TW201920267A - 抗ｃｔｌａ－４抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供與細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)結合之抗體及使用方法。在本發明之各種實施例中，所述抗體為與CTLA-4特異性結合之完全人類抗體。在一些實施例中，本發明抗體適用於抑制或中和CTLA-4活性，從而提供一種活化T細胞及/或治療諸如癌症或病毒感染之疾病或病症的手段。

Description

抗CTLA-4抗體及其用途
序列表之參考
本申請案以引用方式併入序列表，所述序列表以在2018年6月29日創建且含有178,018個位元組之檔案10360WO01-Sequence.txt以電腦可讀形式提交。
本發明係關於與免疫調節受體細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)特異性結合的抗體及抗體之抗原結合片段，及使用彼等抗體之治療及診斷方法。
細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4；亦稱為CD152)為在習知調節性T細胞上表現的I型跨膜T細胞抑制性檢查點受體。CTLA-4藉由在與刺激受體CD28競爭與其天然配體B7-1(CD80)及B7-2(CD86)結合的過程中取勝而負調節T細胞活化。初始T細胞活化藉由刺激T細胞受體(T-cell receptor，TCR)來達成，所述T細胞受體識別抗原呈現細胞(antigen-presenting cell，APC)上由I類或II類主要組織相容性複合體(MHCI或MHCII)蛋白質呈現的特異性肽(Goldrath等人1999,Nature 402：255-262)。經活化TCR繼而引發信號傳導事件之級聯，其可藉由經轉染報 導基因之表現監測，由調節各種轉錄因子之表現的啟動子驅動，諸如活化蛋白1(activator-protein 1，AP-1)、活化T細胞核因子(Nuclear Factor of Activated T-cell，NFAT)或核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NFκB)。隨後經由在T細胞上組成性或誘導性表現之共刺激或共抑制受體之參與來進一步改進T細胞反應，所述受體諸如CD28、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、計劃性細胞死亡蛋白1(Programmed Cell Death Protein 1，PD-1)、淋巴細胞活化基因3(Lymphocyte-Activation Gene 3，LAG-3)或其他分子(Sharpe等人2002,Nat.Rev.Immunol.2：116-126)。
輔受體CD28及CTLA-4競爭相同配體：在抗原呈現細胞(APC)上表現之CD80及CD86。CTLA-4對CD80及CD86之結合親和力高於對CD28之結合親和力，充當誘餌且藉由鉗合走配體，引起T細胞活化減弱來抑制CD28之活化(Alegre等人2001,Nat.Rev.Immunol.1：220-228；Walker等人2011,Nat.Rev.Immunol.11：852-863；及Buchbinder等人，2016,American Journal of Clinical Oncology,39：98-106)。
本發明提供結合CTLA-4之抗體及其抗原結合片段。本發明抗體尤其適用於靶向表現CTLA-4之免疫細胞及調節CTLA-4活性。在某些實施例中，本發明抗體適用於抑制或中和CTLA-4活性及/或刺激T細胞活化，例如在T細胞介導之殺死係有利的或所期望的情況下。在某些實施例中，抗體適用於抑制調節T細胞功能及/或再活化耗竭性T細胞。本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合部分可作為多特異性抗原結合分子之一部分而包括，例如用以調節免疫反應及/或使抗體靶向特定細胞類型，諸如腫瘤 細胞或感染細胞。抗體適用於治療諸如癌症及病毒感染之疾病或病症。
本發明抗體可為全長抗體(例如IgG1或IgG4抗體)或可以僅包含抗原結合部分(例如Fab、F(ab')2或scFv片段)，且可經修飾以影響功能性，例如用以消除殘留效應功能(Reddy等人，2000,J.Immunol.164：1925-1933)。在某些實施例中，抗體可為雙特異性的。
在第一態樣中，本發明提供與CTLA-4特異性結合的經分離重組單株抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體為完全人類抗體。
本發明之例示性抗CTLA-4抗體列於本文中之表1及表2中。表1闡述例示性抗CTLA-4抗體之重鏈可變區(heavy chain variable region，HCVR)、輕鏈可變區(light chain variable region，LCVR)、重鏈互補決定區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)及輕鏈互補決定區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)的胺基酸序列識別符號。表2闡述例示性抗CTLA-4抗體之HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3的核酸序列識別符號。
本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR，所述HCVR包括選自表1中所列出之HCVR胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括LCVR，所述LCVR包括選自表1中所列出之LCVR胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR胺基酸序列對(HCVR/LCVR)，所述胺基酸序列對包括表1中所列 出之HCVR胺基酸序列中之任一者及與其配對的表1中所列出之LCVR胺基酸序列中之任一者。根據某些實施例，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包括表1中所列出之例示性抗CTLA-4抗體中之任一者內所含的HCVR/LCVR胺基酸序列對。在某些實施例中，HCVR/LCVR胺基酸序列對選自由以下組成之群：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482及490/498。在某些實施例中，HCVR/LCVR胺基酸序列對選自SEQ ID NO：194/202(例如H1H19303P)或290/298(例如H1H19319P2)中之一者。在某些實施例中，本發明提供抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR，所述HCVR包括表1中所列出之具有至多十個胺基酸取代的胺基酸序列，且所述LCVR包括表1中所列出之具有至多十個胺基酸取代的胺基酸序列。舉例而言，本發明提供抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR，所述HCVR包括SEQ ID NO：194之具有至多十個胺基酸取代的胺基酸序列，且所述LCVR包括SEQ ID NO：202之具有至多十個胺基酸取代的胺基酸序列。在另一例示性實施例中，本發明提供抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR，所述HCVR包括SEQ ID NO：194之具有至少一個胺基酸取代的胺基酸序列，且所述LCVR包括SEQ ID NO：202之具有至少一個胺基酸取代的胺基酸序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈CDR1(HCDR1)，所述重鏈CDR1包括選自表1中所列出之HCDR1胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈CDR2(HCDR2)，所述重鏈CDR2包括選自表1中所列出之HCDR2胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈CDR3(HCDR3)，所述重鏈CDR3包括選自表1中所列出之HCDR3胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括輕鏈CDR1(LCDR1)，所述輕鏈CDR1包括選自表1中所列出之LCDR1胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括輕鏈CDR2(LCDR2)，所述輕鏈CDR2包括選自表1中所列出之LCDR2胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括輕鏈CDR3(LCDR3)，所述輕鏈CDR3包括選自表1中所列出之LCDR3胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括HCDR3及LCDR3胺基酸序列對(HCDR3/LCDR3)，所述胺基酸序列對包括表1中所列出之HCDR3胺基酸序列中之任一者及與其配對的表1中所列出之LCDR3胺基酸序列中之任一者。根據某些實施例，本發明提供抗體或其抗 原結合片段，其包括表1中所列出之例示性抗CTLA-4抗體中之任一者內所含的HCDR3/LCDR3胺基酸序列對。在某些實施例中，HCDR3/LCDR3胺基酸序列對選自由SEQ ID NO：200/208(例如H1H19303P)及296/304(例如H1H19319P2)組成之群。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR，所述HCVR包括：HCDR1，其包括與表1中所列出之胺基酸序列相差1個胺基酸之胺基酸序列；HCDR2，其包括與表1中所列出之胺基酸序列相差1個胺基酸之胺基酸序列；及HCDR3，其包括與表1中所列出之胺基酸序列相差1個胺基酸之胺基酸序列。在某些實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR，所述LCVR包括：LCDR1，其包括與表1中所列出之胺基酸序列相差1個胺基酸之胺基酸序列；LCDR2，其包括與表1中所列出之胺基酸序列相差1個胺基酸之胺基酸序列；及LCDR3，其包括與表1中所列出之胺基酸序列相差1個胺基酸之胺基酸序列。舉例而言，本發明提供抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR，所述HCVR包括：HCDR1，其包括SEQ ID NO：196之胺基酸序列或與SEQ ID NO：196相差1個胺基酸之胺基酸序列；HCDR2，其包括SEQ ID NO：198之胺基酸序列或與SEQ ID NO：198相差1個胺基酸之胺基酸序列；及HCDR3，其包括SEQ ID NO：200之胺基酸序列或與SEQ ID NO：200相差1個胺基酸之胺基酸序列。在另一例示性實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包括HCVR及LCVR，所述LCVR包括：LCDR1，其包括SEQ ID NO：204之胺基酸序列或與SEQ ID NO：204相差1個胺基酸之胺基酸序列；LCDR2，其包括SEQ ID NO：206之胺基酸序列或與SEQ ID NO：206相差1個胺基酸之胺基酸序列；及LCDR3，其包括SEQ ID NO：208之胺基酸序列或與SEQ ID NO：208相差1個胺基酸之胺 基酸序列。
本發明亦提供抗體或其抗原結合片段，其包括表1中所列出之例示性抗CTLA-4抗體中之任一者內所含的一組六個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些實施例中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組選自由SEQ ID NO：196-198-200-204-206-208(例如H1H19303P)及292-294-296-300-302-304(例如H1H19319P2)組成之群。
在相關實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包括如由表1中所列出之例示性抗CTLA-4抗體中之任一者所定義的HCVR/LCVR胺基酸序列對內所含的一組六個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。舉例而言，本發明包括抗體或其抗原結合片段，其包括選自由SEQ ID NO：194/202(例如H1H19303P)及290/298(例如H1H19319P2)組成之群的HCVR/LCVR胺基酸序列對內所含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組。鑑別HCVR及LCVR胺基酸序列內之CDR的方法及技術為此項技術中所熟知的且可用以鑑別本文所揭示之指定HCVR及/或LCVR胺基酸序列內的CDR。可用於鑑別CDR之邊界的例示性公約包含例如Kabat定義、Chothia定義及AbM定義。一般而言，Kabat定義係基於序列變異性，Chothia定義係基於結構環區域之位置，且AbM定義為Kabat與Chothia方法之間的折中方案。參見例如Kabat,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9268-9272(1989)。公共資料庫亦可用於鑑別抗體內之CDR序列。
本發明包含具有經修飾糖基化模式之抗CTLA-4抗體。在一 些實施例中，用以移除不合需要之糖基化位點的修飾係有用的，或在寡醣鏈上不存在海藻糖部分的抗體，例如用以增加抗體依賴性細胞的細胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)功能(參見Shield等人(2002)JBC 277：26733)。在其他應用中，可進行半乳糖基化修飾以便修飾補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。
本發明包含包括Fc域之抗CTLA-4抗體，其中Fc域包括如本文其他地方所述之IgG1或IgG4同型。
本發明亦提供與包括HCVR之CDR及LCVR之CDR的抗體或其抗原結合片段競爭與CTLA-4特異性結合的抗體及其抗原結合片段，其中HCVR及LCVR各自具有選自表1中所列出之HCVR及LCVR序列的胺基酸序列。
本發明亦提供阻斷CTLA-4與其天然配體(B7-1/CD80及B7-2/CD86)結合的經分離抗體及其抗原結合片段。在一些實施例中，阻斷CTLA-4結合之抗體或其抗原結合片段可以與CTLA-4上與B7-1/CD80及/或B7-2/CD86相同的抗原決定基結合或可以與CTLA-4上與B7-1/CD80及/或B7-2/CD86不同的抗原決定基結合。
本發明亦提供與來自人類或其他物種之CTLA-4特異性結合的抗體及其抗原結合片段。在某些實施例中，抗體可以與人類CTLA-4及/或猴CTLA-4結合。
本發明亦提供與包括HCVR之CDR及LCVR之CDR的參考抗體或其抗原結合片段交叉競爭與CTLA-4結合的抗體及其抗原結合片段，其中HCVR及LCVR各自具有選自表1中所列出之HCVR及LCVR序列的胺基酸序列。
本發明亦提供與包括HCVR之CDR及LCVR之CDR的參考 抗體或其抗原結合片段結合於同一個抗原決定基的抗體及其抗原結合片段，其中HCVR及LCVR各自具有選自表1中所列出之HCVR及LCVR序列的胺基酸序列。在某些實施例中，本發明提供與包括HCVR之CDR及LCVR之CDR的參考抗體或其抗原結合片段結合於同一個抗原決定基的抗體及其抗原結合片段，其中HCVR/LCVR胺基酸序列對具有SEQ ID NO：194/202。
本發明亦包含與人類CTLA-4之細胞外域內所含之一或多個胺基酸相互作用的抗CTLA-4抗體。
在一個實施例中，本發明提供具有以下特徵中之一或多者的重組人類單株抗體或抗原結合片段：(a)與人類CTLA-4及/或食蟹獼猴CTLA-4特異性結合；(b)阻斷CTLA-4與CD80及/或CD86之結合；(c)阻斷CTLA-4誘導之T細胞下調且拯救T細胞信號傳導；及(d)抑止腫瘤生長且增加具有癌症之個體的存活期。
在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段可以促效劑方式與CTLA-4特異性結合，亦即其可以增強或刺激CTLA-4結合及/或活性；在其他實施例中，抗體可以拮抗劑方式與CTLA-4特異性結合，亦即其可以阻斷CTLA-4與其配體結合。
在某些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段為雙特異性的，其包括與CTLA-4之第一結合特異性及對第二目標抗原決定基之第二結合特異性。第二目標抗原決定基可為CTLA-4上或不同蛋白質上的另一抗原決定基。在某些實施例中，第二目標抗原決定基可在不同細胞上，包括不同T細胞、B細胞、腫瘤細胞或病毒感染細胞。
在第二態樣中，本發明提供編碼抗CTLA-4抗體或其部分之核酸分子。舉例而言，本發明提供編碼表1中所列出之HCVR胺基酸序列 中之任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之HCVR核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列出之LCVR胺基酸序列中之任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之LCVR核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列出之HCDR1胺基酸序列中之任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之HCDR1核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列出之HCDR2胺基酸序列中之任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之HCDR2核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列出之HCDR3胺基酸序列中之任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之HCDR3核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列出之LCDR1胺基酸序列中之任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之LCDR1核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列出之LCDR2胺基酸序列中之 任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之LCDR2核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼表1中所列出之LCDR3胺基酸序列中之任一者的核酸分子；在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之LCDR3核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。
本發明亦提供編碼HCVR之核酸分子，其中HCVR包括一組三個CDR(亦即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3胺基酸序列組如由表1中所列出之例示性抗CTLA-4抗體中之任一者所定義。
本發明亦提供編碼LCVR之核酸分子，其中LCVR包括一組三個CDR(亦即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3胺基酸序列組如由表1中所列出之例示性抗CTLA-4抗體中之任一者所定義。
本發明亦提供編碼HCVR及LCVR兩者之核酸分子，其中HCVR包括表1中所列出之HCVR胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列，且其中LCVR包括表1中所列出之LCVR胺基酸序列中之任一者的胺基酸序列。在某些實施例中，核酸分子包括選自表2中所列出之HCVR核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列，及選自表2中所列出之LCVR核酸序列中之任一者的多核苷酸序列或與其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性的大體上相似序列。在某些實施例中，根據本發明之此態樣，核酸分子編碼HCVR及LCVR，其中HCVR及LCVR均 衍生自表1中所列出之同一個抗CTLA-4抗體。
在一相關態樣中，本發明提供重組表現載體，其能夠表現包括抗CTLA-4抗體之重鏈或輕鏈可變區之多肽。舉例而言，本發明包含重組表現載體，其包括以上所提及之核酸分子中之任一者，亦即編碼如表1中所闡述之HCVR、LCVR及/或CDR序列中之任一者的核酸分子。本發明亦提供重組表現載體，其能夠表現包括抗CTLA-4抗體之重鏈或輕鏈之多肽。舉例而言，本發明包含重組表現載體，其包括以上所提及之核酸分子中之任一者，亦即編碼如表1中所闡述之重鏈或輕鏈序列中之任一者的核酸分子。在本發明之範疇內亦包含用以引入此類載體之宿主細胞，以及藉由在允許產生抗體或抗體片段之條件下培養宿主細胞及回收如此產生之抗體及抗體片段來產生抗體或其部分的方法。
在第三態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包括特異性結合CTLA-4之重組人類抗體或其片段及醫藥學上可接受之載劑。在一相關態樣中，本發明之特徵在於一種組合物，其為抗CTLA-4抗體與第二治療劑之組合。在一個實施例中，第二治療劑為任何宜與抗CTLA-4抗體組合之藥劑。宜與抗CTLA-4抗體組合之例示性藥劑包含但不限於其他結合及/或調節CTLA-4信號傳導之藥劑(包含其他抗體或其抗原結合片段等)及/或不直接結合CTLA-4，但是仍然調節免疫細胞活化的藥劑。涉及本發明之抗CTLA-4抗體的其他組合療法及共同調配物揭示於本文其他地方中。
在第四態樣中，本發明提供用以調節個體中之免疫反應的方法，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，本發明提供用以增強個體中之免疫反應的方法，所述方法包括向個體投與有效量之本發明之結合CTLA-4的抗體或其片段。在一個實施例中，本發明提供一種用以刺激或增強個體 中之T細胞活化的方法。在某些實施例中，本發明提供用以拯救T細胞活性之方法，所述方法包括使T細胞與有效量之本發明抗體接觸，使得T細胞活性得到拯救。在一個實施例中，本發明提供用以抑制個體中之調節性T(Treg)細胞之方法，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之本發明之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，有需要之個體可能罹患諸如癌症或病毒感染之疾病或病症。在某些實施例中，本發明提供用以拯救CTLA-4介導之T細胞活性抑制的方法，所述方法包括使T細胞與有效量之本發明抗體接觸。
在第五態樣中，本發明提供使用本發明之抗CTLA-4抗體或抗體之抗原結合部分來治療個體之諸如癌症或病毒感染之疾病或病症的治療方法，其中治療方法包括向有需要之個體投與治療有效量之包括本發明之抗體或抗體片段的醫藥組合物。所治療之病症為任何可藉由刺激或抑制CTLA-4活性或信號傳導而得到改良、改善、抑制或預防的疾病或病況。在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段與第二治療劑組合向有需要之個體投與。第二治療劑可選自由以下組成之群：針對另一T細胞共抑制劑之抗體、針對腫瘤細胞抗原之抗體、針對T細胞受體之抗體、針對病毒感染細胞上之抗原決定基之抗體、細胞毒性劑、抗癌藥、抗病毒藥、消炎藥(例如皮質類固醇)、化學治療劑、放射線療法、手術、免疫抑制劑及此項技術中已知之任何其他藥物或療法。在某些實施例中，若可能出現與本發明之抗體或其抗原結合片段相關的副作用，則第二治療劑可為有助於抵消或減小任何可能的此類副作用的藥劑。
在某些實施例中，本發明提供抑止腫瘤生長之方法。舉例而言，本發明係用於抑止個體中因為原發性腫瘤或轉移性腫瘤而引起之腫瘤生長。在某些實施例中，本發明提供用以提高具有癌症之個體的存活期(例 如無進展存活期或總存活期)的方法。癌症之實例包含但不限於原發性及/或再發性癌症，包含血癌(例如血液科惡性疾病，諸如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病)、腦癌(例如多形性神經膠質母細胞瘤)、肺癌(例如非小細胞肺癌，包含晚期或轉移性NSCLC)、頭頸部鱗狀細胞癌、肝細胞癌、腎細胞癌、黑色素瘤、間皮瘤、卵巢癌、膀胱癌、乳癌、骨癌、結腸直腸癌、腎癌、食道癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、皮膚癌、子宮頸癌、腸癌、前列腺癌及結腸癌。在某些實施例中，本發明提供用於抑制或抑止已建立的腫瘤之生長的方法。方法包括向有需要之個體投與包括治療有效量之本發明之抗CTLA-4抗體的醫藥組合物。在某些實施例中，抗體與選自由以下組成之群的第二治療劑組合投與：計劃性死亡-1(PD-1)抑制劑(例如抗PD-1抗體，諸如納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)或REGN2810)、計劃性死亡配體1(PD-L1)抑制劑(例如抗PD-L1抗體，諸如阿特珠單抗(atezolizumab)、阿瓦魯單抗(avalumab)或德瓦魯單抗(durvalumab))、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)拮抗劑(例如阿柏西普(aflibercept)、貝伐單抗(bevacizumab))、血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang2)抑制劑(例如抗Ang2抗體，諸如內斯瓦庫單抗(nesvacumab))、淋巴細胞活化基因3(LAG3)抑制劑、CD20×CD3雙特異性抗體(例如REGN1979)、細胞毒素、化學治療劑、癌症疫苗、手術及放射線療法。可與本發明之抗CTLA-4抗體組合使用來治療癌症的額外療法/治療劑之額外實例描述於本文其他地方中。
抗體或其片段可以皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、經口、肌肉內或顱內投與。在某些實施例中，抗體或其片段局部投與至腫瘤中(瘤周(peritumorally)或瘤內(intra-tumorally))。抗體或其片段可以每公斤個體體重約0.1mg至每公斤體重約100mg之劑量投與。在某些實施例中， 抗體以約50mg至約1000mg之量向有需要之個體投與。在一些實施例中，抗體以約25mg至約600mg之劑量投與。在一些實施例中，抗體以約50mg至約1200mg之劑量投與。
本發明亦包含本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製造用於治療諸如癌症之將得益於CTLA-4結合及/或信號傳導之阻斷的疾病或病症的藥物。
本發明進一步包含抗體及抗原結合片段或包括其之醫藥組合物之用途，其係用於(i)製造用於治療可藉由拮抗CTLA-4來治療之疾病或病症(例如癌症)的藥物，及/或(ii)治療可藉由拮抗CTLA-4來治療之疾病或病症(例如癌症)。
在另一態樣中，本發明提供一種治療有需要之個體之非小細胞肺癌(包含晚期或轉移性NSCLC)的方法，所述方法包括向個體投與抗CTLA-4抗體及抗PD-1抗體。在一些情況下，抗CTLA-4抗體包括：包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的HCVR之CDR及包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的LCVR之CDR。在一些情況下，抗CTLA-4抗體包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其分別選自由SEQ ID NO：196-198-200-204-206-208組成之群。在一些情況下，抗CTLA-4抗體包括：包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的HCVR及包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的LCVR。在一些情況下，抗CTLA-4抗體包括人類IgG1重鏈恆定區。在一些實施例中，抗PD-1抗體為測米匹單抗(cemiplimab)。本發明亦包含此類抗體之用途，其係用於製造用於治療癌症(例如非小細胞肺癌，包含晚期或轉移性NSCLC)之藥物。
其他實施例將從回顧隨後的實施方式變得顯而易見。
圖1顯示實例7中之研究(A)中所述之實驗的各處理組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm3 +/- SEM)。CTLA-4 hum/hum 基因嵌入(knock-in)小鼠在第0天皮下植入MC38.Ova細胞(106個細胞/小鼠)且分成四個處理組(9隻小鼠/組)。在第3天、第7天、第10天、第14天及第17天，向小鼠腹膜內(intraperitoneally，IP)投與10mg/kg三種主要抗人類CTLA-4抗體(H1H19273P或H1H19303P或H1H19319)中之任一者或10mg/kg hIgG1同型對照。持續37天每週用卡尺量測兩次，監測腫瘤體積。處理日由箭頭指出。
圖2顯示在實例7中之研究(A)中所述之實驗第24天的個別腫瘤體積。當所有組中之所有動物皆存活時，第24天為研究中之最後一個時間點。統計顯著性藉由單因子變異數分析(one-way ANOVA)與鄧尼特多重比較事後檢定(Dunnett's multiple comparisons post-test)來確定(**** p<0.0001)。
圖3顯示實例7中之研究(A)中所述之實驗的卡本-麥爾存活曲線(Kaplan-Meier survival curve)。
圖4顯示實例7中之研究(B)中所述之實驗的各處理組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm3 +/- SEM)。在第3天、第6天、第9天、第13天及第16天，向CTLA-4 hum/hum 基因嵌入小鼠腹膜內投與抗CTLA-4抗體H1H19303P或hIgG1同型對照。持續37天每週用卡尺量測兩次，監測腫瘤體積。處理日由箭頭指出。
圖5顯示在實例7中之研究(B)中所述之實驗的第20天的個別腫瘤體積。統計顯著性藉由單因子變異數分析與鄧尼特多重比較事後檢定(**** p<0.0001)來確定。
圖6顯示實例7中之研究(B)中所述之實驗的卡本-麥爾存活曲線。
圖7顯示血清中之總H1H19303P及hIgG1同型對照抗體之濃度，如實例7中之研究(B)中所述。
圖8顯示針對H1H19303P之小鼠抗人類抗體(anti-human antibody，MAHA)(■)或同型對照(●)之濃度，如實例7中之研究(B)中所述。
圖9顯示實例8中所述之實驗的各處理組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm3 +/- SEM)。處理日由箭頭指出。
圖10顯示開始處理後第10天的個別腫瘤體積，如實例8中所述。
圖11顯示實例8中所述之實驗的卡本-麥爾存活曲線。
圖12及圖13顯示H1H19303P(亦稱為REGN4659)延緩已建立的腫瘤在CTLA-4hum/hum小鼠中之生長。將MC38.Ova細胞(5×105個細胞/小鼠)皮下移植至小鼠側腹中，在第10天當腫瘤體積達到100mm3時，將小鼠隨機分至處理組中，且在第10天、第13天、第17天投與REGN4659(25mg/kg、10mg/kg，n=10)或同型對照抗體(25mg/kg，n=10)且監測腫瘤體積直至第27天。圖12顯示各處理組之平均腫瘤生長曲線。圖13顯示各處理組之個別腫瘤體積，如在研究中之所有動物皆存活時在最後一個時間點第21天所量測。
圖14顯示經hIgG1對照抗體處理之攜帶腫瘤的CTLA-4hum/hum小鼠中之瘤內及脾Treg及T效應細胞上的總(表面及細胞內)人類CTLA-4表現之平均螢光強度(mean fluorescent intensity，MFI)。脾CD8+及CD4+效應細胞上之CTLA-4之表現不能從同型對照染色(MFI=0)區分且未示出。
