JP2022545341A - アフリカ豚熱を治療するための薬物組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

ＮＯ弱毒化剤、ＮＯ増量剤及び一酸化窒素合成酵素誘導剤を含む、体内で安全量の一酸化窒素を産生する薬物組成物及びその使用である。汎用性が強く病原微生物感染を極めて効果的に治療する薬物組成物を提供する。ＮＯ弱毒化剤は５－メチルテトラヒドロ葉酸、ＮＭＮ及びデヒドロアスコルビン酸から選択され、ＮＯ増量剤はアルギニンから選択され、一酸化窒素合成酵素誘導剤は植物性血球凝集素から選択される。５－メチルテトラヒドロ葉酸の新たな薬用活性を提供し、病原体感染による免疫系に対して多種の活性作用を果たし、ウイルス感染及びそのほかの病原体感染による疾患を治療又は予防するために用いられる。特に、組成物はアフリカ豚熱を予防又は治療するために用いられる。

Description

本願は、２０１９年８月６日に中国国家知識産権局に出願された特許番号が２０１９１０７１９５４４．６で、発明の名称が「安全な一酸化窒素組成物及びその使用」である先行出願の優先権を主張し、上述した先行出願の内容のすべてが援用により本願に組み込まれる。
本発明は、医薬の分野に属し、具体的には、安全で十分量の一酸化窒素を提供して疾患の予防と治療に使用できる、動物体内で一酸化窒素を産生できる薬物組成物に関する。

アフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ、ＡＳＦ）は、アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ、ＡＳＦＶ）による急性、熱性、高度接触性、致死性の動物伝染病である。ＡＳＦＶの主宿主は各品種の飼育豚、アフリカやユーラシアイノシシ、ヒメダニなどであり、そのうち、イボイノシシ及びカワイノシシはいずれも感染されるが、臨床症状が現れない。イボイノシシなどのアフリカイノシシ及びヒメダニはＡＳＦＶの宿主である。ＡＳＦＶの毒力に応じて、ＡＳＦの臨床症状および感染過程に顕著な差異があり、最も急性及び急性感染の死亡率が１００％である。

アフリカ豚熱に有効な予防ワクチンもなく、特効治療薬もない。各段階の飼育豚、イノシシ及び軟ダニはアフリカ豚熱の自然宿主であり、飼育豚とイノシシとの間で直接伝播することができ、ダニの刺咬により伝播することもでき、ウイルスに汚染された生ごみ、飼料及びドライ塩漬ハムなどの豚肉製品により国家や地区の間で伝播することもできる。流行が発見されると、殺処分される必要があり、全世界で豚に危害を与える最も深刻な伝染病の一つであり、中国が予防に着目するナンバーワンの外来動物疾患である。

人間の歴史では、新しいウイルスが絶えずに出てきて、既知のウイルスが変異し続けた。新しい伝染性ウイルスに対して、人体内では対応する特異性抗体がないため、準周期的に大規模の感染が発生した。人間のいくつかのインフルエンザウイルスパンデミックで、多数の人間の命を奪ってしまった。２００９年、米国とメキシコではＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスが流行し、２０２０年、全世界でＣＯＶＩＤ－１９ウイルスが流行してきた。個体によっては、同じインフルエンザウイルスに感染するが、結果が異なり、ある患者が命を失うのに対して、ある患者はほとんど症状がない。ウイルスの毒力が異なる可能性があるが、宿主の免疫状態も重要である。

インフルエンザウイルス感染を予防及び治療する必要があるとき、抗体が最適な手段であるが、インフルエンザウイルスの発展が速く、季節性インフルエンザウイルスに対する抗体の選択的圧力によりエスケープ変異体が出てきて、これらの変異体により早期菌株免疫コミュニティで流行病を引き起こしてしまい、これは季節性インフルエンザワクチンを常に更新する必要がある原因となる。残念ながら、抗体反応の特異性もインフルエンザパンデミックの元となる。前世紀では、１９１８、１９５７、１９６８、２００９、２００１及び２０２０年にそれぞれＡ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ（Ｈ２Ｎ２）、Ａ（Ｈ３Ｎ２）、Ａ（Ｈ１Ｎ１）、ＳＡＲＳコロナウイルス及びＣＯＶＩＤ－１９を含むインフルエンザウイルス又はコロナウイルスが複数回大流行した。面白いのは、上述したインフルエンザウイルス感染の流行中、宿主の重篤度は巨大の差がある。ある学者によると、免疫細胞のうち、特にＴ細胞の感染と活性化の差異により、インフルエンザウイルスに抵抗する能力に差異があることが証明された［Ｋｅｌｓｏ，Ａｎｎｅ．ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｌｉｍｉｔ ｔｈｅ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２，１８（２）：２００－２０２．］。

Ｔ細胞は交差保護免疫を媒介することができ、ウイルス感染を予防できないが、感染した上皮細胞又は抗原提示細胞の表面上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と複合するウイルスタンパク質（エピトープ）断片を認識することにより、感染した細胞を感知できる証拠がある。Ｔ細胞がウイルスの内部保存タンパク質に由来するエピトープを優先的に認識するので、交差保護免疫は、予め存在する細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞によるものと考えられ、これらの細胞は、これらの保存エピトープを提示するウイルス感染細胞を殺し、抗体保護の欠乏によるパンデミックウイルス感染の時間及び重篤度を低減する。

アフリカ豚熱ウイルスが独特の性質を有するので、感染から回復する豚から中和抗体を誘導してウイルスの再発にさらに抵抗することはない。非中和抗体の存在によりアフリカ豚熱にＡＤＥ（抗体依存性増強）効果が起こる可能性があり、すなわち、抗体の存在で、ウイルスの感染を防止しないよりも、逆にウイルスの感染及び関連疾患の病理過程を促進する。同時に、非中和抗体の存在により、弱毒化ワクチンの免疫保護を受けた豚で抗原陽性が持続している。報告［Ｄｉｘｏｎ Ｌ Ｋ，Ｉｓｌａｍ Ｍ，Ｎａｓｈ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｅｖａｓｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１９．］では、作者は、アフリカ豚熱ウイルスの免疫回避戦略を説明して分析した。ＳＦＶ ｐＡ１７９ Ｌ Ｂｃｌ－２ファミリータンパク質は、いくつかのＢＨ３のみのドメインアポトーシス促進タンパク質に結合してそれを抑制する。ｐＡ２２４ Ｌ ＩＡＰファミリータンパク質はｃａｓｐａｓｅ ３に結合してそれを抑制し、ＮＦ－ｋＢシグナル伝達を活性化させ、抗アポトーシス遺伝子（ｃＦＬＩＰ、ｃＩＡＰ２及びｃ－ｒｅｌを含む）の発現を増加させる。上述した機構の存在により、アフリカ豚熱ウイルスが感染細胞のアポトーシスを抑制し、ウイルスの連続複製を確保することができる一方、ＴＮＦ－αにより感染されていないリンパ球のアポトーシスを誘導する。急性ＡＳＦＶ疾患の特徴は主にリンパ組織と血液中のＢとＴリンパ球の大量アポトーシスである。

抗生物質の発見のため、細菌感染に対して良好な臨床的治療手段があるが、ウイルスに対しては、いまだに良好な治療手段がない。現在、ウイルスに対する治療薬物は主として、Ｍ２イオンチャネル遮断薬とノイラミニダーゼ阻害薬の二つに分類され、Ｍ２イオンチャネル遮断薬は、全体的なウイルス抵抗効果及び神経系に対する副作用があるので、臨床的応用が理想的ではない。ノイラミニダーゼ阻害薬は、ウイルスを誘導できるが、効果が弱い。近年、鳥インフルエンザウイルス、アフリカ豚熱ウイルス、ＳＡＲＳウイルスといった大量のウイルスが爆発的に流行し、これらのウイルスの毒物学的効果が非常に深刻であり、患者又は患畜に対して医師でも良好な治療手段を与えられない。新しいウイルスに対して良好な治療手段がないだけでなく、デングウイルス、エイズウイルスなどを含む、長期間存在した多くのウイルスに対しても対応方法はない。ウイルスを治療する最適な方案は予防、つまり、ワクチンであり、人体の免疫系によりウイルスを予防する効果を達成する。以上の事実も、ウイルスの治療に対して、抗生物質といった病原体を直接殺滅又は抑制する薬物を開発するという構想は実に労力が倍なのに成果が半分であると証明された。

抗ウイルス薬物の開発には新たな構想が必要である。ウイルス感染を治療する効果を達成するためのヒト免疫系の使用は、特にＮＯ及び免疫に関する薬物にとって、汎用性が強い抗ウイルス効果を実現するために重要な方向である。

一酸化窒素ガスは、無色無臭で、水、アルコール類、脂肪に可溶である。前世紀の８０年代以前、一酸化窒素は通常で不要な化学ガスにすぎず、自動車排気及びある化学過程のガス汚染物に存在することしか知られていない。１９８０年より２７年の前、内皮細胞から産生される物質（「内皮由来弛緩因子」と呼ばれる）が発見され、１９８６年に、Ｉｇｎａｒｒｏが提出した初めての実験論文から、内皮由来弛緩因子（ＥＤＲＦ）が一酸化窒素であると主張した。これらの成果により、ＮＯに対する注目及び検討に巨大な興味を誘発された。ＮＯは細胞に迅速に出入りし、シグナルを伝達して血管拡張、神経伝達、脳の発育、ひいては学習及び記憶を調節し、免疫を強化して一部の外来微生物を殺滅することができ、血圧の低下や卒中、心臓病、腫瘍、老年期痴呆の予防ができる。

ＮＯは、Ｌ－アルギニンから一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の触媒でＮＡＤＰＨにより還元されたものであり、一酸化窒素合成酵素は、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）に分けられる。それらはそれぞれ、ヒトの異なる組織細胞において、それぞれ心脳血管系の調節、免疫調節、神経系の調節に関与する。

免疫に関与するＮＯは、様々な免疫細胞（樹状細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球および好中球）から産生され、ｉＮＯＳが発現される場合、多量のＮＯが発生し、ヒトの能動的防御機構となる。ＮＯがウイルスのコピーを抑制できる証拠があり、関連機構には、ウイルススパイクタンパク質のパルミトイル化の低下、ウイルスプロテアーゼの抑制、ウイルスタンパク質及び核酸の合成の阻害が含まれる。

一酸化窒素合成酵素はダイマーであり、酸化条件下で脱共役し、本来ＮＯを合成する反応経路を変換させてＯ₂－、ＮＯ₃－（ＰＯＮ）などの活性酸素ラジカル（ＲＯＳ）を生成する。また、ＮＯ自身も活性酸素ラジカル（ＲＯＳ）と反応して活性窒素（ＲＮＳ）を生成できる。

ＮＯは体内で超酸化物アニオンと迅速に反応して過酸化亜硝酸を生成する。酸性条件下で、迅速に分解して水酸基ラジカルを産生する。過酸化亜硝酸は酸化性が極めて強い物質であり、タンパク質のニトロ化や、ＤＮＡ鎖の破断に繋がる。様々な原因で、生体内で、活性酸素及び活性窒素を同時に含む多くの酸化性ラジカルが産生される。これらのラジカルの存在により、過去のバランスをある程度破壊した。これらのラジカルのうち、最も大きな影響を与えるのは、過酸化亜硝酸アニオン（ＰＯＮ）である。その生成経路としては、主に一酸化窒素と超酸化物アニオンとの反応により得られる。

ＰＯＮは、人体内での作用がほとんどネガティブであり、以下を含むがそれに限らない。
１．酸化作用：ＰＯＮ自身は強い酸化剤であり、酸性条件下で迅速に二酸化窒素と水酸基ラジカルに分解される。水酸基ラジカルはより強い酸化剤であり、ほとんどすべての有機物を酸化分解できる。生体内では、ＰＯＮは多くの酵素、タンパク質、サイトカインなどの鉄／硫黄中心、メルカプト、脂質などと反応して酸化ダメージを引き起こし、細胞機能の損傷及びアポトーシスをきたし、さらに、グルタチオンによるラジカルの除去機構を低下させ、悪循環となる。ＰＯＮ酸化作用により、例えば急性慢性炎症、敗血症、外傷性局所的虚血、動脈硬化、神経再生性失調などの各種の疾患を引き起こす可能性がある。
２．ニトロ化作用：ＰＯＮはタンパク質におけるチロシンと反応してニトロチロシンを生成してタンパク質の機能に影響することができ、ＤＮＡ破断などの結果をきたす。
３．エネルギー代謝に対する影響：チモプロテインは酸化作用及びニトロ化作用により活性が低下する。例えばミトコンドリアのＡＴＰ合成酵素、アコニターゼの活性が抑制され、エネルギーが減少する。ＰＯＮはポリＡＤＰ－リボース合成酵素の強い活性化物である。当該酵素は、活性化されると無効な修復循環を開始させ、エネルギーセルが迅速に枯渇する。細胞代謝及び膜の完全性が破壊され、細胞死を引き起こす。
４．カルシウム輸送の干渉：Ｎａ⁺／Ｃａ²⁺交換タンパク質のメルカプトが酸化され、機能障害が起こり、細胞内のカルシウム過負荷に繋がり、機能障害をきたす。
もちろん、耐用量のＰＯＮも、ウイルス、病菌、病原虫、癌細胞などによる人体に対する危害に抵抗するといったポジティブな作用を示す。

