CN111133004B - 抗ctla-4抗体和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA‑4)结合的抗体和使用方法。在本发明的各种实施例中，所述抗体是与CTLA‑4特异性结合的完全人类抗体。在一些实施例中，本发明抗体适用于抑制或中和CTLA‑4活性，从而提供一种活化T细胞和/或治疗例如癌症或病毒感染的疾病或病症的手段。

Description

抗CTLA-4抗体和其用途
序列表的引用
本申请以引用方式并有序列表，所述序列表以在2018年6月29日创建并且含有178,018个字节的文件10360WO01-Sequence.txt以计算机可读形式提交。
技术领域
本发明涉及与免疫调节受体细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)特异性结合的抗体和抗体的抗原结合片段，和使用那些抗体的治疗和诊断方法。
背景技术
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4；也称为CD152)是在常规调节性T细胞上表达的I型跨膜T细胞抑制性检查点受体。CTLA-4通过在与刺激受体CD28竞争与其天然配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)结合的过程中取胜而负调节T细胞活化。初始T细胞活化是通过刺激T细胞受体(T-cell receptor，TCR)来实现，所述T细胞受体识别抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)上由I类或II类主要组织相容性复合体(MHCI或MHCII)蛋白质呈递的特异性肽(Goldrath等人1999,《自然(Nature)》402:255-262)。经活化TCR继而引发信号传导事件的级联，其可以通过经转染报导基因的表达来进行监测，由调节各种转录因子的表达的启动子驱动，所述转录因子例如活化蛋白1(activator-protein 1，AP-1)、活化T细胞核因子(Nuclear Factor of Activated T-cells，NFAT)或核因子活化B细胞κ轻链增强子(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NFκB)。随后经由在T细胞上组成性或诱导性表达的共刺激或共抑制受体的参与来进一步改进T细胞反应，所述受体例如CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(Programmed Cell Death Protein 1，PD-1)、淋巴细胞活化基因3(Lymphocyte-Activation Gene 3，LAG-3)或其它分子(Sharpe等人2002,《自然免疫学综述(Nat.Rev.Immunol.)》2:116-126)。
辅受体CD28和CTLA-4竞争相同配体：在抗原呈递细胞(APC)上表达的CD80和CD86。CTLA-4对CD80和CD86的结合亲和力高于对CD28的结合亲和力，充当诱饵并且通过与配体隔离，引起T细胞活化减弱来抑制CD28活化(Alegre等人2001,《自然免疫学综述》1:220-228；Walker等人2011,《自然免疫学综述》11:852-863；和Buchbinder等人,2016,《美国临床肿瘤学杂志(American Journal of Clinical Oncology)》,39:98-106)。
发明内容
本发明提供结合CTLA-4的抗体和其抗原结合片段。本发明抗体尤其适用于靶向表达CTLA-4的免疫细胞并调节CTLA-4活性。在某些实施例中，本发明抗体适用于抑制或中和CTLA-4活性且/或刺激T细胞活化，例如在T细胞介导的杀伤是有利的或期望的情况下。在某些实施例中，抗体适用于抑制调节T细胞功能且/或再活化耗竭性T细胞。本发明的抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分可以作为多特异性抗原结合分子的一部分而包括在内，例如用以调节免疫反应且/或使抗体靶向特定细胞类型，例如肿瘤细胞或感染细胞。抗体适用于治疗例如癌症和病毒感染的疾病或病症。
本发明抗体可以是全长抗体(例如IgG1或IgG4抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如Fab、F(ab′)2或scFv片段)，并且可以经修饰以影响功能性，例如用以消除残留效应功能(Reddy等人,2000,《免疫学杂志(J.Immunol.)》164:1925-1933)。在某些实施例中，抗体可以是双特异性的。
在第一方面中，本发明提供与CTLA-4特异性结合的经分离重组单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体是完全人类抗体。
本发明的示范性抗CTLA-4抗体列于本文中的表1和表2中。表1阐述示范性抗CTLA-4抗体的重链可变区(heavy chain variable region，HCVR)、轻链可变区(light chainvariable region，LCVR)、重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2阐述示范性抗CTLA-4抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识符。
本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR，所述HCVR包含选自表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述氨基酸序列对包含表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者和与其配对的表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含表1中所列出的示范性抗CTLA-4抗体中的任一者内所含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施例中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482和490/498。在某些实施例中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自SEQ ID NO:194/202(例如H1H19303P)或290/298(例如H1H19319P2)中的一者。在某些实施例中，本发明提供抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含表1中所列出的具有至多十个氨基酸取代的氨基酸序列，并且所述LCVR包含表1中所列出的具有至多十个氨基酸取代的氨基酸序列。举例来说，本发明提供抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含具有至多十个氨基酸取代的SEQ ID NO:194的氨基酸序列，并且所述LCVR包含具有至多十个氨基酸取代的SEQ ID NO:202的氨基酸序列。在另一个示范性实施例中，本发明提供抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含具有至少一个氨基酸取代的SEQ ID NO:194的氨基酸序列，并且所述LCVR包含具有至少一个氨基酸取代的SEQ ID NO:202的氨基酸序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR1(HCDR1)，所述重链CDR1包含选自表1中所列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR2(HCDR2)，所述重链CDR2包含选自表1中所列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR3(HCDR3)，所述重链CDR3包含选自表1中所列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR1(LCDR1)，所述轻链CDR1包含选自表1中所列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR2(LCDR2)，所述轻链CDR2包含选自表1中所列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR3(LCDR3)，所述轻链CDR3包含选自表1中所列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述氨基酸序列对包含表1中所列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者和与其配对的表1中所列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施例，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含表1中所列出的示范性抗CTLA-4抗体中的任一者内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施例中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由SEQ IDNO:200/208(例如H1H19303P)和SEQ ID NO:296/304(例如H1H19319P2)组成的组。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含：HCDR1，其包含与表1中所列出的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列；HCDR2，其包含与表1中所列出的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列；和HCDR3，其包含与表1中所列出的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列。在某些实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述LCVR包含：LCDR1，其包含与表1中所列出的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列；LCDR2，其包含与表1中所列出的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列；和LCDR3，其包含与表1中所列出的氨基酸序列相差1个氨基酸的氨基酸序列。举例来说，本发明提供抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述HCVR包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列或与SEQ ID NO:196相差1个氨基酸的氨基酸序列；HCDR2，其包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列或与SEQ ID NO:198相差1个氨基酸的氨基酸序列；和HCDR3，其包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列或与SEQ ID NO:200相差1个氨基酸的氨基酸序列。在另一个示范性实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR，所述LCVR包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列或与SEQ ID NO:204相差1个氨基酸的氨基酸序列；LCDR2，其包含SEQ ID NO:206的氨基酸序列或与SEQ ID NO:206相差1个氨基酸的氨基酸序列；和LCDR3，其包含SEQ ID NO:208的氨基酸序列或与SEQID NO:208相差1个氨基酸的氨基酸序列。
本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其包含表1中所列出的示范性抗CTLA-4抗体中的任一者内所含的一组六个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施例中，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组选自由SEQ ID NO:196-198-200-204-206-208(例如H1H19303P)和SEQ ID NO:292-294-296-300-302-304(例如H1H19319P2)组成的组。
在相关实施例中，本发明提供抗体或其抗原结合片段，其包含如由表1中所列出的示范性抗CTLA-4抗体中的任一者所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的一组六个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。举例来说，本发明包含抗体或其抗原结合片段，其包含选自由SEQ ID NO:194/202(例如H1H19303P)和SEQ ID NO:290/298(例如H1H19319P2)组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组。鉴别HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是所属领域中所熟知的并且可以用以鉴别本文所公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴别CDR的边界的示范性惯例包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般来说，Kabat定义是基于序列变异性，Chothia定义是基于结构环区域的位置，并且AbM定义是Kabat与Chothia方法之间的折中方案。参见例如Kabat,《免疫学感兴趣的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health),Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》273:927-948(1997)；和Martin等人,《美国国家科学院院刊Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》86:9268-9272(1989)。公共数据库还可以用于鉴别抗体内的CDR序列。
本发明包括具有经修饰糖基化模式的抗CTLA-4抗体。在一些实施例中，用以去除不合需要的糖基化位点的修饰是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分的抗体，例如用以增加抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖基化修饰以便修饰补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。
本发明包括包含Fc结构域的抗CTLA-4抗体，其中Fc结构域包含如本文其它地方所述的IgG1或IgG4同型。
本发明还提供与包含HCVR的CDR和LCVR的CDR的抗体或其抗原结合片段竞争与CTLA-4特异性结合的抗体和其抗原结合片段，其中HCVR和LCVR各自具有选自表1中所列出的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。
本发明还提供阻断CTLA-4与其天然配体(B7-1/CD80和B7-2/CD86)结合的经分离抗体和其抗原结合片段。在一些实施例中，阻断CTLA-4结合的抗体或其抗原结合片段可以与CTLA-4上与B7-1/CD80和/或B7-2/CD86相同的抗原决定基结合或可以与CTLA-4上与B7-1/CD80和/或B7-2/CD86不同的抗原决定基结合。
本发明还提供与来自人类或其它物种的CTLA-4特异性结合的抗体和其抗原结合片段。在某些实施例中，抗体可以与人类CTLA-4和/或猴CTLA-4结合。
本发明还提供与包含HCVR的CDR和LCVR的CDR的参考抗体或其抗原结合片段交叉竞争与CTLA-4结合的抗体和其抗原结合片段，其中HCVR和LCVR各自具有选自表1中所列出的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。
本发明还提供与包含HCVR的CDR和LCVR的CDR的参考抗体或其抗原结合片段结合到同一个抗原决定基的抗体和其抗原结合片段，其中HCVR和LCVR各自具有选自表1中所列出的HCVR和LCVR序列的氨基酸序列。在某些实施例中，本发明提供与包含HCVR的CDR和LCVR的CDR的参考抗体或其抗原结合片段结合到同一个抗原决定基的抗体和其抗原结合片段，其中HCVR/LCVR氨基酸序列对具有SEQ ID NO:194/202。
本发明还包括与人类CTLA-4的胞外结构域内所含的一个或多个氨基酸相互作用的抗CTLA-4抗体。
在一个实施例中，本发明提供具有以下特征中的一者或多者的重组人类单克隆抗体或抗原结合片段：(a)与人类CTLA-4和/或食蟹猕猴CTLA-4特异性结合；(b)阻断CTLA-4与CD80和/或CD86的结合；(c)阻断CTLA-4诱导的T细胞下调并且拯救T细胞信号传导；和(d)抑止肿瘤生长并且延长患有癌症的个体的存活期。
在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段可以以促效剂方式与CTLA-4特异性结合，即其可以增强或刺激CTLA-4结合和/或活性；在其它实施例中，抗体可以以拮抗剂方式与CTLA-4特异性结合，即其可以阻断CTLA-4与其配体结合。
在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段是双特异性的，其包含与CTLA-4的第一结合特异性和对第二靶抗原决定基的第二结合特异性。第二靶抗原决定基可以是CTLA-4上或不同蛋白质上的另一抗原决定基。在某些实施例中，第二靶抗原决定基可以处于不同细胞上，所述细胞包含不同T细胞、B细胞、肿瘤细胞或病毒感染细胞。
在第二方面中，本发明提供编码抗CTLA-4抗体或其部分的核酸分子。举例来说，本发明提供编码表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码表1中所列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的HCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码表1中所列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的HCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码表1中所列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的HCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码表1中所列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的LCDR1核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码表1中所列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的LCDR2核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码表1中所列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的LCDR3核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。
本发明还提供编码HCVR的核酸分子，其中HCVR包含一组三个CDR(即HCDR1-HCDR2-HCDR3)，其中HCDR1-HCDR2-HCDR3氨基酸序列组如由表1中所列出的示范性抗CTLA-4抗体中的任一者所定义。
本发明还提供编码LCVR的核酸分子，其中LCVR包含一组三个CDR(即LCDR1-LCDR2-LCDR3)，其中LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列组如由表1中所列出的示范性抗CTLA-4抗体中的任一者所定义。
本发明还提供编码HCVR和LCVR两者的核酸分子，其中HCVR包含表1中所列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，并且其中LCVR包含表1中所列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列。在某些实施例中，核酸分子包含选自表2中所列出的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列，和选自表2中所列出的LCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列。在根据本发明的这个方面的某些实施例中，核酸分子编码HCVR和LCVR，其中HCVR和LCVR均来源于表1中所列出的同一个抗CTLA-4抗体。
在一个相关方面中，本发明提供重组表达载体，其能够表达包含抗CTLA-4抗体的重链或轻链可变区的多肽。举例来说，本发明包括重组表达载体，其包含以上所提及的核酸分子中的任一者，即编码如表1中所阐述的HCVR、LCVR和/或CDR序列中的任一者的核酸分子。本发明还提供重组表达载体，其能够表达包含抗CTLA-4抗体的重链或轻链的多肽。举例来说，本发明包括重组表达载体，其包含以上所提及的核酸分子中的任一者，即编码如表1中所阐述的重链或轻链序列中的任一者的核酸分子。在本发明的范围内还包括其中引入所述载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并回收如此产生的抗体和抗体片段来产生抗体或其部分的方法。
在第三方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含特异性结合CTLA-4的重组人类抗体或其片段和药学上可接受的载剂。在一个相关方面中，本发明的特征在于一种组合物，其是抗CTLA-4抗体与第二治疗剂的组合。在一个实施例中，第二治疗剂是任何宜与抗CTLA-4抗体组合的药剂。宜与抗CTLA-4抗体组合的示范性药剂包括但不限于其它结合且/或调节CTLA-4信号传导的药剂(包括其它抗体或其抗原结合片段等)和/或不直接结合CTLA-4、但是仍然调节免疫细胞活化的药剂。涉及本发明的抗CTLA-4抗体的其它组合疗法和共配制物公开于本文其它地方中。
在第四方面中，本发明提供用以调节个体中的免疫反应的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，本发明提供用以增强个体中的免疫反应的方法，所述方法包含向个体施用有效量的本发明的结合CTLA-4的抗体或其片段。在一个实施例中，本发明提供一种用以刺激或增强个体中的T细胞活化的方法。在某些实施例中，本发明提供用以拯救T细胞活性的方法，所述方法包含使T细胞与有效量的本发明抗体接触，使得T细胞活性得到拯救。在一个实施例中，本发明提供用以抑制个体中的调节性T(Treg)细胞的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，有需要的个体可能罹患例如癌症或病毒感染的疾病或病症。在某些实施例中，本发明提供用以拯救CTLA-4介导的T细胞活性抑制的方法，所述方法包含使T细胞与有效量的本发明抗体接触。
在第五方面中，本发明提供使用本发明的抗CTLA-4抗体或抗体的抗原结合部分来治疗个体的例如癌症或病毒感染的疾病或病症的治疗方法，其中治疗方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的包含本发明的抗体或抗体片段的药物组合物。所治疗的病症是通过刺激或抑制CTLA-4活性或信号传导而得到改善、缓解、抑制或预防的任何疾病或病况。在某些实施例中，向有需要之的个体施用本发明的抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂的组合。第二治疗剂可以选自由以下组成的组：针对另一个T细胞共抑制因子的抗体、针对肿瘤细胞抗原的抗体、针对T细胞受体的抗体、针对病毒感染细胞上的抗原决定基的抗体、细胞毒性剂、抗癌药、抗病毒药、消炎药(例如皮质类固醇)、化学治疗剂、放射线疗法、手术、免疫抑制剂和所属领域中已知的任何其它药物或疗法。在某些实施例中，如果可能出现与本发明的抗体或其抗原结合片段相关的副作用，那么第二治疗剂可以是有助于抵消或减轻任何可能性所述副作用的药剂。
在某些实施例中，本发明提供抑止肿瘤生长的方法。举例来说，本发明提供用于抑止个体中因原发性肿瘤或转移性肿瘤而导致的肿瘤生长。在某些实施例中，本发明提供用于延长患有癌症的个体的存活期(例如无发展存活期或总存活期)的方法。癌症的实例包括但不限于原发性癌症和/或复发性癌症，包括血癌(例如血液科恶性疾病，例如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病)、脑癌(例如多形性胶质母细胞瘤)、肺癌(例如非小细胞肺癌，包括晚期或转移性NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、肾细胞癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、骨癌、结肠直肠癌、肾癌、食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、子宫颈癌、肠癌、前列腺癌和结肠癌。在某些实施例中，本发明提供用于抑制或抑止已建立的肿瘤的生长的方法。所述方法包含向有需要的个体施用包含治疗有效量的本发明的抗CTLA-4抗体的药物组合物。在某些实施例中，抗体与选自由以下组成的组的第二治疗剂组合施用：程序性死亡-1(PD-1)抑制剂(例如抗PD-1抗体，例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)或REGN2810)、程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂(例如抗PD-L1抗体，例如阿特珠单抗(atezolizumab)、阿瓦鲁单抗(avalumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab))、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)拮抗剂(例如阿柏西普(aflibercept)、贝伐单抗(bevacizumab))、血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang2)抑制剂(例如抗Ang2抗体，例如内斯瓦库单抗(nesvacumab))、淋巴细胞活化基因3(LAG3)抑制剂、CD20×CD3双特异性抗体(例如REGN1979)、细胞毒素、化学治疗剂、癌症疫苗、手术和放射线疗法。可以与本发明的抗CTLA-4抗体组合使用以供治疗癌症使用的额外疗法/治疗剂的额外实例描述于本文其它地方中。
抗体或其片段可以皮下、静脉内、皮内、腹膜内、经口、肌肉内或颅内施用。在某些实施例中，将抗体或其片段局部施用到肿瘤中(瘤周(peritumorally)或瘤内(intra-tumorally))。抗体或其片段可以以每千克个体体重约0.1mg到每千克体重约100mg的剂量施用。在某些实施例中，抗体以约50mg到约1000mg的量向有需要的个体施用。在一些实施例中，抗体以约25mg到约600mg的剂量施用。在一些实施例中，抗体以约50mg到约1200mg的剂量施用。
本发明还包括本发明的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造用以治疗例如癌症的将得益于CTLA-4结合和/或信号传导的阻断的疾病或病症的药物。
本发明进一步包括抗体和抗原结合片段或包含其的药物组合物的用途，其用于(i)制造用以治疗可以通过拮抗CTLA-4来治疗的疾病或病症(例如癌症)的药物，和/或(ii)治疗可以通过拮抗CTLA-4来治疗的疾病或病症(例如癌症)。
在另一个方面中，本发明提供一种治疗有需要的个体的非小细胞肺癌(包括晚期或转移性NSCLC)的方法，所述方法包含向个体施用抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体。在一些情况下，抗CTLA-4抗体包含：包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HCVR的CDR和包含SEQ IDNO:202的氨基酸序列的LCVR的CDR。在一些情况下，抗CTLA-4抗体包含HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别选自由SEQ ID NO:196-198-200-204-206-208组成的组。在一些情况下，抗CTLA-4抗体包含：包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HCVR和包含SEQID NO:202的氨基酸序列的LCVR。在一些情况下，抗CTLA-4抗体包含人类IgG1重链恒定区。在一些实施例中，抗PD-1抗体是测米匹单抗(cemiplimab)。本发明还包括所述抗体的用途，其用于制造用以治疗癌症(例如非小细胞肺癌，包括晚期或转移性NSCLC)的药物。
其它实施例将从回顾后续实施方式变得显而易见。
附图说明
图1显示实例7中的研究(A)中所述的实验的各治疗组在多个肿瘤植入后时间点的平均肿瘤体积(mm3+/-SEM)。CTLA-4hum/hum基因敲入(knock-in)小鼠在第0天皮下植入MC38.Ova细胞(106个细胞/只小鼠)并且分成四个治疗组(9只小鼠/组)。在第3天、第7天、第10天、第14天和第17天，向小鼠腹膜内(intraperitoneally，IP)施用10mg/kg三种主要抗人类CTLA-4抗体(H1H19273P或H1H19303P或H1H19319)中的任一者或10mg/kg hIgG1同型对照。通过每周进行两次卡尺测量持续37天来监测肿瘤体积。治疗日由箭头指出。
图2显示在实例7中的研究(A)中所述的实验第24天的单独肿瘤体积。当所有组中的所有动物皆存活时，第24天是研究中的最后一个时间点。统计显著性是通过单因素方差分析(one-way ANOVA)与邓尼特多重比较事后检定(Dunnett′s multiple comparisonspost-test)来确定(****p<0.0001)。
图3显示实例7中的研究(A)中所述的实验的卡本-麦尔存活曲线(Kaplan-Meiersurvival curve)。
图4显示实例7中的研究(B)中所述的实验的各治疗组在多个肿瘤植入后时间点的平均肿瘤体积(mm3+/-SEM)。在第3天、第6天、第9天、第13天和第16天，向CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠腹膜内施用抗CTLA-4抗体H1H19303P或hIgG1同型对照。通过每周进行两次卡尺测量持续37天来监测肿瘤体积。治疗日由箭头指出。
