JP2023113893A - 抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｃｔｌａ－４抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）を発現する免疫細胞を標的とし、ＣＴＬＡ－４活性を調節するために有用であるＣＴＬＡ－４に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。【解決手段】本発明の様々な実施形態では、抗体は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する完全ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＣＴＬＡ－４活性を阻害または中和するために有用であり、よってＴ細胞を活性化する手段および／または癌もしくはウイルス感染症などの疾患もしくは障害を治療するための手段を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年６月２９日に作成され、１７８，０１８バイトを含有するファイル１０３６０ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。
本発明は、免疫調節受容体細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する抗体および抗体の抗原結合断片、ならびにそれらの抗体を使用する治療および診断方法に関する。
細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４、ＣＤ１５２としても知られる）は、従来型および制御性Ｔ細胞上に発現したＩ型膜貫通Ｔ細胞阻害チェックポイント受容体である。ＣＴＬＡ－４は、その天然リガンドであるＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）に結合する刺激性受容体ＣＤ２８を打ち負かすことによって、Ｔ細胞の活性化を負に制御する。初期Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合性複合体クラスＩまたはＩＩ（ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）タンパク質によって提示される特定のペプチドを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を刺激することによって達成される（非特許文献１）。活性化されたＴＣＲは、順にシグナル伝達事象のカスケードを開始し、これはアクチベータータンパク質１（ＡＰ－１）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、または活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）のなどの様々な転写因子の発現を制御するプロモーターによって駆動される、トランスフェクトされたレポーター遺伝子の発現によってモニターすることができる。Ｔ細胞応答は次いで、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、またはその他の分子などのＴ細胞上に構成的または誘導的に発現した共刺激性または共阻害性受容体の関与を介してさらに精製される（非特許文献２）。
共受容体であるＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現した、同じリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６について競合する。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８よりも高い親和性でＣＤ８０およびＣＤ８６に結合し、デコイとして機能し、リガンドを隔離してＴ細胞活性化の低減をもたらすことによって、ＣＤ２８の活性化を阻害する（非特許文献３、非特許文献４および非特許文献５）。
Ｇｏｌｄｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：２５５－２６２ Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１６－１２６ Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２２０－２２８ Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：８５２－８６３ Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３９：９８－１０６
本発明は、ＣＴＬＡ－４に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。本発明の抗体は、とりわけ、ＣＴＬＡ－４を発現する免疫細胞を標的とし、ＣＴＬＡ－４活性を調節するために有用である。特定の実施形態では、本発明の抗体は、例えば、Ｔ細胞媒介性殺滅が有益または所望である状況下で、ＣＴＬＡ－４活性の阻害もしくは中和および／またはＴ細胞活性化の刺激に有用である。特定の実施形態では、抗体は、制御性Ｔ細胞機能の阻害および／または消耗したＴ細胞の再活性化に有用である。本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはその抗原結合部分は、例えば、免疫応答を調節するため、および／または抗体を腫瘍細胞もしくは感染細胞などの特定の細胞タイプに標的化するために、多重特異性抗原結合分子の一部として含まれてもよい。抗体は、癌およびウイルス感染症などの疾患または障害の治療において有用である。
本発明の抗体は、完全長（例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体）であり得、または抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、機能性に影響するように、例えば、残存するエフェクター機能を除去するように修飾されてもよい（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１９２５－１９３３）。特定の実施形態では、抗体は、二重特異性であってもよい。
第１の態様では、本発明は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する、単離された組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、抗体は、完全にヒトのものである。
本発明の例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、本明細書の表１および２に列挙される。表１は、例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を説明する。表２は、例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を説明する。
本発明は、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対形成した、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含む、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかに含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／２９８、３１４／３２２、３３０／３３８、
３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、および４９０／４９８からなる群から選択される。特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号１９４／２０２（例えば、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）または２９０／２９８（例えば、Ｈ１Ｈ１９３１９Ｐ２）のうちの１つから選択される。特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、最大１０個のアミノ酸置換を有する表１に列挙されたアミノ酸配列を含み、当該ＬＣＶＲは、最大１０個のアミノ酸置換を有する表１に列挙されたアミノ酸配列を含む。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、最大１０個のアミノ酸置換を有する配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、当該ＬＣＶＲは、最大１０個のアミノ酸置換を有する配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、当該ＬＣＶＲは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号２０２のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対形成した表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３のアミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供す
る。特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかに含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号２００／２０８（例えば、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）および２９６／３０４（例えば、Ｈ１Ｈ１９３１９Ｐ２）からなる群から選択される。
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、１アミノ酸だけ表１に列挙されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、１アミノ酸だけ表１に列挙されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および１アミノ酸だけ表１に列挙されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＬＣＶＲは、１アミノ酸だけ表１に列挙されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、１アミノ酸だけ表１に列挙されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および１アミノ酸だけ表１に列挙されたアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。例えば、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含むＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＨＣＶＲは、配列番号１９６のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号１９６とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１９８のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号１９８とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、および配列番号２００のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２００とは異なるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む。別の例示的な実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む抗体またはその抗原結合断片を提供し、当該ＬＣＶＲは、配列番号２０４のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２０４とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２０６のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２０６とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号２０８のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２０８とは異なるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
本発明はまた、表１に列挙された例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかに含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号１９６－１９８－２００－２０４－２０６－２０８（例えば、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）および２９２－２９４－２９６－３００－３０２－３０４（例えば、Ｈ１Ｈ１９３１９Ｐ２）からなる群から選択される。
関連する実施形態では、本発明は、表１に列挙された例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有される６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号１９４／２０２（例えば、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）および２９０／２９８（例えば、Ｈ１Ｈ１９３１９Ｐ２）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、抗体またはその抗原結合断片を含む。ＨＣＶＲアミノ酸配列およびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技術は、当該技術分野において周知であり、それらを使用して、本明細書に開示される特定のＨＣＶＲアミノ酸配列および／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定することができる。ＣＤＲの境界を同定するために使用可能な例示的な規則には、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、およびＡｂＭ定義が含まれる。一般的には、Ｋａｂａｔ定義は配列の可変性に基づいており、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づいており、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔのアプローチとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの間の折衷案である。例
えば、Ｋａｂａｔ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８（１９９７）、およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９２６８－９２７２（１９８９）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公開データベースも利用可能である。
本発明は、修飾グリコシル化パターンを有する抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。いくつかの実施形態において、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、または例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）機能を増大させるための、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失している抗体が有用であり得る（Ｓｈｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＪＢＣ ２７７：２６７３３を参照されたい）。他の用途において、ガラクトシル化の修飾は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を修飾するために行うことができる。
本発明は、Ｆｃドメインを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体を含み、Ｆｃドメインは、本明細書の他の箇所で説明されるようなＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを含む。
本発明はまた、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合断片とＣＴＬＡ－４への特異的結合について競合する抗体およびその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、その天然リガンド（Ｂ７－１／ＣＤ８０およびＢ７－２／ＣＤ８６）へのＣＴＬＡ－４結合をブロックする単離された抗体およびその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ－４結合をブロックする抗体またはその抗原結合断片は、ＣＴＬＡ－４上のＢ７－１／ＣＤ８０および／もしくはＢ７－２／ＣＤ８６と同じエピトープに結合し得るか、またはＣＴＬＡ－４上のＢ７－１／ＣＤ８０および／もしくはＢ７－２／ＣＤ８６とは異なるエピトープに結合し得る。
本発明はまた、ヒトまたは他の種からのＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４および／またはサルＣＴＬＡ－４に結合し得る。
本発明はまた、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片とＣＴＬＡ－４への結合について交差競合する抗体およびその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。
本発明はまた、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体およびその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲはそれぞれ、表１に列挙されたＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本発明は、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む参照抗体またはその抗原結合断片と同じエピトープに結合する抗体およびその抗原結合断片を提供し、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号１９４／２０２を有する。
本発明はまた、ヒトＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン内に含有される１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。
一実施形態では、本発明は、以下の特徴：（ａ）ヒトＣＴＬＡ－４および／またはカニクイザルＣＴＬＡ－４に特異的に結合すること、（ｂ）ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０および／またはＣＤ８６への結合をブロックすること、（ｃ）ＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御をブロックし、Ｔ細胞シグナル伝達をレスキューすること、ならびに（ｄ）癌を有する対象において腫瘍成長を抑制し、生存率を増加させることのうちの１つ以上を有する組換えヒトモノクローナル抗体または抗原結合断片を提供する。
いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アゴニスト様式でＣＴＬＡ－４に特異的に結合し得、すなわち、ＣＴＬＡ－４結合および／または活性を増強または刺激し得、他の実施形態において、抗体は、アンタゴニスト様式でＣＴＬＡ－４に特異的に結合し得、すなわち、ＣＴＬＡ－４がそのリガンド（複数可）に結合するのをブロックし得る。
特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、ＣＴＬＡ－４に対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープについての第２の結合特異性を含む二重特異性である。第２の標的エピトープは、ＣＴＬＡ－４上または異なるタンパク質上の別のエピトープであってもよい。特定の実施形態において、第２の標的エピトープは、異なるＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍細胞、またはウイルス感染細胞を含む異なる細胞上にあってもよい。
第２の態様において、本発明は、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ１核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ２核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、表１に列挙されたＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＬＣＤＲ３核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を含む。
本発明はまた、ＨＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３）を含み、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙された例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかによって定義されるとおりである。
本発明はまた、ＬＣＶＲをコードする核酸分子を提供し、ＬＣＶＲは、３つのＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３）を含み、ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、表１に列挙された例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかによって定義されるとおりである。
本発明はまた、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子を提供し、ＨＣＶＲは、表１に列挙されたＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲは、表１に列挙されたＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、核酸分子は、表２に列挙されたＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、表２に列挙されたＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列と、を含む。本発明のこの態様による特定の実施形態において、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、両方とも表１に列挙された同じ抗ＣＴＬＡ－４抗体に由来する。
関連する態様において、本発明は、抗ＣＴＬＡ－４抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表１に記載のＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。本発明はまた、抗ＣＴＬＡ－４抗体の重鎖または軽鎖を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表１に記載の重鎖または軽鎖配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。本発明の範囲内にはまた、このようなベクターが導入さ
れた宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって抗体またはその一部を産生する方法と、そのように産生された抗体および抗体断片を回収する方法とが含まれる。
第３の態様において、本発明は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗ＣＴＬＡ－４抗体と第２の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態において、第２の治療剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。抗ＣＴＬＡ－４抗体と有利に組み合わされ得る例示的な薬剤には、限定なしに、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達を結合および／もしくは調節する他の薬剤（他の抗体またはその抗原結合断片などを含む）ならびに／またはＣＴＬＡ－４に直接結合しないが、それにもかかわらず免疫細胞活性化を調節する薬剤が含まれる。本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む追加の併用療法および共製剤は、本明細書の他の箇所に開示されている。
第４の態様において、本発明は、対象において免疫応答を調節する方法を提供し、方法は、治療有効量の本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片をそれを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態において、本発明は、対象において免疫応答を増強する方法を提供し、方法は、対象に有効量のＣＴＬＡ－４に結合する本発明の抗体またはその断片を投与することを含む。一実施形態において、本発明は、対象においてＴ細胞活性化を刺激または増強する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞活性がレスキューされるようにＴ細胞を有効量の本発明の抗体と接触させることを含む、Ｔ細胞活性をレスキューする方法を提供する。一実施形態において、本発明は、対象においてＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を阻害する方法を提供し、方法は、治療有効量の本発明の抗体またはその抗原結合断片をそれを必要とする対象に投与することを含む。特定の実施形態において、それを必要とする対象は、癌またはウイルス感染症などの疾患または障害に罹患している場合がある。特定の実施形態において、本発明は、Ｔ細胞を有効量の本発明の抗体と接触させることを含む、Ｔ細胞活性のＣＴＬＡ－４媒介性阻害をレスキューする方法を提供する。
第５の態様において、本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗体の抗原結合部分を使用して、対象において癌またはウイルス感染症などの疾患または障害を治療するための治療方法を提供し、治療方法は、治療有効量の本発明の抗体または抗体の断片を含む薬学的組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む。治療される障害は、ＣＴＬＡ－４活性またはシグナル伝達の刺激または阻害によって改善、改良、阻害、または予防される任意の疾患または状態である。特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、第２の治療剤と組み合わせてそれを必要とする対象に投与される。第２の治療剤は、別のＴ細胞共阻害剤に対する抗体、腫瘍細胞抗原に対する抗体、Ｔ細胞受容体に対する抗体、ウイルス感染細胞上のエピトープに対する抗体、細胞毒性剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド）、化学療法剤、放射線療法、手術、免疫抑制剤、および当該技術分野で知られている他の薬物または療法からなる群から選択され得る。ある特定の実施形態において、第２の治療剤は、本発明の抗体または抗原結合断片と関連した何らかの起こり得る副作用（複数可）が生じるであろう場合、この副作用に対処またはこれを軽減するのを助ける薬剤であり得る。
特定の実施形態において、本発明は、腫瘍成長を抑制するための方法を提供する。例えば、本発明は、対象における原発性腫瘍または転移性腫瘍による腫瘍成長を抑制することを提供する。特定の実施形態において、本発明は、癌を有する対象の生存率（例えば、無増悪生存率または全生存率）を高める方法を提供する。癌の例には、これらに限定されないが、血液癌（例えば、リンパ腫、骨髄腫、または白血病などの血液悪性腫瘍）、脳癌（
例えば、多形性膠芽腫）、肺癌（例えば、進行性または転移性ＮＳＣＬＣを含む、非小細胞肺癌）、頭頸部の扁平上皮癌、肝細胞癌、腎細胞癌、黒色腫、中皮腫、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、骨癌、結腸直腸癌、腎臓癌、食道癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、皮膚癌、子宮頸癌、腸癌、前立腺癌、および結腸癌を含む、原発性および／または再発性癌が含まれる。特定の実施形態において、本発明は、定着腫瘍の成長を阻害または抑制するための方法を提供する。方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む薬学的組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、抗体は、プログラム死－１（ＰＤ－１）阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、またはＲＥＧＮ２８１０などの抗ＰＤ－１抗体）、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）阻害剤（例えば、アテゾリズマブ、アバルマブ、またはデュルバルマブなどの抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト、ベバシズマブ）、アンジオポエチン－２（Ａｎｇ２）阻害剤（例えば、ネスバクマブなどの抗Ａｎｇ２抗体）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）阻害剤、ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体（例えば、ＲＥＧＮ１９７９）、細胞毒、化学療法剤、癌ワクチン、手術、および放射線療法からなる群から選択される第２の治療剤と組み合わせて投与される。癌の治療における使用のための本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせて使用することができる追加の療法／治療剤の追加の例は、本明細書の他の箇所に記載されている。
抗体またはその断片は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内に投与され得る。特定の実施形態において、抗体またはその断片は、腫瘍内に局所的に（腫瘍周囲または腫瘍内に）投与される。抗体またはその断片は、対象の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ～体重の約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。特定の実施形態において、抗体は、それを必要とする対象に約５０ｍｇ～約１０００ｍｇの量で投与される。いくつかの実施形態において、抗体は、約２５ｍｇ～約６００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、抗体は、約５０ｍｇ～約１２００ｍｇの用量で投与される。
本発明はまた、ＣＴＬＡ－４結合および／または癌などのシグナル伝達の遮断から利益を得るであろう疾患または障害の治療のための医薬品の製造における、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片の使用を含む。
本発明はさらに、（ｉ）ＣＴＬＡ－４をアンタゴナイズすることによって治療可能である疾患もしくは障害（例えば、癌）を治療するための医薬品の製造における、および／または（ｉｉ）ＣＴＬＡ－４をアンタゴナイズすることによって治療可能である疾患もしくは障害（例えば、癌）の治療における、抗体および抗原結合断片、またはそれらを含む薬学的組成物の使用を含む。
別の態様において、本発明は、対象に抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－１抗体を投与することを含む、それを必要とする対象において非小細胞肺癌（進行性または転移性ＮＳＣＬＣを含む）を治療する方法を提供する。いくつかの事例において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲと、配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲと、を含む。いくつかの事例において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、それぞれ、配列番号１９６－１９８－２００－２０４－２０６－２０８からなる群から選択されるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む。いくつかの事例において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む。いくつかの事例において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、セミプリマブである。本発明はまた、癌（例えば、進行性または転移性ＮＳＣＬＣを含む、非小細胞肺癌）の治療のための医薬品の製造におけるそのような抗体の使用を含む。
他の実施形態は、後述の詳細な説明の精査から明らかとなるであろう。
実施例７において試験（Ａ）に記載される実験の複数の腫瘍移植後の時点での各治療群における平均腫瘍体積（ｍｍ３＋／－ＳＥＭ）を示す。ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスに、０日目にＭＣ３８．Ｏｖａ細胞（１０６細胞／マウス）をＳＣ移植し、４つの治療群（９マウス／群）に分けた。マウスに、３、７、１０、１４、および１７日目に、１０ｍｇ／ｋｇの３つのリード抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（Ｈ１Ｈ１９２７３Ｐ、またはＨ１Ｈ１９３０３Ｐ、またはＨ１Ｈ１９３１９）のうちのいずれか１つ、または１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照を腹腔内（ＩＰ）投与した。腫瘍体積は、キャリパー測定によって３７日間にわたって週に２回モニターした。治療日は矢印で示される。 実施例７において試験（Ａ）に記載される実験について２４日目の個々の腫瘍体積を示す。２４日目は、全ての群における全ての動物が生存していた試験における最後の時点であった。統計的有意性は、試験後のダネットの多重比較での一元配置分散分析によって決定した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 実施例７において試験（Ａ）に記載される実験についてのカプラン・マイヤー生存率曲線を示す。 実施例７において試験（Ｂ）に記載される実験の複数の腫瘍移植後の時点での各治療群における平均腫瘍体積（ｍｍ３＋／－ＳＥＭ）を示す。ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスに、３、６、９、１３、および１６日目に抗ＣＴＬＡ－４抗体Ｈ１Ｈ１９３０３ＰまたはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照ＩＰを投与した。腫瘍体積は、キャリパー測定によって３７日間にわたって週に２回モニターした。治療日は矢印で示される。 実施例７において試験（Ｂ）に記載される実験について２０日目の個々の腫瘍体積を示す。統計的有意性は、試験後のＤｕｎｎｅｔｔの多重比較での一元配置分散分析によって決定した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 実施例７において試験（Ｂ）に記載される実験についてのカプラン・マイヤー生存率曲線を示す。 実施例７において試験（Ｂ）に記載されるように、血清中の総Ｈ１Ｈ１９３０３ＰおよびｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の濃度を示す。 実施例７において試験（Ｂ）に記載されるように、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ（■）またはアイソタイプ対照（●）に対するマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）の濃度を示す。 実施例８に記載される実験の複数の腫瘍移植後の時点での各治療群における平均腫瘍体積（ｍｍ３＋／－ＳＥＭ）を示す。治療日は矢印で示される。 実施例８に記載されるように、治療開始後１０日目の個々の腫瘍体積を示す。 実施例８に記載される実験についてのカプラン・マイヤー生存率曲線を示す。 Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ（ＲＥＧＮ４６５９としても知られる）がＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスにおいて定着腫瘍の成長を遅らせることを示す。マウスの脇腹にＭｃ３８．Ｏｖａ細胞（５ｘ１０＾５細胞／マウス）をｓｃ移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ＾３に達した１０日目に治療群に無作為化し、ＲＥＧＮ４６５９（２５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）またはアイソタイプ対照Ａｂ（２５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）を１０、１３、１７日目に投与し、２７日目まで腫瘍体積をモニターした。図１２は、各治療群における平均腫瘍成長曲線を示す。 Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ（ＲＥＧＮ４６５９としても知られる）がＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスにおいて定着腫瘍の成長を遅らせることを示す。マウスの脇腹にＭｃ３８．Ｏｖａ細胞（５ｘ１０＾５細胞／マウス）をｓｃ移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ＾３に達した１０日目に治療群に無作為化し、ＲＥＧＮ４６５９（２５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）またはアイソタイプ対照Ａｂ（２５ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１０）を１０、１３、１７日目に投与し、２７日目まで腫瘍体積をモニターした。図１３は、試験中の全ての動物が生存していた最後の時点である２１日目に測定された各治療群における個々の腫瘍体積を示す。 ｈＩｇＧ１対照抗体で治療された腫瘍を有するＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスにおける腫瘍内および脾臓ＴｒｅｇおよびＴエフェクター細胞上での全（表面および細胞内）ヒトＣＴＬＡ－４発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。脾臓ＣＤ８＋およびＣＤ４＋エフェクター細胞上でのＣＴＬＡ－４の発現は、アイソタイプ対照染色と区別がつかず（ＭＦＩ＝０）、示されていない。
本発明の方法を説明する前に、本発明は、特定の方法および説明される実験条件が変わり得るので、このような方法および条件に限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。
別段定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の何らかの方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれより説明する。本明細書で言及される全ての出版物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「ＣＴＬＡ－４」という用語は、ＣＤ１５２としても知られる、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４、免疫チェックポイント受容体、またはＴ細胞共阻害剤を指す。全長ヒトＣＴＬＡ－４のアミノ酸配列は、配列番号５０５（アクセッション番号ＮＰ＿００５２０５．２）として提供される。「ＣＴＬＡ－４」という用語には、組換えＣＴＬＡ－４またはその断片が含まれる。用語は、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトＦｃ、シグナル配列、またはＣＤ３００ａの膜貫通および細胞質ドメインに結合したＣＴＬＡ－４またはその断片も含む（ａａ １８１－２９９、アクセッション番号ＮＰ＿００９１９２．２）。例えば、用語は、例えば、全長ＣＴＬＡ－４のＣ末端にｍｙｃ－ｍｙｃ－ポリヒスチジンタグを含む、または全長ＣＴＬＡ－４のＣ末端にマウスＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ）を含む、例において議論される配列を含む。非ヒト種からのものであると指定されない限り、「ＣＴＬＡ－４」という用語は、ヒトＣＴＬＡ－４を意味する。