１９９２年のスター分子であるＮＯは、実際に生体内の所々に存在する。ＮＯは、免疫系のメッセンジャーであり、血流の調節、神経伝達、脳の発育などで重要な役割を果たし、病菌、ウイルス、病原虫、癌細胞を殺滅することができ、非特異的免疫に非常に重要な組成部分である。ＮＯで殺滅された外来微生物又は異常細胞が自己分解してから多量の抗原物質を放出し、特異的免疫を開始させる。ＮＯもまた、生体にインターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ、コロニー刺激因子ＣＳＦ等の多くのサイトカインを放出させ、免疫応答を調節する。

ＮＯは超酸化物アニオンなどのラジカルと反応して過酸化亜硝酸塩（ＰＯＮ）が生成され、酸化性が極めて強く、特別なニトロ化能力を有し、一定の程度まで堆積すると炎症を起こしてしまい、病理過程に影響するサイトカインを放出する。ＰＯＮはタンパク質ニトロ化によりタンパク質機能を破壊し、ＤＮＡを破断し、ウイルスの変異を促進し、免疫バランスを破壊し、癌原遺伝子を活性化し、癌を誘発する。

ＮＯは免疫調節に関与する。急性炎症反応は複雑で高度に調和したイベント配列であり、分子、細胞及び生理学的変化に関し、宿主が感染に対する反応が失調すると、さらに異常免疫応答が発生し、臓器機能障害の症候群、すなわち膿毒症（Ｓｅｐｓｉｓ）が発生する。膿毒症の治療の研究は、人間が病態生理学及び宿主－微生物の相互作用に対する理解の進歩を反映する。初期に微生物及びその病原性が注目され、２０世紀８０年代に分子クローンの実施及びヒト炎症遺伝子のシーケンシングに伴い、膿毒症の研究では、宿主の侵入病原体に対する反応により注目してきた。

２０１６年の膿毒症３の国際会議（Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｓｅｐｓｉｓ）によると、膿毒症は、宿主の感染に対する反応失調による生命を脅かす臓器機能障害と定義され、その臨床的症状は発熱、頻呼吸、意識レベル変化及び低血圧であり、そして例えば肺感染による肺炎、腎臓感染、尿路感染など、当該疾患の関連症状を伴う。

膿毒症の由来、発展に対する認識は従来より大幅に高まっているが、膿毒症の死亡率は依然として非常に高く、［Ｈｏｔｃｈｋｉｓｓ Ｒ Ｓ，Ｍｏｌｄａｗｅｒ Ｌ Ｌ、Ｏｐａｌ Ｓ Ｍ、ｅｔ ａｌ．Ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ、２０１６、２（１）：１－２１．］という文章によると、高収入国家のデータに対する初期推定から、全世界では、毎年３１５０万例の膿毒症及び１９４０万例の重症膿毒症が発生し、毎年５３０万人が死亡する可能性があることが示される。多くの場合に、特に慢性疾患（例えば癌症、うっ血性心不全及び慢性閉塞性肺疾患）に罹患している患者では、公式な死亡記録は、一般的に直接的な死亡原因（膿毒症）ではなく、潜在的疾患を報告するので、膿毒症の死亡率が顕著に少なく見積もられている可能性がある。また、関連する発症率及び低収入、中収入国家での膿毒症の死亡率記録が欠けているので、これらの値は推定にすぎない。

炎症は、侵入病原体に対する宿主の防御反応であるので、抗生物質薬物又は抗ウイルス薬物を用いて病原体抗原の外来刺激を減少させることは、臨床上優先的に採用される病原体を除去する治療方案である。ウイルス感染性疾患が免疫失調段階に進行すると、重篤な炎症が起こってしまう。炎症を停止させる又は炎症に抵抗するいくつかの療法により、炎症領域のマクロファージ数が減少されるので、免疫応答を向上させるか低下させるかは常に決められにくい。よく見られる抗炎症薬物には、非ステロイド性抗炎症薬、糖質コルチコイドなどがある。重症炎症が発生したとき、一般的には臨床上糖質コルチコイドを用いるが、膿毒症に対しては、コルチゾールの使用は実質的な利益がない。ランダム対照試験［Ａｎｎａｎｅ Ｄ、Ｃａｒｉｏｕ Ａ、Ｍａｘｉｍｅ Ｖ、ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ［Ｊ］．Ｊａｍａ、２０１０、３０３（４）：３４１－３４８．］から、フルドロコルチゾンにより膿毒症患者の死亡率を低下させることはないことが示される。その後の抽出分析［Ｗａｎｇ Ｃ、Ｓｕｎ Ｊ、Ｚｈｅｎｇ Ｊ、ｅｔ ａｌ．Ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｕｔ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｒｅｄｕｃｅ ２８－ｄａｙ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ：ａ ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌｓ［Ｊ］．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ＆ Ａｎａｌｇｅｓｉａ、２０１４、１１８（２）：３４６－３５７．］からも、ヒドロコルチゾンにより重症感染患者又は膿毒症の死亡率を低下させることができないことが示される。従って、現在臨床的に重症感染患者にステロイドを使用することは争議がある。

過去の２０年内では、ビタミンＣと膿毒症との関係を明らかにする試みが行われている。膿毒症患者は一般に血清ビタミンＣレベルが非常に低く、重症患者の低いビタミンＣレベルは血管加圧、腎臓損傷、多臓器機能障害及び死亡率の増加に関すると考えられる。ビタミンＣの作用機構に対する研究により、抗酸化、抗炎症、マイクロ循環、抗血栓、副腎感受性の増加、創傷治癒促進などを含む、膿毒症に作用する可能性がある多種の機構が発見された。しかしながら、意外にも、ビタミンＣの臨床使用には顕著な効果が見られず、［常雪●（●は女へんに尼）、李敏、張正馨他 ビタミンＣの膿毒症及び膿毒症性ショック患者の治療における効果のＭｅｔａ分析［Ｊ］．中華危重症医学雑誌（電子版）、２０１９、０１２（００１）：３７－４１．］による統計から、ビタミンＣの静脈注入により、膿毒症及び膿毒症性ショック患者の病死率を改善することができない。

５－メチルテトラヒドロ葉酸は、人体での葉酸の活性形態であり、直接的な抗ウイルス作用が見られない。現在、葉酸とウイルスとの直接関係は主に葉酸受容体α（ＦＲａｌｐｈａ）にあり、エボラなどを含むウイルスが細胞に侵入することを媒介する因子と述べられた。５－メチルテトラヒドロ葉酸は、直接的な抗酸化作用を有し、ジヒドロ葉酸還元酵素の作用により、ＢＨ２からＢＨ４への変換を促進し、ＢＨ４がｅＮＯＳに必要な補助因子であることは公知である。５－メチルテトラヒドロ葉酸はｅＮＯＳを促進することにより、心血管疾患の予防及び保護に有利であることは既に証明されたが、先天性免疫活性化の条件下で５－メチルテトラヒドロ葉酸のｉＮＯＳ及びマクロファージによるＮＯ分泌に対する影響について研究や報告がほとんどない。

Ｌ－アルギニンはＮＯの内因性合成の前駆体であり、一酸化窒素合成酵素の作用で反応してＮＯ及びＬ－シトルリンを生成し、Ｌ－アルギニンのわずかの一部がこのような経路を経て体内で代謝されるが、急性炎症の場合には、マクロファージのｉＮＯＳから産生されるＮＯはヒトでの通常量を遥かに超えてしまう。Ｌ－アルギニンは非必須アミノ酸であり、プロリン、グルタミン又はグルタミン酸の代謝経路で内因性合成され（全身タンパク質分解過程による）、腎臓では、シトルリンは、アルギニンコハク酸シンターゼ及びアルギニンコハク酸分解酵素の作用によりアルギニンに変換されるが、アルギニンの内因性合成が生体の代謝ニーズを満たせないと、異なる病態生理条件下で非常に重要となる。

本発明によれば、５－メチルテトラヒドロ葉酸が「薬理」濃度で「栄養支持」の低濃度と異なる生理学的活性を有し、５－メチルテトラヒドロ葉酸を含有する組成物はウイルス感染を治療する作用を有することが見出され、細菌、真菌などを含む異なる病原体のいずれに対しても治療効果があることがさらに見出された。本発明によれば、デヒドロアスコルビン酸及びＮＭＮの活性が５－メチルテトラヒドロ葉酸と類似することがさらに見出された。

以上の発見に基づき、本発明は、以下の技術方案を提供する。
動物体内で安全量の一酸化窒素を産生する、すなわち体内での活性窒素の割合を制御又は低減することができる薬物組成物であって、体内で産生される一酸化窒素を疾患の予防及び治療に必要な量にすることができる、薬物組成物。

本発明にかかる薬物組成物は、投薬量で過酸化亜硝酸又はその塩（ＰＯＮ）を除去する抗酸化物質から選択されるＮＯ弱毒化剤と、任意のＮＯ増量剤を含む。好ましくは、前記弱毒化剤は、１０μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現を抑制せず、例えばＬＳＰ誘導によるマクロファージにおけるｉＮＯＳの発現を抑制しない。

本発明にかかるＮＯ弱毒化剤は、ｉＮＯＳ合成酵素の活性化に影響を与えず、かつ過酸化亜硝酸塩を選択的にクエンチする抗酸化物質から選択される。例としては、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、デヒドロアスコルビン酸、ＮＭＮから選択される１つ又は複数である。

本発明にかかるＮＯ増量剤は、Ｌ－アルギニン又はその塩、シトルリン又はその塩、或いはアルギニン活性化添加剤から選択される酵素由来ＮＯ基質から選択される。

本発明にかかる薬物組成物は、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩及びアルギニン又はその塩を含む。さらには、植物性血球凝集素を含んでもよい。

本発明にかかる薬物組成物において、前記５－メチルテトラヒドロ葉酸は一回量で１５ｍｇ以上であり、前記アルギニンは一回量で５０ｍｇである。

本発明は、病原微生物感染による疾患を予防又は治療する薬物を調製するための、上述した薬物組成物の使用をさらに提供する。好ましくは、前記病原微生物感染はウイルス感染である。

本発明にかかる薬物組成物の使用によれば、ウイルスに感染した宿主のＴ細胞、特にＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のレベルを高め、炎症因子の発現を低下させ、抗ウイルス感染に用いることができる。

本発明にかかる薬物組成物の使用によれば、前記ウイルスがインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、アフリカ豚熱ウイルス、ＣＯＶＩＤ－１９のようなコロナウイルスである。

特に、本発明は、ＮＯ弱毒化剤とＮＯ増量剤を含む、豚熱を予防及び治療するための薬物組成物を提供し、前記ＮＯ弱毒化剤は、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、デヒドロアスコルビン酸、ＮＭＮから選択される一つ又は複数であり、前記ＮＯ増量剤はアルギニン、シトルリン又はアルギニン活性化添加剤から選択される一つ又は複数である。

本発明にかかる前記豚熱を治療する組成物によれば、５－メチルテトラヒドロ葉酸とアルギニンを含む。さらには、植物性血球凝集素を含んでもよく、三者の質量比が２：８：１である。

本発明にかかる前記豚熱を治療する組成物によれば、前記豚熱がアフリカ豚熱である。

本発明にかかる前記豚熱を治療する組成物によれば、前記組成物は、ウイルスに感染した宿主のＴ細胞、特にＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のレベルを高め、炎症因子の発現を低下させ、抗ウイルス感染に用いることができる。

本発明にかかる前記豚熱を治療する組成物によれば、前記組成物は、一回量での活性成分が少なくとも３０ｍｇ／キログラムであり、例えば５０ｍｇ／キログラムである。本発明にかかる薬物組成物の使用によれば、前記組成物は感染による膿毒症、全身性炎症反応症候群を予防及び治療する薬物を調製するために用いられる。

本発明にかかる薬物組成物によれば、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩及びビタミンＣを含む。好ましくは、前記５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとビタミンＣとの質量比が２：１～５：１であり、例えば３：１、４：１である。

