JP2022549360A - Ｖｍｄ２プロモーターからの構成的活性型ｒａｐ１ａの発現のための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結された、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物が開示される。本明細書に開示される核酸構築物を含むベクターが開示される。本開示の核酸構築物またはベクターを含む組成物が開示される。また、一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法が開示される。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月２５日出願の米国仮特許出願第６２／９０５，８８０号の利益を主張するものであり、ここにその全体を参照により本明細書に組み込まれる。

連邦がスポンサーとなる研究に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＥＹ０１７０１１およびＥＹ０１５１３０の下で政府の支援によりなされたものである。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。

配列表への参照
２０１９年９月２５日に提出された配列表は、２０１９年９月２４日に作成され、４，５，４７バイトのサイズを有する「２１１０１＿０４０２Ｕ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして、米国特許法規則１．５２（ｅ）（５）に従い、ここに参照により組み込まれる。

加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）は、依然として世界中の高齢者における法的盲の主要な原因である。網膜色素上皮（ＲＰＥ）の機能不全は、新生血管型および萎縮型の両方のＡＭＤに先行して生じ、これらの末期型のＡＭＤの病因において重要である可能性がある。ＲＰＥは、網膜のホメオスタシスにおいて極めて重要な単層の分極細胞である。ＲＰＥは、外側の網膜への栄養素および酸素の送達、ならびに光受容体からの代謝廃棄物の除去を調節しながら、外側の血液－網膜関門を維持する。ＲＰＥはまた、網膜および脈絡毛細血管を支持する生理学的なレベルで、成長因子を産生する。老化および病的ストレスの増加に伴い、ＲＰＥはこれらの機能の効率を失う可能性がある。その結果、ブルッフ膜内に破片が蓄積すると、ＲＰＥのすぐ下にドルーゼンとして現れる。機能不全が進行するにつれて、ＲＰＥのバリアの完全性が損なわれ、ストレスを受けたＲＰＥは病的なレベルで成長因子を放出し、進行性ＡＭＤに繋がる。したがって、ＲＰＥの機能を維持または復元する戦略は、ＡＭＤ療法の潜在的な標的となる可能性がある。

そのため、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療するための組成物および方法が本明細書に開示される。

活性型Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結された、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物が開示される。

本明細書に開示される核酸構築物を含むベクターが開示される。

本明細書に開示される核酸構築物またはベクターを含む組成物が開示される。

本明細書に開示される核酸構築物またはベクターのうち一つまたは複数を含む組換え細胞が開示される。

核酸構築物、ベクター、または組成物のうちの一つまたは複数を、それを必要とする対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法が開示される。

本明細書に開示される核酸構築物、ベクター、または組成物のうちの一つまたは複数を対象に投与することを含む、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する方法が開示される。

本明細書に開示される核酸構築物、ベクター、または組成物のうちの一つまたは複数を対象に投与することを含む、脈絡膜組織における炎症シグナル伝達を低減する方法が開示される。

本明細書に開示される核酸構築物、ベクター、または組成物のうちの一つまたは複数を対象に投与することを含む、脈絡膜組織におけるＶＥＧＦ発現を低減する方法が開示される。

本開示の方法および組成物の追加的な利点は、以下の説明に部分的に記載されるものとなるか、部分的にはこの説明から理解されるものとなるか、または本開示の方法および組成物の実践によって学習され得る。本開示の方法および組成物の利点は、添付の特許請求の範囲で具体的に指摘される要素および組合せによって実現され達成されるものとなる。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、いずれも例示および説明にすぎず、特許請求の範囲にあるような本発明を制限するものではないことが理解されよう。

本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成する添付の図面は、本開示の方法および組成物の複数の実施形態を例示し、説明と併せて、本開示の方法および組成物の原理を説明するのに役立つ。

図１Ａおよび図１Ｂは、（Ａ）ＲＰＥ６５プロモーター（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＣＡＲａｐ１ａおよびｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＧＦＰ）または（Ｂ）ＶＭＤ２プロモーター（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａおよびｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰ）によって駆動される構成的活性型Ｒａｐ１ａ（ＣＡＲａｐ１ａ）またはＧＦＰのみを送達する自己相補型アデノ随伴ウイルス２（ｓｃ－ＡＡＶ２）ベクターの図を示す。 図１Ａおよび図１Ｂは、（Ａ）ＲＰＥ６５プロモーター（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＣＡＲａｐ１ａおよびｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＧＦＰ）または（Ｂ）ＶＭＤ２プロモーター（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａおよびｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰ）によって駆動される構成的活性型Ｒａｐ１ａ（ＣＡＲａｐ１ａ）またはＧＦＰのみを送達する自己相補型アデノ随伴ウイルス２（ｓｃ－ＡＡＶ２）ベクターの図を示す。 図２Ａおよび図２Ｂは、野生型マウスのＲＰＥにおけるｓｃ－ＡＡＶ２形質導入のｉｎ ｖｉｖｏ分析を示す。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＧＦＰまたはｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰベクターを用量５×１０⁸ウイルス粒子／μｌで注射して５週間後の野生型マウスの網膜凍結切片における（Ａ）ＧＦＰのＭｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜イメージング、ならびに（Ｂ）ＧＦＰおよびＲＰＥ６５の免疫染色である。 図２Ａおよび図２Ｂは、野生型マウスのＲＰＥにおけるｓｃ－ＡＡＶ２形質導入のｉｎ ｖｉｖｏ分析を示す。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＧＦＰまたはｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰベクターを用量５×１０⁸ウイルス粒子／μｌで注射して５週間後の野生型マウスの網膜凍結切片における（Ａ）ＧＦＰのＭｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜イメージング、ならびに（Ｂ）ＧＦＰおよびＲＰＥ６５の免疫染色である。 図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ベクターが、ＲＰＥにおいてより特異的なＧＦＰ形質導入とより大きなＲａｐ１発現とを示すことを示す。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５またはｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２のどちらかを注射した野生型マウスの（Ａ）網膜凍結切片におけるＧＦＰのＩＨＣ、（Ｂ～Ｃ）ＲＰＥ／脈絡膜におけるＲａｐ１およびβ－アクチンのウェスタンブロット（Ｂは代表的なゲル画像、Ｃはデンシトメトリーの定量）である（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝５～６）。 図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ベクターが、ＲＰＥにおいてより特異的なＧＦＰ形質導入とより大きなＲａｐ１発現とを示すことを示す。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５またはｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２のどちらかを注射した野生型マウスの（Ａ）網膜凍結切片におけるＧＦＰのＩＨＣ、（Ｂ～Ｃ）ＲＰＥ／脈絡膜におけるＲａｐ１およびβ－アクチンのウェスタンブロット（Ｂは代表的なゲル画像、Ｃはデンシトメトリーの定量）である（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝５～６）。 図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ベクターが、ＲＰＥにおいてより特異的なＧＦＰ形質導入とより大きなＲａｐ１発現とを示すことを示す。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５またはｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２のどちらかを注射した野生型マウスの（Ａ）網膜凍結切片におけるＧＦＰのＩＨＣ、（Ｂ～Ｃ）ＲＰＥ／脈絡膜におけるＲａｐ１およびβ－アクチンのウェスタンブロット（Ｂは代表的なゲル画像、Ｃはデンシトメトリーの定量）である（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊＊ｐ＜０．０１、ｎ＝５～６）。 図４Ａおよび図４Ｂは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、レーザー誘発性ＣＮＶモデルにおいて野生型マウスで脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を低減することを示す。（Ａ）ＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントの代表的な画像、および（Ｂ）ＣＮＶ病変の定量化（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２に対し＊ｐ＜０．０５、マウス１２頭からｎ＝４０のスポット）。 図４Ａおよび図４Ｂは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、レーザー誘発性ＣＮＶモデルにおいて野生型マウスで脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を低減することを示す。（Ａ）ＲＰＥ／脈絡膜フラットマウントの代表的な画像、および（Ｂ）ＣＮＶ病変の定量化（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２に対し＊ｐ＜０．０５、マウス１２頭からｎ＝４０のスポット）。 図５Ａ～図５Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、ＲＰＥ／脈絡膜における炎症およびＶＥＧＦを低減することを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）リン酸化ＮＦ－κＢおよび（Ｃ～Ｄ）ＶＥＧＦのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝５～６）。 図５Ａ～図５Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、ＲＰＥ／脈絡膜における炎症およびＶＥＧＦを低減することを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）リン酸化ＮＦ－κＢおよび（Ｃ～Ｄ）ＶＥＧＦのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝５～６）。 図５Ａ～図５Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、ＲＰＥ／脈絡膜における炎症およびＶＥＧＦを低減することを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）リン酸化ＮＦ－κＢおよび（Ｃ～Ｄ）ＶＥＧＦのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝５～６）。 図５Ａ～図５Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、ＲＰＥ／脈絡膜における炎症およびＶＥＧＦを低減することを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）リン酸化ＮＦ－κＢおよび（Ｃ～Ｄ）ＶＥＧＦのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝５～６）。 図６Ａ～図６Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、アポトーシスおよびオートファジーを活性化しないことを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）カスパーゼ３および（Ｃ～Ｄ）ＬＣ３Ａ／Ｂのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５；ｎ＝５～６；ＣＣ、シトクロムＣ処理細胞溶解物）。 図６Ａ～図６Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、アポトーシスおよびオートファジーを活性化しないことを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）カスパーゼ３および（Ｃ～Ｄ）ＬＣ３Ａ／Ｂのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５；ｎ＝５～６；ＣＣ、シトクロムＣ処理細胞溶解物）。 図６Ａ～図６Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、アポトーシスおよびオートファジーを活性化しないことを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）カスパーゼ３および（Ｃ～Ｄ）ＬＣ３Ａ／Ｂのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５；ｎ＝５～６；ＣＣ、シトクロムＣ処理細胞溶解物）。 図６Ａ～図６Ｄは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、アポトーシスおよびオートファジーを活性化しないことを示す。レーザー処置の７日後のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２を注射された野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜における（Ａ～Ｂ）カスパーゼ３および（Ｃ～Ｄ）ＬＣ３Ａ／Ｂのウェスタンブロットである（ＡおよびＣは代表的なゲル画像、ＢおよびＤはデンシトメトリーの定量；ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５；ｎ＝５～６；ＣＣ、シトクロムＣ処理細胞溶解物）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。 図７Ａ～図７Ｋは、アデノウイルス形質導入によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーおよび細胞死を増加させることなくＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢの活性化を低減することを示す。（Ａ）ウイルスを形質導入されたＲＰＥ、ならびに（Ｂ～Ｃ）Ｒａｐ１タンパク質、（Ｄ～Ｅ）ＶＥＧＦタンパク質、（Ｆ）リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）および総ＮＦ－κＢ、（Ｇ～Ｈ）ＬＣ３Ａ／Ｂタンパク質、ならびに（Ｉ）カスパーゼ３および切断型カスパーゼ３のウェスタンブロット；ならびに（Ｊ～Ｋ）ＧＦＰ（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰおよび構成的活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルスにより形質導入されたヒトＲＰＥにおけるＴＵＮＥＬ染色である（Ａｄ－ＧＦＰに対し＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；ｎ＝３；図ＩのＣＣはシトクロムＣ 処理細胞溶解物を指す）。

本開示の方法および組成物は、具体的な実施形態の以下の詳細な説明およびそこに含まれる実施例、ならびに図およびそれらの前後の説明を参照することにより、より容易に理解され得る。

本開示の方法および組成物は、別段の指定がない限り、特定の合成方法、特定の分析技術、または具体的な試薬に限定されず、それゆえに変化し得ることが理解されよう。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。

本開示の方法および組成物に用いることができるか、本開示の方法および組成物と併せて用いることができるか、本開示の方法および組成物の調製に用いることができるか、または本開示の方法および組成物の製品である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される際に、これらの複合物の様々なそれぞれの個物ならびに集合的な組合せおよび並べ替えの具体的な参照が明示的に開示されない場合があるが、それぞれは本明細書に具体的に想定および記載されていることが理解される。ゆえに、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスのみでなく分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスも開示され、かつ組合せ分子の一例Ａ－Ｄが開示されている場合、そしてそれぞれが個別に記載されていない場合であっても、それぞれは個別におよび集合的に想定される。ゆえに、この例では、組合せＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、およびＣ－Ｆのそれぞれは、明確に想定されており、ＡとＢとＣ、ＤとＥとＦの開示、および組合せ例Ａ－Ｄから開示されているものと考えられるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組合せも、明確に想定され開示されている。ゆえに、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、およびＣ－Ｅのサブグループは、明確に想定されており、ＡとＢとＣ、ＤとＥとＦ、および組合せの一例Ａ－Ｄの開示から開示されているものと考えられるべきである。この概念は、本開示の組成物を作製し使用する方法のステップを含むがこれに限定されない、本願のすべての態様に適用される。ゆえに、実施可能な種々の追加的なステップがある場合、これらの追加ステップのそれぞれが、本開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組合せを用いて実施することができること、ならびにそのような組合せのそれぞれが、明確に想定されており、開示されているものと考えられるべきであることが理解される。

