JP2023059239A - 抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられるサナギタケ子実体抽出物の使用 - Google Patents

抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられるサナギタケ子実体抽出物の使用 Download PDF

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【課題】抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられるサナギタケ子実体抽出物の使用を提供する。【解決手段】前記サナギタケ子実体抽出物は、エタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を抽出して獲得されるものである。【選択図】図1

Description

本発明は、サナギタケ子実体抽出物の使用に関するもので、特に、抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられるサナギタケ子実体抽出物の使用に関するものである。
可視光線とは人の目で見える電磁波であり、可視光線に相当する電磁波の波長は約380~750nmである。そのうち、ブルーライト(blue light)とは一般的に波長が380~500nmの可視光線であり、具体的な区別として、波長が380~410nmの紫色光(violet light)、波長が410~455nmの青紫色光(blue-violet light)と波長が455~500nmの青緑色光(blue-turquoise light)を含む。紫色光と青紫色光は波長が短くて、高エネルギーをもつので、目に対して損傷を引き起こす可能性があり、有害ブルーライト(harmful blue light)と称される。
ブルーライトは角膜(cornea)と水晶体(lens)を通して網膜(retina)に達することができ、且つ過去の研究により、ブルーライトは視力に対する影響を齎すことがあり、さらに目が早老になってしまうことが証明された。例えば、過度にブルーライトに曝す場合、目の痛み或いは刺激(sore or irritated eyes)、集中力の低下(difficulty focusing)などのデジタル眼精疲労(digital eye strain)、または、老人性黄斑変性(age-related macular degeneration)などの網膜損傷(retina damage)に至ってしまうことがある。
一般的には、日常生活にブルーライトの来源として太陽光、蛍光灯、LED及びテレビ、タブレットとスマートフォンのディスプレイなどを含む。そのうち、ディスプレイからのブルーライトに曝す量が少ないが、人の目とディスプレイの距離が比較的に近く、そして人が目でディスプレイを注視する時間も多い。そのため、ブルーライトによる目に対する損傷を避けるように、ディスプレイフィルタ(screen filter)、パソコン用メガネ(computer glasses)、反射防止レンズ(anti-reflective lenses)などの抗ブルーライト商品が開発された。
サナギタケ(Cordyceps militaris)はノムシタケ科(familyCordycipitaceae)に属する真菌の一つであり、ノムシタケ属(genusCordyceps)の模式種である。サナギタケの活性成分は性欲の促進、抗炎症、抗酸化、抗老化、抗腫瘍/抗癌/抗白血病、抗悪性腫瘍の増殖、抗悪性腫瘍の転移、免疫調節、そして細菌、真菌、ウイルスなどの微生物に対する抵抗、抗繊維症、血糖の降下、血中脂質の降下、抗血管新生、抗疲労に対して有利な効果を有し、さらに、神経、肝臓、腎臓などの器官の保護にも役に立っている。
台湾公告第I459953号
近年、多種のサナギタケの培養技術が既に開発されている。例えば、特許文献1に開示された内容のように、サナギタケを、動物性蛋白(牛乳、肉汁の抽出物、牛胎児血清、魚粉、魚介エキス、カイコの蛹、イトミミズ)、植物性蛋白、腸内有益菌の発酵液(乳酸菌発酵液、真菌発酵液)、漢方薬の抽出物等を含むPCB(plate count broth)培地に接種した後、20~24℃、90rpmの条件で3~7日振盪培養を行った後、米、玄米、或いは燕麦等を含む穀物培地に再接種する。そして、18~25℃、70~90%の湿度で暗黒環境(光照強度約0Lux)にて3~7日培養してから、18~25℃、70~90%の湿度で光照環境(光照強度500Lux以上、照射時間が毎日8~15時間)にて50日培養する。これにより、獲得したサナギタケ子実体は成長が速く、そして、抽出したサナギタケ子実体の抽出物に含まれるコルジヤピン(cordycepin)の含有量も高い。しかしながら、上記の方法で獲得したサナギタケ子実体の抽出物は抗ブルーライト損傷効果に用いられるかどうか未知である。これに鑑みて、依然として、抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられるサナギタケ子実体抽出物の使用を提供する必要がある。
