JP2022538046A

JP2022538046A - 核酸を検出するためのアッセイおよび方法

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Publication number: JP2022538046A
Application number: JP2021575939A
Authority: JP
Inventors: ジェームズポールブロートン; ジャスミートシン; クレアルイーズファッシング; マリア－ネフェリツァログロウ; ペドロパトリックドレイパーガラルザ; ジャニスシャーチェン; シンミャオ; ルーカスハリントン; ダニエルトーマスドルザル; サラジェーンシャピロ
Original assignee: マンモスバイオサイエンシズインコーポレイテッド
Priority date: 2019-06-18
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2022-08-31
Also published as: WO2020257356A3; AU2020296016A1; US20220325363A1; CN114650883A; IL289050A; EP3986614A2; CA3143685A1; KR20220035376A; MX2021016027A; WO2020257356A4; BR112021025669A2; WO2020257356A2; CN114650883B

Abstract

標的核酸を検出するための装置、システム、流体装置、キット、および方法が本明細書に記載される。TIFF2022538046000102.tif120128

Description

相互参照
本出願は、2019年6月18日に出願された米国仮特許出願第62/863,178号、2019年7月26日に出願された米国仮特許出願第62/879,325号、2019年8月1日に出願された米国仮特許出願第62/881,809号、2019年12月6日に出願された米国仮特許出願第62/944,926号、および2020年3月5日に出願された米国仮特許出願第62/985,850号の優先権および恩典を主張し、これらの各々の内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。

背景
様々な伝染性疾患は、個体または環境から個体に容易に広まり得る。これらの疾患には、限定されないがインフルエンザが含まれ得る。インフルエンザを有する個体の転帰は、不良である場合がある。特に感染の初期段階における疾患の検出は、疾患の進行または伝播を減少させるための治療または介入に関するガイダンスを提供し得る。

概要
様々な局面において、本開示は、バルブに流体接続された増幅チャンバと;試料計量チャネルに接続されているバルブに流体接続された検出チャンバと;抵抗チャネルを介して検出チャンバに流体接続された検出試薬チャンバであって、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、および標識されたディテクター核酸を含み、前記標識されたディテクター核酸が、標的核酸のセグメントへの前記ガイド核酸の結合によりに切断され得る、検出試薬チャンバとを含む、標的核酸を検出するためのマイクロ流体カートリッジを提供する。

いくつかの局面では、試料計量チャネルは、チャネル内またはチャンバ内に分配される液体の量を制御する。いくつかの局面では、試料計量チャネルは、検出チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、抵抗チャネルは、蛇行経路、角度のついた経路、または遠回り経路を有する。いくつかの局面では、バルブは、回転バルブ、空気圧バルブ、油圧バルブ、エラストマーバルブである。いくつかの局面では、抵抗チャネルはバルブと流体接続されている。いくつかの局面では、バルブは、「基材」または「オーバーモールド」を含むケーシングを含む。いくつかの局面では、バルブはソレノイドによって作動される。いくつかの局面では、バルブは、手動で、磁気的に、電気的に、熱的に、双安定回路によって、圧電材料によって、電気化学的に、相変化によって、レオロジー的に、空気圧的に、逆止バルブによって、毛細管現象によって、またはそれらの任意の組み合わせによって制御される。いくつかの局面では、回転バルブは、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つのチャンバを流体接続する。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、増幅チャンバに流体接続された増幅試薬チャンバをさらに含む。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、増幅試薬チャンバに流体接続された試料チャンバをさらに含む。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、試料チャンバに接続された試料投入口をさらに含む。いくつかの局面では、試料投入口は密閉可能である。いくつかの局面では、試料投入口は試料の周りにシールを形成する。

いくつかの局面では、試料チャンバは溶解緩衝液を含む。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、試料チャンバに流体接続された溶解緩衝液貯蔵チャンバをさらに含む。いくつかの局面では、溶解緩衝液貯蔵チャンバは溶解緩衝液を含む。いくつかの局面では、溶解緩衝液は二重溶解/増幅緩衝液である。

いくつかの局面では、溶解緩衝液貯蔵チャンバは、第2のバルブを介して試料チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、試料チャンバは、増幅試薬チャンバを介して増幅チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、試料チャンバは、増幅チャンバを介して増幅試薬チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、増幅試薬チャンバと増幅チャンバとの間で流体を双方向に導くように構成される。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは増幅チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、増幅チャンバは、検出試薬チャンバを介して検出チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、検出チャンバの上方にある試薬ポートを含み、試薬ポートが検出試薬チャンバから検出チャンバに流体を送達するように構成されている。いくつかの局面では、増幅チャンバは、検出チャンバを介して検出試薬チャンバに流体接続される。

いくつかの局面では、抵抗チャネルは、検出チャンバへのおよび検出試薬チャンバへの逆流を低減するように構成される。いくつかの局面では、試料計量チャネルは、所定の体積の流体を検出試薬チャンバから検出チャンバに導くように構成される。いくつかの局面では、増幅チャンバと検出チャンバとは、熱的に隔離されている。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは検出チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは、第2の抵抗チャネルを介して検出チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、抵抗チャネルまたは第2の抵抗チャネルは、蛇行抵抗チャネルである。いくつかの局面では、抵抗チャネルまたは第2の抵抗チャネルは、少なくとも2つのヘアピン部を含む。いくつかの局面では、抵抗チャネルまたは第2の抵抗チャネルは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの直角部を含む。

いくつかの局面では、増幅チャンバは、密閉可能な試料投入口を含む。いくつかの局面では、試料投入口は、スワブの周りにシールを形成するように構成される。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、増幅チャンバから検出チャンバに流体を圧送するための第1のポンプに接続するように構成される。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、検出試薬チャンバから検出チャンバに流体を圧送するための第2のポンプに接続するように構成される。いくつかの局面では、第1のポンプまたは第2のポンプは、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである。いくつかの局面では、増幅チャンバは、空気圧を受けるように構成されたポートに流体接続される。いくつかの局面では、増幅チャンバは、チャネルを介してポートに流体接続される。いくつかの局面では、増幅試薬チャンバは、空気圧を受けるように構成された第2のポートに接続される。いくつかの局面では、増幅試薬チャンバは、第2のチャネルを介して第2のポートに流体接続される。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、増幅試薬チャンバから増幅チャンバに流体を圧送するための第3のポンプに接続するように構成される。いくつかの局面では、第3のポンプは、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは、空気圧を受けるように構成されたポートに接続される。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは、第3のチャネルを介して第3のポートに流体接続される。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、検出試薬チャンバから検出チャンバに流体を圧送するための第4のポンプに接続するように構成される。いくつかの局面では、第4のポンプは、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、ガスマニホールドに結合するように構成された複数のポートをさらに含み、複数のポートは、空気圧を受けるように構成される。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジのいずれのチャンバも、複数のポートに接続される。いくつかの局面では、バルブは、電流電気信号の印加により開かれる。

いくつかの局面では、検出試薬チャンバは円形である。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは細長い。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは六角形である。いくつかの局面では、抵抗チャネルの領域は、正味の流れ方向に対して垂直な方向に流れを導くように成形される。いくつかの局面では、抵抗チャネルの領域は、抵抗チャネルの2つの末端で画定される軸に対して垂直な方向に流れを導くように成形される。いくつかの局面では、抵抗チャネルの領域は、マイクロ流体カートリッジのz軸に沿って流れを導くように成形される。いくつかの局面では、バルブは、増幅混合物スプリッターを介して2つの検出チャンバに流体接続される。いくつかの局面では、バルブは、増幅混合物スプリッターを介して3、4、5、6、7、8、9、または10個の検出チャンバに流体接続される。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、検出試薬チャンバにおよび検出チャンバに流体接続された第2のバルブをさらに含む。いくつかの局面では、検出チャンバは、疎水性PTFEベントで通気される。いくつかの局面では、検出チャンバは光学的に透明な表面を含む。

いくつかの局面では、増幅チャンバは、10μL～500μLの流体を保持するように構成される。いくつかの局面では、増幅試薬チャンバは、10μL～500μLの流体を保持するように構成される。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、核酸を含む2μL～100μLの試料を受け入れるように構成される。いくつかの局面では、増幅試薬チャンバは、5～200μlの増幅緩衝液を含む。いくつかの局面では、増幅チャンバは、45μlの増幅緩衝液を含む。いくつかの局面では、検出試薬チャンバは、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、および標識されたディテクター核酸を含む5～200μlの流体を貯蔵する。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、2、3、4、5、6、7、または8個の検出チャンバを含む。いくつかの局面では、2、3、4、5、6、7、または8個の検出チャンバは、単一の試料チャンバに流体接続されている。いくつかの局面では、検出チャンバは、最大100μL、200μL、300μL、または400μLの流体を保持する。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、5～7つの層を含む。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、図130Bに示すような層を含む。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、スリップルアーチップに適合するように構成された試料投入口をさらに含む。いくつかの局面では、スリップルアーチップは、試料を保持するシリンジに合うように適合される。いくつかの局面では、試料投入口は気密封止可能である。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、スライドバルブをさらに含む。いくつかの局面では、スライドバルブは、増幅試薬チャンバを増幅チャンバに接続する。いくつかの局面では、スライドバルブは、増幅チャンバを検出試薬チャンバに接続する。いくつかの局面では、スライドバルブは、増幅試薬チャンバを検出チャンバに接続する。

様々な局面では、本開示は、マイクロ流体カートリッジを受け入れるように構成されたマニホールドを提供する。いくつかの局面では、マニホールドは、検出チャンバに流体を圧送するように構成されたポンプと、検出チャンバを照明するように構成された照明源と、標識されたディテクター核酸によって生成された検出可能な信号を検出するように構成された検出器と、増幅チャンバを加熱するように構成されたヒーターとを含む。いくつかの局面では、マニホールドは、検出チャンバを加熱するように構成された第2のヒーターをさらに含む。

いくつかの局面では、照明源は、広域スペクトル光源である。いくつかの局面では、照明源の光は、5nm未満の帯域幅を有する照明をもたらす。いくつかの局面では、照明源は、発光ダイオードである。いくつかの局面では、発光ダイオードは、白色光、青色光、または緑色光を生成する。

いくつかの局面では、検出可能な信号は光である。いくつかの局面では、検出器はカメラまたはフォトダイオードである。いくつかの局面では、検出器は、100nm未満、75nm未満、50nm未満、40nm未満、30nm未満、20nm未満、10nm未満、または5nm未満の検出帯域幅を有する。

いくつかの局面では、マニホールドは、検出チャンバと検出器との間に存在するように構成された光学フィルターをさらに含む。いくつかの局面では、増幅チャンバは増幅試薬を含む。いくつかの局面では、増幅試薬チャンバは増幅試薬を含む。いくつかの局面では、増幅試薬は、プライマー、ポリメラーゼ、dNTP、増幅緩衝液を含む。いくつかの局面では、増幅チャンバは溶解緩衝液を含む。いくつかの局面では、増幅試薬チャンバは溶解緩衝液を含む。いくつかの局面では、増幅試薬は逆転写酵素を含む。いくつかの局面では、増幅試薬は、熱サイクル増幅のための試薬を含む。いくつかの局面では、増幅試薬は、等温増幅のための試薬を含む。いくつかの局面では、増幅試薬は、転写増幅（TMA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（cHDA）、鎖置換増幅（SDA）、ループ介在増幅（LAMP）、指数関数的増幅反応（EXPAR）、ローリングサークル増幅（RCA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、多置換増幅（MDA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（HIP）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、または改良多置換増幅（IMDA）のための試薬を含む。いくつかの局面では、増幅試薬は、ループ介在増幅（LAMP）のための試薬を含む。

いくつかの局面では、溶解緩衝液および増幅緩衝液は、単一の緩衝液である。いくつかの局面では、溶解緩衝液貯蔵チャンバは溶解緩衝液を含む。いくつかの局面では、溶解緩衝液はpH 4～pH 5のpHを有する。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは逆転写試薬をさらに含む。いくつかの局面では、逆転写試薬は、逆転写酵素、プライマーおよびdNTPを含む。いくつかの局面では、プログラマブルヌクレアーゼは、RuvC触媒作用ドメインを含む。いくつかの局面では、プログラマブルヌクレアーゼは、V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である。いくつかの局面では、V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質は、Cas12タンパク質である。いくつかの局面では、Cas12タンパク質は、Cas12aポリペプチド、Cas12bポリペプチド、Cas12cポリペプチド、Cas12dポリペプチド、Cas12eポリペプチド、C2c4ポリペプチド、C2c8ポリペプチド、C2c5ポリペプチド、C2c10ポリペプチド、およびC2c9ポリペプチドを含む。いくつかの局面では、Cas12タンパク質は、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。いくつかの局面では、Cas12タンパク質は、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37から選択される。

いくつかの局面では、V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質はCas14タンパク質である。いくつかの局面では、Cas14タンパク質は、Cas14aポリペプチド、Cas14bポリペプチド、Cas14cポリペプチド、Cas14dポリペプチド、Cas14eポリペプチド、Cas14fポリペプチド、Cas14gポリペプチド、Cas14hポリペプチド、Cas14iポリペプチド、Cas14jポリペプチド、またはCas14kポリペプチドを含む。いくつかの局面では、Cas14タンパク質は、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。いくつかの局面では、Cas14タンパク質は、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129から選択される。

いくつかの局面では、V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質は、Casφタンパク質である。いくつかの局面では、CasФタンパク質は、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。いくつかの局面では、CasФタンパク質は、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321から選択される。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写するための1つまたは複数のチャンバをさらに提供する。いくつかの局面では、インビトロ転写は、増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写のための試薬に接触させることを含む。いくつかの局面では、インビトロ転写のための試薬は、RNAポリメラーゼ、NTP、およびプライマーを含む。

いくつかの局面では、プログラマブルヌクレアーゼは、HEPN切断ドメインを含む。いくつかの局面では、プログラマブルヌクレアーゼは、VI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である。いくつかの局面では、VI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質は、Cas13タンパク質である。いくつかの局面では、Cas13タンパク質は、Cas13aポリペプチド、Cas13bポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13dポリペプチド、またはCas13eポリペプチドを含む。いくつかの局面では、Cas13タンパク質は、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:137のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。いくつかの局面では、Cas13タンパク質は、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:137から選択される。

いくつかの局面では、標的核酸はウイルスに由来する。いくつかの局面では、ウイルスは呼吸器ウイルスを含む。いくつかの局面では、呼吸器ウイルスは上気道ウイルスである。いくつかの局面では、ウイルスはインフルエンザウイルスを含む。いくつかの局面では、ウイルスはコロナウイルスを含む。

いくつかの局面では、コロナウイルス標的核酸はSARS-CoV-2に由来する。いくつかの局面では、コロナウイルス標的核酸は、N遺伝子、E遺伝子、またはそれらの組み合わせに由来する。いくつかの局面では、コロナウイルス標的核酸は、SEQ ID NO:333～SEQ ID NO:338のいずれか1つの配列を有する。いくつかの局面では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの局面では、複数の標的配列は、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、および第3の病原体に由来する配列を含む。

いくつかの局面では、ガイド核酸はガイドRNAである。いくつかの局面では、ガイド核酸は、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:328のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。いくつかの局面では、ガイド核酸は、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:328のいずれか1つから選択される。いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは対照核酸を含む。いくつかの局面では、対照核酸は検出チャンバ内に存在する。いくつかの局面では、対照核酸はRNasePである。いくつかの局面では、対照核酸はSEQ ID NO:379の配列を有する。

いくつかの局面では、ガイド核酸は、SEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する。いくつかの局面では、ガイド核酸は、SEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332のいずれか1つから選択される。いくつかの局面では、ガイド核酸は、複数の標的配列を標的とする。

いくつかの局面では、マイクロ流体カートリッジは、ウイルスに対してタイリングされた複数のガイド配列を含む。いくつかの局面では、標識されたディテクター核酸は、検出部分を含む一本鎖レポーターを含む。いくつかの局面では、検出部分は、フルオロフォア、FRET対、フルオロフォア/クエンチャー対、または電気化学的レポーター分子である。いくつかの局面では、電気化学的レポーター分子は、図149に示す種を含む。いくつかの局面では、標識されたディテクターは、ディテクター核酸の切断により、検出可能な信号を生成した。いくつかの局面では、検出可能な信号は、比色信号、蛍光信号、電流測定信号、または電位差測定信号である。

様々な局面では、本開示は、対象由来の試料を提供する工程;試料をマイクロ流体カートリッジに添加する工程;検出可能な信号を標的核酸の存在または非存在と相関させる工程;および、任意で、検出可能な信号を定量し、それにより、試料中に存在する標的核酸の量を定量する工程を含む、標的核酸を検出する方法を提供する。

いくつかの局面では、標的核酸を検出するための方法においてマイクロ流体カートリッジを使用することができる。いくつかの局面では、ターゲティング核酸を検出するための方法においてシステムを使用することができる。いくつかの局面では、標的核酸を検出するための方法においてプログラマブルヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの局面では、標的核酸を検出するための方法において組成物を使用することができる。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼを、試料中のウイルス由来の標的デオキシリボ核酸をアッセイするための方法で使用することができる。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼを、試料中のウイルス由来の標的リボ核酸をアッセイする方法で使用することができる。いくつかの局面では、試料中の標的核酸を検出するための方法においてプログラマブルヌクレアーゼを使用することができる。

様々な局面では、本開示は、ウイルス由来の標的配列を標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化することができるプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって、検出可能な信号を生成することができる、レポーターを含む、標的核酸を検出するためのシステムを提供する。

いくつかの局面では、レポーターは、検出部分を含む一本鎖レポーターを含む。いくつかの局面では、ウイルスはインフルエンザウイルスを含む。いくつかの局面では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの局面では、ウイルスは呼吸器ウイルスを含む。いくつかの局面では、呼吸器ウイルスは上気道ウイルスである。いくつかの局面では、ガイド核酸は、複数の標的配列を標的とする。

いくつかの局面では、システムは、ウイルスに対してタイリングされた複数のガイド配列を含む。いくつかの局面では、複数の標的配列は、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、および第3の病原体に由来する配列を含む。いくつかの局面では、一本鎖レポーターは5’末端に検出部分を含む。いくつかの局面では、一本鎖レポーターは、ビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を含む。いくつかの局面では、一本鎖レポーターは、基材にコンジュゲートさせることができる3’末端における化学機能ハンドルを含む。

いくつかの局面では、基材は磁気ビーズである。いくつかの局面では、基材は反応チャンバの表面である。いくつかの局面では、反応チャンバの下流は試験ラインである。いくつかの局面では、試験ラインはストレプトアビジンを含む。いくつかの局面では、試験ラインの下流はフローコントロールラインである。いくつかの局面では、フローコントロールラインは抗IgG抗体を含む。いくつかの局面では、抗IgG抗体は抗ウサギIgG抗体を含む。

いくつかの局面では、活性化ヌクレアーゼは、一本鎖レポーターを切断することができ、ビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を放出する。いくつかの局面では、ビオチン-dT/FAM部分は、試験ラインでストレプトアビジンに結合することができる。いくつかの局面では、レポーターは電気活性レポーターである。いくつかの局面では、電気活性レポーターはビオチンおよびメチレンブルーを含む。いくつかの局面では、レポーターは酵素-核酸である。いくつかの局面では、酵素-核酸はインベルターゼ酵素である。いくつかの局面では、酵素-核酸の酵素は、立体障害酵素である。

いくつかの局面では、酵素-核酸の核酸の切断により、酵素は機能的となる。いくつかの局面では、検出可能な信号は、比色信号、蛍光信号、電流測定信号、または電位差測定信号である。

様々な局面では、本開示は、標的配列を標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化することができるプログラマブルヌクレアーゼ;ならびにレポーターに、試料を接触させる工程であって、レポーターが、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって、検出可能な信号を生成することができる、工程を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法を提供する。

いくつかの局面では、標的核酸は外因性病原体に由来する。いくつかの局面では、外因性病原体はウイルスを含む。いくつかの局面では、ウイルスはインフルエンザウイルスを含む。いくつかの局面では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの局面では、ウイルスは呼吸器ウイルスを含む。いくつかの局面では、呼吸器ウイルスは上気道ウイルスである。

いくつかの局面では、検出可能な信号は、試料中のウイルスの存在を示す。いくつかの局面では、方法は、試料がウイルスと共に採取された対象を診断する工程をさらに含む。いくつかの局面では、対象はヒトである。いくつかの局面では、試料は、頬スワブ、鼻スワブ、または尿である。いくつかの局面では、レポーターは、検出部分を含む一本鎖レポーターを含む。いくつかの局面では、ガイド核酸は、複数の標的配列を標的とする。

いくつかの局面では、システムは、ウイルスに対してタイリングされた複数のガイド配列を含む。いくつかの局面では、複数の標的配列は、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、および第3の病原体に由来する配列を含む。いくつかの局面では、一本鎖レポーターは5’末端に検出部分を含む。いくつかの局面では、一本鎖レポーターは、ビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を含む。いくつかの局面では、一本鎖レポーターは、基材にコンジュゲートさせることができる3’末端における化学機能ハンドルを含む。いくつかの局面では、基材は磁気ビーズである。

いくつかの局面では、基材は反応チャンバの表面である。いくつかの局面では、反応チャンバの下流は試験ラインである。いくつかの局面では、試験ラインはストレプトアビジンを含む。いくつかの局面では、試験ラインの下流はフローコントロールラインである。いくつかの局面では、フローコントロールラインは抗IgG抗体を含む。いくつかの局面では、抗IgG抗体は抗ウサギIgG抗体を含む。

いくつかの局面では、活性化ヌクレアーゼは、一本鎖レポーターを切断することができ、ビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を放出する。いくつかの局面では、ビオチン-dT/FAM部分は、試験ラインでストレプトアビジンに結合することができる。いくつかの局面では、レポーターは電気活性レポーターである。いくつかの局面では、電気活性レポーターはビオチンおよびメチレンブルーを含む。いくつかの局面では、レポーターは酵素-核酸である。いくつかの局面では、酵素-核酸はインベルターゼ酵素である。いくつかの局面では、酵素-核酸の酵素は、立体障害酵素である。いくつかの局面では、酵素-核酸の核酸の切断により、酵素は機能的となる。いくつかの局面では、検出可能な信号は、比色信号、蛍光信号、電流測定信号、または電位差測定信号である。いくつかの局面では、上記システムのいずれかにおいて、呼吸器ウイルスは下気道ウイルスである。いくつかの局面では、上記方法のいずれかにおいて、呼吸器ウイルスは下気道ウイルスである。

いくつかの局面では、組成物は、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼ;および、標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸を含み、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼは、ガイド核酸に結合して複合体を形成する。いくつかの局面では、組成物はRNAレポーターをさらに含む。いくつかの局面では、組成物は、ウイルス由来の標的デオキシリボ核酸をさらに含む。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸は核酸のアンプリコンである。いくつかの局面では、核酸はデオキシリボ核酸またはリボ核酸である。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼは、VI型CRISPR/Cas酵素である。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼは、Cas13である。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼは、Cas13aである。いくつかの局面では、Cas13aは、Lbu-Cas13aまたはLwa-Cas13aである。いくつかの局面では、組成物はpH 6.8～pH 8.2のpHを有する。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸は、3’末端にグアニンを欠く。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸は一本鎖デオキシリボ核酸である。いくつかの局面では、組成物は支持媒体をさらに含む。いくつかの局面では、組成物はラテラルフローアッセイ装置をさらに含む。いくつかの局面では、組成物は、蛍光検出用に構成された装置をさらに含む。いくつかの局面では、組成物は、第2のガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼをさらに含み、第2のガイド核酸は、ガイド核酸を含む第2の標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む。いくつかの局面では、組成物はDNAレポーターをさらに含む。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼは、V型CRISPR/Cas酵素である。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼは、Cas12である。いくつかの局面では、Cas12は、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、またはCas12eである。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼは、Cas14である。いくつかの局面では、Cas14は、Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、またはCas14hである。

いくつかの局面では、試料中のウイルス由来の標的デオキシリボ核酸をアッセイする方法は、ガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼを含む複合体に試料を接触させる工程、および、複数のRNAレポーターのうちの少なくともいくつかのRNAレポーターの切断によって生じる信号についてアッセイする工程を含み、ガイド核酸は、標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む。

いくつかの局面では、試料中のウイルス由来の標的シリボ核酸をアッセイする方法は、試料中の核酸を増幅して標的デオキシリボ核酸を生成する工程;ガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼを含む複合体に標的デオキシリボ核酸を接触させる工程;および、複数のRNAレポーターのうちの少なくともいくつかのRNAレポーターの切断によって生じる信号についてアッセイする工程を含み、ガイド核酸は、標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼは、VI型CRISPRヌクレアーゼである。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼは、Cas13である。いくつかの局面では、Cas13はCas13aである。いくつかの局面では、Cas13aは、Lbu-Cas13aまたはLwa-Cas13aである。いくつかの局面では、複数のレポーターの少なくとも一部のRNAレポーターの切断は、pH 6.8～pH 8.2で起こる。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸は、3’末端にグアニンを欠く。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸は一本鎖デオキシリボ核酸である。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸はリボ核酸のアンプリコンである。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸またはリボ核酸は生物由来である。いくつかの局面では、生物は、ウイルス、細菌、植物、または動物である。いくつかの局面では、標的デオキシリボ核酸は、核酸増幅法によって生成される。いくつかの局面では、核酸増幅方法は等温増幅である。いくつかの局面では、核酸増幅方法は温熱増幅である。いくつかの局面では、核酸増幅方法は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、転写増幅（TMA）、鎖置換増幅（SDA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、ループ介在増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、または改良多置換増幅（IMDA）、または核酸配列に基づく増幅（NASBA）である。いくつかの局面では、信号は、蛍光、発光、比色、電気化学、酵素、熱量測定、光学、電流測定、または電位差測定である。いくつかの局面では、方法は、試料を第2のガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼに接触させる工程をさらに含み、第2のガイド核酸は、ガイド核酸を含む第2の標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む。いくつかの局面では、方法は、複数のDNAレポーターのうちの少なくとも一部のDNAレポーターの切断によって生じる信号についてアッセイする工程をさらに含む。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼは、V型CRISPRヌクレアーゼである。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼは、Cas12である。いくつかの局面では、Cas12は、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、またはCas12eである。いくつかの局面では、DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼは、Cas14である。いくつかの局面では、Cas14は、Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、またはCas14hである。いくつかの局面では、ガイド核酸はcrRNAを含む。いくつかの局面では、ガイド核酸はcrRNAおよびtracrRNAを含む。いくつかの局面では、信号は、少なくとも一部のRNAレポーターの切断前に存在する。いくつかの局面では、信号は、少なくとも一部のRNAレポーターの切断前には存在しない。いくつかの局面では、試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、粘膜試料、腹膜試料、脳脊髄液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽頭滲出液、尿道または膣分泌物、滲出液、浸出液、または組織を含む。いくつかの局面では、方法は支持媒体上で実行される。いくつかの局面では、方法はラテラルフローアッセイ装置で実行される。いくつかの局面では、方法は、蛍光検出用に構成された装置で実行される。

様々な局面では、本開示は、標的核酸を提供する工程であって、本明細書ではガイド核酸が標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の配列の少なくとも60％がF1c領域とB1領域との間またはF1とB1c領域との間に存在する、工程;および、i）F2領域の配列のF1c領域5’の配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域の配列のB1c領域5’の配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域の配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域の配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマーを設計する工程を含む、標的核酸を増幅するための複数のプライマーを設計する方法を提供する。

様々な局面では、本開示は、
i）F2領域に対応する配列のF1c領域5’に対応する配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域に対応する配列のB1c領域5’に対応する配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域に対応する配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域に対応する配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマー;ガイド核酸が標的核酸にハイブリタイズし、標的核酸の配列の少なくとも60％がF1c領域とB1領域との間またはF1領域とB1c領域との間に存在する、ガイド核酸;レポーター;および、ガイド核酸と複合体を形成した場合にレポーターを切断する、プログラマブルヌクレアーゼに、試料を接触させる工程;ならびに
レポーターの切断によって生じる検出可能な信号を測定する工程であって、測定が試料中の標的核酸の検出をもたらす、工程
を含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。

いくつかの局面では、F1c領域とB1領域との間の配列、またはB1c領域とF1領域との間の配列は、ガイド核酸配列に対して少なくとも50％逆相補的である。いくつかの局面では、ガイド核酸配列は、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、またはそれらの組み合わせの50％以下に対して逆相補的である。いくつかの局面では、ガイド核酸は、フォワードインナープライマーおよびバックワードインナープライマーにハイブリダイズしない。

いくつかの局面では、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、標的核酸の3’である。いくつかの局面では、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、B1領域の3’およびF1c領域の5’であるか、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、F1領域の3’およびB1c領域の5’である。いくつかの局面では、標的核酸の3’末端は、F3c領域の5’末端の5’であるか、または標的核酸の3’末端は、B3c領域の5’末端の5’である。いくつかの局面では、標的核酸の3’末端は、F2c領域の5’末端の5’であるか、または標的核酸の3’末端は、B2c領域の5’末端の5’である。いくつかの局面では、標的核酸はF1c領域とB1領域との間に存在し、標的核酸の3’末端がF2c領域の3’末端の5’であるか、または標的核酸はB1c領域とF1領域との間に存在し、標的核酸の3’末端がB2c領域の3’末端の5’である。

いくつかの局面では、ガイド核酸は、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、またはそれらの任意の組み合わせの50％以下に逆相補的な配列を有する。いくつかの局面では、ガイド核酸配列は、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、またはそれらの任意の組み合わせにハイブリタイズしない。

いくつかの局面では、ガイド核酸配列は、F3c領域、F2c領域、F1c領域、B1c領域、B2c領域、B3c領域、またはそれらの任意の組み合わせの配列の50％以下に逆相補的な配列を有する。いくつかの局面では、ガイド核酸配列は、F3c領域、F2c領域、F1c領域、B1c領域、B2c領域、B3c領域、またはそれらの任意の組み合わせの配列にハイブリタイズしない。

様々な局面では、本開示は、ガイド核酸にハイブリタイズするB2領域とB1領域との間またはF2領域とF1領域との間の配列を含む標的核酸を提供する工程;および、i）F2領域の配列のF1c領域5’の配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域の配列のB1c領域5’の配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域の配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域の配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマーを設計する工程を含む、標的核酸を増幅するための複数のプライマーを設計する方法を提供する。

様々な局面では、本開示は、ガイド核酸にハイブリタイズするF1c領域とF2c領域との間またはB1c領域とB2c領域との間の配列を含む標的核酸を提供する工程;および、i）F2領域の配列のF1c領域5’の配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域の配列のB1c領域5’の配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域の配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域の配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマーを設計する工程を含む、標的核酸を増幅するための複数のプライマーを設計する方法を提供する。

様々な局面では、本開示は、i）F2領域に対応する配列のF1c領域5’に対応する配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域に対応する配列のB1c領域5’に対応する配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域に対応する配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域に対応する配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマー;標的核酸が、ガイド核酸にハイブリタイズするB2領域とB1領域との間またはF2領域とF1領域との間の配列を含む、ガイド核酸;レポーター;および、ガイド核酸と複合体を形成した場合にレポーターを切断する、プログラマブルヌクレアーゼに、試料を接触させる工程;ならびに、レポーターの切断によって生じる検出可能な信号を測定する工程であって、測定が試料中の標的核酸の検出をもたらす、工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。

様々な局面では、本開示は、i）F2領域に対応する配列のF1c領域5’に対応する配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域に対応する配列のB1c領域5’に対応する配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域に対応する配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域に対応する配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマー;標的核酸が、ガイド核酸にハイブリタイズするF1c領域とF2c領域との間またはB1c領域とB2c領域との間の配列を含む、ガイド核酸;レポーター;および、ガイド核酸と複合体を形成した場合にレポーターを切断する、プログラマブルヌクレアーゼに、試料を接触させる工程;ならびに、レポーターの切断によって生じる検出可能な信号を測定する工程であって、測定が試料中の標的核酸の検出をもたらす、工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。

いくつかの局面では、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、B2領域の3’およびB1領域の5’であるか、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、F2領域の3’およびF1領域の5’である。いくつかの局面では、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、B1c領域の3’およびB2c領域の5’であるか、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、F1c領域の3’およびF2c領域の5’である。

いくつかの局面では、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）は、標的核酸の3’である。いくつかの局面では、PAMおよびPFSは、F1c領域の5’末端の5’、B1c領域の5’末端の5’、F3領域の3’末端の3’、B3領域の3’末端の3’、F2領域の3’末端の3’、B2領域の3’末端の3’、またはそれらの任意の組み合わせである。

いくつかの局面では、PAMおよびPFSは、F2領域、B3領域、F1c領域、F2領域、B1c領域、B2領域、またはそれらの任意の組み合わせと重複しない。いくつかの局面では、PAMおよびPFSは、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、またはそれらの任意の組み合わせにハイブリタイズしない。

いくつかの局面では、複数のプライマーは、ループフォワードプライマーをさらに含む。いくつかの局面では、複数のプライマーは、ループバックワードプライマーをさらに含む。いくつかの局面では、ループフォワードプライマーは、F1c領域とF2c領域との間に存在する。いくつかの局面では、ループバックワードプライマーは、B1c領域とB2c領域との間に存在する。

いくつかの局面では、標的核酸は一塩基多型（SNP）を含む。いくつかの局面では、一塩基多型（SNP）は、HERC2 SNPを含む。いくつかの局面では、一塩基多型（SNP）は、がんのリスク増加またはリスク減少に関連する。いくつかの局面では、標的核酸は一塩基多型（SNP）を含み、検出可能な信号は、一塩基多型（SNP）を含む標的核酸に100％相補的なガイド核酸の存在下では、一塩基多型（SNP）を含む標的核酸に100％未満で相補的なガイド核酸の存在下よりも高い。

いくつかの局面では、複数のプライマーおよびガイド核酸は、標的核酸を含む試料中に一緒に存在する。いくつかの局面では、試料を複数のプライマーに接触させることにより、標的核酸が増幅される。いくつかの局面では、増幅および試料のガイド核酸への接触は同時に行われる。いくつかの局面では、増幅および試料のガイド核酸への接触は、異なる時間に行われる。いくつかの局面では、方法は、ポリメラーゼ、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、またはそれらの任意の組み合わせを提供する工程をさらに含む。

いくつかの局面では、標的核酸はウイルスに由来する。いくつかの局面では、ウイルスは、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる局面では、インフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの局面では、ウイルスは呼吸器ウイルスを含む。さらなる局面では、呼吸器ウイルスは上気道ウイルスである。

いくつかの局面では、システムは、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの局面では、方法は、試料を、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせに接触させる工程をさらに含む。いくつかの局面では、方法は、標的デオキシリボ核酸を、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせを用いて増幅する工程をさらに含む。いくつかの局面では、増幅は、試料をフォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせと接触させる工程をさらに含む。

参照による援用
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な料金の支払いに応じて局から提供される。本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が用いられる例示的な態様を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
（図１）CRISPR-Cas反応のワークフローを示す概略図である。ワークフローに示される工程1は試料の調製であり、ワークフローに示される工程2は核酸の増幅である。ワークフローに示される工程3は、Cas反応インキュベーションである。ワークフローに示される工程4は、検出（読み出し）である。必須ではない工程は、楕円形の円で示されている。検出および読み出しがCRISPR反応に組み込まれる場合、工程1および2は必須ではなく、工程3および4は同時に行うことができる。
（図２）図1のワークフロー概略図の工程1で使用され得る、試料調製のための例示的な流体装置を示す。この図に示される試料調製流体装置は、異なる種類の生物学的試料、すなわち、指先穿刺による血液、尿、または、糞便、頬もしくは他の収集物を含むスワブを処理することができる。
（図３）図1のワークフロー概略図の工程2～工程4で使用され得る、蛍光または電気化学的読み出しを含むCas反応のための3つの例示的な流体装置を示す。この図は、装置が図1のワークフロー概略図の工程2～4の3回の反復を実行することを示している。
（図４）（a）蛍光読み出しおよび（b）電気化学的読み出しを含む、使用され得る読み出しプロセスの概略図を示す。
（図５）比色または電気化学的/血糖値測定器（glucometer）読み出しを含む、結合したインベルターゼ/Cas反応のための例示的な流体装置を示す。この図は、酵素インベルターゼと結合したCas反応を縮小化するための流体装置を示す。表面改質、ならびに（a）DNSまたは他の化合物を使用した光学的読み出し、および（b）電気化学的読み出し（電気化学分析器または血糖値測定器）を含む読み出しプロセスは、下部の分解図スキームに示されている。
（図６）図6Aは、検出効率について評価されたRSVについてのgRNAのパネルを示す。バックグラウンドを差し引いた行の正方形が暗いほど、RSV標的核酸を検出する効率が高いことを示す。図6Bは、バックグラウンドを差し引いた蛍光に対するgRNAのプールのグラフを示す。
（図７）本開示の試料調製装置の個々の部品を示す。
（図８）試料プロセシング装置を使用した、試料ワークフローを示す図である。
（図９）残りの臨床試料からインフルエンザA RNAを抽出するために使用される抽出緩衝液を示す。
（図１０）低pH条件でインフルエンザAゲノムRNAの迅速な抽出が可能になることを示す。
（図１１）Cas12aによる、インフルエンザA、インフルエンザB、およびヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のウイルスRNAの検出へのRT-RPAの適用を示す図である。左の概略図は、DNA/RNA、RPA/RT-RPAの提供、およびCas12a検出を含むワークフローを示す。右のグラフは、蛍光によって測定されるCas12a検出の経時的な結果を示す。
（図１２）Cas13aを使用したウイルスRNAの検出を可能にする、IVT反応と組み合わせたRT-RPAの適用を示す。左の概略図は、DNA/RNA、RPA/RT-RPAの提供、インビトロ転写、およびCas13a検出を含むワークフローを示す。右のグラフは、各試験条件について、蛍光によって測定したCas13a検出の結果を示す。
（図１３）Cas13aによって検出される、RT-RPA-IVT「ツーポット」反応を使用したRNAウイルスからのRNAの生成を示す。左の概略図は、DNA/RNAの提供、第1の反応におけるRPA/RT-RPAおよびインビトロ転写を含む「ツーポット」反応、ならびに第2の反応におけるCas13a検出を含む、ワークフローを示す。右のグラフは、各試験条件について、蛍光によって測定したCas13a検出の結果を示す。
（図１４）ワンポットCas13aアッセイの実行に対する様々な緩衝液の効果を示す。左の概略図は、DNA/RNAおよびRPA/RT-RPAの提供、インビトロ転写、ならびにCas13a検出を含むワークフローを示す。右のグラフは、各試験条件について、蛍光によって測定したCas13a検出の結果を示す。
（図１５）ワンポットCas13aアッセイを使用した、ヤギに感染する小反芻獣疫（Peste des petits ruminants）（PPR）ウイルスからのウイルスRNAの特異的検出を示す図である。左の概略図は、DNA/RNAおよびRPA/RT-RPAの提供、インビトロ転写、ならびにCas13a検出を含むワークフローを示す。右のグラフは、蛍光によって経時的に測定されるCas13a検出の、試験条件についての結果を示す。
（図１６）40°Cで実施されるワンポットCas13aアッセイを使用した、インフルエンザBの特異的検出を示す。40fMのウイルスRNAを反応物に添加した。左の概略図は、DNA/RNAおよびRPA/RT-RPAの提供、インビトロ転写、ならびにCas13a検出を含むワークフローを示す。右のグラフは、各試験条件について、蛍光によって測定したCas13a検出の結果を示す。
（図１７）universal輸送培地（UTM Copan）と呼ばれるuniversal輸送培地の存在下および非存在下での、40°CでのインフルエンザBウイルスからのRNAの検出のためのワンポットCas13aアッセイの耐性を示す。左の概略図は、DNA/RNAおよびRPA/RT-RPAの提供、インビトロ転写、ならびにCas13a検出を含むワークフローを示す。右のグラフは、蛍光によって経時的に測定されるCas13a検出の、各試験条件についての結果を示す。
（図１８）様々な温度でのワンポットCas13a検出アッセイを示す。図18Aは、DNA/RNAの提供、ならびにRPA/RT-RPA、インビトロ転写、およびCas13a検出を含むワンポット反応を含むワークフローの概略図を示す。図18Bは、様々な温度でのインフルエンザA RNAのCas13a検出のグラフを示す。図18Cは、様々な温度でのインフルエンザB RNAのCas13a検出のグラフを示す。図18Dは、様々な温度でのヒトRSV RNAのCas13a検出のグラフを示す。
（図１９）マムーサス・プリミゲニウス（Mammuthus primigenius）（ケナガマンモス）ミトコンドリア由来のDNA配列を使用した、内部増幅対照の検出のためのLAMP反応の最適化を示す図である。図19Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas12a検出を含むワークフローの概略図を示す。図19Bは、蛍光によって定量化される、マムーサス・プリミゲニウスに由来するDNA配列を使用した内部増幅対照のためのLAMP反応が起こる時間を示す図である。図19Cは、68°Cの温度反応からの、37°CでのLAMPアンプリコンのCas12a特異的検出を示す。
（図２０）LAMPの最適化およびヒトPOP7遺伝子のCas12特異的検出を示す。ヒトPOP7遺伝子は、RNase P

