－Ｋ１細胞（またはＭ３
－またはＭ５－ＮＦＡＴ－ｂｌａＣＨＯ－Ｋ１細胞）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ、１０％透析ＦＢＳ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、０．１ｍＭ ＮＥＡＡ）中に解凍した。１０，０００細胞／ウェルを３８４ウェルＴＣ処置アッセイプレートに添加し、３７℃で１６～２４時間インキュベートした。抗ムスカリン分子の１０×の原液４μｌをプレートへ添加し、３０分インキュベートした。１０×の対照作動薬カルバコール４μｌを、あらかじめ決定されたＥＣ８０濃度で抗ムスカリン分子を含むウェルへ添加した。プレートを５時間インキュベートし、１μＭ基質＋溶液Ｄ添加液８μｌを各ウェルへ添加し、プレートを室温で２時間インキュベートしてから、蛍光プレートリーダーで読み取った。
結果
[00231]ハイスループット表現型スクリーニングが、新規の希突起膠細胞のＯＰＣから
の生成を強化する小分子を同定するための有望な経路として出現した。複数のグループが、ミエリン脱落の動物モデルにおける機能的利点を示すスクリーニングヒット化合物を同定してきた。しかし、これらの発見をヒトへ移行することは、希突起膠細胞形成の強化においてこれらの分子の機能的標的の知識がなかったことにより妨げられてきた。以前に、本発明者らはマウス多能性幹細胞から誘導されたＯＰＣを使用し、新規のマウスおよびヒト希突起膠細胞の生成を刺激し、かつマウス疾患モデルにおける再ミエリン形成を強化するヒット化合物の頑強なクラスとして構造的に多様なイミダゾール抗真菌剤薬物を同定した。イミダゾール抗真菌剤は、真菌と哺乳動物の両方の細胞におけるステロール生合成に必須の酵素である、ステロール１４－α－メチル基分解酵素（ＣＹＰ５１）を阻害することによって、酵母におけるそれらの効果を媒介することは既知である。しかし、ＯＰＣにおけるイミダゾール抗真菌剤薬物の作用のメカニズムは依然として未定義のままである。
[00232]ＣＹＰ５１阻害が、ＯＰＣからの希突起膠細胞の生成の促進におけるイミダゾ
ール抗真菌剤薬物の効果を担っているかを試験するために、本発明者らは、哺乳動物ＣＹＰ５１阻害に関して広範囲の効力を有する９種類のアゾール含有分子のコレクションを集めた（図１Ａ）。本発明者らは、質量分析ベースの生化学的アッセイを使用し、３００～７００ｎＭの範囲にある同様のＩＣ５０値を有する、ＦＤＡ承認されたイミダゾール抗真菌剤（ミコナゾール、クロトリマゾール、およびケトコナゾール）が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで齧歯動物のＣＹＰ５１の明らかな阻害を示すことを確認した（図１Ｂ）。抗真菌活性がないことが既知の３種類のケトコナゾールの近接した類似体：すなわち、ケトコナゾールのＲ－トランスおよびＳ－トランスジアステレオマーならびに切断類似体のイミダゾール１２４は、哺乳動物ＣＹＰ５１の阻害に著しく効果的ではなかった（図１Ａ、Ｂ）。さらに、本発明者らは、酵母ＣＹＰ５１を選択的に標的化するトリアゾール抗真菌剤のフルコナゾールは、哺乳動物ＣＹＰ５１をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害しないことを確認した（図１Ｂ）。本発明者らのパネルにおける各分子に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの哺乳動物ＣＹＰ５１の阻害に関する効力は、マウス胚盤葉上層幹細胞から誘導されたＯＰＣからの成熟ミエリン塩基性タンパク質陽性（ＭＢＰ＋）希突起膠細胞の強化された形成に匹敵する（図１Ｃ、Ｄ）。これらの発見は、イミダゾール抗真菌剤がそれらの標準的な標的であるＣＹＰ５１によって作用し、希突起膠細胞形成を強化することを示唆する。
[00233]ＣＹＰ５１は、哺乳動物細胞におけるコレステロールの生合成で機能すること