在描述本發明方法之前，應理解，本發明不限於所描述之特 定方法及實驗條件，因為此類方法及條件可變化。亦應理解，本文中所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，並不意欲為限制性的，因為本發明之範疇將僅由所附申請專利範圍限制。
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之普通技術人員通常所理解的相同的含義。雖然可在本發明之實踐或測試中使用類似於或等同於本文所述之方法及材料的任何方法及材料，但現在描述較佳的方法及材料。本文中所提及之所有公開案均以全文引用之方式併入本文中。
術語「CTLA-4」係指細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4，一種免疫檢查點受體或T細胞共抑制劑，亦稱為CD152。全長人類CTLA-4之胺基酸序列以SEQ ID NO：505(寄存編號NP_005205.2)形式提供。術語「CTLA-4」包含重組CTLA-4或其片段。所述術語亦涵蓋例如與組胺酸標籤、小鼠或人類Fc、信號序列或CD300a(aa 181-299；寄存編號NP_009192.2)之跨膜域及細胞質域偶聯的CTLA-4或其片段。舉例而言，所述術語包含實例中所論述之序列，例如包括全長CTLA-4之C端的myc-myc-聚組胺酸標籤或包括全長CTLA-4之C端的小鼠Fc(mIgG2a)。除非明確說明來自非人類物種，否則術語「CTLA-4」意謂人類CTLA-4。
CTLA-4為免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族之成員及CD28之同源物，但對配體CD80及CD86具有較大的結合親和力。CTLA-4為在活化T細胞及調節性T細胞上表現的223個胺基酸的I型跨膜蛋白，其含有V域、跨膜域及細胞質尾區。CTLA-4受體與存在於抗原呈現細胞(APC)上之B7-1/CD80及B7-2/CD86配體結合。
如本文所用之術語「T細胞共抑制劑」係指經由T細胞活化或抑止來調節免疫反應的配體及/或受體。術語「T細胞共抑制劑」亦稱為T 細胞共信號傳導分子，包含但不限於計劃性死亡-1(PD-1)、淋巴細胞活化基因3(LAG3)、B及T淋巴細胞弱化子(B and T lymphocyte attenuator，BTLA)、CD-28、2B4、LY108、T細胞免疫球蛋白及黏蛋白3(T cell immunoglobulin and mucin 3，TIM3)、T細胞免疫受體與免疫球蛋白及ITIM(TIGIT；亦稱為VSIG9)、白血球相關免疫球蛋白樣受體1(leucocyte associated immunoglobulin-like receptor 1，LAIR1；亦稱為CD305)、誘導性T細胞共刺激因子(inducible T cell costimulator，ICOS；亦稱為CD278)、T細胞活化之V域Ig抑制因子(V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA)及CD160。
如本文所用之術語「抗體」意欲指包括四個多肽鏈，即藉由雙硫鍵相互連接之兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈的免疫球蛋白分子(亦即「完整抗體分子」)，以及其多聚體(例如IgM)或其抗原結合片段。各重鏈包括重鏈可變區(「HCVR」或「VH」)及重鏈恆定區(包括域CH1、CH2及CH3)。各輕鏈包括輕鏈可變區(「LCVR」或「VL」及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL區可進一步再分為高變區，高變區稱為互補決定區(complementarity determining region，CDR)，其中穿插有稱為構架區(framework region，FR)之較保守區。各VH及VL係由從胺基端至羧基端按以下順序排列的三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本發明之某些實施例中，抗體(或其抗原結合片段)之FR可以與人類生殖系序列相同，或可以經天然或人工修飾。胺基酸共同序列可基於兩個或更多個CDR之並列分析(side-by-side analysis)定義。
一或多個CDR殘基之取代或一或多個CDR之省略亦為可能的。抗體在科學文獻中已有描述，其中為了結合，可省去一個或兩個CDR。Padlan等人(1995 FASEB J.9：133-139)基於公開的晶體結構分析了抗體與其 抗原之間的接觸區，且得出的結論為：CDR殘基中僅約五分之一至三分之一真正接觸抗原。Padlan亦發現一個或兩個CDR不含與抗原接觸之胺基酸的多個抗體(另外參見Vajdos等人2002 J Mol Biol 320：415-428)。
不接觸抗原之CDR殘基可基於先前的研究(例如常常不需要CDRH2中之殘基H60-H65)從位於Chothia CDR之外的Kabat CDR之區域藉由分子模型化及/或憑經驗鑑別。若某個CDR或其殘基省略，則其通常經佔據另一個人類抗體序列或所述序列之共同序列中之對應位置的胺基酸取代。CDR內之取代位置及待取代之胺基酸亦可以憑經驗選擇。經驗取代可為保守取代或非保守取代。
相比於相應生殖系序列，本文所揭示之完全人類抗CTLA-4單株抗體可在重鏈及輕鏈可變域之構架區及/或CDR區中包括一或多個胺基酸取代、插入及/或缺失。此類突變可容易地藉由比較本文所揭示之胺基酸序列與可自例如公共抗體序列資料庫獲得的生殖系序列而確定。本發明包含衍生自本文所揭示之胺基酸序列中之任一者的抗體及其抗原結合片段，其中一或多個構架區及/或CDR區內之一或多個胺基酸突變為衍生出抗體的生殖系序列之相應殘基，或突變為另一個人類生殖系序列之相應殘基，或突變為相應生殖系殘基之保守性胺基酸取代(此類序列改變在本文中統稱為「生殖系突變」)。本領域中一般熟習此項技術者從本文所揭示之重鏈及輕鏈可變區序列開始，可容易地產生許多包括一或多個個別生殖系突變或其組合之抗體及抗原結合片段。在某些實施例中，VH及/或VL域內之所有構架及/或CDR殘基全部突變回衍生出抗體之初始生殖系序列中所發現的殘基。在其他實施例中，僅某些殘基突變回初始生殖系序列，例如僅FR1之前8個胺基酸內或FR4之後8個胺基酸內所發現的突變型殘基，或僅CDR1、CDR2或CDR3內所發現的突變型殘基。在其他實施例中，構 架及/或CDR殘基中之一或多者突變為不同生殖系序列(亦即不同於最初衍生出抗體之生殖系序列的生殖系序列)之相應殘基。此外，本發明抗體可在構架區及/或CDR區內含有兩個或更多個生殖系突變之任何組合，例如其中某些個別殘基突變為特定生殖系序列之對應殘基，而不同於初始生殖系序列之某些其他殘基維持不變或突變為不同生殖系序列之對應殘基。一旦獲得，即可針對一或多種所期望的特性容易地測試含有一或多個生殖系突變之抗體及抗原結合片段，所述特性諸如改良的結合特異性、增加的結合親和力、改良或增強的拮抗或促效生物特性(視具體情況而定)、減小的免疫原性等。本發明內涵蓋以此一般方式獲得的抗體及抗原結合片段。
本發明亦包含完全人類抗CTLA-4單株抗體，其包括本文所揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列中之任一者的具有一或多個保守取代的變異體。舉例而言，本發明包含抗CTLA-4抗體，其具有相對於本文所揭示之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列中之任一者而言，含有例如10個或更少個、8個或更少個、6個或更少個、4個或更少個等保守性胺基酸取代的HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列。
如本文所用之術語「人類抗體」及「完全人類抗體」意欲包含具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可以例如在CDR中且尤其在CDR3中包含不是由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入的突變)。然而，如本文所用之術語「人類抗體」及「完全人類抗體」不意欲包含衍生自另一哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列移植至人類FR序列上的mAb。所述術語包含在非人類哺乳動物中或在非人類哺乳動物之細胞中以重組方式產生的抗體。所述術語不意欲包含分離自或產生於人類個體的抗體。
如本文所用之術語「重組」係指本發明之藉由此項技術中已知為重組DNA技術之技術或方法產生、表現、分離或獲得的抗體或其抗原結合片段，其包含例如DNA剪接及基因轉殖表現。所述術語係指在非人類哺乳動物(包含基因轉殖非人類哺乳動物，例如基因轉殖小鼠)或細胞(例如CHO細胞)表現系統中表現或從重組組合人類抗體庫分離的抗體。
如本文所用之術語「多特異性抗原結合分子」係指雙特異性、三特異性或多特異性抗原結合分子及其抗原結合片段。多特異性抗原結合分子可以對一個目標多肽之不同抗原決定基具有特異性或可含有對超過一個目標多肽之抗原決定基具有特異性的抗原結合域。多特異性抗原結合分子可為單一多功能多肽，或其可為兩個或更多個彼此共價或非共價締合的多肽的多聚複合物。術語「多特異性抗原結合分子」包含可以與另一種功能分子、例如另一種肽或蛋白質連接或共表現的本發明抗體。舉例而言，抗體或其片段可在功能上連接(例如藉由化學偶合、基因融合(genetic fusion)、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如蛋白質或其片段，以產生具有第二結合特異性的雙特異性或多特異性抗原結合分子。根據本發明，術語「多特異性抗原結合分子」亦包含雙特異性、三特異性或多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，本發明抗體在功能上連結至另一個抗體或其抗原結合片段以產生具有第二結合特異性的雙特異性抗體。本發明之雙特異性及多特異性抗體描述於本文其他地方中。
術語「特異性結合」或「與……特異性結合」或類似術語意謂抗體或其抗原結合片段與抗原形成在生理條件下相對穩定的複合物。特異性結合可特徵在於至少約1×10-8M或更小(例如，較小的KD表示較緊密的結合)的平衡解離常數。判定兩個分子是否特異性結合之方法為此項技術中熟知的，且包含例如平衡透析、表面電漿子共振及類似方法。如本文 所述，已藉由表面電漿子共振，例如BIACORETM來鑑別與CTLA-4特異性結合之抗體。此外，與CTLA-4中之一個域及一或多個額外抗原結合的多特異性抗體或與CTLA-4之兩個不同區域結合的雙特異性抗體仍然視為如本文所用之「特異性結合」抗體。
術語「高親和力」抗體係指如藉由表面電漿子共振，例如BIACORETM或溶液親和力ELISA所量測，對CTLA-4具有至少10-8M、較佳10-9M、更佳10-10M、甚至更佳10-11M、甚至更佳10-12M的結合親和力的彼等mAb，結合親和力用KD表示。
術語「減慢速率」、「Koff」或「kd」意謂如藉由表面電漿子共振、例如BIACORETM所測定，抗體以1×10-3s-1或更小、較佳1×10-4s-1或更小之速率常數與CTLA-4解離。
如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及類似術語包含特異性結合抗原以形成複合物的任何天然存在的、可以酶方式獲得的、合成的或經基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所用之術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」係指抗體之保留與CTLA-4之結合能力的一或多個片段。
在特定實施例中，本發明之抗體或抗體片段可以結合於諸如配體或治療部分(「免疫結合物」)之部分，諸如細胞毒素、第二抗CTLA-4抗體、針對腫瘤特異性抗原之抗體、抗癌藥或任何其他適用於治療包含癌症或病毒感染、包含慢性病毒感染之疾病或病況的治療部分。
如本文所用之「經分離抗體」意欲指大體上不含其他具有不同抗原特異性的抗體(Ab)的抗體(例如，特異性結合CTLA-4，大體上不含特異性結合除CTLA-4以外之抗原的Ab的經分離抗體或其片段)。
如本文所用之「阻斷抗體」或「中和抗體」(或「中和CTLA-4 活性之抗體」或「拮抗劑抗體」)意欲指與CTLA-4之結合引起CTLA-4之至少一種生物活性之抑制的抗體。舉例而言，本發明抗體可以防止或阻斷CTLA-4與CD80及/或CD86結合。
如本文所用之「活化抗體」或「增強性抗體」(或「促效劑抗體」)意欲指與CTLA-4之結合引起增加或刺激CTLA-4之至少一種生物活性的抗體。舉例而言，本發明抗體可以藉由以符合配體結合(例如CD80或CD86)的方式與CTLA-4結合來增加CTLA-4活性，產生CTLA-4細胞內信號傳導。
如本文所用之術語「表面電漿子共振」係指能夠藉由例如使用BIACORETM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)在生物感測器矩陣內偵測蛋白質濃度之變化而實現即時生物分子相互作用之分析的光學現象。
如本文所用之術語「KD」意欲指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。
術語「抗原決定基」係指與抗體分子之可變區中稱為互補位之特異性抗原結合位點相互作用的抗原決定子。單一抗原可具有超過一個抗原決定基。因此，不同抗體可與抗原上之不同區域結合且可具有不同生物作用。術語「抗原決定基」亦指抗原上B細胞及/或T細胞所響應的位點。其亦指抗原之由抗體結合的區域。抗原決定基可定義為結構性或功能性的。功能性抗原決定基通常為結構性抗原決定基之子組且具有直接有助於相互作用之親和力的彼等殘基。抗原決定基亦可為構形抗原決定基，亦即由非線性胺基酸構成。在某些實施例中，抗原決定基可以包含決定子，其為分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基；且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或荷質比特徵。
如本文所用之術語「交叉競爭」意謂抗體或其抗原結合片段與抗原結合且抑制或阻斷另一抗體或其抗原結合片段之結合。所述術語亦包含兩個抗體之間在兩個方向上的競爭，亦即，第一抗體結合且阻斷第二抗體之結合且反之亦然。在某些實施例中，第一抗體及第二抗體可以與同一個抗原決定基結合。或者，第一抗體及第二抗體可以與不同但是重疊的抗原決定基結合，使得一個抗體之結合抑制或阻斷另一個抗體之結合，例如經由位阻。抗體之間的交叉競爭可以藉由此項技術中已知之方法量測，例如藉由即時、無標記生物層干涉分析。兩個抗體之間的交叉競爭可以表示為小於因為自身結合(self-self binding)(其中第一抗體及第二抗體為相同抗體)所導致之背景信號的第二抗體結合。2個抗體之間的交叉競爭可以表示為例如小於基線自身背景結合(其中第一抗體及第二抗體為相同抗體)的第二抗體結合%。
術語「大體上一致性(substantial identity)」或「大體上相同」當指的是核酸或其片段時，表示當在適當核苷酸插入或缺失下與另一核酸(或其互補鏈)最佳對準時，在至少約90%、且更佳至少約95%、96%、97%、98%或99%之核苷酸鹼基中存在核苷酸序列一致性，如藉由序列一致性之任何熟知演算法所量測，如下文所論述。與參考核酸分子具有大體上一致性之核酸分子在某些情況下可編碼具有與由參考核酸分子所編碼之多肽相同或大體上相似的胺基酸序列的多肽。
序列一致性可使用演算法計算，例如針對全域對準(global alignment)之Needleman Wunsch演算法(Needleman及Wunsch 1970,J.Mol.Biol.48：443-453)，或針對局域對準(local alignment)之Smith Waterman演算法(Smith及Waterman 1981,J.Mol.Biol.147：195-197)。另一較佳演算法由Dufresne等人在2002年在Nature Biotechnology(第20卷，第1269-71 頁)中描述且在軟體GenePAST(GQ Life Sciences,Inc.Boston,MA)中使用。
如應用於多肽，術語「大體相似性」或「大體上相似」意謂兩個肽序列在諸如藉由程式GAP或BESTFIT，使用預設間隙權數最佳對準時，共用至少90%序列一致性，甚至更佳至少95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不相同的殘基位置的差異為保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經另一個具有化學特性(例如電荷或疏水性)相似之側鏈(R基團)的胺基酸殘基取代。一般而言，保守性胺基酸取代大體上不會改變蛋白質之功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列彼此間差異為保守取代的情況下，可上調相似性百分比或相似度以校正取代之保守性質。進行此調整之手段為本領域中熟習此項技術者所熟知的。參見例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，其以引用的方式併入本文中。具有化學特性相似之側鏈的胺基酸組之實例包含1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。較佳的保守性胺基酸取代組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。或者，保守性置換為在以引用之方式併入本文中之Gonnet等人(1992)Science 256：1443 45中所揭示的PAM250對數似然矩陣中具有正值的任何改變。「適度保守」置換為在PAM250對數似然矩陣中具有非負值的任何改變。
多肽之序列相似性典型地使用序列分析軟體來量測。蛋白質分析軟體使用分配於各種取代、缺失及其他修飾，包含保守性胺基酸取代的相似性量度來匹配相似序列。舉例而言，GCG軟體含有諸如GAP及 BESTFIT之程式，其可在預設參數下使用以測定密切相關之多肽，諸如來自生物體之不同物種的同源多肽之間，或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列一致性。參見例如6.1版GCG。多肽序列亦可使用FASTA在預設或推薦參數下比較；6.1版GCG中之程式。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢序列與搜尋序列之間的最佳重疊區域之對準及序列一致性百分比(Pearson(2000)，同前文獻)。當比較本發明序列與含有大量來自不同生物體之序列之資料庫時，另一較佳演算法為電腦程式BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN，使用預設參數。參見例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402，其各者以引用的方式併入本文中。
短語「治療有效量」意謂投藥後產生所期望的作用的量。精確的量將視治療目的而定且可由本領域中熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding)。
如本文所用之術語「個體」係指需要改善、預防及/或治療諸如病毒感染或癌症之疾病或病症的動物，較佳哺乳動物。所述術語包含患有或有風險患上癌症、轉移癌或病毒感染的人類個體。
如本文所用之「抗癌藥」意謂任何適用於治療或改善或抑制癌症的藥劑，包含但不限於細胞毒素及諸如以下之藥劑：抗代謝物、烷基化劑、蒽環黴素(anthracycline)、抗生素、抗有絲分裂劑、丙卡巴肼(procarbazine)、羥基脲、天冬醯胺酶、皮質類固醇、環磷醯胺(cyclophosphamide)、米托坦(mytotane)(O,P'-(DDD))、生物製劑(例如抗體及干擾素)及放射性試劑。如本文所用之「細胞毒素或細胞毒性劑」亦指化學治療劑且意謂任何對細胞有害的藥劑。實例包含Taxol®(太平洋 紫杉醇(paclitaxel))、替莫唑胺(temozolamide)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、順鉑(cisplatin)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinbiastine)、秋水仙鹼(coichicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。
如本文所用之術語「抗病毒藥」係指任何用於治療、預防或改善宿主個體之病毒感染的藥物或療法。術語「抗病毒藥」包含但不限於齊多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韋(abacavir)、利巴韋林(ribavirin)、洛匹那韋(lopinavir)、依法韋侖(efavirenz)、考比西他(cobicistat)、田諾弗(tenofovir)、利匹韋林(rilpivirine)止痛劑及皮質類固醇。在本發明之上下文中，病毒感染包含由病毒引起的長期或慢性感染，病毒包含但不限於人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人類乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)及猿猴免疫缺乏病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)。
如本文所用之術語「用以增強免疫反應」係指增加諸如T細胞或NK細胞之針對腫瘤細胞或病毒感染細胞之免疫細胞的活性。在本發明之上下文中，所述術語包含阻斷T細胞活性之CTLA-4介導之抑制，或拯 救或逆轉T細胞之耗竭狀態。其亦包含調節性T細胞活性之抑制。如在本發明之上下文中所用的增強的免疫反應引起腫瘤細胞之殺死增加及/或抑制腫瘤生長。
本發明之抗體及抗原結合片段與CTLA-4特異性結合且增強T細胞活化。抗CTLA-4抗體可以高親和力或低親和力與CTLA-4結合。在某些實施例中，本發明抗體可為阻斷抗體，其中抗體可以與CTLA-4結合且抑制CTLA-4信號傳導。在一些實施例中，本發明抗體阻斷CTLA-4與CD80及/或CD86之結合及/或刺激或增強T細胞活化。在一些實施例中，抗體與CTLA-4結合且逆轉耗竭性T細胞之無反應性狀態(anergic state)。在某些實施例中，抗體與CTLA-4結合且抑制調節性T細胞活性。在一些實施例中，抗體可適用於刺激或增強免疫反應及/或治療患有癌症或病毒感染之個體。當向有需要之個體投與時，抗體可以減少個體被諸如HIV、LCMV或HBV之病毒慢性感染。其可用於抑制腫瘤細胞在個體中生長。其可單獨使用或作為輔助療法與此項技術中已知之其他治療部分或儀器治療(modalities)一起使用，用於治療癌症或病毒感染。
在某些實施例中，抗CTLA-4抗體可為多特異性抗原結合分子，其中其包括與CTLA-4之第一結合特異性及與選自由以下組成之群的抗原的第二結合特異性：另一T細胞共抑制劑及CTLA-4之不同抗原決定基。
可使用包括以下中之任一者的免疫原來產生針對CTLA-4之抗體。在某些實施例中，本發明抗體從經全長天然CTLA-4(參見NCBI寄存編號NP_005205.2)(SEQ ID NO：505)或經重組CTLA-4肽免疫之小鼠獲得。或者，CTLA-4或其片段可以使用標準生化技術產生且用作免疫原。
在某些實施例中，免疫原為CTLA-4之細胞外域。在本發明之一個實施例中，免疫原為CTLA-4之細胞外域之片段。
在一些實施例中，免疫原可為在大腸桿菌(E.coli)中或在諸如中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞之任何其他真核或哺乳動物細胞中表現的重組CTLA-4肽。
在某些實施例中，與CTLA-4特異性結合之抗體可以使用上述區域之片段或從本文所述之區域之N端或C端中之任一端或兩端延伸超出指定區域約5個至約20個胺基酸殘基的肽製備。在某些實施例中，可以使用上述區域或其片段之任何組合來製備CTLA-4特異性抗體。
為了標記或出於與諸如KLH之載劑分子結合的目的，肽可經修飾以包含某些殘基之添加或取代。舉例而言，可在肽之N端或C端添加半胱胺酸，或可添加連接子序列以製備用於與例如KLH結合之肽進行免疫。
本發明之某些抗CTLA-4抗體能夠與CTLA-4結合並中和其活性，如藉由活體外或活體內分析所測定。本發明抗體與CTLA-4結合並中和其活性的能力可使用本領域中熟習此項技術者已知之任何標準方法來量測，包含如本文所述之結合分析或活性分析。
用於量測結合活性之非限制性例示性活體外分析在本文實例中加以說明。在實例3中，藉由表面電漿子共振或MASS-1測定人類抗CTLA-4抗體對人類及猴CTLA-4之結合親和力及動力學常數。在實例4中，使用競爭夾心ELISA評定抗CTLA-4抗體阻斷CTLA-4蛋白質與其天然配體B7-1及B7-2結合的能力。實例5描述抗CTLA-4抗體與表現CTLA-4之細胞的結合。在實例6中，使用螢光素酶分析及IL-2釋放分析測定抗CTLA-4抗體活化T細胞並拯救IL-2釋放的能力。
在某些實施例中，本發明抗體能夠活體外增強或刺激具有癌症之個體中或經諸如LCMV之病毒感染之個體中的T細胞活性。在某些實 施例中，本發明抗體與第二治療劑組合使用以增強個體中之免疫反應並抑制腫瘤生長，第二治療劑諸如針對第二T細胞共抑制劑之抗體。
對CTLA-4具有特異性之抗體可以不含額外標記或部分，或其可含有標記或部分，例如N端或C端標記或部分。在一個實施例中，標記或部分為生物素。在結合分析中，標記(若存在)之位置可決定肽相對於發生肽結合之表面的取向。舉例而言，若表面塗有抗生物素蛋白(avidin)，則含有N端生物素之肽之取向將使得肽之C端部分遠離表面。在一個實施例中，標記可為放射性核素、螢光染料或MRI可偵測標記。在某些實施例中，此類經標記抗體可用於診斷分析中，包含成像分析。
本發明之例示性實施例
在一個態樣中，本發明提供結合人類細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)且阻斷hCTLA-4與配體B7-1及B7-2之間的相互作用的抗體或其抗原結合片段。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段誘導T細胞活化。在一些情況下，T細胞為細胞毒性T細胞。在一些情況下，T細胞為腫瘤浸潤性淋巴細胞。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段結合猴CTLA-4。在一些情況下，抗體或抗原結合片段以小於0.5nM之EC50結合表現猴CTLA-4之細胞。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段以小於5nM、小於1nM或小於0.5nM之EC50結合表現hCTLA-4之細胞。
在各種實施例中，抗體或抗原結合片段為完全人類抗體。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段與包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的參考抗體競爭與人類CTLA-4結 合：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482及490/498。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段與包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的參考抗體結合於人類CTLA-4上之同一個抗原決定基：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482及490/498。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包括：(a)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)之互補決定區(CDR)：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474及490；及(b)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)之CDR：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482及498。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的重鏈及輕鏈CDR：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、 290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482及490/498。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包括分別選自由以下組成之群之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域：SEQ ID NO：4-6-8-12-14-16；20-22-24-28-30-32；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；68-70-72-76-78-80；84-86-88-92-94-96；100-102-104-108-110-112；116-118-120-124-126-128；132-134-136-140-142-144；148-150-152-156-158-160；164-166-168-172-174-176；180-182-184-188-190-192；196-198-200-204-206-208；212-214-216-220-222-224；228-230-232-236-238-240；244-246-248-252-254-256；260-262-264-268-270-272；276-278-280-284-286-288；292-294-296-300-302-304；308-310-312-300-302-304；316-318-320-324-326-328；332-334-336-340-342-344；348-350-352-356-358-360；364-366-368-372-374-376；380-382-384-388-390-392；396-398-400-404-406-408；412-414-416-420-422-424；428-430-432-436-438-440；444-446-448-452-454-456；460-462-464-468-470-472；476-478-480-484-486-488；及492-494-496-500-502-504。
在某些實施例中，抗體或抗原結合片段包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、 458/466、474/482及490/498。
在某些實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其為人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。抗體或其抗原結合片段例如可為IgG1或IgG4抗體，諸如人類IgG1或IgG4抗體。彼等抗體之恆定區對應於野生型恆定區，或已引入突變之恆定區。
在一個態樣中，本發明提供一種多特異性抗原結合分子，其包括與CTLA-4特異性結合的第一抗原結合特異性及與第二目標抗原決定基特異性結合的第二抗原結合特異性。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包括以上實施例中之任一者之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
在一個態樣中，本發明提供經分離多核苷酸分子及載體，其包括本文所揭示之抗體或其抗原結合片段之多核苷酸序列。在某些實施例中，本發明提供經分離多核苷酸分子及/或載體，其包括編碼如本文所闡述之抗體之HCVR的多核苷酸序列。在某些實施例中，本發明提供一種經分離多核苷酸分子及/或載體，其包括編碼如本文所闡述之抗體之LCVR的多核苷酸序列。在某些實施例中，本發明提供一種表現在上文或此處所論述之載體的細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種治療可藉由拮抗CTLA-4治療之疾病或病症的方法，其係經由向有需要之個體投與治療有效量之如本文所揭示之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段或包括此類抗體或抗原結合片段之醫藥組合物。在一些情況下，疾病或病症為由選自由以下組成之群之病毒引起的慢性病毒感染：人類免疫缺乏病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、淋巴細胞 性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。在一些情況下，疾病或病症選自由以下組成之群：血癌、腦癌、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌、皮膚癌、子宮頸癌、腎癌、胃癌、胰臟癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、B細胞淋巴瘤及黑色素瘤。