图5显示在实例7中的研究(B)中所述的实验的第20天的单独肿瘤体积。统计显著性是通过单因素方差分析与邓尼特多重比较事后检定(****p<0.0001)来确定。
图6显示实例7中的研究(B)中所述的实验的卡本-麦尔存活曲线。
图7显示如实例7中的研究(B)中所述的血清中的总H1H19303P和hIgG1同型对照抗体的浓度。
图8显示如实例7中的研究(B)中所述的针对H1H19303P的小鼠抗人类抗体(anti-human antibody，MAHA)(■)或同型对照(●)的浓度。
图9显示实例8中所述的实验的各治疗组在多个肿瘤植入后时间点的平均肿瘤体积(mm3+/-SEM)。治疗日由箭头指出。
图10显示如实例8中所述的开始治疗后第10天的单独肿瘤体积。
图11显示实例8中所述的实验的卡本-麦尔存活曲线。
图12和13显示H1H19303P(也称为REGN4659)延缓已建立的肿瘤在CTLA-4hum/hum小鼠中的生长。将MC38.Ova细胞(5×105个细胞/只小鼠)皮下移植到小鼠侧腹中，在第10天当肿瘤体积达到100mm3时，将小鼠随机分成治疗组，并且在第10天、第13天、第17天施用REGN4659(25mg/kg、10mg/kg，n＝10)或同型对照抗体(25mg/kg，n＝10)并且监测肿瘤体积直到第27天为止。图12显示各治疗组的平均肿瘤生长曲线。图13显示如在研究中的所有动物皆存活时在最后一个时间点第21天所测量的各治疗组的单独肿瘤体积。
图14显示经hIgG1对照抗体治疗的携带肿瘤的CTLA-4hum/hum小鼠中的瘤内和脾Treg和T效应细胞上的总(表面和胞内)人类CTLA-4表达的平均荧光强度(meanfluorescent intensity，MFI)。脾CD8+和CD4+效应细胞上的CTLA-4的表达不能与同型对照染色(MFI＝0)区分开来并且未示出。
具体实施方式
在描述本发明方法之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可能变化。还应该理解，本文中所用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并不打算具有限制性，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术和科学术语皆具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文中所提及的所有公开均以全文引用的方式并入本文中。
术语“CTLA-4”是指细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，一种免疫检查点受体或T细胞共抑制因子，也称为CD152。全长人类CTLA-4的氨基酸序列以SEQID NO:505(寄存编号NP_005205.2)形式提供。术语“CTLA-4”包括重组CTLA-4或其片段。所述术语还涵盖例如与组氨酸标签、小鼠或人类Fc、信号序列或CD300a(aa 181-299；寄存编号NP_009192.2)的跨膜结构域和细胞质结构域偶合的CTLA-4或其片段。举例来说，所述术语包括实例中所论述的序列，例如包含全长CTLA-4的C端的myc-myc-聚组氨酸标签或包含全长CTLA-4的C端的小鼠Fc(mIgG2a)。除非明确说明来自非人类物种，否则术语“CTLA-4”意思指人类CTLA-4。
CTLA-4是免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族的成员和CD28的同源物，但对配体CD80和CD86具有较大的结合亲和力。CTLA-4是在活化T细胞和调节性T细胞上表达的223个氨基酸的I型跨膜蛋白，其含有V结构域、跨膜结构域和细胞质尾区。CTLA-4受体与存在于抗原呈递细胞(APC)上的B7-1/CD80和B7-2/CD86配体结合。
如本文所用的术语“T细胞共抑制因子”是指经由T细胞活化或抑止来调节免疫反应的配体和/或受体。术语“T细胞共抑制因子”也称为T细胞共信号传导分子，包括但不限于程序性死亡-1(PD-1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、B和T淋巴细胞弱化因子(B and Tlymphocyte attenuator，BTLA)、CD-28、2B4、LY108、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白3(T cellimmunoglobulin and mucin 3，TIM3)、T细胞免疫受体与免疫球蛋白和ITIM(TIGIT；也称为VSIG9)、白血球相关免疫球蛋白样受体1(leucocyte associated immunoglobulin-likereceptor 1，LAIR1；也称为CD305)、诱导性T细胞共刺激因子(inducible T cellcostimulator，ICOS；也称为CD278)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(V-domain Igsuppressor of T cell activation，VISTA)和CD160。
如本文所用的术语“抗体”打算指由四个多肽链，即通过双硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链构成的免疫球蛋白分子(即“完整抗体分子”)，以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。各重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(由结构域CH1、CH2和CH3构成)构成。各轻链由轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)构成。VH区和VL区可以进一步再分为高变区，高变区称为互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)，其中穿插有称为构架区(framework region，FR)的较保守区。各VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的某些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人类胚原序列相同，或可以经天然或人工修饰。氨基酸共有序列可以基于两个或更多个CDR的并列分析(side-by-side analysis)来定义。
一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的略去也是可能的。抗体在科学文献中已有描述，其中为了结合，可以分配一个或两个CDR。Padlan等人(1995FASEB J.9:133-139)基于所公开的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区，并且得出结论：CDR残基中仅约五分之一到三分之一真正接触抗原。Padlan还发现一个或两个CDR不含与抗原接触的氨基酸的多个抗体(另外参见Vajdos等人2002《分子生物学杂志》320:415-428)。
不接触抗原的CDR残基可以基于先前研究(例如常常不需要CDRH2中的残基H60-H65)从位于Chothia CDR之外的Kabat CDR的区域通过分子模型化且/或凭经验来鉴别。如果略去某个CDR或其残基，那么其通常被占据另一个人类抗体序列或所述序列的共有序列中的对应位置的氨基酸取代。CDR内的取代位置和待取代的氨基酸也可以凭经验选择。经验取代可以是保守取代或非保守取代。
相比于相应胚原序列，本文所公开的完全人类抗CTLA-4单克隆抗体可以在重链和轻链可变结构域的构架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或删除。所述突变可以容易地通过比较本文所公开的氨基酸序列与可以从例如公共抗体序列数据库获得的胚原序列来确定。本发明包括来源于本文所公开的氨基酸序列中的任一者的抗体和其抗原结合片段，其中一个或多个构架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生出抗体的胚原序列的相应残基，或突变为另一个人类胚原序列的相应残基，或突变为相应胚原残基的保守性氨基酸取代(所述序列改变在本文中统称为“胚原突变”)。所属领域的普通技术人员以本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地生产许多包含一个或多个单独胚原突变或其组合的抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，VH结构域和/或VL结构域内的所有构架残基和/或CDR残基全部突变回为衍生出抗体的初始胚原序列中所发现的残基。在其它实施例中，仅某些残基突变回为初始胚原序列，例如仅FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸内所发现的突变型残基，或仅CDR1、CDR2或CDR3内所发现的突变型残基。在其它实施例中，构架残基和/或CDR残基中的一者或多者突变为不同胚原序列(即不同于最初衍生出抗体的胚原序列的胚原序列)的相应残基。此外，本发明抗体可以在构架区和/或CDR区内含有两个或更多个胚原突变的任何组合，例如其中某些单独残基突变为特定胚原序列的对应残基，而不同于初始胚原序列的某些其它残基维持不变或突变为不同胚原序列的对应残基。一旦获得，即可以针对一种或多种所期望的性质容易地测试含有一个或多个胚原突变的抗体和抗原结合片段，所述性质例如改进的结合特异性、提高的结合亲和力、改进或增强的拮抗或促效生物性质(取决于具体情况)、降低的免疫原性等。本发明内涵盖以这种一般方式获得的抗体和抗原结合片段。
本发明还包括完全人类抗CTLA-4单克隆抗体，其包含本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的具有一个或多个保守取代的变异体。举例来说，本发明包括抗CTLA-4抗体，其具有相对于本文所公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者而言含有例如10个或更少个、8个或更少个、6个或更少个、4个或更少个等保守性氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
如本文所用的术语“人类抗体”和“完全人类抗体”打算包括具有来源于人类胚原免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类mAb可以例如在CDR中并且尤其在CDR3中包括不是由人类胚原免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过活体外随机或位点特异性突变诱发或通过活体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人类抗体”和“完全人类抗体”不打算包括其中来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的胚原的CDR序列接枝到人类FR序列上的mAb。所述术语包括在非人类哺乳动物中或在非人类哺乳动物的细胞中以重组方式产生的抗体。所述术语不打算包括与人类个体分离或产生于人类个体中的抗体。
如本文所用的术语“重组”是指通过所属领域中作为重组DNA技术已知的技术或方法产生、表达、分离或获得的本发明的抗体或其抗原结合片段，所述重组DNA技术包括例如DNA剪接和转基因表达。所述术语是指在非人类哺乳动物(包括转基因非人类哺乳动物，例如转基因小鼠)或细胞(例如CHO细胞)表达系统中表达或从重组组合人类抗体库分离的抗体。
如本文所用的术语“多特异性抗原结合分子”是指双特异性、三特异性或多特异性抗原结合分子和其抗原结合片段。多特异性抗原结合分子可以对一个靶多肽的不同抗原决定基具有特异性或可以含有对超过一个靶多肽的抗原决定基具有特异性的抗原结合结构域。多特异性抗原结合分子可以是单一多功能多肽，或其可以是两个或更多个彼此共价或非共价缔合的多肽的多聚复合物。术语“多特异性抗原结合分子”包括可以与另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质连接或共表达的本发明抗体。举例来说，抗体或其片段可以在功能上连接(例如通过化学偶合、基因融合(genetic fusion)、非共价缔合或其它方式)到一个或多个其它分子实体，例如蛋白质或其片段，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗原结合分子。根据本发明，术语“多特异性抗原结合分子”还包括双特异性、三特异性或多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，本发明抗体在功能上连结到另一个抗体或其抗原结合片段以产生具有第二结合特异性的双特异性抗体。本发明的双特异性和多特异性抗体描述于本文其它地方中。
术语“特异性结合”或“与……特异性结合”或类似术语意思指抗体或其抗原结合片段与抗原形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征可以在于至少约1×10-8M或更小(例如，较小的KD表示较紧密的结合)的平衡解离常数。确定两个分子是否特异性结合的方法是所属领域中熟知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等等。如本文所述，已经通过表面等离子体共振，例如BIACORETM来鉴别与CTLA-4特异性结合的抗体。此外，与CTLA-4中的一个结构域和一个或多个额外抗原结合的多特异性抗体或与CTLA-4的两个不同区域结合的双特异性抗体仍然视为如本文所用的“特异性结合”抗体。
术语“高亲和力”抗体是指如通过表面等离子体共振，例如BIACORETM或溶液亲和力ELISA所测量，对CTLA-4具有至少10-8M、优选10-9M、更优选10-10M、甚至更优选10-11M、甚至更优选10-12M的结合亲和力的那些mAb，结合亲和力用KD表示。
术语“减慢速率”、“Koff”或“kd”意思指如通过表面等离子体共振、例如BIACORETM所测定，抗体以1×10-3s-1或更小、优选1×10-4s-1或更小的速率常数与CTLA-4解离。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、以酶方式可获得的、合成的或经基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保留与CTLA-4结合的能力的抗体的一个或多个片段。
在特定实施例中，本发明的抗体或抗体片段可以结合到例如配体或治疗部分(“免疫结合物”)的部分，例如细胞毒素、第二抗CTLA-4抗体、针对肿瘤特异性抗原的抗体、抗癌药或任何其它适用于治疗包括癌症或病毒感染、包括慢性病毒感染的疾病或病况的治疗部分。
如本文所用的“经分离抗体”打算指实质上不含其它具有不同抗原特异性的抗体(Ab)的抗体(例如，特异性结合CTLA-4的经分离抗体或其片段实质上不含特异性结合除CTLA-4以外的抗原的Ab)。
如本文所用的“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和CTLA-4活性的抗体”或“拮抗剂抗体”)打算指与CTLA-4的结合引起CTLA-4的至少一种生物活性的抑制的抗体。举例来说，本发明抗体可以防止或阻断CTLA-4与CD80和/或CD86结合。
如本文所用的“活化抗体”或“增强性抗体”(或“促效剂抗体”)打算指与CTLA-4的结合引起增加或刺激CTLA-4的至少一种生物活性的抗体。举例来说，本发明抗体可以通过以符合配体结合(例如CD80或CD86)的方式与CTLA-4结合来增加CTLA-4活性，引起CTLA-4细胞内信号传导。
如本文所用的术语“表面等离子体共振”是指能够通过例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡特维(Uppsala,Sweden andPiscataway,N.J.))在生物传感器矩阵内检测蛋白质浓度的变化而实现实时生物分子相互作用的分析的光学现象。
如本文所用的术语“KD”打算指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“抗原决定基”是指与抗体分子的可变区中称为互补位的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定子。单一抗原可以具有超过一个抗原决定基。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同生物作用。术语“抗原决定基”也指抗原上B细胞和/或T细胞所响应的位点。其也指抗原的由抗体结合的区域。抗原决定基可以定义是结构性或功能性的。功能性抗原决定基通常是结构性抗原决定基的子组并且具有直接有助于相互作用的亲和力的那些残基。抗原决定基也可以是由非线性氨基酸构成的构象抗原决定基。在某些实施例中，抗原决定基可以包括决定子，其是分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基；并且在某些实施例中，可以具有特定三维结构特征和/或荷质比特征。
如本文所用的术语“交叉竞争”意思指抗体或其抗原结合片段与抗原结合并且抑制或阻断另一抗体或其抗原结合片段的结合。所述术语还包括两个方向上的两个抗体之间的竞争，即，第一抗体结合并且阻断第二抗体的结合且反之亦然。在某些实施例中，第一抗体和第二抗体可以与同一个抗原决定基结合。或者，第一抗体和第二抗体可以与不同但重叠的抗原决定基结合，使得一个抗体的结合例如经由位阻抑制或阻断另一个抗体的结合。抗体之间的交叉竞争可以通过所属领域中已知的方法，例如通过实时、无标记生物层干涉分析来测量。两个抗体之间的交叉竞争可以表示为因为自身结合(self-self binding)而小于背景信号的第二抗体的结合(其中第一抗体和第二抗体是相同抗体)。2个抗体之间的交叉竞争可以例如表示为小于基线自身背景结合的第二抗体的结合％(其中第一抗体和第二抗体是相同抗体)。
术语“实质一致性”或“实质上一致”当指核酸或其片段时，表示当在适当核苷酸插入或删除下与另一核酸(或其互补链)最优对准时，如通过下文所论述的序列一致性的任何熟知算法所测量，在至少约90％、并且更优选至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基中存在核苷酸序列一致性。与参考核酸分子具有实质一致性的核酸分子在某些情况下可以编码具有与由参考核酸分子所编码的多肽相同或实质上相似的氨基酸序列的多肽。
序列一致性可以使用算法计算，例如针对全域对准(global alignment)的Needleman Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970,《分子生物学杂志》48:443-453)，或针对局域对准(local alignment)的Smith Waterman算法(Smith和Waterman 1981,《分子生物学杂志》147:195-197)。另一种优选算法由Dufresne等人2002年在《自然－生物技术(Nature Biotechnology)》(第20卷,第1269-71页)中描述并且在软件GenePAST(GQ LifeSciences,Inc.马萨诸塞州波士顿(Boston,MA))中使用。
如应用于多肽，术语“实质相似性”或“实质上相似”意思指两个肽序列在例如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认间隙权数最优对准时，共享至少90％序列一致性，甚至更优选至少95％、98％或99％序列一致性。优选地，不一致的残基位置的差异是保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被另一个具有有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基取代。一般来说，保守性氨基酸取代实质上不会改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此不同之处在于保守取代的情况下，可以上调相似性百分比或相似度以校正取代的保守性质。作出这种调整的手段为所属领域的技术人员所熟知。参见例如Pearson(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24:307-331，其以引用的方式并入本文中。具有有相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、白氨酸和异白氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天门冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天门冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-白氨酸-异白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天门冬氨酸和天门冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性置换是在以引用的方式并入本文中的Gonnet等人(1992)《科学(Science)》256:1443 45中所公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何改变。“适度保守”置换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
多肽的序列相似性通常使用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件使用分配于各种取代、删除和其它修饰，包括保守性氨基酸取代的相似性度量来匹配相似序列。举例来说，GCG软件含有例如GAP和BESTFIT的程序，所述程序可以在默认参数情况下用于测定密切相关的多肽(例如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间或野生型蛋白与其突变蛋白之间的序列同源性或序列一致性。参见例如6.1版GCG。多肽序列还可以使用FASTA在默认或推荐参数情况下进行比较；6.1版GCG中的程序。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查询序列与搜索序列之间的最优重叠区域的对准和序列一致性百分比(培生(Pearson)(2000)，见上文)。当比较本发明序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库时，另一种优选算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410和(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402，所述文献中的每一个以引用的方式并入本文中。
短语“治疗有效量”意思指施用后产生所期望的作用的量。精确的量将取决于治疗目的并且可以由所属领域的技术人员使用已知技术来确定(参见例如Lloyd(1999)《药物混配的艺术、科学和技术(The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)》)。
如本文所用的术语“个体”是指需要缓解、预防和/或治疗例如病毒感染或癌症的疾病或病症的动物，优选哺乳动物。所述术语包括患有癌症、转移性癌症或病毒感染或处于患有癌症、转移性癌症或病毒感染风险下的人类个体。
如本文所用的“抗癌药”意思指适用于治疗或缓解或抑制癌症的任何药剂，包括但不限于细胞毒素和例如以下的药剂：抗代谢物、烷基化剂、蒽环类药物(anthracyclines)、抗生素、抗有丝分裂剂、丙卡巴肼(procarbazine)、羟基脲、天门冬酰胺酶、皮质类固醇、环磷酰胺(cyclophosphamide)、米托坦(mytotane)(O,P′-(DDD))、生物制剂(例如抗体和干扰素)和放射性药剂。如本文所用的“细胞毒素或细胞毒性剂”也指化学治疗剂并且意思指对细胞有害的任何药剂。实例包括(太平洋紫杉醇(paclitaxel))、替莫唑胺(temozolamide)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根碱(emetine)、顺铂(cisplatin)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinbiastine)、秋水仙碱(coichicin)、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睪固酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)和其类似物或同源物。
如本文所用的术语“抗病毒药”是指用于治疗、预防或缓解宿主个体的病毒感染的任何药物或疗法。术语“抗病毒药”包括但不限于齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、利巴韦林(ribavirin)、洛匹那韦(lopinavir)、依法韦仑(efavirenz)、考比西他(cobicistat)、替诺福韦(tenofovir)、利匹韦林(rilpivirine)止痛剂和皮质类固醇。在本发明的上下文中，病毒感染包括由病毒造成的长期或慢性感染，病毒包括但不限于人类免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人类乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)和猿猴免疫缺乏病毒(simianimmunodeficiency virus，SIV)。
如本文所用的术语“用以增强免疫反应”是指增加例如T细胞或NK细胞的针对肿瘤细胞或病毒感染细胞的免疫细胞的活性。在本发明的上下文中，所述术语包括阻断T细胞活性的CTLA-4介导的抑制，或拯救或逆转T细胞的耗竭状态。其还包括调节性T细胞活性的抑制。如在本发明的上下文中所用的增强的免疫反应引起肿瘤细胞的杀伤增加和/或肿瘤生长抑制。
本发明的抗体和抗原结合片段与CTLA-4特异性结合并且增强T细胞活化。抗CTLA-4抗体可以高亲和力地或低亲和力地与CTLA-4结合。在某些实施例中，本发明抗体可以是阻断抗体，其中抗体可以与CTLA-4结合并且抑制CTLA-4信号传导。在一些实施例中，本发明抗体阻断CTLA-4与CD80和/或CD86的结合且/或刺激或增强T细胞活化。在一些实施例中，抗体与CTLA-4结合并且逆转耗竭性T细胞的无反应性状态(anergic state)。在某些实施例中，抗体与CTLA-4结合并且抑制调节性T细胞活性。在一些实施例中，抗体可以适用于刺激或增强免疫反应且/或治疗患有癌症或病毒感染的个体。当向有需要的个体施用时，抗体可以减少个体的例如HIV、LCMV或HBV的病毒的慢性感染。其可以用于在个体中抑制肿瘤细胞生长。其可以单独使用或作为辅助疗法与所属领域中已知的其它治疗部分或治疗方法一起使用，以用于治疗癌症或病毒感染。
在某些实施例中，抗CTLA-4抗体可以是多特异性抗原结合分子，其中其包含与CTLA-4的第一结合特异性和与选自由另一种T细胞共抑制因子和CTLA-4的不同抗原决定基组成的组的抗原的第二结合特异性。
可以使用包含以下中的任一者的免疫原来产生针对CTLA-4的抗体。在某些实施例中，本发明抗体是从经全长天然CTLA-4(参见NCBI寄存编号NP_005205.2)(SEQ ID NO:505)或经重组CTLA-4肽免疫的小鼠获得。或者，CTLA-4或其片段可以使用标准生化技术产生并且用作免疫原。
在某些实施例中，免疫原是CTLA-4的胞外结构域。在本发明的一个实施例中，免疫原是CTLA-4的胞外结构域的片段。
在一些实施例中，免疫原可以是在大肠杆菌(E.coli)中或在例如中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞的任何其它真核或哺乳动物细胞中表达的重组CTLA-4肽。
在某些实施例中，与CTLA-4特异性结合的抗体可以使用上述区域的片段或从本文所述的区域的N端或C端中的任一端或两端延伸超出指定区域约5个到约20个氨基酸残基的肽制备。在某些实施例中，可以使用上述区域或其片段的任何组合来制备CTLA-4特异性抗体。
为了标记或出于与例如KLH的载体分子结合的目的，肽可以经修饰以包括某些残基的添加或取代。举例来说，可以在肽的N端或C端添加半胱氨酸，或可以添加连接子序列以制备用于与例如KLH结合的肽进行免疫。
如通过活体外或活体内分析所测定，本发明的某些抗CTLA-4抗体能够与CTLA-4结合并中和其活性。本发明抗体与CTLA-4结合并中和其活性的能力可以使用所属领域的技术人员已知的任何标准方法来测量，包括如本文所述的结合分析或活性分析。
用于测量结合活性的非限制性示范性活体外分析在本文实例中加以说明。在实例3中，通过表面等离子体共振或MASS-1测定人类抗CTLA-4抗体对人类和猴CTLA-4的结合亲和力和动力学常数。在实例4中，使用竞争夹心ELISA评定抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4蛋白质与其天然配体B7-1和B7-2结合的能力。实例5描述抗CTLA-4抗体与表达CTLA-4的细胞的结合。在实例6中，使用荧光素酶分析和IL-2释放分析测定抗CTLA-4抗体活化T细胞并拯救IL-2释放的能力。
在某些实施例中，本发明抗体能够活体外增强或刺激患有癌症的个体中或经例如LCMV的病毒感染的个体中的T细胞活性。在某些实施例中，本发明抗体与例如针对第二T细胞共抑制因子的抗体的第二治疗剂组合使用以增强个体中的免疫反应并抑制肿瘤生长。
对CTLA-4具有特异性的抗体可以不含额外标记或部分，或其可以含有例如N端或C端标记或部分的标记或部分。在一个实施例中，标记或部分为生物素。在结合分析中，标记(如果存在)的位置可以决定肽相对于发生肽结合的表面的取向。举例来说，如果表面包覆有抗生物素蛋白(avidin)，那么含有N端生物素的肽的取向将使得肽的C端部分远离表面。在一个实施例中，标记可以是放射性核素、荧光染料或MRI可检测标记。在某些实施例中，所述经标记抗体可以用于包括成像分析的诊断分析中。
本发明的示范性实施例
在一个方面中，本发明提供结合人类细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)并且阻断hCTLA-4与配体B7-1和B7-2之间的相互作用的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段诱导T细胞活化。在一些情况下，T细胞是细胞毒性T细胞。在一些情况下，T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞。
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段结合猴CTLA-4。在一些情况下，抗体或抗原结合片段以小于0.5nM的EC50结合表达猴CTLA-4的细胞。