Ａ．定義
本開示の方法および組成物は、記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるものとなることも理解されるべきである。

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、別段に文脈によって明確に規定されない限り、複数の参照を含むことに留意しなければならない。ゆえに、例えば、「核酸配列」への言及は、複数のそのような核酸配列を含み、「ベクター」への言及とは、当業者に公知の一つまたは複数のベクターおよびその等価物などへの言及である。

「動作可能に連結された」発現とは、転写が開始できるように、プロモーター配列が目的の遺伝子のコード配列に対して位置付けられることを意味する。このことは、プロモーターが、コード配列の発現を可能にする距離で、コード配列の上流に位置することを意味する。

用語「パーセント（％）相同性」は、本明細書では、用語「パーセント（％）同一性」と互換的に用いられ、配列アライメントプログラムを用いて野生型配列とアライメントされた際の核酸またはアミノ酸配列の同一性のレベルを指す。例えば、本明細書で用いられる場合、８０％の相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定される８０％の配列同一性と同じものを意味し、したがって、所与の配列のホモログは、所与の配列の長さにわたって８０％を超える配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルとしては、以下に限定されないが、所与の配列、例えば、本明細書に記載される本発明のポリペプチドのいずれか一つのためのコード配列などに対する、８０、８５、９０、９５、９８％またはそれを超える配列同一性が挙げられる。二つの配列間の同一性を判定するために用いることのできる例示的なコンピュータプログラムとしては、以下に限定されないが、一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、およびＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、およびＴＢＬＡＳＴＮが挙げられ、それらはインターネット上で公的に入手可能である。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，１９９７も参照されたい。配列検索は、典型的には、ＧｅｎＢａｎｋ ＤＮＡ配列および他の公開データベース中の核酸配列に対して所与の核酸配列を評価する際に、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて実施される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列および他の公開データベース内のアミノ酸配列に対して、すべてのリーディングフレームで翻訳されている核酸配列を検索するために好適である。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸはどちらも、オープンギャップペナルティ１１．０および拡張ギャップペナルティ１．０のデフォルトパラメータを用いて作動され、ＢＬＯＳＵＭ－６２マトリックスを利用する。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７を参照されたい。）二つ以上の配列間の“同一性％”を決定するための選択された配列の好適なアライメントは、例えば、オープンギャップペナルティ１０．０、拡張ギャップペナルティ０．１、およびＢＬＯＳＵＭ３０類似性マトリックスを含むデフォルトパラメータにより操作される、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒバージョン１３．０．７のＣＬＵＳＴＡＬ－Ｗプログラムを用いて実行される。

本明細書で用いられる場合、用語「野生型」とは、天然起源から単離された際にその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。

用語「バリアント」および「変異体」は、本明細書では互換的に用いられる。本明細書で用いられる場合、用語「変異体」とは、参照の核酸またはタンパク質の配列と比較した際に同じ特徴を呈する改変された核酸またはタンパク質を指す。バリアントは、参照配列に対して少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセントのホモログであり得る。一部の態様では、参照配列は、ＣＡＲａｐ１ａ核酸配列または活性型Ｒａｐ１ａタンパク質配列であり得る。バリアントはまた、本明細書に開示されるｍｉＲＮＡの配列と実質的に類似したヌクレオチド配列を含み得る。「バリアント」とは、Ｎ末端および／またはＣ末端のヌクレオチドの単純な欠失に過ぎないもの以外の参照配列との何らかの方法での差異を意味し得る。バリアントはまた、または代替的に、少なくとも一つの置換および／または少なくとも一つの追加を含むことがあり、少なくとも一つの欠失があってもよい。あるいは、または追加的に、バリアントは、参照の核酸またはタンパク質に関し一つまたは複数の位置に非天然残基などの改変を含み得る。

置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せを用いて、最終誘導体またはバリアントに達してもよい。一般的に、これらの変化は、分子の変化を最小限にするために、数個のヌクレオチド上で行われる。しかし、ある特定の状況において、より大きな変化が許容され得る。

一般に、個々のバリアント配列間のヌクレオチド同一性は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％とすることができる。そのため、「バリアント配列」は、本発明の親配列または参照配列（例えば、野生型配列）に指定の同一性を有するものとすることができ、以下に限定されないが親配列の特異性および／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、および９８％、または９９％を含む生物学的機能を共有する。例えば、「バリアント配列」は、本発明の親配列または参照配列と比較して、１つ、２つ、または３つ、４つのヌクレオチド塩基変化を含有する配列とすることができ、親配列の生物学的機能、特異性、および／または活性を共有または向上する。
ゆえに、「バリアント配列」は、本発明の親配列に対し指定の同一性を有するものとすることができ、以下に限定されないが親配列の特異性および／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む生物学的機能を共有する。バリアント配列はまた、参照配列（例えば、野生型配列、ＣＡＲａｐ１ａ核酸配列または活性型Ｒａｐ１ａタンパク質配列）の特異性および／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を共有し得る。

本明細書に用いられる場合、語句「核酸」とは、ＤＮＡであるかＲＮＡであるかＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであるか、一本鎖であるか二本鎖であるか、センスであるかアンチセンスであるかに関わらず、ワトソン・クリック塩基対形成によって相補的な核酸とハイブリダイゼーションすることができる、天然のまたは合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。本発明の核酸はまた、ヌクレオチド類似体（例えば、ＢｒｄＵ）、および非ホスホジエステルヌクレオシド間結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）を含み得る。特に、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含み得るが、これらに限定されない。

本明細書に提供される組成物の「有効量」とは、所望の効果を提供するのに十分な量の組成物を意味する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、治療される疾患（または根底にある遺伝的欠損）の重症度、使用される特定の組成物、その投与様式などに応じて、対象によって変化するものとなる。そのため、正確な「有効量」を指定することはできない。しかし、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを用いて、当業者によって決定され得る。

「治療する」とは、疾患もしくは状態の影響の悪化を防止もしくは遅延させるために、または疾患の影響を部分的もしくは完全に逆転させるために、加齢性黄斑変性症の発症の感受性が増加しているか、または加齢性黄斑変性症を有する、ヒトもしくは他の哺乳動物（例えば、動物モデル）などの対象に、本発明のペプチド、核酸、ベクター、または組成物を投与することを意味する。

「予防する」とは、加齢性黄斑変性症の発症の感受性が増加した対象の可能性を最小限にすることを意味する。

「任意選択的な」または「任意選択的に」とは、以降に説明される事象、状況、もしくは材料が発生することも発生しないこともあること、ならびに、その説明がその事象、状況、もしくは材料が発生するかもしくは存在する事例および発生しないかもしくは存在しない事例を含むことを意味する。

範囲は、「約」の一つの特定の値からおよび／または「約」の別の特定の値までとして本明細書に表現されてもよい。そのような範囲が表現される際に、やはり開示されるものと明確に想定され考えられるのは、別段に文脈により具体的に標示されない限り、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までの範囲である。同様に、先行する「約」の使用によって、値が近似値として表現される際に、別段に文脈により具体的に標示されない限り、特定の値が、開示されているものと考えられるべき別の具体的に想定される実施形態を成すことが理解されよう。各範囲の端点は、別段に文脈により明確に標示されない限り、他方の端点との関連においておよび他方の端点とは独立してのどちらでも、有意であることがさらに理解されよう。結局は、明示的に開示された範囲内に含まれる個々の値および値のサブレンジの全てがまた、別段に文脈により標示されない限り、明確に想定されており、開示されているものと考えられるべきである。前述は、特定の事例においてこれらの実施形態の一部またはすべてが明示的に開示されているか否かに関わらず、適用される。

別段に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本開示の方法および組成物の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料は、本発明の方法および組成物の実践または試験に用いることができるが、特に有用な方法、デバイス、および材料は記載の通りである。本明細書に引用される刊行物およびそれらの引用される材料は、ここに参照により具体的に組み込まれる。本明細書のいかなることも、本発明が従来の発明によってかかる開示に先行する権利を有しないことを自認するものとして解釈されるべきではない。いかなる参照も従来技術を構成することを自認するものではない。参考文献の考察は、その著者の主張を述べているのであって、出願人は、引用された文書の正確性および妥当性に異議を唱える権利を留保する。本明細書には多数の刊行物が参照されているが、このような参照は、これらの文書のいずれかが当技術分野の共通の一般知識の一部を成すことの自認を構成しない。

本明細書の記載および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのその単語の変化形は、「含むが、限定されない」を意味し、例えば他の追加点、構成要素、整数、または工程を除外することを意図されるものではない。特に、一つまたは複数のステップまたは動作を含むものとして記述される方法では、各ステップが、（そのステップが「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの限定的な用語を含まない限り）列挙されているものを含むことが明確に想定され、このことは、各ステップが例えば、ステップに列挙されていない他の追加点、構成要素、整数、またはステップを排除することを意図するものではないことを意味する。

Ｂ．核酸
Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結された、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物が開示される。また、構成的活性型Ｒａｐ１ａの核酸配列に動作可能に連結された、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物が開示される。また、活性型Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結された、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物が開示される。

一部の態様では、ＶＭＤ２プロモーターは、ヒトＶＭＤ２プロモーターである。一部の態様では、ヒトＶＭＤ２プロモーターは、
ＣＡＡＴＴＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＡＣＴＡＧＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＣＡＣＴＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＴＡＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＴＡＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＧＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＡＧＧＧＣＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＧＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＴＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＴＡＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＧＧＧＧＧＴＧＴＴＧＣＣＣＴＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＡＧＣＣＧＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＴＴＴＧＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧＧＧＡＧＴＣＡＡＧＴＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＴＣＡＣＧＴＧＧＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＣＴＣＴＡＡＧＡＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＣＡＧＧＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＡＧＴＣＧＣＣＡＧＡＣＣ（配列番号１）であり得る。

一部の態様では、ＶＭＤ２プロモーターは、配列番号１のバリアントである。一部の態様では、ＶＭＤ２プロモーターは、配列番号１に６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント相同である。

一部の態様では、コードされたＲａｐ１ａタンパク質は、活性型Ｒａｐ１ａタンパク質である。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａタンパク質は、構成的活性型Ｒａｐ１ａ（ＣＡＲａｐ１ａ）核酸配列によってコードされる。本明細書で用いられる場合、用語「ＣＡＲａｐ１ａ」、「構成的活性型Ｒａｐ１ａ」、および「構成的活性型Ｒａｐ１ａ核酸」は、互換的に用いられる。言い換えれば、構成的活性型Ｒａｐ１ａ核酸配列は、活性型Ｒａｐ１ａタンパク質をコードし得る。本明細書で用いられる場合、用語「活性型Ｒａｐ１ａタンパク質」および「活性型Ｒａｐ１ａ」は、互換的に用いられる。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａタンパク質は、ヒトＲａｐ１ａタンパク質である。一部の態様では、ヒト活性型Ｒａｐ１ａをコードする構成的活性型Ｒａｐ１ａ核酸配列は、
ＡＴＧＣＧＧＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧＣＧＴＴＡＡＣＣＧＴＣＣＡＧＴＴＴＧＴＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＣＧＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＴＡＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＧＧＣＴＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＡＴＡＴＴＣＣＡＴＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＴＣＧＣＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＡＣＧＣＧＴＧＡＡＡＧＡＴＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＣＣＡＡＴＧＡＴＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＧＧＴＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＣＴＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＣＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＧＴＡＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＧＡＣＣＴＡＧＴＡＣＧＴＣＡＧＡＴＴＡＡＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡ（配列番号２）であり得る。

一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａは、配列番号２のバリアントである。一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａは、配列番号２に対し６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント相同である。一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａのバリアントは、上記の配列番号２に下線で示されたＧＡＡを含む必要がある。ゆえに、一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａのバリアントの同一性パーセントは、配列番号２に対し６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント相同であり得、配列番号２で上記に示される下線部ＧＡＡ配列を含み得る。一部の態様では、下線部ＧＡＡに存在するコドンは、グルタミン酸をコードする。一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａのバリアントは、配列番号２の下線部ＧＡＡの位置にグルタミン酸をコードする任意のコドンを含み得る。野生型Ｒａｐ１ａの核酸配列は、配列番号２のＧＡＡの場所に対応する配列でグルタミンをコードする。ゆえに、一部の態様では、グルタミンからグルタミン酸へのアミノ酸変化を結果としてもたらす核酸変異を含む核酸配列は、構成的活性型Ｒａｐ１ａの核酸配列であり得る。