の成分である。図20Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas12a検出を含むワークフローの概略図を示す。図20Bは、蛍光によって定量化される、異なる温度でのRNase P POP7のためのLAMP/RT-LAMP反応の結果に至る時間を示す。図20Cは、68°Cの温度反応からの、LAMP/RT-LAMPアンプリコンの37°CでのCas12a特異的検出を示す3つのグラフを示す。
（図２１）インフルエンザAウイルス用の、3つの異なるRT-LAMPアンプリコンの特異的検出を示す。左側は、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas12a検出を含むワークフローの概略図である。右側は、蛍光によって経時的に測定されたCas12a検出の、各試験条件についての結果を示すグラフである。
（図２２）インフルエンザB（IBV）RT-LAMPアンプリコンの特異的検出のための最適なcrRNAの同定を示す。左側は、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas12a検出を含むワークフローの概略図である。右側は、各試験条件について経時的に蛍光によって測定したCas12a検出の結果を示すグラフである（IAVはインフルエンザAウイルスであり、IBVはインフルエンザBウイルスであり、NTCはテンプレートの無い対照である）。
（図２３）RT-LAMP反応の生成物を示すバンドを有する1％アガロースゲルの結果を示す。
（図２４）インフルエンザAおよびインフルエンザBについての多重化RT-LAMP反応からのアンプリコン間のCas12a識別を示す。図24Aは、ウイルスRNA、多重化RT-LAMPの提供、およびCas12aインフルエンザA検出またはCas12aインフルエンザB検出を含むワークフローの概略図を示す。図24Bは、60°Cで30分間の多重化RT-LAMP増幅後のRT-LAMPアンプリコンのCas12a検出を示す。図24Cは、IAVおよびIBVの10,000ウイルスゲノムコピーについてRT-LAMPアンプリコンを37°Cで30分間Cas12a検出した、バックグラウンドを差し引いた蛍光を示す。
（図２５）60°Cで30分間の多重化RT-LAMP増幅後、インフルエンザA、インフルエンザB、およびマムーサス・プリミゲニウス（ケナガマンモス）ミトコンドリア内部増幅対照配列についての三つ組み多重化RT-LAMP反応間のCas12a識別を示す。上部は、ウイルスRNA、多重化RT-LAMPの提供、およびCas12aインフルエンザA検出またはCas12aインフルエンザB検出またはCas12内部増幅対照検出を含むワークフローの概略図である。下部は、蛍光によって経時的に測定されたCas12検出の、各試験条件についての結果を示すグラフである。
（図２６）LAMPおよびRT-LAMPプライマー設計の概略図を示す。図26Aは、LAMPおよびRT-LAMPで使用されるプライマーの同一性を示す概略図を示す。プライマーLFおよびLBは、いくつかのLAMPおよびRT-LAMP設計では任意選択であるが、一般に反応の効率を上げる。図26Bは、様々なLAMPプライマーにおけるT7プロモーターの位置および配向を示す概略図を示す。
（図２７）T7プロモーターが、F3もしくはB3プライマー（アウタープライマー）、またはインフルエンザAのためのFIPもしくはBIPプライマーに含まれ得ることを示す。図27Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、インビトロ転写、およびCas13a検出を含むワークフローの概略図を示す。図27Bは、蛍光によって定量化された、異なるプライマーセットを使用したインフルエンザAのRT-LAMP反応の結果までの時間を示す。図27Cは、異なるプライマーセットを37°Cで10分間使用した、インフルエンザAについてのRT-LAMP反応の生成物のT7 RNAポリメラーゼによるインビトロ転写（IVT）を示す。
（図２８）Cas12による、インフルエンザAについてのRT-SIBAアンプリコンの検出を示す。左側は、DNA/RNA、SIBA/RT-SIBAの提供、およびCas12a検出を含むワークフローの概略図である。右側は、試験した条件のそれぞれについて蛍光によって測定したCas12a検出を示すグラフである。
（図２９）典型的なレポーターを含む、Mileniaの市販ストリップのレイアウトを示す。
（図３０）アンプリコンを含む、Milenia HybridDetect 1ストリップのレイアウトを示す。
（図３１）標準的なCasレポーターを含む、Milenia HybridDetect 1ストリップのレイアウトを示す。
（図３２）FAM分子（緑色のスタートで示す）に結合したビオチン-dT（ピンクの六角形で示す）へのDNAリンカーを含む改変Casレポーターを示す。
（図３３）改変Casレポーターを含む、Milenia HybridDetectストリップのレイアウトを示す。
（図３４）単一の標的アッセイフォーマット（左）および多重化アッセイフォーマット（右）の一例を示す。
（図３５）使用前のアッセイ（上）、陽性結果を有するアッセイ（左中央）、陰性結果を有するアッセイ（右中央）、および失敗した試験（下）の別のバリエーションを示す。
（図３６）つながれたラテラルフローCasレポーターの1つの設計を示す。
（図３７）磁気ビーズを使用するつながれた切断レポーターを使用する、CRISPR診断のためのワークフローを示す。
（図３８）反応チャンバに到達する前にストレプトアビジン-ビオチンによって濾過される酵素-レポーター系の概略図を示す。
（図３９）標的核酸の検出に使用されるインベルターゼ核酸を示す。インベルターゼ-核酸は、磁気ビーズ上に固定化されており、Casタンパク質、ガイドRNAおよび標的核酸を含む試料反応に添加される。標的認識は、Casタンパク質を活性化して、インベルターゼ-核酸の核酸を切断し、固定化された磁気ビーズからインベルターゼ酵素を遊離させる。この溶液は、スクロースおよびDNS試薬を含有し、インベルターゼがスクロースをグルコースに変換すると黄色から赤色に変色する「反応混合物」に移されるか、またはデジタル読み出しのために手持ち式血糖値測定器装置に移すことができる。
（図４０）ツーポットDETECTRアッセイの1つのレイアウトを示す。このレイアウトでは、スワブ収集キャップがスワブ貯蔵器チャンバを密閉する。スワブ貯蔵器チャンバに対して時計回りに、増幅反応混合物を保持するチャンバがある。増幅反応混合物を保持するチャンバに対して時計回りに、DETECTR反応混合物を保持するチャンバがある。これに対して時計回りに検出領域がある。検出領域に対して時計回りに、pHバランスウェルがある。カートリッジウェルのキャップが示され、様々な試薬混合物を含有するすべてのウェルを封止している。カートリッジ自体は、概略図の下部に正方形の層として示されている。右側には、各チャンバ/ウェル内の流体を駆動し、カートリッジ全体に接続される、機器パイパーポンプの図が示されている。カートリッジの下方には、機器と接続する回転バルブがある。
（図４１）図40のツーポットDETECTRアッセイにおける様々な反応の一ワークフローを示す。最初に、左上の図に示すように、スワブが200ulスワブチャンバに挿入され、混合され得る。中央の左の図では、バルブを時計回りに「スワブチャンバ位置」まで回転させ、1uLの試料を採取する。左下の図では、バルブを時計回りに「増幅反応混合」位置まで回転させ、1ulの試料を分注して混合する。右上の図では、2uLの試料が「増幅反応混合」から吸引される。上の中央の図では、バルブを時計回りに「DETECTR」位置まで回転させ、試料を分注して混合し、20ulの試料が吸引される。最後に、右下の図では、バルブを時計回りに検出領域位置まで回転させ、20ulの試料を分注する。
（図４２）本開示の方法およびシステムとも一致する、図41に示されるワークフローの変形例を示す。左側は、図41の右上に示されている図である。右側は修正図であり、そこでは、スワブ溶解チャンバに対して反時計回りに第1の増幅チャンバがあり、スワブ溶解チャンバに対して時計回りに第2の増幅チャンバがある。さらに、増幅チャンバ＃2に対して時計回りに2つのセット、すなわちそれぞれ「二重DETECTRチャンバ＃2」および「二重DETECTRチャンバ＃1」と標識された「二重」DETECTRチャンバがある。
（図４３）図42に示す変更されたレイアウトのワークフローの内訳を示す。具体的には、200ulの試料を保持するスワブ溶解チャンバから、20ulの試料を増幅チャンバ＃1に移動させることができ、20ulの試料を増幅チャンバ＃2に移動させることができる。増幅チャンバ＃1で増幅した後、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃1aに移動させ、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃1bに移動させることができる。さらに、増幅チャンバ＃2で増幅した後、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃2aに移動させ、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃2bに移動させることができる。
（図４４）図43および図42に示すカートリッジの変形例を示す。
（図４５）図44のカートリッジの上面図を示す。このレイアウトおよびワークフローは、図40～図41のレイアウトおよびワークフローと比較する再現を有する。
（図４６）ツーポットDETECTRアッセイのレイアウトを示す。上部には、カートリッジと接続する空気圧ポンプが示されている。中央には、貯蔵器を有する最上層を示すカートリッジの上面図が示されている。下部には、試料を含むスライドバルブ、および左側の溶解チャンバを指す矢印が示され、右側に増幅チャンバ、さらに右側にDETECTチャンバが続く。
（図４７）本明細書に開示されるDETECTRアッセイと、標的核酸を検出するゴールドスタンダードPCRベース方法との比較を示す。粗（左）から純粋（右）への試料調製評価の勾配を示すフローチャートが示されている。粗試料を純粋な試料にする試料調製工程には、溶解、結合、洗浄および溶出が含まれる。本明細書に開示されるDETECTRアッセイは、溶解の試料調製工程のみを必要とし、粗試料をもたらし得る。一方、PCRベース方法は、溶解、結合、洗浄および溶出を必要とし、非常に純粋な試料をもたらし得る。
（図４８）標的RT-LAMP DNAアンプリコンのCas13a検出を示す。図48Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas13a検出を含むワークフローの概略図を示す。図48Bは、y軸上のバックグラウンドを差し引いた蛍光によって測定される、第1のプライマーセットを含む標的RT-LAMP DNAアンプリコンのCas13a特異的検出を示す。図48Cは、y軸上のバックグラウンドを差し引いた蛍光によって測定される、第2のプライマーセットを含む標的RT-LAMP DNAアンプリコンのCas13a特異的検出を示す。
（図４９）図49Aは、2.5nMのRNA、一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖（dsDNA）を標的核酸として使用するCas13検出アッセイを示し、検出は試験した標的核酸のそれぞれについて蛍光によって測定した。図48Bは、2.5nMのRNA、ssDNAおよびdsDNAを標的核酸として使用するCas12検出アッセイを示し、検出は試験した標的核酸のそれぞれについて蛍光によって測定した。図48Cは、様々な濃度の標的RNA、標的ssDNAおよび標的dsDNAに対するCas13およびCas12の性能を示し、試験した標的核酸のそれぞれについて検出を蛍光によって測定した。
（図５０）170nMの様々なレポーター基材を含む2.5nMの標的ssDNAを使用するLbuCas13a検出アッセイを示し、試験したレポーター基材のそれぞれについて蛍光によって検出を測定した。
（図５１）図51Aは、10nMまたは0nMの標的RNAを使用するLbuCas13a（SEQ ID NO:131）およびLwaCas13a（SEQ ID NO:137）についてのCas13検出アッセイの結果を示す。検出は、レポーターの切断から生じる蛍光によって経時的に測定した。図51Bは、10nMまたは0nMの標的ssDNAを使用するLbuCas13a（SEQ ID NO:131）およびLwaCas13a（SEQ ID NO:137）についてのCas13検出アッセイの結果を示す。検出は、レポーターの切断から生じる蛍光によって経時的に測定した。
（図５２）6.8～8.2の範囲の様々なpH値を有する緩衝液中で1nMの標的RNA（左）または標的ssDNA（右）を使用するLbuCas13a（SEQ ID NO:131）検出アッセイを示す。
（図５３）図53Aは、1ヌクレオチド間隔で標的配列に沿ってタイリングされたガイドRNA（gRNA）を示す。図53Bは、1ヌクレオチド間隔でタイリングされたgRNAおよび標的外gRNAを含む0.1nM RNAまたは2nM標的ssDNAを使用した、LbuCas13a（SEQ ID NO:131）検出アッセイを示す。図53Cは、標的ssDNAの性能によってランク付けされた図97Bからのデータを示す。図53Dは、標的RNAの3’末端上の各ヌクレオチドに対するgRNAの性能を示す。図53Eは、標的ssDNAの3’末端上の各ヌクレオチドに対するgRNAの性能を示す。
（図５４）図54Aは、様々なLAMP等温核酸増幅反応からの1μLの標的DNAアンプリコンを使用したLbuCas13a検出アッセイを示す。図54Bは、様々な量のPCR反応を標的DNAとして使用するLbuCas13a（SEQ ID NO:131）検出アッセイを示す。
（図５５）DETECTRアッセイのための空気圧バルブ装置レイアウトを示す。図55Aは、空気圧バルブ装置の概略図を示す。ピペットポンプは、試料を吸引して分注する。空気マニホールドを空気圧ポンプに接続して、常閉バルブを開閉する。空気圧装置は、流体をある位置から次の位置に移動させる。空気圧の設計は、他の装置の設計と比較してチャネルクロストークが低減されている。図55Bは、図55Aに示す振動バルブ空気圧装置で使用するためのカートリッジの概略図を示す。バルブ構成が示されている。常閉バルブ（そのようなバルブの1つを矢印で示す）は、チャンバが使用されていないときに各チャンバをシステムの残りの部分から隔離するために、チャネルの上部にエラストマー封止を備える。空気圧ポンプは空気を使用して、カートリッジ内の必要なチャンバに流体を移動させるために必要に応じてバルブを開閉する。
（図５６）図55Aに示す空気圧バルブ装置のバルブ回路レイアウトを示す。（i）に示すように、すべてのバルブを閉じた状態で、試料を試料ウェルに入れる。試料を試料ウェルに溶解する。溶解された試料は、（ii）に示すように、第1の振動バルブを開くことによって試料チャンバから第2のチャンバに移され、ピペットポンプを用いて試料を吸引する。次いで、試料は、（iii）に示すように、第1の振動バルブを閉じ、第2の振動バルブを開くことによって第1の増幅チャンバに移され、そこで増幅混合物と混合される。試料は増幅混合物と混合した後、（iv）に示すように、第2の振動バルブを閉じ、第3の振動バルブを開くことによって、次のチャンバに移動させる。試料は、（v）に示されるように、第3の振動バルブを閉じ、第4の振動バルブを開くことによってDETECTRチャンバに移動される。試料は、（vi）に示すように、常開（例えば、振動タイプ）バルブの異なる系列を開閉することによって、チャンバの異なる系列を通って移動させることができる。所望のチャンバ系列内の個々のバルブの作動は、チャネル間の交差汚染を防止する。
（図５７）スライドバルブ装置の概略図を示す。チャネルのオフセットピッチは、吸引および各ウェルへの別々の分注を可能にし、増幅チャンバと対応するチャンバとの間のクロストークを緩和するのに役立つ。
（図５８）図57に示すスライドバルブ装置を通る試料移動の図を示す。最初の閉位置（i）において、試料を試料ウェルに充填し、溶解する。次いで、スライドバルブを器具によって作動させ、適切な量をチャネルに分注するピペットポンプを使用して試料を各チャネルに充填する（ii）。試料は、スライドバルブを作動させることによって増幅チャンバに送達され、ピペットポンプで混合される（iii）。増幅チャンバからの試料は、各チャネルに吸引され（iv）、次いで、スライドバルブおよびピペットポンプを作動させることによって、各DETECTRチャンバに分注され、混合される（v）。
（図５９）本開示の空気圧バルブ装置のカートリッジの最上層の概略図を、適切な寸法を強調して示す。概略図は、2インチ×1.5インチの1つのカートリッジを示す。
（図６０）電気化学的寸法に適応させた、本開示の空気圧バルブ装置のカートリッジの変更された最上層の概略図を示す。この概略図では、3つの線が検出チャンバ（最も右側の4つのチャンバ）に示されている。これらの3本の線は、3電極システムを形成するために使い捨てカートリッジ内に共成形、3D印刷、または手動で組み立てられる配線（または「金属リード」）を表す。
（図６１）標的核酸配列のループ介在等温増幅（LAMP）用のプライマーを設計するためのスキームを示す。「c」を表示する領域は、「c」を表示しない対応する領域と逆相補的である（例えば、領域F3cは領域F3と逆相補的である）。
（図６２）LAMPプライマーに対応するか、もしくはアニールする核酸配列、またはガイドRNA配列、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）を含むもの、ならびにLAMPおよびDETECTRによる増幅および検出のための標的核酸配列の様々な領域の例示的な構成の概略図を示す。図62Aは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNA（gRNA）の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、F1c領域（すなわち、F1領域と逆相補的な領域）とB1領域との間に存在する標的核酸の配列に逆相補的である。図62Bは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNA配列の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、F1c領域とB1領域との間に存在する標的核酸の配列に部分的に逆相補的である。例えば、標的核酸は、ガイド核酸の少なくとも60％に逆相補的である、F1c領域とB1領域との間の配列を含む。この配置では、ガイドRNAは、図40に示すフォワードインナープライマーまたはバックワードインナープライマーと逆相補的ではない。図62Cは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNAの例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、B1領域とB2領域との間のループ領域内に存在する標的核酸の配列にハイブリタイズする。フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、およびバックワードアウタープライマー配列は、PAMまたはPFSを含有せず、PAMまたはPFSと逆相補的ではない。図62Dは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNAの例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、F2c領域とF1c領域との間のループ領域内に存在する標的核酸の配列にハイブリタイズする。プライマー配列は、PAMもPFSも含まず、PAMともPFSとも逆相補的ではない。
（図６３）LAMPプライマーもしくはガイドRNA配列に対応するか、もしくはアニールする、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）を含む核酸配列、ならびに増幅および検出のために組み合わせたLAMPおよびDETECTRについての標的核酸配列の様々な領域の例示的な構成の概略図をそれぞれ示す。右側では、概略図はまた、LAMP増幅およびガイドRNA配列を使用して標的核酸配列の存在を検出する、対応する蛍光データを示し、ここで蛍光信号は、DETECTR反応の出力であり、標的核酸の存在を示す。図63Aは、LAMPプライマーに対応またはアニールする核酸配列の様々な領域の配置、およびLAMPプライマーに対する3つのガイドRNA（gRNA1、gRNA2およびgRNA3）の位置の概略図を示す（左）。gRNA1はB2c領域と重複し、したがってB2領域と逆相補的である。gRNA2はB1領域と重複し、したがってB1c領域と逆相補的である。gRNA3はB3領域と部分的に重複し、かつB2領域と部分的に重複し、したがって、B3c領域と部分的に逆相補的であり、かつB2c領域と部分的に逆相補的である。相補的領域（B1、B2c、B3c、F1、F2c、およびF3c）は図示されていないが、図40に示されている領域に対応する。右側は、標的核酸の10,000ゲノムコピーまたは標的核酸の0ゲノムコピーの存在下でのDETECTR反応からの蛍光のグラフである。図63Bは、LAMPプライマーに対応またはアニールする核酸配列の様々な領域の配置、およびLAMPプライマーに対する3つのガイドRNA（gRNA1、gRNA2およびgRNA3）の位置の概略図を示す（左）。gRNA1はB1c領域と重複し、したがってB1領域と逆相補的である。gRNA2はLF領域と重複し、したがってLFc領域と逆相補的である。gRNA3はB2領域と部分的に重複し、かつLBc領域と部分的に重複し、したがって、B2c領域と部分的に逆相補的であり、かつLB領域と部分的に逆相補的である。右側は、標的核酸の10,000ゲノムコピーまたは標的核酸の0ゲノムコピーの存在下でのDETECTR反応からの蛍光のグラフである。図63Cは、LAMPプライマーに対応またはアニールする核酸配列の様々な領域の配置、およびLAMPプライマーに対する3つのガイドRNA（gRNA1、gRNA2およびgRNA3）の位置の概略図を示す（左）。gRNA1はB1c領域と重複し、したがってB1領域と逆相補的である。gRNA2はLF領域と部分的に重複し、かつF2c領域と部分的に重複し、したがってLFc領域と部分的に逆相補的であり、かつF2領域と部分的に逆相補てきである。gRNA3はB2領域と重複し、したがってB2c領域と逆相補的である。右側は、標的核酸の10,000ゲノムコピーまたは標的核酸の0ゲノムコピーの存在下でのDETECTR反応からの蛍光のグラフである。
（図６４Ａ）LAMPプライマーもしくはガイドRNA配列に対応もしくはアニールする、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）を含む核酸配列、ならびに図63Aに示すLAMPおよびDETECTRアッセイについての標的核酸配列の様々な領域の配置および配列の詳細な内訳を示す。
（図６４Ｂ）LAMPプライマーもしくはガイドRNA配列に対応もしくはアニールする、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）を含む核酸配列、ならびに図63Bに示すLAMPおよびDETECTRアッセイについての標的核酸配列の様々な領域の配置および配列の詳細な内訳を示す。
（図６４Ｃ）LAMPプライマーもしくはガイドRNA配列に対応もしくはアニールする、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）を含む核酸配列、ならびに図63Cに示すLAMPおよびDETECTRアッセイについての標的核酸配列の様々な領域の配置および配列の詳細な内訳を示す。
（図６５）DNA結合色素を使用して検出された逆転写LAMP（RT-LAMP）反応の結果に至る時間を示す図である。
（図６６）RT-LAMP反応からの生成物との5分間のインキュベーション後のDETECTR反応からの蛍光信号を示す。図65のLAMPプライマーセット＃1～6は、ガイドRNA＃2（SEQ ID NO:250）と共に使用するように設計され、LAMPプライマーセット＃7～10は、ガイドRNA＃1（SEQ ID NO:249）と共に使用するように設計された。
（図６７）LAMPプライマーセット1、2、4、5、6、7、8、9、10、または陰性対照を用いたRT-LAMP増幅後の、SYTO 9（DNA結合色素）を使用したインフルエンザAウイルス（IAV）由来の配列の検出を示す。
（図６８）RT-LAMP増幅後のインフルエンザBウイルス（IBV）標的配列の増幅までの時間を示す。増加する濃度の標的配列（反応あたり標的配列の0、100、1000、10,000または100,000ゲノムコピー）の存在下でSYTO 9を使用して増幅を検出した。
（図６９）異なるプライマーセットを用いたLAMP増幅後のIAV標的配列の増幅までの時間を示す。
（図７０）LAMPプライマーセット1、2、4、5、6、7、8、9、10、または陰性対照を用いたRT-LAMP増幅後の、DETECTRを使用したインフルエンザAウイルス（IAV）由来の標的核酸配列の検出を示す。プライマーセットごとに10回の反応を行った。DETECTR信号を、反応中に存在する標的配列の量の関数として測定した。
（図７１）標的核酸配列のLAMP増幅および標的核酸配列内の一塩基多型（SNP）の検出のためのプライマーを設計するためのスキームを示す。例示的な配置では、標的核酸のSNPは、F1c領域とB1領域との間に位置する。
（図７２）標的核酸のLAMP増幅およびDETECTRを使用した標的核酸の検出の方法のための、LAMPプライマー、ガイドRNA配列、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）、およびSNPを含む標的核酸の例示的な配置の概略図を示す。図72Aは、LAMPプライマーに対応するかまたはアニールする核酸配列の様々な領域に対する、ガイドRNAの例示的な配置の概略図を示す。この配置では、標的核酸のPAMまたはPFSは、F1c領域とB1領域との間に位置する。ガイドRNA配列の全体は、F1c領域とB1c領域との間に存在し得る。SNPは、ガイドRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列内に位置するものとして示されている。図72Bは、LAMPプライマーに対応するかまたはアニールする核酸配列の様々な領域に対する、ガイドRNA配列の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、標的核酸のPAMまたはPFSは、F1c領域とB1領域との間に配置され、標的核酸は、ガイド核酸の少なくとも60％に逆相補的なF1c領域とB1領域との間の配列を含む。この例では、ガイドRNAは、フォワードインナープライマーまたはバックワードインナープライマーと逆相補的ではない。SNPは、ガイドRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列内に位置するものとして示されている。図72Cは、LAMPプライマーに対応するかまたはアニールする核酸配列の様々な領域に対する、ガイドRNA配列の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、標的核酸のPAMまたはPFSは、F1c領域とB1領域との間に位置し、ガイドRNA配列全体は、F1c領域とB1領域との間に存在してもよい。SNPは、ガイドRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列内に位置するものとして示されている。
（図７３）2つのPAM部位およびHERC2 SNPを含む核酸の例示的な配列を示す。
（図７４）LAMP増幅後の第1のPAM部位に対する9位、または第2のPAM部位に対する14位のHERC2 SNPを検出するためのDETECTR反応の結果を示す。標的配列の検出を示す蛍光信号を、HERC2中のG対立遺伝子またはA対立遺伝子のいずれかを含む標的配列の存在下で経時的に測定した。ガイドRNA（crRNAのみ）を使用して標的配列を検出して、A対立遺伝子またはG対立遺伝子のいずれかを検出した。
（図７５）標的核酸配列のLAMP増幅後のDETECTR反応からの蛍光のヒートマップを示す。DETECTR反応は、A対立遺伝子（SEQ ID NO:255、「R570 A SNP」）またはG SNP対立遺伝子（SEQ ID NO:256、「R571 G SNP」）に特異的なガイドRNA（crRNAのみ）を使用して、2つのHERC2対立遺伝子間を識別した。陽性検出は、DETECTR反応における高い蛍光値によって示される。
（図７６）LAMPによる標的核酸の複合LAMP増幅およびDETECTRによる標的核酸の検出を示す図である。検出は、赤色LEDで試料を照らすことによって、DETECTRで視覚的に行った。各反応は、青色眼表現型（「青色眼」）または褐色眼表現型（「褐色眼」）のいずれかのSNP対立遺伝子を含む標的核酸配列を含有した。試料「褐色＊」および「青色＊」は、それぞれ、A対立遺伝子陽性対照およびG対立遺伝子陽性対照であった。各LAMP DETECTR反応には、褐色眼表現型（「Br」）または青色眼表現型（「Bl」）のいずれかのためのガイドRNAを使用した。
（図７７）逆転写ループ介在等温増幅（RT-LAMP）を使用して試料中のSARS-CoV-2（「2019-nCoV」）の有無を調製および検出する工程を概略的に示し、Cas12は、SARS-CoV-2（「2019-nCoV反応」）の有無を調製および検出する工程を概略的に示す。
（図７８）異なるプライマーセット（「2019-nCoV-set1」～「2019-nCoV-set12」）で増幅し、LbCas12aおよびSARS-CoV-2のN遺伝子に指向するgRNAを用いて検出したSARS-CoV-2 N遺伝子のDETECTRアッセイ結果を示す。結果までの時間が短いほど、肯定的な結果を示す。すべてのプライマーセットについて、結果までの時間は、試料に含まれる標的配列が多いほど短くなり、アッセイが標的配列に対して感受性であったことを示している。
（図７９）0fMおよび5fMの試料について図78にプロットされたDETECTR反応の個々のトレースを示す。各プロットにおいて、0fMトレースはベースラインの上には見えず、非特異的検出がほとんどないか全くないことを示している。
（図８０）N遺伝子、E遺伝子、または標的なし（「NTC」）のいずれかを含有し、SARS-CoV-2のE遺伝子に指向するプライマーセット（「2019-nCoV-E-set13」から「2019-nCoV-E-set20」）またはSARS-CoV-2のN遺伝子する指向するプライマーセット（2019-nCoV-N-set21」から「2019-nCoV-N-set24」）を使用して増幅された試料における、DETECTR反応の結果が得られるまでの時間を示す。SARS-CoV-2 E遺伝子の特異的検出に最も性能の良いプライマーセットは、SARS-CoV-2-E-set14であった。
（図８１）プライマーセット1（「2019-nCoV-set1」）で増幅され、LbCas12a、およびSARS-CoV-2のN遺伝子に指向するgRNA（「R1763-CDC-N2-Wuhan」）またはSARS-CoVのN遺伝子に指向するgRNA（「R1766-CDC-N2-SARS」）のいずれかを使用して検出されたSARS-CoV-2 N遺伝子のDETECTRアッセイ結果を示す。
（図８２）SARS-CoV-2のN遺伝子に指向するプライマーセット（「2019-nCoV-N-set1」）を使用して増幅された、DETECTR反応におけるSARS-CoV-2の検出限界を決定するためのDETECTR反応の結果を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子標的核酸のコピーを15,000、4,000、1,000、500、200、100、50、20、または0のいずれかで含有する試料を検出した。N遺伝子RNAのゲルを以下に示す。
（図８３）POP7試料プライマーセットを使用したRNase Pの増幅を示す。試料を、LAMPを使用して増幅した。DETECTR反応は、RNase Pに指向するgRNA（「R779」）およびCas12変異体（SEQ ID NO:37）を使用して行った。試料は、HeLaトータルRNAまたはHeLaゲノムDNAのいずれかを含有していた。
（図８４）多重化されたDETECTR反応の結果までの時間を示す。試料は、SARS-CoV-2のインビトロ転写されたN遺伝子（「N-gene IVT」）、SARS-CoV-2のインビトロ転写されたE遺伝子（「E-gene IVT」）、HeLaトータルRNA、または標的なし（「NTC」）のいずれかを含有した。試料を、SARS-CoV-2 N遺伝子（「set1」）、SARS-CoV-2 E遺伝子（「set14」）、またはRNase（「RNaseP」）に指向する1つまたは複数のプライマーセットを使用して増幅した。
（図８５）SARS-CoV-2 N遺伝子（「set1」）、SARS-CoV-2 E遺伝子（「set14」）、またはRNase P（「RNaseP」）のいずれかを指向するプライマーセットの異なる組み合わせを用いた多重化DETECTR反応の結果までの時間を示す。SARS-CoV-2のインビトロ転写されたN遺伝子（左、「N-gene IVT」）またはSARS-CoV-2のインビトロ転写されたE遺伝子（右、「E-gene IVT」）を含有する試料を試験した。
（図８６）図84および図85からの最も優れた性能のプライマーセットの組み合わせを用いた多重化DETECTR反応の結果までの時間を示す。
（図８７Ａ）SARS-CoV-2のN-2遺伝子を検出するために使用されるCDC-N2標的部位の配列を概略的に示す。
（図８７Ｂ）SARS-CoV-2 N遺伝子（「N-Sarbeco」）標的部位の領域の配列を概略的に示す。
（図８８）SARS-CoV-2のN遺伝子（「N-2019-nCoV」）、SARS-CoVのN遺伝子（「N-SARS-CoV」）またはbat-SL-CoV45のN遺伝子（「N-bat-SL-CoV45」）のいずれかを含む試料について、SARS-CoV-2のN遺伝子（「R1763」）、SARS-CoVのN遺伝子（「R1766」）またはサルベココロナウイルスのN遺伝子（「R1767」）のいずれかに指向するgRNAの感受性を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。
（図８９）SARS-CoV-2 E遺伝子（「E-Sarbeco」）標的部位の領域の配列を概略的に示す。
（図９０）SARS-CoV-2のE遺伝子（「E-2019-nCoV」）、SARS-CoVのE遺伝子（「E-SARS-CoV」）、bat-SL-CoV45のE遺伝子（「E-bat-SL-CoV45」）またはbat-SL-CoV21のE遺伝子（「E-bat-SL-CoV21」）のいずれかを含む試料について、コロナウイルスN遺伝子に指向する2つのgRNAの感受性を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。
（図９１）Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を使用してSARS-CoV-2 N遺伝子標的RNAの存在または非存在を検出するためのラテラルフローDETECTR反応の結果を示す。ラテラルフロー試験ストリップを示す。インビトロ転写されたSARS-CoV-2 N遺伝子RNA（「N-gene IVT」）を含有する（「＋」）かまたは欠く（「-」）試料を試験した。横線の上部セット（「試験」と表記）は、DETECTR反応の結果を示した。
（図９２）プログラマブルヌクレアーゼを使用した標的核酸の検出を概略的に示す。簡潔には、トランス付帯的切断活性を有するCasタンパク質が、ガイド核酸およびガイド核酸の領域に逆相補的な標的配列に結合すると活性化される。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、レポーター核酸を切断し、それによって、検出可能な信号を生成する。
（図９３）試料中の標的核酸の存在または非存在の検出を概略的に示す。試料中の選択核酸は、等温増幅を用いて増幅される。増幅された試料を、図17に示されるように、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸およびレポーター核酸に接触させる。試料が標的核酸を含む場合、検出可能な信号が生成される。
（図９４）試料中のSARS-CoV-2（「2019-nCoV」）RNAの存在または非存在を検出するためのDETECTRラテラルフロー反応の結果を示す。RNase Pの検出を試料の品質管理として使用する。試料をインビトロで転写および増幅し（左）、Cas12プログラマブルヌクレアーゼを用いて検出した（右）。インビトロ転写されたSARS-CoV-2 RNA（「2019-nCoV IVT」）を含有する（「＋」）または欠く（「-」）試料を、Cas12プログラマブルヌクレアーゼ、およびSARS-CoV-2に指向するgRNAを用いて0分間または5分間アッセイした。反応は、SARS-CoV-2を含有する試料に対して感受性であった。
（図９５）LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用して、患者試料中のSARS-CoV-2の存在または非存在を決定するDETECTR反応の結果を示す。
（図９６）患者試料中のSARS-CoV-2の存在または非存在を検出するための、ラテラルフローDETECTR反応の結果を示す。試料を、SARS-CoV-2に指向するgRNAまたはRNase Pに指向するgRNAのいずれかを用いて検出した。
（図９７）逆転写およびループ介在等温増幅（RT-LAMP）およびCas12検出を用いたコロナウイルスの検出のための技術仕様およびアッセイ条件を示す。
（図９８）LbCas12aを使用してSARS-CoV-2を検出するための複数のgRNAを評価するDETECTRアッセイの結果を示す。標的核酸配列を、SARS-CoV-2 E遺伝子（「2019-nCoV-E-set13」から「2019-nCoV-E-set20」またはSARS-CoV-2 N遺伝子（「2019-nCoV-N-set21」から「2019-nCoV-N-set24」）を増幅するためのプライマーセットを使用して増幅した。
（図９９）コロナウイルスの3つの異なる株、SARS-CoV-2（「COVID-2019」）、SARS-CoV、またはbat-SL-CoV45の識別における有用性について複数のgRNAを評価する、DETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2（「N-2019-nCoV」）、SARS-CoV（「N-SARS-CoV」）、またはbat-SL-CoV45（「N-bat-SL-CoV45」）のいずれかのN遺伝子アンプリコンを含有する試料を試験した。
（図１００）コロナウイルスの3つの異なる株、SARS-CoV-2（「COVID-2019」）、SARS-CoV、またはbat-SL-CoV45の識別における有用性について複数のgRNAを評価する、DETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2（「N-2019-nCoV」）、SARS-CoV（「N-SARS-CoV」）、またはbat-SL-CoV45（「N-bat-SL-CoV45」）のいずれかのE遺伝子アンプリコンを含有する試料を試験した。
（図１０１）LAMPプライマーセットをSARS-CoV-2標的の多重化増幅におけるそれらの有用性について評価する、DETECTRアッセイの結果を示す。試料を、SARS-CoV-2 N遺伝子（「set1」）またはSARS-CoV-2 E遺伝子（「set14」）、またはRNase P（「RNaseP」）に指向する1つまたは複数のプライマーセットを用いて増幅した。
（図１０２）一般的な試料緩衝液に対するRT-LAMP増幅反応の感受性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。様々な緩衝希釈度（左から右へ:1×、0.5×、0.25×、0.125×、または緩衝液なし）の、ユニバーサルトランスポート培地（UTM、上部）またはDNA/RNA Shield緩衝液（下）中で反応を測定した。
（図１０３）SARS-CoV-2（COVID-19感染症に起因するウイルス）についてのDETECTRアッセイの検出限界（LoD）を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。
（図１０４）LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用した2-plex多重化RT-LAMP反応において、SARS-CoV-2のN遺伝子（「R1763-N-gene」）に指向するgRNAの標的特異性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。
（図１０５）LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用した3-plex多重化RT-LAMP反応において、SARS-CoV-2のN遺伝子（「R1763-N-gene」）またはSARS-CoV-2のE遺伝子（「R1765-E-gene」）に指向するgRNAの標的特異性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。
（図１０６）PCRDラテラルフロー装置に適合するディテクター核酸の設計を示す。例示的な適合ディテクター核酸である、rep072、rep076、およびrep100が提供される（左）。これらのディテクター核酸をPCRDラテラルフロー装置（右）で使用して、標的核酸の存在または非存在を検出することができる。右上の概略図は、標的核酸を含有しない試料と接触させた場合に生成される例示的なバンド構成を示す。右下の概略図は、標的核酸を含有する試料と接触させた場合に生成される例示的なバンド構成を示す。
（図１０７）図107Aは、コロナウイルスのゲノム内のE（エンベロープ）遺伝子およびN（核タンパク質）遺伝子領域の位置を示すゲノムマップを示す。EおよびN遺伝子領域に関するプライマーおよびプローブの対応する領域またはアニーリング領域を、それぞれの遺伝子領域の下に示す。RT-LAMPプライマーは黒い長方形で示されており、FIPプライマー（灰色）のF1cとB1cの半分との結合位置は破線の境界を有する縞模様の長方形で表されている。世界保健機関（WHO）および疾病管理センター（CDC）によって用いられる試験で増幅された領域は、それぞれ「WHO Eアンプリコン」および「CDC N2アンプリコン」と呼ばれる。図107Bは、LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用して、様々なコロナウイルス株（SARS-CoV-2、SARS-CoV、またはbat-SL-CoVZC45）のN遺伝子またはE遺伝子に指向するgRNAの特異性または広範な検出有用性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。アッセイで使用したN遺伝子gRNA（左、「N遺伝子」）は、SARS-CoV-2に特異的であったが、E遺伝子gRNAは、3つのSARS様コロナウイルスを検出することができた（右、「E遺伝子」）。SARS-CoVおよびコウモリコロナウイルスを標的とする別個のN遺伝子gRNAは、SARS-CoV-2を検出することができなかった（中央、「N遺伝子関連種変異体」）。図107Cは、コロナウイルスDETECTRアッセイで用いられる例示的な実験機器を示す。適切なバイオセーフティ保護装置に加えて、用いられる装置は、試料回収装置、微小遠心チューブ、37°Cおよび62°Cに設定されたヒートブロック、ピペットおよびチップ、およびラテラルフローストリップを含む。図107Dは、対象におけるコロナウイルスの検出のためのDETECTRアッセイの例示的なワークフローを示す。従来のRNA抽出または試料マトリックスは、DETECTR（LAMP事前増幅およびNE遺伝子、EN遺伝子およびRNase PのCas12ベースの検出）へのインプットとして使用することができ、それは、蛍光リーダーまたはラテラルフローストリップによって可視化される。図107Eは、ラテラルフロー試験ストリップ（左）を示し、SARS-CoV-2 N遺伝子についての陽性試験結果（左、上）およびSARS-CoV-2 N遺伝子についての陰性試験結果（左、下）を示す。表（右）は、RNase P（陽性対照）、SARS-CoV-2 N遺伝子、およびコロナウイルスE遺伝子の非存在の存在を試験するラテラルフローストリップベースのコロナウイルス診断アッセイの、可能な試験指標および関連する結果を示す。
（図１０８）図108Aは、標的核酸の存在下でのCas12プログラマブルヌクレアーゼによる、FAMおよびビオチンで標識されたディテクター核酸の切断を示す（上）。ラテラルフロー試験ストリップ（下）の概略図は、試験試料中の標的核酸の存在（「陽性」）または非存在（「陰性」）のいずれかを示すマーキングを示す。完全なFAM-ビオチン化レポーター分子は、コントロール捕捉ラインに流れる。合致する標的が認識されると、Cas-gRNA複合体はレポーター分子を切断し、それは標的捕捉ラインに流れる。図108Bは、0fMのSARS-CoV-2 RNAまたは5fMのSARS-CoV-2 RNAのいずれかを含有する試料について、反応時間の効果を決定するためのLbCas12aを使用したDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子では、RT-LAMPアンプリコンでのLbCas12a検出アッセイの蛍光信号は10分以内に飽和した。RT-LAMPアンプリコンを、2μLの5fMまたは0fMのSARS-CoV-2 N-gene IVT RNAから、62°Cで20分間増幅することによって作製した。図108Cは、図108BのDETECTRによってアッセイされた試料に相当する試料をアッセイするラテラルフロー試験ストリップを示す。0fMのSARS-CoV-2 RNA（「-」）または5fMのSARS-CoV-2 RNA（「＋」）のいずれかを含有する試料について、対照（C）または試験（T）に対応するバンドを反応時間の関数として示す。同じRT-LAMPアンプリコン上のLbCas12aは、5分以内にラテラルフローアッセイを通して可視信号を生成した。図108Dは、SARS-CoV-2の検出限界を決定するための、LbCas12a（中央）またはCDCプロトコール（左）を用いたDETECTRアッセイの結果を示す。信号は、反応当たりのウイルスゲノムのコピー数の関数として示される。アッセイの代表的なラテラルフロー結果を、0コピー/μLおよび10コピー/μLの場合について示す（右）。図108Eは、患者試料のDETECTRデータを示す。COVID-19感染症患者6人（n＝11、反復5）およびインフルエンザまたは4つの季節性コロナウイルス（HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43）のうちの1つに感染している患者12人（n＝12）からの臨床試料を、SARS-CoV-2 DETECTRを用いて分析した（明暗をつけたボックス）。ラテラルフローストリップからの信号強度をImageJを使用して定量化し、バックグラウンドを5標準偏差上回る正の閾値を用いて、N遺伝子、E遺伝子またはRNase Pセット内の最大値に正規化した。SARS-CoV-2試験の最終決定は、図107Eの解釈行列に基づいた。FluAはインフルエンザAを表し、FluBはインフルエンザBを表す。HCoVはヒトコロナウイルスを表す。図108Fは、COVID-19患者（SARS-CoV-2に対して陽性、「患者1」）、標的核酸を欠く標的なし対照試料（「NTC」）、および標的核酸を含有する陽性対照試料（「PC」）におけるSARS-CoV-2について試験するラテラルフロー試験ストリップを示す。3つすべての試料を、SARS-CoV-2 N遺伝子、SARS-CoV-2 E遺伝子、およびRNase Pの存在について試験した。図108Gは、SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの性能特性を示す。83の臨床試料（COVID-19の陽性41、陰性42）を、SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの蛍光バージョンを使用して評価した。1つの試料（COVID19-3）を、アッセイ品質管理の失敗により除外した。陽性コールおよび陰性コールは、図32Eに記載されている基準に基づいた。fMはフェムトモルを示し、NTCはテンプレートなしの対照を示し、PPAは陽性予測一致（positive predictive agreement）を示し、NPAは、陰性予測一致（negative predictive agreement）を示す。
（図１０９）本開示のRT-LAMPを用いたSARS-CoV-2 DETECTRアッセイと、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）検出法を用いたSARS-CoV-2アッセイとを比較する表を示す。DETECTR RT-LAMPアッセイにおけるN遺伝子標的は、qRT-PCRアッセイで検出されたN遺伝子N2アンプリコンと同じである。
（図１１０Ａ）異なる緩衝液条件下でのRT-LAMP増幅の結果までの時間を示す。結果までの時間は、蛍光値が実験の最大値の1/3になる時間として計算した。増幅に失敗した反応は、20分での値で報告され、「no amp」と標識する。水、10％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、または10％ユニバーサルトランスポート培地（UTM）のいずれかにおける異なる出発濃度の標的対照プラスミドについて、結果までの時間を決定した。結果まで時間が短いほど、増幅が速いことを示す。
（図１１０Ｂ）5％ UTM、5％ PBSまたは水のいずれかにおける、SARS-CoV-2のN遺伝子、SARS-CoV-2のE遺伝子およびRNase Pの増幅効率を決定するためのRT-LAMPアッセイの結果を示す。インビトロ転写された0.5fMのN遺伝子、インビトロ転写された0.5fMのE遺伝子、および0.8ng/μLのHeLa総RNA（「N＋E＋総RNA」）を含む試料、または標的を含まない対照（「NTC」）を試験した。
（図１１０Ｃ）PBS中の鼻スワブからの直接的なRNAの増幅を示す。結果までの時間をPBS濃度の関数として測定した。鼻スワブ（「鼻スワブ」）を、HeLaトータルRNA（左、「トータルRNA:0.08ng/uL」）または水（右、「トータルRNA:0ng/uL」）のいずれかでスパイクした。鼻スワブを含まない試料（「スワブなし」）を対照として比較した。
（図１１１Ａ）SARS-CoV-2 N遺伝子（n＝6）のLbCas12a（SEQ ID NO:27）検出によって生成された生の蛍光曲線を示す。曲線は、20分未満で飽和を示した。
（図１１１Ｂ）図111Aに示す生の蛍光トレースから決定した、LbCas12aで検出されたSARS-CoV-2 N遺伝子についてのDETECTRアッセイの検出限界を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子の濃度（コピー/mL）を減少させながら蛍光強度を測定した。
（図１１１Ｃ）図111Aに示される生の蛍光トレースから決定された、DETECTRアッセイの検出限界の結果までの時間を示す。結果まで時間が短いほど、検出が速いことを示す。
（図１１２）図112Aは、0fMのSARS-CoV-2 RNAまたは5fMのSARS-CoV-2 RNAのいずれかを含有する試料について、反応時間の効果を決定するためのLbCas12aを使用したDETECTRアッセイの結果を示す。図112Bは、図112AのDETECTRによってアッセイされた試料に相当する試料をアッセイするラテラルフロー試験ストリップを示す。0fMのSARS-CoV-2 RNA（「-」）または5fMのSARS-CoV-2 RNA（「＋」）のいずれかを含有する試料について、対照（C）または試験（T）に対応するバンドを反応時間の関数として示す。
（図１１３）異なるヒトコロナウイルス株に対するgRNAの交差反応性を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子、SARS-CoV N遺伝子、bat-SL-CoVZC45 N遺伝子、SARS-CoV-2 E遺伝子、SARS-CoV E遺伝子もしくはbat-SL-CoVZC45 E遺伝子のインビトロ転写RNAを含有する試料、またはCoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43もしくはCoV-NL63について陽性の臨床試料を試験した。HeLaトータルRNAをRNase Pの陽性対照として試験し、標的核酸を欠く試料（「NTC」）を陰性対照として試験した。
（図１１４）図114Aは、3つのコロナウイルス株について、N遺伝子gRNAによって標的とされる標的部位の配列アラインメントを示す。N遺伝子gRNA＃1はCDC-N2アンプリコンと適合性であり、N遺伝子gRNA＃2はWHO N-Sarbecoアンプリコンと適合性である。図114Bは、3つのコロナウイルス株について、E遺伝子gRNAによって標的とされる標的部位の配列アラインメントを示す。試験した2つのE遺伝子gRNA（E遺伝子gRNA＃1およびE遺伝子gRNA＃2）は、WHO E-Sarbecoアンプリコンと適合性である。
（図１１５）図115A～図115Cは、COVID-19感染患者試料のDETECTR動態曲線を示す。5人の患者からの10個の鼻スワブ試料（COVID19-1～COVID19-10）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。図115Aは、標準的な増幅および検出条件を使用して、10人の患者のうち9人に、SARS-CoV-2 E遺伝子の存在を示す強い蛍光曲線が生じたことを示す（20分間の増幅、10分以内の信号）。図115Bは、10人の患者のうち8人について、SARS-CoV-2 N遺伝子が強い蛍光曲線を生成するのに必要とする増幅時間が延長されたことを示す（30分間の増幅、10分以内の信号）。図115Cは、試料インプット対照としてのRNase Pが、試験した全試料22のうち17で陽性であったことを示す（20分間の増幅、10分以内の信号）。
（図１１６）SARS-CoV-2のDETECTR分析により、約30分でウイルスゲノムが10個まで同定されることを示す（20分間の増幅、10分間のDETECTR）。LbCas12a DETECTR分析の前に、重複LAMP反応を20分間増幅した。
（図１１７）図116で提供されたLbCas12a DETECTR分析について、5分での生の蛍光を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子の検出限界は、反応あたり10ウイルスゲノムであると決定された（n＝6）。
（図１１８）10個のCOVID-19感染患者試料および他のウイルス性呼吸器感染症についての12個の患者試料のラテラルフローDETECTR結果を示す。1つの鼻咽頭スワブ（A）および1つの中咽頭スワブ（B）を含む6人の患者からの10個の試料（COVID19-1～COVID19-5）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。結果を図119に提供される指針に従って分析した。
（図１１９）SARS-CoV-2 DETECTRラテラルフロー結果の解釈のための規定を示す。
（図１２０Ａ）11個のCOVID-19感染患者試料および他のウイルス性呼吸器感染症の12個の患者試料の蛍光DETECTR動態曲線を示す。6人の患者からの10個の鼻咽頭/中咽頭スワブ試料（COVID19-1～COVID19-6）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。図120Aは、標準的な増幅および検出条件を使用して試験した試料を示し、12個のCOVID-19陽性患者試料のうち10個に、SARS-CoV-2 E遺伝子の存在を示す強い蛍光曲線が生じた（20分間の増幅、10分以内の信号）。12個の他のウイルス性呼吸器臨床試料では、E遺伝子信号は検出されなかった。
（図１２０Ｂ）11個のCOVID-19感染患者試料および他のウイルス性呼吸器感染症の12個の患者試料の蛍光DETECTR動態曲線を示す。6人の患者からの10個の鼻咽頭/中咽頭スワブ試料（COVID19-1～COVID19-6）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。図120Bは、12個のCOVID-19陽性患者試料のうち10個について、時間を延長した増幅を使用してSARS-CoV-2 N遺伝子の存在について試験された試料が、強い蛍光曲線を生成することを示す（30分間の増幅、10分以内の信号）。12個の他のウイルス性呼吸器臨床試料では、N遺伝子信号は検出されなかった。
（図１２０Ｃ）11個のCOVID-19感染患者試料および他のウイルス性呼吸器感染症の12個の患者試料の蛍光DETECTR動態曲線を示す。6人の患者からの10個の鼻咽頭/中咽頭スワブ試料（COVID19-1～COVID19-6）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。図120Cは、試料インプット対照である、RNase Pに対応するグラフを示す。
（図１２１）示される試験解釈を用いた臨床試料についてのSARS-CoV-2 DETECTRアッセイ結果のヒートマップを示す。24個の臨床試料（COVID-19陽性、12個）を、ImageJ ゲル分析器ツールによってSARS-CoV-2 DETECTRについて定量化したラテラルフローSARS-CoV-2 DETECTRアッセイの結果（上）は、アッセイの蛍光バージョンの結果（下）と98.6％（71/72ストリップ）一致していることを示す。両方のアッセイを30分間の増幅で実行し、Cas12反応信号を10分で得た。推定陽性はオレンジ色の（＋）で示される（下、列4）。
（図１２２）示される試験解釈を用いた臨床試料についてのSARS-CoV-2 DETECTRアッセイ結果のヒートマップを示す。上のプロットは、追加の30個のCOVID-19陽性臨床試料（陽性27、推定陽性1、陰性2）に対する蛍光SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの結果を示す。推定陽性はオレンジ色の（＋）で示される（上、列9）。下のプロットは、追加の30個のCOVID-19陰性臨床試料（陽性0、陰性30）に対する蛍光SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの結果を示す。
（図１２３）異なるプライマーセットを用いたRNase P POP7のRT-LAMP増幅について、結果までの時間を示す。プライマーセット1～10を用いて増幅した試料について、結果までの時間を決定した。プライマーセット1は、SEQ ID NO:360-SEQ ID NO:365に対応し、プライマーセット9は、SEQ ID NO:366-SEQ ID NO:371に対応する。
（図１２４）プライマーセット1またはプライマーセット9を用いてRT-LAMPを使用して増幅され、R779、R780またはR1965 gRNAで検出されたRNase P POP7に行われたDETECTR反応の経時的な生蛍光を示す。DETECTR反応は、37°Cで90分間行った。セット1プライマーによって生成されたアンプリコンは、R779によってバックグラウンドなし（点線）で検出された。
（図１２５）図125Aは、プライマーセット1またはプライマーセット9を用いるRT-LAMPを使用して増幅されたトータルRNAの10倍希釈物を含む試料における、RNase P POP7検出の結果までの時間を示す。増幅は、60°Cで30分間行った。図125Bは、図125Aに示され、gRNA 779（SEQ ID NO:330）またはgRNA 1965（SEQ ID NO:331）を使用して検出されたRNase P POP7アンプリコンのDETECTR反応を示す。プライマーセット1を使用して増幅した試料をgRNA 779で検出し、プライマーセット9を使用して増幅した試料をgRNA 1965で検出した。DETECTR反応は、37°Cで90分間行った。
（図１２６）図126Aおよび図126Bは、DETECTRアッセイで使用するために設計されたカートリッジの写真を示す。
（図１２７）図127Aおよび図127Bは、図126Aの写真で示されるカートリッジの概略図である。
（図１２８Ａ）DETECTRアッセイで使用するために設計されたカートリッジの概略図を示す。図128Aは、円形の試薬貯蔵ウェルおよびz方向の高抵抗蛇行経路を有するカートリッジを示す。
（図１２８Ｂ）DETECTRアッセイで使用するために設計されたカートリッジの概略図を示す。図128Bは、細長い試薬貯蔵ウェルおよびz方向の高抵抗蛇行経路を有するカートリッジを示す。
（図１２８Ｃ）DETECTRアッセイで使用するために設計されたカートリッジの概略図を示す。図128Cは、円形の試薬貯蔵ウェルおよびxy方向の高抵抗蛇行経路を有するカートリッジを示す。
（図１２８Ｄ）DETECTRアッセイで使用するために設計されたカートリッジの概略図を示す。図128Dは、細長い試薬貯蔵ウェルおよびxy方向の高抵抗蛇行経路を有するカートリッジを示す。
（図１２９）図129A～図129Dは、DETECTRアッセイで使用するために設計されたカートリッジの概略図を示す。図129Aは、試料計量チャネルとは異なる平面または層上で蛇行している、試料計量のための蛇行抵抗チャネルを有するカートリッジを示す。図129Bは、試料計量チャネルと同じ平面または層上で蛇行している、試料計量のための蛇行抵抗チャネルを有するカートリッジを示す。図129Cは、直角の困難な経路（arduous path）の試料計量のための抵抗性経路、および試料計量チャネルとは異なる平面または層上のDETECTR試料計量投入口を含むカートリッジを示す。図129Dは、試料計量のための直角の困難な経路抵抗性経路、および試料計量チャネルと同じ平面または層上のDETECTR試料計量投入口を含むカートリッジを示す。
（図１３０）図130Aは、DETECTRアッセイで使用するために設計されたカートリッジの特徴を示す。図130Bは、本開示のカートリッジを製造するための製造スキーム（左および中央）およびカートリッジ内の試料を検出するための読み出し装置（右）を示す。
（図１３１）図131Aは、本開示のカートリッジの領域を加熱するためのカートリッジマニホールドの概略図を示す。カートリッジマニホールドは、一体化された空気供給接続部および空気供給インターフェース用の一体化されたOリング溝を備える、一体化された加熱ゾーンを有する。カートリッジマニホールドは、増幅温度ゾーンを検出温度ゾーンから熱的に分離し、カートリッジの増幅チャンバおよび検出チャンバの適切な温度を維持するための絶縁ゾーンを含む。図131Bは、本明細書に記載のカートリッジを製造するための2つの製造方法を示す。第1の製造方法（左）では、多層の二次元（2D）積層を用いてカートリッジを製造する。第2の製造方法（右）では、統合された複雑な形質を含む部品が射出成形され、ラミネーションによって封止される。図131Cは、カートリッジをシリンジに結合するためのルアースリップアダプタを備えるカートリッジの概略図を示す。アダプタは、スリップルアーチップを有するしまりばめ封止を形成することができる。アダプタは、本明細書に開示されるカートリッジのいずれかと共に機能するように構成される。
（図１３２）図132Aおよび図132Bは、マイクロ流体カートリッジと共に使用するための一体化フローセルの概略図を示す。一体化フローセルは、溶解領域、増幅領域、および検出領域の3つの領域を含む。溶解領域は、マイクロ流体チップショップ試料溶解フローセルを収容するのに十分な長さである。溶解フローセルは、本明細書に開示されるカートリッジ上の増幅および検出チャンバと組み合わせてもよい。
（図１３３）本開示のカートリッジ上の投入口チャネルの詳細を示す。
（図１３４）本開示のマイクロ流体カートリッジを使用してDETECTRアッセイを実行するためのワークフローを示す。カートリッジ（「チップ」）に試料および反応溶液を充填する。増幅チャンバ（「LAMPチャンバ」）を60°Cに加熱し、試料を増幅チャンバ内で30分間インキュベートする。増幅された試料（「LAMPアンプリコン」）が、DETECTR反応チャンバにポンプで圧送され、DETECTR試薬が、DETECTR反応チャンバにポンプで圧送される。DETECTR反応チャンバを37°Cに加熱し、試料を30分間インキュベートする。DETECTR反応チャンバ内の蛍光をリアルタイムで測定して、定量的結果を生成する。
（図１３５）本明細書に開示されるカートリッジと互換性のあるカートリッジマニホールドのシステム電子機器の構造の概略図を示す。電子機器は、カートリッジの第1のゾーンを37°Cに、カートリッジの第2のゾーンを60°Cに加熱するように構成されている。
（図１３６）図136Aおよび図136Bは、本開示のカートリッジを加熱および検出するためのカートリッジマニホールドの概略図を示す。マニホールドは、カートリッジを受け入れ、DETECTR反応を促進し、DETECTR反応の結果生じる蛍光を読み取るように構成される。
（図１３７Ａ）カートリッジ内の蛍光試料の一例を示し、カートリッジマニホールドで照射される。陽性対照ウェルは、60°Cで30分間の増幅工程および37°Cで30分間の検出工程後の試薬および増幅試料を含有する。空のウェルは、偽陰性試料として機能する。
（図１３７Ｂ）本開示のカートリッジを加熱および検出するためのカートリッジマニホールドを示す。
（図１３７Ｃ）本開示のカートリッジを加熱および検出するためのカートリッジマニホールドを示す。
（図１３８）図138Aおよび図138Bは、本開示のマニホールドによって促進されるマイクロ流体カートリッジの検出チャンバ内で生成される蛍光を示す。
（図１３９）図139Aおよび図139Bは、60°Cに加熱された増幅チャンバ（図139A）または37°Cに加熱されたDETECTRチャンバ（図139B）の熱試験概要を示す。
（図１４０）図140Aおよび図140Bは、60°Cに加熱された増幅チャンバ（図140A）または37°Cに加熱されたDETECTRチャンバ（図140B）の熱試験概要を示す。
（図１４１）図141Aは、マイクロ流体カートリッジからのLAMP生成物をインプットとして使用して、ゲイン100でプレートリーダー上で実行されたDETECTR結果を示す。試料は、単一の非テンプレート対照（NTC）と共に2つ組で実行された。図141Bは、マイクロ流体チップからの試料を使用してプレートリーダー上で実施される3つのLAMP生成物を示す。LAMP反応は、チップが実行された順序で番号付けされる（最初に実行されたLAMP＿1など）。ドナーはSNP Aについてホモ接合性であり、それによれば、crRNA 570が最初に現れる。ATTO 488を蛍光標準として使用した。
（図１４２）図142Aは、充填されたマイクロ流体チップの画像を示す。図142Bは、30分間のLAMP増幅後にプレートリーダーで測定したDETECTR反応の結果を示す。
（図１４３）図143A、図143B、図143Cおよび図143Dは、コロナウイルスDETECTR反応の結果を示す。10コピーがLAMPにインプットされた2つの反応チャンバは、DETECTR信号の急速な増加をもたらした。すべてのNTCは陰性であった。10コピーがLAMPに入力されると、以下の図143Cのフォトダイオード測定値に示されるように、DETECTR信号は反応の過程にわたって徐々に増加した。図143Dの陰性対照は、汚染がないことを示した。
（図１４４）図144A、図144B、図144Cおよび図144Dは、反復コロナウイルスDETECTR反応の結果を示す。
（図１４５）図145Aおよび図145Bは、マイクロ流体カートリッジにおけるインフルエンザB DETECTR反応のフォトダイオード測定値を示す。
（図１４６）図146A、図146Bおよび図146Cは、マイクロ流体カートリッジにおけるインフルエンザB DETECTR反応のフォトダイオード測定値を示す。
（図１４７）ガラスキャピラリーに7ヶ月間保存された一連のDETECTR試薬からの蛍光結果を示す。
（図１４８）スピンスルーカラム（spin-through column）の設計、ならびに連続増幅およびDETECTR反応のためのスピンスルーカラムの使用方法を提供する。
（図１４９）電気化学的に検出可能な核酸を構築するために使用される3つの試薬:（A）フェロセン標識チミジン、（B）6-カルボキシフルオレセイン、および（C）ビオチン標識ホスフェートの構造を提供する。
（図１５０）試料インプットチャンバと、試料の一部を増幅およびディテクター反応に供することができる複数のチャンバとを含む射出成形カートリッジの設計を提供する。
（図１５１）図150に示す射出成形カートリッジを用いることができる、検出器ダイオードアレイおよび加熱パネルを含む装置の設計を提供する。
（図１５２）異なる二重溶解増幅緩衝液に供した試料で実施した一連のDETECTR反応からの蛍光データを示す。
（図１５３）異なる二重溶解増幅緩衝液に供した試料で実施した一連のDETECTR反応からの蛍光データを示す。
（図１５４）パネル（a）は、試料に複数の増幅およびDETECTR反応を実施するための射出成形カートリッジの設計を提供する。パネル（b）は、射出成形カートリッジを用い、カートリッジで行われるDETECTR反応からの蛍光を測定するように構成された装置の設計を提供する。
（図１５５）試料に並列増幅およびDETECTR反応を実行するために、射出成形カートリッジ、および図154に示す装置を用いる方法を提供する。
（図１５６）射出成形カートリッジおよび図154の装置からのダイオードアレイおよび色素充填反応区画を示す。
（図１５７）5つの増幅チャンバに接続された1つの試料チャンバと、各増幅チャンバに接続された2つの検出チャンバとを含む射出成形カートリッジの可能な設計を示す。したがって、装置は、単一の試料に対して10の並行したDETECTR反応を実行することができる。
（図１５８）4つの増幅チャンバに接続された1つの試料チャンバと、各増幅チャンバに接続された2つの検出チャンバとを含む射出成形カートリッジの可能な設計を示す。射出成形カートリッジは、カートリッジ全体の流れを制御するポンプマニホールドを圧送するための、一連のバルブおよびポンプまたはポートを含む。
（図１５９）4つの増幅チャンバに接続された1つの試料チャンバと、各増幅チャンバに接続された2つの検出チャンバと、試料チャンバに接触された試薬チャンバとを含む射出成形カートリッジの可能な設計を示す。
（図１６０）増幅および検出チャンバに通じる流路内に試薬チャンバを有する射出成形カートリッジ設計の上面図を提供する。
（図１６１）単一の回転バルブによって複数の試薬および増幅チャンバに接続することができる試料チャンバを有する、射出成形カートリッジ設計の一部を示す。
（図１６２）複数の区画を接続するスライドバルブを有する射出成形カートリッジ設計の一部を示す。パネルA～Cは、スライドバルブが選ぶことができる様々な位置を示す。
（図１６３）パネルAは、ケーシングを有する射出成形カートリッジの可能な設計を示す。パネルBは、パネルAに示されている設計の物理モデルを提供する。
（図１６４）パネルAは、ケーシングを有する射出成形カートリッジの設計の底面図を提供する。パネルBは、射出成形カートリッジの上部の図を提供する。
（図１６５）スライドバルブを有する射出成形カートリッジの複数の図を提供する。
（図１６６）透明な反応チャンバにつながる複数の試薬ウェルを有する射出成形カートリッジの一部の図を2つ提供する。
（図１６７）パネルA～Bは、射出成形カートリッジ設計の上面図を提供する。パネルCは、射出成形カートリッジの物理モデルの写真を示す。
（図１６８）ダイオードアレイを含む装置に収容された射出成形カートリッジの写真を示す。
（図１６９）射出成形カートリッジおよび検出用のダイオードアレイを含む装置を制御するためのグラフィックユーザインターフェースを示す。
（図１７０）8ダイオード検出器アレイ、8チャンバ射出成形カートリッジ、および色素を用いた一連の蛍光実験の結果を示す。
（図１７１）8ダイオード検出器アレイを用いて測定された、一連のHERC2ターゲティングDETECTR反応および緩衝液対照からの蛍光結果を示す。
（図１７２）DETECTR反応を含有する8つのチャンバと共に、装置に挿入された射出成形カートリッジを示す。
（図１７３）異なる溶解条件下でLAMPを使用したSeraCare標的核酸の増幅の結果を示す。緩衝液（上のプロット）またはウイルス溶解緩衝液（「VLB」、下のプロット）のいずれかを含有する低pH緩衝液中で試料を増幅した。緩衝剤は、還元剤を含まないか（「制御」、列1および4）、還元剤Bを含むか（列2および5）、または還元剤Aを含んだ（列3および6）。試料を室温（左のプロット）または95°C（右のプロット）のいずれかで5分間インキュベートした。試料は、標的を含まない（「NTC」）か、反応あたり2.5、25、または250コピーのいずれかを含む。25μLの反応物において5μLの試料を使用してアッセイを3つ組で行った。
（図１７４）異なる溶解条件下でLAMPを使用したSeraCare標準標的核酸の増幅の結果を示す。緩衝液（左のプロット）またはウイルス溶解緩衝液（「VLB」、右のプロット）のいずれかを含有する低pH緩衝液中で試料を増幅した。緩衝液は、還元剤を含まない（「対照」）か、還元剤B、または還元剤Aを含んだ。試料を室温（上のプロット）または95°C（下のプロット）のいずれかで5分間インキュベートした。試料は、標的を含まない（「NTC」）か、反応あたり1.5、2.5、15、25、150、または250コピーのいずれかを含む。15μLの反応物において3μLの試料、または25μLの反応物において5μLの試料を使用してアッセイを3つ組で実施した。
（図１７５）6つの異なるウイルス溶解緩衝液（「VLB」、「VLB-D」、「VLB-T」、「緩衝液」、「緩衝液A」、「緩衝液B」）の存在下での、SARS-CoV-2 N遺伝子（「N」）およびRNase P試料インプット対照核酸（「RP」）の増幅を示す。緩衝液-Aは還元剤Aを含む緩衝液を含有し、緩衝液-Bは還元剤Bを含む緩衝液を含有する。陰影付きの正方形は増幅速度を示し、陰影が濃いほど速い増幅を示す。増幅を、力価の高い、中力価または低力価のCOVID-19陽性患者試料（それぞれ「16.9」、「30.5」、「33.6」）に対して95°C（「95 C」）または室温（「RT」）で行った。試料は2つ組で測定した。
（図１７６）電気活性レポーター核酸を用いて実施したDETECTR反応の矩形波ボルタンメトリー結果を示す。結果は、DETECTR反応の開始直後（0分）および33分後に収集した。
（図１７７）電気活性レポーター核酸を用いて実施したDETECTR反応のサイクリックボルタンメトリー結果を示す。結果は、DETECTR反応の開始直後（0分）および26分後に収集した。

詳細な説明
本開示は、迅速なラボ試験のための様々な装置、システム、流体装置、およびキットを提供し、これらは、流体システムの機能化された表面と相互作用して検出可能な信号を生成することができるプログラマブルヌクレアーゼを使用することによって、標的核酸が試料中に存在するかどうかを迅速に評価することができる。特に、標的核酸が生物学的試料中に存在するかどうかを迅速に評価することができる、迅速なラボ試験のための様々な装置、システム、流体装置、およびキットが本明細書で提供される。標的核酸は、ウイルスに由来し得る。例えば、本明細書に開示される迅速なラボ試験のための装置、システム流体装置、およびキットは、インフルエンザウイルス株由来の標的核酸が試料中に存在するかどうかを評価することができる。インフルエンザは、インフルエンザAまたはインフルエンザBであり得る。ウイルスは、コロナウイルスであり得る。本明細書で提供される組成物および方法は、インフルエンザまたは別のウイルス、例えば別の呼吸器ウイルス（例えば、コロナウイルス）から標的核酸を検出するために、本明細書で提供されるシステム、流体装置およびキットで使用することができるプログラマブルヌクレアーゼを開示する。いくつかの態様では、標的核酸は、上気道ウイルスに由来し得る。いくつかの態様では、標的核酸の2つ以上の固有の配列の多重化検出を実施することができる装置、システム、流体装置、およびキットが本明細書で提供される。例えば、本明細書で提供される装置、システム、流体装置、キット、およびプログラマブルヌクレアーゼは、1つまたは複数のウイルス由来の標的核酸の多重化検出に使用することができる。特定の態様では、本明細書中に提供される装置、システム、流体装置、キット、およびプログラマブルヌクレアーゼは、インフルエンザAおよびインフルエンザBの多重化検出のために使用することができる。いくつかの態様では、本明細書中に提供される装置、システム、流体装置、キット、およびプログラマブルヌクレアーゼは、インフルエンザA、インフルエンザB、および1つまたは複数の他のウイルス（例えば、コロナウイルス、RSVまたは他の呼吸器ウイルス、例えば上気道ウイルス）の多重検出のために使用することができる。