本発明は、上記の課題を解決するために、抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられるサナギタケ子実体抽出物の使用を提供する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられることができる、また、前記サナギタケ子実体抽出物はエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を抽出して獲得されるものである。
よって、本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、サナギタケ子実体抽出物が含有する活性成分(例えば、サナギタケ黄素III等のサナギタケカロテノイド)により、需要個体の網膜に位置する光受容細胞を保護し、それらの光受容細胞のアポトーシスを避けるため、有害ブルーライト(一般的には波長が380~500nmの高エネルギー可視光線を指す)の照射による網膜変性を防止して、ひいては抗ブルーライト損傷効果の薬物の製造を用いられることができるという効果を有する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、サナギタケ子実体抽出物はエタノール濃度が20%以上のエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を抽出して獲得することができる。よって、サナギタケ子実体抽出物が含有するサナギタケカロテノイドは効率的にエタノール水溶液に溶出され(例えば、サナギタケカロテノイドを20~100分内大量に溶出させることができ、且つサナギタケ子実体抽出物の1kgにつき、200mg以上のサナギタケカロテノイドを含有する)、繰り返して抽出することなく、サナギタケ子実体抽出物を獲得する方法の製造過程を最適化する効果を有する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、サナギタケ子実体抽出物はエタノール濃度が60%以上のエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を40~100分の抽出時間で抽出して獲得することができる。よって、サナギタケ子実体抽出物が含有するサナギタケカロテノイドは効率的にエタノール水溶液に溶出させ、サナギタケ子実体抽出物の1kgにつき含有するサナギタケカロテノイドが500mg以上に達するようにし、サナギタケ子実体抽出物を獲得する方法の製造過程を最適化する効果を有する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、サナギタケ子実体抽出物はエタノール濃度が62.9%のエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を88.3分の抽出時間で抽出して獲得することができる。よって、サナギタケ子実体抽出物が含有するサナギタケカロテノイドは効率的にエタノール水溶液に溶出され、サナギタケ子実体抽出物の1kgにつき含有するサナギタケカロテノイドが690mg以上に達するようにし、サナギタケ子実体抽出物を獲得する方法の製造過程を最適化する効果を有する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、前記のサナギタケ子実体抽出物が需要個体に経口投与される。よって、使用者はサナギタケ子実体抽出物を便利的に摂取することができ、使用者の服薬コンプライアンス(drug compliance)の向上に役に立つ効果を有する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、10~100mg/kg体重であり、2~30日間連続して投与される。よって、サナギタケ子実体抽出物は優れた光受容細胞の保護能力を有し、視感度及び視覚の対比感度の低下を防ぐことができる。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、20mg/kg体重であり、7~22日間連続して投与される。よって、サナギタケ子実体抽出物は優れた光受容細胞の保護能力を有し、視感度及び視覚の対比感度の低下を防ぐことができる。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、1~10mg/kg体重であり、7~60日間連続して投与される。よって、サナギタケ子実体抽出物は優れた光受容細胞の保護能力を有し、視感度及び視覚の対比感度の低下を防ぐことができる。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、1~3mg/kg体重であり、7~22日間連続して投与される。よって、サナギタケ子実体抽出物は優れた光受容細胞の保護能力を有し、視感度及び視覚の対比感度の低下を防ぐことができる。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、前記のサナギタケ子実体抽出物は1日当たり1~3回の頻度で連続して投与される。よって、サナギタケ子実体抽出物は優れた光受容細胞の保護能力を有し、視感度及び視覚の対比感度の低下を防ぐことができる。
本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、また、前記のサナギタケ子実体抽出物は1日当たり2回の頻度で連続して投与される。よって、サナギタケ子実体抽出物は優れた光受容細胞の保護能力を有し、視感度及び視覚の対比感度の低下を防ぐことができる。