在一個態樣中，本發明提供增強個體中之免疫反應的方法，所述方法包括投與包括如本文中所揭示之經分離抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供抑制個體中之調節性T(Treg)細胞的方法，所述方法包括投與包括如本文中所揭示之經分離抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。在某些實施例中，本發明提供增強個體中之T細胞活化的方法，所述方法包括投與包括如本文中所揭示之經分離抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物。在某些實施例中，個體具有選自由以下組成之群的疾病或病症：血癌、腦癌、腎細胞癌(例如透明細胞腎癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、皮膚癌、子宮頸癌、胃癌、腎癌、胰臟癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、淋巴瘤(例如B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤)及黑色素瘤。在某些實施例中，個體具有由選自由以下組成之群之病毒引起的慢性病毒感染：人類免疫缺乏病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體與選自由以下組成之群之第二治療劑組合向個體投與：PD-1抑制劑、LAG3抑制劑、針對腫瘤特異性抗原之抗體、針對病毒感染細胞抗原之抗體、PD-L1抑制劑、CD20抑制劑、針對CD20及CD3之雙特異性抗體、諸如抗氧化劑之膳食補 充劑、VEGF拮抗劑、癌症疫苗、化學治療劑、細胞毒性劑、手術、放射線、NSAID、皮質類固醇及任何其他適用於改善至少一種與疾病或病症相關之症狀的療法。
在一個態樣中，本發明提供抑制個體中之腫瘤或腫瘤細胞生長的方法，所述方法包括向有需要之個體投與治療有效量之如本文中所揭示之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段或包括此類抗體或抗原結合片段的醫藥組合物。在某些實施例中，腫瘤為原發性的或再發性的。在某些實施例中，腫瘤為已建立的腫瘤。在某些實施例中，個體具有轉移性疾病及/或已用先前療法治療。在某些實施例中，腫瘤存在於具有選自由以下組成之群之疾病或病症的個體中：血癌、腦癌、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、淋巴瘤及黑色素瘤。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段以一或多個劑量投與，其中各劑量在前一劑量之後1週至12週投與。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段以每公斤個體體重約0.1mg至每公斤體重約100mg之劑量投與。在某些實施例中，各劑量包括約50mg至約1000mg之抗體。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體與選自由以下組成之群之第二治療劑組合向個體投與：PD-1抑制劑、LAG3抑制劑、針對腫瘤特異性抗原之抗體、PD-L1抑制劑、CD20抑制劑、針對CD20及CD3之雙特異性抗體、諸如抗氧化劑之膳食補充劑、VEGF拮抗劑、癌症疫苗、化學治療劑、細胞毒性劑、手術、放射線、NSAID、皮質類固醇及任何其他適用於改善至少一種與疾病或病症相關之症狀的療法。在一個實施例中，第二治療劑為PD-1抑制劑，其中PD-1抑制劑為與PD-1特異性結合之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，PD-1抑制劑為REGN2810、納武單抗或派姆單抗。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體或 其抗原結合片段係皮下、靜脈內、瘤內、瘤周、皮內、腹膜內、經口、肌肉內或顱內投與。
在一個態樣中，本發明提供拯救T細胞活性之CTLA-4介導之抑制的方法，所述方法包括使T細胞與如本文中所揭示之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段接觸。在一個實施例中，用本發明之抗CTLA-4抗體與抗PD-1抗體(例如REGN2810)組合來接觸T細胞。
在一個態樣中，本發明提供如本文中所揭示之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段或包括此類抗體或抗原結合片段之醫藥組合物的用途，其係用於治療可藉由拮抗CTLA-4治療之疾病或病症。在一些情況下，疾病或病症為癌症。
在一個態樣中，本發明提供如本文中所揭示之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段或包括此類抗體或抗原結合片段之醫藥組合物的用途，其係用於製造用於治療可藉由拮抗CTLA-4治療之疾病或病症的藥物。在一些情況下，疾病或病症為癌症。
抗體之抗原結合片段
除非另外特別指示，否則如本文所用之術語「抗體」應理解為涵蓋包括兩個免疫球蛋白重鏈及兩個免疫球蛋白輕鏈之抗體分子(亦即「完整抗體分子」)以及其抗原結合片段。如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」、抗體之「抗原結合片段」及類似術語包含特異性結合抗原以形成複合物的任何天然存在的、可以酶方式獲得的、合成的或經基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所用之術語抗體之「抗原結合片段」或「抗體片段」係指抗體之保留與CTLA-4特異性結合的能力的一或多個片段。抗體片段可以包含Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR之片段或經分離CDR。在某些實施例中，術語「抗原結合片段」係指多特異 性抗原結合分子之多肽片段。抗體之抗原結合片段可使用任何適合的標準技術衍生自例如完整抗體分子，所述技術諸如涉及編碼抗體可變域及(視情況)恆定域之DNA之操縱及表現的蛋白水解消化或重組基因工程改造技術。此類DNA為已知的及/或可從例如商業來源、DNA庫(包含例如噬菌體-抗體庫)容易地獲得，或可以合成。DNA可以化學方式或藉由使用分子生物學技術定序及操縱，例如將一或多個可變域及/或恆定域配置成適合組態，或引入密碼子，產生半胱胺酸殘基，修飾、添加或缺失胺基酸等。
抗原結合片段之非限制性實例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體之高變區(例如經分離互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)，或限制性FR3-CDR3-FR4肽之胺基酸殘基組成的最小識別單位。其他經工程改造之分子，諸如域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模組化免疫藥物(small modular immunopharmaceutical；SMIP)及鯊魚可變IgNAR域，亦涵蓋在如本文所用之表述「抗原結合片段」內。
抗體之抗原結合片段通常將包括至少一個可變域。可變域可具有任何大小或胺基酸組成且一般將包括至少一個與一或多個構架序列相鄰或同框的CDR。在具有與VL域相關聯之VH域的抗原結合片段中，VH及VL域可以任何適合之配置相對於彼此定位。舉例而言，可變區可為二聚的且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚體。或者，抗體之抗原結合片段可含有單體VH或VL域。
在某些實施例中，抗體之抗原結合片段可含有至少一個共價連接至至少一個恆定域之可變域。可在本發明抗體之抗原結合片段內發現 的可變域及恆定域之非限制性例示性組態包含：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；及(xiv)VL-CL。在可變域及恆定域之任何組態，包含以上列出之例示性組態中之任一者中，可變域及恆定域可直接彼此連接或可藉由完全或部分鉸鏈區或連接區連接。鉸鏈區可以由至少2個(例如5、10、15、20、40、60個或更多個)胺基酸組成，其在單一多肽分子中之相鄰可變域及/或恆定域之間產生可撓性或半可撓性鍵聯。此外，本發明抗體之抗原結合片段可包括以上列出之可變域及恆定域組態中之任一者相互之間及/或與一或多個單體VH或VL域(例如藉由雙硫鍵)非共價締合的均二聚體或雜二聚體(或其他多聚體)。
如同完整抗體分子，抗原結合片段可為單特異性或多特異性的(例如雙特異性的)。抗體之多特異性抗原結合片段通常將包括至少兩個不同可變域，其中各可變域能夠與各別抗原或與同一抗原上之不同抗原決定基特異性結合。任何多特異性抗體型式，包含本文所揭示之例示性雙特異性抗體型式，可用以使用此項技術中可用之常規技術在本發明抗體之抗原結合片段的情況下使用。
製備人類抗體
在基因轉殖小鼠中產生人類抗體的方法為此項技術中已知的。可在本發明之情形下使用任何此類已知方法來製造與CTLA-4特異性結合的人類抗體。
使用VELOCIMMUNE®技術(參見例如US 6,596,541，Regeneron Pharmaceuticals，VELOCIMMUNE®)或任何其他已知用於產生單株抗體的方法，首先分離具有人類可變區及小鼠恆定區的針對CTLA-4 之高親和力嵌合抗體。VELOCIMMUNE®技術包括產生具有包括人類重鏈及輕鏈可變區可操作地連接於內源性小鼠恆定區基因座之基因組的基因轉殖小鼠，使得小鼠產生包括人類可變區及小鼠恆定區的對抗原刺激起反應的抗體。分離編碼抗體之重鏈及輕鏈之可變區的DNA且將其可操作地連接於編碼人類重鏈及輕鏈恆定區的DNA。隨後使DNA在能夠表現完全人類抗體之細胞中表現。
一般而言，用所關注之抗原攻擊VELOCIMMUNE®小鼠，且從表現抗體之小鼠回收淋巴細胞(諸如B細胞)。淋巴細胞可與骨髓瘤細胞株融合以製備永生融合瘤細胞株，且此類融合瘤細胞株經篩選及選擇以鑑別產生對所關注之抗原具有特異性之抗體的融合瘤細胞株。可分離編碼重鏈及輕鏈之可變區的DNA且將其連接至重鏈及輕鏈之所期望的同型恆定區。此類抗體蛋白質可在諸如CHO細胞之細胞中產生。或者，編碼抗原特異性嵌合抗體或輕鏈及重鏈之可變域的DNA可直接從抗原特異性淋巴細胞分離。
首先，分離具有人類可變區及小鼠恆定區之高親和力嵌合抗體。如在下文實驗部分中，對抗體進行表徵且針對所期望的特徵加以選擇，所述特徵包含親和力、選擇性、抗原決定基等。用所期望的人類恆定區置換小鼠恆定區以產生本發明之完全人類抗體，例如野生型或經修飾IgG1或IgG4。雖然所選恆定區可根據特定用途而改變，但高親和力抗原結合及目標特異性特徵存在於可變區中。
生物等效物
本發明之抗CTLA-4抗體及抗體片段涵蓋具有在所述抗體之間不同，但是保留結合CTLA-4之能力的胺基酸序列的蛋白質。當相比於親本序列時，此類變異體抗體及抗體片段包括一或多個胺基酸添加、缺失或 取代，但所展現之生物活性基本上等效於所述抗體之生物活性。同樣，本發明之編碼抗體之DNA序列涵蓋如下序列：當相比於所揭示之序列時，其包括一或多個核苷酸添加、缺失或取代，但是編碼基本上與本發明之抗體或抗體片段生物等效的抗體或抗體片段。
舉例而言，若兩個抗原結合蛋白或抗體為如下藥物等效物或藥物替代物：當在類似實驗條件下以單次劑量或多劑量方式以相同莫耳劑量投與時，所述藥物等效物或藥物替代物之吸收速率及吸收程度不顯示顯著差異，則將這兩個抗原結合蛋白或抗體視為生物等效的。一些抗體將被視為等效物或藥物替代物若其在吸收程度方面等效，而在吸收速率方面不等效仍可將其視為生物等效物，因為吸收速率方面之此類差異係故意的且反映在標記中，對於在例如慢性使用方面達到有效體藥濃度不是必要的，且對於所研究之特定藥品而言被視為醫療上無關緊要的。
在一個實施例中，兩個抗原結合蛋白若其安全性、純度或效能方面不存在臨床上有意義的差異，則其為生物等效的。
在一個實施例中，若患者能夠在參考產品與生物產品之間轉換一或多次，且相比於無此類轉換之持續療法，不存在副作用風險之預期增加，副作用包括免疫原性之臨床顯著變化或有效性減弱，則兩個抗原結合蛋白為生物等效的。
在一個實施例中，若兩個抗原結合蛋白均藉由一或多種共同的作用機制在一或多種使用條件下起作用，達到此類機制所已知的程度，則其為生物等效的。
生物等效性可藉由活體內及/或活體外方法證明。生物等效性量測包含例如(a)人類或其他哺乳動物中之活體內測試，其中量測血液、血漿、血清或其他生物流體中隨時間而變的抗體或其代謝物之濃度；(b) 與人類活體內生物可用性資料相關且合理地預測人類活體內生物可用性資料之活體外測試；(c)人類或其他哺乳動物中之活體內測試，其中量測隨時間而變的抗體(或其目標)之適當急性藥理學效應；及(d)建立抗體之安全性、功效或生物可用性或生物等效性之良好控制的臨床試驗。
本發明抗體之生物等效變異體可藉由例如進行殘基或序列之各種取代或使生物活性所不需要的末端或內部殘基或序列缺失來構築。舉例而言，對於生物活性而言非必需之半胱胺酸殘基可缺失或經其他胺基酸置換以阻止在複性後形成不必要或不恰當的分子內雙硫橋。在其他情況下，生物等效抗體可以包含包括胺基酸改變之抗體變異體，所述胺基酸改變修飾抗體之糖基化特徵，例如消除或移除糖基化之突變。
包括Fc變異體之抗CTLA-4抗體
根據本發明之某些實施例，提供抗CTLA-4抗體，其包括含有一或多個突變之Fc域，所述突變增強或減弱抗體與FcRn受體之結合，例如在酸性pH下，相比於中性pH而言。舉例而言，本發明包含在Fc域之CH2或CH3區中包括突變的抗CTLA-4抗體，其中所述突變增加Fc域在酸性環境中(例如在內體中，其中pH在約5.5至約6.0之範圍內)對FcRn之親和力。此類突變可導致當向動物投與抗體時，抗體之血清半衰期增加。此類Fc修飾之非限制性實例包含例如在位置250(例如E或Q)；250及428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)及256(例如S/R/Q/E/D或T)處之修飾；或在位置428及/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)及/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])處之修飾；或在位置250及/或428處之修飾；或在位置307或308(例如308F、V308F)及434處之修飾。在一個實施例中，修飾包括428L(例如M428L)及434S(例如N434S)修飾；428L、259I(例如V259I)及 308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)及434(例如434Y)修飾；252、254及256(例如252Y、254T及256E)修飾；250Q及428L修飾(例如T250Q及M428L)；及307及/或308修飾(例如308F或308P)。在另一實施例中，修飾包括265A(例如D265A)及/或297A(例如D297A)修飾。
舉例而言，本發明包含抗CTLA-4抗體，其包括含有一或多對或一或多組選自由以下組成之群之突變的Fc域：250Q及248L(例如T250Q及M248L)；252Y、254T及256E(例如M252Y、S254T及T256E)；428L及434S(例如M428L及N434S)；257I及311I(例如P257I及Q311I)；257I及434H(例如P257I及N434H)；376V及434H(例如D376V及N434H)；307A、380A及434A(例如T307A、E380A及N434A)；及433K及434F(例如H433K及N434F)。在一個實施例中，本發明包含抗CTLA-4抗體，其包括在IgG4之鉸鏈區中包括S108P突變之Fc域以促進二聚體穩定化。前述Fc域突變及本文所揭示之抗體可變域內之其他突變之所有可能的組合涵蓋於本發明範疇內。
本發明亦包含包括嵌合重鏈恆定(CH)區之抗CTLA-4抗體，其中嵌合CH區包括衍生自超過一個免疫球蛋白同型之CH區的區段。舉例而言，本發明抗體可包括嵌合CH區，其包括衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH2域中之部分或全部，與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4分子之CH3域中之部分或全部組合。根據某些實施例，本發明抗體包括具有嵌合鉸鏈區之嵌合CH區。舉例而言，嵌合鉸鏈可包括衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區之「上鉸鏈」胺基酸序列(根據EU編號，在位置216至227之胺基酸殘基)，與衍生自人類IgG1、人類IgG2或人類IgG4鉸鏈區之「下鉸鏈」序列(根據EU編號，在位置228至236 之胺基酸殘基)組合。根據某些實施例，嵌合鉸鏈區包括衍生自人類IgG1或人類IgG4上鉸鏈之胺基酸殘基及衍生自人類IgG2下鉸鏈之胺基酸殘基。包括如本文所述之嵌合CH區之抗體在某些實施例中可展現經改良Fc效應功能而不會不利地影響抗體之治療或藥物動力學特性。(參見例如美國專利公開案第20140243504號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中)。
抗體之生物學特徵
一般而言，本發明抗體藉由與CTLA-4結合而起作用。本發明包含以高親和力結合可溶性單體或二聚CTLA-4分子之抗CTLA-4抗體及其抗原結合片段。舉例而言，本發明包含如藉由表面電漿子共振，例如使用如本文實例3中所定義之分析型式所量測，以小於約20nM之KD結合二聚人類及猴CTLA-4(例如在25℃下)的抗體及抗體之抗原結合片段。在某些實施例中，如藉由表面電漿子共振，例如使用如本文實例3中所定義之分析型式或大體上類似的分析所量測，抗體或其抗原結合片段以小於約10nM、小於約5nM、小於約2nM或小於約1nM之KD結合單體CTLA-4。
本發明亦包含如在25℃下藉由表面電漿子共振，例如使用如本文實例3中所定義之分析型式或大體上類似的分析所量測，以大於約4分鐘之解離半衰期(t½)結合CTLA-4的抗體及其抗原結合片段。在某些實施例中，如在25℃下藉由表面電漿子共振，例如使用如本文實例3中所定義之分析型式(例如mAb捕捉型式)或大體上類似的分析所量測，本發明之抗體或抗原結合片段以大於約5分鐘、大於約10分鐘、大於約15分鐘、大於約20分鐘、大於約30分鐘、大於約40分鐘、大於約100分鐘、大於約200分鐘、大於約300分鐘或大於約500分鐘之t½結合CTLA-4。
本發明亦包含如使用例如如實例4中所示之酶聯免疫吸附分 析(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)或大體上類似的分析所測定，以小於約320nM之IC50阻斷hCTLA-4與hB7-1(CD80)及/或hB7-2(CD86)結合的抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，如藉由例如如所本文實例4中定義之競爭夾心ELISA或大體上類似的分析所量測，抗體或其抗原結合片段以小於約200nM、小於約100nM、小於約70nM、小於約20nM、小於約10nM、小於約5nM、小於約1nM或小於約0.5nM之IC50阻斷hCTLA-4與人類B7-1及/或人類B7-2結合。
本發明亦包含如藉由例如如本文實例4中所定義之競爭夾心ELISA或大體上類似的分析所量測，將hCTLA-4與人類B7-1及/或人類B7-2之結合阻斷至少85%的抗體或其抗原結合片段。
本發明亦包含如藉由如本文實例5中所定義之電化學發光分析或大體上類似的分析所量測，以小於約6nM之EC50與人類CTLA-4表現細胞結合的抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，如藉由電化學發光分析，例如使用本文實例5中之分析型式或大體上類似的分析所量測，抗體或其抗原結合片段以小於約4nM、小於約2nM、小於約1nM或小於約0.5nM之EC50與hCTLA-4表現細胞結合。在某些實施例中，如藉由電化學發光分析，例如使用本文實例5中之分析型式或大體上類似的分析所量測，抗體或其抗原結合片段與hCTLA-4表現細胞以比與對照細胞之結合高出大於約10倍之比率、以大於約15倍之比率或以比與對照細胞之結合高出大於約20倍之比率結合。
本發明亦包含如藉由如本文實例5中所定義之電化學發光分析或大體上類似的分析所量測，以小於約0.5nM之EC50與食蟹獼猴CTLA-4表現細胞結合的抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，如藉由電化學發光分析，例如使用如本文實例5中所定義之分析型式或大體上類似的分 析所量測，抗體或其抗原結合片段以小於約0.5nM或小於約0.2nM之EC50與mfCTLA-4表現細胞結合。
本發明亦包含如藉由如本文實例6中所定義之T細胞/APC螢光素酶報導分析或大體上類似的分析所量測，以小於8nM之EC50阻斷CTLA-4誘導之T細胞下調(藉由阻斷CTLA-4/CD80及CTLA-4/CD86相互作用)的抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，如藉由T細胞/APC螢光素酶報導分析，例如使用如本文實例6中所定義之分析型式或大體上類似的分析所量測，抗體或其抗原結合片段以小於約6nM、小於約5nM、小於約3nM、小於約2.5nM或小於約2nM之EC50阻斷CTLA-4誘導之T細胞下調。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段阻斷人類及猴CTLA-4之CTLA-4誘導之T細胞下調。
本發明亦包含如藉由如本文實例6中所定義之T細胞/APC IL-2釋放分析或大體上類似的分析所量測，以小於約50nM之EC50拯救IL-2釋放之CTLA-4介導之抑制(藉由阻斷CTLA-4/CD80及CTLA-4/CD86相互作用)的抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，如藉由T細胞/APC IL-2釋放分析，例如使用如本文實例6中所定義之分析型式或大體上類似的分析所量測，抗體或其抗原結合片段以小於約45nM、小於約35nM、小於約25nM或小於約20nM之EC50拯救IL-2釋放之CTLA-4介導之抑制。在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段阻斷人類及猴CTLA-4兩者的CTLA-4誘導之T細胞下調及/或IL-2釋放之CTLA-4介導之抑制。在某些實施例中，如藉由IL-2產生所證明，抗體或其抗原結合片段以比同型對照抗體所觀測到之速率高出4倍至6倍的速率阻斷CTLA-4誘導之T細胞下調。
在某些實施例中，本發明抗體在向有需要之個體預防性投與 時適用於抑制腫瘤生長或延遲癌症進程且可增加個體之存活期。舉例而言，本發明抗體之投與可引起原發性腫瘤縮小且可預防轉移或第二腫瘤之發展。在某些實施例中，本發明抗體在向有需要之個體治療性投與時適用於抑制腫瘤生長且可增加個體之存活期。舉例而言，向個體投與治療有效量之本發明抗體可引起個體中之已建立的腫瘤縮小並消失。在某些實施例中，局部(瘤內或瘤周)投與一或多種本發明抗體且其引起所注射之腫瘤病灶中及遠端腫瘤病灶中(遠隔效應(abscopal effect))腫瘤生長之抑制。
在各種實施例中，本發明提供一種與CTLA-4結合之經分離重組單株抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段展現以下特徵中之一或多者：(i)包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的HCVR：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474及490或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；(ii)包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的LCVR：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482及498或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；(iii)包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的HCDR3域：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、320、336、352、368、384、400、416、432、448、464、480及496或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的LCDR3域：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、 112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、328、344、360、376、392、408、424、440、456、472、488及504或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；(iv)包括具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的HCDR1域：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、316、332、348、364、380、396、412、428、444、460、476及492或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的HCDR2域：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、318、334、350、366、382、398、414、430、446、462、478及494或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的LCDR1域：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、324、340、356、372、388、404、420、436、452、468、484及500或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；及具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的LCDR2域：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、326、342、358、374、390、406、422、438、454、470、486及502或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列一致性之大體上相似序列；(v)如在表面電漿子共振分析中在25℃下所量測，以小於約20nM之結合解離平衡常數(KD)結合二聚人類及猴CTLA-4；(vi)如在表面電漿子共振分析中在25℃下所量測，以大於約4分鐘之解離半衰期(t½)結合二聚人類及猴CTLA-4；(vii)如使用細胞黏 附分析所測定，以小於約320nM之IC50阻斷hCTLA-4與hB7-1(CD80)及/或hB7-2(CD86)結合；(viii)如藉由競爭夾心ELISA所量測，將hCTLA-4與人類B7-1及/或人類B7-2之結合阻斷至少85%；(ix)如藉由電化學發光分析所量測，以小於約6nM之EC50與人類CTLA-4表現細胞結合；(x)以大於10倍約與對照細胞之結合的比率與hCTLA-4表現細胞結合；(xi)如電化學發光分析藉由所量測，以小於約0.5nM之EC50與猴CTLA-4表現細胞結合；(xii)如藉由T細胞/APC螢光素酶報導分析所量測，以小於8nM之EC50阻斷CTLA-4誘導之T細胞下調；(xiii)阻斷人類及猴CTLA-4兩者之CTLA-4誘導之T細胞下調；(xiv)如在T細胞/APC IL-2釋放分析中所測定，以小於約50nM之EC50拯救IL-2釋放之CTLA-4介導之抑制；(xv)阻斷人類及猴CTLA-4兩者的CTLA-4誘導之T細胞下調及/或IL-2釋放之CTLA-4介導之抑制；(xvi)如藉由IL-2產生所證明，以比同型對照抗體所觀測到之速率高出4倍至6倍之速率阻斷CTLA-4誘導之T細胞下調；(xvii)抑止具有癌症之個體的腫瘤生長且增加存活期；及(xviii)為完全人類的。
本發明抗體可具有前述生物學特徵中之一或多者或其任何組合。本發明抗體之其他生物學特徵將在本領域中一般熟習此項技術者審閱本發明，包含本文中之實施例後顯而易見。
物種選擇性及物種交叉反應性
根據本發明之某些實施例，抗CTLA-4抗體與人類CTLA-4結合，但不與其他物種之CTLA-4結合。或者，在某些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體與人類CTLA-4及來自一或多個非人類物種之CTLA-4結合。舉例而言，本發明之抗CTLA-4抗體可與人類CTLA-4結合且可視具體情況結合或不結合小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、沙鼠、豬、貓、狗、兔、 山羊、綿羊、母牛、馬、駱駝、食蟹獼猴、狨猴、恆河猴或黑猩猩CTLA-4中之一或多者。在某些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體可以相同親和力或以不同親和力與人類及食蟹獼猴CTLA-4結合，但不與大鼠及小鼠CTLA-4結合。
抗原決定基定位(Epitope Mapping)及相關技術
本發明包含與CTLA-4分子之一或多個域內所發現的一或多個胺基酸相互作用的抗CTLA-4抗體，所述一或多個域包含例如細胞外域、跨膜域及細胞質域。抗體所結合之抗原決定基可由位於CTLA-4分子之前述域中之任一者內的3個或更多個(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個)胺基酸之單一連續序列組成(例如域中之線性抗原決定基)。或者，抗原決定基可由位於CTLA-4分子之前述任何域或所有域內的複數個非相鄰胺基酸(或胺基酸序列)組成(例如構形抗原決定基)。
本領域中一般熟習此項技術者已知之各種技術可用於判定抗體是否在多肽或蛋白質內「與一或多個胺基酸相互作用」。例示性技術包含例如常規交叉阻斷分析，諸如Antibodies,Harlow及Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)中所述之分析。其他方法包含丙胺酸掃描突變分析、肽墨點分析(Reineke(2004)Methods Mol.Biol.248：443-63)、肽裂解分析、結晶學研究及NMR分析。另外，可以採用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及化學修飾抗原之方法(Tomer(2000)Prot.Sci.9：487-496)。可用於鑑別多肽內與抗體相互作用之胺基酸的另一方法為藉由質譜偵測之氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法涉及氘標記所關注之蛋白質，接著使抗體與氘標記之蛋白質結合。接著，將蛋白質/抗體複合物轉移至水中且胺基酸內由抗體複合物保護之可交換質子以比不是界面之 一部分的胺基酸內的可交換質子慢的速率發生氘回到氫之交換。因此，形成蛋白質/抗體界面之一部分的胺基酸可保留氘且因此相比於未包含在界面中的胺基酸而言，展現相對較高的質量。在抗體解離之後，對目標蛋白質進行蛋白酶裂解及質譜分析，藉此展現對應於與抗體相互作用之特定胺基酸的氘標記殘基。參見例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267：252-259；Engen及Smith(2001)Anal.Chem.73：256A-265A。