本明細書中に開示されるシステムおよびプログラマブルヌクレアーゼは、本明細書中に開示される疾患（例えば、RSV、敗血症、インフルエンザ）のいずれかのコンパニオン診断薬として使用することができ、または、試薬キット、ポイントオブケア診断、もしくは処方箋なしの診断において使用することができる。システムは、ポイントオブケア診断として、または標的核酸を検出し、それによって試料が採取された対象の状態を検出するためのラボ試験として使用され得る。システムは、試料が採取された対象における関心対象の遺伝子（例えば、疾患状態に関連する遺伝子）の有無を決定するために使用され得る。システムは、試料が採取された対象における病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）の有無を決定するために使用され得る。システムは、ラボ、病院、診療所/ラボ（POL）、クリニック、遠隔地域、または自宅など、様々な地域または場所で使用され得る。場合により、本開示は、消費者の遺伝子学的使用のための、または処方箋なしでの使用のための様々な装置、システム、流体装置、およびキットを提供する。

試料中の標的核酸の存在を検出するための装置、システム、流体装置、キット、および方法が本明細書に記載される。標的核酸は、疾患状態に関連する遺伝子または遺伝子の一部であり得る。標的核酸は、病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）由来の核酸であり得る。試料中の標的核酸の存在を検出するための装置、システム、流体装置、キット、および方法は、関心対象の標的核酸（例えば、インフルエンザ、コロナウイルスもしくは他の病原体由来の標的核酸、または関心対象の遺伝子に対応する標的核酸）の検出のための迅速なラボ試験で使用することができる。特に、迅速なラボ試験を単一のシステムで実行することができる、装置、システム、流体装置、およびキットが本明細書で提供される。標的核酸は、疾患の原因となる、試料中のウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する核酸の一部であり得る。標的核酸は、試料中の任意の生物由来のRNAまたはDNAの一部であり得る。いくつかの態様では、本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼを活性化して、RNAまたはDNAによるRNAレポーターのトランス切断活性を開始する。本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼは、場合により、標的RNAに結合してRNAレポーターのトランス切断を開始し、このプログラマブルヌクレアーゼは、RNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼと呼ぶことができる。いくつかの例では、本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼは、標的DNAに結合してRNAレポーターのトランス切断を開始し、このプログラマブルヌクレアーゼは、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼと呼ぶことができる。いくつかの場合、本明細書に記載のプログラマブルヌクレアーゼは、標的RNAまたは標的DNAによって活性化され得る。例えば、本明細書に開示されるCas13タンパク質、例えばCas13aは、標的RNA核酸または標的DNA核酸によって活性化され、RNAレポーター分子をトランス付帯的に切断する。いくつかの態様では、Cas13は、RNAレポーターのトランス切断を開始する標的ssDNAに結合する。試料中の標的核酸の検出は、試料中の疾患の存在を示すことができ、疾患の影響を受けた環境内の、または疾患を有する個体の近くの個体への疾患の伝染を減らすよう措置を講じるための情報を提供することができる。試料中の標的核酸の検出は、疾患を引き起こす細菌に抗生物質耐性を与える、一塩基多型（SNP）などの疾患突然変異の存在を示すことができる。標的核酸の検出は、プログラマブルヌクレアーゼによって促進される。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合後に活性化され得、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を切断し、トランス切断活性を有することができ、これは「付帯的」または「トランス付帯的」切断とも称され得る。トランス切断活性は、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる近くの一本鎖核酸の非特異的切断、例えば検出部分を有するディテクター核酸のトランス切断であり得る。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによってディテクター核酸が切断されると、検出部分はディテクター核酸から放出され、支持媒体上に固定化された検出可能な信号を生成する。多くの場合、検出部分は、フルオロフォア、色素、ポリペプチドまたは核酸のうちの少なくとも1つである。検出部分は、固定化されるべき支持媒体上の捕捉分子に結合する場合がある。検出可能な信号を支持媒体上で可視化して、疾患などの病気に関連する標的核酸の存在またはレベルを評価することができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合によって活性化され得る、トランス切断活性を有するCRISPR-Cas（規則的に間の空いた短いパリンドローム反復のクラスタ-CRISPR関連）核タンパク質複合体であり得る。

一局面では、標的核酸を検出するためのシステムが本明細書に記載される。システムは、支持媒体;標的核酸を標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸であって、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第1の検出可能な信号を生成することができる、一本鎖ディテクター核酸を含み得る。

別の局面では、試薬チャンバと、第1の検出可能な信号を検出するための支持媒体とを含む、標的核酸を検出するためのシステムシステムが本明細書に記載される。試薬チャンバは、支持媒体;標的核酸を標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに、検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸であって、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第1の検出可能な信号を生成することができる、一本鎖ディテクター核酸を含む。

標的核酸を標的とするガイド核酸、ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ、検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸であって、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第1の検出可能な信号を生成することができる、一本鎖ディテクター核酸と、試料を接触させる工程、ならびに支持媒体を使用して第1の検出可能な信号を提示する工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法が、本明細書にさらに記載される。

標的核酸（例えば、インフルエンザ、コロナウイルス、または疾患状態に関連する遺伝子に由来する）を検出するためのCRISPR-Cas診断のためのアッセイの様々な設計も本明細書中に記載される。本明細書に開示されるラテラルフローアッセイの設計およびフォーマットは、新しいCasレポーター分子を含むことができ、これは、ラテラルフローストリップ自体の上流にあるアッセイの反応チャンバの表面につなぐことができる。本明細書に開示されるアッセイ設計は、偽陽性の可能性を最小限に抑え、したがって標的核酸に対する改善された感度および特異性を有することができるので、有意な利点を提供する。

標的核酸（例えば、インフルエンザ、コロナウイルス、または疾患状態に関連する遺伝子に由来する）を検出するためのキットが、本明細書にさらに記載される。キットは、支持媒体;標的配列を標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸であって、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第1の検出可能な信号を生成することができる、一本鎖ディテクター核酸を含み得る。

個体由来の生物学的試料または環境試料を試験して、個体が伝染性疾患を有するかどうかを判定することができる。生物学的試料を試験して、ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、または呼吸器合胞体ウイルス）由来の少なくとも1つの標的核酸の存在または非存在を検出することができる。生物学的試料を試験して、細菌由来の少なくとも1つの標的核酸の存在または非存在を検出することができる。検出される、疾患の原因となる病原体由来の少なくとも1つの標的核酸はまた、病原体が野生型であること、または抗生物質治療などの治療に対する耐性を与える突然変異を含むことを示すことができる。いくつかの態様では、個体由来の生物学的試料または環境試料を試験して、個体が疾患状態に関連する遺伝子または遺伝子変異を有するかどうかを判定することができる。個体または環境からの試料を本明細書に記載の試薬に適用する。試料と試薬との反応は、キットに備えられた試薬チャンバ内で行ってもよいし、キットに備えられた支持媒体上で行ってもよい。標的核酸が試料中に存在する場合、標的核酸は、ガイド核酸に結合してプログラマブルヌクレアーゼを活性化する。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、ディテクター核酸を切断し、支持媒体上に可視化され得る検出可能な信号を生成する。標的核酸が試料中に存在しないか、または検出閾値未満である場合、ガイド核酸は未結合のままであり、プログラマブルヌクレアーゼは活性化されないままであり、ディテクター核酸は切断されないままである。試料と試薬とを所定時間接触させた後、反応済みの試料を支持媒体の試料パッド上に配置する。試料は、支持媒体を試薬チャンバに浸漬すること、反応した試料を試料パッドに塗布すること、または試薬が最初に支持媒体上に配置された場合、試料を移動させることによって、試料パッド上に配置することができる。反応した試料および試薬が支持媒体に沿って検出領域に移動し、反応した試料を塗布してから所定の時間後に、陽性対照マーカーを検出領域に可視化することができる。試料が標的核酸について陽性である場合、検出可能な信号についての試験マーカーも可視化することができる。検出領域での結果は、目で、または移動式装置を使用して視覚化することができる。いくつかの場合では、個体は、カメラを有する移動式装置で試験結果を読み取るために移動式アプリケーションを開き、移動式装置のカメラおよび移動式アプリケーションのグラフィックユーザインターフェース（GUI）を使用して、ハウジング上の検出領域、バーコード、基準カラースケール、および基準マーカーを含む支持媒体の画像を得ることができる。移動式アプリケーションは、試験を同定し、画像内の検出領域を可視化し、分析して疾患の原因となる標的核酸の有無またはレベルを決定することができる。移動式アプリケーションは、試験の結果を個人に提示し、試験結果を移動式アプリケーションに格納するか、または遠隔装置と通信して試験結果のデータを転送することができる。

本明細書中に記載されるそのような装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、標的核酸、次いでウイルス感染（例えば、インフルエンザウイルス感染、コロナウイルス、または呼吸器合胞体ウイルス）、細菌感染、または標的核酸に関連する疾患状態の検出を、特殊な機器を用いずに遠隔地域またはリソースの乏しい環境において可能にし得る。さらに、本明細書に記載のそのような装置、システム、流体装置、キット、および方法は、医療クリニックまたは医院において、特殊な機器を用いずに標的核酸、次に標的核酸に関連する病原体および疾患の検出を可能にし得る。いくつかの場合では、これは、ユーザが家庭または医療提供者のオフィスで迅速に疾患または感染について容易に検査するためのポイントオブケア検査を提供する。1時間未満、例えば15～60分で結果をもたらすアッセイは、多くの理由から家庭での試験に特に望ましい。抗ウイルス薬は、最初の48時間以内に投与された場合に最も効果的であり得、抗生物質の管理を改善し得る。したがって、1時間未満で結果を提供することができる本明細書に開示されるシステムおよびアッセイは、最適な時間で抗ウイルス療法の提供を可能にすることができる。さらに、本明細書で提供されるシステムおよびアッセイは、迅速な診断および結果を提供することができ、患者を自宅に留めるかまたは自宅に送るのに役立ち、包括的な疾患監視を改善し、感染症の拡大を予防することができる。他の場合では、これは、対象由来の試料中の関心対象の核酸を検出するためにラボで使用することができる試験を提供する。特に、迅速なラボ試験を単一のシステムで実行することができる、装置、システム、流体装置、およびキットが本明細書で提供される。いくつかの場合では、これは、発展途上国における疾患の検出において、および疾患の蔓延もしくは治療の有効性を検出するための、またはインフルエンザなどのウイルス感染の早期検出を提供するための世界的なヘルスケアツールとして有益であり得る。

本明細書に記載されるいくつかの方法は、編集技術、例えば編集酵素またはプログラマブルヌクレアーゼおよびガイド核酸を使用した技術を使用して、標的核酸を検出する。編集技術における編集酵素またはプログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸によって活性化することができ、その後、活性化された編集酵素または活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、検出部分を有するディテクター核酸など、近くの一本鎖核酸を切断することができる。標的核酸（例えば、インフルエンザなどのウイルス由来の標的核酸）を等温増幅によって増幅することができ、次いで編集技術を使用してマーカーを検出することができる。いくつかの例では、編集技術は、活性化されると、検出の読み出しとして近くのRNAまたはDNAを切断する編集酵素またはプログラマブルヌクレアーゼを含むことができる。本明細書に記載の方法は、いくつかの例では、無細胞DNA試料を得る工程、試料からDNAを増幅する工程、編集技術を使用してディテクター核酸を切断する工程、および編集技術の出力を読み取る工程を含む。他の例では、方法は、患者から流体試料を得る工程、流体試料の核酸を増幅することなく、編集技術を使用してディテクター核酸を切断する工程、および核酸を検出する工程を含む。この方法はまた、一本鎖ディテクターDNAを使用する工程、活性化編集酵素を使用して一本鎖ディテクターDNAを切断する工程を含むことができ、編集酵素は、色の変化によって測定されるように、一本鎖ディテクターDNAの集団の少なくとも50％を切断する。いくつかの試料、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼまたは編集酵素、支持媒体、標的核酸、一本鎖ディテクター核酸、および試薬は、本明細書に開示される装置、システム、流体装置、キット、および方法と一致する。

ディテクター核酸およびディテクター核酸を使用して標的核酸を検出する方法も本明細書に開示される。多くの場合、ディテクター核酸はタンパク質-核酸である。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、タンパク質-核酸は、酵素-核酸または酵素基質-核酸である。タンパク質-核酸は、固体支持体に結合される場合がある。核酸は、DNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッドであり得る。本明細書に記載の方法は、CRISPR/Cas系などのプログラマブルヌクレアーゼを使用して標的核酸を検出する。試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、a）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;b）複合体を基材に接触させる工程;c）基材を、切断された基材と差次的に反応する試薬に接触させる工程;およびd）基材の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素-核酸である。場合によって、基質は酵素基質-核酸である。

タンパク質-核酸の切断は、信号を生成する。例えば、タンパク質-核酸の切断は、熱量測定信号、電位差測定信号、電流測定信号、光学信号、または圧電信号を生成する。様々な装置を使用して、標的核酸が試料中に存在するかどうかを示すこれらの異なる種類の信号を検出することができる。

試料
多くの試料は、本明細書に開示される装置、システム、流体装置、キット、および方法と一致する。これらの試料は、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される流体装置と一致し、流体装置は、流体システム自体内部での試料調製、試料内の標的核酸の増幅、プログラマブルヌクレアーゼとの混合、およびプログラマブルヌクレアーゼによるディテクター核酸の切断から生じる検出可能な信号の検出のために、複数のポンプ、バルブ、貯蔵器、およびチャンバを含み得る。これらの試料は、疾患などの病気、病原体、またはインフルエンザなどのウイルスの検出のための標的核酸を含むことができる。一般に、個体もしくは動物からの試料または環境試料を得て、疾患または関心対象の任意の突然変異の存在について試験することができる。個体からの生物学的試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、粘膜試料、腹膜試料、脳脊髄液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽頭滲出液、尿道または膣分泌物、滲出液、浸出液、または組織であり得る。組織試料は、本開示の検出システムに適用する前に分離または液化することができる。試料は、疾患、がん、もしくは遺伝障害など病気の検出、またはフェノタイピング、ジェノタイピングなどの遺伝情報、または表現型決定、遺伝子型決定、または家系の決定のための1つまたは複数の標的核酸を含むことができ、本明細書に記載の試薬および支持媒体と適合する。一般に、試料は、核酸を見出すことができる任意の場所から採取することができる。試料は、個体/ヒト、非ヒト動物、もしくは作物から採取することができ、または環境試料を取得して、疾患、ウイルス、病原体、がん、遺伝障害、または任意の突然変異または関心対象の病原体の存在について試験することができる。生物学的試料は、血液、血清、血漿、肺液、呼気凝縮物、唾液、痰、尿、便、糞、粘液、リンパ液、腹膜、脳脊髄液、羊水、母乳、胃液分泌物、排泄物、潰瘍からの分泌物、膿、鼻分泌物、痰、咽頭滲出液、尿道分泌物/粘液、膣分泌物/粘液、肛門分泌物/粘液、精液、涙、滲出液、浸出液、組織液、間質液（例えば、腫瘍間質液）、嚢胞液、組織、またはいくつかの例では、それらの組み合わせであり得る。試料は、動物（例えば、ヒト、動物、家畜、ペットなど）または植物からの体液の吸引液であり得る。組織試料は、病原体に感染または影響され得る任意の組織（例えば、いぼ、肺組織、皮膚組織など）に由来し得る。組織試料（例えば、動物、植物、またはヒト由来）は、本開示の検出システムに適用する前に分離または液化することができる。試料は、植物（例えば、作物、水耕栽培された作物もしくは植物、および/または観葉植物）に由来し得る。植物試料は、組織（例えば、根、葉、茎、幹など）からの細胞外液を含むことができる。試料は、水耕液/水または土壌など、植物を直接取り囲む環境から採取することができる。環境からの試料は、土壌、空気、または水からのものであり得る。いくつかの例では、環境試料は、関心対象の表面からスワブとして採取されるか、または関心対象の表面から直接採取される。いくつかの例では、未処理の試料を検出システムに適用する。いくつかの例では、試料を緩衝液もしくは流体で希釈するか、または検出システムに適用する前に濃縮するか、または検出システムにそのまま適用する。場合によっては、試料は20uL以下で含まれる。いくつかの場合では、試料は、1uL以下、5uL以下、10uL以下、15uL以下、20uL以下、25uL以下、30uL以下、35uL以下、40uL以下、45uL以下、50uL以下、55uL以下、60uL以下、65uL以下、70uL以下、75uL以下、80uL以下、90uL以下、100uL以下、200uL以下、300uL以下、400uL以下、500uL以下、または1uL～500uLのいずれかの値で含まれる。場合によっては、試料は500uL超で含まれる。

いくつかの例では、試料は、単細胞真核生物;植物または植物細胞;藻類細胞;真菌細胞;動物の細胞、組織、または器官;無脊椎動物由来の細胞、組織または器官;脊椎動物、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、および哺乳類の細胞、組織、体液、または器官;ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、ネコ、ウシ、ヒツジおよびヤギなどの哺乳類由来の細胞、組織、体液または器官から採取される。いくつかの例では、試料は、線虫、原虫、蠕虫またはマラリア寄生虫から採取される。いくつかの場合では、試料は、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、原核細胞または植物細胞からの細胞溶解物由来の核酸を含む。いくつかの場合では、試料は、細胞から発現された核酸を含む。

疾患試験に使用される試料は、本明細書に記載される試薬のガイド核酸に結合することができる少なくとも1つの標的配列を含み得る。いくつかの場合では、標的配列は核酸の一部である。核酸の一部は、ゲノム遺伝子座、転写mRNA、または逆転写cDNAに由来し得る。核酸の一部は、5～100、5～90、5～80、5～70、5～60、5～50、5～40、5～30、5～25、5～20、5～15、または5～10ヌクレオチド長であり得る。核酸の一部は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90、または100ヌクレオチド長であり得る。標的配列は、ガイド核酸と逆相補的であり得る。

いくつかの場合では、標的配列は、疾患の原因となる、試料中のウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、性感染症または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、上気道感染症、下気道感染症、または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、院内感染症または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列はssRNAである。これらの標的配列は、疾患に由来し得、疾患には、これらに限定されないがインフルエンザAウイルス（IAV）またはインフルエンザBウイルス（IBV）を含むインフルエンザウイルス、ライノウイルス、風邪ウイルス、呼吸器ウイルス、上気道ウイルス、下気道ウイルス、または呼吸器合胞体ウイルスが含まれ得る。病原体には、ウイルス、真菌、蠕虫、原虫、および寄生虫が含まれる。病原性ウイルスには、インフルエンザウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。病原体としては、例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agalactiae）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、肺炎球菌（Pneumococcus）、ヘモフィルス・インフルエンザB、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、肺炎マイコプラズマ（M.pneumoniae）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermdius）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）が挙げられる。多くの場合、標的核酸は、試料中で発見され得る、疾患の原因となるウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する配列を含む。病原性ウイルスには、これらに限定されないがインフルエンザウイルス;RSV;コロナウイルス、ssRNAウイルス、呼吸器ウイルス、上気道ウイルス、下気道ウイルス、またはライノウイルスが含まれる。病原体としては、例えば、結核菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿レンサ球菌、ヘモフィルス・インフルエンザB インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、または結核菌が挙げられる。

いくつかの場合では、標的配列は、疾患の原因となる、試料中のウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、性感染症または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、上気道感染症、下気道感染症、または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、院内感染症または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の敗血症由来の核酸の一部である。これらの疾患には、呼吸器ウイルス（例えば、COVID-19、SARS、MERS、インフルエンザなど）ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、クラミジア、淋病、梅毒、トリコモナス症、性感染症、マラリア、デング熱、エボラ、チクングニア熱、およびリーシュマニア症が含まれ得るが、これらに限定されない。病原体には、ウイルス、真菌、蠕虫、原虫、マラリア寄生虫、プラスモディウム寄生虫、トキソプラズマ寄生虫、および住血吸虫属寄生虫が含まれる。蠕虫には、回虫、犬糸状虫、および植物性線虫、吸虫、鉤頭虫類、およびサナダムシが含まれる。原虫感染症には、ジアルジア属（Giardia）種、トリコモナス属（Trichomonas）種、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム赤痢、シャーガス病、コクシジウム症、マラリアおよびトキソプラズマ症からの感染症が含まれる。寄生虫/原虫病原体などの病原体の例には、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（P.vivax）、トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）およびトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）が含まれるが、これらに限定されない。真菌病原体としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストマイセス・デルマチティディス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）が挙げられるが、これらに限定されない。病原性ウイルスには、これらに限定されないが、呼吸器ウイルス（例えば、アデノウイルス、パラインフルエンザ、重症急性呼吸器症候群（SARS）、コロナウイルス、MERS）、胃腸ウイルス（例えば、ノロウイルス、ロタウイルス、一部のアデノウイルス、アストロウイルス）、発疹性ウイルス（例えば、麻疹を引き起こすウイルス、風疹を引き起こすウイルス、水痘/帯状ヘルペスを引き起こすウイルス、バラ疹を引き起こすウイルス、天然痘を引き起こすウイルス、第5病を引き起こすウイルス、チクングニアウイルス感染症）;肝ウイルス性疾患（例えば、A、B、C、D、E型肝炎）;皮膚ウイルス性疾患（例えば、いぼ（生殖器、肛門を含む）、ヘルペス（口腔、生殖器、肛門を含む）、伝染性軟属腫）;出血性ウイルス性疾患（例えば、エボラ、ラッサ熱、デング熱、黄熱病、マールブルグ出血熱、クリミア-コンゴ出血熱）;神経ウイルス（例えば、ポリオ、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性脳炎、狂犬病）、性感染症（例えば、HIV、HPV等）、免疫不全ウイルス（例えば、HIV）;インフルエンザウイルス;デング熱;西ナイルウイルス;ヘルペスウイルス;黄熱ウイルス;C型肝炎ウイルス;A型肝炎ウイルス;B型肝炎ウイルス;パピローマウイルス等が含まれる。病原体には、例えば、HIVウイルス、結核菌、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、ストレプトコッカス・アガラクティエ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿レンサ球菌、大腸菌、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌、肺炎球菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、ヘモフィルス・インフルエンザB、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ライム病スピロヘータ、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、ブルセラ・ボルツス（Brucella abortus）、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスウイルスII、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、M.ジェニタリウム（M.genitalium）、T.バギナリス（T.Vaginalis）、水痘帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス40、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、トリパノソーマ・ランゲリ（Trypanosoma rangeli）、トリパノソーマ・クルジ、トリパノソーマ・ロディセンス（Trypanosoma rhodesiense）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ウシバベシア、アイメリア・テネラ（Eimeria tenella）、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、結核菌、旋毛虫、タイレリア・パルバ（Theileria parva）、胞状条虫、テニア・オビス（Taenia ovis）、無鉤条虫、単包条虫、メソセストイデス・コルチ（Mesocestoides corti）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Mycoplasma arthritidis）、M.ハイオリニス（M.hyorhinis）、M.オラレ（M.orale）、M.アルギニーニ（M.arginini）、アコレプラズマ・ライドラウイイ（Acholeplasma laidlawii）、M.サリバリウム（M.salivarium）、M.ニュウーモニエ（M.pneumoniae）、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）、クレブシエラ・アエロゲネス（Kiebsiella aerogenes）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、セラチア・マルセッセンス（Serratia macesens）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ストレプトコッカス・インターメディウス、肺炎レンサ球菌、および化膿レンサ球菌が含まれる。多くの場合、標的核酸は、試料中で発見され得る、疾患の原因となるウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する配列を含む。いくつかの場合では、標的核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、クラミジア、淋病、梅毒、トリコモナス症、性感染症、マラリア、デング熱、エボラ、チクングニア熱およびリーシュマニア症のうちの少なくとも1つの遺伝子座からのゲノム遺伝子座、転写mRNAまたは逆転写cDNAからの核酸の一部である。病原体には、ウイルス、真菌、蠕虫、原虫、マラリア寄生虫、プラスモディウム寄生虫、トキソプラズマ寄生虫、および住血吸虫属寄生虫が含まれる。蠕虫には、回虫、犬糸状虫、および植物性線虫、吸虫、鉤頭虫類、およびサナダムシが含まれる。原虫感染症には、ジアルジア属（Giardia）種、トリコモナス属（Trichomonas）種、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム赤痢、シャーガス病、コクシジウム症、マラリアおよびトキソプラズマ症からの感染症が含まれる。寄生虫/原虫病原体などの病原体の例には、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（P.vivax）、トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）およびトキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）が含まれるが、これらに限定されない。真菌病原体としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、ブラストマイセス・デルマチティディス（Blastomyces dermatitidis）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）が挙げられるが、これらに限定されない。病原性ウイルスには、これらに限定されないが、免疫不全ウイルス（例えば、HIV）;インフルエンザウイルス;デング熱;西ナイルウイルス;ヘルペスウイルス;黄熱ウイルス;C型肝炎ウイルス;A型肝炎ウイルス;B型肝炎ウイルス;パピローマウイルス等が含まれる。病原体には、例えば、HIVウイルス、結核菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿レンサ球菌、大腸菌、淋菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、ヘモフィルス・インフルエンザB、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、ライ菌、ブルセラ・ボルツス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスI、単純ヘルペスII、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、M.ジェニタリウム、T.バギナリス、水痘帯状疱疹ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、シミアンウイルス40、マウス乳腺腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、トリパノソーマ・ランゲリ、トリパノソーマ・クルジ、トリパノソーマ・ロディセンス、トリパノソーマ・ブルセイ、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、ウシバベシア、アイメリア・テネラ、回旋糸状虫、熱帯リーシュマニア、結核菌、旋毛虫、タイレリア・パルバ、胞状条虫、テニア・オビス、無鉤条虫、単包条虫、メソセストイデス・コルチ、マイコプラズマ・アルスリチジス、M.ハイオリニス、M.オラレ、M.アルギニーニ、アコレプラズマ・ライドラウイイ、M.サリバリウムおよびM.ニュウーモニエが含まれる。いくつかの場合では、標的配列は、治療に対する耐性をもたらす突然変異、例えば抗生物質治療に対する耐性をもたらす単一ヌクレオチドの突然変異を含む、試料中の疾患の原因となる細菌または他の作用因子の遺伝子座からのゲノム遺伝子座、転写mRNAまたは逆転写cDNAからの核酸の一部である。

がん試験またはがんリスク試験に使用される試料は、本明細書に記載される試薬のガイド核酸に結合することができる少なくとも1つの標的核酸セグメントを含み得る。標的核酸セグメントは、いくつかの場合では、がんに関連する突然変異を有する遺伝子、過剰発現ががんに関連する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、がん遺伝子、チェックポイント阻害剤遺伝子、細胞増殖に関連する遺伝子、細胞代謝に関連する遺伝子、または細胞周期に関連する遺伝子由来の核酸の一部である。場合により、標的核酸は、前立腺がんバイオマーカーまたは非小細胞肺がんなどのがんバイオマーカーをコード化する。いくつかの場合では、このアッセイを使用して、肺がん、子宮頸がんなどのがんを予測することができる標的核酸中の「ホットスポット」を検出することができ、場合によっては、がんは、ウイルスによって引き起こされるがんであり得る。ヒトにおいてがんを引き起こすウイルスのいくつかの非限定的な例としては、エプスタイン・バーウイルス（例えば、バーキットリンパ腫、ホジキン病、および鼻咽頭がん）、パピローマウイルス（例えば、子宮頸がん、肛門がん、中咽頭がん、陰茎がん）;B型およびC型肝炎ウイルス（例えば、肝細胞がん）;ヒト成人T細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）（例えば、T細胞白血病）;およびメルケル細胞ポリオーマウイルス（例えば、メルケル細胞がん）が挙げられる。当業者は、ウイルスが他の種類のがんを引き起こすか、またはそれに寄与し得ることを認識するであろう。いくつかの場合では、標的核酸は、血熱に関連する核酸の一部である。いくつかの場合では、標的核酸セグメントは、ALK、APC、ATM、AXIN2、BAP1、BARD1、BLM、BMPR1A、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CASR、CDC73、CDH1、CDK4、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CEBPA、CHEK2、CTNNA1、DICER1、DIS3L2、EGFR、EPCAM、FH、FLCN、GATA2、GPC3、GREM1、HOXB13、HRAS、KIT、MAX、MEN1、MET、MITF、MLH1、MSH2、MSH3、MSH6、MUTYH、NBN、NF1、NF2、NTHL1、PALB2、PDGFRA、PHOX2B、PMS2、POLD1、POLE、POT1、PRKAR1A、PTCH1、PTEN、RAD50、RAD51C、RAD51D、RB1、RECQL4、RET、RUNX1、SDHA、SDHAF2、SDHB、SDHC、SDHD、SMAD4、SMARCA4、SMARCB1、SMARCE1、STK11、SUFU、TERC、TERT、TMEM127、TP53、TSC1、TSC2、VHL、WRN、およびWT1のうちの少なくとも1つの遺伝子座からのゲノム遺伝子座、転写mRNA、または逆転写cDNA由来の核酸の部分である。

遺伝性障害試験に使用される試料は、本明細書に記載される試薬のガイド核酸に結合することができる少なくとも1つの標的核酸セグメントを含み得る。いくつかの態様では、遺伝性障害は、血友病、鎌状赤血球貧血、β-サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、重症複合免疫不全症、または嚢胞性線維症である。標的核酸セグメントは、いくつかの場合では、遺伝性障害に関連する突然変異を有する遺伝子、過剰発現が遺伝性障害に関連する遺伝子、遺伝性障害をもたらす異常な細胞増殖に関連する遺伝子、または遺伝性障害をもたらす異常な細胞代謝に関連する遺伝子由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的核酸セグメントは、以下のうちの少なくとも1つの遺伝子座からの遺伝子座、転写mRNA、または逆転写cDNAからの核酸の一部である:CFTR、FMR1、SMN1、ABCB11、ABCC8、ABCD1、ACAD9、ACADM、ACADVL、ACAT1、ACOX1、ACSF3、ADA、ADAMTS2、ADGRG1、AGA、AGL、AGPS、AGXT、AIRE、ALDH3A2、ALDOB、ALG6、ALMS1、ALPL、AMT、AQP2、ARG1、ARSA、ARSB、ASL、ASNS、ASPA、ASS1、ATM、ATP6V1B1、ATP7A、ATP7B、ATRX、BBS1、BBS10、BBS12、BBS2、BCKDHA、BCKDHB、BCS1L、BLM、BSND、CAPN3、CBS、CDH23、CEP290、CERKL、CHM、CHRNE、CIITA、CLN3、CLN5、CLN6、CLN8、CLRN1、CNGB3、COL27A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL7A1、CPS1、CPT1A、CPT2、CRB1、CTNS、CTSK、CYBA、CYBB、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、CYP19A1、CYP27A1、DBT、DCLRE1C、DHCR7、DHDDS、DLD、DMD、DNAH5、DNAI1、DNAI2、DYSF、EDA、EIF2B5、EMD、ERCC6、ERCC8、ESCO2、ETFA、ETFDH、ETHE1、EVC、EVC2、EYS、F9、FAH、FAM161A、FANCA、FANCC、FANCG、FH、FKRP、FKTN、G6PC、GAA、GALC、GALK1、GALT、GAMT、GBA、GBE1、GCDH、GFM1、GJB1、GJB2、GLA、GLB1、GLDC、GLE1、GNE、GNPTAB、GNPTG、GNS、GRHPR、HADHA、HAX1、HBA1、HBA2、HBB、HEXA、HEXB、HGSNAT、HLCS、HMGCL、HOGA1、HPS1、HPS3、HSD17B4、HSD3B2、HYAL1、HYLS1、IDS、IDUA、IKBKAP、IL2RG、IVD、KCNJ11、LAMA2、LAMA3、LAMB3、LAMC2、LCA5、LDLR、LDLRAP1、LHX3、LIFR、LIPA、LOXHD1、LPL、LRPPRC、MAN2B1、MCOLN1、MED17、MESP2、MFSD8、MKS1、MLC1、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MPI、MPL、MPV17、MTHFR、MTM1、MTRR、MTTP、MUT、MYO7A、NAGLU、NAGS、NBN、NDRG1、NDUFAF5、NDUFS6、NEB、NPC1、NPC2、NPHS1、NPHS2、NR2E3、NTRK1、OAT、OPA3、OTC、PAH、PC、PCCA、PCCB、PCDH15、PDHA1、PDHB、PEX1、PEX10、PEX12、PEX2、PEX6、PEX7、PFKM、PHGDH、PKHD1、PMM2、POMGNT1、PPT1、PROP1、PRPS1、PSAP、PTS、PUS1、PYGM、RAB23、RAG2、RAPSN、RARS2、RDH12、RMRP、RPE65、RPGRIP1L、RS1、RTEL1、SACS、SAMHD1、SEPSECS、SGCA、SGCB、SGCG、SGSH、SLC12A3、SLC12A6、SLC17A5、SLC22A5、SLC25A13、SLC25A15、SLC26A2、SLC26A4、SLC35A3、SLC37A4、SLC39A4、SLC4A11、SLC6A8、SLC7A7、SMARCAL1、SMPD1、STAR、SUMF1、TAT、TCIRG1、TECPR2、TFR2、TGM1、TH、TMEM216、TPP1、TRMU、TSFM、TTPA、TYMP、USH1C、USH2A、VPS13A、VPS13B、VPS45、VRK1、VSX2、WNT10A、XPA、XPC、およびZFYVE26。

いくつかの態様では、標的核酸配列は、ウイルス、細菌、または植物（例えば、作物）における疾患の原因となる他の病原体の核酸配列を含む。本開示の方法および組成物は、植物における疾患を治療または検出するために使用することができる。例えば、本開示の方法を使用して、植物のウイルス核酸配列を標的とすることができる。本開示のプログラマブルヌクレアーゼは、ウイルス核酸を切断することができる。いくつかの態様では、標的核酸配列は、ウイルスまたは細菌、または植物（例えば、作物）における疾患の原因となる他の作用因子（例えば、病原体）の核酸配列を含む。いくつかの態様では、標的核酸は、本明細書中に開示される組成物、システムおよび方法を使用して、検出前にプログラマブルヌクレアーゼによる逆転写酵素を使用してRNAから逆転写されるDNAを含む。標的核酸は、いくつかの場合では、ウイルスまたは細菌、または植物（例えば、作物）の疾患の原因となる他の作用因子に由来する核酸の一部である。いくつかの場合では、標的核酸は、ゲノム遺伝子座からの核酸、または任意のDNAアンプリコン、例えば遺伝子座からの逆転写mRNAもしくはcDNA、転写mRNA、またはウイルスもしくは細菌もしくは植物（例えば、作物）における疾患の原因となる他の作用因子（例えば、任意の病原体）の遺伝子座からのまたは遺伝子座からの逆転写cDNAの一部である。植物に感染するウイルスは、RNAウイルスであり得る。植物に感染するウイルスは、DNAウイルスであり得る。本開示で標的とされ得るウイルスの非限定的な例には、タバコモザイクウイルス（TMV）、トマト黄化えそウイルス（TSWV）、キュウリモザイクウイルス（CMV）、ジャガイモYウイルス（PVY）、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）（RTウイルス）、プラムポックスウイルス（PPV）、ブロムモザイクウイルス（BMV）およびジャガイモXウイルス（PVX）が含まれる。

植物は、単子葉植物であり得る。植物は、双子葉植物であり得る。双子葉植物の目の非限定的な例には、モクレン目（Magniolales）、シキミ目、クスノキ目、コショウ目、ウマノスズクサ目、スイレン目、キンポウゲ目、パペベラレス目（Papeverales）、サラセニア科、ヤマグルマ目、マンサク目、ユーコミアレス目（Eucomiales）、レイトネリア目、ヤマモモ目、ブナ目、モクマオウ目、ナデシコ目、バテス目、タデ目、イソマツ目、サルナシ目、ツバキ目、アオイ目、イラクサ目、サガリバナ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目、バラ目、マメ目、カワゴケソウ目、アリノトウグサ目、テンニンカ目、ミズキ目、ヤマモガシ目、サンテイルズ（San tales）、ラフレシア目、ニシキギ目、トウダイグサ目、クロウメモドキ目、ムクロジ目、クルミ目、フウロソウ目、ヒメハギ目、セリ目、リンドウ目、ハナシノブ目、シソ目、オオバコ目、ゴマノハグサ目、キキョウ目、アカネ目、マツムシソウ目、およびキク目が含まれる。

単子葉植物の目の非限定的な例には、オモダカ目、トチカガミ目、イバラモ目、ホンゴウソウ目、ツユクサ目、ホシクサ目、レスティオナ目、イネ目、イグサ目、カヤツリグサ目、ガマ目、パイナップル目、ショウガ目、ヤシ目、パナマソウ目、タコノキ目、サトイモ目、ユリ目、およびラン目が含まれる。植物は、例えば、裸子植物、マツ目、イチョウ目、ソテツ目、ナンヨウスギ目、ヒノキ目およびグネツム目に属することができる。

植物の非限定的な例としては、植物作物、果実、野菜、穀物、ダイズ、コーン、トウモロコシ、コムギ、種子、トマト、イネ、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、大麻、タバコ、顕花植物、針葉樹、裸子植物、シダ、ヒカゲノカズラ、金魚藻、コケ、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ、アカシア、ニンジン、ジャガイモ、テンサイ、ヤム、レタス、ホウレンソウ、ヒマワリ、ナタネ、アラビドプシス、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、トネリコの木、アスパラガス、アボガド、バナナ、オオムギ、インゲンマメ、ビート、カバノキ、ブナ、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタループメロン、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、シダー、穀物、セロリ、クリ、サクランボ、ハクサイ、柑橘類、クレメンタイン、クローバー、コーヒー、コーン、綿、ササゲ、キュウリ、ヒノキ、ナス、ニレ、エンダイブ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、落花生、ホオズキ、ガム・ヘムロック（gum hemlock）、ヒッコリー、ケール、キワイフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、イナゴ、マツ、アジアンタム、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、ナッツ、オーク、オート麦、アブラヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞用の植物または花または樹木、パパイヤ、ヤシ、パセリ、パースニップ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、ナシ、ピート、コショウ、カキ、キマメ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、ラディッキオ、ダイコン、ナタネ、ラズベリー、イネ、ライムギ、ソルガム、ベニバナ、サロー、ダイズ、ホウレンソウ、トウヒ、スカッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、樹木、ライコムギ、芝生、カブ、ブドウの木、クルミ、オランダガラシ、スイカ、コムギ、ヤム、イチイ、およびズッキーニが挙げられる。植物は藻類を含むことができる。

試料は、疾患状態を特定するために使用することができる。例えば、試料は、本明細書に記載される任意の試料であり、対象の疾患状態の特定に使用するために対象から得られる。場合によって、方法は、対象から血清試料を得る工程、および対象の疾患状態を特定する工程を含む。

いくつかの例では、標的核酸は一本鎖核酸である。代替え的にまたは組み合わせて、標的核酸は二本鎖核酸であり、試薬との接触前または接触の際に一本鎖核酸に調製される。標的核酸は、RNA、DNA、合成核酸、または生物学的試料もしくは環境試料に見られる核酸であり得る。標的核酸には、mRNA、rRNA、tRNA、非コードRNA、長鎖非コードRNA、およびマイクロRNA（miRNA）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、標的核酸はmRNAである。いくつかの場合では、標的核酸は、本明細書に記載のウイルス、寄生虫、または細菌に由来する。いくつかの場合では、標的核酸は、本明細書に記載の遺伝子から転写される。

いくつかの標的核酸は、本明細書に開示される方法および組成物と一致する。本明細書に記載されるいくつかの方法は、標的核酸集団として様々な濃度または量で試料中に存在する標的核酸を検出することができる。いくつかの場合では、試料は少なくとも2つの標的核酸を有する。いくつかの場合では、試料は、少なくとも3、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも2000、少なくとも3000、少なくとも4000、少なくとも5000、少なくとも6000、少なくとも7000、少なくとも8000、少なくとも9000、または少なくとも10000個の標的核酸を有する。いくつかの場合では、方法は、10¹個の非標的核酸、10²個の非標的核酸、10³個の非標的核酸、10⁴個の非標的核酸、10⁵個の非標的核酸、10⁶個の非標的核酸、10⁷個の非標的核酸、10⁸個の非標的核酸、10⁹個の非標的核酸、または10¹⁰個の非標的核酸あたり少なくとも1つのコピーで存在する標的核酸を検出する。

いくつかの標的核酸集団は、本明細書に開示される方法および組成物と一致する。本明細書に記載されるいくつかの方法は、様々な濃度または量で試料中に存在する2つ以上の標的核酸集団を検出することができる。いくつかの場合では、試料は少なくとも2つの標的核酸集団を有する。いくつかの場合では、試料は、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、または少なくとも50個の標的核酸集団を有する。いくつかの場合では、方法は、10¹個の非標的核酸、10²個の非標的核酸、10³個の非標的核酸、10⁴個の非標的核酸、10⁵個の非標的核酸、10⁶個の非標的核酸、10⁷個の非標的核酸、10⁸個の非標的核酸、10⁹個の非標的核酸、または10¹⁰個の非標的核酸あたり少なくとも1つのコピーで存在する標的核酸集団を検出する。標的核酸集団は、試料中に異なる濃度または量で存在し得る。

上に開示された試料のいずれも、本明細書中に開示されるシステム、アッセイ、およびプログラマブルヌクレアーゼに一致し、本明細書中に開示される疾患（例えば、インフルエンザA、インフルエンザB、RSV）のいずれかのコンパニオン診断薬として使用することができ、または、試薬キット、ポイントオブケア診断、もしくは処方箋なしの診断において使用することができる。

試薬
多くの試薬は、本明細書に開示される装置、システム、流体装置、キット、および方法と一致する。これらの試薬は、例えば、試料内の標的核酸（例えば、インフルエンザAまたはインフルエンザB）の検出のための本明細書に開示される流体装置内での使用のために一貫しており、流体装置は、流体システム自体内部での試料調製、試料内の標的核酸の増幅、プログラマブルヌクレアーゼとの混合、およびプログラマブルヌクレアーゼによるディテクター核酸の切断から生じる検出可能な信号の検出のために、複数のポンプ、バルブ、貯蔵器、およびチャンバを含み得る。これらの試薬は、病気などの疾患の検出のための本明細書に記載される試料、流体装置、および支持媒体と適合性である。インフルエンザまたはRSVなどの疾患を検出するための本明細書に記載の試薬は、疾患を示す標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸を含む。ガイド核酸は、ウイルスまたは細菌、または本明細書に記載の疾患の原因となる他の作用因子に由来する核酸の一部を含む一本鎖標的核酸に結合する。ガイド核酸は、細菌または本明細書に記載の疾患の原因となる他の作用因子に由来する核酸の一部を含み、抗生物質治療などの治療への耐性をもたらし得る、一塩基多型（SNP）などの突然変異をさらに含む一本鎖標的核酸に結合することができる。ガイド核酸は、インフルエンザAまたはインフルエンザBなどのインフルエンザウイルス由来の核酸の一部を含む一本鎖標的核酸に結合する。ガイド核酸は、標的核酸に相補的である。多くの場合、ガイド核酸は標的核酸に特異的に結合する。標的核酸は、RNA、DNA、または合成核酸であり得る。

本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、a）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;b）複合体を基材に接触させる工程;c）基材を、切断された基材と差次的に反応する試薬に接触させる工程;およびd）基材の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素-核酸である。場合によって、基質は酵素基質-核酸である。

プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸および標的核酸と複合体化した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼを含むことができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合後に活性化され得、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を切断し、トランス切断活性を有することができる。トランス切断活性は、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる近くの一本鎖核酸の非特異的切断、例えば検出部分を有するディテクター核酸のトランス切断であり得る。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによってディテクター核酸が切断されると、検出部分はディテクター核酸から放出され、信号を生成することができる。信号は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電信号であり得る。多くの場合、信号は、ディテクター核酸切断の前に存在し、ディテクター核酸が切断されると変化する。信号は、ディテクター核酸切断の前には存在せず、ディテクター核酸が切断されると存在する場合もある。検出可能な信号は、検出のために支持媒体上に固定化することができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合によって活性化され得る、トランス切断活性を有するCRISPR-Cas（規則的に間の空いた短いパリンドローム反復のクラスタ-CRISPR関連）核タンパク質複合体であり得る。CRISPR-Cas核タンパク質複合体は、CRISPR酵素とも呼ばれ得るガイド核酸と複合体化したCasタンパク質（Casヌクレアーゼとも呼ばれる）を含むことができる。ガイド核酸は、CRISPR RNA（crRNA）であり得る。ガイド核酸は、crRNAおよびトランス活性化crRNA（tracrRNA）を含む場合がある。

改変された標的核酸を検出するために使用されるCRISPR/Casシステムは、CRISPR RNA（crRNA）、トランス活性化crRNA（tracrRNA）、Casタンパク質、およびディテクター核酸を含み得る。

ガイド核酸は、標的核酸の配列に逆相補的な配列を含み得る。ガイド核酸は、crRNAであり得る。ガイド核酸は、crRNAおよびtracrRNAを含む場合がある。ガイド核酸は、標的核酸に特異的に結合することができる。いくつかの場合では、ガイド核酸は天然に存在せず、配列の別々のセグメントを別途人工的に組み合わせることによって作製される。多くの場合、人工的な組み合わせは、化学合成によって、遺伝子工学技術によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって行われる。標的核酸は、所望の機能を提供するように設計および作製することができる。いくつかの場合では、ガイド核酸のターゲティング領域は、20ヌクレオチド長である。ガイド核酸のターゲティング領域は、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30ヌクレオチド長の長さを有し得る。いくつかの例では、ガイド核酸のターゲティング領域は、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ガイド核酸のターゲティング領域は、正確にまたは約12ヌクレオチド（nt）～約80nt、約12nt～約50nt、約12nt～約45nt、約12nt～約40nt、約12nt～約35nt、約12nt～約30nt、約12nt～約25nt、約12nt～約20nt、約12nt～約19nt、約19nt～約20nt、約19nt～約25nt、約19nt～約30nt、約19nt～約35nt、約19nt～約40nt、約19nt～約45nt、約19nt～約50nt、約19nt～約60nt、約20nt～約25nt、約20nt～約30nt、約20nt～約35nt、約20nt～約40nt、約20nt～約45nt、約20nt～約50nt、または約20nt～約60ntの長さを有する。ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるため、またはハイブリダイズ可能であるため、または特異的に結合するために、その標的核酸のそれに対して100％相補的である必要はないことが理解される。ガイド核酸は、標的核酸中の改変可変領域に逆相補的な核酸残基5～20からの領域に少なくとも1つのウラシルを含む配列を有することができる。ガイド核酸は、いくつかの場合では、標的核酸中の改変可変領域に逆相補的な核酸残基5～9、10～14、または15～20からの領域に少なくとも1つのウラシルを含む配列を有する。ガイド核酸は、標的核酸中のメチル化可変領域に逆相補的な核酸残基5～20からの領域に少なくとも1つのウラシルを含む配列を有することができる。ガイド核酸は、いくつかの場合では、標的核酸中のメチル化可変領域に逆相補的な核酸残基5～9、10～14、または15～20からの領域に少なくとも1つのウラシルを含む配列を有する。

ガイド核酸は、関心対象の感染またはゲノム遺伝子座の株の核酸配列に対してタイリングされたガイド核酸の群から選択することができる。ガイド核酸は、インフルエンザAまたはインフルエンザBの株の核酸配列に対してタイリングされたガイド核酸の群から選択することができる。多くの場合、感染症の株のまたは関心対象のゲノム遺伝子座の核酸に対してタイリングされたガイド核酸を、本明細書に記載の方法で使用するためにプールすることができる。多くの場合、これらのガイド核酸は、単一のアッセイで標的核酸を検出するためにプールされる。単一の標的核酸に対してタイリングされるガイド核酸のプールは、本明細書に記載の方法を使用する標的核酸の検出を増強することができる。単一の標的核酸に対してタイリングされるガイド核酸のプールは、本明細書に記載の方法を使用する単一の反応内で標的核酸を広くカバーすることを保証する。タイリングは、例えば、標的核酸に沿って連続的である。タイリングは、標的核酸に沿って重複することがある。いくつかの例では、タイリングは、標的核酸に沿ったタイリングされたガイド核酸間のギャップを含む。いくつかの例では、ガイド核酸のタイリングは非連続的である。多くの場合、標的核酸を検出するための方法は、標的核酸をガイド核酸のプールおよびプログラマブルヌクレアーゼに接触させる工程であって、ガイド核酸のプールのガイド核酸が、標的核酸の核酸に対応するタイリングされたガイド核酸の群から選択される配列を有する、工程;ならびに、ディテクター核酸の集団の少なくとも一部のディテクター核酸の切断によって生じる信号をアッセイする工程を含む。ガイド核酸のプールは、単一の反応内で標的種の広域スペクトル同定または広域カバーを確保することができる。これは、敗血症など、複数の生物によって引き起こされ得る疾患または適応症において特に有用であり得る。

ガイド核酸および標的核酸セグメントと複合体化した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼを含む試薬が、本明細書に記述される。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸および標的配列と複合体化した場合に活性化することができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸がその標的核酸に結合すると活性化され得、その環境において非特異的に核酸を分解する。プログラマブルヌクレアーゼは、活性化されるとトランス切断活性を有する。プログラマブルヌクレアーゼは、Casタンパク質（交換可能にCasヌクレアーゼとも呼ばれる）であり得る。crRNAおよびCasタンパク質は、CRISPR酵素を形成することができる。

「同一性パーセント」および「同一性％」は、2つの配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）がアラインメントの同じ位置に同じ残基を有する程度を指すことができる。例えば、「アミノ酸配列は、SEQ ID NO:YとX％同一性である」は、SEQ ID NO:Yに対するアミノ酸配列の同一性％を指すことができ、アミノ酸配列中の残基のX％がSEQ ID NO:Yに開示されている配列の残基と同一であると詳述される。一般に、コンピュータプログラムをそのような計算に使用することができる。配列の対を比較およびアラインメントする例示的なプログラムには、ALIGN（Myers and Miller、Comput Appl Biosci. 1988 Mar;4（1）:11-7）、FASTA（Pearson and Lipman、Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 Apr;85（8）:2444-8;Pearson,Methods Enzymol. 1990;183:63-98）、およびギャップBLAST（Altschul et al.,Nucleic Acids Res 1997 Sep 1;25（17）:3389-40）、BLASTP、BLASTNまたはGCG（Devereux et al.、Nucleic Acids Res. 1984 Jan 11;12（1 Pt 1）:387-95）が含まれる。

いくつかのプログラマブルヌクレアーゼは、本開示の方法および装置と一致する。例えば、CRISPR/Cas酵素は、本明細書中に開示される方法およびシステムにおいて使用されるプログラマブルヌクレアーゼである。CRISPR/Cas酵素は、CRISPR/Cas酵素の公知のクラスおよびタイプのいずれかを含み得る。本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼには、クラス1 CRISPR/Cas酵素、例えばI型、IV型またはIII型CRISPR/Cas酵素が含まれる。本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼには、クラス2 CRISPR/Cas酵素、例えばII型、V型およびVI型CRISPR/Cas酵素も含まれる。本明細書中に開示されるいくつかの装置（例えば、空気圧バルブ装置またはスライドバルブ装置またはラテラルフローアッセイなどのマイクロ流体装置）およびその使用方法に含まれる好ましいプログラマブルヌクレアーゼには、V型またはVI型のCRISPR/Cas酵素が含まれる。

いくつかの態様では、V型CRISPR/Cas酵素は、プログラマブルCas12ヌクレアーゼである。V型CRISPR/Cas酵素（例えば、Cas12またはCas14）は、HNHドメインを欠く。本開示のCas12ヌクレアーゼは、単一の触媒作用的RuvCドメインを介して核酸を切断する。RuvCドメインは、ヌクレアーゼ内、またはタンパク質の「NUC」ローブ内に存在し、Cas12ヌクレアーゼは、認識または「REC」ローブをさらに含む。RECローブおよびNUCローブは、架橋ヘリックスによって接続され、Cas12タンパク質は、PAM相互作用（PI）ドメインおよびウエッジ（WED）ドメインと呼ばれるPAM認識のための2つのドメインをさらに含む。（Murugan et al.,Mol Cell. 2017 Oct 5;68（1）:15-25）プログラマブルCas12ヌクレアーゼは、Cas12a（Cpf1とも呼ばれる）タンパク質、Cas12bタンパク質、Cas12cタンパク質、Cas12dタンパク質、またはCas12eタンパク質であり得る。いくつかの場合では、適切なCas12タンパク質は、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

（表１）Cas12タンパク質配列

あるいは、V型CRISPR/Cas酵素は、プログラマブルCas14ヌクレアーゼである。本開示のCas14タンパク質は、Cas14タンパク質の一次アミノ酸配列に関して連続していないが、タンパク質が生成されて折り畳まれるとRuvCドメインを形成する3つの部分RuvCドメイン（RuvC-I、RuvC-IIおよびRuvC-III、本明細書ではサブドメインとも呼ばれる）を含む。天然のCas14タンパク質は、標的核酸中の特定の配列での切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。プログラマブルCas14ヌクレアーゼは、Cas14aタンパク質、Cas14bタンパク質、Cas14cタンパク質、Cas14dタンパク質、Cas14eタンパク質、Cas14fタンパク質、Cas14gタンパク質、Cas14hタンパク質、またはCas14uタンパク質であり得る。いくつかの場合では、適切なCas14タンパク質は、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

（表２）Cas14タンパク質配列

いくつかの態様では、V型CRISPR/Cas酵素は、CasФヌクレアーゼである。CasФポリペプチドは、標的核酸中の特定の配列での切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。本開示のプログラマブルCasФヌクレアーゼは、pre-crRNAプロセシングおよび核酸のニッキングまたは切断を触媒することができる単一の活性部位をRuvCドメインに有し得る。この密な触媒部位は、プログラマブルCasФヌクレアーゼをゲノム工学、およびゲノム操作のための新たな機能性にとって特に有利なものにすることができる。

表3は、本開示の組成物および方法において使用することができる、例示的なCasФポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。

（表３）Casφアミノ酸配列

いくつかの態様では、本開示のプログラマブルCasФヌクレアーゼのいずれか（例えば、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つ、またはそれらの断片もしくは変異体）は、核局在化シグナル（NLS）を含み得る。いくつかの場合では、前記NLSは、KRPAATKKAGQAKKKKEFの配列（SEQ ID NO:322）を有し得る。

CasФポリペプチドまたはその変異体は、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％、または100％の配列同一性を含むことができる。

いくつかの態様では、VI型CRISPR/Cas酵素は、プログラマブルCas13ヌクレアーゼである。Cas13タンパク質の一般的な構造は、N末端ドメイン、および2つのヘリカルドメインによって分離された2つのHEPN（高等真核生物および原核生物のヌクレオチド結合）ドメインを含む（Liu et al.,Cell 2017 Jan 12;168（l-2）:121-134. el2）。HEPNドメインはそれぞれ、aR-X₄-Hモチーフを含む。Cas13タンパク質全体で共有される特徴としては、ガイド核酸のcrRNAが標的核酸に結合すると、タンパク質が立体構造変化を受けてHEPNドメインを一緒にし、触媒的に活性なRNaseを形成することが挙げられる。（Tambe et al.,Cell Rep. 2018 Jul 24;24（4）:1025-1036）。したがって、2つの活性化可能なHEPNドメインは、本開示のプログラマブルCas13ヌクレアーゼの特徴である。しかしながら、本開示と一致するプログラマブルCas13ヌクレアーゼには、Cas13タンパク質の切断効率を高めるHEPNドメイン中の突然変異、またはHEPNドメインを触媒的に不活性化する突然変異を含むCas13ヌクレアーゼも含まれる。本開示と一致するプログラマブルCas13ヌクレアーゼはまた、触媒作用を有するCas13ヌクレアーゼである。