サナギタケ黄素IIIの化学構造式を示す。 試験(A)において、異なる抽出時間で抽出したサナギタケ子実体抽出物のサナギタケカロテノイドの総含有量の変化の折れ線グラフを示す。 試験(B)において、異なるエタノール濃度のエタノール水溶液により、抽出したサナギタケ子実体抽出物のサナギタケカロテノイドの総含有量の変化の折れ線グラフを示す。 試験(C)において、エタノール水溶液のエタノール濃度と抽出時間を反応変数とし、そして獲得したサナギタケ子実体抽出物のサナギタケカロテノイドの総含有量を反応値とし、応答曲面法のモデル予測により得られた三次元曲面反応図を示す。 試験(E)において、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計の分析結果を示す。 試験(F)において、網膜光損傷モデルマウスを形成するのに用いられるLED光源が発する白光の分光写真を示す。 試験(F)において、試験の1日目に、第F1~F5組のマウスの外顆粒層領域においてアポトーシスを行う光受容細胞の数の柱状グラフを示す。Mann-Whitney U検定により分析を行った。“#”は第F1組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“*”は第F2組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“$”は第F5組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05)。 (図面代用写真)試験(F)において、試験の1日目の第F1組のマウスのTUNEL測定分析結果であり、“ONL”は外顆粒層(outer nuclear layer)の領域を示し、且つ“INL”は内顆粒層(inner nuclear layer)の領域を示す。 (図面代用写真)試験(F)において、試験の1日目に第F5組のマウスのTUNEL測定分析結果であり、“ONL”は外顆粒層の領域を示し、且つ“INL”は内顆粒層の領域を示す。 試験(G)において、試験の第-5~15日の間の、第F1~F5組のマウスの視感度の閾値の変化の折れ線グラフを示す。 試験(G)において、試験の15日目の、第F1~F5組のマウスの視感度の閾値の柱状グラフを示す。Mann-Whitney U検定により分析を行った。“#”は第F1組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“*”は第F2組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“$”は第F5組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05)。 試験(H)において、試験の15日目の、第F1~F5組のマウスの視覚の対比感度の閾値の変化折れ線グラフを示す。 試験(H)において、試験の15日目の、第F1~F5組のマウスの視覚の対比感度の視程指数の柱状グラフを示す。Mann-Whitney U検定により分析を行った。“#”は第F1組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“*”は第F2組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“$”は第F5組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05)。 試験(I)において、試験の16日目の、第F1~F5組のマウス外顆粒層領域において光受容細胞の細胞核の数の柱状グラフを示す。Mann-Whitney U検定により分析を行った。“#”は第F1組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“*”は第F2組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05);“$”は第F5組に対して有意差を有したことを表す(p<0.05)。
本発明の実施の一形態について、以下、図面を参照して説明する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物はエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を抽出して獲得することができる。例を挙げると、操作者は10gのサナギタケ子実体試料と100~1000mlのエタノール水溶液(例えば、エタノール濃度が20%以上のエタノール水溶液)を混合し、40~70℃の温度で20~100分で還流抽出することができる。抽出効率を向上させるために、還流抽出を行うと同時に、超音波振盪(振動数40 kHz)を行ってもよい。前記工程により得たサナギタケ子実体粗抽出液のろ過、減圧濃縮、冷凍乾燥を経た後、サナギタケ子実体抽出物を獲得することができる。