術語「抗原決定基」係指抗原上B細胞及/或T細胞所響應的位點。B細胞抗原決定基可由藉由蛋白質之三級摺疊並列的相鄰胺基酸或非相鄰胺基酸形成。由相鄰胺基酸形成的抗原決定基通常在暴露於變性溶劑後保留，而藉由三級摺疊形成的抗原決定基在用變性溶劑處理後通常消失。抗原決定基在獨特空間構形中通常包含至少3個，且更通常至少5個或8-10個胺基酸。
修飾輔助剖析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，亦稱為基於抗原結構之抗體剖析(Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，為根據各抗體對經化學或酶修飾之抗原表面的結合概況的相似性，對大量針對同一抗原之單株抗體(mAb)進行分類的方法(參見US 2004/0101920，特此以全文引用的方式併入本文中)。各類別可反映與由另一類別表示之抗原決定基明顯不同或部分重疊的獨特抗原決定基。此項技術允許快速過濾基因相同的抗體，使得表徵可以集中於基因不同的抗體。當應用於融合瘤篩選時，MAP可促進產生具有所期望特徵之mAb的稀有融合瘤純系的鑑別。MAP可用以將本發明抗體分成結合不同抗原決定基之抗體組。
在某些實施例中，抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段結合如SEQ ID NO：505中所舉例說明呈天然形式的或以重組方式產生的CTLA-4 中所舉例說明的區域中之任何一或多者內的抗原決定基，或與其片段結合。
本發明包含與本文表1中所述之特定例示性抗體中之任一者或具有表1中所述之例示性抗體中之任一者之CDR序列的抗體結合於同一抗原決定基或抗原決定基之一部分的抗CTLA-4抗體。同樣，本發明亦包含與本文表1中所述之特定例示性抗體中之任一者或具有表1中所述之例示性抗體中之任一者之CDR序列的抗體競爭與CTLA-4或CTLA-4片段結合的抗CTLA-4抗體。舉例而言，本發明包含與本文所舉例說明之一或多種抗體(例如H1H19303P或H1H19319P2)交叉競爭與CTLA-4結合的抗CTLA-4抗體。
藉由使用此項技術中已知之常規方法，可以容易地判定抗體是與參考抗CTLA-4抗體結合於同一抗原決定基還是競爭結合。舉例而言，為判定測試抗體是否與本發明之參考抗CTLA-4抗體結合於同一抗原決定基，使參考抗體在飽和條件下與CTLA-4蛋白質或肽結合。接著，評定測試抗體與CTLA-4分子結合之能力。若測試抗體能夠在用參考抗CTLA-4抗體飽和結合之後與CTLA-4結合，則可得出測試抗體與參考抗CTLA-4抗體結合於不同抗原決定基的結論。另一方面，若測試抗體不能夠在用參考抗CTLA-4抗體飽和結合之後與CTLA-4蛋白質結合，則測試抗體可與本發明之參考抗CTLA-4抗體所結合之抗原決定基相同的抗原決定基結合。
為判定抗體是否與參考抗CTLA-4抗體競爭結合，按兩個方向進行上述結合方法：在第一方向中，使參考抗體與CTLA-4蛋白質在飽和條件下結合，隨後評定測試抗體與CTLA-4分子之結合。在第二方向中，使測試抗體與CTLA-4分子在飽和條件下結合，隨後評定參考抗體與CTLA-4分子之結合。若在兩個方向中，只有第一(飽和)抗體能夠與CTLA-4分子結合，則得出測試抗體及參考抗體競爭與CTLA-4結合的結論。如本領域中 熟習此項技術者應理解，與參考抗體競爭結合之抗體未必與參考抗體結合於同一抗原決定基，但可藉由結合重疊或相鄰抗原決定基而在空間上阻斷參考抗體之結合。
兩個抗體若各自競爭性地抑制(阻斷)另一個與抗原之結合，則結合於相同或重疊的抗原決定基。亦即，1、5、10、20或100倍過量的一種抗體抑制另一種之結合達至少50%，但是較佳75%、90%或甚至99%，如在競爭性結合分析中所量測(參見例如Junghans等人，Cancer Res.1990 50：1495-1502)。或者，若抗原中減少或消除一種抗體之結合的基本上所有胺基酸突變減少或消除了另一抗體之結合，則兩個抗體具有相同抗原決定基。若減少或消除一個抗體之結合的一些胺基酸突變減少或消除另一抗體之結合，則兩個抗體具有重疊抗原決定基。
隨後可進行其他常規實驗(例如肽突變及結合分析)，以確認所觀測到之測試抗體之結合缺失實際上是否是由於與參考抗體結合於同一抗原決定基，或是否是空間阻斷(或另一現象)負責所觀測到之結合缺乏。這種實驗可以使用ELISA、RIA、表面電漿子共振、流動式細胞測量術或此項技術中可用之任何其他定量或定性抗體結合分析進行。
免疫結合物
本發明涵蓋一種人類抗CTLA-4單株抗體，其與諸如細胞毒素或化學治療劑之治療部分結合(「免疫結合物」)以治療癌症。如本文所用之術語「免疫結合物」係指以化學方式或以生物方式與細胞毒素、放射性試劑、細胞介素、干擾素、目標或報導部分、酶、毒素、肽或蛋白質或治療劑連接的抗體。抗體可沿著分子在任何位置與細胞毒素、放射性試劑、細胞介素、干擾素、目標或報導部分、酶、毒素、肽或治療劑連接，只要其能夠結合其目標即可。免疫結合物之實例包含抗體藥物結合物及抗 體-毒素融合蛋白。在一個實施例中，試劑可為針對CTLA-4之第二不同抗體。在某些實施例中，抗體可與對腫瘤細胞或病毒感染細胞具有特異性之試劑結合。在一個實施例中，抗體與對T細胞具有特異性之試劑結合。可與抗CTLA-4抗體結合之治療部分之類型且將考慮待治療之病況及待達成之所期望的治療效果。適合形成免疫結合物之試劑的實例為此項技術中已知的；參見例如WO 05/103081。
多特異性抗體
本發明抗體可為單特異性、雙特異性或多特異性。多特異性抗體可對一個目標多肽之不同抗原決定基具有特異性或可含有對超過一個目標多肽具有特異性之抗原結合域。參見例如Tutt等人，1991,J.Immunol.147：60-69；Kufer等人，2004,Trends Biotechnol.22：238-244。
在一個態樣中，本發明包含多特異性抗原結合分子或其抗原結合片段，其中免疫球蛋白之一種特異性係特異性針對CTLA-4之細胞外域或其片段，且免疫球蛋白之另一特異性係特異性針對CTLA-4之細胞外域外的結合或第二治療目標，或與治療部分結合。
如本領域中一般熟習此項技術者所知，本發明之多特異性抗原結合分子中之任一者或其變異體可使用標準分子生物技術(例如重組DNA及蛋白質表現技術)構築。
在一些實施例中，CTLA-4特異性抗體以雙特異性型式(「雙特異性抗體(bi-specific)」)產生，其中與CTLA-4之不同域結合的可變區連接在一起以在單一結合分子內賦予雙域特異性。恰當設計的雙特異性抗體可經由增加特異性及結合親合力來增強整體CTLA-4抑制功效。對個別域(例如N端域之區段)具有特異性或可與一個域內之不同區域結合的可變區在允許各區域同時與各別抗原決定基或與一個域內之不同區域結合的 結構架構上配對。在一個實例中，關於雙特異性抗體，來自對一個域具有特異性之結合子的重鏈可變區(VH)與來自一系列對第二域具有特異性之結合子的輕鏈可變區(VL)重組以鑑別可與初始VH配對而不破壞對彼VH之初始特異性的非同源VL搭配物。以此方式，單一VL區段(例如VL1)可與兩個不同VH域(例如VH1及VH2)組合以產生包括兩個結合「臂」(VH1-VL1及VH2-VL1)的雙特異性抗體。單一VL區段之使用降低了系統複雜性，由此簡化用於產生雙特異性抗體之選殖、表現及純化製程並提高效率(參見例如USSN13/022759及US2010/0331527)。
或者，結合超過一個域及第二目標之抗體，例如但不限於例如第二不同抗CTLA-4抗體，可使用本文所述之技術或本領域中熟習此項技術者已知之其他技術以雙特異性型式製備。可將與不同區域結合之抗體可變區及與例如CTLA-4之細胞外域上之相關位點結合之可變區連接在一起，以在單一結合分子內賦予雙重抗原特異性。具有此性質之恰當設計的雙特異性抗體起雙重作用。將對細胞外域具有特異性之可變區與對細胞外域外部具有特異性之可變區組合且在允許各可變區與各別抗原結合之結構架構上配對。
可在本發明之情形下使用的例示性雙特異性抗體型式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3域及第二Ig CH3域，其中第一及第二Ig CH3域彼此相差至少一個胺基酸，且其中相比於缺乏胺基酸差異之雙特異性抗體，至少一個胺基酸差異減小了雙特異性抗體與蛋白A之結合。在一個實施例中，第一Ig CH3域結合蛋白A且第二Ig CH3域含有減少或消除蛋白A結合之突變，諸如H95R修飾(根據IMGT外顯子編號；根據EU編號係H435R)。第二CH3可進一步包括Y96F修飾(根據IMGT；根據EU係Y436F)。可發現於第二CH3內之其他修飾在IgG1抗體之情況下包含： D16E、L18M、N44S、K52N、V57M及V82I(根據IMGT；根據EU係D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；在IgG2抗體之情況下包含：N44S、K52N及V82I(IMGT；根據EU係N384S、K392N及V422I)；及在IgG4抗體之情況下包含：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q及V82I(根據IMGT；根據EU係Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q及V422I)。上文所描述的雙特異性抗體型式上之變化涵蓋在本發明之範疇內。
可在本發明之情形下使用之其他例示性雙特異性型式包含但不限於例如基於scFv或雙功能抗體雙特異性型式、IgG-scFv融合物、雙重可變域(dual variable domain，DVD)-Ig、四源雜交瘤(Quadroma)、杵臼(knobs-into-holes)、常見輕鏈(例如具有杵臼之常見輕鏈等)、交叉Mab(CrossMab)、交叉Fab(CrossFab)、(SEED)體、白胺酸拉鏈(leucine zipper)、Duobody、IgG1/IgG2、雙重作用Fab(DAF)-IgG及Mab2雙特異性型式(關於前述型式之綜述，參見例如Klein等人2012,mAbs4：6,1-11，及其中所引用之參考文獻)。雙特異性抗體亦可使用肽/核酸結合來構築，例如其中使用具有正交化學反應性之非天然胺基酸來產生位點特異性抗體-寡核苷酸結合物，其隨後自組裝成具有規定組成、價數及幾何結構之多聚複合物。(參見例如Kazane等人，J.Am.Chem.Soc.[電子版：2012年12月4日])。
治療性投藥及調配物
本發明提供包括本發明之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段的治療性組合物。根據本發明之治療性組合物將與適合載劑、賦形劑及其他併入於調配物中以提供改良的轉移、遞送、耐受性及類似特性之試劑一起投與。眾多適當調配物可發現於所有醫藥化學家已知的處方集： Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA中。此等調配物包含例如散劑、糊劑、軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂質、含有脂質(陽離子或陰離子型)之囊泡(諸如LIPOFECTINTM)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油型及油包水型乳液、乳液卡波蠟(carbowax)(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠及含有卡波蠟之半固體混合物。亦參見Powell等人「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。
抗體之劑量可視待投藥之個體的年齡及身材、目標疾病、病狀、投藥途徑及類似因素而變化。當使用本發明抗體來治療成年患者之疾病或病症或預防此類疾病時，正常按以下單次劑量投與本發明抗體係有利的：每公斤體重約0.1至約60mg、更佳地每公斤體重約5至約60、約20至約50、約10至約50、約1至約10或約0.8至約11mg。視病狀之嚴重程度而定，可調整治療之頻率及持續時間。在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可以至少約0.1mg至約800mg、約1至約500mg、約5至約300mg或約10至約200mg、至約100mg或至約50mg之初始劑量投與。在某些實施例中，初始劑量之後可以大致上與初始劑量相同或小於初始劑量之量投與第二或複數個後續劑量的抗體或其抗原結合片段，其中各後續劑量之間間隔至少1天至3天；至少一週；至少2週；至少3週；至少4週；至少5週；至少6週；至少7週；至少8週；至少9週；至少10週；至少12週；或至少14週。
各種遞送系統已知且可用於投與例如封裝於脂質體、微粒、微膠囊中之本發明之醫藥組合物、能夠表現突變型病毒之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見例如Wu等人(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入方法包含但不限於皮內、經皮、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻 內、硬膜外及經口途徑。組合物可藉由任何適宜途徑投與，例如藉由輸注或快速注射(bolus injection)、藉由經由上皮或黏膜皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸黏膜及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物學活性劑一起投與。可全身或局部投與。醫藥組合物亦可在囊泡、尤其是脂質體中遞送(參見例如Langer(1990)Science 249：1527-1533)。
本文亦設想使用奈米粒子遞送本發明抗體。可使用抗體結合的奈米粒子用於治療及診斷應用。抗體結合的奈米粒子及製備及使用方法由Arruebo,M.等人2009(「Antibody-conjugated nanoparticles for biomedical applications」J.Nanomat.第2009卷，文章ID 439389,24頁，doi：10.1155/2009/439389)詳細描述，其以引入之方式併入本文中。可開發奈米粒子且將其與醫藥組合物中所含的抗體結合以靶向腫瘤細胞或自體免疫性組織細胞或病毒感染細胞。用於藥物遞送之奈米粒子亦描述於例如US 8257740或US 8246995中，其各自以全文併入本文中。
在某些情況下，醫藥組合物可在控制釋放系統中遞送。在一個實施例中，可使用泵。在另一實施例中，可使用聚合物材料。在另一實施例中，控制釋放系統可置放在組合物之目標的附近，因此僅需要全身性劑量之一部分。
可注射製劑可包含用於靜脈內、皮下、瘤內、瘤周、皮內、顱內、腹膜內及肌肉內注射、點滴輸注(drip infusion)等的劑型。此等可注射製劑可藉由公開已知之方法製備。舉例而言，可注射製劑可例如藉由在習知用於注射之無菌水性介質或油性介質中溶解、懸浮或乳化上文所描述之抗體或其鹽來製備。關於注射用水性介質，存在例如生理鹽水、含有葡萄糖及其他輔助劑之等張溶液等，其可與適當助溶劑組合使用，所述助溶劑諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子型 界面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。關於油性介質，採用例如芝麻油、大豆油等，其可與諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等助溶劑組合使用。較佳將由此製備之注射液填充於適當安瓿中。
本發明之醫藥組合物可用標準針頭及注射器皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送，筆式遞送裝置易於在遞送本發明之醫藥組合物時應用。此類筆式遞送裝置可為可再用的或拋棄式的。可再用的筆式遞送裝置一般利用含有醫藥組合物之可替換筒。在筒內所有醫藥組合物都已投與且筒為空的之後，可容易地丟棄空筒且用含有醫藥組合物之新筒替換。隨後可再使用筆式遞送裝置。在拋棄式筆式遞送裝置中，不存在可替換筒。確切而言，拋棄式筆式遞送裝置預填充有保存於裝置內之儲集器中的醫藥組合物。一旦清空儲集器之醫藥組合物，即丟棄整個裝置。
許多可再用筆式及自動注射器遞送裝置可應用於本發明之醫藥組合物的皮下遞送。僅列舉幾例，實例包含但當然不限於：AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM筆(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM筆、HUMALOGTM筆、HUMALIN 70/30TM筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTM I、II及III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM及OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)。僅列舉幾例，可應用於皮下遞送本發明之醫藥組合物的拋棄式筆式遞送裝置之實例包含但當然不限於：SOLOSTARTM筆(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)及KWIKPENTM(Eli Lilly)、SURECLICKTM自動注射器(Amgen, Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)及HUMIRATM筆(Abbott Labs,Abbott Park,IL)。
上文所述之用於經口或非經腸使用之醫藥組合物宜製備成呈適於配合活性成分之劑量之單位劑量的劑型。此類呈單位劑量之劑型包含例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。單位劑量中所含抗體之量一般為每劑型約5至約500mg；尤其呈注射劑形式，對於其他劑型而言，含有約5至約100mg及約10至約250mg的抗體係較佳的。
抗體之治療性用途
本發明抗體尤其適用於治療、預防及/或改善與CTLA-4表現、信號傳導或活性相關或由其介導、或可藉由阻斷CTLA-4與CTLA-4配體B7-1/CD80及/或B7-2/CD86之間的相互作用或以其他方式抑制CTLA-4活性及/或信號傳導來治療的任何疾病或病症。可投與一或多種本發明抗體來減輕或預防疾病或病症之症狀或病況中之一或多者或減小其嚴重程度。舉例而言，本發明提供藉由向有需要此類治療之患者投與如本文所述之抗CTLA-4抗體(或包括抗CTLA-4抗體之醫藥組合物)來治療癌症(腫瘤生長抑制)及/或病毒感染的方法，及用於治療癌症(腫瘤生長抑制)及/或病毒感染的抗CTLA-4抗體(或包括抗CTLA-4抗體之醫藥組合物)。本發明抗體適用於治療、預防及/或改善諸如癌症或病毒感染之疾病或病症或病況及/或用於改善至少一種與此類疾病、病症或病況相關之症狀。在本文所述之治療方法之情況下，抗CTLA-4抗體可以單一療法(亦即作為唯一治療劑)或與一或多種額外治療劑(其實例描述於本文其他地方中)組合投與。
在本發明之一些實施例中，本文所述之抗體適用於治療患有原發性或再發性癌症之個體，所述癌症包含但不限於血癌、腦癌(例如多 形性神經膠質母細胞瘤)、腎細胞癌(例如透明細胞腎癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌(例如三陰性乳癌)、腎癌、子宮頸癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、胰臟癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤及黑色素瘤。
如本文所用之術語「血癌」包含影響血液、骨髓、淋巴或淋巴系統之血液科惡性疾病。因此，所述術語包含來自淋巴及骨髓細胞譜系之細胞的惡性疾病。骨髓細胞株正常產生粒細胞、紅血球、凝血細胞、巨噬細胞及肥大細胞；淋巴細胞株產生B、T、NK及漿細胞。因此，所述術語包含以上提及之細胞的惡性疾病，即淋巴瘤、骨髓瘤、淋巴性白血病及骨髓性白血病。實例包含但不限於急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性單核球性白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)、非霍奇金氏淋巴瘤(例如B細胞淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤)及骨髓瘤(包含多發性骨髓瘤)。
可使用抗體來治療癌症之早期或晚期症狀。在一個實施例中，可使用本發明之抗體或其片段來治療晚期癌或轉移癌。抗體適用於減少或抑制或縮小實體腫瘤及血癌的腫瘤生長。在某些實施例中，用本發明之抗體或其抗原結合片段治療引起個體中之腫瘤發生超過40%之消退、超過50%之消退、超過60%之消退、超過70%之消退、超過80%之消退或超過90%之消退。在某些實施例中，抗體可用於預防腫瘤復發。在某些實施例中，抗體適用於延長具有癌症之個體的無進展存活期或總存活期。在一些實施例中，抗體適用於減小因為化學療法或放射線療法所引起的毒性，同時保持患有癌症之患者長期存活。在某些實施例中，將一或多種本發明抗體局部注射至一或多個腫瘤病灶中9瘤內或瘤周)，且在個體中之所注射腫瘤中以及在一或多個相鄰或遠端腫瘤(遠隔效應)中引起腫瘤生長抑 制。
在某些實施例中，本發明抗體適用於治療患有慢性病毒感染之個體。在一些實施例中，本發明抗體適用於降低宿主中之病毒效價及/或拯救耗竭性T細胞。在某些實施例中，本發明之抗體或其片段可用於治療由淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)所導致的慢性病毒感染。在一些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可以治療劑量向被人類免疫缺乏病毒(HIV)或人類乳頭狀瘤病毒(HPV)或B型/C型肝炎病毒(HBV/HCV)感染的患者投與。在相關實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可用於治療諸如食蟹獼猴之猿猴個體中由猿猴免疫缺乏病毒(SIV)所導致的感染。
在某些實施例中，可向患有癌症或病毒感染之個體投與治療有效量的本發明之阻斷抗體。
在某些實施例中，將一或多種本發明抗體局部投與至具有癌症之個體中之腫瘤中或腫瘤病灶附近(瘤內或瘤周)以使全身暴露降到最低且預防/改善因為抗體之全身暴露所導致的毒性。
本文亦涵蓋對有風險患上諸如癌症及病毒感染之疾病或病症的患者預防性地使用一或多種本發明抗體。
在本發明之另一實施例中，本發明抗體用於製備用於治療患有癌症或病毒感染之患者的醫藥組合物。在本發明之另一實施例中，本發明抗體作為輔助療法與本領域中熟習此項技術者已知適用於治療癌症或病毒感染之任何其他藥劑或任何其他療法一起使用。
組合療法及調配物
組合療法可包含本發明之抗CTLA-4抗體及宜與本發明抗體或本發明抗體之生物學活性片段組合的任何額外治療劑。
本發明抗體可與一或多種用於治療或抑制癌症之抗癌藥或療法以協同方式組合，所述癌症包含例如血癌、腦癌(例如多形性神經膠質母細胞瘤)、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、皮膚癌、子宮頸癌、胃癌、腎癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤及黑色素瘤。本文中設想本發明之抗CTLA-4抗體與免疫刺激性及/或免疫支持性療法組合使用來抑制腫瘤生長及/或提高癌症患者之存活期。免疫刺激性療法包含藉由針對受抑止免疫細胞「釋放制動器(releasing the brake)」或「加速(stepping on the gas)」活化免疫反應來強化免疫細胞活性的直接免疫刺激性療法。實例包含靶向其他檢查點受體、疫苗接種及佐劑。免疫支持型式可藉由促進免疫原性細胞死亡、炎症來增加腫瘤之抗原性或具有其他促進抗腫瘤免疫反應的間接作用。實例包含放射線、化學療法、抗血管生成劑及手術。
在各種實施例中，一或多種本發明抗體可與以下各者組合使用：PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，諸如納武單抗、派姆單抗、皮立珠單抗(pidilizumab)、BGB-A317或REGN2810)、PD-L1抑制劑(例如抗PD-L1抗體，諸如阿維魯單抗(avelumab)、阿特珠單抗、德瓦魯單抗、MDX-1105或REGN3504)、LAG3抑制劑、TIM3抑制劑、BTLA抑制劑、TIGIT抑制劑、CD47抑制劑、CD28抑制劑、CSF1R抑制劑、CXCR抑制劑、CCR4抑制劑、CCR8抑制劑、CD40抑制劑、OX40抑制劑、GITR抑制劑、另一T細胞共抑制劑或配體之拮抗劑(例如針對CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA之抗體)、吲哚胺-2,3-二氧酶(IDO)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑[例如「VEGF捕獲劑(VEGF-Trap)」，諸如阿柏西普或如US 7,087,411中所闡述之其他抑制VEGF之融合蛋白或抗VEGF抗體或其抗原結合片段(例如貝伐單抗或蘭尼單抗(ranibizumab)) 或VEGF受體之小分子激酶抑制劑(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕佐泮尼(pazopanib)]、Ang2抑制劑(例如內斯瓦庫單抗)、轉形生長因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)抑制劑、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab))、CD20抑制劑(例如抗CD20抗體，諸如利妥昔單抗(rituximab))、針對腫瘤特異性抗原[例如CA9、CA125、黑色素瘤相關抗原3(melanoma-associated antigen 3，MAGE3)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、波形蛋白(vimentin)、腫瘤-M2-PK、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、黏蛋白-1、MART-1及CA19-9]之抗體、疫苗(例如卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)、癌症疫苗)、用以增加抗原呈現之佐劑(例如粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子)、雙特異性抗體(例如CD3×CD20雙特異性抗體或PSMA×CD3雙特異性抗體)、細胞毒素、化學治療劑(例如達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、環磷醯胺、多西他賽(docetaxel)、小紅莓、道諾黴素、順鉑、卡鉑(carboplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、甲胺喋呤(methotrexate)、米托蒽醌、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇及長春新鹼)、環磷醯胺、手術、放射線療法、IL-6R抑制劑(例如沙瑞盧單抗(sarilumab))、IL-4R抑制劑(例如度匹魯單抗(dupilumab))、IL-10抑制劑、諸如IL-2、IL-7、IL-21及IL-15之細胞介素、抗體-藥物結合物(antibody-drug conjugate，ADC)(例如抗CD19-DM4 ADC及抗DS6-DM4 ADC)、消炎藥(例如皮質類固醇及非類固醇消炎藥)、諸如抗氧化劑之膳食補充劑或任何其他用於治療癌症之療法護理。在某些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體可與包含樹突狀細胞疫苗、溶瘤病毒、腫瘤細胞疫苗等癌症疫苗組合使用來強化抗腫瘤反應。可與本發明之抗CTLA-4抗體組合使 用之癌症疫苗的實例包含用於黑色素瘤及膀胱癌之MAGE3疫苗、用於乳癌之MUC1疫苗、用於腦癌(包含多形性神經膠質母細胞瘤)之EGFRv3(例如林德佩皮姆(Rindopepimut))或ALVAC-CEA(用於CEA+癌症)。
在某些實施例中，在用於產生長期耐用抗腫瘤反應及/或提高具有癌症之患者的存活期的方法中，本發明之抗CTLA-4抗體可與放射線療法組合投與。在一些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體可在向癌症患者投與放射線療法之前、同時或之後投與。舉例而言，可向腫瘤病灶投與一或多個劑量的放射線療法，隨後投與一或多個劑量的本發明之抗CTLA-4抗體。在一些實施例中，可局部投與放射線療法至腫瘤病灶以增強患者腫瘤之局部免疫原性(輔助放射線)及/或殺死腫瘤細胞(燒蝕性放射線)，隨後全身性投與本發明之抗CTLA-4抗體。舉例而言，可向具有腦癌(例如多形性神經膠質母細胞瘤)之患者投與顱內放射線，與全身性投與本發明之抗CTLA-4抗體相組合。在某些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體可與放射線療法及化學治療劑(例如替莫唑胺)或VEGF拮抗劑(例如阿柏西普)組合投與。在某些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體可與放射線療法及化學治療劑(例如替莫唑胺)或PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，諸如REGN2810、納武單抗或派姆單抗)組合投與。
在某些實施例中，本發明之抗CTLA-4抗體可與一或多種用於治療由LCMV、HIV、HPV、HBV或HCV引起之慢性病毒感染的抗病毒藥組合投與。抗病毒藥之實例包含但不限於齊多夫定、拉米夫定、阿巴卡韋、利巴韋林、洛匹那韋、依法韋侖、考比西他、田諾弗、利匹韋林及皮質類固醇。
額外治療活性劑/組分可在投與本發明之抗CTLA-4抗體之前、同時或之後投與。出於本揭示案的目的，考慮這樣的投藥方案：抗 CTLA-4抗體「與」第二治療活性組分「組合」投與。
額外治療活性組分可在投與本發明之抗CTLA-4抗體之前向個體投與。舉例而言，若第一組分在投與第二組分前1週、前72小時、前60小時、前48小時、前36小時、前24小時、前12小時、前6小時、前5小時、前4小時、前3小時、前2小時、前1小時、前30分鐘、前15分鐘、前10分鐘、前5分鐘或前不到1分鐘投與，則可視為第一組分係「在」第二組分「之前」投與。在其他實施例中，額外治療活性組分可在投與本發明之抗CTLA-4抗體之後向個體投與。舉例而言，若第一組分在投與第二組分之後1分鐘、之後5分鐘、之後10分鐘、之後15分鐘、之後30分鐘、之後1小時、之後2小時、之後3小時、之後4小時、之後5小時、之後6小時、之後12小時、之後24小時、之後36小時、之後48小時、之後60小時、之後72小時投與，則可視為第一組分係「在」第二組分「之後」投與。在其他實施例中，額外治療活性組分可與投與本發明之抗CTLA-4抗體同時向個體投與。出於本發明之目的，「同時」投藥包含例如以單一劑型(例如共同調配)或以相互之間在約30分鐘或更短時間內向個體投與的各別劑型向個體投與抗CTLA-4抗體及額外治療活性組分。若以各別劑型投與，則各劑型可經由相同途徑投與(例如，抗CTLA-4抗體及額外治療活性組分均可靜脈內、皮下等投與)；或者，各劑型可經由不同途徑投與(例如抗CTLA-4抗體可靜脈內投與，且額外治療活性組分可皮下投與)。在任何情況下，出於本揭示案的目的，以單一劑型、以相同途徑的各別劑型或以不同途徑的各別劑型投與組分皆視為「同時投藥」。出於本揭示案的目的，在投與額外治療活性組分「之前」、「同時」或「之後」(如在上文中所定義之彼等術語)投與抗CTLA-4抗體皆視為抗CTLA-4抗體「與」額外治療活性組分「組合」投與。
本發明包含醫藥組合物，其中本發明之抗CTLA-4抗體與如本文其他地方所述之額外治療活性組分中之一或多者一起使用各種劑量組合共同調配。