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段以小于5nM、小于1nM或小于0.5nM的EC50结合表达hCTLA-4的细胞。
在各种实施例中，抗体或抗原结合片段是完全人类抗体。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争与人类CTLA-4结合：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482和490/498。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合到人类CTLA-4上的同一个抗原决定基：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482和490/498。
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：(a)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474和490；和(b)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482和498。
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482和490/498。
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包含分别选自由以下组成的组的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域：SEQ ID NO:4-6-8-12-14-16；20-22-24-28-30-32；36-38-40-44-46-48；52-54-56-60-62-64；68-70-72-76-78-80；84-86-88-92-94-96；100-102-104-108-110-112；116-118-120-124-126-128；132-134-136-140-142-144；148-150-152-156-158-160；164-166-168-172-174-176；180-182-184-188-190-192；196-198-200-204-206-208；212-214-216-220-222-224；228-230-232-236-238-240；244-246-248-252-254-256；260-262-264-268-270-272；276-278-280-284-286-288；292-294-296-300-302-304；308-310-312-300-302-304；316-318-320-324-326-328；332-334-336-340-342-344；348-350-352-356-358-360；364-366-368-372-374-376；380-382-384-388-390-392；396-398-400-404-406-408；412-414-416-420-422-424；428-430-432-436-438-440；444-446-448-452-454-456；460-462-464-468-470-472；476-478-480-484-486-488；和492-494-496-500-502-504。
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/298、314/322、330/338、346/354、362/370、378/386、394/402、410/418、426/434、442/450、458/466、474/482和490/498。
在某些实施例中，本发明提供一种抗体或其抗原结合片段，其是人类抗体、人类化抗体或嵌合抗体。抗体或其抗原结合片段例如可以是IgG1或IgG4抗体，例如人类IgG1或IgG4抗体。那些抗体的恒定区对应于野生型恒定区，或已引入突变的恒定区。
在一个方面中，本发明提供一种多特异性抗原结合分子，其包含与CTLA-4特异性结合的第一抗原结合特异性和与第二靶抗原决定基特异性结合的第二抗原结合特异性。
在一个方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含以上实施例中的任一者的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂或稀释剂。
在一个方面中，本发明提供经分离多核苷酸分子和载体，其包含本文所公开的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列。在某些实施例中，本发明提供经分离多核苷酸分子和/或载体，其包含编码如本文所阐述的抗体的HCVR的多核苷酸序列。在某些实施例中，本发明提供一种经分离多核苷酸分子和/或载体，其包含编码如本文所阐述的抗体的LCVR的多核苷酸序列。在某些实施例中，本发明提供一种表达在上文或此处所论述的载体的细胞。
在一个方面中，本发明提供一种治疗可以通过拮抗CTLA-4治疗的疾病或病症的方法，其经由向有需要的个体施用治疗有效量的如本文所公开的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物来进行。在一些情况下，疾病或病症是由选自由以下组成的组的病毒造成的慢性病毒感染：人类免疫缺乏病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。在一些情况下，疾病或病症选自由以下组成的组：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、子宫颈癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤、B细胞淋巴瘤和黑色素瘤。
在一个方面中，本发明提供增强个体中的免疫反应的方法，所述方法包含施用包含如本文中所公开的经分离抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些实施例中，本发明提供抑制个体中的调节性T(Treg)细胞的方法，所述方法包含施用包含如本文中所公开的经分离抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些实施例中，本发明提供增强个体中的T细胞活化的方法，所述方法包含施用包含如本文中所公开的经分离抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些实施例中，个体患有选自由以下组成的组的疾病或病症：血癌、脑癌、肾细胞癌(例如透明细胞肾癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、皮肤癌、子宫颈癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤、淋巴瘤(例如B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)和黑色素瘤。在某些实施例中，个体患有由选自由以下组成的组的病毒造成的慢性病毒感染：人类免疫缺乏病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。在某些实施例中，向个体施用抗CTLA-4抗体与选自由以下组成的组的第二治疗剂的组合：PD-1抑制剂、LAG3抑制剂、针对肿瘤特异性抗原的抗体、针对病毒感染的细胞抗原的抗体、PD-L1抑制剂、CD20抑制剂、针对CD20和CD3的双特异性抗体、例如抗氧化剂的膳食补充剂、VEGF拮抗剂、癌症疫苗、化学治疗剂、细胞毒性剂、手术、放射线、NSAID、皮质类固醇和任何其它适用于缓解至少一种与疾病或病症相关的症状的疗法。
在一个方面中，本发明提供抑制个体中的肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，所述方法包含向有需要的个体施用治疗有效量的如本文中所公开的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。在某些实施例中，肿瘤是原发性肿瘤或复发性肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是已建立的肿瘤。在某些实施例中，个体患有转移性疾病和/或已经经先前疗法治疗。在某些实施例中，肿瘤存在于患有选自由以下组成的组的疾病或病症的个体中：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤、淋巴瘤和黑色素瘤。在某些实施例中，以一个或多个剂量施用抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其中每个剂量是在前一剂量之后1周到12周施用。在某些实施例中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段以每千克个体体重约0.1mg到每千克体重约100mg的剂量施用。在某些实施例中，每个剂量包含约50mg到约1000mg抗体。在某些实施例中，向个体施用抗CTLA-4抗体与选自由以下组成的组的第二治疗剂的组合：PD-1抑制剂、LAG3抑制剂、针对肿瘤特异性抗原的抗体、PD-L1抑制剂、CD20抑制剂、针对CD20和CD3的双特异性抗体、例如抗氧化剂的膳食补充剂、VEGF拮抗剂、癌症疫苗、化学治疗剂、细胞毒性剂、手术、放射线、NSAID、皮质类固醇和任何其它适用于缓解至少一种与疾病或病症相关的症状的疗法。在一个实施例中，第二治疗剂是PD-1抑制剂，其中PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，PD-1抑制剂是REGN2810、纳武单抗或派姆单抗。在某些实施例中，皮下、静脉内、瘤内、瘤周、皮内、腹膜内、经口、肌肉内或颅内施用抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
在一个方面中，本发明提供拯救T细胞活性的CTLA-4介导的抑制的方法，所述方法包含使T细胞与如本文中所公开的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段接触。在一个实施例中，用本发明的抗CTLA-4抗体与抗PD-1抗体(例如REGN2810)的组合来接触T细胞。
在一个方面中，本发明提供如本文中所公开的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物的用途，其用于治疗可以通过拮抗CTLA-4治疗的疾病或病症。在一些情况下，疾病或病症是癌症。
在一个方面中，本发明提供如本文中所公开的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的药物组合物的用途，其用于制造用以治疗可以通过拮抗CTLA-4治疗的疾病或病症的药物。在一些情况下，疾病或病症是癌症。
抗体的抗原结合片段
除非另外特别指示，否则如本文所用的术语“抗体”应该理解为涵盖包含两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“完整抗体分子”)以及其抗原结合片段。如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、以酶方式可获得的、合成的或经基因工程改造的多肽或糖蛋白。如本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保留与CTLA-4特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。抗体片段可以包括Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR或经分离CDR的片段。在某些实施例中，术语“抗原结合片段”是指多特异性抗原结合分子的多肽片段。抗体的抗原结合片段可以使用任何适合的标准技术来源于例如完整抗体分子，所述标准技术例如涉及编码抗体可变结构域和(任选的)恒定结构域的DNA的操纵和表达的蛋白水解消化或重组基因工程改造技术。所述DNA是已知的且/或可以容易地从例如商业来源、DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以合成。DNA可以以化学方式或通过使用分子生物学技术来进行定序和操纵，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域布置成适合配置，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab′)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区(例如经分离互补决定区(CDR)，例如CDR3肽)或限制性FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单元。如本文所用的“抗原结合片段”表述内还涵盖其它经工程改造的分子，例如结构域特异性抗体、单结构域抗体、删除结构域的抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(small modular immunopharmaceutical；SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且一般将包含至少一个与一个或多个构架序列相邻或同框的CDR。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何适合的布置相对于彼此定位。举例来说，可变区可以是二聚可变区并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH结构域或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有至少一个共价连接到至少一个恒定结构域的可变结构域。可以在本发明抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示范性配置包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在包括以上列出的示范性配置中的任一者的可变结构域和恒定结构域的任何配置中，可变结构域和恒定结构域可以直接彼此连接或可以通过完全或部分铰链区或连接区连接。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸组成，其在单一多肽分子中的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性键联。此外，本发明抗体的抗原结合片段可以包含以上列出的可变结构域和恒定结构域配置中的任一者与彼此和/或与一个或多个单体VH结构域或VL结构域(例如通过双硫键)非共价缔合的均二聚体或杂二聚体(或其它多聚体)。
如同完整抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同可变结构域，其中每个可变结构域能够与独立抗原或与同一抗原上的不同抗原决定基特异性结合。包括本文所公开的示范性双特异性抗体型式的任何多特异性抗体型式可以经调适以使用所属领域中可用的常规技术在本发明抗体的抗原结合片段的情形下使用。
制备人类抗体
在转基因小鼠中产生人类抗体的方法是所属领域中已知的。可以在本发明的上下文下使用任何所述已知方法来制造与CTLA-4特异性结合的人类抗体。
使用技术(参见例如US 6,596,541、再生元制药(Regeneron Pharmaceuticals)、)或用于产生单克隆抗体的任何其它已知方法，首先分离具有人类可变区和小鼠恒定区的针对CTLA-4的高亲和力嵌合抗体。技术涉及产生具有包含人类重链和轻链可变区基因组的转基因小鼠，所述人类重链和轻链可变区可操作地连接到内源性小鼠恒定区基因座以使得小鼠产生对抗原刺激起反应的包含人类可变区和小鼠恒定区的抗体。分离编码抗体重链和轻链的可变区的DNA并且将其可操作地连接到编码人类重链和轻链恒定区的DNA。随后使DNA在能够表达完全人类抗体的细胞中表达。
一般来说，用所关注的抗原攻击小鼠，并且从表达抗体的小鼠回收淋巴细胞(例如B细胞)。淋巴细胞可以与骨髓瘤细胞系融合以制备永生融合瘤细胞系，并且筛选并选择所述融合瘤细胞系以鉴别产生对所关注的抗原具有特异性的抗体的融合瘤细胞系。可以分离编码重链和轻链的可变区的DNA并且将其连接到重链和轻链的所期望的同型恒定区。此类抗体蛋白质可以在例如CHO细胞的细胞中产生。或者，编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变结构域的DNA可以直接从抗原特异性淋巴细胞分离。
首先，分离具有人类可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如在下文实验部分中，对抗体进行表征并且针对所期望的特征加以选择，所述特征包括亲和力、选择性、抗原决定基等。用所期望的人类恒定区置换小鼠恒定区以产生本发明的完全人类抗体，例如野生型或经修饰IgG1或IgG4。虽然所选恒定区可以根据特定用途而改变，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。
生物同等物
本发明的抗CTLA-4抗体和抗体片段涵盖具有与所述抗体的氨基酸序列不同、但保留结合CTLA-4的能力的氨基酸序列的蛋白质。当与亲本序列相比时，所述变异抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸添加、删除或取代，但展现基本上同等于所述抗体的生物活性的生物活性。同样，本发明的编码抗体的DNA序列涵盖如下序列：当与所公开的序列相比时包含一个或多个核苷酸添加、删除或取代，但编码基本上与本发明的抗体或抗体片段生物同等的抗体或抗体片段。
举例来说，如果两个抗原结合蛋白或抗体是如下药物同等物或药物替代物：当在类似实验条件下以单次剂量或多次剂量方式以相同摩尔剂量施用时，所述药物同等物或药物替代物的吸收速率和吸收程度不显示显著差异，那么将这两个抗原结合蛋白或抗体视为生物同等的。一些抗体如果在吸收程度方面同等但在吸收速率方面不同等，那么其将视为同等物或药物替代物，并且又由于吸收速率方面的所述差异是故意的并且反映在标记中，，对于在例如慢性使用方面达到有效体药浓度不是必要的，并且对于所研究的特定药品而言被视为医疗上无关紧要的，那么其仍可以视为生物同等物。
在一个实施例中，如果两个抗原结合蛋白的安全性、纯度或性能方面不存在临床上有意义的差异，那么其是生物同等的。
在一个实施例中，如果患者可以在参考产品与生物产品之间转换一或多次，并且相比于无所述转换的持续疗法而言不存在副作用(包括免疫原性临床上显著改变或有效性减弱)风险预期增加，那么两个抗原结合蛋白是生物同等的。
在一个实施例中，如果两个抗原结合蛋白均通过一种或多种共同作用机制在一种或多种使用条件下起作用，达到所述机制所已知的程度，那么其是生物同等的。
生物同等性可以通过活体内和/或活体外方法来证明。生物同等性测量包括例如(a)人类或其它哺乳动物中的活体内测试，其中测量血液、血浆、血清或其它生物流体中随时间而变的抗体或其代谢物的浓度；(b)与人类活体内生物可用性数据相关并且合理地预测人类活体内生物可用性数据的活体外测试；(c)人类或其它哺乳动物中的活体内测试，其中测量随时间而变的抗体(或其标靶)的适当急性药理学效应；和(d)建立抗体的安全性、功效或生物可用性或生物同等性的良好控制的临床试验。
本发明抗体的生物同等变异体可以通过例如进行残基或序列的各种取代或删除生物活性所不需要的末端或内部残基或序列来构筑。举例来说，对于生物活性而言非必需的半胱氨酸残基可以被删除或被其它氨基酸置换以防止在复性后形成不必要或不恰当的分子内双硫桥。在其它情况下，生物同等抗体可以包括包含氨基酸改变的抗体变异体，所述氨基酸改变修饰抗体的糖基化特征，例如消除或去除糖基化的突变。
包含Fc变异体的抗CTLA-4抗体
根据本发明的某些实施例，提供抗CTLA-4抗体，其包含含有一个或多个突变的Fc结构域，所述突变例如在相比于中性pH而言的酸性pH下增强或减弱抗体与FcRn受体的结合。举例来说，本发明包括在Fc结构域的CH2区或CH3区中包含突变的抗CTLA-4抗体，其中所述突变增加Fc结构域在酸性环境中(例如在内体中，其中pH介于约5.5到约6.0范围内)对FcRn的亲和力。所述突变可以引起当向动物施用抗体时，抗体的血清半衰期延长。所述Fc修饰的非限制性实例包括例如在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如A、W、H、F或Y[N434A、N434W、N434H、N434F或N434Y])处的修饰；或在位置250和/或428处的修饰；或在位置307或308(例如308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施例中，修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如308F或308P)。在另一个实施例中，修饰包含265A(例如D265A)和/或297A(例如D297A)修饰。
举例来说，本发明包括抗CTLA-4抗体，其包含含有一对或多对或一组或多组选自由以下组成的组的突变的Fc结构域：250Q和248L(例如T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如M428L和N434S)；257I和311I(例如P257I和Q311I)；257I和434H(例如P257I和N434H)；376V和434H(例如D376V和N434H)；307A、380A和434A(例如T307A、E380A和N434A)；和433K和434F(例如H433K和N434F)。在一个实施例中，本发明包括抗CTLA-4抗体，其包含在IgG4的铰链区中包含S108P突变的Fc结构域以促进二聚体稳定化。本发明范围内涵盖前述Fc结构域突变和本文所公开的抗体可变结构域内的其它突变的所有可能性组合。
本发明还包括包含嵌合重链恒定(CH)区的抗CTLA-4抗体，其中嵌合CH区包含来源于超过一个免疫球蛋白同型的CH区的区段。举例来说，本发明抗体可以包含嵌合CH区，其包含来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的CH2结构域中的部分或全部与来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4分子的CH3结构域中的部分或全部的组合。根据某些实施例，本发明抗体包含具有嵌合铰链区的嵌合CH区。举例来说，嵌合铰链可以包含来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号，在位置216到227的氨基酸残基)与来源于人类IgG1、人类IgG2或人类IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号，在位置228到236的氨基酸残基)的组合。根据某些实施例，嵌合铰链区包含来源于人类IgG1或人类IgG4上铰链的氨基酸残基和来源于人类IgG2下铰链的氨基酸残基。在某些实施例中，包含如本文所述的嵌合CH区的抗体可以展现经改进Fc效应功能而不会不利地影响抗体的治疗或药物动力学性质。(参见例如美国专利公开第20140243504号，所述案的公开内容以全文引用的方式并入本文中)。
抗体的生物学特征
一般来说，本发明抗体通过与CTLA-4结合而起作用。本发明包括以高亲和力结合可溶性单体或二聚CTLA-4分子的抗CTLA-4抗体和其抗原结合片段。举例来说，本发明包括如通过表面等离子体共振，例如使用如本文实例3中所定义的分析型式所测量，以小于约20nM的KD结合二聚人类和猴CTLA-4(例如在25℃下)的抗体和抗体的抗原结合片段。在某些实施例中，如通过表面等离子体共振，例如使用如本文实例3中所定义的分析型式或实质上相似的分析所测量，抗体或其抗原结合片段以小于约10nM、小于约5nM、小于约2nM或小于约1nM的KD结合单体CTLA-4。
本发明还包括如在25℃下通过表面等离子体共振，例如使用如本文实例3中所定义的分析型式或实质上相似的分析所测量，以大于约4分钟的解离半衰期(t1/2)结合CTLA-4的抗体和其抗原结合片段。在某些实施例中，如在25℃下通过表面等离子体共振，例如使用如本文实例3中所定义的分析型式(例如mAb捕捉型式)或实质上相似的分析所测量，本发明的抗体或抗原结合片段以大于约5分钟、大于约10分钟、大于约15分钟、大于约20分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约100分钟、大于约200分钟、大于约300分钟或大于约500分钟的t1/2结合CTLA-4。
本发明还包括如使用例如如实例4中所示的酶联免疫吸附分析(Enzyme-linkedImmunosorbent Assay，ELISA)或实质上相似的分析所测定，以小于约320nM的IC50阻断hCTLA-4与hB7-1(CD80)和/或hB7-2(CD86)结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，如通过例如如所本文实例4中定义的竞争夹心ELISA或实质上相似的分析所测量，抗体或其抗原结合片段以小于约200nM、小于约100nM、小于约70nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约1nM或小于约0.5nM的IC50阻断hCTLA-4与人类B7-1和/或人类B7-2结合。
本发明还包括如通过例如如本文实例4中所定义的竞争夹心ELISA或实质上相似的分析所测量，将hCTLA-4与人类B7-1和/或人类B7-2的结合阻断至少85％的抗体或其抗原结合片段。
本发明还包括如通过如本文实例5中所定义的电化学发光分析或实质上相似的分析所测量，以小于约6nM的EC50与人类CTLA-4表达细胞结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，如通过电化学发光分析，例如使用本文实例5中的分析型式或实质上相似的分析所测量，抗体或其抗原结合片段以小于约4nM、小于约2nM、小于约1nM或小于约0.5nM的EC50与hCTLA-4表达细胞结合。在某些实施例中，如通过电化学发光分析，例如使用本文实例5中的分析型式或实质上相似的分析所测量，抗体或其抗原结合片段与hCTLA-4表达细胞以比与对照细胞的结合高出大于约10倍的比率、以大于约15倍的比率或以比与对照细胞的结合高出大于约20倍的比率结合。
本发明还包括如通过如本文实例5中所定义的电化学发光分析或实质上相似的分析所测量，以小于约0.5nM的EC50与食蟹猕猴CTLA-4表达细胞结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，如通过电化学发光分析，例如使用如本文实例5中所定义的分析型式或实质上相似的分析所测量，抗体或其抗原结合片段以小于约0.5nM或小于约0.2nM的EC50与mfCTLA-4表达细胞结合。
本发明还包括如通过如本文实例6中所定义的T细胞/APC荧光素酶报导子分析或实质上相似的分析所测量，以小于8nM的EC50阻断CTLA-4诱导的T细胞下调(通过阻断CTLA-4/CD80和CTLA-4/CD86相互作用)的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，如通过T细胞/APC荧光素酶报导子分析，例如使用如本文实例6中所定义的分析型式或实质上相似的分析所测量，抗体或其抗原结合片段以小于约6nM、小于约5nM、小于约3nM、小于约2.5nM或小于约2nM的EC50阻断CTLA-4诱导的T细胞下调。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段阻断人类和猴CTLA-4的CTLA-4诱导的T细胞下调。
本发明还包括如通过如本文实例6中所定义的T细胞/APC IL-2释放分析或实质上相似的分析所测量，以小于约50nM的EC50拯救IL-2释放的CTLA-4介导的抑制(通过阻断CTLA-4/CD80和CTLA-4/CD86相互作用)的抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，如通过T细胞/APC IL-2释放分析，例如使用如本文实例6中所定义的分析型式或实质上相似的分析所测量，抗体或其抗原结合片段以小于约45nM、小于约35nM、小于约25nM或小于约20nM的EC50拯救IL-2释放的CTLA-4介导的抑制。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段阻断人类和猴CTLA-4两者的CTLA-4诱导的T细胞下调和/或IL-2释放的CTLA-4介导的抑制。在某些实施例中，如通过IL-2产生所证明，抗体或其抗原结合片段以比同型对照抗体所观测到的速率高出4倍到6倍的速率阻断CTLA-4诱导的T细胞下调。
在某些实施例中，本发明抗体在向有需要的个体预防性施用时适用于抑制肿瘤生长或延迟癌症发展并且可以延长个体的存活期。举例来说，本发明抗体的施用可以引起原发性肿瘤缩小并且可以预防转移或第二肿瘤的发展。在某些实施例中，本发明抗体在向有需要的个体治疗性施用时适用于抑制肿瘤生长并且可以延长个体的存活期。举例来说，向个体施用治疗有效量的本发明抗体可以引起个体中的已建立的肿瘤缩小并消失。在某些实施例中，局部(瘤内或瘤周)施用一种或多种本发明抗体并且其引起经注射的肿瘤病灶中和远端肿瘤病灶(远隔效应(abscopal effect))中肿瘤生长的抑制。