が既知であるため、本発明者らは、ＯＰＣにおけるＣＹＰ５１の機能阻害を、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）を使用して評価し、細胞ステロールレベルを測定した。マウスＯＰＣを各アゾール含有分子で２４時間処置し、この時点で、これらをＧＣ／ＭＳによる分析用に溶解し、ラノステロール、ＣＹＰ５１基質のレベル、ならびに下流コレステロールレベルを定量化した。５種類の活性イミダゾール抗真菌剤でそれぞれ処置した後のみに、ラノステロールはＯＰＣにおいて蓄積し、本発明者らの生化学的アッセイにおけるＣＹＰ５１の機能に対するこれらの分子の効果を反映する（図１Ｂ、Ｅ、図５Ａ）。特に、潜在的な細胞供給源またはアッセイの人為的な影響を除外するために、本発明者らは、マウス胚盤葉上層幹細胞から誘導されたＯＰＣの独立に単離された第二のバッチを使用して、希突起膠細胞形成ステロールレベルに対する小分子のすべての効果を確認した（拡張データ図１ｂ～ｄ；ＯＰＣ誘導の詳細に関する方法を参照のこと）。さらに、希突起膠細胞形成およびラノステロールレベルに対するアゾール分子の効果を、一次マウスＯＰＣを使用して（図５Ｅ、Ｆ）、全プロセス長を測定する直交画像定量アプローチを使用して（図１Ｇ）、かつ希突起膠細胞形成の第２のマーカーとしてＰＬＰ１を使用して（図１Ｈ）確認した。ケトコナゾールに関しては、ラノステロールの蓄積に関する用量反応は、強化された希突起膠細胞形成に関する用量反応に酷似していた（図１Ｆ、１Ｃ；図５Ｉ、５Ｂを匹敵されたい）。これらの構造的多様性に富むアゾール含有小分子のうち、ＣＹＰ５１阻害と希突起膠細胞の強化された形成との間の密接な相関は、ＣＹＰ５１がＯＰＣにおける適切な標的であることを示唆する。
[00234]次に、本発明者らは、遺伝子操作および代謝産物補充を使用し、希突起膠細胞
の形成におけるＣＹＰ５１の役割を独立に確認した。本発明者らは、細胞透過性ｓｉＲＮＡ試薬を使用し、ＯＰＣにおけるＣＹＰ５１転写レベルを８０％激減させた（図１Ｇ）。ＣＹＰ５１を抑制すると、ラノステロールの著しい蓄積およびＭＢＰ＋希突起膠細胞の強
化された形成が生じたが、この効果は、ケトコナゾール処置で確認されたものよりも小さく、おそらく、ｓｉＲＮＡ処置の低速な動態および不完全な標的抑制に起因する（図１Ｈ、Ｉ、図５Ｊ；図５Ｋ、Ｌにおける独立のＯＰＣバッチで確認される）。さらに、本発明者らは、ＯＰＣを、精製ラノステロールで直接処置し、用量反応様式でＭＢＰ＋希突起膠細胞の強化された形成を観察した（図１Ｊ、図５Ｍ、図５Ｎで確認された）。この発見は、ステロール中間体の蓄積が、ＯＰＣからの希突起膠細胞形成を強化する直接的な役割を果たし得ることを示唆する。
[00235]ＣＹＰ５１阻害は、希突起膠細胞の形成を誘発するのに十分であるために、本
発明者らは、化学遺伝学的アプローチを使用し、コレステロール生合成における他のステップを変更すると、同様の効果があるかを試験した。コレステロール生合成は、長く複雑に制御された経路であり、多くの高品質な小分子プローブおよび承認薬が利用可能である（図２Ａ、図６）。本発明者らは、コレステロール生合成経路にわたる８種類の酵素の選択的小分子阻害剤を収集し、ＯＰＣにおける希突起膠細胞生成およびステロールレベルに対するこれらの影響を評価した。本発明者らは、ステロール代謝酵素を選択的に標的化する阻害剤は、ＯＰＣにおける予想される上流ステロール中間体の蓄積をもたらすことを確認し、かつ本発明者らは、すべてのプローブに関して、経路の最終産物であるデスモステロールおよびコレステロールのうちの１つまたは両方のレベルの減少を確認した（図７Ａ～Ｄ）。本発明者らは、ＯＰＣの希突起膠細胞へ分化に対する、これらの８種類の経路阻害剤のそれぞれの効果を評価した。ＣＹＰ５１（ケトコナゾール）、ステロール１４－レダクターゼ（アモロルフィン）、およびＥＢＰ（ＴＡＳＩＮ－１）を標的化する分子のみが、ＭＢＰ＋希突起膠細胞の形成を強化したが、残りの５種類の経路酵素阻害剤は効果がなかった（図２Ｂ、図７Ｅ、拡張データ図３ｆで確認され、図７Ｇ、Ｈの一次ＯＰＣで検証された）。