CN109512817A - 氯马斯汀或其组合物的制药用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了氯马斯汀或其组合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。氯马斯汀价格低廉，易获取，并且治疗阿尔茨海默病时的副作用小。

Description

氯马斯汀或其组合物的制药用途

技术领域

本公开涉及一种药物的新用途，具体涉及氯马斯汀或其组合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer‘s disease，AD)，又译为阿尔茨海默病，俗称的老年痴呆症，是发生在老年期及老年前期的一种原发性退行性脑病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、情绪等方面的障碍。其特征性病理变化为大脑皮层萎缩，并伴有β淀粉样蛋白沉积、神经原纤维缠结、大量记忆性神经元数目减少以及老年斑的形成。AD 以淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)沉积与tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结为主要病理特征^[1]。不断增多的Aβ和神经纤维缠结引起慢性神经炎症反应，导致突触、神经元缺失，最终导致进行性的认知功能障碍。AD是最常见的痴呆类型之一，约占所有痴呆中的 50％～60％。AD通常分为家族性早发型痴呆、家族性早发型痴呆和散发性晚发型痴呆。随着人口老龄化的进程加快，AD患者将以惊人的速度增长，AD是人类21世纪面临最大的健康、社会及经济危机^[2]。

β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)由第21号染色体编码，是淀粉样蛋白前体(APP)经蛋白水解酶作用后的底物，是阿尔茨默海病脑内主要病理标志性蛋白之一，它的形成、沉积和降解贯穿了AD 的整个病理过程^[3]。APP可以被至少3种分泌酶切割。APP首先被β分泌酶裂解，然后在γ分泌酶作用下，切割丙氨酸713和苏氨酸714 之间位点产生Aβ42。Aβ42是由42～43个氨基酸组成的蛋白质片断，主要位于AD患者脑内；若在缬氨酸711和异亮氨酸712之间酶切割则形成Aβ40^[4]。Aβ40是由40个氨基酸组成的蛋白片断，正常老年人和AD患者脑内均存在。相对于Aβ40，Aβ42更易聚集形成淀粉样蛋白，因此其是形成老年斑的主要成分，提示它在AD发病机制中占有更重要的作用。

AD的病因复杂，其发生为多种因素相互作用的结果。近年来国内外大量研究的重点集中在遗传学、神经递质学说、病毒感染及免疫学等方面。目前AD没有特效的治疗药物，以对症治疗为主。随着几大类药物的临床试验的失败，新药的开发也并不顺利。

目前AD的治疗药物主要包括两大类：胆碱酶抑制剂如(安理申) 和兴奋性氨基酸NMDA(N-甲基天冬氨酸)受体拮抗剂(如易倍申)。这些药物都只是对症治疗，治疗效果不理想，并且长期服用毒副作用大，同时其价格昂贵，停药后容易复发，并不能逆转或根治AD。

目前认为，靶向针对增多的Aβ和tau蛋白过度磷酸化是治疗AD 的主要策略^[2]。虽然大量的临床试验致力于靶向抑制Aβ水平的治疗药物研发，但是这些药物的长期有效性和安全性仍然没有得到有效的验证。随着几类药物临床实验的失败，阿尔兹海默病的药物开发陷入了瓶颈阶段，目前仍然没有有效的方法可以预防、阻止和逆转的AD进展。另一方面大量的研究表明AD患者脑中Aβ斑块周围异常的胶质细胞聚集，释放大量的促炎因子和趋化因子，导致持续性的慢性神经炎症反应，引起神经元的大量丢失，及进行性的突触损伤，缓解脑内异常的胶质细胞激活及聚集亦是保护神经细胞及缓解AD症状的重要方面^[5]，但目前此药物的研发及开展并不是一帆风顺。找到一条能有效预防或者抑制AD病理渐进性恶化的治疗策略刻不容缓。