在本發明之抗CTLA-4抗體與PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，如以全文引用之方式併入本文中的US 2015/0203579中所揭示)組合投與的例示性實施例中，包含包括抗CTLA-4抗體及PD-1抑制劑之共同調配物之投與，可使用各種劑量組合向個體投與及/或共同調配個別組分。因此，本發明包含(i)本發明之抗CTLA-4抗體與(ii)PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體，如以全文引用之方式併入本文中的US 2015/0203579中所揭示)之組合，以便同時、分別及/或依序用於治療癌症或病毒感染。舉例而言，抗CTLA-4抗體及PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體)各自可以選自由以下組成之群之量向個體投與及/或含於共同調配物中：0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg及10.0mg/kg。在一個實施例中，抗CTLA-4抗體及PD-1抑制劑(例如抗PD-1抗體)各自可以約50mg至約600mg之量，例如選自由以下組成之群之量向個體投與及/或含於共同調配物中：50mg、100mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg及600mg。組合/共同調配物可根據本文其他地方所揭示之投藥方案中之任一者向個體投與，所述投藥方案包含例如一週兩次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次、每2個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次、每6個月一次等。本發明之抗CTLA-4抗體可以例如以約0.8至約11、約1至約10、約3至約10、約1、 約3或約10mg/kg之劑量，與約3至5或約3.0mg/kg之劑量的PD-1抑制劑(例如，如US 2015/0203579中所揭示之抗PD-1抗體)同時投與。同時投藥可以例如每14天、每21天或每28天進行。
在本發明之抗CTLA-4抗體與抗PD-1抗體及VEGF拮抗劑(例如VEGF捕獲劑，諸如阿柏西普)組合投與的例示性實施例中，包含包括抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體及VEGF拮抗劑之共同調配物的投與，個別組分可使用各種劑量組合向個體投與及/或共同調配。舉例而言，抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體可以選自由以下組成之群之量向個體投與及/或含於共同調配物中：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg及10.0mg；且VEGF拮抗劑(例如VEGF捕獲劑，諸如阿柏西普)可以選自由以下組成之群之量向個體投與及/或含於共同調配物中：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg及3.0mg。組合/共同調配物可根據本文其他地方所揭示之投藥方案中之任一者向個體投與，所述投藥方案包含例如一週兩次、每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次、每2個月一次、每3個月一次、每4個月一次、每5個月一次、每6個月一次等。
投藥方案
根據本發明之某些實施例，可在規定的時間過程內向個體投與多個劑量之抗CTLA-4抗體(或包括抗CTLA-4抗體與本文所提及之額外治療活性劑中之任一者之組合的醫藥組合物)。根據本發明之此態樣的方 法包括向個體依序投與多個劑量之本發明之抗CTLA-4抗體。如本文所用之「依序投與」意謂各劑量之抗CTLA-4抗體在不同時間點向個體投與，例如在間隔預定時間間隔(例如數小時、數天、數週或數月)的不同日子投與。本發明包含如下方法，其包括向患者依序投與單一初始劑量之抗CTLA-4抗體，繼之以一或多個第二劑量之抗CTLA-4抗體，及視情況繼之以一或多個第三劑量之抗CTLA-4抗體。抗CTLA-4抗體可以每公斤個體體重0.1mg至100mg之間的劑量投與。
術語「初始劑量」、「第二劑量」及「第三劑量」係指本發明之抗CTLA-4抗體之投與的時間順序。因此，「初始劑量」為在治療方案開始時投與之劑量(亦稱為「基線劑量」)；「第二劑量」為在初始劑量之後投與之劑量；且「第三劑量」為在第二劑量之後投與之劑量。初始劑量、第二劑量及第三劑量可均含有相同量之抗CTLA-4抗體，但就投藥頻率而言一般彼此不同。然而，在某些實施例中，在治療過程中，初始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含之抗CTLA-4抗體之量彼此不同(例如視情況上調或下調)。在某些實施例中，在治療方案開始時投與兩個或更多個(例如2、3、4或5個)劑量作為「速效劑量(loading dose)」，接著以較低頻率投與後續劑量(例如「維持劑量」)。
在某些實施例中，初始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含之抗CTLA-4抗體之量可為次最佳化的或低於治療劑量(sub-therapeutic)。如本文所用之術語「低於治療劑量」或「次最佳化的」係指所投與的抗體劑量之程度過低以致於不能產生治療效果或低於治療諸如癌症之疾病所必需的程度。
在本發明之某些例示性實施例中，第二劑量及/或第三劑量各自在前一劑量之後1至26週(例如1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、 5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½、15、15½、16、16½、17、17½、18、18½、19、19½、20、20½、21、21½、22、22½、23、23½、24、24½、25、25½、26、26½週或更久)投與。如本文所用之短語「前一劑量」意謂在多次投藥的順序中，在投與所述順序中之下一個劑量之前向患者投與的抗CTLA-4抗體之劑量，沒有中間劑量。
根據本發明之此態樣的方法可包括向患者投與任何數目的第二劑量及/或第三劑量之抗CTLA-4抗體。舉例而言，在某些實施例中，僅向患者投與單一第二劑量。在其他實施例中，向患者投與兩個或更多個(例如2、3、4、5、6、7、8個或更多個)第二劑量。同樣，在某些實施例中，僅向患者投與單一第三劑量。在其他實施例中，向患者投與兩個或更多個(例如2、3、4、5、6、7、8個或更多個)第三劑量。
在涉及多個第二劑量之實施例中，各第二劑量可以與其他第二劑量相同的頻率投與。舉例而言，各第二劑量可在前一劑量之後1至2週或1至2個月向患者投與。類似地，在涉及多個第三劑量之實施例中，各第三劑量可以與其他第三劑量相同的頻率投與。舉例而言，各第三劑量可在前一劑量之後2至12週向患者投與。在本發明之某些實施例中，在治療方案之過程中，向患者投與第二劑量及/或第三劑量之頻率可不同。亦可在治療過程中在臨床檢查之後由醫師根據個別患者之需要來調整投藥頻率。
抗體之診斷性用途
本發明之抗CTLA-4抗體可用於偵測及/或量測樣品中之CTLA-4，例如用於診斷目的。一些實施例設想在用於偵測諸如癌症、自體免疫疾病或病毒感染之疾病或病症的分析中使用一或多種本發明抗體。 CTLA-4之例示性診斷分析可包括例如使獲自個體(例如患者)之樣品與本發明之抗CTLA-4抗體接觸，其中抗CTLA-4抗體經可偵測標記或報導分子標記或用作用於從個體樣品中選擇性分離CTLA-4的捕捉配體。或者，未標記之抗CTLA-4抗體可與自身可偵測地標記之二級抗體組合用於診斷應用中。可偵測標記或報導分子可為放射性同位素，諸如3H、14C、32P、35S或125I；螢光或化學發光部分，諸如螢光素異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate)或若丹明(rhodamine)；或酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或螢光素酶。可用於偵測或量測樣品中之CTLA-4的特定例示性分析包括酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)及螢光活化細胞分選(fluorescence-activated cell sorting，FACS)。
可在根據本發明之CTLA-4診斷分析中使用之樣品包含在正常條件或病理條件下任何可從個體獲得的含有可偵測的數量的CTLA-4蛋白質或其片段的組織或流體樣品。一般而言，將量測從健康患者(例如，未患癌症或自體免疫疾病之患者)獲得之特定樣品中之CTLA-4之含量以首先建立CTLA-4之基線或標準含量。隨後可比較CTLA-4之此基線含量與在從懷疑具有癌症相關病況或與此類病況相關之症狀的個體獲得的樣品中所量測到之CTLA-4含量。
對CTLA-4具有特異性之抗體可不含額外標記或部分，或其可含有N端或C端標記或部分。在一個實施例中，標記或部分為生物素。在結合分析中，標記(若存在)之位置可決定肽相對於發生肽結合之表面的取向。舉例而言，若表面塗有抗生物素蛋白，則含有N端生物素之肽之取向將使得肽之C端部分遠離表面。
本發明之態樣係關於使用所揭示之抗體作為標誌物來預測 患者中之癌症或病毒感染之預後。可在診斷分析中使用本發明抗體來評估患者之癌症預後及預測存活期。
實例
提出以下實例以便為本領域普通技術人員提供如何製得及使用本發明之方法及組合物的完整揭示及說明，且以下實例不意欲限制本發明人視作本發明之物的範疇。關於所用數值(例如量、溫度等)，已努力確保準確性，但應當說明存在一些實驗誤差及偏差。除非另外指明，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度以攝氏度計，室溫為約25℃，且壓力為在大氣壓下或接近大氣壓。
實例1：產生針對CTLA-4之人類抗體
使用人類CTLA-4蛋白質(目錄號：7268-CT，R&D Systems)或編碼hCTLA-4之DNA(寄存編號：NM_005214.4)產生針對CTLA-4之人類抗體。向VELOCIMMUNE®小鼠(亦即經工程改造包括編碼人類免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈可變區之DNA的小鼠)直接投與免疫原，用佐劑刺激免疫反應，如US 8502018 B2中所述。藉由CTLA-4特異性免疫分析監測抗體免疫反應。當達成所期望的免疫反應時，收集脾細胞且使其與小鼠骨髓瘤細胞融合以保留其活力且形成融合瘤細胞株。對融合瘤細胞株進行篩選及選擇以鑑別產生CTLA-4特異性抗體之細胞株。使用此項技術及上述免疫原，獲得若干抗CTLA-4嵌合抗體(亦即，具有人類可變域及小鼠恆定域之抗體)；以此方式從VELOCIMMUNE®小鼠產生的例示性抗體命名為H1M20370N、H1M20372N、H1M20393N、H2M20361N、H2M20368N、H2M20369N、H2M20373N、H2M20375N、H2M20379N、H2M20385N、H2M20386N及H2M20387N。
亦直接從抗原陽性B細胞(從免疫小鼠中之任一者)分離抗 CTLA-4抗體而不與骨髓瘤細胞融合，如特此以全文引用的方式併入本文中之美國專利7,582,298中所述。使用此方法，獲得若干完全人類抗CTLA-4抗體(亦即，具有人類可變域及人類恆定域之抗體)；以此方式產生之例示性抗體命名如下：H1H19264P、H1H19269P、H1H19273P、H1H19274P、H1H19278P、H1H19279P、H1H19280P、H1H19281P、H1H19283P、H1H19284P、H1H19291P、H1H19294P、H1H19303P、H1H19305P、H1H19307P、H1H19312P、H1H19313P、H1H19314P2、H1H19319P2及H1H19327P2。
根據此實例之方法產生的例示性抗體之生物特性詳細描述於下文所闡述之實例中。
實例2：重鏈及輕鏈可變區胺基酸及核苷酸序列
表1闡述所選擇的本發明之抗CTLA-4抗體之重鏈及輕鏈可變區及CDR之胺基酸序列識別符號。對應核酸序列識別符號闡述於表2中。
抗體在本文中通常根據以下命名法指出：Fc前綴(例如「H1M」、「H4H」等)，繼之以數字識別符號(例如「19264」、「20370」等，如表1中所示)，繼之以「P」、「P2」或「N」後綴。因此，根據此命名法，抗體在本文中可被稱作例如「H1M20370N」、「H1H19264P」、「H1H19314P2」等。本文中所用之抗體名稱中之H1H前綴表示抗體之特定Fc區同型。舉例而言，「H1H」抗體具有人類IgG1 Fc，「H1M」抗體具有小鼠IgG1 Fc，且「H2M」抗體具有小鼠IgG2 Fc(所有可變區為完全人類的，如由抗體名稱中之第一個『H』所表示)。如本領域中一般熟習此項技術者應瞭解，具有特定Fc同型之抗體可轉換為具有不同Fc同型之抗體(例如，具有小鼠IgG1 Fc之抗體可轉換為具有人類IgG1或人類IgG4等之抗體)，但是在任何情況下，由表1中所示之數字識別符號表示之可變域(包含CDR)將保持相同，且期望無論Fc域之性質如何，對抗原之結合特性總是相同或大體上相似的。
對照構築體：
出於比較目的，在以下實驗中包含兩個對照構築體(抗CTLA4抗體)：
COMP1：重鏈及輕鏈可變域具有如WO 01/14424 A2(Bristol Myers Squibb)中所闡述且用hIgG1 Fc產生的「10D1」之對應域之胺基酸序列的人類抗CTLA-4抗體。
COMP2：重鏈及輕鏈可變域具有如US 2014/099325 A1(Pfizer)中所闡述且用hIgG2 Fc產生的「11.2.1」之對應域之胺基酸序列的人類抗CTLA-4抗體。
實例3：人類單株抗CTLA-4抗體之由表面電漿子共振得出的結合親和力及動力學常數
人類抗CTLA-4抗體之結合親和力及動力學常數藉由表面電漿子共振(Biacore 4000(GE,Pittsburgh,PA)或MASS-1(Sierra Sensors,Greenville,RI))在25℃下測定(表3及表4)。將表示為人類IgG1之抗體(亦即「H1H」)捕捉至藉由與單株小鼠抗人類Fc抗體(GE)發生胺偶合而衍生化的CM5感測器表面(GE)上。將表示為小鼠IgG1或小鼠IgG2之抗體(亦即「H1M」、「H2M」)捕捉至藉由與多株山羊抗小鼠Fc抗體(GE)發生胺偶合而衍生化的高容量胺感測器表面(Sierra Sensors)上。將各種濃度之經表現具有c端myc-myc-聚組胺酸標籤(mmh)的可溶性人類(h)CTLA-4(SEQ ID NO：506)或食蟹獼猴(Macaca fasicularis，mf)CTLA-4(SEQ ID NO：507)蛋白質以30或50微升/分鐘之流速注射到捕捉有抗CTLA-4 mAb之感測器表面上。CTLA-4為在細胞外域中在半胱胺酸殘基157處藉由一個雙硫鍵互連的均二聚體。
所有結合研究均在由0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v界面活性劑P20構成的緩衝液(HBS-ET操作緩衝液)中進行。監測hCTLA4.mmh或mfCTLA4.mmh與所捕捉之單株抗體之締合4或5分鐘且監測hCTLA4.mmh或mfCTLA4.mmh在HBS-ET操作緩衝液中之解離10分鐘。
動力學締合(k a)及解離(k d)速率常數藉由使用Scrubber 2.0c曲線擬合軟體擬合即時感測器圖譜與1：1結合模型來確定。結合平衡解離常 數(K D)及解離半衰期(t½)從動力學速率常數計算如下： ，且
如表3中所示，本發明之所有抗CTLA-4抗體均與人類CTLA-4結合，許多對hCTLA-4.mmh具有奈莫耳親和力，且展現與食蟹獼猴CTLA-4蛋白質之交叉反應性。未觀測到與小鼠或大鼠CTLA-4蛋白質之交叉反應性(資料未示出)。
*h及mfCTLA-4 mmh蛋白質以在3倍稀釋液中在0.37nM至90nM範圍內之濃度流過mAb捕捉表面；ND=未測定
實例4：抗CTLA-4抗體阻斷人類CTLA-4與其天然配體B7-1及B7-2之間的相互作用
細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)為在習知調節性 T細胞上表現的I型跨膜T細胞抑制性檢查點受體。CTLA-4藉由在與刺激受體CD28競爭與其天然配體B7-1(CD80)及B7-2(CD86)結合的過程中取勝而負調節T細胞活化。在此實例中，使用競爭夾心酶聯免疫吸附分析(ELISA)評定抗CTLA-4抗體阻斷CTLA-4蛋白質與培養盤結合的(plate-bound)B7-1及B7-2結合的能力。將各種濃度之抗CTLA-4抗體與恆定量之二聚CTLA-4蛋白質預混合且監測因為抗體之存在而引起的與培養盤固定的B7-1或B7-2結合之CTLA-4的減少量。
簡言之，使用以下程序進行分析：在96孔微量滴定盤上在PBS中在4℃下以2μg/mL分別塗佈經表現具有c端人類IgG1及6×組胺酸(hIgG1-6×His；R&D Systems,Minneapolis,MN)之人類B7-1及B7-2蛋白質過夜(overnight，ON)。隨後使用0.5%(w/v)BSA於PBS中之溶液阻斷非特異性結合位點。分別將恆定量之200pM或400pM之重組hCTLA-4-mFc蛋白質(經表現具有小鼠IgG2a之c端Fc部分之人類CTLA-4細胞外域，SEQ ID NO：508)添加至經連續稀釋之抗CTLA-4抗體或不存在抗體的溶液中。在此實例中，抗CTLA-4抗體劑量在1.7pM至最大100nM或1.0μM之範圍內。接著，在室溫(room temperature，RT)下1小時之後，將含有200pM恆定濃度之hCTLA-4-mFc蛋白質的抗體-蛋白質複合物轉移至塗有hB7-1-hIgG1-6His之微量滴定盤，且將含有400pM恆定濃度之hCTLA-4-mFc的抗體-蛋白質複合物轉移至塗有hB7-2-hIgG1-6His之培養盤。隨後在室溫下培育1小時之後，洗滌各孔，且用與辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)結合之抗小鼠Fcγ片段特異性山羊多株抗體(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)偵測培養盤結合的hCTLA-4-mFc。使用TMB受質溶液(BD Biosciences,San Jose,CA)，根據製造商之說明書使培養盤顯影，且在Victor盤式讀取器(PerkinElmerTM, Waltham,MA)上量測450nm下之吸光度。
所有資料分析使用S形劑量-反應模型在PrismTM軟體(GraphPad,LaJolla,CA)內進行。如下進行計算：使用定義為hCTLA-4與hB7-1或B7-2之結合減少50%所需的抗體濃度的IC50來指示阻斷效能。在所測試抗體之最大濃度(100nM或1.0μM)下之阻斷百分比按抗體分別阻斷200pM或400pM之hCTLA-4-mFc與hB7-1或hB7-2結合的能力來計算，相對於分析基線而言。含有200pM或400pM之hCTLA-4-mFc的樣品在不存在抗體的情況下的結合信號標記為100%結合或0%阻斷；且不含hCTLA-4-mFc或抗體之樣品緩衝液的基線信號標記為0%結合或100%阻斷。
如表4中之結果所示，本發明之抗CTLA-4抗體展現廣泛範圍的阻斷人類CTLA-4與其天然配體B7-1或B7-2結合的能力。例示性抗體H1H19273P及H1H19313P以皮莫耳IC50值及以約100%之阻斷百分比在1.0μM最大抗體濃度下有效地阻斷CTLA-4與B7-1或B7-2之結合。諸如H1H20373N之若干抗體對CTLA-4與B7-2之結合的阻斷強於對B7-1，而一些抗體則顯示對任一配體之阻斷能力均極小(H1H19314P2)。
負最大阻斷%(亦即-8)表示在抗體存在下所偵測到之hCTLA-4結合之增加量。
(-)表示在所測試之最高濃度下阻斷<50%之抗體的IC50值不定量。
(INC)：不確定：未用PrismTM軟體擬合S形結合曲線來計算IC50值。
(*)表示低於分析之理論下限(關於hCTLA-4與hB7-1/CD80之結合，為0.1×10-09M；或關於hCTLA-4與hB7-2/CD86之結合，為0.2×1009M)的IC50值
實例5：抗CTLA-4抗體展現與人類CTLA-4工程改造細胞株之特異性且有效的結合
在此實例中，使用基於電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)之偵測測定抗人類(h)CTLA-4抗體與表現人類CTLA-4之細胞株特異性結合的能力。
簡言之，用人類CTLA-4(胺基酸M1-N223，NCBI寄存編號NM_005214.4)穩定地轉染從Velocimmune®小鼠分離的小鼠胚胎纖維母細胞(VI-纖維母細胞)。未經轉染之VI-纖維母細胞不具有可藉由螢光活化細胞分選(FACS)偵測之CTLA-4表現且包含所述細胞作為結合對照。另外，亦在此分析中評定藉由用NFAT-Luc慢病毒報導子(Qiagen,Germantown,MD)及h、m或mf CTLA-4嵌合構築體轉導永生化人類Jurkat T細胞(ATCC,Manassas,VA)產生的報導T細胞株。嵌合構築體包括hCTLA-4(aa 1-161；寄存編號NP_005205.2)、小鼠CTLA-4(ms CTLA-4，胺基酸1-161，寄存編號NM_009843.4)或mf CTLA-4(aa 1-161；寄存編號XP_005574071.1)之細胞外域與hCD300a(aa 181-299；寄存編號NP_009192.2)之跨膜域及細胞質域融合。
將約2.0×104個VI-纖維母細胞/hCTLA-4細胞或1.0×104個Jurkat/NFAT嵌合體細胞分別接種至96孔碳電極培養盤(MULTI-ARRAY高結合培養盤，Meso Scale Discovery(MSD；Rockville,MD))上且在37℃下培育1小時(h)。藉由PBS中之2% BSA(w/v)在室溫(RT)下阻斷非特異性結合位點1小時。在室溫下，向培養盤結合的細胞中添加抗CTLA-4或同型對照抗體之在1.7pM至150nM範圍內的連續稀釋液或不含抗體之緩衝液，持續1小時。隨後使用具有細胞洗滌頭之AquaMax2000培養盤洗滌器(MDS Analytical Technologies,Sunnyvale,CA)洗滌培養盤以移 除未結合的抗體。在室溫下，用特異性針對重鏈及輕鏈之SULFO-TAGTM結合的山羊多株抗人類IgG抗體(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)或特異性針對Fcγ片段之SULFO-TAGTM結合的山羊多株抗小鼠IgG抗體(Jackson Immunoresearch)偵測培養盤結合的抗體1小時。
在洗滌之後，用Read Buffer(MSD)根據製造商之推薦程序使培養盤顯影且用SECTOR Imager 600(MSD)記錄發光信號。記錄按相對光單位(relative light unit，RLU)計量的發光強度以指示各抗體在所述濃度範圍下之結合強度。報導藉由0.4nM或0.6nM抗體與CTLA-4工程改造細胞結合相比於在相同濃度下之親本細胞所偵測到的信號比，作為CTLA-4結合特異性之指示。
此外，分析直接結合信號(RLU)隨抗體濃度之變化且使用GraphPad PrismTM軟體(GraphPad,LaJolla,CA)用S形(四參數邏輯)劑量-反應模型擬合資料。測定定義為偵測到最大結合信號之50%時之抗體濃度的EC50值以指示對CTLA-4工程改造細胞之結合效能。
如表5中之結果所示，本發明之大部分抗CTLA-4抗體與hCTLA-4工程改造細胞株特異性結合。諸如H1H19303P及H1H19280P之若干例示性抗體以皮莫耳EC50值及以比與對照細胞株之結合高出20至23倍的比率結合。
進一步評定一系列抗體與小鼠及食蟹獼猴工程改造細胞株之交叉反應性。如表6中之結果所示，抗CTLA-4抗體H1H19303P、H1H19273P、H1H19319P2及H1H19319P以皮莫耳EC50值與Jurkat/NFAT Luc/人類及食蟹獼猴CTLA-4/hCD300嵌合體細胞株有效地結合。未觀測到與小鼠CTLA-4嵌合體細胞之交叉反應性。
表5：抗CTLA-4抗體與經工程改造以表現人類CTLA-4之
NB=非結合子；將結合比率小於3之抗體歸類為非結合子
(*)排除最高的兩個抗體濃度之RLU值來計算EC50值。
INC=不確定，GraphPad PrismTM不能擬合4參數S形曲線進行EC50值計算，但是抗體以比親本細胞高出3倍或更多倍的比率與CTLA-4表現細胞特異性結合。
猴=食蟹獼猴。
NB=非結合子；將結合比率小於3之抗體歸類為非結合子
(*)排除最高的兩個抗體濃度之RLU值來計算EC50值。
INC=不確定，GraphPad PrismTM不能擬合4參數S形曲線進行EC50值計 算，但是抗體以比親本細胞高出3倍或更多倍的比率與CTLA-4表現細胞特異性結合。
實例6：抗CTLA-4抗體在經工程改造之報導T細胞/APC生物分析系統中誘導T細胞活化
在此實例中，開發基於T細胞/抗原呈現細胞(APC)之螢光素酶報導生物分析來評估阻斷CTLA-4/CD80或CTLA-4/CD86相互作用之作用及T細胞活化。在一種生物分析型式中，藉由量測螢光素酶活性來評定投與抗CTLA-4抗體對T細胞/APC系統之影響。在第二分析中，評定抗CTLA-4抗體誘導介白素(IL)-2釋放之能力。
如以上實例中所述，在此實例中測試之抗CTLA-4抗體經由表面電漿子共振(surface plasmon resonance，SPR)證實與人類及食蟹獼猴(cynomolgus monkey/Macaca fasciularis)CTLA-4之結合且展現與經工程改造以表現人類CTLA-4之細胞株的特異性且有效的結合。所選擇的此等CTLA-4抗體先前亦顯示可阻斷CTLA-4與B7-1(CD80)及B7-2(CD86)之結合。
背景
T細胞活化藉由刺激T細胞受體(TCR)來達成，所述T細胞受體識別抗原呈現細胞(APC)上由I類或II類主要組織相容性複合體(MHCI或MHCII)蛋白質呈現的特異性肽(Goldrath等人1999)。經活化TCR繼而引發信號傳導事件之級聯，其可藉由報導基因來監測，由各種轉錄因子驅動，諸如活化蛋白1(AP-1)、活化T細胞核因子(NFAT)或核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(NFκB)。隨後經由在T細胞上組成性或誘導性表現之輔受體之參與來進一步改進T細胞反應，所述輔受體諸如CD28、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、計劃性細胞死亡蛋白 1(PD-1)、淋巴細胞活化基因3(LAG-3)或其他分子(Sharpe等人2002)。輔受體CD28及CTLA-4競爭在抗原呈現細胞(APC)上表現之相同配體CD80及CD86，CTLA-4對所述配體之親和力比CD28高。CTLA-4充當誘餌且藉由鉗合走配體，引起T細胞活化減弱來抑制CD28之活化。(Alegre等人2001及Walker等人2011)。
NFAT-螢光素酶活性
細胞株工程改造：報導T細胞藉由用NFAT-Luc慢病毒報導子(Qiagen,Rockville,MD)根據製造商之說明書轉導在細胞表面上內源性表現TCR及CD28之永生化人類Jurkat T細胞(ATCC)來進行工程改造。慢病毒在最小細胞巨大病毒(Cytomegalovirus，CMV)啟動子及NFAT轉錄反應元件(transcriptional response element，TRE)之縱排重複序列及嘌呤黴素抗性基因的控制下編碼螢火蟲螢光素酶基因。
在抗生素選擇及單一選殖之後，用編碼人類(h)或猴(mf-食蟹獼猴)CTLA-4嵌合蛋白質之慢病毒轉導Jurkat/NFAT-Luc純系株3C7(Jurkat/NFAT-Luc cl.3C7)。嵌合構築體包括hCTLA-4(aa 1-161；寄存編號NP_005205.2)或mfCTLA-4(aa 1-161；寄存編號XP_005574071.1)之細胞外域與hCD300a(aa 181-299；寄存編號NP_009192.2)之跨膜域及細胞質域融合。CD300a發現於免疫細胞上且經由其基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(immuno-receptor tyrosine based inhibition motif，ITIM)傳輸抑制信號(DeBell等人2012)。選擇所得穩定T細胞株Jurkat/NFAT-Luc/hCTLA-4-hCD300a及Jurkat/NFAT-Luc/mfCTLA-4-hCD300a且將其維持於補充有500μg/mL G418及1μg/mL嘌呤黴素的RPMI+10% FBS+青黴素(penicillin)+鏈黴素(streptomycin)+麩醯胺酸中。
使用內源性表現CD20、Fcγ受體(FcγR)、細胞表面上之CD80及CD86的人類Raji B細胞(ATCC，Manassas,VA)作為基於螢光素酶之生物分析中之APC細胞。將Raji細胞維持於補充有HEPES及丙酮酸鈉之RPMI+10% FBS+青黴素+鏈黴素+麩醯胺酸中。
T細胞/APC刺激：經由活化T細胞之抗CD20×CD3雙特異性抗體(REGN2281)刺激報導T細胞，所述雙特異性抗體靶向在Jurkat T細胞上表現之CD3及Raji B細胞上之CD20。REGN2281之雙特異性結合模式引起Jurkat/NFAT-Luc T細胞中之NFAT偶聯的報導基因、螢光素酶之增加。
然而在Jurkat/NFAT-Luc/CTLA-hCD300a嵌合體細胞中，REGN2281對報導基因之最大活化因為藉由CTLA-4-hCD300a嵌合受體與其在Raji細胞上表現之配體CD80/CD86之相互作用所傳遞的抑制性信號傳導而減弱。在此生物分析中，阻斷CTLA-4/CD80及CD86軸之抗CTLA-4抗體理論上將藉由停用經由嵌合CTLA-4蛋白質之CD300a尾部遞送之抑制信號來拯救Jurkat報導細胞中之NFAT-Luc活性。
在此分析型式中，抗CTLA-4抗體可在Jurkat中同時誘導促效性信號，藉由將抗體Fc錨定於Raji細胞上之FcγR而觸發。用飽和量之IgG分子或FcγR特異性抗體阻斷FcγR可減小CTLA-4抗體之促效作用。因此，在分析中包含Fc阻斷步驟以抑制CTLA-4 mab與Raji細胞上之FcγR的結合。
螢光素酶分析：在篩選之前24小時，在分析培養基(RPMI1640，補充有10% FBS及青黴素+鏈黴素+麩醯胺酸(PSG))中培養5×105個報導T細胞及7.5×105個Raji APC。第二天，在用以佔用Raji細胞上之內源性FcγRIIb受體之100pM REGN2281及10nM Fc阻斷或10 nM人類IgG4同型對照存在下，測試抗CTLA-4抗體及同型匹配陰性對照(經1：3連續稀釋；劑量範圍15pM至100nM)。向含有固定濃度之100pM REGN2281/10nM Fc阻斷或100pM REGN2281/10nM hIgG4同型對照的96孔白色平底培養盤(Nunc/Thermo Fisher,Pittsburgh,PA)中之對應孔中添加經連續稀釋之抗體。將報導T細胞及Raji APC以2×106/mL再懸浮且首先以5×104個細胞/孔之最終濃度向培養盤中添加T細胞。將培養盤在37℃/5% CO2下培育15-30分鐘，隨後以5×104個細胞/孔之最終濃度添加Raji細胞。將樣品在37℃/5% CO2下再培育4-6小時，隨後添加100μL ONE-GloTM(Promega,Madison WI)以偵測NFAT-Luc活性。在多標記盤式讀取器Victor(PerkinElmer,Waltham,MA)上捕捉所發射的光，以相對光單位(RLU)計。所有連續稀釋液一式兩份地測試。
使用GraphPad Prism軟體(GraphPad,La Jolla,CA)，從四參數邏輯方程式經由10點劑量-反應曲線確定CTLA-4抗體之EC50值。藉由將各樣品之相對RLU值針對設為1的不含CTLA-4抗體之樣品的平均值標準化來計算倍數誘導。
結果：如表7中所記錄，當在REGN2281 +/- Fc阻斷存在下，向親本Jurkat/NFAT-Luc cl 3C7細胞加Raji APC中添加抗CTLA-4抗體時，未觀測到報導基因活性(螢光素酶)增加。然而，當在REGN2281 +/- Fc阻斷存在下，向Jurkat/NFAT-Luc/h及mf CTLA-4/hCD300嵌合體細胞株/Raji APC系統中添加抗CTLA-4抗體時，記錄下增加的螢光素酶活性。在此生物分析型式中，抗CTLA-4抗體阻斷Jurkat報導細胞上之CTLA-4與在Raji細胞上內源性表現之CD80/CD86的相互作用，引起螢光素酶蛋白質之誘導。在此分析中測試之抗CTLA-4抗體增加螢光素酶活性，且在Fc阻斷存在下觀測到最大值，EC50在1.77nM至7.67nM範圍內。如表7中所示， H1H19303P之表現比所測試之比較物1及2好。
CTLA-4 T細胞/APC人類介白素2(hIL-2)釋放分析
細胞株工程改造：用編碼hCTLA-4全長蛋白質之內部製造的慢病毒sup(寄存編號NP_005205.2)轉導Jurkat/NFAT-Luc純系株3C7(如上所述)。藉由流動式細胞測量術分選所得穩定T細胞株(Jurkat/NFAT-Luc/hCTLA-4wt)中之高表現者且將其維持於補充有500μg/mL G418及1μg/mL嘌呤黴素之RPMI+10% FBS+PSG中。
人類胚胎腎(Human Embryonic Kidney，HEK)293細胞(ATCC)經人類CD20轉染且用於經慢病毒sup轉導以過度表現與綠色螢光蛋白(GFP；aa 2-240；寄存編號WP_031943942.1)融合之hCD80(aa 1-288；寄存編號NP_005182.1)或hCD86(aa 1-329；寄存編號NP_787058.4)，兩者之間具有4×G4S連接子。在藉由限制稀釋法進行單一選殖之後，產生以下所得純系株：HEK293/hCD20/hCD80-GFP純系1F4及HEK293/hCD20/hCD86-GFP純系4G5。將細胞株維持在補充有500μg/mL G418之DME+10% FBS+PSG+非必需胺基酸(NEAA，Irvine Scientific,Santa Ana,CA)中。