プログラマブルCas13ヌクレアーゼは、Cas13aタンパク質（「c2c2」とも呼ばれる）、Cas13bタンパク質、Cas13cタンパク質、Cas13dタンパク質、またはCas13eタンパク質であり得る。実施例C2c2タンパク質は、SEQ ID NO:130-SEQ ID NO:137として示されている。いくつかの場合では、対象C2c2タンパク質は、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:137のいずれか1つに示されるアミノ酸配列との80％以上（例えば、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上、99.5％以上、または100％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なC2c2ポリペプチドは、SEQ ID NO:130に示されるListeria seeligeri C2c2アミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なC2c2ポリペプチドは、SEQ ID NO:131に示されるレプトトリキア・ブッカリス（Leptotrichia buccalis）C2c2アミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なC2c2ポリペプチドは、SEQ ID NO:133に示されるロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）C2c2アミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なC2c2ポリペプチドは、SEQ ID NO:134に示されるカルノバクテリウム・ガリナルム（Carnobacterium gallinarum）C2c2アミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なC2c2ポリペプチドは、SEQ ID NO:135に示されるハービニクス・ヘミセルロシリティカ（Herbinix hemicellulosilytica）C2c2アミノ酸配列との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または100％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、C2c2タンパク質は、SEQ ID NO:131に示されるレプトトリキア・ブッカリス（Lbu）C2c2アミノ酸配列との80％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、C2c2タンパク質は、レプトトリキア・ブッカリス（Lbu）C2c2タンパク質（例えば、SEQ ID NO:131を参照）である。いくつかの場合では、C2c2タンパク質は、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:131およびSEQ ID NO:133～SEQ ID NO:137のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、本開示の方法で使用されるC2c2タンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ（Leptotrichia shahii（Lsh））C2c2タンパク質ではない。いくつかの場合では、本開示の方法で使用されるC2c2タンパク質は、SEQ ID NO:132に示されるLsh C2c2ポリペプチドとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または100％のアミノ酸配列同一性を有するC2c2ポリペプチドではない。他のCas13タンパク質配列は、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:147に示される。

（表４）Cas13タンパク質配列

プログラマブルヌクレアーゼは、Cas13であり得る。Cas13は、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13dまたはCas13eであり得る場合もある。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Mad7またはMad2であり得る。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Cas12であり得る。Cas12は、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、またはCas12eであり得る場合もある。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Csm1、Cas9、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、またはCasZであり得る。Csm1は、smCms1、miCms1、obCms1、またはsuCms1と呼ばれることもある。Cas13aは、C2c2と呼ばれることもある。CasZは、Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、またはCas14hと呼ばれることもある。プログラマブルヌクレアーゼは、V型CRISPR-Cas系であり得る。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、VI型CRISPR-Cas系であり得る。プログラマブルヌクレアーゼは、III型CRISPR-Cas系であり得る場合がある。いくつかの場合、プログラマブルヌクレアーゼは、レプトトリキア・シャーイイ（Lsh）、リステリア・シーリジェリー（Listeria seeligeri）（Lse）、レプトトリキア・ブッカリス（Lbu）、レプトトリキア・ウェイディイ（Leptotrichia wadeu）（Lwa）、ロドバクター・カプスラタス（Rca）、ハービニクス・ヘミセルロシリティカ（Hhe）、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Paludibacter propionicigenes）（Ppr）、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）細菌（Lba）、［ユウバクテリウム］・レクターレ（［Eubacterium］rectale）（Ere）、リステリア・ニュヨークネンシス（Listeria newyorkensis）（Lny）、クロストリジウム・アミノフィラム（Clostridium aminophilum）（Cam）、プレボテーラ属種（Prevotella sp.）（Psm）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Capnocytophaga canimorsus）（Cca、ラクノスピラ細菌（Lba））、バージイエラ・ズーヘルカム（Bergeyella zoohelcum）（Bzo）、プレボテーラ・インターメディア（Prevotella intermedia）（Pin）、プレボテーラ・ブッカエ（Prevotella buccae）（Pbu）、アリスティペス属種（Alistipes sp.）（Asp）、リエメレラ・アナティペステイファー（Riemerella anatipestifer）（Ran）、プレボテーラ・オーランティアカ（Prevotella aurantiaca）（Pau）、プレボテーラ・サッカロリティカ（Prevotella saccharolytica）（Psa）、プレボテーラ・インターメディア（Prevotella intermedia）（Pin2）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Capnocytophaga canimorsus）（Cca）、ポルフィロモナス・グラエ（Porphyromonas gulae）（Pgu）、プレボテーラ属種（Psp）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）（Pig）、プレボテーラ・インターメディア（Prevotella intermedia）（Pin3）、エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus）（Ei）、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）（Ls）、またはサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Tt）のうちの少なくとも1つに由来し得る。Cas13は、LbuCas13a、LwaCas13a、LbaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、EreCas13a、CamCas13a、またはLshCas13aのうちの少なくとも1つである場合がある。CRISPR酵素のトランス切断活性は、crRNAが標的核酸と複合体化されると活性化され得る。CRISPR酵素のトランス切断活性は、tracrRNAおよびcrRNAを含むガイド核酸が標的核酸と複合体化されると活性化され得る。標的核酸は、RNAまたはDNAであり得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼは、RNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼである。いくつかの態様では、本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼは、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼである。いくつかの態様では、プログラマブルヌクレアーゼは、標的RNAによって活性化されてRNAレポーターのトランス切断を開始することができ、標的DNAによって活性化されてVI型CRISPR/Cas酵素（例えば、Cas13）などのRNAレポーターのトランス切断を開始することができる。例えば、本開示のCas13aは、標的RNAによって活性化されてRNAレポーターの切断のためのCas13aのトランス切断活性を開始することができ、DNAによって活性化されて、RNAレポーターのトランス切断のためのCas13aのトランス切断活性を開始することができる。RNAレポーターは、RNAベースのレポーター分子であり得る。いくつかの態様では、Cas13aはssDNAを認識かつ検出して、RNAレポーターのトランス切断を開始する。複数のCas13a分離株は、ガイド核酸が標的DNAとハイブリタイズする際に、ssDNAを含む標的DNAを認識し、それによって活性化され、それを検出することができる。例えば、LbuCas13aおよびLwaCas13aの両方を活性化して、RNAレポーターを標的DNAによってトランス付帯的に切断することができる。したがって、VI型CRISPR/Cas酵素（例えば、Cas13、例えばCas13a）は、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼであり得、したがって、本明細書に記載される方法を使用して標的DNAを検出するために使用され得る。ssDNAのDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼ検出は、複数のpH値で強固であり得る。例えば、Cas13による標的ssDNA検出は、pH 6.8～pH 8.2など、広範囲のpH条件にわたって一貫した切断を示すことができる。対照的に、Cas13による標的RNA検出は、7.9～8.2のpH値の高い切断活性を示し得る。いくつかの態様では、RNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼでもあり得るDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼは、そのRNA標的選択とは異なるDNA標的選択を有することができる。例えば、Cas13aの最適なssDNA標的は、Cas13aの最適なRNA標的とは異なる特性を有する。一例として、ssDNAに対するgRNAの機能は、RNAに対する同じgRNAの機能と必ずしも相関しない場合がある。別の例として、gRNAは、標的RNA配列上の3’位置での標的ヌクレオチド同一性にかかわらず高レベルで機能することができる。いくつかの態様では、gRNAは、標的ssDNA配列の3’位置におけるGの非存在下で、高レベルで機能することができる。さらに、本明細書に開示されるCas13によって検出される標的DNAは、直接生物由来であり得るか、または核酸増幅方法、例えばPCRおよびLAMPもしくは本明細書に記載されるいずれかの増幅方法によって間接的に生成され得る。Cas13aなどのDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼによる、標的ssDNAなどの標的DNAの高感度検出のための重要な工程は、（1）インビトロ診断のための反応あたり約0.1nMを超える濃度までのDNAの生成または単離、（2）DNA検出を可能にする適切な配列特徴を有する標的配列の選択（これらの特徴がRNA検出に必要な特徴とは異なるため）、および（3）DNA検出を強化する緩衝組成物を含むことができる。DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼによる標的DNAの検出は、蛍光、ラテラルフロー、電気化学、または本明細書に記載の任意の他の読み出しを含む様々な読み出しにつながり得る。V型CRISPR-Casタンパク質などのプログラマブルDNAヌクレアーゼと、VI型タンパク質などのDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼと、DNAレポーターおよびRNAレポーターとの多重化は、標的ssDNA、または標的dsDNAと標的ssDNAとの組み合わせの多重化検出をそれぞれ可能にすることができる。異なるRNAレポーター切断選択を有する異なるRNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼの多重化は、さらなる多重化を可能にし得る。DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼベース診断のためのssDNAの生成方法は、（1）非対称PCR、（2）RPA、LAMP、SDAなどの非対称等温増幅、（3）短いssDNA分子の生成のためのNEAR、および（4）逆転写酵素によるRNA標的のssDNAへの変換、その後のRNase H消化、を含むことができる。したがって、標的DNAのDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼ検出は、本明細書に開示される様々なシステム、キット、組成物、試薬および方法に適合する。例えば、Cas13aによる標的ssDNA検出は、本明細書に開示されるDETECTRアッセイで用いることができる。

検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸を含む試薬が本明細書に記載され、ディテクター核酸は活性化ヌクレアーゼによって切断され、それによって第1の検出可能な信号を生成することができる。本明細書で使用される場合、ディテクター核酸は、レポーターまたはレポーター分子と交換可能に使用される。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、デオキシリボヌクレオチドを含む一本鎖核酸である。他の場合では、ディテクター核酸は、リボヌクレオチドを含む一本鎖核酸である。ディテクター核酸は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドおよび少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む一本鎖核酸であり得る。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、切断部位として機能する内部位置に少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含む一本鎖核酸である。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、内部位置に少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個のリボヌクレオチド残基を含む。リボヌクレオチド残基は、連続している場合がある。あるいは、リボヌクレオチド残基は、非リボヌクレオチド残基の間に散在している。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、リボヌクレオチド残基のみを有する。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、デオキシリボヌクレオチド残基のみを有する。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、本明細書に記載のプログラマブルヌクレアーゼによる切断に耐性のヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、合成ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基および少なくとも1つの非リボヌクレオチド残基を含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、5～20、5～15、5～10、7～20、7～15または7～10ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも1つのウラシルリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも2つのウラシルリボヌクレオチドを含む。ディテクター核酸は、ウラシルリボヌクレオチドのみを有する場合がある。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも1つのアデニンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも2つのアデニンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、アデニンリボヌクレオチドのみを有する。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも1つのシトシンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも2つのシトシンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも1つのグアニンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも2つのグアニンリボヌクレオチドを含む。ディテクター核酸は、改変リボヌクレオチドのみ、非改変デオキシリボヌクレオチドのみ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、5～12ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ディテクター核酸は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である。Cas13を含むプログラマブルヌクレアーゼによる切断の場合、ディテクター核酸は5、8または10ヌクレオチド長であり得る。Cas12を含むプログラマブルヌクレアーゼによる切断の場合、ディテクター核酸は10ヌクレオチド長であり得る。

一本鎖ディテクター核酸は、第1の検出可能な信号を生成することができる検出部分を含む。場合により、ディテクター核酸は、信号を生成することができるタンパク質を含む。信号は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電信号であり得る。いくつかの場合では、検出部分は切断部位の片側に存在する。任意で、クエンチング部分は、切断部位の別の側に存在する。クエンチング部分は、蛍光クエンチング部分である場合がある。いくつかの場合では、クエンチング部分は切断部位に対して5’であり、検出部分は切断部位に対して3’である。いくつかの場合では、検出部分は切断部位に対して5’であり、クエンチング部分は切断部位に対して3’である。クエンチング部分は、ディテクター核酸の5’末端に存在する場合がある。検出部分は、ディテクター核酸の3’末端に存在する場合がある。いくつかの場合では、検出部分は、ディテクター核酸の5’末端に存在する。いくつかの場合では、クエンチング部分は、ディテクター核酸の3’末端に存在する。いくつかの場合では、一本鎖ディテクター核酸は、第1の検出可能な信号を生成することができる一本鎖核酸の少なくとも1つの集団である。いくつかの場合では、一本鎖ディテクター核酸は、第1の検出可能な信号を生成することができる一本鎖核酸の集団である。任意で、一本鎖ディテクター核酸の集団が2つ以上存在する。いくつかの場合では、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、または50超、またはこのリストの範囲にかかる任意の数の、検出可能な信号を生成することができる一本鎖ディテクター核酸の異なる集団が存在する。

（表５）例示的な一本鎖ディテクター核酸

/56-FAM/:5’6-フルオレセイン（Integrated DNA Technologies）
/3IABkFQ/:3’Iowa Black FQ（Integrated DNA Technologies）
/5IRD700/:5’IRDye 700（Integrated DNA Technologies）
/5TYE665/:5’TYE 665（Integrated DNA Technologies）
/5Alex594N/:5’Alexa Fluor 594（NHSエステル）（Integrated DNA Technologies）
/5ATTO633N/:5’ATTO（商標）633（NHSエステル）（Integrated DNA Technologies）
/3IRQC1N/:3’IRDye QC-1クエンチャー（Li-Cor）
/3IAbRQSp/:3’Iowa Black RQ（Integrated DNA Technologies）
rU:ウラシルリボヌクレオチド
rG:グアニンリボヌクレオチド
＊この表は、検出部分およびクエンチャー部分に、それらの商品名およびそれらの供給源が特定されていれば言及する。しかしながら、他の供給源からの類似の機能を有する代替物、ジェネリック、または商品名のない部分も使用することができる。

検出部分は、赤外線フルオロフォアであり得る。検出部分は、500nm～720nmの範囲の蛍光を発するフルオロフォアであり得る。検出部分は、500nm～720nmの範囲の蛍光を発するフルオロフォアであり得る。いくつかの場合では、検出部分は、700nm以上の波長で蛍光を発する。他の場合では、検出部分は、約660nmまたは約670nmで蛍光を発する。いくつかの場合では、検出部分は、500～520、500～540、500～590、590～600、600～610、610～620、620～630、630～640、640～650、650～660、660～670、670～680、6890～690、690～700、700～710、710～720、または720～730nmの範囲で蛍光を発する。検出部分は、6-フルオレセイン、IRDye 700、TYE 665、Alex Fluor、またはATTO（商標）633（NHSエステル）と同じ範囲の蛍光を発するフルオロフォアであり得る。検出部分は、フルオレセインアミダイト、6-フルオレセイン、IRDye 700、TYE 665、Alex Fluor 594、またはATTO（商標）633（NHSエステル）であり得る。検出部分は、6-フルオレセイン（Integrated DNA Technologies）、IRDye 700（Integrated DNA Technologies）、TYE 665（Integrated DNA Technologies）、Alex Fluor 594（Integrated DNA Technologies）、またはATTO（商標）633（NHSエステル）（Integrated DNA Technologies）と同じ範囲の蛍光を発するフルオロフォアであり得る。検出部分は、フルオレセインアミダイト、6-フルオレセイン（Integrated DNA Technologies）、IRDye 700（Integrated DNA Technologies）、TYE 665（Integrated DNA Technologies）、Alex Fluor 594（Integrated DNA Technologies）、またはATTO（商標）633（NHSエステル）（Integrated DNA Technologies）であり得る。本明細書に記載の検出部分のいずれも、任意の市販の供給源からのものであり得、同様の機能を有する代替物、ジェネリック、または列挙した商品名でない検出部分であってもよい。

検出部分は、試験される試料の種類に基づいて使用するために選択することができる。例えば、赤外線フルオロフォアである検出部分は、尿試料と共に使用される。別の例として、約520nmを放出するフルオロフォアを有するSEQ ID NO:1は、非尿試料での試験に使用され、約700nmを放出するフルオロフォアを有するSEQ ID NO:8は、尿試料での試験に使用される。

クエンチング部分は、検出部分をクエンチングする能力に基づいて選択することができる。クエンチング部分は、非蛍光の蛍光クエンチャーであり得る。クエンチング部分は、500nm～720nmの範囲の蛍光を発する検出部分をクエンチングすることができる。クエンチング部分は、500nm～720nmの範囲の蛍光を発する検出部分をクエンチングすることができる。いくつかの場合では、クエンチング部分は、700nm以上の波長で蛍光を発する検出部分をクエンチングする。いくつかの場合では、クエンチング部分は、約660nmまたは約670nmで蛍光を発する検出部分をクエンチングする。いくつかの場合では、クエンチング部分は、500～520、500～540、500～590、590～600、600～610、610～620、620～630、630～640、640～650、650～660、660～670、670～680、6890～690、690～700、700～710、710～720、または720～730nmの範囲で蛍光を発する検出部分をクエンチングする。クエンチング部分は、フルオレセインアミダイト、6-フルオレセイン、IRDye 700、TYE 665、Alex Fluor 594、またはATTO（商標）633（NHSエステル）をクエンチングすることができる。クエンチング部分は、Iowa Black RQ、Iowa Black FQまたはIRDye QC-1クエンチャーであり得る。クエンチング部分は、フルオレセインアミダイト、6-フルオレセイン（Integrated DNA Technologies）、IRDye 700（Integrated DNA Technologies）、TYE 665（Integrated DNA Technologies）、Alex Fluor 594（Integrated DNA Technologies）、またはATTO（商標）633（NHSエステル）（Integrated DNA Technologies）をクエンチングすることができる。クエンチング部分は、Iowa Black RQ（Integrated DNA Technologies）、Iowa Black FQ（Integrated DNA Technologies）またはIRDye QC-1クエンチャー（LiCor）であり得る。本明細書に記載のクエンチング部分のいずれも、任意の市販の供給源からのものであり得、同様の機能を有する代替物、ジェネリック、または列挙した商品名でないクエンチング部分であってもよい。

検出部分の放出からの検出可能な信号の発生は、プログラマブルヌクレアーゼによる切断が起こったこと、および試料が標的核酸を含むことを示す。いくつかの場合では、検出部分は蛍光色素を含む。検出部分は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）対を含む場合がある。いくつかの場合では、検出部分は赤外線（IR）色素を含む。いくつかの場合では、検出部分は紫外線（UV）色素を含む。代替的にまたは組み合わせて、検出部分はポリペプチドを含む。場合により、検出部分はビオチンを含む。場合により、検出部分は、アビジンまたはストレプトアビジンの少なくとも1つを含む。いくつかの例では、検出部分は、多糖、ポリマー、またはナノ粒子を含む。いくつかの例では、検出部分は、金ナノ粒子またはラテックスナノ粒子を含む。

検出部分は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電信号を生成することができる任意の部分であり得る。ディテクター核酸は、場合により、核酸の切断により熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電信号を生成することができるタンパク質-核酸である。タンパク質-核酸は、核酸成分およびタンパク質またはペプチド成分を含み得る。いくつかの態様では、タンパク質-核酸は、タンパク質またはペプチドに融合した核酸を含み得る。多くの場合、熱量測定信号は、ディテクター核酸の切断後に生成される熱である。場合により、熱量測定信号は、ディテクター核酸の切断後に吸収される熱である。電位差測定信号は、例えば、ディテクター核酸の切断後に生成される電位である。電流測定信号は、ディテクター核酸の切断後に生成される電子の動きであり得る。多くの場合、信号は、比色信号または蛍光信号などの光学信号ある。光学信号は、例えば、ディテクター核酸の切断後に生成される光出力である。場合により、光学信号は、ディテクター核酸の切断の前と後での吸光度の変化である。多くの場合、圧電信号は、ディテクター核酸の切断の前と後での質量の変化である。

多くの場合、タンパク質-核酸は酵素-核酸である。酵素は、酵素-核酸のように存在する場合、立体的に妨げられ得るが、核酸からの切断により機能的となり得る。多くの場合、酵素は、基質との反応を起こす酵素である。酵素は、インベルターゼであり得る。多くの場合、インベルターゼの基質はスクロースおよびDNS試薬である。

場合により、タンパク質-核酸は基質-核酸である。多くの場合、基質は、酵素との反応を起こす基質である。

タンパク質-核酸は、固体支持体に結合され得る。固体支持体は、例えば、表面である。表面は電極であり得る。固体支持体は、ビーズである場合ある。多くの場合、ビーズは磁気ビーズである。切断により、タンパク質は固体から遊離し、他の混合物と相互作用する。例えば、タンパク質は酵素であり、酵素-核酸の核酸の切断により、酵素はチャンバを通って基質を含む混合物に流入する。酵素が酵素基質と出会うと、比色反応などの反応が起こり、次いでそれは検出される。別の例として、タンパク質は酵素基質であり、酵素基質-核酸の核酸の切断により、酵素はチャンバを通って酵素を含む混合物に流入する。酵素基質が酵素と出会うと、熱量測定反応などの反応が起こり、次いでそれは検出される。

いくつかの態様では、レポーターは、親和性分子にコンジュゲートされた核酸およびフルオロフォアにコンジュゲートされた親和性分子（例えば、核酸-親和性分子-フルオロフォア）、またはフルオロフォアにコンジュゲートされた核酸および親和性分子にコンジュゲートされたフルオロフォア（例えば、核酸-フルオロフォア-親和性分子）を含む。いくつかの態様では、リンカーは、核酸を親和性分子にコンジュゲートさせる。いくつかの態様では、リンカーは、親和性分子をフルオロフォアにコンジュゲートさせる。いくつかの態様では、リンカーは、核酸をフルオロフォアにコンジュゲートさせる。リンカーは、当技術分野で公知の任意の適切なリンカーであり得る。いくつかの態様では、レポーターの核酸を親和性分子に直接コンジュゲートさせることができ、親和性分子をフルオロフォアに直接コンジュゲートさせることができ、または核酸をフルオロフォアに直接コンジュゲートさせることができ、フルオロフォアを親和性分子に直接コンジュゲートさせることができる。これに関連して、「直接コンジュゲート」は、互いに直接コンジュゲートした2つの部分の間に、介在する分子、ポリペプチド、タンパク質、または他の部分が存在しないことを示した。例えば、レポーターが親和性分子に直接コンジュゲートされた核酸、およびフルオロフォアに直接コンジュゲートされた親和性分子を含む場合、核酸と親和性分子との間に介在部分は存在せず、親和性分子とフルオロフォアとの間に介在部分は存在しない。親和性分子は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または任意の類似の分子であり得る。

いくつかの場合では、レポーターは、基質-核酸を含む。基質は、基質-核酸のように存在する場合、その同族酵素から隔離され得るが、切断されると核酸から放出され、放出された基質は同族酵素と接触して検出可能な信号を生成し得る。多くの場合、基質はスクロースであり、同族酵素はインベルターゼであり、DNS試薬を使用してインベルターゼ活性を監視することができる。

本明細書に開示される装置および方法の主な利点は、レポーターの核酸を含まない未増幅または増幅試料中の全核酸に対する過剰なレポーターの設計である。全核酸は、レポーターの核酸を含まずに、標的核酸および非標的核酸を含み得る。非標的核酸は、溶解されたまたはされていない、いずれかの元の試料からのものであり得る。非標的核酸はまた、増幅の副産物であり得る。したがって、非標的核酸は、溶解または非溶解の元の試料からの非標的核酸、および増幅された試料からの非標的核酸の両方を含み得る。大量の非標的核酸が存在すると、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、結合してレポーター配列を切断するその能力において阻害され得る。これは、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼが任意の核酸を付随的に切断するためである。全核酸が大量に存在する場合、それらはプログラマブルヌクレアーゼについてレポーターを打ち負かす可能性がある。本明細書中に開示される装置および方法は、切断反応（例えば、DETECTR反応）からの検出可能な信号が特に優れるように、全核酸に対して過剰のレポーターを有するように設計される。いくつかの態様では、レポーターは、全核酸の少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、少なくとも12倍、少なくとも13倍、少なくとも14倍、少なくとも15倍、少なくとも16倍、少なくとも17倍、少なくとも18倍、少なくとも19倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍、1.5倍～100倍、2倍～10倍、10倍～20倍、20倍～30倍、30倍～40倍、40倍～50倍、50倍～60倍、60倍～70倍、70倍～80倍、80倍～90倍、90倍～100倍、1.5倍～10倍、1.5倍～20倍、10倍～40倍、20倍～60倍、または10倍～80倍過剰に存在する。

本明細書に開示される装置および方法の第2の重要な利点は、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、およびレポーターを含む過剰な体積の設計であり、これは関心対象の標的核酸を有する試料を含む、より小さな体積と接触する。試料を含むより小さな体積は、非溶解試料、溶解試料、または逆転写、増幅、およびインビトロ転写の任意の組み合わせを被った溶解試料であり得る。緩衝液、硫酸マグネシウム、塩、pH、還元剤、プライマー、dNTP、NTP、細胞溶解物、非標的核酸、プライマー、または他の成分など、粗非溶解試料、溶解試料、溶解試料、または溶解増幅試料中の様々な試薬の存在は、レポーターの核酸を見つけて切断するプログラマブルヌクレアーゼの能力を阻害し得る。これは、プログラマブルヌクレアーゼについてレポーターの核酸を打ち負かす、レポーターではない核酸に起因し得る。あるいは、試料中の様々な試薬は、単にプログラマブルヌクレアーゼの活性を阻害し得る。したがって、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、およびレポーターを含む過剰な体積を、関心対象の標的核酸を有する試料を含むより小さな体積に接触させるための本明細書で提供される装置および方法は、プログラマブルヌクレアーゼがレポーターの核酸を見つけて切断できることを保証することによって、標的核酸の優れた検出を提供する。いくつかの態様では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼおよびレポーターを含む体積（「第2の体積」と称され得る）は、試料を含む体積（「第1の体積」と称され得る）よりも4倍大きい。いくつかの態様では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼおよびレポーターを含む体積（「第2の体積」と称され得る）は、試料を含む体積（「第1の体積」と称され得る）よりも少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも11倍、少なくとも12倍、少なくとも13倍、少なくとも14倍、少なくとも15倍、少なくとも16倍、少なくとも17倍、少なくとも18倍、少なくとも19倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも60倍、少なくとも70倍、少なくとも80倍、少なくとも90倍、少なくとも100倍、1.5倍～100倍、2倍～10倍、10倍～20倍、20倍～30倍、30倍～40倍、40倍～50倍、50倍～60倍、60倍～70倍、70倍～80倍、80倍～90倍、90倍～100倍、1.5倍～10倍、1.5倍～20倍、10倍～40倍、20倍～60倍、または10倍～80倍大きい。いくつかの態様では、試料を含む体積は、少なくとも0.5μL、少なくとも1μL、少なくとも少なくとも1μL、少なくとも2μL、少なくとも3μL、少なくとも4μL、少なくとも5μL、少なくとも6μL、少なくとも7μL、少なくとも8μL、少なくとも9μL、少なくとも10μL、少なくとも11μL、少なくとも12μL、少なくとも13μL、少なくとも14μL、少なくとも15μL、少なくとも16μL、少なくとも17μL、少なくとも18μL、少なくとも19μL、少なくとも20μL、少なくとも25μL、少なくとも30μL、少なくとも35μL、少なくとも40μL、少なくとも45μL、少なくとも50μL、少なくとも55μL、少なくとも60μL、少なくとも65μL、少なくとも70μL、少なくとも75μL、少なくとも80μL、少なくとも85μL、少なくとも90μL、少なくとも95μL、少なくとも100μL、0.5μL～5μL、5μL～10μL、10μL～15μL、15μL～20μL、20μL～25μL、25μL～30μL、30μL～35μL、35μL～40μL、40μL～45μL、45μL～50μL、10μL～20μL、5μL～20μL、1μL～40μL、2μL～10μL、または1μL～10μLである。いくつかの態様では、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸およびレポーターを含む体積は、少なくとも10μL、少なくとも11μL、少なくとも12μL、少なくとも13μL、少なくとも14μL、少なくとも15μL、少なくとも16μL、少なくとも17μL、少なくとも18μL、少なくとも19μL、少なくとも20μL、少なくとも21μL、少なくとも22μL、少なくとも23μL、少なくとも24μL、少なくとも25μL、少なくとも26μL、少なくとも27μL、少なくとも28μL、少なくとも29μL、少なくとも30μL、少なくとも40μL、少なくとも50μL、少なくとも60μL、少なくとも70μL、少なくとも80μL、少なくとも90μL、少なくとも100μL、少なくとも150μL、少なくとも200μL、少なくとも250μL、少なくとも300μL、少なくとも350μL、少なくとも400μL、少なくとも450μL、少なくとも500μL、10μL～15μLμL、15μL～20μL、20μL～25μL、25μL～30μL、30μL～35μL、35μL～40μL、40μL～45μL、45μL～50μL、50μL～55μL、55μL～60μL、60μL～65μL、65μL～70μL、70μL～75μL、75μL～80μL、80μL～85μL、85μL～90μL、90μL～95μL、95μL～100μL、100μL～150μL、150μL～200μL、200μL～250μL、250μL～300μL、300μL～350μL、350μL～400μL、400μL～450μL、450μL～500μL、10μL～20μL、10μL～30μL、25μL～35μL、10μL～40μL、20μL～50μL、18μL～28μL、または17μL～22μLである。

レポーターは、ハイブリッド核酸レポーターであり得る。ハイブリッド核酸は、少なくとも1つのデオキシリボヌクレオチドおよび少なくとも1つのリボヌクレオチドを有する核酸を含む。いくつかの態様では、ハイブリッド核酸レポーターの核酸は、任意の長さであり得、DNAおよびRNAの任意の混合物を有し得る。例えば、いくつかの場合では、より長いDNA伸長は、数個のリボヌクレオチドによって中断され得る。あるいは、より長いRNA伸長は、数個のデオキシリボヌクレオチドによって中断され得る。あるいは、核酸中の1つおきの塩基が、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間で交互に並んでもよい。ハイブリッド核酸レポーターの主な利点は、純粋なRNA核酸レポーターと比較して安定性が高いことである。例えば、ハイブリッド核酸レポーターは、純粋なDNAレポーターまたは純粋なRNAレポーターと比較して、溶液中、凍結乾燥、またはガラス化においてより安定であり得る。

レポーターは凍結乾燥またはガラス化することができる。レポーターは、溶液に懸濁され得るか、または表面に固定化され得る。例えば、レポーターは、本明細書中に開示されるような装置のチャンバの表面に固定化され得る。いくつかの場合では、レポーターは、本明細書中に開示されるような装置のチャンバ中で、磁気ビーズなどのビーズに固定化され、それらは、チャンバの下に置かれる磁石によって定位置に保持される。

さらに、CRISPR酵素のcrRNAに結合する前に、標的核酸を増幅することができる。この増幅は、PCR増幅または等温増幅であり得る。試料のこの核酸増幅は、標的RNAの感受性、特異性、または精度の少なくとも1つを改善することができる。核酸増幅のための試薬は、リコンビナーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、一本鎖DNA結合（SSB）タンパク質、およびポリメラーゼを含み得る。核酸増幅は、転写増幅（TMA）であり得る。核酸増幅は、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）または環状ヘリカーゼ依存性増幅（cHDA）であり得る。さらなる場合では、核酸増幅は鎖置換増幅（SDA）である。核酸増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）であり得る。核酸増幅は、ループ介在増幅（LAMP）または指数関数的増幅反応（EXPAR）の少なくとも1つであり得る。核酸増幅は、いくつかの場合では、ローリングサークル増幅（RCA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、多置換増幅（MDA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（HIP）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、または改良多置換増幅（IMDA）である。核酸増幅は、1分以下、2分以下、3分以下、4分以下、5分以下、6分以下、7分以下、8分以下、9分以下、10分以下、11分以下、12分以下、13分以下、14分以下、15分以下、16分以下、17分以下、18分以下、19分以下、20分以下、25分以下、30分以下、40分以下、50分以下、または60分以下にわたって行うことができる。核酸増幅反応は、約20～45°Cの温度で行われる場合がある。核酸増幅反応は、20°C以下、25°C以下、30°C以下、35°C以下、37°C以下、40°C以下、45°C以下の温度で行うことができる。核酸増幅反応は、20°C以上、25°C以上、30°C以上、35°C以上、37°C以上、40°C以上、または45°C以上の温度で行うことができる。

信号が検出される、本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、a）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;b）複合体を基材に接触させる工程;c）基材を、切断された基材と差次的に反応する試薬に接触させる工程;およびd）基材の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素-核酸である。場合によって、基質は酵素基質-核酸である。

プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸および標的核酸と複合体化した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼを含むことができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合後に活性化され得、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を切断し、トランス切断活性を有することができる。トランス切断活性は、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる近くの核酸の非特異的切断、例えば検出部分を有するディテクター核酸のトランス切断であり得る。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによってディテクター核酸が切断されると、検出部分はディテクター核酸から放出され、信号を生成することができる。信号は、検出のために支持媒体上に固定化することができる。信号を可視化して、標的核酸が改変を含むかどうかを評価することができる。

多くの場合、信号は比色信号または目で見える信号である。いくつかの例では、信号は、蛍光、電気、化学、電気化学、または磁気である。信号は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電信号であり得る。いくつかの場合では、検出可能な信号は、比色信号または目で見える信号である。いくつかの例では、検出可能な信号は、蛍光、電気、化学、電気化学、または磁気である。いくつかの場合では、第1の検出信号は、検出部分が検出領域内の捕捉分子に結合することによって生成され、ここで第1の検出信号は、試料が標的核酸を含有したことを示す。場合により、システムは、2種類以上の標的核酸を検出することができ、システムは、2種類以上のガイド核酸および2種類以上のディテクター核酸を含む。いくつかの場合では、検出可能な信号は、切断事象によって直接生成される。代替的にまたは組み合わせて、検出可能な信号は、信号事象によって間接的に生成される。検出可能な信号は、蛍光信号ではない場合がある。いくつかの場合では、検出可能な信号は、比色または色ベースの信号である。いくつかの場合では、検出された標的核酸は、支持媒体の検出領域上のその空間的位置に基づいて同定される。いくつかの場合では、第2の検出可能な信号は、第1の生成された信号とは空間的に異なる位置に生成される。

いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出する対象方法の検出の閾値は、10nM以下である。「検出の閾値」という用語は、検出を行うために試料中に存在しなければならない標的核酸の最小量を説明するために本明細書で使用される。例えば、検出の閾値が10nMである場合、標的核酸が試料中に10nM以上の濃度で存在する場合に信号を検出することができる。いくつかの場合では、検出の閾値は、5nM以下、1nM以下、0.5nM以下、0.1nM以下、0.05nM以下、0.01nM以下、0.005nM以下、0.001nM以下、0.0005nM以下、0.0001nM以下、0.00005nM以下、0.00001nM以下、10pM以下、1pM以下、500fM以下、250fM以下、100fM以下、50fM以下、10fM以下、5fM以下、1fM以下、500アトモル（aM）以下、100aM以下、50aM以下、10aM以下、または1aM以下である。いくつかの場合では、検出の閾値は、1aM～1nM、1aM～500pM、1aM～200pM、1aM～100pM、1aM～10pM、1aM～1pM、1aM～500fM、1aM～100fM、1aM～1fM、1aM～500aM、1aM～100aM、1aM～50aM、1aM～10aM、10aM～1nM、10aM～500pM、10aM～200pM、10aM～100pM、10aM～10pM、10aM～1pM、10aM～500fM、10aM～100fM、10aM～1fM、10aM～500aM、10aM～100aM、10aM～50aM、100aM～1nM、100aM～500pM、100aM～200pM、100aM～100pM、100aM～10pM、100aM～1pM、100aM～500fM、100aM～100fM、100aM～1fM、100aM～500aM、500aM～1nM、500aM～500pM、500aM～200pM、500aM～100pM、500aM～10pM、500aM～1pM、500aM～500fM、500aM～100fM、500aM～1fM、1fM～1nM、1fM～500pM、1fM～200pM、1fM～100pM、1fM～10pM、1fM～1pM、10fM～1nM、10fM～500pM、10fM～200pM、10fM～100pM、10fM～10pM、10fM～1pM、500fM～1nM、500fM～500pM、500fM～200pM、500fM～100pM、500fM～10pM、500fM～1pM、800fM～1nM、800fM～500pM、800fM～200pM、800fM～100pM、800fM～10pM、800fM～1pM、1pM～1nM、1pM～500pM、1pM～200pM、1pM～100pM、または1pM～10pMの範囲内である。いくつかの場合では、検出の閾値は800fM～100pM、1pM～10pM、10fM～500fM、10fM～50fM、50fM～100fM、100fM～250fM、または250fM～500fMの範囲内である。いくつかの場合では、一本鎖標的核酸が試料中で検出される最小濃度は、1aM～1nM、10aM～1nM、100aM～1nM、500aM～1nM、1fM～1nM、1fM～500pM、1fM～200pM、1fM～100pM、1fM～10pM、1fM～1pM、10fM～1nM、10fM～500pM、10fM～200pM、10fM～100pM、10fM～10pM、10fM～1pM、500fM～1nM、500fM～500pM、500fM～200pM、500fM～100pM、500fM～10pM、500fM～1pM、800fM～1nM、800fM～500pM、800fM～200pM、800fM～100pM、800fM～10pM、800fM～1pM、1pM～1nM、1pM～500pM、1pM～200pM、1pM～100pM、または1pM～10pMの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、1aM～100pMの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、1fM～100pMの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、10fM～100pMの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、800fM～100pMの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、1pM～10pMの範囲内である。いくつかの場合では、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キット、および方法は、複数の非標的核酸などの複数の核酸を含む試料中の標的一本鎖核酸を検出し、標的一本鎖核酸は、1aM、10aM、100aM、500aM、1fM、10fM、500fM、800fM、1pM、10pM、100pM、または1pMという低い濃度で存在する。

いくつかの場合では、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、試料中の標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料を、トランス切断が起こるかまたは切断反応が完了に達するのに十分な所定の時間にわたって試薬と接触させる。いくつかの場合では、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、試料中の標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料を、試薬と60分以下の間接触させる。場合により、試料を試薬と120分以下、110分以下、100分以下、90分以下、80分以下、70分以下、60分以下、55分以下、50分以下、45分以下、40分以下、35分以下、30分以下、25分以下、20分以下、15分以下、10分以下、5分以下、4分以下、3分以下、2分以下、または1分以下の間接触させる。場合により、試料を試薬と少なくとも120分間、少なくとも110分間、少なくとも100分間、少なくとも90分間、少なくとも80分間、少なくとも70分間、少なくとも60分間、少なくとも55分間、少なくとも50分間、少なくとも45分間、少なくとも40分間、少なくとも35分間、少なくとも30分間、少なくとも25分間、少なくとも20分間、少なくとも15分間、少なくとも10分間、または少なくとも5分間接触させる。いくつかの場合では、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、10時間未満、9時間未満、8時間未満、7時間未満、6時間未満、5時間未満、4時間未満、3時間未満、2時間未満、1時間未満、50分未満、45分未満、40分未満、35分未満、30分未満、25分未満、20分未満、15分未満、10分未満、9分未満、8分未満、7分未満、6分未満または5分未満で試料中の標的核酸を検出することができる。

ガイド核酸が標的核酸に結合すると、プログラマブルヌクレアーゼのトランス切断活性を開始することができ、ディテクター核酸を切断して蛍光の検出をもたらすことができる。本明細書に記載されるいくつかの方法の試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み得、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。非限定的な例として、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電である信号の変化によって測定すると、プログラマブルヌクレアーゼを使用したディテクター核酸の切断は、50％の効率で切断することができる。本明細書に記載のいくつかの方法は、試料中の標的核酸を検出する方法であり得、標的核酸を含む試料を、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸と、ガイド核酸および標的核酸セグメントと複合体を形成したときに活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼと、検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸とに接触させる工程、および支持媒体上の第1の検出可能な信号を測定する工程を含み、ここでディテクター核酸は、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによって切断され得、それによって第1の検出可能な信号を生成し、色の変化によって測定されるように、切断するプログラマブルヌクレアーゼを使用して一本鎖ディテクター核酸を切断する。プログラマブルヌクレアーゼを使用した一本鎖ディテクター核酸の切断は、色の変化によって測定した場合、50％の効率で切断することができる。いくつかの場合では、切断効率は、色の変化によって測定された場合、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも95％である。色の変化は、検出可能な比色信号または目で認識できる信号であってもよい。色の変化は、第1の検出可能な信号として測定することができる。第1の検出可能な信号は、標的核酸を含む試料の、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸と、ガイド核酸および標的核酸セグメントと複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼと、検出部分を含み、ディテクター核酸が活性化されたヌクレアーゼによって切断され得る一本鎖ディテクター核酸との接触の5分以内に検出可能になり得る。第1の検出可能な信号は、試料と接触してから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110、または120分以内に検出可能であり得る。

いくつかの場合では、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、試料中のプログラマブルヌクレアーゼおよび一本鎖ディテクター核酸で標的一本鎖核酸を検出し、試料は、一本鎖ディテクター核酸のトランス切断に十分な所定の時間にわたって試薬と接触される。例えば、プログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を検出するLbuCas13aであり、一本鎖ディテクター核酸は、切断により検出される緑色の検出可能部分を有する2つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む。別の例として、プログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を検出するLbaCas13aであり、一本鎖ディテクター核酸は、切断により検出される赤色の検出可能部分を有する2つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む。

いくつかの場合では、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、試料中の2つの異なるプログラマブルヌクレアーゼおよび2つの異なる一本鎖ディテクター核酸で2つの異なる標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料は、少なくとも2つの一本鎖ディテクター核酸のトランス切断に十分な所定の時間にわたって試薬と接触される。例えば、第1のプログラマブルヌクレアーゼは、第1の一本鎖標的核酸によって活性化され、活性化時に、切断により検出される緑色の検出可能な部分を有する2つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む第1の一本鎖ディテクター核酸を切断するLbuCas13aであり、第2のプログラマブルヌクレアーゼは、第2の一本鎖標的核酸によって活性化され、活性化時に、切断により検出される赤色の検出可能な部分を有する2つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む第2の一本鎖ディテクター核酸を切断するLbaCas13aである。いくつかの場合では、それぞれの一本鎖核酸を切断するための両方のプログラマブルヌクレアーゼ、例えば、切断により検出される緑色の検出可能部分を有する2つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む第1の一本鎖ディテクター核酸を切断するLbuCas13a、および切断により検出される赤色の検出可能部分を有する2つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む第2の一本鎖ディテクター核酸を切断するLbaCas13aの活性化、それに続く黄色信号の検出は、第1の一本鎖標的核酸および第2の一本鎖標的核酸が試料中に存在することを示す。

あるいは、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、試料中の第1の一本鎖標的核酸の存在を検出する第1のプログラマブルヌクレアーゼ、および対照として使用される第2のプログラマブルヌクレアーゼを含むことができる。例えば、第1のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される緑色の検出可能部分を有する2つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む第1の一本鎖ディテクター核酸を切断し、試料中に存在する場合、第1の一本標的核酸によって活性化されるLbu13aであり、第2のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される赤色の検出可能部分を有する2つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む第2の一本鎖ディテクター核酸を切断し、試料中に見られない（かつ、決して見られるとは予想されない）第2の一本鎖標的核酸によって活性化され、対照として役立つLba13aである。この場合では、赤色信号または黄色信号の検出は、試験に問題がある（例えば、試料に含有される高レベルの他のRNAseが、第2のプログラマブルヌクレアーゼの活性化なしで一本鎖ディテクター核酸を切断している）ことを示すが、緑色信号の検出は、試験が正しく作用しており、第1のプログラマブルヌクレアーゼの第1の標的一本鎖核酸が試料中に存在することを示す。

さらなる例として、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、試料中の2つの異なるプログラマブルヌクレアーゼおよび2つの異なる一本鎖ディテクター核酸で2つの異なる標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料は、少なくとも2つの一本鎖ディテクター核酸のトランス切断に十分な所定の時間にわたって試薬と接触される。例えば、第1のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される第1の一本鎖ディテクター核酸を切断し、試料中に存在する場合には敗血症RNAバイオマーカーからの第1の一本鎖標的核酸によって活性化されるCas13aタンパク質であり、第2のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される第2の一本鎖ディテクター核酸を切断し、インフルエンザウイルス由来の第2の一本鎖標的核酸によって活性化されるCas14タンパク質である。

本明細書中に記載される試薬はまた、本明細書中に開示される装置、システム、流体装置、キットおよび方法と適合性である緩衝液を含むことができる。これらの緩衝液は、インフルエンザなどのウイルスによって引き起こされるものを含む、疾患などの病気の検出のための、本明細書に記載の他の試薬、試料および支持媒体と適合性である。本明細書中に記載される方法はまた、本明細書中に開示される方法と適合性である緩衝液の使用を含むことができる。例えば、緩衝液は、20mM HEPES pH 6.8、50mM KCl、5mM MgCl₂および5％グリセロールを含む。いくつかの例では、緩衝液は、0～100、0～75、0～50、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、～30、5～40、5～50、5～75、5～100、10～20、10～30、10～40、10～50、15～20、15～25、15～30、15～4、15～50、20～25、20～30、20～40または20～50mM HEPES pH 6.8を含む。緩衝液は、0～500、0～400、0～300、0～250、0～200、0～150、0～100、0～75、0～50、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、～30、5～40、5～50、5～75、5～100、5～150、5～200、5～250、5～300、5～400、5～500、25～50、25～75、25～100、50～100、50 150、50～200、50～250、50～300、100～200、100～250、100～300または150～250mM KClを含むことができる。他の例では、緩衝液は、0～100、0～75、0～50、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、～30、5～40、5～50、5～75、5～100、10～20、10～30、10～40、10～50、15～20、15～25、15～30、15～4、15～50、20～25、20～30、20～40または20～50mM MgCl₂を含む。緩衝液は、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、5～30％グリセロールを含むことができる。

別の例として、緩衝液は、100mMイミダゾールpH 7.5;250mM KCl、25mM MgCl₂、50ug/mL BSA、0.05％ Igepal Ca-630、および25％グリセロールを含む。いくつかの場合では、緩衝液は、0～500、0～400、0～300、0～250、0～200、0～150、0～100、0～75、0～50、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、～30、5～40、5～50、5～75、5～100、5～150、5～200、5～250、5～300、5～400、5～500、25～50、25～75、25～100、50～100、50 150、50～200、50～250、50～300、100～200、100～250、100～300または150～250mMイミダゾールpH 7.5を含む。緩衝液は、0～500、0～400、0～300、0～250、0～200、0～150、0～100、0～75、0～50、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、～30、5～40、5～50、5～75、5～100、5～150、5～200、5～250、5～300、5～400、5～500、25～50、25～75、25～100、50～100、50 150、50～200、50～250、50～300、100～200、100～250、100～300または150～250mM KClを含むことができる。他の例では、緩衝液は、0～100、0～75、0～50、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、～30、5～40、5～50、5～75、5～100、10～20、10～30、10～40、10～50、15～20、15～25、15～30、15～4、15～50、20～25、20～30、20～40または20～50mM MgCl₂を含む。緩衝液は、いくつかの例では、0～100、0～75、0～50、0～25、0～20、0～10、0～5、5～50、5～75、5～100、10～20、10～50、10～75、10～100、25～50、25～75、25～100、50～75、または50～100ug/mL BSAを含む。いくつかの例では、緩衝液は、0～1、0～0.5、0～0.25、0～0.01、0～0.05、0～0.025、0～0.01、0.01～0.025、0.01～0.05、0.01～0.1、0.01～0.25、0.01～0.5、0.01～1、0.025～0.05、0.025～0.1、0.025～0.5、0.025～1、0.05～0.1、0.05～0.25、0.05～0.5、0.05～0.75、0.05～1、0.1～0.25、0.1～0.5または0.1～1％ Igepal Ca-630を含む。緩衝液は、0～25、0～20、0～10、0～5、5～10、5～15、5～20、5～25、5～30％グリセロールを含むことができる。

本開示の緩衝液は、ウイルス溶解緩衝液を含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、ウイルス試料（例えば、コロナウイルス感染症を有すると疑われる個体から採取された試料）中のコロナウイルスのカプシドを溶解し、ウイルスゲノムを放出し得る。ウイルス溶解緩衝液は、ウイルスゲノムの標的領域の増幅（例えば、RT-LAMP増幅）に適合し得る。ウイルス溶解緩衝液は、検出（例えば、本明細書中に開示されるDETECTR反応）に適合し得る。ウイルスを溶解する機能を有し、増幅、検出、またはその両方に適合するウイルス溶解緩衝液は、二重溶解緩衝液であり得る。ウイルスを溶解する機能を有し、増幅に適合するウイルス溶解緩衝液は、二重溶解/増幅緩衝液であり得る。ウイルスを溶解する機能を有し、検出に適合するウイルス溶解緩衝液は、二重溶解/検出緩衝液であり得る。試料は、増幅、検出（例えば、DETECTR反応）、またはその両方に適合するウイルス溶解緩衝液に試料を懸濁することを含む、一段階試料調製方法で調製することができる。増幅（例えば、RT-LAMP増幅）、検出（例えば、DETECTR）、またはその両方に適合するウイルス溶解緩衝液は、緩衝液（例えば、Tris-HCl、ホスフェート、またはHEPES）、還元剤（例えば、N-アセチルシステイン（NAC）、ジチオスレイトール（DTT）、β-メルカプトエタノール（BME）またはトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP））、キレート剤（例えば、EDTAまたはEGTA）、界面活性剤（例えば、デオキシコレート、NP-40（Ipgal）、Triton X-100またはTween 20）、塩（例えば、酢酸アンモニウム、酢酸マグネシウム、酢酸マンガン、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸カリウムまたは硫酸ナトリウム）、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、ウイルス溶解緩衝液は緩衝液および還元剤を含み得るか、またはウイルス溶解緩衝液は緩衝液およびキレート剤を含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、低pHで配合され得る。例えば、ウイルス溶解緩衝液は、約pH 4～約pH 5のpHで配合され得る。いくつかの場合では、ウイルス溶解緩衝液は、約pH 4～約pH 8.8のpHで配合され得る。いくつかの場合では、ウイルス溶解緩衝液は、約pH 4～約pH 9のpHで配合され得る。ウイルス溶解緩衝液は、防腐剤（例えば、ProClin 150）をさらに含み得る。いくつかの態様では、ウイルス溶解緩衝液は、増幅反応の活性化物質を含み得る。例えば、緩衝液は、プライマー、dNTP、またはマグネシウム（例えば、MgSO₄、MgCl₂、またはMgOAc）、またはそれらの組み合わせを含んで、増幅反応を活性化することができるいくつかの態様では、コロナウイルスの溶解後に活性化物質（例えば、プライマー、dNTPまたはマグネシウム）を緩衝液に添加して、増幅反応を開始することができる。

ウイルス溶解緩衝液は、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、約4、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、約4.7、約4.8、約4.9、約5、約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5または約9のpHを含み得る。いくつかの態様では、ウイルス溶解緩衝液は、3.5～4.5、4～5、4.5～5.5、3.5～4、4～4.5、4.5～5、5～5.5、5～6、6～7、7～8、または8～9のpHを含み得る。

ウイルス溶解緩衝液は、約0mM、約2mM、約4mM、約5mM、約6mM、約8mM、約10mM、約12mM、約13mM、約14mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM、約55mM、または約60mMのマグネシウム（例えば、MgSO₄、MgCl₂またはMgOAc）のマグネシウム濃度を含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、0mM～5mM、5mM～10mM、10mM～15mM、15mM～20mM、20mM～25mM、25mM～30mM、30mM～40mM、40mM～50mM、または50mM～60mMのマグネシウム（例えば、MgSO₄、MgCl₂またはMgOAc）のマグネシウム濃度を含み得る。いくつかの態様では、ウイルス溶解後にマグネシウムを添加して増幅反応を活性化することができる。

ウイルス溶解緩衝液は、約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約10mM、約12mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約40mM、約50mM、約60mM、約7mM、約80mM、約90mM、約100mM、または約120mMの濃度の還元剤（例えば、NAC、DTT、BME、またはTCEP）を含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、1mM～5mM、5mM～10mM、10mM～15mM、15mM～20mM、20mM～25mM、または25mM～30mM、30mM～40mM、40mM～50mM、50mM～60mM、60mM～70mM、70mM～80mM、または80mM～90mM、90mM～100mM、または100mM～120mMの濃度の還元剤（例えば、NAC、DTT、BME、またはTCEP）を含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、約0.1mM、約0.2mM、約0.3mM、約0.4mM、約0.5mM、約0.6mM、約0.7mM、約0.8mM、約0.9mM、約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約10mM、約12mM、約15mM、約20mM、約25mM、または約30mMの濃度のキレート剤（例えば、EDTAまたはEGTA）を含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、0.1mM～0.5mM、0.25mM～0.5mM、0.4mM～0.6mM、0.5mM～1mM、1mM～5mM、5mM～10mM、10mM～15mM、15mM～20mM、20mM～25mM、または25mM～30mMの濃度のキレート剤（例えば、EDTAまたはEGTA）を含み得る。

ウイルス溶解緩衝液は、塩（例えば、酢酸アンモニウム（（NH₄）₂OAc）、酢酸マグネシウム（MgOAc）、酢酸マンガン（MnOAc）、酢酸カリウム（K₂OAc）、酢酸ナトリウム（Na₂OAc）、塩化アンモニウム（NH₄Cl）、塩化カリウム（KCl）、塩化マグネシウム（MgCl₂）、塩化マンガン（MnCl₂）、塩化ナトリウム（NaCl）、硫酸アンモニウム（（NH₄）₂SO₄）、硫酸マグネシウム（MgSO₄）、硫酸マンガン（MnSO₄）、硫酸カリウム（K₂SO₄）、または硫酸ナトリウム（Na₂SO₄））を約1mM、約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約45mM、約50mM、約55mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM、または約100mMの濃度で含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、塩（例えば、（NH₄）₂OAc、MgOAc、MnOAc、K₂OAc、Na₂OAc、NH₄Cl、KCl、MgCl₂、MnCl₂、NaCl、（NH₄）₂SO₄、MgSO₄、MnSO₄、K₂SO₄、またはNa₂SO₄）を1mM～5mM、1mM～10mM、5mM～10mM、10mM～15mM、15mM～20mM、20mM～25mM、25mM～30mM、30mM～35mM、35mM～40mM、40mM～45mM、45mM～50mM、50mM～55mM、55mM～60mM、60mM～70mM、70mM～80mM、80mM～90mM、または90mM～100mMの濃度で含み得る。