富马酸氯马斯汀(Clemastine Fumarate)是瑞士山道士(Sandoz) 公司二十世纪六十年代开发成功的抗组胺药，其主要化学成分为吡咯醇胺。其后，在美国、日本、德国等陆续投放市场。作为FDA认证的 OTC药物，其商品名(例如氯马斯汀、吡咯醇胺、克立马丁、Meclastin、 Mecloprodin、TAVEGIL、TAVIST等)及规格(如片剂、针剂、口服液等)种类繁多，其中最为公众所熟知的商品名为克雷满汀(Tavegil)，本品是一个典型的、有代表性的第二代H1受体拮抗剂，临床上用于治疗由组胺引起的各种过敏性疾病。其优势在于与大多数广泛使用的抗组胺药物相比，它的副作用更少，是目前世界上公认的最好的抗组胺药之一。

近年来，随着研究的深入，及对该药物的探索，其不同的作用及机制也逐渐被人们所认识。其中包括通过增强少突胶质前体细胞的分化从而增强髓鞘^[6]，在治疗脱髓鞘疾病中具有突出的效果。及通过mtor 途径激活自噬，缓解并改善肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateral sclerosis,ALS)模型小鼠的相关病理及行为学症状^[7]。肌萎缩性侧索硬化又称为卢伽雷氏症(Lou Cehrigs disease)，俗称渐冻人症。它是一种不可逆的致死性运动神经元疾病。病变主要侵犯上运动神经元(大脑、脑干、脊髓)，又影响到下运动神经元(颅神经核、脊髓前角细胞)及其支配的躯干、四肢和头面部肌肉的一种慢性进行性变性疾病，肌萎缩侧索硬化的病因至今不明。20％的病例可能与遗传及基因缺陷有关。另外有部分环境因素，如重金属铝中毒等，都可能造成运动神经元损害。产生运动神经元损害的原因，目前主要理论有：1、神经毒性物质累积，谷氨酸堆积在神经细胞之间，久而久之，造成神经细胞的损伤；2、自由基使神经细胞膜受损；3、神经生长因子缺乏，使神经细胞无法持续生长、发育。目前该病没有有效的治疗手段，国际上正尝试以神经营养因子、抗氧化剂如维生素E、维生素C以及肌酸、 CoQ10等与力如太联合应用，以对肌萎缩侧索硬化进行保护性治疗。但上述治疗还有待于临床试验的证实。此外，科学家们也正在进行有关本病基因治疗的实验研究。

虽然ALS及AD都有异常的蛋白聚集，都存在神经元的丢失，并且两者同为退行性疾病，但是它们存在很大的不同：AD的神经元异常丢失主要出现在海马区及新皮层区域并伴有神经元的缠结，患者只存在记忆力障碍并不会出现运动及感觉障碍。而ALS主要为运动神经元丢失，并常累积脊髓，患者意识及记忆并无障碍，以运动及感觉障碍为主。因此，ALS及AD的发病机理、症状和治疗方法都不相同。因此，虽然氯马斯汀能够缓解并改善肌萎缩侧索硬化模型小鼠的相关病理及行为学症状，没有任何的理论和实验证据证明或暗示该药物是否可以治疗AD，这需要大量的研究来验证。

发明内容

鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，期望提供一种用于治疗AD 的价格低廉、易获取、副作用小且效果良好的药物。

根据本发明的一个方面，本发明提供了氯马斯汀或其组合物在制备治疗AD的药物中的用途。

根据一个实施方式，所述药物为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

所述组合物还包括改善神经递质的化合物(例如胆碱酯酶抑制剂)，改善去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、神经肽等失衡的非胆碱能类化合物，脑细胞代谢激活剂，脑血循环促进剂，麦角碱类，钙离子拮抗剂，神经营养因子，抗氧化剂或者雌激素等。

与现有治疗AD的方法相比，本发明的优点在于：氯马斯汀价格低廉，易获取，副作用小。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1至图5显示了小鼠的水迷宫实验结果；其中，图1至图3显示了水迷宫隐蔽平台实验结果，图4显示了目标象限空间探索时间结果；图5显示了水迷宫空间探索实验结果；