サナギタケ子実体試料は、台湾公告第I459953号に掲示された方法により、培養して獲得したサナギタケ子実体であってもよい。詳しく言うと、予め動物性蛋白(牛乳、肉汁の抽出物、牛胎児血清、魚粉、魚介エキス、カイコの蛹、イトミミズ)、植物性蛋白、腸内有益菌の発酵液(乳酸菌発酵液、真菌発酵液)、漢方薬の抽出物等を含むPCB(plate count broth)培地を使用して、20~24℃、90rpmの条件で3~7日に振盪培養を行って、サナギタケ菌糸体を獲得し、そのサナギタケ菌糸体を、米、玄米、或いは燕麦等を含む穀物培地に接種し、そして、18~25℃、70~90%の湿度で暗黒環境(光照強度約0Lux)にて3~7日に培養してから、18~25℃、70~90%の湿度で光照環境(光照強度500Lux以上、照射時間が毎日8~15時間)にて50日培養して、サナギタケ子実体試料を獲得することができる。
好ましくは、操作者はエタノール水溶液によりサナギタケ子実体試料の抽出を行う前に、予めサナギタケ子実体試料を乾燥させてサナギタケ乾燥物を獲得することができ(サナギタケ乾燥物の含水量が15%より低い)、また、サナギタケ子実体試料は予め粉砕する(例えば、粒径が0.4mm以下に粉砕する)ことができ、これにより、サナギタケ子実体試料がエタノール水溶液と接触する表面積を増やすことで、効率的に抽出することができる。
本発明の実施例では、100gの前記のサナギタケ子実体試料と1000mlのエタノール水溶液(エタノール濃度が62.9%のエタノール水溶液)を混合し、70℃の温度で還流抽出を88.3分行う。そして、還流抽出を行うと同時に、超音波設備(DC-100H、DELTA ULTRASONIC社より購入)で超音波振盪(振動数40 kHz)を行い、ろ過、減圧濃縮、冷凍乾燥を経た後、最終的に約5gのサナギタケ子実体抽出物を獲得する。
前記工程によって獲得したサナギタケ子実体抽出物はカロテノイド(carotenoid、以下サナギタケカロテノイドと称する)を豊富に含有し、それらのサナギタケカロテノイドのうち、水に不溶性の油溶性カロテノイドのほか、水に可溶性の水溶性カロテノイド(water-soluble carotenoid)も含む。その中に、主に図1に示すような化学構造を有するサナギタケ黄素III(cordyxanthin III,2, 3, 2’, 3’-tetradehydro-18, 17’, 18’-trinor-ε,ε-carotene-5, 5’, -diol)が含まれ(サナギタケ子実体抽出物におけるサナギタケカロテノイドの総量に対して約35%を占める)、そして、同様にカロテノイドに属するルテイン(β,ε-carotene-3,3’-diol,lutein)と比較すると、サナギタケ黄素IIIのメチル基(methyl group)の数が少なく、サナギタケ黄素IIIが優れる水溶解度を有するので、需要個体に投与されるとき、需要個体が吸収し易く、ひいては需要個体の体内にサナギタケ黄素IIIの生物活性(bioactivity)が発揮し易い。
前記工程によって獲得したサナギタケ子実体抽出物は需要個体に投与されることができ、サナギタケ子実体抽出物の活性成分(例えば、サナギタケ黄素III等のサナギタケカロテノイド)が需要個体の網膜に位置する光受容細胞(photoreceptor cell)を保護し、それらの光受容細胞のアポトーシスを避けるため、有害ブルーライト(一般的には波長が380~500nmの高エネルギー可視光線を指す)の照射による網膜変性(retinal degeneration)を防止して、ひいては抗ブルーライト損傷効果の薬物の製造に用いられることができるという効果を有する。サナギタケ子実体抽出物は医薬的に許容可能なキャリアとさらに組み合わせて、医薬組成物として形成されることができ、そして、サナギタケ子実体抽出物は例えば錠剤、カプセル剤、粉薬、粒剤または液剤等、いかなる投与に便利な形式として製造されてもよく、或いはサナギタケ子実体抽出物を他の食品または飲料と組み合わせて食用に適合な食品の様態で生物体に経口投与されることができる。
また、需要個体はマウスである場合、サナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、10~100mg/kg体重で需要個体に投与することができ、投与量が1日当たり、20mg/kg体重で需要個体に投与することが好ましい。そして、サナギタケ子実体抽出物は2~30日間連続して需要個体に投与することができ、好ましくは7~22日間連続して需要個体に投与する。さらに、サナギタケ子実体抽出物は1日当たり1~3回の頻度で連続して投与することができ、好ましくは1日当たり2回の頻度で連続して投与する。
なお、体表面積(body surface area、略称BSA)の投与量転換(dose translation)の式(“Dose translation from animal to human studies revisited”学術雑誌論文、Reagan-Shaw et al. (2008),《FASEB Journal》を参照する)によってさらに前記の投与量を算出し、需要個体がヒトである場合、サナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、1~10mg/kg体重で需要個体に投与することができ、投与量が1日当たり、1~3mg/kg体重で需要個体に投与することが好ましい。そして、サナギタケ子実体抽出物は7~60日間連続して需要個体に投与することができ、好ましくは7~22日間連続して需要個体に投与する。さらに、サナギタケ子実体抽出物は1日当たり1~3回の頻度で連続して投与することができ、好ましくは1日当たり2回の頻度で連続して投与することが判明する。