ウイルス溶解緩衝液は、界面活性剤（例えば、デオキシコレート、NP-40（Ipgal）、Triton X-100またはTween 20）を約0.01％、約0.05％、約0.10％、約0.15％、約0.20％、約0.25％、約0.30％、約0.35％、約0.40％、約0.45％、約0.50％、約0.55％、約0.60％、約0.65％、約0.70％、約0.75％、約0.80％、約0.85％、約0.90％、約0.95％、約1.00％、約1.10％、約1.20％、約1.30％、約1.40％、約1.50％、約2.00％、約2.50％、約3.00％、約3.50％、約4.00％、約4.50％、または約5.00％の濃度で含み得る。ウイルス溶解緩衝液は、界面活性剤（例えば、デオキシコレート、NP-40（Ipgal）、Triton X-100またはTween 20）を0.01％～0.10％、0.05％～0.15％、0.10％～0.20％、0.15％～0.25％、0.20％～0.30％、0.25％～0.35％、0.30％～0.40％、0.35％～0.45％、0.40％～0.50％、0.45％～0.55％、0.50％～0.60％、0.55％～0.65％、0.60％～0.70％、0.65％～0.75％、0.70％～0.80％、0.75％～0.85％、0.80％～0.90％、0.85％～0.95％、0.90％～1.00％、0.95％～1.10％、1.00％～1.20％、1.10％～1.30％、1.20％～1.40％、1.30％～1.50％、1.40％～1.60％、1.50％～2.00％、2.00％～2.50％、2.50％～3.00％、3.00％～3.50％、3.50％～4.00％、4.00％～4.50％、または4.50％～5.00％の濃度で含み得る。

溶解反応は、ある温度範囲で実施され得る。いくつかの態様では、溶解反応は、ほぼ室温で実施され得る。いくつかの態様では、溶解反応は、約95℃で実施され得る。いくつかの態様では、溶解反応は、1°C～10°C、4°C～8°C、10°C～20°C、15°C～25°C、15°C～20°C、18°C～25°C、18°C～95°C、20°C～37°C、25°C～40°C、35°C～45°C、40°C～60°C、50°C～70°C、60°C～80°C、70°C～90°C、80°C～95°C、または90°C～99°Cで実施され得る。いくつかの態様では、溶解反応は、約5分間、約15分間、または約30分間実施され得る。いくつかの態様では、溶解反応は、2分～5分、3分～8分、5分～15分、10分～20分、15分～25分、20分～30分、25分～35分、30分～40分、35分～45分、40分～50分、45分～55分、50分～60分、55分～65分、60分～70分、65分～75分、70分～80分、75分～85分、または80分～90分実施され得る。

多くの検出装置および方法は、本明細書に開示される方法と一致する。例えば、任意の装置は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電信号を測定または検出することができる。多くの場合、熱量測定信号は、ディテクター核酸の切断後に生成される熱である。場合により、熱量測定信号は、ディテクター核酸の切断後に吸収される熱である。電位差測定信号は、例えば、ディテクター核酸の切断後に生成される電位である。電流測定信号は、ディテクター核酸の切断後に生成される電子の動きであり得る。多くの場合、信号は、比色信号または蛍光信号などの光学信号である。光学信号は、例えば、ディテクター核酸の切断後に生成される光出力である。場合により、光学信号は、ディテクター核酸の切断の前と後での吸光度の変化である。多くの場合、圧電信号は、ディテクター核酸の切断の前と後での質量の変化である。場合により、ディテクター核酸はタンパク質-核酸である。多くの場合、タンパク質-核酸は酵素-核酸である。

完了したアッセイからの検出領域からの結果は、様々な方法で、例えば血糖値測定器によって検出および分析することができる。いくつかの場合では、陽性対照スポットおよび検出領域内の検出スポットが目に見え、ユーザは結果を読み取ることができる。いくつかの場合では、陽性対照スポットおよび検出領域内の検出スポットは、信号の種類に応じて画像化装置または他の装置によって視覚化される。多くの場合、画像化装置は、移動式装置上のデジタルカメラなどのデジタルカメラである。移動式装置は、支持媒体の画像を取り込み、実行されているアッセイを識別し、検出領域および検出スポットを検出し、検出スポットの画像特性を提供し、検出スポットの画像特性を分析し、結果を提供することができるソフトウェアプログラムまたは移動式アプリケーションを有することができる。代替的にまたは組み合わせて、画像化装置は、蛍光、紫外線（UV）、赤外線（IR）、または可視波長信号を捕捉することができる。画像化装置は、励起源を有して励起エネルギーを供給し、放出された信号を捕捉することができる。いくつかの場合では、励起源は、カメラフラッシュであってよく、任意でフィルターであってもよい。いくつかの場合では、画像化装置を、暗室を作製するために支持媒体上に配置された画像化ボックスと共に使用して、画像化を改善する。画像化ボックスは、画像化前に画像化装置を嵌め込むことができる段ボール箱であってもよい。いくつかの場合では、画像化ボックスは、より集束された励起信号の生成を助けるために、またはより集束された放出信号を捕捉するために、光学レンズ、ミラー、フィルター、または他の光学素子を有する。多くの場合、画像化ボックスおよび画像化装置は、遠隔または低リソース設定でのアッセイの輸送および使用を容易にするために、小型の手持ち式で、携帯可能である。

本明細書に記載のアッセイは、移動式アプリケーション（アプリ）またはソフトウェアプログラムによって視覚化および分析することができる。アプリまたはプログラムのグラフィックユーザインターフェース（GUI）を使用して、移動式装置上のカメラを使用して、検出領域、バーコード、基準カラースケール、およびハウジングの基準マーカーを含む支持媒体の画像を個人で撮ることができる。プログラムまたはアプリは、試験種類のバーコードまたは識別可能なラベルを読み取り、基準マーカーを配置して試料を配向させ、検出可能な信号を読み取り、基準カラーグリッドと比較し、疾患の原因となる遺伝子、ウイルスまたは作用因子の存在を示す標的核酸の有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個人に提示することができる。移動式アプリケーションは、試験結果を移動式アプリケーションに格納することができる。移動式アプリケーションは、遠隔装置と通信し、試験結果のデータを転送することができる。試験結果は、ヘルスケア専門家を含む別の個人によって遠隔装置から遠隔で見ることができる。遠隔ユーザは、結果にアクセスし、情報を使用して、治療、介入、環境の浄化のための措置を推奨することができる。

標的核酸における突然変異の検出
標的核酸中の突然変異の検出に使用することができる、本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。信号の検出は、標的核酸の存在を示すことができる。標的核酸は、突然変異を含む場合がある。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、a）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;b）複合体を基材に接触させる工程;c）基材を、切断された基材と差次的に反応する試薬に接触させる工程;およびd）基材の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素-核酸である。場合によって、基質は酵素基質-核酸である。

本明細書に記載の方法を使用して、標的核酸中の突然変異を同定することができる。本方法を使用して、遺伝子の発現に影響を及ぼす標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異を同定することができる。遺伝子の発現に影響を及ぼす突然変異は、遺伝子内の標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異、遺伝子の発現に関連するRNAを含む標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異、または遺伝子の発現の調節に関連する核酸、例えば遺伝子のRNAもしくはプロモーター、エンハンサーもしくはリプレッサーの単一ヌクレオチド突然変異を含む標的核酸であり得る。多くの場合、突然変異の状態を使用して、標的核酸の突然変異に関連する疾患を診断または特定する。突然変異を有する標的核酸の検出は、臨床、診断など多くの分野で、研究ツールとして実験室において、および農業用途に適用可能である。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。突然変異は、インフルエンザAまたはインフルエンザBウイルスなどのウイルスの変異株をもたらし得る。

疾患の検出
疾患の検出に使用することができる、本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸（例えば、インフルエンザウイルスに由来する）をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。信号の検出は、標的核酸の存在を示すことができる。標的核酸は、突然変異を含む場合がある。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、a）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;b）複合体を基材に接触させる工程;c）基材を、切断された基材と差次的に反応する試薬に接触させる工程;およびd）基材の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素-核酸である。場合によって、基質は酵素基質-核酸である。

本明細書に記載の方法を使用して、細菌、ウイルス、または微生物由来の標的核酸中の突然変異を同定することができる。本方法を使用して、遺伝子の発現に影響を及ぼす標的核酸の突然変異を同定することができる。遺伝子の発現に影響を及ぼす突然変異は、遺伝子内の標的核酸の突然変異、遺伝子の発現に関連するRNAを含む標的核酸の突然変異、または遺伝子の発現の調節に関連する核酸、例えば遺伝子のRNAもしくはプロモーター、エンハンサーもしくはリプレッサーの突然変異を含む標的核酸であり得る。場合により、標的核酸突然変異の状態を使用して、細菌、ウイルスもしくは微生物の病原性、または抗生物質治療に対する耐性などの治療耐性を決定する。多くの場合、突然変異の状態を使用して、細菌、ウイルスもしくは微生物における標的核酸の突然変異に関連する疾患を診断または特定する。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。

研究ツール、ポイントオブケア、または処方箋なしとしての検出
本明細書に開示されるのは、研究ツールとして使用することができ、試薬キットとして提供することができる、本明細書に記載の標的核酸（例えば、インフルエンザウイルス由来）をアッセイする方法である。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。信号の検出は、標的核酸の存在を示すことができる。標的核酸は、突然変異を含む場合がある。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、a）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;b）複合体を基材に接触させる工程;c）基材を、切断された基材と差次的に反応する試薬に接触させる工程;およびd）基材の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素-核酸である。場合によって、基質は酵素基質-核酸である。

本明細書に記載の方法を使用して、標的核酸中の単一ヌクレオチド突然変異を同定することができる。本方法を使用して、遺伝子の発現に影響を及ぼす標的核酸の突然変異を同定することができる。遺伝子の発現に影響を及ぼす突然変異は、遺伝子内の標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異、遺伝子の発現に関連するRNAを含む標的核酸の突然変異、または遺伝子の発現の調節に関連する核酸、例えば遺伝子のRNAもしくはプロモーター、エンハンサーもしくはリプレッサーの突然変異を含む標的核酸であり得る。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。

試薬キットまたは研究ツールを使用して、本明細書に開示される任意の数の標的核酸、突然変異、または他の指標を実験室環境において検出することができる。試薬キットは、開放ボックス計装用の試薬パックとして提供することができる。

他の態様では、システム、アッセイフォーマット、Casレポーター、プログラマブルヌクレアーゼ、または他の試薬のいずれかを、病院、POL、またはクリニックなどの分散化した場所で実施され得るポイントオブケア（POC）検査で使用することができる。これらのポイントオブケア検査を使用して、インフルエンザまたは連鎖球菌感染症などの本明細書に開示される適応症のいずれかを診断することができ、または標的核酸（例えば、EGFR）における特定の突然変異の有無を測定することができる。POC検査は、消耗可能な検査カードを備えた小型機器として提供することができ、検査カードは、本明細書に開示されるアッセイフォマード（例えば、ラテラルフローアッセイ）のいずれかである。

さらに他の態様では、システム、アッセイフォマード、Casレポーター、プログラマブルヌクレアーゼ、または他の試薬のいずれかを処方箋なし（OTC）で、遠隔地または家庭で使用することができるリーダレスフォーマットで使用して、インフルエンザなどの一連の適応症を診断することができる。これらの適応症には、インフルエンザA、インフルエンザB、連鎖球菌感染症、またはCT/NG感染症が含まれ得る。OTC製品は、消耗可能な検査カードを含むことができ、検査カードは、本明細書に開示されるアッセイフォマード（例えば、ラテラルフローアッセイ）のいずれかである。OTC製品では、検査カードは、視覚的にまたは携帯電話を使用して解釈することができる。

支持媒体
多くの支持媒体は、本明細書に開示される装置、システム、流体装置、キット、および方法と一致する。これらの支持媒体は、例えば、試料内の標的核酸（例えば、インフルエンザウイルス由来）の検出のための本明細書に開示される流体装置と一致し、流体装置は、流体システム自体内部での試料調製、試料内の標的核酸の増幅、プログラマブルヌクレアーゼとの混合、およびプログラマブルヌクレアーゼによるディテクター核酸の切断から生じる検出可能な信号の検出のために、複数のポンプ、バルブ、貯蔵器、およびチャンバを含み得る。これらの支持媒体は、ウイルス感染症、例えばインフルエンザAまたはインフルエンザBからの感染症などの疾患の検出のための本明細書に記載の試料、試薬および流体装置と適合性である。本明細書に記載の支持媒体は、試薬と試料との間の活性からの結果を提示する方法を提供することができる。支持媒体は、検出可能な信号を提示するための媒体を検出可能な形式で提供する。任意で、支持媒体は、検出可能な信号を検出領域内の検出スポットに集中させて、アッセイの感受性、特異性または精度を高める。支持媒体は、アッセイの結果を提示し、標的核酸によって標的にされた関心対象の疾患の有無を示すことができる。支持媒体上の結果は、目で、または機械を使用して読み取ることができる。支持媒体は、支持媒体の表面上の切断されたディテクター分子によって生成された検出可能な信号を安定化させるのに役立つ。いくつかの例では、支持媒体は、ラテラルフローアッセイストリップである。いくつかの例では、支持媒体はPCRプレートである。PCRプレートは、96ウェルまたは384ウェルを有することができる。PCRプレートは、96ウェルプレートまたは384ウェルプレートのサブセット数のウェルを有することができる。96ウェルPCRプレートのウェルのサブセット数は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95ウェルである。例えば、PCRサブセットプレートは4ウェルを有することができ、ウェルは96ウェルPCRプレートからのウェルのサイズである（例えば、ウェルが96ウェルPCRプレートからのウェルのサイズである、4ウェルPCRサブセットプレート）。384ウェルPCRプレートのウェルのサブセット数は、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360、または380ウェルである。例えば、PCRサブセットプレートは20ウェルを有することができ、ウェルは384ウェルPCRプレートからのウェルのサイズである（例えば、ウェルが384ウェルPCRプレートからのウェルのサイズである、20ウェルPCRサブセットプレート）。PCRプレートまたはPCRサブセットプレートは、蛍光リーダー、可視光リーダー、または他の画像化装置と対にすることができる。多くの場合、画像化装置は、移動式装置上のデジタルカメラなどのデジタルカメラである。移動式装置は、PCRプレートまたはPCRサブセットプレートの画像を取り込み、実行されているアッセイを識別し、個々のウェルおよびその中の試料を検出し、アッセイされた試料を含む個々のウェルの画像特性を提供し、個々のウェルの内容物の画像特性を分析し、結果を提供することができるソフトウェアプログラムまたは移動式アプリケーションを有することができる。

支持媒体は、検出可能な信号を提示するための少なくとも1つの特定化されたゾーンまたは領域を有する。領域は、試料パッド領域、核酸増幅領域、コンジュゲートパッド領域、検出領域、および回収パッド領域のうちの少なくとも1つを含む。いくつかの例では、領域は完全に重なり合っているか、部分的に重なり合っているか、または連続して領域の縁部のみが接触しており、そこで領域はその隣接領域と流体連通している。いくつかの例では、支持媒体は、他の領域の上流に配置された試料パッド; ディテクター部分を特異的に標識するための手段を有するコンジュゲートパッド領域;試料パッドの下流に位置する検出領域;および試料パッドと流体接続する流路を画定する少なくとも1つのマトリックスを有する。いくつかの例では、支持媒体は、上に様々なゾーンまたは領域が配置される拡張ベース層を有する。拡張ベース層は、ゾーンに機械的支持を提供することができる。

本明細書では、試料を支持媒体に適用するための領域を提供する試料パッドが記載される。試料は、試料パッドの上のスポイトまたはピペットによって、試料パッド領域の上に試料を注ぐかもしくは分注することによって、または試料を保持する試薬チャンバに試料パッドを浸漬することによって、支持媒体に適用され得る。試料は、試薬が支持媒体上に配置される場合に試薬との反応の前に試料パッドに適用されても、または試料パッドに適用する前に試薬と反応させてもよい。試料パッド領域は、反応した試薬および試料を支持媒体の他のゾーンに移送することができる。反応した試薬および試料の移送は、毛細管現象、拡散、対流、またはポンプによって補助される能動輸送によって行われ得る。いくつかの場合では、支持媒体は、マイクロ流体チャネルと一体化されるかまたはそれに覆われて、流体輸送を促進する。

スポイトまたはピペットは、所定の体積を分注することができる。いくつかの場合では、所定の体積は、約1μl～約1000μl、約1μl～約500μl、約1μl～約100μl、または約1μl～約50μlの範囲であり得る。いくつかの場合では、所定の体積は、少なくとも1μl、少なくとも2μl、少なくとも3μl、少なくとも4μl、少なくとも5μl、少なくとも6μl、少なくとも7μl、少なくとも8μl、少なくとも9μl、少なくとも10μl、少なくとも25μl、少なくとも50μl、少なくとも75μl、少なくとも100μl、少なくとも250μl、少なくとも500μl、少なくとも750μl、または少なくとも1000μlであり得る。所定の体積は、5μl以下、10μl以下、25μl以下、50μl以下、75μl以下、100μl以下、250μl以下、500μl以下、750μl以下、または1000μl以下であり得る。スポイトまたはピペットは、使い捨てであってもよく、または1回使用であってもよい。

任意で、緩衝液または流体を試料パッドに適用して、支持媒体に沿った試料の移動の駆動を補助することもできる。いくつかの場合では、緩衝液または流体の体積は、約1μl～約1000μl、約1μl～約500μl、約1μl～約100μl、または約1μl～約50μlの範囲であり得る。いくつかの場合では、緩衝液または流体の体積は、少なくとも1μl、少なくとも2μl、少なくとも3μl、少なくとも4μl、少なくとも5μl、少なくとも6μl、少なくとも7μl、少なくとも8μl、少なくとも9μl、少なくとも10μl、少なくとも25μl、少なくとも50μl、少なくとも75μl、少なくとも100μl、少なくとも250μl、少なくとも500μl、少なくとも750μl、または少なくとも1000μlであり得る。緩衝液または流体の体積は、5μl以下、10μl以下、25μl以下、50μl以下、75μl以下、100μl以下、250μl以下、500μl以下、750μl以下、または1000μl以下であり得る。いくつかの場合では、緩衝液または流体は、試料対緩衝液または流体の比が少なくとも1:1、少なくとも1:2、少なくとも1:3、少なくとも1:4、少なくとも1:5、少なくとも1:6、少なくとも1:7、少なくとも1:8、少なくとも1:9、または少なくとも1:10であってもよい。

試料パッドは、適用された反応試薬および試料の大部分を後続の領域に移送する様々な材料から作製することができる。試料パッドは、セルロース繊維フィルター、織メッシュ、多孔性プラスチック膜、ガラス繊維フィルター、酸化アルミニウムでコーティングした膜、ニトロセルロース、紙、ポリエステルフィルター、またはポリマーベースのマトリックスを含み得る。試料パッド領域の材料は親水性であり、低程度の非特異的結合を有し得る。試料パッドの材料は、約50μm～約1000μm、約50μm～約750μm、約50μm～約500μm、または約100μm～約500μmの範囲であり得る。

試料パッドは、支持媒体上の反応結果の提示を改善するために化学物質で処理することができる。試料パッドを処理して、試料中の核酸の抽出を強化し、反応した試薬および試料またはコンジュゲートの支持媒体の他の領域への輸送を制御し、または切断された検出部分の、コンジュゲートの表面上のコンジュゲート結合分子もしくは検出領域内の捕捉分子への結合を強化することができる。化学物質は、洗剤、界面活性剤、緩衝剤、塩、増粘剤、またはポリペプチドを含み得る。いくつかの例では、化学物質はウシ血清アルブミンを含む。

支持媒体上にその表面上を被覆されたコンジュゲートを含む領域を、切断されたディテクター分子からのディテクター部分または対照分子に結合することができるコンジュゲート結合分子によって提供するコンジュゲートパッドが本明細書に記載される。コンジュゲートパッドは、切断されたディテクター分子からの検出部分へのコンジュゲート結合分子の結合、およびコンジュゲート結合検出部分の大部分の、後続領域への移動を促進する様々な材料から作製することができる。コンジュゲートパッドは、試料パッドもしくは他のゾーンと同じ材料、または試料パッドとは異なる材料を含み得る。コンジュゲートパッドは、ガラス繊維フィルター、多孔性プラスチック膜、酸化アルミニウムでコーティングした膜、紙、セルロース繊維フィルター、織メッシュ、ポリエステルフィルター、またはポリマーベースのマトリックスを含み得る。コンジュゲートパッド領域の材料は、親水性であり得るか、低程度の非特異的結合を有し得るか、またはコンジュゲートパッド全体にわたって一貫した流体流動特性を有し得る。いくつかの場合では、コンジュゲートパッドの材料は、約50μm～約1000μm、約50μm～約750μm、約50μm～約500μm、または約100μm～約500μmの範囲であり得る。

コンジュゲートパッド上に配置され、試料が支持媒体に適用されるまでコンジュゲートパッドに固定化されるコンジュゲートが、本明細書中にさらに記載される。コンジュゲートは、ナノ粒子、金ナノ粒子、ラテックスナノ粒子、量子ドット、化学発光ナノ粒子、炭素ナノ粒子、セレンナノ粒子、蛍光ナノ粒子、リポソーム、またはデンドリマーを含み得る。コンジュゲートの表面は、切断された検出分子からの検出部分に結合するコンジュゲート結合分子によって被覆され得る。

本明細書に記載のコンジュゲート結合分子は、コンジュゲートの表面を被覆し、検出部分に結合することができる。コンジュゲート結合分子は、ディテクター核酸から切断された検出部分に選択的に結合する。いくつかの適切なコンジュゲート結合分子は、抗体、ポリペプチドまたは一本鎖核酸を含む。いくつかの場合では、コンジュゲート結合分子は、色素およびフルオロフォアに結合する。色素またはフルオロフォアに結合するそのようなコンジュゲート結合分子のいくつかは、それらの信号をクエンチングすることができる。いくつかの場合では、コンジュゲート結合分子はモノクローナル抗体である。いくつかの場合では、免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、任意のアイソタイプ、可変領域、定常領域、Fc領域、Fab断片、F（ab’）2断片、およびFab’断片を含む。あるいは、コンジュゲート結合分子は、検出部分に特異的に結合する非抗体化合物である。場合により、コンジュゲート結合分子は、検出部分に結合することができるポリペプチドである。場合により、コンジュゲート結合分子は、ビオチンに結合するアビジンまたはポリペプチドである。場合により、コンジュゲート結合分子は、ディテクター部分結合核酸である。

コンジュゲートの直径は、所望の表面対体積比を提供するように選択されてもよい。いくつかの例では、表面積対体積比が高いと、コンジュゲートの総体積当たり、より多くの使用可能なコンジュゲート結合分子が検出部分に結合することが可能になり得る。いくつかの場合では、コンジュゲートの直径は、約1nm～約1000nm、約1nm～約500nm、約1nm～約100nm、または約1nm～約50nmの範囲であり得る。いくつかの場合では、コンジュゲートの直径は、少なくとも1nm、少なくとも2nm、少なくとも3nm、少なくとも4nm、少なくとも5nm、少なくとも6nm、少なくとも7nm、少なくとも8nm、少なくとも9nm、少なくとも10nm、少なくとも15nm、少なくとも20nm、少なくとも25nm、少なくとも30nm、少なくとも30nm、少なくとも35nm、少なくとも40nm、少なくとも45nm、少なくとも50nm、少なくとも55nm、少なくとも60nm、少なくとも65nm、少なくとも70nm、少なくとも75nm、少なくとも80nm、少なくとも85nm、少なくとも90nm、少なくとも95nm、少なくとも100nm、少なくとも200nm、少なくとも300nm、少なくとも400nm、少なくとも500nm、少なくとも600nm、少なくとも700nm、少なくとも800nm、少なくとも900nm、または少なくとも1000nmであり得る。いくつかの場合では、コンジュゲートの直径は、1nm以下、2nm以下、3nm以下、4nm以下、5nm以下、6nm以下、7nm以下、8nm以下、9nm以下、10nm以下、15nm以下、20nm以下、25nm以下、30nm以下、30nm以下、35nm以下、40nm以下、45nm以下、50nm以下、55nm以下、60nm以下、65nm以下、70nm以下、75nm以下、80nm以下、85nm以下、90nm以下、95nm以下、100nm以下、200nm以下、300nm以下、400nm以下、500nm以下、600nm以下、700nm以下、800nm以下、900nm以下、または1000nm以下であり得る。

コンジュゲート結合分子対コンジュゲートの比は、コンジュゲート結合分子と検出部分との間の所望の結合特性を達成するように調整することができる。いくつかの例では、コンジュゲート結合分子対コンジュゲートのモル比は、少なくとも1:1、少なくとも1:5、少なくとも1:10、少なくとも1:20、少なくとも1:30、少なくとも1:40、少なくとも1:50、少なくとも1:60、少なくとも1:70、少なくとも1:80、少なくとも1:90、少なくとも1:100、少なくとも1:110、少なくとも1:120、少なくとも1:130、少なくとも1:140、少なくとも1:150、少なくとも1:160、少なくとも1:170、少なくとも1:180、少なくとも1:190、少なくとも1:200、少なくとも1:250、少なくとも1:300、少なくとも1:350、少なくとも1:400、少なくとも1:450、または少なくとも1:500である。いくつかの例では、コンジュゲート結合分子対コンジュゲートの質量比は、少なくとも1:1、少なくとも1:5、少なくとも1:10、少なくとも1:20、少なくとも1:30、少なくとも1:40、少なくとも1:50、少なくとも1:60、少なくとも1:70、少なくとも1:80、少なくとも1:90、少なくとも1:100、少なくとも1:110、少なくとも1:120、少なくとも1:130、少なくとも1:140、少なくとも1:150、少なくとも1:160、少なくとも1:170、少なくとも1:180、少なくとも1:190、少なくとも1:200、少なくとも1:250、少なくとも1:300、少なくとも1:350、少なくとも1:400、少なくとも1:450、または少なくとも1:500である。いくつかの例では、コンジュゲートあたりのコンジュゲート結合分子の数は、少なくとも1、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、または少なくとも10000である。

コンジュゲート結合分子は、様々な手法によってコンジュゲートに結合され得る。場合により、コンジュゲート結合分子は、受動結合によってコンジュゲートに結合され得る。いくつかのそのような受動結合は、吸着、吸収、疎水性相互作用、静電相互作用、イオン結合、または表面相互作用を含む。いくつかの場合では、コンジュゲート結合分子は、共有結合的にコンジュゲートに結合され得る。場合により、コンジュゲート結合分子のコンジュゲートへの共有結合は、EDC/NHS化学またはチオール化学によって促進される。

アッセイ結果を提示するための領域を提供する、支持媒体上の検出領域が本明細書に記載される。検出領域は、コンジュゲート-切断されたディテクター分子からの結合検出部分の、検出部分に特異的な捕捉分子への結合を促進する様々な材料から作製することができる。検出領域は、他のゾーンと同じ材料、または他のゾーンとは異なる材料を含み得る。検出領域は、ニトロセルロース、紙、セルロース、セルロース繊維フィルター、ガラス繊維フィルター、多孔性プラスチック膜、酸化アルミニウムでコーティングした膜、織メッシュ、ポリエステルフィルター、またはポリマーベースのマトリックスを含み得る。多くの場合、検出領域はニトロセルロースを含み得る。領域パッド領域の材料は、親水性であり得るか、低程度の非特異的結合を有し得るか、または領域パッド全体にわたって一貫した流体流動特性を有し得る。コンジュゲートパッドの材料は、約10μm～約1000μm、約10μm～約750μm、約10μm～約500μm、または約10μm～約300μmの範囲であり得る。

検出領域は、切断された検出分子からの検出部分に結合することができる高密度の捕捉分子を有する少なくとも1つの捕捉領域と、高密度の陽性対照捕捉分子を有する少なくとも1つの領域とを含む。捕捉分子または陽性対照捕捉分子の密度が高い捕捉領域は、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号、または任意の他の形状であり得る。いくつかの例では、検出領域は、2つ以上の高密度の捕捉分子を有する2つ以上の捕捉領域を含み、各捕捉領域は、切断された検出分子からの1つのタイプの検出部分に特異的に結合する、他の捕捉領域の捕捉分子とは異なる1つのタイプの捕捉分子を含む。異なる捕捉分子を有する捕捉領域は、完全に重なり合っていてもよく、部分的に重なり合っていてもよく、または互いに空間的に分離していてもよい。いくつかの例では、捕捉領域は重なり合い、個々の捕捉領域によって生成された検出可能な信号とは異なる、組み合わされた検出可能な信号を生成することができる。通常、陽性対照スポットは、検出スポットのいずれとも空間的に別個である。

本明細書に記載の捕捉分子は、検出部分に結合し、検出領域内の検出スポットに固定化した。いくつかの適切な捕捉分子は、抗体、ポリペプチドまたは一本鎖核酸を含む。いくつかの場合では、捕捉分子は、色素およびフルオロフォアに結合する。色素またはフルオロフォアに結合するそのような捕捉分子のいくつかは、それらの信号をクエンチングすることができる。場合により、捕捉分子は、色素に結合する抗体であるか、またはフルオロフォアが、それらの信号をクエンチングし得る。いくつかの場合では、捕捉分子はモノクローナル抗体である。いくつかの場合では、免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、任意のアイソタイプ、可変領域、定常領域、Fc領域、Fab断片、F（ab’）2断片、およびFab’断片を含む。あるいは、捕捉分子は、検出部分に特異的に結合する非抗体化合物である。場合により、捕捉分子は、検出部分に結合することができるポリペプチドである。いくつかの例では、切断された検出分子からの検出部分は、検出部分に結合したコンジュゲートを有し、コンジュゲート-検出部分複合体は、検出領域上の検出部分に特異的な捕捉分子に結合し得る。場合により、捕捉分子は、検出部分に結合することができるポリペプチドである。場合により、捕捉分子は、ビオチンに結合するアビジンまたはポリペプチドである。場合により、捕捉分子は、ディテクター部分結合核酸である。

本明細書に記載の検出領域は、高密度の陽性対照捕捉分子を有する少なくとも1つの領域を含む。検出領域内の陽性対照スポットは、アッセイの検証およびアッセイの完了の確認を提供する。陽性対照スポットが本明細書に記載の可視化方法によって検出できない場合、アッセイは有効ではなく、新たなシステムまたはキットを用いて再度行うべきである。陽性対照捕捉分子は、コンジュゲート、コンジュゲート結合分子、または検出部分の少なくとも1つに結合し、検出領域内の陽性対照スポットに固定化される。いくつかの適切な陽性対照捕捉分子は、抗体、ポリペプチドまたは一本鎖核酸を含む。いくつかの場合では、陽性対照捕捉分子は、コンジュゲート結合分子に結合する。色素またはフルオロフォアに結合するそのような陽性対照捕捉分子のいくつかは、それらの信号をクエンチングすることができる。場合により、陽性対照捕捉分子は、色素に結合する抗体であるか、またはフルオロフォアが、それらの信号をクエンチングし得る。いくつかの場合では、陽性対照捕捉分子はモノクローナル抗体である。いくつかの場合では、抗体は、任意のアイソタイプ、可変領域、定常領域、Fc領域、Fab断片、F（ab’）2断片、およびFab’断片を含む。あるいは、陽性対照捕捉分子は、検出部分に特異的に結合する非抗体化合物である。場合により、陽性対照捕捉分子は、コンジュゲート、コンジュゲート結合分子または検出部分の少なくとも1つに結合することができるポリペプチドである。いくつかの例では、検出部分に結合していないコンジュゲートは、コンジュゲート、コンジュゲート結合分子の少なくとも1つに特異的な陽性対照捕捉分子に結合する。

本明細書に記載のキットまたはシステムはまた、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、または一本鎖ディテクター核酸の少なくとも1つの活性を決定するための陽性対照試料を含み得る。多くの場合、陽性対照試料は、ガイド核酸に結合する標的核酸を含む。陽性対照試料を試験試料と同じ方法で試薬と接触させ、支持媒体を使用して可視化する。陽性対照試料の陽性対照スポットおよび検出スポットの可視化は、試薬およびアッセイの検証を提供する。

本明細書に記載の標的核酸の検出のためのキットまたはシステムは、試料の試薬プロテアーゼ処理をさらに含むことができる。増幅前または検出可能な信号についてアッセイする前に、試料をプロテアーゼKなどのプロテアーゼで処理することができる。多くの場合、プロテアーゼ処理は15分以下である。時には、プロテアーゼ処理は、1分以下、5分以下、10分以下、15分以下、20分以下、25分以下、30分以下である、もしくはそれ以上を超えないか、または1～30分間の任意の値である。

本明細書に記載の標的核酸の検出のためのキットまたはシステムは、試料中の標的核酸の核酸増幅のための試薬をさらに含む。等温核酸増幅によって、増幅のための特別な機器を用いずに、遠隔地域または低リソース設定においてキットまたはシステムの使用が可能になる。多くの場合、核酸増幅のための試薬は、リコンビナーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、一本鎖DNA結合（SSB）タンパク質、およびポリメラーゼを含む。場合により、試料の核酸増幅は、標的核酸を検出する際のアッセイの感受性、特異性、または精度の少なくとも1つを改善する。いくつかの場合では、核酸増幅は、支持媒体上の核酸増幅領域において行われる。代わりに、または組み合わせて、核酸増幅を試薬チャンバ内で行い、得られた試料を支持媒体に適用する。場合により、核酸増幅は等温核酸増幅である。いくつかの場合では、核酸増幅は、転写増幅（TMA）である。核酸増幅は、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、または他の場合では環状ヘリカーゼ依存性増幅（cHDA）である。さらなる場合では、核酸増幅は鎖置換増幅（SDA）である。いくつかの場合では、核酸増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）である。いくつかの場合では、核酸増幅は、ループ介在増幅（LAMP）または指数関数的増幅反応（EXPAR）の少なくとも1つである。核酸増幅は、いくつかの場合では、ローリングサークル増幅（RCA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、多置換増幅（MDA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（HIP）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、または改良多置換増幅（IMDA）である。多くの場合、核酸増幅は、1分以下、2分以下、3分以下、4分以下、5分以下、6分以下、7分以下、8分以下、9分以下、10分以下、11分以下、12分以下、13分以下、14分以下、15分以下、16分以下、17分以下、18分以下、19分以下、20分以下、25分以下、30分以下、40分以下、50分以下、または60分以下、または1～60分の任意の値で行われる。核酸増幅反応は、約20～45°Cの温度で行われる場合がある。いくつかの場合では、核酸増幅反応は、20°C以下、25°C以下、30°C以下、35°C以下、37°C以下、40°C以下、45°C以下、または20°C～45°Cの任意の値の温度で行われる。いくつかの場合では、核酸増幅反応は、少なくとも20°C、少なくとも25°C、少なくとも30°C、少なくとも35°C、少なくとも37°C、少なくとも40°C、少なくとももしくは45°C、または20°C～45°Cの任意の値の温度で行われる。

場合によっては、本明細書に記載の方法を実施するための総時間は、3時間以下、2時間以下、1時間以下、50分以下、40分以下、30分以下、20分以下、または3時間～20分の任意の値である。多くの場合、未処理試料からの核酸検出の方法は、試料を15分間以下プロテアーゼ処理する工程、試料を15分間以下増幅する工程（前増幅とも呼ばれ得る）、試料をプログラマブルヌクレアーゼ介在検出に供するこ工程、およびヌクレアーゼ介在検出をアッセイする工程を含む。この方法を実施するための総時間は、場合によっては、3時間以下、2時間以下、1時間以下、50分以下、40分以下、30分以下、20分以下、または3時間～20分の任意の値である。多くの場合、プロテアーゼ処理はプロテアーゼKである。多くの場合、増幅は熱サイクル増幅である。増幅は等温増幅である場合がある。

支持媒体を流れ落ちる試料を回収するための領域を提供する、回収パッド領域が本明細書に記載される。多くの場合、回収パッドは検出領域の下流に配置され、吸収材料を含む。回収パッドは、支持媒体の他の領域から試料を回収および移動することによって、支持媒体に入る試料の総体積を増加させることができる。この増加した体積を使用して、未結合コンジュゲートを検出領域から洗い流して、バックグラウンドを低下させ、アッセイ感度を高めることができる。支持媒体の設計が回収パッドを含まない場合、支持媒体において分析される試料の体積は、支持媒体のベッド体積によって決定され得る。回収パッドは、試料体積のための貯蔵器を提供することができ、支持媒体を下る試料の流れのためのキャピラリー力を提供するのに役立つことができる。

回収パッドは、高度に吸収性であり、流体を保持することができる様々な材料から調製することができる。多くの場合、回収パッドはセルロースフィルターを含む。いくつかの例では、回収パッドは、セルロース、綿、織メッシュ、ポリマーベースのマトリックスを含む。通常は回収パッドの長さである回収パッドの寸法は、支持媒体によって吸収される全体積を変えるように調整することができる。

本明細書に記載の支持媒体は、支持媒体の縁部の周りにバリアを有することができる。多くの場合、バリアは、試料の支持媒体内での維持または支持媒体内の試料の流れを促進する疎水性バリアである。通常、疎水性バリアにおける試料の輸送速度は、支持媒体の領域を通るよりもはるかに低い。いくつかの場合では、疎水性バリアは、疎水性材料を支持媒体の縁部の周りに接触させることによって調製される。場合によって、疎水性バリアは、ワックス、ポリジメチルシロキサン、ゴム、またはシリコーンのうちの少なくとも1つを含む。

支持媒体上の任意の領域を化学物質で処理して、支持媒体上の検出スポットおよび陽性対照スポットの可視化を改善することができる。領域を処理して、試料中の核酸の抽出を強化し、反応した試薬および試料またはコンジュゲートの支持媒体の他の領域への輸送を制御し、または切断された検出部分の、コンジュゲートの表面上のコンジュゲート結合分子もしくは検出領域内の捕捉分子への結合を強化することができる。化学物質は、洗剤、界面活性剤、緩衝剤、塩、増粘剤、またはポリペプチドを含み得る。いくつかの例では、化学物質はウシ血清アルブミンを含む。いくつかの場合では、化学物質または物理的薬剤は、領域の幅にわたってより均一な流れを有する試料の流れを促進する。いくつかの場合では、化学物質または物理的薬剤は、領域の幅にわたってより均一な試料の混合を提供する。いくつかの場合では、化学物質または物理的薬剤は、アッセイの性能を改善するために流速を速くするか、または遅くするように制御する。場合により、アッセイの性能は、アッセイ時間の短縮、切断活性中時間の延長、コンジュゲートとの結合時間の延長または短縮、感度、特異性、または精度のうちの少なくとも1つによって測定される。

多重化
本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キット、および方法は、いくつかの方法で多重化することができる。これらの多重化方法は、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される流体装置と一致し、流体装置は、流体システム自体内部での試料調製、試料内の標的核酸の1つまたは複数の配列の増幅、プログラマブルヌクレアーゼとの混合、およびプログラマブルヌクレアーゼによるディテクター核酸の切断から生じる検出可能な信号の検出のために、複数のポンプ、バルブ、貯蔵器、およびチャンバを含み得る。

本開示と一致する方法は、試料中の標的核酸をアッセイする多重化方法を含む。多重化方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;およびタンパク質-核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質-核酸の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする多重化方法は、例えば、a）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させる工程;b）複合体を基材に接触させる工程;c）基材を、切断された基材と差次的に反応する試薬に接触させる工程;およびd）基材の切断を示す信号についてアッセイする工程を含み、ここで、信号は試料中の標的核酸の存在を示し、信号の非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素-核酸である。場合によって、基質は酵素基質-核酸である。

多重化は、複数の異なる標的核酸が同時に存在するが、反応が空間的に分離される空間多重化のいずれかであり得る。多くの場合、複数の標的核酸は、同じプログラマブルヌクレアーゼを使用して検出されるが、ガイド核酸は異なる。複数の標的核酸は、異なるプログラマブルヌクレアーゼを使用して検出されることがある。場合によっては、多重化は、単一の反応体積内で複数の異なる標的酸が検出される、単一反応多重化であり得る。多くの場合、少なくとも2つの異なるプログラマブルヌクレアーゼが単一反応多重化で使用される。例えば、多重化は、流体システム内で複数のカテゴリのディテクター核酸を固定化することによって可能になり得、単一の流体システム内で複数の標的核酸の検出が可能になる。多重化は、1つのキットまたはシステムにおける複数の標的核酸の検出を可能にする。いくつかの場合では、複数の標的核酸は、インフルエンザウイルスなどのウイルスに対する種々の標的核酸を含む。いくつかの場合では、複数の標的核酸は、インフルエンザおよび別の疾患（例えば、敗血症、または上気道ウイルスなどの呼吸器感染症）に関連する種々の標的核酸を含む。1つの疾患についての多重化は、試料中の疾患の存在を検出するためのアッセイの感度、特異性、または精度の少なくとも1つを向上させる。いくつかの場合では、複数の標的核酸は、2つ以上の疾患の原因となる種々のウイルス、細菌または病原体に向けられる標的核酸を含む。いくつかの場合では、多重化は、複数の標的核酸間、例えば疾患の原因となる同じ細菌または病原体の異なる遺伝子型、例えば細菌または病原体の野生型遺伝子型、および抗生物質治療などの治療に対する耐性をもたらし得る一塩基多型（SNP）などの突然変異を含む細菌または病原体の遺伝子型を含む標的核酸間の識別を可能にする。例えば、多重化は、第1のプログラマブルヌクレアーゼを使用する微生物種、および第2のプログラマブルヌクレアーゼを使用する微生物における抗生物質耐性パターンについての単一アッセイを含むアッセイ方法を含む。多重化は、異なるインフルエンザ株、例えばインフルエンザAおよびインフルエンザBの複数の標的核酸間の識別を可能にする場合がある。多くの場合、多重化は、例えば野生型遺伝子型およびSNP遺伝子型について、異なる遺伝子型を含む標的核酸などの複数の標的核酸間の識別を可能にする。複数のウイルス感染の多重化は、単一の試料から疾患のパネルを試験する能力を提供する。例えば、複数の疾患の多重化は、新しい患者の広範なパネル検査または疫学的調査において有益であり得る。多くの場合、多重化は、敗血症または複数の病原体に関連する他の疾患において細菌病原体を同定するために使用される。

さらに、多重化からの信号を定量化することができる。例えば、疾患パネルの定量化方法は、試料からの複数のアリコート中の複数の固有標的核酸をアッセイする工程、試料の第2のアリコート中の対照核酸対照をアッセイする工程、および複数の固有標的核酸の複数の信号を、ディテクター核酸の切断によって生成された信号を第2のアリコート中で生成された信号と比較して測定することによって定量化する工程を含む。多くの場合、複数の固有の標的核酸は、試料中の複数のウイルスに由来する。場合により、複数の信号の定量化は、複数の固有標的核酸の濃度と、複数の信号を生成した複数の固有標的核酸について相関する。疾患パネルは、インフルエンザなどの任意の疾患用であり得る。

本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キット、および方法は、試薬および支持媒体の様々な構成によって多重化することができる。いくつかの場合では、キットまたはシステムは、単一のハウジング内に収容された複数の支持媒体を有するように設計される。場合により、単一のハウジングに収容された複数の支持媒体は、単一の試料パッドを共有する。単一の試料パッドは、分岐または放射状構成などの様々な設計で支持媒体に接続されてもよい。あるいは、複数の支持媒体の各々は、それ自身の試料パッドを有する。いくつかの場合では、キットまたはシステムは、ハウジング内に収容された単一の支持媒体を有するように設計され、そこで支持媒体は、複数の標的核酸を検出するための複数の検出スポットを含む。場合により、多重化アッセイのための試薬は、複数のガイド核酸、複数のプログラマブルヌクレアーゼ、および複数の一本鎖ディテクター核酸を含み、ここで、ガイド核酸の1つと、プログラマブルヌクレアーゼの1つと、一本鎖ディテクター核酸の1つとの組み合わせが1つの標的核酸を検出し、検出領域上に検出スポットを提供することができる。いくつかの場合では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および1つの標的核酸を検出するように構成された一本鎖ディテクター核酸の組み合わせは、単一の試薬チャンバ内で少なくとも1つの他の組み合わせと混合される。いくつかの場合では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および1つの標的核酸を検出するように構成された一本鎖ディテクター核酸の組み合わせは、単一の支持媒体上で少なくとも1つの他の組み合わせと混合される。これらの試薬の組み合わせを試料と接触させると、複数の標的核酸についての反応が同じ媒体または試薬チャンバにおいて同時に起こる。この反応させた試料を本明細書に記載の多重化支持媒体に適用する場合がある。

いくつかの場合では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および1つの標的核酸を検出するように構成された一本鎖ディテクター核酸の組み合わせは、それ自身の試薬チャンバまたはそれ自身の支持媒体に提供される。この場合では、複数の試薬チャンバまたは支持媒体が装置、キットまたはシステムに設けられ、そこで1つの試薬チャンバが、1つの標的核酸を検出するように設計される。この場合では、複数の支持媒体を使用して、ウイルス感染または関心対象の他の疾患のパネルを検出する。

いくつかの例では、多重化装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、単一の反応で少なくとも2つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、単一の反応で少なくとも3つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、単一の反応で少なくとも4つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、単一の反応で少なくとも5つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化装置、システム、流体装置、キットおよび方法は、単一の反応で少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個の異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化キットは、単一のキットにおいて少なくとも2つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化キットは、単一のキットにおいて少なくとも3つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化キットは、単一のキットにおいて少なくとも4つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化キットは、単一のキットにおいて少なくとも5つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化キットは、単一のキットにおいて少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個の異なる標的核酸を検出する。

ハウジング
本明細書に記載される支持媒体は、本明細書に開示される装置、システム、流体装置、キット、および方法と一致するいくつかの方法で収納することができる。支持媒体用のハウジングは、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される流体装置と一致し、流体装置は、流体システム自体内部での試料調製、試料内の標的核酸の増幅、プログラマブルヌクレアーゼとの混合、およびプログラマブルヌクレアーゼによるディテクター核酸の切断から生じる検出可能な信号の検出のために、複数のポンプ、バルブ、貯蔵器、およびチャンバを含み得る。例えば、流体装置は、流体の流れを1つのチャンバから別のチャンバに導くための支持媒体を含むことができ、流体装置全体は、本明細書に記載のハウジング内に収容される。典型的には、本明細書に記載の支持媒体は、支持媒体を汚染および分解から保護するためにハウジング内に収容される。ハウジングは、2つ以上の部品で作られ、支持媒体を収容するように組み立てることができる。いくつかの例では、単一のハウジングが2つ以上の支持媒体を収容することができる。ハウジングは、厚紙、プラスチック、ポリマー、または支持媒体に機械的保護を提供する材料から作製することができる。多くの場合、ハウジング用の材料は不活性であるか、または支持媒体もしくは支持媒体上に配置された試薬と反応しない。ハウジングは、適所にある場合、試料を受け入れるために試料パッドを曝す上部を有することができ、ラテラルフローアッセイの結果の読み取りを可能にするために、検出領域の上方に開口部または窓を有する。ハウジングは、区画および支持媒体のハウジング内の適所での固定を助けるために、支持媒体の周囲および上に配置されるガイドピンをその内面に有してもよい。いくつかの場合では、ハウジングは支持媒体全体を収容する。あるいは、支持媒体の試料パッドは収容されず、露出された状態にして試料の受け入れを促進し、支持媒体の残りがハウジング内に収容される。

ハウジングおよびハウジング内に収容された支持媒体は、小型で、携帯可能で、手持ち式であるようなサイズであり得る。ハウジングおよび支持媒体の小型のサイズは、遠隔領域または低リソース設定におけるアッセイの輸送および使用を容易にするであろう。いくつかの場合では、ハウジングは、30cm以下、25cm以下、20cm以下、15cm以下、10cm以下、または5cm以下の長さを有する。いくつかの場合では、ハウジングは、少なくとも1cm、少なくとも5cm、少なくとも10cm、少なくとも15cm、少なくとも20cm、少なくとも25cm、または少なくとも30cmの長さを有する。いくつかの場合では、ハウジングは、30cm以下、25cm以下、20cm以下、15cm以下、10cm以下、5cm以下、4cm以下、3cm以下、2cm以下、または1cm以下の幅を有する。いくつかの場合では、ハウジングは、少なくとも1cm、少なくとも2cm、少なくとも3cm、少なくとも4cm、少なくとも5cm、少なくとも10cm、少なくとも15cm、少なくとも20cm、少なくとも25cm、または少なくとも30cmの幅を有する。いくつかの場合では、ハウジングは、10cm以下、9cm以下、8cm以下、7cm以下、6cm以下、5cm以下、4cm以下、3cm以下、2cm以下、または1cm以下の高さを有する。いくつかの場合では、ハウジングは、少なくとも1cm、少なくとも2cm、少なくとも3cm、少なくとも4cm、少なくとも5cm、少なくとも6cm、少なくとも7cm、少なくとも8cm、少なくとも9cm、または少なくとも10cmの高さを有する。典型的には、ハウジングは長方形の形状である。

ハウジングは、2つ以上の部品を含むことができる。ハウジングは、オーバーモールドを含むことができる。ハウジングは、チャンバ、チャネル、区画、またはバルブを周囲環境から密閉することができる。ハウジングは、レーザ結合できるポリカーボネートなどの封止可能な材料を含んでもよい。ハウジングは、剛性材料を含むことができる。ハウジングは、柔軟性材料を含むことができる。ハウジングは、コネクタまたはアダプタを含むことができる。コネクタまたはアダプタのセットは、厳格な公差を有し得る。コネクタまたはアダプタのセットは、緩やかな公差を有し得る。

いくつかの例では、ハウジングは、試験タイプの識別、検出範囲の視覚化、および結果の分析を容易にするために、上部被覆の外面に追加情報を提供する。上部外側ハウジングは、これらに限定されないが、バーコード、QRコード、識別標識、または他の視覚的に識別可能な標識を含む、識別標識を有することができる。いくつかの例では、識別標識は移動式装置上のカメラによって画像化され、画像を分析して、試験されている疾患を特定する。試験の正確な識別、結果を正確に視覚化し分析するために重要である。いくつかの例では、上部外側ハウジングは、検出領域を配向して陽性対照スポットを検出スポットから識別するための基準マーカーを有する。いくつかの例では、上部外側ハウジングは、色基準ガイドを有する。色基準ガイドを用いて検出領域を画像化すると、基準マーカーを使用して位置決めされた検出スポットを陽性対照スポットおよび色基準ガイドと比較して、検出スポットの様々な画像特性、例えばスポットの色、色強度、およびサイズなどを決定することができる。いくつかの場合では、色基準ガイドは、赤色、緑色、青色、黒色、および白色を有する。いくつかの場合では、検出スポットの画像は、色基準ガイドの少なくとも2つの基準色と比較して、色基準ガイドの少なくとも1つの基準色に正規化され、検出スポットの値を生成することができる。場合によっては、基準色のうちの少なくとも2つとの比較は、標準的な基準スケールとの比較である。いくつかの例では、いくつかの例における検出スポットの画像は、分析の前に変換またはフィルタリングを経る。検出スポットの画像特性の分析は、アッセイによって標的とされる標的核酸の有無および標的核酸に関連する疾患に関する情報を提供することができる。いくつかの場合では、分析は、試料中の標的核酸の有無の定性的結果を提供する。いくつかの場合では、分析は、試料中に存在する標的核酸のレベルの半定量的または定量的結果を提供する。定量化は、スポット/ウェルに標準のセットを有すること、および試験試料を標準の範囲と比較することによって実施され得る。より半定量的な手法は、互いに比較される2つのスポット/ウェルの色強度を計算し、一方のスポット/ウェルが他方よりも強いかどうかを評価することによって実施され得る。場合によって、定量化は循環核酸の定量化である。循環核酸は標的核酸を含むことができる。例えば、循環核酸を定量化する方法は、試料の第1のアリコート中の循環核酸の標的核酸をアッセイする工程、試料の第2のアリコート中の対照核酸をアッセイする工程、およびディテクター核酸の切断によって生成された信号を測定することによって第1のアリコート中の標的核酸標的を定量化する工程を含む。場合によって、循環RNAを定量化する方法は、試料の第1のアリコート中の循環RNAの標的核酸をアッセイする工程、試料の第2のアリコート中の対照核酸をアッセイする工程、およびディテクター核酸の切断によって生成された信号を測定することによって第1のアリコート中の標的核酸標的を定量化する工程を含む。多くの場合、出力は蛍光/秒を含む。反応速度は、時には、出力信号および標的核酸濃度について対数線形である。いくつかの例では、信号出力は標的核酸濃度と相関する。循環核酸は、DNAである場合がある。

検出/視覚化装置
多くの検出または視覚化装置および方法は、本明細書に開示される装置、システム、流体装置、キット、および方法と一致する。検出/視覚化方法は、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される流体装置と一致し、流体装置は、流体システム自体内部での試料調製、試料内の標的核酸の増幅、プログラマブルヌクレアーゼとの混合、およびプログラマブルヌクレアーゼによるディテクター核酸の切断から生じる検出可能な信号の検出のために、複数のポンプ、バルブ、貯蔵器、およびチャンバを含み得る。例えば、流体装置は、インキュベーションおよび検出チャンバまたは独立型検出チャンバを含むことができ、そこで、検出/可視化のための比色、蛍光、電気化学、または電気化学発光信号が生成される。場合により、検出のために生成される信号は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電信号である。多くの場合、熱量測定信号は、ディテクター核酸の切断後に生成される熱である。場合により、熱量測定信号は、ディテクター核酸の切断後に吸収される熱である。電位差測定信号は、例えば、ディテクター核酸の切断後に生成される電位である。電流測定信号は、ディテクター核酸の切断後に生成される電子の動きであり得る。多くの場合、信号は、比色信号または蛍光信号などの光学信号ある。光学信号は、例えば、ディテクター核酸の切断後に生成される光出力である。場合により、光学信号は、ディテクター核酸の切断の前と後での吸光度の変化である。多くの場合、圧電信号は、ディテクター核酸の切断の前と後での質量の変化である。場合により、ディテクター核酸はタンパク質-核酸である。多くの場合、タンパク質-核酸は酵素-核酸である。検出/視覚化は、以下でさらに説明するように、様々な方法を使用して分析することができる。完了したアッセイからの検出領域からの結果は、様々な方法で視覚化および分析することができる。いくつかの場合では、陽性対照スポットおよび検出領域内の検出スポットが目に見え、ユーザは結果を読み取ることができる。いくつかの場合では、陽性対照スポットおよび検出領域内の検出スポットは、画像化装置によって視覚化される。多くの場合、画像化装置は、移動式装置上のデジタルカメラなどのデジタルカメラである。移動式装置は、支持媒体の画像を取り込み、実行されているアッセイを識別し、検出領域および検出スポットを検出し、検出スポットの画像特性を提供し、検出スポットの画像特性を分析し、結果を提供することができるソフトウェアプログラムまたは移動式アプリケーションを有することができる。代替的にまたは組み合わせて、画像化装置は、蛍光、紫外線（UV）、赤外線（IR）、または可視波長信号を捕捉することができる。画像化装置は、励起源を有して励起エネルギーを供給し、放出された信号を捕捉することができる。いくつかの場合では、励起源は、カメラフラッシュであってよく、任意でフィルターであってもよい。いくつかの場合では、画像化装置を、暗室を作製するために支持媒体上に配置された画像化ボックスと共に使用して、画像化を改善する。画像化ボックスは、画像化前に画像化装置を嵌め込むことができる段ボール箱であってもよい。いくつかの場合では、画像化ボックスは、より集束された励起信号の生成を助けるために、またはより集束された放出信号を捕捉するために、光学レンズ、ミラー、フィルター、または他の光学素子を有する。多くの場合、画像化ボックスおよび画像化装置は、遠隔または低リソース設定でのアッセイの輸送および使用を容易にするために、小型の手持ち式で、携帯可能である。