T細胞/APC刺激：經由活化T細胞之雙特異性抗體REGN2281刺激經工程改造之T細胞，如上所述。REGN2281與CD3之結合導致與TCR複合之CD3亞基簇聚且活化T細胞，其繼而釋放hIL-2。IL-2之釋放可進一步藉由CD28與其位於經工程改造之HEK293細胞上之配體CD80或CD86的相互作用來確定。Jurkat/NFAT-Luc/hCTLA-4細胞之最大活化因為CTLA-4與CD28競爭HEK293細胞上之配體CD80/CD86之結合而減弱(Carreno等人2000)。
在此生物分析中，阻斷CTLA-4/CD80或CD86相互作用之抗 體將藉由停用抑制性CTLA-4臂而拯救經工程改造之Jurkat細胞中之IL-2釋放。
IL-2釋放分析：在篩選之前24小時，在分析培養基(RPMI1640+10% FBS+PSG)中培養經工程改造之T細胞至5×105個細胞/毫升。第二天，用D-PBS(Irvine Scientific)洗滌HEK293細胞，用胰蛋白酶(Specialty Media)分離且用分析培養基阻斷。接著，在37℃/5% CO2下，用含有50μg/mL絲裂黴素C之分析培養基處理HEK293細胞以抑制細胞生長，持續1小時。隨後用分析培養基徹底洗滌細胞以移除游離的絲裂黴素C。
藉由在15pM至100nM範圍內之10點稀釋，在分析培養基中1：3連續稀釋抗CTLA-4抗體及其同型對照。將經連續稀釋之抗體添加至含有固定濃度之300pM REGN2281的96孔圓底培養盤(Nunc)中之對應孔中。將報導T細胞以1×105個細胞/孔之最終濃度添加至培養盤。將培養盤在37℃/5% CO2下培育15-30分鐘，隨後以2.5×103個細胞/孔之最終濃度添加HEK293細胞。將培養盤在37℃/5% CO2下培育72小時，收集上清液且用上清液進行IL-2量測。使用AlphaLISA套組(PerkinElmer)根據製造商之方案量測IL-2含量。在多標記盤式讀取器Envision(PerkinElmer)上獲得量測結果。所有連續稀釋液一式兩份地測試。
使用GraphPad Prism，從四參數邏輯方程式經由10點劑量-反應曲線確定CTLA-4 mAb之EC50值。藉由將各樣品之相對IL-2值針對不含抗CTLA-4抗體之樣品標準化來計算倍數誘導。表9顯示在100nM下達到的倍數誘導及在hIL-2釋放分析中達到的EC50計算值。
結果：如表8中之結果所示，在此分析中測試之抗CTLA-4抗體在Jurkat/NFAT-Luc/CTLA-4嵌合體//Raji APC系統中誘導IL-2產生。在100nM濃度下，抗CTLA-4抗體以在比使用CTLA-4陰性報導T細胞在 分析系統中觀測到之倍數活性高出4至6倍的範圍內的倍數活性誘導IL-2產生。如表8中所示，H1H19303P之表現比所測試之比較物1及2好。
總結
總而言之，在設計成用於評定抗體對T細胞活化之活性的兩個工程改造T細胞/APC生物分析系統中測試所選擇的抗CTLA-4抗體。在一種型式中，抗CTLA-4抗體活化T細胞，如藉由NFAT-螢光素酶活性增加所量測，指示抗體阻斷CTLA-4與配體CD80及CD86之間的相互作用。在第二型式中，抗CTLA-4抗體誘導IL-2之產生，指示抗CTLA-4抗體可阻斷CTLA-4/CD80及CTLA-4/CD86相互作用，從而拯救IL-2釋放。
(-)指示EC50值不能從擬合曲線確定
(-)指示EC50值不能從擬合曲線確定
實例7：抗CTLA-4抗體對腫瘤之功效
此實例描述本發明之例示性抗CTLA-4抗體對在CTLA-4基因人類化之小鼠中生長之MC38.Ova腫瘤的抗腫瘤功效。
在C57BL/6菌株背景下，使用VelociGeneTM技術對人類CTLA-4 hum/hum 基因嵌入小鼠進行工程改造，其中小鼠表現包括人類CTLA-4細胞外域與來自內源性Ctla4基因座之小鼠CTLA-4跨膜域及細胞質域融合的嵌合蛋白質(Valenzuela等人2003；Nat.Biotechnol.21：652-659)。 MC38.Ova細胞株藉由MC38細胞之穩定慢病毒轉導以表現跨膜雞卵白蛋白抗原(Ova)來工程改造。
研究(A)
CTLA-4 hum/hum 基因嵌入小鼠在第0天皮下植入(SC)MC38.Ova細胞(106個細胞/小鼠)且在第3天、第7天、第10天、第14天及第17天腹膜內接受10mg/kg之H1H19273P或H1H19303P或H1H19319，或10mg/kg之hIgG1同型對照。監測腫瘤體積及無腫瘤動物長達37天。
以10mg/kg測試之所有三種抗CTLA-4抗體相比於用同型對照處理展現部分腫瘤生長抑制(圖1)。截止第24天，用H1H19303P處理引起10mg/kg劑量組中8/9(89%)之小鼠無腫瘤(圖2)。用H1H19319P或H1H19273P處理具有類似效果，截止第24天，分別在7/9之小鼠(78%)及5/9之小鼠(56%)中引起完全腫瘤生長抑制。在第24天，同型對照處理組中沒有動物係無腫瘤的。在第24天，相比於投與同型對照之組，各抗CTLA-4抗體處理組之腫瘤體積顯著較小(p<0.0001)。
在第24天觀測到無腫瘤的小鼠在植入後監測37天。相比於投與同型對照之小鼠，經抗人類CTLA-4抗體中之任一者處理之小鼠的存活率顯著較高(p<0.0001)(圖3)。在抗CTLA-4抗體組之所有無腫瘤小鼠中均未觀測到腫瘤復發。未觀測到因為抗體處理而引起體重減輕的跡象。
總而言之，用三種抗人類CTLA-4抗體(H1H19273P、H1H19303P及H1H19319)中之每一者處理相比於同型對照引起腫瘤生長減少、腫瘤清除率改良且存活期改良。在此模型中，三種抗人類CTLA-4抗體各自之功效相當。
研究(B)
用於此研究之例示性抗CTLA-4抗體為與人類CTLA-4特異性結合且包括SEQ ID NO：196-198-200-204-206-208之HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3及SEQ ID No：194/202之HCVR/LCVR的完全人類抗體(亦稱為H1H19303P)。H1H19303P(亦稱為REGN4659)之全長重鏈胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：509中，且H1H19303P之全長輕鏈胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：510中(表9)。
*加底線序列為可變區
抗CTLA-4抗體之投與及抗腫瘤活性之分析
在攜帶MC38.Ova腫瘤之CTLA-4 hum/hum 基因嵌入小鼠中測試不同劑量之H1H19303P的抗腫瘤活性。包含hIgG1同型對照作為陰性對照。CTLA-4 hum/hum 基因嵌入小鼠在第0天在後側腹中皮下植入1×106個MC38.Ova細胞且分成四個處理組(表10)。在第3天、第6天、第9天、第13天及第16天，向小鼠腹膜內投與H1H19303P或hIgG1同型對照。持續37天每週用卡尺量測腫瘤體積兩次。在第37天或在以下終點用CO2處死攜帶腫瘤之小鼠：腫瘤體積>2000mm3或腫瘤潰瘍。無腫瘤小鼠繼續進行長達107天的存活研究。
a藉由ELISA分析血清樣品之抗體含量。分析10mg/kg H1H19303P及hIgG1對照組在第6天、第13天及第20天收集之樣品，且分析H1H19303P之2mg/kg及5mg/kg劑量組在第6天及第20天收集之樣品。
在實驗開始前兩天(第-2天)及在第6天、第13天及第20天投與抗體前兩小時從頜下靜脈收集血液樣品。冷凍且儲存血清樣品用於血清抗體含量之後續量測。
使用GraphPad Prism軟體(版本6)進行統計分析。藉由單因子變異數分析與鄧尼特多重比較事後檢定確定動物組之間的腫瘤體積差 異的統計顯著性。藉由對數秩(Mantel-Cox)檢定確定無腫瘤存活期的統計顯著性。為判定各組是否顯著不同於對照組，使用龐費洛尼法(Bonferroni method)以針對比較數目(k=6)調整之顯著水準(α=0.05)進行兩組Mantel-Cox分析(α經調整=0.05/6)。
總人類IgG抗體之血清濃度
總H1H19303P及hIgG1同型對照抗體之血清濃度使用特異性針對人類Fcγ之偵測的夾心ELISA測定。分析10mg/kg H1H19303P及hIgG1對照組在第6天、第13天及第20天收集之血清樣品，且分析H1H19303P之2mg/kg及5mg/kg劑量組在第6天及第20天收集之樣品。簡言之，使PBS中之1μg/mL山羊抗人類Fcγ多株抗體在4℃下被動吸附至微量滴定盤隔夜，隨後用PBS中之5% BSA進行非特異性結合阻斷。此分析中用於校準之標準為濃度在2.7至350ng/mL範圍內(1：2連續稀釋液)之H1H19303P或同型對照抗體。在稀釋緩衝液(含0.5% BSA之PBS)中製備標準及血清樣品之連續稀釋液。隨後將樣品添加至塗有抗hFcγ之培養盤(100微升/孔)且在室溫下培育1小時。隨後，使用稀釋緩衝液中之160ng/mL之HRP結合的抗hFcγ多株抗體偵測培養盤捕捉的人類IgG抗體。使用顯色HRP-受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)偵測HRP活性，且在Perkin Elmer Victor X4多模式盤式讀取器上讀取所得OD450。用於校準之標準(H1H19303P或同型對照抗體)之最低濃度(2.7ng/mL)在分析之動態範圍內且被定義為此分析之LLOQ。藉由非線性回歸，使用GraphPad Prism軟體分析資料。使用2個複製實驗之平均濃度進行分析。
小鼠抗人類抗體之血清濃度
使用特異性針對所注射抗體中之每一者之偵測的夾心ELISA測定抗H1H19303P或抗IgG1對照抗體小鼠IgG效價。分析10mg/kg H1H19303P及hIgG1對照組在第6天、第13天及第20天收集之血清樣品，且分析H1H19303P之2mg/kg及5mg/kg劑量組在第6天及第20天收集之樣品。簡言之，使PBS中之1μg/mL之H1H19303P或抗IgG1對照抗體在4℃下被動吸附至微量滴定盤隔夜，隨後用PBS中之5%牛血清白蛋白(BSA)進行非特異性結合阻斷。在稀釋緩衝液(含0.5% BSA之PBS)中從1：500開始製備血清樣品之連續稀釋液。因此，對應稀釋因數(500)定義為分析之偵測下限(lower limit of detection，LOD)。隨後將樣品添加至塗有H1H19303P或抗IgG1對照抗體之培養盤(100微升/孔)且在4℃下培育16-18小時。包含僅添加稀釋緩衝液之孔以測定分析背景。隨後，以40ng/mL使用辣根過氧化酶(HRP)結合的山羊抗小鼠Fcγ多株抗體來偵測培養盤捕捉的小鼠IgG。使用顯色HRP-受質TMB偵測HRP活性，且在Perkin Elmer Victor X4多模式盤式讀取器上讀取450nm下之所得光密度(OD450)。結合信號對比稀釋因數之資料藉由非線性回歸，使用GraphPad Prism軟體分析，且計算效價。MAHA效價定義為血清樣品之對應於等於分析背景信號之兩倍的結合信號的稀釋因數計算值。
結果
CTLA-4 hum/hum 基因嵌入小鼠在第0天皮下植入MC38.Ova細胞且在第3天、第6天、第9天、第13天及第16天腹膜內接受2、5或10mg/kg之H1H19303P或10mg/kg之hIgG1同型對照。監測腫瘤體積37天，且監測無腫瘤動物長達107天。
在所有測試劑量下，H1H19303P相比於用同型對照處理顯示出部分腫瘤生長抑制(圖4)。截止第20天，用H1H19303P處理引起5mg/kg及10mg/kg劑量組中5/8(63%)小鼠無腫瘤及2mg/kg劑量組中2/8(25%)小鼠無腫瘤。在第20天，相比於投與同型對照之組，H1H19303P處理組之 腫瘤體積顯著較小(p<0.0001)(圖5)。
在第20天觀測到無腫瘤的小鼠在植入後監測長達107天。經H1H19303P處理之小鼠相比於投與同型對照之小鼠而言存活率顯著較高(p<0.0001)(圖6)。在所有劑量組中24/25之無腫瘤小鼠中均未觀測到腫瘤復發。未觀測到因為抗體處理而引起體重減輕的跡象。
總而言之，用H1H19303P預防性治療相比於同型對照顯著地以劑量依賴性方式減小腫瘤生長，改良腫瘤清除率且改良存活期。
藉由ELISA評估血清抗體濃度及MAHA
使用ELISA分析在第6天、第13天及第20天收集之血清樣品中H1H19303P及同型對照之濃度以及MAHA效價。血清中之H1H19303P及hIgG1同型對照抗體之濃度使用特異性針對人類IgG之偵測的夾心ELISA測定(圖7)。使用特異性針對各抗體之偵測的夾心ELISA測定H1H19303P或IgG1對照抗體之特異性小鼠IgG效價(圖8)。
在第6天，偵測所有測試劑量下血清中之H1H19303P及同型對照，其中10、5及2mg/kg劑量之H1H19303P所觀測到的平均血清濃度分別為39.8±24、33.5±8.9及10.4±2.9(表11)。
a所示資料為平均血清濃度與標準差。
NT：未測試；LLOQ：定量下限
表12：小鼠抗H1H19303P及抗同型對照抗體之平均效價
a所示資料為平均效價與標準差。
NT：未測試；LOD：偵測極限
在第6天之後，觀測到儘管在第6天、第9天、第13天及第16天額外投與抗體，但是截止第20天，H1H19303P之所有劑量組之血清濃度降低(表11)。相比於同型對照而言，10mg/kg劑量組觀測到快速抗體清除率。H1H19303P之血清濃度減小可能是因為MAHA之發展(圖8，表12)。觀測所有劑量之H1H19303P在第6天後之所有時間點量測的MAHA效價。然而，同型對照之MAHA效價在所有測試時間點都處於偵測極限。
結論
相比於hIgG1對照，以10mg/kg、5mg/kg或2mg/kg之劑量腹膜內投與H1H19303P在植入有MC38.Ova腫瘤細胞之CTLA-4 hum/hum 基因嵌入小鼠中引起腫瘤生長減少、腫瘤清除率改良且存活期改良。H1H19303P之血清濃度隨時間減小，與在第6天後之時間點抗H1H19303P MAHA之發展相符。
實例8：抗小鼠CTLA-4抗體與抗人類PD-1抗體(REGN2810)之組合處理在攜帶MC38.Ova腫瘤之PD-1 hum/hum 基因嵌入小鼠中的功效
此實例描述抗CTLA-4抗體與抗PD-1抗體組合在PD-1基因人類化之小鼠中之抗腫瘤功效。在此研究中所用之抗PD-1抗體為REGN2810(亦稱為測米匹單抗)，且在美國專利9,987,500中描述為H4H7798N。PD-1 hum/hum 基因嵌入小鼠在美國專利申請公開案 US2015/0203579中已有描述。
向PD-1 hum/hum 基因嵌入小鼠皮下植入MC38.Ova細胞(5×105個細胞/小鼠)。當平均腫瘤大小達到100mm3(處理第0天)時，將小鼠隨機分成4個處理組。在第0天、第3天、第7天、第10天及第14天，向小鼠腹膜內投與10mg/kg之同型對照抗體、抗小鼠CTLA-4-mIgG2a抗體(純系9D9)、抗人類PD-1抗體(REGN2810)或抗小鼠CTLA-4與抗人類PD-1抗體之組合(10mg/kg+10mg/kg)。監測腫瘤體積及無腫瘤動物長達22天。持續22天每週用卡尺量測兩次，監測腫瘤體積。抗CTLA-4抗體或抗PD-1抗體之單一療法在所測試之10mg/kg下相比於用同型對照處理顯示出部分腫瘤生長抑制(圖9)。使用在處理開始後第10天之個別腫瘤體積(圖10)進行統計分析，因為這是研究中所有組中之所有動物均存活的最後一個時間點。統計顯著性藉由單因子變異數分析與鄧尼特多重比較事後檢定(** p<0.01，**** p<0.0001)來確定。抗CTLA-4與抗PD-1抗體處理之組合相比於任一抗體之單一療法產生更有效的腫瘤生長抑制，其中在第10天，組合處理組中之腫瘤在統計學上顯著小於抗PD-1處理組中(**** p<0.0001，圖10)。截止第22天，抗CTLA-4處理組中八分之一的動物及組合處理組中八分之二的動物變成無腫瘤。用抗CTLA-4與抗PD-1抗體之組合處理相比於對照組亦在動物存活率方面產生顯著差異(Mantel-Cox檢定，****p<0.0001，圖11)。未觀測到因為抗體處理而引起體重減輕的跡象。
總而言之，用抗mCTLA-4及抗PD-1(REGN2810)抗體之組合處理相比於任一抗體之單一療法引起腫瘤生長減少及存活期改良。
實例9：REGN4659處理在已建立的MC38.Ova腫瘤模型中在人類CTLA-4 hum/hum 小鼠中之抗腫瘤功效
實驗設計
在第0天，向六十隻CTLA-4hum/hum小鼠之側腹中皮下植入5×105個MC38.Ova細胞。在第10天，選擇三十隻平均腫瘤體積為100mm3之小鼠且將其隨機分成3個處理組(N=10/組)。在第10天、第13天及第17天，如下給予小鼠抗體：第1組，hIgG1同型對照Ab(REGN1932)，25mg/kg；第2組，抗hCTLA-4 Ab(REGN4659；H1H19303P)，25mg/kg；第3組，抗hCTLA-4 Ab(REGN4659；H1H19303P)，10mg/kg。
所有抗體全部藉由腹膜內注射投與。在實驗持續期內(27天)，藉由卡尺量測監測腫瘤體積。
結果
REGN4569處理已建立的MC38.Ova腫瘤引起部分腫瘤生長抑制(圖12)。
REGN4659單一療法之兩種劑量10mg/kg及25mg/kg在減少腫瘤生長方面的有效性類似(圖13)。
單因子變異數分析(ANOVA)與圖基多重比較事後檢定(Tukey's multiple comparison post-test)揭示，在第21天，即所有處理組中之動物全都活著的最後一天，各REGN4569單一療法組與hIgG1同型對照組之間的平均腫瘤體積存在顯著差異(p<0.05)(圖13)。
實例10：在REGN4659處理CTLA-4 hum/hum 小鼠中之已建立的皮下MC38.Ova腫瘤之後瘤內及周邊T細胞之分析
實驗設計
在第0天，向四十隻CTLA-4hum/hum小鼠之側腹中皮下植入5×105個MC38.Ova細胞。在第10天，選擇二十隻平均腫瘤體積為100mm3之小鼠且將其隨機分成2個處理組(N=10/組)。在第10天及第13天，如 下給予小鼠抗體：第1組，hIgG1同型對照Ab(REGN1932)，25mg/kg；第2組，抗hCTLA-4 Ab(REGN4659；H1H19303P)，25mg/kg。所有抗體全部藉由腹膜內注射投與。藉由卡尺量測監測腫瘤體積。在第17天，當腫瘤在hIgG1組中達到355 +/- 35mm3(平均值+/- SEM)且在REGN4659處理組中達到180 +/- 43mm3(平均值+/- SEM)時，處死所有小鼠。收集腫瘤及脾臟以便藉由流動式細胞測量術進行淋巴細胞分析。製備腫瘤及脾臟之單細胞懸浮液。用24G.2(Bioxcell)處理細胞，其阻斷Fc與FcgRIIb及FcgRIII結合，且隨後用LIVE/DEADTM可固定Aqua死細胞染料(Invitrogen)進行活力染色，且隨後用針對CD45(純系30-F11；Biolegend)、C90.2(純系30-H12；Biolegend)、CD8(純系53-6.7；Biolegend)、CD4(GK1.5；Biolegend)、CD11b(cloneM1/70；Biolegend)及人類CTLA-4(純系BNI3，BD)之抗體的混合物染色。關於細胞內染色，將樣品固定，滲透且用針對FoxP3(純系FJK-16s，Invitrogen)及人類CTLA-4之抗體染色。隨後在FACS Canto流式細胞儀(BD)上分析樣品。
結果
在植入及REGN4659抗體處理後第17天分析攜帶MC38.Ova腫瘤之小鼠的腫瘤及脾臟中之T細胞亞群。腫瘤位點及脾臟周邊之Teff及Treg群體的評定結果顯示，REGN4659，其具有hIgG1同型(SEQ ID NO：509為H1H19303P之全長重鏈胺基酸序列，亦稱為REGN4659)，介導正好投與兩次治療性抗體後攜帶MC38.Ova腫瘤之CTLA-4hum/hum小鼠中之腫瘤位點中的Treg的減少(表12)。觀測到腫瘤位點處之CD4+效應細胞及CD8+細胞擴增，而用REGN4659處理引起脾臟中之Treg擴增。此等資料顯示，在MC38.Ova腫瘤模型中在CTLA-4hum/hum小鼠中，REGN4659藉由選擇性減少瘤內Treg及活化瘤內效應T細胞而促進抗腫瘤活性。相比於脾Treg或 T效應細胞，REGN4659對瘤內Treg數目之不同結果可能是因為CTLA-4表現量之差異。為回答此問題，藉由FACS量測hIgG1對照處理組的T細胞上之CTLA-4表現量(表面及細胞內)。瘤內Treg上之總CTLA-4之表現比瘤內CD8+及CD4+效應細胞上高出約3倍且比來自脾臟之Treg上高出約8倍(圖14)。此表現差異可解釋FcgR依賴性機制所造成之腫瘤Treg之選擇性丟失，假定具有人類IgG1恆定區之抗體對鼠類Fcg受體具有高結合親和力。
表13顯示作為CD4+FoxP3-(CD4+效應子)之CD45+細胞之百分比、作為CD8+之CD45+之百分比及作為FoxP3+(CD4+Treg)之CD4+細胞之百分比。未配對T檢定分析揭示，在REGN4659組與同型對照處理組之間，在腫瘤中之CD4+效應子、CD8+、CD4+Treg及脾臟中之CD4+效應子及CD4+Treg方面存在顯著差異(**p<0.005，***p<0.001)。
實例11：經REGN4659處理之攜帶腫瘤之小鼠的脾臟中之T細胞功能及整體全身性免疫活化的變化
實驗設計
在第0天，向二十隻CTLA-4hum/hum小鼠之側腹中皮下植入 5×105個MC38.Ova細胞，且將其隨機分成2個處理組(N=9/組)。在第3天、第7天、第11天、第14天及第17天，給予小鼠10mg/kg之hIgG1同型對照Ab(REGN1932)或10mg/kg之抗hCTLA-4 Ab(REGN4659；H1H19303P)。所有抗體全部藉由腹膜內注射投與。藉由卡尺量測監測腫瘤體積。從第24天(當腫瘤生長過大時)開始至第37天(實驗結束)，處死小鼠。在第24天，在REGN4659組中，8/9之小鼠變成無腫瘤，而在對照組中，沒有小鼠是無腫瘤的。鼠類基因之表現量(針對鼠類親環素B RNA表現標準化)藉由Taqman即時PCR量測。未配對t檢定顯示，相比於同型對照組，REGN4659組中之FoxP3、CD3e、穿孔素(Perforin)、IFNg、TNFa、PD-L1、PD-L2之相對含量統計學上顯著增加。
結果
經REGN4659處理小鼠之脾臟的Taqman分析揭示，FoxP3、CD3e、穿孔素、IFNg、TNFa、PD-L1、PD-L2之轉錄量增加，表明REGN4659之T細胞效應功能及整體免疫增強功能增加。鼠類基因之表現量(針對鼠類親環素B RNA表現標準化)顯示於表14中。未配對t檢定顯示，相比於同型對照組，REGN4659組中之FoxP3、CD3e、穿孔素、IFNg、TNFa、PD-L1及PD-L2之相對含量統計學上顯著增加。
以平均值±SEM報告；雙尾未配對t檢定；*p<0.05，**p0.01，***p0.001。
實例12：抗CTLA-4抗體(REGN4659)與測米匹單抗(抗PD-1抗 體)組合治療患有晚期或轉移性非小細胞肺癌之患者的人類臨床試驗
此研究為開放標籤、I期、首次在人類中進行(first-in-human，FIH)的研究，評估單獨的REGN4659(亦即實例1至7及9至11之H1H19303P)、單獨的高劑量測米匹單抗(群組C)及REGN4659與測米匹單抗之組合對晚期或轉移性非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)之治療。研究包括劑量遞增期(dose escalation phase)及劑量擴增期(dose expansion phase)。
測米匹單抗(REGN2810；實例8)為針對PD-1受體之高親和力、完全人類、鉸鏈穩定的IgG4P抗體，其有效阻斷PD-1與其配體PD-L1及PD-L2之相互作用。
研究目標
劑量遞增期之主要目標為評定單獨的REGN4659、單獨的高劑量測米匹單抗及REGN4659與測米匹單抗之組合在患有非小細胞肺癌(NSCLC)之經歷治療的患者中的安全性、耐受性及藥物動力學(pharmacokinetics，PK)。劑量擴增期之主要目標為評定REGN4659與測米匹單抗之組合的初步抗腫瘤活性，如藉由經歷抗PD-1/PD-L1免疫療法之NSCLC患者中之客觀反應率(objective response rate，ORR)所量測，及評定REGN4659及測米匹單抗在經歷抗PD-1/PD-L1免疫療法之NSCLC患者中之安全性、耐受性及PK。
研究之第二目標為(i)評定高劑量測米匹單抗單一療法及REGN4659與測米匹單抗之組合的初步抗腫瘤活性，如藉由經歷治療之NSCLC患者在劑量遞增期之ORR所量測；(ii)經由多重準則評定在劑量遞增及擴增期間REGN4659與測米匹單抗之抗腫瘤活性；及(iii)評定REGN4659及測米匹單抗之全身性藥效作用，藉由T細胞活化之末梢血液 生物標記之變化來量測，包含ICOS+ CD4 T細胞。
研究設計
此研究為開放標籤、I期、首次在人類中進行(FIH)的研究，評估單獨的REGN4659、單獨的高劑量測米匹單抗(群組C)及REGN4659與測米匹單抗之組合對晚期或轉移性NSCLC之治療。此研究存在2個階段：經歷治療之NSCLC患者(在化學療法及/或抗PD-1/PD-L1免疫療法之前)的劑量遞增期，及經歷抗PD-1/PD-L1免疫療法之NSCLC患者的劑量擴增期。
研究包括長達28天(第-28天至第-1天)之篩選期、繼之以至多十七個42天治療週期(長達102週之治療)及24週隨訪期。在102週治療期完成之前，或在明確的疾病進展、不可接受的毒性、撤銷同意之前，或在滿足另一個研究撤消準則之前，患者將一直接受治療。在最少治療24週之後，確認完全反應(complete response，CR)之患者可選擇中斷治療且繼續進行所有相關的研究評定。在劑量遞增時，除非醫學禁忌，否則期望進行腫瘤活體組織切片檢查。腫瘤活體組織切片檢查必須作為劑量擴增群組之一部分。關於出現反應且隨後出現進展的患者，會要求在進展時進行腫瘤活體組織切片檢查，但不強迫。
在治療期完成後6個月內在滿足研究所規定之準則且繼續進行所規定之訪視之後CR、部分反應(partial response，PR)或穩定疾病(SD)有進展的患者允許在再次確認相關研究合格準則之後恢復研究治療。患者可接受長達102週之額外治療。在試驗委託者(sponsor)與試驗主持人(investigator)之間進行討論之後，所恢復之劑量及藥物一般應該與患者最初接受的或擴增群組所選之劑量相同。
群組C中耐受2個劑量之測米匹單抗(1050mg Q3W)，但 是隨後顯示PD的患者將可以選擇添加安全投與的最高組合劑量之測米匹單抗與REGN4659，達到試圖使用所組合之CTLA-4及PD-1阻斷尋求反應的程度。
劑量遞增：計劃八個劑量遞增群組。將研究以各種方案每3、6及12週(Q3W、Q6W、Q12W)三種劑量之REGN4659(25、75及250mg靜脈內[IV]固定劑量)，與以2個劑量(350及1050mg IV固定劑量)Q3W投與之測米匹單抗組合。在與1050mg測米匹單抗之組合群組開始之前，將研究1050mg測米匹單抗Q3W單一療法之群組(群組C)。關於由星號指示之劑量遞增群組(群組1*、2*及4*)，單一引入劑量之REGN4659單一療法將先於組合療法3週以在與測米匹單抗組合之前評定REGN4649之安全性。8個群組中之六個(1*、C、2*、2、3及4*)將用於進行劑量限制性毒性(dose-limiting toxicity，DLT)評估。除了DLT可評估群組之外，另外2個劑量群組(5及6)將各自登記6名患者進行安全性及PK/藥效學評估。群組5及6將在分別建立群組2及3之耐受性之後登記。群組5及6中之劑量組合可能引人關注，即使較高劑量強度之REGN4659(群組2及3)為可耐受的。然而，若群組2及3因為群組5及6中REGN4659之暴露減小而為可耐受的，則此等群組將不需要DLT評估。除了將登記6名患者之群組C以外，各劑量群組中最少需要3名患者以使DLT可評估。為了在保持患者安全的同時使1期劑量遞增之效率達到最大，將在各劑量群組(群組C除外)中登記4名患者，以防患者在DLT可評估之前就中斷。群組3及6(與高劑量測米匹單抗之組合群組)直至群組C中之所有6名患者全部完成DLT期才開始。劑量群組將繼續進行劑量遞增，直至達到組合之最大耐受劑量(maximum tolerated dose，MTD)或所有劑量群組已測試為止。然而，即使在劑量遞增完成之前，仍可在評估任何群組之耐受性及藥效學 活性之後選擇劑量群組進行擴增。
劑量限制性毒性：除了不能投與(因為研究藥物毒性)窗內之2號劑量之外，除了明確認為與疾病進展或間發病相關的事件之外，在出現以下研究毒性之後將考慮DLT：非血液學毒性：(i)2級葡萄膜炎(視為潛在irAE)；(ii)天冬胺酸轉胺酶(Aspartate aminotransferase，AST)或丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase，ALT)>5倍正常值上限(upper limit of normal，ULN)及/或總膽紅素>3倍ULN。關於具有肝轉移之患者，若2級處於基線，則AST、ALT及/或總膽紅素>2倍基線值；及(iii)任何3級非血液學毒性，包含irAE(如藉由體驗其他免疫調節藥物所定義)，但以下除外：(a)儘管有最大支持性護理措施，如由治療醫師所開出，但仍存在持久(>72小時持續時間)的3級噁心、嘔吐或腹瀉；及(b)視為臨床上不顯著且不滿足不良事件(adverse event，AE)之準則的3級實驗室異常。
血液學毒性：(i)持續超過7天之4級嗜中性白血球減少症；(ii)4級血小板減少症；(iii)伴隨流血之3級血小板減少症；(iv)3級發熱性嗜中性白血球減少症(發熱38.5℃且絕對嗜中性白血球計數<1.0×109/L)或伴隨有記載的感染的3級嗜中性白血球減少症；(v)4級貧血；及(vi)持續超過7天或需要輸液的3級貧血。
若在個別群組中在DLT評估之後發展出安全問題，則可在試驗主持人與試驗委託者之間進行討論之後暫停登記。觸發暫停之安全問題可包含早期或晚期安全性事件。
劑量擴增：可在評估除了群組C以外的任何群組之耐受性及藥效學活性(包含但不限於周邊ICOS+ T細胞增加)之後，選擇劑量群組進行擴增，群組C將不擴增。劑量擴增群組將登記在接受抗PD-1/PD-L1療法的同時仍有進展的經歷抗PD-1/PD-L1免疫療法之NSCLC患者，以測定組合療法在此群體中之耐受性及活性。至多選擇3個各別劑量方案進行劑量擴增以鑑別NSCLC患者之最佳組合方案。擴增群組將登記最多27名患者，各自基於Simon二階段設計。若在個別擴增群組中發展出安全問題，則可在試驗主持人與試驗委託者之間進行討論之後暫停登記。觸發暫停之安全問題可包含早期或晚期安全性事件。
研究持續時間
研究持續時間為約102週，不包含篩選或隨訪期。
群體
樣品大小：期望在劑量遞增期間登記至多約53名成年患者且期望在劑量擴增期間登記至多3個擴增群組，各群組中登記最多27名患者，在美國至多約15個地點登記。所登記患者之總數將視在劑量遞增期間所觀測到之DLT、PK/藥效學分析、所開啟之擴增群組之數目及Simon二階段擴增群組之第1階段之功效而定。
目標群體：此研究之目標群體為診斷患有不可切除性IIIB期或IV期鱗狀或非鱗狀NSCLC的18歲之男性及女性。
納入準則(Inclusion Criteria)：患者必須滿足以下準則才有資格納入研究中：
1.18歲之男性及女性；
2.具有不可切除性IIIB期或IV期疾病的組織學或細胞學上證實鱗狀或非鱗狀NSCLC患者；
3.劑量遞增(群組C除外)：已接受不超過3線全身性療法、包含不超過2線細胞毒性化學療法且預期沒有療法可向其傳遞臨床益處的經歷治療之患者。已接受先前的PD-1/PD-L1免疫療法的患者一定不能因為治療相關之AE而永久性中斷。在劑量遞增期間允許具有可靶向突變(包含表皮生長因子受體[EGFR]、ALK及ROS1)之患者，但所述患者必須另外接受至少1線靶向療法。
a.注意：可容許1)輔助或新輔助化學療法或免疫療法(在手術及/或放射線療法之後)或2)存在或不存在後續免疫療法的確定性化學放射線療法用於III期疾病且在評估在完成療法之後超過6個月患上再發性或轉移性疾病的患者之療法線時不包含所述療法；
4.劑量遞增群組C：已接受先前的1至2線細胞毒性化學療法，包含含有鉑之雙重方案的抗PD-1/PD-L1未經治療的患者。在劑量遞增期間允許患者具有可靶向的突變(包含EGFR、ALK及ROS1)，但所述患者必須另外接受至少1線靶向療法。
a.注意：可容許1)輔助或新輔助化學療法或2)確定性化學放射性療法用於III期疾病且在評估在完成療法之後超過6個月患上再發性或轉移性疾病的患者之療法線時不包含所述療法。
5.擴增群組：在接受療法的同時或在療法停止6個月之內III期或IV期疾病有進展的經歷抗PD-1/PD-L1之患者。患者一定不能因為治療相關之AE而永久性中斷抗PD-1/PD-L1療法。患者必須接受一線抗PD-1/PD-L1免疫療法。患者亦可接受一線化學療法。只要除了如以下注意事項中所述者 之外不再接受額外的療法線，便可容許先前的化學療法及免疫療法組合。