图6和图7显示了新物体识别实验结果；

图8至图13显示了小鼠的Aβ斑块的免疫荧光染色实验结果；

图14至图19显示了小鼠的Aβ斑块的Elisa实验结果；

图20至图25显示了小鼠在皮层及海马区域的小胶质细胞及星形胶质细胞免疫荧光染色结果；

图26至图31显示了小鼠脑组织的western blot检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

本发明人通过长期口服给药方式探索氯马斯汀在AD中作用及机制，意外地发现氯马斯汀具有治疗AD的技术效果。

为了证实氯马斯汀治疗AD的技术效果，用APP/PS1双转基因小鼠模型进行了验证。

APP/PS1双转基因小鼠是目前AD病理学实验中常用的动物模型，该模型是Jankowsky实验室以AD病理学理论中Aβ级联致病假说为基础，培育出能够表达人类APP和PS1突变基因的转基因鼠动物模型，该模型可在一定程度上模拟AD的病理特征和渐进性的病程^[8]。鉴于此，本发明使用该模型进行之后的一系列实验。

一、实验材料及分组

同窝野生型C57BL/6J小鼠及APP/PS1小鼠均采购于南京大学南京生物医药研究院(品系名称：B6/JNju-Tg(APPswe,PSEN1dE9)/Nju，品系编号：D000268)，饲养于陆军总医院八一脑科医院神经外科研究所层流动物房。实验动物房常年温度控制在24℃左右，湿度 40～60％，光照时间8:00-21:30。所有实验动物的相关管理遵循中华人民共和国卫生部动物实验管理条例，本研究中所有实验动物的使用和管理均获得了相关实验动物管理委员的批准。

氯马斯汀(clemastine，后简称CLEM)购于Tocris Bioscience公司(货号：1453)。

以口服给药方式(药物混匀于常规饲料中，CLEM给药量：每天 10mg/kg，给药时间：5个月)处理3月龄小鼠5个月，即各组小鼠在 3月龄大小时开始给予添加氯马斯汀及安慰剂饲料饲养，处理5个月。

在APP/PS1转基因小鼠8月龄的时候进行水迷宫及新物体识别实验进行行为学评估，验证氯马斯汀是否能改善APP/PS1转基因小鼠认知功能的作用。

实验分组：本实验将WT及APP/PS1小鼠分为4组，每组15只，分别为：A组：WT小鼠安慰剂对照组(WT)，B组：WT小鼠氯马斯汀处理组(WT+clem)，C组：APP/PS1安慰剂对照组(APP/PS1)， D组：APP/PS1氯马斯汀处理组(APP/PS1+clem)。

二、氯马斯汀改善了APP/PS1转基因小鼠的认知功能

认知障碍是AD早期最重要的临床特征^[3]。因此，在APP/PS1转基因小鼠个8月龄的时候进行水迷宫及新物体识别实验进行行为学评估，验证氯马斯汀是否能改善APP/PS1转基因小鼠认知功能的作用。

水迷宫实验是一种利用啮齿类动物既会水又怕水的天性将其置于水中，迫使其奋力逃避水环境而学会利用环境标记物和隐匿平台的关系来寻找水中平台位置的实验，已被应用于学习记忆的神经生物学机制探讨。水迷宫实验包括隐蔽平台实验及空间探索实验。

隐蔽平台实验

水迷宫圆筒直径为120cm，高50cm，一个15cm的可隐藏型平台(10cm直径)被放于圆筒中的一个象限(离桶壁30cm位置)，水温24℃左右。训练开始前，将平台暴露于水面上，各只老鼠放入水中适应性游泳2分钟左右，结束后将小鼠放于平台上停留15秒，使其熟悉周边环境。正式训练时，把小鼠面向桶壁分别从4个落水点(东、南、西、北)以半随机方式放入水池中。每只小鼠训练持续90秒或直到小鼠找到平台时为潜伏期(latency)，未找到平台的小鼠将会被引导上平台停留10秒。小鼠一天被训练4次，上午2次下午2次，连续 5天。在整个训练过程中，平台的位置保持不变。