処置によって、３日間のアッセイ中に全細胞数に対して最小限の効果が与えられた（図７Ｅ）。アモロルフィンおよびＴＡＳＩＮ－１は、１００ｎＭ未満の用量で効果的であり、１４－デヒドロザイモステノールおよびザイモステノールを蓄積する効力を有し、希突起膠細胞形成を強化する効力を反映した（図２Ｃ、図７Ｉ）。ＯＰＣを１４－デヒドロザイモステノールおよびザイモステノールで直接的に処置すると、ＭＢＰ＋希突起膠細胞の形成が強化されたが、コレステロール自体を含む、ＥＢＰの下流ステップと関連する残りのステロールは、効果がなかった（図２Ｄ、図７Ｊ、Ｋ）。全体的に、この化学遺伝学的分析によって、ＣＹＰ５１からＥＢＰに及ぶ限られた治療域内のコレステロール生合成経路を阻害することは、希突起膠細胞の形成を強化するために十分であることが示唆される。本発明者らがコレステロールおよびデスモステロールレベルを枯渇させるとして確認したスタチン薬物および様々な別の経路の阻害剤が、ＯＰＣの分化を調節しなかったことから、この効果のメカニズムは、ステロールレベルの単純な減少によって媒介されるのではない（図２Ｂ、図７Ａ、Ｂ）。特に、ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間のステップを阻害した後に蓄積するステロール中間体は、Δ８，９不飽和の存在によって統一され、希突起膠細胞形成を強化するためのそれらの機能的効果に関する化学的根拠を示唆する（図６）。
[00236]並行して、本発明者らは、３，０００種類超の生物活性小分子および承認され
た薬物にわたる２μＭの均一な用量でのスクリーニングを達成した（図８Ａ）。このライブラリーは、あらかじめスクリーニングされた多くの承認薬、ならびに広範囲の未承認候補薬物、および注釈の豊富な化学的プローブを含む。本発明者らのヒット化合物のうち、本発明者らは、９種類のイミダゾール抗真菌剤、ならびにＯＰＣの分化を強化するとして、クレマスチンを含むすでに注釈されている他の分子を得た（拡張データ表１）。本発明者らはまた、既知の標的を用いて、識別可能なカテゴリーへ容易に分類できない多数の確認されたヒット化合物を同定した（拡張データ表１）。ＯＰＣの分化を調節することがまだ報告されていない分子のうち、本発明者らの首位のヒット化合物は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２阻害剤であるＥＰＺ００５６８７であった。ＥＰＺ００５６８７は、本発明者らのマウス胚盤葉上層幹細胞から誘導されたＯＰＣとマウス一次ＯＰＣの両方における希突起膠細胞形成を強化した（図８Ｂ～Ｆ）。驚くべきことに、本発明者らは、３種類の構造類似体ＥＺＨ２阻害剤は、ＯＰＣの分化に対する効果を有さないことを検証し、ＥＰＺ００５６８７が、ＥＺＨ２を超える特異的なオフターゲット効果を有することが示唆された（図８Ｃ、Ｄ、Ｆ）。本発明者らは、本発明者らのＧＣ／ＭＳベースのステロールプロファイリングアッセイで、これらの４種類のＥＺＨ２阻害剤の効果を検討し、ＥＰＺ００５６８７がＯＰＣにおいて、ザイモステロールおよびザイモステノールの蓄積を独自にもたらし、ＥＢＰ阻害を示すことを見い出した（図８Ｇ～Ｉ）。これらの４種類の密接に関連したＥＺＨ２阻害剤のうち、モルホリン環およびインダゾール環の存在と関連する構造的な差が、ＥＰＺ００５６８７単独で、ＯＰＣにおけるＥＢＰを阻害することおよび希突起膠細胞の形成を強化することを可能にすると思われる。
Figure 2023139105000040
Figure 2023139105000041
[00237]本発明者らは、ＥＰＺ００５６８７の後に確認された上位１０種類のヒット化
合物（イミダゾール抗真菌剤およびすでに公表されているスクリーニングで同定された他の分子を除く）をさらに検討し、１０種類すべてが、スクリーニング用量で、ステロール
