JP2022548980A - 疾患または障害を治療するための方法および組成物 - Google Patents

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Abstract

本出願は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する薬剤などのＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤、前記薬剤を使用する方法、および前記薬剤を同定する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年９月２６日に出願された米国仮出願第６２／９０６，２８２号に対する優先権を主張し、その開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年９月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２５１６０９＿００００３４＿ＳＬ．ｔｘｔと指定され、１１，３７２バイトのサイズである。
本発明は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７シグナル伝達経路を遮断（またはブロック）する薬剤を含む方法および組成物に関する。
血管新生促進シグナル伝達（pro-angiogenic signaling）と抗血管新生シグナル伝達（anti-angiogenic signaling）との不均衡によって駆動される病的血管新生は、悪性および良性の両方の多くの疾患の特徴である。血管新生がしっかりと調節されている健康な成人とは異なり、そのような疾患は、制御されない新しい血管形成を特徴とし、深刻な構造的および機能的異常を伴う血管の未熟さを特徴とする微小血管ネットワークをもたらす。これらの異常の結果は、微小環境のさらなる変形であり、しばしば疾患の進行を促進し、従来の療法に対する応答を弱める働きをする。
したがって、これらの疾患（がんなど）における血管系の成熟を正常化または促進するための方法または組成物を開発する必要がある。
本出願は、それを必要とする対象において腫瘍（がんなど）を治療する方法であって、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害するＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬は、ＣＤ９３を特異的に認識する抗ＣＤ９３抗体を含む。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０と競合的にＣＤ９３に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０のエピトープと重複するかまたは実質的に重複するエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３とマルチメリン２（ＭＭＲＮ２）との間の相互作用も遮断する。いくつかの態様では、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３とＭＭＲＮ２との間の相互作用を遮断しない。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３上のＩＧＦＢＰ７結合部位に結合する。いくつかの態様では、抗ＣＤ９３抗体は、ＩＧＦＢＰ７結合部位の外側にあるＣＤ９３上の領域に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３の細胞外領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３の細胞外領域は、配列番号１のアミノ酸配列の残基２２～５８０を含む。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３のＥＧＦ様領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３のＥＧＦ様領域は、配列番号１のアミノ酸配列の残基２５７～４６９および／または２６０～４６８からなる。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３のＣ型レクチンドメインに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３のＣ型レクチンドメインは、配列番号１のアミノ酸配列の残基２２～１７４を含む。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３の長いループ領域に結合する。いくつかの態様において、ＣＤ９３の長いループ領域は、配列番号１のアミノ酸配列の残基９６～１４１を含む。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、抗ヒトＣＤ９３抗体である。いくつかの態様において、抗ヒトＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはそのヒト化バージョンである。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ９３抗体は、全長抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディである。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３は融合タンパク質に含まれる。
いくつかの態様において、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬はポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドは阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３の細胞外ドメインを含むＣＤ９３の断片またはＣＤ９３のバリアントである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは膜結合型である。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３の細胞外ドメインのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＭＭＮＲ２に対するよりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドはＭＭＮＲ２に結合しない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＣＤ９３よりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、Ｆ２３８残基を含み、アミノ酸の番号付け（ナンバリング）は配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、安定化ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、安定化ドメインはＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは約５０～約２００アミノ酸長である。
いくつかの態様において、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬は、ＩＧＦＢＰ７を特異的に認識する抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６と競合的にＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６のエピトープと重複するエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７と、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用も遮断する。いくつかの実施形態において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７と、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用を遮断しない。いくつかの実施形態において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７上のＣＤ９３結合部位に結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＣＤ９３結合部位の外側にあるＩＧＦＢＰ７上の領域に結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のＮ末端ドメイン（残基２８～１０６）に結合する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＢＰ７のＮ末端ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列の残基２８～１０６からなる。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のＫａｚａｌ様ドメインに結合する。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＢＰ７のｋａｚａｌ様ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列の残基１０５～１５８からなる。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のＩｇ様Ｃ２タイプドメインに結合する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７のＩｇ様Ｃ２タイプドメインは、配列番号２のアミノ酸配列の残基１６０～２６４からなる。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のインスリン結合（ＩＢ）ドメインに結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は抗ヒトＩＧＦＢＰ７抗体である。いくつかの実施形態では、抗ヒトＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３またはそのヒト化バージョンである。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、全長抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディである。いくつかの実施態様では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は融合タンパク質に含まれる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬はポリペプチドであり、そのポリペプチドはＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＣＤ９３に結合するが、ＣＤ９３を活性化しない。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒに対してよりも高い親和性でＣＤ９３に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７よりも高い親和性でＣＤ９３に結合する。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７のＩＢドメインを含む。いくつかの実施形態において、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、安定化ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、安定化ドメインはＦｃドメインである。いくつかの実施形態において、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、約５０～約２００アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬は、融合タンパク質、ペプチド類似体、アプタマー、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、シュピーゲルマー（ｓｐｅｉｇｅｌｍｅｒ）、または小分子化合物を含む。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬は、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または遺伝子編集システムを含む。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、その方法は、対象に第２の薬剤を投与するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ４抗体からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、抗血管新生阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗血管新生阻害剤は抗ＶＥＧＦ阻害剤である。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは異常な腫瘍血管系を特徴とする。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、ＶＥＧＦの高い発現を特徴とする。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは、ＣＤ９３の高い発現を特徴とする。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんはＩＧＦＢＰ７の高い発現を特徴とする。
上記の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、がんは固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、神経膠芽腫（グリオブラストーマ）、腎細胞がん、子宮頸がん、卵巣がん、卵管がん、腹膜がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、口腔扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、脳腫瘍、骨がん、メラノーマ（悪性黒色腫）である。いくつかの実施形態では、がんは血管が豊富である（血管に富む）。いくつかの実施形態では、がんはトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、がんはメラノーマである。いくつかの実施形態では、患者は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせの投与を含む以前の治療に抵抗性（または耐性）である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される「豊富（enriched）」とは、がんを有さない対象における対応する組織中の血管の量または密度と比較して、腫瘍組織中の血管のより大きい量またはより高い密度（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％またはそれ以上）を指す。
いくつかの実施形態では、候補薬剤ががんを治療するのに有用であるかどうかを決定する方法であって、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を破壊するかどうかを決定することを含み、候補薬剤は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊することが示される場合にがんの治療に有用である方法も提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、候補薬剤が細胞表面でのＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との相互作用を破壊するかどうかを決定することを含む。いくつかの態様において、方法は、候補薬剤がｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系においてＣＤ９３とＩＧＦＢ７との相互作用を特異的に破壊するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系は酵母ツーハイブリッドシステムである。いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系はＥＬＩＳＡベースのアッセイである。いくつかの態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系はＦＡＣＳベースのアッセイである。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、抗体、ペプチド、融合ペプチド、ペプチド類似体、ポリペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、または小分子化合物である。いくつかの実施形態では、方法は、候補薬剤をＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、上記の方法のいずれかによって同定される薬剤が提供される。
いくつかの実施形態では、天然に存在しない（non-naturally occurring）ポリペプチドも提供され、天然に存在しないポリペプチドは、ＣＤ９３の細胞外ドメインを含むバリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドであり、そのポリペプチドは、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは膜結合型である。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは可溶性である。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＭＭＮＲ２に対するよりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３よりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、Ｆ２３８残基を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、安定化ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、安定化ドメインはＦｃドメインである。いくつかの実施形態では、阻害性ポリペプチドは、約５０～約２００アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドであって、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断するポリペプチドも提供される。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＣＤ９３に結合するが、ＣＤ９３を活性化しない。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒに対してよりも高い親和性でＣＤ９３に結合する。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７よりも高い親和性でＣＤ９３に結合する。いくつかの実施形態では、バリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７のＩＢドメインを含む。いくつかの実施形態において、バリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、安定化ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、安定化ドメインはＦｃドメインである。いくつかの実施形態において、バリアント阻害性は、約５０～約２００アミノ酸長である。
いくつかの実施形態では、上記の薬剤、天然に存在しないポリペプチド、または天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物も提供される。
図１Ａ～１Ｇは、ＶＥＧＦシグナル伝達によって調節される腫瘍血管系における受容体タンパク質としてのＣＤ９３の同定を示す。図１Ａは、４つの異なる公開されたＲＮＡ－ＳｅｑデータセットからのＶＥＧＦ阻害剤によって有意に低減された（Ｌｏｇ２倍変化＜－０．５）腫瘍血管遺伝子の重複を表すベン図を示す。ＣＤ９３は、全てのデータセットにおいてダウンレギュレートされることが見出された唯一の遺伝子であり、１０個のさらなる遺伝子（リスト、右）が４つのデータセットのうちの３つにおいてダウンレギュレートされた。 図１Ｂは、それぞれ示された遺伝子をノックダウンしたときのＨＵＶＥＣ細胞における管形成を示す。 図１Ｃは、ＣＤ９３転写についてのＴＣＧＡ正常およびＧＴＥｘデータセットの解析を示す。 図１Ｄは、ＣＤ９３発現についてのヒト膵臓、ＰＤＡおよびＰＮＥＴ腫瘍のＩＨＣ染色の代表を示す。 図１Ｅは、ＶＥＧＦありまたはなしで培養したマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）における表面ＣＤ９３の免疫蛍光（「ＩＦ」）染色を示す。 図１Ｆは、正常な膵臓および同所性ＫＰＣ腫瘍の組織からの標本をＣＤ９３およびＣＤ３１について染色した免疫蛍光染色を示す。 図１Ｇは、正常な皮膚および皮下移植されたＢ１６マウス腫瘍からの標本をＣＤ９３およびＣＤ３１について染色した免疫蛍光染色を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図２Ａ～２Ｅは、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用の遮断が腫瘍成長を阻害し、血管成熟を促進することを示す。図２Ａは、対照またはマウスＣＤ９３モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）による処置後の腫瘍体積の変化を示す。Ｂ６マウスにＫＰＣ腫瘍細胞を移植し、週に２回対照またはマウスＣＤ９３ ｍＡｂの処置を開始した。腫瘍成長を経時的にモニターした。 図２Ｂは、対照およびｍＣＤ９３ ｍＡｂ ７Ｃ１０で処置したマウスからの腫瘍切片におけるＣＤ３１のＩＦ染色を示す。血管密度、円形血管（circular vessel）の割合（％）、および全血管長を群間で比較した。矢印は円形血管を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図２Ｃは、凍結腫瘍切片をＣＤ３１およびαＳＭＡについて共染色し、各視野（field）のαＳＭＡ＋血管の割合（％）を定量化したことを示す。スケールバー＝５０μｍ。 図２Ｄは、腫瘍切片をＣＤ３１およびＮＧ２について共染色し、各視野のＮＧ２＋血管の割合（％）の定量化したことを示す。各ドットは１匹の動物の平均値を表し、そのうちの少なくとも５つのランダムな視野を分析した。スケールバー＝５０μｍ。 図２Ｅは、ＫＰＣ腫瘍担持マウスを対照またはＣＤ９３ ｍＡｂで１週間に２回処置し、続いてレクチン－ＦＩＴＣの静脈内注射により腫瘍灌流を評価したことを示す。ＣＤ３１＋血管とレクチン－ＦＩＴＣとの重ね合わせは、灌流腫瘍血管と非灌流腫瘍血管を明示する。灌流した腫瘍血管の定量を右側に示す。各ドットは、１匹の動物についての平均値を表し、各動物について少なくとも５つのランダムな視野が取られる（ｎ＝５）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。 図３Ａ～３Ｆは、ＣＤ９３の遮断が腫瘍における免疫細胞の浸潤を促進することを示す。図３Ａは、対照または抗ＣＤ９３の処置開始後８日目および１５日目の移植されたＫＰＣ腫瘍におけるＣＤ３およびＣＤ３１免疫染色およびＤＡＰＩ核染色の代表的な画像を示す。 図３Ｂは、対照または抗ＣＤ９３によって処置された腫瘍組織におけるＣＤ３＋Ｔ細胞の定量を示す。各ドットは、１匹の動物についての平均値を表し、各動物について少なくとも５つのランダムな視野が取られる。 １５日間の抗体処置後のフローサイトメトリー分析を示す。フローサイトメトリー分析を実施して、浸潤するＣＤ４５＋白血球の割合（％）を決定した。各ドットは１つの腫瘍を示す。 １５日間の抗体処置後のフローサイトメトリー分析を示す。フローサイトメトリー分析を実施して、ＣＤ４５＋白血球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの数を決定した。各ドットは１つの腫瘍を示す。 １５日間の抗体処置後のフローサイトメトリー分析を示す。フローサイトメトリー分析を実施して、腫瘍におけるＣＤ４５＋白血球中の顆粒球性（ＣＤ３－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ－）ＭＤＳＣおよび単球性（ＣＤ３－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ＋）ＭＤＳＣの割合（％）を決定した。各ドットは１つの腫瘍を示す。 図３Ｆは、抗体処置の１４日後の皮下Ｂ１６マウス腫瘍におけるＣＤ３およびＣＤ３１免疫染色の代表的な画像を示す。各ドットは１匹の動物の平均値を表し、少なくとも５つのランダムな視野を分析した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。 図４Ａ～４Ｇは、ＩＧＦＢＰ７がＣＤ９３の結合パートナーとして同定されたことを示す。図４Ａは、ヒトゲノムスケール受容体アレイ（ＧＳＲＡ）スクリーニングシステムにおけるＣＤ９３－Ｉｇに対する陽性ヒット（ＩＧＦＢＰ７）を有する対象ウェルのグラフィックビューを示す。Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の発現構築物を含むウェルを陽性対照として使用した。 図４Ｂは、示されるように対照、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂの存在下で、結合についてＩＧＦＢＰ７－Ｉｇで染色された、対照またはＣＤ９３遺伝子で形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。 図４Ｃは、ｈＣＤ９３に対するｍＡｂの存在下または不在下で、対照またはＩＧＦＢＰ７－Ｉｇで染色されたＨＵＶＥＣ細胞を示す。 図４Ｄは、ＨＵＶＥＣ細胞溶解物を対照ＩｇＧまたはＣＤ９３ ｍＡｂで免疫沈降させ、ＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７抗体でブロットした。 図４Ｅは、ＣＤ９３に対するヒトＩＧＦＢＰ７のマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）結合曲線を示す。Ｋｄ値を示す。 図４Ｆは、結合に関してマウスＩＧＦＢＰ７－Ｉｇで染色された対照またはマウスＣＤ９３遺伝子で形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を示す。マウスＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７に対するモノクローナル抗体を添加して、それらの遮断能力を評価した。 図４Ｇは、ＩＧＦＢＰ７（ＢＰ７）の各ドメインをＩＧＦＢＰＬ１（ＢＰＬ１）由来の対応する部分で置き換えることによって作製された一連のキメラタンパク質の構造を表す概略図である。各キメラタンパク質のＣＤ９３トランスフェクタントへの結合をフローサイトメトリーによって試験した。結合指数は、ＣＤ９３トランスフェクタントの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を対照のＭＦＩで割ったものを指す。 図５Ａ～５Ｅは、腫瘍血管内皮上でのＩＧＦＢＰ７の発現を示す。図５Ａは、ヒト膵臓およびＰＤＡがんにおけるＩＧＦＢＰ７およびＣＤ３１のＨ＆Ｅ染色およびＩＦ共染色を示す。膵管腺がん（ＰＤＡＣ）および正常な膵臓におけるＩＧＦＢＰ７陽性血管の割合（％）を定量化した。各ドットは、１つの組織の平均値を表し、少なくとも５つのランダムな視野が分析された。Ｉ：膵島。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｂは、移植されたＫＰＣ腫瘍組織をＩＧＦＢＰ７およびＣＤ３１について共染色したことを示し、破線は腫瘍の縁部（Ｅ）から中央領域（Ｃ）を分離する。スケールバー１００μｍ。 図５Ｃは、ＤＭＯＧで処理した（０、１０および２４時間）ＨＵＶＥＣ細胞のＨＩＦ－１αおよびＩＧＦＢＰ７の発現についての代表的なウェスタンブロットを示す。Ｌ：タンパク質ラダー。 図５Ｄは、免疫蛍光法によって検出されたマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）上のＩＧＦＢＰ７発現を示す。マウスＶＥＧＦＲ遮断ｍＡｂありまたはなしで、ＭＡＥＣ細胞をジメチルオキサロイルグリシン（ＤＭＯＧ）と共にインキュベートして、低酸素状態（hypoxia）を誘導した。ＩＧＦＢＰ７発現細胞の割合（％）を定量化した。ドットは、ランダムに取得された視野からの値を表わす。スケールバー＝５０μｍ。 図５Ｅは、アフリベルセプト（aflibercept）処置の２４時間後の異種移植結腸がんモデル（Zhao Q., Cancer Research 2018;78(9):2370-82）由来の腫瘍内皮細胞におけるＩＧＦＢＰ７発現を示すバイオリンプロット（violin plot）を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。 図６Ａ～６Ｄは、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３経路の標的化が薬物送達を改善し、化学療法を容易に（facilitate）することを示す。図６Ａは、対照またはＣＤ９３ ｍＡｂで処置したＫＰＣ腫瘍担持マウスにおけるドキソルビシンおよび低酸素状態（低酸素プローブ（hypoxyprobe））の免疫蛍光染色を示す。対照またはＣＤ９３ ｍＡｂで１週間に２回処置したＫＰＣ腫瘍担持マウスに、薬物送達および低酸素状態の評価のためにそれぞれドキソルビシンおよびピモニダゾール（pimonidazole）を注射した。腫瘍内のドキソルビシンの進入および低酸素（低酸素プローブ）領域を定量化した。各ドットは１匹の動物を表し、その腫瘍組織全体を分析した。 図６Ｂは、対照、ｍＣＤ９３ ｍＡｂ単独、５－ＦＵ単独、およびｍＣＤ９３ ｍＡｂと５－ＦＵの組み合わせの処置を受けた群の腫瘍体積曲線を示す。ｎ＝７。＊Ｐ＝０．０４５；＊＊Ｐ＝０．０１６３。Ｂ６マウスに２ｘ１０５Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を皮下移植し、腫瘍が触知可能になった６日目に抗体および５－ＦＵの処置を開始した。 図６Ｃは、対照、ｍＣＤ９３ ｍＡｂ単独、５－ＦＵ単独、およびｍＣＤ９３ ｍＡｂと５－ＦＵの組み合わせの処置を受けた群のカプラン・マイヤー生存時間分析（Kaplan-Meier survival analysis）を示す。ｎ＝７。＊Ｐ＝０．０４５＊＊；Ｐ＝０．０１６３。Ｂ６マウスに２ｘ１０５Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を皮下移植し、腫瘍が触知可能になった６日目に抗体および５－ＦＵの処置を開始した。 図６Ｄは、５－ＦＵ単独、ならびに５－ＦＵとｍＣＤ９３ ｍＡｂの組み合わせの処置による、Ｂ１６マウス腫瘍組織におけるＫｉ－６７および切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）の免疫蛍光染色を示す。腫瘍組織におけるＫｉ－６７陽性およびＣＣ３陽性細胞の割合（％）を定量化した。各ドットは１匹の動物を表し、その腫瘍組織全体を分析した。スケールバー＝５０μｍ。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。 図７Ａ～７Ｇは、ＣＤ９３の遮断が抗ＰＤ－１療法に対する腫瘍の感受性を高める（sensitize）ことを示す。図７Ａは、１４日間の抗体処置後の腫瘍重量を示す。ＫＰＣ腫瘍担持マウスに、対照または抗ＣＤ９３の処置を開始した。一部の群では、抗ＣＤ９３での処置前に、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞をそれぞれの抗体によって枯渇させた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。各ドットは１つの腫瘍を表す。 図７Ｂは、皮下ＫＰＣマウス腫瘍におけるＢ７－Ｈ１およびＣＤ３１の免疫染色の代表的な画像を示す。 図７Ｃは、Ｂ７－Ｈ１発現に関する腫瘍組織の単細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析を示す。腫瘍細胞、ＣＤ４５＋白血球、およびＣＤ３１＋ＥＣにおけるＢ７－Ｈ１陽性細胞の割合（％）を決定した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。各ドットは１つの腫瘍を表す。 図７Ｄは、ＫＰＣ腫瘍担持マウスにおいて示される、腫瘍成長曲線を示す。処置は、ＫＰＣ腫瘍の７日後に開始した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。 図７Ｅは、ＫＰＣ腫瘍担持マウスにおいて示される、抗体での処置の１６日後の腫瘍重量を示す。処置は、ＫＰＣ腫瘍接種の７日後に開始した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。各ドットは１つの腫瘍を表す。 図７Ｆは、フローサイトメトリーによって決定された、腫瘍内の免疫細胞の数を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。各ドットは１つの腫瘍を表す。 図７Ｇは、フローサイトメトリーによって決定された腫瘍内の免疫細胞の組成を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ｐ値は対応のないスチューデントｔ検定によって決定した。全てのデータは平均±ＳＥＭを表す。各ドットは１つの腫瘍を表す。 図８Ａおよび８Ｂは、抗ＣＤ９３処置が腫瘍内のＴ細胞サブセットの比率に影響を及ぼさないことを示す。図８Ａは、１５日間の抗体処置を行った際に腫瘍に浸潤するＴ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析を示す。 図８Ｂは、４時間のＰＭＡ＋イノマイシン刺激を行った際の、新たに単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおける細胞内サイトカインＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分析を示す。 図９Ａおよび９Ｂは、抗ＣＤ９３が腫瘍血管上のＩＣＡＭ－１発現を増加させることを示す。図９Ａは、１４日間の抗体処置後の皮下ＫＰＣマウス腫瘍由来の腫瘍組織におけるＩＣＡＭ－１およびＣＤ３１の免疫染色の代表的な画像を示す。 図９Ｂは、１４日間の抗体処置後の皮下Ｂ１６マウス腫瘍由来の腫瘍組織におけるＣＤ４５、ＣＤ３１およびＩＣＡＭ－１の免疫染色の代表的な画像を示す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＤ９３に対するＩＧＦＢＰ７上の結合ドメインの同定を示す。インスリン結合（ＩＢ）、Ｋａｚａｌ、およびＩｇを含むＩＧＦＢＰ７の各細胞外ドメインを、ＰＣＲクローニングを使用してＩＧＦＢＰＬ１上の対応するドメインとスワップし、Ｃ末端Ｉｇに融合させた。これらのキメラ変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性に発現させ、上清を用いてＣＤ９３トランスフェクタントを染色した。図１０Ａは、多様なキメラＩＧＦＢＰ７変異体がＣＤ９３に結合するかどうかを示す。 図１０Ｂは、Ｆｃ－Ｔａｇを含む発現ベクター上に構築されたＩＢドメインを含む様々なヒト遺伝子を示す。構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性に形質導入して、上清中にＦｃタグ付け融合タンパク質を産生させた。上清を使用して、フローサイトメトリーによってＣＤ９３トランスフェクタントを染色した。結合指数は、ＣＤ９３トランスフェクタントの結合ＭＦＩの対照細胞に対する比を表す。 図１１Ａおよび１１Ｂは、ヒトＰＤＡがんにおけるＩＧＦＢＰ７転写を示す。図１１Ａは、正常な膵臓におけるよりもヒトＰＤＡにおけるＩＧＦＢＰ７転写物の増加を示す。 図１１Ｂは、ＩＧＦＢＰ７の転写が、ＰＥＣＡＭ１、ＣＤ３４、ＶＷＦ、およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）を含む既知の内皮細胞マーカーと相関することを示す、ＴＣＧＡ ＰＤＡデータセットのＦＡＣＳ分析を示す。 図１２Ａおよび１２Ｂは、マウス腫瘍血管系上でのＩＧＦＢＰ７の選択的発現を示す。図１１Ａは、ナイーブＢ６マウスの正常な膵臓由来の標本および同所性ＫＰＣマウス腫瘍由来の組織における、ＩＧＦＢＰ７およびＣＤ３１のＩＦ染色を示す。Ｉは膵島を指す。 図１２Ｂは、ナイーブＢ６マウスの正常な皮膚、ならびに皮下移植されたＫＰＣおよびＢ１６マウス腫瘍由来の組織からの標本における、ＩＧＦＢＰ７およびＣＤ３１のＩＦ染色を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１３Ａ～１３Ｃは、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用の遮断が血管新生および腫瘍成長を阻害することを示す。図１３Ａは、ＩＧＦＢＰ７ノックダウンＨＵＶＥＣ細胞および対照ＨＵＶＥＣ細胞において実施された管形成アッセイの結果を示す。 図１３Ｂは、ＷＴまたはＣＤ９３ノックダウンＨＵＶＥＣ細胞において外因性ＩＧＦＢＰ７タンパク質を用いてまたは用いずに実施した管形成アッセイの結果を示す。 図１３Ｃは、ＷＴまたはＣＤ９３ノックダウンＨＵＶＥＣ細胞において外因性ＩＧＦＢＰ７タンパク質を用いてまたは用いずに実施したトランスウェル遊走アッセイ（transwell migration assay）の結果を示す。 図１４Ａ～１４Ｆは、ＩＧＦＢＰ７遮断が腫瘍成長を遅延させ、腫瘍血管成熟を促進することを示す。図１４Ａは、マウスＩＧＦＢＰ７がＭＡＥＣ細胞に結合し、相互作用がＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂ（クローン２Ｃ６）によって遮断され得ることを示す。 図１４Ｂは、ＩＧＦＢＰ７抗体の処置後の腫瘍体積の変化を示す。触診可能なＫＰＣ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、対照またはｍＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂ（クローン２Ｃ６）で週に２回処置した。腫瘍成長を経時的にモニターした（ｎ＝１０マウス／群）。 図１４Ｃは、凍結腫瘍切片でのＣＤ３１のＩＦ染色を示す。血管密度、円形血管の割合（％）および全血管長を群間で比較した。矢印は円形血管を示す。スケールバー＝５０μｍ。 図１４Ｄは、凍結ＫＰＣマウス腫瘍切片でのＣＤ３１およびαＳＭＡのＩＦ染色の代表的な画像を示す。各ドットは、３匹の動物からのランダムな視野を表し、少なくとも３つのランダムな視野が各動物から取られる。 図１４Ｅは、凍結ＫＰＣマウス腫瘍切片でのＣＤ３１およびＮＧ２のＩＦ染色の代表的な画像を示す。各ドットは、３匹の動物からのランダムな視野を表し、少なくとも３つのランダムな視野が各動物から取られる。 図１４Ｆは、ＫＰＣマウス腫瘍切片でのＣＤ３１および活性化インテグリンβｌ（９ＥＧ７）のＩＦ染色の代表的な画像、ならびに９ＥＧ７＋血管の定量化（全血管に対する％）を示す。各ドットは、１匹の動物についての平均値を表し、各動物について少なくとも５つのランダムな視野が取られる。スケールバー＝５０μｍ。 図１５は、ヒトＩＧＦＢＰ７がヒトＩＧＦ１Ｒトランスフェクタントに結合しないことを示す。野生型ＣＨＯおよびＩＧＦ１ＲトランスフェクトＣＨＯ細胞をヒトＩＧＦ１Ｒ染色抗体で染色して、表面ＩＧＦ１Ｒ発現を確認した。同時に、フローサイトメトリー分析による可能な相互作用の分析のために、細胞をＩＧＦＢＰ７－Ｉｇと共にインキュベートした。 図１６は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を遮断するための様々な市販の抗ヒトＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂおよび抗ＣＤ９３ ｍＡｂの能力を示す。 図１７Ａおよび１７Ｂは、非造血細胞上のＣＤ９３が、ＣＤ９３を遮断することによる抗腫瘍効果を媒介することを示す。図１７Ａは、腫瘍血管系（ＣＤ３１＋）上の注射された抗ＣＤ９３を検出したＢ１６腫瘍のＩＦ染色の代表的な画像を示す。 図１７Ｂは、抗ＣＤ９３抗体での処置後のＣＤ９３キメラマウスにおける腫瘍成長を示す。ＷＴまたはＣＤ９３ＫＯマウス由来の骨髄（ＢＭ）細胞で再構成されたＷＴ Ｂ６マウスに、Ｂ１６腫瘍細胞を接種し、続いて抗体処置を行った。＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１８Ａ～１８Ｃは、ＣＤ９３遮断がマウス腫瘍成長を阻害することを示す。ＣＤ９３（図１８Ａ）およびＩＧＦＢＰ７（図１８Ｂ）の両方が、皮下Ｂ１６腫瘍の腫瘍血管系においてアップレギュレートされた。 ＣＤ９３（図１８Ａ）およびＩＧＦＢＰ７（図１８Ｂ）の両方が、皮下Ｂ１６腫瘍の腫瘍血管系においてアップレギュレートされた。 図１８Ｃは、抗ＣＤ９３抗体処置後の腫瘍成長を示す。触知可能なＢ１６腫瘍を有するマウスに、対照または抗ＣＤ９３（７Ｃ１０）での処置を施した。ｎ＝１０。＊ｐ＜０．０１。 図１９Ａ～１９Ｇは、ＣＤ９３遮断が、好ましい腫瘍免疫微小環境を促進することを示す。図１９Ａは、抗体処置の２週間後のＢ１６腫瘍のＣＤ３およびＣＤ３１免疫染色の代表的な画像を示す。 図１９Ｂは、Ｂ１６腫瘍における浸潤ＣＤ４５＋白血球のフローサイトメトリー分析を示す。 図１９Ｃは、Ｂ１６腫瘍における免疫細胞サブセットを示す。 抗ＣＤ９３は、ＣＤ８＋ＴＩＬにおける、ＴＥＭ（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌ－）、ＰＤ１＋およびグランザイムＢ＋細胞の割合（％）を増加させた。 抗ＣＤ９３は、ＣＤ８＋ＴＩＬにおけるサイトカイン産生細胞の割合（％）を増加させた。 図１９Ｆは、ＰＤ１＋細胞、ＴＥＭ細胞およびＴｒｅｇ細胞に対する抗ＣＤ９３処置の効果を示す。同じ処置は、ＰＤ１＋およびＴＥＭ細胞の増加を引き起こし、ＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントにおけるＴｒｅｇ細胞の減少を伴った。 図１９Ｇは、Ｂ１６腫瘍組織のＩＦ染色の代表的な画像を示す。ＩＦ染色は、抗ＣＤ９３処置腫瘍における低酸素領域の減少およびより少ないＣＤ１１ｂ＋サプレッサーを明らかにした。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２０Ａ～２０Ｅは、ＣＤ９３遮断が免疫チェックポイント遮断（ＩＣＢ）療法に対してＢ１６メラノーマの感受性を高めることを示す。図２０Ａは、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ３１、およびＣＤ４５について染色された抗体処理下のＢ１６腫瘍の代表的な画像を示す。 図２０Ｂは、異なる細胞タイプでのＰＤ－Ｌ１のフローサイトメトリー分析を示す。触知可能なＢ１６腫瘍を有するＢ６マウスを、示された抗体により２回／週で処置した。 図２０Ｃは、腫瘍成長および生存曲線を示す。 図２０Ｄは、腫瘍内免疫細胞の定量化を示す。 図２０Ｅは、異なるＴ細胞サブセットにおけるＴＥＭ細胞（ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌ－）の定量化を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。 図２１Ａ～２１Ｄは、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３経路がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の血管系においてアップレギュレートされることを示す。図２１Ａは、ヒトＴＮＢＣ腫瘍におけるＣＤ９３のＩＦ染色の代表的な画像を示す。ＣＤ３１は血管を染色するために使用される。 図２１Ｂは、ヒトＴＮＢＣ腫瘍におけるＩＧＦＢＰ７のＩＦ染色の代表的な画像を示す。ＣＤ３１は血管を染色するために使用される。 図２１Ｃは、マウス４Ｔ１腫瘍におけるＣＤ９３のＩＦ染色の代表的な画像を示す。ＣＤ３１は血管を染色するために使用される。 図２１Ｄは、マウス４Ｔ１腫瘍におけるＩＧＦＢＰ７のＩＦ染色の代表的な画像を示す。ＣＤ３１は血管を染色するために使用される。 図２２は、ＩＧＦＢＰ７発現がＴＮＢＣにおける予後不良に関連することを示す。 図２３Ａおよび２３Ｂは、抗ＣＤ９３がｉｎ ｖｉｖｏで同所性ＢＣ腫瘍成長を阻害することを示す。マウスに４Ｔ１を同所移植した（図２３Ａ）。触知可能になると、マウスを対照または抗ＣＤ９３ ｍＡｂ（クローン７Ｃ１０、１０ｍｇ／ｋｇ）で週２回処置した。 マウスにＰＹ８１１９（図２３Ｂ）を同所移植した。触知可能になると、マウスを対照または抗ＣＤ９３ ｍＡｂ（クローン７Ｃ１０、１０ｍｇ／ｋｇ）で週２回処置した。 図２４Ａ～２４Ｃは、ＣＤ９３シグナル伝達の遮断が、同所性４Ｔ１における腫瘍血管成熟を促進することを示す。抗ＣＤ９３処置の１０日後、４Ｔ１腫瘍組織をαＳＭＡ（図２４Ａ）およびＮＧ２（図２４Ｂ）について染色して、ＣＤ３１＋血管上の周皮細胞被覆率を調べた。血管をＣＤ３１染色によって計数した。図２４Ｃは、抗ＣＤ９３処置が、腫瘍低酸素状態を有意に軽減し、かつ灌流を増加させることを示し、それぞれ、ピモニダゾールおよびレクチン－ＦＩＴＣ染色によって示される。 図２５Ａ～２５Ｃは、ＣＤ９３遮断が好ましいＴＭＥを促進することを示す。抗ＣＤ９３の処置下の４Ｔ１腫瘍は、ＩＦに基づいて（図２５Ａ、２５Ｂ）、およびＦＡＣＳ分析に基づいて（図２５Ｃ）、より少ない腫瘍内ＭＤＳＣを伴ってより多くのＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤を示した。 図２６Ａ～２６Ｃは、ＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３がヒトがん内の血管系においてアップレギュレートされることを示す。ＩＧＦＢＰ７は、腎臓、頭頸部、ならびに結腸を含むヒトがん内の脈管構造においてアップレギュレートされる。 ＣＤ９３は、腎臓、頭頸部、ならびに結腸を含むヒトがん内の脈管構造においてアップレギュレートされる。 図２６Ｃは、ＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７の両方がメラノーマ腫瘍内皮（melanoma-associated endothelium）においてアップレギュレートされることを示す。 図２７Ａおよび２７Ｂは、抗ＰＤ療法に抵抗性のヒトがんにおけるＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３経路の豊富さを示す。図２７Ａは、転移性尿路上皮がんを有する患者におけるＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３の発現レベルを示す。抗ＰＤ－Ｌ１で処置された転移性尿路上皮がんを有する患者の第ＩＩ相試験（７７）において、ＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３の発現レベルを、ノンレスポンダー（ＳＤ／ＰＤ）とレスポンダー（ＣＲ／ＰＲ）との間で比較した。統計分析は、ウィルコクソン順位和検定を用いて行った。 図２７Ｂは、メラノーマ患者におけるＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３の発現レベルを示す。抗ＰＤ－１療法下のメラノーマ患者のコホートにおいて（７８）、レスポンダーおよびノンレスポンダーにおけるＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３の発現を決定した。統計分析は、対応のないスチューデントｔ検定を用いて行った。 図２８Ａ～２８Ｅは、ＩＧＦＢＰ７およびＭＭＲＮ２がＣＤ９３上の異なるモチーフに結合することを示す。図２８Ａでは、グループ１４のＣ型レクチン分子を発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結合を、ＩＧＦＢＰ７－ＩｇおよびＭＭＲＮ２－Ｉｇの結合について染色した。 図２８Ｂでは、ＣＤ９３を安定に発現するＣＨＯ細胞を、ＩＧＦＢＰ７－Ｈｉｓタンパク質の存在下または不在下で、対照またはＭＭＲＮ２－Ｉｇで染色した。 図２８Ｃでは、ＩＧＦＢＰ７－Ｈｉｓタンパク質でコーティングしたウェルをＣＤ９３－Ｈｉｓタンパク質と共にインキュベートした後、ＥＬＩＳＡによってＭＭＲＮ２－Ｉｇ結合について調べた。ＣＤ９３－Ｈｉｓタンパク質でコーティングしたウェルを陽性対照として用いた。 図２８Ｄでは、対照またはＣＤ９３構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ｍＣＤ９３（７Ｃ１０）の存在下または不在下で、結合についてＭＭＲＮ－Ｉｇで染色した。 図２８Ｅでは、異なるマウスＣＤ９３変異体を発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、抗ＣＤ９３（７Ｃ１０）、ＩＧＦＢＰ７－Ｉｇ、およびＭＭＲＮ２－Ｉｇで染色した。