空间探索试验

每只小鼠在第5天训练结束后，在第6天将平台撤离，将各组小鼠从平台所在象限的对面象限放入水中，让每只小鼠自由游泳。持续时间60秒，用软件记录小鼠游泳轨迹、各个象限的时间以及穿梭平台象限区域的次数，此为探索试验(probe trial)。导出软件各组数据，进行统计分析。

新物体识别实验

实验装置由一个开放的50cm×50cm×40cm树脂玻璃箱(矿场试验用)构成。实验是在一个隔音房间内进行。实验过程分成3个阶段：习惯，训练，保持。软件视频追踪、记录实验动物训练、保持所有参数。每只老鼠在连续3天中被单独置于没有物品的实验箱中待10 分钟以使其习惯(习惯阶段，第1～3天。在训练阶段，两个相同的物品(A)被放置于两个相反的角落，离实验箱壁8.5厘米远。每只老鼠被放到实验装置中间使其探索物品10分钟(第4天)。当实验鼠的头部面向物品时它将被认定为正在探索此物品(头部与物品的距离不大于2厘米)。训练阶段90分钟后，实验鼠会置于放有一个熟悉物品，与训练阶段一样的物品和新物品(B)的实验箱中探索10分钟。在预实验中，A和B放置给开采的概率和时间是相等的。每次实验之间，实验箱和物品A、B都用70％酒精清洗。所有阶段都将录像，采用双盲法分析物品认知行为。统计新物体和旧物体的偏好指数以及认知指数来评估各组动物认知功能。

水迷宫隐蔽平台实验结果显示，相比野生小鼠，对照组未给予氯马斯汀的APP/PS1转基因小鼠逃逸潜伏期、找到平台所游泳的距离明显延长(图1至图3)，说明APP/PS1模型小鼠展现出学习记忆障碍；而氯马斯汀处理组APP/PS1转基因小鼠的逃逸潜伏期、找到平台所游泳的距离比对照组APP/PS1转基因小鼠明显减少(图1至图3)。在水迷宫平台实验的进行的5天内观察了各组动物的学习趋势。结果显示，野生对照组和野生药物处理组小鼠均显示了良好的学习趋势，表现为随着训练天数的增加，小鼠找到平台的逃逸潜伏期和找到平台所游泳的距离明显减少；未给药的APP/PS1转基因小鼠却未展现出这样的学习趋势；给以氯马斯汀处理的APP/PS1转基因小鼠随着训练时间则呈现了良好的学习趋势(图1至图3)。

在水迷宫空间探索实验中，氯马斯汀处理的APP/PS1小鼠穿越平台象限区域的次数明显多于未给药的转基因小鼠(图5)，在目标象限空间探索时间较对照转基因小鼠有明显增加(图4)。因此，这些结果说明，口服氯马斯汀可以改善APP/PS1转基因小鼠的认知障碍。值得注意的是，口服氯马斯汀未导致野生型小鼠在上述实验中与未给药的对照野生小鼠之间有任何差别(图1至图3)，说明氯马斯汀不会改变野生型小鼠的学习记忆能力。

新物体识别实验中，各组小鼠对放在矿场区角落处两个相同的物体A没有特别的偏爱(图7)，不影响各组动物下一步对新物体B的探索行为。在探索实验阶段，未给药的APP/PS1转基因小鼠对新物体 B的认知指数明显少于野生型小鼠(图6)，显示它们有记忆障碍。而氯马斯汀处理的APP/PS1转基因小鼠较未给药的转基因消暑的认知指数有显著增高(图6)，说明氯马斯汀改善了AD模型小鼠的认知障碍。与水迷宫实验结果一致，野生对照与野生氯马斯汀处理组之间识别指数差异无统计学意义(图6)，说明氯马斯汀不影响正常小鼠的行为认知功能。