在各种实施例中，本发明提供一种与CTLA-4结合的经分离重组单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗体或其抗原结合片段展现以下特征中的一者或多者：(i)包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474和490或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；(ii)包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482和498或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；(iii)包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的HCDR3结构域：SEQ ID NO:8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、320、336、352、368、384、400、416、432、448、464、480和496或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；和具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的LCDR3结构域：SEQ ID NO:16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、328、344、360、376、392、408、424、440、456、472、488和504或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；(iv)包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的HCDR1结构域：SEQ IDNO:4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、316、332、348、364、380、396、412、428、444、460、476和492或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的HCDR2结构域：SEQ ID NO:6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、318、334、350、366、382、398、414、430、446、462、478和494或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的LCDR1结构域：SEQ ID NO:12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、324、340、356、372、388、404、420、436、452、468、484和500或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；和具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的LCDR2结构域：SEQ ID NO:14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、326、342、358、374、390、406、422、438、454、470、486和502或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的实质上相似序列；(v)如在表面等离子体共振分析中在25℃下所测量，以小于约20nM的结合解离平衡常数(KD)结合二聚人类和猴CTLA-4；(vi)如在表面等离子体共振分析中在25℃下所测量，以大于约4分钟的解离半衰期(t1/2)结合二聚人类和猴CTLA-4；(vii)如使用细胞粘附分析所测定，以小于约320nM的IC50阻断hCTLA-4与hB7-1(CD80)和/或hB7-2(CD86)结合；(viii)如通过竞争夹心ELISA所测量，将hCTLA-4与人类B7-1和/或人类B7-2的结合阻断至少85％；(ix)如通过电化学发光分析所测量，以小于约6nM的EC50与人类CTLA-4表达细胞结合；(x)以大于与对照细胞的结合约10倍的比率与hCTLA-4表达细胞结合；(xi)如电化学发光分析通过所测量，以小于约0.5nM的EC50与猴CTLA-4表达细胞结合；(xii)如通过T细胞/APC荧光素酶报导子分析所测量，以小于8nM的EC50阻断CTLA-4诱导的T细胞下调；(xiii)阻断人类和猴CTLA-4两者的CTLA-4诱导的T细胞下调；(xiv)如在T细胞/APC IL-2释放分析中所测定，以小于约50nM的EC50拯救IL-2释放的CTLA-4介导的抑制；(xv)阻断人类和猴CTLA-4两者的CTLA-4诱导的T细胞下调和/或IL-2释放的CTLA-4介导的抑制；(xvi)如通过IL-2产生所证明，以比同型对照抗体所观测到的速率高出4倍到6倍的速率阻断CTLA-4诱导的T细胞下调；(xvii)抑止患有癌症的个体的肿瘤生长并且延长存活期；和(xviii)是完全人类的。
本发明抗体可以具有前述生物学特征中的一者或多者或其任何组合。本发明抗体的其它生物学特征将为所属领域的普通技术人员从审阅本发明，包括本文中的工作实例而显而易知。
物种选择性和物种交叉反应性
根据本发明的某些实施例，抗CTLA-4抗体与人类CTLA-4结合，但不与其它物种的CTLA-4结合。或者，在某些实施例中，本发明的抗CTLA-4抗体与人类CTLA-4和来自一个或多个非人类物种的CTLA-4结合。举例来说，本发明的抗CTLA-4抗体可以与人类CTLA-4结合并且可以取决于具体情况而结合或不结合小鼠、大鼠、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、母牛、马、骆驼、食蟹猕猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩CTLA-4中的一者或多者。在某些实施例中，本发明的抗CTLA-4抗体可以以相同亲和力或以不同亲和力与人类和食蟹猕猴CTLA-4结合，但不与大鼠和小鼠CTLA-4结合。
抗原决定基定位(Epitope Mapping)和相关技术
本发明包括与在CTLA-4分子的一个或多个结构域内所发现的一个或多个氨基酸相互作用的抗CTLA-4抗体，所述一个或多个结构域包括例如胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。抗体所结合的抗原决定基可以由位于CTLA-4分子的前述结构域中的任一者内的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续序列(例如结构域中的线性抗原决定基)组成。或者，抗原决定基可以由位于CTLA-4分子的前述任何结构域或所有结构域内的多个非相邻氨基酸(或氨基酸序列)(例如构象抗原决定基)组成。
所属领域的普通技术人员已知的各种技术可以用于确定抗体是否在多肽或蛋白质内“与一个或多个氨基酸相互作用”。示范性技术包括例如常规交叉阻断分析，例如Antibodies,Harlow和Lane(纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY))中所述的分析。其它方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)《分子生物学方法》248:443-63)、肽裂解分析、结晶学研究和NMR分析。另外，可以采用例如抗原决定基切除、抗原决定基提取和抗原化学修饰的方法(Tomer(2000)《蛋白质科学(Prot.Sci.)》9:487-496)。可以用于鉴别多肽内与抗体相互作用的氨基酸的另一方法是通过质谱检测的氢/氘交换。一般来说，氢/氘交换方法涉及氘标记所关注的蛋白质，接着使抗体与氘标记的蛋白质结合。接着，将蛋白质/抗体复合物转移到水中并且氨基酸内由抗体复合物保护的可交换质子以比不是界面的一部分的氨基酸内的可交换质子慢的速率发生氘回到氢的交换。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氘并且因此相比于未包括在界面中的氨基酸而言展现相对较高的质量。在抗体解离之后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，借此展现对应于与抗体相互作用的特定氨基酸的氘标记残基。参见例如Ehring(1999)《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》267:252-259；Engen和Smith(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A。
术语“抗原决定基”是指抗原上B细胞和/或T细胞所响应的位点。B细胞抗原决定基可以由通过蛋白质的三级折叠并列的相邻氨基酸或非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的抗原决定基通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成的抗原决定基在用变性溶剂处理后通常消失。抗原决定基在独特空间构象中通常包括至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。
修饰辅助剖析(Modification-Assisted Profiling，MAP)也称为基于抗原结构的抗体剖析(Antigen Structure-based Antibody Profiling，ASAP)，是根据各抗体对经化学或酶修饰的抗原表面的结合概况的相似性，对大量针对同一抗原的单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(参见US 2004/0101920，特此以全文引用的方式并入本文中)。各类别可以反映与由另一类别表示的抗原决定基明显不同或部分重叠的独特抗原决定基。所属领域允许快速过滤基因相同的抗体，使得表征可以集中于基因不同的抗体。当应用于融合瘤筛检时，MAP可以促进对产生具有所期望特征的mAb的稀有融合瘤克隆的鉴别。MAP可以用以将本发明抗体分成结合不同抗原决定基的抗体组。
在某些实施例中，抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段结合如SEQ ID NO:505中所举例说明的呈天然形式的或以重组方式产生的CTLA-4中所举例说明的区域中的任一者或多者内的抗原决定基，或结合到其片段。
本发明包括与本文表1中所述的特定示范性抗体中的任一者或具有表1中所述的示范性抗体中的任一者的CDR序列的抗体结合到同一抗原决定基或抗原决定基的一部分的抗CTLA-4抗体。同样，本发明还包括与本文表1中所述的特定示范性抗体中的任一者或具有表1中所述的示范性抗体中的任一者的CDR序列的抗体竞争与CTLA-4或CTLA-4片段结合的抗CTLA-4抗体。举例来说，本发明包括与本文所举例说明的一种或多种抗体(例如H1H19303P或H1H19319P2)交叉竞争与CTLA-4结合的抗CTLA-4抗体。
通过使用所属领域中已知的常规方法，可以容易地确定抗体与参考抗CTLA-4抗体是结合还是竞争结合到同一抗原决定基。举例来说，为确定测试抗体是否与本发明的参考抗CTLA-4抗体结合到同一抗原决定基，使参考抗体在饱和条件下与CTLA-4蛋白质或肽结合。接着，评定测试抗体与CTLA-4分子结合的能力。如果测试抗体能够在用参考抗CTLA-4抗体饱和结合之后与CTLA-4结合，那么可以得出测试抗体与参考抗CTLA-4抗体结合到不同抗原决定基的结论。另一方面，如果测试抗体不能够在用参考抗CTLA-4抗体饱和结合之后与CTLA-4蛋白质结合，那么测试抗体可以结合到与本发明的参考抗CTLA-4抗体所结合的抗原决定基相同的抗原决定基。
为确定抗体是否与参考抗CTLA-4抗体竞争结合，按两个方向进行上述结合方法：在第一方向中，使参考抗体与CTLA-4蛋白质在饱和条件下结合，随后评定测试抗体与CTLA-4分子的结合。在第二方向中，使测试抗体与CTLA-4分子在饱和条件下结合，随后评定参考抗体与CTLA-4分子的结合。如果在两个方向中，只有第一(饱和)抗体能够与CTLA-4分子结合，那么得出测试抗体和参考抗体竞争与CTLA-4结合的结论。如所属领域的技术人员应该理解，与参考抗体竞争结合的抗体未必与参考抗体结合到同一抗原决定基，但可以通过结合重叠或相邻抗原决定基而在空间上阻断参考抗体的结合。
如果两个抗体各自竞争性地抑制(阻断)另一个抗体与抗原的结合，那么其结合到相同或重叠的抗原决定基。也就是说，如在竞争性结合分析中所测量(参见例如Junghans等人,《癌症研究(Cancer Res.)》1990 50:1495-1502)，1、5、10、20或100倍过量的一个抗体抑制另一个抗体的结合达至少50％，但是优选75％、90％或甚至99％。或者，如果抗原中减少或消除一个抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除了另一个抗体的结合，那么两个抗体具有同一抗原决定基。如果减少或消除一个抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一个抗体的结合，那么两个抗体具有重叠抗原决定基。
随后可以进行额外的常规实验(例如肽突变和结合分析)以确认所观测到的测试抗体的结合缺乏实际上是否是由与参考抗体结合到同一抗原决定基所致，或空间阻断(或另一种现象)是否负责所观测到的结合缺乏。这种实验可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流动式细胞测量术或所属领域中可用的任何其它定量或定性抗体结合分析来进行。
免疫结合物
本发明涵盖一种人类抗CTLA-4单克隆抗体，其与例如细胞毒素或化学治疗剂的治疗部分结合(“免疫结合物”)以治疗癌症。如本文所用的术语“免疫结合物”是指以化学方式或以生物方式与细胞毒素、放射性药剂、细胞介素、干扰素、靶部分或报导部分、酶、毒素、肽或蛋白质或治疗剂连接的抗体。抗体可以沿着分子在任何位置与细胞毒素、放射性药剂、细胞介素、干扰素、靶部分或报导部分、酶、毒素、肽或治疗剂连接，只要其能够结合其标靶即可。免疫结合物的实例包括抗体药物结合物和抗体-毒素融合蛋白。在一个实施例中，试剂可以是针对CTLA-4的第二不同抗体。在某些实施例中，抗体可以与对肿瘤细胞或病毒感染细胞具有特异性的试剂结合。在一个实施例中，抗体与对T细胞具有特异性的试剂结合。可以与抗CTLA-4抗体结合的治疗部分的类型将考虑待治疗的病况和待实现的所期望的治疗效果。适合形成免疫结合物的试剂的实例是所属领域中已知的；参见例如WO 05/103081。
多特异性抗体
本发明抗体可以是单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可以对一个靶多肽的不同抗原决定基具有特异性或可以含有对超过一个靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等人,1991,《免疫学杂志(J.Immunol.)》147:60-69；Kufer等人,2004,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》22:238-244。
在一个方面中，本发明包括多特异性抗原结合分子或其抗原结合片段，其中免疫球蛋白的一种特异性专用于CTLA-4的胞外结构域或其片段，而免疫球蛋白的另一特异性专用于CTLA-4的胞外结构域外的结合或第二治疗标靶，或与治疗部分结合。
如所属领域的普通技术人员所已知，本发明的多特异性抗原结合分子中的任一者或其变异体可以使用标准分子生物技术(例如重组DNA和蛋白质表达技术)来构筑。
在一些实施例中，CTLA-4特异性抗体是以双特异性型式(“双特异性抗体(bi-specific)”)产生，其中与CTLA-4的不同结构域结合的可变区连接在一起以在单一结合分子内赋予双结构域特异性。适当设计的双特异性抗体可以经由增加特异性和结合亲合力来增强整体CTLA-4抑制功效。对单独结构域(例如N端结构域的区段)具有特异性或可以与一个结构域内的不同区域结合的可变区在允许每个区域同时与独立抗原决定基结合或与一个结构域内的不同区域结合的结构架构上配对。在一个实例中，关于双特异性抗体，来自对一个结构域具有特异性的结合子的重链可变区(VH)与来自一系列对第二结构域具有特异性的结合子的轻链可变区(VL)重组以鉴别可以与初始VH配对而不破坏对所述VH的初始特异性的非同源VL搭配物。以此方式，单一VL区段(例如VL1)可以与两个不同VH结构域(例如VH1和VH2)组合以产生由两个结合“臂”(VH1-VL1和VH2-VL1)构成的双特异性抗体。单一VL区段的使用降低了系统复杂性，由此简化了用于产生双特异性抗体的克隆、表达和纯化工艺并提高效率(参见例如USSN13/022759和US2010/0331527)。
或者，例如但不限于例如第二不同抗CTLA-4抗体的结合超过一个结构域和第二标靶的抗体可以使用本文所述的技术或所属领域的技术人员已知的其它技术以双特异性型式制备。可以将与不同区域结合的抗体可变区和与例如CTLA-4的胞外结构域上的相关位点结合的可变区连接在一起以在单一结合分子内赋予双重抗原特异性。具有此性质的恰当设计的双特异性抗体起双重作用。将对胞外结构域具有特异性的可变区与对胞外结构域外部具有特异性的可变区组合并且在允许各可变区与各别抗原结合的结构架构上配对。
可以在本发明的上下文中使用的示范性双特异性抗体型式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中相比于缺乏氨基酸差异的双特异性抗体，至少一个氨基酸差异减小了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号是H435R)。第二CH3可以进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU是Y436F)。可以发现于第二CH3内的其它修饰在IgG1抗体的情况下包括：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU是D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下包括：N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU是N384S、K392N和V422I)；并且在IgG4抗体的情况下包括：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU是Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所描述的双特异性抗体型式上的变化涵盖在本发明的范围内。
可以在本发明的上下文中使用的其它示范性双特异性型式包括但不限于例如基于scFv或双功能抗体双特异性型式、IgG-scFv融合物、双重可变结构域(dual variabledomain，DVD)-Ig、四源杂交瘤(Quadroma)、杵臼(knobs-into-holes)、常见轻链(例如具有杵臼的常见轻链等)、交叉Mab(CrossMab)、交叉Fab(CrossFab)、(SEED)体、白氨酸拉链(leucine zipper)、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性型式(关于前述型式的综述，参见例如Klein等人2012,《mAbs》4:6,1-11，和其中所引用的参考文献)。双特异性抗体还可以使用肽/核酸结合来构筑，例如其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸结合物，其随后自组装成具有规定组成、价数和几何结构的多聚复合物。(参见例如Kazane等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》[电子版：2012年12月4日])。
治疗性施用和配制物
本发明提供包含本发明的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的治疗性组合物。根据本发明的治疗性组合物将与适合载剂、赋形剂和并入配制物中以提供改进的转移、递送、耐受性等等的其它试剂一起施用。大量适当配制物可以发现于所有医药化学家已知的处方集：《雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,PA)中。此些配制物包括例如散剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子型)(例如LIPOFECTINTM)、DNA结合物、无水吸收糊剂、水包油型乳液和油包水型乳液、乳液卡波蜡(carbowax)(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有卡波蜡的半固体混合物。也参见Powell等人《肠胃外制剂用赋形剂纲要(Compendium of excipients for parenteral formulations)》PDA(1998)《药物科学与技术杂志(J Pharm Sci Technol)》52:238-311。
抗体的剂量可以取决于待施用的个体的年龄和身材、靶疾病、病况、施用途径等等而变化。当使用本发明抗体来治疗成年患者的疾病或病症或预防此类疾病时，正常按以下单次剂量施用本发明抗体是有利的：每千克体重约0.1到约60mg、更优选地每千克体重约5到约60、约20到约50、约10到约50、约1到约10或约0.8到约11mg。取决于病况的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以至少约0.1mg到约800mg、约1到约500mg、约5到约300mg或约10到约200mg、到约100mg或到约50mg的初始剂量施用。在某些实施例中，初始剂量之后可以以大致上与初始剂量相同或小于初始剂量的量施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其中各后续剂量之间间隔至少1天到3天；至少一周；至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
各种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如脂质体、微粒、微胶囊封装、能够表达突变型病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等人(1987)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮内、经皮、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和经口途径。组合物可以通过任何适宜途径施用，例如通过输注或快速注射(bolus injection)、通过经由上皮或黏膜皮肤内层(例如口腔黏膜、直肠黏膜和肠黏膜等)吸收，并且可以与其它生物学活性剂一起施用。可以全身或局部施用。药物组合物还可以在囊泡、尤其是脂质体中递送(参见例如Langer(1990)《科学(Science)》249:1527-1533)。
本文还设想使用纳米粒子递送本发明抗体。可以使用抗体结合的纳米粒子以用于治疗应用和诊断应用两者。抗体结合的纳米粒子以及制备和使用方法由Arruebo,M.等人2009(《用于生物医学应用的抗体结合的纳米粒子(Antibody-conjugated nanoparticlesfor biomedical applications)》《纳米材料杂志(J.Nanomat.)》第2009卷,文章ID439389,24页,doi:10.1155/2009/439389)详细描述，所述文献以引入的方式并入本文中。可以研发纳米粒子并且将其与药物组合物中所含的抗体结合以靶向肿瘤细胞或自体免疫性组织细胞或病毒感染细胞。用于药物递送的纳米粒子也描述于例如US 8257740或US8246995中，其各自以全文并入本文中。
在某些情况下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵。在另一个实施例中，可以使用聚合物材料。在另一个实施例中，控制释放系统可以放置在组合物的标靶附近，因此仅需要全身性剂量的一部分。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、瘤内、瘤周、皮内、颅内、腹膜内和肌肉内注射、点滴输注(drip infusion)等的剂型。此些可注射制剂可以通过公开已知的方法制备。举例来说，可注射制剂可以例如通过在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中溶解、悬浮或乳化上文所描述的抗体或其盐来制备。至于注射用水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖的等张溶液和其它辅助剂等，其可以与适当助溶剂组合使用，所述助溶剂例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。至于油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与例如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等助溶剂组合使用。优选将由此制备的注射液填充于适当安瓿中。
本发明的药物组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。另外，关于皮下递送，笔式递送装置易于在递送本发明的药物组合物时应用。此类笔式递送装置可以是可再用的或抛弃式的。可再用的笔式递送装置一般利用含有药物组合物的可替换筒。在筒内所有药物组合物都已经施用并且筒空之后，可以容易地丢弃空筒并且用含有药物组合物的新筒替换。随后可以再使用笔式递送装置。在抛弃式笔式递送装置中，不存在可替换筒。确切而言，抛弃式笔式递送装置预填充有保存于装置内的储集器中的药物组合物。一旦清空储集器的药物组合物，即丢弃整个装置。
许多可再用笔式和自动注射器递送装置可以应用于本发明的药物组合物的皮下递送。仅列举几例，实例包括但当然不限于：AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOGMIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(印第安纳州印第安纳波利斯的礼来公司(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN))、NOVOPENTMI、II和III(丹麦哥本哈根的诺和诺德(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark))、NOVOPEN JUNIORTM(丹麦哥本哈根的诺和诺德)、BDTM笔(新泽西州富兰克林湖的BD公司(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ))、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(德国法兰克福的赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany))。仅列举几例，可以应用于皮下递送本发明的药物组合物的抛弃式笔式递送装置的实例包括但当然不限于：SOLOSTARTM笔(赛诺菲-安万特)、FLEXPENTM(诺和诺德)和KWIKPENTM(礼来)、SURECLICKTM自动注射器(加利福尼亚州千橡市的安进(Amgen,Thousand Oaks,CA))、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(伊利诺伊州雅培园区的雅培公司(Abbott Labs,AbbottPark,IL))。
上文所述的用于经口或非经肠使用的药物组合物宜制备成呈适于配合活性成分的剂量的单位剂量的剂型。所述呈单位剂量的剂型包括例如锭剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。单位剂量中所含抗体的量一般是每剂型约5到约500mg；尤其呈注射剂形式，对于其它剂型而言，含有约5到约100mg和约10到约250mg的抗体是优选的。
抗体的治疗性用途
本发明抗体尤其适用于治疗、预防和/或缓解与CTLA-4表达、信号传导或活性相关或由其介导、或可以通过阻断CTLA-4与CTLA-4配体B7-1/CD80和/或B7-2/CD86之间的相互作用或以其它方式抑制CTLA-4活性和/或信号传导来治疗的任何疾病或病症。可以施用一种或多种本发明抗体来减轻或预防疾病或病症的症状或病况中的一者或多者或降低其严重程度。举例来说，本发明提供通过向需要所述治疗的患者施用如本文所述的抗CTLA-4抗体(或包含抗CTLA-4抗体的药物组合物)来治疗癌症(肿瘤生长抑制)和/或病毒感染的方法，和用于治疗癌症(肿瘤生长抑制)和/或病毒感染的抗CTLA-4抗体(或包含抗CTLA-4抗体的药物组合物)。本发明抗体适用于治疗、预防和/或缓解例如癌症或病毒感染的疾病或病症或病况和/或用于缓解至少一种与所述疾病、病症或病况相关的症状。在本文所述的治疗方法的情况下，抗CTLA-4抗体可以以单一疗法(即作为唯一治疗剂)或与一种或多种额外治疗剂(其实例描述于本文其它地方中)组合施用。
在本发明的一些实施例中，本文所述的抗体适用于治疗患有原发性癌症或复发性癌症的个体，所述癌症包括但不限于血癌、脑癌(例如多形性胶质母细胞瘤)、肾细胞癌(例如透明细胞肾癌)、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、肾癌、子宫颈癌、皮肤癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤和黑色素瘤。
如本文所用的术语“血癌”包括影响血液、骨髓、淋巴或淋巴系统的血液科恶性疾病。因此，所述术语包括来自淋巴和骨髓细胞谱系的细胞的恶性疾病。骨髓细胞系正常产生粒细胞、红血球、凝血细胞、巨噬细胞和肥大细胞；淋巴细胞系产生B、T、NK和浆细胞。因此，所述术语包括以上提及的细胞的恶性疾病，即淋巴瘤、骨髓瘤、淋巴性白血病和骨髓性白血病。实例包括但不限于急性淋巴母细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、急性单核球性白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin′s lymphomas)、非霍奇金氏淋巴瘤(例如B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)和骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤)。
可以使用抗体来治疗癌症的早期或晚期症状。在一个实施例中，可以使用本发明的抗体或其片段来治疗晚期癌或转移性癌症。抗体适用于减少或抑制或缩小实体肿瘤和血癌两者的肿瘤生长。在某些实施例中，用本发明的抗体或其抗原结合片段进行的治疗引起个体中的肿瘤发生超过40％的消退、超过50％的消退、超过60％的消退、超过70％的消退、超过80％的消退或超过90％的消退。在某些实施例中，抗体可以用于预防肿瘤复发。在某些实施例中，抗体适用于延长患有癌症的个体的无发展存活期或总存活期。在一些实施例中，抗体适用于降低因化学疗法或放射线疗法所导致的毒性，同时维持患有癌症的患者长期存活。在某些实施例中，将一种或多种本发明抗体9瘤内或瘤周地局部注射到一个或多个肿瘤病灶中)，并且在个体中的经注射肿瘤中以及在一个或多个相邻或远端肿瘤(远隔效应)中引起肿瘤生长抑制。
在某些实施例中，本发明抗体适用于治疗患有慢性病毒感染的个体。在一些实施例中，本发明抗体适用于降低宿主中的病毒效价和/或拯救耗竭性T细胞。在某些实施例中，本发明的抗体或其片段可以用于治疗由淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)所导致的慢性病毒感染。在一些实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以治疗剂量施用到感染人类免疫缺乏病毒(HIV)或人类乳头瘤病毒(HPV)或B型/丙型肝炎病毒(HBV/HCV)的患者。在相关实施例中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以用于治疗例如食蟹猕猴的猿猴个体中由猿猴免疫缺乏病毒(SIV)所导致的感染。
在某些实施例中，可以向患有癌症或病毒感染的个体施用治疗有效量的本发明的阻断抗体。
在某些实施例中，将一种或多种本发明抗体局部施用到患有癌症的个体中的肿瘤中或肿瘤病灶附近(瘤内或瘤周)以使全身暴露降到最低并且预防/缓解因抗体的全身暴露所导致的毒性。
本文还涵盖对处于罹患例如癌症和病毒感染的疾病或病症风险下的患者预防性地使用一种或多种本发明抗体。
在本发明的另一实施例中，本发明抗体用于制备用以治疗患有癌症或病毒感染的患者的药物组合物。在本发明的另一个实施例中，本发明抗体作为辅助疗法与所属领域的技术人员已知的适用于治疗癌症或病毒感染的任何其它药剂或任何其它疗法一起使用。
组合疗法和配制物
组合疗法可以包括本发明的抗CTLA-4抗体和宜与本发明抗体或本发明抗体的生物学活性片段组合的任何额外治疗剂。