プロファイルの変化を誘発したことを見出した（図３Ａ～Ｂ、図９Ａ～Ｂ）。７種類の分子がＥＢＰを阻害し、２種類の分子がステロール１４－レダクターゼ活性を阻害し、かつ１種類の分子（フルベストラント）がＣＹＰ５１を標的化した（図９Ｃ～Ｄ）。これらの分子のうちの４種類：ジプラシドン、イフェンプロジル、ヒドロキシジン、およびラロキシフェンが、ＣＮＳから誘導された細胞におけるステロール１４－レダクターゼまたはＥＢＰ活性を調節することはすでに示されている。本発明者らがスクリーニング用量でＯＰＣの希突起膠細胞への分化に影響を与えないことを独立に確認した１０種類のライブラリー分子のうち、どれも８，９－不飽和ステロール中間体のレベルを強化しなかった（図３Ａ～Ｂ、図９Ａ～Ｂ）。これらのデータは、ステロール合成の調節は、ハイスループットスクリーニングによって同定された小分子の中では、希突起膠細胞の形成を強化するための主要な作用メカニズムであると思われることを示す。
[00238]本発明者らの上位のスクリーニングヒット化合物の範囲内でのコレステロール
経路調節薬の出現頻度を考慮して、本発明者らは、任意のすでに報告済みの再ミエリン形成のエンハンサーもまた、ステロール中間体の蓄積を誘発するかどうかを評価した。本発明者らは、様々な標準的な標的：ベンズトロピン（ムスカリン受容体）、クレマスチン（Ｈ１受容体およびムスカリン受容体）、タモキシフェン（エストロゲン受容体）、Ｕ５０４８８（κ－オピオイド受容体）、ベキサロテン（ＲＸＲ）、およびリオチロニン（甲状腺ホルモン受容体）にわたって、ＯＰＣの分化を誘発することが報告されている分子のコレクションを集めた。本発明者らは、各分子が希突起膠細胞形成のほぼ最大の上方制御を示す用量を同定し、次いで本発明者らのＧＣ／ＭＳステロールプロファイリングアッセイで各分子を評価した（図９Ｅ～Ｇ）。ベンズトロピン、クレマスチン、タモキシフェン、およびＵ５０４８８は、ザイモステノールおよびザイモステロールの蓄積ならびに基本的なステロールレベルの減少を誘発し、ＥＢＰの阻害を示した（図３Ｃ～Ｄ、図９Ｈ）。タモキシフェンは、細胞培養モデルにおいて、かつ化学療法を受けているがん患者において、ＥＢＰを阻害することが生化学的アッセイにおいてすでに示されている。対照的に、リオチロニンおよびベキサロテンは、ステロールレベルに対して最小の効果を示し、転写因子機能のレギュレーターとしてのそれらの既知の機能と一致し、希突起膠細胞形成を強化するすべてではないが多くの処置が、ステロール中間体の蓄積をもたらすことが確認された。
[00239]クレマスチン、タモキシフェン、または他の小分子で処置した後のＯＰＣにお
けるＥＢＰ阻害は、ＥＢＰの直接的な標的化に起因することになる、またはその標準的なタンパク質標的を阻害する各分子の下流の結果を反映することになる。本発明者らは、ＥＢＰ酵素活性のＧＣ／ＭＳベースの生化学的アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＥＢＰの直接的な阻害を評価した。本発明者らは、選択的ＥＢＰ阻害剤ＴＡＳＩＮ－１による、ならびにベンズトロピン、クレマスチン、タモキシフェン、およびＵ５０４８８、およびより強力な細胞ＥＢＰ阻害剤による明らかな阻害がより大きな規模の阻害を示すことを観察した（図３Ｅ）。本発明者らはまた、この生化学的アッセイにおいてＥＢＰ酵素活性を直接的に阻害するとして、本発明者らの生物活性スクリーニングで同定された２種類の分子、ＥＰＺ００５６８７およびヒドロキシジンに注釈を付け、希突起膠細胞形成の多くのエンハンサーがＯＰＣにおいてＥＢＰを直接的に標的化することを示唆した。
[00240]本発明者らは、ムスカリン受容体拮抗薬および選択的エストロゲン受容体調節
薬（ＳＥＲＭ）が、これらの機能的標的としてのＥＢＰに対し作用することにより、ＯＰＣにおいて強化された希突起膠細胞形成を媒介するという追加の証拠を探索した。クレマスチンおよびベンズトロピンは、ＯＰＣの希突起膠細胞への分化のインデューサーとして検証されてきたが、先行研究によって、多くの他のムスカリン受容体拮抗薬は、この機能的特性を共有していないことが示唆された。本発明者らの生物活性スクリーニングデータを使用して、本発明者らは、様々なアイソフォーム選択性を有する４種類のムスカリン受