本発明のサナギタケ子実体抽出物は、豊富なサナギタケカロテノイドを含み、且つその中にサナギタケ黄素III等のサナギタケカロテノイドも含まれることを証明するために、以下に示す試験を行った。
(A)抽出条件の最適化(一)
本試験において、エタノール濃度が65%のエタノール水溶液を抽出剤として、55℃の温度で上記のような方法で獲得したサナギタケ子実体試料を還流抽出し、抽出時間はそれぞれ20、40、60、80、100分であり、且つ、還流抽出を行うと同時に、超音波設備により超音波振盪(振動数40 kHz)を行い、そして、抽出したサナギタケ子実体抽出物はろ過、減圧濃縮、冷凍乾燥を経た後、分光測色器により445nmの波長の吸光度を測定し、サナギタケカロテノイドの総含有量を算出した(“Metabolic Responses of Carotenoid and Cordycepin Biosynthetic Pathways in Cordyceps militaris under Light-Programming Exposure through Genome-Wide Transcriptional Analysis”学術雑誌論文、Thananusak et al. (2020),《Biology》を参照)。
図2に示すように、抽出時間が20~100分の範囲であれば、ナギタケ子実体試料からサナギタケカロテノイドを抽出することができ、抽出時間が60~100分であることが好ましい。
(B)抽出条件の最適化(二)
本試験において、エタノール濃度がそれぞれ20%、40%、60%、80%及び95%であるエタノール水溶液を抽出剤として、60℃の温度で上記のような方法で獲得したサナギタケ子実体試料を還流抽出し、抽出時間は50分であり、且つ、還流抽出を行うと同時に、超音波設備により超音波振盪(振動数40 kHz)を行い、そして、抽出したサナギタケ子実体抽出物はろ過、減圧濃縮、冷凍乾燥を経た後、上記の分光測色法によりサナギタケカロテノイドの総含有量を獲得した。
図3に示すように、エタノール濃度が20%以上であれば、ナギタケ子実体試料からサナギタケカロテノイドを抽出することができ、エタノール濃度が40%以上であるエタノール水溶液が優れた効果を有した。
(C)抽出条件の最適化(三)
続いて、使用したエタノール水溶液のエタノール濃度と抽出時間を反応変数(response variable)として、そして獲得したサナギタケ子実体抽出物のサナギタケカロテノイドの総含有量を反応値(response)として、応答曲面法(response surface methodology,RSM)のモデル予測を行い、各反応変数の統計結果が変数分析法(analysis of variance,ANOVA)によって得た結果を表1のように示し、且つその結果の三次元曲面反応図を図4のように示した。
Figure 2023059239000002
Figure 2023059239000003
表1と図4の結果を参照すると、Design Expert 8.0ソフトウェアの分析により、エタノール濃度62.9%であるエタノール水溶液で抽出を行い、且つ抽出時間は88.3分の場合、最大量のサナギタケカロテノイドを含むサナギタケ子実体抽出物を獲得できることが判明し、且つサナギタケ子実体抽出物のサナギタケカロテノイド濃度が690.8mg/kgであると予測された。
(D)抽出条件の最適化(四)
本試験において、エタノール濃度が62.9%であるエタノール水溶液を抽出剤として、65℃の温度で上記のような方法で獲得したサナギタケ子実体試料を還流抽出し、抽出時間は88.3分であり、且つ、還流抽出を行うと同時に、超音波設備により超音波振盪(振動数40 kHz)を行い、そして、抽出したサナギタケ子実体抽出物はろ過、減圧濃縮、冷凍乾燥を経た後、分光測色器によりサナギタケカロテノイドの総含有量を獲得した。そして、上記の最適条件により獲得したサナギタケ子実体抽出物のサナギタケカロテノイド濃度が691.7±1.5 mg/kgであると判明し、上記の予測結果に相似した。
(E)サナギタケカロテノイドの同定
本試験において、エタノール濃度が62.9%であるエタノール水溶液を抽出剤として、65℃の温度で還流抽出88.3分を行い、且つ、還流抽出を行うと同時に、超音波設備により超音波振盪(振動数40 kHz)を行い、そして、ろ過、減圧濃縮、冷凍乾燥を経た後のサナギタケ子実体抽出物を、メタノールに溶解させ、サナギタケ子実体抽出物の濃度が1mg/mlになるようにした後、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS)により同定を行った。
詳しく言うと、サナギタケカロテノイドを含む留分(fraction)を収集した後、質量検出器(MSD-TRAP-XCT)を用いて分離液を分析した。正電荷モード質量検出器のパラメーターとしては、イオンスプレー電圧(ion spray voltage,IS)は4500Vであり、霧化気体圧力(nebulizer gas pressure)は12psiであり、窒素カーテン圧力(nitrogen curtain gas pressure)は10psiであり、加熱器温度(heater temperature)は450℃であり、衝突誘起解離(collision induced dissociation,CID)気体圧力は6psiであった。