由此我们得出结论，氯马斯汀慢性给药能有效改善APP/PS1转基因小鼠的学习与记忆能力，但对正常小鼠的学习记忆能力无影响。

三、氯马斯汀能有效抑制Aβ的沉积

Aβ在AD病理恶化中发挥着最核心的作用。Aβ在的脑内大量沉积，异常激活星形胶质细胞和小胶质细胞，释放大量的促炎因子和趋化因子，导致持续性的慢性神经炎症反应引起慢性二次脑损伤^[3]。Aβ的神经毒性损害以及大量的炎症毒性因子促使脑内慢性进行性神经元缺失，Aβ的慢性神经毒性损害联同其诱发的慢性神经炎症反应，引起钙超载，造成细胞线粒体能量代谢障碍，诱发细胞凋亡，加重神经元和神经棘突丢失，抑制长时程增强，导致认知障碍^[9]。

为了验证氯马斯汀处理对皮层及海马淀粉样蛋白沉淀沉积的影响，将APP/PS1转基因小鼠及野生型小鼠分别给予氯马斯汀处理5月后(口服给药，10mg/kg每天)，取标本进行免疫荧光染色及Elisa 蛋白测定评估皮层及海马淀粉样蛋白沉淀沉积情况。

各组小鼠行为学实验结束后，灌注固定，取材，切片，然后进行病理学分析。

免疫荧光染色：

1.从﹣80℃冰箱取出待染色脑片，室温复温半小时；

2.复温后，PBS湿化5分钟，后用滤纸吸干；

3.用免疫组化笔在组织周围画圈，加入适量0.3％tritionX-100破细胞膜，室温孵育30分钟；

4.吸干后，加入适量10％驴血清封闭1小时；

5.一抗(一抗稀释液稀释6E10,1:300GFAP,1:500Iba1,1:300)4℃孵育过夜；

6.PBS漂洗3次，每次10分钟；

7.加入对应的FITC标记荧光二抗(二抗稀释液稀释1:1000)室温孵育2小时；

8.PBS漂洗3次，每次10分钟；

9.加入DAPI进行核染，封片；

10.普通倒置荧光显微镜及激光共聚焦荧光显微镜拍照，摄片。

免疫荧光染色结果显示氯马斯汀给药能显著抑制APP/PS1转基因小鼠皮层(图8至图10)及海马(图11至图13)Aβ数量及斑块面积。

酶联免疫吸附法(Elisa)：Aβ40-42ELISA试剂盒采购于invitrogen(货号Aβ40:KMB3481，Aβ42：KMB3441)

1.样本收集与储存：

小鼠断头后，立即取出脑组织，用预冷的PBS冲洗干净表面血迹，分离皮层海马，称取重量。加入一定量冷TBS，用匀浆机将标本充分匀浆(冰上操作)，冰上裂解30分钟，4℃5000g离心10分钟，仔细收集上清液(可溶性Aβ)。离心后剩余沉淀加入配置好的盐酸胍溶液，混匀后，冰上裂解4小时，4℃10000g离心15分钟，仔细收集上清液 (不可溶性Aβ)。尽快进行测量。剩余样本储存于﹣80℃。

2.绘制标准曲线

3.操作步骤

3.1准备好试剂、标准品工作液和样品：所有试剂与样品使用前需在室温中平衡，冻融过的样品使用前需离心；

3.2根据孔板数目，取出所需用的板条，剩余孔板密封包装好放回冰箱中备用；

3.3分别将样品与标准品100μl加入对应的孔中，用提供的封板胶纸封住各个孔，37℃孵育箱孵育2小时；

3.4弃孔板中的液体，甩干，加入1×冲洗液冲洗4次；

3.5各孔中加入100ul 1×生物素抗体，用新封板胶纸封住，37℃孵育箱孵育1小时；

3.6弃孔板中的液体，甩干，加入1×冲洗液冲洗4次，后弃去，拍干；

3.7各孔中加入1×HRP标记的抗生物素抗体，新封板胶纸封住， 37℃孵育箱孵育30分钟；

3.8弃孔板中的液体，甩干，加入1×冲洗液冲洗4次，后弃去，拍干；

3.9各孔中加入100μl四甲基联苯胺(TBM)底物，37℃孵育箱孵育30分钟，避光；

3.10各孔中加入100μl终止液，用枪头吹打混匀，用酶标仪测量吸光度(OD值)，选择450nm波长测量各孔的OD值。

Elisa蛋白测定显示，给药组的APP/PS1转基因小鼠皮层及海马可溶性及不可溶性Aβ40、Aβ42都有明显的下降(图14至图19)。这些数据均能说明氯马斯汀能有效抑制Aβ的沉积。