ＣＴＬＡ－４は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバー、およびＣＤ２８のホモログであるが、リガンドＣＤ８０およびＣＤ８６に対してより大きな結合親和性を有する。ＣＴＬＡ－４は、Ｖドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに活性化Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞上に発現した細胞質尾部を含有する２２３アミノ酸Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＣＴＬＡ－４受容体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在するＢ７－１／ＣＤ８０およびＢ７－２／ＣＤ８６リガンドに結合する。
本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞共阻害剤」という用語は、Ｔ細胞の活性化または抑制を介して免疫応答を調節するリガンドおよび／または受容体を指す。Ｔ細胞共シグナル伝達分子としても知られる「Ｔ細胞共阻害剤」という用語には、これらに限定されないが、プログラム死－１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン３（ＴＩＭ３）、免疫グロブリンおよびＩＴＩＭを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ、ＶＳＩＧ９としても知られる）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１、ＣＤ３０５としても知られる）、誘導性Ｔ細胞共刺激剤（ＩＣＯ
Ｓ、ＣＤ２７８としても知られる）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制剤（ＶＩＳＴＡ）、ならびにＣＤ１６０が含まれる。
本明細書で使用する「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すよう企図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本発明のある特定の実施形態において、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、または天然にもしくは人工的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も可能である。抗体は、１つまたは２つのＣＤＲが結合のために省かれる場合がある科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５ ＦＡＳＥＢＪ．９：１３３－１３９）は、公開された結晶構造に基づいて、抗体とそれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約１／５～１／３のみが実際に抗原と接触すると結論づけた。Ｐａｄｌａｎは、１つまたは２つのＣＤＲが抗原と接触しているアミノ酸を有さない多くの抗体も発見した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照されたい）。
抗原と連絡していないＣＤＲ残基は、先行研究に基づいて、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデリングによっておよび／または演繹的に識別することができる（例えば、ＣＤＲＨ２中の残基Ｈ６０～Ｈ６５はしばしば必要ではない）。ＣＤＲまたはその残基（複数可）が省略される場合、そのＣＤＲまたはその残基（複数可）は、別のヒト抗体配列またはこのような配列のコンセンサスにおける対応する位置を占有するアミノ酸と置換される。ＣＤＲ内の置換のための位置および置換すべきアミノ酸も演繹的に選択することができる。演繹的な置換は、保存的置換または非保存的置換であり得る。
本明細書に開示される完全ヒト抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み得る。このような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公共の抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、ここで、１つ以上のフレームワーク領域および／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、もしくは別のヒト生殖系列配列の対応する残基（複数可）に変異し、または対応する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換に変異する（このような配列変化を本明細書では纏めて、「生殖系列変異」と称する）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、１つ以上の個々の生殖系列変異またはそれらの組み合わせを含む多くの抗体および抗体結合断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基は全
て、抗体が由来した元の生殖系列配列において見出される残基へと再び変異する。他の実施形態において、ある特定の残基のみが元の生殖系列配列へと変異し戻され、例えば、変異した残基はＦＲ１の最初の８個のアミノ酸内に、もしくは変異した残基はＦＲ４の最後の８個のアミノ酸内に認められ、または変異した残基は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３内にのみ認められる。他の実施形態において、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）の１つ以上は、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来した生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の対応する残基（複数可）へ変異する。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に２つ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有してもよく、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基へ変異するのに対し、元の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持され、または異なる生殖系列配列の対応する残基へ変異する。いったん得られれば、１つ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗体結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニストの生物学的特性の改善または増強（場合によって）、免疫原性の低下などの１つ以上の所望の特性について容易に試験することができる。この一般的な方法で得られる抗体および抗体結合断片は、本発明の範囲内に包含される。
本発明は、１つ以上の保存的置換を有する本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体も含む。例えば、本発明は、本明細書に開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下などの保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。
「ヒト抗体」および「完全ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」および「完全ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列に移植されたｍＡｂを含むことを意図しない。用語は、非ヒト哺乳動物において、または非ヒト哺乳動物の細胞において組換え産生された抗体を含む。用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むことを意図しない。
本明細書で使用する「組換え」という用語は、例えばＤＮＡスプライシングおよび遺伝子導入発現を含む組換えＤＮＡ技術として当該技術分野で既知の技術または方法によって作製、発現、単離または得られた本発明の抗体またはその抗原結合断片を指す。この用語は、非ヒト哺乳類（トランスジェニック非ヒト哺乳類、例えばトランスジェニックマウスを含む）、もしくは細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）発現系において発現した抗体、または組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体を指す。
本明細書で使用される「多重特異性抗原結合分子」という用語は、二重特異性、三重特異性、または多重特異性抗原結合分子、およびその抗原結合断片を指す。多重特異性抗原結合分子は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。多重特異性抗原結合分子は、単一の多機能性ポリペプチドであり得るか、または共有結合的または非共有結合的に互いに会合した２つ以上のポリペプチドの多量体複合体であり得る。「多重特異性抗原結合分子」という用語には、別の機能分子、例えば、別のペプチドま
たはタンパク質と連結または共発現され得る本発明の抗体が含まれる。例えば、抗体またはその断片は、タンパク質またはその断片などの１つ以上の他の分子実体に（例えば、化学結合、遺伝的融合、非共有結合性会合などによって）機能的に連結して、第２の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性抗原結合分子を産生することができる。本発明によれば、「多重特異性抗原結合分子」という用語は、二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性抗体またはその抗原結合断片も含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、別の抗体またはその抗原結合断片に機能的に連結されて、第２の結合特異性を有する二重特異性抗体を産生する。本発明の二重特異性および多重特異性抗体は、本明細書の他の箇所に記載されている。
「～が特異的に結合する」もしくは「～に特異的に結合する」という用語、またはこれらに類するものは、抗体もしくはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定的である抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－８Ｍ以下の平衡解離定数を特徴とし得る（例えば、より小さなＫＤは、より緊密な結合を示す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、およびこれらに類するものを含む。本明細書に記載されるように、抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって識別されている。さらに、ＣＴＬＡ－４における１つのドメインおよび１つ以上の追加の抗原に結合する多重特異性抗体またはＣＴＬＡ－４の２つの異なる領域に結合する二重特異性は、それにもかかわらず、本明細書に使用される「特異的に結合する」抗体とみなされる。
「高親和性」抗体という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）または溶液親和性ＥＬＩＳＡによって測定されるように、少なくとも１０－８Ｍ、好ましくは１０－９Ｍ、より好ましくは１０－１０Ｍ、さらにより好ましくは１０－１１Ｍ、さらにより好ましくは１０－１２ＭのＫＤとして表される、ＣＴＬＡ－４に対する結合親和性を有するｍＡｂを指す。
「スローオフレート」、「Ｋｏｆｆ」、または「ｋｄ」という用語は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）によって測定されるように、１×１０－３秒－１以下、好ましくは１×１０－４秒－１以下の速度定数で、ＣＴＬＡ－４から解離する抗体を意味する。
抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」という用語、およびこれらに類するものは、本明細書で使用される場合、任意の天然に生じる、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用されるとき、ＣＴＬＡ－４に結合する能力を保有する抗体の１つ以上の断片を指す。
特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体断片は、細胞毒素、第２の抗ＣＴＬＡ－４抗体、腫瘍特異的抗原に対する抗体、抗癌薬、または癌もしくは慢性ウイルス感染症を含むウイルス感染症を含む疾患もしくは状態を治療するために有用な任意の他の治療部分などの、リガンドまたは治療部分（「免疫結合体」）などの部分に結合され得る。
「単離された抗体」は、本明細書で使用されるとき、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、ＣＴＬＡ－４以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
「遮断抗体」または「中和抗体」は、本明細書で使用されるとき（または「ＣＴＬＡ－４活性を中和する抗体」もしくは「アンタゴニスト抗体」は）、ＣＴＬＡ－４へのその結合がＣＴＬＡ－４の少なくとも１つの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６へのＣＴＬＡ－４結合を防止またはブロックし得る。
本明細書で使用される「活性化抗体」または「増強抗体」（または「アゴニスト抗体」）は、ＣＴＬＡ－４へのその結合がＣＴＬＡ－４の少なくとも１つの生物学的活性の増加または刺激をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、リガンド結合（例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６）と一貫した方法でＣＴＬＡ－４に結合することにより、ＣＴＬＡ－４活性を増加させ、ＣＴＬＡ－４細胞内シグナル伝達をもたらし得る。
「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、スウェーデン国ウプサラ市および米国ニュージャージー州ピスカタウェイ郡区）を使用して、バイオセンサマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によって実時間での生体分子相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体・抗原相互作用の平衡解離定数を指すことが企図される。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして既知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つ超のエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域へ結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。この用語は、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的と定義され得る。機能的エピトープは概して、構造エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープは、立体配座的でもあり得、すなわち、非線形アミノ酸から構成され得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的に活性のある表面群である決定基を含み得、特定の実施形態では、特異的三次元構造特徴および／または比電荷特徴を有し得る。
「交差競合」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原へ結合し、別の抗体またはその抗原結合断片の結合を阻害またはブロックする抗体または抗原結合断片を意味する。この用語は、両方の配向における２つの抗体間の競合、すなわち結合して第２の抗体の結合をブロックする第１の抗体、およびその逆も含む。ある特定の実施形態において、第１の抗体および第２の抗体は、同じエピトープへ結合し得る。あるいは、第１および第２の抗体は、例えば、立体障害を介して、あるものの結合が第２の抗体の結合を阻害またはブロックするように、異なってはいるが重複しているエピトープへ結合し得る。抗体間の交差競合は、当該技術分野で既知の方法によって、例えば、リアルタイムの無標識バイオ層干渉測定アッセイによって測定してもよい。２つの抗体間の交差競合は、自己間結合によるバックグラウンドシグナルよりも低い第２の抗体の結合として表され得る（第１および第２の抗体は、同じ抗体である）。２つの抗体間の交差競合は、例えば、ベースラインの自己間バックグラウンド結合よりも低い第２の抗体の結合％として表され得る（第１および第２の抗体は、同じ抗体である）。
「実質的な同一性」または「実質的に同一である」という用語は、核酸またはその断片を指す場合、別の核酸（またはその相補鎖）での適切なヌクレオチド挿入または欠失と最
適に整列されるとき、以下に議論される、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定されるように、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のヌクレオチド配列同一性があることを示す。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の場合では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
配列同一性は、アルゴリズム、例えば、グローバルアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ １９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）またはローカルアラインメントのためのＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ １９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）を使用して計算することができる。別の好ましいアルゴリズムは、Ｄｕｆｒｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ２００２（ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１２６９－７１）によって記載され、ソフトウェアＧｅｎｅＰＡＳＴ（ＧＱ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で使用される。
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似の」という用語は、２つのペプチド配列が、既定のギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰもしくはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換だけ異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を備えた側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されたものである。概して、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換だけ互いに異なる場合、相同性の百分率または程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整してもよい。この調整を行うための手段は、当業者によく知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照されたい。類似の化学的特性を備えた側鎖を有するアミノ酸基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン、２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）含硫側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸－アスパラギン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。あるいは、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する任意の変化である。「適度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負以外の値を有する任意の変化である。
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の測定値を使用して類似の配列と一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドのような密接に関連するポリペプチド間の、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定するための既定パラメーターとともに使用することができるＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ第６．１版
を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＧＣＧ第６．１版におけるプログラムである、既定パラメーターまたは推奨パラメーターを備えたＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列の間の最良重複の領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００）上述）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別の好ましいアルゴリズムは、既定パラメーターを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０および（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２を参照されたい。
「治療有効量」という語句は、所望の効果のために投与されて所望の効果を生じる量を意味する。正確な量は、治療の目的によることになっており、既知の技術を使用して当業者によって確認できるであろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、ウイルス感染症または癌などの疾患または障害の改善、予防、および／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳動物を指す。用語には、癌、転移性癌、またはウイルス感染症を有するか、またはそのリスクがあるヒト対象が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「抗癌薬」は、細胞毒、ならびに代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、シクロホスファミド、ミトタン（Ｏ，Ｐ’－（ＤＤＤ））、生物製剤（例えば、抗体およびインターフェロン）、および放射性薬剤などの薬剤を含むが、これらに限定されない、癌を治療または改善または阻害するために有用な任意の薬剤を意味する。本明細書で使用されるとき、「細胞毒または細胞毒性剤」は、化学療法剤も指し、細胞に有害である任意の薬剤を意味する。例には、Ｔａｘｏｌ（登録商標）（パクリタキセル）、テモゾラミド、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、シスプラチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンビアスチン、コイチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが含まれる。
本明細書で使用されるとき、「抗ウイルス薬」という用語は、宿主対象におけるウイルス感染症を治療、予防、または改善するために使用される任意の薬物または療法を指す。「抗ウイルス薬」という用語には、これらに限定されないが、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリン、鎮痛剤、およびコルチコステロイドが含まれる。本発明の文脈において、ウイルス感染症には、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含むウイルスによって引き起こされる長期または慢性感染症が含まれる。
本明細書で使用されるとき、「免疫応答を増強する」という用語は、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に対するＴ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞の活性の増加を指す。本発明の文脈において、用語は、Ｔ細胞活性のＣＴＬＡ－４媒介性阻害のブロック、またはＴ
細胞の消耗状態のレスキューもしくは逆転を含む。また、制御性Ｔ細胞活性の阻害も含まれる。本発明の文脈で使用される免疫応答の増強は、腫瘍細胞の殺滅の増加および／または腫瘍成長の阻害をもたらす。
本発明の抗体および抗原結合断片は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、Ｔ細胞活性化を増強する。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＣＴＬＡ－４に高親和性または低親和性で結合し得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、遮断抗体であり得、抗体は、ＣＴＬＡ－４に結合し、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達を阻害し得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６への結合をブロックし、ならび／またはＴ細胞活性化を刺激もしくは増強する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＣＴＬＡ－４に結合し、消耗したＴ細胞のアネルギー状態を逆転させる。特定の実施形態において、抗体は、ＣＴＬＡ－４に結合し、制御性Ｔ細胞活性を阻害する。いくつかの実施形態において、抗体は、免疫応答を刺激もしくは増強、および／または癌もしくはウイルス感染症に罹患している対象を治療するために有用であり得る。抗体は、それを必要とする対象に投与された場合、対象におけるＨＩＶ、ＬＣＭＶ、またはＨＢＶなどのウイルスによる慢性感染を低減し得る。それらは、対象において腫瘍細胞の成長を阻害するために使用され得る。抗体は、単独で、または癌もしくはウイルス感染症を治療するための当該技術分野で既知の他の治療部分もしくはモダリティでの補助療法として使用され得る。
特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、多重特異性抗原結合分子であり得、それらは、ＣＴＬＡ－４に対する第１の結合特異性、ならびに別のＴ細胞共阻害剤からなる群から選択される抗原、およびＣＴＬＡ－４の異なるエピトープに対する第２の結合特異性を含む。
ＣＴＬＡ－４に対する抗体を生成するために、以下のいずれか１つを含む免疫原を使用することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、完全長の天然ＣＴＬＡ－４（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５２０５．２参照）（配列番号５０５）または組換えＣＴＬＡ－４ペプチドで免疫化されたマウスから得られる。あるいは、ＣＴＬＡ－４またはその断片は、標準的な生化学的技術を使用して産生され、免疫原として使用され得る。
特定の実施形態において、免疫原は、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインである。本発明の一実施形態において、免疫原は、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインの断片である。
いくつかの実施形態において、免疫原は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてまたはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの任意の他の真核細胞もしくは哺乳動物細胞において発現した組換えＣＴＬＡ－４ペプチドであり得る。
特定の実施形態において、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体は、上記の領域の断片、または本明細書に記載される領域のＮもしくはＣ末端のいずれかもしくは両方から約５～約２０個のアミノ酸残基だけ指定領域を超えて延在するペプチドを使用して調製され得る。特定の実施形態において、上記の領域またはその断片の任意の組み合わせは、ＣＴＬＡ－４特異性抗体の調製において使用され得る。
ペプチドは、タグ付けのために、またはＫＬＨなどの担体分子への接合の目的のために、特定の残基の付加または置換を含むように修飾され得る。例えば、システインは、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付加されてもよく、またはリンカー配列を付加して、例えば、免疫化のためのＫＬＨへの結合のためのペプチドを調製してもよい。
本発明の特定の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、インビトロアッセイまたはインビボアッセイによって測定されるように、ＣＴＬＡ－４に結合し、その活性を中和することができる。ＣＴＬＡ－４に結合し、その活性を中和する本発明の抗体の能力は、本明細書に記載される、結合アッセイまたは活性アッセイを含む、当業者に知られる任意の標準的な方法を使用して測定され得る。
結合活性を測定するための非限定的な、例示的なインビトロアッセイは、本明細書の実施例に示される。実施例３では、ヒトおよびサルＣＴＬＡ－４についてのヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体の結合親和性および動態定数は、表面プラズモン共鳴またはＭＡＳＳ－１によって決定された。実施例４では、その天然リガンドＢ７－１およびＢ７－２へのＣＴＬＡ－４タンパク質結合をブロックする抗ＣＴＬＡ－４抗体の能力を評価するために、競合サンドイッチＥＬＩＳＡが使用された。実施例５は、ＣＴＬＡ－４を発現する細胞への抗ＣＴＬＡ－４抗体の結合を記載する。実施例６では、Ｔ細胞を活性化し、ＩＬ－２放出をレスキューする抗ＣＴＬＡ－４抗体の能力を決定するために、ルシフェラーゼアッセイおよびＩＬ－２放出アッセイが使用された。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、癌を有する対象において、またはＬＣＭＶなどのウイルスに感染した対象において、インビトロでＴ細胞活性を増強または刺激することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、第２のＴ細胞共阻害剤に対する抗体などの第２の治療剤と組み合わせて使用され、対象において免疫応答を増強し、腫瘍成長を阻害する。
ＣＴＬＡ－４に特異的な抗体は、追加の標識もしくは部分を全く含有しなくてもよいか、または標識もしくは部分、例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端の標識もしくは部分を含有してもよい。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイにおいて、標識（存在する場合）の位置は、ペプチドが結合した表面に対するペプチドの向きを決定し得る。例えば、表面がアビジンで被覆されている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように配向されるであろう。一実施形態において、標識は放射性核種、蛍光色素またはＭＲＩ検出可能標識であり得る。特定の実施形態では、このような標識された抗体は、撮像アッセイを含む診断アッセイにおいて使用され得る。
本発明の例示的な実施形態
一態様において、本発明は、ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に結合し、ｈＣＴＬＡ－４とリガンドＢ７－１およびＢ７－２との間の相互作用をブロックする抗体またはその抗原結合断片を提供する。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、Ｔ細胞活性化を誘導する。いくつかの事例において、Ｔ細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。いくつかの事例において、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、サルＣＴＬＡ－４に結合する。いくつかの事例において、抗体または抗原結合断片は、０．５ｎＭ未満のＥＣ５０でサルＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満のＥＣ５０でｈＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する。
様々な実施形態において、抗体または抗原結合断片は、完全ヒト抗体である。
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／２９８、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、および４９０／４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体とヒトＣＴＬＡ－４への結合について競合する。
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／２９８、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、および４９０／４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じヒトＣＴＬＡ－４上のエピトープに結合する。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、および４９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／２９８、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、および４９０／４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、それぞれ、配列番号４－６－８－１２－１４－１６、２０－２２－２４－２８－３０－３２、３６－３８－４０－４４－４６－４８、５２－５４－５６－６０－６２－６４、６８－７０－７２－７６－７８－８０、８４－８６－８８－９２－９４－９６、１００－１０２－１０４－１０８－１１０－１１２、１１６－１１８－１２０－１２４－１２６－１２８、１３２－１３４－１３６－１４０－１４２－１４４、１４８－１５０－１５２－１５６－１５８－１６０、１６４－１６６－１６８－１７２－１７４－１７６、１８０－１８２－１８４－１８８－１９０－１９２、１９６－１９８－２００－２０４－２０６－２０８、２１２－２１４－２１６－２２０－２２２－２２４、２２８－２３０－２３２－２３６－２３８－２４０、２４４－２４６－２４８－２５２－２５４－２５６、２６０－２６２－２６４－２６８－２７０－
２７２、２７６－２７８－２８０－２８４－２８６－２８８、２９２－２９４－２９６－３００－３０２－３０４、３０８－３１０－３１２－３００－３０２－３０４、３１６－３１８－３２０－３２４－３２６－３２８、３３２－３３４－３３６－３４０－３４２－３４４、３４８－３５０－３５２－３５６－３５８－３６０、３６４－３６６－３６８－３７２－３７４－３７６、３８０－３８２－３８４－３８８－３９０－３９２、３９６－３９８－４００－４０４－４０６－４０８、４１２－４１４－４１６－４２０－４２２－４２４、４２８－４３０－４３２－４３６－４３８－４４０、４４４－４４６－４４８－４５２－４５４－４５６、４６０－４６２－４６４－４６８－４７０－４７２、４７６－４７８－４８０－４８４－４８６－４８８、および４９２－４９４－４９６－５００－５０２－５０４からなる群から選択される、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
特定の実施形態において、抗体または抗原結合断片は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／２９８、３１４／３２２、３３０／３３８、３４６／３５４、３６２／３７０、３７８／３８６、３９４／４０２、４１０／４１８、４２６／４３４、４４２／４５０、４５８／４６６、４７４／４８２、および４９０／４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
特定の実施形態において、本発明は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である抗体またはその抗原結合断片を提供する。抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体などの、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体であり得る。これらの抗体の定常領域は、野生型定常領域、または突然変異が導入された定常領域に対応し得る。
一態様において、本発明は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する第１の抗原結合特異性および第２の標的エピトープに特異的に結合する第２の抗原結合特異性を含む多重特異性抗原結合分子を提供する。
一態様において、本発明は、上記実施形態のいずれかの抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。
一態様において、本発明は、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子およびベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子および／またはベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子および／またはベクターを提供する。特定の実施形態において、本発明は、上記または本明細書で議論されるベクターを発現する細胞を提供する。
一態様において、本発明は、治療有効量の本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、またはそのような抗体もしくは抗原結合断片を含む薬学的組成物のそれを必要とする対象への投与を介してＣＴＬＡ－４をアンタゴナイズすることによって治療可能である疾患または障害を治療するための方法を提供する。いくつかの事例において、疾患または障害は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球性脈絡髄
膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる慢性ウイルス感染症である。いくつかの事例において、疾患または障害は、血液癌、脳癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、膵臓癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される。
一態様において、本発明は、対象において免疫応答を増強する方法を提供し、方法は、本明細書に開示される単離された抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、本発明は、本明細書に開示される単離された抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を投与することを含む、対象においてＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、対象においてＴ細胞活性化を増強する方法を提供し、方法は、本明細書に開示される単離された抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物を投与することを含む。特定の実施形態において、対象は、血液癌、脳癌、腎細胞癌（例えば、腎明細胞癌）、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、皮膚癌、子宮頸癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫）、および黒色腫からなる群から選択される疾患または障害を有する。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる慢性ウイルス感染症を有する。特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＰＤ－１阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、ウイルス感染細胞抗原に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ２０およびＣＤ３に対する二重特異性抗体、酸化防止剤などの栄養補助剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト、癌ワクチン、化学療法剤、細胞毒性剤、手術、放射線、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、ならびに疾患または障害に関連する少なくとも１つの症状を改善するために有用な任意の他の療法からなる群から選択される第２の治療剤と組み合わせて対象に投与される。