いくつかの場合では、検出または視覚化は、ダイオードによる光の生成を含むことができる。いくつかの場合では、ダイオードは可視光を生成することができる。いくつかの場合では、ダイオード赤外光を生成することができる。いくつかの場合では、ダイオードは紫外光を生成することができる。いくつかの場合では、ダイオードは、光の異なる波長またはスペクトルを生成することができる。ダイオードは、広いまたは狭いスペクトルにわたって光を生成することができる。ダイオードは、可視スペクトルの大部分を包含する白色光を生成することができる。ダイオードは、特定の波長の光（例えば、特定の波長を中心とする、強度プロファイルに対するほぼガウス型またはローレンツ型曲線の波長）を生成することができる。いくつかの場合では、ダイオードによって生成される光の帯域幅は、ガウス型様またはローレンツ型様帯域の半値全幅として定義されてもよい。一部のダイオードは、狭い発光帯域幅を有する光を生成する。ダイオードは、1nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、5nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、10nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、20nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、30nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、50nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、100nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、150nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。ダイオードは、200nm未満の帯域幅を有する光を生成することができる。

いくつかの場合では、検出または視覚化は、ダイオード（例えば、フォトダイオード）による光検出を含むことができる。ダイオードによって生成された電流を使用して、偏光、波長、強度、進行方向、原点、またはそれらの任意の組み合わせを含む吸収された光の特性を決定することができる。いくつかの場合では、検出または視覚化は、カメラ（例えば、電荷結合素子（CCD）検出器）または金属-酸化物-半導体（MOS）検出器による光検出を含み得る。検出器（例えば、フォトダイオード、CCD検出器、またはMOS検出器）は、光の帯域幅を検出するように構成され得る。いくつかの場合では、検出器によって検出される光の帯域幅は、ガウス型様またはローレンツ型様帯域の半値全幅として定義されてもよい。いくつかの場合では、検出器によって検出される光の帯域幅は、試料と検出器との間に配置された発光フィルターによって狭められてもよい。発光フィルターは、ロングパスフィルターであってもよい。発光フィルターは、バンドパスフィルターであってもよい。発光フィルターは、ノッチフィルターであってもよい。いくつかの態様では、検出器によって検出される光の帯域幅は、約300nm未満、約200nm未満、約100nm未満、約75nm未満、約50nm未満、約40nm未満、約30nm未満、約20nm未満、約10nm未満、または約5nm未満であり得る。

いくつかの場合では、ダイオードアレイを使用して、試料からの蛍光を励起および検出することができる。いくつかの場合では、装置は、照射して、試料の特定の部分からの光を検出するように配置された光生成ダイオードおよび検出器ダイオードを含むことができる。いくつかの場合では、装置は、照射して、特定の試料区画またはチャンバからの光を検出するように配置された光生成ダイオードおよび検出器ダイオードを含むことができる。

製造
支持媒体は、様々な材料および試薬で組み立てることができる。試薬は、支持媒体用の材料の表面に分注されてもよく、またはコーティングされてもよい。支持媒体の材料は、バッキングカードに積層されてもよく、バッキングカードは、単離されてもよく、または個々の試験ストリップへと切断されてもよい。装置は、完全に手動のバッチ式プロセシング、または完全に自動化されたインライン連続プロセス、または2つのプロセシング手法のハイブリッドによって製造することができる。バッチプロセスは、支持媒体用の各材料のシートまたはロールから開始することができる。支持媒体の個々のゾーンは、分配および乾燥用に独立して加工されてもよく、最終的な支持媒体は、独立して調製されたゾーンと組み合わせられ、切断されてもよい。バッチプロセシングスキームは、設備コストが高くなり得る、より自動化されたインラインプロセシングよりも設備コストが低く、労働コストが高い可能性がある。いくつかの例では、設備投資が軽減されるので、少量生産の場合はバッチプロセシングが好ましい可能性がある。いくつかの例では、製造時間が短縮されるので、大量生産の場合は自動化されたインラインプロセシングが好ましい可能性がある。両方の手法は、生産レベルに合わせてスケーラブルであり得る。

いくつかの例では、支持媒体は、ディスペンサー、含浸タンク、乾燥オーブン、手動または半自動ラミネーターを備えたXYZ方向運動システム含む様々な機器、およびラミネーションのためにロールまたはシートストックを適切な長さおよび幅に縮小するための切断方法を使用して調製される。コンジュゲートゾーン用のコンジュゲート結合分子および検出ゾーン用の捕捉分子を分配するために、ディスペンサーを備えたXYZ方向運動システムを使用することができる。いくつかの態様では、ディスペンサーは、接触法または非接触法によって分配することができる。

支持媒体の自動または半自動調製では、支持媒体を、最終的な組み立てられた状態へと整えられる各領域用の膜のロールから調製し、ロールから広げることができる。例えば、支持媒体上の領域に対応する1つの膜で、左から右へ試料パッド領域から回収パッド領域まで、すべて接着性カードストック上で膜を整えることができる。ディスペンサーは、試薬、コンジュゲート、検出分子、および膜用の他の処理剤を膜上に配置する。分配された流体を低湿度チャンバ内で熱によって、または凍結乾燥によって膜上で乾燥させて、分配された分子を安定化する。膜は、ストリップへと切断され、ハウジング内に配置され、包装される。

流体装置における標的核酸の検出
本明細書では、生物学的試料中の関心対象の標的核酸を検出するための様々な流体装置が開示される。以下に詳細に記載される流体装置を使用して、試料中の標的核酸とプログラマブルヌクレアーゼとの反応を監視することができ、それによって前記標的核酸の検出が可能になる。本明細書に開示されるすべての試料および試薬は、以下に開示される流体装置での使用に適合する。本明細書に記載される任意のCasヌクレアーゼなどの任意のプログラマブルヌクレアーゼは、以下に開示される流体装置での使用に適合する。本明細書に開示される支持媒体およびハウジングもまた、以下に開示される流体装置と組み合わせた使用に適合する。本開示を通して記載される多重化検出は、本明細書に開示される流体装置内で実行することができる。本明細書に開示される検出および視覚化のための組成物および方法もまた、以下に記載される流体システム内での使用に適合する。

以下に記載する流体システムでは、任意のプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、CRISPR-Cas）反応を監視することができる。例えば、本明細書に開示される任意のプログラマブルヌクレアーゼを使用して、レポーター分子を切断して検出信号を生成することができる。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼはCas13である。場合により、Cas13は、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、またはCas13eである。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Mad7またはMad2である。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼはCas12である。場合により、Cas12は、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、またはCas12eである。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Csm1、Cas9、C2c4、C2c8、C2c5、C2c10、C2c9、またはCasZである。場合により、Csm1は、smCms1、miCms1、obCms1、またはsuCms1である。場合によりCas13aは、C2c2とも呼ばれる。場合によりCasZは、Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、またはCas14hとも呼ばれる。場合により、プログラマブルヌクレアーゼは、V型CRISPR-Cas系である。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、VI型CRISPR-Cas系である。場合により、プログラマブルヌクレアーゼは、III型CRISPR-Cas系である。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、レプトトリキア・シャーイイ（Lsh）、リステリア・シーリジェリー（Lse）、レプトトリキア・ブッカリス（Lbu）、レプトトリキア・ウェイディイ（Lwa）、ロドバクター・カプスラタス（Rca）、ハービニクス・ヘミセルロシリティカ（Hhe）、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ppr）、ラクノスピラ科（Lba）、［ユウバクテリウム］・レクターレ（Ere）、リステリア・ニュヨークネンシス（Lny）、クロストリジウム・アミノフィラム（Cam）、プレボテーラ属種（Psm）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Cca、ラクノスピラ細菌（Lba））、バージイエラ・ズーヘルカム（Bzo）、プレボテーラ・インターメディア（Pin）、プレボテーラ・ブッカエ（Pbu）、アリスティペス属種（Alistipes sp. ）（Asp）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ran）、プレボテーラ・オーランティアカ（Pau）、プレボテーラ・サッカロリティカ（Psa）、プレボテーラ・インターメディア（Prevotella intermedia）（Pin2）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Cca）、ポルフィロモナス・グラエ（Pgu）、プレボテーラ属種（Psp）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Pig）、プレボテーラ・インターメディア（Pin3）、エンテロコッカス・イタリクス（Ei）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ls）、またはサーマス・サーモフィルス（Tt）のうちの少なくとも1つに由来する。Cas13は、LbuCas13a、LwaCas13a、LbaCas13a、HheCas13a、PprCas13a、EreCas13a、CamCas13a、またはLshCas13aのうちの少なくとも1つである場合がある。

流体装置内の試料中の標的核酸を検出するための方法のワークフローは、試料調製、核酸増幅、プログラマブルヌクレアーゼとのインキュベーション、および/または検出（読み出し）を含むことができる。図1は、プログラマブルヌクレアーゼ反応のワークフローを示す概略図である。ワークフローに示される工程1は試料の調製であり、ワークフローに示される工程2は核酸の増幅である。ワークフローに示される工程3は、プログラマブルヌクレアーゼインキュベーションである。ワークフローに示される工程4は、検出（読み出し）である。必須ではない工程は、楕円形の円で示されている。インキュベーションおよびプログラマブルヌクレアーゼ活性の検出が同じチャンバ内でのものである場合、工程1および2は任意であり、工程3および4は同時に行うことができる。試料の調製および増幅は、本明細書に記載の流体装置内で行うことができ、あるいは、流体装置に導入する前に行うことができる。上述のように、任意の核酸増幅の試料調製は任意であり、除外することができる。さらなる場合では、プログラマブルヌクレアーゼ反応のインキュベーションおよび検出（読み出し）を、連続的に（順次）または同時に（同時に）行うことができる。いくつかの態様では、試料の調製および/または増幅を第1の流体装置内で行うことができ、次いで試料を第2の流体装置に移して、工程3および4、および任意で工程2を行うことができる。

本明細書で提供される組成物および方法に適合するワークフローおよびシステムは、ワンポット反応およびツーポット反応を含む。ワンポット反応では、増幅、逆転写、増幅と逆転写、または増幅とインビトロ転写、および検出を1つのチャンバ内で同時に行うことができる。言い換えれば、ワンポット反応では、逆転写、増幅、およびインビトロ転写の任意の組み合わせを検出と同じ反応で行うことができる。ツーポット反応では、逆転写、増幅、およびインビトロ転写の任意の組み合わせを第1の反応で実施し、第2の反応での検出が続く。ワンポットまたはツーポット反応は、本明細書に開示される装置のチャンバのいずれかで行うことができる。

試料調製のための流体装置は、濾過装置と呼ぶことができる。いくつかの態様では、試料調製のための濾過装置は、シリンジに類似しているか、またはシリンジと同様の機能要素を含む。例えば、試料調製のための濾過装置の機能要素は、液体試料を回収するための狭い先端を含む。液体試料は、血液、唾液、尿、または任意の他の体液を含むことができる。液体試料はまた、液体組織ホモジネートを含むことができる。液体試料を回収するための先端部は、ガラス、金属、プラスチック、または他の生体適合性材料から製造することができる。先端部は、流体装置の下流に添加される生物学的試料の量を計量する装置として機能し得るガラスキャピラリーと交換することができる。いくつかの試料、例えば血液の場合、キャピラリーは試料調製に必要な唯一の流体装置であり得る。試料調製のための濾過装置の別の機能要素は、このプロセスの下流のプログラマブルヌクレアーゼ反応に適合する溶解緩衝液を含む、nLからmLの体積を運ぶことができるチャネルを含み得る。チャネルは、金属、プラスチック、または他の生体適合性材料から製造されてもよい。チャネルは、糞便、頬、または他の生物学的試料収集スワブ全体を保持するのに十分な大きさであり得る。濾過装置は、各タイプの試料中の細胞を溶解し、プログラマブルヌクレアーゼにアクセスできるように核酸を放出する試薬の溶液をさらに含み得る。溶液の活性成分は、カオトロピック剤、界面活性剤、塩であり得、高い浸透圧、イオン強度およびpHを有することができる。カオトロピック剤またはカオトロピックは、タンパク質、DNAまたはRNAなどの巨大分子の三次元構造を破壊する物質である。1つの例示的なプロトコールは、4Mグアニジニウムイソチオシアネート、25mMクエン酸ナトリウム、2H₂0、0.5％（w/v）ラウリルサルコシン酸ナトリウム、および0.1M β-メルカプトエタノールを含むが、様々な細胞標的用の多数の市販の緩衝液も使用することができる。アルカリ性緩衝液はまた、硬質シェルを有する細胞、特に環境試料に使用され得る。ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）などの界面活性剤を化学的溶解緩衝液に実施することもできる。細胞溶解はまた、前述の化学的に誘導された細胞溶解に加えて、物理的、機械的、熱的または酵素的手段によって実施され得る。装置は、試料のタイプに応じてより複雑な構築物、例えばナノスケールのバーブ（barb）、ナノワイヤ、装置の別個のチャンバ内の超音波処理能力、一体型レーザ、一体型ヒーター、例えばペルチェタイプヒーター、または薄膜平面ヒーター、および/または電気的溶解のためのマイクロキャピラリープローブを含み得る。本明細書に記載の任意の試料をこのワークフローで使用することができる。例えば、試料は、関心対象の状態について検査されている対象から採取された液体試料を含み得る。図2は、1のワークフロー概略図の工程1で使用され得る、試料調製のための例示的な流体または濾過装置を示す。この図に示される試料調製流体装置は、異なる種類の生物学的試料、すなわち、指先穿刺による血液、尿、または、糞便、頬もしくは他の収集物を含むスワブを処理することができる。

流体装置を使用して、図1の工程2～4（核酸増幅、プログラマブルヌクレアーゼ反応インキュベーション、検出（読み出し））のいずれか1つ、または任意の組み合わせを実行することができる。図3は、図1のワークフロー概略図の工程2～工程4で使用され得る、蛍光または電気化学的読み出しを含むプログラマブルヌクレアーゼ反応のための例示的な流体装置を示す。この図は、装置が図1のワークフロー概略図の工程2～4の3回の反復を実行することを示している。上部には、プログラマブルヌクレアーゼ反応インキュベーションおよび検出（読み出し）工程を行うが増幅は行わない、この流体装置の1つの変形例がある。中央は、増幅を伴う1チャンバ反応を含む、前記流体装置の別の変形例を示す。下部は、増幅を伴う2チャンバ反応を含む、流体装置のさらに別の変形例を示す。反応の検出に使用され得る蛍光および電気化学プロセスを要約した分解図を図4に示す。

流体装置は、複数のチャンバおよびチャンバの種類を含むことができる。流体装置は、試薬を含む試料を含有するように、かつ特定の種類の反応を引き起こす条件で構成された複数のチャンバを含むことができる。そのようなチャンバは、反応または反応種の検出を容易にするように（例えば、チャンバの内容物が外部蛍光光度計によって監視され得るように透明な表面を有することによって、または電位差分析が可能な電極を有することによって）設計することができる。流体装置は、増幅反応に適した条件（例えば、温度）で試料および試薬を収容するように設計され得る増幅チャンバを含むことができる。流体装置は、検出チャンバを含み得、それは、検出反応（例えば、比色反応またはDETECTR反応）に適した条件で試薬と共に試料を収容するように設計され得る。流体装置はまた、試薬を貯蔵または移送するように設計されたチャンバを含んでもよい。例えば、流体装置は、増幅反応（例えば、LAMP）のための試薬を保持するように設計された増幅試薬チャンバ、または種の存在または非存在を検出することができる反応（例えば、DETECTR反応）のための試薬を保持するように設計された検出試薬チャンバを含み得る。流体装置は、複数の目的のために構成されたチャンバを含むことができる（例えば、チャンバは、試薬の貯蔵、別々の2種類の反応のための2種類の試料の収容、および蛍光検出の容易のために構成されてもよい）。

流体装置は、チャンバまたは流体チャネルなどの流体装置内の内部空間に通じる試料投入口（「試料投入口」という用語は、本明細書では試料投入口ポートおよび試料回収ポートと交換可能に使用される）を含むことができる。試料投入口は、流体装置内のチャンバに通じることができる。試料投入口は封止可能であってもよい。試料投入口は、流体が試料投入口を通過するのを防止するように封止されてもよい。いくつかの場合では、試料投入口は、試料を送達するように設計された第2の装置の周りを封止し、したがって周囲環境から試料投入口を封止する。例えば、試料投入口は、スワブまたはシリンジの周りを封止することができる。試料投入口はまた、キャップ、または包含もしくは封止する他の機構を収容するように構成されてもよく、試料投入口は、屈曲可能な、または壊れやすい成分を含んでもよい。例えば、試料投入口は、試料挿入時に破損するシールを含んでもよい。いくつかの場合では、試料投入口内のシールは、破損時に試薬を放出する。試料投入口は、複数のチャンバまたは区画を含むことができる。例えば、試料投入口は、壊れやすいプラスチックシールによって分離された上部区画および下部区画を含むことができる。シールは、試料挿入時に破断し、内容物（例えば、溶解緩衝液または増幅緩衝液）を上部容器から下部容器に放出し、そこで試料と混合し、流体装置内の別個の区画（例えば、試料区画）に溶出することができる。

いくつかの態様では、流体装置は空気圧装置であり得る。空気圧装置は、1つまたは複数の空気圧バルブによって1つまたは複数の検出チャンバに接続された1つまたは複数の試料チャンバを備えてもよい。任意で、空気圧装置は、1つまたは複数の試料チャンバと1つまたは複数の検出チャンバとの間に1つまたは複数の増幅チャンバをさらに備えてもよい。1つまたは複数の増幅チャンバは、1つまたは複数の空気圧バルブによって、1つまたは複数の試料チャンバにおよび1つまたは複数の検出チャンバに接続されてもよい。空気圧バルブは、PDMSまたは任意の他の適切な材料から作製され得る。空気圧バルブは、チャンバを接続し、バルブが開いているときに流体がチャンバ間を通過することを可能にする、マイクロ流体チャネルに垂直なチャネルを含むことができる。いくつかの態様では、チャネルは、マイクロ流体チャネルに垂直なチャネルを通して空気圧を加えると下方に撓む。いくつかの態様では、流体装置はスライドバルブ装置であり得る。スライドバルブ装置は、1つまたは複数のチャネルを有するスライド層と、1つまたは複数の試料チャンバおよび1つまたは複数の検出チャンバを有する固定層とを備えることができる。任意で、固定層は、1つまたは複数の増幅チャンバをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、スライド層は上層であり、固定層は下層である。他の態様では、スライド層は下層であり、固定層は上層である。スライドバルブ装置は、試料チャンバの開口部と位置合わせされた開口部を有する側面チャネル、増幅チャンバの開口部と位置合わせされた開口部を有する側面チャネル、または検出チャンバの開口部と位置合わせされた開口部を有する側面チャネルのうちの1つまたは複数をさらに含むことができる。いくつかの態様では、側面チャネルは、チャンバ間の流体の移送を可能にするために混合チャンバに接続される。いくつかの態様では、スライドバルブ装置は、装置内の流体を混合、吸引、および分配するための空気圧ポンプを備える。

いくつかの態様では、流体装置はスライドバルブを含み得る。スライドバルブは、装置内の異なるチャネルまたは区画を接続する複数の位置を用いることが可能であり得る。いくつかの場合では、スライド装置は、複数の異なるチャネルまたは区画を同時に接続することができるチャネルの複数のセットを含む。例えば、10個の増幅チャンバ、10個の試薬チャンバ、および1個の試料チャンバを含む装置は、10個の別個のチャネルを介して試料チャンバを10個の増幅チャンバに接続する第1の位置、および10個の増幅チャンバを10個の試薬チャンバに別個に接続する第2の位置を用いることができるスライドバルブを含むことができる。スライドバルブは、装置またはコンピュータによる自動制御が可能であり得る。スライドバルブは、移送流体チャネルを含むことができ、移送流体チャネルは、第1のチャンバまたは流体チャネルに開口する第1の端部と、スライドバルブが第1の位置にあるときに遮断される第2の端部とを有することができ、スライドバルブが第2の位置にあるときに第1の端部を遮断し、第2の端部を第2のチャンバまたは流体チャネルに開口することができる。スライドバルブは、2つ以上のチャンバまたはチャネルから単一のチャンバまたはチャネルへの流れを組み合わせるように設計されてもよい。スライドバルブは、単一のチャンバまたはチャネルからの流れを2つ以上の別個のチャンバまたは流体チャネルに分配するように設計されてもよい。

チップ（流体装置とも呼ばれる）は、様々な異なる材料から製造することができる。使用され得る例示的な材料としては、ポリメタクリレート（PMMA）、環状オレフィンポリマー（COP）、環状オレフィンコポリマー（COC）、ポリエチレン（PE）、高密度ポリエチレン（HDPE）、ポリプロピレン（PP）などのプラスチックポリマー;ガラス;およびシリコンが挙げられる。チップの形質は、様々なプロセスによって製造することができる。例えば、形質は、（1）射出成形を使用してエンボス加工されても、（2）コンピュータ数値制御（CNC）マイクロマシニングを使用してマイクロ粉砕もしくはマイクロ彫刻されるか、または（CO2レーザ源による）非接触レーザ穿孔されてもよく、（3）付加製造、および/または（4）フォトリソグラフィ法であってもよい。チップは、チップの異なる部分を熱的に隔離する材料または材料の組み合わせを含むことができる（例えば、2つの流体チャネルまたは反応チャンバは、それらの間に介在する材料によって熱的に隔離され得る）。

設計は、複数のポンプによって作動される複数の入力ポートを含むことができる。例えば、設計は、図3にP1～P3と標識された3つのポンプによって動作する最大3つの入力ポートを含むことができる。ポンプは、低圧または高圧を使用する外部シリンジポンプによって動作させることができる。ポンプは、受動的かつ/または能動的（空気圧、圧電、点字ピン、電気浸透、音響、ガス透過、その他）であってもよい。

ポートは空気圧ポンプに接続されてもよく、空気またはガスをマイクロ流体チャネルに圧送して、流体装置への流体の注入を制御してもよい。少なくとも3つの貯蔵器を装置に接続することができ、それぞれが、（1）別個の流体装置で処理された精製核酸を含有する溶液であり得る試料、または生の試料（血液、唾液、尿、便、および/または痰）;（2）使用される方法に応じて変化する増幅マスターミックスであって、方法が、ループ介在等温増幅（LAMP）、鎖置換増幅（SDA）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、多置換増幅（MDA）、ローリングサークル増幅（RCA）、および核酸配列に基づく増幅（NASBA）、転写増幅（TMA）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（cHDA）、指数関数的増幅反応（EXPAR）、リガーゼ鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（HIP）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、または改良多置換増幅（IMDA）のいずれかを含み得る、増幅マスターミックス;および（3）1つまたは複数のプログラマブルヌクレアーゼおよびガイドオリゴヌクレオチドを含む、予め複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合物、の緩衝溶液を含有する。核酸増幅の方法はまた、異なるレベルでのインキュベーション温度のサイクルを含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）であってもよく、したがって等温として定義されない。多くの場合、核酸増幅のための試薬は、リコンビナーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、一本鎖DNA結合（SSB）タンパク質、およびポリメラーゼを含む。場合により、試料の核酸増幅は、標的核酸を検出する際のアッセイの感受性、特異性、または精度の少なくとも1つを改善する。いくつかの場合では、核酸増幅は、支持媒体上の核酸増幅領域において行われる。代わりに、または組み合わせて、核酸増幅を試薬チャンバ内で行い、得られた試料を支持媒体に適用する。場合により、核酸増幅は等温核酸増幅である。ガイドを含むヌクレアーゼ（プログラマブルヌクレアーゼ）とレポータープローブとの複合体形成は、チップから離れて起こり得る。最終反応生成物を出力するための追加のポートが流体経路の端部に示されており、P1～P3について記載されたものと同様のポンプによって作動される。したがって、反応生成物は、さらなるプロセシングおよび/または特性評価、例えば配列決定のために回収することができる。

装置は、複数のチャンバ、流体チャネルおよびバルブを含むことができる。装置は、複数の種類のチャンバ、流体チャネル、バルブ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。装置は、異なる数のチャンバ、流体チャネルおよびバルブを含むことができる。例えば、装置は、1つの試料チャンバ、試料チャンバを10個の別個の増幅反応チャンバに接続する回転バルブ、および10個の増幅反応チャンバから30個の別個の検出チャンバへの流れを制御する2つのスライドバルブを含むことができる。回転バルブは、2つ以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。回転バルブは、3つ以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。回転バルブは、4つ以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。回転バルブは、5つ以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。回転バルブは、8つ以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。回転バルブは、10個以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。回転バルブは、15個以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。回転バルブは、20個以上のチャンバまたは流体チャネルを接続することができる。

流体装置は、複数のチャネルを含むことができる。流体装置は、複数の寸法および特性を含む複数のチャネルを含むことができる。流体装置は、同一の長さを有する2つのチャネルを含むことができる。流体装置は、同一の抵抗性を提供する2つのチャネルを含むことができる。流体装置は、2つの同一のチャネルを含むことができる。

流体装置は、ミリチャネルを含むことができる。ミリチャネルは、100～200mmの幅を有し得る。ミリチャネルは、50～100nmの幅を有し得る。ミリチャネルは、20～50nmの幅を有し得る。ミリチャネルは、10～20nmの幅を有し得る。ミリチャネルは、1～10nmの幅を有し得る。流体装置は、マイクロチャネルを含むことができる。マイクロチャネルは、800～990μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、600～800μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、400～600μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、200～400μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、100～200μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、50～100μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、30～50μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、20～30μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、10～20μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、5～10μmの幅を有し得る。マイクロチャネルは、1～5μmの幅を有し得る。流体装置は、ナノチャネルを含むことができる。ナノチャネルは、800～990nmの幅を有し得る。ナノチャネルは、600～800nmの幅を有し得る。ナノチャネルは、400～600nmの幅を有し得る。ナノチャネルは、200～400nmの幅を有し得る。ナノチャネルは、1～200nmの幅を有し得る。チャネルは、同等の高さおよび幅を有し得る。チャネルは、高さよりも広い幅、または高さよりも狭い幅を有することができる。チャネルは、その高さの1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、500、1000倍またはそれ以上の幅を有することができる。チャネルは、その高さの0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.25、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001倍の幅を有することができる。チャネルは、その高さの0.001倍未満の幅を有することができる。チャネルは、不均一な寸法を有することができる。チャネルは、その長さに伴い、異なる点において異なる寸法を有することができる。チャネルは、2つ以上の別個のチャネルに分配することができる。チャネルは、直線であってもよく、または屈曲、曲線、回転、角度、もしくは非線形形状の他の形質を有してもよい。チャネルは、ループまたは複数のループを含むことができる。

流体装置は、抵抗チャネルを含むことができる。抵抗チャネルは、流体装置内の他のチャネルと比較して流速が遅いチャネルであってもよい。抵抗チャネルは、流体装置内の他のチャネルと比較して体積流量が低いチャネルであってもよい。抵抗チャネルは、流体装置内の他のチャネルと比較して、試料の流れに対してより大きな抵抗を与えることができる。抵抗チャネルは、試料逆流を防止または制限することができる。抵抗チャネルは、乱流を制限することによって、装置内の複数の試料間の交差汚染を防止または制限することができる。抵抗チャネルは、流体装置内の流れの安定性に寄与することができる。抵抗チャネルは、流体装置の複数の部分間における流速の不同性を制限することができる。抵抗チャネルは、装置内の流速を安定させ、経時的な流速変動を最小限に抑えることができる。

流体装置内の液体の流れは、複数のマイクロバルブによって制御され得る。例えば、この流体装置内の液体の流れは、図3ではV1～V4と標識された最大4つのマイクロバルブを使用して制御され得る。これらのバルブは、界面動電マイクロバルブ、空気圧マイクロバルブ、真空マイクロバルブ、キャピラリーマイクロバルブ、ピンチマイクロバルブ、相変化マイクロバルブ、バーストマイクロバルブであり得る。

P1～P4の各々からの流体チャネルへの流れ、および流体チャネルからの流れは、V1～V4と標識されたバルブによって制御される。ポートに圧送される液体の体積は、装置の全体サイズに応じてnLからmLまで変動し得る。

図3に示す装置2.1版では、増幅は必要とされない。試料および予め複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合物をP1およびP2にそれぞれ添加した後、試薬は蛇行チャネルS1中で混合され得、それは次いで、混合物が必要な温度および時間でインキュベートされ得るチャンバC1へ至る。読み出しは、図4に記載されているC1で同時に行うことができる。C1の熱調節は、例えばカプトンまたは他の類似の材料から製造され、比例積分微分（PID）によって制御される薄膜平面ヒーターを使用して実施することができる。

図3に示される装置2.2版では、試料、増幅混合物および予め複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合物をP1、P2およびP3にそれぞれ添加した後、試薬は蛇行チャネルS1中で混合され得、それは次いで、使用される方法の条件に従って、混合物が効率的な増幅に要求される温度および必要な時間でインキュベートされるチャンバC1に至る。読み出しは、図4に記載されているC1で同時に行うことができる。熱調節は、前述のように達成することができる。

図3に示す装置2.3版では、増幅およびプログラマブルヌクレアーゼ反応は別々のチャンバ内で起こる。予め複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合物は、C1からポンプP3を使用して増幅混合物中へ圧送される。液体の流れは、バルブV3によって制御され、蛇行ミキサーS2に導入され、その後、必要な温度、例えば37°Cで90分間のインキュベーションのためにチャンバC2に導入される。

検出工程（図1のワークフロー図の工程4として示される）の間、Cas-gRNA複合体は、増幅された試料からのその適合する核酸標的に結合し、非特異的ヌクレアーゼへと活性化され、これは核酸ベースのレポーター分子を切断して信号読み出しを生成する。適合する核酸標的の非存在下では、Cas-gRNA複合体は核酸ベースのレポーター分子を切断しない。Cas反応のリアルタイム検出は、（1）蛍光、（2）電気化学的検出、および（3）電気化学発光の3つの方法によって達成することができる。3つの方法すべてを以下に説明し、これらのプロセスの概略図を図4に示す。信号の検出は、非限定的な例として、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電である信号を検出することができる複数の方法によって達成することができる。

図4は、（a）蛍光読み出しおよび（b）電気化学的読み出しを含む、流体装置（例えば、図3の流体装置）と組み合わせて使用され得る読み出しプロセスの概略図を示す。切断されたレポーターオリゴヌクレオチドの放出された蛍光は、検出およびインキュベーションチャンバの真上に配置された蛍光光度計を使用して監視され得る。蛍光光度計は、市販の機器、携帯電話もしくはスマートフォンの光学センサー、または蛍光励起手段、例えばCO₂、他、レーザおよび/もしくは発光ダイオード（LED）、ならびに蛍光検出手段、例えばフォトダイオードアレイ、フォトトランジスタ、その他を含む特注の光学アレイであってもよい。装置は、光がチャンバに出入りすることを可能にする透明または半透明の材料を含むチャンバを含むことができる。

蛍光検出および励起は多重化されてもよく、例えば、蛍光検出は、インキュベーションおよび検出チャンバ（C1またはC2）内で複数のフルオロフォアを励起および検出することを含む。蛍光光度計自体は、異なる波長で光を検出および励起する多重チャネルであってもよく、または複数の蛍光光度計をタンデムで使用してもよく、インキュベーションおよび検出チャンバ（C1およびC2）の上方のそれらの位置を、マイクロまたはマクロ制御装置およびアクチュエータ（電気、電子、および/または圧電）を使用する電動機構などの機械的手段によって変更することができる。

インキュベーションおよび検出チャンバ（C1またはC2）内で一体化された作用電極、対電極および参照電極を使用する、2つの電気化学的検出の変形例が本明細書に記載されている。

信号の増加。プログラマブルヌクレアーゼによって触媒される切断反応の進行は、ストレプトアビジン-ビオチン結合反応を使用して検出することができる。検出およびインキュベーションチャンバの上面は、ビオチン部分とコンジュゲートした核酸分子（ssRNA、ssDNAまたはssRNA/DNAハイブリッド分子）で機能化されてもよい。検出およびインキュベーションチャンバの底面は、炭素、グラフェン、銀、金、白金、ホウ素ドープダイヤモンド、銅、ビスマス、チタン、アンチモン、クロム、ニッケル、スズ、アルミニウム、モリブデン、鉛、タンタル、タングステン、鋼、炭素鋼、コバルト、インジウムスズ酸化物（ITO）、酸化ルテニウム、パラジウム、銀コーティング銅、カーボンナノチューブ、または他の金属から製造（またはスクリーン印刷）された作用領域、参照領域、および対領域を含む電極として動作する。検出およびインキュベーションチャンバの底面を、ストレプトアビジン分子でコーティングしてもよい。ビオチン分子が存在しない場合、接続された電気化学分析装置（市販品、または特注品）によって測定される電流は低い。予め複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼが検出およびインキュベーションチャンバ内で増幅された標的流と混合し、より高い温度、例えば37°Cで活性化されると、一本鎖核酸（ssNA）リンカーの切断により、検出およびインキュベーションチャンバのストレプトアビジンコーティング底面に拡散し得るビオチン分子が放出される。ビオチンとストレプトアビジン分子との相互作用により、接続された電気化学分析装置によって電流の増加が読み取られる。

いくつかの場合では、レポーター切断は、電気化学信号（例えば、矩形波またはサイクリックボルタモグラムからの電位差測定信号）の強度を増加させ得る。レポーター切断は、レポーターにおける電気活性部分の拡散定数を増加することができ、これが電気化学信号の増加につながり得る。したがって、いくつかの場合では、電気化学信号は、トランス付帯的なレポーター切断の程度に比例して増加する。

いくつかのDETECTR実験は、切断されたレポーター濃度の小さな変化に感受性であり得、低濃度の標的核酸を検出または識別することを可能にする。電気化学的DETECTRアッセイ（電気化学的検出を用いるDETECTRアッセイ）は、100nM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、10nM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、1nM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、100pM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、10pM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、1pM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、100fM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、50fM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、10fM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。電気化学的DETECTRアッセイは、1fM未満の標的核酸を検出することが可能であり得る。いくつかの場合では、電気化学的検出は蛍光検出よりも高感度であり得る。いくつかの場合では、電気化学的検出によるDETECTRアッセイは、蛍光検出を用いるDETECTRアッセイよりも低い検出限界を有し得る。

いくつかの場合では、電気化学的DETECTR反応は、低いレポーター濃度を必要とし得る。いくつかの場合では、電気化学的DETECTR反応は、低いレポーター濃度を必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、10μM未満のレポーターを必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、1μM未満のレポーターを必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、100nM未満のレポーターを必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、10nM未満のレポーターを必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、1nM未満のレポーターを必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、100pM未満のレポーターを必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、10pM未満のレポーターを必要とし得る。電気化学的DETECTR反応は、1pM未満のレポーターを必要とし得る。

濃縮を使用する他のタイプの信号増幅も、ビオチン-ストレプトアビジン励起とは別に使用され得る。非限定的な例は、（1）グルタチオン、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、（2）マルトース、マルトース結合タンパク質、（3）キチン、キチン結合タンパク質である。

信号の減少。プログラマブルヌクレアーゼ切断反応の進行は、検出およびインキュベーションチャンバの底面に固定化された核酸分子（ssRNA、ssDNAまたはssRNA/DNAハイブリッド分子）の個々のヌクレオチドにコンジュゲートされたフェロセン（Fc）、または他の電気活性メディエーター部分によって生成される電流の減少を記録することによって監視され得る。増幅された標的が存在しない場合、プログラマブルヌクレアーゼ複合体は不活性のままであり、電気活性部分によって発生する高電流が記録される。ガイドを有するプログラマブルヌクレアーゼ複合体が検出およびインキュベーションチャンバ内に流入し、適合する核酸によって37°Cで活性化されると、プログラマブルヌクレアーゼ複合体は、固定化されたFcコンジュゲート核酸分子を非特異的に分解する。この開裂反応は、電気活性分子の数を減少させ、したがって、記録される電流の減少につながる。

電気化学的検出を多重化することもできる。これは、インキュベーションおよび検出チャンバ（C1またはC2）内に1つまたは複数の作用電極を追加することによって達成される。電極は、単一の電気化学的検出方法について上述したように、平坦であってもよく、または改質されてもよい。

光学的読み出しと電気化学的読み出しとを組み合わせた方法における電気化学発光。光学信号は、化合物、例えば、ルテニウムビピリジン、［Ru（py）3］2＋などの電気活性生成物の酸化生成物として生成されるトリプロピルアミン（TPA）の発光によって生成され得る。

いくつかの異なるプログラマブルヌクレアーゼタンパク質は、（1）タンパク質のそれぞれについて、同じ試料と混合される別個の流体経路（チャネルの並列化）によって、または（2）それぞれ個々の液滴が別個の反応混合物を含む、デジタル（二相）マイクロ流体に切り替えることによって多重化され得る。液滴は、水および油のシングルまたはダブルエマルジョンから生成することができる。エマルジョンは、プログラマブルヌクレアーゼ反応と適合性であり、光学的に不活性である。

図5は、比色または電気化学的/血糖値測定器の読み出しを含む、結合したインベルターゼ/Cas反応のための例示的な流体装置を示す。この図は、酵素インベルターゼと結合したCas反応を縮小化するための流体装置を示す。表面改質、ならびに（a）DNSまたは他の化合物を使用した光学的読み出し、および（b）電気化学的読み出し（電気化学分析器または血糖値測定器）を含む読み出しプロセスは、下部の分解図スキームに示されている。Cas反応と酵素インベルターゼ（EC 3.2.1.26）、またはスクラーゼまたはβ-フルクトフラノシダーゼとの連動が本明細書に記載される。この酵素は、スクロースのフルクトースおよびグルコースへの分解を触媒する。

以下の方法を使用して、Cas反応の読み出しをインベルターゼ活性に連動させることができる。

カメラ、スタンドアロン、または一体型携帯電話光学センサーを使用した比色法。フルクトースおよびグルコースの量を、比色反応に関連付ける。2つの例は、（a）3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）、および（b）ホルマザン色素チアゾリルブルーである。色の変化は、CCDカメラまたは携帯電話の画像センサーを使用して監視することができる。この方法では、図5に記載の流体装置の変形を使用する。変更は、C3上の蛍光光度計の代わりにカメラを使用することである。

従来の血糖値測定器、または電気化学分析装置を用いた、電流測定法。図3に記載の流体装置の変形、例えば、もう1つのインキュベーションチャンバC3の追加を使用することができる。さらなる工程を、チャンバC2で行われる反応スキームに追加する。チャンバ表面の上部は、酵素インベルターゼ（Inv）にコンジュゲートされた一本鎖核酸でコーティングされている。標的活性化プログラマブルヌクレアーゼ複合体は、C2においてオリゴ（ssRNA、ssDNAまたはssRNA/DNAハイブリッド分子）からインベルターゼ酵素を切断し、インベルターゼは、その後、ポンプP4によって注入され、バルブV4によって制御されるスクロースの加水分解を触媒するために使用可能である。混合物を蛇行ミキサーS3で混合し、チャンバC3で、生成されたグルコースを、前述のように比色分析により電気化学的に検出することができる。酵素グルコースオキシダーゼは、C3上の表面上で乾燥され、グルコースの過酸化水素およびD-グルコノ-δ-ラクトンへの酸化を触媒する。

様々な装置の多くは、本明細書に開示される方法および組成物を使用した標的核酸の検出に適合する。いくつかの態様では、装置は、本明細書に開示されるマイクロ流体装置のいずれかである。他の態様では、装置は、反応チャンバに接続されたラテラルフロー試験ストリップである。さらなる態様では、ラテラルフローストリップは、試料調製装置に接続されてもよい。

いくつかの態様では、流体装置は空気圧装置であり得る。空気圧装置は、1つまたは複数の空気圧バルブによって1つまたは複数の検出チャンバに接続された1つまたは複数の試料チャンバを備えてもよい。任意で、空気圧装置は、1つまたは複数の試料チャンバと1つまたは複数の検出チャンバとの間に1つまたは複数の増幅チャンバをさらに備えてもよい。1つまたは複数の増幅チャンバは、1つまたは複数の空気圧バルブによって、1つまたは複数の試料チャンバにおよび1つまたは複数の検出チャンバに接続されてもよい。空気圧バルブは、PDMSまたは任意の他の適切な材料から作製され得る。空気圧バルブは、チャンバを接続し、バルブが開いているときに流体がチャンバ間を通過することを可能にする、マイクロ流体チャネルに垂直なチャネルを含むことができる。いくつかの態様では、チャネルは、マイクロ流体チャネルに垂直なチャネルを通して空気圧を加えると下方に撓む。

いくつかの態様では、流体装置はスライドバルブ装置であり得る。スライドバルブ装置は、1つまたは複数のチャネルを有するスライド層と、1つまたは複数の試料チャンバおよび1つまたは複数の検出チャンバを有する固定層とを備えることができる。任意で、固定層は、1つまたは複数の増幅チャンバをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、スライド層は上層であり、固定層は下層である。他の態様では、スライド層は下層であり、固定層は上層である。いくつかの態様では、上層は、ポリメタクリレート（PMMA）、環状オレフィンポリマー（COP）、環状オレフィンコポリマー（COC）、ポリエチレン（PE）、高密度ポリエチレン（HDPE）、ポリプロピレン（PP）を含むプラスチックポリマー;ガラス;またはシリコンで作製される。いくつかの態様では、下層は、ポリメタクリレート（PMMA）、環状オレフィンポリマー（COP）、環状オレフィンコポリマー（COC）、ポリエチレン（PE）、高密度ポリエチレン（HDPE）、ポリプロピレン（PP）を含むプラスチックポリマー;ガラス;またはシリコンで作製される。スライドバルブ装置は、試料チャンバの開口部と位置合わせされた開口部を有する側面チャネル、増幅チャンバの開口部と位置合わせされた開口部を有する側面チャネル、または検出チャンバの開口部と位置合わせされた開口部を有する側面チャネルのうちの1つまたは複数をさらに備えてもよい。いくつかの態様では、側面チャネルは、チャンバ間の流体の移送を可能にするために混合チャンバに接続される。いくつかの態様では、スライドバルブ装置は、装置内の流体を混合、吸引、および分配するための空気圧ポンプを備える。

空気圧バルブ装置。本明細書に記載のDETECTR反応を実行するのに特によく適したマイクロ流体装置は、「振動バルブ」とも呼ばれる、空気圧バルブを含むものである。空気圧バルブは、例えば空気マニホールドからの空気の流れによって開閉され得る。空気圧バルブを開放すると、空気圧バルブを含むチャネルを下方に撓ませることができ、続いて空気圧バルブを含むチャネルの下のマイクロ流体チャネルを下方に撓ませ、封鎖することができる。これは、マイクロ流体チャネル内の流体の流れの停止につながり得る。空気マニホールドをオフにすると、振動バルブを備えるチャネルを通る空気の流れが止まり、振動バルブを備えるチャネルの下のマイクロ流体チャネルを「開放」すると、流体が流れることができる。いくつかの態様では、空気圧バルブを含むチャネルは、関心対象の流体を運ぶマイクロ流体チャネルの上または下にあってもよい。いくつかの態様では、空気圧バルブを含むチャネルは、関心対象の流体を運ぶマイクロ流体チャネルに対して平行または垂直であってもよい。空気圧バルブは、軟質シリコーン層を挟む2つの硬質熱可塑性層で作ることができる。

本明細書に開示される組成物および方法に適合性のあるレイアウトの一例を図55および図55に示す。いくつかの態様では、装置は試料チャンバおよび検出チャンバを含み、検出チャンバは空気圧バルブによって試料チャンバに流体接続され、検出チャンバは本開示の任意のプログラマブルヌクレアーゼを含む。任意で、装置はまた、試料チャンバから検出チャンバへの流体経路の間に存在し、空気圧バルブによって試料チャンバに接続され、さらに空気圧バルブによって検出チャンバに接続される増幅チャンバを含むことができる。いくつかの態様では、空気圧バルブは、PDMS、またはマイクロ流体バルブを形成するための任意の他の材料で作られる。いくつかの態様では、試料チャンバは、試料を挿入するためのポートを有する。スワブを用いて試料を挿入することができる。試料チャンバは、試料を溶解するための緩衝液を有することができる。試料チャンバは、チャンバと増幅または検出チャンバへの流体チャネルとの間にフィルターを有することができる。試料チャンバは、試料を挿入するための開口部を有していてもよい。試料は、試料チャンバ内で30秒～10分間インキュベートすることができる。空気マニホールドは、この点までオンであり得、空気を空気圧バルブを通して押し込み、試料チャンバと増幅または検出チャンバとの間の流体チャネルを閉じたまま維持する。この段階で、空気が空気圧バルブを通過しないように空気マニホールドをオフすることができ、マイクロ流体チャネルを開けさせて、試料チャンバから次のチャンバ（例えば、増幅チャンバまたは検出チャンバ）への流体の流れを可能にすることができる。増幅チャンバが存在する装置では、溶解された試料は、試料チャンバから増幅チャンバに流入する。そうでなければ、溶解された試料、試料チャンバから検出チャンバに流入する。この段階で、空気を空気圧バルブによって押し込み、マイクロ流体チャネルを封止するために空気マニホールドをオンに戻す。増幅チャンバは、試料中の標的核酸の増幅、および任意で逆転写のための様々な試薬を保持する。これらの試薬は、フォワードおよびリバースプライマー、デオキシヌクレオチドトリホスフェート、逆転写酵素、T7プロモーター、T7ポリメラーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。試料を増幅チャンバ内で5分～40分間インキュベートさせる。増幅され、任意で逆転写された試料は、上述のように空気マニホールドをオフにして、空気圧バルブによって空気流を停止して、マイクロ流体チャネルを開いて、検出チャンバに移動される。検出チャンバは、本明細書に開示される任意のプログラマブルヌクレアーゼ、標的核酸の一部に逆相補的な部分を有するガイドRNA、および本明細書に開示される任意のレポーターを含むことができる。いくつかの態様では、検出チャンバは、複数のガイドRNAを含み得る。複数のガイドRNAは同じ配列を有していてもよく、または複数のガイドRNAのうちの1つまたは複数が異なる配列を有していてもよい。いくつかの態様では、複数のガイドRNAは、複数のガイドRNAの第2のRNAとは異なる標的核酸の一部に逆相補的な部分を有する。複数のガイドRNAは、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、または少なくとも50個のガイドRNAを含み得る。試料が検出チャンバに移されると、DETECTR反応は、1分～20分間実施され得る。ガイドRNAの標的核酸へのハイブリダイゼーション時にプログラマブルヌクレアーゼが活性化され、レポーターを付随的に切断し始め、これは本開示の他の箇所に記載されるように、核酸、および切断の検出を可能にする1つまたは複数の分子を有する。検出チャンバは、信号を読み出すための装置と接続することができる。例えば、切断により生成される比色または蛍光信号の場合、検出チャンバは分光光度計または蛍光リーダーに連結され得る。電気化学信号が生成される場合、検出チャンバは、図60に示すように、読み出し装置（例えば、血糖値測定器）に接続された1～10本の金属リードを有することができる。図59は、本開示の空気圧バルブ装置のカートリッジの最上層の概略図を、適切な寸法を強調して示す。概略図は、2インチ×1.5インチの1つのカートリッジを示す。図60は、電気化学的寸法に適応させた、本開示の空気圧バルブ装置のカートリッジの変更された最上層の概略図を示す。この概略図では、3つの線が検出チャンバ（最も右側の4つのチャンバ）に示されている。これらの3本の線は、3電極システムを形成するために使い捨てカートリッジ内に共成形、3D印刷、または手動で組み立てられる配線（または「金属リード」）を表す。電極は、動作電極、カウンター電極、および基準電極と称される。電極をカートリッジにスクリーン印刷することもできる。使用される金属は、炭素、金、白金または銀であり得る。空気圧バルブ装置の主な利点は、装置の様々なチャンバを接続する空気圧バルブがチャンバからチャンバへの逆流を防止し、それにより汚染を低減することである。逆流の防止および試料汚染の防止は、本明細書に記載の用途にとって特に重要である。試料汚染は、偽陽性をもたらし得るか、または一般に標的核酸の検出限界を混乱させ得る。別の例として、本明細書に開示される空気圧バルブは、多重検出のための装置および方法に特に有利である。2つ以上の標的核酸がアッセイされる多重化アッセイでは、逆流および汚染が回避されることが特に重要である。多重化アッセイにおけるチャンバ間の逆流は、異なるガイド核酸または異なるプログラマブルヌクレアーゼの交差汚染をもたらし得、誤った結果をもたらし得る。したがって、逆流を最小化または完全に回避するように設計された空気圧バルブ装置は、本明細書に開示された検出方法を実行するために、他の装置レイアウトと比較して特に優れている。

図55は、DETECTRアッセイのための振動バルブ空気圧ポンプレイアウトを示す。図55Aは、空気圧バルブ装置の概略図を示す。ピペットポンプは、試料を吸引して分注する。空気マニホールドを空気圧ポンプに接続して、常閉バルブを開閉する。空気圧装置は、流体をある位置から次の位置に移動させる。空気圧の設計は、他の装置の設計と比較してチャネルクロストークが低減されている。図55Bは、図55Aに示す空気圧バルブ装置で使用するためのカートリッジの概略図を示す。バルブ構成が示されている。常閉バルブ（そのようなバルブの1つを矢印で示す）は、チャンバが使用されていないときに各チャンバをシステムの残りの部分から隔離するために、チャネルの上部にエラストマー封止を備える。空気圧ポンプは空気を使用して、カートリッジ内の必要なチャンバに流体を移動させるために必要に応じてバルブを開閉する。図56は、図55Aに示す空気圧バルブ装置のバルブ回路レイアウトを示す。（i）に示すように、すべてのバルブを閉じた状態で、試料を試料ウェルに入れる。試料を試料ウェルに溶解する。溶解された試料は、（ii）に示すように、第1の振動バルブを開くことによって試料チャンバから第2のチャンバに移され、ピペットポンプを用いて試料を吸引する。次いで、試料は、（iii）に示すように、第1の振動バルブを閉じ、第2の振動バルブを開くことによって第1の増幅チャンバに移され、そこで増幅混合物と混合される。試料は増幅混合物と混合した後、（iv）に示すように、第2の振動バルブを閉じ、第3の振動バルブを開くことによって、次のチャンバに移動させる。試料は、（v）に示されるように、第3の振動バルブを閉じ、第4の振動バルブを開くことによってDETECTRチャンバに移動される。試料は、（vi）に示すように、振動バルブの異なる系列を開閉することによって、チャンバの異なる系列を通って移動させることができる。所望のチャンバ系列内の個々のバルブの作動は、チャネル間の交差汚染を防止する。いくつかの態様では、スライドバルブ装置の表面積は、5cm×5cm、5×6cm、6×7cm、7×8cm、8×9cm、9×10cm、10×11cm、11×12cm、6×9cm、7×10cm、8×11cm、9×12cm、10×13cm、11×14cm、12×11cm、約30平方cm、約35平方cm、約40平方cm、約45平方cm、約50平方cm、約55平方cm、約60平方cm、約65平方cm、約70平方cm、約75平方cm、約25平方cm、約20平方cm、約15平方cm、約10平方cm、約5平方cm、1～100平方cm、5～10平方cm、10～15平方cm、15～20平方cm、20～25平方cm、25～30平方cm、30～35平方cm、35～40平方cm、40～45平方cm、45～50平方cm、5～90平方cm、10～0平方cm、15～5平方cm、20～10平方cm、または25～15平方cmである。

スライドバルブ装置。本明細書に記載のDETECTR反応を実行するのに特によく適したマイクロ流体装置は、スライドバルブ装置である。スライドバルブ装置は、スライド層および固定層を有することができる。スライド層が上部にあってもよく、固定層が下部にあってもよい。あるいは、スライド層が下部にあってもよく、固定層が上部にあってもよい。いくつかの態様では、スライドバルブはチャネルを有する。チャネルは、チャンバの開口部と相互作用する開口部を一端に有することができ、チャネルはまた、側面チャネルの開口部と相互作用する開口部を別の端に有することができる。いくつかの態様では、スライド層は2つ以上の開口部を有する。いくつかの態様では、固定層は、試料チャンバ、増幅チャンバ、および検出チャンバを含む。試料チャンバ、増幅チャンバ、および検出層はすべて、チャンバの底部に開口部を有することができる。例えば、試料チャンバは、試料を挿入するための開口部を有していてもよい。チャンバの開口部をチャネルの開口部に位置を合わせると、流体はチャンバからチャネル内に流れることができる。さらに、チャネルの開口部を続けて側面チャネルの開口部に位置を合わせると、流体はチャネルから側面チャネル内に流れることができる。側面チャネルは、混合チャンバ、または流体を混合するための機器（例えば、ピペットポンプ）が挿入されるポートとさらに流体接続することができる。開口部の位置合わせは、固定層の長さに沿ってスライドするように、スライド層を物理的に移動または自動的に作動させることで可能になり得る。いくつかの態様では、1つのチャンバから次のチャンバへの流体の流れを制御するために、上述の空気圧バルブを任意の位置でスライドバルブ装置に追加することができる。スライドバルブ装置はまた、複数の層を有することができる。例えば、スライドバルブは、2、3、4、5、6、7、8、9、10枚、またはそれ以上の層を有することができる。

図46は、DETECTRアッセイのレイアウトを示す。上部には、カートリッジと接続する空気圧ポンプが示されている。中央には、貯蔵器を有する最上層を示すカートリッジの上面図が示されている。下部には、試料を含むスライドバルブ、および左側の溶解チャンバを指す矢印が示され、右側に増幅チャンバ、さらに右側にDETECTチャンバが続く。図57は、スライドバルブ装置の概略図を示す。チャネルのオフセットピッチは、吸引および各ウェルへの別々の分注を可能にし、増幅チャンバと対応するチャンバとの間のクロストークを緩和するのに役立つ。図58は、図57に示すスライドバルブ装置を通る試料移動の図を示す。最初の閉位置（i）において、試料を試料ウェルに充填し、溶解する。次いで、スライドバルブを器具によって作動させ、適切な量をチャネルに分注するピペットポンプを使用して試料を各チャネルに充填する（ii）。試料は、スライドバルブを作動させることによって増幅チャンバに送達され、ピペットポンプで混合される（iii）。増幅チャンバからの試料は、各チャネルに吸引され（iv）、次いで、スライドバルブおよびピペットポンプを作動させることによって、各DETECTRチャンバに分注され、混合される（v）。いくつかの態様では、スライドバルブ装置の表面積は、5cm×8cm、5×6cm、6×7cm、7×8cm、8×9cm、9×10cm、10×11cm、11×12cm、6×9cm、7×10cm、8×11cm、9×12cm、10×13cm、11×14cm、12×11cm、約30平方cm、約35平方cm、約40平方cm、約45平方cm、約50平方cm、約55平方cm、約60平方cm、約65平方cm、約70平方cm、約75平方cm、約25平方cm、約20平方cm、約15平方cm、約10平方cm、約5平方cm、1～100平方cm、5～10平方cm、10～15平方cm、15～20平方cm、20～25平方cm、25～30平方cm、30～35平方cm、35～40平方cm、40～45平方cm、45～50平方cm、5～90平方cm、10～0平方cm、15～5平方cm、20～10平方cm、または25～15平方cmである。