a.注意：可容許1)輔助或新輔助化學療法或免疫療法(在手術及/或放射線療法之後)或2)存在或不存在後續免疫療法的確定性化學放射線療法用於III期疾病且在評估在完成療法之後超過6個月患上再發性或轉移性疾病的患者之療法線時不包含所述療法；
6.先前尚未照射過的存檔的或新獲得的福馬林(formalin)固定的腫瘤組織；
7.擴增群組：至少1個可藉由電腦斷層攝影(computed tomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)根據RECIST 1.1準則在放射線照相下量測的病灶。目標病灶可位於先前照射視野若在彼位點存在有記錄的(放射線照相)疾病進展；
8.1之美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體能狀態(performance status)；
9.預計至少3個月之預期壽命；
10.如下文所定義之適當的器官及骨髓功能：
˙血紅蛋白9.0g/dL(注意：在篩選實驗室評估之前14天內因血紅蛋白<9.0g/dL而接受輸血的患者不符合條件)
˙絕對嗜中性白血球計數1.5×109/L
˙血小板計數75,000/mm3
˙腎小球濾過率(Glomerular filtration rate，GFR)>30mL/min/1.73m2
˙總膽紅素1.5×ULN(若肝轉移3×ULN)，但診斷患有臨床上確認的捷倍耳氏症候群(Gilbert's syndrome)的患者除外
˙若肝轉移，則AST)及ALT3×ULN或5×ULN
˙鹼性磷酸酶2.5×ULN(或若肝或骨轉移，則5.0×ULN)
˙不滿足海氏定律(Hy's law)準則(ALT及/或AST>3×ULN且膽紅素>2×ULN)；
11.願意且能夠遵守臨床訪視及研究相關程序；及
12.提供由研究患者或法律上可接受的代表簽署的知情同意書。
排除準則(Exclusion Criteria)：將從研究中排除滿足以下準則中之任一者的患者：
1.僅擴增群組：從不吸菸的患者，從不吸菸定義為一生中吸100根香菸；
2.活性或未經治療之腦轉移或脊髓壓迫。若在登記之前至少2週，中樞神經系統(central nervous system，CNS)轉移得到充分治療且患者神經學上已回至基線(與CNS治療有關的殘留徵象或症狀除外)，則患者符合條件。患者必須停掉(免疫抑制劑量之)皮質類固醇療法；
3.僅擴增群組：EGFR及ALK基因突變或ROS1融合經測試為陽性之腫瘤患者。所有患者均應針對EGFR突變、ALK重排及ROS1融合評估腫瘤；
4.在登記之前2週之內進行放射線療法且未從任何因為放射線所導致之AE恢復至基線；
5.先前接受抗CTLA-4抗體治療的患者；
6.在知情同意書前一年有腦炎、腦膜炎或不受控制的癲癇；
7.需要免疫抑制劑量之糖皮質激素來輔助管理的間質性肺病(例如特發性肺纖維化、器質化肺炎)或活性、非感染性肺炎史。允許在輻射場中有放射線肺炎史，只要肺炎在登記前6個月解決即可；
8.需要用全身性免疫抑制治療方式治療的顯著自體免疫疾病的持續的或近來的跡象，其可表明有免疫相關之治療中出現的不良事件 (immune-related treatment-emergent adverse event，irTEAE)的風險。以下情況不排除在外：白斑病、已解決的兒童哮喘、I型糖尿病、僅需要激素置換的殘餘甲狀腺功能低下或不需要全身性治療的牛皮癬；
9.在隨機分組14天內具有需要皮質類固醇療法(>10mg潑尼松(prednisone)/天或等效物)之病況的患者。允許生理置換劑量，即使其為>10mg潑尼松/天或等效物，只要其不是出於免疫抑制目的投與即可。允許吸入或局部類固醇，其限制條件為其不是用於治療自體免疫病症；
10.僅擴增群組：另一進行性或要求治療之惡性疾病，但可能已經歷治癒性療法的非黑色素瘤皮膚癌或已經過治療的原位子宮頸癌或任何其他腫瘤除外，且認為患者在進入研究前至少2年完全緩解，且在研究期內不需要額外療法；
11.不受控制的感染人類免疫缺乏病毒、B型肝炎或C型肝炎感染；或診斷患有免疫缺乏；注意：˙在篩選時將對患者進行C型肝炎病毒(HCV)及B型肝炎病毒(HBV)測試；˙允許具有受控制的感染的已知HIV感染患者(不可偵測之病毒負荷(HIV RNA PCR)及CD4計數高於350，自發地或基於穩定抗病毒方案)。關於具有受控制的HIV感染之患者，將根據地方標準進行監測；˙允許具有受控制的感染的B型肝炎(HepBsAg+)患者(血清B型肝炎病毒DNA PCR低於偵測極限且接受針對B型肝炎之抗病毒療法)。具有受控制的感染的患者必須定期監測HBV DNA。在最後一個劑量之試驗用研究藥物之後，患者必須堅持抗病毒療法至少6個月；˙允許具有受控制的感染的C型肝炎病毒抗體陽性(HCV Ab+)患者 (PCR不可偵測之HCV RNA，自發地或對抗HCV療法之成功的先驗過程起反應)。
12.在開始研究藥物之前14天內需要全身性療法的活動性感染；
13.在開始用研究療法治療之前至少3個月尚未轉變成基線之來自免疫調節劑(包含但不限於抗PD1/PD-L1療法、其他檢查點抑制劑療法及PI 3K-δ抑制劑)的治療相關之免疫介導性AE。若患者經歷與先前用PD-1/PD-L1途徑之阻斷劑治療相關之免疫介導性AE，不管發生時間，需要永久性中止所述藥劑，則排除用測米匹單抗治療所述患者。注意：允許已用激素置換控制的經歷任何級別之甲狀腺功能低下或I型糖尿病之患者；
14.先前在任何時間用艾德昔布(idelalisib，ZYDELIG®)治療；
15.當前正在另一研究中接受治療或已經參與試驗藥之研究且接受治療，或在研究療法之第一次給藥4週內使用試驗裝置，或在研究療法之第一次給藥3週內接受審批通過的全身性療法治療，或已在研究療法之第一次給藥之5個半衰期內接受任何先前全身性療法，無論哪個更久(抗PD-1/PD-L1療法除外)。若從最後一個治療起已經過至少28天，則在與試驗委託者討論之後，允許預先經貝伐單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或半衰期大於7天的其他非免疫調節性抗體治療之患者。關於經歷抗PD-1/PD-L1之患者，在研究療法之第一次給藥3週之內不能預先給予抗PD-1/PD-L1療法，無論藥物之半衰期或審批狀態如何；
16.在研究藥品計劃開始30天內接受活毒疫苗；
17.在第一次給藥之前4週之內做過大手術或有明顯的創傷性損傷；
18.已知對多西環素(doxycycline)或類似化合物(亦即，四環素)過敏；
19.有記載對任何蛋白質類治療劑(例如重組蛋白、疫苗、靜脈內 免疫球蛋白、單株抗體、受體捕獲劑)具有過敏或超敏反應；
20.已知的精神病學或物質使用疾患(substance abuse disorder)，其將干擾參與研究的要求，包含非法藥物之當前使用；
21.預先同種異體幹細胞移植；
22.在試驗主持人看來參與研究並不符合患者最佳利益的任何醫學病況；
23.妊娠期或哺乳期女性；
24.在基線(第1個週期第1天，在給藥之前)訪視時陽性血清hCG妊娠測試；
25.在初次給藥/第一次治療開始之前、在研究期間及在最後一次給藥之後至少6個月，不願意採取非常有效的避孕措施的有生育潛力*之性活躍的男性及女性。非常有效的避孕措施包含：˙穩定使用組合(含有雌激素及助孕素)激素避孕(經口、陰道內、經皮)或僅助孕素激素避孕(經口、可注射、可植入)，其與抑制在篩選前2個或更多個月經週期開始的排卵有關；˙子宮內裝置(intrauterine device，IUD)；子宮內激素釋放系統(intrauterine hormone-releasing system，IUS)；˙兩側輸卵管結紮；˙伴侶切除輸精管；˙及或禁慾†,‡。
*為了被視為沒有生育潛力，停經後女性必須停經至少12個月。已記載做過子宮切除術或輸卵管結紮之女性不需要妊娠測試及避孕。
†禁慾僅在定義為在與研究治療相關之整個風險期內忍住不與異性性交時才被視為非常有效的方法。‡週期性禁慾(日曆法、征狀基礎體溫法、 排卵後法)、撤出(性交中斷)、僅殺精劑及泌乳停經法(lactational amenorrhoea method，LAM)為不可接受的避孕方法。女性保險套及男性保險套不應一起使用；
26.臨床現場研究小組之成員及/或其近親屬(immediate family)。
治療
REGN4659：將按各種方案(Q3W、Q6W、Q12W)研究3種劑量(25、75及250mg IV固定劑量)。
測米匹單抗：Q3W投與2種劑量(350及1050mg IV固定劑量)。
主要終點
在劑量遞增期中：DLT、治療中出現的不良事件(TEAE)、irAE、嚴重不良事件(SAE)、死亡、實驗室異常(根據不良事件之常見術語準則[Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE]，3級或更高級)之比率。
在劑量擴增期中：基於實體腫瘤反應評估準則(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST)1.1之客觀反應率(ORR)，及TEAE、irAE、SAE、死亡、實驗室異常(根據CTCAE 3級或更高級)之比率。
次要終點
基於多反應準則之腫瘤量測包含：(i)基於RECIST 1.1之ORR(劑量遞增)，(ii)基於免疫類療法反應評估準則(iRECIST)之ORR，(iii)最佳整體反應(best overall response，BOR)、反應持續時間(duration of response，DOR)、疾病控制率及基於RECIST 1.1、iRECIST之無進展存活期(progression-free survival，PFS)，及(iv)總存活期(Overall survival， OS)。
經由流動式細胞測量術對各劑量群組內之絕對ICOS+ CD4 T細胞及其他活化標誌物之改變%進行定量。
程序及評定
REGN4659及測米匹單抗之安全性及耐受性將藉由臨床評定AE及藉由反覆量測臨床評估及實驗室評定來監測，臨床評估包含生命徵象(溫度、血壓、脈搏及呼吸)、體檢(全面的及有限的)、12導程心電圖(electrocardiogram，ECG)，實驗室評定包含標準血液學、化學及尿分析。
抗腫瘤活性將藉由CT/MRI評定。
將收集血液樣品用於測定血清及抗藥物抗體(抗REGN4659或抗測米匹單抗)樣品中之功能性REGN4659及功能性測米匹單抗。
將收集血清、血漿、外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及腫瘤活體組織切片用於生物標誌物分析。將收集基因組DNA樣品。將在血清、血漿、PBMC及腫瘤組織中研究所推測的藥效學、與REGN4659及測米匹單抗治療暴露相關的預測及預後生物標誌物、臨床活性或潛在疾病。
統計計劃
劑量遞增期：不存在關於研究之劑量遞增期的形式統計假設；此階段之分析在本質上將為描述性及探索性的。關於各劑量遞增群組(群組1*、2*、2、3及4*)，基於經修改的3+3設計(「4+3」)，計劃約35名DLT可評估患者。群組5及6計劃十二名患者(每個群組6名患者)。此等劑量遞增群組之實際樣品大小將視所記載之DLT、所得群組大小及所實施之劑量之數值而定。
劑量擴增期：關於各擴增群組，在NSCLC患者中，其經歷 過抗PD-1/PD-L1免疫療法且在接受抗PD-1/PD-L1療法的同時有進展，因為此等患者存在較少可用功效資料，所以試驗委託者認為任何優於5%之可量測的ORR均表示有臨床意義的治療效果。使用Simon二階段Minimax設計以5%之單邊顯著水準(1-sided significant level)及80%之檢定力(power)測定各擴增群組中27名患者之樣品大小。
主要功效分析：擴增群組之藉由RECIST 1.1確定之最佳整體反應將使用描述統計連同雙邊95%信賴區間來概述。
ORR將藉由描述統計連同95%信賴區間來概述。BOR不可評估之患者將視為無反應者。
關於擴增群組，若反應者之數目大於或等於Simon二階段設計中所指定之反應者的最小數目，則視為治療有效且值得進一步研究。
次要功效分析包含如藉由iRECIST所量測之ORR、DOR、疾病控制率及PFS。彼等次要功效終點將藉由劑量遞增及擴增群組以描述方式概述。
安全性觀測及量測包含藥物暴露、AE、實驗室資料及生命徵象，將概述及呈現於表格及列表中。
關於劑量遞增期：在DLT評估期內觀測到之DLT將藉由劑量群組概述。
結果
在劑量遞增期中，單獨的及呈組合形式之REGN4659及測米匹單抗在經歷治療之NSCLC患者中均將被良好耐受。在劑量擴增期中，在經歷抗PD-1/PD-1免疫療法之NSCLC患者中，REGN4659與測米匹單抗組合將被良好耐受且將展現可量測的抗腫瘤反應。
例示性實施例
本發明亦關於以下項目：
項目1.一種抗體或其抗原結合片段，其結合人類細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)且阻斷hCTLA-4與配體B7-1及/或配體B7-2之間的相互作用。
項目2.如項目1之抗體或抗原結合片段，其誘導T細胞活化。
項目3.如項目2之抗體或抗原結合片段，其中所述T細胞為細胞毒性T細胞。
項目4.如項目2或3之抗體或抗原結合片段，其中所述T細胞為腫瘤浸潤性淋巴細胞。
項目5.如項目1至4中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段結合猴CTLA-4。
項目6.如項目1至5中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段以小於5nM之EC50結合CTLA-4表現細胞。
項目7.如項目1至6中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段以小於1nM之EC50結合CTLA-4表現細胞。
項目8.如項目1至7中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段以小於0.5nM之EC50結合人類CTLA-4表現細胞。
項目9.如項目1至8中任一項之抗體或抗原結合片段，其以小於0.5nM之EC50結合猴CTLA-4表現細胞。
項目10.如項目1至9中任一項之抗體或抗原結合片段，其為完全人類抗體。
項目11.如項目1至10中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR 胺基酸序列對的參考抗體競爭與人類CTLA-4結合：(a)SEQ ID NO：2及10、(b)SEQ ID NO：18及26、(c)SEQ ID NO：34及42、(d)SEQ ID NO：50及58、(e)SEQ ID NO：66及74、(f)SEQ ID NO：82及90、(g)SEQ ID NO：98及106、(h)SEQ ID NO：114及122、(i)SEQ ID NO：130及138、(j)SEQ ID NO：146及154、(k)SEQ ID NO：162及170、(l)SEQ ID NO：178及186、(m)SEQ ID NO：194及202、(n)SEQ ID NO：210及218、(o)SEQ ID NO：226及234、(p)SEQ ID NO：242及250、(q)SEQ ID NO：258及266、(r)SEQ ID NO：274及282、(s)SEQ ID NO：290及298、(t)SEQ ID NO：306及298、(u)SEQ ID NO：314及322、(v)SEQ ID NO：330及338、(w)SEQ ID NO：346及354、(x)SEQ ID NO：362及370、(y)SEQ ID NO：378及386、(z)SEQ ID NO：394及402、(a')SEQ ID NO：410及418、(b')SEQ ID NO：426及434、(c')SEQ ID NO：442及450、(d')SEQ ID NO：458及466、(e')SEQ ID NO：474及482及(f')SEQ ID NO：490及498。
項目12.如項目1至11中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段與包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的參考抗體結合於人類CTLA-4上之同一個抗原決定基：(a)SEQ ID NO：2及10、(b)SEQ ID NO：18及26、(c)SEQ ID NO：34及42、(d)SEQ ID NO：50及58、(e)SEQ ID NO：66及74、(f)SEQ ID NO：82及90、(g)SEQ ID NO：98及106、(h)SEQ ID NO：114及122、(i)SEQ ID NO：130及138、(j)SEQ ID NO：146及154、(k)SEQ ID NO：162及170、(l)SEQ ID NO：178及186、(m)SEQ ID NO：194及202、(n)SEQ ID NO：210及218、(o)SEQ ID NO：226及234、(p)SEQ ID NO：242及250、(q)SEQ ID NO：258及266、(r)SEQ ID NO：274及282、(s) SEQ ID NO：290及298、(t)SEQ ID NO：306及298、(u)SEQ ID NO：314及322、(v)SEQ ID NO：330及338、(w)SEQ ID NO：346及354、(x)SEQ ID NO：362及370、(y)SEQ ID NO：378及386、(z)SEQ ID NO：394及402、(a')SEQ ID NO：410及418、(b')SEQ ID NO：426及434、(c')SEQ ID NO：442及450、(d')SEQ ID NO：458及466、(e')SEQ ID NO：474及482及(f')SEQ ID NO：490及498。
項目13.如項目1至12中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括：(a)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)之互補決定區(CDR)：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474及490；及(b)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)之CDR：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482及498。
項目14.如項目1至13中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對的重鏈及輕鏈CDR：(a)SEQ ID NO：2及10、(b)SEQ ID NO：18及26、(c)SEQ ID NO：34及42、(d)SEQ ID NO：50及58、(e)SEQ ID NO：66及74、(f)SEQ ID NO：82及90、(g)SEQ ID NO：98及106、(h)SEQ ID NO：114及122、(i)SEQ ID NO：130及138、(j)SEQ ID NO：146及154、(k)SEQ ID NO：162及170、(l)SEQ ID NO：178及186、(m)SEQ ID NO：194及202、(n)SEQ ID NO：210及218、(o)SEQ ID NO：226及234、(p)SEQ ID NO：242及250、(q)SEQ ID NO：258及266、 (r)SEQ ID NO：274及282、(s)SEQ ID NO：290及298、(t)SEQ ID NO：306及298、(u)SEQ ID NO：314及322、(v)SEQ ID NO：330及338、(w)SEQ ID NO：346及354、(x)SEQ ID NO：362及370、(y)SEQ ID NO：378及386、(z)SEQ ID NO：394及402、(a')SEQ ID NO：410及418、(b')SEQ ID NO：426及434、(c')SEQ ID NO：442及450、(d')SEQ ID NO：458及466、(e')SEQ ID NO：474及482及(f')SEQ ID NO：490及498。
項目15.如項目1至14中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括包括選自由以下組成之群之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3域：(a)分別為SEQ ID NO：4、6、8、12、14及16；(b)分別為SEQ ID NO：20、22、24、28、30及32；(c)分別為SEQ ID NO：36、38、40、44、46及48；(d)分別為SEQ ID NO：52、54、56、60、62及64；(e)分別為SEQ ID NO：68、70、72、76、78及80；(f)分別為SEQ ID NO：84、86、88、92、94及96；(g)分別為SEQ ID NO：100、102、104、108、110及112；(h)分別為SEQ ID NO：116、118、120、124、126及128；(i)分別為SEQ ID NO：132、134、136、140、142及144；(j)分別為SEQ ID NO：148、150、152、156、158及160；(k)分別為SEQ ID NO：164、166、168、172、174及176；(l)分別為SEQ ID NO：180、182、184、188、190及192；(m)分別為SEQ ID NO：196、198、200、204、206及208；(n)分別為SEQ ID NO：212、214、216、220、222及224；(o)分別為SEQ ID NO：228、230、232、236、238及240；(p)分別為SEQ ID NO：244、246、248、252、254及256；(q)分別為SEQ ID NO：260、262、264、268、270及272；(r)分別為SEQ ID NO：276、278、280、284、286及288；(s)分別為SEQ ID NO：292、294、 296、300、302及304；(t)分別為SEQ ID NO：308、310、312、300、302及304；(u)分別為SEQ ID NO：316、318、320、324、326及328；(v)分別為SEQ ID NO：332、334、336、340、342及344；(w)分別為SEQ ID NO：348、350、352、356、358及360；(x)分別為SEQ ID NO：364、366、368、372、374及376；(y)分別為SEQ ID NO：380、382、384、388、390及392；(z)分別為SEQ ID NO：396、398、400、404、406及408；(a')分別為SEQ ID NO：412、414、416、420、422及424；(b')分別為SEQ ID NO：428、430、432、436、438及440；(c')分別為SEQ ID NO：444、446、448、452、454及456；(d')分別為SEQ ID NO：460、462、464、468、470及472；(e')分別為SEQ ID NO：476、478、480、484、486及488；及(f')分別為SEQ ID NO：492、494、496、500、502及504。
項目16.如項目1至15中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對：(a)SEQ ID NO：2及10、(b)SEQ ID NO：18及26、(c)SEQ ID NO：34及42、(d)SEQ ID NO：50及58、(e)SEQ ID NO：66及74、(f)SEQ ID NO：82及90、(g)SEQ ID NO：98及106、(h)SEQ ID NO：114及122、(i)SEQ ID NO：130及138、(j)SEQ ID NO：146及154、(k)SEQ ID NO：162及170、(l)SEQ ID NO：178及186、(m)SEQ ID NO：194及202、(n)SEQ ID NO：210及218、(o)SEQ ID NO：226及234、(p)SEQ ID NO：242及250、(q)SEQ ID NO：258及266、(r)SEQ ID NO：274及282、(s)SEQ ID NO：290及298、(t)SEQ ID NO：306及298、(u)SEQ ID NO：314及322、(v)SEQ ID NO：330及338、(w)SEQ ID NO：346及354、(x)SEQ ID NO：362及370、(y)SEQ ID NO：378及386、(z)SEQ ID NO：394及402、(a')SEQ ID NO：410及418、(b')SEQ ID NO：426 及434、(c')SEQ ID NO：442及450、(d')SEQ ID NO：458及466、(e')SEQ ID NO：474及482及(f')SEQ ID NO：490及498。
項目17.一種抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其包括：(a)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)之互補決定區(CDR)：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474及490；及(b)具有選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)之CDR：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482及498。
項目18.如項目17之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對之重鏈及輕鏈CDR：(a)SEQ ID NO：2及10、(b)SEQ ID NO：18及26、(c)SEQ ID NO：34及42、(d)SEQ ID NO：50及58、(e)SEQ ID NO：66及74、(f)SEQ ID NO：82及90、(g)SEQ ID NO：98及106、(h)SEQ ID NO：114及122、(i)SEQ ID NO：130及138、(j)SEQ ID NO：146及154、(k)SEQ ID NO：162及170、(l)SEQ ID NO：178及186、(m)SEQ ID NO：194及202、(n)SEQ ID NO：210及218、(o)SEQ ID NO：226及234、(p)SEQ ID NO：242及250、(q)SEQ ID NO：258及266、(r)SEQ ID NO：274及282、(s)SEQ ID NO：290及298、(t)SEQ ID NO：306及298、(u)SEQ ID NO：314及322、(v)SEQ ID NO：330及338、(w)SEQ ID NO：346及354、(x)SEQ ID NO：362及370、(y)SEQ ID NO：378及386、(z)SEQ ID NO：394及402、(a')SEQ ID NO：410及418、(b')SEQ ID NO：426及434、 (c')SEQ ID NO：442及450、(d')SEQ ID NO：458及466、(e')SEQ ID NO：474及482及(f')SEQ ID NO：490及498。
項目19.如項目17或18之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括選自由以下組成之群之HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3域：(a)分別為SEQ ID NO：4、6、8、12、14及16；(b)分別為SEQ ID NO：20、22、24、28、30及32；(c)分別為SEQ ID NO：36、38、40、44、46及48；(d)分別為SEQ ID NO：52、54、56、60、62及64；(e)分別為SEQ ID NO：68、70、72、76、78及80；(f)分別為SEQ ID NO：84、86、88、92、94及96；(g)分別為SEQ ID NO：100、102、104、108、110及112；(h)分別為SEQ ID NO：116、118、120、124、126及128；(i)分別為SEQ ID NO：132、134、136、140、142及144；(j)分別為SEQ ID NO：148、150、152、156、158及160；(k)分別為SEQ ID NO：164、166、168、172、174及176；(l)分別為SEQ ID NO：180、182、184、188、190及192；(m)分別為SEQ ID NO：196、198、200、204、206及208；(n)分別為SEQ ID NO：212、214、216、220、222及224；(o)分別為SEQ ID NO：228、230、232、236、238及240；(p)分別為SEQ ID NO：244、246、248、252、254及256；(q)分別為SEQ ID NO：260、262、264、268、270及272；(r)分別為SEQ ID NO：276、278、280、284、286及288；(s)分別為SEQ ID NO：292、294、296、300、302及304；(t)分別為SEQ ID NO：308、310、312、300、302及304；(u)分別為SEQ ID NO：316、318、320、324、326及328；(v)分別為SEQ ID NO：332、334、336、340、342及344；(w)分別為SEQ ID NO：348、350、352、356、358及360；(x)分別為SEQ ID NO：364、366、368、372、374及376；(y)分別為SEQ ID NO：380、382、384、388、390及392；(z) 分別為SEQ ID NO：396、398、400、404、406及408；(a')分別為SEQ ID NO：412、414、416、420、422及424；(b')分別為SEQ ID NO：428、430、432、436、438及440；(c')分別為SEQ ID NO：444、446、448、452、454及456；(d')分別為SEQ ID NO：460、462、464、468、470及472；(e')分別為SEQ ID NO：476、478、480、484、486及488；及(f')分別為SEQ ID NO：492、494、496、500、502及504。
項目20.如項目17至19中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括選自由以下組成之群之HCVR/LCVR胺基酸序列對：(a)SEQ ID NO：2及10、(b)SEQ ID NO：18及26、(c)SEQ ID NO：34及42、(d)SEQ ID NO：50及58、(e)SEQ ID NO：66及74、(f)SEQ ID NO：82及90、(g)SEQ ID NO：98及106、(h)SEQ ID NO：114及122、(i)SEQ ID NO：130及138、(j)SEQ ID NO：146及154、(k)SEQ ID NO：162及170、(l)SEQ ID NO：178及186、(m)SEQ ID NO：194及202、(n)SEQ ID NO：210及218、(o)SEQ ID NO：226及234、(p)SEQ ID NO：242及250、(q)SEQ ID NO：258及266、(r)SEQ ID NO：274及282、(s)SEQ ID NO：290及298、(t)SEQ ID NO：306及298、(u)SEQ ID NO：314及322、(v)SEQ ID NO：330及338、(w)SEQ ID NO：346及354、(x)SEQ ID NO：362及370、(y)SEQ ID NO：378及386、(z)SEQ ID NO：394及402、(a')SEQ ID NO：410及418、(b')SEQ ID NO：426及434、(c')SEQ ID NO：442及450、(d')SEQ ID NO：458及466、(e')SEQ ID NO：474及482及(f')SEQ ID NO：490及498。
項目21.如項目17至20中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體包括：包括SEQ ID NO：509之胺基酸序列的重鏈及包括SEQ ID NO：510之胺基酸序列的輕鏈。
項目22.一種醫藥組合物，其包括如項目1至21中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
項目23.一種經分離多核苷酸分子，其包括編碼如項目1至21中任一項中所闡述之抗體之HCVR的多核苷酸序列。
項目24.一種經分離多核苷酸分子，其包括編碼如項目1至21中任一項中所闡述之抗體之LCVR的多核苷酸序列。
項目25.一種載體，其包括如項目23之多核苷酸及/或如項目24之多核苷酸。