一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａは、配列番号３のバリアントである。
ＡＴＧＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＧＴＴＣＡＧＧＡＧＧＣＧＴＴＧＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＴＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡＡＣＧＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＣＣＴＡＣＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＧＡＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＧＴＡＴＧＣＴＣＧＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＴＡＣＴＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＴＴＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＣＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＣＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣＴＡＴＴＡＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＣＡＣＧＴＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＡＣＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＡＧＧＡＣＡＣＧＧＡＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧＣＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＧＡＧＴＡＧＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＴＴＴＡＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＴＡＧＡＡＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＴＣＡＡＴＧＴＴＡＡＴＧＡＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＡＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＡＧ（配列番号３）
一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａは、配列番号３に対し６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント相同である。一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａのバリアントは、ＧＡＡへのＣＡＡ（配列番号３の下線部）変異を含む必要がある。一部の態様では、ＣＡＡからＧＡＡへの変異以外のさらに別の変異が存在し得る。そのため、一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａのバリアントの同一性パーセントは、配列番号３に対し６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント相同とすることができ、少なくとも、ＧＡＡ配列に対する下線部ＣＡＡの変異を含み得る。ゆえに、コードされた活性型Ｒａｐ１ａは、グルタミンからグルタミン酸への変異を含む。

一部の態様では、構成的活性型Ｒａｐ１ａは、活性型Ｒａｐ１ａをコードする。活性型Ｒａｐ１ａの一例は、
ＭＲＥＹＫＬＶＶＬＧＳＧＧＶＧＫＳＡＬＴＶＱＦＶＱＧＩＦＶＥＫＹＤＰＴＩＥＤＳＹＲＫＱＶＥＶＤＣＱＱＣＭＬＥＩＬＤＴＡＧＴＥＥＦＴＡＭＲＤＬＹＭＫＮＧＱＧＦＡＬＶＹＳＩＴＡＱＳＴＦＮＤＬＱＤＬＲＥＱＩＬＲＶＫＤＴＥＤＶＰＭＩＬＶＧＮＫＣＤＬＥＤＥＲＶＶＧＫＥＱＧＱＮＬＡＲＱＷＣＮＣＡＦＬＥＳＳＡＫＳＫＩＮＶＮＥＩＦＹＤＬＶＲＱＩＮＲＫＴＰＶＥＫＫＫＰＫＫＫＳＣＬＬＬ（配列番号４）であり得る。
一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、配列番号４に対し６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント相同である。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａのバリアントは、上記の配列番号４に太字で示される６３位のグルタミン酸（Ｅ）を含む必要がある。そのため、一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａのバリアントの同一性パーセントは、配列番号４に対し６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント相同であり得、配列番号４で上記に示される太字のＥアミノ酸を少なくとも含み得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａおよび野生型Ｒａｐ１ａは、活性Ｒａｐ１Ａ中の６３位のＱ→Ｅ変異を除いて同一である。

一部の態様では、本開示の核酸構築物のいずれかは、マーカーをコードする核酸配列をさらに含み得る。例えば、マーカーをコードする核酸配列をさらに含む、活性型Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結されたＶＭＤ２プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物が開示される。

一部の態様では、マーカーは標識であり得る。一部の態様では、マーカー遺伝子は、β－ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とすることができる。一部の態様では、マーカーは選択マーカーであり得る。哺乳類細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。

一部の態様では、ＶＭＤ２プロモーターは、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターとすることができる。誘導性プロモーターは、その活性が特定の環境条件または特異的な化合物の存在によって制御され得るプロモーターであり、したがって、対象遺伝子（例えば、構成的活性型Ｒａｐ１ａ）の発現を制御することを可能にする。一部の態様では、プロモーターは、天然の遺伝子から得ることができ、または合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。

一態様では、選択された遺伝子（例えば、構造的活性型Ｒａｐ１ａ）の転写をオンおよびオフにすることができるように、本明細書に開示される構築物内に誘導性プロモーターを含む組成物が、本明細書に開示される。これにより、細胞傷害性ウイルスタンパク質の発現によって時として引き起こされ得る細胞毒性を最小限にすることができ、ベクターを含有する細胞の安定性が増大する。例えば、高レベルのＶＳＶ－Ｇ（エンベロープタンパク質）およびＶｐｒの発現は、細胞傷害性であることがあり（Ｙｅｅ，Ｊ．－Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：９６５４－９５６８（１９９４）、それゆえに、本発明のパッケージング細胞におけるこれらのタンパク質の発現は、誘導性Ｔｅｔオペレーター系（ギブコＢＲＬ、カールスバッド、カリフォルニア州）などの誘導性オペレーター系によって制御することができ、培養培地中のテトラサイクリンの濃度による遺伝子発現の厳密な制御（すなわち、レトロウイルス粒子の生成）を可能にする。すなわち、Ｔｅｔオペレーター系では、テトラサイクリンの存在下、テトラサイクリンは、Ｔｅｔトランス活性化因子融合タンパク質（ｔＴＡ）に結合され、Ｔｅｔオペレーター配列へのｔＴＡの結合を防止し、Ｔｅｔオペレーター配列の制御下での遺伝子の発現を可能にする（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：５５４７－５５５１）。この文献は、ｔＴＡの教示について、およびＴｅｔオペレーター配列の制御下での遺伝子の発現を可能にすることについて、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。テトラサイクリンの非存在下で、ｔＴＡは、Ｔｅｔオペレーターの制御下での遺伝子の発現を防止するＴｅｔオペレーター配列に結合する。

タンパク質の発現の制御に使用され得る他の誘導性オペレーター系の例としては、１）金属イオン（例えば、メタロチオネインプロモーター）、グルココルチコイドホルモンに応答性の誘導性真核性プロモーター、および２）大腸菌のＬａｃＳｗｉｔｃｈ（商標）誘導性哺乳類発現系（ストラタジーン）（ラホヤ、カリフォルニア州）を挙げることができる。簡潔に述べれば、大腸菌ラクトースオペロンでは、Ｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーターにホモ四量体として結合し、ｌａｃ２遺伝子の転写を遮断する。アロラクトース（生理学的誘導剤）またはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、合成誘導剤）などの誘導剤は、Ｌａｃリプレッサーに結合し、立体構造変化を引き起こし、オペレーターに対するリプレッサーの親和性を効果的に減少させる。リプレッサーがオペレーターから除去された際に、ラクトースオペロンからの転写が再開する。

Ｃ．ベクター
本明細書に開示される核酸構築物のいずれかを含むベクターが開示される。

用語「発現ベクター」は、細胞による発現に適した形態の遺伝子構築物を含有する（例えば、転写制御因子に連結されている）任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）を含む。「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの一般的に使用される形態である際に、互換的に使用される。さらに、本発明は、同等の機能を果たす他のベクターを含むことが意図されている。

一部の態様では、ベクターはウイルスベクターとすることができる。例えば、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターとすることができる。一部の態様では、ベクターは、ＤＮＡベースのベクターなどの非ウイルスベクターとすることができる。

ｉ．ウイルスベクターおよび非ウイルスベクター
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのどちらかで、開示された核酸を細胞に送達するために使用できる多くの組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、ウイルスベースの送達システムと非ウイルスベースの送達システムとの二つのクラスに大きく分類することができる。例えば、核酸は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿法、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドなどの数多くの直接送達系を通じて、または細胞における遺伝物質の移送もしくはカチオン性リポソームなどの担体を介して、送達することができる。ウイルスベクター、化学トランスフェクタント、または電気穿孔およびＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法を含む、トランスフェクションの適切な手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５－１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５－８１８，（１９９１）によって記載されている。このような方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される組成物および方法による使用に容易に適合可能である。ある特定の事例では、本方法は、大きなＤＮＡ分子で特異的に機能するように改変されるものとなる。さらに、これらの方法は、担体の標的化特性を用いることによって、ある特定の疾患および細胞集団を標的とするために用いることができる。

発現ベクターは、遺伝子もしくは遺伝子断片を細胞内に送達するために用いられる任意のヌクレオチド構築物（例えばプラスミド）、または遺伝子もしくは遺伝子断片を送達するための一般的な戦略の一部として、例えば、組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルスの一部として用いられる（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３－８８，（１９９３））、任意のヌクレオチド構築物とすることができる。例えば、Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結されたＶＭＤ２プロモーターをコードすることがコードすることができる核酸配列を含む発現ベクターが、本明細書に開示される。

発現ベクターに存在する「制御因子」とは、転写および翻訳を実施するために宿主細胞タンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、すなわちエンハンサー、プロモーター、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域である。このような因子は、その強度および特異性において様々であり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、任意の数の適切な転写因子および翻訳因子を用いてもよく、そのような因子としては、恒常的プロモーターおよび誘導性プロモーターが挙げられる。例えば、細菌系でクローニングする際には、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（ストラタジーン、ラホヤ、カリフォルニア州）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（ギブコＢＲＬ、ゲイザースバーグ、メリーランド州）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導性プロモーターが用いられてもよい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含有する細胞株を生成する必要がある場合に、ＳＶ４０またはＥＢＶをベースとするベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に用いられ得る。

エンハンサーは一般に、転写開始部位から定まった距離なく機能するＤＮＡの配列を指し、転写ユニットに対し５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のどちらかとすることができる。さらに、エンハンサーは、イントロン（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））内、ならびにコード配列自体（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））内にあり得る。それらは通常、１０ｂｐと３００ｂｐとの間の長さであり、シスで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加させるように機能する。エンハンサーはまた、転写の調節を媒介する応答因子もしばしば含有する。プロモーターは、転写の調節を媒介する応答因子も含有し得る。エンハンサーは多くの場合、遺伝子の発現の調節を決定する。現在、哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、およびインスリン）由来の数多くのエンハンサー配列が知られているが、典型的には、一般的な発現には真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するものとなる。好適な例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００～２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。

プロモーターまたはエンハンサーは、その機能を惹起する光または特定の化学事象のどちらかによって特異的に活性化されてもよい。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬によって制御され得る。また、ガンマ線照射などの照射またはアルキル化化学療法剤への曝露によってウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もある。

任意選択的に、プロモーターまたはエンハンサー領域は、本発明のポリヌクレオチドの発現を最大にするために、構成的プロモーターまたはエンハンサーとして作用することができる。ある特定の構築物では、プロモーターまたはエンハンサー領域は、特定の時点で特定のタイプの細胞にのみ発現する場合であっても、全ての真核細胞タイプで活性である。

真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または有核の細胞）で用いられる発現ベクターは、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写の終了に必要な配列も含有していてもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分において、ポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写ユニットはまた、ポリアデニル化領域を含有することが好ましい。この領域の利点の一つは、転写ユニットがｍＲＮＡのように処理され輸送される可能性が高くなることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの特定および使用は、十分に確立されている。相同ポリアデニル化シグナルが導入遺伝子構築物で用いられることが好ましい。ある特定の転写ユニットでは、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。

発現ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を用いて、遺伝子が細胞に送達されているか、ならびに送達されると発現されているかを決定することができる。マーカー遺伝子としては、以下に限定されないが、β－ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。

いくつかの実施形態では、マーカーは選択マーカーであってもよい。哺乳類細胞に適した選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択マーカーが哺乳類宿主細胞に首尾よく移送された際に、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択的な圧力下に置かれると生存することができる。選択的なレジメンには、広く用いられている二つの別個のカテゴリーがある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝と、補充培地に依存せずに成長する能力を欠いた変異細胞株の使用とに基づく。二つの例は、ＣＨＯ ＤＨＦＲ－細胞およびマウスＬＴＫ－細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養素の添加なく成長する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要なある特定の遺伝子を欠いているため、欠落したヌクレオチドが補充培地に供給されない限り生存できない。培地の補充の代替策は、それぞれの遺伝子を欠いた細胞内に無傷のＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子を導入し、それゆえにそれらの成長要件を変化させることである。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子により形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地では生存することができないものとなる。

本明細書に開示される組成物および方法と併用可能な別のタイプの選択とは優性選択であり、優性選択は、任意の細胞タイプで使用される選択スキームを指し、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の成長を阻止するために薬剤を使用する。新規の遺伝子を有するこれらの細胞は、薬剤耐性をもたらすタンパク質を発現するものとなり、選択を生き延びるものとなる。そのような優性選択の例は、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））、またはハイグロマイシン、（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０－４１３（１９８５））を用いる。この三つの例は、真核性の制御下の細菌遺伝子を採用して、適切な薬剤であるＧ４１８またはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンそれぞれに対する耐性をもたらす。他のものとしては、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピューラマイシンが挙げられる。

本明細書で用いられる場合、プラスミドまたはウイルスベクターとは、本開示の核酸、例えば、開示されたペプチドのうちの一つまたは複数をコードできる核酸配列などを、分解することなく細胞内に輸送し、かつそれが送達される細胞内に遺伝子の発現を生じるプロモーターを含む剤である。一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸配列は、ウイルスまたはレトロウイルスのどちらかに由来する。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス、シンドビス、および他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含む。また、ベクターとしての使用に適するものとするこれらのウイルスの特性を共有する任意のウイルスファミリーも好適である。レトロウイルスには、マウスマロニー白血病ウイルスＭＭＬＶ、およびベクターとしてのＭＭＬＶの望ましい特性を発現するレトロウイルスが含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子ペイロード、すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子を担持することができ、この理由から、一般的に用いられるベクターである。しかし、それらは非増殖細胞ではそれほど有用ではない。アデノウイルスベクターは比較的安定しており、作業が容易であり、高い力価を有し、エアロゾル製剤で送達することができ、非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。Ｐｏｘウイルスベクターは、大型であるゆえに遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、熱安定性であるゆえに室温で保存することができる。好適な実施形態は、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物体の免疫応答を抑制するように工学的に改変されているウイルスベクターである。このタイプの好適なベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を担持するものとなる。