ラテラルフロー装置。いくつかの態様では、本開示の装置は、チャンバおよびラテラルフローストリップを含む。図32～図33は、ラテラルフローストリップおよび対応する適切なレポーターの特に有利なレイアウトを示す。図32は、FAM分子（緑色のスタートで示す）に結合したビオチン-dT（ピンクの六角形で示す）へのDNAリンカーを含む改変Casレポーターを示す。図33は、改変Casレポーターを含む、Milenia HybridDetectストリップのレイアウトを示す。この特定のレイアウトは、偽陽性を最小限に抑えながら、陽性結果の場合により高い信号を生成することによって試験結果を改善する。このアッセイレイアウトでは、レポーターは、ビオチンと、核酸の1つに結合したフルオロフォアとを含む。核酸は、ビオチン分子、次いでフルオロフォアに直接コンジュゲートされ得るか、またはフルオロフォア、次いでビオチンに直接コンジュゲートされ得る。ビオチンの代わりに、本明細書に記載されるものを含む他の親和性分子を使用することができる。本明細書に開示されるフルオロフォアのいずれも、レポーターにおいて使用することもできる。レポーターは、溶液に懸濁され得るか、またはCasチャンバの表面に固定化され得る。あるいは、レポーターは、反応チャンバ中で磁気ビーズなどのビーズに固定化され得、それらは、チャンバの下に置かれる磁石によって定位置に保持される。レポーターが活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによって切断されると、切断されたビオチン-フルオロフォアは、ストレプトアビジン（または別の捕捉分子）を含む第1のラインに蓄積する。試料パッド上に存在し、チェイス緩衝液（chase buffer）を使用してストリップ上に流される金ナノ粒子は、抗フルオロフォア抗体でコーティングされ、第1ラインでの金ナノ粒子の結合および蓄積を可能にする。金ナノ粒子上にコーティングされた抗体（例えば、ウサギ、抗FAM）に対する抗体（例えば、抗ウサギ）でコーティングされたナノ粒子が、第2のラインにさらに蓄積する。陰性結果の場合、レポーターは切断されず、ラテラルフローストリップ上を流動しない。したがって、ナノ粒子は、第2のラインでのみ結合して蓄積する。ラテラルフローストリップでの多重化は、2つのレポーター（例えば、ビオチン-FAMレポーターおよびビオチン-DIGレポーター）を有することによって実施することができる。抗FAMおよび抗DIG抗体は、2つの異なる領域でラテラルフローストリップ上にコーティングされる。抗ビオチン抗体を金ナノ粒子上にコーティングする。フルオロフォアは、レポーターの核酸に続いてビオチン-dNTPを最初に生成し、次いでフルオロフォアをコンジュゲートすることによって、親和性分子（例えば、ビオチン）に直接コンジュゲートされる。いくつかの態様では、ラテラルフローストリップは、複数の層を含む。

いくつかの態様では、上記のラテラルフローストリップは、図7および図8に示すように、試料調製装置とさらに接続することができる。図7は、本開示の試料調製装置の個々の部品を示す。図のA部は、単一のチャンバ試料抽出装置を示す。（a）インサートは試料回収装置を保持し、試料の抽出と、別の反応または検出装置への試料の分注との間の工程を調整し、（b）単一のチャンバは抽出緩衝液を含む。図のB部は、分注される際に核酸をさらに精製する材料で分注チャンバを充填することが選択肢であることを示す。（a）インサートは試料回収装置を保持し、試料抽出および核酸増幅の「段階」を調整する。ノッチ（赤色、青色および緑色）の各セットは、先行するセットから90°オフセットされており、（b）反応モジュールは、独立した反応の発生を可能にする基材によって分離された複数のチャンバを含む。（例えば、i. 核酸分離チャンバ、ii. 核酸増幅チャンバ、およびiii. DETECTR反応チャンバまたは分注チャンバ）。各チャンバは、意図的に90°回転することなくインサートが次のチャンバに進行するのを防止するノッチ（黒色）を有する。最初の2つのチャンバは、抽出反応と増幅反応との間のインヒビターを除去する材料によって分離されてもよい。C部は、反応/分注チャンバの選択肢を示す:（a）単一の分注チャンバが、抽出された試料、または抽出/増幅もしくは抽出/増幅/DETECTR反応物のみを放出することができる、（b）二重の分注チャンバが、抽出/多重増幅生成物を放出することができる、（c）四重の分注チャンバが、多重増幅および単一のDETECTRまたは4つの単一増幅反応を可能にする。図8は、試料プロセシング装置を使用した、試料ワークフローを示す図である。試料回収装置が、試料プロセシング装置のインサートに結合される（A）。インサートは、装置チャンバに入れられ、最初に止まる（上部の下方タブが底部の上方タブと出会う）まで押圧される（B）。この工程により、試料を核酸抽出試薬と接触させることができる。適切な時間の後、インサートを90°回転し（C）、次のノッチのセットまで押し下げる（D）。これらの作用により、試料が増幅チャンバに移送される。試料回収装置は、もはや試料または増幅生成物と接触していない。適切なインキュベーションの後、インサートを90°回転し（E）、次のノッチのセットまで押し下げる（F）。これらの作用で、試料がDETECTRに放出される（グリーン反応）。インサートを再び90°回転させ（G）、押し下げて（H）反応物を分注する。

抵抗チャネル装置。いくつかの態様では、本開示の装置は、抵抗チャネル試料計量チャネル、流体の流れのためのバルブ、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。図126A、図126B、図127A、図127B、図128A、図128B、図128C、図128D、図129A、図129B、図129C、および図129Dは、DETECTR反応で使用するための前記マイクロ流体カートリッジの例を示す。いくつかの態様では、図130Aに示すように、カートリッジは、増幅チャンバと、増幅チャンバに流体接続されたバルブと、バルブに流体接続された検出反応チャンバと、検出チャンバに流体接続された検出試薬貯蔵器とを含むことができる。いくつかの態様では、装置は、図131Cに示すように、ルアースリップアダプタをさらに含んでもよい。ルアースリップアダプタを使用して、装置内への試料または試薬の送達のためのルアーロックシリンジに適合させることができる。マイクロ流体装置の1つまたは複数の構成要素（例えば、チャンバ、チャネル、バルブ、またはポンプ）は、マイクロ流体装置の1つまたは複数の他の構成要素に流体接続されてもよい。第1の構成要素は、流体が第1の構成要素と第2の構成要素との間を流れることができるように、第2の構成要素に流体接続されてもよい。第1の構成要素は、第3の構成要素を介して、流体が第3の構成要素を通過することによって第1の構成要素から第2の構成要素に流れることができるように第2の要素に流体接続されてもよい。例えば、検出試薬チャンバは、図130Aに示すように、抵抗チャネルを介して検出チャンバに流体接続されてもよい。

装置のチャンバ（例えば、増幅チャンバ、検出チャンバ、または検出試薬貯蔵器）は、1つまたは複数のチャネルによって1つまたは複数の追加のチャンバに流体接続されてもよい。いくつかの態様では、チャネルは、第1のチャンバと第2のチャンバとの間の流体の流れを調整するように構成された抵抗チャネルであってもよい。抵抗チャネルは、第1のチャンバと第2のチャンバとの間に非線形経路を形成することができる。それは、屈曲、回転、フィン、山形、ヘリンボーンまたは他の微細構造など、流れを制限または混乱させる形質を含むことができる。抵抗チャネルは、同等の長さおよび幅の直線チャネルと比較して、逆流を低減し得る。抵抗チャネルは、同等の長さおよび幅の直線チャネルと比較して、流体がチャネルを通過するためにより大きい圧力を必要とすることによって機能することができる。いくつかの態様では、抵抗チャネルは、同等の長さおよび幅の直線チャネルによって接続された2つのチャンバ間の交差汚染と比較して、抵抗チャネルによって接続された2つのチャンバ間の交差汚染の減少をもたらし得る。抵抗チャネルは、例えば図128A、図128B、図129C、および図129Dに示すように、角度のついた経路を有し得る。角度のついた経路は、チャネルを通過する流体の流れの方向に1つまたは複数の角度を含み得る。いくつかの態様では、角度のついた経路は直角部を含むことができる。いくつかの態様では、角度のついた経路は、約90°の角度を含むことができる。いくつかの態様では、角度のついた経路は、約45°～約135°の少なくとも1つの角度を含むことができる。いくつかの態様では、角度のついた経路は、約80°～約100°の少なくとも1つの角度を含むことができる。いくつかの態様では、角度のついた経路は、約85°～約95°の少なくとも1つの角度を含むことができる。抵抗チャネルは、例えば図128C、図128D、図129A、および図129Bに示すように、遠回り経路または蛇行経路を有することができる。遠回りまたは蛇行経路は、チャネルを通過する流体の流れの方向に1つまたは複数の屈曲を含み得る。いくつかの態様では、遠回りまたは蛇行経路は、約90°の屈曲を含むことができる。いくつかの態様では、遠回りまたは蛇行経路は、約45°～約135°の少なくとも1つの屈曲を含むことができる。いくつかの態様では、遠回りまたは蛇行経路は、約80°～約100°の少なくとも1つの屈曲を含むことができる。いくつかの態様では、遠回りまたは蛇行経路は、約85°～約95°の少なくとも1つの屈曲を含むことができる。いくつかの態様では、抵抗チャネルは、平面内に実質的に含有され得る（例えば、抵抗チャネルは、二次元で角のあるチャネル、遠回りチャネル、または蛇行するチャネルであり得る）。二次元抵抗チャネルは、本開示のマイクロ流体装置の実質的に単一層内に配置されてもよい。いくつかの態様では、抵抗チャネルは、三次元抵抗チャネルであってもよい（例えば、抵抗チャネルは、マイクロ流体装置のx、y、およびz次元で角のあるチャネル、遠回りチャネル、または蛇行するチャネルであり得る）。いくつかの態様では、抵抗チャネルの試料インプットは、抵抗チャネル、抵抗チャネルに接続されたチャンバ、またはその両方と同じ平面（例えば、z方向に同じレベルで）内にあってもよい。いくつかの態様では、抵抗チャネルの試料インプットは、抵抗チャネル、抵抗チャネルに接続されたチャンバ、またはその両方と異なる平面（例えば、z方向に異なるレベルで）内にあってもよい。抵抗チャネルの例を図133に示す。いくつかの態様では、抵抗チャネルは、約300μmの幅を有し得る。いくつかの態様では、抵抗チャネルは、約10μm～約100μm、約50μm～約100μm、約100μm～約200μm、約100μm～約300μm、約100μm～約400μm、約100μm～約500μm、約200μm～約300μm、約200μm～約400μm、約200μm～約500μm、約200μm～約600μm、約200μm～約700μm、約200μm～約800μm、約200μm～約900μm、または約200μm～約1000μmの幅を有し得る。

いくつかの態様では、チャネルは、試料計量チャネルあり得る。試料計量チャネルは、第1のチャンバと第2のチャンバとの間に経路を形成し、流体の設定体積を保持して、第1のチャンバから第2のチャンバに移送される流体の体積を計量するように構成されたチャネル体積を有することができる。試料計量経路は、第1のチャンバと第2のチャンバとの間の経路を形成し、第1のチャネルから第2のチャネルへの所望の速度での流れを可能にするように構成されたチャネル容積を有することができる。計量はまた、液体試薬貯蔵リザーバとして作用する補助チャンバに加えられる正または負の圧力によって影響され得る。これは、低コスト用途のためのブリスターパックに空気を貯蔵することによって行うこともできる。試料計量チャネルの例を図133に示す。いくつかの態様では、試料計量チャネルの試料インプットは、試料計量チャネル、試料計量チャネルに接続されたチャンバ、またはその両方と同じ平面（例えば、z方向に同じレベルで）内に存在してもよい。いくつかの態様では、試料計量チャネルの試料インプットは、試料計量チャネル、試料計量チャネルに接続されたチャンバ、またはその両方と異なる平面（例えば、z方向に異なるレベルで）内に存在してもよい。試料計量チャネルの長さ、幅、体積、またはそれらの組み合わせは、第1のチャンバから第2のチャンバに所望の体積の流体を通過させるように設計されてもよい。試料計量チャネルの長さ、幅、体積、またはそれらの組み合わせは、第1のチャンバから第2のチャンバに所望の速度で流体を通過させるように設計されてもよい。いくつかの態様では、試料計量チャネルは、約300μmの幅を有し得る。いくつかの態様では、試料計量チャネルは、約10μm～約100μm、約50μm～約100μm、約100μm～約200μm、約100μm～約300μm、約100μm～約400μm、約100μm～約500μm、約200μm～約300μm、約200μm～約400μm、約200μm～約500μm、約200μm～約600μm、約200μm～約700μm、約200μm～約800μm、約200μm～約900μm、または約200μm～約1000μmの幅を有し得る。いくつかの態様では、第1のチャンバは、抵抗チャネルおよび試料計量チャネルを含むチャネルによって第2のチャンバに接続されてもよい。

抵抗チャネルの概略例を図133に示す。バルブシートは、約142μmの低い高さを有してもよく、バルブは、約2μLのデッドボリュームを有する。バルブを試料計量チャネルとは異なる平面上に配置して、シートの高さおよびデッドボリュームを最小限に抑え、封止を改善することができる。DETECTR試料計量投入口は、増幅された試料の進入または逆流を防止するために試料が異なる高さでチャネルに入るように、試料計量チャネルとは異なるレベルに配置され得る。試料計量チャネルは、高さ142μmおよび設置面積約0.142mm×0.75mm×46mmのチャネルと比較して、計量試料5μLを収容するために増加された約784μmの高さを、約0.784mm×0.75mm×8.25mmの設置面積で有し得る。DETECTR試料が異なるレベルで検出ウェルに入るように、DETECTR試料検出ウェル投入口を混合ウェルとは異なるレベルに配置して、断面積を減らし、逆流を低減することができる。

マイクロ流体装置、装置内（例えば、装置のチャンバ内）に試薬を受け入れるように構成された1つまたは複数の試薬ポートを含み得る。試薬ポートは、チャンバの壁に開口部を含むことができる。試薬ポートは、チャネルの壁またはチャネルの端部に開口部を含むことができる。試料を受け入れるように構成された試薬ポートは、試料投入口であり得る。試薬（例えば、緩衝液、溶液、または試料）は、試薬ポートを通じてマイクロ流体装置に導入することができる。試薬は、ユーザ（例えば、ヒトユーザ）によって手動で導入されてもよく、または試薬は、機器によって（例えば、検出マニホールドによって）自動で導入されてもよい。

本開示のカートリッジでは、様々なチャンバ形状を用いることができる。チャンバは、円形、例えば、図128Aおよび図128Cに示す増幅チャンバ、検出チャンバ、および検出試薬貯蔵器であってもよい。チャンバは、例えば、図128B、図128D、図129A、図129B、図129C、および図129Dに示す増幅チャンバおよび検出試薬貯蔵器など、細長いものであってもよい。

バルブは、第1のチャンバから1つまたは複数のさらなるチャンバへの流体の流れを防止、調整、または可能にするように構成することができる。いくつかの態様では、バルブは、第1の位置から第2の位置まで回転して、流体流路を阻止、許容、または変更することができる。いくつかの態様では、バルブは、第1の位置から第2の位置までスライドして、流体流路を阻止、許容、または変更することができる。いくつかの態様では、バルブは、バルブに加えられる圧力に基づいて開閉することができる。いくつかの態様では、バルブはエラストマーバルブであり得る。バルブは、能動的（機械的、非機械的、または外部作動）または受動的（機械的または非機械的）であり得る。バルブは、プッシュプル/ソレノイド作動バルブであってもよい。バルブは、電子的に制御され得る。例えば、ソレノイドを用いてバルブを制御してもよい。いくつかの態様では、バルブは手動で制御され得る。制御の他の機構は、磁気、電気、圧電、熱、双安定、電気化学、相変化、レオロジー、空気圧、チェックバルブまたはキャピラリーであり得る。いくつかの態様では、バルブは使い捨てであってもよい。例えば、マイクロ流体装置を再使用する場合にバルブをマイクロ流体装置から取り外し、新しいバルブと交換して汚染を防ぐことができる。いくつかの態様では、バルブは、バルブキャップまたはエラストマープラグによって覆われてもよい。

カートリッジは、増幅チャンバから検出チャンバに流体を圧送するための第1のポンプ、および検出試薬貯蔵器から検出チャンバに流体を圧送するための第2のポンプに接続するように構成されてもよい。当技術分野で知られている様々なポンプは、第1のチャンバから第2のチャンバに流体を移動させるように機能し、本開示のカートリッジと共に使用することができる。いくつかの態様では、カートリッジは、蠕動運動ポンプ、空気圧ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプと共に使用することができる。

マイクロ流体カートリッジの一例を図127Aおよび図127Bに示す。図127Aに示すように、カートリッジは、増幅チャンバと、約45μLの水性反応混合物を貯蔵することができ、ユーザが約5μLの試料を加える試料投入口ウェルとを含み得る。増幅チャンバは密閉されてもよい。ポンプ空気入口は、カートリッジを溶液制御用の外部の小容量低出力ポンプに接続する。オンボードカートリッジバルブは、加熱工程中および圧力上昇中に増幅混合物を収容するように構成されてもよい。カートリッジは、入ってくる増幅反応混合物を分割するための増幅混合物スプリッターを含み、ポンプが約5μLを検出チャンバに直接分注することを可能にする。二重検出チャンバは、疎水性PTFEベントで通気されて溶液の進入を可能にすることができ、画像化および検出のための透明な上部を有し、反応中に10分間37°Cに加熱され得る。いくつかの態様では、検出チャンバは、増幅された試料混合物が検出試薬貯蔵チャンバからの検出試薬と組み合わされた場合に検出チャンバを満たすようなサイズであってもよい。検出試薬貯蔵チャンバとも呼ばれるDETECTR反応混合物貯蔵ウェルは、カートリッジに搭載された約100μLの水性DETECTR混合物を貯蔵することができる。ポンプ空気入口は、カートリッジを溶液制御用の外部の小容量低出力ポンプに接続する。図127Bに示すように、カートリッジは、カートリッジ空気供給バルブを含むことができ、入口は、あふれ出しを防ぐために水性試薬の上にある。受動的試薬充填止め具は、曲がりくねった経路を形成し、静水学的ヘッドを有して、充填後に水溶液がカートリッジへ流入するのを受動的に防止する。オンボードエラストマーバルブは、65°Cに加熱された反応混合物からの圧力上昇下での前方流を防止し、低コストの、設置面積の小さいリニアアクチュエータによって作動される。

いくつかの態様では、装置は、図130Bに示すように、レーザエンボス加工でパターン化された多層積層カートリッジと、電子機器、光学部品、および機械が組み込まれたハードウェアとを備えてもよい。多層装置は、図131B（左）に示すように、二次元積層によって製造することができる。いくつかの態様では、装置は射出成形されてもよい。図131B（右）に示すように、射出成形装置を積層して装置を封止することができる。射出成形は、本開示のマイクロ流体装置の大量生産に使用することができる。

検出マニホールド。検出マニホールドを使用して、本開示の装置において本開示のDETECTRアッセイを実行および検出することができる。検出マニホールドは、本明細書ではカートリッジマニホールドまたは加熱マニホールドとも呼ばれ得る。検出マニホールドは、本開示のマイクロ流体装置で実行されるDETECTR反応を促進または検出するように構成され得る。いくつかの態様では、検出マニホールドは、マイクロ流体装置の1つまたは複数の領域を加熱するための1つまたは複数の加熱ゾーンを含むことができる。いくつかの態様では、検出マニホールドは、増幅反応が実行されるマイクロ流体装置の第1の領域を加熱するための第1の加熱ゾーンを含むことができる。例えば、第1のヒーターは、マイクロ流体装置の第1の領域を約60°Cまで加熱してもよい。いくつかの態様では、検出マニホールドは、検出反応が実行されるマイクロ流体装置の第2の領域を加熱するための第2の加熱ゾーンを含むことができる。例えば、第2のヒーターは、マイクロ流体装置の第2の領域を約37°Cまで加熱してもよい。いくつかの態様では、検出マニホールドは、溶解反応が実行されるマイクロ流体装置の第3の領域を加熱するための第3の加熱ゾーンを含むことができる。例えば、第3のヒーターは、マイクロ流体装置の第3の領域を約95°Cまで加熱してもよい。マイクロ流体カートリッジと共に使用するための、2つの断熱加熱領域を含む検出マニホールドの例を図131Aに示す。いくつかの態様では、検出マニホールドは、本開示のマイクロ流体装置の溶解領域を加熱するように構成された加熱ゾーンを含むことができる。溶解加熱ゾーン、増幅加熱ゾーン、および検出加熱ゾーンを含む検出マニホールドの例を図132Aおよび図132Bに示す。検出マニホールドは、溶解チャンバ、増幅チャンバ、および検出チャンバを含むマイクロ流体装置に適合するように構成することができる。

いくつかの態様では、検出マニホールドは、マイクロ流体装置の検出チャンバを照明するように構成された照明源を含むことができる。照明源は、狭スペクトル照明（例えば、LED）を放射するように構成されてもよく、または照明は、広域スペクトル照明（例えば、アークランプ）を放射するように構成されてもよい。検出マニホールドは、所望の照明波長をフィルタリングするための、1つまたは複数のフィルターまたは回析格子をさらに含むことができる。いくつかの態様では、照明源は、マイクロ流体装置の上面を通して検出チャンバ（例えば、DETECTR反応を含むチャンバ）を照明するように構成されてもよい。いくつかの態様では、照明源は、マイクロ流体装置の側面を通して検出チャンバを照明するように構成されてもよい。いくつかの態様では、照明源は、マイクロ流体装置の底面を通して検出チャンバを照明するように構成されてもよい。いくつかの態様では、検出マニホールドは、DETECTR反応によって生成された信号を検出するためのセンサーを含み得る。信号は、蛍光信号であり得る。例えば、検出マニホールドは、カメラ（例えば、電荷結合素子（CCD）、相補型金属酸化膜半導体（CMOS））またはフォトダイオードを含み得る。検出マニホールドの概略図例を図136Aおよび図136Bに示す。検出マニホールド内で照明される検出の例を図137Aに示す。

検出マニホールドは、温度、ポンプ、バルブ、照明源、またはセンサーのうちの1つまたは複数を制御するように構成された電子機器を含むことができる。いくつかの態様では、電子機器は、プログラムを使用して自律的に制御され得る。例えば、電子機器は、本開示のワークフロー（例えば、図134で提供されるワークフロー）を実施するために自律的に制御されてもよい。電子機器レイアウトの概略図例を図135に示す。電子機器は、電力制御、温度フィードバック、またはPIDループのうちの1つまたは複数を使用して、1つまたは複数のヒーターを制御することができる。ポンプ、バルブ（例えば、ソレノイド制御バルブ）、またはLED（例えば、青色LED）のうちの1つまたは複数を、電力変換器（例えば、3V、12V、または9Vの電力変換器）または電源リレーボードのうちの1つまたは複数によって制御することができる。ロジックボードを使用して、検出マニホールドの1つまたは複数の構成要素を制御することができる。検出マニホールドは、1つまたは複数の構成要素（例えば、LED、ヒーター、ポンプ、またはバルブ）の状態を示す1つまたは複数のインジケータ灯を含み得る。このセクションに記載された装置は、本明細書に開示された任意の他の特徴（例えば、空気圧バルブ、スライドバルブの使用によって動作する構成要素、または本明細書に開示される装置の任意の他の一般的な特徴）と組み合わせることができる。

装置の一般的な特徴。いくつかの態様では、本開示の装置は、2個以上の増幅チャンバを保持することができる。いくつかの態様では、本開示の装置は、10個以上の検出チャンバを保持することができる。いくつかの態様では、本開示の装置は、試料溶解、標的核酸増幅、逆転写、および検出がすべて実行される単一のチャンバを含む。いくつかの場合では、異なる緩衝液が異なるチャンバに存在する。いくつかの態様では、本開示の装置のすべてのチャンバが同じ緩衝液を有する。いくつかの態様では、試料チャンバは溶解緩衝液を含み、増幅および検出チャンバ内のすべての材料は凍結乾燥またはガラス化される。いくつかの態様では、試料チャンバは、本明細書に開示される試料を溶解するための任意の緩衝液を含む。増幅チャンバは、標的核酸の増幅および/または逆転写に適合する、本明細書に開示される任意の緩衝液を含むことができる。検出チャンバは、本明細書に開示されるか、そうでなければDETECTR反応の実行を可能にすることができる任意のDETECTRまたはCRISPR緩衝液（例えば、Mバッファー）を含むことができる。この場合では、試料溶解が起こると、体積は、試料チャンバから、他のチャンバ内の材料を再水和させるのに十分な量で他のチャンバに移動される。いくつかの態様では、装置は、液体を吸引し、混合し、分注するためのピペットポンプを一端にさらに含む。いくつかの態様では、自動化された器具を使用して液体の吸引、混合、および分注を制御する。いくつかの態様では、装置内の流体をチャンバからチャンバへと移動させるための、または試料の混合を起こすための他の機器は必要ではない。本開示の装置は、COC、ポリマーCOP、テフロン、または別の熱可塑性材料など、任意の適切な熱可塑性材料で作製することができる。あるいは、装置はガラス製であってもよい。いくつかの態様では、検出チャンバは、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）などのビーズを含み得る。いくつかの態様では、レポーターはビーズ上に固定化される。いくつかの態様では、ビーズからの切断後、遊離されたレポーターは二次検出チャンバに流入し、そこで生成された信号の検出が、本明細書に開示される機器のいずれか1つによって行われる。いくつかの態様では、検出チャンバは浅いが、光学的検出のために最適化された大きな表面積を有する。本開示の装置はまた、熱調節器に結合されてもよい。例えば、装置は、装置を高温まで加熱することができる平面ヒーターの上に存在するか、またはそれに隣接していてもよい。あるいは、熱を伝導する金属ロッドが装置の内部に挿入され、軟質ポリマーを押圧する。熱は、ポリマーを通って試料に放散することによって試料に伝達される。これにより、金属ロッドと試料との間の直接接触による試料の加熱が可能になる。いくつかの態様では、試料を溶解するための緩衝液に加えて、またはその代わりに、試料チャンバは、試料溶解用の超音波装置を含み得る。試料を運ぶスワブを試料チャンバに直接挿入することができる。一般に、血液、尿、または唾液試料を運ぶことができる頬スワブを使用することができる。本明細書に開示される装置のチャンバのいずれかにフィルターを含めて、試料を方法の次の工程に試料を運ぶ前に濾過してもよい。本明細書に開示される装置のいずれも、DETECTR反応の様々な工程の前に試料をさらに操作するための、追加の試料調製モジュールに接続され得る。いくつかの態様では、レポーターは、検出チャンバ内の溶液中に存在し得る。他の態様では、レポーターを検出チャンバの表面に直接固定化することができる。表面は、チャンバの上部または底部であり得る。さらに他の態様では、レポーターをビーズの表面に固定化することができる。ビーズの場合、切断後、検出可能な信号は、ビーズが捕捉されたままで次のチャンバへと洗い流されることができ、したがって、検出可能な信号のビーズからの分離が可能になる。あるいは、ビーズの表面からのレポーターの切断は、測定されるのに十分強い検出可能な信号を生成するのに十分である。上記のレポーターを分離または固定化することにより、DETECTR反応を行う本明細書に開示される装置においてレポーターの安定性を改善することができる。上記の装置のいずれも、比色、蛍光、電流測定、電位差測定、または別の電気化学信号に適合することができる。いくつかの態様では、比色、蛍光、電流測定、電位差測定、または別の電気化学サインは、検出チャンバに接続された測定装置（例えば、蛍光測定装置、分光光度計、オシロスコープ）を使用して検出することができる。

いくつかの態様では、信号自体を、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）などの酵素の使用によって増幅することができる。いくつかの態様では、4:1の比で結合するビオチンおよびアビジン反応を使用して、複数の酵素または二次信号分子（例えば、それぞれビオチン上の二次信号分子の4つの酵素）を単一のタンパク質（例えば、アビジン）に固定することができる。いくつかの態様では、電気化学信号は、電気化学的分子（例えば、ビオチン、フェロセン、ジゴキシゲニン、またはインベルターゼ）によって生成され得る。いくつかの態様では、上記の装置を追加の濃縮工程と組み合わせることができる。例えば、シリカ膜を使用して、カラムから核酸を捕捉し、前記フィルターの上にCas反応混合物を直接適用することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される装置のいずれか1つの試料チャンバは、20ul～1000ulの体積を保持することができる。いくつかの態様では、試料チャンバは、20～500、40～400、30～300、20～200、または10～100ulの体積を保持する。好ましい態様では、試料チャンバは200ulの体積を保持する。増幅および検出チャンバは、試料チャンバよりも低い容積を保持することができる。例えば、増幅および検出チャンバは、1～50、10～40、20～30、10～40、5～35、40～50、または1～30ulの体積を保持することができる。好ましくは、増幅および検出チャンバは、約200ulの体積を保持することができる。いくつかの態様では、エキソヌクレアーゼは、増幅チャンバ内に存在するか、または増幅チャンバに添加され得る。エキソヌクレアーゼは、標的ではない一本鎖核酸を浄化することができる。いくつかの態様では、エキソヌクレアーゼの存在下での標的核酸の分解を防ぐために、標的核酸のプライマーをホスホロチオエート化することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される装置のいずれかは、試料のpHを平衡させるためのpH平衡ウェルを有することができる。いくつかの態様では、上記の各装置において、レポーターは、全核酸（標的核酸＋非標的核酸）の少なくとも4倍超過で存在する。好ましくは、レポーターは、全核酸の少なくとも10倍超過で存在する。いくつかの態様では、レポーターは、全核酸の少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、1.5倍～100倍、4倍～80倍、4倍～10倍、5倍～20倍または4倍～15倍超過で存在する。いくつかの態様では、本明細書に開示される装置のいずれかは、少なくとも0.1aM、少なくとも0.1nM、少なくとも1nMまたは0.1aM～1nMの検出限界でDETECTR反応を行うことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される装置は、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％または100％の陽性予測値でDETECTR反応を行うことができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される装置は、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも99％、または100％の陰性予測値でDETECTR反応を行うことができる。いくつかの態様では、上記の装置における空間多重化は、装置内の少なくとも1つ、2つ以上、またはすべての検出チャンバに固有のガイド核酸を含ませることによって行われる。

ワークフロー。多くの異なるワークフローを使用して、マイクロ流体装置でDETECTR反応を実行することができる。いくつかの態様では、頬スワブ試料を測定するためのワークフローは、頬を拭き取ること、スワブを溶解溶液に添加すること、スワブをインキュベートして試料を溶解すること、溶解した試料を標的核酸の増幅のための試薬と組み合わせること、増幅した試料をDETCTR試薬と組み合わせること、および試料をインキュベートして標的核酸を検出することを含み得る。いくつかの態様では、溶解、増幅、および検出の1つまたは複数は、マイクロ流体装置（例えば、図126A～図126B、図127A～図127B、図128A～図128D、図129A～図129D、図130A、図133、図150、図151、または図157～図167に示すマイクロ流体カートリッジ）で実行され得る。いくつかの態様では、ワークフローは、検出マニホールド（例えば、図136A～図136B、図137B、図137C、図138A～図138B、図156、図168、または図172に示す検出マニホールド）を使用して標的核酸の有無を示す検出可能な信号を測定することを含み得る。

標的核酸を検出するためのワークフローの例を図134に示す。カートリッジに試料および反応溶液を充填してもよい。増幅チャンバを60°Cに加熱し、試料を増幅チャンバ内で30分間インキュベートしてもよい。増幅された試料が、DETECTR反応チャンバにポンプで圧送され得、DETECTR試薬が、DETECTR反応チャンバにポンプで圧送され得る。DETECTR反応チャンバは37°Cに加熱され得、試料は30分間インキュベートされ得る。DETECTR反応チャンバ内の蛍光をリアルタイムで測定して、定量的結果を生成することができる。

標的核酸（例えば、ウイルス標的核酸）を検出するためのワークフローの例は、対象の頬を拭き取ることを含み得る。スワブは、約200μLの低pH溶液に添加され得る。いくつかの態様では、スワブは、総体積が約220μLになるように溶液を置き換えることができる。スワブを低pH溶液中で約1分間インキュベートすることができる。いくつかの態様では、スワブ上に存在する細胞またはウイルスカプシドは、低pH溶液中で溶解され得る。試料の一部（5μL）を増幅チャンバ内で約45μLの増幅溶液と組み合わせてもよい。チャンバ内の総体積は、約50μLであってもよい。試料を増幅チャンバ内で約50°C～約65°Cの温度で最大約30分間インキュベートして、試料の標的核酸を増幅することができる。いくつかの態様では、増幅された試料のそれぞれ約5μLの2つのアリコートを2つの検出チャンバに導入し、そこでそれぞれ約95μLのDETECTR反応混合物と組み合わせることができる。増幅された試料を2つの検出チャンバの各々において約37°Cで最大約10分間、DETECTR反応混合物と共にインキュベートして、標的核酸の有無を検出することができる。

いくつかの態様では、マイクロ流体装置で実行されるDETECTR反応のためのワークフローは、ユーザによって実施され得る。ユーザは、対象から試料を回収し（例えば、頬スワブまたは鼻スワブ）、試料を溶解緩衝液に入れ、溶解した試料を本開示のマイクロ流体カートリッジに添加し、カートリッジを本開示の検出マニホールドに挿入することができる。いくつかの態様では、ユーザは、未溶解試料をマイクロ流体カートリッジに添加することができる。いくつかの態様では、DETECTR反応のためのワークフローは、本開示のマイクロ流体カートリッジにおいて実施され得る。マイクロ流体カートリッジは、試料中の標的核酸の溶解、増幅、または検出のうちの1つまたは複数を促進するために、1つまたは複数のチャンバ内に1つまたは複数の試薬を含んでもよい。いくつかの態様では、マイクロ流体装置で実行されるDETECTR反応のためのワークフローは、検出マニホールドによって促進され得る。検出マニホールドは、増幅反応、検出反応、またはその両方のための加熱制御、溶液移動制御（例えば、ポンプ制御またはバルブ制御）、照射、または検出のうちの1つまたは複数を提供することができる。

いくつかの態様では、マイクロ流体カートリッジで実行され、ユーザおよび検出マニホールドによって促進されるDETECTRのためのワークフローは、1）ユーザが1つまたは複数の試薬を含むカートリッジに試料を充填する工程、2）ユーザがカートリッジを検出マニホールドに挿入し、開始ボタンを押す工程、3）マニホールドがソレノイドを作動させて、増幅チャンバと検出チャンバとの間のバルブを閉じる工程、4）マニホールドインジケータLEDがオンになる工程、5）マニホールドが第1のヒーターをオンにして第1の加熱ゾーンを60°Cに加熱し、第2のヒーターをオンにして第2の加熱ゾーンを37°Cに加熱する工程、5）第1の加熱ゾーンで30分間増幅チャンバ内の試料をインキュベートして試料を増幅する工程、6）マニホールドが第1のヒーターをオフにする工程、7）マニホールドがソレノイドの動力源を絶ち、バルブを開ける工程、8）マニホールドが第1のポンプを15秒間オンにして、増幅された試料を検出チャンバへと圧送する工程、9）マニホールドが第1のポンプをオフにする工程、10）マニホールドが第2のポンプを15秒間オンにして、検出試薬を検出試薬貯蔵チャンバから検出チャンバに圧送する工程、11）マニホールドが第2のポンプをオフにする工程、12）増幅された試料および検出試薬を第2の加熱ゾーンで検出チャンバ内で30分間インキュベートして、検出反応を実行する工程、13）マニホールドインジケータLEDがオフになる工程、14）マニホールドが照明源をオンにして、検出反応によって生成された検出可能な信号を測定する工程を含み得る。

マイクロ流体装置、例えば図159に示すマイクロ流体装置で実行され得、検出マニホールド、例えば図168に示す検出マニホールドによって促進され得るワークフローの例は、1）バルブV1～V18が閉じており、ヒーター1がオフであり、かつヒーター2がオフである間に、試料を含むスワブをチャンバC2に添加する工程;2）スワブの端部を折り、装置の蓋を閉じる工程;3）バルブV1を開いてチャンバC1からチャンバC2への溶解溶液の流れを促進することによって、スワブを溶解溶液中に懸濁させる工程;4）バルブV2を開くことによってチャンバC2からチャンバC7～C10の各々に約20μLの溶解物を計量し、バルブV3～V6を開くことによってチャンバC3～C6からの内容物と混合する工程;5）すべての弁を閉じ、ヒーター1をオンにして、試料をチャンバC7～C10内で60°Cでインキュベートして、増幅する工程。6）ヒーター1をオフにし、約10μLのアンプリコンをチャンバC7～C10から（各チャンバから2×10μL）チャンバC19～C26の各々に計量し、バルブV7～V18を開くことによってチャンバC11～C18の各々からの内容物と合わせる工程;7）すべてのバルブを閉じ、ヒーター2をオンにして、試料を37°CでチャンバC19～C26内でインキュベートし、CRISPR検出反応を行う工程;8）工程7のインキュベート中に470nmで照射し、520nmで検出することによって、チャンバC19～C26内の試料を検出する工程を含み得る。

いくつかの態様では、マイクロ流体装置で実行されるワークフローは、試料を2つ以上のチャンバに分割することを含み得る。装置は、試料を複数の部分に分割するように構成され得る。装置は、分割された試料の2つの部分を別々の流体チャネルまたはチャンバに移送するように構成され得る。装置は、試料の複数の部分を複数の異なる流体チャネルまたはチャンバに移送するように構成され得る。装置は、分割された試料の個々の部分に対して反応を行うように構成され得る。装置は、試料を2つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を3つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を4つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を5つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を6つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を7つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を8つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を9つの部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を10の部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を12の部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を15の部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を少なくとも20の部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を少なくとも50の部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を100の部分に分割するように構成され得る。装置は、試料を500の部分に分割するように構成され得る。

装置は、試料の第1の部分に対して第1の反応を行い、分割された試料の第2の部分に対して第2の反応を行うように構成され得る。装置は、分割された試料のそれぞれの部分に対して異なる反応を行うように構成され得る。装置は、試料または試料の一部に対して順次反応を実行するように構成され得る。装置は、試料または試料の一部に対して、第1のチャンバ内の第1の反応および第2のチャンバ内の第2の反応を実行するように構成され得る。

装置は、試料を試薬と混合するように構成され得る。いくつかの場合では、装置は、試料および試薬を複数の区画間で前後に流すことによって、試料を試薬と混合する。いくつかの場合では、装置は、試料および試薬を単一の区画にカスケードすることによって（例えば、試料と試薬の両方を上方から区画に流すことによって）試料を試薬と混合する。いくつかの場合では、装置によって実行される混合方法は、気泡の形成を最小限に抑える。いくつかの場合では、装置によって実行される混合方法は、試料の損失または損傷（例えば、タンパク質沈殿）を最小限に抑える。

装置は、試料の複数の部分に対して複数の反応を実行するように構成され得る。いくつかの場合では、装置は、各々が試薬を含む複数のチャンバを含む。いくつかの場合では、チャンバを含む複数の試薬の中からの2つのチャンバは、異なる試薬を含む。いくつかの場合では、試料の第1の部分および第2の部分は、異なる反応に供され得る。いくつかの場合では、試料の第1の部分および第2の部分は、異なるレポーター分子の存在下で同じ反応に供され得る。いくつかの場合では、試料の第1の部分および第2の部分は、同じ検出方法に供され得る。いくつかの場合では、試料の第1の部分および第2の部分は、異なる検出方法に供され得る。いくつかの場合では、試料の複数の部分を別々に検出することができる（例えば、試料の各部分からの蛍光を個別に励起および検出するダイオードアレイによる）。いくつかの場合では、試料の複数の部分を同時に検出することができる。例えば、装置は、単一の試料を4つの部分に分割し、各部分で異なる増幅反応を行い、各増幅反応の生成物を2つの部分に分割し、各部分で異なるDETECTR反応を行い、各DETECTR反応の進行を個別に測定してもよい。

装置は、多数の異なる反応または一連の反応のために少量の試料を分配するように構成され得る。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために1ml未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために800μl未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために600μl未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために400μl未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために200μl未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために100μl未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために50μl未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために1mg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために800μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために600μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために400μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために200μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために100μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために50μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために20μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために10μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために1μg未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために800ng未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために600ng未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために400ng未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために200ng未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために100ng未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、装置は、複数の異なる反応または一連の反応のために50ng未満の試料を分配することができる。いくつかの場合では、試料は核酸を含み得る。いくつかの場合では、試料は細胞を含み得る。いくつかの場合では、試料はタンパク質を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、2つ以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、3つ以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、4つ以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、5つ以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、10以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、20以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、50以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、100以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、500以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応は、1000以上の異なる反応または一連の反応を含み得る。いくつかの場合では、第1の反応または一連の反応および第2の反応または一連の反応は、2つの異なる核酸配列を検出する。いくつかの場合では、複数の異なる反応または一連の反応の中からの各反応または一連の反応は、異なる核酸配列を検出する。例えば、装置は、200ngのDNA（例えば、頬スワブからの200ngのDNA）を含む単一の試料から40個の異なる核酸配列を検出するように設計された、40の異なる一連の反応を実施するように構成され得る。そのような場合では、40個の異なる核酸配列のそれぞれを使用して、試料中の特定のウイルスの存在を決定することができる。

いくつかの場合では、装置は工程を自動化するように構成される。いくつかの場合では、装置は試料分配工程を自動化する。いくつかの場合では、装置は反応工程を自動化する（例えば、試料を試薬と混合し、規定の長さの時間にわたって温度まで加熱することによって）。いくつかの場合では、装置は試料インプット後のすべての工程を自動化する。いくつかの場合では、装置は、単一のインプット試料に対する複数の反応を自動化することができる。いくつかの場合では、装置は、単一のインプット試料に対する複数の反応について自動化し、検出し、結果を提供することができる。いくつかの場合では、装置は、単一の試料に対する複数の反応について2時間未満で自動化し、検出し、結果を提供することができる。例えば、装置は、400ngのDNAを含む試料に対する100回の別個の増幅およびDETECTR反応を2時間未満で自動化し、検出し、次いで反応の結果を提供することができる。いくつかの場合では、装置は、単一の試料に対する複数の反応について1時間未満で自動化し、検出し、結果を提供することができる。いくつかの場合では、装置は、単一の試料に対する複数の反応について40分未満で自動化し、検出し、結果を提供することができる。いくつかの場合では、装置は、単一の試料に対する複数の反応について20分未満で自動化し、検出し、結果を提供することができる。いくつかの場合では、装置は、単一の試料に対する複数の反応について10分未満で自動化し、検出し、結果を提供することができる。いくつかの場合では、装置は、単一の試料に対する複数の反応について5分未満で自動化し、検出し、結果を提供することができる。いくつかの場合では、装置は、単一の試料に対する複数の反応について2分未満で自動化し、検出し、結果を提供することができる。

ウイルス感染を検出するためのマイクロ流体装置および検出マニホールド。本開示のマイクロ流体装置（例えば、図126A～図126B、図127A～図127B、図128A～図128D、図129A～図129D、図130A、図133、図151、図154、または図157～図167に示されるマイクロ流体装置）を使用して、生物学的試料中のインフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザAウイルスまたはインフルエンザBウイルス）の存在または非存在を検出することができる。インフルエンザウイルスの検出は、検出マニホールド（例えば、図136A～図136B、図137B、図137C、図138A～図138B、図156、図168、または図172に示す検出マニホールド）によって促進され得る。生物学的試料は、例えば鼻スワブまたは頬スワブを介して対象から収集され、マイクロ流体装置の増幅チャンバに導入され得る。チャンバは、溶解緩衝液、増幅試薬、またはその両方を含み得る。いくつかの態様では、生物学的試料は、増幅チャンバに導入する前に溶解緩衝液と接触させてもよい。いくつかの態様では、増幅試薬は、増幅試薬貯蔵チャンバから増幅チャンバに導入されてもよい。増幅試薬の導入は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって制御することができる。増幅試薬は、インフルエンザウイルスゲノムに存在する標的核酸を増幅するためのプライマーを含み得る。標的核酸が試料中に存在する場合、標的核酸を増幅することができる（例えば、TMA、HDA、cHDA、SDA、LAMP、EXPAR、RCA、LCR、SMART、SPIA、MDA、NASBA、HIP、NEARまたはIMDAによって）。第1のチャンバは、検出マニホールドによって加熱されてもよい。増幅された試料は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって検出チャンバに導入することができる。増幅された試料は、試料計量チャネルを通過することができる。検出試料は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって、検出試薬貯蔵チャンバから検出チャネルに導入することができる。検出試薬は、試料計量チャネル、抵抗チャネル、またはその両方を通過することができる。検出試薬は、プログラマブルヌクレアーゼ、標的核酸に向けられるガイド核酸、および標識されたディテクター核酸を含み得る。検出反応は、検出マニホールドを介して検出チャネルを加熱することによって検出チャネル内で行われてもよい。インフルエンザウイルスに関連する標的核酸の存在または非存在は、検出マニホールドを使用して検出チャネル内で検出され得る。インフルエンザウイルスの有無は、プログラマブルヌクレアーゼが標的核酸に結合したときにディテクター核酸を切断することによって生成される、検出可能な信号を測定することによって決定され得る。

本開示のマイクロ流体装置（例えば、図126A～図126B、図127A～図127B、図128A～図128D、図129A～図129D、図130A、図133、図151、図154、または図157～図167に示されるマイクロ流体装置）を使用して、生体試料中のコロナウイルス（例えば、SARS-CoV-2ウイルス、SARS-CoVウイルス、MERS-CoVウイルス、それらの組み合わせ、または任意のコロナウイルス株と1つまたは複数の他のウイルスもしくは細菌との組み合わせ）の有無を検出することができる。コロナウイルスの検出は、検出マニホールド（例えば、図136A～図136B、図137B、図137C、図138A～図138B、図156、図168、または図172に示す検出マニホールド）によって促進され得る。生物学的試料は、例えば鼻スワブまたは頬スワブを介して対象から収集され、マイクロ流体装置の増幅チャンバに導入され得る。チャンバは、溶解緩衝液、増幅試薬、またはその両方を含み得る。いくつかの態様では、生物学的試料は、増幅チャンバに導入する前に溶解緩衝液と接触させてもよい。いくつかの態様では、増幅試薬は、増幅試薬貯蔵チャンバから増幅チャンバに導入されてもよい。増幅試薬の導入は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって制御することができる。増幅試薬は、コロナウイルスゲノムに存在する標的核酸を増幅するためのプライマーを含み得る。標的核酸が試料中に存在する場合、標的核酸を増幅することができる（例えば、TMA、HDA、cHDA、SDA、LAMP、EXPAR、RCA、LCR、SMART、SPIA、MDA、NASBA、HIP、NEARまたはIMDAによって）。第1のチャンバは、検出マニホールドによって加熱されてもよい。増幅された試料は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって検出チャンバに導入することができる。増幅された試料は、試料計量チャネルを通過することができる。検出試料は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって、検出試薬貯蔵チャンバから検出チャネルに導入することができる。検出試薬は、試料計量チャネル、抵抗チャネル、またはその両方を通過することができる。検出試薬は、プログラマブルヌクレアーゼ、標的核酸に向けられるガイド核酸、および標識されたディテクター核酸を含み得る。検出反応は、検出マニホールドを介して検出チャネルを加熱することによって検出チャネル内で行われてもよい。コロナウイルスに関連する標的核酸の有無は、検出マニホールドを使用して検出チャネル内で検出され得る。コロナウイルスの有無は、プログラマブルヌクレアーゼが標的核酸に結合したときにディテクター核酸を切断することによって生成される、検出可能な信号を測定することによって決定され得る。

本開示のマイクロ流体装置（例えば、図126A～図126B、図127A～図127B、図128A～図128D、図129A～図129D、図130A、図133、図151、図154、または図157～図167に示されるマイクロ流体装置）を使用して、生物学的試料中の呼吸器合胞体ウイルスの存在または非存在を検出することができる。呼吸器合胞体ウイルスの検出は、検出マニホールド（例えば、図136A～図136B、図137B、図137C、図138A～図138B、図156、図168、または図172に示す検出マニホールド）によって促進され得る。生物学的試料は、例えば鼻スワブまたは頬スワブを介して対象から収集され、マイクロ流体装置の増幅チャンバに導入され得る。チャンバは、溶解緩衝液、増幅試薬、またはその両方を含み得る。いくつかの態様では、生物学的試料は、増幅チャンバに導入する前に溶解緩衝液と接触させてもよい。いくつかの態様では、増幅試薬は、増幅試薬貯蔵チャンバから増幅チャンバに導入されてもよい。増幅試薬の導入は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって制御することができる。増幅試薬は、呼吸器合胞体ウイルスゲノムに存在する標的核酸を増幅するためのプライマーを含み得る。標的核酸が試料中に存在する場合、標的核酸を増幅することができる（例えば、TMA、HDA、cHDA、SDA、LAMP、EXPAR、RCA、LCR、SMART、SPIA、MDA、NASBA、HIP、NEARまたはIMDAによって）。第1のチャンバは、検出マニホールドによって加熱されてもよい。増幅された試料は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって検出チャンバに導入することができる。増幅された試料は、試料計量チャネルを通過することができる。検出試料は、検出マニホールドを介してポンプ、バルブ、またはその両方を作動させることによって、検出試薬貯蔵チャンバから検出チャネルに導入することができる。検出試薬は、試料計量チャネル、抵抗チャネル、またはその両方を通過することができる。検出試薬は、プログラマブルヌクレアーゼ、標的核酸に向けられるガイド核酸、および標識されたディテクター核酸を含み得る。検出反応は、検出マニホールドを介して検出チャネルを加熱することによって検出チャネル内で行われてもよい。呼吸器合胞体ウイルスに関連する標的核酸の有無は、検出マニホールドを使用して検出チャネル内で検出され得る。呼吸器合胞体の有無は、プログラマブルヌクレアーゼが標的核酸に結合したときにディテクター核酸を切断することによって生成される、検出可能な信号を測定することによって決定され得る。

キット
標的核酸の検出に使用するためのキット、流体装置、およびシステムが本明細書で開示される。いくつかの態様では、キットは、試薬および支持媒体を含む。試薬は、試薬チャンバ内または支持媒体上に提供され得る。あるいは、キットを用いて、個人が試薬チャンバまたは支持媒体に試薬を入れてもよい。任意で、キットは、緩衝液およびスポイトをさらに含む。試薬チャンバは、試験ウェルまたは容器である。試薬チャンバの開口は、支持媒体を収容するのに十分な大きさであり得る。緩衝剤は、分注を容易にするためにスポイトボトル内に提供されてもよい。スポイトは使い捨てであり、一定量を移送することができる。スポイトを使用して、試料を試薬チャンバ内または支持媒体上に配置することができる。

いくつかの場合では、標的核酸を検出するためのキットは、支持媒体;標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的核酸セグメントと複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸であって、ディテクター核酸が活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第1の検出可能な信号を生成することができる、一本鎖ディテクター核酸を含み得る。

いくつかの場合では、標的核酸を検出するためのキットは、PCRプレート;標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的核酸セグメントと複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸であって、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第1の検出可能な信号を生成することができる、一本鎖ディテクター核酸を含み得る。PCRプレートのウェルは、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸、ガイド核酸および標的配列と複合体を形成したときに活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ、ならびに検出部分を含む一本鎖ディテクター核酸の少なくとも1つの集団で予め等分することができる。したがって、使用者は、関心対象の生物学的試料を予め等分したPCRプレートのウェルに加え、蛍光リーダーまたは可視光リーダーを用いて検出可能な信号を測定することができる。

いくつかの例では、そのようなキットは、バイアル、チューブなどの1つまたは複数の容器を受け入れるように区画化されたパッケージ、キャリア、または容器を含むことができ、容器の各々は、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素の1つを含む。適切な容器には、例えば、試験ウェル、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。一態様では、容器は、ガラス、プラスチック、またはポリマーなどの様々な材料から形成される。

本明細書に記載のキットまたはシステムは、包装材料を含む。包装材料の例には、パウチ、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、および意図された使用形態に適した任意の包装材料が含まれるが、これらに限定されない。

キットは、典型的には、内容物を列挙するラベルおよび/または使用説明書、および使用説明書を備える添付文書を含む。典型的には、指示のセットも含まれる。一態様では、ラベルは、容器上に存在するか、または容器に関連付けられている。いくつかの例では、ラベルを形成する文字、数字または他の字が容器自体に付けられ、成形され、またはエッチングされる場合、ラベルは容器上に存在し、ラベルは、それが容器を保持するレセプタクルまたはキャリア内に存在する場合、例えば添付文書として容器に関連付けられる。一態様では、ラベルを使用して、内容物が特定の治療用途に使用されることを示す。ラベルはまた、本明細書に記載の方法などの内容物の使用のための指示を示す。

成形された製品を包装し、滅菌バリアを維持するためにラッピングまたは箱詰めした後、製品は、加熱滅菌、ガス滅菌、ガンマ線照射または電子ビーム滅菌によって最終滅菌され得る。あるいは、製品は、無菌プロセシングによって調製および包装されてもよい。

安定性
本明細書では、上記の方法で使用するための試薬の安定な組成物およびプログラマブルヌクレアーゼシステムが開示される。本明細書に記載の試薬およびプログラマブルヌクレアーゼシステムは、冷蔵条件、周囲条件、および加速条件を含む様々な貯蔵条件で安定であり得る。安定な試薬が本明細書に開示される。安定性は、試薬およびプログラマブルヌクレアーゼシステム自体、または支持媒体上に存在する試薬およびプログラマブルヌクレアーゼシステムについて測定され得る。

いくつかの例では、本明細書で使用される安定とは、所与の貯蔵期間の終わりに約5％ w/w以下の総不純物を有する試薬を指す。安定性は、HPLCまたは任意の他の公知の試験方法によって評価することができる。安定な試薬は、所与の貯蔵期間の終わりに約10％ w/w、約5％ w/w、約4％ w/w、約3％ w/w、約2％ w/w、約1％ w/w、または約0.5％ w/wの総不純物を有し得る。

いくつかの態様では、本明細書中で使用される安定とは、所与の貯蔵条件における所与の貯蔵期間の終わりに、約10％以下の検出活性の喪失を有する試薬およびプログラマブルヌクレアーゼシステムのことを指す。検出活性は、既知の方法を用いて既知の陽性試料によって評価することができる。選択的にまたは組み合わせて、検出活性は、感度、精度、または特異性によって評価することができる。いくつかの態様では、安定な試薬は、所与の貯蔵期間の終わりに、検出活性の約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％、約1％または約0.5％を喪失する。

いくつかの態様では、安定な組成物は、所与の貯蔵条件における所与の貯蔵期間の終わりに、検出活性の喪失がゼロである。所与の貯蔵条件は、相対湿度10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下、80％以下、90％以下、または100％以下の湿度を含み得る。制御された貯蔵環境は、0％～50％の相対湿度、0％～40％の相対湿度、0％～30％の相対湿度、0％～20％の相対湿度、または0％～10％の相対湿度を含み得る。制御された貯蔵環境は、-100°C、-80°C、-20°C、4°C、約25°C（室温）、または40°Cの温度を含み得る。制御された貯蔵環境は、-80°C～25°C、または-100°C～40°Cの温度を含み得る。制御された保管環境は、システムまたはキットを光または機械的損傷から保護することができる。制御された貯蔵環境は、無菌または防腐性であり得、または光導管の無菌性を維持し得る。制御された貯蔵環境は、無菌または防腐性であり得る。