本発明は、非感染性原因による全身性炎症反応症候群、膿毒症を治療する薬物を調製するための、上述した薬物組成物の使用をさらに提供する。

本発明にかかる薬物組成物の使用によれば、前記膿毒症は、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、緑膿菌、インフルエンザウイルス感染によるものである。

本発明にかかる薬物組成物よれば、活性成分及び薬学的に許容できる副原料から調製されてもよく、例えば、前記薬物製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、外用ハップ剤又はスプレイ剤から選択される。

本発明にかかる薬物組成物によれば、免疫アジュバントである。

本発明において、安全量の一酸化窒素とは、一酸化窒素を用いて疾患を予防及び治療する安全欲求を満たせるように、一酸化窒素のうち、過酸化亜硝酸をはじめとした毒性ラジカル、活性窒素へ変換する割合が制御可能である。これらのラジカルは、体内で物質及びエネルギーの代謝に大きく影響し、細胞及び組織の機能に影響し、さらに細胞及び組織の機能を破壊し、遺伝子突然変異の確率を著しく向上させ、多くの疾患の発生の原因となる。

本発明の組成物は、毒性ラジカルを制御することにより、疾患を予防及び治療するニーズを満たせるまで一酸化窒素の産生量を効果的に向上させる。

本発明において、安全量の一酸化窒素を産生する薬物組成物は、多種の疾患の治療に応用する見通しがある。本発明の組成物は、Ｔ細胞の増殖及び活性化を促進し、感染過程での宿主のＣＤ４及びＣＤ８細胞のレベルを高め、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のアポトーシスを遮断し、宿主の生存率を著しく向上させ、感染過程での炎症反応を改善することができる。

本発明では、インフルエンザウイルスに感染したマウスに５－メチルテトラヒドロ葉酸、アルギニンを含有する組成物を投与することにより、治癒割合が高い結果が得られ、かつ病気の経過が顕著に短縮される。

葉酸の機能として主に炭素移動であり、ＤＮＡのメチル化や、プリン及びチミンの合成に関与し、さらにＤＮＡ及びＲＮＡを合成する。ウイルスは、ＤＮＡ又はＲＮＡの構造で、宿主細胞で大量にコピーし、十分な葉酸を供給することによりウイルスのコピーと伝播に寄与すべきであると考えられるが、実験の結果から、意外にも５－メチルテトラヒドロ葉酸は一酸化窒素増量剤と協同して逆にウイルスを抑制する。本発明は、５－メチルテトラヒドロ葉酸とアルギニンなどの組成物を、微生物感染、特にウイルス感染に応用することをはじめて提案する。

ｉＮＯＳは、免疫系でＮＯを生成するキー酵素であり、従来技術より、当該酵素の酸化によりダイマーの脱共役を引き起こし、ＮＯを生成する反応経路を、ラジカル、活性窒素を生成する反応経路へ変換させることが知られている。５－メチルテトラヒドロ葉酸は内因性抗酸化剤であり、ＮＡＤＰＨを活性化させることができ、良好な抗酸化効果を達成し、直接的な抗酸化作用を有する。本発明の組成物によれば、病原体に感染した生体では、ＮＯを産生するとともに、活性酸素（ＲＯＳ）及び活性窒素（ＲＮＳ）を含む生体に不利なラジカルを産生しないようにすることができる。本発明により、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、デヒドロアスコルビン酸、ＮＭＮを含む抗酸化剤が、ｉＮＯＳ発現の機能に影響を与えずに、過酸化亜硝酸塩を除去することができる。

本発明は、体内で十分量の一酸化窒素を産生する方法を提供する。本発明の組成物は、過酸化亜硝酸塩の生成を抑制し、かつ一酸化窒素合成酵素の活性を抑制せずに向上を誘導し、さらに酵素由来一酸化窒素基質であるアルギニン及びその前駆体を増加させることにより、体内で十分量の一酸化窒素を産生させる。

本発明において、十分量という概念は、疾患の予防及び治療に必要な一酸化窒素の最小投与量を達成したり超えたりすることをいう。

本発明は、十分量の一酸化窒素を提供するために、系統的な方案を提供し、必要に応じて選択して最適化することができる。一酸化窒素の産生量を高めるために、組成物には、植物性血球凝集素のような一酸化窒素合成酵素誘導剤を使用してもよい。植物性血球凝集素ＰＨＡは、有糸分裂促進因子であり、効率的で安全な一酸化窒素合成酵素誘導剤であり、マメ科植物から抽出する技術により既に大規模生産することができた。本発明の他の目的は、上述した安全な一酸化窒素組成物の使用を多種提供する。

本発明の組成物における活性成分には、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩が含まれる。前記塩はカルシウム塩、アルギニン塩、グルコサミン塩、ナトリウム塩から選択されるが、それらに限らない。

一つの好ましい実施形態において、本発明における一回量あたりの組成物における５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の量が１５ｍｇ以上であり、好ましくは２５ｍｇ以上、より好ましくは５０～１０００ミリグラムである。

ある実施形態において、組成物には、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、或いはデヒドロアスコルビン酸又はＮＭＮ、及びアルギニンが含まれる。一回量あたりの組成物に含まれる５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の量が１５ｍｇ以上であり、好ましくは２５ｍｇ以上であり、好ましくは５０～１０００ミリグラムであり、より好ましくは５０～５００ミリグラムである。例としては、アルギニンの量が５０～５０００ミリグラムであり、好ましくは１００～１０００ミリグラムである。

ある実施形態において、組成物には、５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩、アルギニン及び植物性血球凝集素ＰＨＡが含まれる。単位用量あたりの組成物に含まれる５－メチルテトラヒドロ葉酸又はその塩の量が１５ｍｇ以上（５－メチルテトラヒドロ葉酸換算）であり、好ましくは２５ｍｇ以上であり、好ましくは５０～１０００ミリグラムであり、より好ましくは５０～５００ミリグラムである。単位用量あたりの組成物におけるアルギニンの量が５０～５０００ミリグラムであり、好ましくは１００～１０００ミリグラムである。単位用量あたりの組成物における植物性血球凝集素の量が１０～５００ミリグラムであり、好ましくは２０～１００ミリグラムである。

前記薬物製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤、外用ハップ剤又はガス製剤から選択されてもよい。

ＮＯにより誘導されるＨＩＦ－１αの安定化及びリン酸化のｐ５３レベルは活性酸素により低下する［Ｔｈｏｍａｓ ＤＤ、Ｒｉｄｎｏｕｒ ＬＡ、Ｅｓｐｅｙ ＭＧ、ｅｔ ａｌ．Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｌｕｘｅｓ ｌｉｍｉｔ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００６；２８１（３６）：２５９８４-２５９９３．］。実際に、抗酸化剤の添加は、ニトロソ化シグナルに対して保護作用がある［Ｅｄｉｒｉｓｉｎｇｈｅ Ｉ、Ａｒｕｎａｃｈａｌａｍ Ｇ、Ｗｏｎｇ Ｃ、ｅｔ ａｌ．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ－ｓｍｏｋｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ／ｎｉｔｒｏｓａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｍｐａｉｒｓ ＶＥＧＦ－ ａｎｄ ｆｌｕｉｄ－ｓｈｅａｒ－ｓｔｒｅｓｓ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ［ｒｅｔｒａｃｔｅｄ ｉｎ：Ｒａｈｍａｎ Ｉ．Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３ Ａｐｒ ２０１８（１２）：１５３５］．Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．２０１０；１２（１２）：１３５５-１３６９．］。そのため、ＮＯレベル及びその後の下流シグナルの伝達は活性酸素により調節され、それも酸化還元シグナルを調節する要素である。

ｉＮＯＳの発現には、ＳＴＡＴとＮＦ－κＢを同時に活性化する必要があり、ＮＦ－κＢは、炎症の主スイッチとし、Ｈ₂Ｏ₂の産生に関し、ＮＦ－κＢが酸化還元により調節される。大部分の還元剤又は抗酸化剤はある程度で抗炎症作用を有し、ＮＦ－κＢ通路を抑制することにより、ｉＮＯＳの発現を抑制することができる。一つの実施例では、ＬＰＳにより誘導されるマクロファージにおけるｉＮＯＳの発現に対する、異なる抗酸化剤の影響を比較したところ、５－メチルテトラヒドロ葉酸、デヒドロアスコルビン酸、ＢＨ₄、グルタチオン、ニコチンアミドモノヌクレオチドは１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でｉＮＯＳの発現にほとんど影響しないことが示される。上述した抗酸化剤の過酸化亜硝酸塩に対する反応性を考察したところ、５－メチルテトラヒドロ葉酸、デヒドロアスコルビン酸、ＮＭＮはいずれも高い過酸化亜硝酸塩の除去能力を有することが示される。低酸素条件下で、リンパ球の免疫機能が抑制され、アポトーシス率が増加することが既に証明された。活性酸素の欠乏により、ｉＮＯＳの合成が阻害され、ｉＮＯＳとα－ａｃｔｉｎｉｎ４との結合が破壊され、ｉＮＯＳのアクチン細胞骨格への付着を防止する。そのため、抗酸化剤の存在により、ｉＮＯＳが下方調節される可能性がある。しかしながら、本発明は、抗酸化剤である５－メチルテトラヒドロ葉酸、デヒドロアスコルビン酸、ＮＭＮが独特の性質を有し、一定の濃度でｉＮＯＳの発現を低下させることなく、良好な過酸化亜硝酸塩の除去能力を有することを見出した。上述した抗酸化剤はいずれも、抗原により免疫を活性化させた後、免疫応答能力を低下させることなく、特に感染過程でのｉＮＯＳの発現に悪影響を与えず、かつ過酸化亜硝酸塩の産生を低下させる。ＮＯは細胞アポトーシスを抑制する作用を有し、Ｓ－ニトロソ化作用によりｃａｓｐａｓｅｓ－８、ｃａｓｐａｓｅｓ－９又はｃａｓｐａｓｅｓ－３を抑制するが、過酸化亜硝酸塩はＤＮＡ損傷及びｐ５３の上方調節により細胞のアポトーシスを促進する。

ＮＯは、感染性微生物に直接及び間接的な作用を有し、ＮＯは病原微生物の酵素構造、特に［Ｆｅ－Ｓ］クラスターを直接破壊することができ、ウイルス感染では、ＮＯの発現により、ウイルスの酵素活性を抑制し、ウイルスのコピーを抑制することができる。ＮＯの直接毒性、特に細胞外での抗ウイルス活性が十分に証明されたが、ＮＯの免疫機能に対する間接的な調節作用が相当に複雑である。研究によると、インフルエンザウイルスに感染したｉＮＯＳ欠損マウスには肺炎の組織病理学的証拠がないことが証明されたので、当該学者は、ウイルスコピーよりも、宿主のｉＮＯＳが肺炎により貢献すると考えている［Ｋａｒｕｐｉａｈ Ｇ、Ｃｈｅｎ ＪＨ、Ｍａｈａｌｉｎｇａｍ Ｓ、Ｎａｔｈａｎ ＣＦ、ＭａｃＭｉｃｋｉｎｇ ＪＤ．Ｒａｐｉｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｎｇ ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ ｉｎ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９８；１８８（８）：１５４１-１５４６．］。エンドトキシン血症では、早期に使用されたｉＮＯＳ阻害剤による治療の前臨床モデルの結果が失望を招いた［Ｈａｕｓｅｒ Ｂ、Ｂｒａｃｈｔ Ｈ、Ｍａｔｅｊｏｖｉｃ Ｍ、ｅｔ ａｌ．Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ？ Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ－ａｎｉｍａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ［Ｊ］．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ ＆ Ａｎａｌｇｅｓｉａ、２００５、１０１（２）：４８８－４９８．］。これまで、有益及び有害な効果が述べられており、ＮＯは感染に対してポジティブなのかネガティブなのかは分からない。

外因性ＮＯはＴリンパ球の増殖を抑制し、外因性ＮＯ（すなわち、Ｔ細胞から産生されるＮＯ自身ではない）は増殖を抑制し、さらにＴ細胞の死亡を引き起こすことが認められた［Ｂｏｇｄａｎ Ｃ ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ．［Ｊ］．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０１１、６７７：３７５－３９３．］。重要な抗酸化剤機構が欠損したマウス（すなわちＧＳＮＯＲ）は、過剰のＳ－ニトロソ化及びリンパ球アポトーシスにより、周辺でＴ及びＢ細胞の顕著な欠乏が示される。一方で、少量のＮＯ分岐Ｔ細胞サブセット、特にＴｈ１細胞及びＦｏｘＰ３のネガティブ調節性Ｔ細胞群は、Ｔｈ１７細胞の分化を効果的に抑制できる。なお、最近の研究によると、外因性ＮＯもＴｈ９及びＴｈ１７細胞を調節することが示される。