容体拮抗薬を選択し、４種類すべてがＭＢＰ＋希突起膠細胞生成を２μＭで強化しないことを独立に確認した（図１０Ａ～Ｃ）。しかし、独立の細胞活性アッセイも２μＭで行い、これらの４種類の分子およびクレマスチンが、ムスカリン受容体Ｍ１、Ｍ３、およびＭ５アイソフォームの同等でほぼ完全な阻害を示し、ムスカリン受容体をＯＰＣにおける機能的標的とすることはできないことが示唆された（図１０Ｄ）。８，９－不飽和ステロール蓄積を強化しかつＥＢＰ酵素活性を直接的に阻害するクレマスチンおよびベンズトロピンとは対照的に、希突起膠細胞形成を強化しないムスカリン受容体拮抗薬に関する細胞ステロールレベルをプロファイリングすると、ＯＰＣにおけるザイモステノールまたは他のステロール中間体への効果はなく、かつＥＢＰを阻害しないことが酵素活性アッセイで観察されたことが明らかになった（図３Ｅ、図１０Ｅ～Ｆ）。これらの発見によって、ＥＢＰを阻害するムスカリン受容体拮抗薬のみが希突起膠細胞の形成を強化することができることが示唆される。
[00241]ＯＰＣにおけるＥＢＰを阻害するための能力によってまた、選択的エストロゲ
ン受容体調節薬（ＳＥＲＭ）間での希突起膠細胞の強化された形成が予測される。多数のＳＥＲＭが、他の細胞タイプにおいてＥＢＰを強力に標的化することが示されており、タモキシフェンおよびトレミフェンのようなＳＥＲＭの第三級アミン官能性が、生理学的ｐＨでプロトン化されるときに、ＥＢＰのステロールＣ８陽イオン様遷移状態を模倣すると考えられた。本発明者らは、トレミフェンが、広範な用量範囲にわたってＥＢＰを阻害し、かつＭＢＰ＋希突起膠細胞生成を強化したことを確認した（図１０Ｇ～Ｌ）。オスペミフェンも、トレミフェンの第三級アミン官能性が第一級アルコールで置換されていることを除いて、トレミフェンと構造的に同一である、ＦＤＡ承認されたＳＥＲＭである。この変化は、オスペミフェンが、生理学的ｐＨで正荷電を有することを妨害し、かつＥＢＰ阻害性活性を消去するはずである。実際に、オスペミフェンは、ＯＰＣにおけるＥＢＰを阻害せず、かつＭＢＰ＋希突起膠細胞への分化を強化しなかった（図１０Ｇ～Ｌ）。特に、トレミフェンおよびオスペミフェンは、独立のエストロゲン依存的細胞増殖アッセイにおいて同等な抗エストロゲン効果が実証され、構造的にほぼ同一のＳＥＲＭのうち、ＥＢＰを阻害できること、およびエストロゲン受容体を調節しないことが、強化された希突起膠細胞形成を予測することを示唆する（図１０Ｌ）。
[00242]本発明者らの結果は、ステロール調節が、希突起膠細胞形成を強化する多くの
（すべてではないが）化合物の共有された機能であることを示唆するために、本発明者らは、小分子の組合せに関する効力を試験し、相加効果または非相加効果を示した。甲状腺ホルモン作動薬であるリオチロニンの、様々なステロール調節ＯＰＣ分化誘発処置との組合せは、希突起膠細胞形成に対して相加効果をもたらし、これらの分子が、おそらく甲状腺ホルモン受容体シグナル伝達以外のメカニズムによって機能し、希突起膠細胞生成を強化することを示した（図１１Ａ、Ｂ）。対照的に、最大有効用量のケトコナゾールの、すでに報告済みの４つのＯＰＣ分化エンハンサー（ベンズトロピン、クレマスチン、タモキシフェン、およびＵ５０４８８）のうちのいずれかとの組合せは、ケトコナゾール単独で確認されるレベルを超えて分化を強化しなかった（図３Ｆ、図１１Ｃ）。この非相加効果は、希突起膠細胞形成の誘発に関する一般的なメカニズムとしての８，９－不飽和ステロール蓄積を共有するこれらの分子と一致する。ケトコナゾールを用いてＣＹＰ５１における経路の流れを阻害することによって、ＥＢＰ阻害剤は、さらなるステロール蓄積をもはやもたらすことができなくなる、または希突起膠細胞形成をもはや強化することができなくなる。