本出願は、治療的介入のための好ましい腫瘍微小環境を促進するのに有用な方法および組成物を提供する。固形腫瘍内の漏出性でかつ不規則な血管ネットワークは、薬物送達に大きな障害をもたらし、また免疫細胞浸潤を損なう。インスリン様成長因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）が、この異常の中枢であるＣＤ９３を介してシグナルを伝達することが、本出願の発明者らによる新規な発見であった。ＶＥＧＦシグナル伝達によって制御されるＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７の発現は、両方とも腫瘍組織においてアップレギュレートされる。驚くべきことに、ＩＧＦＢＰ７モノクローナル抗体またはＣＤ９３モノクローナル抗体のいずれかによるＩＧＦＢＰ７とＣＤ９３との相互作用の破壊は、腫瘍成長を弱め、血管成熟を促進することが見出された。ＣＤ９３の遮断は、腫瘍灌流を増加させ、低酸素状態を軽減し、化学療法を容易にする。さらに、ＣＤ９３の標的化は、腫瘍内Ｔ細胞浸潤を促進し、それによって抗ＰＤ１抗体療法に対して腫瘍の感受性を高める。したがって、本出願は、異常な腫瘍血管形成の原因となる新規な分子相互作用を同定し、がん治療に対する新規なアプローチを提供する。
本出願は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤、例えば、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する薬剤を提供する。適切な薬剤には、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体（blocking antibody）、ＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチド、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチド、ならびに、ペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムなどの他の薬剤が含まれる。これらの薬剤は、がんを治療するのに有用であるか、あるいは、異常な腫瘍血管新生を遮断する、未熟で漏出性の血管を正常化する、腫瘍における機能的血管ネットワークの形成を促進する、血管成熟を促進する、好ましい腫瘍微小環境を促進する、腫瘍における免疫細胞浸潤を増加させる、腫瘍灌流を増加させる、および腫瘍における低酸素状態を軽減させるなどの、がん治療の１つまたは複数の態様に寄与するために有用である。本明細書に記載される薬剤はまた、第２の療法に対して腫瘍の感受性を高める、または第２の治療剤の送達を容易にするのに有用である。したがって、本明細書に記載の薬剤は、併用療法、例えば、化学療法剤および免疫調節剤との併用に特に有用である。
したがって、一態様では、対象におけるがんまたはがん治療の１つまたは複数の態様を治療する方法であって、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（例えば、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する薬剤）の有効量を対象に投与することを含む方法が提供される。
別の態様では、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する新規薬剤（例えば、抗ＣＤ９３、抗ＩＧＦＢＰ７、阻害性ＣＤ９３ポリペプチド、および阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）が提供される。
別の態様では、例えばハイスループットスクリーニングの状況において、がん治療に有用な薬剤（例えば、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する薬剤）を同定する方法が提供される。
キット、薬剤（本明細書に記載の薬剤のいずれかなど）、薬剤（本明細書に記載の薬剤のいずれかなど）をコードするポリヌクレオチド、および本明細書に記載の方法に有用な試薬（単離されたＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体など）も提供される。
Ｉ．定義
特に断りがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。加えて、本明細書に記載される方法または材料と類似または同等の任意の方法または材料を、本出願の実施において使用することができる。本出願の目的のために以下の用語が定義される。
本明細書において「含む」という用語で説明される本出願の実施形態は、「からなる」および／または「から本質的になる」の実施形態を含むことが理解される。
ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を阻害する薬剤は、薬剤の非存在下でのＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合のレベルと比較して、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合のレベルを低下させる任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合レベルを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％または５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下させるものである。いくつかの態様において、薬剤は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合のレベルを検出不可能なレベルまで低下させるか、またはＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合を排除するものである。ＩＧＦＢＰ７へのＣＤ９３の結合を検出および／または測定（定量化）するための適切な方法は、当業者に周知であり、本明細書に記載されるものを含む。
「血管新生」は、新しい血管が既存の血管から発芽するプロセスを指す。
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体、キメラ抗体、全長抗体およびその抗原結合フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。抗体および／または抗体フラグメントは、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、サメ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、しっかり非共有結合性会合した１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与しかつ抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（重鎖および軽鎖からそれぞれ３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識して結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低い親和性である。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖になるように連結されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) （あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書に記載の「ダイアボディ（単数または複数）」は、２つのｓｃＦｖポリペプチドを含む複合体を指す。いくつかの態様において、ＶＨおよびＶＬドメインの鎖間対合が達成されるが、鎖内対合は達成されず、二価フラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントがもたらされる。
非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＨＶＲ）由来の残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992) （各々が、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、等モル濃度の第１の抗体の存在下で、第２の抗体の標的結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のいずれか）阻害する場合に、第１の抗体は、標的（例えば、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７）への結合に関して第２の抗体と「競合」し、またその逆もそうである。これらの交差競合に基づいて抗体を「ビニング（binning）」するためのハイスループットプロセスは、国際公開第０３／４８７３１号に記載されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において同定されるポリペプチドおよび抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」または「相同性」は、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮して配列をアラインメントさせた後に、比較対象のポリペプチド中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、またはＭＵＳＣＬＥソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の技術の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＭＵＳＣＬＥ(Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004; Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004；各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して作製される。
「相同性」は、２つのポリペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性または配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められる場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占められる場合、分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセントは、２つの配列によって共有されるマッチング位置または相同位置の数を、比較した位置の数で割ったものの１００倍の関数である。例えば、２つの配列中の１０個の位置のうちの６個がマッチしているかまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。一般に、比較は、２つの配列が最大の相同性を与えるように整列されたときに行われる。
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体またはダイアボディが結合する抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。２つの抗体または抗体部分は、それらが抗原に対して競合的結合を示す場合、抗原内の同じエピトープに結合し得る。
本明細書で使用する場合、等モル濃度の第１の抗体の存在下で、第２の抗体の標的抗原結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％のいずれか）阻害する場合に、第１の抗体（ダイアボディなど）は、標的抗原への結合に関して第２の抗体（ダイアボディなど）と「競合」し、またはその逆もそうである。これらの交差競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスは、国際公開第０３／４８７３１号に記載されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
「ポリペプチド」または「ペプチド」という用語は、本明細書では、あらゆる長さのタンパク質断片、融合タンパク質、および修飾タンパク質を含む、あらゆる種類の天然に存在するおよび合成のタンパク質を包含するために使用され、修飾タンパク質には、糖タンパク質、ならびにあらゆる他の種類の修飾タンパク質（例えば、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、グリコシル化、酸化、ホルミル化、アミド化、ポリグルタミル化、ＡＤＰ－リボシル化、ペグ化、ビオチン化などから生じるタンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、および「に特異的である」という用語は、標的と抗体（ダイアボディなど）との間の結合など、測定可能でかつ再現可能な相互作用を指す。ある特定の実施形態では、特異的結合は、生体分子（例えば、細胞表面受容体）を含む、異種集団の分子の存在下で標的の存在を決定するものである。例えば、標的（エピトープであり得る）を特異的に認識する抗体は、他の分子への結合よりも、高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い持続時間でこの標的に結合する抗体（ダイアボディなど）である。いくつかの実施形態では、無関係の分子への抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合に、標的への抗体の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、≦１０－５Ｍ、≦１０－６Ｍ、≦１０－７Ｍ、≦１０－８Ｍ、≦１０－９Ｍ、≦１０－１０Ｍ、≦１０－１１Ｍ、または≦１０－１２Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、排他的結合を必要としない。抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。このような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）およびペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「組成物（単数または複数）」は、本出願の組成物を含み、またそれに適用可能である。本出願はまた、本明細書に記載の成分を含む医薬組成物を提供する。
本明細書で使用される場合、「治療（treatment）」または「治療すること（treating）」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本出願の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、以下のうちの１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない：疾患から生じる１つまたは複数の症状を緩和すること、疾患の程度を軽減させること、疾患を安定化させること（例えば、疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の広がり（例えば、転移）を予防または遅延させること、疾患の再発を予防または遅延させること、疾患の進行を遅延または減速させること、疾患状態を改善すること、疾患の寛解（部分的または全体的）をもたらすこと、疾患を治療するために必要な１つまたは複数の他の薬物の用量を減らすこと、疾患の進行を遅延させること、生活の質を高めること、および／または生存を延長させること。また、「治療」には、腫瘍（例えば、がん）、再狭窄、または肺高血圧症などの過形成の病理学的結果の低減も包含される。本出願の方法は、治療のこれらの態様のいずれか１つまたは複数を企図する。治療される対象に対する利益は、統計的に有意であるか、または患者もしくは医師に少なくとも認知可能である。
本明細書で使用する「有効量」という用語は、特定の状況、障害、状態、または疾患を治療する、例えばその症状（例えば、臨床的または亜臨床的症状）の１つまたは複数を改善する、緩和する、軽減する、および／または遅延させるのに十分な薬剤または組成物の量を指す。治療的使用に関して、有益なまたは所望の結果には、例えば、疾患から生じる１つまたは複数の症状（生化学的、組織学的および／または行動学的）（その合併症および疾患の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む）を低減させること、疾患に罹患している人の生活の質を高めること、疾患を治療するために必要な他の薬物の用量を減らすこと、別の薬物の効果を増強させること、疾患の進行を遅延させること、および／または患者の生存を延長させることが含まれる。過形成（例えば、がん、再狭窄、または肺高血圧症）に関して、有効量は、過形成組織（腫瘍など）を縮小させ、および／または過形成組織の成長速度を低下させる（過形成または腫瘍成長を抑制するなど）か、または過形成における他の望ましくない細胞増殖を防止もしくは遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、過形成（例えば、がん、再狭窄、または肺高血圧症）の発症を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を防止または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与で投与することができる。がんの場合、薬物または組成物の有効量は、（ｉ）腫瘍細胞の数を減少させる；（ｉｉ）腫瘍サイズを減少させる；（ｉｉｉ）末梢器官への腫瘍細胞の浸潤を阻害し、遅延させ、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅らせ、好ましくは停止させる）；（ｖ）腫瘍成長を阻害する；（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延させる；および／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状の１つまたは複数をある程度軽減する。活性成分の組合せが投与される場合、組合せの有効量は、個々に投与された場合に有効であったであろう各成分の量を含んでも含まなくてもよいことに留意されたい。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢および全身状態、処置される状態の重症度、使用される特定の薬物（単数または複数）、投与方法などに応じて、対象ごとに変化する。
本明細書で使用する「同時投与（simultaneous administration）」という用語は、併用療法における第１の療法と第２の療法が、約１５分以下、例えば約１０分以下、約５分以下、または約１分以下のいずれかの時間間隔で投与されることを意味する。第１および第２の療法が同時に投与される場合、第１および第２の療法は、同じ組成物（例えば、第１および第２の療法の両方を含む組成物）に含まれていても、または別々の組成物に含まれてもよい（例えば、第１の療法は１つの組成物中に含まれ、２の療法は別の組成物中に含まれる）。
本明細書で使用される場合、「連続投与」という用語は、併用療法における第１の療法と第２の療法が、約１５分超、例えば、約２０分超、３０分超、４０分超、５０分超、６０分超、またはそれ以上のいずれかの時間間隔で投与されることを意味する。第１の療法または第２の療法のいずれかが最初に投与され得る。第１および第２の療法は、別々の組成物中に含有され、それらは、同じまたは異なるパッケージまたはキット中に含まれ得る。
本明細書で使用される場合、「同時並行投与（concurrent administration）」という用語は、併用療法における第１の療法の投与と第２の療法の投与が互いに重複することを意味する。
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に適合性である」とは、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない材料を意味し、例えば、その材料は、いずれの有意な望ましくない生物学的効果も引き起こすことなく、またそれが含まれる組成物の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物中に組み込まれ得る。薬学的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、毒物学的試験および製造試験の要求基準を満たしており、および／または米国食品医薬品局または他の州／連邦政府によって作製されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれ、あるいは、哺乳動物、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方に掲載されている。
用語「担体」は、それと共に化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油などの滅菌液体であってよく、それには、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれる。水または水溶液、生理食塩水溶液、ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、特に注射用溶液のための担体として好ましく使用される。あるいは、担体は、（圧縮丸剤用の）結合剤、流動促進剤、カプセル化剤、風味剤、および着色剤のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない固体剤形担体であってもよい。適切な医薬担体は、Ｅ．Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されており、それはあらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
「腫瘍」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とし、組織の良性または悪性の異常増殖を含む、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは説明する。用語「腫瘍」はがんを含む。
「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、本明細書において、哺乳動物を指すために互換的に使用され、それには、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類、または霊長類が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。特定の実施形態では、範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。用語「約」または「およそ」によって包含される許容可能な変動は、研究している特定の系に依存し、当業者によって容易に理解され得る。
本明細書で用いられる用語「約Ｘ～Ｙ」は、「約Ｘから約Ｙ」と同じ意味を有る。
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを記載しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、１つまたは複数の方法、および／または本明細書に記載されるタイプのステップ、および／または本開示を読むと当業者に明らかになるであろうステップを含む。当業者には明らかなように、評価され、治療のために選択され、および／または治療を受ける対象は、そのような活性を必要とする対象である。
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である統計解析、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来の技術を使用する。このようなツールおよび技術は、例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al. eds. (2005) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Bonifacino et al. eds. (2005) Current Protocols in Cell Biology. John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coico et al. eds. (2005) Current Protocols in Microbiology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ; Coligan et al. eds. (2005) Current Protocols in Protein Science, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ;およびEnna et al. eds. (2005) Current Protocols in Pharmacology, John Wiley and Sons, Inc.: Hoboken, NJ.に詳細に記載されている。さらなる技術は、例えば、米国特許第７，９１２，６９８号、ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０２３２２号および同第２０１１／０３０７４３７号に記載されており、これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
用いられている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語および表現の使用は、示され説明される特徴またはその部分のいかなる均等物も排除せず、様々な修正が請求される技術の範囲内で可能である。
ＩＩ．治療方法
本出願は、一態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍（がんなど）または腫瘍（がんなど）治療の１つまたは複数の態様を治療する方法を提供する。薬剤が、薬剤の非存在下でのＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合のレベルと比較して、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合を減少させる場合、その薬剤は「ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する」。いくつかの態様において、薬剤は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７の結合を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少させる。いくつかの態様において、薬剤は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７の結合を少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上減少させる。いくつかの態様において、薬剤は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を検出不可能なレベルまで遮断するか、またはＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の結合を排除する。
ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７の結合を決定するための適切な方法は、当技術分野において公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、プルダウンアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、チップベースのアッセイ、ＦＡＣＳ、酵母ツーハイブリッドシステム、ファージディスプレイ、およびＦＲＥＴを含むことができる。
本明細書に記載される薬剤は、直接投与され得るか、または薬剤をコードするポリヌクレオチドの形態で投与され得る。したがって、本明細書で使用する場合、「対象に投与する」という用語は、薬剤を対象に直接投与することと、例えばベクターを介して、薬剤をコードするポリヌクレオチドを投与することの両方を包含する。
いくつかの実施態様では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍（がんなど）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または遺伝子編集システムである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施態様では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における異常な腫瘍血管新生を遮断する方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における未熟で漏出性の血管を正常化する方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施態様では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍での機能的血管ネットワークの形成を促進する方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施態様では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍での血管成熟を促進する方法が提供される。いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍での血管の正常化を促進する方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、周皮細胞および／または平滑筋細胞と血管壁を裏打ちする内皮細胞との会合の増加、より正常な（例えば、より生理学的な厚さを有する）基底膜の形成、および／または血管と基底膜とのより密接な会合によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血管の正常化は、血管の数の減少（例えば、密度の低いネットワーク）を含まない。
いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における好ましい腫瘍微小環境を促進する方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍での免疫細胞浸潤を増加させる方法が提供される。いくつかの態様において、本方法は、ＣＤ３＋細胞（腫瘍浸潤白血球（「ＴＩＬ」）など）の浸潤を増加させる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＤ４５＋細胞（ＴＩＬなど）の浸潤を増加させる。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＤ８＋細胞（ＮＫ細胞またはＴ細胞など）の浸潤を増加させる。いくつかの実施形態では、本方法は、腫瘍への免疫細胞浸潤を、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上増加させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍灌流を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、腫瘍灌流は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における腫瘍での低酸素状態を軽減する方法が提供される。いくつかの実施形態では、腫瘍低酸素状態は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上軽減される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、対象における免疫抑制細胞（Ｔｒｅｇ細胞、顆粒球性骨髄由来サプレッサー細胞（ｇＭＤＳＣ）、および腫瘍関連マクロファージ（Ｍａｃ）など）を減少させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、腫瘍微小環境における免疫抑制細胞を減少させる。いくつかの実施形態において、免疫抑制細胞は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上減少する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。
いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、第２の療法に対する腫瘍の感受性を高める方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の療法（化学療法、免疫療法、細胞療法、放射線療法など）を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の療法は免疫療法である。いくつかの実施形態では、第２の療法は、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、または抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体などのそれらの組み合わせを含む、免疫チェックポイント阻害剤の投与を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、第２の治療剤（化学療法剤または免疫調節剤など）の送達を容易にする方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、第２の治療剤（化学療法剤または免疫調節剤など）の有効性を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を逐次的に、同時に、および／または同時並行的に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、または抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体などのそれらの組み合わせを含む、免疫チェックポイント阻害剤である。
本明細書に記載される薬剤はまた、以下のうちの１つまたは複数に有用である：１）周皮細胞で被覆された血管の増加；２）円形状を有する血管の血管長の増加；３）血管に関連するα平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）陽性細胞の増加；および４）βインテグリンの活性化の低減。いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、周皮細胞で被覆された血管を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、円形状を有する血管の血管長を増加させる方法が提供される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、血管に関連するα平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）陽性細胞を増加させる方法が提供される。いくつかの実施態様において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害する薬剤（ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤など）の有効量を対象に投与することを含む、βｌインテグリンの活性化を低減する方法が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、小分子化合物、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＦＧＢＰ７を特異的に認識する遮断抗体である。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を逐次的に、同時に、および／または同時並行的に投与することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＤ９３を特異的に認識しかつＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する抗ＣＤ９３抗体の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３とＭＭＮＲ２との間の相互作用をさらに遮断する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３とＭＭＮＲ２との間の相互作用を遮断しない。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３上のＩＧＦＢＰ７結合部位に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＩＧＦＢＰ７結合部位の外側、例えば安定な相互作用に必要とされる部位の外側にあるＣＤ９３の領域に結合し、したがって、その結合はＩＧＦＢＰ７への結合に間接的に影響を及ぼす。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０と競合的にＣＤ９３に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０のエピトープと重複するかまたは実質的に重複するエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０のエピトープと実質的に重複しないエピトープに結合する。いくつかの態様において、上記の「実質的に重複する」は、抗ＣＤ９３抗体が結合するＣＤ９３上の残基の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０が結合する残基と重複するシナリオを指す。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはそのヒト化バージョンである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせ、例えば抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体の組み合わせなど）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントの少なくとも一部を含むポリペプチド（阻害性ＣＤ９３ポリペプチド）の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、またはその組合せ、例えば抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体との組合せなど）である。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、安定化ドメイン（Ｆｃなど）をさらに含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、約５０～約１００アミノ酸長である。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドのＣＤ９３部分、すなわち、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはその部分に対応し、かつＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７の結合を遮断する機能を運ぶ部分は、約５０～約１００アミノ酸長である。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドはＦ２３８残基を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく。
いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、例えばＧＰＩ結合を介して膜に結合している。ある特定の実施形態では、膜結合阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、投与前に膜から切断される。これら阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、静脈内経路などの任意の投与経路を介して対象に投与することができる。あるいは、阻害性ポリペプチドは、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与を介して、例えばベクタープラットフォームを介して、対象に投与することができる。
いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、膜貫通ドメインを介して膜に結合している。このような阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、阻害性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど）を対象の細胞に導入し、細胞表面上で阻害性ＣＤ９３ポリペプチドの発現を引き起こすことによって対象に導入することができる。例えば、膜結合阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７に結合するが下流にシグナルを伝達することができないＣＤ９３のドミナントネガティブ形態であり得る。ＣＤ９３のドミナントネガティブ形態は、ＣＤ９３の細胞内シグナル伝達ドメインを不活性化する１つまたは複数の変異を含み得る。あるいは、ＣＤ９３のドミナントネガティブ形態は、ＣＤ９３の細胞内ドメインを欠く。
阻害性ＣＤ９３ポリペプチドがＭＭＮＲ２などのＣＤ９３の他の結合パートナーよりもＩＧＦＢＰ７への優先的結合を示すことを可能にする変異など、細胞外ドメインにおける１つまたは複数の変異を含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドも本明細書で企図される。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＭＭＮＲ２に対するよりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、野生型ＣＤ９３と比較してより高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＩＧＦＢＰ７を特異的に認識しかつＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する抗ＩＧＦＢＰ７抗体の有効量を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７と、それの他の結合パートナー、例えばＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、およびＩＧＦ１Ｒのうちの１つまたは複数との間の相互作用をさらに遮断する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７と、それの結合パートナーのうちの１つまたは複数との間の相互作用を遮断しない。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７上のＣＤ９３結合部位に結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＣＤ９３結合部位の外側、例えば安定な相互作用に必要とされる部位の外側にあるＩＧＦＢＰ７の領域に結合し、したがってその結合はＣＤ９３への結合に間接的に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のインスリン結合（ＩＢ）ドメインに結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６と競合的にＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６のエピトープと重複するかまたは実質的に重複するエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、上記の「実質的に重複する」とは、抗ＩＧＦＢＰ７抗体が結合するＩＧＦＢＰ７上の残基の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６が結合する残基と重複するシナリオを指す。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３またはそのヒト化バージョンである。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体など）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断するＩＧＦＢＰ７のバリアントを含むポリペプチド（阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）の有効量を対象に投与することを含み、そのようなバリアントには、ＩＧＦＢＰ７の変異体形態およびＩＧＦＢＰ７の断片（部分）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、方法は、対象に第２の治療剤（例えば、化学療法剤、免疫調節剤、または免疫細胞など）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は免疫チェックポイント阻害剤（例えば、抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体など）である。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、安定化ドメイン（Ｆｃなど）をさらに含む。いくつかの実施形態において、阻害性ＩＧＦＢＰポリペプチドは、約５０～約１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドのＩＧＦＢＰ部分、すなわち、ＩＧＦＢＰ７またはその部分に対応し、かつＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７の結合を遮断する機能を運ぶ部分は、約５０～約１００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７のＩＢドメインを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＢドメイン以外のＩＧＦＢＰ７のいかなるドメインも含まない。
阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、静脈内経路などの任意の投与経路を介して対象に投与することができる。あるいは、阻害性ポリペプチドは、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの投与を介して対象に投与することができる。
阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドが、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、およびＩＧＦ１ＲなどのＩＧＦＢＰ７の１つまたは複数の他の結合パートナーよりもＣＤ９３への優先的結合を示すことを可能にする１つまたは複数の変異を含む阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドも本明細書で企図される。いくつかの態様において、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、およびＩＧＦ１ＲなどのＩＧＦＢＰ７の１つまたは複数の他の結合パートナーに対するよりも高い親和性でＣＤ９３に結合する。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、野生型ＩＧＦＢＰ７と比較してより高い親和性でＣＤ９３に結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の発現を低下させる有効量の薬剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、その薬剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、および遺伝子編集システムからなる群より選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に適した対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、異常な腫瘍血管系を特徴とする。いくつかの実施形態では、対象は、高密度または豊富な血管を特徴とする。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＶＥＧＦ抗体、あるいは１つまたは複数のＶＥＧＦＲドメインを含む阻害性ポリペプチドを含む、ＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害剤を投与することを含む事前治療などの、事前治療を受ける。いくつかの実施形態では、対象は、ＣＤ９３の高い発現を特徴とする。実施形態では、対象は、ＩＧＦＢＰ７の高い発現を特徴とする。いくつかの実施形態では、対象は、ＶＥＧＦの高い発現を特徴とする。いくつかの実施形態では、本明細書で議論される腫瘍は固形腫瘍であり、例えば、固形腫瘍は、大腸（または結腸直腸）がん、非小細胞肺がん、神経膠芽腫、腎細胞がん、子宮頸がん、卵巣がん、卵管がん、腹膜がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、口腔扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、脳腫瘍、骨がん、メラノーマであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬の投与前に、対象の組織（腫瘍血管など）の血管上のＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の存在および分布を評価して、例えば、対象の血管上のＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の相対レベルおよび活性を決定する。その組織血管（腫瘍血管など）がＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を発現する対象（ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を発現するまたはそれらを高レベルで発現するものなど）は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬による治療の候補であり得る。これは、サンプル組織（腫瘍組織など）を得て、例えば免疫アッセイを用いて試験して、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７、および任意選択で細胞上のさらなる他のマーカーの相対的顕著性（relative prominence）を決定することによって達成することができる。また、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングがＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７発現の検出のために使用され得る。ＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７の発現を検出するために使用され得る他の方法には、例えば、ＲＴ－ＰＣＲまたはノーザンブロッティングなどの、ＲＮＡベースの方法が含まれる。