図5に示すように、サナギタケ子実体抽出物の分析結果により、523m/zにて信号が示されることが判明したので、サナギタケ子実体抽出物の水溶性サナギタケカロテノイドが、少なくとも分子量(molecular weight)が522Daの水溶性サナギタケカロテノイドを含むと推断し、よく知られているサナギタケ黄素(“Composition and Characterization of Cordyxanthins from Cordyceps militaris fruit bodies”学術雑誌論文、Dong et al. (2013),《Journal of Functional Foods》を参照する)と比較すると、サナギタケ子実体抽出物の水溶性サナギタケカロテノイドのうち、主にサナギタケ黄素IIIであることが判明した。
そして、サナギタケ子実体抽出物は生体の体内に網膜に位置する光受容細胞を保護し、有害ブルーライトの照射による網膜変性(retinal degeneration)を防止して、ひいては抗ブルーライト損傷効果の薬物の製造を用いられることができることを証明するために、上記の最適条件により獲得したサナギタケ子実体抽出物を使用して試験を行った。24mgのサナギタケ子実体抽出物を800μLのキャリア溶液に溶解させ、キャリア溶液が50重量%の水、20重量%のポリエチレングリコール400(polyethylene glycol 400,PEG400)及び30重量%のプロパントリオール(glycerol)を含み、さらに、PH値が11以上となるように、10μLの水酸化ナトリウム水溶液(濃度は12Nである)を加えた。オーバーナイトで振盪させた後、さらに35~40μLの塩酸水溶液(濃度は4Nである)により、pH値が7~7.5となるように調整しておいた。
(F)網膜光損傷モデルマウスの準備
以下の試験において、8~14周齢のICR(BLTW:CD1)マウス(BioLASCO Taiwan Co.,Ltdより購入)を採用し、温度が23±2℃、湿度が55±7%である飼育室に飼育し、且つ食物及び水を自由に取れるようにし、且つ表2に示すようにマウスをそれぞれF1~F5組に分けた(各4匹)。
Figure 2023059239000004
試験の1~5日目に、1日当たり2回の頻度(毎日の午後5時と朝9時)で経管摂食(oral gavage)によりキャリア溶液(第F1、F2組)、低剤量のルテイン粉末(第F3組)、高剤量のルテイン粉末(第F4組)、サナギタケ子実体抽出物(第F5組)それぞれを上記マウスに経口投与した。また、試験の0日目に、第F2~F5組のマウスを箱に置き、その箱を錫箔により包み、上方にLED光源が設置された。LED光源は14000~20000Luxの光通量の白光を発することができ、その白光の分光写真(spectrogram)は図6に示した(波長が380~500nmの有害ブルーライトは可視光線の光通量の約27.1%を占め、即ち約3800~5500Luxである)。LED光源の白光により、第F2~F5組のマウスに対して4~5時間の光照射処理を行い、それらのマウスの網膜の光受容細胞(photoreceptor cell)がアポトーシス(apoptosis)を発生させ、ひいては網膜光損傷モデル(light-induced retinal damage model)マウスが形成された。
さらに、試験の0~15日目に、依然として1日当たり2回の頻度でキャリア溶液(第F1、F2組)、低剤量のルテイン粉末(第F3組)、高剤量のルテイン粉末(第F4組)、サナギタケ子実体抽出物(第F5組)それぞれを上記マウスに経口投与した。
(F)アポトーシスの分析結果
試験の1日目(第F2~F5組のマウスに対して24時間の光照射処理を行った)に、上記の第F1~F5組のマウスを犠牲にした後、早めにマウスの目を取り、そして目を固定液で固定した。固定した目を石蝋(paraffin)で包み、垂直切片をした。外顆粒層(outer nuclear layer,ONL)の領域を含む切片を選択し、TUNEL測定(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP nick and labeling assay)を行い、即ち末端デオキシヌクレオチド転移酵素(terminal deoxynucleotidyl transferase,TdT)で、ブロモデオキシウリジン(bromodeoxyridine,BrdU)或いは緑色螢光蛋白質(green fluorescent protein,GFP)等の標記物により標記したデオキシウリジン3リン酸(2’-deoxyuridine 5’-triphosphate,dUTP)を、断裂DNAが生成した3’-ヒドロキシ基粘着末端(3’-OH sticky end)に混ぜて、そして抗体によりその標記物を認識し染色した。これにより、各組マウス切片のDNA断片(DNA fragmentation)を標記して外顆粒層領域においてアポトーシスを行う光受容細胞の数を計算することができる。
図7に示すように、光照射処理は大量な光受容細胞がアポトーシスを行うことに至り(第F2組)、予めサナギタケ子実体抽出物を摂取させることによりアポトーシスを行う光受容細胞の数の減少に役に立った(第F5組)。且つ、その効果は予め低剤量のルテイン粉末或いは高剤量のルテイン粉末を摂取させることより、明らかに優れていた(第F3、F4組)。第F3、F5組のTUNEL染色分析結果はそれぞれ図8、9に示した。