一態様において、本発明は、治療有効量の本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、またはそのような抗体もしくは抗原結合断片を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において腫瘍または腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供する。特定の実施形態において、腫瘍は、原発性または再発性である。特定の実施形態において、腫瘍は、定着腫瘍である。特定の実施形態において、対象は、転移性疾患を有し、および／または前療法で治療されている。特定の実施形態において、腫瘍は、血液癌、脳癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される疾患または障害を有する対象に存在する。特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片は、１つ以上の用量として投与され、各用量は、直前の用量の１～１２週間後に投与される。特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片は、対象の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ～体重の約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。特定の実施形態において、各用量は、約５０ｍｇ～約１０００ｍｇの抗体を含む。特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＰＤ－１阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ２０およびＣＤ３に対する二重特異性抗体、酸化防止剤などの栄養補助剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト、化学療法剤、細胞毒性剤、手術、放射線、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、ならびに疾患または障害に関連する少なくとも１つの症状を改善するために有用な任意の他の療法からなる群から選択される第２の治療剤と組み合わ
せて対象に投与される。一実施形態において、第２の治療剤は、ＰＤ－１阻害剤であり、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ＲＥＧＮ２８１０、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである。特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片は、皮下、静脈内、腫瘍内、腫瘍周囲、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内に投与される。
一態様において、本発明は、Ｔ細胞を本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片と接触させることを含む、Ｔ細胞活性のＣＴＬＡ－４媒介性阻害をレスキューする方法を提供する。一実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＰＤ－１抗体（例えば、ＲＥＧＮ２８１０）と組み合わせて本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体と接触させる。
一態様において、本発明は、ＣＴＬＡ－４をアンタゴナイズすることによって治療可能である疾患または障害の治療における、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、またはそのような抗体もしくは抗原結合断片を含む薬学的組成物の使用を提供する。いくつかの事例において、疾患または障害は、癌である。
一態様において、本発明は、ＣＴＬＡ－４をアンタゴナイズすることによって治療可能である疾患または障害を治療するための医薬品の製造における、本明細書に開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体もしくはその抗原結合断片、またはそのような抗体もしくは抗原結合断片を含む薬学的組成物の使用を提供する。いくつかの事例において、疾患または障害は、癌である。
抗体の抗原結合断片
別段の具体的な記載がない限り、「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、２つの免疫グロブリン重鎖と、２つの免疫グロブリン軽鎖と、を含む、抗体分子（すなわち、「完全抗体分子」）ならびにその抗原結合断片を包含すると理解される。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」という用語、およびこれらに類するものは、本明細書で使用される場合、任意の天然に生じる、酵素処理で入手可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原を特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合断片」または「抗体断片」という用語は、本明細書で使用されるとき、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する能力を保有する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。ある特定の実施形態において、「抗原結合断片」という用語は、多重特異性抗原結合分子のポリペプチド断片を指す。抗体の抗原結合断片は、例えば、ＤＮＡコード抗体可変ドメインおよび（場合により）定常ドメインの操作および発現を包含するタンパク質消化技術または組換え遺伝子操作技術などの何らかの適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得られ得る。このようなＤＮＡは既知であり、および／または例えば市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ－抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変ドメインおよび／もしくは定常ドメインを好適な配置へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を創造し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。
抗原結合断片の非限定例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または拘束ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイ
ン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュール免疫薬剤（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の操作された分子も、本明細書で使用される「抗原結合断片」という表現内に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意の大きさまたはアミノ酸組成物であり得、概して、１つ以上のフレームワーク配列に隣接しているかまたは１つ以上のフレームワーク配列とともにインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶＬドメインと結合したＶＨドメインを有する抗原結合断片において、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、何らかの適切な配置で互いに対して配置され得る。例えば、可変領域は二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＬ二量体を含有し得る。あるいは、抗体の抗原結合断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含み得る。
特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含み得る。本発明の抗体の抗原結合断片内に認められ得る可変ドメインおよび定常ドメインの非限定的な例示的な立体配置には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが含まれる。先に列挙した例示的な立体配置のいずれかを含む、可変ドメインおよび定常ドメインの何らかの立体配置において、可変ドメインおよび定常ドメインは、互いに直接連結されていてもよく、または完全もしくは部分的ヒンジ領域もしくはリンカー領域によって連結されていてもよい。ヒンジ領域は、単一のポリペプチド分子において隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の可撓性または半可撓性の結合をもたらす少なくとも２つの（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれより多数の）アミノ酸からなり得る。そのうえ、本発明の抗体の抗原結合断片は、互いとのおよび／または１つ以上の単量体ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）との非共有結合において、先に列挙した可変ドメイン立体配置および定常ドメイン立体配置のいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含むことになっており、各可変ドメインは、別個の抗原へまたは同じ抗原上の異なるエピトープへ特異的に結合することができる。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多重特異性抗体フォーマットは、当該技術分野で利用可能な通例の技術を使用して、本発明の抗体の抗原結合断片という背景における使用に適合され得る。
ヒト抗体の調製
トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。任意のそのような既知の方法は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合するヒト抗体を作製するために、本発明の文脈において使用することができる。
モノクローナル抗体を生成するためにＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）または任意の他の既知の方法を使
用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有するＣＴＬＡ－４に対する高親和性キメラ抗体がまず単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を産生するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。
概して、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに関心対象の抗原を負荷し、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（Ｂ細胞など）を回収する。リンパ細胞を骨髄腫細胞株と融合させて不死化ハイブリドーマ細胞株を調製し得、関心対象の抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定するためにこのようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択する。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し得、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域へ連結することができる。このような抗体タンパク質は、ＣＨＯ細胞などの細胞において産生され得る。代替的に、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを抗原特異的リンパ球から直接単離することができる。
まず、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する高親和性キメラ抗体を単離する。以下の実験セクションと同様に、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴について特徴付けられ、かつ選択される。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体、例えば、野生型または修飾ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４を生成するために所望のヒト定常領域と置換される。選択された定常領域は特異的用途に応じて変化し得るが、高親和性抗原結合特徴および標的特異性特徴は、可変領域に存在する。
生物学的等価物
本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗体断片は、記載された抗体のものとは異なるが、ＣＴＬＡ－４に結合する能力を保有するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような変異体抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、説明された抗体の生物学的活性とは本質的に等価である生物学的活性を呈する。同様に、本発明の抗体コードＤＮＡ配列は、開示された配列と比較して、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体断片と本質的に生物学的に等価である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、それらが類似の実験条件下で単回用量または複数回用量のいずれかで同じモル用量で投与された場合に、吸収速度および吸収の程度が有意差を示さない薬学的等価物または薬学的選択肢である場合、生物学的等価物とみなされる。いくつかの抗体は、これらの吸収の程度は等価であるが吸収速度は等価ではなく、吸収速度のこのような差が意図的であり、標識することに反映されているので生物学的に等価とみなされ得る場合、等価物または薬学的選択肢とみなされることになっており、例えば長期使用に及ぼす有効な身体薬剤濃度の達成に必須ではなく、研究した特定の薬剤製品にとって医学的に有意ではないとみなされる。
一実施形態において、２つの抗原結合タンパク質は、これらの安全性、純度、または効力において臨床的に意味のある差がない場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減退を含む有害作用のリスクの期待される上昇なしで参照生成物と生物学的生成物の間での切り替えなしで持続される療法と比較して、患者が１回以上切り替えられるこ
とができる場合、生物学的に等価である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、これらが両方とも、条件または使用条件についての共通の機序または作用機序によって、このような機序が既知である程度まで作用する場合、生物学的に等価である。
生物学的等価性は、インビボおよび／またはインビトロの方法によって実証され得る。生物学的等価性測定法には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が血液、血漿、血清または他の生物学的流体中で時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボでの試験、（ｂ）ヒト生物学的利用能データと相関した、このデータを合理的に予測しているインビトロ試験、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果が時間の関数として測定されるヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験、および（ｄ）抗体の安全性、効能、または生物学的利用能もしくは生物学的等価性を確立する、十分に管理された臨床試験が含まれる。
本発明の抗体の生物学的に等価な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を生じさせること、または生物活性に必要とされない末端もしくは内部の残基もしくは配列を欠失させることによって構築され得る。例えば、生物学的活性にとって必須ではないシステイン残基は、再生の際の不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために、欠失または他のアミノ酸で置換することができる。他の文脈において、生物学的に等価の抗体には、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除または除去する変異を含む抗体変異体が含まれ得る。
Ｆｃバリアントを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体
本発明の特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨで、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減少させる１つ以上の突然変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＣＴＬＡ－４抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に突然変異を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体を含み、突然変異（複数可）は、酸性環境において（例えば、ｐＨが約５．５～約６．０の範囲であるエンドソームにおいて）ＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。そのような突然変異は、動物に投与されたときに抗体の血清半減期の増加をもたらし得る。そのようなＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、および２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、または４２８位および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、Ｆ、またはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙ］）での修飾、または２５０位および／もしくは４２８位での修飾、または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、および４３４位での修飾が含まれる。一実施形態において、修飾は４２８Ｌ（例えばＭ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えばＮ４３４Ｓ）の修飾、４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾、４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾、２５２、２５４、および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）の修飾、２５０Ｑおよび４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）、３０７および／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態において、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）、４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）、２５７Ｉ
および３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）、２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）、３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）、３０７Ａ、３８０Ａ、および４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａ）、ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群から選択される突然変異の１つ以上の対または群を含む、Ｆｃドメインを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。一実施形態において、本発明は、ダイマー安定化を促進するためにＩｇＧ４のヒンジ領域にＳ１０８Ｐ突然変異を含むＦｃドメインを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異、および本明細書に開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせが、本発明の範囲内で熟慮される。
本発明はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＣＴＬＡ－４抗体を含み、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含む、キメラＣＨ領域を含み得る。特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下部ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けによる位置２２８～２３６のアミノ酸残基）と組み合わされた、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域、またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上部ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けによる位置２１６～２２７のアミノ酸残基）を含み得る。特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下部ヒンジに由来するアミノ酸残基と、を含む。本明細書に記載されるようなキメラＣＨ領域を含む抗体は、特定の実施形態では、抗体の治療特性または薬物動態学的特性に悪影響を与えることなく、修飾Ｆｃエフェクター機能を呈し得る。（例えば、その開示がその全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１４０２４３５０４号を参照されたい）。
抗体の生物学的特徴
概して、本発明の抗体は、ＣＴＬＡ－４に結合することによって機能する。本発明は、可溶性モノマーまたはダイマーＣＴＬＡ－４分子に高親和性で結合する抗ＣＴＬＡ－４抗体およびその抗原結合断片を含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書の実施例３で定義されるアッセイフォーマットを使用する、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、約２０ｎＭ未満のＫＤでヒトおよびサルＣＴＬＡ－４に（例えば、２５℃で）結合する抗体および抗体の抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例３で定義されるアッセイフォーマットを使用する、表面プラズモン共鳴、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、または約１ｎＭ未満のＫＤでモノマーＣＴＬＡ－４に結合する。
本発明はまた、例えば、本明細書の実施例３に定義されるアッセイフォーマットを使用する、２５℃での表面プラズモン共鳴、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約４分超の解離半減期（ｔ１／２）でＣＴＬＡ－４に結合する抗体およびその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例３で定義されるアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕捉フォーマット）を使用する、２５℃での表面プラズモン共鳴、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約５分超、約１０分超、約１５分超、約２０分超、約３０分超、約４０分超、約１００分超、約２００分超、約３００分超、または約５００分超のｔ
１／２でＣＴＬＡ－４に結合する。
本発明はまた、例えば、実施例４に示される、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または実質的に類似のアッセイを使用して決定されるように、約３２０ｎＭ未満のＩＣ５０でｈＢ７－１（ＣＤ８０）および／またはｈＢ７－２（ＣＤ８６）へのｈＣＴＬＡ－４結合をブロックする抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例４で定義される、競合サンドイッチＥＬＩＳＡ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＩＣ５０でヒトＢ７－１および／またはヒトＢ７－２へのｈＣＴＬＡ－４結合をブロックする。
本発明はまた、例えば、実施例４で定義される、競合サンドイッチＥＬＩＳＡ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、ｈＣＴＬＡ－４のヒトＢ７－１および／またはヒトＢ７－２への結合を少なくとも８５％ブロックする抗体またはその抗原結合断片を含む。
本発明はまた、本明細書の実施例５で定義される電気化学発光アッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約６ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例５におけるアッセイフォーマットを使用する、電気化学発光アッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約４ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．５ｎＭ未満のＥＣ５０でｈＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例５のアッセイフォーマットを使用する、電気化学発光アッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、対照細胞への結合の約１０倍超の比で、約１５倍超の比で、または対照細胞への結合の約２０倍超の比でｈＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する。
本発明はまた、本明細書の実施例５で定義される電気化学発光アッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約０．５ｎＭ未満のＥＣ５０でカニクイザルＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例５で定義されるアッセイフォーマットを使用する、電気化学発光アッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約０．５ｎＭ未満、または約０．２ｎＭ未満のＥＣ５０でｍｆＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する。
本発明はまた、本明細書の実施例６で定義されるＴ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、８ｎＭ未満のＥＣ５０でＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御を（ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０およびＣＴＬＡ－４／ＣＤ８６相互作用をブロックすることによって）ブロックする抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例６で定義されるアッセイフォーマットを使用する、Ｔ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２．５ｎＭ未満、約２ｎＭのＥＣ５０でＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御をブロックする。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトおよびサルＣＴＬＡ－４の両方のＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御をブロックする。
本発明はまた、本明細書の実施例６で定義されるＴ細胞／ＡＰＣ ＩＬ－２放出アッセ
イ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約５０ｎＭ未満のＥＣ５０でＩＬ－２放出のＣＴＬＡ－４媒介性阻害を（ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０およびＣＴＬＡ－４／ＣＤ８６相互作用をブロックすることによって）レスキューする抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、本明細書の実施例６で定義されるアッセイフォーマットを使用する、Ｔ細胞／ＡＰＣ ＩＬ－２放出アッセイ、または実質的に類似のアッセイによって測定されるように、約４５ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約２０ｎＭ未満のＥＣ５０でＩＬ－２放出のＣＴＬＡ－４媒介性阻害をレスキューする。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、ヒトおよびサルＣＴＬＡ－４の両方についてＩＬ－２放出のＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御および／またはＣＴＬＡ－４媒介性阻害をブロックする。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合断片は、アイソタイプ対照抗体で観察されるものの４～６倍の速度で、ＩＬ－２産生によって実証されるように、ＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御をブロックする。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、それを必要とする対象に予防的に投与される場合、腫瘍の成長を阻害するか、または癌の進行を遅らせるために有用であり、対象の生存率を増加させ得る。例えば、本発明の抗体の投与は、原発性腫瘍の縮小をもたらし得、二次性腫瘍の転移または発生を防止し得る。特定の実施形態において、本発明の抗体は、それを必要とする対象に治療的に投与される場合、腫瘍の成長を阻害するために有用であり、対象の生存率を増加させ得る。例えば、治療有効量の本発明の抗体の対象への投与は、対象における定着腫瘍の縮小および消失をもたらし得る。特定の実施形態において、本発明の１つ以上の抗体は、局所的に（腫瘍内または腫瘍周囲に）投与され、注射された腫瘍病変および遠位腫瘍病変における腫瘍成長の阻害をもたらす（アブスコパル効果）。
様々な実施形態において、本発明は、ＣＴＬＡ－４に結合する単離された組換えモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、抗体またはその抗原結合断片は、以下の特徴：（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＶＲを含むこと、（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、および４９８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＶＲを含むこと、（ｉｉｉ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３２０、３３６、３５２、３６８、３８４、４００、４１６、４３２、４４８、４６４、４８０、および４９６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン、ならびに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２８、３４４、３６０、３７６、３９２、４０８、４２４、４４０、４５６、４７２、４８８、および５０４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含むこと、（ｉｖ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９
６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３１６、３３２、３４８、３６４、３８０、３９６、４１２、４２８、４４４、４６０、４７６、および４９２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン、配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３１８、３３４、３５０、３６６、３８２、３９８、４１４、４３０、４４６、４６２、４７８、および４９４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３２４、３４０、３５６、３７２、３８８、４０４、４２０、４３６、４５２、４６８、４８４、および５００からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン、ならびに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３２６、３４２、３５８、３７４、３９０、４０６、４２２、４３８、４５４、４７０、４８６、および５０２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含むこと、（ｖ）２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されるように、約２０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）でダイマーヒトおよびサルＣＴＬＡ－４に結合すること、（ｖｉ）２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定されるように、約４分超の解離半減期（ｔ１／２）でダイマーヒトおよびサルＣＴＬＡ－４に結合すること、（ｖｉｉ）細胞接着アッセイを使用して決定されるように、約３２０ｎＭ未満のＩＣ５０でｈＢ７－１（ＣＤ８０）および／またはｈＢ７－２（ＣＤ８６）へのｈＣＴＬＡ－４結合をブロックすること、（ｖｉｉｉ）競合サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定されるように、ｈＣＴＬＡ－４のヒトＢ７－１および／またはヒトＢ７－２への結合を少なくとも８５％ブロックすること、（ｉｘ）電気化学発光アッセイによって測定されるように、約６ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ－４発現細胞に結合すること、（ｘ）対照細胞への結合についての１０倍超の比でｈＣＴＬＡ－４発現細胞に結合すること、（ｘｉ）電気化学発光アッセイによって測定されるように、約０．５ｎＭ未満のＥＣ５０でサルＣＴＬＡ－４発現細胞に結合すること、（ｘｉｉ）Ｔ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されるように、８ｎＭ未満のＥＣ５０でＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御をブロックすること、（ｘｉｉｉ）ヒトおよびサル両方のＣＴＬＡ－４のＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御をブロックすること、（ｘｉｖ）Ｔ細胞／ＡＰＣ ＩＬ－２放出アッセイにおいて決定されるように、約５０ｎＭ未満のＥＣ５０でＩＬ－２放出のＣＴＬＡ－４媒介性阻害をレスキューすること、（ｘｖ）ヒトおよびサル両方のＣＴＬＡ－４についてのＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御および／またはＩＬ－２放出のＣＴＬＡ－４媒介性阻害をブロックすること、（ｘｖｉ）ＩＬ－２産生によって示されるように、アイソタイプ対照抗体において観察されるものの４～６倍の速度で、ＣＴＬＡ－４誘導性Ｔ細胞下方制御をブロックすること、（ｘｖｉｉ）癌を有する患者において腫瘍の成長を抑制し、生存率を増加させること、ならびに（ｘｖｉｉｉ）完全にヒトであることのうちの１つ以上を示す。
本発明の抗体は、上述の生物学的特徴の１つ以上、またはこれらの何らかの組み合わせを有することができる。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書における実施例を含む本開示の再吟味から当業者に明らかとなるであろう。
種の選択性および種の交差反応性
本発明の特定の実施形態によれば、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４に結合するが、他の種からのＣＴＬＡ－４には結合しない。あるいは、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、特定の実施形態において、ヒトＣＴＬＡ－４および１つ以上の非ヒト種からのＣＴＬＡ－４に結合する。例えば、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４に結合してもよく、場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーＣＴＬＡ－４のうちの１つ以上に結合しても、しなくてもよい。特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、同じ親和性または異なる親和性で、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ－４に結合し得るが、ラットおよびマウスＣＴＬＡ－４には結合しない。
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含むＣＴＬＡ－４分子の１つ以上のドメイン内に見られる１つ以上のアミノ酸と相互作用する抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、ＣＴＬＡ－４分子の上述ドメインのいずれか内に位置する３つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）のアミノ酸の単一連続配列（例えば、ドメイン中の線状エピトープ）からなってもよい。あるいは、エピトープは、ＣＴＬＡ－４分子の上述ドメインのいずれかまたは全ての内に位置する複数の非連続アミノ酸（またはアミノ酸配列）（例えば、立体配座エピトープ）からなってもよい。
当業者に知られている様々な技術を使用して、抗体がポリペプチドまたはタンパク質の内部にある「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを判定することができる。例示的な技術としては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）に説明されているような通例の交差遮断アッセイが挙げられる。他の方法には、アラニン走査突然変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析結晶学的研究、およびＮＭＲ分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法を利用することができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチドの内部にあるアミノ酸を識別するために用いることができる別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般的にいえば、水素／重水素交換法は、関心対象のタンパク質を重水素標識した後、抗体を重水素標識タンパク質へ結合させることを包含する。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移し、抗体複合体によって保護されたアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸の内部にある交換可能なプロトンよりも低速で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持することができ、それゆえ、界面に含まれないアミノ酸と比較して相対的に大きな質量を呈する。抗体の解離後、標的タンパク質をプロテアーゼ切断および質量分析へ供し、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。
「エピトープ」という用語は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、タンパク質の三次元折り畳みによって並置された連続的なアミノ酸または非連続的なアミノ酸の両方から形成されることができる。連続的なアミノ酸