本発明の一実施例では、細胞培養液において５－メチルテトラヒドロ葉酸は１５．６２５μｍの濃度で、マクロファージによるＮＯ分泌にほとんど影響せず、より面白いのは、ＬＰＳ刺激を与えていない場合、５－メチルテトラヒドロ葉酸は低濃度でＮＯ分泌を促進できることを見出した。

本発明で選択されるＮＯ弱毒化剤とＮＯ増量剤の併用により、抗原で刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖活性を著しく向上させることができることを示す。従来の研究によると、ウイルス除去は抗原特異的ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞により媒介されるが、記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ８＋ＴとＢ細胞の記憶応答の維持に重要な役割を果たすことが示される［Ｓｔａｍｂａｓ Ｊ、Ｇｕｉｌｌｏｎｎｅａｕ Ｃ、Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋａ Ｋ、ｅｔ ａｌ．Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００８、１２０（２）：１８６－１９６．］。また、最近の研究によると、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞はいずれも肺炎の制御に関し、インターロイキン１０の産生により過度の組織損傷を制限することが示される。そのため、本発明における上述したＮＯ弱毒化剤とＮＯ増量剤を含有する薬物組成物は、ウイルス除去及び抗炎症治療に用いられる。

本発明においては、アルギニンはＮＯの増量物として、５－メチルテトラヒドロ葉酸とともに使用される場合、予想外の抗ウイルス、膿毒症治療効果を示した。一実施例では、本発明の組成物は、マウスの胸腺及び脾臓のＴ細胞増殖を顕著に刺激することができ、アルギニンのみを添加する場合と比べ、アルギニンと５－メチルテトラヒドロ葉酸との組合せを投与する場合には、ＣＤ４細胞の増殖が著しく向上し、組成物がエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖能力を向上させることができることが説明される。背景技術に述べるように、ウイルス特異的記憶ＣＤ４⁺Ｔ細胞の数から、インフルエンザウイルスによるヒト感染の重篤度を予測することができ、ウイルス特異的Ｔ細胞の数と疾患の重篤度とは反比例する。そのため、本発明の組成物はインフルエンザウイルス感染を治療する見通しがあり、病態の重篤度を低下させることができる。過酸化亜硝酸塩が細胞の免疫応答に影響することは既知のことであり、過酸化亜硝酸塩が炎症反応及び修復を抑制するフィードバック能力を阻害し、感染中で宿主の免疫失調を引き起こしやすいことは、研究によりサポートされる。使用される組成物は、宿主の免疫能力を向上させることができるだけでなく、炎症のネガティブフィードバック機構を維持し、感染、特にウイルス感染から宿主を保護することができる。

従来のウイルス風邪薬の多くは、症状を緩和して風邪の痛みを軽減するために用いられるが、病気の経過を確実で顕著に短縮することができない。本発明の上述した薬物組成物は、風邪の治療に転覆的な効果をもたらす。効き目が速く、４０余りの被験者を再診したところ、組成物が投与されてから一般に４８時間内に風邪症状が消えた。二重盲検対照臨床実験が行われていないが、関連する試用組成物のフィードバック結果も予期外である。

さらには、本発明は、動物モデルで組成物の抗ウイルス感染効果を検証したところ、組成物によりマウスの免疫機能を保護し、インフルエンザウイルスによる肺部感染の病理状態を軽減し、肺組織損傷を軽減することができることが示される。５－メチルテトラヒドロ葉酸とアルギニンとの組成物により、感染による炎症性因子のレベルを顕著に低下させ、感染後５日間の肺部のウイルス力価を顕著に低下させることができ、組成物が一定の抗ウイルス作用を有することが示唆される。なお、組成物の使用により、感染したマウスの脾臓及び胸腺のＣＤ４⁺とＣＤ８⁺Ｔ細胞のレベルを顕著に向上させることができ、組成物が炎症性因子を低下させるが宿主の免疫力を低下させていないことが示唆される。肺組織切片の結果から、組成物により肺組織損傷及び炎症状態を軽減することができ、風邪ウイルスに対する宿主モデルで非常に良好な治療効果を示す。

最近の研究によると、ＮＯはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により媒介される免疫シナプス（ＩＳ）シグナルを促進できる［Ｇａｒｃｉａ－Ｏｒｔｉｚ Ａ、Ｍａｒｔｉｎ－Ｃｏｆｒｅｃｅｓ Ｎ Ｂ、Ｉｂｉｚａ Ｓ、ｅｔ ａｌ．ｅＮＯＳ Ｓ－ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｅｓ β－ａｃｔｉｎ ｏｎ Ｃｙｓ３７４ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＰＫＣ－θ ａｔ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｎａｐｓｅ ｂｙ ｉｍｐａｉｒｉｎｇ ａｃｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｐｒｏｆｉｌｉｎ－１［Ｊ］．ＰＬｏＳ ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１７、１５（４）：ｅ２０００６５３．］。ＩＳは、Ｔ細胞の活性化、分泌及び細胞間の免疫シグナル通信の調節に非常に重要であり、これも組成物がＴ細胞数を顕著に向上できる可能な理由である。

本発明の一実施例では、組成物を、アフリカ豚熱ウイルスに感染した豚の治療に応用したところ、非常に良好な効果が得られ、アフリカ豚熱ウイルスに感染した豚の生存率を顕著に向上させ、組成物による抗ウイルスの見通しをさらに証明した。

なお、本発明では、本発明にかかる上述した組成物は高用量ウイルスのチャレンジ実験における宿主の生存を顕著に保護でき、一定の膿毒症の治療見通しを示すことを見出した。

過去の三十年間では、各種の新規な薬物及び治療介入手段をテストするように、１００回以上のII期及びIII期臨床試験を行い、重症膿毒症及び敗血症性ショック患者の予後を改善することを期待する。しかしながら、これらのすべての努力で、臓器不全を低減して膿毒症患者の生存率を改善できる新規な薬物が産生できない［Ａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ ＡＷ、Ｈｉｇｇｉｎｓ ＴＬ、Ｏｐａｌ ＳＭ．Ｓｅｐｓｉｓ ａｎｄ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２０１３；４１（１２）：２７７０-２７７２．］。これらのすべての研究は、いずれも特定の分子又は経路の単一薬物を使用し、非常に複雑な免疫代謝経路、及び千個以上の可能なターゲットに関するので、このような構想により薬物を選別することは容易ではない。

外因性アルギニンの補充は膿毒症の治療で争議がある。ＮＯにより媒介される過酸化が膿毒症の病態進行に重要である。ＮＯ産生過程での薬学遮断薬が膿毒症を治療可能であると想定されるので、ＮＯＳ合成酵素阻害剤を開発したが、臨床結果を振り返ると、ＮＯＳを抑制する療法は全体として利益がない。一方で、膿毒症患者のアルギニンレベルが低下するが、ＮＯの内因性ドナーの増加により酸化ストレスが増加するという悪影響を与える可能性がある。本発明の組成物における５－メチルテトラヒドロ葉酸とアルギニンとの併用により前臨床動物モデルで意外にも非常に良好な治療効果が得られる。

本発明では、５－メチルテトラヒドロ葉酸はＬＰＳにより誘導される膿毒症マウスの死亡率を顕著に低下させることができることを見出し、５－メチルテトラヒドロ葉酸は重症のアレルギーによる膿毒症の治療に有益でありえることが示唆される。

本発明では、５－メチルテトラヒドロ葉酸とアルギニンとの組成物により微生物（例えば、黄色ブドウ球菌）感染による膿毒症マウスの死亡率が顕著に低下することを見出した。膿毒症は高度致死病であり、幅広い細胞アポトーシスで誘導される免疫細胞の枯渇及びその後の免疫抑制を特徴とする。本発明では、５－メチルテトラヒドロ葉酸とアルギニンとの組合せにより、宿主の生存率を顕著に向上させ、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞のアポトーシスを遮断することができ、多種の細菌及びウイルスによる膿毒症モデルで組成物が有する治療効果が証明された。

人体で、ある酸化性シグナルが感染性疾患に有益であり、保護性酸化シグナルと活性酸素の有害作用との間に微妙なバランスが存在することを理解すべきである。本発明の組成物で使用される抗酸化剤は、独特の性質を有し、病原微生物感染による症状を緩和するとともに、ＮＯのレベルを向上させ、ＮＯにより媒介される病原体殺滅作用がＮＯで誘発される酸化ストレス機構を上回ることができる。

確かにＴ細胞は交差保護で重要な役割を果たし、ワクチン分野において、不活性化ウイルスワクチンはあるウイルスに対して特異性抗体を誘導することにより保護を行い、交差保護性Ｔ細胞の応答増強に対して作用が小さい。本発明の組成物は免疫応答を増強させる作用を有し、一実施例では、組成物の使用により、狂犬病ワクチン接種後の免疫動物の抗体レベルを顕著に向上させる。

本発明は、天然で強力な抗ウイルスツールであるヒト及び動物体の免疫系を利用する。アフリカ豚熱は致死率９５％～１００％の重症感染症であり、従来技術で何もできないが、本発明を用いることにより明確な治療効果が示され、組成物の抗ウイルス感染能力が予期外であることが示される。［Ｏｕｒａ、Ｃ．Ａ Ｌ ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｂｒｏｇａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００５、８６（９）：２４４５－２４５０．］には、弱毒化ウイルス分離株ＯＵＲ／Ｔ８８／３が報告され、当該ウイルスをワクチンとすると、無毒ＡＳＦＶ分離株ＯＵＲ／Ｔ８８／３の感染により、遠縁豚をポルトガルＡＳＦＶ強毒性分離株ＯＵＲ／Ｔ８８／１の攻撃から保護することができる。ただし、ＯＵＲ／Ｔ８８／３に曝されてＣＤ８（＋）リンパ球が枯渇した豚はＯＵＲ／Ｔ８８／１の攻撃から完全に保護されることができず、ＣＤ８＋リンパ球は、ＡＳＦＶ感染への保護性免疫応答において重要な役割を果たすことを示す。

近年、免疫力に対するＮＯの作用に対する認識が大幅に進歩し、病原微生物に対する直接抑制のほか、免疫機能を広く調節する。ｉＮＯＳのほか、ｅＮＯＳを免疫条件でのＮＯのソースとする必要がある。従って、ＮＯの多種の機能及び標的ターゲットに対する認識の補充により、ＮＯＳサブクラスに対する抑制又は活性化を臨床実践に応用しにくいことが認識される。しかし、本発明の組成物の前臨床動物モデルでの結果が鼓舞的であり、ＮＯは、抗ウイルス及び膿毒症治療において見通しを示す。

本発明は、安全で十分量の一酸化窒素を抗ウイルス感染疾患に応用するという概念を初めて提出し、使用される組成物が相乗効果を示し、良好な効果を示す。免疫系では複雑な調節機構が存在し、多くのシグナル通路又は標的ターゲットが有益又は有害な作用を有し、一酸化窒素に関する研究論文も数万篇と多いが、研究の結論が一致しておらず、互いに矛盾し、明らかにしにくい。ある研究者はさらに、各種のターゲット機構の両刃の剣のような作用を説明するために東方文明における「陰と陽のバランス」という概念を導入した［Ｂｕｒｋｅ Ａ Ｊ、Ｓｕｌｌｉｖａｎ Ｆ Ｊ、Ｇｉｌｅｓ Ｆ Ｊ、ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｙｉｎ ａｎｄ ｙａｎｇ ｏｆ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、２０１３、３４（３）：５０３－５１２．］。本発明は、免疫の全体から発明される組成物は、十分に顕著な技術的効果をもたらす。すなわち、１．宿主の免疫細胞レベルを顕著に向上させ、又は免疫細胞のアポトーシスを防止することができる。２．炎症因子を効果的に低下させ、炎症損傷を低下させる。３．免疫機能を調節することによりウイルスに抵抗し、宿主が二次感染に良好に抵抗することができる。４．組成物における各成分の安全性が良好である。

名詞解釈：
ＮＯ、一酸化窒素。
ＮＯＳ、一酸化窒素合成酵素。
ＳＮＯ、安全な一酸化窒素。過酸化亜硝酸などの毒性ラジカルの含有量が制御可能な一酸化窒素をいい、一酸化窒素を用いて疾患を治療及び予防するときの安全欲求を満たせる。
ＰＯＮ：過酸化亜硝酸及びその塩。
ＮＯ弱毒化剤：過酸化亜硝酸などの毒性窒素含有ラジカルの生成を減少するための還元性物質。
ＮＯ増量剤：ＮＯを産生する前駆体物質。体内でＮＯを放出できる化学物質と酵素由来ＮＯを産生するアルギニン、アルギニン活性化添加剤などの物質とに分けられる。
ＮＯ合成酵素誘導剤：ＮＯ合成酵素の産生を誘導する物質。
葉酸：６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム。
本発明で述べられる塩は、薬学的に許容できる塩を言う。