以下に述べる視感度(visual acuity,VA)及び視覚の対比感度(visual contrast sensitivity function,VCSF)等の試験は動物の視運動反射(optomotor reflex,OMR)に基づいて行うものであった。各試験の閾値は受験マウスの視野(visual field)が刺激グレーチング(stimulus grating)が現れたときに、受験したマウスの反射的頭部移動(reflexive head movement)により決定されるものであった。詳しく言うと、受験マウスを高い台の上に乗せて、高い台の前方にディスプレイを設置し、マウスとディスプレイとの距離は15cmであり、マウスの視野は110×90°を遮蔽した。ディスプレイは刺激グレーチングを表示し、受験マウスの視運動反射を誘発するのに用いられた(刺激グレーチングは相同幅及び相同間隔距離を有する複数の垂直グレーチングである)。操作者は受験マウスの頭部及び体の反射運動(即ち、受験マウスの頭部及び体は刺激グレーチングと共に移動する)を記録し、受験マウスの閾値を獲得した。
(G)視感度試験
試験を行う前の5日目(第-5日)、試験の0日目(光照射処理を行った後)及び5、10、15日目にそれぞれ視感度試験を行った。
視感度試験において、操作者はディスプレイの刺激グレーチングの対比を100%に設定し、ディスプレイは0.033、0.055、0.082、0.162、0.328及び0.437の周期/度(cycle per decree,cpd)の空間頻度(spatial frequency)、及び1秒当たり12度(°)の固定回転速度(constant rotational speed)により、水平に浮んで移動して全画面矩形波(full-screen square wave)からなる間歇性刺激(episodic stimulus)を表示した。刺激グレーチングが始まった後、上記反射運動が刺激グレーチングと同調しなくなるまで、操作者が受験マウスの頭部及び体の反射運動を記録した(即ち、受験マウスの頭部及び体は刺激グレーチングと共に移動するかどうかを記録する)。これにより、100%の対比にて受験マウスの閾値を獲得した。
図10に示すように、光照射処理を行った後、第F2~F5組のマウスの視感度は損傷を受けたが、予めサナギタケ子実体抽出物を摂取させた第F5組のマウスの視感度損傷が比較的に低かった(第0日)。15日を経た後、予め低剤量又は高剤量のルテインを摂取させた第F3、F4組のマウスでも、予めにサナギタケ子実体抽出物を摂取させた第F5組のマウスでも、視感度の閾値が向上したが、予めサナギタケ子実体抽出物を摂取させた第F5組のマウスが優れた回復効果を有した。
続いて図11に示すように、例えば15日目の試験結果により、光照射処理は受験マウスの視感度を破壊した(第F2組)。そして、予めサナギタケ子実体抽出物を摂取させることにより受験マウスの視感度の回復に役に立ち(第F5組)、且つ、予めに低剤量又は高剤量のルテインを摂取させること(第F3、F4組)と比べ、明らかに優れた効果を有した。
(H)視覚の対比感度試験
試験の15日目に視覚の対比感度試験を行った。
視覚の対比感度試験において、操作者はディスプレイの刺激グレーチングの対比をそれぞれ10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、及び100%等の異なったレベルに設定し、そして上記の試験を繰り返した。これにより、受験マウスが10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及び100%等の対比における閾値を獲得した。よって、図12のような視覚の対比感度曲線(VSCF curve)を描くことができ、そして視覚の対比感度曲線下の面積に基づいて、図13に示した視覚の対比感度の視程指数(VSCF visibility index)を算出した。
図12、13に示すように、光照射処理は受験マウスの視覚の対比感度曲線を縮小させ、視覚の対比感度の視程指数を低下させ(第F2組)、予めサナギタケ子実体抽出物を摂取させることにより受験マウスの視感度の視程指数の回復に役に立ち(第F5組)、且つ、予め低剤量又は高剤量のルテインを摂取させること(第F3、F4組)と比べ、明らかに優れた効果を有した。
(I)組織染色結果の分析
試験の16日目に、上記第F1~F5組のマウスを犠牲した後、早めにマウスの目を取り、そして目を固定液で固定した。固定した目を石蝋(paraffin)で包み、垂直切片をした(厚さは5μmである)。外顆粒層及び内顆粒層の領域を含む切片を選択し、ヘマトキシリン-エオジン染色(hematoxylin and eosin stain,H&E stain)を行い、視神経頭との距離が0.4~0.6mmである細胞核の数を算定した。
図14に示すように、光照射処理は光受容細胞の死亡に至らせ、染色できた細胞核の数が下がり(第F2組)、予めサナギタケ子実体抽出物を摂取させることにより光受容細胞の死亡を緩和することに役に立ち、染色された細胞核の数を向上させ(第F5組)、且つ、予め低剤量のルテインを摂取させること(第F3組)と比べ、明らかに優れた効果を有したが、高剤量のルテインを摂取させること(第F4組)とは有意差はなかった。