本发明抗体可以与一种或多种用于治疗或抑制癌症的抗癌药或疗法以协同方式组合，所述癌症包括例如血癌、脑癌(例如多形性胶质母细胞瘤)、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、皮肤癌、子宫颈癌、胃癌、肾癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤和黑色素瘤。本文中设想本发明的抗CTLA-4抗体与免疫刺激性和/或免疫支持性疗法组合使用来抑制肿瘤生长和/或延长癌症患者的存活期。免疫刺激性疗法包括通过针对受抑止免疫细胞“释放制动器(releasing thebrake)”或“加速(stepping on the gas)”活化免疫反应来强化免疫细胞活性的直接免疫刺激性疗法。实例包括靶向其它检查点受体、疫苗接种和佐剂。免疫支持型式可以通过促进免疫原性细胞死亡、炎症来增加肿瘤的抗原性或具有其它促进抗肿瘤免疫反应的间接作用。实例包括放射线、化学疗法、抗血管生成剂和手术。
在各种实施例中，一种或多种本发明抗体可以与以下各者组合使用：PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体，例如纳武单抗、派姆单抗、皮立珠单抗(pidilizumab)、BGB-A317或REGN2810)、PD-L1抑制剂(例如抗PD-L1抗体，例如阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、MDX-1105或REGN3504)、LAG3抑制剂、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、CD28抑制剂、CSF1R抑制剂、CXCR抑制剂、CCR4抑制剂、CCR8抑制剂、CD40抑制剂、OX40抑制剂、GITR抑制剂、另一个T细胞共抑制因子或配体的拮抗剂(例如针对CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA的抗体)、吲哚胺-2,3-二氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂[例如“VEGF捕获剂(VEGF-Trap)”，例如阿柏西普或如US 7,087,411中所阐述的其它抑制VEGF的融合蛋白或抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如贝伐单抗或兰尼单抗(ranibizumab))或VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕佐泮尼(pazopanib)]、Ang2抑制剂(例如内斯瓦库单抗)、转形生长因子β(transforming growth factor beta，TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制剂(例如埃罗替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab))、CD20抑制剂(例如抗CD20抗体，例如利妥昔单抗(rituximab))、针对肿瘤特异性抗原[例如CA9、CA125、黑色素瘤相关抗原3(melanoma-associated antigen 3，MAGE3)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、波形蛋白(vimentin)、肿瘤-M2-PK、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，PSA)、粘蛋白-1、MART-1和CA19-9]的抗体、疫苗(例如卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)、癌症疫苗)、用以增加抗原呈递的佐剂(例如粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子)、双特异性抗体(例如CD3×CD20双特异性抗体或PSMA×CD3双特异性抗体)、细胞毒素、化学治疗剂(例如达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、环磷酰胺、多西他赛(docetaxel)、阿霉素、柔红霉素、顺铂、卡铂(carboplatin)、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)、米托蒽醌、奥沙利铂(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇和长春新碱)、环磷酰胺、手术、放射线疗法、IL-6R抑制剂(例如沙瑞卢单抗(sarilumab))、IL-4R抑制剂(例如度匹鲁单抗(dupilumab))、IL-10抑制剂、例如IL-2、IL-7、IL-21和IL-15的细胞介素、抗体-药物结合物(antibody-drug conjugate，ADC)(例如抗CD19-DM4 ADC和抗DS6-DM4 ADC)、消炎药(例如皮质类固醇和非类固醇消炎药)、例如抗氧化剂的膳食补充剂或任何其它用于治疗癌症的疗法护理。在某些实施例中，本发明的抗CTLA-4抗体可以与包括树突状细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等的癌症疫苗组合使用来强化抗肿瘤反应。可以与本发明的抗CTLA-4抗体组合使用的癌症疫苗的实例包括用于黑色素瘤和膀胱癌的MAGE3疫苗、用于乳腺癌的MUC1疫苗、用于脑癌(包括多形性胶质母细胞瘤)的EGFRv3(例如林德佩皮姆(Rindopepimut))或ALVAC-CEA(用于CEA+癌症)。
在某些实施例中，在用于产生长期耐用抗肿瘤反应和/或延长患有癌症的患者的存活期的方法中，本发明的抗CTLA-4抗体可以与放射线疗法组合施用。在一些实施例中，本发明的抗CTLA-4抗体可以在向癌症患者施用放射线疗法之前、同时或之后施用。举例来说，可以向肿瘤病灶施用一次或多次剂量的放射线疗法，随后施用一次或多次剂量的本发明的抗CTLA-4抗体。在一些实施例中，可以局部施用放射线疗法到肿瘤病灶以增强患者肿瘤的局部免疫原性(辅助放射线)和/或杀伤肿瘤细胞(烧蚀性放射线)，随后全身性施用本发明的抗CTLA-4抗体。举例来说，可以与全身性施用本发明的抗CTLA-4抗体相组合向患有脑癌(例如多形性胶质母细胞瘤)的患者施用颅内放射线。在某些实施例中，本发明的抗CTLA-4抗体可以与放射线疗法和化学治疗剂(例如替莫唑胺)或VEGF拮抗剂(例如阿柏西普)组合施用。在某些实施例中，本发明的抗CTLA-4抗体可以与放射线疗法和化学治疗剂(例如替莫唑胺)或PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体，例如REGN2810、纳武单抗或派姆单抗)组合施用。
在某些实施例中，本发明的抗CTLA-4抗体可以与一种或多种用于治疗由LCMV、HIV、HPV、HBV或HCV导致的慢性病毒感染的抗病毒药组合施用。抗病毒药的实例包括但不限于齐多夫定、拉米夫定、阿巴卡韦、利巴韦林、洛匹那韦、依法韦仑、考比西他、替诺福韦、利匹韦林和皮质类固醇。
额外治疗活性剂/组分可以在施用本发明的抗CTLA-4抗体之前、同时或之后施用。出于本公开的目的，考虑这样的施用方案：抗CTLA-4抗体“与”第二治疗活性组分“组合”施用。
额外治疗活性组分可以在施用本发明的抗CTLA-4抗体之前向个体施用。举例来说，如果第一组分在施用第二组分前1周、前72小时、前60小时、前48小时、前36小时、前24小时、前12小时、前6小时、前5小时、前4小时、前3小时、前2小时、前1小时、前30分钟、前15分钟、前10分钟、前5分钟或前不到1分钟施用，那么可以视为第一组分是“在”第二组分“之前”施用。在其它实施例中，额外治疗活性组分可以在施用本发明的抗CTLA-4抗体之后向个体施用。举例来说，如果第一组分在施用第二组分之后1分钟、之后5分钟、之后10分钟、之后15分钟、之后30分钟、之后1小时、之后2小时、之后3小时、之后4小时、之后5小时、之后6小时、之后12小时、之后24小时、之后36小时、之后48小时、之后60小时、之后72小时施用，那么可以视为第一组分是“在”第二组分“之后”施用。在其它实施例中，额外治疗活性组分可以与施用本发明的抗CTLA-4抗体同时向个体施用。出于本发明的目的，“同时”施用包括例如以单一剂型(例如共配制)或以相互之间在约30分钟或更短时间内向个体施用的各别剂型向个体施用抗CTLA-4抗体和额外治疗活性组分。如果以各别剂型施用，那么各剂型可以经由相同途径施用(例如，抗CTLA-4抗体和额外治疗活性组分均可以静脉内、皮下等施用)；或者，各剂型可以经由不同途径施用(例如抗CTLA-4抗体可以静脉内施用，并且额外治疗活性组分可以皮下施用)。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、以相同途径的各别剂型或以不同途径的各别剂型施用组分皆视为“同时施用”。出于本公开的目的，在施用额外治疗活性组分“之前”、“同时”或“之后”(如在上文中所定义的那些术语)施用抗CTLA-4抗体皆视为抗CTLA-4抗体“与”额外治疗活性组分“组合”施用。
本发明包括药物组合物，其中本发明的抗CTLA-4抗体与如本文其它地方所述的额外治疗活性组分中的一者或多者一起使用各种剂量组合来共配制。
在本发明的抗CTLA-4抗体与PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体，如以全文引用的方式并入本文中的US 2015/0203579中所公开)组合施用的示范性实施例，包括施用包含抗CTLA-4抗体和PD-1抑制剂的共配制物中，可以使用各种剂量组合向个体施用单独组分且/或共配制单独组分。因此，本发明包括(i)本发明的抗CTLA-4抗体与(ii)PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体，如以全文引用的方式并入本文中的US 2015/0203579中所公开)的组合，以便同时、分别和/或依序用以治疗癌症或病毒感染。举例来说，抗CTLA-4抗体和PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体)各自可以以选自由以下组成的组的量向个体施用和/或含于共配制物中：0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kg和10.0mg/kg。在一个实施例中，抗CTLA-4抗体和PD-1抑制剂(例如抗PD-1抗体)各自可以以约50mg到约600mg的量，例如选自由以下组成的组的量向个体施用和/或含于共配制物中：50mg、100mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg和600mg。组合/共配制物可以根据本文其它地方所公开的施用方案中的任一者向个体施用，所述施用方案包括例如一周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次等。本发明的抗CTLA-4抗体可以例如以约0.8到约11、约1到约10、约3到约10、约1、约3或约10mg/kg的剂量，与约3到5或约3.0mg/kg的剂量的PD-1抑制剂(例如，如US 2015/0203579中所公开的抗PD-1抗体)同时施用。同时施用可以例如每14天、每21天或每28天进行。
在本发明的抗CTLA-4抗体与抗PD-1抗体和VEGF拮抗剂(例如VEGF捕获剂，例如阿柏西普)组合施用的示范性实施例，包括施用包含抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体和VEGF拮抗剂的共配制物中，可以使用各种剂量组合向个体施用单独组分且/或共配制单独组分。举例来说，抗CTLA-4抗体和/或抗PD-1抗体可以以选自由以下组成的组的量向个体施用和/或含于共配制物中：0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg、6.0mg、7.0mg、8.0mg、9.0mg和10.0mg；并且VEGF拮抗剂(例如VEGF捕获剂，例如阿柏西普)可以以选自由以下组成的组的量向个体施用和/或含于共配制物中：0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg和3.0mg。组合/共配制物可以根据本文其它地方所公开的施用方案中的任一者向个体施用，所述施用方案包括例如一周两次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次等。
施用方案
根据本发明的某些实施例，可以在规定的时间过程内向个体施用多次剂量的抗CTLA-4抗体(或包含抗CTLA-4抗体与本文所提及的额外治疗活性剂中的任一者的组合的药物组合物)。根据本发明的此方面的方法包含向个体依序施用多次剂量的本发明的抗CTLA-4抗体。如本文所用的“依序施用”意思指每次剂量的抗CTLA-4抗体在不同时间点向个体施用，例如在间隔预定时间间隔(例如数小时、数天、数周或数月)的不同日子施用。本发明包括如下方法，其包含向患者依序施用单次初始剂量的抗CTLA-4抗体，接着为一次或多次第二剂量的抗CTLA-4抗体，和任选地接着为一次或多次第三剂量的抗CTLA-4抗体。抗CTLA-4抗体可以以每千克个体体重0.1mg到100mg之间的剂量施用。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本发明的抗CTLA-4抗体的施用时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可以均含有相同量的抗CTLA-4抗体，但在施用频率方面一般彼此不同。然而，在某些实施例中，在治疗过程中，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中所含的抗CTLA-4抗体的量彼此不同(例如任选地上调或下调)。在某些实施例中，在治疗方案开始时施用两次或更多次(例如2、3、4或5次)剂量作为“速效剂量(loading dose)”，接着以较低频率施用后续剂量(例如“维持剂量”)。
在某些实施例中，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中所含的抗CTLA-4抗体的量可以是次优化的或次治疗性的(sub-therapeutic)。如本文所用的术语“次治疗性的”或“次优化的”是指所施用的抗体剂量的程度过低以致于不能产生治疗效果或低于治疗例如癌症的疾病所必需的程度。
在本发明的某些示范性实施例中，第二剂量和/或第三剂量各自在前一剂量之后1到26周(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2周或更久)施用。如本文所用的短语“前一剂量”意思指在多次施用的顺序中，在施用所述顺序中的下一次剂量之前向患者施用的抗CTLA-4抗体的剂量，并且没有中间剂量。
根据本发明的此方面的方法可以包含向患者施用任何次数的第二剂量和/或第三剂量的抗CTLA-4抗体。举例来说，在某些实施例中，仅向患者施用单次第二剂量。在其它实施例中，向患者施用两次或更多次(例如2、3、4、5、6、7、8次或更多次)第二剂量。同样，在某些实施例中，仅向患者施用单次第三剂量。在其它实施例中，向患者施用两次或更多次(例如2、3、4、5、6、7、8次或更多次)第三剂量。
在涉及多次第二剂量的实施例中，每次第二剂量均可以以与其它第二剂量相同的频率施用。举例来说，每次第二剂量均可以在前一剂量之后1到2周或1到2个月向患者施用。类似地，在涉及多次第三剂量的实施例中，每次第三剂量均可以以与其它第三剂量相同的频率施用。举例来说，每次第三剂量均可以在前一剂量之后2到12周向患者施用。在本发明的某些实施例中，在治疗方案的过程中，向患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以不同。还可以在治疗过程中在临床检查之后由医师根据单独患者的需要来调整施用频率。
抗体的诊断性用途
例如出于诊断目的，本发明的抗CTLA-4抗体可以用于检测和/或测量样品中的CTLA-4。一些实施例设想在用于检测例如癌症、自体免疫疾病或病毒感染的疾病或病症的分析中使用一种或多种本发明抗体。CTLA-4的示范性诊断分析可以包含例如使获自个体(例如患者)的样品与本发明的抗CTLA-4抗体接触，其中抗CTLA-4抗体经可检测标记或报导分子标记或用作用于从个体样品中选择性分离CTLA-4的捕捉配体。或者，未标记的抗CTLA-4抗体可以与自身可检测地标记的二级抗体组合以用于诊断应用中。可检测标记或报导分子可以是放射性同位素，例如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，例如荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate)或若丹明(rhodamine)；或酶，例如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶或荧光素酶。可以用于检测或测量样品中的CTLA-4的特定示范性分析包含酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)和荧光活化细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)。
可以在根据本发明的CTLA-4诊断分析中使用的样品包括在正常条件或病理条件下任何可以从个体获得的含有可检测数量的CTLA-4蛋白质或其片段的组织或流体样品。一般来说，将测量从健康患者(例如，未患癌症或自体免疫疾病的患者)获得的特定样品中的CTLA-4含量以首先建立CTLA-4的基线或标准含量。随后可以比较CTLA-4的这种基线含量与在从疑似患有癌症相关病况或与所述病况相关症状的个体获得的样品中所测量到的CTLA-4含量。
对CTLA-4具有特异性的抗体可以不含额外标记或部分，或其可以含有N端或C端标记或部分。在一个实施例中，标记或部分为生物素。在结合分析中，标记(如果存在)的位置可以决定肽相对于发生肽结合的表面的取向。举例来说，如果表面包覆有抗生物素蛋白，那么含有N端生物素的肽的取向将使得肽的C端部分远离表面。
本发明的方面涉及使用所公开的抗体作为标志物来预测患者的癌症或病毒感染的预后。可以在诊断分析中使用本发明抗体来评估患者的癌症预后和预测存活期。
实例
提出以下实例以便为所属领域的普通技术人员提供如何制造和使用本发明的方法和组合物的完整公开内容和说明，并且以下实例不打算限制本发明人视作本发明之物的范围。关于所用数值(例如量、温度等)，已努力确保准确性，但应当说明存在一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度以摄氏度为单位，室温是约25℃，并且压力处于大气压下或接近大气压。
实例1：产生针对CTLA-4的人类抗体
使用人类CTLA-4蛋白质(目录号：7268-CT，R&D Systems)或编码hCTLA-4的DNA(寄存编号：NM_005214.4)产生针对CTLA-4的人类抗体。如US 8502018B2中所述，向小鼠(即经工程改造包含编码人类免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的小鼠)直接施用免疫原，用佐剂刺激免疫反应。通过CTLA-4特异性免疫分析监测抗体免疫反应。当实现所期望的免疫反应时，收集脾细胞并且使其与小鼠骨髓瘤细胞融合以保留其活力并且形成融合瘤细胞系。对融合瘤细胞系进行筛选和选择以鉴别产生CTLA-4特异性抗体的细胞系。使用这种技术和上述免疫原，获得若干抗CTLA-4嵌合抗体(即，具有人类可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；以此方式从小鼠产生的示范性抗体命名为H1M20370N、H1M20372N、H1M20393N、H2M20361N、H2M20368N、H2M20369N、H2M20373N、H2M20375N、H2M20379N、H2M20385N、H2M20386N和H2M20387N。
如特此以全文引用的方式并入本文中的美国专利7,582,298中所述，还直接从抗原阳性B细胞(从免疫小鼠中的任一者)分离抗CTLA-4抗体而不与骨髓瘤细胞融合。使用此方法，获得若干完全人类抗CTLA-4抗体(即，具有人类可变结构域和人类恒定结构域的抗体)；以此方式产生的示范性抗体命名如下：H1H19264P、H1H19269P、H1H19273P、H1H19274P、H1H19278P、H1H19279P、H1H19280P、H1H19281P、H1H19283P、H1H19284P、H1H19291P、H1H19294P、H1H19303P、H1H19305P、H1H19307P、H1H19312P、H1H19313P、H1H19314P2、H1H19319P2和H1H19327P2。
根据这项实例的方法产生的示范性抗体的生物性质详细描述于下文所阐述的实例中。
实例2：重链和轻链可变区氨基酸和核苷酸序列
表1阐述所选择的本发明的抗CTLA-4抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。对应核酸序列标识符阐述于表2中。
表1：氨基酸序列标识符
表2：核酸序列标识符
抗体在本文中通常根据以下命名法指出：Fc前缀(例如“H1M”、“H4H”等)，接着为数字标识符(例如“19264”、“20370”等，如表1中所示)，接着为“P”、“P2”或“N”后缀。因此，根据此命名法，抗体在本文中可以称作例如“H1M20370N”、“H1H19264P”、“H1H19314P2”等。本文中所用的抗体名称中的H1H前缀表示抗体的特定Fc区同型。举例来说，“H1H”抗体具有人类IgG1 Fc，“H1M”抗体具有小鼠IgG1 Fc，并且“H2M”抗体具有小鼠IgG2 Fc(如由抗体名称中的第一个‘H’所表示，所有可变区都是完全人类的)。如所属领域的普通技术人员应该了解，具有特定Fc同型的抗体可以转换为具有不同Fc同型的抗体(例如，具有小鼠IgG1 Fc的抗体可以转换为具有人类IgG1或人类IgG4等的抗体)，但是在任何情况下，由表1中所示的数字标识符表示的可变结构域(包括CDR)将保持相同，并且期望无论Fc结构域的性质如何，对抗原的结合性质总是相同或实质上相似的。
对照构筑体：
出于比较目的，在以下实验中包括两个对照构筑体(抗CTLA4抗体)：
COMP1：具有有如WO 01/14424A2(Bristol Myers Squibb)中所阐述并且用hIgG1Fc产生的“10D1”的对应结构域的氨基酸序列的重链和轻链可变结构域的人类抗CTLA-4抗体。
COMP2：具有有如US 2014/099325A1(Pfizer)中所阐述并且用hIgG2 Fc产生的“11.2.1”的对应结构域的氨基酸序列的重链和轻链可变结构域的人类抗CTLA-4抗体。
实例3：由表面等离子体共振得出的人类单克隆抗CTLA-4抗体的结合亲和力和动力学常数
人类抗CTLA-4抗体的结合亲和力和动力学常数是通过表面等离子体共振(Biacore 4000(GE,Pittsburgh,PA)或MASS-1(Sierra Sensors,Greenville,RI))在25℃下测定(表3和表4)。将表示为人类IgG1的抗体(即“H1H”)捕捉到通过与单克隆小鼠抗人类Fc抗体(GE)发生胺偶合而衍生化的CM5传感器表面(GE)上。将表示为小鼠IgG1或小鼠IgG2的抗体(即“H1M”、“H2M”)捕捉到通过与多株山羊抗小鼠Fc抗体(GE)发生胺偶合而衍生化的高容量胺传感器表面(Sierra Sensors)上。将各种浓度的经表达具有c端myc-myc-聚组氨酸标签(mmh)的可溶性人类(h)CTLA-4(SEQ ID NO:506)或食蟹猕猴(Macaca fasicularis，mf)CTLA-4(SEQ ID NO:507)蛋白质以30或50微升/分钟的流速注射到捕捉有抗CTLA-4mAb的传感器表面上。CTLA-4是在胞外结构域中在半胱氨酸残基157处通过一个双硫键互连的均二聚体。
所有结合研究均在由0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20构成的缓冲液(HBS-ET操作缓冲液)中进行。监测hCTLA4.mmh或mfCTLA4.mmh与所捕捉的单克隆抗体的缔合持续4或5分钟并且监测hCTLA4.mmh或mfCTLA4.mmh在HBS-ET操作缓冲液中的解离持续10分钟。
动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数是通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件拟合实时传感器图谱与1:1结合模型来测定。由动力学速率常数如下计算结合平衡解离常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：
并且
如表3中所示，本发明的所有抗CTLA-4抗体均与人类CTLA-4结合，许多对hCTLA-4.mmh具有奈摩尔亲和力，并且展现与食蟹猕猴CTLA-4蛋白的交叉反应性。未观测到与小鼠或大鼠CTLA-4蛋白的交叉反应性(数据未示出)。
表3：人类Fc mAb在25℃下的Biacore结合亲和力
*h和mf CTLA-4mmh蛋白质以在3倍稀释液中介于0.37nM到90nM范围内的浓度流过mAb捕捉表面；ND＝未测定
实例4：抗CTLA-4抗体阻断人类CTLA-4与其天然配体B7-1和B7-2之间的相互作用
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)是在常规调节性T细胞上表达的I型跨膜T细胞抑制性检查点受体。CTLA-4通过在与刺激受体CD28竞争与其天然配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)结合的过程中取胜而负调节T细胞活化。在此实例中，使用竞争夹心酶联免疫吸附分析(ELISA)评定抗CTLA-4抗体阻断CTLA-4蛋白质与培养盘结合的(plate-bound)B7-1和B7-2结合的能力。将各种浓度的抗CTLA-4抗体与恒定量的二聚CTLA-4蛋白质预混合并且监测因抗体存在而引起的与培养盘固定的B7-1或B7-2结合的CTLA-4的减少量。
简言之，使用以下程序进行分析：在96孔微量滴定板上在PBS中在4℃下以2μg/mL分别涂布经表达具有c端人类IgG1和6×组氨酸(hIgG1-6×His；R&D Systems,Minneapolis,MN)的人类B7-1和B7-2蛋白隔夜(overnight，ON)。随后使用0.5％(w/v)BSA于PBS中的溶液阻断非特异性结合位点。分别将恒定量的200pM或400pM重组hCTLA-4-mFc蛋白(经表达具有小鼠IgG2a的c端Fc部分的人类CTLA-4胞外结构域，SEQ ID NO:508)添加到经连续稀释的抗CTLA-4抗体或不存在抗体的溶液中。在此实例中，抗CTLA-4抗体剂量介于1.7pM到最大100nM或1.0μM范围内。接着，在室温(room temperature，RT)下1小时之后，将含有200pM恒定浓度的hCTLA-4-mFc蛋白的抗体-蛋白质复合物转移到涂有hB7-1-hIgG1-6His的微量滴定板，并且将含有400pM恒定浓度的hCTLA-4-mFc的抗体-蛋白质复合物转移到涂有hB7-2-hIgG1-6His的培养盘。随后在室温下培育1小时之后，洗涤各孔，并且用与辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)结合的抗小鼠Fcγ片段特异性山羊多株抗体(JacksonImmunoResearch,West Grove,PA)检测培养盘结合的hCTLA-4-mFc。根据制造商说明书使用TMB受质溶液(加利福尼亚州圣何塞的BD生物科学(BD Biosciences,San Jose,CA))使培养盘显影，并且在Victor盘式读取器(PerkinElmerTM,Waltham,MA)上测量450nm处的吸光度。
所有数据分析使用S形剂量-反应模型在PrismTM软件(GraphPad,LaJolla,CA)内进行。如下进行计算：使用定义为hCTLA-4与hB7-1或B7-2的结合减少50％所需的抗体浓度的IC50来指示阻断性能。相对于分析基线而言，在所测试抗体的最大浓度(100nM或1.0μM)下的阻断百分比按抗体分别阻断200pM或400pM的hCTLA-4-mFc与hB7-1或hB7-2结合的能力来计算。含有200pM或400pM的hCTLA-4-mFc的样品在不存在抗体的情况下的结合信号标记为100％结合或0％阻断；并且不含hCTLA-4-mFc或抗体的样品缓冲液的基线信号标记为0％结合或100％阻断。
如表4中的结果所示，本发明的抗CTLA-4抗体展现广泛范围的阻断人类CTLA-4与其天然配体B7-1或B7-2结合的能力。示范性抗体H1H19273P和H1H19313P以皮摩尔IC50值并且以约100％的阻断百分比在1.0μM最大抗体浓度下有效地阻断CTLA-4与B7-1或B7-2的结合。例如H1H20373N的若干抗体对CTLA-4与B7-2结合的阻断强于对与B7-1结合的阻断，而一些抗体显示对任一种配体的阻断能力均极小(H1H19314P2)。
表4：抗CTLA-4抗体阻断hCTLA-4与配体hB7-1或hB7-2的结合
负最大阻断％(即-8)表示在抗体存在下所检测到的hCTLA-4结合的增加量。(-)表示在所测试的最高浓度下阻断<50％的抗体的不定量IC50值。
(INC)：不确定：未用PrismTM软件拟合S形结合曲线来计算IC50值。
(*)表示低于分析的理论下限(关于hCTLA-4与hB7-1/CD80的结合，是0.1×10-09M；或关于hCTLA-4与hB7-2/CD86的结合，是0.2×1009M)的IC50值
实例5：抗CTLA-4抗体展现与人类CTLA-4工程改造细胞系的特异性且有效性结合
在这项实例中，使用基于电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)的检测测定抗人类(h)CTLA-4抗体与表达人类CTLA-4的细胞系特异性结合的能力。
简言之，用人类CTLA-4(氨基酸M1-N223，NCBI寄存编号NM_005214.4)稳定地转染从小鼠分离的小鼠胚胎成纤维细胞(VI-成纤维细胞)。未经转染的VI-成纤维细胞不具有可以通过荧光活化细胞分选(FACS)检测的CTLA-4表达并且包括所述细胞作为结合对照。另外，还在此分析中评定通过用NFAT-Luc慢病毒报导子(Qiagen,Germantown,MD)和h、m或mfCTLA-4嵌合构筑体转导永生化人类Jurkat T细胞(ATCC,Manassas,VA)产生的报导T细胞系。嵌合构筑体包含与hCD300a(aa 181-299；寄存编号NP_009192.2)的跨膜结构域和细胞质结构域融合的hCTLA-4(aa 1-161；寄存编号NP_005205.2)、小鼠CTLA-4(ms CTLA-4，氨基酸1-161，寄存编号NM_009843.4)或mf CTLA-4(aa1-161；寄存编号XP_005574071.1)的胞外结构域。