ウイルスベクターは、遺伝子を細胞内に導入する化学的または物理的方法よりも高い処理遂行能力（すなわち、遺伝子を導入する能力）を有し得る。典型的には、ウイルスベクターは、非構造的な初期遺伝子、構造的な後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆位末端リピート、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして工学的に改変された場合、ウイルスは、典型的には、除去された初期遺伝子のうちの一つまたは複数を有し、遺伝子または遺伝子／プロモーターのカセットは、除去されたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム内に挿入される。このタイプの構築物は、最大約８ｋｂの外来性遺伝物質を担持することができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、トランスにおいて初期遺伝子の遺伝子産物を発現するように工学的に改変されている細胞株によって供給される。

レトロウイルスベクターは、概して、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９－２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）によって記載されており、この文献はここに参照によりその全体を組み込まれている。遺伝子療法にレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６、ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２（１９９３））に記載されており、その教示は、遺伝子療法にレトロウイルスベクターを使用する方法の教示について、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。

レトロウイルスは本質的に、核酸カーゴ内に詰め込んでいるパッケージである。この核酸カーゴは、パッケージングシグナルを担持し、パッケージングシグナルは、複製された娘分子がパッケージコート内に効率的に確実にパッケージングされるものとする。パッケージシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングのために、シスで必要な数多くの分子がある。典型的には、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含有する。標的細胞に移送されるのは、典型的には外来ＤＮＡによって置換されるｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージコートに組み込むためのパッケージングシグナルと、逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するプライマー結合部位を含む逆転写に必要な因子と、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖のスイッチをガイドする末端反復配列と、ＤＮＡ合成の第二鎖の合成のためのプライミング部位として機能するプリンリッチ配列５’ＬＴＲから３’ＬＴＲと、レトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入物を宿主ゲノム内に挿入することを可能にするＬＴＲの末端付近の特異的な配列とを含有する。この量の核酸は、各転写物のサイズに応じて、一個から多数の遺伝子を送達するのに十分である。挿入物中の他の遺伝子と共に、ポジティブ選択またはネガティブ選択の可能なマーカーのどちらかを含むことが好ましい。

殆どのレトロウイルスベクターにおける複製機構およびパッケージングタンパク質が除去されているため（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）、典型的には、それらをパッケージング細胞株に配することによってベクターが生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージングの機構を含有するがパッケージングシグナルを欠いているレトロウイルスを用いて、トランスフェクトまたは形質転換されている細胞株である。選んだＤＮＡを担持するベクターがこれらの細胞株にトランスフェクトされると、目的の遺伝子を含有するベクターは、ヘルパー細胞によりシスに提供される機構によって、複製されて新しいレトロウイルス粒子にパッケージングされる。この機構のゲノムは、必要なシグナルを欠くため、パッケージングされていない。

複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３－１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２－２８８３（１９８６）；Ｈａｊ－Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７－２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６－１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ” ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８－８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用する利点は、それらが他の細胞型に広がることのできる程度に制限されることであるが、なぜなら、それらは初期感染細胞内では複製できるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないためである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質、および多数の他の組織部位（（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０－１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１－３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５－１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４－１５９（１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ－Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９－２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１－４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５－８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：１２０１－１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５：２０７－２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７－１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１－５０７（１９９３））への直接的なｉｎ ｖｉｖｏの送達の後に高効率の遺伝子移送を達成することを示しており、上記文献の教示は、遺伝子療法にレトロウイルスベクターを使用する方法の教示について、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面受容体に結合することによって遺伝子導入を達成し、その後、ウイルスは、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じ様式で、受容体媒介性エンドサイトーシスによって内部移行される（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｄａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２－４７７（１９７０）；Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：３８６－３９６（１９７３）；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２－４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０－６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１５２８－１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１－６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：３０９－３１９（１９９３））。

ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスをベースとしたものとすることができ、これらのビロンは、ヒト２９３細胞株などの細胞株で生成される。任意選択的に、Ｅ１遺伝子とＥ３遺伝子の両方がアデノウイルスゲノムから除去される。

本発明のポリヌクレオチドを細胞内に導入するために使用できる別のタイプのウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとする。この欠損型パルボウイルスは、数多くの細胞型に感染し、ヒトに非病原性であるため、好適なベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４ｋｂから５ｋｂを輸送することができ、野生型ＡＡＶは、１９番染色体内に安定的に挿入することが知られている。この部位特異的組込み特性を含有するベクターが好適である。このタイプのベクターの特に好適な実施形態は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ－ｔｋ、または緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含有することができる、カリフォルニア州サンフランシスコのアビジェン（Ａｖｉｇｅｎ）によって生産されるＰ４．１ Ｃベクターである。

別のタイプのＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、異種遺伝子に動作可能に連結された細胞特異的発現を方向付けるプロモーターを含有する少なくとも一つのカセットの側面に位置する一対の逆位末端リピート（ＩＴＲ）を含有する。この文脈における異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに本来はない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。典型的には、ＡＡＶおよびＢ１９コード領域は欠失しており、安全な非細胞毒性ベクターが結果として生じる。ＡＡＶ ＩＴＲまたはその改変体は、感染性および部位特異的組込みをもたらすが細胞傷害性をもたらさず、プロモーターは、細胞特異的発現を方向付ける。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する材料についてその全体を参照により本明細書に組み込まれる。

ウイルスベクターおよびレトロウイルスベクター内の挿入遺伝子は、通常、プロモーター、または所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つエンハンサーを含有する。プロモーターは、概して、転写開始部位に関して比較的固定された場所にある際に機能する一つまたは複数のＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含有し、上流エレメントと応答エレメントとを含有してもよい。

他の有用なシステムには、例えば、複製のおよび宿主制限型の非複製のワクシニアウイルスベクターが含まれる。さらに、開示された核酸配列は、非核酸ベースの系において標的細胞に送達することができる。例えば、開示されたポリヌクレオチドは、電気穿孔を介して、またはリポフェクションを介して、またはリン酸カルシウム沈殿を介して、送達することができる。選択される送達機構は、部分的に、標的とされた細胞のタイプと、送達が例えばｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こっているか否かとに依存するものとなる。

そのため、組成物は、開示された発現ベクターに加えて、リポソームなどの脂質、例えばカチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ－コレステロール）またはアニオン性リポソームを含み得る。リポソームは、所望に応じて、特定の細胞を標的とすることを容易にするタンパク質をさらに含み得る。ペプチドおよびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、血液、標的臓器に投与することができ、または、気道内に吸入されて気道の細胞を標的とすることもできる。例えば、本明細書に記載のペプチドまたは核酸配列とカチオン性リポソームとを含む組成物は、対象の肺細胞に投与することができる。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５－１００（１９８９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３－７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。さらに、本化合物は、マクロファージなどの特定の細胞型を標的とすることができるマイクロカプセルの構成成分として、またはマイクロカプセルからの化合物の拡散もしくは化合物の送達が特定の速度または用量に対して設計される場合に、投与することができる。

Ｄ．組成物
本開示の核酸構築物またはベクターを含む組成物が開示される。核酸構築物を含む組成物が開示されており、ここでは、核酸構築物は、構造的活性型Ｒａｐ１ａ核酸配列に動作可能に連結されたＶＭＤ２プロモーターをコードする核酸配列を含む。核酸構築物を含む組成物が開示されており、ここでは、核酸構築物は、活性型Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結されたＶＭＤ２プロモーターをコードする核酸配列を含む。また、核酸構築物を含むウイルスベクターなどのベクターを含む組成物も開示されており、ここでは、核酸構築物は、活性型Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結されたＶＭＤ２プロモーターをコードする核酸配列を含む。

開示された組成物は、医薬的に許容可能な担体をさらに含み得る。

１．組成物の送達
本明細書に記載の方法では、細胞への組成物の送達（または投与）は、種々の機構を介して行うことができる。上記で定義されるように、本明細書に記載のペプチド、核酸、および／またはベクターのうち任意の一つまたは複数を含む組成物が、本明細書に開示されており、医薬的に許容可能な担体などの担体も含み得る組成物を作製することができる。例えば、本明細書に開示されるペプチドと医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物が開示される。

例えば、本明細書に記載の組成物は、医薬的に許容可能な担体を含み得る。「医薬的に許容可能な」とは、当業者に周知となるように、活性成分のいかなる分解も最小限とし、対象におけるいかなる有害な副作用も最小限とするために選択されるものとなる材料または担体を意味する。担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝生理食塩水、または多胞リポソームが挙げられる。例えば、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチドまたはＰＣ：ペプチドを、本発明において担体として用いることができる。他の適した医薬的に許容可能な担体およびその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載されている。典型的には、適量の医薬的に許容可能な塩が、製剤中に用いられて製剤を等張性にする。医薬的に許容可能な担体の他の例としては、以下に限定されないが、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、約５から約８または約７から約７．５とすることができる。さらに別の担体としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が挙げられ、このマトリックスは、例えば、フィルム、ステント（血管形成術の処置の間に血管に移植される）、リポソーム、または微粒子などの成形品の形態である。例えば、投与されている組成物の投与経路および濃度に応じて、ある特定の担体がより好ましい場合があることは、当業者に明らかになろう。これらは、最も典型的には、滅菌した水、生理食塩水、および生理的ｐＨの緩衝溶液などの溶液を含む、ヒトへの薬剤の投与のための標準的な担体となる。

医薬組成物はまた、本発明のポリペプチド、ペプチド、核酸、ベクターの意図される活性が損なわれない限り、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤などを含み得る。医薬組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤などの一つまたは複数の活性成分を（本発明の組成物に加えて）含んでいてもよい。医薬組成物は、局所的または全身的のいずれの治療が望ましいか、および治療される範囲に応じて、いくつかの方法で投与されてもよい。

非経口投与の調製物には、滅菌した水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性の溶液、エマルション、または懸濁液が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流体および栄養補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースをベースとするものなど）などが含まれる。保存剤および他の添加剤も存在していてもよく、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどがある。

光学投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴下剤、坐剤、スプレー、液体、および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉末基剤、または油性基剤、増粘剤などが必要であるかまたは望ましい場合がある。

経口投与のための組成物は、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤を含む。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましい場合がある。組成物の一部は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモン－、ジ－、トリアルキルおよびアリールアミン、および置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される、医薬的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与されてもよい。

本開示の送達技術は、本開示の組成物だけでなく、本開示の核酸構築物およびベクターにも用いることができる。

Ｅ．組換え細胞
本開示の核酸構築物またはベクターのうちの一つまたは複数を含む組換え細胞が開示される。例えば、核酸構築物を含む組換え細胞が開示されており、ここでは、核酸構築物は、Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結されたＶＭＤ２プロモーターをコードする核酸配列を含む。

一部の態様では、細胞は哺乳類細胞である。一部の態様では、細胞は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。

Ｆ．治療方法
一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法が開示される。

一部の態様では、組成物は、網膜下投与を介して投与される。一部の態様では、組成物は、硝子体内投与を介して投与される。一部の態様では、組成物は、硝子体内投与を介して投与され、組成物は、５×１０¹²ウイルス粒子の濃度の７Ｍ８ ＡＡＶベクター構築物を含む。本開示の方法と共に、他の既知の投与経路も用いることができる。

本開示の治療方法の一部の態様では、活性Ｒａｐ１の発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象において増加され得る。例えば、一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法が開示され、ここでは、対象にオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、Ｒａｐ１の発現が対象において増加される。一部の態様では、
活性Ｒａｐ１の発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象の網膜上皮細胞において増加され得る。例えば、一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法が開示され、ここでは、対象の網膜上皮細胞にオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、活性Ｒａｐ１の発現が対象の網膜上皮細胞において増加され得る。

一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも二倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍のレベルで発現され得る。

一部の態様では、本開示のベクターのうちの一つの最適な用量は、網膜下注射のための５×１０⁸ウイルス粒子であり得る。一部の態様では、用量は、以下に限定されないが、２．５×１０⁸、３×１０⁸、３．５×１０⁸、４×１０⁸、４．５×１０⁸、５×１０⁸、５．５×１０⁸、６×１０⁸、６．５×１０⁸、７×１０⁸、７．５×１０⁸、８×１０⁸、８．５×１０⁸、９×１０⁸、９．５×１０⁸、１×１０⁹、２×１０⁹、３×１０⁹、４×１０⁹、５×１０⁹、６×１０⁹、７×１０⁹、８×１０⁹、または９×１０⁹であり得る。一部の態様では、特に硝子体内注射では、用量がより高い場合がある。例えば、より高い用量は、以下に限定されないが、５×１０¹¹、５．５×１０¹¹、６×１０¹¹、６．５×１０¹¹、７×１０¹¹、７．５×１０¹¹、８×１０¹¹、８．５×１０¹¹、９×１０¹¹、９．５×１０¹¹、１×１０¹²、２×１０¹²、３×１０¹²、４×１０¹²、５×１０¹²、６×１０¹²、７×１０¹²、８×１０¹²、または９×１０¹²であり得る。