綜合すると、本発明のサナギタケ子実体抽出物の使用は、サナギタケ子実体抽出物が含有する活性成分(例えば、サナギタケ黄素III等のサナギタケカロテノイド)により、需要個体の網膜に位置する光受容細胞を保護し、それらの光受容細胞のアポトーシスを避けるため、有害ブルーライト(一般的には波長が380~500nmの高エネルギー可視光線を指す)の照射による網膜変性を防止して、ひいては抗ブルーライト損傷効果の薬物の製造を用いられることができるという効果を有する。
本発明は、その精神と必須の特徴事項から逸脱することなく他のやり方で実施することができる。従って、本明細書に記載した好ましい実施形態は例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

Claims (14)

  1. 抗ブルーライト損傷効果を向上するための薬物を製造するのに用いられるサナギタケ子実体抽出物の使用であって、前記サナギタケ子実体抽出物は、エタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を抽出して獲得されるものであることを特徴とするサナギタケ子実体抽出物の使用。
  2. 前記サナギタケ子実体抽出物が、エタノール濃度が20%以上のエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を抽出して獲得されるものであることを特徴とする請求項1に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  3. 前記サナギタケ子実体抽出物が、エタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を20~100分抽出して獲得されるものであることを特徴とする請求項1に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  4. 前記サナギタケ子実体抽出物は、エタノール濃度が60%以上のエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を40~100分の抽出時間で抽出して獲得されるものであることを特徴とする請求項1に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  5. 前記サナギタケ子実体抽出物は、エタノール濃度が62.9%のエタノール水溶液により、サナギタケ子実体試料を88.3分の抽出時間で抽出して獲得されるものであることを特徴とする請求項4に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  6. 前記のサナギタケ子実体抽出物が需要個体に経口投与されることを特徴とする請求項1~5のいずれか1項に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  7. 前記の需要個体はマウス個体であり、前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、10~100mg/kg体重であり、2~30日間連続して投与されることを特徴とする請求項6に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  8. 前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、20mg/kg体重であり、7~22日間連続して需要個体に投与されることを特徴とする請求項7に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  9. 前記のサナギタケ子実体抽出物は1日当たり1~3回の頻度で需要個体に連続して投与されることを特徴とする請求項7に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  10. 前記のサナギタケ子実体抽出物は1日当たり2回の頻度で需要個体に連続して投与されることを特徴とする請求項9に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  11. 前記の需要個体はヒト個体であり、前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、1~10mg/kg体重であり、7~60日間連続して需要個体に投与されることを特徴とする請求項6に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  12. 前記のサナギタケ子実体抽出物の投与量は1日当たり、1~3mg/kg体重であり、7~22日間連続して需要個体に投与されることを特徴とする請求項11に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  13. 前記のサナギタケ子実体抽出物は1日当たり1~3回の頻度で需要個体に連続して投与されることを特徴とする請求項11に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
  14. 前記のサナギタケ子実体抽出物は1日当たり2回の頻度で需要個体に連続して投与されることを特徴とする請求項13に記載のサナギタケ子実体抽出物の使用。
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