実施例７における各群の体重変化曲線である。 実施例７における各群の体温変化曲線である。 実施例７における各群の摂食量変化曲線である。 実施例７における各群の摂水量変化曲線である。 実施例７における各群の生存曲線である。 実施例８における各種の抗酸化剤がＬＰＳにより誘導されることによるマクロファージにおけるｉＮＯＳの発現に対する影響である。 実施例９における各種の抗酸化剤の過酸化亜硝酸塩に対する除去作用である。 実施例１０における組成物の、ＣＤ４ Ｔ細胞の三日間刺激による増殖に対する影響である。 実施例１０における定量組成物の、ＣＤ４ Ｔ細胞の三日間刺激による増殖に対する結果である。 実施例１２における炎症性因子の検出結果である。 実施例１２における炎症性因子の検出結果である。 実施例１２における炎症性因子の検出結果である。 実施例１３における脾臓指数及び脾臓の各免疫細胞の総数変化である。 実施例１３における脾臓指数及び脾臓の各免疫細胞の総数変化である。 実施例１３における脾臓指数及び脾臓の各免疫細胞の総数変化である。 実施例１３における胸腺指数及び胸腺の各免疫細胞の総数変化である。 実施例１３における肺の組織切片図である。 実施例１３における末梢血炎症性因子の分泌変化である。 実施例１３における各群のマウスのウイルス力価である。 実施例１７における膿毒症モデルマウスの脾臓リンパ球のカウント図である。 実施例２４における組成物による飼育豚の耳静脈血ルーチン検査のＬＹＭＰ／ＮＥＵＰ変化図である。

以下、本発明の実施例により本発明における上記及びそのほかの特性及び利点をさらに詳しく解釈して説明する。以下の実施例は、本発明の技術方案を例示的に説明するものであり、請求項及び相当方案に限定される本発明の保護範囲を制限することを意図するものではないことを理解すべきである。
別に説明がない限り、本文における材料及び試薬はいずれも市販品や、当業者が従来技術により調製できるものである。

実施例１ カプセル
６ｓ－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム ２００ｍｇ
ビタミンｃ ２００ｍｇ
充填剤 適量
粘着剤 適量
崩壊剤 適量

実施例２ カプセル
６ｓ－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム １００ｍｇ
アルギニン ４００ｍｇ
充填剤 適量
粘着剤 適量
崩壊剤 適量

実施例３ 錠剤
６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム １００ミリグラム
植物性血球凝集素 ５０ミリグラム
アルギニン ４００ミリグラム
充填剤 適量
粘着剤 適量
崩壊剤 適量

実施例４ 錠剤
６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム ２００ミリグラム
ビタミンＣ ６００ミリグラム
充填剤 適量
粘着剤 適量
崩壊剤 適量

実施例５ 錠剤
６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム ４００ミリグラム
ビタミンＣナトリウム １００ミリグラム
フルクトース－１，６－ビスリン酸 ２ミリグラム
充填剤 適量
粘着剤 適量
崩壊剤 適量

実施例６ 注射用凍結乾燥粉末
６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム ８００ミリグラム
アルギニン ３グラム
溶解、濾過、凍結乾燥すればよい。

実施例７ マウスの抗風邪試験
マウス：Ｂａｌｂ／ｃマウス、雌、６週齢、１５～１７ｇ、２５匹。
Ａ、薬物投与群。感染させて薬物を投与した。１０匹。
Ｂ、モデル群。感染させるが薬物を投与しなかった。１０匹。
Ｃ、正常群。感染も投与もしなかった。５匹。

感染方法：５％抱水クロラール１５０μｌで腹腔注射によりマウスを麻酔し、ＰＲ８インフルエンザウイルス（１×１０⁶ｐｆｕ／ｍｏｕｓｅ）に点鼻により感染させた。
投与方法：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムと蒸留水を濃度６ｍｇ／ｍｌとなるように配合し、マウス１匹に２００μｌ、１．２ｍｇ／匹で、胃内投与により、本回の実験で感染させてから３２時間後に投与した。

感染当日から、体重、体温、摂水量、摂食量を測定した。マウスの体重、摂食量及び摂水量を毎日一定の時間に一回測定した。体温測定は、感染後の３日間内に、１２時間おきに毎日２回測定し、感染から４日目から、毎日一定の時間に一回測定した。実験では感染後１５日目まで、マウスの体重が基本的に復帰した。

結果：各群の体重変化曲線を図１に、体温変化曲線を図２に、摂食量変化曲線を図３に、摂水量変化曲線を図４に、生存曲線を図５にそれぞれ示した。各図から、薬物投与群の状況が大幅に改善されたことが分かった。そのうちの図１～４の縦座標は、一日目の値を１とする相対値である。

実施例８ 組成物における弱毒化剤の選別
一、実験材料
１、細胞株：マクロファージＲＡＷ２６４．７。
２、試薬：ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）；ｉＮＯＳ検出キット（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）；ＭＴＴ（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ）。

二、実験方案
１、細胞培養：
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７を、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターにて１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ高グルコース培地で培養した。

２、薬物添加処理：
細胞密度を５×１０⁴ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで細胞懸濁液を加え、ＣＯ₂インキュベーターにおいて２４ｈ培養した。
ＬＰＳ誘導による炎症モデル：
ＬＰＳ誘導：すべてのウェルに４０μＬのＬＰＳを（最終濃度０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
ビタミンＣ群：各ウェルにビタミンＣ、ＬＰＳを（最終濃度がビタミンＣで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
ビタミンＥ群：各ウェルにビタミンＥ、ＬＰＳを（最終濃度がビタミンＥで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
グルタチオン群：各ウェルにグルタチオン、ＬＰＳを（最終濃度がグルタチオンで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
５－メチルテトラヒドロ葉酸群：各ウェルに５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム、ＬＰＳを（最終濃度が５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
デヒドロアスコルビン酸群：各ウェルにデヒドロアスコルビン酸、ＬＰＳを（最終濃度がデヒドロアスコルビン酸で１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
アントシアニジン群：各ウェルにアントシアニジン、ＬＰＳを（最終濃度がアントシアニジンで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
クルクミン群：各ウェルにクルクミン、ＬＰＳを（最終濃度がクルクミンで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
レスベラトロール群：各ウェルにレスベラトロール、ＬＰＳを（最終濃度がレスベラトロールで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
アンドログラホリド群：各ウェルにアンドログラホリド、ＬＰＳを（最終濃度がアンドログラホリドで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
バイカリン群：各ウェルにバイカリン、ＬＰＳを（最終濃度がバイカリンで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
ＮＭＮ群：各ウェルにＮＭＮ、ＬＰＳを（最終濃度がＮＭＮで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
テトラヒドロビオプテリン群：各ウェルにテトラヒドロビオプテリン、ＬＰＳを（最終濃度がテトラヒドロビオプテリンで１０μｍｏｌ／Ｌ、ＬＰＳで０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
正常群：各ウェルに完全培地５０μＬを加えた。
均一に混合し、ＣＯ₂インキュベーターで２４ｈ培養し続けた。

３、ｉＮＯＳの検出
ポリクローナル抗体抗ヒトｉＮＯＳ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ）を用いて、ＥＬＩＳＡによりマクロファージにおけるｉＮＯＳタンパク質レベルを測定した。自動フローサイトメーターを用いてマクロファージの数を決定した。

４、結果
結果を図６に示した。その結果から、５－メチルテトラヒドロ葉酸、グルタチオン、ＮＭＮ、テトラヒドロビオプテリンが１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でｉＮＯＳの発現に影響しなかったことを示した。

実施例９ 異なる抗酸化剤による過酸化亜硝酸塩除去の比較
過酸化亜硝酸塩ドナーである３－モルホリノ－シドノニミン（ＳＩＮ－１）を濃度１μｍｏｌ／Ｌで１５個の試験管にそれぞれ入れた。それぞれＳＩＮ－１溶液を含有する試験管に、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムを最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌまで、デヒドロアスコルビン酸を最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌまで、グルタチオンを最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌまで、ＮＭＮを最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌまで、テトラヒドロビオプテリンを最終濃度１μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、１００μｍｏｌ／Ｌまで加えた。過酸化亜硝酸塩の濃度を分光光度法により測定し、検出波長が３０２ｎｍであった。
結果を図７に示した。その結果から、デヒドロアスコルビン酸、５－メチルテトラヒドロ葉酸、ＮＭＮはいずれも非常に良好な過酸化亜硝酸塩の除去効果を有することを示した。

実施例１０ 組成物によるＴ細胞の増殖分化実験
頚椎脱臼法によりマウスを死亡させ、マウスの脾臓及びリンパ節を無菌分離してＨａｎｋ’ｓ液に入れ、免疫マイクロスフェア（ＣＤ４＋細胞抽出キット；米国Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてマウスの脾臓及びリンパ節からＣＤ４Ｔ細胞を精製した。９６ウェルプレートにマウスＣＤ３モノクローナル抗体４μｇ／ｍＬ及び抗ＣＤ２８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）２μｇ／ｍＬをそれぞれ加え、そしてＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｌ－アルギニンを含まない）、微量ペニシリン、グリシン、１０％ウシ胎仔血清を添加した。

組成物Ａ群：細胞培養液に５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムを最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ、アルギニンを最終濃度４０μｍｏｌ／Ｌまでそれぞれ添加した。組成物Ｂ群：細胞培養液にデヒドロアスコルビン酸を最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ、アルギニンを最終濃度４０μｍｏｌ／Ｌまでそれぞれ添加した。組成物Ｃ群：細胞培養液にＮＭＮを最終濃度１０μｍｏｌ／Ｌ、アルギニンを最終濃度４０μｍｏｌ／Ｌまでそれぞれ添加した。アルギニン群：細胞培養液にアルギニンを最終濃度４０μｍｏｌ／Ｌまで添加した。ブランク：初期細胞培養液（Ｌ－アルギニンを含まない）を用いた。

精製されたＴ細胞をＣｅｌｌ Ｖｉｏｌｅｔ Ｔｒａｃｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により染色して三日間培養し、フローサイトメーターにより増殖を分析して測定した。
結果を図８、９に示した。その結果から、選別された組成物はいずれも刺激後のＣＤ４細胞の増殖をある程度向上させることができ、感染していた宿主の細胞免疫能力を向上させることができたことを示した。

実施例１１ 風邪患者に組成物を試用させる前臨床実験
４００ミリグラム／個の葉酸（６Ｓ－５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム）カプセルを調製し、風邪患者に試用させ、投与後各症状の消失時間（時間）を表１に示した。扁桃炎、咽頭痛以外の症状がすべて消失した場合を基本回復と定義し、扁桃炎、咽頭痛を含むすべてが消失した場合を完全回復と定義した。

表１ 風邪患者の臨床統計（症状消失時間、時間）

風邪患者に処方ＧＫ３０１（葉酸３００ミリグラム、Ｌ－アルギニン１００ミリグラム）カプセルを試用させ、結果を表２にまとめた。

表２ 風邪患者の臨床分析（症状消失時間）

表１と比較すると、アルギニンを加えたことにより病気の経過を短縮したことが分かる。組成物投与による抗風邪効果は５－メチルテトラヒドロ葉酸単独より優れた。ただし、表１及び表２のデータから、いずれも、５－メチルテトラヒドロ葉酸を投与した後、患者の風邪がほとんど２日間内に治癒したことを示した。

実施例１２ ５－メチルテトラヒドロ葉酸による炎症性因子の一部に対する影響及びＮＯ分泌に対する影響
一、実験材料
１．細胞株：マクロファージＲＡＷ２６４．７。
２．薬剤：ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）；ＭＴＴ（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ）；葉酸は５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムである（連雲港金康和信薬業有限公司）；ＮＯ検出キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ）

二、実験方案
１．細胞培養：マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７を３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターにて１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ高グルコース培地で培養した。ＥＬＩＳＡ法により上清炎症性因子（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１α、ＩＬ－６）を検出した。
２．薬物添加処理：
１）細胞密度を２×１０⁵ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで細胞懸濁液を加え、ＣＯ₂インキュベーターにおいて２４ｈ培養した。
２）葉酸群では各ウェルに葉酸５０μＬを（最終濃度１５．６２５、６２．５、２５０μｍｏｌ／Ｌまで）加えた。
ＬＰＳ＋葉酸群では、各ウェルにＬＰＳ ５０μＬを（最終濃度０．１μｇ／ｍＬまで）加え、インキュベーターで６ｈ培養した後、各ウェルに葉酸１０μＬを（最終濃度１５．６２５、６２．５、２５０μｍｏｌ／Ｌまで）加えた。
ＬＰＳ群では、ＬＰＳ ５０μＬを（最終濃度０．１μｇ／ｍＬまで）加えた。
正常群では各ウェルに完全培地５０μＬを加えた。
３）均一に混合し、ＣＯ₂インキュベーターで２４ｈ培養した。
５２０ｎｍの吸光度値で平均数±標準差で表された。ＮＯ分泌率＝（ＯＤサンプルウェル－ＯＤブランクウェル）／（ＯＤ正常ウェル－ＯＤブランクウェル）×１００％を計算し、標準曲線からＮＯ分泌量を算出した。