から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるのに対し、三次元折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒を用いた処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも３個、より通常は少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても知られている修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）とは、化学的にまたは酵素により修飾された抗原表面に対する各抗体の結合特性の類似性により、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をカテゴリー分類する方法である（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれるＵＳ２００４／０１０１９２０を参照されたい）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明確に異なるか、または部分的に重複するかのいずれかの独特のエピトープを反映し得る。この技術は、特徴付けが遺伝的に異なる抗体に的を絞ることができるように、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングへ適用する場合、ＭＡＰは、所望の特徴を有するｍＡｂを産生する稀なハイブリドーマクローンの識別を容易にし得る。ＭＡＰを使用して、本発明の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に選別することができる。
特定の実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５０５で例示される、天然形態、もしくは組換え産生のいずれかの、ＣＴＬＡ－４で例示される領域のうちのいずれか１つ以上内のエピトープ、またはその断片に結合する。
本発明は、表１において本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかと同じエピトープ、もしくはエピトープの一部分に結合する抗ＣＴＬＡ－４抗体、または表１に記載される例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体を含む。同様に、本発明はまた、表１において本明細書に記載される特定の例示的な抗体のうちのいずれかとＣＴＬＡ－４もしくはＣＴＬＡ－４断片への結合について競合する抗ＣＴＬＡ－４抗体、または表１に記載される例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書に例示される１つ以上の抗体（例えば、Ｈ１Ｈ１９３０３ＰまたはＨ１Ｈ１９３１９Ｐ２）とＣＴＬＡ－４への結合について交差競合する抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む。
当該技術分野で知られている通例の方法を使用することによって、抗体が、参照抗ＣＴＬＡ－４抗体と同じエピトープに結合するか、またはこれと結合について競合するかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＣＴＬＡ－４抗体と同じエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体は、飽和条件下でＣＴＬＡ－４タンパク質またはペプチドに結合させる。次に、ＣＴＬＡ－４分子に結合する試験抗体の能力が評価される。試験抗体が、参照抗ＣＴＬＡ－４抗体との飽和結合後にＣＴＬＡ－４に結合することができる場合、試験抗体は、参照抗ＣＴＬＡ－４抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。その一方で、試験抗体が、参照抗ＣＴＬＡ－４抗体との飽和結合後にＣＴＬＡ－４タンパク質に結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗ＣＴＬＡ－４抗体によって結合したエピトープと同じエピトープに結合し得る。
抗体が参照抗ＣＴＬＡ－４抗体と結合について競合するかを決定するために、上記の結合方法論が２つの配向で行われる。第１の配向では、参照抗体は、飽和条件下でＣＴＬＡ－４タンパク質に結合させ、続いてＣＴＬＡ－４分子への試験抗体の結合の評価が行われる。第２の配向では、試験抗体は、飽和条件下でＣＴＬＡ－４分子に結合させ、続いてＣＴＬＡ－４分子への参照抗体の結合の評価が行われる。両方の配向において、第１の（飽和）抗体のみがＣＴＬＡ－４分子に結合することができる場合、試験抗体および参照抗体は、ＣＴＬＡ－４への結合について競合すると結論づけられる。当業者によって認識され
ることになっているように、参照抗体との結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープへ結合する必要はないかもしれないが、重複しているまたは隣接しているエピトープを結合することによって、参照抗体の結合を立体的にブロックするかもしれない。
２つの抗体は、それぞれが抗原へのその他の結合を競合的に阻害する（ブロックする）場合、同じかまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍または１００倍過剰量の一方の抗体は、競合結合において測定されるように、少なくとも５０％、しかし好ましくは７５％、９０％またはさらには９９％ほど、もう一方の抗体の結合を阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ ５０：１４９５－１５０２を参照されたい）。あるいは、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原における本質的にすべてのアミノ酸変異がもう一方の抗体の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減または排除するいくつかのアミノ酸変異がもう一方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は重複しているエピトープを有する。
次に、試験抗体の結合の観察された欠失が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、それとも立体遮断（または別の現象）が、観察された結合の欠失の原因であるのかを確認するために、さらなる通例の実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）を実施することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリーまたは当該技術分野で利用可能な任意の他の定量的または定性的な抗体結合アッセイを使用して実施することができる。
免疫結合体
本発明は、癌を治療するための細胞毒または化学療法剤などの治療部分（「免疫結合体」）に結合したヒト抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体を包含する。本明細書で使用されるとき、「免疫結合体」という用語は、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチドもしくはタンパク質、または治療剤に化学的または生物学的に連結した抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置で、細胞毒素、放射性物質、サイトカイン、インターフェロン、標的部分もしくはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチド、または治療剤に連結され得る。免疫結合体の例としては、抗体薬剤結合体および抗体－毒素融合タンパク質が挙げられる。一実施形態において、薬剤は、ＣＴＬＡ－４に対する第２の異なる抗体であってもよい。特定の実施形態において、抗体は、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に特異的な薬剤に結合し得る。一実施形態において、抗体は、Ｔ細胞に特異的な薬剤に結合される。抗ＣＴＬＡ－４抗体に結合し得る治療部分のタイプは、治療される状態および達成される所望の治療効果を考慮するであろう。免疫結合体を形成するために好適な薬剤の例は、当該技術分野で知られており、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。
多重特異性抗体
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または２つ以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。
一態様において、本発明は、多重特異性抗原結合分子またはその抗原結合断片を含み、免疫グロブリンの１つの特異性は、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインまたはその断片に特異的であり、免疫グロブリンの他の特異性は、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインの外側、もし
くは第２の治療標的の結合に特異的であるか、または治療部分に結合している。
本発明の多重特異性抗原結合分子のいずれか、またはその変異体は、当業者に既知であることになっているように、標準的な分子生物学的技術（例えば、組換えＤＮＡおよびタンパク質発現技術）を用いて構築され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＴＬＡ－４特異的抗体は、ＣＴＬＡ－４の異なるドメインに結合する可変領域が一緒に連結されて、単一の結合分子内に二重ドメイン特異性を付与する二重特異性フォーマット（「二重特異性」）で生成される。適切に設計された二重特異性は、特異性および結合活性の両方を増加させることを通じて全体的なＣＴＬＡ－４阻害有効性を増強し得る。個々のドメインに対して特異性を有する可変領域（例えば、Ｎ末端ドメインのセグメント）、または１つのドメイン内の異なる領域へ結合することができる可変領域は、各領域を別個のエピトープへ、または１つのドメイン内の異なる領域へ、同時に結合させる構造的足場の上で対形成している。二重特異性についての一例において、１つのドメインに対する特異性を備えた結合剤由来の重鎖可変領域（ＶＨ）は、第２のドメインに対する特異性を備えた一連の結合剤由来の軽鎖可変領域（ＶＬ）と組み合わされて、ＶＨに対する元の特異性を破壊することなく、元のＶＨと対形成することができる非同族ＶＬのパートナーを識別する。このように、単一のＶＬセグメント（例えば、ＶＬ１）を２つの異なるＶＨドメイン（例えば、ＶＨ１およびＶＨ２）と組み合わせて、２つの結合「アーム」（ＶＨ１－ＶＬ１およびＶＨ２－ＶＬ１）から構成される二重特異性を生じることができる。単一のＶＬセグメントの使用は、このシステムの複雑性を低減させ、それにより、二重特異性を生成するために使用されるクローニング過程、発現過程、および精製過程における効率を単純化し、増大させる（例えば、ＵＳＳＮ１３／０２２７５９およびＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照されたい）。
あるいは、これに限定されないが、例えば、第２の異なる抗ＣＴＬＡ－４抗体などの、２つ以上のドメインおよび第２の標的を結合する抗体は、本明細書に記載される技術または当業者に既知の他の技術を使用して、二重特異性フォーマットで調製され得る。異なる領域に結合する抗体可変領域は、単一の結合分子内に二重抗原特異性を付与するために、例えば、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメイン上の関連部位に結合する可変領域と一緒に連結され得る。この性質の適切に設計された二重特異性は、二重の機能を果たす。細胞外ドメインに対する特異性を備えた可変領域は、細胞外ドメインの外側に対する特異性を備えた可変領域と組み合わされ、各可変領域が別々の抗原へ結合することを可能にする構造的足場の上で対形成する。
本発明の文脈において使用することのできる例示的な二重特異性抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇＣＨ３ドメインの使用を包含し、第１および第２のＩｇＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸ほど互いに異なっており、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、このアミノ酸の相違を欠失する二重特異性抗体と比較して、プロテインＡへの二重特異性抗体の結合を低減させる。一実施形態において、第１のＩｇＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合し、第２のＩｇＣＨ３ドメインはＨ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソン番号付けによるものであり、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ）などのプロテインＡ結合を低減または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に認められ得るさらなる修飾には、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）、ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴであって、ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）、ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ
８２Ｉ（ＩＭＧＴによるものであり、ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）が含まれる。上記に記載される二重特異性抗体フォーマットの変形は、本発明の範囲内で熟慮される。
本発明の文脈において使用することのできる他の例示的な二重特異性フォーマットには、例えば、ｓｃＦｖ系フォーマットまたはダイアボディ二重特異性フォーマット、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ、Ｑｕａｄｒｏｍａ、ノブズ－イントゥ－ホールズ（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）、共通の軽鎖（例えば、ノブズ－イントゥ－ホールズを備えた共通の軽鎖など）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、Ｄｕｏｂｏｄｙ、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用型Ｆａｂ（ＤＡＦ）－ＩｇＧ、およびＭａｂ２二重特異性フォーマットが含まれるが、これらに限定されない（上述のフォーマットの総説については、例えば、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ ４：６，１－１１、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。二重特異性抗体は、ペプチド／核酸結合を用いて構築することもでき、例えば、直交化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体－オリゴヌクレオチド結合体を生成し、これが次に、規定される組成物、原子価および幾何学的形状を有する多量体複合体へと自己集合する。（例えば、Ｋａｚａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．４，２０１２］を参照のこと）。
治療用の投与および製剤
本発明は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を含む治療組成物を提供する。本発明に従った治療用組成物は、改善された移動、送達、寛容、およびこれらに類するものを提供するために、製剤へと組み込まれた適切な担体、賦形剤、および他の薬剤とともに投与されることになっている。多くの適切な製剤は、製薬化学者全員に既知の処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて認めることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）を含有する脂質（カチオン性またはアニオン性）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油エマルションおよび油中水エマルション、エマルションカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、ならびにカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ
Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
抗体の用量は、投与されることになっている対象の年齢およびサイズ、標的疾患、容態、投与経路、ならびにこれらに類するものによって変わり得る。本発明の抗体が成人患者において疾患もしくは障害を治療するため、またはそのような疾患を予防するために使用される場合、本発明の抗体を通常は体重１ｋｇあたり約０．１～約６０ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり約５～約６０、約２０～約５０、約１０～約５０、約１～約１０、または約０．８～約１１ｍｇの単一用量で投与することが有利である。状態の重症度に応じて、治療の頻度および期間を調整することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約５００ｍｇ、約５～約３００ｍｇ、または約１０～約２００ｍｇ、～約１００ｍｇ、または～約５０ｍｇの初回用量として投与することができる。特定の実施形態において、初回用量に続いて、一次投与とほぼ同じか、またはそれ未満であり得る量の二次または複数の後続用量の抗体またはその抗原結合断片の投与が行われ得、後続用量は、少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間離れてい
る。
種々の送達系、例えば、リポソームにおける封入、微粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが既知であり、本発明の薬学的組成物を投与するために使用することができる（例えば、Ｗｕ ｅｔ
ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたい）。導入方法には、皮内経路、経皮経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路、鼻腔内経路、硬膜外経路、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、例えば、注入もしくはボーラス注射による、上皮もしくは粘膜皮膚の裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を通じての吸収による何らかの簡便な経路によって投与され得、他の生物学的に活性のある薬剤とともに投与され得る。投与は全身または局所であり得る。薬学的組成物を、ベシクル、特にリポソーム中で送達することもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３を参照されたい）。
本発明の抗体を送達するためのナノ粒子の使用もまた、本明細書において熟慮される。抗体結合ナノ粒子は、治療用途および診断用途の両方に使用され得る。抗体結合ナノ粒子ならびに調製方法および使用方法は、参照により本明細書に組み込まれるＡｒｒｕｅｂｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００９（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ“ｉｎ
Ｊ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ ２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４３９３８９，２４ ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）によって詳細に記載されている。ナノ粒子は、腫瘍細胞または自己免疫疾患組織細胞またはウイルス感染細胞を標的とするために開発され、薬学的組成物中に含有される抗体と結合され得る。薬物送達のためのナノ粒子は、例えば、各々がその全体として本明細書に組み込まれるＵＳ８２５７７４０、またはＵＳ８２４６９９５にも説明されている。
特定の状況において、薬学的組成物は、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、徐放系を組成物の標的の近傍に配置することができ、したがって全身用量のほんの一部しか必要としない。
注射可能な調製物には、静脈内注射、皮下注射、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、皮内注射、頭蓋内注射、腹腔内注射、および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形が含まれ得る。これらの注射可能な調製物は、公共的に既知の方法によって調製され得る。例えば、注入可能な調製物は、例えば、注入用に従来どおり使用される滅菌水性媒体または油性媒体中に上述の抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化させることによって調製され得る。注入用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、グルコース含有等張液、および他の補助剤などがあり、これらは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性媒体として、例えば、ゴマ油、ダイズ油などが使用され、ベンジルベンゾエート、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。このように調製された注射は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
本発明の薬学的組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本発明の薬学的組成物を送達する上での適用を容易に有する。このようなペン送達デバイスは、再利用可能または使い捨て可能であり得る。再利用可能なペン送達デバイスは、概して、薬学的組成
物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。一度、カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空になると、この空のカートリッジは容易に廃棄することができ、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと容易に交換することができる。次に、ペン送達デバイスは再利用することができる。使い捨てのペン送達デバイスにおいて、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、このデバイス内の貯蔵器の中に保持された薬学的組成物が事前に充填されている。一度、貯蔵器が薬学的組成物に関して空になると、デバイス全体が廃棄される。
数多くの再利用可能なペン送達デバイスおよび自動注射送達デバイスは、本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，英国ウッドストック町）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，スイス国ブルクドルフ市）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，インディアナ州インディアナポリス市）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，デンマーク国コペンハーゲン市）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，デンマーク国コペンハーゲン市）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ニュージャージー州フランクリンレイク地区）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ，ドイツ国フランクフルト市）が挙げられるが、確かにこれらに限定されず、ほんの数種類しか挙げていない。本発明の薬学的組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達装置の例としては、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注射装置（Ａｍｇｅｎ，カリフォルニア州サウザンドオークス市）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，ドイツ国シュトゥットガルト市）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，イリノイ州アボットパーク地区）が挙げられるが、ほんの数種類しか挙げていない。
有益なことに、上記に記載される経口または非経口での使用のための薬学的組成物は、有効成分の用量に適合するために好適な単位用量の投薬形態へと調製される。そのような単位用量の剤形には、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射（アンプル）、坐剤などが含まれる。含有される抗体の量は、概して、単位用量の剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に注射の形態では、抗体は、他の剤形について約５～約１００ｍｇ、および約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、とりわけ、ＣＴＬＡ－４発現、シグナル伝達、もしくは活性に関連するか、またはこれによって媒介されるか、あるいはＣＴＬＡ－４とＣＴＬＡ－４リガンドＢ７－１／ＣＤ８０および／もしくはＢ７－２／ＣＤ８６との相互作用をブロックするか、またはそうでなければＣＴＬＡ－４活性および／もしくはシグナル伝達を阻害することによって治療可能である、任意の疾患または障害の治療、予防、および／または改善に有用である。本発明の１つ以上の抗体は、疾患または障害の症状または容態の１つ以上の重症度を緩和または予防または低下させるために投与され得る。例えば、本発明は、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ－４抗体（または抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む薬学的組成物）を、そのような治療を必要とする患者に投与することによって、癌（腫瘍成長阻害）および／またはウイルス感染症を治療するための方法、ならびに癌（腫瘍成長阻害）および／またはウイルス感染の治療における使用のための抗ＣＴＬＡ－４抗体（または抗ＣＴＬＡ－４抗体を含む薬学的組成物）を提供する。本発明の抗体は、癌またはウイルス感染症など
の疾患もしくは障害もしくは状態の治療、予防、および／もしくは改善、ならびに／またはそのような疾患、障害、もしくは状態と関連した少なくとも１つの症状の改善に有用である。本明細書に記載される治療方法の文脈において、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、単剤療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、または１つ以上の追加の治療剤（この例は本明細書の他の箇所に記載される）と組み合わせて投与され得る。
本発明のいくつかの実施形態において、本明細書に記載される抗体は、これらに限定されないが、血液癌、脳癌（多形膠芽腫）、腎細胞癌（例えば、腎明細胞癌）、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌（例えば、トリプルネガティブ乳癌）、腎臓癌、子宮頸癌、皮膚癌、肝臓癌、胃癌、膵臓癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、および黒色腫を含む、原発性または再発性癌に罹患している対象を治療するために有用である。
本明細書で使用されるとき、「血液癌」という用語には、血液、骨髄、リンパ、またはリンパ系に影響を及ぼす血液悪性腫瘍が含まれる。そのようなものとして、用語には、リンパ性および骨髄性細胞系列からの細胞の悪性腫瘍が含まれる。骨髄性細胞株は通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、およびマスト細胞を産生し、リンパ性細胞株は、Ｂ、Ｔ、ＮＫ、および形質細胞を産生する。したがって、用語には、上記細胞の悪性腫瘍、すなわち、リンパ腫、骨髄腫、リンパ性白血病、および骨髄性白血病が含まれる。例には、これらに限定されないが、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫）、および骨髄腫（多発性骨髄腫を含む）が含まれる。
抗体は、癌の初期または後期症状を治療するために使用され得る。一実施形態において、本発明の抗体またはその断片は、進行性または転移性癌を治療するために使用され得る。抗体は、固形腫瘍および血液癌の両方の腫瘍成長を低減または阻害または縮小するために有用である。特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片での治療は、対象における腫瘍の４０％超の退縮、５０％超の退縮、６０％超の退縮、７０％超の退縮、８０％超の退縮、または９０％超の退縮をもたらす。特定の実施形態において、抗体は、腫瘍の再発を防止するために使用され得る。特定の実施形態において、抗体は、癌を有する対象において無増悪生存期間または全生存期間を延長するために有用である。いくつかの実施形態において、抗体は、癌に罹患している患者において長期生存率を維持しながら、化学療法または放射線療法による毒性を低減するために有用である。特定の実施形態において、本発明の１つ以上の抗体は、１つ以上の腫瘍病変（腫瘍内または腫瘍周囲）に局所的に注入され、対象において注入された腫瘍および１つ以上の隣接または遠位腫瘍における腫瘍成長の阻害をもたらす（アブスコパル効果）。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、慢性ウイルス感染症に罹患している対象を治療するために有用である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、宿主におけるウイルス力価を低下させるか、または消耗したＴ細胞をレスキューするために有用である。特定の実施形態において、本発明の抗体またはその断片は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）による慢性ウイルス感染症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）またはＢ／Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ／ＨＣＶ）による感染症を有する患者に治療用量で投与され得る。関連する実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、カニクイザルなどのサル対象においてサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）による感染症を治療するために使用され得る。
特定の実施形態において、本発明の遮断抗体は、癌またはウイルス感染症に罹患してい
る対象に治療有効量で投与され得る。
特定の実施形態において、本発明の１つ以上の抗体は、全身曝露を最小限にし、抗体の全身曝露による毒性を予防／改善するために、癌を有する対象において腫瘍または腫瘍病変の近く（腫瘍内または腫瘍周辺）に局所投与される。
本明細書では、癌およびウイルス感染症などの疾患または障害を発症するリスクのある患者に予防的に本発明の１つ以上の抗体を使用することも企図される。
本発明のさらなる実施形態において、本抗体は、癌、またはウイルス感染症に罹患している患者を治療するための薬学的組成物の調製のために使用される。本発明の別の実施形態において、本抗体は、癌またはウイルス感染症を治療するために有用な、当業者に知られる任意の他の薬剤または任意の他の療法と共に補助療法として使用される。
併用療法および製剤
併用療法には、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体、および本発明の抗体と、または本発明の抗体の生物学的に活性な断片と有益に組み合わされ得る任意の追加の治療剤が含まれ得る。
本発明の抗体は、例えば、血液癌、脳癌（例えば、多形膠芽腫）、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、皮膚癌、子宮頸癌、胃癌、腎臓癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、および黒色腫を含む、癌を治療または阻害するために使用される１つ以上の抗癌薬または療法と相乗的に組み合わされ得る。本明細書では、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体を免疫刺激療法および／または免疫支持療法と組み合わせて使用して、腫瘍成長を阻害し、および／または癌患者の生存率を高めることが企図される。免疫刺激療法には、抑制された免疫細胞の「ブレーキを緩める」か、または免疫応答を活性化するために「アクセルを踏む」かのいずれかによって免疫細胞活性を増強する直接免疫刺激療法が含まれる。例には、他のチェックポイント受容体の標的化、ワクチン接種、およびアジュバントが含まれる。免疫支持モダリティは、免疫原性細胞死、炎症を促進することによって腫瘍の抗原性を増加させるか、または抗腫瘍免疫応答を促進する他の間接的効果を有し得る。例には、放射線、化学療法、抗血管新生剤、および手術が含まれる。
様々な実施形態において、本発明の１つ以上の抗体は、ＰＤ－１阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＧＢ－Ａ３１７、またはＲＥＧＮ２８１０などの抗ＰＤ－１抗体）、ＰＤ－Ｌ１阻害剤（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＭＤＸ－１１０５、またはＲＥＧＮ３５０４などの抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＣＤ４７阻害剤、ＣＤ２８阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤、ＣＸＣＲ阻害剤、ＣＣＲ４阻害剤、ＣＣＲ８阻害剤、ＣＤ４０阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、別のＴ細胞共阻害剤またはリガンドのアンタゴニスト（例えば、ＣＤ－２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、ＬＡＩＲ１、ＩＣＯＳ、ＣＤ１６０、またはＶＩＳＴＡ）、インドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト［例えば、アフリベルセプトまたはＵＳ ７，０８７，４１１に記載される他のＶＥＧＦ阻害融合タンパク質などの「ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ」、あるいは抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ベバシズマブ、またはラニビズマブ）またはＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブ、またはパゾパニブ）］、Ａｎｇ２阻害剤（例えば、ネスバクマブ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）阻害剤、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えば、エルロチニブ、セツキシマブ）、ＣＤ２０阻害剤（例えば、リツキシマブなどの抗ＣＤ２０抗体）、腫瘍特異的抗原に対する抗体［例えば
、ＣＡ９、ＣＡ１２５、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ビメンチン、腫瘍－Ｍ２－ＰＫ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ムチン－１、ＭＡＲＴ－１、およびＣＡ１９－９］、ワクチン（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ、癌ワクチン）、抗原提示を高めるアジュバント（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、二重特異性抗体（例えば、ＣＤ３ｘＣＤ２０二重特異性抗体、またはＰＳＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体）、細胞毒、化学療法剤（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、およびビンクリスチン）、シクロホスファミド、手術、放射線療法、ＩＬ－６Ｒ阻害剤（例えば、サリルマブ）、ＩＬ－４Ｒ阻害剤（例えば、デュピルマブ）、ＩＬ－１０阻害剤、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、およびＩＬ－１５などのサイトカイン、抗体－薬物結合体（ＡＤＣ）（例えば、抗ＣＤ１９－ＤＭ４ ＡＤＣ、および抗ＤＳ６－ＤＭ４ ＡＤＣ）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、および非ステロイド系抗炎症薬）、抗酸化剤などの栄養補助剤、または癌を治療するための任意の他の療法ケアと組み合わせて使用され得る。特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、樹状細胞ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、腫瘍細胞ワクチンなどを含む癌ワクチンと組み合わせて使用され、抗腫瘍応答を増強し得る。本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせて使用することができる癌ワクチンの例には、黒色腫および膀胱癌のためのＭＡＧＥ３ワクチン、乳癌のためのＭＵＣ１ワクチン、脳癌（多形膠芽腫を含む）のためのＥＧＦＲｖ３（例えば、リンドペピムト）、または（ＣＥＡ＋癌のための）ＡＬＶＡＣ－ＣＥＡが含まれる。
特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、長期持続性抗腫瘍応答を生じる方法および／または癌を有する患者の生存率を高める方法において放射線療法と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、癌患者に放射線療法を投与する前、それと同時、またはその後に投与され得る。例えば、放射線療法は、腫瘍病変に１つ以上の用量で投与され、続いて１つ以上の用量の本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与が行われ得る。いくつかの実施形態において、放射線療法は、患者の腫瘍の局所免疫原性を増強（補助放射線）および／または腫瘍細胞を殺滅（剥離放射線）するために腫瘍病変に局所投与され、続いて本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の全身投与が行われ得る。例えば、頭蓋内放射線は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の全身投与と組み合わせて脳癌（例えば、多形膠芽腫）を有する患者に投与され得る。特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、放射線療法および化学療法剤（例えば、テモゾロミド）またはＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト）と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、放射線療法および化学療法剤（例えば、テモゾロミド）またはＰＤ－１阻害剤（例えば、ＲＥＧＮ２８１０、ニボルマブ、またはペンブロリズマブなどの抗ＰＤ－１抗体）と組み合わせて投与され得る。
特定の実施形態において、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＬＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶによって引き起こされる慢性ウイルス感染症を治療するために１つ以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与され得る。抗ウイルス剤の例には、これらに限定されないが、ジドブジン、ラミブジン、アバカビル、リバビリン、ロピナビル、エファビレンツ、コビシスタット、テノホビル、リルピビリン、およびコルチコステロイドが含まれる。
追加の治療的に活性な薬剤（複数可）／成分（複数可）は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与前、それと同時、またはその後に投与され得る。本開示の目的のために、そのような投与レジメンは、第２の治療活性成分「と組み合わせた」抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与であると考えられる。