一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に、一つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することと組み合わせて投与することを含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法が開示される。一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、一つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することをさらに含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法が開示される。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、同時に投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、単一の製剤で共投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、別々の製剤で投与することができる。そのため、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とは、単一の製剤で一緒に製剤化されるかまたは別々の製剤で製剤化されるかに関わらず、やはり同時に投与され得る。同時投与は、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、互いに１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、または３０分以内に投与することを含み得る。

Ｇ．阻害する方法
いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する方法が開示される。

また、いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、ＣＮＶを低減する方法が開示される。開示される方法は、ＣＮＶを低減する方法の方法であって、一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む対象である、ということである。

一部の態様では、本開示の方法における投与は、網膜下投与または硝子体内投与である。一部の態様では、投与は静脈内経路によって行うことができる。

本開示の治療方法の一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａの発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象において増加され得る。例えば、一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む対象である、ＣＮＶを低減する方法の方法が開示され、ここでは、対象にオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、活性Ｒａｐ１の発現が対象において増加される。一部の態様では、活性Ｒａｐ１の発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象の網膜上皮細胞において増加され得る。例えば、一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む対象である、ＣＮＶを低減する方法である方法が開示され、ここでは、対象の網膜上皮細胞にオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、活性Ｒａｐ１の発現が対象の網膜上皮細胞において増加される。

一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも二倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍のレベルで発現され得る。

一部の態様では、本開示のベクターのうちの一つの最適な用量は、網膜下注射のための５×１０⁸ウイルス粒子であり得る。一部の態様では、用量は、以下に限定されないが、２．５×１０⁸、３×１０⁸、３．５×１０⁸、４×１０⁸、４．５×１０⁸、５×１０⁸、５．５×１０⁸、６×１０⁸、６．５×１０⁸、７×１０⁸、７．５×１０⁸、８×１０⁸、８．５×１０⁸、９×１０⁸、９．５×１０⁸、１×１０⁹、２×１０⁹、３×１０⁹、４×１０⁹、５×１０⁹、６×１０⁹、７×１０⁹、８×１０⁹、または９×１０⁹であり得る。一部の態様では、特に硝子体内注射では、用量がより高い場合がある。例えば、より高い用量は、以下に限定されないが、５×１０¹¹、５．５×１０¹¹、６×１０¹¹、６．５×１０¹¹、７×１０¹¹、７．５×１０¹¹、８×１０¹¹、８．５×１０¹¹、９×１０¹¹、９．５×１０¹¹、１×１０¹²、２×１０¹²、３×１０¹²、４×１０¹²、５×１０¹²、６×１０¹²、７×１０¹²、８×１０¹²、または９×１０¹²であり得る。

いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含み、一つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することをさらに含む、ＣＮＶを阻害または低減する方法が開示される。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、同時に投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、単一の製剤で共投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、別々の製剤で投与することができる。そのため、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とは、単一の製剤で一緒に製剤化されるかまたは別々の製剤で製剤化されるかに関わらず、やはり同時に投与され得る。同時投与は、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、互いに１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、または３０分以内に投与することを含み得る。

Ｈ．炎症性シグナル伝達を低減する方法
いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、脈絡膜組織における炎症性シグナル伝達を低減する方法が開示される。

一部の態様では、本開示の方法における投与は、網膜下、硝子体内、または静脈内投与である。

本開示の方法の一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａの発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象において増加され得る。例えば、いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、脈絡膜組織における炎症性シグナル伝達を低減する方法が開示され、ここでは、対象においてオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、活性型Ｒａｐ１ａの発現が対象において増加する。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａの発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象の網膜上皮細胞において増加され得る。例えば、いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、脈絡膜組織における炎症性シグナル伝達を低減する方法が開示され、ここでは、対象の網膜上皮細胞においてオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、活性型Ｒａｐ１ａの発現が対象の網膜上皮細胞において増加され得る。

一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも二倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍のレベルで発現され得る。

一部の態様では、本開示のベクターのうちの一つの最適な用量は、網膜下注射のための５×１０⁸ウイルス粒子であり得る。一部の態様では、用量は、以下に限定されないが、２．５×１０⁸、３×１０⁸、３．５×１０⁸、４×１０⁸、４．５×１０⁸、５×１０⁸、５．５×１０⁸、６×１０⁸、６．５×１０⁸、７×１０⁸、７．５×１０⁸、８×１０⁸、８．５×１０⁸、９×１０⁸、９．５×１０⁸、１×１０⁹、２×１０⁹、３×１０⁹、４×１０⁹、５×１０⁹、６×１０⁹、７×１０⁹、８×１０⁹、または９×１０⁹であり得る。一部の態様では、特に硝子体内注射では、用量がより高い場合がある。例えば、より高い用量は、以下に限定されないが、５×１０¹¹、５．５×１０¹¹、６×１０¹¹、６．５×１０¹¹、７×１０¹¹、７．５×１０¹¹、８×１０¹¹、８．５×１０¹¹、９×１０¹¹、９．５×１０¹¹、１×１０¹²、２×１０¹²、３×１０¹²、４×１０¹²、５×１０¹²、６×１０¹²、７×１０¹²、８×１０¹²、または９×１０¹²であり得る。

いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含み、一つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することさらを含む、脈絡膜組織における炎症性シグナル伝達を低減する方法が開示される。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、同時に投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、単一の製剤で共投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、別々の製剤で投与することができる。そのため、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とは、単一の製剤で一緒に製剤化されるかまたは別々の製剤で製剤化されるかに関わらず、やはり同時に投与され得る。同時投与は、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、互いに１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、または３０分以内に投与することを含み得る。

Ｉ．ＶＥＧＦ発現を低減する方法
いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、脈絡膜組織におけるＶＥＧＦ発現を低減する方法が開示される。

一部の態様では、本開示の方法における投与は、網膜下、硝子体内、または静脈内投与である。

本開示の治療方法の一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａの発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象において増加され得る。例えば、いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、脈絡膜組織におけるＶＥＧＦ発現を低減する方法が開示され、ここでは、対象においてオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、活性型Ｒａｐ１ａの発現が対象において増加する。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａの発現は、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、対象の網膜上皮細胞において増加され得る。例えば、いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含む、脈絡膜組織におけるＶＥＧＦ発現を低減する方法が開示され、ここでは、対象の網膜上皮細胞においてオートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、活性型Ｒａｐ１ａの発現が対象の網膜上皮細胞において増加する。

一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも二倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、または１０倍のレベルで発現され得る。一部の態様では、活性型Ｒａｐ１ａは、対照の対象において発現される活性型Ｒａｐ１ａの少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍のレベルで発現され得る。

一部の態様では、本開示のベクターのうちの一つの最適な用量は、網膜下注射のための５×１０⁸ウイルス粒子であり得る。一部の態様では、用量は、以下に限定されないが、２．５×１０⁸、３×１０⁸、３．５×１０⁸、４×１０⁸、４．５×１０⁸、５×１０⁸、５．５×１０⁸、６×１０⁸、６．５×１０⁸、７×１０⁸、７．５×１０⁸、８×１０⁸、８．５×１０⁸、９×１０⁸、９．５×１０⁸、１×１０⁹、２×１０⁹、３×１０⁹、４×１０⁹、５×１０⁹、６×１０⁹、７×１０⁹、８×１０⁹、または９×１０⁹であり得る。一部の態様では、特に硝子体内注射では、用量がより高い場合がある。例えば、より高い用量は、以下に限定されないが、５×１０¹¹、５．５×１０¹¹、６×１０¹¹、６．５×１０¹¹、７×１０¹¹、７．５×１０¹¹、８×１０¹¹、８．５×１０¹¹、９×１０¹¹、９．５×１０¹¹、１×１０¹²、２×１０¹²、３×１０¹²、４×１０¹²、５×１０¹²、６×１０¹²、７×１０¹²、８×１０¹²、または９×１０¹²であり得る。

いずれかの本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を対象に投与することを含み、一つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することさらを含む、脈絡膜組織におけるＶＥＧＦ発現を低減する方法が開示される。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、同時に投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、単一の製剤で共投与することができる。一部の態様では、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、別々の製剤で投与することができる。そのため、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とは、単一の製剤で一緒に製剤化されるかまたは別々の製剤で製剤化されるかに関わらず、やはり同時に投与され得る。同時投与は、核酸構築物、ベクター、または組成物と、抗ＶＥＧＦ剤とを、互いに１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、または３０分以内に投与することを含み得る。

Ｊ．キット
上述の材料ならびに他の材料は、開示された方法を実施するかまたは実施の一助とするのに有用なキットとして、任意の適した組合せで共に包装され得る。それは、所与のキット中のキットの構成要素が、本開示の方法で共に使用するために設計され適合されている場合に有用である。例えば、一つまたは複数の本開示の核酸構築物、ベクター、または組成物を含むキットが開示される。また、本開示のベクターのいずれかを作製するためのキットも開示され、このキットは、Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結されたＶＭＤ２プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物を含む。キットは、ベクター骨格も含有し得る。

ＧＴＰａｓｅタンパク質であるＲａｐ１ａの活性化は、炎症ストレスからＲＰＥのバリア機能を保護することが見出された。レーザー誘発性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のマウスモデルでは、Ｒａｐ１活性は、ＲＰＥおよび脈絡膜組織において低下したが、内因性Ｒａｐ１を活性化するための硝子体内８－ＣＰＴ－２Ｍｅ－ｃＡＭＰの送達は、レーザーによって誘発されたＣＮＶを阻害した。遺伝子療法は、ＲＰＥを特異的に標的とし、硝子体内送達に必要な治療数を低減する可能性のあるアプローチとして検討された。病原性が欠けており、免疫原性が低く、硝子体内中和抗体または薬理作用剤と比較して導入遺伝子の発現が比較的長期であり、形質導入効率が高いことから、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターは、網膜変性を治療するための有望なツールとなりつつある。ＲＰＥで活性型Ｒａｐ１ａを増加させるために、構成的活性型Ｒａｐ１ａ（ＣＡＲａｐ１ａ）を、ＲＰＥ６５プロモーター（ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５）によって駆動される自己相補型ＡＡＶ２（ｓｃ－ＡＡＶ２）ウイルスベクターにおいて送達すると、Ｒａｐ１ｂ欠損マウスでは実験的なＣＮＶを低減するが野生型マウスでは低減しないことが見出された。

ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５により送達されたＣＡＲａｐ１ａによる野生型マウスにおけるＣＮＶの不十分な低減は、ＲＰＥ６５プロモーターの弱い転写活性に関連することが予測された。この可能性を試験するために、ＲＰＥ６５プロモーターを、ＲＰＥの別の特異的プロモーターである卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）と比較した。二つのプロモーターＲＰＥ６５およびＶＭＤ２を、ＲＰＥにおけるＣＡＲａｐ１ａの発現の駆動、および野生型マウスにおける実験的なＣＮＶの低減において比較した。この研究では、外因性ＣＡＲａｐ１ａの発現の効果も評価し、異なる二つのプロモーターＲＰＥ６５およびＶＭＤ２により処置された眼で比較した。

１．結果
ＶＭＤ２プロモーターによって駆動される自己相補的アデノ随伴ウイルス２（ｓｃ－ＡＡＶ２）の生成。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグを有する自己相補性アデノ随伴ウイルス２（ｓｃ－ＡＡＶ２）を、本試験で使用した。ＧＦＰ単独または活性型Ｒａｐ１ａ（ＣＡＲａｐ１ａ）（図１Ａ）のどちらかを発現するマウスＲＰＥ６５プロモーターによって駆動されるｓｃ－ＡＡＶ２を生成した。ＲＰＥでの活性型Ｒａｐ１ａの送達におけるＲＰＥ６５プロモーターとＶＭＤ２プロモーターの転写活性を比較するため、マウスＶＭＤ２プロモーターをｓｃ－ＡＡＶ２ベクターにクローニングしてＲＰＥ６５プロモーターを置換し、ＧＦＰまたはＧＦＰおよび活性Ｒａｐ１ａ（ＣＡＲａｐ１ａ）のいずれかを駆動した（図１Ｂ）。