四、氯马斯汀能有效减轻脑内慢性炎症反应

阿尔茨海默病患者脑内和阿尔茨海默病转基因模型鼠脑内，均可见大量激活的星型胶质细胞和小胶质细胞等炎性细胞浸润生长在沉积物周边，这是阿尔茨海默病脑内慢性炎症过程的最主要的参与者。异常激活的炎症细胞释放大量的炎症因子和趋化因子，损害正常的神经细胞和突触功能，导致神经元细胞大量死亡、进行性神经退化和慢性的脑损伤，因此抗炎治疗是有效抑制慢性炎症反应^[10]，减缓阿尔茨海默病病理恶化的一大策略。

按照上述方法，使用星型胶质细胞特异性抗体GFAP及小胶质细胞特异性抗体IBA1对脑片进行免疫荧光染色，发现同龄对照组 APP/PS1小鼠在皮层及海马区域存在明显的小胶质细胞(图23)及星形胶质细胞(图20)异常激活及聚集，而经由氯马斯汀处理的APP/PS1小鼠皮层及海马区域异常激活的小胶质细胞(图23至图25)及星形胶质细胞(图20至图22)数量明显减少，但仍未达到野生型小鼠水平。这些结果表明，氯马斯汀能有效抑制APP/PS1转基因模型小鼠脑内星型胶质细胞与小胶质细胞的激活，减轻脑内慢性炎症反应，改善脑内环境，抑制阿尔茨海默病病理进行性进展。

五、氯马斯汀通过激活自噬而缓解AD样症状

近年来，大部分研究表明，Aβ的发生发展伴随着自噬功能的异常。自噬的激活可能参与到Aβ斑块的产生、集聚及清除^[11]。因此，为了探索氯马斯汀缓解AD病理发展的分子机制，我们通过western blot 检测分析了氯马斯汀是否在AD模型小鼠脑中激活自噬。

Western-bloting检测：

1.提取组织蛋白及测定蛋白浓度

断头取脑后，分离好组织，用生理盐水清洗干净血迹，按组织质量没20mg加入150～250μl RIPA强裂解液，冰上操作于匀浆机上匀浆，冰上裂解30分钟，14000g 4℃离心15分钟。取上清，使用BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。剩余样本加入5×的上样缓冲液，95℃煮沸5分钟后冻存，进行下一步实验。

2.SDS-PAGE电泳跑胶

根据所测蛋白分子量的大小，选择合适的SDS-PAGE胶，参考 SDS-PAGE凝胶试剂盒使用说明配置分离胶及浓缩胶，将胶置于电泳槽中，加入适量1×的电泳缓冲液，小心拔出梳子，取出上样蛋白，按每孔20～40μg蛋白量进行上样，使用80V电压电泳至蛋白跑入浓缩胶，再调高电压至120V，待所需蛋白条带完全分离后即刻终止电泳。

3.转膜

准备好海绵和滤纸，剪取适当大小的PVDF膜。将PVDF膜分别浸泡于甲醇中15秒，去离子水5分钟，转膜缓冲液中10分钟。用切割刀切割好适量大小的胶，放置于对应的PVDF膜上。采用湿转法，需根据黑面-海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序排列好，小心赶走气泡。280mA电流转膜2小时。

4.免疫印迹反应

转膜结束后，将膜取出，放入预先配制好的5％BSA中封闭，摇床上室温封闭1小时，防止非特异性结合；制备好小口袋，加入稀释好的一抗，4℃孵育过夜；TBST漂洗3次，10分钟/次,加入对应的标记二抗，室温孵育1.5小时。TBST漂洗3次。