本方法は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬の複数回の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、投与の最初のラウンドの後に、対象におけるＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７のレベルおよび／または活性を再測定してよく、まだ上昇している場合に、投与のさらなるラウンドが実施され得る。このようにして、複数回のＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬の投与を行うことができる。
ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を阻害する薬剤
薬剤は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド模倣物、天然物、炭水化物、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、または小分子のいずれかであり得る。薬剤が何であり得るかの特定の例は以下に記載され、適切な薬剤を同定するための方法は、本出願の後続の態様において特徴付けられる。いくつかの実施形態では、薬剤は融合タンパク質（例えば、半減期延長ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）を含む融合タンパク質など）である。
ＣＤ９３
ＣＤ９３は、Ｃ型レクチンの遺伝子ファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質であり、補体Ｃ１ｑ受容体（ＣｌｑＲｐ）として知られている。ＣＤ９３は、Ｃ型レクチン様ドメイン（Ｄ１）、５つのＥＧＦ様リピート（Ｄ２）、ムチン様ドメイン（Ｄ３）、膜貫通ドメイン（Ｄ４）、細胞質ドメイン（Ｄ５）、およびＤ１とＤ２との間に局在する７９アミノ酸のＤＸドメインからなる［９］。また、ＣＤ９３は、主に内皮細胞（ＥＣ）上で発現され、可溶性成長因子およびＥＣ接着分子として血管新生の促進に関与する。以前の研究は、マルチメリン２（ＭＭＲＮ２）がＣＤ９３と相互作用してＥＣ接着、遊走、およびｉｎ ｖｉｔｒｏ血管新生を促進することを示した。ＥｎｄｏＧｌｙｘ－１とも呼ばれるＭＭＲＮ２は、ＥＤＥＮタンパク質ファミリーの内皮特異的メンバーであり、ＥＣＭの構成成分である。腫瘍組織において、ＭＭＲＮ２は、腫瘍毛細血管に沿って発現し、腫瘍新生血管系においてＣＤ９３と共発現されることが見出されている。Galvagni et al., Matrix Biol. (2017) 64, 112-127（あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ヒトＣＤ９３遺伝子は２０ｐ１１．２１に位置し、６５２アミノ酸残基のポリペプチドをコードする。用語「ＣＤ９３ポリペプチド」は、ヒトＣＤ９３の遺伝子産物（その天然に存在するバリアントを含む）の意味を含む。ヒトＣＤ９３ポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６２０４．２に見られるアミノ酸配列、およびその天然に存在するバリアントを含む。「天然バリアント」には、例えば、対立遺伝子バリアントが含まれる。典型的には、これらは、所与の配列から１個または２個または３個だけ、典型的には１０個以下または２０個以下のアミノ酸残基だけ異なる。典型的には、バリアントは保存的置換を有する。ＮＰ＿０３６２０４．２からのＣＤ９３ポリペプチド配列を配列番号１として示す。ヒトＣＤ９３の天然バリアントには、Ａ２２０Ｖ変異、Ｖ３１８Ａ変異、またはＰ５４１変異を有するものが含まれる。
本出願に記載されるＣＤ９３は、ＣＤ９３の機能を有する任意の天然に存在するＣＤ９３またはそのバリアントを含む。ウマ、雄ウシ、チンパンジー、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモットまたは霊長類などの他の種において見られるＣＤ９３オルソログも含まれる。
ＩＧＦＢＰ７
Ｍａｃ２５、ＩＧＦＢＰ－ｒｐ１、腫瘍由来接着因子（ＴＡＦ）、プロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）、およびアンギオモジュリン（angiomodulin）（ＡＧＭ）としても知られるインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）７は、ＩＧＦＢＰファミリーに属する分泌細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質である（５７、５８）。ＩＧＦＢＰファミリーのメンバーは、ＩＧＦ１に結合して血液中のＩＧＦ１のバイオアベイラビリティを調節するのに役立つＩＧＦ結合（ＩＢ）ドメインをＮ末端に含む。ＩＧＦＢＰ７は、ＩＧＦ１結合を安定化するように機能するＣ末端ドメインを欠いており、したがって、ＩＧＦ－１に対するその親和性は、ＩＧＦＢＰ１～６の親和性よりも有意に低い（５９）。ＩＧＦＢＰ７は、多くの正常組織およびがん細胞において発現されることが見出された；しかしながら、がんにおけるＩＧＦＢＰ７の正確な役割は議論の余地があった。一方で、ＩＧＦＢＰ７はがん細胞から放出され、腫瘍抑制因子として作用して腫瘍アポトーシスを誘発し、血管新生を抑制することが示された（６０）；ＩＧＦ１Ｒは受容体として提案され、ＩＧＦＢＰ７結合は、ＩＧＦ－１とＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用を遮断して、がん幹細胞様細胞の拡大および攻撃性を阻害した（６１、６２）。ＩＧＦＢＰ７の投与は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害し、ＩＧＦＢＰ７－／－マウスは、ジエチルニトロサミン誘導性肝がんを発がんしやすかった（５５、６３）。他方、ＩＧＦＢＰ７は、がん組織の血管においてアップレギュレートされることが示され、血管新生を促進することができた（４８、６４）。ＩＧＦＢＰ７は、血管ＥＣにおいてＶＥＧＦによって強く誘導され（４８）、血管新生におけるＩＧＦＢＰ７とＶＥＧＦとの間の相乗効果が報告されている（５０）。上記の各参考文献は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
ヒトＩＧＦＢＰ７遺伝子は４ｑ１２に位置し、ポリペプチドをコードする。ポリペプチドの１つのアイソフォームは、シグナルペプチドドメイン（配列番号２の残基１～２６）、インスリン結合ドメイン（ＩＢドメイン、配列番号２の残基２８～１０６）、Ｋａｚａｌ様ドメイン（配列番号２の残基１０５～１５８）、およびＩｇ様Ｃ２タイプドメイン（配列番号２の残基１６０～２６４）を含む、２６４アミノ酸残基（配列番号２）を有する。
本出願に記載されるＩＧＦＢＰ７は、ＩＧＦＢＰ７の機能を有する任意の天然に存在するＩＧＦＢＰ７またはそのバリアントを含む。他の種、例えば、ウマ、雄ウシ、チンパンジー、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、モルモットまたは霊長類において見られるＩＧＦＢＰ７オルソログも含まれる。
抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ抗体
本明細書に記載の方法は、いくつかの実施形態において、ＣＤ９３を特異的に認識しかつＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する抗ＣＤ９３抗体の使用を含む。本出願はまた、一態様において、本明細書に記載の新規な抗ＣＤ９３抗体のいずれかを提供する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体によって認識されるＣＤ９３はヒトＣＤ９３である。いくつかの態様において、ヒトＣＤ９３は、配列番号１またはヒトＣＤ９３の天然バリアントのアミノ酸配列を含むかまたは有する。いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ９３の天然バリアントは腫瘍組織に由来する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３上のＩＧＦＢＰ７結合部位に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＩＧＦＢＰ７結合部位の外側にあるＣＤ９３の領域に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３の細胞外領域に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ヒトＣＤ９３の細胞外領域（例えば、配列番号１による残基Ａ２４～Ｋ５８０など）に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３のＣ型レクチンドメインに結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ヒトＣＤ９３のＣ型レクチンドメイン（例えば、配列番号１による残基Ｔ２２～Ｎ１７４など）に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３のＣ型レクチンドメイン中の長いループ領域に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ヒトＣＤ９３のＣ型レクチンドメイン中の長いループ領域（例えば、配列番号１による残基Ｇ９６～Ｃ１４１など）に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３のＣ型レクチンドメイン内またはＣ型レクチンドメイン中の長いループ領域内のあまり保存されていない残基に結合する。例えば、抗ＣＤ９３抗体は、配列番号１による、Ｇ９６、Ｑ９８、Ｒ９９、Ｅ１００、Ｋ１０１、Ｇ１０２、Ｋ１０３、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｄ１０６、Ｐ１０７、Ｓ１０８、Ｌ１０９、Ｋ１１２、Ｓ１１５、Ｖ１１７、Ｇ１１８、Ｇ１２０、Ｅ１２１、Ｄ１２２、Ｔ１２３、Ｐ１２４、Ｙ１２５、Ｓ１２６、Ｎ１２７、Ｈ１２９、Ｋ１３０、Ｅ１３１、Ｌ１３２、Ｒ１３３、Ｎ１３４、Ｓ１３５、Ｃ１３６、Ｉ１３７、Ｓ１３８、Ｋ１３９、およびＲ１４０から選択される残基の任意の１つまたは複数（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個など）に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、配列番号１による残基Ｆ１８２～Ｙ２６２を含むかまたはそれらからなるヒトＣＤ９３の領域に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、配列番号１によるＦ２３８に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、Ｃ型レクチン様ドメイン（Ｄ１ドメイン）とＥＧＦ様ドメイン（Ｄ２ドメイン）との間のＤＸドメインに結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ヒトＣＤ９３のＤＸドメイン（例えば、配列番号１による残基Ｉ１７５～Ｌ２５６またはＩ１７５～Ｓ２５９など）に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、配列番号１によるＦ２３８に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３のＤＸドメインおよびＣ型レクチンドメインの両方に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ヒトＣＤ９３のＦ２３８およびＣ型レクチンドメイン（例えば、配列番号１による残基Ｔ２２～Ｎ１７４など）の両方に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ヒトＣＤ９３のＦ２３８、およびＣ型レクチンドメイン中の長いループ領域（例えば、配列番号１による残基Ｇ９６～Ｃ１４１など）の両方に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ９３抗体は、配列番号１による、Ｆ２３８と、Ｇ９６、Ｑ９８、Ｒ９９、Ｅ１００、Ｋ１０１、Ｇ１０２、Ｋ１０３、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｄ１０６、Ｐ１０７、Ｓ１０８、Ｌ１０９、Ｋ１１２、Ｓ１１５、Ｖ１１７、Ｇ１１８、Ｇ１２０、Ｅ１２１、Ｄ１２２、Ｔ１２３、Ｐ１２４、Ｙ１２５、Ｓ１２６、Ｎ１２７、Ｈ１２９、Ｋ１３０、Ｅ１３１、Ｌ１３２、Ｒ１３３、Ｎ１３４、Ｓ１３５、Ｃ１３６、Ｉ１３７、Ｓ１３８、Ｋ１３９、およびＲ１４０から選択される残基のいずれか１つまたは複数（約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個など）の両方に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３のＥＧＦ様領域に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ヒトＣＤ９３のＥＧＦ様領域（例えば、配列番号１による残基Ｃ２５７～Ｍ４６９またはＰ２６０～Ｔ４６８など）に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３とＭＭＮＲ２との間の相互作用も遮断する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＭＭＮＲ２が結合するエピトープと同じＣＤ９３上のエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＭＭＮＲ２が結合するエピトープとは異なるＣＤ９３上のエピトープに結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＣＤ９３とＭＭＮＲ２との間の相互作用を遮断しない。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体はモノクローナル抗体である。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は抗ヒトＣＤ９３抗体である。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体はヒト化されているかまたはキメラである。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または２７３１０７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と競合的にＣＤ９３に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または２７３１０７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）のエピトープと重複するかまたは実質的に重複するエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または２７３１０７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）のエピトープと実質的に重複するエピトープには結合しない。いくつかの態様において、上記の「実質的に重複する」は、抗ＣＤ９３抗体が結合するＣＤ９３上の残基の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、または２７３１０７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）が結合する残基と重複するシナリオを指す。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ９３抗体は、ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または２７３１０７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）が結合するＣＤ９３上の残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と競合的にはＣＤ９３に結合しない。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ Ｒ００４（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と競合的にはＣＤ９３に結合しない。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ７Ｃ１０と競合的にＣＤ９３に結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、７Ｃ１０のエピトープと重複するかまたは実質的に重複するエピトープに結合する。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、７Ｃ１０のエピトープと実質的に重複するエピトープに結合しない。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、７Ｃ１０が結合するＣＤ９３上の残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個に結合する。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、ＥＰＲ５３８６（ａｂｃａｍ）、３Ｄ１２（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）、１Ａ４（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）、１Ａ１０Ｅ１０、２Ｆ７Ｄ１１、Ｒ１３９、Ｒ３、ｍＮＩ－１１、Ｘ－２、およびＭＭ０１からなる群より選択される抗ヒトＣＤ９３モノクローナル抗体である。
いくつかの態様において、抗ヒトＣＤ９３抗体は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはそのヒト化バージョンである。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は全長抗体または免疫グロブリン誘導体である。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、抗原結合フラグメント、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリボディおよびテトラボディからなる群より選択される抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体はｓｃＦｖである。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体はＦａｂまたはＦａｂ’である。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、部分ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、または半合成抗体である。抗体および／または抗体フラグメントは、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、サメ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３抗体はＦｃフラグメントを含む。いくつかの態様において、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッド由来のＦｃフラグメントからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＦｃフラグメントはヒトＩｇＧに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または組み合わせもしくはハイブリッドＩｇＧのＦｃ領域を含む。
Ｂ．抗ＩＧＦＢＰ７抗体
本明細書に記載の方法は、いくつかの実施形態において、ＩＧＦＢＰ７を特異的に認識しかつＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を特異的に遮断する抗ＩＧＦＢＰ７抗体の使用を含む。本出願はまた、一態様において、本明細書に記載の新規な抗ＩＧＦＢＰ７抗体のいずれかを提供する。
いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体によって認識されるＩＧＦＢＰ７は、ヒトＩＧＦＢＰ７である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７はマウスＩＧＦＢＰ７である。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７上のＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）結合部位に結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＣＤ９３結合部位の外側にあるＩＧＦＢＰ７の領域に結合する。
いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のインスリン結合ドメイン（「ＩＢドメイン」）に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ヒトＩＧＦＢＰ７のＩＢドメイン（例えば、配列番号２による残基Ｓ２８～Ｇ１０６など）に結合する。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のＫａｚａｌ様ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ヒトＩＧＦＢＰ７のＫａｚａｌ様ドメイン（例えば、配列番号２による残基Ｐ１０５～Ｑ１５８など）に結合する。
いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７のＩｇ様Ｃ２ドメインに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ヒトＩＧＦＢＰ７のＩｇ様Ｃ２ドメイン（例えば、配列番号２による残基Ｐ１６０～Ｔ２６４など）に結合する。
いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦＢＰＬ１、ＫＡＺＡＬＤ１、ＨＴＲＡ１、ＷＩＳＰ１、ＷＩＳＰ３、ＮＯＶ、ＣＹＲ６１、ＣＴＧＦ、およびＥＳＭ１のいずれか１つまたは複数に特異的に結合しない。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ１、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ４、ＩＧＦＢＰ５、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦＢＰＬ１、ＫＡＺＡＬＤ１、ＨＴＲＡ１、ＷＩＳＰ１、ＷＩＳＰ３、ＮＯＶ、ＣＹＲ６１、ＣＴＧＦ、およびＥＳＭ１からなる群より選択されるいずれの分子にも特異的に結合しない。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７と、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用も遮断する。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ＩＧＦＢＰ７と、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用を遮断しない。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体はモノクローナル抗体である。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は抗ヒトＩＧＦＢＰ７抗体である。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体はヒト化されているまたはキメラである。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ０６５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＲ１１５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と競合的にＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ Ｒ００３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ０６５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＲ１１５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）のエピトープと重複するエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、Ｒ００３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＭＭ０１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｒ０６５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはＲ１１５（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）が結合するＩＧＦＢＰ７上の残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個に結合する。
いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ ２Ｃ６と競合的にＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ ２Ｃ６のエピトープと重複するエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、２Ｃ６が結合するＩＧＦＢＰ７上の残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個に結合する。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体は、ｍＡｂ ＡＥＤＯ－９（クローン名、以下の抗体について同じ）（Ｂｏｓｔｅｒｂｉｏ）、１Ｄ９Ｅ７（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、５Ａ４Ａ９（ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）、１９２５２０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、４００１２Ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＥＰＲ１１９１２（Ｂ）（Ａｂｃａｍ）、ＭＭ０３４６－３Ｎ３７（Ａｂｃａｍ）、０１（すなわち、ＭＭ０１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、００３（すなわち、Ｒ００３、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）からなる群より選択される抗ヒトＩＧＦＢＰ７モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗ヒトＩＧＦＢＰ７モノクローナル抗体は、ｍＡｂ ００３（すなわち、Ｒ００３、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）またはそのヒト化バージョンである。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ抗体は全長抗体または免疫グロブリン誘導体である。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ抗体は、抗原結合フラグメント、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリボディおよびテトラボディからなる群より選択される抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ抗体はｓｃＦｖである。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ抗体はＦａｂまたはＦａｂ’である。いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、部分ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、または半合成抗体である。抗体および／または抗体フラグメントは、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、ラクダ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、サメ抗体可変ドメインおよびヒト化バージョン、ならびにラクダ化抗体可変ドメインに由来し得る。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ抗体はＦｃフラグメントを含む。いくつかの態様において、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッド由来のＦｃフラグメントからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＦｃフラグメントはヒトＩｇＧに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または組み合わせもしくはハイブリッドＩｇＧのＦｃ領域を含む。
競合アッセイおよびエピトープマッピング
競合アッセイおよびエピトープマッピングに関する以下の記載は、実証のための例として抗ＩＧＦＢＰ７抗体を使用する。それは、上記の抗ＣＤ９３抗体にも同様に適用される。
競合は、例えば、フローサイトメトリー試験によって評価することができる。このような試験では、ＩＧＦＢＰ７を有する所与のＩＧＦＢＰ７ポリペプチドを有する細胞を、まずは抗体（例えば、ｍＡｂ ２Ｃ６）とインキュベートし、次いで蛍光色素またはビオチンで標識された試験抗体とインキュベートすることができる。抗体は、飽和量の２Ｃ６とプレインキュベーションした際に得られる結合が、２Ｃ６とのプレインキュベーションなしでその抗体によって得られる結合（蛍光によって測定）の約８０％以下、好ましくは５０％以下、４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合に、２Ｃ６と競合するまたは２Ｃ６と競合的にＩＧＦＢＰ７に結合すると言われる。あるいは、抗体は、飽和量の試験抗体とプレインキュベートした細胞において（蛍光色素またはビオチンにより）標識された２Ｃ６抗体を用いて得られる結合が、試験抗体とのプレインキュベーションなしで得られる結合の約８０％以下、好ましくは５０％以下、４０％以下（例えば、約３０％、２０％または１０％）である場合に、２Ｃ６と競合すると言われる。
ＩＧＦＢＰ７を固定化した表面に試験抗体を飽和濃度で予め吸着および適用する単純な競合アッセイも用いることができる。単純競合アッセイにおける表面は、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥチップ（または表面プラズモン共鳴分析に適した他の媒体）である。次いで、対照抗体（例えば、２Ｃ６）を、ＩＧＦＢＰ７を飽和させる濃度で表面と接触させ、対照抗体のＩＧＦＢＰ７および表面への結合を測定する。対照抗体のこの結合を、試験抗体の非存在下でのＩＧＦＢＰ７含有表面への対照抗体の結合と比較する。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での対照抗体のＩＧＦＢＰ７含有表面への結合の有意な減少は、試験抗体が対照抗体と「交差反応」するように、試験抗体が対照抗体と実質的に同じエピトープを認識することを示す。対照（例えば、２Ｃ６）抗体のＩＧＦＢＰ７への結合を少なくとも約３０％以上、好ましくは約４０％減少させる任意の試験抗体は、対照（例えば、２Ｃ６）と実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する抗体であると考えることができる。好ましくは、このような試験抗体は、対照抗体（例えば、２Ｃ６）のＩＧＦＢＰ７への結合を少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、またはそれ以上）減少させる。対照抗体と試験抗体の順序を逆にすることも可能であることを理解されたい：すなわち、対照抗体を最初に表面に結合させ、その後、競合アッセイにおいて試験抗体を表面に接触させることができる。好ましくは、ＩＧＦＢＰ７に対してより高い親和性を有する抗体を最初に表面に結合させる（その方が、第２の抗体について見られる結合の減少（抗体が交差反応していると仮定して）がより大きくなることが予想されるため）。そのようなアッセイのさらなる例は、例えば、Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41に提供され、その開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
好ましくは、ＩＧＦＢＰ７エピトープを認識するモノクローナル抗体は、関連するＩＧＦＢＰ７対立遺伝子の実質的なパーセンテージまたは全てに存在するエピトープと反応する。
好ましい実施形態では、抗体は、ＩＧＦＢＰ７陽性細胞の発現を特徴とする疾患を有する１つまたは複数の対象、すなわち本出願の抗ＩＧＦＢＰ７抗体を使用する本明細書に記載の方法の１つによる治療の候補である対象に由来するＩＧＦＢＰ７発現細胞に結合する。したがって、細胞上のＩＧＦＢＰ７を特異的に認識する抗体が得られたら、ＩＧＦＢＰ７陽性細胞（例えばがん細胞）に結合するその能力について試験することができる。特に、患者を本発明の抗体の１つで治療する前に、例えば血液サンプルまたは腫瘍生検において、患者から採取した悪性細胞に結合する抗体の能力を試験して、治療が患者において有益となる可能性を最大にすることは有益である。一実施形態では、本出願の抗体は、ＩＧＦＢＰ７発現細胞（例えば悪性細胞）に結合するそれらの能力を試験するためにイムノアッセイで検証される。例えば、腫瘍生検を行い、腫瘍細胞を回収する。次いで、細胞に結合する所与の抗体の能力を、当業者に周知の標準的な方法を用いて評価する。対象または患者のかなりの割合（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上）からのＩＧＦＢＰ７を発現することが知られている細胞（例えば腫瘍細胞）のうち実質的な割合（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％またはそれ以上）の細胞に結合することが見出される抗体は、患者における悪性細胞の存在もしくはレベルを決定するための診断目的のため、あるいは本明細書に記載される治療方法での使用のため（例えば、悪性細胞の数または活性を増加または減少させるための使用のため）の両方について、本発明で使用するのに適している。細胞への抗体の結合を評価するために、抗体を直接または間接的に標識することができる。間接的に標識される場合、典型的には、二次標識抗体が添加される。
抗体がエピトープ領域内に結合するかどうかの決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。そのようなマッピング／特徴付け方法の一例として、抗ＩＧＦＢＰ７抗体のエピトープ領域は、ＩＧＦＢＰ７タンパク質における露出したアミン／カルボキシルの化学修飾を使用するエピトープ「フットプリント」によって決定することができる。そのようなフットプリント技術の１つの特定の例は、ＨＸＭＳ（質量分析によって検出される水素－重水素交換）の使用であり、受容体およびリガンドタンパク質のアミドプロトンの水素／重水素交換、結合、および逆交換が起こり、タンパク質結合に関与する骨格アミド基は逆交換から保護され、したがって重水素化されたままである。関連する領域は、この時点で、消化性タンパク質分解、高速マイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離（fast microbore high-performance liquid chromatography separation）、および／またはエレクトロスプレーイオン化質量分析によって同定することができる。例えば、Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999); Engen, J. R. and Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A（ぞれぞれがあらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。適切なエピトープ同定技術の別の例は、核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、典型的には、遊離抗原と、ならびに抗体などの抗原結合ペプチドと複合体形成した抗原との二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。典型的には、抗原に対応するシグナルのみがＮＭＲスペクトルにおいて見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが見られないように、抗原は１５Ｎで選択的に同位体標識される。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸に由来する抗原シグナルは、典型的には、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルの位置をシフトさせ、このようにして結合に関与するアミノ酸を同定することができる。例えば、Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61 -67 (1998)；およびSaito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24（それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
エピトープマッピング／特徴付けは、質量分析法を用いて行うこともできる。例えば、Downard, J Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 and Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-1801（それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。プロテアーゼ消化技術も、エピトープマッピングおよび同定の文脈において有用であり得る。抗原決定基に関連する領域／配列は、プロテアーゼ消化によって、例えば、ＩＧＦＢＰ７に対して約１：５０の比でトリプシンを使用することによって、またはｐＨ７～８でｏ／ｎ消化した後、ペプチド同定のための質量分析（ＭＳ）分析によって、決定することができる。その後、トリプシン消化に供されたサンプルと、抗体と共にインキュベートされた後に例えばトリプシンによる消化に供されたサンプルとの比較によって、抗ＩＧＦＢＰ７結合剤によってトリプシン切断から保護されたペプチドが同定され得る（それによって結合剤のフットプリントが明らかになる）。キモトリプシン、ペプシン等の他の酵素もまた、あるいは代替として、同様のエピトープ特徴付け方法において使用することができる。さらに、酵素消化は、潜在的な抗原決定基配列が、表面露出しておらずしたがって免疫原性／抗原性に関して関連しない可能性が非常に高いＩＧＦＢＰ７ポリペプチドの領域内にあるかどうかを分析するための迅速な方法を提供することができる。
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープの解明に有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」では、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置き換え、結合親和性の結果を測定する。変異が結合親和性の有意な低下をもたらす場合、それは結合に関与する可能性が非常に高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち、アンフォールド（折り畳まれていない）タンパク質に結合しない抗体）を使用して、アラニン置換がタンパク質の全体の折り畳みに影響しないことを検証することができる。例えば、Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386;およびWells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6を参照されたい。
電子顕微鏡もまた、エピトープ「フットプリント」のために使用され得る。例えば、Wang et al., Nature 1992; 355:275-278は、天然のササゲモザイクウイルス（native cowpea mosaic virus）のカプシド表面上のＦａｂフラグメントの物理的フットプリントを決定するために、クライオ電子顕微鏡検査、三次元画像再構成、およびＸ線結晶学の連携適用を使用した。
エピトープ評価のための「標識なし」アッセイの他の形態には、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）および反射干渉分光法（ＲｉｆＳ）が含まれる。例えば、Fagerstam et al., Journal of Molecular Recognition 1990;3:208-14; Nice et al., J. Chroma-togr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308- 3311; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944を参照されたい。
本出願の抗体（第２の抗体）と同じまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体（第１の抗体）は、本明細書に記載の例示的な競合アッセイの１つまたは複数において同定され得ることにも留意されたい。いくつかの実施形態では、第２の抗体と実質的に同じエピトープに結合する第１の抗体は、第１の抗体が結合する残基が、第２の抗体が結合する残基と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の重複を有するシナリオを指す。
抗ＣＤ９３抗体または抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む薬剤
Ａ．抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７ Ｆｃ融合タンパク質
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＣＤ９３抗体または抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む薬剤は融合タンパク質である。いくつかの態様において、抗ＣＤ９３および／または抗ＩＧＦＢＰ７抗体（例えば、抗ＣＤ９３および／または抗ＩＧＦＢＰ７抗体フラグメント）は、リンカー（ペプチドリンカーなど）を介してＦｃフラグメントに融合される。「抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体」の項に記載の抗ＣＤ９３抗体または抗ＩＧＦＢＰ７抗体のいずれも、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質に用いることができる。
１．Ｆｃフラグメント
「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端非抗原結合領域を指す。この用語は、天然Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６からカルボキシル末端まで延在する。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、Ｆｃ領域の構造または安定性に影響を及ぼすことなく、存在してもしなくてもよい。本明細書において別段の指定がない限り、ＩｇＧまたはＦｃ領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれる抗体のＥＵナンバリングシステムに従う。
いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。本明細書で使用される「ヒンジ領域」または「ヒンジ配列」という用語は、リンカーとＣＨ２ドメインとの間に位置するアミノ酸配列を指す。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヒンジ領域を含むＦｃフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、二量体化を容易にするために、天然ＩｇＧ１ヒンジ領域中に見出される配列であるアミノ酸配列ＣＰＰＣＰ（配列番号３）を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＦｃフラグメントはヒンジ領域で始まり、ＩｇＧ重鎖のＣ末端まで延在する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ヒンジ領域を含まないＦｃフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ重鎖ヒンジ領域（Ｃｙｓ２２６で始まる）、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインおよび／またはＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ならびにそれらの組み合わせおよびハイブリッド由来のＦｃフラグメントからなる群より選択されるＦｃフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃフラグメントはヒトＩｇＧに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または組み合わせもしくはハイブリッドＩｇＧのＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃフラグメントはＩｇＧ１ Ｆｃフラグメントである。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃフラグメントはＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＧ４ Ｆｃは、ＩｇＧ１ Ｆｃよりも低いエフェクター活性を示すことが知られており、したがって、いくつかの用途に望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、マウス免疫グロブリンに由来する。
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは、Ａｌａ２３１で始まる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインはＧｌｙ３４１で始まる。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧのＣ末端Ｌｙｓ残基は存在しない。いくつかの実施形態では、Ｆｃの所望の構造および／または安定性に影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換がＦｃ領域において行われる。
さらに、以下に記載されるＦｃバリアントのいずれかまたはそれらの組み合わせを含む抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質が企図される。いくつかの実施形態では、Ｆｃフラグメントは、増強された抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）エフェクター機能を有するように改変されているか、さもなければ変化している配列を含む。
抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質における非同一ポリペプチドのヘテロ二量体化は、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）技術によるヘテロ二量体化を非限定的に含む、当技術分野で公知の方法によって促進することができる。ノブ・イントゥ・ホール技術の構造および組立て方法は、例えば、米国特許第５，８２１，３３３号、同第７，６４２，２２８号、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５９８１０に見出すことができ、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。この技術は、１つのＦｃのＣＨ３ドメインにおける小さなアミノ酸残基を大きなアミノ酸残基で置き換えることによって「ノブ」（または隆起）を導入し、１つまたは複数の大きなアミノ酸残基をより小さなアミノ酸残基で置き換えることによって他のＦｃのＣＨ３ドメインに「ホール」（または空洞）を導入することによって開発された。いくつかの実施形態では、融合タンパク質中のＦｃフラグメントの１つの鎖はノブを含み、Ｆｃフラグメントの第２の鎖はホールを含む。
ノブの形成に好ましい残基は、一般に天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくはアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）から選択される。最も好ましいのはトリプトファンおよびチロシンである。一実施形態では、ノブの形成のための元の残基は、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニンまたはバリンなどの小さい側鎖体積を有する。ノブを形成するためのＩｇＧのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換には、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６ＹまたはＦ４０５Ｗ置換が含まれるが、これらに限定されない。
ホールの形成に好ましい残基は、通常、天然に存在するアミノ酸残基であり、好ましくは、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）から選択される。一実施形態では、ホールの形成のための元の残基は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニンまたはトリプトファンなどの大きな側鎖体積を有する。ホールを作製するためのＩｇＧのＣＨ３ドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、限定されないが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７ＴおよびＹ４０７Ｖの置換が挙げられる。特定の実施形態では、ノブはＴ３６６Ｗ置換を含み、ホールはＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換を含む。ヘテロ二量体化を促進する当該分野で公知のＦｃ領域に対する他の改変もまた、本出願によって企図および包含されることが理解される。
本明細書に記載のバリアント（例えば、Ｆｃバリアント、エフェクター機能バリアント、グリコシル化バリアント、システイン操作バリアント）のいずれかあるいはそれらの組み合わせを含む、単離された抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質のバリアント（例えば、全長抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体バリアント）などの薬剤を含む方法が企図される。
２．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質は、リンカーを介してＦｃフラグメントに融合された本明細書に記載の抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む。
抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質において使用されるリンカーの長さ、柔軟性の程度および／または他の特性は、限定されないが、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体の親和性、特異性またはアビディティ、および／またはＣＤ９３および／またはＩＧＦＢＰ７上に存在する１つまたは複数の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性またはアビディティを含む、特性に何らかの影響を有し得る。例えば、２つの隣接する抗体部分が互いに立体的に干渉しないことを確実にするために、より長いリンカーが選択され得る。いくつかの実施形態では、リンカー（ペプチドリンカーなど）は、隣接する抗体部分が互いに対して自由に移動するように、柔軟な残基（グリシンおよびセリンなど）を含む。例えば、グリシン－セリンダブレットは、適切なペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは非ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。
他のリンカーの考慮事項には、得られる抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質の物理的または薬物動態学的特性、例えば、溶解度、親油性、親水性、疎水性、安定性（多かれ少なかれ安定である、ならびに計画された分解）、剛直性、柔軟性、免疫原性、抗体結合の調節、ミセルまたはリポソームに組み込まれる能力などに対する効果が含まれる。
ａ．非ペプチドリンカー
成分またはフラグメントがそれぞれの活性、すなわち標的ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７への結合、ＦｃＲへの結合、および／またはＡＤＣＣ／ＣＤＣを保持する限り、本明細書に記載のリンカーのいずれか１つまたはすべては、２つの分子を結合させる任意の化学反応によって達成され得る。この連結は、多くの化学的機構、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合および複合体形成を含むことができる。いくつかの実施形態では、結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接縮合によってまたは外部架橋分子の組み込みによって、達成することができる。多くの二価または多価連結剤が、Ｆｃフラグメントなどのタンパク質分子を本発明の抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体にカップリングさせるのに有用である。例えば、代表的なカップリング剤として、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンなどの、有機化合物を挙げることができる。このリストは、当技術分野で公知の様々なクラスのカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例示である（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982);およびVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照されたい；それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）。
本出願において適用することができるリンカーは、文献に記載されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について記載するRamakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される非ペプチドリンカーには以下のものが含まれる：（ｉ）ＥＤＣ（ｌ－エチル－３－（３－ジメチルアミノ－プロピル）カルボジイミド塩酸塩）；（ｉｉ）ＳＭＰＴ（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－プリジル－ジチオ）－トルエン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，カタログ番号（２１５５８Ｇ））；（ｉｉｉ）ＳＰＤＰ（６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサン酸スクシンイミジル）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、カタログ番号２１６５１Ｇ）；（ｉｖ）スルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（６［３－（２－ピリジルジチオ）－プロピアンアミド］ヘキサン酸スルホスクシンイミジル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．，Ｃｏ．カタログ番号２１６５－Ｇ）；および（ｖ）ＥＤＣにコンジュゲートしたスルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホ－スクシンイミド：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．，カタログ番号２４５１０）。
上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含有し、したがって、異なる生理化学的特性を有する抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質をもたらす。例えば、アルキルカルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルは、芳香族カルボキシレートのスルホ－ＮＨＳエステルよりも安定である。ＮＨＳ－エステル含有リンカーは、スルホ－ＮＨＳエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を含み、安定性が向上した融合タンパク質を形成することができる。ジスルフィド結合はｉｎ ｖｉｔｒｏで切断され、利用可能な融合タンパク質が少なくなるため、ジスルフィド結合は一般に他の結合よりも安定性が低い。特に、スルホ－ＮＨＳは、カルボジイミドカップリングの安定性を高めることができる。カルボジイミドカップリング（ＥＤＣなど）は、スルホ－ＮＨＳと併せて使用される場合、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対してより抵抗性であるエステルを形成する。
ｂ．ペプチドリンカー
本明細書に記載されるリンカーのいずれか１つまたは全ては、ペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、天然に存在する配列または天然に存在しない配列を有し得る。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域に由来する配列をリンカーとして使用することができる。例えば、国際公開第１９９６／３４１０３号（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、天然ＩｇＧ１ヒンジ領域に見出される配列であるＣＰＰＣＰ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む。
ペプチドリンカーは、任意の適切な長さであってよい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１ａａ～約１０ａａ、約１ａａ～約２０ａａ、約１ａａ～約３０ａａ、約５ａａ～約１５ａａ、約１０ａａ～約２５ａａ、約５ａａ～約３０ａａ、約１０ａａ～約３０ａａ、約３０ａａ～約５０ａａ、約５０ａａ～約１００ａａ、または約１ａａ～約１００ａａであり得る。
このようなペプチドリンカーの重要な技術的特徴は、前記ペプチドリンカーがいずれの重合活性も含まないことである。二次構造の促進の不在を含むペプチドリンカーの特性は、当技術分野において公知であり、例えば、Dall’Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) およびRaag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80（それぞれ、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている。「ペプチドリンカー」との関連で特に好ましいアミノ酸はＧｌｙである。さらに、いかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。分子の互いへの連結は、例えば、遺伝子操作によって提供され得る。融合されおよび作動可能に連結された抗体構築物を調製し、それらを哺乳動物細胞または細菌において発現させる方法は、当技術分野において周知である（例えば、国際公開第９９／５４４４０号、Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989 and 1994、 またはSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001；それぞれがあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）などのプロテアーゼによって切断可能ではない安定なリンカーである。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、剛直な三次元構造をとらない傾向があり、むしろ、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体とＦｃフラグメントとの間に柔軟性を提供するなど、ポリペプチド（例えば、第１および／または第２の成分）に柔軟性を提供する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、柔軟性（flexible）リンカーである。例示的な柔軟性性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号４）、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号５）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号７）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号８）（式中、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および当技術分野で公知の他の柔軟性リンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン－セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、したがって、成分間の中立テザー（neutral tether）として機能することが可能であり得る。グリシンは、アラニンよりも有意に多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限されない（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992)を参照されたい）。当業者は、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質の設計が、全てまたは部分的に柔軟性であるリンカーを含み得ることを認識することができ、リンカーは、柔軟性リンカー部分、ならびに所望の融合タンパク質構造を提供するためのより低い柔軟性の構造を付与する１つまたは複数の部分を含むことができる。
いくつかの態様において、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体フラグメント）とＦｃフラグメントは、標的ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７ならびにＦｃＲへの結合を可能にするような方法で抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７－Ｆｃ融合タンパク質が折り畳まれることを可能にするのに十分な長さのリンカーによって互いに連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＳＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＭＡ（配列番号９）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３）の配列であるか、またはそれを含み、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＴＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＥＧＴＳＴＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＤ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む。
天然リンカーは、へリックス、β－ストランド、コイル／ベンドおよびターンなどの二次構造における様々な立体構造を採用して、それらの機能を発揮する。α－ヘリックス構造にあるリンカーは、タンパク質ドメインを効果的に分離する剛直なスペーサーとして働き、したがって、それらの好ましくない相互作用を低減し得る。Ｐｒｏリッチ配列を有する非ヘリックスリンカーは、リンカーの剛直性を増加させ、ドメイン間干渉を低減する機能を果たし得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体（抗体フラグメントなど）とＦｃフラグメント（またはＦｃフラグメントを含む抗体）は、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有するα－ヘリックスリンカーによって互いに連結される。
Ｂ．多重特異性抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７分子
多重特異性分子は、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに対する結合特異性を有する分子である（例えば、二重特異性抗体は、２つの抗原またはエピトープに対する結合特異性を有する）。２つより多い価数および／または特異性を有する多重特異性分子も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)）。当業者は、本明細書に記載される主題の多重特異性分子の適切な特徴を選択し、互いに組み合わせて本出願の多重特異性抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７分子を形成することができることを理解されたい。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤は、本明細書に記載の抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体のいずれか１つにしたがう抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体と、第２の抗原を特異的に認識する第２の結合部分（第２の抗体など）とを含む、多重特異性（例えば、二重特異性）抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７分子を含む。いくつかの態様において、多重特異性抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７分子は、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体と、第２の抗原を特異的に認識する第２の抗体とを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７分子は、例えば、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線状ダイマーｓｃＤｂ（ＬＤ－ｓｃＤｂ）、環状ダイマーｓｃＤｂ（ＣＤ－ｓｃＤｂ）、ジダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムジ－ｓｃＦｖ（例えば、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）、タンデムトリ－ｓｃＦｖ、トリ（ア）ボディ、二重特異性Ｆａｂ２、ジ－ミニ抗体（ｄｉ－ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、テトラボディ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ融合体、二重親和性再標的化（ｄｕａｌ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）（ＤＡＲＴ）抗体、二重可変領域（ＤＶＤ）抗体、ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ－ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｖ２－Ｆｃ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ融合体、ドックアンドロック（ｄｏｃｋ ａｎｄ ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）抗体、ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）抗体（ＫｉＨ技術によって調製された二重特異性ＩｇＧ）、ＤｕｏＢｏｄｙ（ＤｕｏＢｏｄｙ技術によって調製された二重特異性ＩｇＧ）、ヘテロ多量体抗体、またはヘテロコンジュゲート抗体である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、抗ＣＤ９３および抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は二重特異性抗体である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤は、ＣＤ９３上の第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗ＣＤ９３抗体と、ＣＤ９３上の第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗ＣＤ９３抗体とを含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗ＣＤ９３分子を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のエピトープの一方または両方は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０のエピトープと重複するか、または実質的に重複する。いくつかの実施形態では、第１の抗体および第２の抗体の一方または両方は、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０と競合的にＣＤ９３に結合する。いくつかの実施形態では、第１の抗体および第２の抗体の一方または両方はまた、ＣＤ９３とＭＭＲＮ２との間の相互作用を遮断する。いくつかの態様において、第１の抗体および第２の抗体の一方または両方は、ＣＤ９３とＭＭＲＮ２との間の相互作用を遮断しない。いくつかの態様において、第１の抗体および第２の抗体の一方または両方は、ＩＧＦＢＰ７結合部位の外側にあるＣＤ９３上の領域に結合する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する薬剤は、ＩＧＦＢＰ７上の第１のエピトープに特異的に結合する第１の抗ＩＧＦＢＰ７抗体と、ＩＧＦＢＰ７上の第２のエピトープに特異的に結合する第２の抗ＩＧＦＢＰ７抗体とを含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗ＩＧＦＢＰ７分子を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２のエピトープの一方または両方は、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６のエピトープと重複するか、または実質的に重複する。いくつかの実施形態では、第１の抗体および第２の抗体の一方または両方は、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６と競合的にＩＧＦＢＰ７に結合する。
阻害性ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７ポリペプチド
Ａ．阻害性ＣＤ９３ポリペプチド
本明細書に記載の方法は、いくつかの実施形態において、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントを含む、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断するポリペプチド（「阻害性ＣＤ９３ポリペプチド」）の使用を含む。本出願は、ある態様において、本明細書に記載の新規でかつ天然に存在しない阻害性ＣＤ９３ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは膜結合型である。いくつかの態様において、膜結合阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７に結合するが、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７シグナル伝達を誘発しない。いくつかの実施形態では、膜結合阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７に結合し、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７シグナル伝達を弱める。いくつかの実施形態では、膜結合阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、遺伝子編集システムまたはｍＲＮＡ送達ビヒクルによって導入される。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）の細胞外ドメインまたはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１の残基Ａ２４～Ｋ５８０、または配列番号１の残基Ａ２４～Ｋ５８０と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、Ｆ２３８残基をさらに含み、アミノ酸の番号付け（ナンバリング）は配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）のＣ型レクチンドメインまたはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１の残基Ｔ２２～Ｎ１７４、または配列番号１の残基Ｔ２２～Ｎ１７４と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、Ｆ２３８残基をさらに含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）のＣ型レクチンドメイン中の長いループ領域またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１の残基Ｇ９６～Ｃ１４１、または配列番号１の残基Ｇ９６～Ｃ１４１と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、Ｇ９６、Ｑ９８、Ｒ９９、Ｅ１００、Ｋ１０１、Ｇ１０２、Ｋ１０３、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｄ１０６、Ｐ１０７、Ｓ１０８、Ｌ１０９、Ｋ１１２、Ｓ１１５、Ｖ１１７、Ｇ１１８、Ｇ１２０、Ｅ１２１、Ｄ１２２、Ｔ１２３、Ｐ１２４、Ｙ１２５、Ｓ１２６、Ｎ１２７、Ｈ１２９、Ｋ１３０、Ｅ１３１、Ｌ１３２、Ｒ１３３、Ｎ１３４、Ｓ１３５、Ｃ１３６、Ｉ１３７、Ｓ１３８、Ｋ１３９、およびＲ１４０から選択される残基の少なくとも１つまたは複数（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５または全て）をさらに含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）のＣ型レクチン様ドメイン（Ｄ１ドメイン）とＥＧＦ様ドメイン（Ｄ２ドメイン）との間のＤＸドメイン、またはそのバリアントを含む。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１の残基Ｉ１７５～Ｌ２５６およびＩ１７５～Ｌ２５９、または配列番号１の残基Ｉ１７５～Ｌ２５６およびＩ１７５～Ｌ２５９と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１の残基Ｆ１８２～Ｙ２６２、Ｉ１７５～Ｌ２５６、および／もしくはＩ１７５～Ｌ２５９のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号１の残基Ｆ１８２～Ｙ２６２、Ｉ１７５～Ｌ２５６、およびＩ１７５～Ｌ２５９のいずれか１つの配列と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１に基づくＦ２３８残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、Ｇ９６、Ｑ９８、Ｒ９９、Ｅ１００、Ｋ１０１、Ｇ１０２、Ｋ１０３、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｄ１０６、Ｐ１０７、Ｓ１０８、Ｌ１０９、Ｋ１１２、Ｓ１１５、Ｖ１１７、Ｇ１１８、Ｇ１２０、Ｅ１２１、Ｄ１２２、Ｔ１２３、Ｐ１２４、Ｙ１２５、Ｓ１２６、Ｎ１２７、Ｈ１２９、Ｋ１３０、Ｅ１３１、Ｌ１３２、Ｒ１３３、Ｎ１３４、Ｓ１３５、Ｃ１３６、Ｉ１３７、Ｓ１３８、Ｋ１３９、およびＲ１４０から選択される残基の少なくとも１つまたは複数（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５または全て）をさらに含む。アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１の残基Ｔ２２～Ｙ２６２、または配列番号１の残基Ｔ２２～Ｙ２６２と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１に基づきＦ２３８残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１に基づき、Ｇ９６、Ｑ９８、Ｒ９９、Ｅ１００、Ｋ１０１、Ｇ１０２、Ｋ１０３、Ｃ１０４、Ｌ１０５、Ｄ１０６、Ｐ１０７、Ｓ１０８、Ｌ１０９、Ｋ１１２、Ｓ１１５、Ｖ１１７、Ｇ１１８、Ｇ１２０、Ｅ１２１、Ｄ１２２、Ｔ１２３、Ｐ１２４、Ｙ１２５、Ｓ１２６、Ｎ１２７、Ｈ１２９、Ｋ１３０、Ｅ１３１、Ｌ１３２、Ｒ１３３、Ｎ１３４、Ｓ１３５、Ｃ１３６、Ｉ１３７、Ｓ１３８、Ｋ１３９、およびＲ１４０から選択される残基の少なくとも１つまたは複数（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５または全て）をさらに含む。
いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドはＦ２３８残基を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）の５つのＥＧＦ様領域またはそれらのバリアントの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つを含む。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、配列番号１の残基Ｃ２５７～Ｍ４６９もしくはＰ２６０～Ｔ４６８、または配列番号１の残基Ｃ２５７～Ｍ４６９もしくはＰ２６０～Ｔ４６８と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバリアントは、天然に存在するバリアントである。いくつかの実施形態において、バリアントは、非保存的置換を含まない。いくつかの実施形態において、バリアントは、１つまたは複数の保存的置換のみを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の保存的置換は、「好ましい置換」の見出しの下で以下の表１に示される置換を含むか、またはそれらからなる
Figure 2022548980000001
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＭＭＮＲ２に対するよりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドとＭＭＮＲ２との間の結合のＫＤの多くとも半分、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／１０００のＫＤで、ＩＧＦＢＰ７に結合する。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、ＣＤ９３よりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する。いくつかの態様において、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、野生型ＣＤ９３（配列番号１に記載のポリペプチドなど）とＩＧＦＢＰ７との間の結合のＫＤの多くとも半分、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／１０００のＫＤでＩＧＦＢＰ７に結合する。
いくつかの実施形態では、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドは、安定化ドメインをさらに含む。安定化ドメインは、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドを安定化する（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドの半減期を延長する）任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、安定化ドメインはＦｃドメインである。例示的なＦｃドメインは、「Ｆｃフラグメント」のセクションに記載されるものを含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ポリペプチドは、約５０～約１０００アミノ酸長、例えば、約５０～８００、５０～５００、５０～４００、５０～３００または５０～２００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、阻害性ポリペプチドは、約５０～約１００アミノ酸、約１００～約１５０アミノ酸、または約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸の長さである。
Ｂ．阻害性ＩＧＦＢＰポリペプチド
本明細書に記載の方法は、いくつかの実施形態において、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断するポリペプチド（「阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド」）の使用を含む。本出願は、一態様において、本明細書に記載の新規でかつ天然に存在しない阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドを提供する。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＣＤ９３に結合するが、ＣＤ９３を活性化しない。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒに対してよりも高い親和性でＣＤ９３に結合する。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、阻害性ＩＧＦＢＰポリペプチドとＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の結合のＫＤの多くとも半分、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／１０００のＫＤでＩＧＦＢＰ７に結合する。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７よりも高い親和性でＣＤ９３に結合する。いくつかの態様において、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、野生型ＩＧＦＢＰ７（配列番号２に記載のポリペプチドなど）とＣＤ９３との間の結合のＫＤの多くとも半分、１／５、１／１０、１／２０、１／５０、１／１００、１／１０００のＫＤでＣＤ９３に結合する。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７（ヒトＩＧＦＢＰ７など）のＩＢドメインまたはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、配列番号２の残基Ｓ２８～Ｇ１０６、または配列番号２の残基Ｓ２８～Ｇ１０６と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７（ヒトＩＧＦＢＰ７など）のＫａｚａｌ様ドメインまたはそのバリアントを含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、配列番号２の残基Ｐ１０５～Ｑ１５８、または配列番号２の残基Ｐ１０５～Ｑ１５８と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはさらに含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＩＧＦＢＰ７（ヒトＩＧＦＢＰ７など）のＩｇ様Ｃ２ドメインまたはそのバリアントを含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、配列番号２の残基Ｐ１６０～Ｔ２６４、または配列番号２の残基Ｐ１６０～Ｔ２６４と少なくとも約８０％（例えば、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％など）の配列同一性を有するそのバリアントのアミノ酸配列を含むか、またはさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のバリアントは、天然に存在するバリアントである。いくつかの実施形態において、バリアントは、非保存的置換を含まない。いくつかの実施形態において、バリアントは、１つまたは複数の保存的置換のみを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表１に示される置換を含むかまたはそれらからなる
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドはまた、ＣＤ９３とＭＭＮＲ２との間の相互作用を遮断する。いくつかの態様において、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＭＭＮＲ２が結合するエピトープと同じＣＤ９３上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＭＭＮＲ２が結合するエピトープとは異なるＣＤ９３上のエピトープに結合する。
いくつかの態様において、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＣＤ９３とＭＭＮＲ２との間の相互作用を遮断しない。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは可溶性ポリペプチドである。
いくつかの実施形態では、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは膜結合型である。いくつかの実施形態では、膜結合阻害ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、ＣＤ９３に結合するが、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７シグナル伝達を誘発も減弱もしない。いくつかの実施形態において、膜結合阻害ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドは、遺伝子編集システムまたはｍＲＮＡ送達ビヒクルによって導入される。
いくつかの実施形態において、阻害性ＩＧＦＢＰポリペプチドは、安定化ドメインをさらに含む。安定化ドメインは、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドを安定化する（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドの半減期を延長する）任意のドメインであり得る。いくつかの実施形態では、安定化ドメインはＦｃドメインである。例示的なＦｃドメインは、「Ｆｃフラグメント」のセクションに記載されるものを含む。
いくつかの実施形態では、阻害性ポリペプチドは、約５０～約１０００アミノ酸長、例えば、約５０～８００、５０～５００、５０～４００、５０～３００または５０～２００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、阻害性ポリペプチドは、約５０～約１００アミノ酸、約１００～約１５０アミノ酸、または約１５０アミノ酸～約２００アミノ酸の長さである。
ＩＧＦＢＰ３／ＣＤ９３シグナル伝達経路を阻害する他の薬剤
上記のもの以外のＩＧＦＢＰ３／ＣＤ９３を阻害することができる他の薬剤もまた、本明細書に記載される方法において使用されることが企図される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、または小分子化合物を含む。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）の発現を低下させる。いくつかの態様において、薬剤は、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）の発現を、薬剤なしでのＣＤ９３のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３の発現を基準レベルと同程度にする。いくつかの態様において、基準レベルは、対象の非腫瘍器官におけるＣＤ９３発現のレベルである。いくつかの態様において、基準レベルは、疾患もしくは状態または異常な血管構造を有さない対象または対象群におけるＣＤ９３発現のレベル（または平均レベル）である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７（ヒトＩＧＦＢＰ７など）の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７（ヒトＩＧＦＢＰ７など）の発現を、薬剤なしでのＩＧＦＢＰ７のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％低下させる。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＩＧＦＢＰ７の発現を基準レベルと同程度にする。いくつかの実施形態では、基準レベルは、対象の非腫瘍器官におけるＩＧＦＢＰ７発現のレベルである。いくつかの実施形態では、基準レベルは、疾患もしくは状態または異常な血管構造を有さない対象または対象群におけるＩＧＦＢＰ７発現のレベル（または平均レベル）である。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３（ヒトＣＤ９３など）を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７（ヒトＩＧＦＢＰ７など）を特異的に標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡである。
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を標的とするゲノム編集システムを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集システムは、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するように操作された（例えば、プログラム可能なまたは標的可能な）ＤＮＡヌクレアーゼなどの、ＤＮＡヌクレアーゼを含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、それらのバリアント、それらの断片、およびそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない、任意の好適なＤＮＡヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの実施形態では、ゲノム編集は、改変ＣＤ９３がＩＧＦＢＰ７にもはや結合しないように、または野生型ＣＤ９３よりも少ない程度でＩＧＦＢＰ７に結合するように、ＣＤ９３を改変することを含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ９３のバリアントを含む導入遺伝子を挿入することを含む。いくつかの態様において、バリアントＣＤ９３は、配列番号１に基づきＦ２３８に変異を有する。いくつかの態様において、バリアントＣＤ９３は、配列番号１に基づきＦ２３８Ｔ変異を有する。
いくつかの実施形態では、ゲノム編集は、改変ＩＧＦＢＰ７がもはやＣＤ９３に結合しないか、または野生型ＩＧＦＢＰ７よりも少ない程度でＣＤ９３に結合するようにＩＧＦＢＰ７を改変することを含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む導入遺伝子を挿入することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７のバリアントはＣ型レクチンドメインを有し、ＩＧＦＢＰ７のＣ型レクチンドメインはＩＧＦＢＰ７に由来しない。
血管の成熟／正常化
すべての組織の成功した機能は、階層的に構造化された成熟した血管ネットワークの確立に依存する。健康な状態とは対照的に、多くのヒト疾患は、調節不全の過剰な新しい血管形成を示す。固形腫瘍は、１つの特徴的な例である。増殖するがん細胞の塊であるよりもはるかに、固形腫瘍は、がん細胞、血管ネットワーク、リンパ管、および様々な他の細胞の集合体であり、それらの全てが局所微小環境に寄与する。固形腫瘍内の血管新生は、低酸素状態によって大いに駆動される。この低酸素状態は、腫瘍微小環境の特徴であり、酸素感知分子の調節を介してＶＥＧＦなどの血管新生促進因子の産生に直接つながる。Goel et al., Cold Spring Harb Perspect Med 2012;2:a006486を参照されたい。
ＶＥＧＦおよび他の血管新生促進因子の微小環境存在量は、継続的な血管新生および異常な血管ネットワークの作製を駆動する。構造的には、血管はしばしば拡張され、曲がりくねった経路をとり、また、腫瘍内の特定の領域は乏血性（hypovascular）でありそして他の領域は多血性（hypervascular）であるような分布の不均質性を示す。細胞レベルでは、血管新生促進因子は、ＶＥ－カドヘリン媒介性内皮細胞（ＥＣ）接合部の弱化およびＥＣ遊走を誘導し、血管壁構造を変化させる。同様に、血管周囲細胞（ＰＶＣ、周皮細胞および血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）から構成される）はしばしばＥＣに緩くしか付着せず、数が減少する。最後に、血管周囲基底膜（ＢＭ）はまた、腫瘍において構造的に異常であり、ある領域では過度に薄いかまたは存在せず、他の領域では異常に厚い。Goel et al., Cold Spring Harb Perspect Med 2012;2:a006486を参照されたい。
これらの構造的異常の直接的な結果は、腫瘍血管機能の顕著な異常である。血管のでたらめで異様な分布は、不均質な血流をもたらし、いくつかの領域では緩慢であり、他の領域では過剰である。さらに、ＰＶＣ被覆率の低下、ＥＣ解離、および過剰なｖｅｓｉｃｕｌｏ－ｖａｃｕｌｏｒ ｏｒｇａｎｅｌｌｅ（ＶＶＯ）は、顕著な腫瘍血管透過性をもたらし、細胞外コンパートメントへの体液およびタンパク質の過剰な血管外漏出を伴う。この漏出は、機能的な腫瘍内リンパ管の相対的欠如と共に、腫瘍間質液圧（ＩＦＰ）の血管内圧と釣り合うレベルへの著しい上昇をもたらし、これは、経血管流（transvascular flow）の低下をもたらす。さらに、がん細胞の増殖塊によって加えられる圧縮力は、血管の圧縮および崩壊を引き起こし得る。正味の結果は、不均質な血液供給、ならびに結果として生じる低酸素状態およびアシドーシスである。記載される生理学的変化は、固形腫瘍の挙動に対して直接的な影響を及ぼす。低酸素腫瘍細胞は、しばしば、より攻撃的な表現型を示し、がん遺伝子を活性化し、「上皮間葉転換」（ＥＭＴ）を通過し、これがそれらの転移能を高める。さらに、不利な微小環境は抗腫瘍免疫細胞の機能を損ない、それら免疫細胞の腫瘍への送達も損なわれる。重要なことに、治療に対する腫瘍応答も影響を受ける。低酸素状態は、放射線および化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を低下させることが知られており、全身投与された細胞傷害性薬剤の腫瘍への送達は、特に低血流および腫瘍ＩＦＰが上昇した領域において劇的に妨げられる。Goel et al., Cold Spring Harb Perspect Med 2012;2:a006486を参照されたい。