[00243]本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＯＰＣアッセイは、希突起膠細胞への初期
分化事象のモデルにすぎないため、次に、本発明者らは、ステロール経路を調節しても、その後の希突起膠細胞成熟およびミエリン形成をｉｎ ｖｉｔｒｏでおよびｉｎ ｖｉｖｏで強化するかどうかを試験した。本発明者らは、ＯＰＣをエレクトロスパンマイクロフ
ァイバー上で１４日間培養し、軸索様基質に沿って追跡しかつそれを包む希突起膠細胞の能力に対するステロール経路調節薬の効果を評価した。ＯＰＣにおけるステロール中間体を蓄積するケトコナゾール（ＣＹＰ５１）、アモロルフィン（ステロール１４－レダクターゼ）、およびＴＡＳＩＮ－１（ＥＢＰ）のそれぞれの機能が、マイクロファイバーに沿って追跡しかつそれを包むＭＢＰ＋希突起膠細胞を有意に強化した（図１２Ａ～Ｃ）。経路における上流または下流の他の酵素を阻害すると、希突起膠細胞成熟およびマイクロファイバーを鞘で覆うこと（ｅｎｓｈｅａｔｈｍｅｎｔ）への効果は認められなかった。（図１２Ａ～Ｂ）。
[00244]以前に本発明者らは、ＣＹＰ５１を標的とするイミダゾール抗真菌剤ミコナゾ
ールは、ミエリン脱落のマウスモデルにおいてマウス血液脳関門に浸透し、再ミエリン形成を強化することを確立した。他のステロール経路酵素を阻害しても、ｉｎ ｖｉｖｏでの再ミエリン形成を強化することがあるかどうかを評価するために、本発明者らは１つの阻害剤のステロール１４－レダクターゼ（イフェンプロジル）および１つの阻害剤のＥＢＰ（タモキシフェン）を選択して、さらに評価した。イフェンプロジルとタモキシフェンの両方が、マウス血液脳関門を横断することは既知である。本発明者らは最初にＧＣ／ＭＳベースのステロールプロファイリングを使用し、ＣＮＳにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの標的への関与を試験した。ミコナゾール（１ｋｇ（体重）あたり１０ｍｇ）、イフェンプロジル（１ｋｇあたり１０ｍｇ）、およびタモキシフェン（１ｋｇあたり２ｍｇ）は、腹腔内投薬してから３日後の野生型成体マウスの脳において、８，９－不飽和ステロールの有意な蓄積をそれぞれ誘発した（図４Ａ）。これらのデータは、ステロール調節薬であるミコナゾール、イフェンプロジル、およびタモキシフェンが、マウスＣＮＳにおけるＣＹＰ５１、ステロール１４－レダクターゼ、およびＥＢＰにそれぞれ機能的に関与できることを実証する。
[00245]本発明者らは、リゾレシチン注射を使用して成体脊髄の後索白質におけるミエ
リン脱落の病巣病変部を生成する十分に確立されたマウスモデルを使用して、ミコナゾールの再ミエリン形成に対する陽性効果をすでに実証している。他の８，９－不飽和ステロールが蓄積すると、ｉｎ ｖｉｖｏでの再ミエリン形成を強化するかどうかを試験するために、本発明者らは、病変マウスをイフェンプロジル（１ｋｇあたり１０ｍｇ）またはタモキシフェン（１ｋｇあたり２ｍｇ）を用い、毎日腹腔内注射することによって処置した。処置は病変から４日後に開始し、８日後に再ミエリン形成に対する効果を、組織学的に定量化した（図４Ｂ）。ビヒクル処置動物では、薄いミエリン鞘によって特徴付けられるまばらに分布されたミエリン再形成軸索のプロファイルが、主に病変部の周辺で検出され（図４Ｃ）、同時に超微細構造分析によって、非ミエリン化軸索またはミエリンで単一に包まれた軸索が明らかにされた（図４Ｄ）。対照的に、イフェンプロジルまたはタモキシフェンで処置してから８日後、再ミエリン形成は、病変部にわたって広がった（図４Ｃ）。病変部の中枢と末梢の両方の領域において、軸索の大部分が薄いミエリン鞘によって囲まれた（図４Ｄ）。軸索の直径に明らかな差はないことは、非ミエリン化軸索とミエリン化軸索との間で明らかであり、かつ小さい径と大きい径の両方の軸索が両方の処置で等しいミエリン化を示した。まとめると、これらのデータは、ＣＹＰ５１、ステロール１４－レダクターゼ、およびＥＢＰの小分子阻害剤は、マウスにおける再ミエリン形成を有意に強化できることを示す。