5.显色及图像分析

将ECL发光液中的A液、B液以适量等体积混匀后，滴在PVDF 膜上，在成像仪中观察和拍照,用分析软件进行分析条带的密度，计算各条带的平均密度值。

通过western blot检测，发现经氯马斯汀药物处理后的APP/PS1 转基因小鼠脑中磷酸化mTOR、磷酸化P70S6K水平较未给药的对照组APP/PS1转基因小鼠有明显的减少(图26和图27)，而总mTOR 及P70S6K水平却基本无差异(图26、28～31)。这些结果说明，氯马斯汀处理抑制APP/PS1小鼠脑内的mTOR信号通路，而后者在激活自噬中起着关键作用。与此结果一致的是，LC3-II水平在氯马斯汀处理的APP/PS1小鼠脑内有明显升高(图31)，提示该药物激活APP/PS1 小鼠脑内的自噬。因此，氯马斯汀通过抑制mTOR信号通路激活自噬，从而缓解AD样症状。

总之，本发明表明，氯马斯汀慢性给药可以减少AD模型小鼠的 Aβ斑块的密度，抑制神经炎症反应，从而改善模型小鼠的认知障碍。这说明，氯马斯汀是治疗AD的一个新型药物。

所述药物为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

所述组合物还包括改善神经递质的化合物(例如胆碱酯酶抑制剂)，改善去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、神经肽等失衡的非胆碱能类化合物，脑细胞代谢激活剂，脑血循环促进剂，麦角碱类，钙离子拮抗剂、神经营养因子、抗氧化剂、雌激素等。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于) 具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

主要参考文献：

[1].Ding,Y.,et al.,Retinoic acid attenuates beta-amyloid depositionand rescues memory deficits in an Alzheimer's disease transgenic mousemodel.J Neurosci,2008.28(45):p.11622-34.

[2].Ballard,C.,et al.,Alzheimer's disease.Lancet,2011.377(9770):p.1019-31.

[3].Huang,Y.and L.Mucke,Alzheimer mechanisms and therapeuticstrategies.Cell,2012.148(6):p.1204-22.

[4].De Strooper,B.,et al.,Deficiency of presenilin-1inhibits thenormal cleavage of amyloid precursor protein.Nature,1998.391(6665):p. 387-90.

[5].Latta,C.H.,H.M.Brothers and D.M.Wilcock,Neuroinflammation inAlzheimer's disease；A source of heterogeneity and target for personalizedtherapy.Neuroscience,2015.302:p.103-11.

[6].Liu,J.,et al.,Clemastine Enhances Myelination in the PrefrontalCortex and Rescues Behavioral Changes in Socially Isolated Mice. Journal ofNeuroscience,2016.36(3):p.957-962.

[7].Apolloni,S.,et al.,Actions of the antihistaminergic clemastine onpresymptomatic SOD1-G93A mice ameliorate ALS disease progression. Journal ofNeuroinflammation,2016.13(1).

[8].Jankowsky,J.L.,et al.,Mutant presenilins specifically elevate thelevels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo:evidence foraugmentation of a 42-specific gamma secretase.Hum Mol Genet,2004. 13(2):p.159-70.

[9].Hardy,J.A.and G.A.Higgins,Alzheimer's disease:the amyloid cascadehypothesis.Science,1992.256(5054):p.184-5.

[10].Lopez-Gonzalez,I.,et al.,Neuroinflammatory signals in Alzheimerdisease and APP/PS1 transgenic mice:correlations with plaques,tangles,andoligomeric species.J Neuropathol Exp Neurol,2015. 74(4):p.319-44.

[11].Li,Q.,Y.Liu and M.Sun,Autophagy and Alzheimer's Disease. CellMol Neurobiol,2017.37(3):p.377-388。

Claims (3)

1.氯马斯汀或其组合物在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述药物为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述组合物还包括改善神经递质的化合物，改善去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸、神经肽失衡的非胆碱能类化合物，脑细胞代谢激活剂，脑血循环促进剂，麦角碱类，钙离子拮抗剂，神经营养因子，抗氧化剂或者雌激素。