本出願は、疾患または状態（固形腫瘍などのがんなど）における血管を正常化する（すなわち、異常な血管系の成熟を促進する）のに有用な方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、異常な血管は低酸素状態に関連する。
「血管系の正常化」、「未熟で漏出性の血管を正常化する」、「血管成熟」、または「機能的血管ネットワークの形成を促進する」、および「好ましい腫瘍微小環境を促進する」は、概して、漏出性で、蛇行性で、無秩序な血管（例えば、腫瘍血管）のネットワークの、より透過性が低く、あまり拡張せず、および／またはより蛇行しない血管のより組織化されたネットワークへの変換を指すか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、より成熟した血管（例えば、より長い血管、円形血管）を特徴とする。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、周皮細胞および／または平滑筋細胞と、血管壁を裏打ちする内皮細胞との会合の増加、より正常な基底膜の形成（例えば、より生理学的厚さを有する）、および／または血管と基底膜とのより密接な会合によって特徴付けられる。脈管構造の正常化はまた、残留脈管構造の完全性および安定性の増加とともに、未成熟血管の取り除き（pruning）を伴い得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の血管の正常化は、血管密度の維持を特徴とする。
いくつかの実施形態では、血管の成熟（または血管の正常化）は、血管の形態によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、組織中の血管の長さの増加を特徴とする。血管の長さは、実施例に記載されるように（例えば、図２Ｂを参照されたい）、視野あたりの全血管長（例えば、ｍｍ）の単位で測定することができる。いくつかの実施形態では、血管の長さ（例えば、視野あたりの全長）は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。いくつかの態様において、血管はＣＤ３１発現によって同定される。
いくつかの実施形態では、血管の正常化は、組織中の円形血管の割合（％）（円形血管／全血管の％）の増加によって特徴付けられる。円形血管の割合（％）は、実施例に記載されるような、円形血管数を全血管数で割ることによって測定することができる（例えば、図２Ｂを参照されたい）。いくつかの実施形態では、円形血管の割合（％）は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。いくつかの態様において、血管はＣＤ３１発現によって同定される。
いくつかの実施形態では、血管の正常化は、組織中の血管の血管密度の維持を特徴とする。血管の密度は、実施例に記載されるように、視野あたりの血管数の単位で測定することができる（例えば、図２Ｂ参照）。いくつかの実施形態では、血管密度は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に約３０％、２０％、１０％、または５％より多くは減少しない。いくつかの実施形態では、血管密度は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に約３０％、２０％、１０％、または５％より多くは増加しない。いくつかの実施形態では、血管密度は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、約３０％、２０％、１０％、または５より多くは増加も減少もしない。いくつかの態様において、血管はＣＤ３１発現によって同定される。
いくつかの実施形態では、血管の成熟（または血管の正常化）は、周皮細胞（例えば、ＮＧ２＋周皮細胞）のより高密度のレベルおよび／または平滑筋細胞（例えば、α－ＳＭＡ＋平滑筋細胞）のより高密度のレベルによって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、血管上のＮＧ２発現の増加を特徴とする。いくつかの実施形態では、血管におけるＮＧ２発現は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、または２００％増加する。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、血管上のα－ＳＭＡ＋発現の増加を特徴とする。いくつかの実施形態では、血管におけるα－ＳＭＡ＋発現は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、または２５０％増加する。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、血管上のＩＣＡＭ発現の増加を特徴とする。いくつかの態様において、血管におけるＩＣＡＭ＋発現は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％増加する。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、血管における活性化インテグリンβｌ発現の減少を特徴とする。いくつかの実施形態では、血管における活性化インテグリンの発現は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少する。いくつかの態様において、血管はＣＤ３１発現によって同定される。
いくつかの実施形態では、血管の成熟（または血管の正常化）は、血管灌流および／または透過性によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、血管の正常化は、血管透過性または灌流の増加を特徴とする。透過性または灌流は、例えば、実施例（例えば、図２Ｅ）に記載されるように、血管における投与薬物（レクチンなど）の分布を評価することによって評価することができる。いくつかの実施形態では、血管灌流は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、または３００％増加する。
いくつかの実施形態では、血管の正常化は、組織における低酸素状態の軽減を特徴とする。腫瘍低酸素状態は、例えば、実施例（図６Ａなど）に記載されるように評価することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍低酸素状態は、ピモニダゾール陽性の割合（％）（すなわち、ピモニダゾール陽性領域（面積）を全腫瘍領域（面積）で割ったものなど）によって評価される。いくつかの実施形態では、腫瘍低酸素状態は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少する。
いくつかの実施形態では、血管の正常化は、より有効な薬物送達を特徴とする。薬物送達の有効性は、例えば、薬物送達後の組織（腫瘍組織など）における薬物の分布を評価することによって決定することができる（例えば、実施例（例えば、図６Ａ）に記載されるように）。いくつかの実施形態では、送達後の組織における薬物（化学療法薬など）の存在／分布は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、または３００％増加する。
いくつかの実施形態では、血管の正常化は、組織（例えば、腫瘍組織）における免疫細胞の浸潤の増加を特徴とする。組織における免疫細胞の浸潤は、組織（例えば、腫瘍組織）における免疫細胞の割合（％）を評価することによって測定することができる（例えば、図３Ａおよび３Ｄに記載されるように、組織中の免疫細胞の数を腫瘍重量単位（例えば、ｍｇ）で割って測定することによって、または組織中の免疫細胞の数を視野単位で割って測定することによって）。いくつかの実施形態では、免疫細胞は腫瘍浸潤リンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＣＤ４５＋白血球を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は内因性免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は外因性免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、対象に由来する操作された免疫細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）である。いくつかの実施形態では、組織（例えば、腫瘍組織）中の免疫細胞の割合（％）は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、または３００％増加する。
いくつかの実施形態において、浸潤免疫細胞中のサプレッサー免疫細胞の比率は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断剤の投与後に減少する。いくつかの実施形態では、サプレッサー免疫細胞は骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣは顆粒球性ＭＤＳＣ（例えば、ＣＤ３－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ－ＣＤ４５＋白血球）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＤＳＣは単球性ＭＤＳＣ（例えば、ＣＤ３－ＣＤ１１ｃ－ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－Ｌｙ６Ｃ＋ＣＤ４５＋白血球）を含む。いくつかの態様において、ＭＤＳＣは、顆粒球性ＭＤＳＣおよび単球性ＭＤＳＣの両方を含む。いくつかの態様において、浸潤免疫細胞中のサプレッサー免疫細胞の比率は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少する。
上記のセクションに記載の様々なパラメータ（血管の長さ、形態、低酸素状態、灌流、免疫細胞の浸潤、薬物送達など）は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の１つまたは複数の投与後の様々な時点で評価することができる。いくつかの実施形態では、パラメータは、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与の１４日後に評価され、ここで、薬剤は、２週間にわたって週に約２回の頻度で投与される。
エンドポイント
「血管成熟／正常化」のセクションに記載される任意のパラメータ（血管の長さ、形態、低酸素状態、灌流、免疫細胞の浸潤、薬物送達など）は、上記方法（例えば、がんを治療する方法）の特徴として使用され得る。「血管成熟／正常化」のセクションは、上記の方法の様々な実施形態の特徴の考察のために、その全体がここに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、対象は、腫瘍細胞の増殖の減少および／または腫瘍細胞のアポトーシスの増加を有する。腫瘍細胞の増殖およびアポトーシスは、増殖マーカーまたはアポトーシスマーカー（例えば、実施例に記載されるＫｉ－６７および切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）など）によって評価することができる。いくつかの態様において、腫瘍細胞の増殖は、腫瘍におけるＫｉ－６７陽性細胞によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、腫瘍におけるＫｉ－６７陽性細胞は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％減少する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞のアポトーシスは、腫瘍組織中のＣＣ３陽性細胞を特徴とする。いくつかの実施形態では、腫瘍組織中のＣＤ３陽性細胞は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％増加する。
いくつかの実施形態では、対象は、処置前の同じ対象における対応する腫瘍サイズ、がん細胞の数、または腫瘍成長速度と比較して、あるいは処置を受けていない他の対象における対応する活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の腫瘍サイズの減少、がん細胞の数の減少、または腫瘍の増殖速度の減少を有する。精製酵素を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、動物モデル、またはヒト試験などの標準的な方法を使用して、これら効果の大きさを測定することができる。
疾患または状態
本明細書に記載される方法は、異常な血管構造に関連する任意の疾患または状態に適用可能である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は皮膚乾癬である。いくつかの実施形態では、疾患または状態は良性腫瘍である。いくつかの実施形態では、疾患または状態はがんである。
がん
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の疾患または状態はがんである。本明細書に記載の方法のいずれかを用いて治療することができるがんには、任意の種類のがんが含まれる。本出願に記載されるような薬剤で治療されるがんの種類としては、がん腫、芽細胞腫、肉腫、良性および悪性腫瘍、ならびにマリグナンシー（悪性腫瘍）、例えば、肉腫、がん腫、およびメラノーマが挙げられるが、これらに限定されない。成人腫瘍／がんおよび小児腫瘍／がんも含まれる。
様々な実施形態では、がんは、早期がん、非転移性がん、原発性がん、進行性がん、局所進行性がん、転移性がん、寛解したがん、再発性がん、術後補助療法（アジュバント療法）（adjuvant setting）におけるがん、術前補助療法（ネオアジュバント療法）（neoadjuvant setting）におけるがん、または治療に実質的に抵抗性のがんである。
いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍である。
いくつかの実施形態では、がんはＣＤ９３＋腫瘍内皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍内の内皮細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％がＣＤ９３陽性である。いくつかの実施形態では、がんは、対象の正常組織のＣＤ９３＋内皮細胞よりも、少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＣＤ９３＋内皮細胞を含む。いくつかの態様において、がんは、がんを有さない対象または対象群の対応する器官のＣＤ９３＋内皮細胞よりも、少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＣＤ９３＋内皮細胞を含む。
いくつかの実施形態では、がんはＩＧＦＢＰ７＋血管を含む。いくつかの実施形態では、がんは、対象の正常組織の血管よりも、少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＩＧＦＢＰ７＋血管を含む。いくつかの実施形態では、がんは、がんを有さない対象または対象群における対応する器官の血管よりも、少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＩＧＦＢＰ７＋血管を含む。
いくつかの実施形態では、がん（例えば、固形腫瘍）は、腫瘍低酸素状態を特徴とする。腫瘍低酸素状態は、例えば、実施例（図６Ａなど）に記載されるように評価することができる。いくつかの実施形態では、がんは、少なくとも約１％、２％、３％、４％、または５％のピモニダゾール陽性パーセンテージ（すなわち、ピモニダゾール陽性領域（面積）を全腫瘍領域（面積）で割ったものなど）を特徴とする。
本出願の方法によって治療され得るがんの例としては、肛門がん、星細胞腫（例えば、小脳および脳）、基底細胞がん、膀胱がん、骨がん（例えば、骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば、神経膠腫（グリオーマ）、脳幹部神経膠腫、小脳または脳星細胞腫（例えば、星細胞腫、悪性神経膠腫、髄芽腫、および神経膠芽腫（グリオブラストーマ））、乳がん（例えば、ＴＮＢＣ）、子宮頸がん、結腸がん、大腸（結腸直腸）がん、子宮内膜がん（例えば、子宮がん）、食道がん、眼がん（例えば、眼内メラノーマおよび網膜芽細胞腫）、胃がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん（例えば、肝がん腫およびヘパトーマ）、肝臓がん、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、および肺の扁平上皮がん）、髄芽腫、メラノーマ（悪性黒色腫）、中皮腫、骨髄異形成症候群、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、卵巣がん、膵臓がん、副甲状腺がん、腹膜がん、下垂体腫瘍、直腸がん、腎臓がん。腎盂・尿管がん（移行上皮がん）、横紋筋肉腫、皮膚がん（例えば、非メラノーマ（例えば、扁平上皮がん）、メラノーマ、およびメルケル細胞がん）、小腸がん、扁平上皮がん、精巣がん、甲状腺がん、および結節性硬化症が挙げられるが、これらに限定されない。がんのさらなる例は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, § on Hematology and Oncology, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, § on Hematology and Oncology, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 978-0-911-91042-1) (2018 digital online edition at internet website of Merck Manuals)；およびSEER Program Coding and Staging Manual 2016に見ることができ、これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの実施形態では、がんはトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ、例えば、高いＩＧＦＢＰまたはＣＤ９３発現を有するＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、がんはメラノーマである。いくつかの実施形態では、患者は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせの投与を含む以前の治療に抵抗性である。
対象
いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物（ヒトなど）である。
いくつかの実施形態では、対象は、ＣＤ９３＋内皮細胞を含む異常な血管を含む組織を有する。いくつかの実施形態では、異常な血管を有する組織中の内皮細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％がＣＤ９３陽性である。いくつかの実施形態では、異常な血管を有する組織は、対象の正常組織のＣＤ９３＋内皮細胞よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＣＤ９３＋内皮細胞を含む。いくつかの態様において、異常な血管を有する組織は、異常な血管を有さない対象または対象群における対応する器官のＣＤ９３＋内皮細胞よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＣＤ９３＋内皮細胞を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、ＩＧＦＢＰ７＋血管を含む異常な血管を含む組織を有する。いくつかの実施形態では、組織は、対象の正常組織よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＩＧＦＢＰ７＋血管を含む。いくつかの実施形態では、組織は、異常な血管を有さない対象または対象群における対応する器官の血管よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＩＧＦＢＰ７＋血管を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、異常な血管構造に基づき、治療のために選択される。いくつかの実施形態では、異常な血管構造は、ＣＤ９３＋内皮細胞によって特徴付けられる（例えば、ＣＤ９３＋ＣＤ３１＋細胞を測定することによって）。いくつかの実施形態では、異常な血管を有する組織中の内皮細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％がＣＤ９３陽性である。いくつかの実施形態では、異常な血管を有する組織は、対象の正常組織のＣＤ９３＋内皮細胞よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＣＤ９３＋内皮細胞を含む。いくつかの態様において、異常な血管を有する組織は、異常な血管を有さない対象または対象群における対応する器官のＣＤ９３＋内皮細胞よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＣＤ９３＋内皮細胞を含む。
いくつかの実施形態では、異常な血管構造は、ＩＧＦＢＰ７＋血管の異常なレベルを特徴とする。いくつかの実施形態では、組織は、対象の正常組織よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＩＧＦＢＰ７＋血管を含む。いくつかの実施形態では、組織は、異常な血管を有さない対象または対象の群における対応する器官の血管よりも少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％多いＩＧＦＢＰ７＋血管を含む。
いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも１つの前治療（prior therapy）を有する。いくつかの実施形態において、前治療は、放射線療法、化学療法および／または免疫療法を含む。いくつかの実施形態では、対象は、前治療に対して抵抗性、難治性、または再発性である。いくつかの実施形態では、前治療は、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせの投与を含む。
併用療法
本出願はまた、本明細書に記載のＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を阻害する薬剤（「ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬」）を、疾患または状態（がんなど）を治療するために対象に投与する方法であって、第２の薬剤を投与するまたは第２の療法を施すことをさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または療法は、疾患または状態を治療するための標準的または通常使用される薬剤または療法である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または療法は、化学療法剤を含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または療法は手術を含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または療法は放射線療法を含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または療法は免疫療法を含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または療法は細胞療法（免疫細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）を含む細胞療法など）を含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤または療法は血管新生阻害剤を含む。
いくつかの実施形態では、第２の薬剤は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は代謝拮抗剤である。いくつかの実施形態では、代謝拮抗剤は５－ＦＵである。
いくつかの実施形態では、第２の薬剤は免疫チェックポイントモジュレーターである。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＣＤ４７、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、およびＢ７Ｈ４からなる群より選択される免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイントタンパク質はＰＤ－１である。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、抗ＰＤ－１抗体またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、抗ＣＴＬＡ４抗体またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は、抗ＰＤ１抗体またはそのフラグメントと抗ＣＴＬＡ４抗体またはそのフラグメントとの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬は、第２の薬剤または療法と同時に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を阻害するＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬は、第２の薬剤または療法と同時並行的に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬は、第２の薬剤または療法と逐次的に投与される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬は、第２の薬剤または療法と同じ単位剤形で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬は、第２の薬剤または療法とは異なる単位剤形で投与される。
投与レジメンおよび投与経路
対象（ヒトなど）に投与されるＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬、およびいくつかの実施形態では本明細書に記載の第２の薬剤の用量は、特定の組成物、投与方法、ならびに処置される疾患または状態（がんなど）の特定の種類および段階によって異なり得る。この量は、疾患または状態（がんなど）に対する治療応答などの望ましい応答を生じるのに十分であるべきである。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬および／または第２の薬剤の量は治療有効量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、血管の正常化（例えば、血管の長さの増加、円形血管の数の増加、血管の密度の維持、ならびに／または周皮細胞および／もしくは平滑筋細胞の増加）、組織（腫瘍組織など）の灌流の増加、低酸素状態の軽減、組織に送達される薬物の量の増加、組織における免疫細胞浸潤の増加、および／または腫瘍細胞増殖の阻害を促進するのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織における血管の長さ（例えば、視野あたりの全長）を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％だけ増加させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織中の円形血管の割合（％）（円形血管／全血管の％）を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％だけ増加させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織における血管の密度を維持するのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織中の周皮細胞（例えば、血管上でのＮＧ２陽性発現）を少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、または２００％増加させるに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織中の平滑筋細胞（例えば、血管上でのα－ＳＭＡ＋発現）を少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、または２５０％増加させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、ＩＣＡＭ＋発現を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％増加させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、活性化インテグリンの発現を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少させるのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織における血管透過性または灌流を少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、または３００％増加させるのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織における低酸素状態を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％軽減させるのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、送達後の組織中の薬物（化学療法薬など）の存在／分布を少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、または３００％増加させるのに十分な量である。
いくつかの実施形態において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織中の免疫細胞の浸潤（組織中の免疫細胞の割合（％）など）を少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、または３００％増加させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織における浸潤免疫細胞中のサプレッサー免疫細胞の比率を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％減少させるのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織中の細胞（例えば、腫瘍細胞）の増殖を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％減少させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の投与後に、組織中の細胞（例えば、腫瘍細胞）のアポトーシスを少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％増加させるのに十分な量である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬の量は、治療前の同じ対象における対応する腫瘍サイズ、がん細胞の数、もしくは腫瘍成長の速度と比較して、または治療を受けていない他の対象における対応する活性と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは１００％の、腫瘍サイズの減少、がん細胞の数の減少、または腫瘍成長の速度の減少をもたらすのに十分な量である。
いくつかの実施形態において、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬は、抗ＣＤ９３抗体を含む。いくつかの態様において、対象はヒトであり、各投与についての抗ＣＤ９３抗体の量は、マウスについての約３００μｇの用量に相当する。いくつかの実施態様では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＣＤ９３抗体の量は約２ｇ以下（例えば、約５０～７５ｍｇ）である。いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＣＤ９３抗体の量は、約３０ｍｇ／ｋｇ以下（例えば、約０．８ｍｇ／ｋｇ～約１．２ｍｇ／ｋｇなど）である。いくつかの実施態様では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＣＤ９３抗体の量は３０～４５ｍｇ／ｍ２である。いくつかの実施態様では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＣＤ９３抗体の量は約７５ｍｇ（または約１．２５ｍｇ／ｋｇ、もしくは約４５ｍｇ／ｍ２）以下である。
いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬は、抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む。いくつかの態様において、対象はヒトであり、各投与についての抗ＩＧＦＢＰ７抗体の量は、マウスについての約３００μｇの用量に相当する。いくつかの実施態様では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＩＧＦＢＰ７抗体の量は約２ｇ以下（例えば約５０～７５ｍｇ）である。いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＩＧＦＢＰ７抗体の量は、約３０ｍｇ／ｋｇ以下（例えば、約０．８ｍｇ／ｋｇ～約１．２ｍｇ／ｋｇなど）である。いくつかの実施態様では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＩＧＦＢＰ７抗体の量は３０～４５ｍｇ／ｍ２である。いくつかの実施態様では、対象はヒトであり、各投与についての抗ＩＧＦＢＰ７抗体の量は約７５ｍｇ（または約１．２５ｍｇ／ｋｇ、もしくは約４５ｍｇ／ｍ２）以下である。
いくつかの態様において、抗ＩＧＦＢＰ７抗体または抗ＣＤ９３抗体は、少なくとも約１、３、７、１０、１２、または１４日間投与される。いくつかの実施形態では、抗ＩＧＦＢＰ７抗体または抗ＣＤ９３抗体は、週に少なくとも約２回の頻度で投与される。
いくつかの実施形態では、本方法は、第２の薬剤を投与することを含み、第２の薬剤は５－ＦＵである。いくつかの実施形態において、対象はヒトであり、各投与についての５－ＦＵ抗体の量は、マウスについての約３ｍｇ～約４ｍｇの用量に相当する。
本明細書に記載の方法のいずれかによるいくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬および／または第２の薬剤組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、膀胱内、皮下、髄腔内、肺内、筋肉内、気管内、眼内、経皮、経口、または吸入によって投与される。いくつかの実施形態では、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３遮断薬および／または第２の薬剤は静脈内に投与される。
ＩＩＩ．診断および予後診断の方法
本明細書ではまた、対象を診断または予後診断する方法であって、セクションＩＩで記載されるような治療または異なる療法に対する対象の適合性を決定すること、セクションＩＩに記載されるような方法または異なる療法に対する対象の応答性の可能性を決定すること、および対象の組織における血管の成熟状態を決定することを含む方法も提供される。
いくつかの実施形態では、対象の組織におけるＣＤ９３発現のレベルを測定することを含む、治療に対する対象の適合性を決定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象の組織におけるＩＧＦＢＰ７発現のレベルを測定することを含む、治療に対する対象の適合性を決定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、対象はがんを有し、組織は腫瘍組織である。いくつかの実施形態では、治療は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬を含む。いくつかの実施形態において、治療はがん療法（例えば、化学療法剤などの細胞療法）を含む。いくつかの態様において、基準レベルと比較してより高いＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７発現レベルは、治療に対するより低い適合性を示す。
いくつかの実施形態では、がん（固形腫瘍など）を有する対象における予後診断の方法であって、腫瘍サンプル中のＣＤ９３発現のレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測定することを含み、基準レベルと比較してより高いＣＤ９３発現レベルが、治療に応答しないかまたは反応が乏しい可能性が高いことを示す方法を提供する。いくつかの態様において、基準レベルは、対象の非腫瘍サンプルまたはがんを有さない異なる対象（または対象群）の対応する組織における、ＣＤ９３発現のレベル（平均ＣＤ９３発現など）である。
いくつかの実施態様において、がん（例えば固形腫瘍）を有する対象における予後診断の方法であって、腫瘍サンプル中のＩＧＦＢＰ７発現のレベルをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで測定することを含み、基準レベルと比較してより高いＩＧＦＢＰ７発現レベルが、治療に対して反応しないまたは反応が乏しい可能性が高いことを示す方法が提供される。いくつかの態様において、基準レベルは、対象の非腫瘍サンプルまたはがんを有さない異なる対象（または対象群）の対応する組織における、ＩＧＦＢＰ７発現のレベル（平均ＩＧＦＢＰ７発現など）である。
いくつかの実施形態では、療法は細胞療法を含む。いくつかの実施形態では、療法は、化学療法剤（代謝拮抗剤など、免疫チェックポイントモジュレーターなど）、放射線剤（radiation agent）、または免疫療法剤から選択される薬剤を含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、１μｍ、０．５μｍ、０．２μｍ、または０．１μｍ以下のサイズを有する。
いくつかの実施態様において、イメージング分子で標識された抗ＣＤ９３抗体を含むイメージング剤を投与することを含む、対象の組織（がん組織など）における血管の成熟状態を決定する方法が提供される。いくつかの態様において、イメージング分子は放射性核種である。
いくつかの実施態様において、イメージング分子で標識された抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含むイメージング剤を投与することを含む、対象の組織（がん組織など）における血管の成熟状態を決定する方法が提供される。いくつかの態様において、イメージング分子は放射性核種である。
ＩＶ．ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を破壊する薬剤を同定する方法
本明細書に記載の薬剤は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を破壊する薬剤の能力を評価することによって同定することができる。がんを治療するためあるいはがん治療の１つまたは複数の態様に有用な薬剤（例えば、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド類似体、融合ペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、および小分子化合物など）を同定する方法が本明細書に提供され、がん治療の態様には、異常な腫瘍血管新生を遮断すること、未熟で漏出性の腫瘍血管を正常化すること、腫瘍における機能的血管ネットワークを促進すること、血管成熟を促進すること、好ましい腫瘍微小環境を促進すること、腫瘍における免疫細胞浸潤を増大させること、腫瘍灌流を増大させること、腫瘍における過形成を低減させること、第２の療法に対する腫瘍の感受性を高めること、および第２の薬剤の送達を促進させることが含まれるが、これらに限定されない。本方法は、概して、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊するかどうかを決定することを含み、候補薬剤は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊することが示される場合に、がんを治療するためおよびがん治療の態様に有用である。
薬剤は、（ｉ）ＣＤ９３に対する；（ｉｉ）ＩＧＦＢＰ７に対する；（ｉｉｉ）ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用によって作られる新規な部位（例えば、新たに作製されたエピトープ決定基）に対する、または（ｉｖ）それらのいずれかを含むタンパク質複合体に対する、抗体、抗体様足場、小分子、融合タンパク質、ペプチド、模倣物、または阻害性ヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉ）であり得る。
したがって、例えば、いくつかの実施形態では、候補薬剤ががんを治療するのに有用であるかどうかを決定する方法であって、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊するかどうかを決定することを含み、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ相互作用を特異的に破壊することが示される場合に、その候補薬剤はがんを治療するのに有用である方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、候補薬剤がＣＤ９３／ＭＭＲＮ２相互作用を特異的に破壊するかどうかを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、候補薬剤がＣＤ９３／ＭＭＲＮ２よりもＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７の結合を優先的に破壊するかどうかを決定することをさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、候補薬剤がＩＧＦＢＰ７とＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用の結合を特異的に破壊するかどうかを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、候補薬剤が、ＩＧＦＢＰ７／ＩＧＦ－１、ＩＧＦＢＰ－７／ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦＢＰ－７／ＩＧＦ１Ｒよりも、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７の結合を優先的に破壊するかどうかを決定することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、がんを治療するのに有用な薬剤をスクリーニングする方法であって：ａ）複数の候補薬剤を提供すること；およびｂ）ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊する候補薬剤を同定し、それによってがんを治療するのに有用な薬剤を得ることを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊する薬剤を同定する方法であって：ａ）候補薬剤をＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体と接触させることと；およびｂ）ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体に対する候補薬剤の効果を評価し、それによってＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊する薬剤を同定することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体を形成することをさらに含む。いくつかの態様において、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体は細胞表面上に存在する。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系に存在する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体は天然に存在しない。例えば、複合体は、ＣＤ９３のバリアントおよび／またはＩＧＦＢＰ７のバリアントを含み得る。いくつかの態様において、バリアントＣＤ９３は、野生型ＣＤ９３よりも高いＩＧＦＢＰ７に対する結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、バリアントＩＧＦＢＰ７は、野生型ＩＧＦＢＰ７よりも高いＣＤ９３に対する結合親和性を有する。適切なＣＤ９３バリアントおよびＩＧＦＢＰ７バリアントは、上記のセクションに記載されるものを含む。本出願はまた、いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＤ９３および／またはＩＧＦＢＰ７バリアントのいずれかを含む天然に存在しないＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体を提供する。このような複合体は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との相互作用を破壊する候補薬剤を同定するのに有用である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊する薬剤を同定する方法であって：ａ）候補薬剤をＣＤ９３と接触させること；およびｂ）ＩＧＦＢＰ７とＣＤ９３との間の相互作用を評価すること；を含み、ＣＤ９３を候補薬剤と接触させていない場合と比較して低減された相互作用は、その薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊することを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＣＤ９３を提供することを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＩＧＦＢＰ７を提供することを含む。適切なＣＤ９３には、野生型ＣＤ９３およびそのバリアントが含まれる。適切なＩＧＦＢＰ７には、野生型ＩＧＦＢＰ９３およびそのバリアントが含まれる。本明細書に記載のＣＤ９３バリアントおよび／またはＩＧＦＢＰ７バリアントのいずれかを同定方法に使用することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊する薬剤を同定する方法であって：ａ）候補薬剤をＩＧＦＢＰ７と接触させること；およびｂ）ＩＧＦＢＰ７とＣＤ９３との間の相互作用を評価すること；を含み、ＩＧＦＢＰ７を候補薬剤と接触させていない場合と比較して低減された相互作用は、その薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊することを示す、方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＩＧＦＢＰ７を提供することを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＣＤ９３を提供することを含む。いくつかの実施形態では、この方法はさらに、ＩＧＦＢＰ７を提供することを含む。適切なＣＤ９３には、野生型ＣＤ９３およびそのバリアントが含まれる。適切なＩＧＦＢＰ７には、野生型ＩＧＦＢＰ９３およびそのバリアントが含まれる。本明細書に記載のＣＤ９３バリアントおよび／またはＩＧＦＢＰ７バリアントのいずれかを同定方法に使用することができる。
ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７結合活性および／またはＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７経路活性の破壊は、ＰＣＲ、Ｔａｑｍａｎ ＰＣＲ、ファージディスプレイシステム、ゲル電気泳動、レポーター遺伝子アッセイ、酵母－ツーハイブリッドアッセイ、ノーザンまたはウェスタン分析、免疫組織化学、従来のシンチレーションカメラ、ガンマカメラ、直線スキャナー、ＰＥＴスキャナー、ＳＰＥＣＴスキャナー、ＭＲＩスキャナー、ＮＭＲスキャナーまたはＸ線機器によって測定することができる。破壊はまた、標識置換（label displacement）、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）または生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、蛍光クエンチング（消光）、および蛍光偏光から選択される方法を使用することによって測定することができる。
ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７結合活性および／またはＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７経路活性の変化は、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用の変化を検出することによって、ＣＤ９３および／もしくはＩＧＦＢＰ７のレベルの変化を検出することによって、またはＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７経路におけるタンパク質の１つまたは複数のレベルの変化を検出することによって検出され得る。上記のものが検出され得る細胞は、腫瘍起源のものであるか、培養細胞であるか、またはトランスジェニック生物から得られるかもしくはトランスジェニック生物内にあるものであってよい。このようなトランスジェニック生物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシまたは霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。
本出願のスクリーニングアッセイは、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適する方法を含むことができ、アッセイを小分子薬物候補の同定に特に適したものにする。アッセイは、タンパク質－タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、および細胞ベースアッセイを含む、様々な形式で実施することができ、これらは当技術分野においてよく特徴付けられている。ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングの場合、薬剤は、例えば、ファージディスプレイ、ＧＳＴプルダウン、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）、またはＢＩＡｃｏｒｅ（表面プラズモン共鳴；ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）分析によって同定することができる。ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの場合、薬剤は、例えば、酵母ツーハイブリッド分析、共免疫沈降、免疫蛍光法による共局在化、またはＦＲＥＴによって同定することができる。
ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の破壊を伴うスクリーニング実験では、漸増濃度の候補薬剤の存在下または非存在下において、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を発現する細胞を、それぞれ標識ＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３を含む結合緩衝液中においてインキュベートすることができる。アッセイを検証および較正するために、それぞれ漸増濃度の非標識ＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３を用いた対照競合反応を実施することができる。インキュベーション後、洗浄ステップを実施して、結合していないＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３を除去する。結合した標識ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を所与の標識（例えば、シンチレーション計数、蛍光、抗体色素など）について適切に測定する。候補薬剤の存在下での結合した標識ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の量の少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％）の減少は、候補薬剤による結合の置き換えを示す。
いくつかの実施形態では、候補薬剤は、１ｍＭ以下の濃度で、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％以上の標識ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７に置き換わる場合、本明細書に記載のこのアッセイまたは他のアッセイにおいて特異的に結合すると考えられる。もちろん、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７の役割を交換することができる；当業者は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の破壊を決定するために、様々な濃度の候補薬剤の存在下でＣＤ９３をＩＧＦＢＰ７に添加するように方法を適合させることができる。
ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の破壊は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってモニターすることができる。表面プラズモン共鳴アッセイは、水相からセンサ上に固定化されたＣＤ９３へのＩＧＦＢＰ７の結合または結合の喪失（またはその逆）によって引き起こされる、固定化されたセンサ付近の質量の変化によって、２つの分子間の結合を測定する定量的方法として使用することができる。この質量の変化は、ＩＧＦＢＰ７または候補薬剤の注入または除去後の時間に対する共鳴単位として測定され、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）を使用して測定される。ＣＤ９３は、Ｓａｌａｍｏｎらにより記載される方法（(Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219；それぞれ、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）に従って、センサーチップ（例えば、研究グレードのＣＭ５チップ；Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ）上に固定化することができる。Ｓａｒｒｉｏらは、ＳＰＲを使用して、チップ上の脂質層に固定化されたＧＰＣＲ Ａ（１）アデノシン受容体へのリガンド結合を検出できることを実証した（Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174；あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＰＲアッセイにおけるＣＤ９３へのＩＧＦＢＰ７結合の条件は、出発点としてＳａｒｒｉｏらによって報告された条件を使用して、当業者によって微調整され得る。
ＳＰＲは、少なくとも２つの方法で結合の阻害剤についてアッセイすることができる。第１に、ＩＧＦＢＰ７を固定化ＣＤ９３に予め結合させ、続いて候補薬剤を０．１ｎＭ～１ｐＭの範囲の濃度で注入することができる。結合したＩＧＦＢＰ７の置き換えを定量化することができ、阻害剤の結合の検出を可能にする。あるいは、チップ結合ＣＤ９３を候補薬剤とプレインキュベートし、ＩＧＦＢＰ７をチャレンジすることができる。阻害剤に予め曝露されていないチップ上の結合と比較した、阻害剤に曝露されたＣＤ９３へのＩＧＦＢＰ７の結合の差は、ＣＤ９３の存在下でのＩＧＦＢＰ７の結合または置き換えを示す。いずれのアッセイにおいても、候補薬剤の非存在下で結合したＩＧＦＢＰ７の量と比較した、候補薬剤の存在下で結合したＩＧＦＢＰ７の量の１０％（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％）以上の減少は、候補薬剤がＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との相互作用を阻害することを示す。上記ではＣＤ９３が固定化されているが、当業者は、ＩＧＦＢＰ７が固定化された成分であるように方法を容易に適合させることができる。
ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の結合を阻害する薬剤を検出する別の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用する。ＦＲＥＴは、蛍光ドナー（Ｄ）の発光スペクトルが蛍光アクセプター（Ａ）の励起スペクトルと重複する場合に、互いに近接した（通常、＜１００オングストロームの分離）蛍光ドナー（Ｄ）と蛍光アクセプター（Ａ）との間で生じる量子力学的現象である。試験される分子、例えばＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７は、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアの相補的な対で標識される。ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用によって密接に結合している間に、ドナーフルオロフォアの励起時に放出される蛍光は、ＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７が結合していないときにその励起波長に応答して放出されるものとは異なる波長を有し、各波長における発光強度の測定により結合分子対非結合分子の定量化を提供する。ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を標識するためのドナーフルオロフォアは、当技術分野において周知である。例としては、シアンＦＰ（ＣＦＰ、ドナー（Ｄ））およびイエローＦＰ（ＹＦＰ、アクセプター（Ａ））として知られるオワンクラゲ（Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ）のＧＦＰのバリアントが挙げられる。
いくつかの実施形態では、標識ＩＧＦＢＰ７およびＹＦＰ－ＣＤ９３の混合物への候補薬剤の添加は、例えば、候補薬剤を含まないサンプルと比較したＹＦＰ蛍光の減少によって証明されるエネルギー移動の阻害をもたらす。ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の検出のためにＦＲＥＴを使用するアッセイにおいて、候補薬剤を含まないサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプルにおけるアクセプター波長での蛍光発光の強度の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上）の減少は、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害することを示す。逆に、候補薬剤を含まないサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプルにおけるアクセプター波長での蛍光発光の強度の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上）の増加は、候補薬剤が立体構造変化を誘導し、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を増強することを示す。
ＦＲＥＴのバリエーションは、分子相互作用をモニターするために蛍光クエンチング（消光）を使用する。相互作用ペアにおける一方の分子はフルオロフォアで標識され、また他方の分子は、フルオロフォアと近接して並置されるとフルオロフォアの蛍光を消光する分子で標識され得る。励起時の蛍光の変化は、フルオロフォア：クエンチャー対でタグ付けされた分子の会合の変化を示す。一般に、標識ＣＤ９３の蛍光の増加は、クエンチャーを有するＩＧＦＢＰ７分子が置き換えられたことを示す。もちろん、ＩＧＦＢＰ７が蛍光標識され、ＣＤ９３がクエンチャーを有する場合にも、同様の効果が生じる。クエンチングアッセイについて、候補薬剤を含まないサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプルにおける蛍光発光の強度の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上）の増加は、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害することを示す。逆に、候補薬剤を含まないサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプルにおける蛍光発光の強度の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上）の減少は、候補薬剤が立体構造変化を誘導し、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を増強することを示す。
表面プラズモン共鳴およびＦＲＥＴ法に加えて、蛍光偏光測定は、結合を定量化するために有用である。蛍光標識分子の蛍光偏光値は、回転相関時間またはタンブリング速度に依存する。蛍光標識されたＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３とそれぞれ会合するＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７によって形成されるものなどの複合体は、複合体化されていない標識ＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３よりも高い偏光値を有する。候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７の相互作用を妨害または阻害する場合、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の候補薬剤を含めると、候補薬剤を含まない混合物と比較して、蛍光偏光の減少をもたらす。蛍光偏光は、複合体の形成を妨害する小分子の同定によく適している。候補薬剤を含まないサンプルにおける蛍光偏光と比較して、候補薬剤を含むサンプルにおける蛍光偏光の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上）の減少は、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害することを示す。
別の検出システムは、生物発光ルシフェラーゼおよび蛍光アクセプターを含む融合タンパク質間の光移動を使用する生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である。一般に、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用対の１つの分子は、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ））－ルシフェラーゼ基質（例えば、ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ）の存在下で約３９５ｎｍの波長の光を放射するドナー－に融合される。対の他方の分子は、ドナーからの光を吸収し、異なる波長の光を放射することができるアクセプター蛍光タンパク質に融合される。蛍光タンパク質の例は、約５１０ｎｍの光を放射するＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）である。ドナー融合ＩＧＦＢＰ７およびアクセプター融合ＣＤ９３の混合物への候補薬剤の添加（またはその逆）は、例えば、候補薬剤を含まないサンプルと比較して、アクセプター蛍光の減少によって証明されるエネルギー移動の阻害をもたらす。ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の検出のためにＢＲＥＴを使用するアッセイにおいて、候補薬剤を含まないサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプルにおけるアクセプター波長での蛍光発光の強度の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上）の減少は、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害することを示す。逆に、候補薬剤を含まないサンプルと比較して、候補薬剤を含むサンプルにおけるアクセプター波長での蛍光発光の強度の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上）の増加は、候補薬剤が立体構造変化を誘導し、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を増強することを示す。
本明細書に記載される結合アッセイのいずれも、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７に結合するＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７以外の任意のリガンド（例えば、アゴニスト、アンタゴニストなど）、例えば、本明細書に記載されるように同定される小分子、あるいは、天然もしくは合成ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合フラグメント、脂質、炭水化物、および有機小分子のいずれかを含むがこれらに限定されないＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７模倣物を用いて実施することができることを理解されたい。
記載される結合アッセイのいずれかを使用して、ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７に結合するまたはＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７の結合に影響を及ぼす、サンプル（例えば組織サンプル）中の阻害剤の存在を決定することができる。そうするために、サンプルの存在下または非存在下でＣＤ９３をＩＧＦＢＰ７と反応させ、使用している結合アッセイに適切であるように結合を測定する。ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７の結合の１０％以上（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上）の減少は、サンプルがＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を遮断する阻害剤を含有することを示す。
記載される結合アッセイのいずれかを使用して、化合物のライブラリーにおいて阻害剤の存在を決定することもできる。例えば、ハイスループットスクリーニングを使用するそのようなスクリーニング技術は、当技術分野において周知である。
本出願はまた、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７シグナル伝達経路を阻害することができる薬剤を同定するための方法であって、前記薬剤の存在下でＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用によって誘導されるシグナル伝達応答を測定すること、およびそれを前記薬剤の非存在下でＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用によって誘導されるシグナル伝達応答と比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は：ａ）ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との相互作用を可能にする条件下において、試験薬剤の存在下および非存在下で、ＣＤ９３をＩＧＦＢＰ７と接触させるステップ；およびｂ）ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用によって誘導されるシグナル伝達応答を測定するステップを含み、試験薬剤の非存在下での応答と比較して、試験薬剤の存在下での少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％）の応答の変化は、試験薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害することができると同定されることを示す。
本出願は、ＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３との相互作用においてＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７と同じ、類似の、または改善された機能的効果を有するＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７模倣物を同定する方法であって、候補模倣物によるＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３との相互作用を測定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は：ａ）候補模倣物とＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７との相互作用を可能にする条件下で、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を候補模倣物と接触させること；およびｂ）模倣物とＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７との相互作用を測定すること；を含み、その相互作用が、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用について観察される相互作用の少なくとも約１０％（例えば、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）である場合に、候補模倣物は本出願のＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７模倣物として区別される。
さらに、本出願はまた、それぞれＩＧＦＢＰ７またはＣＤ９３との相互作用においてＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７と同じ、類似のまたは改善された機能的効果を有するＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７模倣物を同定する方法であって、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７と模倣物との相互作用によって誘導されるシグナル伝達応答を測定すること；およびそれをＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用によって誘導されるシグナル伝達応答と比較すること；を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は：ａ）候補模倣物とＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７との相互作用を可能にする条件下で、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を候補模倣物と接触させること；ｂ）ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７と模倣物との相互作用によって誘導されるシグナル伝達応答を測定すること；を含み、そのシグナル伝達応答が、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用について観察されるシグナル伝達応答の少なくとも約１０％（例えば、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）である場合に、候補模倣物は本出願のＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７模倣物として区別される。
ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７との相互作用の模倣シグナル伝達活性の測定は、ＳＰＲおよびＦＲＥＴなどの、他のアッセイについて本明細書に記載される方法によって行うことができる。記載される結合アッセイのいずれかを使用して、サンプル（例えば、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７に結合する組織サンプル）中の模倣物の存在を決定することができる。そうするために、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７をサンプルの存在下または非存在下で反応させ、使用されているアッセイに適切であるようにシグナル伝達を測定する。ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７のシグナル伝達の約１０％以上（例えば、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上）の増加は、サンプルがＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７に結合する模倣物を含有することを示す。
記載されるシグナル伝達アッセイのいずれかを使用して、化合物のライブラリーにおいて模倣物の存在を決定することもできる。例えば、ハイスループットスクリーニングを使用するそのようなスクリーニング技術は、当技術分野において周知である。
本出願のまたは本出願によって使用される候補または試験化合物または薬剤は、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができ、そのようなライブラリー法には：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並列固相または溶液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase library）；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法が含まれる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Lam et al. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145；あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野において、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233に見ることができ、これらのそれぞれは、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13: 412）、またはビーズ上（Lam (1991) Nature 354: 82）、チップ上（Fodor (1993) Nature 364: 555）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒ’４０９）、プラスミド上（Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865）、またはファージ上（Scott and Smith (1990) Science 249: 386）に提示され得る；(Devlin (1990) Science 249: 404); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301); (Ladner, 上記)；これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
いくつかの態様において、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を発現する細胞を候補または試験化合物または薬剤と接触させること、および前記ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の活性を阻害する試験化合物の能力を決定することを含む、細胞ベースのアッセイが提供される。ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害する試験化合物の能力の決定は、例えば、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害する候補または試験化合物または薬剤の能力を決定することによって達成することができる。
ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７シグナル伝達経路を阻害する候補または試験化合物または薬剤の能力の決定は、直接結合を決定することによって達成することができる。これらの決定は、例えば、候補または試験化合物または薬剤へのタンパク質の結合が、複合体中の標識タンパク質を検出することによって決定され得るように、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得る。例えば、分子、例えばタンパク質を、直接的または間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識することができ、放射性同位体は、放射線放射（radioemission）の直接的計数によって、またはシンチレーション計数によって検出することができる。あるいは、分子を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識することができ、酵素標識は、適切な基質の生成物への変換の決定によって検出することができる。
相互作用物質のいずれも標識することなく、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害する候補または試験化合物または薬剤の能力を決定することも本出願の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、いずれの相互作用物質も標識することなく試験化合物とＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７との相互作用を検出することができる（McConnell et al. (1992) Science 257: 1906 ；あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）。本明細書で使用される場合、「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光アドレス可能な電位差測定センサ（ｉｇｈｔ－ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ）（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物と受容体との間の相互作用の指標として使用することができる。
いくつかの実施形態では、タンパク質またはその生物学的活性部分を候補または試験化合物または薬剤（例えば、またはＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を阻害するその能力について試験した化合物）と接触させ、試験化合物がＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７、あるいはその生物学的活性部分に結合する能力を決定する、無細胞アッセイを提供する。ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７への試験化合物の結合は、上記のように直接または間接的に決定することができる。
このような決定は、リアルタイム生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）などの技術を用いて達成することができる。Sjolander et al., 1991 Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995 Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705（これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）。本明細書で使用される場合、「ＢＩＡ」は、いずれの相互作用物質（例えば、ＢｌＡｃｏｒｅ）も標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究するための技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を、生体分子間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。
本出願の上記のアッセイ方法のいくつかの実施形態では、複合体化形態のタンパク質から非複合体化形態のタンパク質の分離を容易にするため、ならびにアッセイの自動化に適応させるために、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を固定化することが望ましい場合がある。ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７への試験化合物の結合は、反応物を含有するのに適した任意の容器中で達成することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微量遠心管が挙げられる。いくつかの実施形態において、タンパク質がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ／キナーゼ融合タンパク質またはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、次いでそれを試験化合物、または試験化合物および非吸着ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７と組み合わせ、複合体形成をもたらす条件下（例えば、塩およびｐＨの生理学的条件下）で混合物をインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、あらゆる非結合成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、例えば、上記のように直接的または間接的に複合体を測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、標準的な技術を用いて結合のレベルを決定することができる。
マトリックス上にタンパク質を固定化するための他の技術もまた、本出願のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７は、ビオチンとストレプトアビジンとのコンジュゲーションを利用して固定化することができる。ビオチン化ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７または標的分子を、当技術分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州ロックフォード）を用いてビオチン－ＮＨＳ（Ｎヒドロキシ－スクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートのウェルに固定化することができる（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）。あるいは、ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７または標的分子と反応する抗体をプレートのウェルに被覆（derivatized）し、未結合ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７を抗体コンジュゲーションによってウェルに捕捉することができる。そのような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定化複合体について上述したものに加えて、ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７または標的分子と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出が含まれる。
いくつかの態様において、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７に結合する他のタンパク質を同定するために、ツーハイブリッドアッセイ（two-hybrid assay）またはスリーハイブリッドアッセイ（three-hybrid assay）においてＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７を「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用することができる（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Zervos et al., 1993 Cell 72:223-232; Madura et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., 1993 Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993 Oncogene 8:1693-1696；およびＢｒｅｎｔの国際公開第９４／１０３００号を参照されたい；これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる）。
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、ほとんどの転写因子のモジュラー性質（modular nature）に基づく。簡単に説明すると、そのアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物では、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７をコードする遺伝子を、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ－４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合させる。他方の構築物では、ＤＮＡ配列のライブラリーからの、未同定のタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合させる。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質がｉｎ ｖｉｖｏで相互作用してキナーゼ依存性複合体を形成することができる場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは近接する。この近接性は、転写因子に応答する転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために使用することができる。
本明細書に記載されるタンパク質－タンパク質相互作用アッセイはまた、薬剤が、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７と他の結合パートナーとの間の相互作用（例えば、ＣＤ９３とＭＭＮＲ２との間の相互作用およびＩＧＦＢＰ７とＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用）を遮断するかどうかを決定するために有用であり得ることを理解されたい。
本明細書に記載される方法のいずれかによって同定される薬剤も提供される。したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載されるように同定された薬剤をさらに使用することは、本出願の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように同定された薬剤（例えば、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を遮断することができる薬剤）を動物モデルにおいて用いて、このような薬剤による処置の有効性、毒性、または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載されるように同定された薬剤を動物モデルにおいて使用して、そのような薬剤の作用機序を決定することができる。さらに、本出願は、本明細書に記載の治療のための、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤の使用に関する。
Ｖ．調製方法、核酸、ベクター、宿主細胞、および培地
いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬（本明細書に記載の抗ＣＤ９３抗体、抗ＩＧＦＢＰ７抗体、阻害性ＣＤ９３ポリペプチド、阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドなど）およびその薬剤を含む組成物を調製する方法、核酸構築物、ベクター、宿主細胞、または薬剤の調製中に生成される培地が提供される。
ポリペプチドの発現および生成
本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体、例えば、阻害性ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）は、以下および実施例に記載されるものを含む、当技術分野において公知の任意の方法を使用して調製することができる。
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体集団から得られ、すなわち、その集団を構成する対象抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の特徴が別個の抗体の混合物ではないことを示す。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製することができ、あるいは、組換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）により作製してもよい。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターまたはラマを、上記のように免疫して、免疫に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘起する。あるいは、リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてミエローマ細胞（骨髄腫細胞）と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986）。
免疫剤は、典型的には、抗原性タンパク質またはその融合バリアントを含む。一般に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは、非ヒト哺乳動物源が所望される場合、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103；あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。
不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシおよびヒト起源のミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞株が用いられる。このように調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、非融合親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する適切な培地中で播種および増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むであろう（ＨＡＴ培地）。
好ましい不死化ミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性であるものである。これらの中でも、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＭＯＰＣ－２１およびＭＰＣ－１１マウス腫瘍、ならびに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナサス）から入手可能なＳＰ－２細胞（およびその誘導体、例えば、Ｘ６３－Ａｇ８－６５３）に由来するものなど、マウスミエローマ株が好ましい。ヒトミエローマおよびマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987；これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
ハイブリドーマ細胞が増殖している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。
ハイブリドーマ細胞が培養される培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性および特異性は、免疫沈降によって、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定することができる。このような技術およびアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、結合親和性は、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析によって決定することができる。
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、上記）。この目的に適した培地には、例えば、Ｄ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腫瘍としてｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培地、腹水、または血清から適切に分離される。
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法、および上記の方法によって作製され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは容易に単離され、従来の手順を用いて配列決定される（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。ひとたび単離すると、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次に、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞などの、宿主細胞中にそれをトランスフェクトし、そのような組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関するレビュー論文としては、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) およびPlueckthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992)が挙げられる
さらなる態様において、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)；およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) に記載される技術を用いて作製される抗体ファージライブラリーから抗体を単離することができ、これらの各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれ、ファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離をそれぞれ記載している。その後の刊行物には、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の産生、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ ｖｉｖｏ組換え（Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)が記載されている。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替法である。
例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を代用することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、ＤＮＡを修飾してもよい。典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置き換わり、または抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置き換わり、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
本明細書に記載のモノクローナル抗体は一価であってよく、その調製は当技術分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖および修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、概して、重鎖架橋を防止するように、Ｆｃ領域内の任意の点で切断される。あるいは、架橋を防ぐために、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換してもよく、または欠失させてもよい。ｉｎ ｖｉｔｒｏ法も一価抗体の調製に適している。抗体のフラグメント、特にＦａｂフラグメントを作製するための抗体の消化は、当該分野で公知の常用技術を用いて達成され得る。