三、実験結果
表３ ＮＯ検出キットによる５２０ｎｍでのＯＤ値の測定。平均値で表示（ｎ＝６）

その結果から、５－メチルテトラヒドロ葉酸は１５．６２５μｍｏｌ／Ｌの濃度で、ＬＰＳにより誘導されるマクロファージにおけるＮＯの発現を抑制しなかったことが分かる。炎症因子の結果を明細書の図１０、明細書の図１１、明細書の図１２に示した。
上述した結果から、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムはマクロファージ及びＬＰＳにより誘導される炎症性因子の発現に顕著な影響を与えなかったことが分かる。

実施例１３ 用量の異なる組成物の一度投与によるインフルエンザウイルスに感染したマウスに対する早期保護作用の考察
１．１ 材料と方法
１．１．１ マウス
Ｂａｌｂ／ｃマウス、２０匹（各群５匹）、雌、６週齢、１５～１７ｇ、維通利華実験動物公司から購入。
１．１．２ 薬物調製
脱イオン水を用いて薬物を溶解し、調製してから３０分間内で使用した。

１．１．３ 投与方法
Ｇ１群：ブランク対照群
Ｇ２群：モデル群
Ｇ３群：低用量投与群（５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：アルギニン＝１：４、０．１７３ｇ／ｋｇ）
Ｇ４群：高用量投与群（５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：アルギニン＝１：４、０．３４６ｇ／ｋｇ）
低用量群、高用量群では胃内投与を行い、モデル群ではモデル構築のみを行い、薬物を投与せず、等体積の脱イオン水を投与した。ブランク対照群では、等体積の脱イオン水を投与した。一度投与した。
１．１．４ 感染方法
５％抱水クロラール１５０μｌを用いて腹腔注射によりマウスを麻酔し、ＰＲ８インフルエンザウイルス（１×１０⁶ｐｆｕ／ｍｏｕｓｅ）に点鼻により感染させた。

１．１．５ マウス処理方法
感染当日から体重を測定し、マウスの体重を毎日一定の時間に一回測定した。感染後３日目に、眼窩から静脈血１００μｌを採血し、血清を調製し、冷凍保管した。感染後５日目にマウスを死亡させ、肺、胸腺、脾臓及び末梢血を摘出した。
血：血清を調製し、一部をサイトカインの検出（外部検出）に用い、残りを冷凍保管した。
肺臓：肺組織を２つに分け、一方（右肺葉）に対してウイルス力価を測定し、他方（左肺葉の上先端）を固定し、パラフィン包埋を行い、切片してＨＥ染色を行った。
脾臓、胸腺：重量を測り、写真を撮り、細胞をカウントして免疫細胞を染色した。

１．１．６指標観察
体重が変化し、毎日体重を測定した。サンプル保管：５日目に血清サンプルを炎症性因子の検出に用いた（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌを用いた検出、外部検出）。肺臓：ウイルス力価を測定し、肺組織の病理切片を作り、肺組織における炎症性因子の変化を検出した。胸腺：重量を測り、写真を撮り、胸腺全細胞をカウントし、リンパ球を染色（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞）した。脾臓：重量を測り、写真を撮り、脾臓全細胞をカウントし、脾臓リンパ球の染色分析を行った（表面染色、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単核球、マクロファージ、樹状細胞、好中球）。

１．２ 実験結果
１．２．１ 脾臓指数及び脾臓の各免疫細胞の総数変化
明細書の図１３、１４、１５に示した。
１．２．３胸腺指数及び各免疫細胞の総数変化
明細書の図１６に示した。
１．２．２肺部病理変化
明細書の図１７に示した。
１．２．６末梢血炎症性因子分泌変化
明細書の図１８に示した。
１．２．７肺部ウイルス力価（５ｄｐｉ）の変化
明細書の図１９に示した。

それらの結果から、インフルエンザウイルスに感染させた後、正常対照群以外の各群では、マウスはいずれも脾臓リンパ球が減少し、胸腺が小さくなり、高用量群では胸腺の変化が小さかった。脾臓と胸腺はいずれも免疫臓器であり、マウスの免疫機能に関連し、胸腺が小さくなることは免疫機能低下を引き起こす原因のひとつであり、組成物が免疫臓器の保護に寄与し、ウイルス感染抵抗による免疫低下に対して一定の保護作用を有する可能性があることが示唆された。肺部病理切片をＨＥ染色後、モデル群及び治療群はいずれも類似する程度のリンパ球浸潤及び肺部組織構造の変化を示し、高用量治療群はモデル群よりも肺組織損傷の程度がやや軽かった。これは、組成物がインフルエンザウイルスに感染した早期肺部の病理状態の軽減に寄与し、肺組織損傷を軽減したことが示唆された。

インフルエンザウイルスに感染させた後、感染後５日間でモデル群では、末梢血の多種のサイトカインが顕著に向上し、薬物投与群では感染による炎症性因子の分泌を著しく低減できた。薬物により炎症性因子のレベルを効果的に低下させることができ、炎症性因子ストームを減弱することに寄与し得、炎症性因子ストームによる肺損傷を予防及び治療できたことが証明された。感染後５日間の肺部ウイルス力価については、治療群はモデル群と比べていずれも異なる程度の降下傾向を示した。特に高用量治療群では、モデル群と比べてウイルス力価の降下が統計学的有意差の閾値に近づいた。組成物によりウイルス力価を低下させることにより、ウイルスの体内でのコピーを抑制でき、一定の抗ウイルス作用を有することを示唆した。

実施例１４ 組成物によるヘルペスウイルスＩ型脳炎マウスの治療
体重１４～１８ｇの昆明雄性マウス６０匹を用い、ＨＳＶ－１によりＨｅｌａ細胞を攻撃し、ＨＳＶ－１をＨｅｌａ細胞中で４８時間培養し、ウイルスを回収して当該ウイルス力価を測定し、質量分率１００ＴＣＩＤ₅₀１０^-5のウイルスをマウスに接種した。マウスを対照群、モデル群、生理食塩水治療群、アシクロビル治療群（１０ｍｇ／ｋｇ）、組成物群（５－メチルテトラヒドロ葉酸１４ｍｇ／ｋｇ、アルギニン５０ｍｇ／ｋｇ、植物性血球凝集素７ｍｇ／ｋｇ）に分け、対照群に無菌生理食塩水０．０３ｍｌを注射し、モデル群及び各治療群にＨＳＶ－１ウイルス液０．０３ｍｌを注射した後、胃内投与し、連続して４日間投与し、各群の死亡状況及びそのほかの変化を観察した。７日間の後、眼球から０．５ｍｌ採血し、３５℃インキュベーターで２ｈ保存し、１０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、ＮＯと１Ｌ－１βを検出した結果を以下に示した。

表４ 各群の死亡数及び死亡率

本実験から、組成物がヘルペスウイルスに感染したマウスの死亡率を顕著に低下させ、感染過程でのマウスからＮＯの放出を向上させ炎症因子のレベルを低下させることができたことがわかる。

実施例１５ ５－メチルテトラヒドロ葉酸組成物の抗膿毒症処方の選別
６～８週齢、体重１８～２２ｇのＣ５７雄性マウスを用い、動物の一般生理指標、体重及び摂食状況を観察した。一週間なじませて飼育した。標準ペレット飼料で飼育し、自由に摂水させた。自然な昼夜光線で照明し、室温を１８～２６℃にし、相対湿度を４０％～７０％にした。ＬＰＳは、ｓｉｇｍａ社から購入され、商品番号：Ｌ２８８０であった。
４９匹のＣ５７雄性マウスを７匹／群で、６群の薬物投与群と１群のモデル群との７群に分け、腹腔注射によりＬＰＳを１３ｍｇ／ｋｇで投与した（予備実験で決定された用量。ＬＰＳ用量２０ｍｇでは１２０時間の様子を観察できなかったので、モデル群の生存時間を延長するために、予備実験により用量が１３ｍｇ／ｋｇであると確認された）。

Ａ群：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝３：１（ヒト用量で５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム３００ｍｇ、ビタミンＣ １００ｍｇ）；
Ｂ群：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝１：３（ヒト用量で５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム１００ｍｇ、ビタミンＣ ３００ｍｇ）；
Ｃ群：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝１：１２（ヒト用量で５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム５０ｍｇ、ビタミンＣ ６００ｍｇ）；
Ｄ群：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝１２：１（ヒト用量で５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム６００ｍｇ、ビタミンＣ ５０ｍｇ）；
Ｅ群：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝４：１（ヒト用量で５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム１２００ｍｇ、ビタミンＣ ３００ｍｇ）；
Ｆ群：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝３：１（ヒト用量で５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム１２００ｍｇ、ビタミンＣ ４００ｍｇ；
Ｈ群：モデル群。
すべての薬物投与群では、それぞれモデル構築後の９時間に一回（１日目の夜９時）、翌日の朝に一回、三日目の朝に一回、計３回投与し、投与体積が一致していた。結果を以下に示した。

表６ ＬＰＳの腹腔注射後の各時点での動物表現及び死亡状況

Ｃ群、Ｄ群では、投与過程で、一部のマウスが身震い、顕著な不活発などの症状を示した。Ｅ、Ｆ群の状態が最も優れており、Ａ、Ｂ群はその次であり、１４４ｈ後に各群では動物が死亡したことはなかった。

その結果から、用量や配合比の異なる５－メチルテトラヒドロ葉酸とビタミンＣとの組成物により、ＬＰＳにより誘導されるマウスの死亡率を異なる程度抑制し、マウスの生存率を向上させることができ、経口胃内投与だけで膿毒症モデルマウスの死亡率を低下させる作用を果たすことができ、それらの最適配合比が３：１であった。用量の増加に伴い、効果が顕著に改善され、ヒト用量で１２００ｍｇの５－メチルテトラヒドロ葉酸の用量で、ビタミンＣ ４００ｍｇと相互作用してＬＰＳにより誘導される膿毒症モデルマウスの生存率を１００％とすることができ、極めて大きな臨床価値がある。

実施例１６ ５－メチルテトラヒドロ葉酸組成物による黄色ブドウ球菌膿毒症モデルマウスに対する保護の試み
体重２０グラム程度のＳＰＦグレード昆明種マウスを用い、黄色ブドウ球菌を単一コロニーで培養液に接種し、３７℃で徹夜振とう培養した。菌液を回収して４０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を回収し、無菌生理食塩水で２回洗浄した。菌液が約５×１０⁹ＣＦＵ／ｍｌであった。予備実験から、菌液２ｍｌを腹腔注射すると、７日間死亡率が９０％以上となったことが分かる。

マウスを雌雄半分で以下のようにランダムに分けた。
Ａ群：高用量群、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝３：１（ヒト用量で１２００ｍｇ／日、すなわち１９２ｍｇ／ｋｇ／日）；
Ｂ群：中用量群、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝３：１（ヒト用量で６００ｍｇ／日、すなわち９６ｍｇ／ｋｇ／日）；
Ｃ群：低用量群、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝３：１（ヒト用量で３００ｍｇ／日、すなわち４８ｍｇ／ｋｇ／日）；
Ｄ群：併用治療群、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：ビタミンＣ＝３：１（ヒト用量で６００ｍｇ／日、すなわち９６ｍｇ／ｋｇ／日）＋オキサシリン３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ；
モデル群。
菌液を腹腔注射した後の４ｈから、上述した用量で、三回に分けて薬物を一日おきに投与した（０、２、４日目）。

表７ 黄色ブドウ球菌膿毒症モデルの治療

実験結果から、驚くべきことに、ＬＰＳモデル群のマウスに確実に保護性を有する組成物は、ブドウ球菌モデルマウスに対して疾患を緩和することができず、両方に有意差がなかった。