ｓｃ－ＡＡＶ２形質導入およびＲａｐ１発現のＩｎ ｖｉｖｏ分析。ウイルスの形質導入効率を決定するために、５×１０⁸ウイルス粒子／μＬでのｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５ウイルスまたはｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ウイルスを、６週齢の野生型マウスの両眼の網膜下腔内に送達した。ウイルスの形質導入を、注射後５週目にＭｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜ライブイメージングシステムを用いたＧＦＰの可視化によって決定した。図２Ａに示すように、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５およびｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２の両方がＧＦＰの発現を示したのに対し、ＰＢＳ注射された眼はＧＦＰの発現を示さなかった。ウイルスの形質導入がＲＰＥを標的としたことを確かめるために、ＧＦＰ陽性の眼を採取し、ＲＰＥ／脈絡膜凍結切片をＧＦＰ抗体およびＲＰＥ６５抗体により免疫標識した。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５ウイルスおよびｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ウイルスにより処置された眼はいずれも、ＧＦＰとＲＰＥ６５との共標識を示し（図２Ｂ）、このことは、両ウイルスベクターが野生型マウスのＲＰＥを形質導入できることを標示する。ＡＡＶ２ウイルスの形質導入の特異性をさらに決定するために、ＧＦＰの免疫染色を全網膜凍結切片で行った。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５により処置した網膜では、ＧＦＰの免疫標識は、ＲＰＥの層内だけでなく、網膜神経節細胞および視細胞外節（ＰＲ／ＯＳ）にも位置していた。しかし、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２により処置した網膜では、ＧＦＰの免疫標識は、ＲＰＥの層およびＰＲ／ＯＳにのみ見出され（図３Ａ）、このことは、ＲＰＥにおける形質導入において、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２がより高い特異性を有することを示す。

全Ｒａｐ１に対する抗体を用いたウェスタンブロットにより、Ｒａｐ１ａのタンパク質レベルを、網膜下注射の５週間後にＧＦＰ陽性の眼から得たＲＰＥ／脈絡膜組織で測定した。図３Ｂおよび図３Ｃに示されるように、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＣＡＲａｐ１ａにより処置したＲＰＥ／脈絡膜溶解物において、Ｒａｐ１タンパク質は、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰと比較して有意に増加した。しかし、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＣＡＲａｐ１ａで処置された眼は、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＧＦＰと比較してＲａｐ１タンパク質の増加を示さなかった。図２および図３のデータは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５およびｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２のどちらも野生型マウスのＲＰＥに対し形質導入したが、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２のみが効率的にＲａｐ１ａの発現を駆動したという証拠を与えている。

ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２によって送達されるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現は、野生型マウスにおいてＣＮＶを低減する。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現は、Ｒａｐ１欠損マウスにおいてレーザー誘発性ＣＮＶを低減したが、野生型マウスでは低減しなかった。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２によるＲＰＥでのＲａｐ１ａの増加が、野生型マウスにおいてレーザーにより誘発されるＣＮＶを低減するか否かを、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５の網膜下注射を施したマウスとアウトカムを比較して決定した。各実験ベクターおよびそのそれぞれの対照を比較するため、各ＣＮＶの病変を個々のデータ点として考慮したＡＮＯＶＡ解析を使用した。以前の所見と一致して、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＣＡＲａｐ１ａは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＧＦＰに比較してＣＮＶを低減しなかったが、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに比較して、ＡＮＯＶＡ分析によりＣＮＶを有意に低減した（ｐ＝０．０２６）（図４）。各ＣＮＶ病変を個々のデータポイントとして考慮できるか否かをさらに確認するために、混合効果線形回帰を用いて統計解析を実行し、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａとｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰとを比較した。同じ眼内のスポット間の相関量を級内補正係数（ＩＣＣ）により測定し、ＩＣＣ＝０．１６、９５％ ＣＩ（０．０２、０．５３）であったが、このことは、通常の二標本ＡＮＯＶＡが、全ての観察結果またはスポットが独立していることを必要とする際には適切ではないことを示している。混合効果線形回帰分析により、平均±ＳＥは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａ群では６１９，９２８±１２４，９３２であり、対照のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰでは９５２，０９１±１２４．９３２であり、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰと比較して、統計的有意差があった（平均差、３３６，１６２、９５％ ＣＩ：２，４５４から６４７，７７８；ｐ＝０．０５）。混合効果線形抑制解析により、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａが野生型マウスにおいてＣＮＶを有意に低減することが支持された。

ＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現は、ＲＰＥ／脈絡膜組織における炎症性シグナル伝達およびＶＥＧＦ発現を低減する。炎症とＶＥＧＦシグナル伝達との両方がＡＭＤの病因に関与する。レーザー治療は、ＲＰＥ／脈絡膜組織においてＴＮＦαを有意に増加させ、硝子体内中和抗体によるＴＮＦαの阻害はＣＮＶを減少させることが以前に見出された。試験例としてＴＮＦα媒介性シグナル伝達を採用することによって、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの増加が炎症を低減するものとなるか否かを決定した。ＴＮＦαの下流エフェクターである活性化Ｂ細胞の核因子カッパ（ＮＦ－κＢ）のリン酸化を、ウェスタンブロットによりＲＰＥ／脈絡膜溶解物において測定した。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、リン酸化ＮＦ－κＢ（ｐ－ＮＦ－κＢ）は、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによって、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰと比較して有意に減少した。同じ組織可溶化物では、ＶＥＧＦタンパク質も、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによって、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａと比較して有意に減少した（図５Ｃおよび図５Ｄ）。

ＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現は、ＲＰＥ／脈絡膜組織におけるカスパーゼ３およびＬＣ３Ａ／Ｂを低減する。図３および図４の結果は、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ベクターが、野生型マウスにおいて、特異的にＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現を効率よく駆動し、ＣＮＶを減少させたという仮説を支持する証拠を提供している。タンパク質の送達は、その生存率を維持するための能力を圧倒する可能性があるため、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの増加が、ＲＰＥのホメオスタシスを圧倒するものとなるか否かを決定した。カスパーゼ３、およびアポトーシスメーカーである切断型カスパーゼ３、およびオートファジー調節因子であるＬＣ３Ａ／Ｂを、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２により処置した眼から得たＲＰＥ／脈絡膜溶解物において測定した。図６に示されるように、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰと比較して、ＲＰＥ／脈絡膜組織における総カスパーゼ３（図６Ａおよび図６Ｂ）およびＬＣ３Ａ／Ｂ（図６Ｃおよび図６Ｄ）は、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａによって有意に減少した。切断型カスパーゼ３は、どちらの群からもＲＰＥ／脈絡膜組織では検出されなかった。まとめると、図６に示されるデータは、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２によるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現が、カスパーゼ３の活性化およびオートファジーの過剰な活性化を引き起こさないことを示している。

ＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現は、細胞死を引き起こすことなく、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα－誘導性ＮＦ－κＢ活性化、およびＬＣ３Ａ／Ｂを低減する。ＶＥＧＦの発現に及ぼされる活性型Ｒａｐ１ａの効果、炎症性シグナル伝達の活性化、オートファジーおよび細胞死をさらに評価するために、Ｒａｐ１ａを恒常的に活性化するＲａｐ１ａ Ｑ６３Ｅ変異体を発現するアデノウイルス（Ａｄ－６３Ｅ）またはＧＦＰのみを発現する対照アデノウイルス（Ａｄ－ＧＦＰ）により形質導入された培養ヒトＲＰＥで、一連の実験を実施した。ウイルスの形質導入をＧＦＰ可視化によってモニタリングした。ウイルスの形質導入の４８時間後、約８０％のＲＰＥがＧＦＰ陽性であり（図７Ａ）、ウェスタンブロットによって測定された総Ｒａｐ１タンパク質は、Ａｄ－ＧＦＰと比較して、Ａｄ－６３Ｅにより形質導入されたＲＰＥで増加した（図７Ｂおよび図７Ｃ）。Ａｄ－６３Ｅ形質導入ＲＰＥでは、ＶＥＧＦタンパク質（図７Ｄおよび図７Ｅ）、ＴＮＦα誘導性ｐ－ＮＦ－κＢ（図７Ｆ）およびＬＣ３Ａ／Ｂ（図７Ｇおよび図７Ｈ）は、Ａｄ－ＧＦＰと比較して有意に低減された。切断型カスパーゼ３は、Ａｄ－ＧＦＰ形質導入ＲＰＥ細胞またはＡｄ－６３Ｅ形質導入ＲＰＥ細胞のいずれにおいても検出されなかった（図７Ｉ）。外因性の活性型Ｒａｐ１ａの発現が細胞死を誘導するか否かをさらに決定するために、ＴＵＮＥＬ染色をウイルス形質導入の４８時間後にＲＰＥで実施した。図７Ｊおよび図７Ｋに示されるように、Ａｄ－６３Ｅ形質導入は、Ａｄ－ＧＦＰと比較してＴＵＮＥＬ陽性細胞を増加させなかった。まとめると、図７に示されるデータは、外因性の活性型Ｒａｐ１ａの発現が、細胞死およびオートファジーを増加させることなく炎症およびＶＥＧＦを低減するということのさらに別の支持を提供する。

２．考察
ＡＭＤは、不可逆的な中心視力障害を特徴とする、複雑な多因子性の疾患である。ＡＭＤの病態生理学的ステップは未だ解明中であるが、ＡＭＤの進行が加齢、遺伝的要因、および環境要因の相互作用によって影響を受けるという概念を支持する広範な証拠がある。これらの相互作用は、ＲＰＥおよび脈絡膜内皮細胞における炎症、酸化ストレス、細胞死のメカニズムおよび血管新生に関与するシグナル伝達経路を惹起し、細胞変性およびＣＮＶによる視力喪失をもたらす。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする治療は、新生血管性ＡＭＤの臨床成績を大幅に改善してきたが、視力の改善は、新生血管性ＡＭＤの治療を受けた患者の半数未満でしか発生せず、萎縮性ＡＭＤについては依然として治療は不十分である。

遺伝子療法は、長期治療の可能性をもたらすため、ＡＭＤの治療において多くの注目を集めており、この長期治療は、抗ＶＥＧＦ剤の硝子体内注射による局所送達につきものの反復治療の数を低減するものとなる。遺伝子療法はまた、細胞特異的プロモーターを用いることによって特定の細胞を標的とする可能性も提供する。遺伝子療法アプローチを用いて、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５ベクターによるＲＰＥにおける外因性の活性型Ｒａｐ１ａの発現により、レーザー誘発性ＣＮＶがＲａｐ１ｂ欠損マウスでは有意に低減されたが、野生型マウスでは低減されなかったことが以前に報告された。本研究では、ＲＰＥの別の特異的プロモーターであるＶＭＤ２を、野生型マウスのＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現の駆動において試験し、効果をｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５と比較した。本研究は、野生型マウスのＲＰＥにおいて、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ベクターが活性型Ｒａｐ１ａの発現を効率的に駆動し、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５と比較して、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２の形質導入がＲＰＥにおいてより高い特異性を有することを示した。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５プロモーターは、野生型マウスのＲＰＥにおいて活性型Ｒａｐ１ａを増加させなかった。ＲＰＥにおいて活性型Ｒａｐ１ａを増加させたｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａ処置マウスは、対照ベクターｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰにより処置したものと比較して、ＣＮＶの有意な低減を示した。この研究の所見は、ＶＭＤ２がＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの発現の駆動においてより強い活性を有し、活性型Ｒａｐ１ａの増加は野生型マウスにおいてＣＮＶを低減することができるという仮説を支持するものである。

炎症、酸化的シグナル伝達、および血管新生に関与するクロストークおよびフィードバックループは、ＡＭＤの病因に関与する。実験的なＣＮＶにおける炎症の役割は、ＡＭＤおよびＣＮＶに関連しているサイトカインの一例として、炎症性サイトカインであるＴＮＦαを用いて、以前に試験された。発明者らは、ＲＰＥにおける活性酸素により惹起されるＶＥＧＦの産生に関与するメカニズムを通して、硝子体内ＴＮＦαが実験的なＣＮＶに寄与したことを報告した。さらに、ＲＰＥにおけるＲａｐ１ａの活性化は、活性酸素種の生成を低減した。ここで、本研究では、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａにより処置された眼は、対照のｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰと比較して、ＲＰＥ／脈絡膜組織においてＶＥＧＦおよびＮＦ－κＢのリン酸化の有意な低減を示した。これらの所見は、培養ヒトＲＰＥにおいて、アデノウイルスの遺伝子導入による活性型Ｒａｐ１ａの増加によりＶＥＧＦおよびｐ－ＮＦ－κＢが有意に低減されたことによって、さらに支持された。しかし、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＣＡＲａｐ１ａにより処置された眼では、同様の効果は観察されなかった。これらの結果は、ＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの増加が、ＶＥＧＦを減少させることによってＣＮＶを低減させたという仮説を支持するものである。炎症性シグナル伝達の低減は、以前にＴＮＦαを炎症性サイトカインとして用いて見出されたように、ＣＮＶに寄与する刺激を低減することができるが、細胞死につながるプロセスに干渉することによって、萎縮性ＡＭＤも低減することができる。