項目26.一種宿主細胞，其表現如項目25之載體。
項目27.如項目1至21中任一項之抗體或其抗原結合片段或如項目22之醫藥組合物，其係用於抑制有需要之個體中之腫瘤或腫瘤細胞之生長。
項目28.如項目27之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述腫瘤為原發性或再發性腫瘤。
項目29.如項目27之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述腫瘤為已建立的腫瘤。
項目30.如項目27至29中任一項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述腫瘤存在於具有選自由以下組成之群之疾病或病症的個體中：血癌、腦癌、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌、腎癌、子宮頸癌、胃癌、胰臟癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、B細胞淋巴瘤、骨髓瘤及黑色素瘤。
項目31.如項目27至30中任一項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述抗體或其抗原結合片段或所述醫藥組合物以初始 劑量、繼之以一或多個第二劑量之形式向所述個體投與，其中各第二劑量在前一劑量之後1週至12週投與。
項目32.如項目31之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述抗體或其抗原結合片段或所述醫藥組合物以約25-600mg之劑量向所述個體投與。
項目33.如項目27至32中任一項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述抗體或其抗原結合片段與第二治療劑組合向個體投與。
項目34.如項目33之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述第二治療劑選自由以下組成之群：LAG3抑制劑、針對腫瘤特異性抗原之抗體、針對病毒感染細胞抗原之抗體、PD-1抑制劑、PD-L1抑制劑、CD20抑制劑、針對CD20及CD3之雙特異性抗體、諸如抗氧化劑之膳食補充劑、VEGF拮抗劑、癌症疫苗、化學治療劑、細胞毒性劑、放射線、手術及任何其他適用於改善至少一種與所述疾病或病症相關之症狀的療法。
項目35.如項目33或34之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述第二治療劑為PD-1抑制劑。
項目36.如項目33至35中任一項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述PD-1抑制劑為測米匹單抗、納武單抗或派姆單抗。
項目37.如項目36之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述PD-1抑制劑以每公斤所述個體之體重1mg、3mg或10mg之劑量投與。
項目38.如項目33至35中任一項之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述PD-1抑制劑以50-1200mg之劑量投與。
項目39.如項目27至38中任一項之抗體或其抗原結合片段 或醫藥組合物，其中所述抗體或其抗原結合片段或所述醫藥組合物皮下、靜脈內、瘤內、瘤周、皮內、腹膜內、經口、肌肉內或顱內投與。
項目40. 如項目1至21中任一項之抗體或其抗原結合片段或如項目22之醫藥組合物，其係用於治療可藉由拮抗有需要之個體中之CTLA-4來治療的疾病或病症。
項目41. 如項目40之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述疾病或病症為由選自由以下組成之群之病毒引起的慢性病毒感染：人類免疫缺乏病毒(HIV)、C型肝炎病毒(HCV)、B型肝炎病毒(HBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)及猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。
項目42. 如項目40之抗體或其抗原結合片段或醫藥組合物，其中所述疾病或病症選自由以下組成之群：血癌、腦癌、腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、皮膚癌、子宮頸癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、B細胞淋巴瘤及黑色素瘤。
項目43. 一種產生抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段之方法，其包括使項目26之宿主細胞在允許所述抗體或其抗原結合片段產生之條件下生長，且回收如此產生之抗體或其抗原結合片段。
項目44. 如項目43之方法，其進一步包括將所述抗體或其抗原結合片段調配為包括可接受之載劑的醫藥組合物。
項目45. 一種抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其係與抗PD-1抗體組合使用以治療有需要之個體之非小細胞肺癌。
項目46. 如項目45之抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段為如項目1至21中任一項所主張 之抗體或其抗原結合片段。
項目47. 如項目45或46之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CTLA-4抗體包括：包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的HCVR之CDR及包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的LCVR之CDR。
項目48. 如項目45至47中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CTLA-4抗體包括序列SEQ ID NO：196之HCDR1、序列SEQ ID NO：198之HCDR2、序列SEQ ID NO：200之HCDR3、序列SEQ ID NO：204之LCDR1、序列SEQ ID NO：206之LCDR2及序列SEQ ID NO：208之LCDR3。
項目49. 如項目45至48中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CTLA-4抗體包括：包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的HCVR及包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的LCVR。
項目50. 如項目45至49中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CTLA-4抗體包括人類IgG1重鏈恆定區。
項目51. 如項目45至50中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CTLA-4抗體包括：包括SEQ ID NO：509之胺基酸序列的重鏈及SEQ ID NO：510之胺基酸序列之輕鏈。
項目52. 如項目45至51中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體為測米匹單抗。
項目53. 如項目45至52中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段以25-600mg之劑量投與。
項目54. 如項目45至53中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗PD-1抗體以50-1200mg之劑量投與。
項目55. 如項目45至54中任一項之抗體或其抗原結合片 段，其中所述抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段以初始劑量、繼之以一或多個第二劑量之形式投與，其中各第二劑量在前一劑量之後1週至12週投與。
項目56. 如項目45至55中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述非小細胞肺癌(NSCLC)為晚期或轉移性NSCLC。
項目57. 如項目22之醫藥組合物，其係與抗PD-1抗體組合使用以治療有需要之個體之非小細胞肺癌。
本發明之範疇不受本文所述之特定實施例限制。實際上，根據前述描述，除本文所描述之修改以外，本發明之各種修改對本領域中熟習此項技術者而言亦會變得顯而易見。此類修改意欲屬於所附申請專利範圍之範疇內。
<110> 再生元醫藥公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<400> 420
<210> 421
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<210> 423
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<220>
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<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<210> 442
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<220>
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<212> DNA
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<223> 合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 459
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 460
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<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 合成
<400> 461
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
<400> 463
<210> 464
<211> 15
<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 465
<210> 466
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 合成
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 470
<210> 471
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 471
<210> 472
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 472
<210> 473
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 473
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 474
<210> 475
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 475
<210> 476
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 476
<210> 477
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 477
<210> 478
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 478
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 480
<210> 481
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 481
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 482
<210> 483
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 483
<210> 484
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 484
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<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 485
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 486
<210> 487
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 487
<210> 488
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 488
<210> 489
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 489
<210> 490
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 490
<210> 491
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 491
<210> 492
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 492
<210> 493
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 493
<210> 494
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 494
<210> 495
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 495
<210> 496
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 496
<210> 497
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 497
<210> 498
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 498
<210> 499
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 499
<210> 500
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 500
<210> 501
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 501
<210> 502
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 502
<210> 503
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 503
<210> 504
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 504
<210> 505
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA-4 NP_005205.2
<400> 505
<210> 506
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hCTLA-4-mmH(NP_005205.2之aa K36-D161，具有C端myc-myc-六組胺酸標籤)
<400> 506
<210> 507
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MfCTLA-4-mmH(XP_005574071.1之aa K36-D161，具有C端myc-myc-六組胺酸標籤)
<400> 507
<210> 508
<211> 359
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有C端小鼠Fc γ域(P01863之aa E98-K330)之 hCTLA-4-mFc二聚hCTLA-4胞外域(NP_005205.2之aa K36-D161))
<400> 508
<210> 509
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R4659：HC
<400> 509
<210> 510
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R4659：LC
<400> 510

Claims (53)

  1. 一種與細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)特異性結合之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包括含於包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)內之三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1、HCDR2及HCDR3)；及含於包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的輕鏈可變區(LCVR)內之三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3，其分別由SEQ ID NO：196、198、200、204、206及208之胺基酸序列組成。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包括SEQ ID NO：194/202之HCVR/LCVR胺基酸序列對。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段為單株抗體。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段為完全人類抗體。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包括人類IgG1重鏈恆定區。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的抗體，其包括重鏈及輕鏈，其中所述重鏈包括SEQ ID NO：509之胺基酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的抗體，其包括重鏈及輕鏈，其中所述輕鏈包括SEQ ID NO：510之胺基酸序列。
  9. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的抗體，其包括重鏈及輕鏈，其中所述重鏈包括SEQ ID NO：509之胺基酸序列且所述輕鏈包括 SEQ ID NO：510之胺基酸序列。
  10. 一種與CTLA-4特異性結合之完全人類單株抗體或其抗原結合片段，其包括具有SEQ ID NO：509之胺基酸序列的重鏈及具有SEQ ID NO：510之胺基酸序列的輕鏈。
  11. 一種與CTLA-4特異性結合之抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包括HCVR之三個CDR(HCDR1、HCDR2及HCDR3)及LCVR之三個CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)，其中所述HCVR包括：(i)SEQ ID NO：194之胺基酸序列；(ii)與SEQ ID NO：194具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；(iii)與SEQ ID NO：194具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(iv)SEQ ID NO：194之具有至多10個胺基酸取代的胺基酸序列；且所述LCVR包括：(v)SEQ ID NO：202之胺基酸序列；(vi)與SEQ ID NO：202具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；(vii)與SEQ ID NO：202具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(viii)SEQ ID NO：202之具有至多10個胺基酸取代的胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包括HCVR，所述HCVR包括SEQ ID NO：194之具有至多10個胺基酸取代的胺基酸序列。
  13. 如申請專利範圍第11項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包括LCVR，所述LCVR包括SEQ ID NO：202之具有至多10個胺基酸取代的胺基酸序列。
  14. 如申請專利範圍第11項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述 HCVR包括與SEQ ID NO：194具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
  15. 如申請專利範圍第11項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述LCVR包括與SEQ ID NO：202具有至少90%序列一致性的胺基酸序列。
  16. 如申請專利範圍第11項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述HCVR包括與SEQ ID NO：194具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第11項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述LCVR包括與SEQ ID NO：202具有至少95%序列一致性的胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第11項至第17項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中HCDR1包括SEQ ID NO：196之胺基酸序列或與SEQ ID NO：196相差1個胺基酸之胺基酸序列，HCDR2包括SEQ ID NO：198之胺基酸序列或與SEQ ID NO：198相差1個胺基酸之胺基酸序列，HCDR3包括SEQ ID NO：200之胺基酸序列或與SEQ ID NO：200相差1個胺基酸之胺基酸序列，LCDR1包括SEQ ID NO：204之胺基酸序列或與SEQ ID NO：204相差1個胺基酸之胺基酸序列，LCDR2包括SEQ ID NO：206之胺基酸序列或與SEQ ID NO：206相差1個胺基酸之胺基酸序列，且LCDR3包括SEQ ID NO：208之胺基酸序列或與SEQ ID NO：208相差1個胺基酸之胺基酸序列。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的抗體或其抗原結合片段，其中HCDR1包括SEQ ID NO：196之胺基酸序列，HCDR2包括SEQ ID NO：198之胺基酸序列，HCDR3包括SEQ ID NO：200之胺基酸序列，LCDR1包括SEQ ID NO：204之胺基酸序列，LCDR2包括SEQ ID NO：206之胺基酸序列，且LCDR3包括SEQ ID NO：208之胺基酸序列。
  20. 如申請專利範圍第19項所述的抗體或其抗原結合片段，其中HCVR包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列且LCVR包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列。
  21. 一種醫藥組合物，其包括如申請專利範圍第1項至第20項中任一項所述的經分離抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  22. 一種經分離多核苷酸分子，其包括編碼如申請專利範圍第1項至第20項中任一項中所述之抗體之HCVR的多核苷酸序列。
  23. 一種經分離多核苷酸分子，其包括編碼如申請專利範圍第1項至第20項中任一項中所述之抗體之LCVR的多核苷酸序列。
  24. 一種載體，其包括如申請專利範圍第22項所述的多核苷酸及/或如申請專利範圍第23項所述的多核苷酸。
  25. 一種宿主細胞，其表現如申請專利範圍第24項所述的載體。
  26. 一種產生抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段的方法，其包括使如申請專利範圍第25項所述的宿主細胞在允許所述抗體或片段產生的條件下生長，且回收如此產生之抗體或片段。
  27. 如申請專利範圍第26項所述的方法，其進一步包括將所述抗體或其抗原結合片段調配為包括可接受之載劑的醫藥組合物。
  28. 一種抑制個體中之腫瘤或腫瘤細胞之生長的方法，其包括向有需要之個體投與治療有效量之如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  29. 如申請專利範圍第28項所述的方法，其中所述腫瘤為原發性或再發性腫瘤。
  30. 如申請專利範圍第28項所述的方法，其中所述腫瘤為已建立的腫瘤。
  31. 如申請專利範圍第28項至第30項中任一項所述的方法，其中所述腫瘤存在於具有選自由以下組成之群之疾病或病症的個體中：血癌、腦癌、 腎細胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肝細胞癌、骨癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、結腸直腸癌、間皮瘤、B細胞淋巴瘤及黑色素瘤。
  32. 如申請專利範圍第28項至第31項中任一項所述的方法，其中所述抗體或其抗原結合片段以初始劑量、繼之以一或多個第二劑量的方式投與，其中各第二劑量係在前一劑量之後1週至12週投與。
  33. 如申請專利範圍第28項至第32項中任一項所述的方法，其中所述抗體或抗原結合片段係以約25mg至600mg之劑量投與。
  34. 如申請專利範圍第28項至第33項中任一項所述的方法，其中所述抗體或其抗原結合片段與第二治療劑組合向所述個體投與。
  35. 如申請專利範圍第34項所述的方法，其中所述第二治療劑係選自由以下組成之群：PD-1抑制劑、針對腫瘤特異性抗原之抗體、針對病毒感染細胞抗原之抗體、PD-L1抑制劑、CD20抑制劑、針對CD20及CD3之雙特異性抗體、諸如抗氧化劑之膳食補充劑、VEGF拮抗劑、化學治療劑、細胞毒性劑、放射線、NSAID、皮質類固醇及任何其他適用於改善至少一種與所述疾病或病症相關之症狀的療法。
  36. 如申請專利範圍第35項所述的方法，其中所述第二治療劑為PD-1抑制劑。
  37. 如申請專利範圍第36項所述的方法，其中所述PD-1抑制劑為測米匹單抗(cemiplimab)、納武單抗(nivolumab)或派姆單抗(pembrolizumab)。
  38. 如申請專利範圍第37項所述的方法，其中所述PD-1抑制劑以每公斤所述個體之體重1mg、3mg或10mg之劑量投與。
  39. 如申請專利範圍第37項所述的方法，其中所述PD-1抑制劑以50mg至1200mg之劑量投與。
  40. 如申請專利範圍第28項至第39項中任一項所述的方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係皮下、靜脈內、皮內、腹膜內、經口、肌肉內或顱內投與。
  41. 一種治療有需要之個體之非小細胞肺癌的方法，其包括向所述個體投與：(a)抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段，其包括；包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的HCVR之CDR及包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的LCVR之CDR；及(b)抗PD-1抗體或其抗原結合片段。
  42. 如申請專利範圍第41項所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗體包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3域，其分別由SEQ ID NO：196-198-200-204-206-208組成。
  43. 如申請專利範圍第42項所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗體包括：包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的HCVR及包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的LCVR。
  44. 如申請專利範圍第41項至第43項中任一項所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗體包括人類IgG1重鏈恆定區。
  45. 如申請專利範圍第41項至第44項中任一項所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段包括：包括SEQ ID NO：509之胺基酸序列的重鏈；及包括SEQ ID NO：510之胺基酸序列的輕鏈。
  46. 如申請專利範圍第41項至第45項中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體為測米匹單抗。
  47. 如申請專利範圍第41項至第46項中任一項所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段以25mg至600mg之劑量投與。
  48. 如申請專利範圍第41項至第47項中任一項所述的方法，其中所述抗PD-1抗體以50mg至1200mg之劑量投與。
  49. 如申請專利範圍第41項至第48項中任一項所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗體或其抗原結合片段以初始劑量、繼之以一或多個第二劑量的方式投與，其中各第二劑量係在前一劑量之後1週至12週投與。
  50. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項所述的抗體或其片段或如申請專利範圍第21項所述的醫藥組合物，其用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)，其中所述抗體、所述抗原結合片段或所述醫藥組合物與抗PD-1抗體組合使用。
  51. 如申請專利範圍第50項所述的抗體或其片段或醫藥組合物，其中所述抗CTLA-4抗體包括：包括SEQ ID NO：194之胺基酸序列的HCVR之CDR及包括SEQ ID NO：202之胺基酸序列的LCVR之CDR。
  52. 如申請專利範圍第50項或第51項所述的抗體或其片段或醫藥組合物，其中所述抗PD-1抗體為測米匹單抗。
  53. 如申請專利範圍第50項至第52項中任一項所述的抗體或其片段或醫藥組合物，其中所述NSCLC為晚期或轉移性NSCLC。
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