実施例１７ 組成物Ｃの処方による膿毒症の治療及び抗菌試験
５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム、アルギニン、植物性血球凝集素を２：８：１の割合で混合し、処方Ｃの組成物を得た。
体重１８～２４ｇ、雌雄半分の健常ＩＣＲマウス１２０匹を用い、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌を試験菌種とし、体重で正常群、モデル群、組成物低用量群（４０ｍｇ／ｋｇ）、組成物中用量群（８０ｍｇ／ｋｇ）、組成物高用量群（１６０ｍｇ／ｋｇ）、アモキシシリン群（１２０ｍｇ／ｋｇ）にランダムに分けた。以上の各群に対して、いずれも２０ｍｌ／ｋｇで毎日１回腹腔投与し、正常群以外の各群のマウスのいずれに対しても０．５ｍｌ／匹で黄色ブドウ球菌液（５×１０⁹ＣＦＵ／ｍｌ）を腹腔注射した。（肺炎球菌の感染方法及び群分け状況は黄色ブドウ球菌と同様）各群マウスに対して菌液注入後の４日間内の死亡状況を観察し、群間の差異を比較し、生存率を算出した。実験結果を以下に示した。

注：モデル対照群と比べて、^*ｐ＜０．０５であった。
モデル対照群と比べて、^**ｐ＜０．０１であった。

その結果から、明確に感染したモデル動物に対しては、組成物にＬ－アルギニンを加える必要があることが分かる。

組成物は、宿主の生存率を顕著に向上させることができた。組成物のリンパ球に対する作用をさらに検証するために、独立実験を行った。すなわち、ＩＣＲマウスに、それぞれ黄色ブドウ球菌菌液（５×１０⁹ＣＦＵ／ｍｌ）０．５ｍｌを注射し、モデルマウス１０匹に同時に５－メチルテトラヒドロ葉酸、アルギニンの組成物溶液２０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射し、モデル構築から２４時間後、マウスを死亡させ、脾臓を回収した。脾臓全細胞のカウント、脾リンパ球の染色分析（表面染色、Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を行った。

結果を図２０に示した。その結果から、組成物が敗血症でＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のアポトーシスを防止することができ、敗血症マウスは、モデル構築から２４時間後、敗血症であらゆるタイプの免疫エフェクター細胞のアポトーシスを誘導し、組成物がＣＤ４Ｔ、ＣＤ８Ｔ細胞及びＢ細胞のアポトーシスを防止したが、ＮＫ細胞の減少（ｎ＝１１）を阻止していなかったことが示される。このような組成物の作用についてこれまで報告がなく、組成物の膿毒症に対する治療見通しを十分に考えるべきである。

実施例１８ 体内で組成物のグラム陰性菌に対する抑制作用
５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム、アルギニン、植物性血球凝集素を２：８：１の割合で混合し、全混合した後、処方Ｃの組成物を得た。
体重１８～２２ｇのＢＡＬ Ｂ／Ｃ雄性マウス５０匹を８匹／群で６群に分け、２群が実験群で、残りが各種の対照群であり、それぞれ組成物低用量群（４０ｍｇ／ｋｇ）、組成物高用量群（８０ｍｇ／ｋｇ）、正常群、モデル群、ペニシリン群（４５０ｍｇ／ｋｇ）、メロペネム群（７５ｍｇ／ｋｇ）であった。緑膿菌の菌液をＬＢ固形培地で画線培養した後、典型的コロニーを選択して通常ＬＢ液体培地に接種し、３７℃で徹夜振とう培養してから約１２ｈ後、４０００ｒ／ｍｉｎで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、使用するまで生理食塩水に菌体を再懸濁した。致死用量の緑膿菌菌液を５００μＬ／匹で各実験群及び三つの対照群のＢＡＬ Ｂ／Ｃ雄性マウスに腹腔注射した。実験群のＢＡＬ Ｂ／Ｃ雄性マウスに菌体を感染させてから３０ｍｉｎ後、組成物中用量群、組成物高用量群に胃内投与し、ペニシリン群及びメロペネム群に同様に胃内投与し、正常群に精製水を胃内投与した。投与してから２４ｈ後、各実験群及び対照群のＢＡＬ Ｂ／Ｃ雄性マウスに再度投与し、投与タイプ及び用量は一回目の投与と同じであった。ＢＡＬ Ｂ／Ｃ雄性マウスに投与した後、２４ｈごとに観察し、生存状況を記録し、１５日目にすべての動物を死亡させた。

その結果から、本発明の処方Ｃの組成物は、動物体内でグラム陰性菌に対する抑制作用を有し、かつ毒性が低かったことが分かる。本発明の前記組成物は致死用量の緑膿菌に感染させたマウスの生存率を１４日間で１００％に維持できた。メロペネム群では、マウスは１４日間後の生存率が１００％であったが、ペニシリン群では全部死亡し、モデル群でも全部死亡した。

実施例１９ 組成物の治療及び予防的投与によるＨ１Ｎ１（ＦＭ１）インフルエンザウイルスに感染したマウスに対する死亡保護作用
１．１ 被験サンプル
組成物顆粒（５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：アルギニン＝１：４）、連雲港金康和信薬業有限公司
１．２ 試験動物
ＩＣＲマウス、ＳＰＦグレード、体重１３～１５ｇ、雌雄半分。北京維通利華試験動物有限責任公司から提供され、許可番号：ＳＣＸＫ（京）２０１６－０００６、動物合格証：１１００１１１９１１０８２３８５。
１．３接種した毒性株
ＦＭ１毒性株（濃度１００．ＴＩＣＤ₅₀）を購入した。本実験室で継代培養し、－８０℃で冷蔵庫で保存した。

２ 試験方法及び結果
２．１ 用量設計
試験で、被験物に対して、いずれも１０００倍ＦＭ１毒性株希釈液によりマウスの点鼻感染を行い、組成物を高、中、低という三つの用量群に分けた。また、予防投与群を設定し、低用量で一度投与し、ビタミン群と中用量群を設定して比較した。
２．２ 菌液の用意
ＦＭ１毒性株０．２ｍｌを凍結融解した後、生理食塩水で勾配希釈して試験に必要な濃度（１０００倍量）を得た。

３．３ 動物感染量の確定
濃度の異なるＦＭ１ウイルス液で、各濃度群１０匹、４５μｌ／匹でそれぞれマウスを点鼻感染させ、感染後の１２日間内の動物の死亡状況を観察し、マウスを８０±５％死亡させたウイルス液濃度を本試験の感染濃度とした。結果を表９に示した。

表９ インフルエンザウイルスＦＭ１のマウス致死感染毒液濃度の確定

以上の結果から、本試験用の濃度が１０００倍ＦＭ１希釈液であり、４５μｌ／匹で点鼻感染させた。

４．１ 動物感染および群分け
ＩＣＲマウス１３０匹を用い、動物を体重レベルで正常対照群、モデル対照群、組成物の高、中、低用量群、組成物予防群、組成物後治療群の７群にランダムに分けた。１０匹を正常対照群とし、残りの各群の動物２０匹を４５μｌ／匹でＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに点鼻感染させた。感染後、各薬物投与群に０．１ｍｌ／１０ｇで胃内投与した。

４．２ 治療的投与及び予防的投与の用量設計
正常対照群：等量の生理食塩水を投与した。
モデル対照群：等量の生理食塩水を投与した。
高用量群：組成物（５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：アルギニン＝１：４）を０．３４６ｇ／ｋｇ体重で投与し、それぞれ感染後の１２ｈ、２４ｈに一回ずつ投与し、二回目の投与量を一回目の投与量の半分にした。
中用量群：組成物（５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：アルギニン＝１：４）を０．１７３ｇ／ｋｇ体重で投与し、それぞれ感染後の１２ｈ、２４ｈに一回ずつ投与し、二回目の投与量を一回目の投与量の半分にした。
低用量群：組成物（５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：アルギニン＝１：４）を０．０８７ｇ／ｋｇ体重で投与し、それぞれ感染後の１２ｈ、２４ｈに一回ずつ投与し、二回目の投与量を一回目の投与量の半分にした。
予防群：予防作用。すなわち、モデル構築前の１２ｈに低用量群の用量、つまり組成物（５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム：アルギニン＝１：４）を０．０８７ｇ／ｋｇ体重で一度投与した。
後治療群：組成物（５－メチルテトラヒドロ葉酸：アルギニン＝１：４）を０．１７３ｇ／ｋｇ体重で投与し、それぞれ感染後の１２ｈ、２４ｈに一回ずつ投与し、二回目の投与量を一回目の投与量の半分にした。組成物（５－メチルテトラヒドロ葉酸：アルギニン：ビタミンＣ＝３：１２：１）を０．１７３ｇ／ｋｇ体重で投与し、それぞれ感染後の３日目、６日目に一回ずつ投与した。

感染後の１４日間内の動物の死亡状況を観察し、死亡率、死亡保護率（対照群死亡率－実験群死亡率）／対照群死亡率を算出した。肺指数＝湿肺重量（ｇ）／体重（ｇ）であった。結果に対して、群間比較でＸ２検定及びｔ検定により統計学的処理した。結果を以下の表に示した。

表１０ 初回ＦＭ１インフルエンザウイルス感染によるマウス致死に対する保護作用

表１１ ＦＭ１インフルエンザウイルスによるマウスの肺部炎症に対する影響

５．組成物の治療後生存マウスの重複感染に対する死亡保護作用
上述した実験で、投与後１５日目に、上述したインフルエンザウイルスに感染させたり薬物介入を行って生存したマウスに対して、重複感染実験を行い、同じインフルエンザウイルスに生存動物を再感染させ、再感染後の７日間内の死亡状況を観察し、インフルエンザウイルスに再感染させたマウスの死亡率及び死亡保護率に対する異なる処理群の影響を比較した。重複感染実験の各群に対しては薬物介入を行っていなかった。

表１２ 組成物によるＦＭ１インフルエンザウイルスに重複感染させたマウスに対する死亡保護作用

その結果から、組成物高用量群では、初回感染および重複感染の後に動物の死亡に対して保護作用を有することを示した。予防的投与群でも一定の保護作用を示した。組成物は、インフルエンザウイルスによるマウスの死亡率を低下させ、動物に対して良好な治療及び死亡保護作用を有するだけでなく、その予防的投与によっても一定の保護作用を示し、マウスの生存期間を延長できたことが示唆された。

実施例２０ エンドトキシンによる発熱に対する処方Ａの組成物の抑制作用
処方Ａの組成物の調製：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとビタミンＣとを質量比１：１で混合し、三次元混合により全混合した後、処方Ａの組成物を調製した。
エンドトキシンの調製：従来文献の報告により、本実験では、予備実験を行った後エンドトキシン発熱量を２５０ｎｇ／ｍｌ／ｋｇにし、実験の前に生理食塩水で調製した。
ウサギの選択：体重２．０～３．０Ｋｇのニュージーランドウサギ３５匹を用い、直腸温を毎日１回、連続して２日間測定し、ウサギをこの温度測定操作になじませた。体温範囲３７．５～３８．５℃で体温変動範囲が０．５℃以内のものを選択し、実験に用いた。

各ウサギに対して耳静脈からエンドトキシンを注射し、注射後の１時間に、直腸温を測定し、体温変化に従って、モデル群、陽性薬物群、本発明の薬物組成物Ａ処方の高（４０ｍｇ／ｋｇ）、中（２０ｍｇ／ｋｇ）、低（１０ｍｇ／ｋｇ）用量群に均一に分けた。各薬物投与群では胃内投与を、２ｍｌ／ｋｇで一回行い、モデル群では同じ条件で蒸留水を投与した。投与後０．５ｈ、１ｈ、１．５ｈ、２ｈに直腸温を測定した。実験結果を表１３に示した。

表１３ 本発明の処方Ａの組成物のエンドトキシン発熱ウサギの体温変化に対する影響（ｎ＝６）

その結果から、エンドトキシンを注射した後、各群のウサギはいずれも体温が顕著に上昇し、薬物が投与された後、各群のウサギはいずれも体温が降下したことを示し、組成物が一定の解熱作用を有することを示した。

実施例２１ Ｃ処方による体内抗肺炎マイコプラズマ試験
肺炎マイコプラズマ国際標準株（ＡＴＣＣＦＨ１５５３１）は、アメリカ培養細胞系統保存機関から購入された。
Ｃ処方の組成物：実験室で自製し、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム、アルギニン、植物性血球凝集素を２：８：１の割合で混合し、全混合した後、処方Ｃの組成物を得た。
雌雄半分、体重１６～２０ｇのＢＡＬＢ／Ｃマウス５０匹は、広東省医学実験動物中心から購入された。
陽性薬物群：アジスロマイシン分散錠、哈薬集団製薬六廠、バッチ番号１６０３０３、規格０．２５ｇ／錠。