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を含むものを含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオラート（iminothiolate）およびメチル－４－メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
ポリペプチドをコードする核酸分子
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体（抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体など）またはポリペプチド（阻害性ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７ポリペプチドなど）のいずれか１つをコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれか１つを用いて調製されるポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体）の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、核酸分子は、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドまたは阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、核酸分子は、抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体）の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸分子は、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチドを含み、第２の核酸分子は、軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７ ｓｃＦｖ）をコードする核酸分子が提供される。いくつかの態様において、核酸分子は、阻害性ＣＤ９３ポリペプチドまたは阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
いくつかのそのような実施形態において、抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体）の重鎖および軽鎖は、１つの核酸分子から、または２つの別々の核酸分子から、２つの別々のポリペプチドとして発現される。いくつかの実施形態において、例えば抗体がｓｃＦｖである場合、単一のポリヌクレオチドは、一緒に連結された重鎖および軽鎖の両方を含む単一のポリペプチドをコードする。
いくつかの態様において、抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体）の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドは、翻訳された場合に重鎖または軽鎖のＮ末端に位置するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む。上記のように、リーダー配列は、天然の重鎖もしくは軽鎖リーダー配列であってもよく、または別の異種リーダー配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。
核酸分子は、当技術分野において慣用的な組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターである。
核酸構築物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれか１つを含む核酸構築物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製される核酸構築物が提供される。
いくつかの実施形態では、核酸構築物は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは遺伝子に該当し、プロモーターは遺伝子の野生型プロモーターである。
ベクター
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、宿主を遺伝子改変し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる媒体（vehicle）を意味する。ベクターには、プラスミド、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、ファージ、ウイルスなどが含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴、アルファウイルス、ヘルペス、レンチウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアベクターなどであるがこれらに限定されない、ウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体）のいずれか１つの重鎖および／または軽鎖をコードする任意のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、阻害性ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）をコードする任意のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の核酸構築物を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製されるベクターが提供される。ポリペプチド（例えば、抗ＣＤ９３もしくは抗ＩＧＦＢＰ７抗体または阻害性ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。このようなベクターとしては、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、重鎖をコードする第１のポリヌクレオチド配列、および軽鎖をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖は、２つの別々のポリペプチドとしてベクターから発現される。
いくつかの実施形態では、第１のベクターは、抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体）の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含み、第２のベクターは、抗体（例えば、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体）の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のベクターおよび第２のベクターは、同様の量（同様のモル量または同様の質量など）で宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの態様において、５：１～１：５のモル比または質量比の第１のベクターと第２のベクターが宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの態様において、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターについて１：１～１：５の質量比が使用される。いくつかの実施形態において、重鎖をコードするベクターと軽鎖をコードするベクターについて１：２の質量比が使用される。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯもしくはＣＨＯ由来細胞またはＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されたベクターが選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)に記載されている。
特定の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターであり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
いくつかの実施形態では、ベクターは非ウイルスベクターである。非ウイルスベクターは、プラスミドまたはトランスポゾン（ＰｉｇｇｙＢａｃ－またはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンなど）であり得る。
宿主細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意のポリペプチド、核酸構築物および／またはベクターを含む宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製される宿主細胞が提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵条件下で本明細書に記載のポリペプチド（抗体または阻害性ポリペプチドなど）のいずれかを産生することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗ＣＤ９３もしくは抗ＩＧＦＢＰ７抗体または阻害性ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）は、細菌細胞などの原核細胞；または真菌細胞（酵母など）、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの真核細胞において発現させることができる。このような発現は、例えば、当該分野で公知の手順に従って実施され得る。ポリペプチドを発現するために使用され得る例示的な真核細胞としては、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞；２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞；ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、およびＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞；ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；およびＨＳＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗ＣＤ９３もしくは抗ＩＧＦＢＰ７抗体または阻害性ＣＤ９３もしくはＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）を酵母で発現させることができる。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４５号を参照されたい。いくつかの実施形態において、特定の真核生物宿主細胞は、所望の抗体の重鎖および／または軽鎖に対して所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生される同じポリペプチドよりも高いレベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。
所望の宿主細胞への１つまたは複数の核酸の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染などを含むがこれらに限定されない任意の方法によって達成され得る。非限定的な例示的方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されており、これはあらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれる。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過性にまたは安定にトランスフェクトされ得る。
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、本発明は、抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む宿主細胞を提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、目的の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的のために使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。国際公開第８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞には、原核生物（大腸菌または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；またはクルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは無細胞系で生成される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)に記載されている。
培地
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意のポリペプチド、ポリヌクレオチド、核酸構築物、ベクター、および／または宿主細胞を含む培地が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意の方法を使用して調製される培地が提供される。
いくつかの実施形態では、培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、および／またはチミジンを含む（例えば、ＨＡＴ培地）。いくつかの実施形態では、培地は血清を含まない。いくつかの実施形態では、培地は血清を含む。いくつかの実施形態では、培地はＤ－ＭＥＭまたはＲＰＭＩ－１６４０培地である。
ポリペプチドの精製
ポリペプチド（例えば抗ＣＤ９３または抗ＩＧＦＢＰ７抗体、例えば阻害性ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７ポリペプチド）は、任意の適切な方法によって精製することができる。このような方法には、アフィニティマトリックスまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が含まれるが、これらに限定されない。適切なアフィニティリガンドには、ＲＯＲ１ ＥＣＤ、および抗体定常領域に結合するリガンドが含まれる。いくつかの実施形態では、定常領域を結合させ、Ｆｃフラグメントを含む抗体を精製するために、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体アフィニティカラムを使用することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルまたはフェニルカラムもまた、抗体などのいくつかのポリペプチドを精製するために好適であり得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィー）も、抗体などのいくつかのポリペプチドを精製するために好適であり得る。混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換など）も、抗体などのいくつかのポリペプチドを精製するのに好適であり得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当技術分野で公知である。
ＶＩ．組成物、キット、および製品
本出願はまた、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するための組成物、キット、医薬、および単位剤形を提供する。
組成物
本明細書に記載のＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬のいずれも、他の薬剤、賦形剤、または安定剤を含む組成物（例えば、製剤）中に存在することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍組織または異常な血管もしくは低酸素状態に関連する組織へのＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬の送達を促進する標的化剤または担体をさらに含む。例示的な担体としては、リポソーム、ミセル、ナノ分散アルブミンおよびその修飾物、ポリマーナノ粒子、デンドリマー、異なる組成の無機ナノ粒子が挙げられる。
いくつかの実施形態では、組成物はヒトへの投与に適している。いくつかの実施形態では、組成物は、獣医学的状況において、家庭用ペットおよび農業用動物などの哺乳動物への投与に適している。ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬を含む組成物の多種多様な適切な製剤がある。以下の製剤および方法は、単なる例示であり、決して限定するものではない。経口投与に適した製剤は、（ａ）水、生理食塩水、またはオレンジジュースなどの希釈剤中に溶解した有効量の化合物などの液体溶液、（ｂ）それぞれが固体または顆粒として所定量の活性成分を含有するカプセル、サシェ、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁液、および（ｄ）適切なエマルジョンからなることができる。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、ならびに薬理学的に適合性の賦形剤のうちの１つまたは複数を含むことができる。ロゼンジ形態は、フレーバー、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中の活性成分、ならびにゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含む芳香錠（pastille）、活性成分に加えて当技術分野で公知の賦形剤を含むエマルジョン、ゲルなどを含むことができる。
適切な担体、賦形剤、および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ならびに鉱油が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬と本明細書で論じる担体とを含む組成物は、乾燥製剤（例えば、凍結乾燥組成物）中に存在する。製剤は、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味剤または香味剤をさらに含むことができる。
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と適合性にする溶質を含有し得る水性および非水性の等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量の密封容器で提供することができ、使用直前に注射用の滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。即時注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。注射用製剤が好ましい。
いくつかの実施形態では、組成物は、約４．５～約９．０のｐＨ範囲（例えば、約５．０～約８．０、約６．５～約７．５、および約６．５～約７．０のいずれかのｐＨ範囲を含む）を有するように製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは約６以上（例えば、約６．５、７、または８（約８など））以上のいずれかを含む）に製剤化される。組成物はまた、グリセロールなどの適切な張性調節剤（tonicity modifier）の添加によって血液と等張になるように作製することができる。
キット
本明細書に提供されるキットは、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、または本明細書に記載されるＣＤ９３／ＩＧＢＰ７遮断薬および／もしくは他の薬剤を含む医薬組成物を含む１つまたは複数の容器を含み、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれかに従って使用するための説明書をさらに含む。キットは、治療に適した対象の選択の説明をさらに含み得る。本発明のキットに提供される説明書は、典型的にはラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙シートなど）に書かれた説明書であるが、機械可読説明書（例えば、磁気または光学記憶ディスク上で運ばれるされる指示）も許容される。
いくつかの態様において、キットは、ａ）抗ＣＤ９３抗体またはその薬学的に許容される塩を含むＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、および薬学的に許容される担体を含む組成物；ならびに任意選択でｂ）疾患または状態の治療のためにＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬を投与するための説明書；を含む。いくつかの態様において、キットは、ａ）抗ＩＧＦＢＰ７抗体またはその薬学的に許容される塩を含むＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、および薬学的に許容される担体を含む組成物；ならびに任意選択でｂ）疾患または状態の治療のためにＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬を投与するための説明書；を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ａ）阻害性ＣＤ９３ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含むＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、および薬学的に許容される担体を含む組成物；ならびに任意選択でｂ）疾患または状態の治療のためにＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬を投与するための説明書；を含む。いくつかの態様において、キットは、ａ）阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を含むＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、および薬学的に許容される担体を含む組成物；ならびに任意選択でｂ）疾患または状態の治療のためにＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬を投与するための説明書；を含む。
本発明のキットは、適切なパッケージ中にある。好適なパッケージとしては、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージ（例えば、密封されたマイラーまたはプラスチックバッグ）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットは、任意選択で、緩衝液および解釈情報などの追加の構成要素を提供することができる。したがって、本出願は、バイアル（密封バイアルなど）、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージなどを含む製品も提供する。
いくつかの態様において、キットは、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、またはその薬剤を含む組成物、および／またはさらなる治療剤の対象への送達を容易にする１つまたは複数の成分を含む。いくつかの態様において、キットは、例えば、対象への細胞の送達に適したシリンジおよび針などを含む。そのような実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、またはその薬剤を含む組成物は、バッグ中、または１つまたは複数のバイアル中のキットに含まれ得る。いくつかの態様において、キットは、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬またはその薬剤を含む組成物の対象への静脈内または動脈内送達を容易にする成分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、またはその薬剤を含む組成物は、例えば、ボトルまたはバッグ（例えば、血液バッグまたは細胞を含む約１．５Ｌまでの溶液を収容できる同様のバッグ）内に含まれていてもよく、キットは、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬、またはその薬剤を含む組成物を対象に送達するのに適したチューブおよび針をさらに含む。
組成物の使用に関する説明書は、概して、意図される治療のための投与量、投与スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回投与パッケージ）またはサブ単位用量であり得る。例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３か月、４か月、５か月、７か月、８か月、９か月、またはそれ以上のいずれかなどの長期間にわたって対象の有効な治療を提供するのに十分な投与量の本明細書に記載の亜鉛を含有するキットを提供することができる。キットはまた、複数単位用量の医薬組成物および使用説明書を含むことができ、薬局、例えば、病院薬局および調剤薬局での保管および使用に十分な量でパッケージングされ得る。
以下の実施例は、純粋に本出願の例示を意図しており、決して本発明を限定するものと見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、限定としてではなく例示として提供される。
実施例１
ＶＥＧＦ阻害剤誘導性血管の正常化に関与し得る新規な標的を同定するために、４つの最近公開されたＲＮＡ－Ｓｅｑデータセット（２８～３１）から、ｉｎ ｖｉｖｏでのＶＥＧＦ阻害剤による処置下の腫瘍ＥＣにおいて遺伝子発現プロファイルを研究した。３つのデータベースは、ＶＥＧＦ阻害剤で処置した異種移植腫瘍モデル由来であり、１つはヒト神経内分泌腫瘍由来であった。カットオフｌｏｇ２倍変化＜－０．５で複数のデータセットにわたって一貫して減少した遺伝子を選別した。少なくとも３つのデータセットにおいてＶＥＧＦ阻害剤によって発現が有意に減少した１１個の遺伝子を同定した（図１Ａ）。これらのうちのほとんどは、膜貫通タンパク質または細胞外マトリックスタンパク質である（表２を参照のこと）。腫瘍ＥＣにおいてアップレギュレートされた５つの候補遺伝子を選択し、それらの機能を、血管から新たに単離されたヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた管形成アッセイにおいて試験した。それらの中で、ＣＤ９３遺伝子のノックダウンは、ＨＵＶＥＣ細胞における管形成の有意な減少をもたらした（図１Ｂ）。
Figure 2022548980000002
膵臓がんについてのがんゲノムアトラス（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）（「ＴＣＧＡ」）データベースの解析は、ＣＤ９３の転写が正常な膵臓におけるよりも膵管腺がん（ＰＤＡ）において有意に高いことを明らかにした（図１Ｃ）。さらに、ＣＤ９３タンパク質は、ＰＤＡおよび膵神経内分泌腫瘍（ＰＮＥＴ）（膵臓における２つの主要な腫瘍タイプ）内の血管で明らかにアップレギュレートされた（図１Ｄ）。
ＣＤ９３発現もマウスの正常組織および腫瘍において評価した。新たに単離された大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）は、無視できる程度のＣＤ９３を発現するが、ＶＥＧＦとのインキュベーションによってアップレギュレートされ、ＶＥＧＦシグナル伝達がＣＤ９３発現を直接調節することが確認された（図１Ｅ）。ＣＤ９３およびＣＤ３１の共免疫蛍光染色によって明らかにされるように、マウスの正常な膵臓および皮膚において、血管は非常に低いレベルのＣＤ９３を発現する。興味深いことに、腫瘍血管系におけるＣＤ９３の発現は、同所性ＫＰＣモデルおよびＢ１６メラノーマモデルにおいて劇的に増加した（図１Ｆおよび１Ｇ）。これらの結果は、ＣＤ９３が腫瘍血管系において選択的にアップレギュレートされることを示し、これは、腫瘍微小環境（「ＴＭＥ」）におけるＶＥＧＦへの曝露に起因し得る。
実施例２
ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ９３の可能な効果を評価するために、マウスＣＤ９３融合タンパク質でラットを免疫することによってマウスＣＤ９３に特異的なｍＡｂ（クローン７Ｃ１０、ラットＩｇＧ）を作製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＫＰＣトランスジェニックマウス由来のＫＰＣ腫瘍株を移植した（３６）。腫瘍が触知可能になったら、マウスを７Ｃ１０で週に２回、２週間処置した。７Ｃ１０単独は、ＫＰＣ腫瘍成長を約６０％遅らせることができた（図２Ａ）。腫瘍組織のＩＦ染色は、７Ｃ１０処置時にＣＤ３１＋微小血管密度の明らかな変化を示さなかった。しかしながら、血管長は１．８倍超に有意に増加し、また７Ｃ１０で処置した腫瘍において円形状を有する血管の割合が３倍に増加した（図２Ｂ）。さらに、処置後、ＮＧ２およびＣＤ３１の共染色に基づき、対照と比較して周皮細胞で被覆された血管が約３．５倍に増加した（図２Ｃ）。この観察に合致して、７Ｃ１０処置腫瘍内の血管に関連するα平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）陽性細胞が２倍を超えて多く存在した（図２Ｄ）。
腫瘍血管系における構造変化が機能的改善につながり得るかどうかを決定するために、ＣＤ９３遮断に応答した腫瘍血管灌流を調べた。１週間の抗体処置を受けている上記の腫瘍担持マウスに、屠殺前にレクチン－ＦＩＴＣを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。対照腫瘍では、腫瘍の縁に位置する血管はほとんどＦＩＴＣ陽性ではなかったが、７Ｃ１０で処置した腫瘍では、腫瘍の中心および縁の両方の血管の大部分がＦＩＴＣ－レクチンで染色されたことが見出された（図２Ｅ）。７Ｃ１０処置腫瘍において、対照よりも有意に多くのＦＩＴＣ陽性微小血管が存在した（７５％対２０％）。要約すると、結果は、ＣＤ９３を標的とすることが、腫瘍血管系を正常化することができ、腫瘍における血管成熟および灌流を促進させることを支持する。
実施例３
ヒトゲノムスケール受容体アレイ（ＧＳＲＡ）を用いて、ＣＤ９３のカウンター受容体を探索した。インスリン成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリーの分泌タンパク質であるＩＧＦＢＰ７は、ライブラリー中の約６，６００個のヒト膜貫通タンパク質および分泌タンパク質のうち唯一の陽性ヒットである（図４Ａ）。ヒトＣＤ９３ ｍＡｂ（クローンＭＭ０１）またはＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂ（クローンＲ００３）の添加は、ＩＧＦＢＰ７タンパク質のＣＤ９３トランスフェクト２９３細胞への結合を有意に減少させた（図４Ｂ）。組換えＩＧＦＢＰ７タンパク質はＨＵＶＥＣ株に明確に結合し、ＣＤ９３ ｍＡｂ ＭＭ０１はこの結合活性を完全に排除し（図４Ｃ）、ＣＤ９３がＩＧＦＢＰ７タンパク質のＨＵＶＥＣ株への結合を媒介することを実証した。さらに、ＣＤ９３ ｍＡｂを用いてＨＵＶＥＣ細胞溶解物からＩＧＦＢＰ７を免疫沈降させることができ、ＣＤ９３－ＩＧＦＢＰ７相互作用が内皮細胞（ＥＣ）において自然に生じることを示す（図４Ｄ）。マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）によるＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用の親和性測定は、５３．１３±２０．１９ｎＭのＫＤ値を示した（図４Ｅ）。ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用はマウスにおいても保存されており、この相互作用は、上記のｉｎ ｖｉｖｏ機能研究で使用された抗マウスＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂ（クローン２Ｃ６）（図４Ｆ）または抗マウスＣＤ９３ ｍＡｂ（クローン７Ｃ１０）（図４Ｆ）によって遮断することができる。結果は、ＣＤ９３ ｍＡｂ ７Ｃ１０が、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用を遮断することによって腫瘍血管の正常化におけるその機能を媒介することを示唆する。
Ｃ－レクチンドメイン（およそ１～１９０ａａ）をそのファミリーメンバーのもので置き換えることによってＣＤ９３のキメラタンパク質を作製した。いずれのキメラタンパク質もＩＧＦＢＰ７に結合できない（データは示さない）。これは、ＣＤ９３上のＩＧＦＢＰ７の結合部位が、Ｃ－レクチンとＥＧＦ様ドメインとの間の特徴付けられていない配列（例えば、配列番号１のＦ１８２～Ｙ２６２）であることを示唆する。
様々な市販の抗ヒトＣＤ９３モノクローナル抗体および抗ヒトＩＧＦＢＰ７モノクローナル抗体を、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を遮断するそれらの能力について試験した。結果を図１６に示した。
実施例４
ＩＧＦＢＰ７は、そのＮ末端にＩＧＦ結合（ＩＢ）ドメイン、その中央領域にＫａｚａｌ型セリンプロテイナーゼ阻害剤ドメイン（Ｋａｚａｌ）、およびそのＣ末端に免疫グロブリン様Ｃ２タイプ（ＩｇＣ２）ドメインを含む（４３）。ＩＧＦＢＰ７とＣＤ９３との間の結合相互作用をさらに調査するために、ＩＧＦＢＰ７の各ドメインを、ＣＤ９３に結合しないＩＧＦＢＰ関連タンパク質であるＩＧＦＢＰＬ１（４４）由来の対応する部分で置き換えることによって、分析のために一連のキメラタンパク質を作製した（図４Ｇ）。予想通り、ＩＧＦＢＰ７はＣＤ９３＋２９３細胞に強く結合するが、ＩＧＦＢＰＬ１は結合しない。ＩＢドメインを置き換えたキメラタンパク質は、ＣＤ９３＋２９３細胞に結合する能力を失うが、ＫａｚａｌまたはＩｇＣ２ドメインの置換は、影響がないかまたは最小限である（図４Ｇおよび図１０Ａ）。他のＩＢドメイン含有ヒトタンパク質もＣＤ９３と相互作用し得る可能性を排除するために、ヒトＩＢドメイン含有遺伝子の大部分からマウスＦｃタグ付け融合タンパク質を構築および作製した（ｎ＝１５）。ＩＧＦＢＰ７を除いて、ＣＤ９３に対するこれらの組換えタンパク質の有意な結合は検出されなかった（図１０Ｂ）。したがって、ＩＧＦＢＰ７上のＩＢドメインは、ＣＤ９３との相互作用に対して高度に特異的である。
実施例５
ＰＤＡＣ患者由来の組織サンプルにおけるＩＧＦＢＰ７発現をＩＦによって分析した。隣接する正常な膵臓組織では、ＩＧＦＢＰ７タンパク質は主に膵島細胞に存在し、検出可能なＩＧＦＢＰ７タンパク質を有する血管はほとんどなかった。ＣＤ３１染色はまた、ヒトＰＤＡＣ組織においても乏しかった。しかしながら、隣接する正常な膵臓と比較して、ＩＧＦＢＰ７陽性の血管は２倍を超えていた（図５Ａ）。これに合致して、ＴＣＧＡ膵臓がんデータセットの解析は、ＩＧＦＢＰ７が正常な膵臓と比較してヒトＰＤＡＣにおいて有意にアップレギュレートされることを明らかにした（図１１Ａ）；ＩＧＦＢＰ７遺伝子の発現は、ＰＤＡにおけるＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、ＣＤ３４、およびフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）などのＥＣシグネチャー遺伝子とよく相関しており、腫瘍ＥＣにおいて豊富な遺伝子としてのＩＧＦＢＰ７をさらに支持する（図１１Ｂ）。マウスがん組織において、ＩＧＦＢＰ７の同様の発現パターンが観察された。腫瘍血管において、ＩＧＦＢＰ７の発現は、正常な膵臓と比較して、同所移植されたＫＰＣ（膵臓腺がん）腫瘍において大きくアップレギュレートされた（図１２Ａ）。ＩＧＦＢＰ７発現は、正常マウス皮膚組織の血管において実質的に検出不可能であったが、ＩＧＦＢＰ７は、皮下移植マウスＫＰＣおよびＢ１６腫瘍においてＣＤ３１＋ＥＣにおいて高度に発現された（図１２Ｂ）。
移植されたマウス腫瘍の中心内にある微小血管は、腫瘍の縁の周りのものと比較して、有意に高いレベルのＩＧＦＢＰ７を発現することが認められ（図５Ｂ）、ＩＧＦＢＰ７のアップレギュレーションが腫瘍内の低酸素状態によって誘導され得ることが示唆された。これを試験するために、ＥＣをジメチルオキサリルグリシン（ＤＭＯＧ）中で培養して低酸素条件を模倣し、ＩＧＦＢＰ７発現についてウェスタンブロットにより試験した。実際に、ＤＭＯＧ中で培養したＨＵＶＥＣ細胞は、ＩＧＦＢＰ７のより高い発現を伴って、ＨＩＦ－１αレベルを上昇させたことが見出された（図５Ｃ）。
ＩＧＦＢＰ７遺伝子は、プロモーター領域にコンセンサス低酸素応答エレメント（ＨＲＥ、５’－ＲＣＧＴＧ－３’モチーフ）（４７）を有していないので、ＥＣにおけるそのアップレギュレーションは、低酸素状態によって直接誘発されない可能性がある。ＥＣにおけるＩＧＦＢＰ７の強力な誘導因子である低酸素誘導ＶＥＧＦ（４８）がＩＧＦＢＰ７のアップレギュレーションに関与し得ると仮定した。この仮説をマウス内皮細胞において試験した。ＨＵＶＥＣ細胞と同様に、ＩＧＦＢＰ７発現は、低酸素状態を模倣するためのＤＭＯＧの存在下においてマウスＥＣでアップレギュレートされた。培養にＶＥＧＦＲ遮断ｍＡｂを含めると、マウスＥＣにおける低酸素誘導ＩＧＦＢＰ７発現が完全に防止され（図５Ｄ）、低酸素誘導ＩＧＦＢＰ７がこの系においてＶＥＧＦシグナル伝達に完全に依存することを示唆した。興味深いことに、異種移植結腸がんマウスモデル（４９）からのＲＮＡ－Ｓｅｑデータ（ＧＳＥ１１０５０１）の解析は、ＩＧＦＢＰ７もまた、ＶＥＧＦ阻害剤であるアフリベルセプトによって腫瘍ＥＣにおいて有意に阻害されたことを示した（図５Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ＩＧＦＢＰ７が、ＶＥＧＦシグナル伝達による腫瘍関連血管系における低酸素誘導ＥＣＭタンパク質であることを支持する。
実施例６
ＩＧＦＢＰ７タンパク質は、ＨＵＶＥＣ細胞において構成的に発現され、ＤＭＯＧによってさらにアップレギュレートされ、ＨＩＦ－１αの誘導を伴った（図５Ｃ）。ＩＧＦＢＰ７遺伝子発現のノックダウンは、ＨＵＶＥＣ細胞における管形成を有意に阻害した（図１３Ａ）。ＩＧＦＢＰ７がＣＤ９３を介して血管新生を媒介するかどうかを決定するために、ＩＧＦＢＰ７タンパク質の効果を試験するためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして、ＨＵＶＥＣ細胞にＣＤ９３ ｓｉＲＮＡをトランスフェクトしてＣＤ９３発現をノックダウンした。外因性ＩＧＦＢＰ７タンパク質の添加は、野生型ＨＵＶＥＣ細胞の管形成および増殖を増加させた。しかしながら、ＣＤ９３ノックダウンＨＵＶＥＣ細胞では、ＩＧＦＢＰ７タンパク質は、トランスウェル遊走アッセイにおいて、管形成またはＥＣ遊走に対するその効果を失った（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。これらの研究は、ＣＤ９３がＥＣに対するＩＧＦＢＰ７タンパク質の血管新生促進効果を媒介することを示す。
ＩＧＦＢＰ７のＣＤ９３への結合を遮断するＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂ（クローン２Ｃ６、図１４Ａ）を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長および腫瘍血管成熟に対するその効果を試験した。２Ｃ６の投与は、上記のように、対照と比較して４０％超、ＫＰＣ腫瘍成長を有意に阻害した（図１４Ｂ）。腫瘍組織のＩＦ染色は、２Ｃ６によるＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用の遮断が、円形血管および腫瘍微小血管の長さを大きく増加させたが、ＣＤ３１＋腫瘍血管の密度に影響を及ぼさなかったことを明らかにした（図１４Ｃ）。ＣＤ９３ ｍＡｂによる血管成熟に対する効果と同様に、ＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂは、腫瘍血管に沿ったＮＧ２＋周皮細胞の被覆率を改善し（図１４Ｄ）、腫瘍血管にわたるα－ＳＭＡ被覆率を増加させた（図１４Ｅ）。２Ｃ６ ｍＡｂで処置したマウスからの腫瘍組織は、βｌインテグリン活性化の５０％を超える明らかな減少を示し（図１４Ｆ）、抗ＩＧＦＢＰ７がインテグリンに影響を及ぼして腫瘍血管を正常化することをさらに支持する（５１）。これらの結果は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用の遮断が血管の正常化を促進し、腫瘍成長を弱めることを支持する。
さらに、高用量のＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂおよびＣＤ９３ ｍＡｂ（１５ｍｇ／ｋｇまたは３００μｇ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍血管密度を低下させなかった。結果は、ＴＭＥにおけるＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７の変化の主な効果が血管異常に対するものであり、増加した血管新生に対するものではないことを示唆する。これは、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３軸が血管の正常化のより良好な治療標的であり得ることを示す。ＩＧＦＢＰ７とＣＤ９３は両方とも、マウスおよびヒト腫瘍の腫瘍血管で選択的にアップレギュレートされる。これらの限定された発現パターンは、正常組織の微小血管におけるＶＥＧＦＲ－１、－２および－３の広範な提示とは対照的である。
実施例７
腫瘍血管新生の異常においてＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用は大きな効果を有するため、ｍＡｂによるこの相互作用の遮断が、血管の正常化の結果として薬物送達を促進するように腫瘍灌流を促進し得るかどうかをさらに試験した。ＫＰＣモデルにおいて、固有の自家蛍光を有するアントラサイクリン化学療法薬であるドキソルビシンの送達効果を試験した。屠殺の２０分前にマウスにドキソルビシンをｉ．ｖ．注射した。同時に、マウスを低酸素プローブとしてのピモニダゾールで処置して、腫瘍低酸素状態の可能性のある変化を評価した。ＣＤ９３ ｍＡｂ処置マウスにおいて腫瘍へのドキソルビシンのより多くの浸透が観察された；その間に、低酸素状態も腫瘍において有意に軽減された（図６Ａ）。また、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）処置を受けるＢ１６腫瘍モデルにおける抗ＣＤ９３の抗腫瘍効果を評価した。マウスにＢ１６メラノーマを皮下（ｓ．ｃ．）移植し、週２回のＣＤ９３ ｍＡｂの処置を開始し、腫瘍が触知可能になったら５－ＦＵを２回投与した。予想通り、ＣＤ９３ ｍＡｂまたは５－ＦＵ単独での処置は、腫瘍成長をわずかに阻害しただけであり、最終的には、両方の群において腫瘍が大きくなった。５－ＦＵおよびＣＤ９３ ｍＡｂの組み合わせ処置は、腫瘍成長を劇的に阻害し（図６Ｂ）、２０日間を越えてマウスの有意な部分（約４０％）の生存を延長することができた（図６Ｃ）。組織染色は、移植されたＢ１６メラノーマのＫｉ－６７染色に基づき、ＣＤ９３遮断が腫瘍成長の５－ＦＵ誘導抑制を増強したことを示した（図６Ｄ）。まとめると、これらの実験は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の遮断が低酸素状態を軽減し、薬物送達を促進し、したがってがんにおける化学療法を容易にすることを実証する。
実施例８
腫瘍血管系の正常化は、腫瘍への免疫細胞トラフィッキングを増強することができ、これは、アップレギュレートされた接着分子によるものであり得る（１６、４０、４１）。抗ＣＤ９３処置は、皮下（ｓ．ｃ．）ＫＰＣおよびＢ１６腫瘍モデルの両方において腫瘍血管上のＩＣＡＭ１発現を増加させたことが見出された。（図９Ａおよび９Ｂ）。これに沿って、ＣＤ３のＩＦ染色は、８日目および１５日目において対照由来のものと比較して、抗ＣＤ９３処置マウス由来のＫＰＣ腫瘍組織におけるＴＩＬが約３倍に増加したことを明らかにした（図３Ａおよび３Ｂ）。フローサイトメトリーによるＴＩＬ組成のさらなる分析は、抗ＣＤ９３が腫瘍中のＣＤ４５＋白血球の割合（％）および絶対数を大幅に増加させたことを明らかにする：ＣＤ９３ ｍＡｂ処置腫瘍において、対照よりも約３倍多いＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図３Ｃおよび３Ｄ）。抗ＣＤ９３は、ＣＤ４５＋造血細胞コンパートメント内のＣＤ８＋またはＣＤ４＋ＴＩＬサブセットの比率（図８Ａ）、ならびにＴＩＬのＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの類似のレベルによって示される機能（図８Ｂ）を変化させなかった。しかしながら、抗ＣＤ９３は、腫瘍内の骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の割合を有意に減少させ（図３Ｅ）、好ましい炎症性ＴＭＥをさらに支援する。Ｂ１６メラノーマにおいてもＴＩＬの促進に対する抗ＣＤ９３の同様の効果が観察されたが、このモデルでは腫瘍内のＴＩＬは概して少なかった（図３Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用の遮断が、Ｔ細胞浸潤を改善することによって炎症性ＴＭＥを整える（condition）ことを支持する。
実施例９
ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７の遮断が腫瘍微小環境の免疫正常化に基づくがん免疫療法を容易にし得るかどうかを試験した。腫瘍成長の阻害に対する抗ＣＤ９３の効果がＴ細胞媒介免疫応答に依存するかどうかを最初に決定した。抗ＣＤ３処置の開始時におけるｍＡｂによるＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇は、抗腫瘍効果を完全に減らしたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、わずかな影響しか有さず（図７Ａ）、このモデルにおける抗ＣＤ９３媒介腫瘍抑制におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の主要な役割を支持する。
Ｂ７－Ｈ１誘導は、抗ＣＤ９３による限られた抗腫瘍効果の原因であり得ると仮定された。実際に、腫瘍組織におけるＢ７－Ｈ１発現のアップレギュレートが、抗ＣＤ９３で処置した際に観察された（図７Ｂ）。ＣＤ３１＋腫瘍ＥＣにおけるＢ７－Ｈ１発現の増加に加えて、対照と比較して抗ＣＤ９３処置腫瘍における腫瘍細胞およびＣＤ４５＋白血球の両方においてもＢ７－Ｈ１発現の有意な増加が観察された（図７Ｃ）。したがって、抗ＣＤ９３によるＴＭＥにおけるＢ７－Ｈ１のアップレギュレーションは、抗腫瘍免疫を制限する可能性があり、これらの知見は、抗ＣＤ９３と抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法との併用療法を正当化し、この可能性をその後ＫＰＣモデルにおいて試験した。抗ＣＤ９３または抗ＰＤ－１ ｍＡｂ単独での処置は、腫瘍成長を部分的に遅延させたが、抗ＣＤ９３／ＰＤ－１ ｍＡｂの組み合わせは、このモデルにおいて腫瘍成長を著しく阻害した（図７Ｄ）。結果として、併用群の腫瘍重量は対照群の約２０％まで低減された（図７Ｅ）。より良好な抗腫瘍効果と一致して、併用療法を受けた腫瘍内の免疫細胞の分析は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の絶対数の大幅な増加を示した（図７Ｆ）。それに付随して、併用療法群において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率が有意に増加し、腫瘍関連マクロファージ（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ＴＡＭ）は大幅に減少した（図７（Ｇ））。これらの結果は、ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７の遮断が、腫瘍血管を正常化することができ、それは抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１がん標的療法の効果を増幅できることを示す。
実施例１０
本実施例は、非造血細胞上のＣＤ９３が、抗ＣＤ９３によって示される抗腫瘍免疫を媒介することを実証する。抗ＣＤ９３ ｍＡｂＢ１６は、注射すると腫瘍の腫瘍血管系上に蓄積したことが見出された（図１７Ａ）。ＥＣに加えて、ＣＤ９３は、単球、マクロファージおよび未成熟Ｂ細胞を含むいくつかの造血細胞タイプで発現されることが知られている（７１）。抗ＣＤ９３処置の抗腫瘍効果に関与するＣＤ９３の細胞源を完全に明らかにするために、致死的に照射された野生型（ＷＴ）Ｂ６マウスをＷＴまたはＣＤ９３ＫＯマウス由来の骨髄（ＢＭ）で再構成することによってＣＤ９３キメラマウスを作製した。予想通り、抗ＣＤ９３の処置は、ＢＭの供給源にかかわらず、キメラマウスにおいて腫瘍成長を阻害した（図１７Ｂ）。ＥＣは非造血細胞におけるＣＤ９３の唯一の細胞源であるので、この結果は、抗ＣＤ９３が腫瘍血管系を標的とする遮断ｍＡｂであることを確認した。
実施例１１
本実施例は、ＣＤ９３遮断がＢ１６メラノーマ腫瘍成長を阻害することを実証する。腫瘍血管系におけるＣＤ９３過剰発現が多くの固形腫瘍において観察されている（３２～３４）。同様に、腫瘍血管系におけるＣＤ９３（図１８Ａ）およびＩＧＦＢＰ７（図１８Ｂ）は両方とも、皮下Ｂ１６メラノーマにおいて著しくアップレギュレートされる。腫瘍担持マウスを遮断ｍＣＤ９３ ｍＡｂ（クローン７Ｃ１０）で処置したときに、ＣＤ９３遮断は、Ｂ１６腫瘍において腫瘍成長を有意に阻害し、腫瘍重量を低減させた（図１８Ｃ）。抗ＣＤ９３のＦａｂでの処置は、Ｆｃ媒介枯渇の可能性を除外して、Ｂ１６腫瘍成長の阻害において依然として有効であった（データは示さず）。これらのデータは、ＣＤ９３－／－マウスにおいて見られる腫瘍成長の遅延と合致する。
実施例１２