追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与前に対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与から１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、または１分未満で投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「前に」投与されるとみなされ得る。他の実施形態において、追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与後に対象に投与され得る。例えば、第１の成分が第２の成分の投与から１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「後に」投与されるとみなされ得る。さらに他の実施形態において、追加の治療活性成分（複数可）は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与と同時に対象に投与され得る。本発明の目的のための「同時」投与には、例えば、対象への抗ＣＴＬＡ－４抗体および追加の治療活性成分の、（例えば、共製剤化された）単一の剤形での、または互いに約３０分以内に対象へ投与される別個の剤形での投与が含まれる。別個の剤形で投与される場合、各剤形は、同じ経路を介して投与され得（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体および追加の治療活性成分の両方は、静脈内、皮下などで投与され得）、あるいは、各剤形は、異なる経路を介して投与され得る（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、静脈内投与され得、追加の治療活性成分は、皮下投与され得る）。いずれの事象においても、単回剤形で、同じ経路による別個の剤形で、または異なる経路による別個の剤形でこの成分を投与することはすべて、本開示の目的のために、「同時投与」とみなされる。本開示の目的のために、追加の治療活性成分の投与「の前の」、「と同時の」、または「の後の」抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与は、追加の治療活性成分「と組み合わせた」抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与と考えられる。
本発明には、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体が、様々な投与量組み合わせを使用して本明細書の他の箇所に記載される追加の治療活性成分（複数可）の１つ以上と共製剤化される、薬学的組成物が含まれる。
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＰＤ－１阻害剤を含む共製剤の投与を含む、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体がＰＤ－１阻害剤（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ ２０１５／０２０３５７９に開示される抗ＰＤ－１抗体）と組み合わせて投与される例示的な実施形態において、個々の成分は、様々な投与量組み合わせを使用して対象に投与され、および／または共製剤化され得る。よって、本発明は、癌またはウイルス感染症の治療における同時、別個、および／または連続使用のための、（ｉ）本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体と、（ｉｉ）ＰＤ－１阻害剤（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１５／０２０３５７９に開示される抗ＰＤ－１抗体）との組み合わせを含む。例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＰＤ－１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）はそれぞれ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、および１０．０ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される量で、対象に投与され、および／または共製剤に含有され得る。一実施形態において、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびＰＤ－１阻害剤（例えば、抗ＰＤ－１抗体）はそれぞれ、約５０ｍｇ～約６００ｍｇの量、例えば、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４５０ｍｇ、５００ｍｇ、５５０ｍｇ、および６００ｍｇからなる群から選択される量で対象に投与され、および／または共製剤に含有され
得る。組み合わせ／共製剤は、例えば、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ケ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月に１回などを含む、本明細書の他の箇所に開示される投与レジメンのいずれかに従って対象に投与され得る。本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、約３～５、または約３．０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＤ－１阻害剤（例えば、ＵＳ ２０１５／０２０３５７９に開示される抗ＰＤ－１抗体）と同時に、約０．８～約１１、約１～約１０、約３～約１０、約１、約３、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。同時投与は、例えば、１４日、２１日、または２８日毎に行われ得る。
抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、およびＶＥＧＦアンタゴニストを含む共製剤の投与を含む、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体が抗ＰＤ－１抗体およびＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦトラップ）と組み合わせて投与される例示的な実施形態において、個々の成分は、様々な投与量組み合わせを使用して対象に投与され、および／または共製剤化され得る。例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体および／または抗ＰＤ－１抗体は、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、２．５ｍｇ、３．０ｍｇ、３．５ｍｇ、４．０ｍｇ、４．５ｍｇ、５．０ｍｇ、６．０ｍｇ、７．０ｍｇ、８．０ｍｇ、９．０ｍｇ、および１０．０ｍｇからなる群から選択される量で対象に投与され、および／または共製剤に含有され得、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプトなどのＶＥＧＦトラップ）は、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１．０ｍｇ、１．１ｍｇ、１．２ｍｇ、１．３ｍｇ、１．４ｍｇ、１．５ｍｇ、１．６ｍｇ、１．７ｍｇ、１．８ｍｇ、１．９ｍｇ、２．０ｍｇ、２．１ｍｇ、２．２ｍｇ、２．３ｍｇ、２．４ｍｇ、２．５ｍｇ、２．６ｍｇ、２．７ｍｇ、２．８ｍｇ、２．９ｍｇ、および３．０ｍｇからなる群から選択される量で対象に投与され、および／または共製剤に含有され得る。組み合わせ／共製剤は、例えば、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１か月に１回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、６か月に１回などを含む、本明細書の他の箇所に開示される投与レジメンのいずれかに従って対象に投与され得る。
投与レジメン
本発明の特定の実施形態によれば、複数用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体（または抗ＣＴＬＡ－４抗体と本明細書で言及される追加の治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む薬学的組成物）は、定義される時間経過にわたって対象に投与し得る。本発明のこの態様による方法は、対象に複数用量の本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体を順次に投与することを含む。本明細書で使用されるとき、「順次に投与すること」は、各用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体が対象に異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、または数か月）によって離れた異なる日に投与されることを意味する。本発明には、患者に単一の１次用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体、続いて１つ以上の２次用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体、任意に続いて１つ以上の３次用量の抗ＣＴＬＡ－４抗体を順次に投与することを含む方法が含まれる。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、対象の０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。
「１次用量」、「２次用量」、および「３次用量」という用語は、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与の時系列を指す。したがって、「１次用量」とは、治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称する）であり、「２次用量」とは、１次用量後に投与される用量であり、「３次用量」とは、２次用量後に投与される用量である。１次用量、２次用量、および３次用量は全て、同じ量の抗ＣＴＬＡ－４抗体を含有し得るが、概して、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、特定の実施形態にお
いて、１次用量、２次用量、および／または３次用量に含有される抗ＣＴＬＡ－４抗体の量は、治療経過中、互いに異なる（例えば、適宜上下に調整される）。ある特定の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、または５回）の用量が治療レジメンの開始時において「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」として投与され、続いてより低い頻度に基づいて投与される後続用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
特定の実施形態において、１次、２次、および／または３次用量に含有される抗ＣＴＬＡ－４抗体の量は、最適量以下または治療量以下であり得る。本明細書で使用されるとき、「治療量以下」または「最適量以下」という用語は、治療効果をもたらすには低すぎるレベルまたは癌などの疾患の治療に必要なレベル未満で投与される抗体用量を指す。
本発明の特定の例示的な実施形態において、各２次および／または３次用量は、直前の用量の１～２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）週間後に投与される。「直前の用量」という句は、本明細書で使用されるとき、一連の複数の投与において、何ら介入用量なく順に直後の用量の投与の前に患者に投与される抗ＣＴＬＡ－４抗体の用量を意味する。
本発明のこの態様による方法は、任意の数の抗ＣＴＬＡ－４抗体の２次および／または３次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、単回の２次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の２次用量が患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態において、単回の３次用量のみが患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回またはそれ以上）の３次用量が患者に投与される。
複数回の二次用量を伴う実施形態において、各二次用量は他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各２次用量は、直前の投与の１～２週間後または１～２ヶ月後に患者に投与されてもよい。同様に、複数回の３次用量を含む実施形態において、各３次用量は他の３次用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、各３次用量は、直前の投与の２～１２週間後に患者に投与されてもよい。本発明のある特定の実施形態において、２次用量および／または３次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変わり得る。投与頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療経過の間に調整され得る。
抗体の診断的使用
本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、診断目的のために、試料中のＣＴＬＡ－４を検出および／または測定するために使用され得る。いくつかの実施形態は、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染症などの疾患または障害を検出するためのアッセイにおける、本発明の１つ以上の抗体の使用を企図する。ＣＴＬＡ－４についての例示的な診断アッセイは、例えば、対象（例えば、患者）から得られた試料を、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体と接触させることを含み得、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または対象試料からＣＴＬＡ－４を選択的に単離するために捕捉リガンドとして使用される。あるいは、標識されていない抗ＣＴＬＡ－４抗体は、それ自体が検出可能に標識された２次抗体と組み合わせて診断用途において使用することができる。検出可能な標識もしくはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５
Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアナートもしくはローダミンなどの蛍光部分もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。試料中のＣＴＬＡ－４を検出または測定するために使用することのできる具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本発明によるＣＴＬＡ－４診断アッセイにおいて使用することができる試料には、正常または病理学的条件下で、検出可能な量のＣＴＬＡ－４タンパク質、またはその断片のいずれかを含有する、患者から入手可能な任意の組織または流体試料が含まれる。概して、健常な患者（例えば、癌または自己免疫疾患に罹患していない患者）から得られた特定の試料中のＣＴＬＡ－４のレベルは、ＣＴＬＡ－４のベースラインまたは標準レベルをまず確立するために測定されるであろう。次いで、ＣＴＬＡ－４のこのベースラインレベルは、癌関連状態、またはそのような状態と関連した症状を有すると疑われる個体から得られた試料において測定されるＣＴＬＡ－４のレベルと比較することができる。
ＣＴＬＡ－４に特異的な抗体は、追加の標識もしくは部分を全く含有していなくてもよく、またはＮ末端もしくはＣ末端標識もしくは部分を含有していてもよい。一実施形態では、標識または部分は、ビオチンである。結合アッセイにおいて、標識（存在する場合）の位置は、ペプチドが結合した表面に対するペプチドの向きを決定し得る。例えば、表面がアビジンで被覆されている場合、Ｎ末端ビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのＣ末端部分が表面から遠位になるように配向されるであろう。
本発明の態様は、患者における癌またはウイルス感染症の予後を予測するためのマーカーとしての開示される抗体の使用に関する。本発明の抗体は、患者における癌の予後を評価し、生存率を予測する診断アッセイにおいて使用され得る。
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように作製および使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを企図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はなされたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
実施例１：ＣＴＬＡ－４に対するヒト抗体の生成
ＣＴＬＡ－４に対するヒト抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４タンパク質（Ｃａｔ．番号：７２６８－ＣＴ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはｈＣＴＬＡ－４をコードするＤＮＡ（アクセッション番号：ＮＭ＿００５２１４．４）のいずれかを用いて生成した。免疫原は、ＵＳ ８５０２０１８ Ｂ２に記載されるように、免疫応答を刺激するアジュバントと共に、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）に直接投与した。抗体免疫応答を、ＣＴＬＡ－４特異的イムノアッセイによってモニターした。所望の免疫応答が達成されたとき、脾細胞を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合させて、それらの生存率を維持し、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＣＴＬＡ－４特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技術および上記の免疫原を使用して、いくつかの抗ＣＴＬＡ－４キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）が得られ、この様式でＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから生成された例示的な抗体を、Ｈ１Ｍ２０３７０Ｎ、Ｈ１Ｍ２
０３７２Ｎ、Ｈ１Ｍ２０３９３Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３６１Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３６８Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３６９Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３７３Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３７５Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３７９Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３８５Ｎ、Ｈ２Ｍ２０３８６Ｎ、およびＨ２Ｍ２０３８７Ｎと指定した。
抗ＣＴＬＡ－４抗体はまた、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第７，５８２，２９８号に記載されるように、骨髄腫細胞への融合なしに（免疫化マウスのいずれかからの）抗原陽性Ｂ細胞から直接単離された。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有する抗体）が得られ、この様式で生成された例示的な抗体を、以下：Ｈ１Ｈ１９２６４Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２６９Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２７３Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２７４Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２７８Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２７９Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２８０Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２８１Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２８３Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２８４Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２９１Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２９４Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３０５Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３０７Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３１２Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３１３Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３１４Ｐ２、Ｈ１Ｈ１９３１９Ｐ２、およびＨ１Ｈ１９３２７Ｐ２と指定した。
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗体の生物学的特性を、以下に記載の実施例において詳細に記載する。
実施例２：重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸およびヌクレオチド配列
表１は、本発明の選択された抗ＣＴＬＡ－４抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を示す。対応する核酸配列識別子を表２に示す。
Figure 2023113893000002
Figure 2023113893000003
抗体は、典型的には、本明細書において以下の命名法：Ｆｃ接頭辞（例えば、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ４Ｈ」など）、続いて数値識別子（例えば、表１に示すように、「１９２６４」、「２０３７０」など）、続いて「Ｐ」、「Ｐ２」、または「Ｎ」接尾辞に従って呼ばれる。よって、この命名法に従って、抗体は、本明細書において、例えば、「Ｈ１Ｍ２０３７０Ｎ」、「Ｈ１Ｈ１９２６４Ｐ」、「Ｈ１Ｈ１９３１４Ｐ２」などと呼ばれ得る。本明細書で使用される抗体名のＨ１Ｈ接頭辞は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ１Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃを有し、「Ｈ１Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ１Ｆｃを有し、「Ｈ２Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ２Ｆｃを有する（抗体名の最初の「Ｈ」によって示されるように全ての可変領域は完全ヒト型である）。当業者によって認識されるように、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができる（例えば、マウスＩｇＧ１ Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４などを有する抗体に変換することができる）が、任意の事象において、表１に示す数値識別子によって示される可変ドメイン（ＣＤＲを含む）は同じままであり、抗原に対する結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず、同一であるか、また
は実質的に類似していると予想される。
対照構成体：
２つの対照構成体（抗ＣＴＬＡ４抗体）は、比較目的で以下の実験に含まれた。
ＣＯＭＰ１：ＷＯ ０１／１４４２４ Ａ２（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）に記載され、ｈＩｇＧ１ Ｆｃで産生された、「１０Ｄ１」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変ドメインを有するヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体。
ＣＯＭＰ２：ＵＳ ２０１４／０９９３２５ Ａ１（Ｐｆｉｚｅｒ）に記載され、ｈＩｇＧ２ Ｆｃで産生された、「１１．２．１」の対応するドメインのアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変ドメインを有するヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体。
実施例３：ヒトモノクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体の表面プラズモン共鳴由来の結合親和性および動態定数
ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体の結合親和性および動態定数を、２５℃での表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００（ＧＥ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）またはＭＡＳＳ－１（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ，Ｇｒｅｅｎｖｉｌｌｅ，ＲＩ））によって決定した（表３および４）。ヒトＩｇＧ１として発現した抗体（すなわち、「Ｈ１Ｈ」）は、モノクローナルマウス抗ヒトＦｃ抗体（ＧＥ）とのアミンカップリングによって誘導体化されたＣＭ５センサー表面（ＧＥ）上に捕捉した。マウスＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２として発現した抗体（すなわち、「Ｈ１Ｍ」、「Ｈ２Ｍ」）を、ポリクローナルヤギ抗マウスＦｃ抗体（ＧＥ）とのアミンカップリングによって誘導体化された高容量アミンセンサー表面（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）上に捕捉した。ｃ末端ｍｙｃ－ｍｙｃ－ポリヒスチジンタグ（ｍｍｈ）で発現した様々な濃度の可溶性ヒト（ｈ）ＣＴＬＡ－４（配列番号５０６）またはカニクイザル（ｍｆ）ＣＴＬＡ－４（配列番号５０７）タンパク質を、抗ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂ捕捉センサー表面にわたって３０または５０ｕＬ／分の流量で注入した。ＣＴＬＡ－４は、システイン残基１５７の細胞外ドメインにおける１つのジスルフィド結合によって相互接続されたホモダイマーである。
全ての結合試験は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５体積／体積％界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファー）で構成されるバッファーにおいて行った。捕捉されたモノクローナル抗体へのｈＣＴＬＡ４．ｍｍｈまたはｍｆＣＴＬＡ４．ｍｍｈの会合を４または５分間モニターし、ＨＢＳ－ＥＴランニングバッファーにおけるｈＣＴＬＡ４．ｍｍｈまたはｍｆＣＴＬＡ４．ｍｍｈの解離を１０分間モニターした。
Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２．０ｃ曲線適合ソフトウェアを用いてリアルタイムセンサーグラムを１：１結合モデルへあてはめることによって、動的結合（ｋａ）速度定数および動的解離（ｋｄ）速度定数を測定した。結合平衡解離定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を、動的速度定数から以下のように計算した：
Figure 2023113893000004
表３に示すように、本発明の全ての抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４に結合し、多くがｈＣＴＬＡ－４．ｍｍｈに対してナノモル親和性を有し、カニクイザルＣＴＬＡ－４タンパク質に対して交差反応性を示した。マウスまたはラットＣＴＬＡ－４タンパク質に対する交差反応性は観察されなかった（データは示されない）。
Figure 2023113893000005
Figure 2023113893000006
実施例４：抗ＣＴＬＡ－４抗体はヒトＣＴＬＡ－４とその天然リガンド、Ｂ７－１およびＢ７－２との間の相互作用をブロックする
ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、従来型および制御性Ｔ細胞上に発現したＩ型膜貫通Ｔ細胞阻害チェックポイント受容体である。ＣＴＬＡ－４は、その天然リガンドであるＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）に結合する刺激性受容体ＣＤ２８を打ち負かすことによって、Ｔ細胞の活性化を負に制御する。この例では、抗ＣＴＬＡ－４抗体がプレート結合Ｂ７－１およびＢ７－２へのＣＴＬＡ－４タンパク質結合をブロックする能力を、競合サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価した。様々な濃度の抗ＣＴＬＡ－４抗体を、一定の量のダイマーＣＴＬＡ－４タンパク質と予め混合し、抗体の存在による、プレート固定化Ｂ７－１またはＢ７－２へのＣＴＬＡ－４結合の低減をモニターした。
簡潔に、アッセイは、以下の手順を使用して行った：ｃ末端ヒトＩｇＧ１および６ｘヒスチジン（ｈＩｇＧ１－６ｘＨｉｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で発現した、ヒトＢ７－１およびＢ７－２タンパク質を、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ
で、９６ウェルマイクロタイタープレート上、一晩（ＯＮ）４℃で別個に被覆した。その後、非特異的結合部位を、ＰＢＳ中のＢＳＡの０．５（重量／体積）％溶液を使用してブロックした。別個に、一定量の２００ｐＭまたは４００ｐＭの組換えｈＣＴＬＡ－４－ｍＦｃタンパク質（マウスＩｇＧ２ａのｃ末端Ｆｃ部分で発現したヒトＣＴＬＡ－４細胞外ドメイン、配列番号５０８）を、連続希釈抗ＣＴＬＡ－４抗体、または抗体が存在しない溶液に添加した。この例では、抗ＣＴＬＡ－４抗体の用量は、１．７ｐＭ～最大１００ｎＭまたは１．０ｕＭのいずれかの範囲であった。次に、室温（ＲＴ）で１時間後、２００ｐＭの一定濃度のｈＣＴＬＡ－４－ｍＦｃタンパク質を含む抗体－タンパク質複合体を、ｈＢ７－１－ｈＩｇＧ１－６Ｈｉｓで被覆したマイクロタイタープレートに移し、４００ｐＭの一定濃度のｈＣＴＬＡ－４－ｍＦｃを含む抗体－タンパク質複合体を、ｈＢ７－２－ｈＩｇＧ１－６Ｈｉｓ被覆プレートに移した。ＲＴでのその後の１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、プレート結合ｈＣＴＬＡ－４－ｍＦｃを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と結合した抗マウスＦｃγ断片特異的ヤギポリクローナル抗体で検出した。プレートは、ＴＭＢ基質溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を製造業者の指示に従って使用して開発し、吸光度は、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（商標），Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で４５０ｎｍで測定した。
全てのデータ分析は、Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）内のＳ字型用量応答モデルを使用して行った。計算は以下のように行った：ｈＢ７－１またはＢ７－２へのｈＣＴＬＡ－４結合を５０％低減するために必要な抗体の濃度として定義されるＩＣ５０を遮断効力の指標として使用した。試験された抗体の最大濃度（１００ｎＭまたは１．０ｕＭ）での遮断パーセントは、それぞれ、アッセイのベースラインに対して、２００ｐＭまたは４００ｐＭのｈＣＴＬＡ－４－ｍＦｃのｈＢ７－１またはｈＢ７－２への結合をブロックする抗体の能力として計算した。抗体の不在下で２００ｐＭまたは４００ｐＭのｈＣＴＬＡ－４－ｍＦｃを含む試料の結合シグナルは、１００％結合または０％遮断として参照し、ｈＣＴＬＡ－４－ｍＦｃまたは抗体を含まない試料バッファーのベースラインシグナルは、０％結合または１００％遮断として参照した。
表４の結果が示すように、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４のその天然リガンドであるＢ７－１またはＢ７－２への結合をブロックする広範な能力を示す。例示的な抗体Ｈ１Ｈ１９２７３ＰおよびＨ１Ｈ１９３１３Ｐは、ピコモルＩＣ５０値で、および１．０ｕＭ最大抗体濃度での約１００％の遮断パーセントでＣＴＬＡ－４のＢ７－１またはＢ７－２への結合を強力にブロックする。Ｈ１Ｈ２０３７３Ｎなどのいくつかの抗体は、Ｂ７－１よりもＢ７－２へのＣＴＬＡ－４結合のより強いブロッカーであり、いくつかの抗体は、いずれかのリガンドの最小の遮断能力を示した（Ｈ１Ｈ１９３１４Ｐ２）。
Figure 2023113893000007
Figure 2023113893000008
実施例５：抗ＣＴＬＡ－４抗体はヒトＣＴＬＡ－４操作細胞株への特異的かつ強力な結合を示す
この例では、抗ヒト（ｈ）ＣＴＬＡ－４抗体がヒトＣＴＬＡ－４発現細胞株に特異的に結合する能力を、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの検出を使用して決定した。
簡潔には、Ｖｅｌｏｃｉｍｍｕｎｅ（登録商標）マウス（ＶＩ線維芽細胞）から単離されたマウス胚性線維芽細胞に、ヒトＣＴＬＡ－４（アミノ酸Ｍ１－Ｎ２２３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００５２１４．４）を安定にトランスフェクトした。非トランスフェクトＶＩ線維芽細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるＣＴＬＡ－４の検出可能な発現を有さず、結合対照として含まれていた。加えて、不死ヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）にＮＦＡＴ－Ｌｕｃレンチウイルスレポーター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）およびｈ、ｍ、またはｍｆ ＣＴＬＡ－４キメラ構成体を形質導入することによって生成されたレポーターＴ細胞株もこのアッセイで評価した。キメラ構成体は、ｈＣＤ３００ａ（ａａ １８１－２９９、アクセッション番号ＮＰ＿００９１９２．２）の膜貫通および細胞質ドメインに融合したｈＣＴＬＡ－４（ａａ １－１６１、アクセッション番号ＮＰ＿００５２０５．２）、マウスＣＴＬＡ－４（ｍｓ ＣＴＬＡ－４、アミノ酸１－１６１、アクセッション番号ＮＭ＿００９８４３．４）、またはｍｆ ＣＴＬＡ－４（ａａ １～１６１、アクセッション番号ＸＰ＿００５５７４０７１．１）のいずれかの細胞外ドメインを含んだ。
約２．０ｘ１０４個のＶＩ線維芽細胞／ｈＣＴＬＡ－４細胞または１．０ｘ１０４個のＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴキメラ細胞を、９６ウェル炭素電極プレート（ＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹハイバインドプレート、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））に別個に播種し、１時間（ｈ）３７℃でインキュベートした。非特異的結合部位を、ＰＢＳ中の２（重量／体積）％ＢＳＡによって１時間室温（ＲＴ）でブロックした。１．７ｐＭ～１５０ｎＭの範囲の抗ＣＴＬＡ－４またはアイソタイプ対照抗体の段階希釈物、または抗体を含有しないバッファーを、プレート結合細胞に１時間、ＲＴで添加した。次いで、細胞洗浄ヘッドを備えるＡｑｕａＭａｘ２０００プレート洗浄機（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、プレートを洗浄し、未結合抗体を除去した。プレート結合抗体を、重鎖および軽鎖に特異的なＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）結合ヤギポリクローナル抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）またはＦｃγ断片に特異的なＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ（商標）結合ヤギポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）のいずれかで、１時間、ＲＴで検出した。
洗浄後、プレートを製造業者の推奨手順に従ってリードバッファー（ＭＳＤ）で顕色させ、発光シグナルをＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６００（ＭＳＤ）で記録した。相対光量単位（ＲＬＵ）で測定される発光強度を、濃度の範囲での各抗体の結合強度を示すために記録した。同じ濃度での親細胞と比較したＣＴＬＡ－４操作細胞への０．４ｎＭまたは０．６ｎＭ抗体結合で検出されたシグナルの比を、ＣＴＬＡ－４結合の特異性の指標として報告した。
加えて、直接結合シグナル（ＲＬＵ）を抗体濃度の関数として分析し、データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてＳ字型（４パラメータロジスティック）用量応答モデルにあてはめた。最大結合シグナルの５０％が検出される抗体の濃度として定義されるＥＣ５０値を、ＣＴＬＡ－４操作細胞への結合有効性を示すために決定した。
表５の結果が示すように、本発明の抗ＣＴＬＡ－４抗体の大部分は、ｈＣＴＬＡ－４操作細胞株に特異的に結合した。Ｈ１Ｈ１９３０３ＰおよびＨ１Ｈ１９２８０Ｐなどのいくつかの例示的な抗体は、ピコモルＥＣ５０値で、および対照細胞株への結合よりも２０～２３倍の比で結合した。
一連の抗体を、マウスおよびカニクイザル操作細胞株に対する交差反応性についてさらに評価した。表６の結果が示すように、抗ＣＴＬＡ－４抗体Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ、Ｈ１Ｈ１９２７３Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３１９Ｐ２、およびＨ１Ｈ１９３１９Ｐは、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ Ｌｕｃ／ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ－４／ｈＣＤ３００キメラ細胞株に、ピコモルＥＣ５０値で、強力に結合する。マウスＣＴＬＡ－４キメラ細胞に対する交差反応性は観察されなかった。
Figure 2023113893000009
Figure 2023113893000010
Figure 2023113893000011
実施例６：抗ＣＴＬＡ－４抗体は操作されたレポーターＴ細胞／ＡＰＣバイオアッセイシステムにおいてＴ細胞活性化を誘導する
この例では、Ｔ細胞／抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースのルシフェラーゼレポーターバイオアッセイを、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０またはＣＴＬＡ－４／ＣＤ８６相互作用およびＴ細胞活性化をブロックする効果を評価するために開発した。１つのバイオアッセイフォーマットでは、Ｔ細胞／ＡＰＣシステムに対する抗ＣＴＬＡ－４抗体投与の効果を、ルシフェラーゼ活性を測定することによって評価した。第２のアッセイでは、抗ＣＴＬＡ－４抗体がインターロイキン（ＩＬ）－２放出を誘導する能力を評価した。
上記の例に記載されるように、この例で試験された抗ＣＴＬＡ－４抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を介してヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｕｌａｒｉｓ）ＣＴＬＡ－４への結合を示し、ヒトＣＴＬＡ－４を発現するように操作された細胞株への特異的かつ強力な結合を示した。これらの選択されたＣＴＬＡ－４抗体は、ＣＴＬＡ－４のＢ７－１（ＣＤ８０）およびＢ７－２（ＣＤ８６）への結合をブロックすることも以前に示された。
背景
Ｔ細胞の活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の主要組織適合性複合体クラスＩまたはＩＩ（ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ）タンパク質によって提示される特定のペプチドを認識
するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を刺激することによって達成される（Ｇｏｌｄｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．１９９９）。活性化されたＴＣＲは、順にシグナル伝達事象のカスケードを開始し、これはアクチベータータンパク質１（ＡＰ－１）、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、または活性化Ｂ細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー（ＮＦκＢ）などの様々な転写因子によって駆動される、レポーター遺伝子によってモニターすることができる。Ｔ細胞応答は次いで、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４（細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４）、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、または他の分子などのＴ細胞上に構成的または誘導的のいずれかで発現した共受容体の関与を介してさらに精製される（Ｓｈａｒｐｅ ｅｔ ａｌ．２００２）。共受容体であるＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４は、ＣＴＬＡ－４がＣＤ２８よりも高い親和性を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で発現した同じリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６について競合する。ＣＴＬＡ－４は、デコイとして機能し、リガンドを隔離してＴ細胞活性化の低減をもたらすことによって、ＣＤ２８の活性化を阻害する。（Ａｌｅｇｒｅ ｅｔ ａｌ．２００１およびＷａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１１）。
ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性
細胞株操作：レポーターＴ細胞は、細胞表面にＴＣＲおよびＣＤ２８を内因的に発現する不死ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に、ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレンチウイルスレポーター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の指示に従って形質導入することによって操作した。レンチウイルスは、最小限のＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターおよびＮＦＡＴ転写応答エレメント（ＴＲＥ）のタンデムリピートおよびピューロマイシン耐性遺伝子の制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードする。
抗生物質選択およびシングルクローニング後、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃクローン株３Ｃ７（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ ｃｌ．３Ｃ７）にレンチウイルスコードヒト（ｈ）またはサル（ｍｆ－カニクイザル）ＣＴＬＡ－４キメラタンパク質を形質導入した。キメラ構成体は、ｈＣＤ３００ａ（ａａ １８１－２９９、アクセッション番号ＮＰ＿００９１９２．２）の膜貫通および細胞質ドメインに融合したｈＣＴＬＡ－４（ａａ
１－１６１、アクセッション番号ＮＰ＿００５２０５．２）またはｍｆ ＣＴＬＡ－４（ａａ １～１６１、アクセッション番号ＸＰ＿００５５７４０７１．１）の細胞外ドメインを含む。ＣＤ３００ａは、免疫細胞上で見られ、その免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介して阻害シグナルを伝達する（ＤｅＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１２）。得られた安定したＴ細胞株であるＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＣＴＬＡ－４－ｈＣＤ３００ａおよびＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｍｆＣＴＬＡ－４－ｈＣＤ３００ａは、選択され、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８および１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補足したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシン＋グルタミンにおいて維持された。
細胞表面上でＣＤ２０、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を内因的に発現するヒトＲａｊｉ Ｂ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、ルシフェラーゼベースのバイオアッセイにおいてＡＰＣ細胞として使用した。Ｒａｊｉ細胞は、ＨＥＰＥＳおよびピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ペニシリン＋ストレプトマイシン＋グルタミンにおいて維持した。
Ｔ細胞／ＡＰＣ刺激：レポーターＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上に発現するＣＤ３およびＲａｊｉ Ｂ細胞上のＣＤ２０を標的とするＴ細胞活性化抗ＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性抗体（ＲＥＧＮ２２８１）を介して刺激される。ＲＥＧＮ２２８１の二重特異性結合モードは、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－ＬｕｃＴ細胞において、ＮＦＡＴ結合レポーター遺伝子、ルシフェラーゼの増加をもたらす。
しかしながら、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＣＴＬＡ－ｈＣＤ３００ａキメラ細胞では、Ｒａｊｉ細胞上で発現した、ＣＴＬＡ－４－ｈＣＤ３００ａキメラ受容体とそのリガンドであるＣＤ８０／ＣＤ８６との相互作用によって伝達される阻害シグナルのために、ＲＥＧＮ２２８１でのレポーター遺伝子の最大活性化が弱められている。このバイオアッセイでは、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０およびＣＤ８６軸をブロックする抗ＣＴＬＡ－４抗体は、理論的には、キメラＣＴＬＡ－４タンパク質のＣＤ３００ａ尾部を介して送達される阻害シグナルを無効化することによってＪｕｒｋａｔレポーター細胞においてＮＦＡＴ－Ｌｕｃ活性をレスキューするであろう。
このアッセイフォーマットでは、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｒａｊｉ細胞上のＦｃγＲへの抗体Ｆｃのアンカーリングによって引き起こされる、Ｊｕｒｋａｔにおけるアゴニストシグナルを同時に誘導することができる。飽和レベルのＩｇＧ分子またはＦｃγＲ特異的抗体でのＦｃγＲの遮断は、ＣＴＬＡ－４抗体のアゴニスト効果を低減し得る。したがって、Ｆｃブロックステップが、Ｒａｊｉ細胞上のＦｃγＲへのＣＴＬＡ－４ ｍａｂの結合を阻害するためにアッセイに含まれた。
ルシフェラーゼアッセイ：スクリーニングの２４時間前に、５ｘ１０５個のレポーターＴ細胞および７．５ｘ１０５個のＲａｊｉ ＡＰＣを、アッセイ培地（１０％ＦＢＳおよびペニシリン＋ストレプトマイシン＋グルタミン（ＰＳＧ）を補足したＲＰＭＩ１６４０）において培養した。翌日、抗ＣＴＬＡ－４抗体およびアイソタイプ一致陰性対照（１：３に段階希釈、用量範囲１５ｐＭ～１００ｎＭ）を、Ｒａｊｉ細胞の内因性ＦｃγＲＩＩｂ受容体を占めるために１００ｐＭのＲＥＧＮ２２８１および１０ｎＭのＦｃブロックまたは１０ｎＭのヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照の存在下で試験した。段階希釈抗体を、固定濃度の１００ｐＭのＲＥＧＮ２２８１／１０ｎＭのＦｃブロックまたは１００ｐＭのＲＥＧＮ２２８１／１０ｎＭのｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を含有する９６ウェル白色平底プレート（Ｎｕｎｃ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）において対応するウェルに添加した。レポーターＴ細胞およびＲａｊｉ ＡＰＣを２ｘ１０６／ｍＬで再懸濁し、Ｔ細胞を最終濃度５ｘ１０４細胞／ウェルでプレートにまず添加した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で１５～３０分間インキュベートし、続いて５×１０４細胞／ウェルの最終濃度でＲａｊｉ細胞を添加した。ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ活性を検出するために１００μＬ ＯＮＥ－Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）の添加前に、試料を３７℃／５％ＣＯ２でさらに４～６時間インキュベートした。放射光は、マルチラベルプレートリーダーＶｉｃｔｏｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で相対光量単位（ＲＬＵ）で捕捉した。全ての段階希釈物を二重に試験した。
ＣＴＬＡ－４抗体のＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、１０点用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。誘導倍率は、各試料の相対ＲＬＵ値を、１に設定されたＣＴＬＡ－４抗体を含有しない試料の平均に正規化することによって計算した。
結果：表７に記録されるように、抗ＣＴＬＡ－４抗体が、ＲＥＧＮ２２８１＋／－Ｆｃブロックの存在下で、親Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ ｃｌ ３Ｃ７細胞およびＲａｊｉ ＡＰＣに添加された場合、レポーター遺伝子活性（ルシフェラーゼ）の増加は観察されなかった。しかしながら、抗ＣＴＬＡ－４抗体が、ＲＥＧＮ２２８１＋／－Ｆｃブロックの存在下で、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈおよびｍｆ ＣＴＬＡ－４／ｈＣＤ３００キメラ細胞株／Ｒａｊｉ ＡＰＣシステムに添加された場合、増加するルシフェラーゼ活性が記録された。このバイオアッセイフォーマットでは、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞上のＣＴＬＡ－４とＲａｊｉ細胞で内因的に発現したＣＤ８０／ＣＤ８６との相互作用をブロックし、ルシフェラーゼタンパク質の誘導をもたらす。このアッセイで試験された抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ルシフェラーゼ活性を増加させ、最
大値は、Ｆｃブロックの存在下、１．７７ｎＭ～７．６７ｎＭの範囲のＥＣ５０で観察された。表７に示すように、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐは、試験においてコンパレータ１および２よりも良好であった。
ＣＴＬＡ－４ Ｔ細胞／ＡＰＣヒトインターロイキン２（ｈＩＬ－２）放出アッセイ
細胞株操作：Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃクローン株３Ｃ７（上述のとおり）に、ｈＣＴＬＡ－４完全長タンパク質（アクセッション番号ＮＰ＿００５２０５．２）をコードする内製型レンチウイルスｓｕｐを形質導入した。得られた安定したＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＣＴＬＡ－４ ｗｔ）は、フローサイトメトリーによって高発現について選別され、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８および１μｇ／ｍＬピューロマイシンを補足したＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ＰＳＧにおいて維持された。
ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞（ＡＴＣＣ）にヒトＣＤ２０をトランスフェクトし、４ｘＧ４Ｓリンカーを介して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ａａ ２－２４０、アクセッション番号ＷＰ＿０３１９４３９４２．１）に融合したｈＣＤ８０（ａａ １－２８８、アクセッション番号ＮＰ＿００５１８２．１）またはｈＣＤ８６（ａａ １－３２９、アクセッション番号ＮＰ＿７８７０５８．４）を過剰発現するためにレンチウイルスｓｕｐの形質導入に使用した。限界希釈によるシングルクローニング後、結果として以下のクローン株：ＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ８０－ＧＦＰクローン１Ｆ４およびＨＥＫ２９３／ｈＣＤ２０／ｈＣＤ８６－ＧＦＰクローン４Ｇ５が生成された。細胞株は、５００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８を補足したＤＭＥ＋１０％ＦＢＳ＋ＰＳＧ＋非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）において維持した。
Ｔ細胞／ＡＰＣ刺激：操作されたＴ細胞は、上述のように、二重特異性抗体ＲＥＧＮ２２８１を活性化するＴ細胞を介して刺激される。ＲＥＧＮ２２８１のＣＤ３への結合は、ＴＣＲと複合してＣＤ３サブユニットのクラスター化をもたらし、Ｔ細胞を活性化し、ひいてはｈＩＬ－２を放出する。ＩＬ－２の放出は、操作されたＨＥＫ２９３細胞上に位置するそのリガンドであるＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＤ２８相互作用によってさらに強めることができる。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ｈＣＴＬＡ－４細胞の最大活性化は、ＨＥＫ２９３細胞上のリガンドＣＤ８０／ＣＤ８６の結合についてのＣＴＬＡ－４とＣＤ２８との競合のために弱められている（Ｃａｒｒｅｎｏ ｅｔ ａｌ．２０００）。
このバイオアッセイでは、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０またはＣＤ８６相互作用をブロックする抗体は、阻害性ＣＴＬＡ－４アームを無効化することによって操作されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ－２放出をレスキューするであろう。
ＩＬ－２放出アッセイ：スクリーニングの２４時間前に、操作されたＴ細胞をアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋ＰＳＧ）において５ｘ１０５細胞／ｍＬまで培養した。翌日、ＨＥＫ２９３細胞をＤ－ＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄し、トリプシン（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ）で剥離し、アッセイ培地でブロックした。次に、ＨＥＫ２９３細胞を、細胞成長を停止させるために５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを含有するアッセイ培地で、３７℃／５％ＣＯ２で１時間処理した。その後、細胞をアッセイ培地で徹底的に洗浄して、遊離マイトマイシンＣを除去した。
抗ＣＴＬＡ－４抗体およびそれらのアイソタイプ対照は、１５ｐＭ～１００ｎＭの範囲の１０点希釈物で、アッセイ培地において１：３に段階希釈した。段階希釈抗体を、３００ｐＭの固定濃度のＲＥＧＮ２２８１を含有する９６ウェル丸底プレート（Ｎｕｎｃ）において対応するウェルに添加した。レポーターＴ細胞を最終濃度１ｘ１０５細胞／ウェルでプレートに添加した。プレートを、３７℃／５％ＣＯ２で１５～３０分間インキュベー
トし、続いて２．５×１０３細胞／ウェルの最終濃度でＨＥＫ２９３細胞を添加した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、上清をＩＬ－２測定のために収集し、使用した。ＩＬ－２レベルは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って測定した。測定値は、マルチラベルプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で取得した。全ての段階希釈物を二重に試験した。
ＣＴＬＡ－４ ｍＡｂのＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、１０ポイントの用量応答曲線上の４パラメータロジスティック方程式から決定した。誘導倍率は、各試料の相対ＩＬ－２値を、抗ＣＴＬＡ－４抗体を含有しない試料に正規化することによって計算した。表９は、１００ｎＭで到達した誘導倍率およびｈＩＬ－２放出アッセイにおいて到達した計算ＥＣ５０値を示す。
結果：表８の結果が示すように、このアッセイで試験された抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ／ＣＴＬＡ－４キメラ／／Ｒａｊｉ ＡＰＣシステムにおいてＩＬ－２産生を誘導した。１００ｎＭ濃度では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＣＴＬＡ－４陰性レポーターＴ細胞を使用したアッセイシステムで観察されるものの４～６倍の範囲の活性倍率でＩＬ－２産生を誘導する。表８に示すように、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐは、試験においてコンパレータ１および２よりも良好であった。
概要
要約すると、選択された抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｔ細胞活性化に対する抗体の活性を評価するように設計された２つの操作されたＴ細胞／ＡＰＣバイオアッセイシステムにおいて試験した。１つのフォーマットでは、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性の増加によって測定されるようにＴ細胞を活性化し、抗体がＣＴＬＡ－４とリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６との間の相互作用をブロックすることを示した。第２のフォーマットでは、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ＩＬ－２の産生を誘導し、抗ＣＴＬＡ－４抗体がＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０およびＣＴＬＡ－４／ＣＤ８６相互作用をブロックし、それによってＩＬ－２放出をレスキューすることができることを示した。
Figure 2023113893000012
Figure 2023113893000013
実施例７：腫瘍に対する抗ＣＴＬＡ－４抗体の有効性
この実施例は、ＣＴＬＡ－４遺伝子についてヒト化されたマウスにおいて成長したＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍に対する本発明の例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍有効性を記載する。
ヒトＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスは、マウスが内因性Ｃｔｌａ４遺伝子座からマウスＣＴＬＡ－４膜貫通および細胞質ドメインに融合したヒトＣＴＬＡ－４細胞外ドメインを含むキメラタンパク質を発現する、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（商標）技術を使用してＣ５７ＢＬ／６株バックグラウンドで操作された（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ
ａｌ ２００３；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：６５２－６５９）。ＭＣ３８．Ｏｖａ細胞株は、膜貫通ニワトリ卵白アルブミン抗原（Ｏｖａ）を発現するようにＭＣ３８細胞の安定したレンチウイルス形質導入によって操作された。
試験（Ａ）
ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスに、０日目にＭＣ３８．Ｏｖａ細胞（１０６細胞／マウス）を皮下（ＳＣ）移植し、３、７、１０、１４、および１７日目に１０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１９２７３Ｐ、もしくはＨ１Ｈ１９３０３Ｐ、もしくはＨ１Ｈ１９３１９のいずれか、または１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照ＩＰを投与した。腫瘍体積および無腫瘍動物を最大３７日間モニターした。
３つの抗ＣＴＬＡ－４抗体は全て、アイソタイプ対照での治療と比較して、１０ｍｇ／ｋｇで試験された部分的な腫瘍成長阻害を示した（図１）。Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐでの治療は、２４日目までに１０ｍｇ／ｋｇ用量群において９匹中８匹（８９％）の無腫瘍マウスをもたらした（図２）。Ｈ１Ｈ１９３１９ＰまたはＨ１Ｈ１９２７３Ｐのいずれかでの治療も同様に有効であり、２４日目までにそれぞれ９匹中７匹のマウス（７８％）および９匹中５匹のマウス（５６％）において完全な腫瘍成長阻害をもたらした。２４日目のアイ
ソタイプ対照治療群において、どの動物も無腫瘍であった。２４日目の腫瘍体積は、アイソタイプ対照が投与された群と比較して、各抗ＣＴＬＡ－４抗体治療群について有意により小さかった（ｐ＜０．０００１）。
２４日目に無腫瘍であることが観察されたマウスを、移植後３７日間モニターした。生存率は、アイソタイプ対照が投与されたマウスと比較して、抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体のいずれかで治療されたマウスにおいて有意により高かった（ｐ＜０．０００１）（図３）。抗ＣＴＬＡ－４抗体群からの全ての無腫瘍マウスにおいて腫瘍再発は観察されなかった。抗体治療の結果として体重減少の証拠は観察されなかった。
要約すると、３つの抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体（Ｈ１Ｈ１９２７３Ｐ、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ、およびＨ１Ｈ１９３１９）のそれぞれでの治療は、アイソタイプ対照と比較して、腫瘍成長の低減、腫瘍クリアランスの改善、および生存率の改善をもたらした。このモデルにおける３つの抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体のそれぞれの有効性は同等であった。
試験（Ｂ）
この試験に使用される例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合する完全ヒト抗体であり、配列番号１９６－１９８－２００－２０４－２０６－２０８のＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３および配列番号１９４／２０２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含む（Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐとしても知られる）。Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ（ＲＥＧＮ４６５９としても知られる）の全長重鎖アミノ酸配列は配列番号５０９に示され、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの全長軽鎖アミノ酸配列は配列番号５１０に示される（表９）。
Figure 2023113893000014
抗ＣＴＬＡ－４抗体の投与および抗腫瘍活性の分析
Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの抗腫瘍活性は、ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍保有ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスにおいて異なる用量で試験した。ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照は、陰性対照として含まれた。ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスの後脇腹に、０日目に１ｘ１０６個のＭＣ３８．Ｏｖａ細胞をＳＣ移植し、４つの治療群に分けた（表１０）。３、６、９、１３、および１６日目に、マウスにＨ１Ｈ１９３０３ＰまたはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照ＩＰを投与した。腫瘍の体積は、３７日間にわたって１週間に２回キャリパーによって測定した。腫瘍保有マウスを、３７日目または以下のエンドポイント：腫瘍体積＞２０００ｍｍ３または腫瘍潰瘍のいずれかでＣＯ２で屠殺した。生存率試験のために無腫瘍マウスを最長１０７日間追跡した。
Figure 2023113893000015
血液試料は、実験開始の２日前（－２日目）ならびに６、１３、および２０日目の抗体投与の２時間前に、顎下静脈から収集した。血清試料は、血清抗体レベルのその後の測定のために凍結し、保存した。
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６）を用いて行った。動物群間の腫瘍体積の差についての統計的有意性は、ダネットの多重比較事後検定での一元配置分散分析によって決定した。無腫瘍生存率についての統計的有意性は、ログランク（マンテル－コックス）検定によって決定した。各群が対照群と有意に異なるかを決定するために、２群マンテル－コックス分析は、比較数（ｋ＝６）について調整された有意性レベル（α＝０．０５）で、ボンフェローニ法（α調整＝０．０５／６）を使用して実行した。
総ヒトＩｇＧ抗体の血清濃度
総Ｈ１Ｈ１９３０３ＰおよびｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の血清濃度は、ヒトＦｃγの検出に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定した。６、１３、および２０日目に収集された血清試料は、１０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１９３０３ＰおよびｈＩｇＧ１対照群について分析し、６および２０日目に収集された試料は、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの２ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量群について分析した。簡潔には、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＦｃγポリクローナル抗体をマイクロタイタープレートに４℃で一晩受動的に吸着させ、続いてＰＢＳ中５％ＢＳＡでの非特異的結合ブロックを行った。このアッセイにおいてキャリブレーションに使用される標準物は、２．７～３５０ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度（１：２段階希釈）でのＨ１Ｈ１９３０３Ｐ、またはアイソタイプ対照抗体であった。標準物および血清試料の段階希釈物を希釈バッファーで調製した（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）。次いで、試料を抗ｈＦｃγ被覆プレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。その後、プレート捕捉ヒトＩｇＧ抗体を、希釈バッファー中の１６０ｎｇ／ｍＬのＨＲＰ結合抗ｈＦｃγポリクローナル抗体を使用して検出した。色原性ＨＲＰ基質である３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用してＨＲＰ活性を検出し、得られたＯＤ４５０をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで読み取った。キャリブレーション（２．７ｎｇ／ｍＬ）に使用される標準物（Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ、またはアイソタイプ対照抗体）の最低濃度は、アッセイのダイナミックレンジ内であり、このアッセイのＬＬＯＱとして定義された。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア
を使用して非線形回帰によって分析した。２回の反復実験の平均濃度を分析に使用した。
マウス抗ヒト抗体の血清濃度
抗Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐまたは抗ＩｇＧ１対照抗体マウスＩｇＧ力価は、注入された抗体のそれぞれの検出に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定した。６、１３、および２０日目に収集された血清試料は、１０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１９３０３ＰおよびｈＩｇＧ１対照群について分析し、６および２０日目に収集された試料は、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの２ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの用量群について分析した。簡潔には、ＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＨ１Ｈ１９３０３Ｐまたは抗ＩｇＧ１対照抗体をマイクロタイタープレートに４℃で一晩受動的に吸着させ、続いてＰＢＳ中５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）での非特異的結合ブロックを行った。血清試料の段階希釈物は、１：５００から開始する希釈バッファー（ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ）で調製した。したがって、対応する希釈係数（５００）は、アッセイの検出下限（ＬＯＤ）として定義された。次いで、試料をＨ１Ｈ１９３０３Ｐまたは抗ＩｇＧ１対照抗体被覆プレート（１００μＬ／ウェル）に添加し、４℃で１６～１８時間インキュベートした。アッセイバックグラウンドを決定するために、希釈バッファーのみを添加したウェルを含めた。その後、プレート捕捉マウスＩｇＧを、４０ｎｇ／ｍＬで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＦｃγポリクローナル抗体を使用して検出した。色原性ＨＲＰ基質であるＴＭＢを使用してＨＲＰ活性を検出し、４５０ｎｍでの得られた光学密度（ＯＤ４５０）をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｖｉｃｔｏｒ Ｘ４ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒで読み取った。結合シグナル対希釈係数のデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して非線形回帰によって分析し、力価を計算した。ＭＡＨＡ力価は、アッセイのバックグラウンドシグナルの２倍に相当する結合シグナルに対応する血清試料の計算希釈係数として定義された。
結果
ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスに、０日目にＭＣ３８．Ｏｖａ細胞をＳＣ移植し、３、６、９、１３、および１６日目に２、５、もしくは１０ｍｇ／ｋｇのＨ１Ｈ１９３０３Ｐまたは１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照ＩＰを投与した。腫瘍体積を３７日間モニターし、無腫瘍動物を最長１０７日間モニターした。
Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐは、アイソタイプ対照での治療と比較して、試験された全ての用量で部分的な腫瘍成長阻害を示した（図４）。Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐでの治療は、２０日目までに５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの両方の用量群において８匹中５匹（６３％）の無腫瘍マウス、２ｍｇ／ｋｇの用量群において８匹中２匹（２５％）の無腫瘍マウスをもたらした。２０日目の腫瘍体積は、アイソタイプ対照が投与された群と比較して、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ治療群について有意により小さかった（ｐ＜０．０００１）（図５）。
２０日目に無腫瘍であることが観察されたマウスを、移植後最長１０７日間モニターした。生存率は、アイソタイプ対照が投与されたマウスと比較して、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐで治療されたマウスにおいて有意により高かった（ｐ＜０．０００１）（図６）。全ての用量群からの２５匹の無腫瘍マウスのうちの２４匹において腫瘍再発は観察されなかった。抗体治療の結果として体重減少の証拠は観察されなかった。
要約すると、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐでの予防的処置は、アイソタイプ対照と比較して、腫瘍成長を用量依存的に有意に低減し、腫瘍クリアランスを改善し、生存率を改善した。
ＥＬＩＳＡによる血清抗体濃度およびＭＡＨＡの評価
６、１３、および２０日目に収集された血清試料を、ＥＬＩＳＡを使用してＨ１Ｈ１９３０３Ｐおよびアイソタイプ対照の濃度、ならびにＭＡＨＡ力価について分析した。血清
中のＨ１Ｈ１９３０３ＰおよびｈＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の濃度は、ヒトＩｇＧの検出に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定した（図７）。Ｈ１Ｈ１９３０３ＰまたはＩｇＧ１対照抗体に対する特定のマウスＩｇＧ力価は、各抗体の検出に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定した（図８）。
６日目に、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐおよびアイソタイプ対照が試験された全ての用量で血清中に検出され、それぞれ、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの１０、５、および２ｍｇ／ｋｇ用量で３９．８±２４、３３．５±８．９、および１０．４±２．９の平均血清濃度が観察された（表１１）。
Figure 2023113893000016
Figure 2023113893000017
６日目後、６、９、１３、および１６日目の抗体の追加投与にもかかわらず、２０日目までに全ての用量群についてＨ１Ｈ１９３０３Ｐの血清濃度の低減が観察された（表１１）。１０ｍｇ／ｋｇの用量群について、アイソタイプ対照と比較して、急速な抗体クリアランスが観察された。Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの血清濃度の低減は、ＭＡＨＡの発生に起因する可能性がある（図８、表１２）。ＭＡＨＡ力価は、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの全ての用量について６日後に測定された全ての時点で観察された。しかしながら、アイソタイプ対照のＭＡＨＡ力価は、試験された全ての時点で検出限界であった。
結論
１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、または２ｍｇ／ｋｇの用量でのＨ１Ｈ１９３０３Ｐの腹腔内投与は、ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍細胞が移植されたＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスにおいて、ｈＩｇＧ１対照と比較して、腫瘍成長の低減、腫瘍クリアランスの改善、および生存率の改善をもたらした。Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐの血清濃度は、時間と共に減少し、６日目後の時点での抗Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ ＭＡＨＡの発生と対応した。
実施例８：ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍を保有するＰＤ－１ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスに
おける抗マウスＣＴＬＡ－４抗体および抗ヒトＰＤ－１抗体（ＲＥＧＮ２８１０）での併用治療の有効性
この実施例は、ＰＤ－１遺伝子についてヒト化されたマウスにおける抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍有効性を記載する。この試験で使用される抗ＰＤ－１抗体は、ＲＥＧＮ２８１０（セミプリマブとしても知られる）であり、米国特許第９，９８７，５００号にＨ４Ｈ７７９８Ｎとして記載される。ＰＤ－１ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０２０３５７９号に記載されている。
ＰＤ－１ｈｕｍ／ｈｕｍノックインマウスに、ＭＣ３８．Ｏｖａ細胞（５ｘ１０５細胞／マウス）を皮下移植した。平均腫瘍サイズが１００ｍｍ３に達したとき（治療の０日目）、マウスを４つの治療群に無作為化した。マウスに、０、３、７、１０、および１４日目に、１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、抗マウスＣＴＬＡ－４－ｍＩｇＧ２ａ抗体（クローン９Ｄ９）、抗ヒトＰＤ－１抗体（ＲＥＧＮ２８１０）、または抗マウスＣＴＬＡ－４および抗ヒトＰＤ－１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ＋１０ｍｇ／ｋｇ）ＩＰのいずれかを投与した。腫瘍体積および無腫瘍動物を最長２２日間モニターした。腫瘍体積は、２２日間にわたって１週間に２回キャリパー測定によってモニターした。抗ＣＴＬＡ－４抗体または抗ＰＤ－１抗体での単剤療法は、アイソタイプ対照での治療と比較して、１０ｍｇ／ｋｇで試験された部分的な腫瘍成長阻害を示した（図９）。これは全ての群において全ての動物が生きていた試験における最後の時点であったため、治療開始後１０日目の個々の腫瘍体積（図１０）を統計分析に使用した。統計的有意性は、試験後のダネットの多重比較での一元配置分散分析によって決定した（＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。抗ＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－１抗体治療の組み合わせは、いずれかの抗体での単剤療法と比較して、より有効な腫瘍成長阻害をもたらし、抗ＰＤ－１治療群よりもコンボ治療群において１０日目に統計的に有意なより小さい腫瘍を有した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、図１０）。抗ＣＴＬＡ－４治療群における８匹の動物のうちの１匹およびコンボ治療群における８匹の動物のうちの２匹は、２２日目までに無腫瘍となった。抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－１抗体の組み合わせでの治療も、対照群と比較して動物生存率において有意な差をもたらした（マンテル－コックス検定、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、図１１）。抗体治療の結果として体重減少の証拠は観察されなかった。
要約すると、抗ｍＣＴＬＡ－４および抗ＰＤ－１（ＲＥＧＮ２８１０）抗体の組み合わせでの治療は、いずれかの抗体での単剤療法と比較して、腫瘍成長の低減および生存率の改善をもたらした。
実施例９：ヒトＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスにおける定着ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍モデルでのＲＥＧＮ４６５９治療の抗腫瘍有効性
実験設計
６０匹のＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脇腹に、０日目に５ｘ１０５個のＭＣ３８．Ｏｖａ細胞を皮下移植した。１０日目に、１００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する３０匹のマウスを選択し、３つの治療群に無作為化した（Ｎ＝１０／群）。１０、１３、および１７日目に、マウスに以下の抗体：群１、２５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照Ａｂ（ＲＥＧＮ１９３２）、群２、２５ｍｇ／ｋｇの抗ｈＣＴＬＡ－４ Ａｂ（ＲＥＧＮ４６５９、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）、群３、１０ｍｇ／ｋｇの抗ｈＣＴＬＡ－４ Ａｂ（ＲＥＧＮ４６５９、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）を投与した。