将约2.0×104个VI-成纤维细胞/hCTLA-4细胞或1.0×104个Jurkat/NFAT嵌合体细胞分别接种到96孔碳电极培养盘(MULTI-ARRAY高结合培养盘，Meso Scale Discovery(MSD；Rockville,MD))上并且在37℃下培育1小时(h)。通过PBS中的2％BSA(w/v)在室温(RT)下阻断非特异性结合位点1小时。在室温下，向培养盘结合的细胞中添加抗CTLA-4或同型对照抗体的介于1.7pM到150nM范围内的连续稀释液或不含抗体的缓冲液，持续1小时。随后使用具有细胞洗涤头的AquaMax2000培养盘洗涤器(MDS Analytical Technologies,Sunnyvale,CA)洗涤培养盘以去除未结合的抗体。在室温下，用特异性针对重链和轻链的SULFO-TAGTM结合的山羊多株抗人类IgG抗体(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)或特异性针对Fcγ片段的SULFO-TAGTM结合的山羊多株抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoresearch)检测培养盘结合的抗体1小时。
在洗涤之后，根据制造商推荐程序用Read Buffer(MSD)使培养盘显影并且用SECTOR Imager 600(MSD)记录发光信号。记录按相对光单位(relative light unit，RLU)计量的发光强度以指示每个抗体在所述浓度范围下的结合强度。报导用0.4nM或0.6nM抗体与CTLA-4工程改造细胞的结合所检测到的信号与在相同浓度下的亲本细胞相比的比率作为CTLA-4结合特异性的指示。
另外，分析直接结合信号(RLU)随抗体浓度的变化并且使用GraphPad PrismTM软件(GraphPad,LaJolla,CA)用S形(四参数逻辑)剂量-反应模型拟合数据。测定定义为检测到最大结合信号的50％时的抗体浓度的EC50值以指示与CTLA-4工程改造细胞的结合性能。
如表5中的结果所示，本发明的大部分抗CTLA-4抗体与hCTLA-4工程改造细胞系特异性结合。例如H1H19303P和H1H19280P的若干示范性抗体以皮摩尔EC50值并且以比与对照细胞系的结合高出20到23倍的比率结合。
进一步评定一系列抗体与小鼠和食蟹猕猴工程改造细胞系的交叉反应性。如表6中的结果所示，抗CTLA-4抗体H1H19303P、H1H19273P、H1H19319P2和H1H19319P以皮摩尔EC50值与Jurkat/NFAT Luc/人类和食蟹猕猴CTLA-4/hCD300嵌合体细胞系有效地结合。未观测到与小鼠CTLA-4嵌合体细胞的交叉反应性。
表5：抗CTLA-4抗体与经工程改造以表达人类CTLA-4的细胞系特异性结合
NB＝非结合子；将结合比率小于3的抗体归类为非结合子(*)排除最高的两个抗体浓度的RLU值来计算EC50值。
INC＝不确定，GraphPad PrismTM不能拟合4参数S形曲线进行EC50值计算，但是抗体以比亲本细胞高出3倍或更多倍的比率与CTLA-4表达细胞特异性结合。
表6：所选择的抗CTLA-4抗体展现与经工程改造的Jurkat人类和猴细胞系的结合的特异性
猴＝食蟹猕猴。
NB＝非结合子；将结合比率小于3的抗体归类为非结合子(*)排除最高的两个抗体浓度的RLU值来计算EC50值。
INC＝不确定，GraphPad PrismTM不能拟合4参数S形曲线进行EC50值计算，但是抗体以比亲本细胞高出3倍或更多倍的比率与CTLA-4表达细胞特异性结合。
实例6：抗CTLA-4抗体在经工程改造的报导T细胞/APC生物分析系统中诱导T细胞活化
在这项实例中，开发基于T细胞/抗原呈递细胞(APC)的荧光素酶报导生物分析来评估阻断CTLA-4/CD80或CTLA-4/CD86相互作用的作用和T细胞活化。在一种生物分析型式中，通过测量荧光素酶活性来评定施用抗CTLA-4抗体对T细胞/APC系统的影响。在第二分析中，评定抗CTLA-4抗体诱导介白素(IL)-2释放的能力。
如以上实例中所述，在这项实例中测试的抗CTLA-4抗体经由表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)证实与人类和食蟹猕猴(cynomolgus monkey/Macacafasciularis)CTLA-4的结合并且展现与经工程改造以表达人类CTLA-4的细胞系的特异性且有效性结合。此些所选CTLA-4抗体先前还显示阻断CTLA-4与B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的结合。
背景
T细胞活化是通过刺激T细胞受体(TCR)来实现，所述T细胞受体识别抗原呈递细胞(APC)上由I类或II类主要组织相容性复合体(MHCI或MHCII)蛋白质呈递的特异性肽(Goldrath等人1999)。经活化TCR继而引发信号传导事件的级联，所述信号传导事件可以通过报导基因来监测，由例如活化蛋白1(AP-1)、活化T细胞核因子(NFAT)或核因子活化B细胞κ轻链增强子(NFκB)的各种转录因子驱动。随后经由在T细胞上组成性或诱导性表达的辅受体的参与来进一步改进T细胞反应，所述辅受体例如CD28、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)或其它分子(Sharpe等人2002)。辅受体CD28和CTLA-4竞争在抗原呈递细胞(APC)上表达的相同配体CD80和CD86，CTLA-4对所述配体的亲和力比CD28高。CTLA-4充当诱饵并且通过与配体隔离，引起T细胞活化减弱来抑制CD28的活化。(Alegre等人2001和Walker等人2011)。
NFAT-荧光素酶活性
细胞系工程改造：通过根据制造商说明书用NFAT-Luc慢病毒报导子(Qiagen,Rockville,MD)转导在细胞表面上内源性表达TCR和CD28的永生化人类Jurkat T细胞(ATCC)来对报导T细胞进行工程改造。慢病毒在最小细胞巨大病毒(Cytomegalovirus，CMV)启动子和NFAT转录反应元件(transcriptional response element，TRE)的纵排重复序列和嘌呤霉素抗性基因的控制下编码萤火虫荧光素酶基因。
在抗生素选择和单一克隆之后，用编码人类(h)或猴(mf-食蟹猕猴)CTLA-4嵌合蛋白的慢病毒转导Jurkat/NFAT-Luc克隆系3C7(Jurkat/NFAT-Luc cl.3C7)。嵌合构筑体包含与hCD300a(aa 181-299；寄存编号NP_009192.2)的跨膜结构域和细胞质结构域融合的hCTLA-4(aa 1-161；寄存编号NP_005205.2)或mfCTLA-4(aa 1-161；寄存编号XP_005574071.1)的胞外结构域。CD300a发现于免疫细胞上并且经由其基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immuno-receptor tyrosine based inhibition motif，ITIM)传输抑制信号(DeBell等人2012)。选择所得稳定T细胞系Jurkat/NFAT-Luc/hCTLA-4-hCD300a和Jurkat/NFAT-Luc/mfCTLA-4-hCD300a并且将其维持在补充有500μg/mL G418和1μg/mL嘌呤霉素的RPMI+10％FBS+青霉素(penicillin)+链霉素(streptomycin)+谷氨酰胺中。
使用内源性表达CD20、Fcγ受体(FcγR)、细胞表面上的CD80和CD86的人类Raji B细胞(ATCC，Manassas,VA)作为基于荧光素酶的生物分析中的APC细胞。将Raji细胞维持在补充有HEPES和丙酮酸钠的RPMI+10％FBS+青霉素+链霉素+谷氨酰胺中。
T细胞/APC刺激：经由活化T细胞的抗CD20×CD3双特异性抗体(REGN2281)刺激报导T细胞，所述双特异性抗体靶向在Jurkat T细胞上表达的CD3和Raji B细胞上的CD20。REGN2281的双特异性结合模式引起Jurkat/NFAT-Luc T细胞中的NFAT偶合的报导基因、荧光素酶增加。
然而在Jurkat/NFAT-Luc/CTLA-hCD300a嵌合体细胞中，REGN2281对报导基因的最大活化因为通过CTLA-4-hCD300a嵌合受体与其在Raji细胞上表达的配体CD80/CD86的相互作用所传递的抑制性信号传导而减弱。在此生物分析中，阻断CTLA-4/CD80和CD86轴的抗CTLA-4抗体理论上将通过停用经由嵌合CTLA-4蛋白质的CD300a尾部递送的抑制信号来拯救Jurkat报导细胞中的NFAT-Luc活性。
在此分析型式中，抗CTLA-4抗体可以在Jurkat中同时诱导促效性信号，通过将抗体Fc锚定于Raji细胞上的FcγR而触发。用饱和量的IgG分子或FcγR特异性抗体阻断FcγR可以减轻CTLA-4抗体的促效作用。因此，在分析中包括Fc阻断步骤以抑制CTLA-4mab与Raji细胞上的FcγR的结合。
荧光素酶分析：在筛选之前24小时，在分析培养基(RPMI1640，补充有10％FBS和青霉素+链霉素+谷氨酰胺(PSG))中培养5×105个报导T细胞和7.5×105个Raji APC。第二天，在用以占用Raji细胞上的内源性FcγRIIb受体的100pM REGN2281和10nM Fc阻断或10nM人类IgG4同型对照存在的情况下，测试抗CTLA-4抗体和同型匹配阴性对照(经1:3连续稀释；15pM到100nM剂量范围)。向含有固定浓度的100pM REGN2281/10nM Fc阻断或100pMREGN2281/10nM hIgG4同型对照的96孔白色平底培养盘(Nunc/Thermo Fisher,Pittsburgh,PA)中的对应孔中添加经连续稀释的抗体。将报导T细胞和Raji APC以2×106/mL再悬浮并且首先以5×104个细胞/孔的最终浓度向培养盘中添加T细胞。将培养盘在37℃/5％CO2下培育15-30分钟，随后以5×104个细胞/孔的最终浓度添加Raji细胞。将样品在37℃/5％CO2下再培育4-6小时，随后添加100μL ONE-GloTM(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格(Promega,Madison WI))以检测NFAT-Luc活性。在多标记盘式读取器Victor(麻萨诸塞州沃尔瑟姆的珀金埃尔默(PerkinElmer,Waltham,MA))上捕捉所发射的光，以相对光单位(RLU)计。所有连续稀释液一式两份地测试。
使用GraphPad Prism软件(GraphPad,La Jolla,CA)由四参数逻辑方程式在10点剂量-反应曲线上测定CTLA-4抗体的EC50值。通过将每个样品的相对RLU值针对设为1的不含CTLA-4抗体的样品的平均值标准化来计算诱导倍数。
结果：如表7中所记录，当在REGN2281+/-Fc阻断存在的情况下，向亲本Jurkat/NFAT-Luc cl 3C7细胞加Raji APC中添加抗CTLA-4抗体时，未观测到报导基因活性(荧光素酶)增加。然而，当在REGN2281+/-Fc阻断存在的情况下，向Jurkat/NFAT-Luc/h和mf CTLA-4/hCD300嵌合体细胞系/Raji APC系统中添加抗CTLA-4抗体时，记录下增加的荧光素酶活性。在此生物分析型式中，抗CTLA-4抗体阻断Jurkat报导细胞上的CTLA-4与在Raji细胞上内源性表达的CD80/CD86的相互作用，引起荧光素酶蛋白质的诱导。在此分析中测试的抗CTLA-4抗体增加荧光素酶活性，并且在Fc阻断存在的情况下观测到最大值，EC50介于1.77nM到7.67nM范围内。如表7中所示，H1H19303P的表达比所测试的比较物1和2更好。
CTLA-4T细胞/APC人类介白素2(hIL-2)释放分析
细胞系工程改造：用编码hCTLA-4全长蛋白的内部制造的慢病毒sup(寄存编号NP_005205.2)转导Jurkat/NFAT-Luc克隆系3C7(如上所述)。通过流动式细胞测量术分选所得稳定T细胞系(Jurkat/NFAT-Luc/hCTLA-4wt)中的高表达者并且将其维持在补充有500μg/mL G418和1μg/mL嘌呤霉素的RPMI+10％FBS+PSG中。
人类胚胎肾(Human Embryonic Kidney，HEK)293细胞(ATCC)经人类CD20转染并且用于经慢病毒sup转导以过度表达其间具有4×G4S连接子的与绿色荧光蛋白(GFP；aa 2-240；寄存编号WP_031943942.1)融合的hCD80(aa1-288；寄存编号NP_005182.1)或hCD86(aa1-329；寄存编号NP_787058.4)。在通过限制稀释法进行单一克隆之后，产生以下所得克隆系：HEK293/hCD20/hCD80-GFP克隆1F4和HEK293/hCD20/hCD86-GFP克隆4G5。将细胞系维持在补充有500μg/mL G418的DME+10％FBS+PSG+非必需氨基酸(NEAA，Irvine Scientific,Santa Ana,CA)中。
T细胞/APC刺激：如上所述，经由活化T细胞的双特异性抗体REGN2281刺激经工程改造的T细胞。REGN2281与CD3的结合引起与TCR复合的CD3亚单元簇聚并且活化T细胞，所述T细胞继而释放hIL-2。IL-2的释放可以进一步通过CD28与其位于经工程改造的HEK293细胞上的配体CD80或CD86的相互作用来确定。Jurkat/NFAT-Luc/hCTLA-4细胞的最大活化因为CTLA-4与CD28竞争HEK293细胞上的配体CD80/CD86的结合而减弱(Carreno等人2000)。
在此生物分析中，阻断CTLA-4/CD80或CD86相互作用的抗体将通过停用抑制性CTLA-4臂而拯救经工程改造的Jurkat细胞中的IL-2释放。
IL-2释放分析：在筛选之前24小时，在分析培养基(RPMI1640+10％FBS+PSG)中将经工程改造的T细胞培养到5×105个细胞/毫升。第二天，将HEK293细胞用D-PBS(IrvineScientific)洗涤，用胰蛋白酶(Specialty Media)分离并且用分析培养基阻断。接着，在37℃/5％CO2下，用含有50μg/mL丝裂霉素C的分析培养基处理HEK293细胞以抑制细胞生长，持续1小时。随后用分析培养基彻底洗涤细胞以去除游离的丝裂霉素C。
在存在介于15pM到100nM范围内的10点稀释的情况下，在分析培养基中1:3连续稀释抗CTLA-4抗体和其同型对照。将经连续稀释的抗体添加到含有固定浓度的300pMREGN2281的96孔圆底培养盘(Nunc)中的对应孔中。将报导T细胞以1×105个细胞/孔的最终浓度添加到培养盘中。将培养盘在37℃/5％CO2下培育15-30分钟，随后以2.5×103个细胞/孔的最终浓度添加HEK293细胞。将培养盘在37℃/5％CO2下培育72小时，收集上清液并且使用上清液进行IL-2测量。根据制造商方案使用AlphaLISA套组(PerkinElmer)测量IL-2含量。在多标记盘式读取器Envision(PerkinElmer)上获得测量结果。所有连续稀释液一式两份地测试。
使用GraphPad Prism由四参数逻辑方程式在10点剂量-反应曲线上测定CTLA-4mAb的EC50值。通过将每个样品的相对IL-2值针对不含抗CTLA-4抗体的样品标准化来计算诱导倍数。表9显示在100nM下达到的诱导倍数和在hIL-2释放分析中达到的EC50计算值。
结果：如表8中的结果所示，在此分析中测试的抗CTLA-4抗体在Jurkat/NFAT-Luc/CTLA-4嵌合体//Raji APC系统中诱导IL-2产生。在100nM浓度下，抗CTLA-4抗体以在比使用CTLA-4阴性报导T细胞在分析系统中观测到的活性倍数高出4到6倍范围内的活性倍数诱导IL-2产生。如表8中所示，H1H19303P的表达比所测试的比较物1和2更好。
总结
总而言之，在设计成用于评定抗体对T细胞活化的活性的两个工程改造T细胞/APC生物分析系统中测试所选择的抗CTLA-4抗体。在一种型式中，如通过NFAT-荧光素酶活性增加所测量，抗CTLA-4抗体活化T细胞，指示抗体阻断CTLA-4与配体CD80和CD86之间的相互作用。在第二型式中，抗CTLA-4抗体诱导IL-2的产生，指示抗CTLA-4抗体可以阻断CTLA-4/CD80和CTLA-4/CD86相互作用，从而拯救IL-2释放。
表7：CTLA-4T细胞/APC荧光素酶分析中CTLA-4mab的EC50
(-)指示EC50值不能由拟合曲线测定
表8：在100nM CTLA-4mab下的诱导倍数和CTLA-4T细胞/APC IL-2释放分析中CTLA-4mab的EC50
(-)指示EC50值不能由拟合曲线测定
实例7：抗CTLA-4抗体对肿瘤的功效
这项实例描述本发明的示范性抗CTLA-4抗体对在CTLA-4基因人类化的小鼠中生长的MC38.Ova肿瘤的抗肿瘤功效。
在C57BL/6菌株背景下，使用VelociGeneTM技术对人类CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠进行工程改造，其中小鼠表达包含与来自内源性Ctla4基因座的小鼠CTLA-4跨膜结构域和细胞质结构域融合的人类CTLA-4胞外结构域的嵌合蛋白(Valenzuela等人2003；《自然－生物技术》21:652-659)。通过MC38细胞的稳定慢病毒转导对MC38.Ova细胞系进行工程改造以表达跨膜鸡卵白蛋白抗原(Ova)。
研究(A)
CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠在第0天皮下植入(SC)MC38.Ova细胞(106个细胞/只小鼠)并且在第3天、第7天、第10天、第14天和第17天腹膜内接受10mg/kgH1H19273P或H1H19303P或H1H19319，或10mg/kghIgG1同型对照。监测肿瘤体积和无肿瘤动物长达37天。
以10mg/kg测试的所有三种抗CTLA-4抗体相比于用同型对照治疗展现部分肿瘤生长抑制(图1)。截止第24天，用H1H19303P进行的治疗引起10mg/kg剂量组中8/9(89％)小鼠无肿瘤(图2)。用H1H19319P或H1H19273P进行的治疗具有相似效果，截止第24天，分别在7/9小鼠(78％)和5/9小鼠(56％)中引起完全肿瘤生长抑制。在第24天，同型对照治疗组中没有动物不含肿瘤。在第24天，相比于施用同型对照的组，每个抗CTLA-4抗体治疗组的肿瘤体积显著较小(p<0.0001)。
对在第24天观测到无肿瘤的小鼠在植入后监测37天。相比于施用同型对照的小鼠，经抗人类CTLA-4抗体中的任一者治疗的小鼠的存活率显著较高(p<0.0001)(图3)。在抗CTLA-4抗体组的所有无肿瘤小鼠中均未观测到肿瘤复发。未观测到因抗体治疗而导致体重减轻的迹象。
总而言之，用三种抗人类CTLA-4抗体(H1H19273P、H1H19303P和H1H19319)中的每一者进行的治疗相比于同型对照引起肿瘤生长减少、肿瘤清除率提高和存活期延长。在这个模型中，三种抗人类CTLA-4抗体各自的功效相当。
研究(B)
用于这项研究的示范性抗CTLA-4抗体是与人类CTLA-4特异性结合并且包含SEQID NO:196-198-200-204-206-208的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3和SEQ IDNo:194/202的HCVR/LCVR的完全人类抗体(也称为H1H19303P)。H1H19303P(也称为REGN4659)的全长重链氨基酸序列显示于SEQ ID NO:509中，并且H1H19303P的全长轻链氨基酸序列显示于SEQ ID NO:510中(表9)。
表9：H1H19303P的氨基酸序列
*加底线序列是可变区
施用抗CTLA-4抗体并分析其抗肿瘤活性
在携带MC38.Ova肿瘤的CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠中测试不同剂量的H1H19303P的抗肿瘤活性。包括hIgG1同型对照作为阴性对照。CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠在第0天在后侧腹中皮下植入1×106个MC38.Ova细胞并且分成四个治疗组(表10)。在第3天、第6天、第9天、第13天和第16天，向小鼠腹膜内施用H1H19303P或hIgG1同型对照。每周通过卡尺测量肿瘤体积两次，持续37天。在第37天或在以下终点用CO2处死携带肿瘤的小鼠：肿瘤体积>2000mm3或肿瘤溃疡。跟踪无肿瘤小鼠长达107天以进行存活研究。
表10：针对植入有MC38.Ova细胞的CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠的功效研究的给药方案
a 通过ELISA分析血清样品的抗体含量。分析10 mg/kg H1H19303P和hIgG1对照组在第6天、第13天和第20天收集的样品，并且分析H1H19303P的2mg/kg和5mg/kg剂量组在第6天和第20天收集的样品。
在实验开始前两天(第-2天)和在第6天、第13天和第20天施用抗体前两小时从颌下静脉收集血液样品。冷冻并且存储血清样品以进行血清抗体含量的后续测量。
使用GraphPad Prism软件(版本6)进行统计分析。通过单因素方差分析与邓尼特多重比较事后检定确定动物组之间的肿瘤体积差异的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检定确定无肿瘤存活期的统计显著性。为确定每个组是否显著地不同于对照组，使用庞费洛尼法(Bonferroni method)以针对比较数目(k＝6)调整的显著水准(α＝0.05)进行两组Mantel-Cox分析(α经调整＝0.05/6)。
总人类IgG抗体的血清浓度
使用专用于人类Fcγ检测的夹心ELISA测定总H1H19303P和hIgG1同型对照抗体的血清浓度。分析10mg/kg H1H19303P和hIgG1对照组在第6天、第13天和第20天收集的血清样品，并且分析H1H19303P的2mg/kg和5mg/kg剂量组在第6天和第20天收集的样品。简言之，使PBS中的1μg/mL山羊抗人类Fcγ多株抗体在4℃下被动吸附到微量滴定板隔夜，随后用PBS中的5％BSA进行非特异性结合阻断。这项分析中用于校准的标准物是浓度介于2.7到350ng/mL范围内(1:2连续稀释液)的H1H19303P或同型对照抗体。在稀释缓冲液(含0.5％BSA的PBS)中制备标准物和血清样品的连续稀释液。随后将样品添加到涂有抗hFcγ的培养盘(100微升/孔)并且在室温下培育1小时。随后，使用稀释缓冲液中的160ng/mL的HRP结合的抗hFcγ多株抗体检测培养盘捕捉的人类IgG抗体。使用显色HRP-受质3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)检测HRP活性，并且在Perkin Elmer Victor X4多模式盘式读取器上读取所得OD450。用于校准的标准物(H1H19303P或同型对照抗体)的最低浓度(2.7ng/mL)介于分析的动态范围内并且定义为此分析的LLOQ。通过非线性回归使用GraphPad Prism软件分析数据。使用2个复制实验的平均浓度进行分析。
小鼠抗人类抗体的血清浓度
使用专用于所注射抗体中的每一者的检测的夹心ELISA测定抗H1H19303P或抗IgG1对照抗体小鼠IgG效价。分析10mg/kg H1H19303P和hIgG1对照组在第6天、第13天和第20天收集的血清样品，并且分析H1H19303P的2mg/kg和5mg/kg剂量组在第6天和第20天收集的样品。简言之，使PBS中的1μg/mL的H1H19303P或抗IgG1对照抗体在4℃下被动吸附到微量滴定板隔夜，随后用PBS中的5％牛血清白蛋白(BSA)进行非特异性结合阻断。在稀释缓冲液(含0.5％BSA的PBS)中以1:500开始制备血清样品的连续稀释液。因此，对应稀释因数(500)定义为分析的检测下限(lower limit of detection，LOD)。随后将样品添加到涂有H1H19303P或抗IgG1对照抗体的培养盘(100微升/孔)中并且在4℃下培育16-18小时。包括仅添加稀释缓冲液的孔以测定分析背景。随后，以40ng/mL使用辣根过氧化酶(HRP)结合的山羊抗小鼠Fcγ多株抗体来检测培养盘捕捉的小鼠IgG。使用显色HRP-受质TMB检测HRP活性，并且在Perkin Elmer Victor X4多模式盘式读取器上读取450nm下的所得光密度(OD450)。通过非线性回归使用GraphPad Prism软件分析结合信号对比稀释因数的数据，并且计算效价。MAHA效价定义为对应于同等于分析背景信号两倍的结合信号的血清样品的计算稀释因数。
结果
CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠在第0天皮下植入MC38.Ova细胞并且在第3天、第6天、第9天、第13天和第16天腹膜内接受2、5或10mg/kg的H1H19303P或10mg/kg的hIgG1同型对照。监测肿瘤体积持续37天，并且监测无肿瘤动物长达107天。
在所有测试剂量下，H1H19303P相比于用同型对照进行的治疗显示出部分肿瘤生长抑制(图4)。截止第20天，用H1H19303P进行的治疗引起5mg/kg和10mg/kg剂量组中5/8(63％)小鼠无肿瘤和2mg/kg剂量组中2/8(25％)小鼠无肿瘤。在第20天，相比于施用同型对照的组，H1H19303P治疗组的肿瘤体积显著较小(p<0.0001)(图5)。
对在第20天观测到无肿瘤的小鼠在植入后监测长达107天。经H1H19303P治疗的小鼠相比于施用同型对照的小鼠而言存活率显著较高(p<0.0001)(图6)。在所有剂量组中24/25无肿瘤小鼠中均未观测到肿瘤复发。未观测到因抗体治疗而导致的体重减轻的迹象。
总而言之，用H1H19303P进行的预防性治疗相比于同型对照显著地以剂量依赖性方式减少肿瘤生长，提高肿瘤清除率并且延长存活期。
通过ELISA评估血清抗体浓度和MAHA
使用ELISA分析在第6天、第13天和第20天收集的血清样品中H1H19303P和同型对照的浓度以及MAHA效价。使用专用于人类IgG检测的夹心ELISA测定血清中的H1H19303P和hIgG1同型对照抗体的浓度(图7)。使用专用于每个抗体的检测的夹心ELISA测定H1H19303P或IgG1对照抗体的特异性小鼠IgG效价(图8)。
在第6天，检测所有测试剂量下血清中的H1H19303P和同型对照，其中10、5和2mg/kg剂量的H1H19303P所观测到的平均血清浓度分别是39.8±24、33.5±8.9和10.4±2.9(表11)。
表11：H1H19303P和同型对照的血清浓度
a所示数据是平均血清浓度与标准差。
NT：未测试；LLOQ：定量下限
表12：小鼠抗H1H19303P和抗同型对照抗体的平均效价
a所示数据是平均效价与标准差。
NT：未测试；LOD：检测极限
在第6天之后，观测到尽管在第6天、第9天、第13天和第16天额外施用抗体，但是截止第20天，H1H19303P的所有剂量组的血清浓度均降低(表11)。相比于同型对照而言，10mg/kg剂量组观测到快速抗体清除率。H1H19303P的血清浓度降低可能是因为MAHA的发展导致(图8，表12)。观测所有剂量的H1H19303P在第6天后的所有时间点测量的MAHA效价。然而，同型对照的MAHA效价在所有测试时间点都处于检测极限。
结论
相比于hIgG1对照，以10mg/kg、5mg/kg或2mg/kg的剂量腹膜内施用H1H19303P在植入有MC38.Ova肿瘤细胞的CTLA-4hum/hum基因敲入小鼠中引起肿瘤生长减少、肿瘤清除率提高并且存活期延长。H1H19303P的血清浓度随时间推移而降低，与在第6天后的时间点抗H1H19303P MAHA的发展相符。
实例8：抗小鼠CTLA-4抗体与抗人类PD-1抗体(REGN2810)的组合治疗在携带MC38.Ova肿瘤的PD-1hum/hum基因敲入小鼠中的功效
这项实例描述抗CTLA-4抗体与抗PD-1抗体组合在PD-1基因人类化的小鼠中的抗肿瘤功效。在这项研究中所用的抗PD-1抗体是REGN2810(也称为测米匹单抗)，并且在美国专利9,987,500中描述为H4H7798N。PD-1hum/hum基因敲入小鼠在美国专利申请公开US2015/0203579中已有所描述。
向PD-1hum/hum基因敲入小鼠皮下植入MC38.Ova细胞(5×105个细胞/只小鼠)。当平均肿瘤尺寸达到100mm3(处理第0天)时，将小鼠随机分成4个治疗组。在第0天、第3天、第7天、第10天和第14天，向小鼠腹膜内施用10mg/kg同型对照抗体、抗小鼠CTLA-4-mIgG2a抗体(克隆9D9)、抗人类PD-1抗体(REGN2810)或抗小鼠CTLA-4与抗人类PD-1抗体的组合(10mg/kg+10mg/kg)。监测肿瘤体积和无肿瘤动物长达22天。通过每周进行两次卡尺测量持续22天来监测肿瘤体积。抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体的单一疗法在所测试的10mg/kg下相比于用同型对照进行的治疗显示出部分肿瘤生长抑制(图9)。使用在治疗开始后第10天的单独肿瘤体积(图10)进行统计分析，因为这是研究中所有组中的所有动物均存活的最后一个时间点。通过单因素方差分析与邓尼特多重比较事后检定(**p<0.01，****p<0.0001)来确定统计显著性。抗CTLA-4与抗PD-1抗体处理的组合相比于任一抗体的单一疗法产生更有效的肿瘤生长抑制，其中在第10天，组合治疗组中的肿瘤在统计学上显著小于抗PD-1治疗组中的肿瘤(****p<0.0001，图10)。截止第22天，抗CTLA-4治疗组中八分之一的动物和组合治疗组中八分之二的动物变得无肿瘤。用抗CTLA-4与抗PD-1抗体的组合进行的治疗相比于对照组也在动物存活率方面产生显著差异(Mantel-Cox检定，****p<0.0001，图11)。未观测到因抗体治疗而导致的体重减轻的迹象。
总而言之，用抗mCTLA-4抗体与抗PD-1抗体(REGN2810)的组合进行的治疗相比于任一抗体的单一疗法引起肿瘤生长减少和存活期延长。
实例9：REGN4659治疗在已建立的MC38.Ova肿瘤模型中在人类CTLA-4hum/hum小鼠中的抗肿瘤功效
实验设计
在第0天，向六十只CTLA-4hum/hum小鼠的侧腹中皮下植入5×105个MC38.Ova细胞。在第10天，选择三十只平均肿瘤体积是100mm3的小鼠并且将其随机分成3个治疗组(N＝10/组)。在第10天、第13天和第17天，如下给药小鼠抗体：第1组，hIgG1同型对照Ab(REGN1932)，25mg/kg；第2组，抗hCTLA-4Ab(REGN4659；H1H19303P)，25mg/kg；第3组，抗hCTLA-4Ab(REGN4659；H1H19303P)，10mg/kg。
通过腹膜内注射施用所有抗体。在实验持续期内(27天)，通过进行卡尺测量来监测肿瘤体积。
结果
已建立的MC38.Ova肿瘤的REGN4569治疗引起部分肿瘤生长抑制(图12)。
REGN4659单一疗法的两种剂量10mg/kg和25mg/kg在减少肿瘤生长方面的有效性相似(图13)。
单因素方差分析(ANOVA)与图基多重比较事后检定(Tukey′s multiplecomparison post-test)揭露，在第21天，即所有治疗组中的动物全都活着的最后一天，每个REGN4569单一疗法组与hIgG1同型对照组之间的平均肿瘤体积存在显著差异(p<0.05)(图13)。
实例10：在REGN4659治疗CTLA-4hum/hum小鼠中的已建立的皮下MC38.Ova肿瘤之后瘤内和周边T细胞的分析
实验设计