保護をもたらすタンパク質の導入に関する懸念の一つは、細胞の天然のタンパク質管理能力を圧倒するリスクである。オートファジーは、細胞がストレスに対処して細胞の恒常性を維持するメカニズムの一つである。オートファジーを介して、過度な細胞ストレスに応答して形成されるミスフォールドまたは凝集したタンパク質および損傷した細胞小器官は分解され得る。したがって、オートファジーの増加は、細胞ストレスの増加を間接的に反映し得る。遺伝子療法による活性型Ｒａｐ１ａの導入が、アポトーシスによる細胞死またはオートファジーの過剰な活性化を惹起するか否かを決定するために、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２によるＲＰＥにおける外因性の活性型Ｒａｐ１ａの発現の誘導に続くアポトーシスのマーカーとして切断型カスパーゼ３の発現を評価し、オートファジーのマーカーとしてＬＣ３Ａ／Ｂを評価した。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰに比較して、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａは、レーザー誘発性ＣＮＶモデルで供試した際の野生型マウスのＲＰＥ／脈絡膜組織において、切断型カスパーゼ３を増加させなかったが、カスパーゼ３およびＬＣ３Ａ／Ｂを低減した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトＲＰＥ細胞における活性型Ｒａｐ１ａの増加は、カスパーゼ３の活性化およびＴＵＮＥＬ染色により決定される細胞死を増加させることなく、ＬＣ３Ａ／Ｂを低減した。

結論として、ＶＭＤ２プロモーターは、ＲＰＥ６５プロモーターと比較して、より特異的にＲＰＥを標的とし、Ｒａｐ１発現を増加させた。ＶＭＤ２プロモーターによるＲＰＥにおける活性型Ｒａｐ１ａの増加は、進行性ＡＭＤに関連する三つのエフェクター：ＶＥＧＦ、活性化ＮＦ－κＢ、およびＬＣ３Ａ／Ｂを低減した。Ｒａｐ１ａの活性化は、炎症および血管新生につながるＡＭＤ関連刺激から保護し、ＲＰＥの完全性および機能を維持することができる。ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２ベクターは、ＲＰＥに遺伝物質を送達するための効率的で安全なツールであり得る。

３．材料および方法
動物。五週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（オスおよびメス）マウスを、ジャクソンラボラトリー（バー・ハーバー、メイン州）から購入した。全ての動物の手技は、ユタ大学のガイドライン（実験動物のケアおよび使用に関するガイド）ならびに眼科学および視覚の研究における動物の使用のための視覚・眼科学学会の声明に従って実施された。全ての実験プロトコールは、ＩＡＣＵＣおよびユタ大学の施設内バイオセーフティ委員会によって承認された。麻酔は、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｋｇ）により遂行し、安楽死は、麻酔下に配した後に頸椎脱臼を行った。

ＲＰＥ６５またはＶＭＤ２プロモーター駆動型自己相補型アデノ随伴ウイルス２の構築。マウスＲＰＥ６５プロモーターによって駆動される自己相補型アデノ随伴ウイルス２（ｓｃ－ＡＡＶ２）ベクターは、前述したように、ノースカロライナ大学ベクターコア（チャペルヒル、ノースカロライナ州）によって生成された。簡潔に述べると、ｓｃ－ＡＡＶ２ベクター内のＣＭＶプロモーターを、マウスＲＰＥ６５プロモーター（１５０７ｂｐ）（Ｔ．Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｅｄｍｏｎｄよりご供与いただいた）により置換し、構成的活性型ヒトＲａｐ１ａ Ｑ６３Ｅ変異体_ENREF_22（ＣＡＲａｐ１ａ）の合成配列を、ＲＰＥ６５プロモーターと共にｓｃＡＡＶ２ベクター内にクローニングした（ｓｃＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＣＡＲａｐ１ａ－ＧＦＰ）。ＣＡＲａｐ１ａ配列を含まないｓｃ－ＡＡＶ２構築物を、対照ベクター（ｓｃＡＡＶ２－ＲＰＥ６５－ＧＦＰ）として用いた。ＲＰＥ６５プロモーターおよびＶＭＤ２プロモーターの形質導入効率および特異性を比較するため、マウスＶＭＤ２プロモーター（６２４ｂｐ）によって駆動されるｓｃ－ＡＡＶ２２ベクターを、フロリダ大学パウエル遺伝子治療センター（ゲインズビル、フロリダ州）によって生成した。ＣＡＲａｐ１ａの配列を、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２内にクローニングしてｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＣＡＲａｐ１ａ－ＧＦＰとし、ｓｃ－ＡＡＶ２－ＶＭＤ２－ＧＦＰベクターを対照として用いた。ウイルスは、フロリダ・パウエル遺伝子治療センターで作製、精製、および力価調整された。

網膜下注射、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶイメージング、およびレーザー誘発性ＣＮＶモデル。１マイクロリットルのｓｃ－ＡＡＶ２（フルオレセインおよびＰＢＳ中５×１０⁸ウイルス粒子に希釈）を、６週齢のマウスの各眼の網膜下腔に注射した。ｓｃ－ＡＡＶ２ウイルスの形質導入を、前述したように、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ網膜イメージングシステム（フェニックスリサーチラボラトリーズ社、プレザントン、カリフォルニア州）を用いたｉ ｎ ｖｉｖｏライブイメージングによってモニタリングした。

ｓｃ－ＡＡＶ２ウイルス注射の五週間後、１１週齢のマウスに、ＣＮＶを誘発するためにレーザーを与えた。各マウスの両眼を、一滴の１％トロピカミド点眼液により散大させた。散大後、マウスを麻酔し、約４６０ｍＷの強度および１００ｍｓの持続時間でフェニックスイメージガイドレーザーシステム９４（フェニックスＭｉｃｒｏｎ ＩＶ、プレザントン、カリフォルニア州）を用いて、視神経からそれぞれ約２乳頭径の４スポットの５３２ｎｍレーザー光凝固により処置した。適切な処置であったことを、ブルッフ膜の破壊を確定するキャビテーション気泡の産生によって評価した。⁷レーザー処置の七日後、マウスを安楽死させ、ＣＮＶ体積およびタンパク質の分析のために眼を収集した。

網膜色素上皮（ＲＰＥ）／脈絡膜のフラットマウントの調製およびＣＮＶ病変体積の分析。 眼を４％のパラホルムアルデヒド（エレクトロンマイクロスコピーサイエンス、ハットフィールド、ペンシルバニア州）中で１時間固定した。角膜、レンズ、硝子体、および網膜の除去後、ＲＰＥ／脈絡膜／強膜の後眼杯を、４％のパラホルムアルデヒド中でさらに１時間固定した。ＰＢＳ中で三回洗浄した後、眼杯を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含むＰＢＳ中、室温で３０分間ブロッキングし、次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５６８コンジュゲートイソレクチンＢ４（１：２００、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）と共に４℃で一晩インキュベートして、侵入脈絡膜血管および抗ＧＦＰ抗体を標識し、ＲＰＥ（１：５００、ＡＢＣＡＭ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）中でＧＦＰを標識した。染色後、眼杯に放射状の切込みを入れ、共焦点イメージング用のベクターシールドマウント媒体（ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、カリフォルニア州）により顕微鏡スライド上にフラットマウントすることによって平らにした。フラットマウントを、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス、日本）を用いて３μｍ単位で光学的なＺ切片を得ることによってイメージングし、ＣＮＶ病変体積を、Ｉｍａｒｉｓ画像解析ソフトウェア（ビットプレーンＵＳＡ、コンコード、マサチューセッツ州）を用いて測定した。明らかな出血または架橋性ＣＮＶを伴う病変を除外した。

網膜凍結切片における免疫染色。安楽死後、眼を除核し、４％のパラホルムアルデヒド（エレクトロンマイクロスコピーサイエンシズ、ハットフィールド、ペンシルバニア州）中で１時間固定した。角膜およびレンズの除去後、眼杯を１０％スクロースと共に二時間インキュベートした後、３０％スクロースと共に４℃で一晩インキュベートし、次いで、ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＣＴ）（ティッシューテック、ハットフィールド、ペンシルバニア州）に包埋して切片を作製した。免疫蛍光法としては、凍結切片（１２μｍ）を、ＰＢＳ／０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００中５％の正常ヤギ血清中で１時間インキュベートして一次抗体の非特異的結合をブロッキングした後、アブカム（ケンブリッジ、英国）から得たウサギ抗ＧＦＰ（１：２００）およびＲＰＥ６５（１：１００）と共に４℃で一晩、インキュベートした。ＰＢＳ中で三回洗浄した後、ＧＦＰに対するＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００）、およびＲＰＥ６５に対するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５９４コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて、切片を１時間インキュベートした。ＴＯ－ＰＲＯ－３（１：５００、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて、核を染色した。切片を、ＰＢＳ中で洗浄した後、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（サザンバイオテック、バーミンガム、アラバマ州）にマウントした。画像を倍率２０×で倒立顕微鏡（オリンパス１×８１：日本）により捕捉した。

細胞培養およびアデノウイルスの遺伝子導入。 ヒト初代ＲＰＥ（ｈＲＰＥ；ロンザ、ウォーカーズビル、メリーランド州）を、網膜色素上皮細胞基底培地（ＲｔＥＢＭ、ロンザ）中で増殖させ、継代数４～６から使用した。細胞を、Ｋｅｉｔｈ Ｂｕｒｒｉｄｇｅ（ノースカロライナ大学、チャペルヒル、ノースカロライナ州）からご供与いただいた緑色蛍光タンパク質（Ａｄ－ＧＦＰ）またはＧＦＰタグ付き活性型Ｒａｐ１ａ（Ａｄ－６３Ｅ）を発現するアデノウイルス構築物により形質導入した。ウイルスの形質導入の４８時間後、細胞を、組換え型ＴＮＦ－α（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）またはＰＢＳと共に２４時間インキュベートした。

培養細胞におけるＴＵＮＥＬアッセイ。ＴＵＮＥＬアッセイを、製造業者の指示に従って実施した（Ｉｎ Ｓｉｔｕ細胞死キット、ＴＭＲレッド、ロシュダイアグノスティクス、インディアナポリス、インディアナ州）。ヒトＲＰＥを、細胞培養カバースリップ（サーモサイエンティフィック、ロチェスター、ニューヨーク）上に播種した。 処理後、細胞を、まず４％のパラホルムアルデヒド中、室温で１時間固定した。ＰＢＳ中で三回洗浄した後、細胞を、新たに調製した透過化溶液（０．１％クエン酸ナトリウム中０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）と共に、氷上で２分間インキュベートした。透過処理後、いくつかの細胞を、陽性対照として、１５～２５℃で１０分間、ＤＮａｓｅ Ｉ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ中３０００Ｕ／ｍＬ）と共にインキュベートした。酵素溶液を含まない標識溶液のみと共に培養した細胞を、陰性対照として使用した。ＴＵＮＥＬ＋細胞を特定するために、細胞を、ＴＵＮＥＬ反応混合物（標識溶液および酵素溶液混合物を１０：１）と共に、暗所にて加湿インキュベーター中、３７℃で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、カバースリップをＤＡＰＩ Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇによりマウントした。カバースリップ当たり五つのランダムな画像を備える蛍光顕微鏡を用いて、画像を取得した。ＤＡＰＩ染色核との共標識化によって決定されたＴＵＮＥＬ＋細胞を定量し、同じカバースリップから得た五つの画像中のＴＵＮＥＬ＋細胞の平均を比較に用いた。状態当たり５～６個のカバースリップがあった。

タンパク質の調製およびウェスタンブロット。 タンパク質溶解物を、前述したようにＲＰＥ／脈絡膜組織から抽出した。⁷簡潔に述べると、ＲＰＥ／脈絡膜組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュダイアグノスティクス、インディアナポリス、インディアナ州）およびホスファターゼ阻害剤オルトバナジン酸塩（２ｍＭ、シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）を含む放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（ＲＩＰＡ）（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．４、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％ ＳＤＳ、１０％ グリセロール）中、氷上で２０分間ホモジナイズした。タンパク質溶解物を、４℃で５分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離することによって収集した。上清中のタンパク質濃度を、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）（ピアース、ロックフォード、イリノイ州）によって定量した。ＲＰＥ／脈絡膜組織由来の２０μｇのタンパク質を、４％から１２％のＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州）にロードし、ＰＶＤＦ膜（インビトロジェン）に転写し、次いで、Ｒａｐ１（１：１０００、ＢＤバイオサイエンシズ、サンノゼ、カリフォルニア州）、ＶＥＧＦ（１：５００、サンタクルーズバイオテクノロジー、サンタクルーズ、カリフォルニア州）、カスパーゼ３、ＬＣ３Ａ、またはリン酸化ＮＦ－κＢ（１：１０００、セルシグナリングテクノロジー社、ダンバース、マサチューセッツ州）に対する抗体と共にインキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートβ－アクチン（サンタクルーズバイオテクノロジー）をローディング対照として、膜を再プロービングした。