[00246]最終的に、本発明者らはまた、ミコナゾール、イフェンプロジル、およびタモ
キシフェンのステロール調節活性は、ネズミ細胞に限定されず、ヒト細胞および組織にまで拡大されることを確立した。本発明者らは、ヒト神経膠腫細胞株におけるステロールプロファイリングを行い、これらの分子が予想されるステロール中間体の蓄積をもたらすことを確立した（図１３Ａ）。同様に、ミコナゾールおよびイフェンプロジルは、ヒト誘発多能性幹細胞から誘導された皮質のスフェロイド内に８，９－不飽和ステロール蓄積をも
たらし、さらにこれらの分子が同様に、マウスおよびヒト細胞ならびにＣＮＳ組織におけるステロール合成経路に関与することを確認した（図１３Ｂ）。
[00247]複数のグループが希突起膠細胞形成の小分子エンハンサーを同定してきたが、
これらの発見を、白質疾患を呈する患者に対して臨床応用するための重要なハードルは、ＯＰＣにおけるこれらの分子の機能的標的の理解が不完全なことである。ここでは、本発明者らは、再ミエリン形成の多くの小分子エンハンサーによって共有される主要なメカニズムを、コレステロール生合成酵素ＣＹＰ５１からＥＢＰに及ぶ狭い治療域を阻害することによるステロール中間体レベルの上昇と定義する。すべてにおいて、本発明者らは、ミエリン形成も強化しかつステロール中間体レベルも上昇させるような広範囲にわたる標準的な標的を有する２４個の小分子を特徴付けた（図１４）。ＣＹＰ５１とＥＢＰとの間のステップを阻害するが、希突起膠細胞形成を強化する点で効果がない分子はまだ同定されていない。これらの分子のうちのいくつかは、マウスＣＮＳ細胞においてかつヒト患者において、８，９－不飽和ステロールレベルを上昇させることがすでに示されている。８，９－不飽和ステロールのＯＰＣへの供給は、希突起膠細胞の形成を強化するために十分であったが、コレステロールレベルの枯渇には効果がなく、ステロール中間体の蓄積は、ＯＰＣからの希突起膠細胞形成を促進する陽性の役割を果たすことを示唆した。特に、８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積は、他の細胞状態遷移で観察され、かつ膜のステロール組成が変化すると、膜構造およびシグナル伝達が撹乱される場合がある。さらに、他の研究室は、ステロール中間体レベルを強化するとして本明細書において注釈した複数の分子が、ＭＳ様疾患を呈するマウスにおいて麻痺を反転させことを独立に示しており、ｉｎ
ｖｉｖｏでステロールレベルを変化させると、機能的なミエリンを再生できることを示唆している。最終的に、本発明者らの研究は、ＯＰＣにおけるステロール環境を調節すると、希突起膠細胞の形成を強化することができ、かつ新規の治療標的、これらの標的の強力な阻害剤、および代謝産物に基づいたバイオマーカーを提示し、最適なミエリン再形成療法の開発を加速することを実証する。
[00248]本明細書で述べる方法は、様々な方法で行い、当技術分野で周知のその様々な
改良および変更を伴っていてもよいことを理解されたい。作用様式として述べられたどの理論も、本発明を任意の様式で限定すると解釈されるべきではないが、本発明の方法をさらに十分に理解することができるように示されることも理解されたい。
[00249]上記明細書で述べられたすべての文献および特許は、参照することにより本明
細書に組み込まれるものとする。

Claims (1)

  1. 希突起膠細胞（oligodendrocyte）の生成を強化する方法であって、ＯＰＣにおけるコレステロール生合成経路のΔ８，９－不飽和ステロール中間体の蓄積を強化するおよび／または誘発する薬剤を、希突起膠細胞前駆体細胞（oligodendrocyte precursor cell）（ＯＰＣ）に投与することを含む方法。
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