在第0天，向四十只CTLA-4hum/hum小鼠的侧腹中皮下植入5×105个MC38.Ova细胞。在第10天，选择二十只平均肿瘤体积是100mm3的小鼠并且将其随机分成2个治疗组(N＝10/组)。在第10天和第13天，如下给药小鼠抗体：第1组，hIgG1同型对照Ab(REGN1932)，25mg/kg；第2组，抗hCTLA-4Ab(REGN4659；H1H19303P)，25mg/kg。通过腹膜内注射施用所有抗体。通过卡尺测量来监测肿瘤体积。在第17天，当肿瘤在hIgG1组中达到355+/-35mm3(平均值+/-SEM)并且在REGN4659治疗组中达到180+/-43mm3(平均值+/-SEM)时，处死所有小鼠。收集肿瘤和脾脏以便通过流动式细胞测量术进行淋巴细胞分析。制备肿瘤和脾脏的单细胞悬浮液。用阻断Fc与FcgRIIb和FcgRIII结合的24G.2(Bioxcell)治疗细胞，并且随后用LIVE/DEADTM可固定Aqua死细胞染料(Invitrogen)对其进行活力染色，并且随后用针对CD45(克隆30-F11；Biolegend)、C90.2(克隆30-H12；Biolegend)、CD8(克隆53-6.7；Biolegend)、CD4(GK1.5；Biolegend)、CD11b(克隆M1/70；Biolegend)和人类CTLA-4(克隆BNI3，BD)的抗体的混合物对其进行染色。关于细胞内染色，将样品固定，渗透并且用针对FoxP3(克隆FJK-16s，Invitrogen)和人类CTLA-4的抗体进行染色。随后在FACS Canto流式细胞仪(BD)上分析样品。
结果
在植入和REGN4659抗体治疗后第17天分析携带MC38.Ova肿瘤的小鼠的肿瘤和脾脏中的T细胞亚群。肿瘤位点和脾脏周边的Teff和Treg群体的评定结果显示，具有hIgG1同型(SEQ ID NO:509是H1H19303P的全长重链氨基酸序列，也称为REGN4659)的REGN4659介导正好施用两次治疗性抗体后携带MC38.Ova肿瘤的CTLA-4hum/hum小鼠中的肿瘤位点中的Treg减少(表12)。观测到肿瘤位点处的CD4+效应细胞和CD8+细胞扩增，而用REGN4659进行的治疗引起脾脏中的Treg扩增。此些数据显示，在MC38.Ova肿瘤模型中在CTLA-4hum/hum小鼠中，REGN4659通过选择性减少瘤内Treg且活化瘤内效应T细胞来促进抗肿瘤活性。相比于脾Treg或T效应细胞，REGN4659对瘤内Treg数目的不同结果可能是因为CTLA-4表达量的差异引起。为回答这个问题，通过FACS测量hIgG1对照治疗组的T细胞上的CTLA-4表达量(表面和细胞内)。瘤内Treg上的总CTLA-4的表达比瘤内CD8+和CD4+效应细胞上高出约3倍并且比来自脾脏的Treg上高出约8倍(图14)。假定具有人类IgG1恒定区的抗体对鼠类Fcg受体具有高结合亲和力，这种表达差异可以解释FcgR依赖性机制所造成的肿瘤Treg的选择性损失。
表13：用REGN4659进行的CTLA-4阻断扩增瘤内CD4+效应细胞和CD8+细胞，但减少Treg。
表13显示作为CD4+FoxP3-(CD4+效应子)的CD45+细胞的百分比、作为CD8+的CD45+的百分比和作为FoxP3+(CD4+Treg)的CD4+细胞的百分比。未配对T检定分析揭露，在REGN4659组与同型对照治疗组之间，在肿瘤中的CD4+效应子、CD8+、CD4+Treg和脾脏中的CD4+效应子和CD4+ Treg方面存在显著差异(**p<0.005，***p<0.001)。
实例11：经REGN4659治疗的携带肿瘤的小鼠的脾脏中的T细胞功能和整体全身性免疫活化的变化
实验设计
在第0天，向二十只CTLA-4hum/hum小鼠的侧腹中皮下植入5×105个MC38.Ova细胞，并且将其随机分成2个治疗组(N＝9/组)。在第3天、第7天、第11天、第14天和第17天，给药小鼠10mg/kg的hIgG1同型对照Ab(REGN1932)或10mg/kg的抗hCTLA-4Ab(REGN4659；H1H19303P)。通过腹膜内注射施用所有抗体。通过卡尺测量来监测肿瘤体积。从第24天(当肿瘤生长过大时)开始到第37天(实验结束)，处死小鼠。在第24天，在REGN4659组中，8/9小鼠变得无肿瘤，而在对照组中，没有小鼠不含肿瘤。通过Taqman实时PCR测量鼠类基因的表达量(针对鼠类亲环素B RNA表达标准化)。未配对t检定显示，相比于同型对照组，REGN4659组中的FoxP3、CD3e、穿孔素(Perforin)、IFNg、TNFa、PD-L1、PD-L2的相对含量统计学上显著增加。
结果
经REGN4659治疗小鼠的脾脏的Taqman分析揭露，FoxP3、CD3e、穿孔素、IFNg、TNFa、PD-L1、PD-L2的转录量增加，表明REGN4659的T细胞效应功能和整体免疫增强功能增加。鼠类基因的表达量(针对鼠类亲环素B RNA表达标准化)显示于表14中。未配对t检定显示，相比于同型对照组，REGN4659组中的FoxP3、CD3e、穿孔素、IFNg、TNFa、PD-L1和PD-L2的相对含量统计学上显著增加。
表14：REGN4659疗法增强活体内适应性免疫反应。
以平均值±SEM报告；双尾未配对t检定；*p<0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。
实例12：抗CTLA-4抗体(REGN4659)与测米匹单抗(抗PD-1抗体)的组合治疗患有晚期或转移性非小细胞肺癌的患者的人类临床试验
这项研究是开放标签、I期、首次在人类中进行(first-in-human，FIH)的研究，评估单独的REGN4659(即实例1到7和9到11的H1H19303P)、单独的高剂量测米匹单抗(群组C)和REGN4659与测米匹单抗的组合在晚期或转移性非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)中的治疗。研究包含剂量递增期(dose escalation phase)和剂量扩增期(dose expansion phase)。
测米匹单抗(REGN2810；实例8)是针对PD-1受体的高亲和力、完全人类、铰链稳定的IgG4P抗体，其有效阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用。
研究标靶
剂量递增期的主要目标是评定单独的REGN4659、单独的高剂量测米匹单抗和REGN4659与测米匹单抗的组合在患有非小细胞肺癌(NSCLC)的经历治疗的患者中的安全性、耐受性和药物动力学(pharmacokinetics，PK)。剂量扩增期的主要目标是评定如通过经历抗PD-1/PD-L1免疫疗法的NSCLC患者中的客观反应率(objective response rate，ORR)所测量的REGN4659与测米匹单抗的组合的初步抗肿瘤活性，并且评定REGN4659和测米匹单抗在经历抗PD-1/PD-L1免疫疗法的NSCLC患者中的安全性、耐受性和PK。
研究的第二目标是(i)评定如通过经历治疗的NSCLC患者在剂量递增期的ORR所测量的高剂量测米匹单抗单一疗法和REGN4659与测米匹单抗的组合的初步抗肿瘤活性；(ii)经由多重准则评定在剂量递增和扩增期间REGN4659与测米匹单抗的抗肿瘤活性；和(iii)评定通过包括ICOS+CD4 T细胞的T细胞活化的末梢血液生物标记的变化所测量的REGN4659和测米匹单抗的全身性药效作用。
研究设计
这项研究是开放标签、I期、首次在人类中进行(FIH)的研究，评估单独的REGN4659、单独的高剂量测米匹单抗(群组C)和REGN4659与测米匹单抗的组合在晚期或转移性NSCLC中的治疗。这项研究存在2个阶段：经历治疗的NSCLC患者(在化学疗法和/或抗PD-1/PD-L1免疫疗法之前)的剂量递增期，和经历抗PD-1/PD-L1免疫疗法的NSCLC患者的剂量扩增期。
研究包含长达28天(第-28天到第-1天)的筛选期、接着为至多十七个42天治疗周期(长达102周的治疗)和24周随访期。在102周治疗期完成之前，或在明确的疾病发展、不可接受的毒性、撤销同意书之前，或在满足另一个研究撤消准则之前，患者将一直接受治疗。在最少治疗24周之后，确认完全反应(complete response，CR)的患者可以选择中断治疗并且继续进行所有相关的研究评定。在剂量递增时，除非医学禁忌，否则期望进行肿瘤活体组织切片检查。肿瘤活体组织切片检查必须作为剂量扩增群组的一部分。关于出现反应并且随后出现发展的患者，会要求在发展时进行肿瘤活体组织切片检查，但不强迫。
在治疗期完成后6个月内在满足研究所规定的准则并且继续进行所规定的访视之后CR、部分反应(partial response，PR)或稳定疾病(SD)有发展的患者允许在再次确认相关研究合格准则之后恢复研究治疗。患者可以接受长达102周的额外治疗。在试验委托者(sponsor)与试验主持人(investigator)之间进行讨论之后，所恢复的剂量和药物一般应该与患者最初接受的或扩增群组所选的剂量相同。
群组C中耐受2次剂量的测米匹单抗(1050mg Q3W)但随后显示PD的患者将可以选择添加安全施用的最高组合剂量的测米匹单抗与REGN4659，达到试图使用所组合的CTLA-4和PD-1阻断寻求反应的程度。
剂量递增：计划八个剂量递增群组。将研究以各种方案每3、6和12周(Q3W、Q6W、Q12W)三次剂量的REGN4659(25、75和250mg静脉内[IV]固定剂量)与以2次剂量(350和1050mg IV固定剂量)Q3W施用的测米匹单抗组合。在与1050mg测米匹单抗的组合群组开始之前，将研究1050mg测米匹单抗Q3W单一疗法的群组(群组C)。关于由星号指示的剂量递增群组(群组1*、2*和4*)，单一引入剂量的REGN4659单一疗法将先于组合疗法3周以在与测米匹单抗组合之前评定REGN4649的安全性。8个群组中的六个(1*、C、2*、2、3和4*)将用于进行剂量限制性毒性(dose-limiting toxicity，DLT)评估。除了DLT可评估群组之外，另外2个剂量群组(5和6)将各自登记6名患者以进行安全性和PK/药效学评估。群组5和6将在分别建立群组2和3的耐受性之后登记。群组5和6中的剂量组合可能引人关注，即使较高剂量强度的REGN4659(群组2和3)是可耐受的。然而，如果群组2和3因为群组5和6中REGN4659的暴露减少而可耐受，那么此些群组将不需要DLT评估。除了将登记6名患者的群组C以外，各剂量群组中最少需要3名患者以使DLT可评估。为了在保持患者安全的同时使1期剂量递增的效率达到最大，将在各剂量群组(群组C除外)中登记4名患者，以防患者在DLT可评估之前就中断。群组3和6(与高剂量测米匹单抗的组合群组)直到群组C中的所有6名患者全部完成DLT期才开始。剂量群组将继续进行剂量递增，直到达到组合的最大耐受剂量(maximumtolerated dose，MTD)或所有剂量群组已测试为止。然而，即使在剂量递增完成之前，仍可以在评估任何群组的耐受性和药效学活性之后选择剂量群组进行扩增。
剂量限制性毒性：除了不能施用(因为研究药物毒性)窗内的2号剂量之外，除了明确认为与疾病发展或间发病相关的事件之外，在出现以下研究毒性之后将考虑DLT：
非血液学毒性：
(i)≥2级葡萄膜炎(视为潜在irAE)；
(ii)天门冬氨酸转胺酶(Aspartate aminotransferase，AST)或丙氨酸转胺酶(alanine aminotransferase，ALT)>5倍正常值上限(upper limit of normal，ULN)和/或总胆红素>3倍ULN。关于患有肝转移的患者，如果2级处于基线，那么AST、ALT和/或总胆红素>2倍基线值；和
(iii)任何≥3级非血液学毒性，包括irAE(如通过体验其它免疫调节药物所定义)，但以下除外：
(a)尽管有如由治疗医师所开出的最大支持性护理措施处方，但仍存在持久(>72小时持续时间)的3级恶心、呕吐或腹泻；和
(b)视为临床上不显著并且不满足不良事件(adverse event，AE)准则的≥3级实验室异常。
血液学毒性：
(i)持续超过7天的4级嗜中性球减少症；
(ii)4级血小板减少症；
(iii)伴随流血的3级血小板减少症；
(iv)≥3级发热性嗜中性球减少症(发热≥38.5℃并且绝对嗜中性球计数<1.0×109/L)或伴随有记载的感染的≥3级嗜中性球减少症；
(v)4级贫血；和
(vi)持续超过7天或需要输液的3级贫血。
如果在单独群组中在DLT评估之后出现安全问题，那么可以在试验主持人与试验委托者之间进行讨论之后暂停登记。触发暂停的安全问题可以包括早期或晚期安全性事件。
剂量扩增：可以在评估除了群组C以外的任何群组的耐受性和药效学活性(包括但不限于周边ICOS+ T细胞增加)之后，选择剂量群组进行扩增，群组C将不扩增。剂量扩增群组将登记在接受抗PD-1/PD-L1疗法的同时仍有发展的经历抗PD-1/PD-L1免疫疗法的NSCLC患者，以测定组合疗法在此群体中的耐受性和活性。选择至多3次独立剂量方案进行剂量扩增以鉴别NSCLC患者的最优组合方案。扩增群组将登记最多27名患者，每个扩增群组基于Simon二阶段设计。如果在单独扩增群组中出现安全问题，那么可以在试验主持人与试验委托者之间进行讨论之后暂停登记。触发暂停的安全问题可以包括早期或晚期安全性事件。
研究持续时间
研究持续时间是约102周，不包括筛选期或随访期。
群体
样品尺寸：期望在剂量递增期间登记至多约53名成年患者并且期望在剂量扩增期间登记至多3个扩增群组，每个群组中登记最多27名患者，在美国至多约15个地点登记。所登记患者的总数将取决于在剂量递增期间所观测到的DLT、PK/药效学分析、所开启的扩增群组的数目和Simon二阶段扩增群组的第1阶段的功效。
目标群体：这项研究的目标群体是诊断患有不可切除的IIIB期或IV期鳞状或非鳞状NSCLC的≥18岁的男性和女性。
纳入准则(Inclusion Criteria)：患者必须满足以下准则才有资格纳入研究中：
1.≥18岁的男性和女性；
2.患有不可切除的IIIB期或IV期疾病的组织学或细胞学上证实的鳞状或非鳞状NSCLC患者；
3.剂量递增(群组C除外)：已接受不超过3线全身性疗法、包括不超过2线细胞毒性化学疗法并且预期没有疗法可以向其传递临床益处的经历治疗的患者。已经接受先前PD-1/PD-L1免疫疗法的患者一定不能因为治疗相关的AE而永久性中断。在剂量递增期间允许具有可靶向突变(包括表皮生长因子受体[EGFR]、ALK和ROS1)的患者，但所述患者必须另外接受至少1线靶向疗法。
a.注意：可以容许用于III期疾病的1)辅助或新辅助化学疗法或免疫疗法(在手术和/或放射线疗法之后)或2)存在或不存在后续免疫疗法的确定性化学放射线疗法，并且在评估在完成疗法之后超过6个月患上复发性或转移性疾病的患者的疗法线时不包括所述疗法；
4.剂量递增群组C：已经接受1到2次前线细胞毒性化学疗法，包括含有铂的双重方案的抗PD-1/PD-L1未治疗患者。在剂量递增期间允许患者具有可靶向的突变(包括EGFR、ALK和ROS1)，但所述患者必须另外接受至少1线靶向疗法。
a.注意：可以容许用于III期疾病的1)辅助或新辅助化学疗法或2)确定性化学放射性疗法，并且在评估在完成疗法之后超过6个月患上复发性或转移性疾病的患者的疗法线时不包括所述疗法。
5.扩增群组：在接受疗法的同时或在疗法停止6个月的内III期或IV期疾病有发展的经历抗PD-1/PD-L1的患者。患者一定不能因为治疗相关的AE而永久性中断抗PD-1/PD-L1疗法。患者必须接受一线抗PD-1/PD-L1免疫疗法。患者还可以接受一线化学疗法。只要除了如以下注意事项中所述者之外不再接受额外的疗法线，便可以容许先前的化学疗法与免疫疗法的组合。
a.注意：可以容许用于III期疾病的1)辅助或新辅助化学疗法或免疫疗法(在手术和/或放射线疗法之后)或2)存在或不存在后续免疫疗法的确定性化学放射线疗法，并且在评估在完成疗法之后超过6个月患上复发性或转移性疾病的患者的疗法线时不包括所述疗法；
6.先前尚未照射过的存档的或新获得的福马林(formalin)固定的肿瘤组织；
7.扩增群组：至少1个根据RECIST 1.1准则通过计算机断层摄影(computedtomography，CT)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)在放射线照相下可测量的病灶。如果在先前照射视野存在有记录的(放射线照相)疾病发展，那么靶病灶可以位于彼位点；
8.≤1的美国东岸癌症临床研究合作组织(Eastern Cooperative OncologyGroup，ECOG)体能状态(performance status)；
9.预计至少3个月的预期寿命；
10.如下文所定义的适当的器官和骨髓功能：
·血红蛋白≥9.0g/dL(注意：在筛选实验室评估之前14天内因血红蛋白<9.0g/dL而接受输血的患者不符合条件)
·绝对嗜中性球计数≥1.5×109/L
·血小板计数≥75,000/mm3
·肾小球滤过率(Glomerular filtration rate，GFR)>30mL/min/1.73m2
·总胆红素≤1.5×ULN(如果肝转移≤3×ULN)，但诊断患有临床上确认的捷倍耳氏症候群(Gilbert′s syndrome)的患者除外
·如果肝转移，那么AST)和ALT≤3×ULN或≤5×ULN
·碱性磷酸酶≤2.5×ULN(或如果肝或骨转移，那么≤5.0×ULN)
·不满足海氏定律(Hy′s law)准则(ALT和/或AST>3×ULN并且胆红素>2×ULN)；
11.愿意并且能够遵守临床访视和研究相关程序；和
12.提供由研究患者或法律上可接受的代表签署的知情同意书。
排除准则(Exclusion Criteria)：将从研究中排除满足以下准则中的任一者的患者：
1.仅扩增群组：从不吸烟的患者，从不吸烟定义为一生中吸≤100根香烟；
2.活性或未治疗的脑转移或脊髓压迫。如果在登记之前至少2周，中枢神经系统(central nervous system，CNS)转移得到充分治疗并且患者神经学上已经回到基线(与CNS治疗有关的残留征象或症状除外)，那么患者符合条件。患者必须停掉(免疫抑制剂量的)皮质类固醇疗法；
3.仅扩增群组：EGFR和ALK基因突变或ROS1融合经测试为阳性的肿瘤患者。所有患者均应该针对EGFR突变、ALK重排和ROS1融合评估肿瘤；
4.在登记之前2周的内进行放射线疗法并且未从任何因为放射线所导致的AE恢复到基线；
5.先前接受抗CTLA-4抗体治疗的患者；
6.在知情同意书前一年有脑炎、脑膜炎或不受控制的癫痫；
7.需要免疫抑制剂量的糖皮质激素来辅助管理的间质性肺病(例如特发性肺纤维化、器质化肺炎)或活性、非感染性肺炎史。允许在辐射场中有放射线肺炎史，只要肺炎在登记前≥6个月解决即可；
8.需要用全身性免疫抑制治疗方式治疗的显著自体免疫疾病的持续的或近来的迹象，其可以表明有免疫相关的治疗中出现的不良事件(immune-related treatment-emergent adverse event，irTEAE)的风险。以下情况不排除在外：白斑病、已解决的儿童哮喘、I型糖尿病、仅需要激素置换的残余甲状腺功能低下或不需要全身性治疗的牛皮癣；
9.在随机分组14天内具有需要皮质类固醇疗法(>10mg泼尼松(prednisone)/天或同等物)的病况的患者。允许生理置换剂量，即使其是>10mg泼尼松/天或同等物，只要其不是出于免疫抑制目的施用即可。吸入的或局部的类固醇是允许的，前提是其不用于治疗自体免疫病症；
10.仅扩增群组：另一种进行性或要求治疗的恶性疾病，但可能已经历治愈性疗法的非黑色素瘤皮肤癌或已经过治疗的原位子宫颈癌或任何其它肿瘤除外，并且认为患者在进入研究前至少2年完全缓解，并且在研究期内不需要额外疗法；
11.不受控制的感染人类免疫缺乏病毒、乙型肝炎或丙型肝炎感染；或诊断患有免疫缺乏；
注意：
·在筛选时将对患者进行丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)测试；
·允许患有受控感染的已知HIV感染患者(不可检测的病毒负荷(HIV RNA PCR)和CD4计数高于350，自发地或基于稳定抗病毒方案)。关于患有受控HIV感染的患者，将根据地方标准进行监测；
·允许患有受控感染的乙型肝炎病毒(HepBsAg+)患者(血清乙型肝炎病毒DNAPCR低于检测极限并且接受针对乙型肝炎病毒的抗病毒疗法)。患有受控感染的患者必须定期监测HBV DNA。在最后一个剂量的试验用研究药物之后，患者必须坚持抗病毒疗法至少6个月；
·允许患有受控感染的丙型肝炎病毒抗体阳性(HCV Ab+)患者(PCR不可检测的HCV RNA，自发地或对抗HCV疗法的成功的先验过程起反应)。
12.在开始研究药物之前14天内需要全身性疗法的活动性感染；
13.在开始用研究疗法治疗之前至少3个月尚未转变成基线的来自免疫调节剂(包括但不限于抗PD1/PD-L1疗法、其它检查点抑制剂疗法和PI 3K-δ抑制剂)的治疗相关的免疫介导性AE。如果患者经历与先前用PD-1/PD-L1途径的阻断剂治疗相关的免疫介导性AE，不管发生时间，需要永久性中止所述药剂，那么排除用测米匹单抗治疗所述患者。注意：允许已用激素置换控制的经历任何级别的甲状腺功能低下或I型糖尿病的患者；
14.先前在任何时间用艾德昔布(idelalisib，)治疗；
15.当前正在另一项研究中接受治疗或已经参与试验药的研究并且接受治疗，或在研究疗法的第一次给药4周内使用试验装置，或在研究疗法的第一次给药3周内接受审批通过的全身性疗法治疗，或已在研究疗法的第一次给药的5个半衰期内接受任何先前全身性疗法，无论哪个更久(抗PD-1/PD-L1疗法除外)。如果从最后一个治疗起已经过至少28天，那么在与试验委托者讨论之后，允许预先经贝伐单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗或半衰期大于7天的其它非免疫调节性抗体治疗的患者。关于经历抗PD-1/PD-L1的患者，在研究疗法的第一次给药3周的内不能预先给予抗PD-1/PD-L1疗法，无论药物的半衰期或审批状态如何均如此；
16.在研究药品计划开始30天内接受活毒疫苗；
17.在第一次给药之前4周之内做过大手术或有明显的创伤性损伤；
18.已知对多西环素(doxycycline)或类似化合物(即，四环素)过敏；
19.有记载对任何蛋白质类治疗剂(例如重组蛋白、疫苗、静脉内免疫球蛋白、单克隆抗体、受体捕获剂)具有过敏或超敏反应；
20.已知的精神病学或物质使用疾患(substance abuse disorder)，其将干扰参与研究的要求，包括非法药物的当前使用；
21.预先同种异体干细胞移植；
22.在试验主持人看来参与研究并不符合患者最佳利益的任何医学病况；
23.妊娠期或哺乳期女性；
24.在基线(第1个周期第1天，在给药之前)访视时阳性血清hCG妊娠测试；
25.在初次给药/第一次治疗开始之前、在研究期间和在最后一次给药之后至少6个月，不愿意采取非常有效的避孕措施的有生育潜力*的性活跃的男性和女性。非常有效的避孕措施包括：
·稳定使用组合(含有雌激素和助孕素)激素避孕(经口、阴道内、经皮)或仅助孕素激素避孕(经口、可注射、可植入)，其与抑制在筛选前2个或更多个月经周期开始的排卵有关；
·子宫内装置(intrauterine device，IUD)；子宫内激素释放系统(intrauterinehormone-releasing system，IUS)；
·两侧输卵管结扎；
·伴侣切除输精管；
·和或禁欲
*为了被视为没有生育潜力，停经后女性必须停经至少12个月。已经记载做过子宫切除术或输卵管结扎的女性不需要妊娠测试和避孕。
禁欲仅在定义为在与研究治疗相关的整个风险期内忍住不与异性性交时才被视为非常有效的方法。周期性禁欲(日历法、征状基础体温法、排卵后法)、撤出(性交中断)、仅杀精剂和泌乳停经法(lactational amenorrhoea method，LAM)是不可接受的避孕方法。女性保险套和男性保险套不应一起使用；
26.临床现场研究小组的成员和/或其近亲属(immediate family)。
治疗
REGN4659：将按各种方案(Q3W、Q6W、Q12W)研究3种剂量(25、75和250mg IV固定剂量)。
测米匹单抗：Q3W施用2种剂量(350和1050mg IV固定剂量)。
主要终点
在剂量递增期中：DLT、治疗中出现的不良事件(TEAE)、irAE、严重不良事件(SAE)、死亡、实验室异常(根据不良事件的常见术语准则[Common Terminology Criteria forAdverse Events，CTCAE]，3级或更高级)的比率。
在剂量扩增期中：基于实体肿瘤反应评估准则(Response Evaluation Criteriain Solid Tumors，RECIST)1.1的客观反应率(ORR)，和TEAE、irAE、SAE、死亡、实验室异常(根据CTCAE 3级或更高级)的比率。
次要终点
基于多反应准则的肿瘤测量包括：(i)基于RECIST 1.1的ORR(剂量递增)，(ii)基于免疫类疗法反应评估准则(iRECIST)的ORR，(iii)最佳整体反应(best overallresponse，BOR)、反应持续时间(duration of response，DOR)、疾病控制率和基于RECIST1.1、iRECIST的无发展存活期(progression-free survival，PFS)，和(iv)总存活期(Overall survival，OS)。
经由流动式细胞测量术对各剂量群组内的绝对ICOS+CD4 T细胞和其它活化标志物的改变％进行定量。
程序和评定
REGN4659和测米匹单抗的安全性和耐受性将通过临床评定AE和通过反复测量临床评估和实验室评定来监测，临床评估包括生命征象(温度、血压、脉搏和呼吸)、体检(全面的和有限的)、12导程心电图(electrocardiogram，ECG)，实验室评定包括标准血液学、化学和尿分析。
抗肿瘤活性将通过CT/MRI来评定。
将收集血液样品用于测定血清和抗药物抗体(抗REGN4659或抗测米匹单抗)样品中的功能性REGN4659和功能性测米匹单抗。
将收集血清、血浆、外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和肿瘤活体组织切片以进行生物标志物分析。将收集基因组DNA样品。将在血清、血浆、PBMC和肿瘤组织中研究所推测的药效学、与REGN4659和测米匹单抗治疗暴露相关的预测和预后生物标志物、临床活性或潜在疾病。
统计计划
剂量递增期：不存在关于研究的剂量递增期的形式统计假设；此阶段的分析在本质上将是描述性并且探索性的。关于各剂量递增群组(群组1*、2*、2、3和4*)，基于经修改的3+3设计(“4+3”)，计划约35名DLT可评估患者。群组5和6计划十二名患者(每个群组6名患者)。此些剂量递增群组的实际样品尺寸将取决于所记载的DLT、所得群组尺寸和所实施的剂量的次数。
剂量扩增期：关于每个扩增群组，在NSCLC患者中，其经历过抗PD-1/PD-L1免疫疗法并且在接受抗PD-1/PD-L1疗法的同时有发展，因为此些患者存在较少可用功效数据，所以试验委托者认为任何优于5％的可测量的ORR均表示有临床意义的治疗效果。使用Simon二阶段Minimax设计以5％的单边显著水准(1-sided significant level)和80％的检定力(power)测定每个扩增群组中27名患者的样品尺寸。
主要功效分析：扩增群组的通过RECIST 1.1确定的最佳整体反应将使用描述统计连同双边95％信赖区间来概述。
ORR将通过描述统计连同95％信赖区间来概述。BOR不可评估的患者将视为无反应者。
关于扩增群组，如果反应者的数目大于或等于Simon二阶段设计中所指定的反应者的最小数目，那么视为治疗有效并且值得进一步研究。
次要功效分析包括如通过iRECIST所测量的ORR、DOR、疾病控制率和PFS。那些次要功效终点将通过剂量递增和扩增群组以描述方式概述。
包括药物暴露的安全性观测和测量、AE、实验室数据和生命征象将概述并展现于表格和列表中。
关于剂量递增期：在DLT评估期内观测到的DLT将通过剂量群组来概述。
结果
在剂量递增期中，单独的和呈组合形式的REGN4659和测米匹单抗在经历治疗的NSCLC患者中均将被良好耐受。在剂量扩增期中，在经历抗PD-1/PD-1免疫疗法的NSCLC患者中，REGN4659与测米匹单抗的组合将被良好耐受并且将展现可测量的抗肿瘤反应。
示范性实施例
本发明还关于以下项目：
项目1.一种抗体或其抗原结合片段，其结合人类细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)并且阻断hCTLA-4与配体B7-1和/或配体B7-2之间的相互作用。
项目2.根据项目1所述的抗体或抗原结合片段，其诱导T细胞活化。
项目3.根据项目2所述的抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞是细胞毒性T细胞。
项目4.根据项目2或3所述的抗体或抗原结合片段，其中所述T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞。
项目5.根据项目1至4中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合猴CTLA-4。
项目6.根据项目1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于5nM的EC50结合CTLA-4表达细胞。
项目7.根据项目1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于1nM的EC50结合CTLA-4表达细胞。
项目8.根据项目1至7中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于0.5nM的EC50结合人类CTLA-4表达细胞。
项目9.根据项目1至8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其以小于0.5nM的EC50结合猴CTLA-4表达细胞。
项目10.根据项目1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是完全人类抗体。
项目11.根据项目1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体竞争与人类CTLA-4结合：(a)SEQ ID NO:2和10、(b)SEQ ID NO:18和26、(c)SEQ ID NO:34和42、(d)SEQ ID NO:50和58、(e)SEQ ID NO:66和74、(f)SEQ ID NO:82和90、(g)SEQ ID NO:98和106、(h)SEQ ID NO:114和122、(i)SEQ ID NO:130和138、(j)SEQ ID NO:146和154、(k)SEQID NO:162和170、(l)SEQ ID NO:178和186、(m)SEQ ID NO:194和202、(n)SEQ ID NO:210和218、(o)SEQ ID NO:226和234、(p)SEQ ID NO:242和250、(q)SEQ ID NO:258和266、(r)SEQID NO:274和282、(s)SEQ ID NO:290和298、(t)SEQ ID NO:306和298、(u)SEQ ID NO:314和322、(v)SEQ ID NO:330和338、(w)SEQ ID NO:346和354、(x)SEQ ID NO:362和370、(y)SEQID NO:378和386、(z)SEQ ID NO:394和402、(a′)SEQ ID NO:410和418、(b′)SEQ ID NO:426和434、(c′)SEQ ID NO:442和450、(d′)SEQ ID NO:458和466、(e′)SEQ ID NO:474和482以及(f′)SEQ ID NO:490和498。