本実施例は、ＣＤ９３遮断が、マウスメラノーマにおけるＴ細胞浸潤および機能を大きく増大させることを実証する。腫瘍血管系の正常化は、腫瘍への免疫細胞トラフィッキングを増強する（１６、７４）。抗ＣＤ９３処置は、Ｂ１６腫瘍においてＣＤ３＋ＴＩＬを約３倍に増加させることが見出された（図１９Ａ）。フローサイトメトリー分析は、抗ＣＤ９３が腫瘍におけるＣＤ４５＋免疫細胞の割合（％）および密度の両方を大きく増加させることを明らかにした（図１９Ｂ）。免疫細胞組成の詳細な分析は、ＮＫおよびＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ９３処置Ｂ１６腫瘍内で増加した主要な細胞タイプであることを示した（図１９Ｃ）。抗ＣＤ９３は、ＰＤ１およびグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）Ｂの発現の増加によってさらに確認されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおけるエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）の割合（％）を有意に増加させた（図１９Ｄ）；一貫して、ＣＤ９３処置腫瘍内のＣＤ８＋ＴＩＬは、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦを含む有意により多くのエフェクターサイトカインを産生した（図１９Ｅ）。ＣＤ９３遮断はＣＤ４＋ＴＩＬの密度に影響を及ぼさなかったが、抗ＣＤ９３処置腫瘍において、相対的により多くのエフェクターＴ細胞（ＴＥＭおよびＰＤ１陽性）ならびにより少ないＴｒｅｇ細胞が存在した（図１９Ｆ）。分析はまた、Ｔｒｅｇ、顆粒球性骨髄由来サプレッサー細胞（ｇＭＤＳＣ）および腫瘍関連マクロファージ（Ｍａｃ）を含む多くの免疫抑制細胞が、抗ＣＤ９３で処置された腫瘍において有意に減少したことを明らかにした（図１９Ｃ）。ＭＤＳＣおよびマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）は、低酸素領域に優先的に局在した；ＭＤＳＣおよびマクロファージはＣＤ９３自体を発現しないため、抗ＣＤ９３処置腫瘍におけるそれらの減少は、低酸素状態の軽減によって引き起こされ得る（図１９Ｇ）。総合すると、結果は、ＣＤ９３経路の遮断が、Ｂ１６メラノーマにおける免疫に好ましいＴＭＥを整えることを支持する。
実施例１３
本実施例は、ＣＤ９３遮断が、免疫療法に対してＢ１６メラノーマの感受性を高めることを実証する。ＰＤ－Ｌ１は、多くの場合、ＴＩＬの増加の結果として、ＩＦＮ－γに応答して腫瘍組織においてアップレギュレートされる（５２）。実際に、抗ＣＤ９３で処置した際にＰＤ－Ｌ１発現のアップレギュレーションが腫瘍組織で観察された（図２０Ａ）。ＣＤ３１＋ＥＣに加えて、ＰＤ－Ｌ１発現の有意な増加が、抗ＣＤ９３によって、腫瘍細胞およびＣＤ４５＋白血球の両方において観察された（図２０Ｂ）。さらに、ＰＤ１陽性ＴＩＬは、抗ＣＤ９３処置下でＢ１６腫瘍においてより豊富であった（図１９Ｅおよび１９Ｇ）。ＴＭＥにおけるＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路のこの観察されたアップレギュレーションは、抗ＣＤ９３による抗腫瘍免疫を制限する可能性がある。Ｂ１６メラノーマモデルにおいて、抗ＣＤ９３またはＩＣＢ（ＰＤ１＋ＣＴＬＡ４遮断ｍＡｂ）単独の処置は、腫瘍成長を適度に遅延させた。しかし、抗ＣＤ９３／ＩＣＢの組み合わせは、このモデルにおいて腫瘍成長を著しく阻害した；組み合わせ群のマウスの８０％超が２０日間にわたって生存したが、対照群の全てのマウスは１５日前に死亡した（図２０Ｃ）。より良好な抗腫瘍効果と合致して、併用療法の腫瘍内の免疫細胞の分析は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を含むＣＤ４５＋免疫細胞の数の大幅な増加を示した（図２０Ｄ）。同時に、エフェクターメモリー表現型（ＴＥＭ、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌ－）を有するＴ細胞の数は、組み合わせ群においてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が有意に増加した（図２０Ｅ）。まとめると、結果は、ＣＤ９３シグナル伝達の遮断が腫瘍をＩＣＢ療法に対して感受性を高めることを支持する。
実施例１４
本実施例は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３経路の発現がＴＮＢＣ血管系においてアップレギュレートされることを実証する。ＣＤ９３は、以前に報告されたヒト原発腫瘍血管新生遺伝子シグネチャーにおける上位遺伝子の１つであり（４５）、腫瘍血管系におけるＣＤ９３過剰発現が多くの固形腫瘍において観察されている（３０、７４～７６）。ＣＤ９３は、隣接する正常乳房組織におけるものと比較して、ヒトＴＮＢＣ内の血管において明らかにアップレギュレートされることが見出された（ｎ＝５）（図２１Ａ）。ＩＧＦＢＰ７タンパク質は、隣接する正常乳房組織の血管ではほとんど検出可能でなかったが、ヒトＴＮＢＣ血管系におけるその発現は著しく増加した（図２１Ｂ）。同様に、同所性４Ｔ１マウス乳腺腫瘍モデルにおいて、腫瘍血管系におけるＣＤ９３（図２１Ｃ）およびＩＧＦＢＰ７（図２１Ｄ）の発現が両方とも劇的にアップレギュレートされた。ＢＣにおけるＩＧＦＢＰ７の臨床的関連性を評価するために、ＴＣＧＡ乳がんデータセットを解析した。興味深いことに、高ＩＧＦＢＰ７は、ＴＮＢＣにおける予後不良と関連しているが、ＥＲ陽性乳がんでは関連していない（図２２）。
実施例１５
本実施例は、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用の遮断がｉｎ ｖｉｖｏでＴＮＢＣ腫瘍成長を阻害することを実証する。４Ｔ１腫瘍担持マウスを、４Ｔ１腫瘍が触知可能になったときに遮断ｍＣＤ９３ ｍＡｂ（クローン７Ｃ１０）で処置した。腫瘍成長曲線は、抗ＣＤ９３遮断ｍＡｂの投与が腫瘍成長を有意に阻害し、したがって腫瘍重量を減少させたことを示した（図２３Ａ）。同様に、同じＣＤ９３遮断ｍＡｂは、別のマウスＴＮＢＣモデルである同所性移植ＰＹ８１１９に対しても同等の抗腫瘍効果を有していた（図２３Ｂ）。
実施例１６
本実施例は、ＣＤ９３遮断が血管成熟を促進してＴＮＢＣにおける灌流を改善することを実証する。ＣＤ９３ ｍＡｂによるＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３相互作用の遮断は、血管密度に影響を及ぼさなかった（図２４Ａ）。腫瘍血管の正常化に対するＣＤ９３ ｍＡｂの効果は、腫瘍血管におけるα－ＳＭＡ染色（図２４Ａ）および周皮細胞被覆率（ＮＧ２＋血管、図２４Ｂ）の増加によって確認された。同様の結果が、ＰＹ８１１９腫瘍モデルにおける血管成熟に対しても抗ＣＤ９３について見出された（データは示さず）。ＣＤ９３ ｍＡｂで処置した腫瘍においてＦＩＴＣ－レクチン陽性血管の２倍を超える増加があったため、ＣＤ９３遮断は腫瘍灌流を増加させた；これに伴って、抗ＣＤ９３処置による４Ｔ１腫瘍における低酸素領域（ピモニダゾール＋）は有意に少なかった（図２４Ｃ）。
実施例１７
本実施例は、ＣＤ９３を遮断した際に４Ｔ１においてＴＩＬが増加し、ＭＤＳＣが減少したことを示す。抗体処置の２週間後、ＩＦ染色によって浸潤免疫細胞を４Ｔ１腫瘍において調べた。ＣＤ９３ ｍＡｂで処置した腫瘍において、有意に多いＣＤ３＋Ｔ細胞が存在することが見出された（図２５Ａ）。ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋ＭＤＳＣは、４Ｔ１腫瘍において豊富である。興味深いことに、抗ＣＤ９３での処置は、腫瘍におけるその数を大幅に減少させた（図２５Ｂ）。腫瘍細胞懸濁液のＩＦ染色の結果を、ＦＡＣＳ分析によってさらに確認した（図２５Ｃ）。したがって、ＣＤ９３遮断は、ＴＮＢＣにおける免疫療法に好ましいＴＭＥを作り出すことができる。
実施例１８
本実施例は、ＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３がヒトがん内の脈管構造においてアップレギュレートされることを実証する。ＩＧＦＢＰ７の発現は、隣接する正常組織と比較して、ヒトがんにおいてアップレギュレートされる（図２６Ａ）。ヒトがんにおけるＣＤ９３発現は、免疫蛍光染色に基づき、主に腫瘍血管系に存在する（図２６Ｂ）。ＣＤ９３およびＩＧＦＢＰ７の両方が、ヒトメラノーマ内の血管においてアップレギュレートされる（図２６Ｃ）。
実施例１９
本実施例は、抗ＰＤ療法に抵抗性のヒトがんにおけるＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３経路の富化（enrichment）を実証する。腫瘍血管機能不全は、抗腫瘍免疫を制限し、免疫療法を大いに脅かす（１９）。ＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３の遺伝子発現を、抗ＰＤ療法下のがん患者において調べた。アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ）の治療を受けた転移性尿路上皮がんを有する患者の第ＩＩ相試験（７７）では、ＩＧＦＢＰ７およびＣＤ９３発現のベースラインレベルは両方とも、レスポンダー由来のものと比較してノンレスポンダー由来の腫瘍組織において有意に高かった（図２７Ａ）。一貫して、抗ＰＤ１治療下の転移性メラノーマ患者の小さなコホートにおいて（７８）、ベースラインＩＧＦＢＰ７レベルは、利益を受けなかった患者と比較して、抗ＰＤ１療法に応答した患者においてより低い傾向があった（図２７Ｂ）。ノンレスポンダーにおいて平均ＣＤ９３発現が増加に向かう傾向が観察されたが、この関連性は統計的有意性に達しなかった（図２７Ｂ）。要約すると、ＴＭＥにおけるＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３経路は、臨床における抗ＰＤ療法のがん抵抗性に寄与する可能性がある。
実施例２０
本実施例は、ＩＧＦＢＰ７およびＭＭＲＮ２がＣＤ９３の異なるモチーフに結合することを実証する。ＧＳＲＡライブラリー（４２）に存在しないＥＣＭタンパク質であるＭＭＲＮ２は、ＣＤ９３に対する別の公知のリガンドである。ＣＤ９３に加えて、ＭＭＲＮ２は、２つのさらなるグループ１４のＣ型レクチンメンバーであるＣＬＥＣ１４ＡおよびＣＤ２４８とも相互作用する；ＭＭＲＮ２とは対照的に、ＩＧＦＢＰ７はＣＤ９３にのみ結合し、他のいずれのＣ型レクチン分子にも結合しなかった（図２８Ａ）。ＩＧＦＢＰ７の添加は、ＭＭＲＮ２によるＣＤ９３結合に干渉せず、逆もまた同様であるので、ＭＭＲＮ２とＩＧＦＢＰ７はＣＤ９３結合に関して互いに競合しなかった（図２８Ｂ）。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＩＧＦＢＰ７で被覆したウェルとＣＤ９３タンパク質とのプレインキュベーションがＭＭＲＮ２結合をもたらしたことを裏付けた（図２８Ｃ）；これは、ＣＤ９３が同時にその２つのリガンドに結合して一緒にタンパク質複合体を形成することができることを示唆した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために使用した抗マウスＣＤ９３（クローン７Ｃ１０）が、ＣＤ９３とＭＭＲＮ２との間の相互作用も遮断することが見出された（図２８Ｄ）。点変異を有するいくつかのマウスＣＤ９３へのこれら２つのリガンドの結合を調べたところ、ＭＭＲＮ２への結合を失ったＣＤ９３変異体の２つ（Ｃ１０３ＳおよびＣ１３５Ｓ）がＩＧＦＢＰ７に大いに結合することが分かった（図２８Ｅ）。これらはすべて、ＩＧＦＢＰ７とＭＭＲＮ２がＣＤ９３上の異なる位置に結合することを支持した。
以下は、実施例で使用した方法および材料である。
細胞株、融合タンパク質および抗体
ＫＰＣ細胞は、ＫｒａｓＬＳＬＧ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ；Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ（ＫＰＣ）トランスジェニックマウスに由来する。ヒトＩＧＦＢＰ７（Ｆｃタグ）およびマウスＩＧＦＢＰ７（Ｆｃタグ）は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入した。ラット抗マウスＣＤ９３ ｍＡｂ（クローン７Ｃ１０）は、ＳＰ２ミエローマとマウスＣＤ９３－Ｉｇで免疫したラット由来のＢ細胞との融合に由来するハイブリドーマから作製した。ハムスター抗マウスＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂ（クローン２Ｃ６、６Ｆ１）は、ＳＰ２ミエローマとマウスＩＧＦＢＰ７－Ｉｇで免疫したアルメニアンハムスター由来のＢ細胞との融合に由来するハイブリドーマから作製した。ハイブリドーマ無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でハイブリドーマを適合させ、培養した。上清中の抗体をＨｉＴｒａｐプロテインＧアフィニティカラム（ＧＥ Ｈｅａａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。抗マウスＶＥＧＦＲ－２（クローンＤＣ１０１）はＢｉｏＸｃｅｌｌから購入した。抗ヒトＩＧＦＢＰ７ ｍＡｂ（Ｒ００３、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）および抗ヒトＣＤ９３（ＭＭ０１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用して、ヒトＩＧＦＢＰ７－ＣＤ９３相互作用を遮断した。市販の抗体は、記載されていない場合、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
ＩＧＦＢＰ７キメラおよびＣＤ９３－Ｆ２３８Ｌ変異体
ＩＧＦＢＰ７－ＩＧＦＢＰＬ１キメラを２ステップＰＣＲによって作製した。キメラタンパク質は類似の構造を共有し、異なる切断部位で交換したＩＧＦＢＰ７およびＩＧＦＢＰＬ１由来のドメインを含む。下流結合アッセイのために、対象トランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から上清を回収した。ＴＴＣ（フェニルアラニン）からＡＣＣ（ロイシン）にコドン配列を変化させるための鋳型として全長ＣＤ９３を使用するＰＣＲによって、フェニルアラニンからロイシンへの置換を含むＣＤ９３－Ｆ２３８Ｌ変異体を作製した（４６）。全ての構築物をシーケンシング（配列決定）によって確認した。
フローサイトメトリー
細胞表面および細胞間染色ならびにフローサイトメトリーによる分析は、以前に記載されたプロトコルに従った（７１）。死細胞をＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｂｌｕｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で除外した。フローサイトメトリー分析は、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｌｉｂｕｒまたはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）セルアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，米国ニュージャージー州）を用いて行い、次いで、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）によって解析した
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）実験
ＩＧＦＢＰ７タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ Ｈｉｓ－Ｔａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ、ＲＥＤ－ｔｒｉｓ－ＮＴＡ ２ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ ＧＭＢＨ、ドイツ、ミュンヘン）を使用して蛍光色素で標識した。１００ｎＭのストックから、サンプルをＰＢＳ＋０．０５％ Ｐ２０で２０ｎＭの濃度に希釈し、Ｐｒｅｍｉｕｍ ＭＳＴキャピラリーにロードし、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５ Ｐｉｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ ＧＭＢＨ、ドイツ、ミュンヘン）で標識の成功およびタンパク質の安定性について予備試験した。５．９μＭの組換えヒトＣＤ９３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）のストック溶液をＰＢＳ＋０．０５％ Ｐ２０で２倍ｘ１６回希釈して、５．９μＭ～１８０ｐＭの範囲に及ぶ希釈系列を作製した。各サンプルが１０ｎＭのＩＧＦＢＰ７の最終濃度を含むように、２０ｎＭのＩＧＦＢＰ７を各濃度に１：１で添加した。サンプルをＭＳＴプレミアムキャピラリーにロードし、前述の機器でマイクロスケール熱泳動について測定した。２０％のレーザー出力およびＭｅｄｉｕｍ ＭＳＴ出力のＰＩＣＯ Ｒｅｄ検出器を用いて実験を行った。この実験を、２つの複製について同じ手順で１回繰り返した。ＭＯ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ ＧＭＢＨ，ドイツ、ミュンヘン）を用いてデータを解析した。
ＥＣ培養
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入したプールされたヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）を、ＬＶＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む培地２００中で培養した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス初代大動脈ＥＣ、および捕足物を含む内皮培地はＣｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓから購入した。管形成のために、２ｘ１０５細胞／ｍｌのＨＵＶＥＣを、２４ウェルプレート中のマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）上に播種した。インキュベーション後４～６時間毎に画像を記録した。２４ウェル培養プレート（Ｃｏｍｉｎｇ ３４２２、８μｍ）に予めロードしたトランズウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）６．５ｍｍポリカーボネート膜インサートを細胞遊走モデルで使用した。２００μｌ中のｌｘｌ０５／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞を各２４ウェルインサートにロードし、異なる試薬を含む５００μｌのＦＢＳ含有培地を下部チャンバーに入れた。約２０時間後、遊走した細胞をメタノールで固定し、ギムザ溶液で染色し、光学顕微鏡下で計数した。
マウス腫瘍モデル
全ての動物ケア、実験および安楽死は、コロラド大学アンシュッツ医学部キャンパス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ａｎｓｃｈｕｔｚ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｍｐｕｓ）の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルに従って行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。６～８週齢のマウスをこれらの実験に使用した。ＫＰＣ（４ｘｌ０５）細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍が触知可能になった後、マウスを１／２×（長さ×幅２）として計算した腫瘍体積に基づいて異なる処置群に無作為化した。３００μｇ／マウスの治療抗体を週２回、計４回腹腔内注射した。腫瘍直径（長さおよび幅）の測定を、キャリパーを用いて２日または３日毎に行った。最初の処置の１４日後に、マウスを安楽死させて屠殺し、詳細な分析のために腫瘍組織を切除した。ＦＩＴＣ－レクチン、ドキソルビシン送達およびヒドロキシプローブアッセイのための腫瘍組織を、最初の処置後８日目に得た。ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）およびＣＤ９３抗体の併用療法のために、ＫＰＣ腫瘍担持マウスに、２週間にわたり週に２回、抗体での処置を開始した。ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞枯渇のために、３００μｇ／マウスの抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）または抗マウスＣＤ８β（クローン５３－５．８、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、最初のＣＤ９３ ｍＡｂ処置の１日前に腹腔内投与し、７日目に２００μｇ用量で繰り返した。抗マウスＣＤ９３ ｍＡｂ処置は、週に２回、３００μｇを投与した。
Ｂ１６腫瘍モデルについては、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウスあたり２ｘｌ０５でＢ１６メラノーマを皮下接種した。腫瘍が検出可能になった後、マウスを４つの異なる群に無作為化した：対照、ＣＤ９３ ｍＡｂ単独、５－ＦＵ単独、およびＣＤ９３ ｍＡｂ＋５－ＦＵ（組み合わせ）。ＣＤ９３ ｍＡｂ（３００μｇ、ｉ．ｐ．）処置を、無作為化の日（０日目）、４日目および９日目に投与した。５－ＦＵ（３．５ｍｇｉ．ｐ．）は、２日目および７日目に投与した。腫瘍サイズの測定を２日または３日毎に行った。腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超え、および／または潰瘍が形成された場合、腫瘍担持マウスを、生存曲線の計算について死亡とみなした。
免疫組織化学および免疫蛍光染色
免疫組織化学染色プロトコルは以前に記載されている（７２）。免疫蛍光染色のために、マウス組織サンプルを収集し、凍結組織切片作製用包埋剤（ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（ＯＴＣ）ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）を用いてドライアイス上で凍結した。次いで、凍結ブロックを７μｍで切片化し、スライドガラス上に載せた。スライドをアセトン中で固定し、２．５％ヤギ血清でブロッキングし、一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、二次抗体とともに１時間インキュベートし、ＤＡＰＩで１０分間対比染色した。次いで、スライドをきれいにして取り付けた。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２０００－Ｅ正立顕微鏡によって画像を撮影し、Ｓｌｉｄｅ Ｂｏｏｋソフトウェア（バージョン６、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．）およびＩｍａｇｅ Ｊ（バージョン１．５２Ｋ、ＮＩＨ）を使用して解析した。ＩＦ染色に使用される一次抗体には、抗ヒトＩＧＦＢＰ７（Ｒ１１５、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、抗ヒトＣＤ３１（ＪＣ／７０Ａ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、抗ヒトＣＤ９３（ＭＭ０１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、抗マウスＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、抗マウスＢ７－Ｈ１（１０Ｆ．９Ｇ２）、抗マウスＩＧＦＢＰ７（６Ｆ１）、および抗マウスＣＤ９３（７Ｃ１０）が含まれる。ＮＧ２（Ｃｙ３コンジュゲートｐＡｂ、ＡＢ５３２０Ｃ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびαＳＭＡ（１Ａ４、ｅＦｌｕｏｒ ６６０コンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色を血管周囲周皮細胞の評価に利用した。活性化インテグリンβｌは、ＢＤ ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからのＣＤ２９ ｍＡｂ（クローン９ＥＧ７）で染色した。Ｋｉ－６７（１６Ａ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および切断カスパーゼ３（＃９６６１、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）染色を、それぞれ腫瘍細胞増殖およびアポトーシスの評価のために行った。
低酸素状態および灌流測定
腫瘍低酸素状態は、３０ｍｇ／ｋｇのピモニダゾール塩酸塩（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅキット）を腫瘍担持マウスに注射した後に検出した（注射の１時間後に腫瘍を採取した）。ピモニダゾール付加物の形成を検出するために、腫瘍凍結切片を、製造業者の指示に従ってＡＰＣ－Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ ｍＡｂで染色した。低酸素腫瘍領域を、全腫瘍領域の割合（％）として表した。腫瘍担持マウスへの３０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの尾静脈注射後に、腫瘍における薬物送達を評価した。注射の１時間後に腫瘍を採取した。凍結組織切片上のドキソルビシンを、励起波長および発光波長を４８８ｎｍおよび５７０ｎｍに設定して蛍光顕微鏡によって検出した。腫瘍血管灌流は、５０μｇのＦＩＴＣ標識Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）レクチン（ＦＬ－１１７１、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ベルギー、ブリュッセル）を腫瘍担持マウスに静脈内注射した後の腫瘍凍結切片で定量した（注射の１０分後に腫瘍を採取した）。灌流領域を、ＣＤ３１＋領域の割合（％）として表されるレクチン＋ＣＤ３１＋領域として定義した。
統計学
プリズムソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、データを解析し、両側の対応のないスチューデントｔ検定を適用することによって群間の差（平均±ＳＥＭを含む）の統計的有意性を決定した。０．０５未満の全てのＰ値を統計的に有意とみなした。
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Figure 2022548980000003
特許請求される主題は、本明細書に記載される特定の実施形態によってその範囲を限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、特許請求される主題の様々な変更が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
本明細書に引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書に物理的に存在するかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (103)

  1. 必要とする対象における腫瘍またはがんを治療する方法であって、ＩＧＦＢＰ７／ＣＤ９３シグナル伝達経路を特異的に阻害するＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬の有効量を対象に投与することを含む、方法。
  2. 前記ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬が、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬が、ＣＤ９３を特異的に認識する抗ＣＤ９３抗体を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０と競合的にＣＤ９３に結合する、請求項３に記載の方法。
  5. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ｍＡｂ ＭＭ０１またはｍＡｂ ７Ｃ１０のエピトープと重複するかまたは実質的に重複するエピトープに結合する、請求項３または４に記載の方法。
  6. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＣＤ９３とＭＭＲＮ２との間の相互作用も遮断する、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＣＤ９３とＭＭＲＮ２との間の相互作用を遮断しない、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＣＤ９３上のＩＧＦＢＰ７結合部位に結合する、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＩＧＦＢＰ７結合部位の外側にあるＣＤ９３上の領域に結合する、請求項３～７のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＣＤ９３の細胞外領域に結合する、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ＣＤ９３の細胞外領域が、配列番号１のアミノ酸配列の残基２２～５８０を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＣＤ９３のＥＧＦ様領域に結合する、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
  13. ＣＤ９３のＥＧＦ様領域が、配列番号１のアミノ酸配列の残基２５７～４６９および／または２６０～４６８からなる、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＣＤ９３のＣ型レクチンドメインに結合する、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＣＤ９３のＣ型レクチンドメインが、配列番号１のアミノ酸配列の残基２２～１７４を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記抗ＣＤ９３抗体が、ＣＤ９３の長いループ領域に結合する、請求項３～９のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＣＤ９３の長いループ領域が、配列番号１のアミノ酸配列の残基９６～１４１を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記抗ＣＤ９３抗体が抗ヒトＣＤ９３抗体である、請求項３～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 抗ヒトＣＤ９３抗体が、ｍＡｂ ＭＭ０１またはそのヒト化バージョンである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記抗ＣＤ９３抗体が、全長抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディである、請求項３～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記抗ＣＤ９３抗体が融合タンパク質に含まれる、請求項３～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬がポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
  23. 前記ポリペプチドが、ＣＤ９３の細胞外ドメインまたはそのバリアントを含む阻害性ＣＤ９３ポリペプチドである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記ポリペプチドが可溶性ポリペプチドである、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 前記ポリペプチドが膜結合型である、請求項２２または２３に記載の方法。
  26. 前記阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが、ＣＤ９３の細胞外ドメインのバリアントを含む、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ポリペプチドが、ＭＭＮＲ２に対するよりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する、請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ポリペプチドが、ＣＤ９３に対するよりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する、請求項２２～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記阻害性ＣＤ９３ポリペプチドがＦ２３８残基を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく、請求項２３～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが、安定化ドメインをさらに含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記安定化ドメインがＦｃドメインである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ポリペプチドが約５０～約２００アミノ酸長である、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬が、ＩＧＦＢＰ７を特異的に認識する抗ＩＧＦＢＰ７抗体を含む、請求項２に記載の方法。
  34. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６と競合的にＩＧＦＢＰ７に結合する、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ｍＡｂ Ｒ００３またはｍＡｂ ２Ｃ６のエピトープと重複するエピトープに結合する、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＩＧＦＢＰ７と、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用も遮断する、請求項３３に記載の方法。
  37. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＩＧＦＢＰ７と、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２および／またはＩＧＦ１Ｒとの間の相互作用を遮断しない、請求項３３に記載の方法。
  38. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＩＧＦＢＰ７上のＣＤ９３結合部位に結合する、請求項３３に記載の方法。
  39. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＣＤ９３結合部位の外側にあるＩＧＦＢＰ７上の領域に結合する、請求項３３に記載の方法。
  40. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＩＧＦＢＰ７のＮ末端ドメイン（残基２８～１０６）に結合する、請求項３３に記載の方法。
  41. ＩＧＦＢＰ７のＮ末端ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列の残基２８～１０６からなる、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＩＧＦＢＰ７のＫａｚａｌ様ドメインに結合する、請求項３３に記載の方法。
  43. ＩＧＦＢＰ７のＫａｚａｌ様ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列の残基１０５～１５８からなる、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＩＧＦＢＰ７のＩｇ様Ｃ２タイプドメインに結合する、請求項３３に記載の方法。
  45. ＩＧＦＢＰ７のＩｇ様Ｃ２タイプドメインが、配列番号２のアミノ酸配列の残基１６０～２６４からなる、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、ＩＧＦＢＰ７のインスリン結合（ＩＢ）ドメインに結合する、請求項３３に記載の方法。
  47. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、抗ヒトＩＧＦＢＰ７抗体である、請求項３３～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記抗ヒトＩＧＦＢＰ７抗体が、ｍＡｂ Ｒ００３またはそのヒト化バージョンである、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が、全長抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、ＶＨＨ、Ｆｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体、ｓｃＦｖ－Ｆｖ融合体、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディである、請求項３３～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記抗ＩＧＦＢＰ７抗体が融合タンパク質に含まれる、請求項３３～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記ポリペプチドが、ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含む阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドである、請求項２２に記載の方法。
  52. 前記阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドが、ＣＤ９３に結合するがＣＤ９３を活性化しない、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドが、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒに対するよりも高い親和性でＣＤ９３に結合する、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 前記ポリペプチドが、ＩＧＦＢＰ７よりも高い親和性でＣＤ９３に結合する、請求項２２または５１～５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドが、ＩＧＦＢＰ７のＩＢドメインを含む、請求項５１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドが、安定化ドメインをさらに含む、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記安定化ドメインがＦｃドメインである、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドが、約５０～約２００アミノ酸長である、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬が、融合タンパク質、ペプチド類似体、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、または小分子化合物を含む、請求項２に記載の方法。
  60. 前記ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬が、ＣＤ９３またはＩＧＦＢＰ７の発現を低下させる、請求項１に記載の方法。
  61. 前記ＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７遮断薬が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、または遺伝子編集システムを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記対象に第２の薬剤を投与することをさらに含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記第２の薬剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、またはそれらの組み合わせである、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記第２の薬剤が化学療法剤である、請求項６２に記載の方法。
  66. 前記第２の薬剤が免疫細胞である、請求項６２に記載の方法。
  67. 前記第２の薬剤が抗血管新生阻害剤である、請求項６２に記載の方法。
  68. 前記抗血管新生阻害剤が抗ＶＥＧＦ阻害剤である、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記がんが、異常な腫瘍血管系を特徴とする、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記がんが、ＶＥＧＦの高い発現を特徴とする、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記がんが、ＣＤ９３の高い発現を特徴とする、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記がんが、ＩＧＦＢＰ７の高い発現を特徴とする、請求項１～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記がんが固形腫瘍である、請求項１～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記がんが、結腸直腸がん、非小細胞肺がん、神経膠芽腫、腎細胞がん、子宮頸がん、卵巣がん、卵管がん、腹膜がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、口腔扁平上皮がん、頭頸部扁平上皮がん、脳腫瘍、骨がん、またはメラノーマである、請求項７２に記載の方法。
  75. 前記がんがトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である、請求項７１～７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記がんは血管が豊富である、請求項７３、７４または７５に記載の方法。
  77. 候補薬剤ががんの治療に有用であるかどうかを決定する方法であって、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を破壊するかどうかを決定することを含み、候補薬剤がＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７相互作用を特異的に破壊することが示される場合にその候補薬剤はがんの治療に有用である、方法。
  78. 候補薬剤が細胞表面上のＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との相互作用を破壊するかどうかを決定することを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系において候補薬剤がＣＤ９３とＩＧＦＢ７との相互作用を特異的に破壊するかどうかを決定することを含む、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系が酵母ツーハイブリッドシステムである、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系がＥＬＩＳＡベースのアッセイである、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ系がＦＡＣＳベースのアッセイである、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記候補薬剤が、抗体、ペプチド、融合ペプチド、ペプチド類似体、ポリペプチド、アプタマー、アビマー、アンチカリン、シュピーゲルマー、または小分子化合物である、請求項７７～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 候補薬剤をＣＤ９３／ＩＧＦＢＰ７複合体と接触させることを含む、請求項７７～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 請求項７７～８４のいずれか一項に記載の方法によって同定される薬剤。
  86. ＣＤ９３の細胞外ドメインを含むバリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドであり、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する、天然に存在しないポリペプチド。
  87. バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが膜結合型である、請求項８６に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  88. バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが可溶性である、請求項８６に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  89. バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが、ＭＭＮＲ２に対するよりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  90. バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが、ＣＤ９３よりも高い親和性でＩＧＦＢＰ７に結合する、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  91. バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドがＦ２３８残基を含み、アミノ酸の番号付けは配列番号１に基づく、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  92. バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが、安定化ドメインをさらに含む、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  93. 前記安定化ドメインがＦｃドメインである、請求項９２に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  94. バリアント阻害性ＣＤ９３ポリペプチドが、約５０～約２００アミノ酸長である、請求項８６～９３のいずれか一項に記載の天然に存在しないポリペプチド。
  95. ＩＧＦＢＰ７のバリアントを含み、ＣＤ９３とＩＧＦＢＰ７との間の相互作用を遮断する、天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  96. ＣＤ９３に結合するがＣＤ９３を活性化しない、請求項９５に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  97. ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、および／またはＩＧＦ１Ｒに対するよりも高い親和性でＣＤ９３に結合する、請求項９４または９６に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  98. ＩＧＦＢＰ７よりも高い親和性でＣＤ９３に結合する、請求項９５～９７のいずれか一項に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  99. ＩＧＦＢＰ７のＩＢドメインを含む、請求項９５～９８のいずれか一項に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  100. 安定化ドメインをさらに含む、請求項９５～９９のいずれか一項に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  101. 前記安定化ドメインがＦｃドメインである、請求項１００に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  102. 約５０～約２００アミノ酸長である、請求項９５～１０１のいずれか一項に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチド。
  103. 請求項８５に記載の薬剤、請求項８６～９４のいずれか一項に記載の天然に存在しないポリペプチド、または請求項９５～１０２のいずれか一項に記載の天然に存在しないバリアント阻害性ＩＧＦＢＰ７ポリペプチドと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物。

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