全ての抗体は、ＩＰ注射によって投与された。腫瘍体積は、実験の期間（２７日）にわたってキャリパー測定によってモニターされた。
結果
定着ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍のＲＥＧＮ４５６９治療は、部分的な腫瘍成長阻害をもたらした（図１２）。
ＲＥＧＮ４６５９単剤療法は、１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇの両方の用量で、腫瘍成長の低減において同様に有効であった（図１３）。
試験後のテューキーの多重比較での一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、全ての治療群における動物が生きていた最後の日である２１日目の各ＲＥＧＮ４５６９単剤療法群とｈＩｇＧ１アイソタイプ対照群との間の平均腫瘍体積における有意な差（ｐ＜０．０５）を明らかにした（図１３）。
実施例１０：ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスにおける定着皮下ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍のＲＥＧＮ４６５９治療後の腫瘍内および周囲Ｔ細胞の分析
実験設計
４０匹のＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脇腹に、０日目に５ｘ１０５個のＭＣ３８．Ｏｖａ細胞を皮下移植した。１０日目に、１００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する２０匹のマウスを選択し、２つの治療群に無作為化した（Ｎ＝１０／群）。１０および１３日目に、マウスに以下の抗体：群１、２５ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照Ａｂ（ＲＥＧＮ１９３２）、群２、２５ｍｇ／ｋｇの抗ｈＣＴＬＡ－４ Ａｂ（ＲＥＧＮ４６５９、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）を投与した。全ての抗体は、ＩＰ注射によって投与した。腫瘍体積は、キャリパー測定によってモニターした。１７日目に、腫瘍がｈＩｇＧ１群において３５５＋／－３５ｍｍ３（平均＋／－ＳＥＭ）、ＲＥＧＮ４６５９治療群において１８０＋／－４３ｍｍ３（平均＋／－ＳＥＭ）に達したとき、全てのマウスを屠殺した。腫瘍および脾臓は、フローサイトメトリーによるリンパ球分析のために採取した。腫瘍および脾臓の単一細胞懸濁液を調製した。細胞を、ＦｃｇＲＩＩｂおよびＦｃｇＲＩＩＩへのＦｃ結合をブロックする２４Ｇ．２（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）で処理し、その後、生存率についてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、次いでＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｃ９０．２（クローン３０－Ｈ１２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４（ＧＫ１．５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、およびヒトＣＴＬＡ－４（クローンＢＮＩ３、ＢＤ）に対する抗体のカクテルで染色した。細胞内染色について、試料を固定し、透過処理し、ＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ－１６ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヒトＣＴＬＡ－４に対する抗体で染色した。次いで、試料をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏフローサイトメーター（ＢＤ）で分析した。
結果
Ｔ細胞サブセットを、移植およびＲＥＧＮ４６５９抗体治療後１７日目のＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍保有マウスの腫瘍および脾臓において分析した。腫瘍部位および脾臓における周囲でのＴｅｆｆおよびＴｒｅｇ集団の評価は、ｈＩｇＧ１アイソタイプを有するＲＥＧＮ４６５９（配列番号５０９はＨ１Ｈ１９３０３Ｐの完全長重鎖アミノ酸配列であり、ＲＥＧＮ４６５９としても知られる）が、ＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍保有ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスにおける治療抗体の２回のみ投与後の腫瘍部位においてＴｒｅｇの低減を媒介することを示した（表１２）。ＣＤ４＋エフェクター細胞およびＣＤ８＋細胞の増殖は腫瘍部位で観察されるが、ＲＥＧＮ４６５９での治療は脾臓においてＴｒｅｇを増殖した。これらのデータは、ＲＥＧＮ４６５９が、腫瘍内エフェクターＴ細胞の活性化に伴って腫瘍内Ｔｒｅｇを選択的に低減させることによって、ＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスにおけるＭＣ３８．Ｏｖａ腫瘍モデルで抗腫瘍活性を促進することを示す。脾臓ＴｒｅｇまたはＴエフェクター細胞と比較した腫瘍内Ｔｒｅｇ数に対するＲＥＧＮ４６５９の異なる結果は、ＣＴＬＡ－４の発現レベルの差に起因し得る。この疑問に答えるために、Ｔ細胞
上でのＣＴＬＡ－４発現レベル（表面および細胞内）をｈＩｇＧ１対照治療群からのＦＡＣＳによって測定した。腫瘍内Ｔｒｅｇでの総ＣＴＬＡ－４の発現は、腫瘍内ＣＤ８＋およびＣＤ４＋エフェクター細胞よりも約３倍高く、脾臓からのＴｒｅｇよりも約８倍高かった（図１４）。発現のこの差は、マウスＦｃｇ受容体に対するヒトＩｇＧ１定常領域を有する抗体の高い結合親和性を考慮すると、ＦｃｇＲ依存メカニズムによる腫瘍Ｔｒｅｇの選択的喪失を説明し得る。
Figure 2023113893000018
表１３は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－（ＣＤ４＋エフェクター）であるＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ、ＣＤ８＋であるＣＤ４５＋のパーセンテージ、およびＦｏｘＰ３＋（ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ）であるＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示す。対応のないｔ検定分析は、ＲＥＧＮ４６５９群とアイソタイプ対照治療群との間での腫瘍におけるＣＤ４＋エフェクター、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ、ならびに膵臓におけるＣＤ４＋エフェクターおよびＣＤ４＋Ｔｒｅｇの有意な差を明らかにした（＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
実施例１１：ＲＥＧＮ４６５９で治療された腫瘍保有マウスの脾臓におけるＴ細胞機能および全体的な全身性免疫活性化の変化
実験設計
２０匹のＣＴＬＡ－４ｈｕｍ／ｈｕｍマウスの脇腹に、０日目に５ｘ１０５個のＭＣ３８．Ｏｖａ細胞を皮下移植し、２つの治療群に無作為化した（Ｎ＝９／群）。３、７、１１、１４、および１７日目に、マウスに１０ｍｇ／ｋｇのｈＩｇＧ１アイソタイプ対照Ａｂ（ＲＥＧＮ１９３２）または１０ｍｇ／ｋｇの抗ｈＣＴＬＡ－４ Ａｂ（ＲＥＧＮ４６５９、Ｈ１Ｈ１９３０３Ｐ）のいずれかを投与した。全ての抗体は、ＩＰ注射によって投与された。腫瘍体積は、キャリパー測定によってモニターした。２４日目（腫瘍が大きくなりすぎたとき）から開始して３７日目（実験の終わり）までにマウスを屠殺した。ＲＥＧＮ４６５９群において、９匹中８匹のマウスが無腫瘍となったが、対照群において、２４日目に無腫瘍のマウスはいなかった。マウス遺伝子の発現レベル（マウスシクロフィリンＢ ＲＮＡ発現に正規化）をＴａｑｍａｎリアルタイムＰＣＲによって測定した。対応のないｔ検定は、アイソタイプ対照群と比較してＲＥＧＮ４６５９群におけるＦｏｘＰ３、ＣＤ３ｅ、パーフォリン、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２の相対レベルの統計的に有意な増加を示した。
結果
ＲＥＧＮ４６５９治療マウスの脾臓のＴａｑｍａｎ分析は、ＦｏｘＰ３、ＣＤ３ｅ、パーフォリン、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２についての転写レベルの増加を明らかにし、ＲＥＧＮ４６５９のＴ細胞エフェクター機能および全体的な免疫増強機能の
増加を示した。マウス遺伝子の発現レベル（マウスシクロフィリンＢ ＲＮＡ発現に正規化）を表１４に示す。対応のないｔ検定は、アイソタイプ対照群と比較してＲＥＧＮ４６５９群におけるＦｏｘＰ３、ＣＤ３ｅ、パーフォリン、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２の相対レベルの統計的に有意な増加を示した。
Figure 2023113893000019
実施例１２：進行性または転移性非小細胞肺癌を有する患者の治療における、セミプリマブ（抗ＰＤ－１抗体）と組み合わせた抗ＣＴＬＡ－４抗体（ＲＥＧＮ４６５９）のヒト臨床試験
この試験は、進行性または転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療におけるＲＥＧＮ４６５９（すなわち、実施例１～７および９～１１のＨ１Ｈ１９３０３Ｐ）単独、高用量セミプリマブ単独（コホートＣ）、およびＲＥＧＮ４６５９とセミプリマブとの組み合わせを評価する非盲検、フェーズＩ、ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）試験である。試験は、用量漸増フェーズおよび用量拡大フェーズの両方を含む。
セミプリマブ（ＲＥＧＮ２８１０、実施例８）は、ＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２との相互作用を強力にブロックする、ＰＤ－１受容体に対する高親和性、完全ヒト、ヒンジ安定化ＩｇＧ４Ｐ抗体である。
試験目的
用量漸増フェーズの主な目的は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する治療経験のある患者における、ＲＥＧＮ４６５９単独、高用量セミプリマブ単独、およびＲＥＧＮ４６５９とセミプリマブとの組み合わせの安全性、忍容性、および薬物動態（ＰＫ）を評価することである。用量拡大フェーズの主な目的は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法の経験があるＮＳＣＬＣ患者における客観的奏効率（ＯＲＲ）によって測定されるＲＥＧＮ４６５９とセミプリマブとの組み合わせの予備的な抗腫瘍活性を評価することと、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法の経験があるＮＳＣＬＣ患者におけるＲＥＧＮ４６５９およびセミプリマブの安全性、忍容性、およびＰＫを評価することである。
試験の二次的な目的は、（ｉ）用量漸増フェーズにおいてＮＳＣＬＣを有する治療の経験がある患者におけるＯＲＲによって測定される高用量セミプリマブ単剤療法およびＲＥＧＮ４６５９とセミプリマブとの組み合わせの予備的な抗腫瘍活性を評価することと、（ｉｉ）用量漸増および拡大中の複数の基準によってＲＥＧＮ４６５９とセミプリマブとの抗腫瘍活性を評価することと、（ｉｉｉ）ＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞を含む、Ｔ細胞活性化の末梢血バイオマーカーの変化によって測定される、ＲＥＧＮ４６５９およびセミプリマブの全身性薬物動態効果を評価することである。
試験設計
この試験は、進行性または転移性ＮＳＣＬＣの治療におけるＲＥＧＮ４６５９単独、高用量セミプリマブ単独（コホートＣ）、およびＲＥＧＮ４６５９とセミプリマブとの組み
合わせを評価する非盲検、フェーズＩ、ファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）試験である。この試験には２つのフェーズ：ＮＳＣＬＣでの治療経験のある患者（前化学療法および／または抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法）における用量漸増フェーズ、およびＮＳＣＬＣでの抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法経験のある患者における用量拡大フェーズがある。
この試験は、最長２８日のスクリーニング期間（－２８日目～－１日目）、続いて最大１７回の４２日治療サイクル（最長１０２週間の治療）、および２４週間のフォローアップ期間を含む。患者は、１０２週間の治療期間が完了するか、または明白な疾患進行、許容できない毒性、同意の撤回、もしくは別の試験中止基準が満たされるまで、治療を受けるであろう。最短２４週間の治療後、完全奏効（ＣＲ）が確認された患者は、治療を中止し、全ての関連試験評価を進めることを選択してもよい。用量漸増では、医学的に禁忌ではない限り、腫瘍生検が行われると予想される。腫瘍生検は、用量拡大コホートの一部として必須である。応答を経験し、その後進行する患者について、進行時に腫瘍生検が要求されるが、必須ではない。
試験で定義された基準を満たし、定義された来院を続けた後、ＣＲ、部分奏効（ＰＲ）、または安定疾患（ＳＤ）の治療期間を完了後６か月以内に進行する患者は、関連試験適格基準の再確認後に試験治療を再開することができる。患者は、最長１０２週間の追加の療法を受けることができる。再開された用量および薬物（複数可）は、概して、患者に最初に投与されたものと同じか、または依頼者と責任医師との間での議論後に拡大コホート（複数可）について選択される用量レベルであるべきである。
２つの用量のセミプリマブ（１０５０ｍｇ Ｑ３Ｗ）に忍容性があるが、その後ＰＤを示すコホートＣにおける患者は、組み合わされたＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１遮断を使用して応答を得る試みにおいてその時点まで安全に投与される最高の組み合わせ用量のセミプリマブおよびＲＥＧＮ４６５９を添加する選択肢を有するであろう。
用量漸増：８つの用量漸増コホートが計画される。ＲＥＧＮ４６５９の３つの用量レベル（２５、７５、および２５０ｍｇ静脈内［ＩＶ］固定用量）は、Ｑ３Ｗで投与された２つの用量レベル（３５０および１０５０ｍｇＩＶ固定用量）でセミプリマブと組み合わせた３、６、および１２週間毎（Ｑ３Ｗ、Ｑ６Ｗ、Ｑ１２Ｗ）の様々なスケジュールで調査されるであろう。１０５０ｍｇのセミプリマブとの組み合わせコホートを開始する前に、１０５０ｍｇのセミプリマブＱ３Ｗ単剤療法のコホートが調査されるであろう（コホートＣ）。アスタリスクで指定された用量漸増コホート（コホート１＊、２＊、および４＊）について、ＲＥＧＮ４６５９単剤療法の単一導入用量は、セミプリマブとの組み合わせ前にＲＥＧＮ４６４９の安全性を評価するために併用療法に３週間先行するであろう。８つのコホートのうちの６つ（１＊、Ｃ、２＊、２、３、および４＊）は、用量制限毒性（ＤＬＴ）評価に使用されるであろう。ＤＬＴ評価可能なコホートに加えて、２つの追加の用量コホート（５および６）は、それぞれ安全性およびＰＫ／薬学動態評価のために６人の患者を登録するであろう。コホート５および６は、それぞれ、コホート２および３の忍容性が確立された後に登録されるであろう。ＲＥＧＮ４６５９のより高い用量強度（コホート２および３）が忍容性である場合でも、コホート５および６の用量組み合わせは潜在的に興味深い。しかしながら、コホート５および６におけるＲＥＧＮ４６５９のより低い曝露のために、コホート２および３が忍容性である場合、これらのコホートはＤＬＴ評価を必要としないであろう。６人の患者が登録されるコホートＣを除き、各用量コホートにおいて最低３人の患者がＤＬＴについて評価可能となる必要があるであろう。患者の安全性を維持しながらフェーズ１用量漸増の効率を最大化するために、ＤＬＴについて評価可能となる前に患者が中止する場合に備えて、各用量コホート（コホートＣを除く）には４人の患者が登録されるであろう。コホート３および６（高用量セミプリマブとの組み合わせ
コホート）は、コホートＣにおける６人の患者全員がＤＬＴ期間を完了するまで開始されないであろう。組み合わせの最大耐量（ＭＴＤ）が達成されるか、または全ての用量コホートが試験されるまで、用量漸増は、用量コホートを通して進行するであろう。しかしながら、用量漸増の完了前であっても、任意のコホートについて忍容性および薬物動態活性が評価されたら、用量コホート（複数可）は拡大について選択され得る。
用量制限毒性：（試験薬物毒性のために）用量＃２をウィンドウ内で投与することができないことに加えて、ＤＬＴは、疾患進行または併発疾患に明らかに関連すると考えられる事象を除き、以下の試験毒性の発生時に考慮されるであろう。
非血液毒性：
（ｉ）グレード≧２ブドウ膜炎（潜在的なｉｒＡＥとみなされる）
（ｉｉ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）もしくはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）＞正常上限（ＵＬＮ）の５倍、および／または総ビリルビン＞ＵＬＮの３倍肝転移を有する患者について、ベースラインでグレード２の場合、ＡＳＴ、ＡＬＴ、および／または総ビリルビン＞ベースライン値の２倍
（ｉｉｉ）（以下を除く、他の免疫調節性薬物での経験によって定義される）ｉｒＡＥを含む、任意のグレード≧３非血液毒性
（ａ）治療医師によって処方される、最大限の支持療法措置にもかかわらず、持続的（＞７２時間）でない限り、グレード３悪心、嘔吐、または下痢
（ｂ）臨床的に重要ではないとみなされ、有害事象（ＡＥ）の基準を満たさないグレード≧３検査異常
血液毒性：
（ｉ）７日超持続するグレード４好中球減少症
（ｉｉ）グレード４血小板減少症
（ｉｉｉ）出血を伴うグレード３血小板減少症
（ｉｖ）グレード≧３発熱性好中球減少症（発熱≧３８．５℃、および絶対好中球数＜１．０×１０９／Ｌ）または文書化された感染症でのグレード≧３好中球減少症
（ｖ）グレード４貧血症
（ｖｉ）７日超持続するか、または輸血が必要なグレード３貧血症
ＤＬＴ評価後、個々のコホートにおいて安全性の問題が発生する場合、登録は、責任医師と依頼者との間での議論後に一時停止され得る。一時停止を引き起こす安全性の問題には、早期または後期安全性事象が含まれ得る。
用量拡大：用量コホート（複数可）は、忍容性および薬学動態活性（周辺ＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の増加を含むが、これに限定されない）が、拡大されないコホートＣを除く全てのコホートについて評価されると、拡大について選択され得る。用量拡大コホート（複数可）は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を受けながら進行した抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法の経験があるＮＳＣＬＣを有する患者を登録し、この集団における併用療法の忍容性および活性を決定するであろう。ＮＳＣＬＣを有する患者において最適な併用レジメンを特定するために、最大３つの別個の用量レジメンが用量拡大について選択されるであろう。拡大コホート（複数可）は、Ｓｉｍｏｎ ２ステージ設計に基づいて、それぞれ最大２７人の患者を登録するであろう。個々の拡大コホートにおいて安全性の問題が発生する場合、登録は、責任医師と依頼者との間での議論後に一時停止され得る。一時停止を引き起こす安全性の問題には、早期または後期安全性事象が含まれ得る。
試験期間
試験の期間は、スクリーニング期間または追跡期間を含まず、約１０２週間である。
集団
サンプルサイズ：最大約５３人の成人患者が用量漸増中に登録されると予想され、各コホートにおける最大２７人の患者に対するが最大３つの拡大コホートは、米国において最大約１５部位での用量拡大中に登録されると予想される。登録される患者の総数は、用量漸増中に観察されたＤＬＴ、ＰＫ／薬物動態分析、開いた拡大コホートの数、およびＳｉｍｏｎ ２ステージ拡大コホートのステージ１における有効性に依存するであろう。
対象集団：この試験の対象集団は、切除不能なＩＩＩＢ期またはＩＶ期扁平上皮または非扁平上皮ＮＳＣＬＣと診断された≧１８歳の男性および女性である。
参加基準：患者は、試験における参加に適格であるために以下の基準を満たさなければならない。
１．男性および女性≧１８歳
２．組織学的または細胞学的に文書化された扁平上皮または非扁平上皮ＮＳＣＬＣを有し、切除不能なＩＩＩＢ期またはＩＶ期の疾患を有する患者
３．用量漸増（コホートＣを除く）：２つ以下の細胞毒性化学療法を含む３つ以下の全身療法を受けたことがあり、臨床的利益をもたらすことが期待される利用可能な療法がない、治療経験のある患者前ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法を受けた患者は、治療関連ＡＥのために永久的に中止したことがあってはならない。標的化可能な突然変異（上皮成長因子受容体［ＥＧＦＲ］、ＡＬＫ、およびＲＯＳ１を含む）を有する患者は、用量漸増中に許容されるが、少なくとも１つの標的療法を追加で受けていなければならない。
ａ．注：１）アジュバントもしくはネオアジュバント化学療法または免疫療法（手術および／または放射線療法後）または２）ＩＩＩ期疾患のための後続免疫療法あり、もしくはなしでの根治的化学放射線療法が許容され、療法を完了して６ヶ月超後に再発性または転移性疾患を発症した患者における療法の選択肢を評価する際には含まれない。
４．用量漸増コホートＣ：プラチナダブレット含有レジメンを含む１～２つの前細胞毒性化学療法を受けたことがある抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ナイーブ患者標的化可能な突然変異（ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、およびＲＯＳ１を含む）を有する患者は、用量漸増中に許容されるが、少なくとも１つの標的療法を追加で受けていなければならない。
ａ．注：１）アジュバントもしくはネオアジュバント化学療法または２）ＩＩＩ期疾患のための根治的化学放射線療法が許容され、療法を完了して６ヶ月超後に再発性または転移性疾患を発症した患者における療法の選択肢を評価する際には含まれない。
５．拡大コホート（複数可）：ＩＩＩ期もしくはＩＶ期疾患のための療法を受けている間、または療法を中止してから６か月以内に進行した、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の経験がある患者は、治療関連ＡＥのために抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を永久的に中止したことがあってはならない。患者は、１つの抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法を受けていなければならない。患者はまた、１つの化学療法を受けていてもよい。以下の注記に記載される場合を除き、化学療法および免疫療法の前併用は、いずれの療法の追加治療も受けていない限り許容される。
ａ．注：１）アジュバントもしくはネオアジュバント化学療法または免疫療法（手術および／または放射線療法後）または２）ＩＩＩ期疾患のための後続免疫療法あり、もしくはなしでの根治的化学放射線療法が許容され、療法を完了して６ヶ月超後に再発性または転移性疾患を発症した患者における療法の選択肢を評価する際には含まれない。
６．以前に照射されていないアーカイブまたは新しく取得されたホルマリン固定腫瘍組織７．拡大コホート（複数可）：ＲＥＣＩＳＴ １．１基準によるコンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって少なくとも１つのＸ線で測定可能な病変標的病変は、その部位に文書化された（Ｘ線撮影された）疾患の進行がある場合、以前に照射されたフィールドに位置していてもよい。
８．Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス≦１
９．少なくとも３か月の予測される余命
１０．以下に定義される適切な臓器および骨髄機能：
ヘモグロビン≧９．０ｇ／ｄＬ（注：スクリーニング検査評価前の１４日以内にヘモグロビン＜９．０ｇ／ｄＬの輸血を受けた患者は適格ではない）
絶対好中球数≧１．５×１０９／Ｌ
血小板数≧７５，０００／ｍｍ３
糸球体濾過量（ＧＦＲ）＞３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２
総ビリルビン≦１．５×ＵＬＮ（肝転移の場合≦３×ＵＬＮ）、臨床的に確認されたギルバート症候群と診断された患者を除く
ＡＳＴ）およびＡＬＴ≦３×ＵＬＮまたは肝転移の場合≦５×ＵＬＮ
アルカリホスファターゼ≦２．５×ＵＬＮ（または肝臓もしくは骨転移の場合、≦５．０×ＵＬＮ）
Ｈｙの法則の基準を満たさない（ＡＬＴおよび／またはＡＳＴ＞３×ＵＬＮおよびビリルビン＞２×ＵＬＮ）
１１．クリニック訪問および試験関連手順を順守する意思があり、順守することができる１２．試験患者または法定代理人によって署名されたインフォームドコンセントを提供する
除外基準：以下の基準のいずれかを満たす患者は試験から除外される。
１．拡大コホート（複数可）のみ：生涯で≦１００本のタバコの喫煙として定義される、喫煙したことがない患者
２．活動性または未治療の脳転移または脊髄圧迫中枢神経系（ＣＮＳ）転移が適切に治療され、患者が登録前の少なくとも２週間に（ＣＮＳ治療に関連する残存徴候または症状を除き）神経学的にベースラインまで回復した場合、患者は適格である。患者は、（免疫抑制用量の）コルチコステロイド療法がオフでなければならない。
３．拡大コホート（複数可）のみ：ＥＧＦＲおよびＡＬＫ遺伝子突然変異またはＲＯＳ１融合について陽性と試験された腫瘍を有する患者全ての患者は、腫瘍がＥＧＦＲ突然変異、ＡＬＫ再配列、およびＲＯＳ１融合について評価されるべきある。
４．登録前２週間以内の放射線療法、および放射線による任意のＡＥからベースラインまで回復しなかった
５．抗ＣＴＬＡ－４抗体での前治療を受けた患者
６．インフォームドコンセント前の１年の脳炎、髄膜炎、または抑制されていない発作
７．間質性肺疾患（例えば、特発性肺線維症、組織化肺炎）または管理を補助するために免疫抑制用量のグルココルチコイドを必要とする活動性、非感染性肺臓炎の病歴肺炎が登録前の≧６ヶ月に回復した限り、照射野における放射線肺臓炎の病歴は許容される。
８．免疫関連治療に起因する有害事象（ｉｒＴＥＡＥ）のリスクを示し得る、全身性免疫抑制治療での治療を必要とする重篤な自己免疫疾患の進行中または最近の証拠以下は排除しない：白斑、回復した小児喘息、Ｉ型糖尿病、ホルモン補充のみを必要とする残存甲状腺機能低下症、または全身治療を必要としない乾癬
９．無作為化の１４日以内にコルチコステロイド療法（＞１０ｍｇプレドニゾン／日または同等物）を必要とする状態を有する患者生理学的補充投与は、免疫抑制の目的で投与されていない限り、＞１０ｍｇのプレドニゾン／日または同等物であっても許容される。吸入または局所ステロイドは、自己免疫障害の治療のためではない場合に限り許容される。１０．拡大コホート（複数可）のみ：潜在的に治癒的な療法を受けた非黒色腫皮膚癌、または治療された子宮頸上皮内癌もしくは任意の他の腫瘍を除き、進行中であるか、または治療を必要とする別の悪性腫瘍、および患者は試験参加前の少なくとも２年間完全寛解にあるとみなされ、試験期間中に追加の療法は必要ない
１１．ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎、もしくはＣ型肝炎感染での抑制されていない感染症、または免疫不全の診断
注：
患者は、スクリーニング時にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（
ＨＢＶ）について検査される。
感染を制御している既知のＨＩＶ感染症（自発的にまたは安定した抗ウイルスレジメンで３５０を超える検出不能なウイルス負荷（ＨＩＶ ＲＮＡ ＰＣＲ）およびＣＤ４カウント）を有する患者は許容される。抑制されたＨＩＶ感染症を有する患者について、現地の基準によってモニタリングが行われる。
感染を抑制しているＢ型肝炎（ＨｅｐＢｓＡｇ＋）を有する（血清Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ ＰＣＲが検出限界を下回り、かつＢ型肝炎の抗ウイルス療法を受けている）患者は許容される。抑制された感染症を有する患者は、ＨＢＶ ＤＮＡの定期的なモニタリングを受けなければならない。患者は、試験薬の最終投与を超えて少なくとも６か月間抗ウイルス療法を継続していなければならない。
Ｃ型肝炎ウイルス抗体陽性（ＨＣＶ Ａｂ＋）であり、抑制された感染症（自発的に、または抗ＨＣＶ療法の成功した以前の経過に応じてＰＣＲによって検出不能なＨＣＶ ＲＮＡ）を有する患者は許容される。
１２．試験薬の開始前１４日以内に全身療法を必要とする活動性感染症
１３．試験療法での治療の開始前の少なくとも３か月にベースラインまで回復しなかった免疫調節剤（抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１療法、他のチェックポイント阻害剤療法、およびＰＩ
３Ｋ－δ阻害剤を含むが、これらに限定されない）からの治療関連免疫媒介性ＡＥ発症時点に関係なく、薬剤の永久的な中止を必要とするＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路のブロッカーでの前治療に関連する免疫媒介性ＡＥを経験した場合、患者はセミプリマブでの治療から除外される。注：ホルモン補充で抑制されているあらゆるグレードの甲状腺機能低下症またはＩ型糖尿病の経験がある患者は許容される。
１４．あらゆる時点でのイデラリシブ（ＺＹＤＥＬＩＧ（登録商標））での前治療
１５．現在、別の試験で治療を受けているか、または試験薬剤の試験に参加し、治療を受けたことがあるか、または試験療法の最初の投与の４週間以内に試験デバイスを使用したか、または試験療法の最初の投与の３週間以内に承認された全身療法での治療を受けたか、または試験療法の最初の投与の５つの半減期内に任意の前全身療法を受けたことがあるか、いずれか長いほうである（抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を除く）。以前にベバシズマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、または７日超の半減期を有する他の非免疫調節抗体で治療された患者は、最後の治療から少なくとも２８日が経過した場合、依頼者との議論後に許容される。抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の経験がある患者について、薬物の半減期または承認状況に関係なく、前抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法が、試験療法の最初の投与の３週間以内に行われていることはできない。
１６．計画された試験薬の開始の３０日以内の生ワクチンの接種
１７．最初の投与前の４週間以内の大手術または重篤な外傷
１８．ドキシサイクリンまたは類似の化合物（すなわち、テトラサイクリン）に対する既知の感受性
１９．いずれかのタンパク質治療剤（例えば、組換えタンパク質、ワクチン、静脈内免疫グロブリン、モノクローナル抗体、受容体トラップ）に対する文書化されたアレルギーまたは過敏反応
２０．違法薬物の現行使用を含む、試験の要件を伴う参加を妨げるであろう既知の精神障害または薬物乱用障害
２１．以前の同種幹細胞移植
２２．責任医師の意見として試験への参加が患者の最善の利益にならないであろう任意の医学的状態
２３．妊娠中または授乳中の女性
２４．ベースライン（投与前のサイクル１、１日目）訪問時の血清ｈＣＧ妊娠検査陽性
２５．最初の治療の最初の投与／開始前、試験中、および最後の投与後少なくとも６か月間、非常に効果的な避妊を実施することを望まない、出産の可能性のある性的に活発な男性および女性＊非常に効果的な避妊手段には以下が含まれる：
スクリーニング前の２回以上の月経周期の排卵阻害に関連する組み合わされた（エス
トロゲンおよびプロゲストゲン含有）ホルモン避妊（経口、膣内、経皮）またはプロゲストゲンのみのホルモン避妊（経口、注射、埋め込み）の安定した使用、
子宮内デバイス（ＩＵＤ）、子宮内ホルモン放出システム（ＩＵＳ）、
両側卵管結紮、
精管切除パートナー、
およびまたは性的禁欲†、‡。
＊閉経後の女性は、出産の可能性を考慮しないためには、少なくとも１２ヶ月間にわたって無月経でなければならない。文書化された子宮摘出または卵管結紮を有する女性には、妊娠検査および避妊は必要ない。
†性的禁欲は、試験治療に関連するリスクの全期間中に異性間性交を控えると定義される場合のみ、非常に効果的な方法とみなされる。‡定期禁欲（カレンダー、シンプトサーマル、排卵後法）、抜去（膣外射精）、殺精子剤のみ、および授乳性無月経法（ＬＡＭ）は、許容される避妊法ではない。女性用コンドームおよび男性用コンドームは一緒に使用されるべきではない。
２６．臨床現場試験チームのメンバーおよび／またはその近親者
治療
ＲＥＧＮ４６５９：３つの用量レベル（２５、７５、および２５０ｍｇのＩＶ固定用量）が様々なスケジュール（Ｑ３Ｗ、Ｑ６Ｗ、Ｑ１２Ｗ）で調査されるであろう。
セミプリマブ：Ｑ３Ｗで投与される２つの用量レベル（３５０および１０５０ｍｇのＩＶ固定用量）。
一次エンドポイント
用量漸増フェーズでは：ＤＬＴ、治療中に発現した有害事象（ＴＥＡＥ）、ｉｒＡＥ、重篤な有害事象（ＳＡＥ）、死亡、検査異常率（有害事象共通用語基準［ＣＴＣＡＥ］によるグレード３以上）。
用量拡大フェーズでは：固形腫瘍における奏効評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）１．１に基づく客観的奏効率（ＯＲＲ）、およびＴＥＡＥ、ｉｒＡＥ、ＳＡＥ、死亡、検査異常率（ＣＴＣＡＥによるグレード３以上）。
二次エンドポイント
（ｉ）ＲＥＣＩＳＴ １．１に基づくＯＲＲ（用量漸増）、（ｉｉ）免疫ベース療法に基づくＯＲＲ奏効評価基準（ｉＲＥＣＩＳＴ）、（ｉｉｉ）ＲＥＣＩＳＴ １．１、ｉＲＥＣＩＳＴに基づく最も良好な全奏効（ＢＯＲ）、奏効期間（ＤＯＲ）、疾患制御率、および無増悪生存率（ＰＦＳ）、ならびに（ｉｖ）全生存率（ＯＳ）を含む複数の奏効基準に基づく腫瘍測定。
各用量コホート内でのフローサイトメトリーによる絶対ＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞および他の活性化のマーカーの変化％の定量化。
手順および評価
ＲＥＧＮ４６５９およびセミプリマブの安全性および忍容性は、ＡＥの臨床評価によって、ならびにバイタルサイン（温度、血圧、脈拍、および呼吸）、身体検査（完全および限定）、１２リード心電図（ＥＣＧ）、および標準的な血液、化学、および尿分析を含む検査評価を含む、臨床評価の繰り返し測定によってモニターされるであろう。
抗腫瘍活性は、ＣＴ／ＭＲＩによって評価されるであろう。
血清および抗薬物抗体（抗ＲＥＧＮ４６５９または抗セミプリマブ）試料中の機能的ＲＥＧＮ４６５９および機能的セミプリマブの決定のための血液試料が収集されるであろう。
血清、血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および腫瘍生検が、バイオマーカーの分析のために収集されるであろう。ゲノムＤＮＡ試料が収集されるであろう。ＲＥＧＮ４６５９およびセミプリマブ治療曝露、臨床活動、または基礎疾患に関する推測される薬物動態、予測、および予後バイオマーカーが、血清、血漿、ＰＢＭＣ、および腫瘍組織において調査されるであろう。
統計計画
用量漸増フェーズ：試験の用量漸増フェーズについて正式な統計的仮説はなく、このフェーズの分析は、本質的に記述的かつ探索的であろう。各用量漸増コホート（コホート１＊、２＊、２、３、および４＊）について、改変された３＋３設計（「４＋３」）に基づいて、約３５人のＤＬＴ評価可能な患者が計画される。コホート５および６について１２人の患者が計画される（コホートあたり６人の患者）。これらの用量漸増コホートの実際のサンプルサイズは、文書化されたＤＬＴ、得られたコホートサイズ、および実装された用量レベルの数に依存するであろう。
用量拡大フェーズ：抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫療法の経験があり、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を受けながら進行しているＮＳＣＬＣを有する患者における各拡大コホートについて、これらの患者における利用可能な有効性データがほとんどないため、依頼者は、５％超の測定可能な任意のＯＲＲが臨床的に意味のある治療効果を表すと考える。各拡大コホートについて２７人の患者のサンプルサイズは、５％の片側有意性レベルおよび８０％のパワーでＳｉｍｏｎ ２ステージＭｉｎｉｍａｘ設計を使用して決定される。
一次有効性分析：拡大コホートについてＲＥＣＩＳＴ １．１によって決定される最良の全体的な応答は、両側９５％信頼区間と共に、記述統計を使用して要約されるであろう。
ＯＲＲは、９５％信頼区間と共に、記述統計によって要約されるであろう。ＢＯＲについて評価可能ではない患者は、ノンレスポンダーとみなされるであろう。
拡大コホートについて、レスポンダーの数がＳｉｍｏｎ ２ステージ設計において指定されるレスポンダーの最小数以上である場合、治療は効果的であり、さらなる調査の価値があるとみなされる。
有効性の二次分析には、ｉＲＥＣＩＳＴによって測定されるＯＲＲ、ＤＯＲ、疾患制御率、およびＰＦＳが含まれる。これらの二次有効性エンドポイントは、用量漸増および拡大コホートによって記述的に要約されるであろう。
薬物曝露、ＡＥ、検査データ、およびバイタルサインを含む安全性観察および測定は、表およびリストに要約され、提示されるであろう。
用量漸増段フェーズについて：ＤＬＴ評価期間中に観察されるＤＬＴは、用量コホート毎に要約されるであろう。
結果
用量漸増フェーズでは、ＲＥＧＮ４６５９およびセミプリマブは、治療経験があるＮＳＣＬＣを有する患者において、単独および組み合わせて十分に忍容性があるであろう。用
量拡大フェーズでは、ＲＥＧＮ４６５９は、セミプリマブと組み合わせて十分に忍容性があり、抗ＰＤ－１／ＰＤ－１免疫療法の経験があるＮＳＣＬＣを有する患者において測定可能な抗腫瘍応答を示すであろう。
例示的な実施形態
本発明はまた、以下の項目に関する。
項目１．ヒト細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に結合し、ｈＣＴＬＡ－４とリガンドＢ７－１および／またはリガンドＢ７－２との間の相互作用をブロックする抗体またはその抗原結合断片。
項目２．Ｔ細胞活性化を誘導する、項目１の抗体または抗原結合断片。
項目３．Ｔ細胞が、細胞毒性Ｔ細胞である、項目２の抗体または抗原結合断片。
項目４．Ｔ細胞が、腫瘍浸潤リンパ球である、項目２または３の抗体または抗原結合断片。
項目５．抗体または抗原結合断片が、サルＣＴＬＡ－４に結合する、項目１～４のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目６．抗体または抗原結合断片が、５ｎＭ未満のＥＣ５０でＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する、項目１～５のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目７．抗体または抗原結合断片が、１ｎＭ未満のＥＣ５０でＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する、項目１～６のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目８．抗体または抗原結合断片が、０．５ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する、項目１～７のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目９．０．５ｎＭ未満のＥＣ５０でサルＣＴＬＡ－４発現細胞に結合する、項目１～８のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目１０．完全ヒト抗体である、項目１～９のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目１１．抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１０、（ｂ）配列番号１８および２６、（ｃ）配列番号３４および４２、（ｄ）配列番号５０および５８、（ｅ）配列番号６６および７４、（ｆ）配列番号８２および９０、（ｇ）配列番号９８および１０６、（ｈ）配列番号１１４および１２２、（ｉ）配列番号１３０および１３８、（ｊ）配列番号１４６および１５４、（ｋ）配列番号１６２および１７０、（ｌ）配列番号１７８および１８６、（ｍ）配列番号１９４および２０２、（ｎ）配列番号２１０および２１８、（ｏ）配列番号２２６および２３４、（ｐ）配列番号２４２および２５０、（ｑ）配列番号２５８および２６６、（ｒ）配列番号２７４および２８２、（ｓ）配列番号２９０および２９８、（ｔ）配列番号３０６および２９８、（ｕ）配列番号３１４および３２２、（ｖ）配列番号３３０および３３８、（ｗ）配列番号３４６および３５４、（ｘ）配列番号３６２および３７０、（ｙ）配列番号３７８および３８６、（ｚ）配列番号３９４および４０２、（ａ’）配列番号４１０および４１８、（ｂ’）配列番号４２６および４３４、（ｃ’）配列番号４４２および４５０、（ｄ’）配列番号４５８および４６６、（ｅ’）配列番号４７４および４８２、ならびに（ｆ’）配列番号４９０および４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体とヒトＣＴＬＡ－４への結合について競合する、項目１～１０のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目１２．抗体またはその抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１０、（ｂ）配列番号１８および２６、（ｃ）配列番号３４および４２、（ｄ）配列番号５０および５８、（ｅ）配列番号６６および７４、（ｆ）配列番号８２および９０、（ｇ）配列番号９８および１０６、（ｈ）配列番号１１４および１２２、（ｉ）配列番号１３０および１３８、（ｊ）配列番号１４６および１５４、（ｋ）配列番号１６２および１７０、（ｌ）配列番号１７８および１８６、（ｍ）配列番号１９４および２０２、（ｎ）配列番号２１０および２１８、（ｏ）配列番号２２６および２３４、（ｐ）配列番号２４２および２５０、（