项目12.根据项目1至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的参考抗体结合到人类CTLA-4上的同一个抗原决定基：(a)SEQ ID NO:2和10、(b)SEQ ID NO:18和26、(c)SEQ IDNO:34和42、(d)SEQ ID NO:50和58、(e)SEQ ID NO:66和74、(f)SEQ ID NO:82和90、(g)SEQID NO:98和106、(h)SEQ ID NO:114和122、(i)SEQ ID NO:130和138、(j)SEQ ID NO:146和154、(k)SEQ ID NO:162和170、(l)SEQ ID NO:178和186、(m)SEQ ID NO:194和202、(n)SEQID NO:210和218、(o)SEQ ID NO:226和234、(p)SEQ ID NO:242和250、(q)SEQ ID NO:258和266、(r)SEQ ID NO:274和282、(s)SEQ ID NO:290和298、(t)SEQ ID NO:306和298、(u)SEQID NO:314和322、(v)SEQ ID NO:330和338、(w)SEQ ID NO:346和354、(x)SEQ ID NO:362和370、(y)SEQ ID NO:378和386、(z)SEQ ID NO:394和402、(a′)SEQ ID NO:410和418、(b′)SEQ ID NO:426和434、(c′)SEQ ID NO:442和450、(d′)SEQ ID NO:458和466、(e′)SEQ IDNO:474和482以及(f′)SEQ ID NO:490和498。
项目13.根据项目1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：(a)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474和490；和(b)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482和498。
项目14.根据项目1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：(a)SEQID NO:2和10、(b)SEQ ID NO:18和26、(c)SEQ ID NO:34和42、(d)SEQ ID NO:50和58、(e)SEQ ID NO:66和74、(f)SEQ ID NO:82和90、(g)SEQ ID NO:98和106、(h)SEQ ID NO:114和122、(i)SEQ ID NO:130和138、(j)SEQ ID NO:146和154、(k)SEQ ID NO:162和170、(l)SEQID NO:178和186、(m)SEQ ID NO:194和202、(n)SEQ ID NO:210和218、(o)SEQ ID NO:226和234、(p)SEQ ID NO:242和250、(q)SEQ ID NO:258和266、(r)SEQ ID NO:274和282、(s)SEQID NO:290和298、(t)SEQ ID NO:306和298、(u)SEQ ID NO:314和322、(v)SEQ ID NO:330和338、(w)SEQ ID NO:346和354、(x)SEQ ID NO:362和370、(y)SEQ ID NO:378和386、(z)SEQID NO:394和402、(a′)SEQ ID NO:410和418、(b′)SEQ ID NO:426和434、(c′)SEQ ID NO:442和450、(d′)SEQ ID NO:458和466、(e′)SEQ ID NO:474和482以及(f′)SEQ ID NO:490和498。
项目15.根据项目1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含包含选自由以下组成的组的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3结构域：(a)分别SEQ ID NO:4、6、8、12、14和16；(b)分别SEQ ID NO:20、22、24、28、30和32；(c)分别SEQ ID NO:36、38、40、44、46和48；(d)分别SEQ ID NO:52、54、56、60、62和64；(e)分别SEQ ID NO:68、70、72、76、78和80；(f)分别SEQ ID NO:84、86、88、92、94和96；(g)分别SEQID NO:100、102、104、108、110和112；(h)分别SEQ ID NO:116、118、120、124、126和128；(i)分别SEQ ID NO:132、134、136、140、142和144；(j)分别SEQ ID NO:148、150、152、156、158和160；(k)分别SEQ ID NO:164、166、168、172、174和176；(l)分别SEQ ID NO:180、182、184、188、190和192；(m)分别SEQ ID NO:196、198、200、204、206和208；(n)分别SEQ ID NO:212、214、216、220、222和224；(o)分别SEQ ID NO:228、230、232、236、238和240；(p)分别SEQ IDNO:244、246、248、252、254和256；(q)分别SEQ ID NO:260、262、264、268、270和272；(r)分别SEQ ID NO:276、278、280、284、286和288；(s)分别SEQ ID NO:292、294、296、300、302和304；(t)分别SEQ ID NO:308、310、312、300、302和304；(u)分别SEQ ID NO:316、318、320、324、326和328；(v)分别SEQ ID NO:332、334、336、340、342和344；(w)分别SEQ ID NO:348、350、352、356、358和360；(x)分别SEQ ID NO:364、366、368、372、374和376；(y)分别SEQ ID NO:380、382、384、388、390和392；(z)分别SEQ ID NO:396、398、400、404、406和408；(a′)分别SEQ ID NO:412、414、416、420、422和424；(b′)分别SEQ ID NO:428、430、432、436、438和440；(c′)分别SEQ ID NO:444、446、448、452、454和456；(d′)分别SEQ ID NO:460、462、464、468、470和472；(e′)分别SEQ ID NO:476、478、480、484、486和488；和(f′)分别SEQ ID NO:492、494、496、500、502和504。
项目16.根据项目1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：(a)SEQ ID NO:2和10、(b)SEQ ID NO:18和26、(c)SEQ ID NO:34和42、(d)SEQ ID NO:50和58、(e)SEQ ID NO:66和74、(f)SEQ ID NO:82和90、(g)SEQ ID NO:98和106、(h)SEQ ID NO:114和122、(i)SEQ IDNO:130和138、(j)SEQ ID NO:146和154、(k)SEQ ID NO:162和170、(l)SEQ ID NO:178和186、(m)SEQ ID NO:194和202、(n)SEQ ID NO:210和218、(o)SEQ ID NO:226和234、(p)SEQID NO:242和250、(q)SEQ ID NO:258和266、(r)SEQ ID NO:274和282、(s)SEQ ID NO:290和298、(t)SEQ ID NO:306和298、(u)SEQ ID NO:314和322、(v)SEQ ID NO:330和338、(w)SEQID NO:346和354、(x)SEQ ID NO:362和370、(y)SEQ ID NO:378和386、(z)SEQ ID NO:394和402、(a′)SEQ ID NO:410和418、(b′)SEQ ID NO:426和434、(c′)SEQ ID NO:442和450、(d′)SEQ ID NO:458和466、(e′)SEQ ID NO:474和482以及(f′)SEQ ID NO:490和498。
项目17.一种抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其包含：(a)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)：SEQ ID NO:2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、314、330、346、362、378、394、410、426、442、458、474和490；和(b)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)的CDR：SEQ ID NO:10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、322、338、354、370、386、402、418、434、450、466、482和498。
项目18.根据项目17所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR：(a)SEQ ID NO:2和10、(b)SEQ IDNO:18和26、(c)SEQ ID NO:34和42、(d)SEQ ID NO:50和58、(e)SEQ ID NO:66和74、(f)SEQID NO:82和90、(g)SEQ ID NO:98和106、(h)SEQ ID NO:114和122、(i)SEQ ID NO:130和138、(j)SEQ ID NO:146和154、(k)SEQ ID NO:162和170、(l)SEQ ID NO:178和186、(m)SEQID NO:194和202、(n)SEQ ID NO:210和218、(o)SEQ ID NO:226和234、(p)SEQ ID NO:242和250、(q)SEQ ID NO:258和266、(r)SEQ ID NO:274和282、(s)SEQ ID NO:290和298、(t)SEQID NO:306和298、(u)SEQ ID NO:314和322、(v)SEQ ID NO:330和338、(w)SEQ ID NO:346和354、(x)SEQ ID NO:362和370、(y)SEQ ID NO:378和386、(z)SEQ IDNO:394和402、(a′)SEQID NO:410和418、(b′)SEQ ID NO:426和434、(c′)SEQ ID NO:442和450、(d′)SEQ ID NO:458和466、(e′)SEQ ID NO:474和482以及(f′)SEQ ID NO:490和498。
项目19.根据项目17或18所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3结构域：(a)分别SEQ ID NO:4、6、8、12、14和16；(b)分别SEQ ID NO:20、22、24、28、30和32；(c)分别SEQ IDNO:36、38、40、44、46和48；(d)分别SEQ ID NO:52、54、56、60、62和64；(e)分别SEQ ID NO:68、70、72、76、78和80；(f)分别SEQ ID NO:84、86、88、92、94和96；(g)分别SEQ ID NO:100、102、104、108、110和112；(h)分别SEQ ID NO:116、118、120、124、126和128；(i)分别SEQ IDNO:132、134、136、140、142和144；(j)分别SEQ ID NO:148、150、152、156、158和160；(k)分别SEQ ID NO:164、166、168、172、174和176；(l)分别SEQ ID NO:180、182、184、188、190和192；(m)分别SEQ ID NO:196、198、200、204、206和208；(n)分别SEQ ID NO:212、214、216、220、222和224；(o)分别SEQ ID NO:228、230、232、236、238和240；(p)分别SEQ ID NO:244、246、248、252、254和256；(q)分别SEQ ID NO:260、262、264、268、270和272；(r)分别SEQ ID NO:276、278、280、284、286和288；(s)分别SEQ ID NO:292、294、296、300、302和304；(t)分别SEQID NO:308、310、312、300、302和304；(u)分别SEQ ID NO:316、318、320、324、326和328；(v)分别SEQ ID NO:332、334、336、340、342和344；(w)分别SEQ ID NO:348、350、352、356、358和360；(x)分别SEQ ID NO:364、366、368、372、374和376；(y)分别SEQ ID NO:380、382、384、388、390和392；(z)分别SEQ ID NO:396、398、400、404、406和408；(a′)分别SEQ ID NO:412、414、416、420、422和424；(b′)分别SEQ ID NO:428、430、432、436、438和440；(c′)分别SEQID NO:444、446、448、452、454和456；(d′)分别SEQ ID NO:460、462、464、468、470和472；(e′)分别SEQ ID NO:476、478、480、484、486和488；和(f′)分别SEQ ID NO:492、494、496、500、502和504。
项目20.根据项目17至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：(a)SEQ ID NO:2和10、(b)SEQ ID NO:18和26、(c)SEQ ID NO:34和42、(d)SEQ ID NO:50和58、(e)SEQ ID NO:66和74、(f)SEQ ID NO:82和90、(g)SEQ ID NO:98和106、(h)SEQ ID NO:114和122、(i)SEQ IDNO:130和138、(j)SEQ ID NO:146和154、(k)SEQ ID NO:162和170、(l)SEQ ID NO:178和186、(m)SEQ ID NO:194和202、(n)SEQ ID NO:210和218、(o)SEQ ID NO:226和234、(p)SEQID NO:242和250、(q)SEQ ID NO:258和266、(r)SEQ ID NO:274和282、(s)SEQ ID NO:290和298、(t)SEQ ID NO:306和298、(u)SEQ ID NO:314和322、(v)SEQ ID NO:330和338、(w)SEQID NO:346和354、(x)SEQ ID NO:362和370、(y)SEQ ID NO:378和386、(z)SEQ ID NO:394和402、(a′)SEQ ID NO:410和418、(b′)SEQ ID NO:426和434、(c′)SEQ ID NO:442和450、(d′)SEQ ID NO:458和466、(e′)SEQ ID NO:474和482以及(f′)SEQ ID NO:490和498。
项目21.根据项目17至20中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO:509的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:510的氨基酸序列的轻链。
项目22.一种药物组合物，其包含根据项目1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂或稀释剂。
项目23.一种经分离多核苷酸分子，其包含编码根据项目1至21中任一项中所阐述所述的抗体的HCVR的多核苷酸序列。
项目24.一种经分离多核苷酸分子，其包含编码根据项目1至21中任一项中所阐述所述的抗体的LCVR的多核苷酸序列。
项目25.一种载体，其包含根据项目23所述的多核苷酸和/或根据项目24所述的多核苷酸。
项目26.一种宿主细胞，其表达根据项目25所述的载体。
项目27.根据项目1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据项目22所述的药物组合物，其用于抑制有需要的个体中的肿瘤或肿瘤细胞的生长。
项目28.根据项目27所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述肿瘤是原发性肿瘤或复发性肿瘤。
项目29.根据项目27所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述肿瘤是已建立的肿瘤。
项目30.根据项目27至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述肿瘤存在于患有选自由以下组成的组的疾病或病症的个体中：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、肾癌、子宫颈癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、骨髓瘤和黑色素瘤。
项目31.根据项目27至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物以初始剂量、接着为一次或多次第二剂量的形式向所述个体施用，其中每个第二剂量在前一剂量之后1周到12周施用。
项目32.根据项目31所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物以约25-600mg的剂量向所述个体施用。
项目33.根据项目27至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与第二治疗剂组合向个体施用。
项目34.根据项目33所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的组：LAG3抑制剂、针对肿瘤特异性抗原的抗体、针对病毒感染的细胞抗原的抗体、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CD20抑制剂、针对CD20和CD3的双特异性抗体、例如抗氧化剂的膳食补充剂、VEGF拮抗剂、癌症疫苗、化学治疗剂、细胞毒性剂、放射线、手术和任何其它适用于缓解至少一种与所述疾病或病症相关的症状的疗法。
项目35.根据项目33或34所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述第二治疗剂是PD-1抑制剂。
项目36.根据项目33至35中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述PD-1抑制剂是测米匹单抗、纳武单抗或派姆单抗。
项目37.根据项目36所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述PD-1抑制剂以每千克所述个体的体重1mg、3mg或10mg的剂量施用。
项目38.根据项目33至35中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述PD-1抑制剂以50-1200mg的剂量施用。
项目39.根据项目27至38中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段或所述药物组合物皮下、静脉内、瘤内、瘤周、皮内、腹膜内、经口、肌肉内或颅内施用。
项目40.根据项目1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据项目22所述的药物组合物，其用于治疗通过拮抗有需要的个体中的CTLA-4可治疗的疾病或病症。
项目41.根据项目40所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述疾病或病症是由选自由以下组成的组的病毒导致的慢性病毒感染：人类免疫缺乏病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和猿猴免疫缺乏病毒(SIV)。
项目42.根据项目40所使用的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫颈癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、结肠癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤、B细胞淋巴瘤和黑色素瘤。
项目43.一种产生抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段的方法，其包含使根据项目26所述的宿主细胞在允许所述抗体或其抗原结合片段产生的条件下生长，并且回收如此产生的抗体或其抗原结合片段。
项目44.根据项目43所述的方法，其进一步包含将所述抗体或其抗原结合片段配制为包含可接受载剂的药物组合物。
项目45.一种抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其与抗PD-1抗体组合使用以治疗有需要的个体的非小细胞肺癌。
项目46.根据项目45所使用的抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段是根据项目1至21中任一项所主张的抗体或其抗原结合片段。
项目47.根据项目45或46所使用的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体包含有包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HCVR的CDR和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的LCVR的CDR。
项目48.根据项目45至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体包含序列SEQ ID NO:196的HCDR1、序列SEQ ID NO:198的HCDR2、序列SEQ IDNO:200的HCDR3、序列SEQ ID NO:204的LCDR1、序列SEQ ID NO:206的LCDR2和序列SEQ IDNO:208的LCDR3。
项目49.根据项目45至48中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体包含有包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的HCVR和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的LCVR。
项目50.根据项目45至49中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体包含人类IgG1重链恒定区。
项目51.根据项目45至50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体包含有包含SEQ ID NO:509的氨基酸序列的重链和SEQ ID NO:510的氨基酸序列的轻链。
项目52.根据项目45至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体是测米匹单抗。
项目53.根据项目45至52中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段以25-600mg的剂量施用。
项目54.根据项目45至53中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗PD-1抗体以50-1200mg的剂量施用。
项目55.根据项目45至54中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段以初始剂量、接着为一次或多次第二剂量的形式施用，其中每个第二剂量在前一剂量之后1周到12周施用。
项目56.根据项目45至55中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述非小细胞肺癌(NSCLC)是晚期NSCLC或转移性NSCLC。
项目57.根据项目22所述的药物组合物，其与抗PD-1抗体组合使用以治疗有需要的个体的非小细胞肺癌。
本发明的范围不受本文所述的特定实施例限制。实际上，根据前述描述，除本文所描述的修改以外，本发明的各种修改对所属领域的技术人员而言也会变得显而易见。所述修改打算落入所附权利要求书的范围内。

Claims (32)

1.一种与细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)特异性结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中所述HCVR包含分别由SEQ ID NO:196、198和200的氨基酸序列组成的三个重链互补决定区(CDR)，即HCDR1、HCDR2和HCDR3；且其中所述LCVR包含分别由SEQ ID NO:204、206和208的氨基酸序列组成的三个轻链CDR，即LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:194的氨基酸序列组成的HCVR和由SEQ ID NO:202的氨基酸序列组成的LCVR。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是完全人类抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人类IgG1重链恒定区。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含人类IgG4重链恒定区。
7.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:509的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述轻链包含SEQ ID NO:510的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含SEQ ID NO:509的氨基酸序列并且所述轻链包含SEQ ID NO:510的氨基酸序列。
10.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂或稀释剂。
11.分别包含编码根据权利要求1至9中任一项中所述的抗体或其抗原结合片段的HCVR的多核苷酸序列和编码根据权利要求1至9中任一项中所述的抗体或其抗原结合片段的LCVR的多核苷酸序列的一对经分离的多核苷酸分子。
12.分别包含根据权利要求11所述的一对经分离的多核苷酸分子的一对载体。
13.一种经分离的多核苷酸分子，其包含编码根据权利要求1至9中任一项中所述的抗体或其抗原结合片段的HCVR和LCVR的多核苷酸序列。
14.一种载体，其包含根据权利要求13所述的多核苷酸分子。
15.一种经分离的宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的一对经分离的多核苷酸分子、根据权利要求12所述的一对载体、根据权利要求13所述的多核苷酸分子或根据权利要求14所述的载体。
16.一种产生根据权利要求1至9任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含使根据权利要求15所述的宿主细胞在允许所述抗体或其抗原结合片段产生的条件下生长，并且回收如此产生的所述抗体或其抗原结合片段。
17.根据权利要求16所述的方法，其进一步包含将所述抗体或其抗原结合片段配制为包含可接受载剂的药物组合物。
18.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制个体中的肿瘤或肿瘤细胞生长的药物中的用途，
其中所述肿瘤存在于患有选自由以下组成的组的疾病或病症的个体中：血癌、脑癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肝细胞癌、骨癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠直肠癌、间皮瘤、B细胞淋巴瘤和黑色素瘤。
19.根据权利要求18所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制个体中的肿瘤或肿瘤细胞生长的药物中的用途，
其中所述肿瘤存在于患有结肠癌的个体中。
20.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述肿瘤是原发性肿瘤或复发性肿瘤。
21.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述肿瘤是已建立的肿瘤。
22.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述药物是用于以初始剂量、接着为一次或多次第二剂量的形式施用的药物，其中每个第二剂量是用于在前一剂量之后1周到12周施用的第二剂量。
23.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述药物是用于以25-600mg的剂量施用所述抗体或其抗原结合片段的药物。
24.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述药物是用于与第二治疗剂组合向所述个体施用的药物。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述第二治疗剂选自由以下组成的组：PD-1抑制剂、针对肿瘤特异性抗原的抗体、针对病毒感染的细胞抗原的抗体、PD-L1抑制剂、CD20抑制剂、针对CD20和CD3的双特异性抗体、抗氧化剂、膳食补充剂、VEGF拮抗剂、化学治疗剂、细胞毒性剂、放射线、NSAID、皮质类固醇和适用于缓解至少一种与所述疾病或病症相关的症状的任何其它疗法。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述第二治疗剂是PD-1抑制剂。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述PD-1抑制剂是测米匹单抗(cemiplimab)、纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述PD-1抑制剂是用于以每千克所述个体的体重1mg、3mg或10mg的剂量施用的形式。
29.根据权利要求27所述的用途，其中所述PD-1抑制剂是用于以50-1200mg的剂量施用的形式。
30.根据权利要求18或19所述的用途，其中所述药物是用于皮下、静脉内、皮内、腹膜内、经口、肌肉内或颅内施用的形式。
31.根据权利要求26所述的用途，其中所述肿瘤是非小细胞肺癌(NSCLC)。
32.根据权利要求31的用途，其中所述NSCLC是晚期NSCLC或转移性NSCLC。
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