ソフトウェアＵＮ－ＳＣＡＮ－ＩＴバージョン７．１（シルクサイエンティフィック、オレム、ユタ州）を用いて、デンシトメトリーを解析した。

統計解析：分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、タンパク質発現およびＴＵＮＥＬ陽性細胞を分析し、各処置から１頭または１ウェルの細胞当たり一つの観察結果を用いて実験群と対照群とを比較した。通常のＡＮＯＶＡでは、全てのデータ点または観察結果は独立していることが要求され、このことは動物一頭当たり一つの観察結果のみを用いた場合に当てはまる。動物ごとに複数の観察結果が用いられる際には、通常は前提に反するが、なぜなら、同じ動物内での観察結果は、動物間の観察結果よりも類似する傾向があるためである。級内相関係数（ＩＣＣ）を用いて、観察結果がどれほど相関しているかを決定することができる。ＩＣＣがゼロに等しい場合、通常のＡＮＯＶＡは正しい分析を提供する。但し、ＩＣＣ＞０の場合、混合効果線形回帰などの方法が必要である。この方法は、基本的には、観測結果の独立性の欠如を説明するための標準誤差の調整を伴うＡＮＯＶＡである。ＣＮＶ病変のアウトカムについては、動物一頭当たり一つの眼で、同じ眼により、クラスター状または巣状のスポットに起因する独立性の欠如を説明するために、混合効果線形回帰を用いた。

結果を平均±ＳＥＭとして表示した。≦０．０５のＰ値は、統計的に有意であるものと考えた。動物試験では、１２頭のマウス個体の少なくとも４０スポットをＣＮＶ体積について分析した。３～６頭の異なるマウスから、ＧＦＰ染色およびＲａｐ１タンパク質のウェスタンブロットに用いる網膜切片を採取した。

当業者は、本明細書に記載される方法および組成物の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、または日常的な実験のみを用いて確認できるものとなる。このような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
参考文献
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２ Ｗａｎｇ，Ｈ．＆ Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｍ．Ｅ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ＡＭＤ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ ２２，１８９－２０２（２０１６）．
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４ Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｒ．，Ｕｅｄａ，Ｋ．＆ Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ＡＭＤ：ＲＰＥ－Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｃｈｏｒｏｉｄ．Ｍｏｌ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ ３３，４３６－４４５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍａｍ．２０１２．０３．００７（２０１２）．
５ Ｆｏｒｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｓａｉｎｔ－Ｇｅｎｉｅｚ，Ｍ．，Ｗａｌｓｈｅ，Ｔ．，Ｚａｈｒ，Ａ．＆ Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ｐ．Ａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｏｌｅ ｏｆ ＶＥＧＦ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｕｌｔ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ５２，９４７８－９４８７（２０１１）．
６ Ａｂｌｏｎｃｚｙ，Ｚ．，Ｄａｈｒｏｕｊ，Ｍ．＆ Ｍａｒｎｅｒｏｓ，Ａ．Ｇ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｒｅｔｉｎａ ｄｕｅ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＶＥＧＦ－Ａ ｌｅｖｅｌｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．１３－２４８０２１（２０１４）．
７ Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ Ｒａｐ １ａ ｂｙ ｓｃＡＡＶ２ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ３，１６０５６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１６．５６（２０１６）．
８ Ｗｉｔｔｃｈｅｎ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐ１ ＧＴＰａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂａｒｒｉｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ＲＰＥ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ８，ｅ７３０７０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７３０７０（２０１３）．
９ Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．，Ｔｏｍｋｏｗｉｃｚ，Ｂ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｗ．Ｌ．，３ｒｄ ＆ Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ） ａｓ ａ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ：ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ３１，３１７－３３４，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ４０２５９－０１７－０２３４－５（２０１７）．
１０ Ｌａｒｅｄｊ，Ｌ．Ｎ．＆ Ｂｅａｒｄ，Ｐ．Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａｎ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ Ｎｏｔ ｉｎ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ Ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８５，１３１３３－１３１４３，ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｖｉ．０５４０７－１１（２０１１）．
１１ Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．＆ Ｈｉｇｈ，Ｋ．Ａ．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｂａｒｒｉｅｒｓ ｔｏ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｌｏｏｄ １２２，２３－３６，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１３－０１－３０６６４７（２０１３）．
１２ Ｈｅ，Ｌ．，Ｍａｒｉｏｕｔｉｎａ，Ｍ．，Ｄｕｎａｉｅｆ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｍａｒｎｅｒｏｓ，Ａ．Ｇ．Ａｇｅ－ ａｎｄ ｇｅｎｅ－ｄｏｓａｇｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｒｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １８４，１６６０－１６６７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｐａｔｈ．２０１４．０２．００７（２０１４）．
１３ Ｍｏｓｈｆｅｇｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＢＥＳＴＲＯＰＨＩＮ１ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｃａｕｓｅ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＰＥ．Ｈｕｍａｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５，２６７２－２６８０，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｗ１２６（２０１６）．
１４ Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ，Ｌ．，Ｗｉｔｔｃｈｅｎ，Ｅ．Ｓ．＆ Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｍ．Ｅ．Ｒａｐ１ ＧＴＰａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｈｏｒｏｉｄａｌ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｖｉａ ＮＡＤＰＨ Ｏｘｉｄａｓｅ－ ａｎｄ ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｃ１．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １８５，３３１６－３３２５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｐａｔｈ．２０１５．０８．０１７（２０１５）．
１５ Ｆｒｉｔｓｃｈｅ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｃｏｍｉｎｇ ｔｏｇｅｔｈｅｒ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １５，１５１－１７１，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ｇｅｎｏｍ－０９０４１３－０２５６１０（２０１４）．
１６ Ｌａｎｃｏｎ，Ａ．，Ｆｒａｚｚｉ，Ｒ．＆ Ｌａｔｒｕｆｆｅ，Ｎ．Ａｎｔｉ－Ｏｘｉｄａｎｔ，Ａｎｔｉ－Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｉｎ Ｏｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２１，３０４，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２１０３０３０４（２０１６）．
１７ Ｔｅｌａｎｄｅｒ，Ｄ．Ｇ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＭＤ）．Ｓｅｍｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２６，１９２－１９７，ｄｏｉ：１０．３１０９／０８８２０５３８．２０１１．５７０８４９（２０１１）．
１８ Ｓｏｂｒｉｎ，Ｌ．＆ Ｓｅｄｄｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ ｎｕｒｔｕｒｅ－ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ－ｐｒｅｄｉｃｔ ｏｎｓｅｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ４０，１－１５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｒｅｔｅｙｅｒｅｓ．２０１３．１２．００４（２０１４）．
１９ Ｅｈｌｋｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｗｉｔｃｈ ｏｆ ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ａｇｅｎｔｓ ｉｓ ａｎ ｏｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＡＭＤ．Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ） ２８，５３８－５４５，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｙｅ．２０１４．６４（２０１４）．
２０ Ｖｅｌｏｓｏ，Ｃ．Ｅ．，ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ，Ｌ．Ｎ．，Ｒｅｃｃｈｉａ，Ｆ．Ｍ．，Ｐｅｌａｙｅｓ，Ｄ．＆ Ｎｅｈｅｍｙ，Ｍ．Ｂ．ＶＥＧＦ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ ｉｎ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓ ５１，１－８，ｄｏｉ：１０．１１５９／０００３５４３２８（２０１４）．
２１ Ｔｈｅｏｄｏｓｓｉａｄｉｓ，Ｐ．Ｇ．，Ｌｉａｒａｋｏｓ，Ｖ．Ｓ．，Ｓｆｉｋａｋｉｓ，Ｐ．Ｐ．，Ｖｅｒｇａｄｏｓ，Ｉ．Ａ．＆ Ｔｈｅｏｄｏｓｓｉａｄｉｓ，Ｇ．Ｐ．Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｇｅｎｔ ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｆｏｒ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １４７，８２５－８３０，８３０ ｅ８２１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｏ．２００８．１２．００４（２００９）．
２２ Ｍａｒｋｏｍｉｃｈｅｌａｋｉｓ，Ｎ．Ｎ．，Ｔｈｅｏｄｏｓｓｉａｄｉｓ，Ｐ．Ｇ．＆ Ｓｆｉｋａｋｉｓ，Ｐ．Ｐ．Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １３９，５３７－５４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｏ．２００４．０９．０５８（２００５）．
２３ Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｈａｎ，Ｘ．，Ｗｉｔｔｃｈｅｎ，Ｅ．Ｓ．＆ Ｈａｒｔｎｅｔｔ，Ｍ．Ｅ．ＴＮＦ－ａｌｐｈａ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＶＥＧＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ＲＰＥ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＯＳ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ ２２，１１６－１２８（２０１６）．
２４ Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｐ１ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＮＡＤＰＨ ｏｘｉｄａｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＯＳ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．１３－２４００２８（２０１３）．
２５ Ａｈｍｅｄ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ａｎ ｏｒａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｄｒｕｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ａｔｒｏｐｈｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖｉｓｉｏｎ ２２，２９４－３１０（２０１６）．
２６ Ｓｅｎｎｌａｕｂ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．ＣＣＲ２＜ｓｕｐ＞＋＜／ｓｕｐ＞ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ ａｔｒｏｐｈｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｇｅ‐ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ＜ｅｍ＞Ｃｘ３ｃｒ１＜／ｅｍ＞ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５，１７７５－１７９３，ｄｏｉ：１０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１３０２６９２（２０１３）．
２７ Ａｒｄｅｌｊａｎ，Ｄ．＆ Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｃ．Ａｇｉｎｇ ｉｓ ｎｏｔ ａ ｄｉｓｅａｓｅ：ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｇｉｎｇ．Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ３７，６８－８９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｒｅｔｅｙｅｒｅｓ．２０１３．０７．００３（２０１３）．
２８ Ｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ｍ．＆ Ｕｒａｎｏ，Ｆ．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ＥＲ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｕｓｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４９０，７１－９２，ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｂ９７８－０－１２－３８５１１４－７．００００４－０（２０１１）．
２９ Ｋｅｅｌｉｎｇ，Ｅ．，Ｌｏｔｅｒｙ，Ａ．Ｊ．，Ｔｕｍｂａｒｅｌｌｏ，Ｄ．Ａ．＆ Ｒａｔｎａｙａｋａ，Ｊ．Ａ．Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｃａｒｇｏ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｔｉｎａｌ Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ（ＲＰＥ） Ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｂｌｉｎｄｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｅｌｌｓ ７，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｃｅｌｌｓ７０２００１６（２０１８）．
３０ Ｋａｒａｋｏｓｔａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅｙｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｕｔｃｏｍｅｓ：ｏｎｅ ｅｙｅ ｏｒ ｔｗｏ？ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １５３，５７１－５７９．ｅ５７１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｊｏ．２０１１．０８．０３２（２０１２）．
３１ Ｍｕｒｄｏｃｈ，Ｉ．Ｅ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｓ．Ｓ．＆ Ｃｏｕｓｅｎｓ，Ｓ．Ｎ．Ｐｅｏｐｌｅ ａｎｄ ｅｙｅｓ：ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｉｎ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ８２，９７１－９７３，ｄｏｉ：１０．１１３６／ｂｊｏ．８２．８．９７１（１９９８）．

Claims (28)

1. 活性型Ｒａｐ１ａをコードする核酸配列に動作可能に連結された、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターをコードする核酸配列を含む核酸構築物。
2. 活性型Ｒａｐ１ａをコードする前記核酸配列が、ＣＡＲａｐ１ａまたはそのバリアントである、請求項１に記載の核酸構築物。
3. 前記ＣＡＲａｐ１ａが、配列番号２の配列またはそのバリアントを含む、請求項0に記載の核酸構築物。
4. 前記ＶＭＤ２プロモーターがヒトＶＭＤ２プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
5. 前記活性型Ｒａｐ１ａがヒト活性型Ｒａｐ１ａである、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
6. 選択マーカーをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
7. 前記選択マーカーが、前記卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーターに動作可能に連結されている、請求項６に記載の核酸構築物。
8. 前記選択マーカーが標識である、請求項６～７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
9. 前記ＶＭＤ２プロモーターが、誘導性または恒常型である、請求項１～８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むベクター。
11. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１０に記載のベクター。
12. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
13. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
14. 医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
15. 請求項１０～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む組成物。
16. 医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
17. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載のベクターを含む、組換え細胞。
18. 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１７に記載の組換え細胞。
19. 前記細胞が網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である、請求項１７～１８のいずれか一項に記載の組換え細胞。
20. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、加齢性黄斑変性症を有する対象を治療する方法。
21. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を阻害する方法。
22. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を低減する方法。
23. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、脈絡膜組織における炎症シグナル伝達を低減する方法。
24. 請求項１～９のいずれか一項に記載の核酸構築物、または請求項１０～１２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、脈絡膜組織におけるＶＥＧＦ発現を低減する方法。
25. 投与が硝子体内投与である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 活性型Ｒａｐ１ａの発現が、オートファジーまたはアポトーシスのマーカーを増加させることなく、前記対象において増加する、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記活性型Ｒａｐ１ａが、対照の対象において発現されるＲａｐ１ａの少なくとも２倍のレベルで発現される、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 一つまたは複数の抗ＶＥＧＦ剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法。

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