ｑ）配列番号２５８および２６６、（ｒ）配列番号２７４および２８２、（ｓ）配列番号２９０および２９８、（ｔ）配列番号３０６および２９８、（ｕ）配列番号３１４および３２２、（ｖ）配列番号３３０および３３８、（ｗ）配列番号３４６および３５４、（ｘ）配列番号３６２および３７０、（ｙ）配列番号３７８および３８６、（ｚ）配列番号３９４および４０２、（ａ’）配列番号４１０および４１８、（ｂ’）配列番号４２６および４３４、（ｃ’）配列番号４４２および４５０、（ｄ’）配列番号４５８および４６６、（ｅ’）配列番号４７４および４８２、ならびに（ｆ’）配列番号４９０および４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む参照抗体と同じヒトＣＴＬＡ－４上のエピトープに結合する、項目１～１１のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目１３．抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、および４９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む、項目１～１２のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片。
項目１４．抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１０、（ｂ）配列番号１８および２６、（ｃ）配列番号３４および４２、（ｄ）配列番号５０および５８、（ｅ）配列番号６６および７４、（ｆ）配列番号８２および９０、（ｇ）配列番号９８および１０６、（ｈ）配列番号１１４および１２２、（ｉ）配列番号１３０および１３８、（ｊ）配列番号１４６および１５４、（ｋ）配列番号１６２および１７０、（ｌ）配列番号１７８および１８６、（ｍ）配列番号１９４および２０２、（ｎ）配列番号２１０および２１８、（ｏ）配列番号２２６および２３４、（ｐ）配列番号２４２および２５０、（ｑ）配列番号２５８および２６６、（ｒ）配列番号２７４および２８２、（ｓ）配列番号２９０および２９８、（ｔ）配列番号３０６および２９８、（ｕ）配列番号３１４および３２２、（ｖ）配列番号３３０および３３８、（ｗ）配列番号３４６および３５４、（ｘ）配列番号３６２および３７０、（ｙ）配列番号３７８および３８６、（ｚ）配列番号３９４および４０２、（ａ’）配列番号４１０および４１８、（ｂ’）配列番号４２６および４３４、（ｃ’）配列番号４４２および４５０、（ｄ’）配列番号４５８および４６６、（ｅ’）配列番号４７４および４８２、ならびに（ｆ’）配列番号４９０および４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む、項目１～１３のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目１５．抗体または抗原結合断片が、（ａ）それぞれ配列番号４、６、８、１２、１４、および１６、（ｂ）それぞれ配列番号２０、２２、２４、２８、３０、および３２、（ｃ）それぞれ配列番号３６、３８、４０、４４、４６、および４８、（ｄ）それぞれ配列番号５２、５４、５６、６０、６２、および６４、（ｅ）それぞれ配列番号６８、７０、７２、７６、７８、および８０、（ｆ）それぞれ配列番号８４、８６、８８、９２、９４、および９６、（ｇ）それぞれ配列番号１００、１０２、１０４、１０８、１１０、および１１２、（ｈ）それぞれ配列番号１１６、１１８、１２０、１２４、１２６、および１２８、（ｉ）それぞれ配列番号１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、および１４４、（ｊ）それぞれ配列番号１４８、１５０、１５２、１５６、１５８、および１６０、（ｋ）それぞれ配列番号１６４、１６６、１６８、１７２、１７４、および１７６、（ｌ）それぞれ配列番号１８０、１８２、１８４、１８８、１９０、および１９２、（ｍ）それぞれ配列番号１９６、１９８、２００、２０４、２０６、および２０８、（ｎ）それぞれ配列番号２１２、２１４、２１６、２２０、２２２、および２２４、（ｏ）それぞれ配列番号２２８、２３０、２３２、２３６、２３８、および２４０、（ｐ）それぞれ配列番
号２４４、２４６、２４８、２５２、２５４、および２５６、（ｑ）それぞれ配列番号２６０、２６２、２６４、２６８、２７０、および２７２、（ｒ）それぞれ配列番号２７６、２７８、２８０、２８４、２８６、および２８８、（ｓ）それぞれ配列番号２９２、２９４、２９６、３００、３０２、および３０４、（ｔ）それぞれ配列番号３０８、３１０、３１２、３００、３０２、および３０４、（ｕ）それぞれ配列番号３１６、３１８、３２０、３２４、３２６、および３２８、（ｖ）それぞれ配列番号３３２、３３４、３３６、３４０、３４２、および３４４、（ｗ）それぞれ配列番号３４８、３５０、３５２、３５６、３５８、および３６０、（ｘ）それぞれ配列番号３６４、３６６、３６８、３７２、３７４、および３７６、（ｙ）それぞれ配列番号３８０、３８２、３８４、３８８、３９０、および３９２、（ｚ）それぞれ配列番号３９６、３９８、４００、４０４、４０６、および４０８、（ａ’）それぞれ配列番号４１２、４１４、４１６、４２０、４２２、および４２４、（ｂ’）それぞれ配列番号４２８、４３０、４３２、４３６、４３８、および４４０、（ｃ’）それぞれ配列番号４４４、４４６、４４８、４５２、４５４、および４５６、（ｄ’）それぞれ配列番号４６０、４６２、４６４、４６８、４７０、および４７２、（ｅ’）それぞれ配列番号４７６、４７８、４８０、４８４、４８６、および４８８、ならびに（ｆ’）それぞれ配列番号４９２、４９４、４９６、５００、５０２、および５０４からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインを含む、項目１～１４のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目１６．抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１０、（ｂ）配列番号１８および２６、（ｃ）配列番号３４および４２、（ｄ）配列番号５０および５８、（ｅ）配列番号６６および７４、（ｆ）配列番号８２および９０、（ｇ）配列番号９８および１０６、（ｈ）配列番号１１４および１２２、（ｉ）配列番号１３０および１３８、（ｊ）配列番号１４６および１５４、（ｋ）配列番号１６２および１７０、（ｌ）配列番号１７８および１８６、（ｍ）配列番号１９４および２０２、（ｎ）配列番号２１０および２１８、（ｏ）配列番号２２６および２３４、（ｐ）配列番号２４２および２５０、（ｑ）配列番号２５８および２６６、（ｒ）配列番号２７４および２８２、（ｓ）配列番号２９０および２９８、（ｔ）配列番号３０６および２９８、（ｕ）配列番号３１４および３２２、（ｖ）配列番号３３０および３３８、（ｗ）配列番号３４６および３５４、（ｘ）配列番号３６２および３７０、（ｙ）配列番号３７８および３８６、（ｚ）配列番号３９４および４０２、（ａ’）配列番号４１０および４１８、（ｂ’）配列番号４２６および４３４、（ｃ’）配列番号４４２および４５０、（ｄ’）配列番号４５８および４６６、（ｅ’）配列番号４７４および４８２、ならびに（ｆ’）配列番号４９０および４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、項目１～１５のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目１７．（ａ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３１４、３３０、３４６、３６２、３７８、３９４、４１０、４２６、４４２、４５８、４７４、および４９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３２２、３３８、３５４、３７０、３８６、４０２、４１８、４３４、４５０、４６６、４８２、および４９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）のＣＤＲと、を含む、抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片。
項目１８．抗体が、（ａ）配列番号２および１０、（ｂ）配列番号１８および２６、（ｃ）配列番号３４および４２、（ｄ）配列番号５０および５８、（ｅ）配列番号６６および７４、（ｆ）配列番号８２および９０、（ｇ）配列番号９８および１０６、（ｈ）配列番号１１４および１２２、（ｉ）配列番号１３０および１３８、（ｊ）配列番号１４６および１５４、（ｋ）配列番号１６２および１７０、（ｌ）配列番号１７８および１８６、
（ｍ）配列番号１９４および２０２、（ｎ）配列番号２１０および２１８、（ｏ）配列番号２２６および２３４、（ｐ）配列番号２４２および２５０、（ｑ）配列番号２５８および２６６、（ｒ）配列番号２７４および２８２、（ｓ）配列番号２９０および２９８、（ｔ）配列番号３０６および２９８、（ｕ）配列番号３１４および３２２、（ｖ）配列番号３３０および３３８、（ｗ）配列番号３４６および３５４、（ｘ）配列番号３６２および３７０、（ｙ）配列番号３７８および３８６、（ｚ）配列番号３９４および４０２、（ａ’）配列番号４１０および４１８、（ｂ’）配列番号４２６および４３４、（ｃ’）配列番号４４２および４５０、（ｄ’）配列番号４５８および４６６、（ｅ’）配列番号４７４および４８２、ならびに（ｆ’）配列番号４９０および４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対の重鎖および軽鎖ＣＤＲを含む、項目１７の抗体または抗原結合断片。
項目１９．抗体または抗原結合断片が、（ａ）それぞれ配列番号４、６、８、１２、１４、および１６、（ｂ）それぞれ配列番号２０、２２、２４、２８、３０、および３２、（ｃ）それぞれ配列番号３６、３８、４０、４４、４６、および４８、（ｄ）それぞれ配列番号５２、５４、５６、６０、６２、および６４、（ｅ）それぞれ配列番号６８、７０、７２、７６、７８、および８０、（ｆ）それぞれ配列番号８４、８６、８８、９２、９４、および９６、（ｇ）それぞれ配列番号１００、１０２、１０４、１０８、１１０、および１１２、（ｈ）それぞれ配列番号１１６、１１８、１２０、１２４、１２６、および１２８、（ｉ）それぞれ配列番号１３２、１３４、１３６、１４０、１４２、および１４４、（ｊ）それぞれ配列番号１４８、１５０、１５２、１５６、１５８、および１６０、（ｋ）それぞれ配列番号１６４、１６６、１６８、１７２、１７４、および１７６、（ｌ）それぞれ配列番号１８０、１８２、１８４、１８８、１９０、および１９２、（ｍ）それぞれ配列番号１９６、１９８、２００、２０４、２０６、および２０８、（ｎ）それぞれ配列番号２１２、２１４、２１６、２２０、２２２、および２２４、（ｏ）それぞれ配列番号２２８、２３０、２３２、２３６、２３８、および２４０、（ｐ）それぞれ配列番号２４４、２４６、２４８、２５２、２５４、および２５６、（ｑ）それぞれ配列番号２６０、２６２、２６４、２６８、２７０、および２７２、（ｒ）それぞれ配列番号２７６、２７８、２８０、２８４、２８６、および２８８、（ｓ）それぞれ配列番号２９２、２９４、２９６、３００、３０２、および３０４、（ｔ）それぞれ配列番号３０８、３１０、３１２、３００、３０２、および３０４、（ｕ）それぞれ配列番号３１６、３１８、３２０、３２４、３２６、および３２８、（ｖ）それぞれ配列番号３３２、３３４、３３６、３４０、３４２、および３４４、（ｗ）それぞれ配列番号３４８、３５０、３５２、３５６、３５８、および３６０、（ｘ）それぞれ配列番号３６４、３６６、３６８、３７２、３７４、および３７６、（ｙ）それぞれ配列番号３８０、３８２、３８４、３８８、３９０、および３９２、（ｚ）それぞれ配列番号３９６、３９８、４００、４０４、４０６、および４０８、（ａ’）それぞれ配列番号４１２、４１４、４１６、４２０、４２２、および４２４、（ｂ’）それぞれ配列番号４２８、４３０、４３２、４３６、４３８、および４４０、（ｃ’）それぞれ配列番号４４４、４４６、４４８、４５２、４５４、および４５６、（ｄ’）それぞれ配列番号４６０、４６２、４６４、４６８、４７０、および４７２、（ｅ’）それぞれ配列番号４７６、４７８、４８０、４８４、４８６、および４８８、ならびに（ｆ’）それぞれ配列番号４９２、４９４、４９６、５００、５０２、および５０４からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３ドメインを含む、項目１７または１８の抗体または抗原結合断片。
項目２０．抗体または抗原結合断片が、（ａ）配列番号２および１０、（ｂ）配列番号１８および２６、（ｃ）配列番号３４および４２、（ｄ）配列番号５０および５８、（ｅ）配列番号６６および７４、（ｆ）配列番号８２および９０、（ｇ）配列番号９８および１０６、（ｈ）配列番号１１４および１２２、（ｉ）配列番号１３０および１３８、（ｊ）配列番号１４６および１５４、（ｋ）配列番号１６２および１７０、（ｌ）配列番号１７８および１８６、（ｍ）配列番号１９４および２０２、（ｎ）配列番号２１０および２
１８、（ｏ）配列番号２２６および２３４、（ｐ）配列番号２４２および２５０、（ｑ）配列番号２５８および２６６、（ｒ）配列番号２７４および２８２、（ｓ）配列番号２９０および２９８、（ｔ）配列番号３０６および２９８、（ｕ）配列番号３１４および３２２、（ｖ）配列番号３３０および３３８、（ｗ）配列番号３４６および３５４、（ｘ）配列番号３６２および３７０、（ｙ）配列番号３７８および３８６、（ｚ）配列番号３９４および４０２、（ａ’）配列番号４１０および４１８、（ｂ’）配列番号４２６および４３４、（ｃ’）配列番号４４２および４５０、（ｄ’）配列番号４５８および４６６、（ｅ’）配列番号４７４および４８２、ならびに（ｆ’）配列番号４９０および４９８からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、項目１７～１９のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目２１．抗体が、配列番号５０９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５１０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、項目１７～２０のいずれか１つの抗体または抗原結合断片。
項目２２．項目１～２１のいずれか１つの抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
項目２３．項目１～２１のいずれか１つに記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
項目２４．項目１～２１のいずれか１つに記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
項目２５．項目２３のポリヌクレオチドおよび／または項目２４のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
項目２６．項目２５のベクターを発現する、宿主細胞。
項目２７．阻害を必要とする対象における腫瘍または腫瘍細胞の成長を阻害するための使用のための、項目１～２１のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、または項目２２の薬学的組成物。
項目２８．腫瘍が、原発性または再発性腫瘍である、項目２７に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目２９．腫瘍が、定着腫瘍である、項目２７に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３０．腫瘍が、血液癌、脳癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、腎臓癌、子宮頸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、骨髄腫、および黒色腫からなる群から選択される疾患または障害を有する対象に存在する、項目２７～２９のいずれか１つに記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３１．抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物が、初回用量として投与され、続いて１つ以上の二次用量が投与され、各二次用量が、直前の用量の１～１２週間後に投与される、項目２７～３０のいずれか１つに記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３２．抗体もしくはその抗原結合断片または薬学的組成物が、約２５～６００ｍｇの用量で対象に投与される、項目３１に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３３．抗体またはその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて対象に投与される、項目２７～３２のいずれか１つに記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３４．第２の治療剤が、ＬＡＧ３阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、ウイルス感染細胞抗原に対する抗体、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ２０およびＣＤ３に対する二重特異性抗体、酸化防止剤などの栄養補助剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト、癌ワクチン、化学療法剤、細胞毒性剤、放射線、手術、ならびに疾患または障害に関連する少なくとも１つの症状を改善するために有用な任意の他の療法からなる群から選択される、項目３３に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、また
は薬学的組成物。
項目３５．第２の治療剤が、ＰＤ－１阻害剤である、項目３３または３４に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３６．ＰＤ－１阻害剤が、セミプリマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである、項目３３～３５のいずれか１つに記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３７．ＰＤ－１阻害剤が、対象の体重の１、３、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、項目３６に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３８．ＰＤ－１阻害剤が、５０～１２００ｍｇの用量で投与される、項目３３～３５のいずれか１つに記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目３９．抗体もしくはその抗原結合断片または薬学的組成物が、皮下、静脈内、腫瘍内、腫瘍周囲、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内に投与される、項目２７～３８のいずれか１つに記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目４０．治療を必要とする対象においてＣＴＬＡ－４をアンタゴナイズすることによって治療可能である疾患または障害の治療における使用のための、項目１～２１のいずれか１つの抗体もしくはその抗原結合断片、または項目２２の薬学的組成物。
項目４１．疾患または障害が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）からなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる慢性ウイルス感染症である、項目４０に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目４２．疾患または障害が、血液癌、脳癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮頸癌、胃癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される、項目４０に記載の使用のための、抗体もしくはその抗原結合断片、または薬学的組成物。
項目４３．抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、抗体またはその抗原結合断片の産生を可能にする条件下で項目２６の宿主細胞を成長させることと、そのように産生された抗体またはその抗原結合断片を回収することと、を含む、方法。
項目４４．許容される担体を含む薬学的組成物として抗体またはその抗原結合断片を製剤化することをさらに含む、項目４３の方法。
項目４５．治療を必要とする対象での非小細胞肺癌の治療における抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた使用のための抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片。
項目４６．抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片が、項目１～２１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片である、項目４５に記載の使用のための抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片。
項目４７．抗ＣＴＬＡ－４抗体が、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲと、配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲと、を含む、項目４５または４６に記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目４８．抗ＣＴＬＡ－４抗体が、配列番号１９６の配列のＨＣＤＲ１、配列番号１９８の配列のＨＣＤＲ２、配列番号２００のＨＣＤＲ３、配列番号２０４の配列のＬＣＤＲ１、配列番号２０６の配列のＬＣＤＲ２、および配列番号２０８の配列のＬＣＤＲ３を含む、項目４５～４７のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目４９．抗ＣＴＬＡ－４抗体が、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、項目４５～４８のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５０．抗ＣＴＬＡ－４抗体が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、項目４５～４９のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５１．抗ＣＴＬＡ－４抗体が、配列番号５０９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５１０のアミノ酸配列の軽鎖と、を含む、項目４５～５０のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５２．抗ＰＤ－１抗体が、セミプリマブである、項目４５～５１のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５３．抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片が、２５～６００ｍｇの用量で投与される、項目４５～５２のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５４．抗ＰＤ－１抗体が、５０～１２００ｍｇの用量で投与される、項目４５～５３のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５５．抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片が、初回用量として投与され、続いて１つ以上の二次用量が投与され、各二次用量が、直前の用量の１～１２週間後に投与される、項目４５～５４のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５６．非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が、進行性または転移性ＮＳＣＬＣである、項目４５～５５のいずれか１つに記載の使用のための抗体またはその抗原結合断片。
項目５７．治療を必要とする対象での非小細胞肺癌の治療における抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた使用のための、項目２２の薬学的組成物。
本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な変更が前述の記載から当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (53)

  1. 細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）内に含有される３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）内に含有される３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含む、抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗体または抗原結合断片が、それぞれ配列番号１９６、１９８、２００、２０４、２０６、および２０８のアミノ酸配列からなるＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合断片。
  3. 前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１９４／２０２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む、請求項２に記載の抗体または抗原結合断片。
  4. 前記抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 前記抗体またはその抗原結合断片が、完全ヒト抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. 重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号５０９のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 重鎖および軽鎖を含み、前記軽鎖が、配列番号５１０のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  9. 重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖が、配列番号５０９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖が、配列番号５１０のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 配列番号５０９のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号５１０のアミノ酸配列を有する軽鎖と、を含む、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
  11. ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその抗原結合断片が、ＨＣＶＲの３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）と、ＬＣＶＲの３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）と、を含み、前記ＨＣＶＲが、
    （ｉ）配列番号１９４のアミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１９４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
    （ｉｖ）最大１０個のアミノ酸置換を有する配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、
    前記ＬＣＶＲが、
    （ｖ）配列番号２０２のアミノ酸配列、
    （ｖｉ）配列番号２０２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
    （ｖｉｉ）配列番号２０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
    （ｖｉｉｉ）最大１０個のアミノ酸置換を有する配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合断片。
  12. 前記抗体またはその抗原結合断片が、最大１０個のアミノ酸置換を有する配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  13. 前記抗体またはその抗原結合断片が、最大１０個のアミノ酸置換を有する配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  14. 前記ＨＣＶＲが、配列番号１９４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  15. 前記ＬＣＶＲが、配列番号２０２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  16. 前記ＨＣＶＲが、配列番号１９４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  17. 前記ＬＣＶＲが、配列番号２０２と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  18. ＨＣＤＲ１が、配列番号１９６のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号１９６とは異なるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号１９８のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号１９８とは異なるアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号２００のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２００とは異なるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０４のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２０４とは異なるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２０６のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２０６とは異なるアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号２０８のアミノ酸配列または１アミノ酸だけ配列番号２０８とは異なるアミノ酸配列を含む、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  19. ＨＣＤＲ１が、配列番号１９６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が、配列番号１９８のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３が、配列番号２００のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号２０４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が、配列番号２０６のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３が、配列番号２０８のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  20. ＨＣＶＲが、配列番号１９４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＶＲが、配列番号２０２のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  21. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体または希釈剤と、を含む、薬学的組成物。
  22. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗体のＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  23. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗体のＬＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
  24. 請求項２２に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  25. 請求項２４に記載のベクターを発現する、宿主細胞。
  26. 抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片を産生する方法であって、前記抗体または断片の産生を可能にする条件下で、請求項２５に記載の宿主細胞を成長させることと、そのように産生された前記抗体または断片を回収することと、を含む、方法。
  27. 許容される担体を含む薬学的組成物として、前記抗体またはその抗原結合断片を製剤化することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 対象における腫瘍または腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、それを必要とする前記対象に、治療有効量の請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
  29. 前記腫瘍が、原発性または再発性腫瘍である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記腫瘍が、定着腫瘍である、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記腫瘍が、血液癌、脳癌、腎細胞癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、結腸直腸癌、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、および黒色腫からなる群から選択される疾患または障害を有する対象に存在する、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記抗体またはその抗原結合断片が、初回用量として投与され、続いて１つ以上の二次用量が投与され、各二次用量が、直前の用量の１～１２週間後に投与される、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記抗体または抗原結合断片が、約２５～６００ｍｇの用量で投与される、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記抗体またはその抗原結合断片が、第２の治療剤と組み合わせて前記対象に投与される、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記第２の治療剤が、ＰＤ－１阻害剤、腫瘍特異的抗原に対する抗体、ウイルス感染細胞抗原に対する抗体、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＤ２０阻害剤、ＣＤ２０およびＣＤ３に対する二重特異性抗体、酸化防止剤などの栄養補助剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト、化学療法剤、細胞毒性剤、放射線、ＮＳＡＩＤ、コルチコステロイド、ならびに前記疾患または障害に関連する少なくとも１つの症状を改善するために有用な任意の他の療法からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記第２の治療剤が、ＰＤ－１阻害剤である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＰＤ－１阻害剤が、セミプリマブ、ニボルマブ、またはペンブロリズマブである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ＰＤ－１阻害剤が、前記対象の体重の１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＰＤ－１阻害剤が、５０～１２００ｍｇの用量で投与される、請求項３７に記載の方法。
  40. 前記抗体またはその抗原結合断片が、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内に投与される、請求項２８～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 非小細胞肺癌の治療を必要とする対象において非小細胞肺癌を治療する方法であって、前記対象に、（ａ）配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲおよび配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片と、（ｂ）抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片と、を投与することを含む、方法。
  42. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、それぞれ、配列番号１９６－１９８－２００－２０４－２０６－２０８からなる、ＨＣＤＲ１－ＨＣＤＲ２－ＨＣＤＲ３－ＬＣＤＲ１－ＬＣＤＲ２－ＬＣＤＲ３ドメインを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲと、配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲと、を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片が、配列番号５０９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５１０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記抗ＰＤ－１抗体が、セミプリマブである、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片が、２５～６００ｍｇの用量で投与される、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記抗ＰＤ－１抗体が、５０～１２００ｍｇの用量で投与される、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記ＣＴＬＡ－４抗体またはその抗原結合断片が、初回用量として投与され、続いて１つ以上の二次用量が投与され、各二次用量が、直前の用量の１～１２週間後に投与される、請求項４１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記抗体、前記抗原結合断片、または前記薬学的組成物が、抗ＰＤ－１抗体と組み合わせて使用される、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療における使用のための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片、または請求項２１に記載の薬学的組成物。
  51. 前記抗ＣＴＬＡ－４抗体が、配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＣＤＲと、配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲのＣＤＲと、を含む、請求項５０に記載の使用のための抗体もしくはその断片または薬学的組成物。
  52. 前記抗ＰＤ－１抗体が、セミプリマブである、請求項５０または５１に記載の使用のための抗体もしくはその断片または薬学的組成物。
  53. 前記ＮＳＣＬＣが、進行性または転移性ＮＳＣＬＣである、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の使用のための抗体もしくはその断片または薬学的組成物。
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