ＢＡＬＢ／Ｃマウスを一週間なじませて飼育した後、雌雄半分で正常対照群、モデル対照群、陽性薬物対照群（４０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ組成物高用量群（８０ｍｇ／ｋｇ）、Ｃ組成物低用量群（４０ｍｇ／ｋｇ）の５群にランダムに分けた。正常対照群以外の各群のマウスをエチルエーテルで麻酔した後、濃度１０⁶ＣＣＵ／ｍｌの肺炎マイコプラズマ（ＭＰ）菌液５０μＬで、連続して３日間点鼻感染させた。その後胃内投与を、毎日一回、連続して１０日間行った。最後の投与から４ｈ後、マウスを眼球から採血して死亡させ、肺臓、脾臓、胸腺を摘出して重量を測定した後、病理学的観察を行った。別に小片の肺組織をとり、研磨した後、ＰＣＲによりＭＰの含有量を定量的に検出した。結果を以下に示した。

表１４ マウス脾指数及び胸腺指数に対する影響

注：モデル対照群と比較して、^*ｐ＜０．０５であった。

モデル群と比べると、ブランク対照群のマウスの脾臓指数に有意差があり、各薬物投与群のマウスの脾指数に有意差があり、投与後、生体内のＭＰが殺滅されたことを示唆した。免疫臓器に対する刺激が軽減され、脾指数が降下した。
マウス肺臓組織の病理学的検査では、解剖時に、正常群と比べてモデル群の肺部組織の病変が著しく、肺部の外観に充血水腫が見られ、肺葉に不均一な壊死巣が散布され、病理学的検査により病変が主に肺内にあり、主に間質性肺炎及び細気管支肺炎であり、気管支に顕著なリンパ球浸潤が見られ、ブランクでは肺組織が基本的に正常であった。アジスロマイシン対照群では軽度の間質性肺炎が見られ、Ｃ組成物群では炎症が顕著に軽減され、細気管支の周辺で僅かに炎症性細胞浸潤が見られ、間質性肺炎の程度が用量の増加につれて次第に軽減された。その結果から、Ｃ組成物がマウスの肺炎マイコプラズマへの感染を制御する作用を有し、肺組織の病変度合いが軽減されたことが分かる。

実施例２２ 免疫アジュバントとして一酸化窒素組成物の狂犬病ウイルスワクチン効果に対する影響
体重２０～２８ｇ、雌雄半分の成熟昆明マウス３０匹は新彊医科大学実験動物中心から購入され、狂犬病ｒＳＲＶ₉弱毒化経口凍結乾燥生ワクチンは北京中聨康生物科技有限公司から購入された。一酸化窒素組成物のＢ処方の調製について、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウムとアルギニンとを質量比１：４で混合し、Ｂ処方の組成物を調製した。マウス３０匹を雌雄半分、１０匹／群で、ブランク対照群、ウイルス経口免疫群、Ｂ処方＋ウイルス経口免疫群の３群に分けた。それぞれ試験の１日目、７日目、１４日目に対応するワクチンを経口投与し、免疫後０、１４、２１、３５、４２、７０日目に３００μＬ／匹で眼窩採血を行い、１ｈ静置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、血清を吸収し、マウスの糞便を０．０５ｇ程度同期採取し、ＰＢＳ（ｐＨ約７．４）５００μＬに置き、粉砕して混濁液を形成し、上清を遠心して吸収し、－２０℃で冷蔵庫に保存し、血清ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ検出キットにより検出し、糞便ＩｇＡ抗体をマウス血清狂犬病特異的ＩｇＡ抗体を用いてＥＬＩＳＡ検出キットにより検出した。結果を以下の表に示した。

表１５ 各群のマウスを初回免疫後、異なる時間で血清抗狂犬病特異的ＩｇＧレベルの検出（Ｕ／ｍｌ）

その結果から、組成物Ｂが血清中ＩｇＧの抗体レベルを高め、経口ワクチンと組成物Ｂとの併用により、１４日目に十分程度の抗体があり、免疫から２１日間後、異なる群間で抗体の差異が著しくなったことが分かる。

表１６ 各群のマウスを初回免疫後、異なる時間で糞便ＳＩｇＡレベルの検出（Ｕ／ｍｌ）

以上の結果から、処方Ｂの組成物がワクチンの免疫活性を向上させ、処方Ｂの組成物が免疫アジュバントとして相乗効果を示し、ｒＳＲＶ₉ウイルス経口弱毒化ワクチンにより、マウス体内での抗体発現を顕著に向上させることができ、免疫接種回数を低減し、免疫効果を向上させる作用を有することが分かる。

実施例２３ 処方Ｃの組成物のアフリカ豚熱の治療への応用
江蘇省動物疫病予防中心から送られてきたサンプルから、中国動物衛生・流行病学研究センターがアフリカ豚熱を一例確認し、陽性サンプルが江蘇省連雲港ガン楡区のある農家に由来し、当該農家では生豚を３００頭飼い、１３０頭が発症し、１２０頭以上が死亡した。死亡した感染豚を解剖して病理学的検査を行ったところ、肺出血、間質性肺炎などの症状が発見された。脾臓を解剖したところ、脾腫が深刻であり、７倍も脾腫したものがあることが発見された。胃を解剖したところ、胃漿膜表面にびまん性出血が発見された。また、腎腫大が顕著であった。それらはアフリカ豚熱の症状に合致した。

当該農家から感染豚３頭、及び健常豚１０頭の血液をとり、３０００ｒ／ｍｉｎで遠心分離し、血清を、セラミックビーズを入れたＲｏｃｈｅに加え、ＰＢＳバッファーを添加し、ウイルスＤＮＡキットによりＤＮＡを抽出し検出したところ、ＡＳＦＶアフリカ豚熱遺伝子II型であり、２０１７年の極東ロシア及び東ヨーロッパで流行したウイルス属であると確認した。アフリカ豚熱の治療には、処方Ｃの組成物を介入させた。

処方Ｃの組成物注射剤の調製：５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム、Ｌ－アルギニン及び植物性血球凝集素を２：８：１の割合で混合し、全混合した後、処方Ｃの組成物を得た。処方Ｃの組成物に滅菌処理を施した後、生理食塩水で溶解させ、精密濾過膜を通して濾過を行い、活性炭で熱源を吸着し、その後注射剤に調製した。

１８頭の感染初期の豚を隔離し、関連飼料及び排水、糞便を無害化処理した。感染豚の体温が平均で４０℃であり、一部の感染豚が皮膚に充血、チアノーゼが現れ、かつ、耳、腹下で複数個所の出血斑又は赤斑が現れ、全部の感染豚は摂食が不正常で、食欲不振であった。感染豚を血液検出したところ、正常豚よりも白血球レベルが低下したことが認められた。

以上のことから、感染豚１８頭に対して処方Ｃの組成物の介入治療を行い、豚一頭あたり処方Ｃを含む注射液を、用量５０ｍｇ／キログラムで毎日、２日間持続して注射し、その間各豚の体温を検出した。
結果を以下に示した。

表１７ 感染豚１８頭の７日間の生存率のまとめ

その結果から、アフリカ豚熱に感染した豚に対して予期外の効果があり、処方Ｃの組成物が非常に優れた抗ウイルス効果を有することが示唆された。その結果から、７日間で豚１頭のみが死亡したことが分かる。その後、ポリシー要件を満たすために、すべての感染豚を死亡させ、当該農家の残りの感染豚がいずれも発症後３～４日間で死亡した。

アフリカ豚熱による死亡例の解剖検出
病死豚を解剖したところ、病死豚の脾臓が深刻に腫大し、かつ脾臓が充血し、脆くなり崩れやすく、肺部に大規模の出血が現れ、肺組織観察により間質性肺炎と定義された。また、胃も同様に出血し、胃漿膜表面にびまん性出血が現れ、腎腫大が顕著であった。

血液を１ｈ静置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、血清を吸収した。ＩｇＧ抗体レベルを検出した。血液にＫｒｅｂｓ－ＨＥＰＥＳバッファーを加え、３７℃に維持して３０分間静置し、Ｌ－ＮＡＭＥ（１００μＭ）を加え、電気化学方法により超酸化物、亜硝酸塩およびＮＯの含有量を検出した。

治癒豚を死亡させて解剖し、病理学的観察を行ったところ、治癒豚では脾臓がやや大きくなる以外、肺の局所に出血が現れた。血液を１ｈ静置した後、５０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、血清を吸収した。ＩｇＧ抗体レベルを検出した。血液にＫｒｅｂｓ－ＨＥＰＥＳバッファーを加え、３７℃に維持して３０分間静置し、Ｌ－ＮＡＭＥ（１００μＭ）を加え、光化学方法により亜硝酸塩およびＮＯの含有量を検出した。
結果を以下に示した。

表１８ 病死豚群及び治癒豚の生化学的指標

その結果から、治癒豚の体内に大量の抗体が存在し、組成物Ｃの向上により豚の免疫系レベルを向上させ、抗ウイルスの効果を果たすことができたことがわかる。

そして、病死豚のＮＯレベルも低くないが、そのうちの活性窒素のレベルが大幅に向上し、ウイルスによる急性症状及び死亡が活性窒素のレベルに関連することを示唆し、高強度の免疫系は逆に個体の死亡を促進してしまい、ウイルスの治療過程によく見られた。あるウイルスに対しては、免疫遺伝子ノックアウトマウスの生存時間は逆に正常マウスを遥かに超えた。したがって、アフリカ豚熱による死亡が免疫系の過剰反応に関連すると推測され、比較すると、病死豚の血液中ＲＮＳ／ＮＯの比が治癒豚の血液中ＲＮＳ／ＮＯ比の３倍以上であったことが認められた。

本発明の組成物は、ＲＮＳを低下させることにより、免疫過剰発現で悪性ウイルスによる死亡を減少させ、免疫系の正常動作を維持し、ウイルスを除去する目的を達成することができたことが示唆された。本発明の組成物の実施効果は予想を大幅に上回った。

実施例２４ 飼育豚の免疫細胞に対する組成物の影響
約３月齢、体重２５ｋｇ程度の通常の飼育豚３匹を用い、それぞれ５－メチルテトラヒドロ葉酸を含有する組成物を投与した。組成物の調製には、５－メチルテトラヒドロ葉酸カルシウム、Ｌ－アルギニン及び植物性血球凝集素を１：４：０．１の割合で混合し、薬物組成物を得た。組成物の投与前、耳から採血し、血ルーチン検査を行った。その後、豚の体重により組成物を３０ｍｇ／キログラムで経口投与し、一週目、二週目にそれぞれ耳から採血し、血ルーチン検査を行った。血ルーチン検査の主な指標はＬＹＭＰ（リンパ球）、ＮＥＵＰ（好中球）であった。

血ルーチン検査の指標

免疫指数ＬＹＭＰ／ＮＥＵＰが高かった患者はウイルス感染による症状が相対的に軽度であった。文章［Ｚｈａｎｇ Ｂ、Ｚｈｏｕ Ｘ、Ｑｉｕ Ｙ、ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ８２ ｄｅａｔｈ ｃａｓｅｓ ｗｉｔｈ ＣＯＶＩＤ－１９［Ｊ］．ＭｅｄＲｘｉｖ、２０２０．］では、新型コロナウイルス感染症の患者に対して臨床分析を行ったところ、死亡した患者は基本的にリンパ球／好中球の比が低かったと述べられている。図２１において、組成物がＬＹＭＰ／ＮＥＵＰ比を高め、ウイルス感染による症状の重篤度を制限することができたことが示される。組成物がウイルスに対して予防作用を有することをある程度説明した。

以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されない。本発明の精神及び原則の範囲内で、いかなる補正、同等置換、改良などはすべて本発明の保護範囲に含まれる。

Claims (8)

1. 豚熱を予防及び治療するための薬物組成物であって、ＮＯ弱毒化剤とＮＯ増量剤を含み、前記ＮＯ弱毒化剤は、５－メチルテトラヒドロ葉酸及びその塩、デヒドロアスコルビン酸、ＮＭＮのうちの一つ又は複数から選択され、前記ＮＯ増量剤はアルギニン、シトルリン又はアルギニン活性化添加剤のうちの一つ又は複数から選択される、薬物組成物。
2. ５－メチルテトラヒドロ葉酸及びアルギニンを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 植物性血球凝集素をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
4. ５－メチルテトラヒドロ葉酸：アルギニン：植物性血球凝集素の質量比が、２：８：１である、請求項３に記載の組成物。
5. 前記豚熱が、アフリカ豚熱である、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物が、ウイルスに感染した宿主のＴ細胞、特にＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のレベルを高め、炎症因子の発現を低下させ、ウイルス感染に抵抗することができる、請求項１に記載の組成物。
7. 前記組成物の活性成分の一回量が、少なくとも３０ｍｇ／キログラムであり、例えば５０ｍｇ／キログラムである、請求項１又は請求項４に記載の組成物。
8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物の、豚熱の予防又は治療のための薬物組成物の調製における使用。

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