いくつかの場合では、試薬はキャピラリーに貯蔵されてもよい。キャピラリーは、ガラスキャピラリーであってもよい。いくつかの場合では、キャピラリーは制御された貯蔵環境を提供する。キャピラリーはまた、制御された貯蔵環境内に貯蔵されてもよい。キャピラリーは、試薬を含む溶液を貯蔵することができる。キャピラリーは、試薬を乾燥形態で保存することができる。キャピラリーに試薬を含む溶液を充填し、次いで乾燥させて、乾燥または粉末化形態の試薬を含むキャピラリーを得ることができる。乾燥または粉末化された試薬は、キャピラリーに溶液（例えば、緩衝液）を充填することによって水和または溶解され得る。キャピラリー内の試薬は、室温で保存した場合に安定であり得る。キャピラリー内の試薬は、（例えば、37°C）で保存した場合に安定であり得る。キャピラリー内の試薬は、室温未満（例えば、4 37°C）で保存した場合に安定であり得る。キャピラリー内の試薬は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12ヶ月間保存した場合に安定であり得る。キャピラリー内の試薬は、1年を超えて保存した場合に安定であり得る。キャピラリー内に保存された試薬は、その活性の25％超、30％超、35％超、40％超、45％超、50％超、55％超、60％超、65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、95％超または100％超を保持し得る。

キャピラリーは、乾燥形態または溶液中で酵素を含有することができる。キャピラリーは、乾燥形態または溶液中でプログラマブルヌクレアーゼを含有することができる。キャピラリーは、乾燥形態または溶液中で核酸を含有することができる。キャピラリーは、乾燥形態または溶液中でリボ核タンパク質を含有することができる。キャピラリーは、乾燥形態または溶液中で色素を含有することができる。キャピラリーは、乾燥形態または溶液中で緩衝液（例えば、溶解緩衝液）を含有することができる。キャピラリーは、乾燥形態または溶液中で増幅試薬を含有することができる。

キャピラリーに溶液を流すことにより、キャピラリーから試薬を除去することができる。キャピラリーの開放端に圧力（例えば、油圧または空気圧）を加えることによって、キャピラリーから試薬を除去することができる。キャピラリーを破壊することにより、キャピラリーから試薬を除去することができる。キャピラリーは、その内容物が重力によって溶出するように配置されてもよい。キャピラリーは、両端が開放されていてもよい。キャピラリーは、1つまたは2つの端部で封止されてもよい。

キャピラリーは、1μl未満の内部容積を有し得る。キャピラリーは、1μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、2μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、3μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、4μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、5μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、5～10μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、10～20μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、20～30μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、30～40μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、40～50μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、50～60μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、60～70μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、70～80μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、80～90μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、90～100μlの内部容積を有し得る。キャピラリーは、100μl超の内部容積を有し得る。

キットまたはシステムは、使用前に長期間保管されるように包装することができる。キットまたはシステムは、キットまたはシステムの劣化を回避するために包装することができる。包装は、包装内の湿度を制御するための乾燥剤または他の薬剤を含むことができる。包装は、キットまたはシステムを機械的損傷または熱的損傷から保護することができる。包装は、試薬およびプログラマブルヌクレアーゼシステムの汚染からキットまたはシステムを保護することができる。キットまたはシステムは、試薬の高い安定性をもたらすか、または試薬活性をほとんど喪失させない貯蔵条件と同様の条件下で輸送され得る。包装は、キットまたはシステムの無菌性を提供かつ維持するように構成され得る。キットまたはシステムは、標準的な製造および出荷作業に適合することができる。

標的増幅および検出
多くの標的増幅および検出の方法は、本明細書に開示される方法、組成物、試薬、酵素およびキットと一致する。本明細書に記載されるように、標的核酸は、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼ（例えば、Cas13）、DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼ（例えば、Cas12）、またはRNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼ（例えば、Cas13）および本明細書に開示される他の試薬（例えば、RNA成分）を使用して検出され得る。標的核酸は、本明細書中に記載されるように、DETECTRを使用して検出され得る。標的核酸は、RNA、逆転写RNA、DNA、DNAアンプリコン、増幅DNA、合成核酸、または生物学的試料もしくは環境試料に見られる核酸であり得る。いくつかの場合では、標的核酸は、検出前または検出と同時に増幅される。いくつかの場合では、標的核酸は、増幅前に逆転写される。標的核酸は、標的核酸の配列のループ介在等温増幅（LAMP）によって増幅され得る。いくつかの場合では、核酸は、逆転写と組み合わせたLAMP（RT-LAMP）を使用して増幅される。LAMP増幅は独立して実行されてもよく、またはLAMP増幅は、標的核酸の検出のためにDETECTRと組み合わされてもよい。RT-LAMP増幅は独立して実行されてもよく、またはRT-LAMP増幅は、標的核酸の検出のためにDETECTRと組み合わされてもよい。DETECTR反応は、本明細書中に開示される方法と一致する任意の方法を使用して行われてもよい。

増幅および検出反応混合物
いくつかの態様では、LAMP増幅反応は、複数のプライマー、dNTP、およびDNAポリメラーゼを含む。LAMPは、等温条件下で高い特異性でDNAを増幅するために使用され得る。DNAは、一本鎖DNAまたは二本鎖DNAであり得る。いくつかの場合では、RNAを含む標的核酸は、LAMP増幅の前に逆転写酵素を使用してDNAに逆転写され得る。逆転写反応は、プライマー、dNTP、および逆転写酵素を含み得る。いくつかの場合では、逆転写反応およびLAMP増幅反応を同じ反応で行ってもよい。組み合わせRT-LAMP反応は、LAMPプライマー、逆転写プライマー、dNTP、逆転写酵素、およびDNAポリメラーゼを含み得る。いくつかの場合では、LAMPプライマーは逆転写プライマーを含み得る。

標的核酸配列を検出するためのDETECTR反応は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸、およびプログラマブルヌクレアーゼを含み得る。プログラマブルヌクレアーゼは、活性化されると、本明細書の他の箇所に記載されるように、レポーター（例えば、プログラマブルヌクレアーゼによって核酸が切断されると検出可能になる部分を含む核酸）の配列非依存性切断を示す。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸が標的核酸にハイブリダイズすると活性化される。組み合わせLAMP DETECTR反応は、複数のプライマー、dNTP、DNAポリメラーゼ、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および基質核酸を含み得る。組み合わせRT-LAMP DETECTR反応は、LAMPプライマー、逆転写プライマー、dNTP、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および基質核酸を含み得る。いくつかの場合では、LAMPプライマーは逆転写プライマーを含み得る。LAMPおよびDETECTRは、同じ試料体積で実施することができる。LAMPおよびDETECTRは、別個の試料体積または同じ試料体積で同時に実施することができる。RT-LAMPおよびDETECTRは、同じ試料体積で実施することができる。RT-LAMPおよびDETECTRは、別個の試料体積または同じ試料体積で同時に実施することができる。

LAMP増幅のためのプライマー設計
LAMP反応は複数のプライマーを含み得る。複数のプライマーは、二本鎖核酸の様々な領域に対して、図61に示される標的核酸配列を増幅するように設計される。プライマーは、これらの様々な領域にアニールするか、またはこれらに対応する配列を有することができる。図61に示すように、標的核酸はF1c領域の5’であり、F1c領域はF2c領域の5’であり、F2c領域はF3c領域の5’である。また、B1領域はB2領域の3’であり、B2領域はB3領域の3’である。F3c、F2c、F1c、B1、B2、およびB3領域は、図61の下方の鎖に示されている。F3領域は、F3c領域と逆相補的な配列である。F2領域は、F2c領域と逆相補的な配列である。F1領域は、F1c領域と逆相補的な配列である。B1c領域は、B1領域と逆相補的な配列である。B2c領域は、B2領域と逆相補的な配列である。B3c領域は、B3領域と逆相補的な配列である。標的核酸は、図61の上部構成に示すように、F1c領域の5’およびB1領域の3’であり得る。標的核酸は、図61の下部構成に示すように、B1c領域の5’およびF1領域の3’であり得る。いくつかの態様では、標的核酸は、F2c領域の5’およびF1c領域の3’であり得る。いくつかの態様では、標的核酸は、B2c領域の5’およびB1c領域の3’であり得る。いくつかの態様では、標的核酸配列は、B1領域の5’およびB2領域の3’であり得る。いくつかの態様では、標的核酸配列は、F1領域の5’およびF2領域の3’であり得る。

図61はまた、様々なプライマーの構造および方向性を示す。フォワードアウタープライマーは、F3領域の配列を有する。したがって、フォワードアウタープライマーは、F3c領域にアニールする。バックワードアウタープライマーは、B3領域の配列を有する。したがって、バックワードアウタープライマーは、B3c領域にアニールする。フォワードインナープライマーは、F2領域の配列のF1c領域5’の配列を有する。したがって、フォワードインナープライマーのF2領域はF2c領域にアニールし、増幅された配列は、フォワードインナープライマーのF1c領域の配列とF1領域とのハイブリダイゼーションを通じて共に保持されたループを形成する。バックワードインナープライマーは、B2領域の配列のB1c領域5’の配列を有する。したがって、バックワードインナープライマーのB2領域はB2c領域にアニールし、増幅された配列は、バックワードインナープライマーのB1c領域の配列と標的鎖のB1領域とのハイブリダイゼーションを通じて共に保持されたループを形成する。

さらに、図61に示されるように、複数のプライマーは、ループフォワードプライマー（LF）および/またはループバックワードプライマー（LB）をさらに含み得る。LFは、F1c領域の3’およびF2c領域の5’に位置する。LBは、B2c領域の5’およびB1c領域の3’に位置する。F1、F1c、F2、F2c、F3、F3c、B1、B1c、B2、B2c、B3、および/またはB3c領域は、図61～図63または図71～図72のいずれか1つに示すように、標的核酸、PAM、およびガイドRNA（gRNA）に対して様々な配置で示されている。標的核酸は、B1、B2、B3、LF、F1c、F2c、F3cおよびLBc領域を含む核酸鎖内に存在し得る。標的核酸は、F1、F2、F3、LB、B1c、B2c、B3cおよびLFc領域を含む核酸鎖内に存在し得る。

LAMPプライマーのセットは、DETECTR反応と組み合わせて使用するために設計することができる。核酸は、ガイドRNAがハイブリダイズする領域（例えば、標的核酸）を含み得る。ガイドRNA配列の全部または一部は、標的配列の全部または一部に対して逆相補的であり得る。標的核酸配列は、標的核酸配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）3’に隣接していてもよい。PAMは、プログラマブルヌクレアーゼと標的核酸との相互作用を促進し得る。標的核酸配列は、標的核酸配列のプロトスペーサー隣接部位（PFS）3’に隣接していてもよい。PFSは、プログラマブルヌクレアーゼと標的核酸との相互作用を促進し得る。ガイドRNA、PAMもしくはPFS、または標的核酸配列の1つまたは複数は、F1、F1c、F2、F2c、F3、F3c、LF、LFc、LB、LBc、B1、B1c、B2、B2c、B3、および/またはB3c領域の1つまたは複数に対して特異的に配置され得る。

いくつかの場合では、ガイドRNAは、図62Aのように、F1c領域とB1領域との間に存在する標的核酸の配列に逆相補的である。いくつかの場合では、ガイドRNAは、B1c領域とF1領域との間に存在する標的核酸の配列に逆相補的である。

いくつかの場合では、ガイドRNAは、図62Bのように、F1c領域とB1領域との間に存在する標的核酸の配列に部分的に逆相補的である。いくつかの場合では、ガイドRNAは、B1c領域とF1領域との間に存在する標的核酸の配列に部分的に逆相補的である。例えば、標的核酸は、ガイド核酸の少なくとも60％に逆相補的である、F1c領域とB1領域との間またはB1c領域とF1領域との間の配列を含む。別の例では、標的核酸は、ガイド核酸の少なくとも10％、少なくとも11％、少なくとも12％、少なくとも13％、少なくとも14％、少なくとも15％、少なくとも16％、少なくとも17％、少なくとも18％、少なくとも19％、少なくとも20％、少なくとも21％、少なくとも22％、少なくとも23％、少なくとも24％、少なくとも25％、少なくとも26％、少なくとも27％、少なくとも28％、少なくとも29％、少なくとも30％、少なくとも31％、少なくとも32％、少なくとも33％、少なくとも34％、少なくとも35％、少なくとも36％、少なくとも37％、少なくとも38％、少なくとも39％、少なくとも40％、少なくとも41％、少なくとも42％、少なくとも43％、少なくとも44％、少なくとも45％、少なくとも46％、少なくとも47％、少なくとも48％、少なくとも49％、少なくとも50％、少なくとも51％、少なくとも52％、少なくとも53％、少なくとも54％、少なくとも55％、少なくとも56％、少なくとも57％、少なくとも58％、少なくとも59％、少なくとも60％、少なくとも61％、少なくとも62％、少なくとも63％、少なくとも64％、少なくとも65％、少なくとも66％、少なくとも67％、少なくとも68％、少なくとも69％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも100％、5％～100％、5％～10％、10％～15％、15％～20％、20％～25％、25％～30％、30％～35％、35％～40％、40％～45％、45％～50％、50％～55％、55％～60％、60％～65％、65％～70％、70％～75％、75％～80％、80％～85％、85％～90％、90％～95％、95％～100％に逆相補的である、F1c領域とB1領域との間の配列を含む。この配置では、ガイドRNAは、図61に示すフォワードインナープライマーまたはバックワードインナープライマーと逆相補的ではない。

いくつかの場合では、ガイドRNAは、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマーまたはそれらの組み合わせの50％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下または5％以下と逆相補的である。F1c領域とB1領域との間の配列またはB1c領域とF1領域との間の配列は、ガイド核酸配列に対して少なくとも50％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも99％、または100％逆相補的である。いくつかの局面では、ガイド核酸は、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、またはそれらの任意の組み合わせの50％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、または5％以下に逆相補的な配列を有する。いくつかの局面では、ガイド核酸配列は、F3c領域、F2c領域、F1c領域、B1c領域、B2c領域、B3c領域、またはそれらの任意の組み合わせの配列の50％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、または5％以下と逆相補的な配列を有する。

いくつかの場合では、ガイドRNA配列に対応する領域は、プライマーのいずれにも重複またはハイブリダイズせず、さらに図61～図63および図71～図72に示される領域のいずれにも重複またはハイブリダイズしなくてもよい。

いくつかの場合では、ガイド核酸の全部または一部は、ループ領域内の標的核酸の配列に逆相補的である。例えば、gRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列の全部または一部は、図62Cに示されるように、B1c領域とB2領域との間に位置し得る。別の例では、gRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列の全部または一部は、図62Dに示されるように、F2c領域とF1c領域との間に位置し得る。いくつかの場合では、gRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列の全部または一部は、F1領域とF2領域との間に位置し得る。いくつかの場合では、gRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列の全部または一部は、B2c領域とB1c領域との間に位置し得る。

いくつかの場合では、LAMPプライマーセットは、市販のプライマー設計ソフトウェアを使用して設計することができる。LAMPプライマーセットは、DETECR反応、逆転写反応、またはその両方と組み合わせて使用するために設計することができる。いくつかの場合では、LAMPプライマーセットは、分散型台帳技術（DLT）、人工知能（AI）、エクステンデッド・リアリティ（XR）、および一般に「DARQ」と呼ばれる量子コンピューティングを使用して設計され得る。場合によっては、LAMPプライマーセットは、組み込まれていない増幅信号レポーターのクエンチング（QUASR）を使用して設計することができる（Ball et al.,Anal Chem. 2016 Apr 5;88（7）:3562-8. doi:10.1021/acs. analchem. 5b04054. Epub 2016年3月24日）。LAMPプライマーのセットを設計するこれらの方法は、例としてのみ提供される。LAMPプライマーのセットを設計する他の方法は、当業者には容易に明らかであり得、本明細書に記載の組成物、キットおよび方法のいずれかで使用され得る。呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、インフルエンザAウイルス（IAV）、インフルエンザBウイルス（IAV）、またはHERC2 SNPに対応する核酸配列の存在を検出するための組み合わせRT-LAMP DETECTR反応またはLAMP-DETECTRで使用する、LAMPプライマーの例示的なセットを表6に提供する。

（表６）例示的なLAMPプライマー

LAMPプライマーのセットをDETECTR反応と組み合わせて使用するために設計して、標的核酸中の一塩基多型（SNP）を検出することができる。いくつかの態様では、SNPを含む標的核酸の配列は、ガイド核酸の全部または一部に対して逆相補的であり得る。例えば、SNPは、図72Cに示されるように、ガイドRNA配列に逆相補的な標的核酸の配列内に配置され得る。いくつかの場合では、SNPを含む標的核酸配列の配列は、プライマー、または図71に示されるF1、F1c、F2、F2c、F3、F3c、B1、B1c、B2、B2c、B3、B3c、LB、LBc、LF、もしくはLFc領域の1つもしくは複数と重複しないか、またはそれらと逆相補的でない。ガイド核酸は、図72Aに示すように、F1c領域とB1領域との間の標的核酸の配列に逆相補的であり得る。ガイド核酸は、B1c領域とF1領域との間の標的核酸の配列に逆相補的であり得る。ガイド核酸は、例えば図72Bに示すように、F1c領域とB1領域との間の標的核酸の配列に部分的に逆相補的であり得る。ガイド核酸は、B1c領域とF1領域との間の標的核酸の配列に部分的に逆相補的であり得る。例えば、SNPを有する標的核酸配列の配列は、ガイド核酸に少なくとも10％、少なくとも11％、少なくとも12％、少なくとも13％、少なくとも14％、少なくとも15％、少なくとも16％、少なくとも17％、少なくとも18％、少なくとも19％、少なくとも20％、少なくとも21％、少なくとも22％、少なくとも23％、少なくとも24％、少なくとも25％、少なくとも26％、少なくとも27％、少なくとも28％、少なくとも29％、少なくとも30％、少なくとも31％、少なくとも32％、少なくとも33％、少なくとも34％、少なくとも35％、少なくとも36％、少なくとも37％、少なくとも38％、少なくとも39％、少なくとも40％、少なくとも41％、少なくとも42％、少なくとも43％、少なくとも44％、少なくとも45％、少なくとも46％、少なくとも47％、少なくとも48％、少なくとも49％、少なくとも50％、少なくとも51％、少なくとも52％、なくとも53％、少なくとも54％、少なくとも55％、少なくとも56％、少なくとも57％、少なくとも58％、少なくとも59％、少なくとも60％、少なくとも61％、少なくとも62％、少なくとも63％、少なくとも64％、少なくとも65％、少なくとも66％、少なくとも67％、少なくとも68％、少なくとも69％、少なくとも70％、少なくとも71％、少なくとも72％、少なくとも73％、少なくとも74％、少なくとも75％、少なくとも76％、少なくとも77％、少なくとも78％、少なくとも79％、少なくとも80％、少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも100％、5％～100％、5％～10％、10％～15％、15％～20％、20％～25％、25％～30％、30％～35％、35％～40％、40％～45％、45％～50％、50％～55％、55％～60％、60％～65％、65％～70％、70％～75％、75％～80％、80％～85％、85％～90％、90％～95％、95％～100％逆相補的であり得る。いくつかの場合では、ガイド核酸は、複数のプライマーまたはF1、F1c、F2、F2c、F3、F3c、B1、B1c、B2、B2c、B3、B3c、LB、LBc、LF、もしくはLFc領域のいずれとも重複せず、かつ/またはそれらと逆相補的でない。組み合わせRT-LAMP DETECTRまたはLAMP-DETECTR反応で使用して、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、インフルエンザAウイルス（IAV）、インフルエンザBウイルス（IAV）、またはHERC2 SNPに対応する核酸配列の存在を検出するためのDETECTR gRNAの例示的なセットを表7に提供する。

（表７）例示的なDETECTRガイドRNA

一塩基多型対立遺伝子の増幅および検出
DETECTR反応を使用して、試料中の特定の一塩基多型（SNP）対立遺伝子の存在を検出することができる。DETECTR反応は、本明細書の他の箇所に記載されるように、特異的SNP対立遺伝子を含む標的核酸の存在下で検出可能な信号を生成し得る。DETECTR反応は、標的核酸の非存在下、または特異的SNP対立遺伝子を含まないかもしくは異なるSNP対立遺伝子を含む核酸配列の存在下では、信号を生成し得ない。いくつかの場合では、DETECTR反応は、特異的SNP対立遺伝子を含む標的核酸配列の一部に逆相補的なガイドRNAを含み得る。ガイドRNA、および特異的SNP対立遺伝子を含む標的核酸は、プログラマブルヌクレアーゼに結合してそれを活性化し、それによって本明細書の他の箇所に記載されるような検出可能な信号を生成し得る。ガイドRNA、および特異的SNP対立遺伝子を含まない核酸配列は、プログラマブルヌクレアーゼに結合またはそれを活性化せず、検出可能な信号を生成し得ない。いくつかの場合では、特定のSNP対立遺伝子を含み得るまたは含み得ない標的核酸配列は、例えばLAMP増幅反応を使用して増幅され得る。いくつかの場合では、LAMP増幅反応は、逆転写反応、DETECTR反応、またはその両方と組み合わせてもよい。例えば、LAMP反応は、RT-LAMP反応、LAMP DETECTR反応、またはRT-LAMP DETECTR反応であってもよい。

DETECTR反応は、本明細書の他の箇所に記載されるように、特異的SNP対立遺伝子を含む標的核酸配列の存在下で特異的に検出可能な信号を生成し得る。例えば、DETECTR反応は、SNPの位置にG核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能な信号を生成し得るが、SNPの位置にC、T、またはA核酸を含む核酸の存在下では生成し得ない。DETECTR反応は、SNPの位置にT核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能な信号を生成し得るが、SNPの位置にG、C、またはA核酸を含む核酸の存在下では生成し得ない。DETECTR反応は、SNPの位置にC核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能な信号を生成し得るが、SNPの位置にG、T、またはAを含む核酸の存在下では生成し得ない。DETECTR反応は、SNPの位置にA核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能な信号を生成し得るが、SNPの位置にG、T、またはC核酸を含む核酸の存在下では生成し得ない。DETECTR反応に加えて、SNPを有する標的核酸は、同時に、連続して、同時に一緒に試料中に存在するか、または試料中で連続して一緒に、LAMPまたはRT-LAMPと一緒に実行され得る。例えば、反応は、LAMPおよびDETECTR反応、またはRT-LAMPおよびDETECTR反応を含み得る。LAMP反応と組み合わせてDETECTR反応を行うと、LAMP反応なしでのDETECTR反応と比較して、検出可能な信号の増加をもたらし得る。

いくつかの場合では、DETECTR反応で生成される検出可能な信号は、特異的SNP対立遺伝子を含む標的核酸の存在下では、特異的SNP対立遺伝子を含まない核酸の存在下よりも増加し得る。いくつかの場合では、DETECTR反応は、特異的SNPを含む標的核酸の存在下で、特異的SNP対立遺伝子を含まない核酸の存在下よりも、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20倍、少なくとも30倍、少なくとも40倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも300倍、少なくとも400倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも2000倍、少なくとも3000倍、少なくとも4000倍、少なくとも5000倍、少なくとも6000倍、少なくとも7000倍、少なくとも8000倍、少なくとも9000倍、少なくとも1万倍、少なくとも5万倍、少なくとも10万倍、少なくとも50万倍、または少なくとも100万倍大きい検出可能な信号を生成し得る。いくつかの場合では、DETECTR反応は、特異的SNP対立遺伝子を含む標的核酸の存在下で、特異的SNP対立遺伝子を含まない核酸の存在下よりも1倍～2倍、2倍～3倍、3倍～4倍、4倍～5倍、5倍～10倍、10倍～20倍、20倍～30倍、30倍～40倍、40倍～50倍、50倍～100倍、100倍～500倍、500倍～1000倍、1000倍～1万倍、1万倍～10万倍または10万倍～100万倍大きい検出可能な信号を生成し得る。

DETECTR反応を使用して、核酸試料中の疾患または状態に関連するSNP対立遺伝子の存在を検出することができる。DETECTR反応を使用して、核酸試料中の疾患または状態を発症する可能性増加に関連するSNP対立遺伝子の存在を検出することができる。DETECTR反応を使用して、核酸試料中の表現型に関連するSNP対立遺伝子の存在を検出することができる。例えば、DETECTR反応を使用して、フェニルケトン尿症（PKU）、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、白化症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー1型、高コレステロール血症、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、血友病、筋ジストロフィー、低リン血症性くる病、レット症候群または精子形成不全などの疾患に関連するSNP対立遺伝子を検出することができる。DETECTR反応を使用して、がん、例えば、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、胆嚢がん、胃がん、白血病、肝臓がん、肺がん、口腔がん、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、精巣がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、またはリンパ腫のリスク増加に関連するSNP対立遺伝子を検出することができる。DETECTR反応を使用して、疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイドーシス、ヘテロクロマトーシス（heterochromatosis）、セリアック病、黄斑変性または高コレステロール血症のリスク増加に関連するSNP対立遺伝子を検出することができる。DETECTR反応を使用して、表現型、例えば、目の色、髪の色、身長、皮膚の色、人種、アルコールフラッシング反応、カフェイン消費、深い睡眠、遺伝的体重、乳糖不耐性、筋肉組成、飽和脂肪および体重、または睡眠運動に関連するSNP対立遺伝子を検出することができる。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」への言及は、いずれも特に明記しない限り、「および/または」を包含することが意図される。

本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」という用語およびその文法上の同義語は、記載された特徴、整数、工程、動作、要素、および/または成分の存在を指定するが、1つまたは複数の他の特徴、整数、工程、動作、要素、成分、および/またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではない。本明細書で使用される場合、「および/または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの1つまたは複数のありとあらゆる組み合わせを含む。

本明細書で使用される場合、具体的に記載されていない限り、または文脈から明らかでない限り、数または数の範囲に関して「約」という用語は、記載された数およびその数＋/-10％、またはある範囲について記載された値について記載された下限を10％下回り、上限を10％上回ることを意味すると理解される。

本明細書で使用される場合、「個体」、「対象」、および「患者」という用語は互換的に使用され、ヒトを含む動物界の任意のメンバーを含む。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Fv（scFv）（二重特異性scFvを含む）、単鎖抗体、Fab断片、F（ab’）断片、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、またはそれらのエピトープ結合断片を指すが、これらに限定されない。いくつかの場合では、抗体は、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分である。いくつかの例では、抗体は、鳥類および哺乳動物を含む動物起源である。あるいは、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。

図1は概略図を示し、左から右にワークフローの工程1から4を示す。工程1の下は、楕円形の「試料調製」である。工程2の下は、楕円形の「核酸増幅」である。工程3の下は、長方形の「プログラマブルヌクレアーゼ反応インキュベーション」である。工程4の下は、長方形の「検出（読み出し）」である。

図2は、シリンジのような形状の濾過装置を右側に示す。左側には、上から下に、頬/顔のスワブ、尿検体収集器、および指紋の3つの試料がある。

図3は、「装置2.1-必須の構成要素のみ/増幅なし」と題する概略図を上部に示す。下部でV1と垂直に接続されたP1を通って入る試料が示されている。V1は、事前に複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合が導入されるP2と上部で垂直に接続されたV2に隣接している。V1の右側には、S1と標識されたねじれ領域がある。S1の右側には、インキュベーション、およびC1と標識された検出チャンバがある。C1の右側には、回収出口であるP3と上部で垂直に接続されているV3がある。概略図の中央には、「装置2.2-増幅を伴う1チャンバ反応」と題する流体装置が示されている。下部でV1と垂直に接続されたP1を通って入る試料が示されている。V1は、増幅混合物が導入されるP2と上部で垂直に接続されたV2に隣接している。V2は、事前に複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合物が導入されるP3と上部で垂直に接続されたV2に隣接している。V3の右側には、S1と標識されたねじれ領域がある。S1の右側には、インキュベーション、およびC1と標識された検出チャンバがある。C1の右側には、回収出口であるP4と上部で垂直に接続されているV4がある。下部には、「装置2.3-増幅を伴う2チャンバ反応」と題する別の流体装置が示されている。下部でV1と垂直に接続されたP1を通って入る試料が示されている。V1は、増幅混合物が導入されるP2と上部で垂直に接続されたV2に隣接している。V2の右側には、S1と標識されたねじれ領域がある。S1の右側には、C1と標識されたインキュベーションチャンバがある。C1の右側には、事前に複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合物が導入されるP3と上部で垂直に接続されたV3がある。V3の右側には、S2と標識された別の蛇行領域がある。S2の右側には、C2と標識されたインキュベーションおよび検出チャンバがある。C2の右側には、回収出口であるP4と上部で垂直に接続されているV4がある。

図4は、上部に「（a）蛍光読み出し」を示し、長方形領域に色付けされて示される薄膜平面ヒーターを有する長方形チップ基材表面を示す。チップの上には、蛍光励起/検出装置の図がある。下部に「（b）電気化学的読み出し」を示す。電気化学的読み出しは、2つの概略図を示す。上部の概略図は、「ストレプトアビジン信号増幅を用いた固相検出」と題される。左側に、星印として示される、ビオチンで標識されたssDNAでコーティングされた上部チャンバの表面を示す長方形の表面がある。真下に、六角形として示される、ストレプトアビジンを有する電極表面がある。機能化されたチャンバの右側には、x軸上の電圧対y軸上の電流のグラフが示されており、グラフの表題は「低」である。右側には、プログラマブルヌクレアーゼの導入を示す矢印があり、これは一本のハサミとして示され、表面上からビオチンを切断することが示されている。ビオチンは、ストレプトアビジンに結合しているものとして示されている。さらに右側には、x軸上の電圧対y軸上の電流のグラフが示されており、グラフの表題は「高」である。下に、「固定化された電気活性オリゴを使用した固相検出」と題する第2の概略図を示す。概略図の左側には、ssNA/Fc-NTPを有する長方形電極表面が示されている。表面は、円で示されているフェロセンを有するツリー状構造として示されている電気活性部分で機能化されている。右側には、x軸上の電圧対y軸上の電流のグラフが示されており、グラフの表題は「高」である。さらに右側には、プログラマブルヌクレアーゼの導入を示す矢印があり、これは一本のハサミとして示され、Fc円を切断することが示されている。さらに右側には、x軸上の電圧対y軸上の電流のグラフが示されており、グラフの表題は「低」である。

図5は、V1の下に垂直に接続されたP1で導入されている試料を示す。V1は、上方で等温増幅混合物に垂直に接続されたV2に隣接している。V2の右側には、S1と標識された蛇行チャネルがある。さらに右側には、C1と標識されたインキュベーションチャンバがある。C1の右側には、事前に複合体化されたプログラマブルヌクレアーゼ混合物が導入されるP3と上部で垂直に接続されたV3がある。V3の右側には、S2と標識された別の蛇行チャネルがあり、さらに右側には、C2と標識された別のインキュベーションチャンバがある。C2の右側にはV4があり、これはスクロースまたは比色試薬が導入されるP4に上方で垂直に接続されている。V4の右側には、S3と標識された別の蛇行チャネルがあり、さらに右側には、C3と標識された検出チャンバがある。C3の右側には、V5があり、これは上方でP5に垂直に接続されている。下は、C2インキュベーションチャンバの分解図である。概略図は、「インベルターゼにコンジュゲートされたssNAでコーティングされた上部チャンバ表面」という標識を有する長方形として示された上部チャンバのものである。インベルターゼは、「Inv」と標識された長方形のボックスに示される。上部チャンバの下に、薄膜平面ヒーターを有する底部チャンバ表面を示す構造がある。さらに右側には、プログラマブルヌクレアーゼの導入を示す矢印があり、これは一本のハサミとして示され、インベルターゼを切断することが示されている。さらに下は、C3と標識された検出チャンバの分解図である。この分解図は、上部に「（a）DNSまたは他の化合物を用いた光学的読み出し」と標識された概略図を示す。上部には、「（a）DNSまたは他の化合物を用いた光学的読み出し」があり、長方形領域に色付けされて示される薄膜平面ヒーターを有する長方形チップ基材表面を示す。チップの上には、カメラまたは光学センサーがある。下部には「（b）電気化学的読み出し（電気化学分析装置または血糖値測定器）」があり、これは左から右に、「GOx」と標識された楕円形で示される固定化グルコースオキシダーゼを有する電極表面を示す。機能化された電極表面の上には、左から右へスクロース、真上に「Inv」を伴う右への矢印、およびその右側にフルクトース＋グルコースを示す流れ図がある。機能化電極表面の右側には、x軸上の電圧対y軸上の電流のグラフがあり、その下には「低」を示す電子リーダーがある。さらに右側には、H2）2＋F-グルコノ-δ-ラクトンに再溶解するGOx機能化電極表面と相互作用するグルコースがある。右側には、x軸上の電圧対y軸上の電流のグラフがあり、その下には「高」を示す電子リーダーがある。下は、インベルターゼ標識オリゴが「Inv」と表示された長方形を含む線として描かれていることを示すキーである。プログラマブルヌクレアーゼは、1つのハサミとして示されている。DNSの分子構造を示す。グルコースオキシダーゼは、GOxと標識された楕円形である。

図9は、未処理蛍光の経時的な折れ線グラフを示す。x軸は、2.5の増分で0.0から20.0までの分単位の時間を示す。y軸は、未処理蛍光を0から350万まで50万刻みで示す。線は、低pH、RT-プール、低pH＋熱、GenMarkプール、デオキシコレート、デオキシコレート＋熱、CHAPS、CHAPS＋熱、デオキシコレート＋尿素、デオキシコレート＋尿素＋熱、Nucleospin gold std、Triton X-100、10e4、およびNTCに対応する標的を示す。cRNAはIAVである。グラフ上の最も高い線は、RT-プール、低pH、およびGenMarkプールに対応する。残りの線は、左上から右下へ順に、NucleoSpin gold std、デオキシコレート、CHAPS＋尿素（ほぼ等しい）、低pH＋熱、CHAPS＋熱、CHAPS＋尿素＋熱、Triton X-100、デオキシコレート＋尿素、10e4、デオキシコレート＋尿素＋熱に対応する。NTCは、約150万で平らな線である。

図10は、未処理蛍光の経時的な折れ線グラフを示す。x軸は、2.5の増分で0.0から20.0までの分単位の時間を示す。y軸は、未処理蛍光を100万から300万まで100万刻みで示す。線は、低pH 0分、低pH 3分、低pH 5分、低pH 10分、低pH 15分、低pH EtOHなし、低pH＋熱50、低pH＋熱100、未処理、RT-プール、10e5、10e4、10e3およびNTCに対応する標的を示す。crRNAはIAVである。2つの最も高い線は、低pH 0分、およびRT-プールに対応する。残りの線は、左上から右下へ、低pH 5分、低pH EtOHなし、低pH 15分、低pH 10分、10e5、低pH＋熱100、低pH＋熱50、未処理、10e4、10e3、およびNTCに対応する。

図15は、フローチャートおよび2つの折れ線グラフを示す。フローチャートは4つのボックスを示す。上のボックスには「DNA/RNA」と表示される。残りの3つのボックスは、上から順に、「RPA/RT-RPA」、「インビトロ転写」および「Cas13a検出」と表示する。両方のプロットは、経時的な未処理蛍光を示す。x軸は、10の増分で0から40までの分単位の時間を示す。y軸は、未処理蛍光（AU）を0から60,000まで20,000刻みで示す。両方のプロットは、500aMでそれぞれオンターゲットおよびオフターゲットに対応する2本の線（実線）、ならびに0aMでそれぞれオンターゲットおよびオフターゲットに対応する2本の線（破線）の2つのセットを示す。左のプロットは、PPRVを示す。左のプロットでは、500aMのオンターゲットに対応する線が時間と共に上昇する。残りの線は、ほぼ平坦に見える。右側のプロットは、PPRV-noIVTを示す。4本の線は、すべてほぼ平坦である。

図17は、フローチャートおよび4つの折れ線グラフを示す。フローチャートは4つのボックスを示す。上のボックスには「DNA/RNA」と表示される。残りの3つのボックスは、上から順に、「RPA/RT-RPA」、「インビトロ転写」および「Cas13a検出」と表示する。4つのプロットはすべて、経時的な未処理蛍光を示す。4つのプロットすべてのx軸は、0から20までの分単位の時間を10の増分で示す。4つのプロットすべてのy軸は、未処理蛍光（AU）を0から25,000まで5,000の増分で示す。4つのプロットはすべて、crRNAのオンターゲットおよびオフターゲットに対応する2つの線を示す。左上のプロットは、＋RTかつ＋UMTを示す。オンターゲット線は時間と共に上昇し、オフターゲット線はほぼ平坦に見える。左下のプロットは、＋RTかつ-UMTを示す。オンターゲット線は時間と共に上昇し、オフターゲット線はほぼ平坦に見える。右上のプロットは-RTかつ＋UMTを示す。両方の線はほぼ平坦に見える。右下のプロットは、-RTかつ-UMTを示す。両方の線はほぼ平坦に見えるが、オンターゲット線がオフターゲット線の上にある。

図20Bは、結果までの時間を示す棒グラフを示す（低いほど良好である）。グラフは、それぞれ4つの棒の6セットを示す。6セットの棒は、x軸上に示すように、左から右へ、74、72、70、68、66、および64の温度（C）に対応する。各セットの4つの棒は、左から右に、HelaトータルRNA、マウス肝臓RNA、Hela-DNA、およびNTCを示す。y軸は、5の増分で0から40までの結果までの時間（分）を示す。6つすべての温度において、マウス肝臓RNAおよびNTCに対応する棒は、結果までの時間が40以上である。6つすべての温度において、Helaトータル-RNAが次に高く、Hela-DNAが最も低い。

図20Cは、左から右に、crRNA＝オフターゲット、crRNA＝オンターゲット＃1、およびcrRNA＝オンターゲット＃2に対応する3つの折れ線グラフを示す。3つのプロットすべてについて、x軸は、25の増分で0から75までの分を示し、y軸は、50万の増分で0から150万までの未処理蛍光（AU）を示す。各プロットは、標的に対応する3つの線示し、これらの線は、Hela-RNA、Hela-DNA、マウス肝臓RNA、およびNTCを表す。左側のプロットおよび右側のプロットでは、4つの線はすべてほぼ平坦である。中央のプロットでは、Hela-DNAおよびHela-RNAに対応する線が時間と共に上昇し、Hela-DNAが最も高い。マウス肝臓RNAおよびNTCが最も低い。

図21は、フローチャートおよび6つの折れ線グラフを示す。フローチャートは、上から順に「DNA/RNA」、「LAMP/RT-LAMP」、および「Cas12a検出」と標識された3つのボックスを示す。6つの折れ線グラフは、経時的な蛍光を示す。6つのプロットすべてについて、x軸は、25の増分で0から75までの分を示し、y軸は、20,000の増分で0から60,000までの未処理蛍光（AU）を示す。6つのプロットはすべて、異なるcrRNAに対応する3つの線を示す。3つの線は、オンターゲット＃1、オンターゲット＃2、およびオフターゲットを示す。左上のプロットは、プライマー＝IAV1、標的＝IAVを示す。オンターゲット＃2に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。オフターゲットに対応する線は、時間と共にわずかに上昇する。オンターゲット＃1に対応する線は、ほぼ平坦に見える。中央上のプロットは、プライマー＝IAV2、標的＝IAVを示す。オンターゲット＃2に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。オンターゲット＃1に対応する線は時間と共に上昇するが、オンターゲット＃2ほど高くはない。オフターゲットに対応する線は、時間と共にわずかに上昇し、最も低い。右上のプロットは、プライマー＝IAV3、標的＝IAVを示す。オンターゲット＃1に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。オフターゲットに対応する線は、時間と共にわずかに上昇するが、オンターゲット＃1ほど高くはない。オンターゲット＃2に対応する線は、グラフ上で低く見え、ほぼ平坦に見える。左下のプロットは、プライマー＝IAV1、標的＝NTCを示す。オンターゲット＃2に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。オフターゲットに対応する線は、時間と共にわずかに上昇するが、オンターゲット＃2ほど高くはない。オンターゲット＃1に対応する線は、ほぼ平坦に見える。中央下のプロットは、プライマー＝IAV2、標的＝NTCを示す。オフターゲットに対応する線は、時間と共にわずかに上昇する。オンターゲット＃1およびオンターゲット＃2に対応する線は、ほぼ平坦に見える。右下のプロットは、プライマー＝IAV3、標的＝NTCを示す。オフターゲットに対応する線は、時間と共にわずかに上昇する。オンターゲット＃1およびオンターゲット＃2に対応する線は、グラフ上で低く見え、ほぼ平坦に見える。

図22は、フローチャートおよび3つの折れ線グラフを示す。フローチャートは、上から順に「DNA/RNA」、「LAMP/RT-LAMP」、および「Cas12a検出」と標識された3つのボックスを示す。3つの折れ線グラフは、経時的な蛍光を示す。3つのプロットすべてについて、x軸は、25の増分で0から75までの分を示し、y軸は、20,000の増分で0から60,000までの未処理蛍光（AU）を示す。3つのプロットはすべて、異なるcrRNAに対応する3つの線を示す。3つの線、IBV＃1、IBV＃2、およびIBV＃3。左のプロットは、標的＝IAVを示す。3つの線はすべて、ほぼ平坦に見える。中央のプロットは、標的＝IBVを示す。IBV＃3に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。IBV＃2に対応する線は、時間と共に上昇するが、IBV＃3ほど急速ではない。IBV＃1に対応する線は、ほぼ平坦に見える。右のプロットは、標的＝NTCを示す。3つの線はすべて、ほぼ平坦に見える。

図24Bは、6つの折れ線グラフを示す。6つのプロットすべてについて、x軸は、25の増分で0から75までの分を示し、y軸は、20,000の増分で0から60,000までの未処理蛍光（AU）を示す。6つのプロットはすべて、10000および0の濃度に対応する2つの線を示す。左上のプロットは、標的＝IAV、crRNA＝IAVを示す。10000に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。0に対応する線は、ほぼ平坦に見える。中央上のプロットは、標的＝IBV、crRNA＝IAVを示す。いずれの線も見えない。右上のプロットは、標的＝IAVおよびIBV、crRNA＝IAVを示す。10000に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。0に対応する線は、ほぼ平坦に見える。左下のプロットは、標的＝IAV、crRNA＝IBVを示す。いずれの線も見えない。中央下のプロットは、標的＝IBV、crRNA＝IBVを示す。10000に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。0に対応する線は、ほぼ平坦に見える。右下のプロットは、標的＝IAVおよびIBV、crRNA＝IBVを示す。10000に対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。0に対応する線は、ほぼ平坦に見える。

図25は、フローチャートおよび4つの折れ線グラフを示す。フローチャートは5つのボックスを有する。上のボックスには「ウイルスRNA」と示され、中央のボックスには「多重化RN-LAMP」が示され、残りのボックスには、左から右に、「Cas12インフルエンザA検出」、「Cas12インフルエンザB検出」および「Cas12a内部amp. 検出」と示されている。4つのプロットは、経時的な蛍光を示す。4つのプロットすべてのx軸は、20の増分で0から80までの分を示し、y軸は、10,000の増分で0から50,000までの未処理蛍光（AU）を示す。各プロットは、異なるcrRNA、IAV、IBV、およびマンモスIACに対応する3つの線を示す。最も左側のプロットはIAVを示す。IAVに対応する線は、時間と共に上昇する。左から2番目のプロットはIBVを示す。IBVに対応する線は、時間と共に上昇する。右から2番目のプロットは、IAVおよびIBVを示す。IBVに対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。IAVに対応する線は時間と共に上昇するが、IBVほど高くはない。最も右側のプロットは、IAV、IBV、およびマンモスIACを示す。IBVに対応する線は時間と共に上昇し、最も高い。マンモスIACに対応する線は時間と共に上昇するが、IBVほど高くはない。IAVに対応する線は、ほぼ平坦に見える。

図49Cは、経時的な蛍光を示す6つの線プロットを示す。6つのプロットすべてにおいて、x軸は、25の増分で0から75までの分を示し、y軸は、0.2の増分で0.0から1.0までの正規化蛍光を示す。各プロットは、4本の線の2つのセットを示す。4本の線の1つ目のセットは、RNA-FQレポーター（実線）の2.5、0.25、0.025および0の濃度（nM）を示す。4本の線の2つ目のセットは、DNA-FQレポーター（破線）の2.5、0.25、0.025および0の濃度（nM）を示す。左上のプロットは、標的＝RNA、タンパク質＝Cas13M26（SEQ ID NO:131の配列を有するLbuCas13a）を示す。2.5のRNA-FQ、0.25のRNA-FQ、および0.0025のRNA-FQに対応する線は、時間と共に上昇する。2.5のRNA-FQに対応する線が最も高く、0.25のRNA-FQに対応する線が続き、0.025のRNA-FQに対応する線が3つのうち最も低い。残りの線は、ベースラインと識別できない。中央上のプロットは、標的＝ssDNA、タンパク質＝Cas13M26を示す。2.5のRNA-FQおよび0.25のRNA-FQに対応する線は、時間と共に上昇する。2.5のRNA-FQに対応する線が最も高く、0.25のRNA-FQに対応する線が続く。残りの線は、ベースラインと識別できない。右上のプロットは、標的＝dsDNA、タンパク質＝Cas13M26を示す。いずれの線もベースラインと識別できない。左下のプロットは、標的＝RNA、タンパク質＝Cas12M08（SEQ ID NO:37の配列を有するCas12ファミリー内の変異体）を示す。いずれの線もベースラインと識別できない。中央下のプロットは、標的＝ssDNA、タンパク質＝Cas12M08を示す。2.5のDNA-FQ、0.25のDNA-FQ、および0.0025のDNA-FQに対応する線は、時間と共に上昇する。2.5のDNA-FQに対応する線が最も高く、0.25のDNA-FQに対応する線が続き、0.025のDNA-FQに対応する線が3つのうち最も低い。残りの線は、ごくわずかにベースラインと識別できる。右下のプロットは、標的＝dsDNA、タンパク質＝Cas12M08を示す。2.5のDNA-FQ、0.25のDNA-FQ、および0.0025のDNA-FQに対応する線は、時間と共に上昇する。2.5のDNA-FQに対応する線が最も高く、0.25のDNA-FQに対応する線が続き、0.025のDNA-FQに対応する線が3つのうち最も低い。残りの線は、ごくわずかにベースラインと識別できる。

図50は、経時的な蛍光を示す2つの線プロットを示す。両方のプロットすべてについて、x軸は、50の増分で0から50までの分を示し、y軸は、500,000の増分で0から2,000,000までの未処理蛍光（AU）を示す。両方のプロットは、レポーターrep01-FAM-U5、rep08-A5、rep09-C5、rep10-G5、rep11-T5、rep12-TA6、rep13-TA13、rep14-TA10、rep15-T6、rep16-T7、rep19-T10、rep20-T11、rep21-T12、およびrep30-ビーコンを表す線を示す。左のプロットは0nMを示し、いずれの線も実質的にベースラインと識別できない。右のプロットは2.5nMを示す。rep01-FAM-upに対応する線は、時間と共に上昇する。残りの線は、実質的にベースラインと識別できない。

図54Aは、異なるcrRNAおよびプライマーを用いた蛍光を示す棒グラフを示す。y軸は、正規化蛍光を0から160,000まで20,000刻みで示す。x軸はcrRNAを示す。プロットは、3つの棒の2つのセットを示す。左のセットはオンターゲットcrRNAを示し、右のセットはオフターゲットcrRNAを示す。各セットの3つの棒は、左から右に、プライマーLF＋LB、LF、およびLBに対応する。

本発明の様々な態様を本明細書に示し説明してきたが、そのような態様が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、および置換が考えられるであろう。本明細書に記載の本発明の態様に対する様々な代替形態が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

番号付けした態様
以下の態様は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も企図される。特に、これらの番号付けされた態様のそれぞれは、列挙された順序とは無関係に、前または後のすべての番号付けされた態様に依存するかまたは関連すると考えられる。1. a）バルブに流体接続された増幅チャンバ;b）試料計量チャネルに接続されているバルブに流体接続された検出チャンバ;c）抵抗チャネルを介して検出チャンバに流体接続された検出試薬チャンバであって、プログラマブルヌクレアーゼとガイド核酸と標識されたディテクター核酸とを含み、標識されたディテクター核酸が、標的核酸のセグメントへのガイド核酸の結合により切断され得る、検出試薬チャンバを含む、標的核酸を検出するためのマイクロ流体カートリッジ。2. 試料計量チャネルが、チャネル内またはチャンバ内に分配される液体の体積を制御する、態様1のマイクロ流体カートリッジ。3. 試料計量チャネルが、検出チャンバに流体接続されている、態様2のマイクロ流体カートリッジ。4. 抵抗チャネルが、蛇行経路、角度のついた経路、または遠回り経路を有する、態様1～3のいずれか1つの抵抗チャネル。5. バルブが、回転バルブ、空気圧バルブ、油圧バルブ、エラストマーバルブである、態様1～4のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。6. 抵抗チャネルがバルブと流体接続されている、態様1～5のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。7. バルブが、「基材」または「オーバーモールド」を含むケーシングを含む、態様1～6のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。8. バルブがソレノイドによって作動される、態様1～7のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。9. バルブが、手動で、磁気的に、電気的に、熱的に、双安定回路によって、圧電材料によって、電気化学的に、相変化によって、レオロジー的に、空気圧的に、逆止バルブによって、毛細管現象によって、またはそれらの任意の組み合わせによって制御される、態様1～8のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。10. 回転バルブが、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つのチャンバを流体接続する、態様5～9のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。11. 増幅チャンバに流体接続された増幅試薬チャンバをさらに含む、態様1～10のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。12. 増幅試薬チャンバに流体接続された試料チャンバをさらに含む、態様11のマイクロ流体カートリッジ。13. 試料チャンバに接続された試料投入口をさらに含む、態様12のマイクロ流体カートリッジ。14. 試料投入口が、密閉可能である、態様13のマイクロ流体カートリッジ。15. 試料投入口が前記試料の周りにシールを形成する、態様14のマイクロ流体カートリッジ。16. 試料チャンバが溶解緩衝液を含む、態様12～15のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。17. 試料チャンバに流体接続された溶解緩衝液貯蔵チャンバをさらに含む、態様12～16のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ18. 溶解緩衝液貯蔵チャンバが溶解緩衝液を含む、態様17のマイクロ流体カートリッジ。19. 溶解緩衝液が二重溶解/増幅緩衝液である、態様16～18のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。20. 溶解緩衝液貯蔵チャンバが、第2のバルブを介して試料チャンバに流体接続されている、態様17～19のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。21. 試料チャンバが増幅試薬チャンバを介して増幅チャンバに流体接続されている、態様12～20のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。22. 試料チャンバが増幅チャンバを介して増幅試薬チャンバに流体接続されている、態様12～20のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。23. マイクロ流体カートリッジが、増幅試薬チャンバと増幅チャンバとの間で流体を双方向に導くように構成されている、態様11～22のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。24. 検出試薬チャンバが増幅チャンバに流体接続されている、態様1～23のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。25. 増幅チャンバが検出試薬チャンバを介して検出チャンバに流体接続されている、態様1～24のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。26. 検出チャンバの上方にある試薬ポートをさらに含み、試薬ポートが、検出試薬チャンバから検出チャンバに流体を送達するように構成されている、態様1～25のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。27. 増幅チャンバが検出チャンバを介して検出試薬チャンバに流体接続されている、態様1～26のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。28. 抵抗チャネルが、検出チャンバへのおよび検出試薬チャンバへの逆流を低減するように構成されている、態様1～27のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。29. 試料計量チャネルが、所定の体積の流体を検出試薬チャンバから検出チャンバに導くように構成されている、態様2～27のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。30. 増幅チャンバと検出チャンバとが熱的に隔離されている、態様1～29のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。31. 検出試薬チャンバが検出チャンバに流体接続されている、態様1～30のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。32. 検出試薬チャンバが、第2の抵抗チャネルを介して検出チャンバに流体接続されている、態様1～31のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。33. 抵抗チャネルまたは第2の抵抗チャネルが蛇行抵抗チャネルである、態様1～32のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。34. 抵抗チャネルまたは第2の抵抗チャネルが、少なくとも2つのヘアピン部を含む、態様1～33のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。35. 抵抗チャネルまたは第2の抵抗チャネルが、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの直角部を含む、態様1～34のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。36. 増幅チャンバが、密閉可能な試料投入口を含む、態様1～35のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。37. 試料投入口が、スワブの周りにシールを形成するように構成されている、態様36のマイクロ流体カートリッジ。38. マイクロ流体カートリッジが、増幅チャンバから検出チャンバに流体を圧送するための第1のポンプに接続するように構成されている、態様1～37のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。39. マイクロ流体カートリッジが、検出試薬チャンバから検出チャンバに流体を圧送するための第2のポンプに接続するように構成されている、態様1～38のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。40. 第1のポンプまたは第2のポンプが、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである、態様38～39のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。41. 増幅チャンバが、空気圧を受けるように構成されたポートに流体接続されている、態様1～40のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。42. 増幅チャンバが、チャネルを介してポートに流体接続されている、態様41のマイクロ流体カートリッジ。43. 増幅試薬チャンバが、空気圧を受けるように構成された第2のポートに接続されている、態様11～42のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。44. 増幅試薬チャンバが、第2のチャネルを介して第2のポートに流体接続されている、態様43のマイクロ流体カートリッジ。45. マイクロ流体カートリッジが、増幅試薬チャンバから増幅チャンバに流体を圧送するための第3のポンプに接続するように構成されている、態様11～44のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。46. 第3のポンプが、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである、態様45のマイクロ流体カートリッジ。47. 検出試薬チャンバが、空気圧を受けるように構成されたポートに接続されている、態様1～46のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。48. 検出試薬チャンバが、第3のチャネルを介して第3のポートに流体接続されている、態様1～47のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。49. マイクロ流体カートリッジが、検出試薬チャンバから検出チャンバに流体を圧送するための第4のポンプに接続するように構成されている、態様1～48のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。50. 第4のポンプが、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである、態様49のマイクロ流体カートリッジ。51. ガスマニホールドに結合するように構成された複数のポートをさらに含み、複数のポートが、空気圧を受けるように構成されている、態様1～50のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。52. マイクロ流体カートリッジのいずれかのチャンバが態様50の複数のポートに接続されている、態様1～51のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。53. バルブが電流電気信号の印加により開かれる、態様1～52のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。54. 検出試薬チャンバが円形である、態様1～53のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。55. 検出試薬チャンバが細長い、態様1～53のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。56. 検出試薬チャンバが六角形である、態様1～53のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。57. 抵抗チャネルの領域が、正味の流れ方向に対して垂直な方向に流れを導くように成形される、態様2～56のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。58. 抵抗チャネルの領域が、抵抗チャネルの2つの末端で画定される軸に対して垂直な方向に流れを導くように成形される、態様2～56のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。59. 抵抗チャネルの領域が、マイクロ流体カートリッジのz軸に沿って流れを導くように成形される、態様2～58のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。60. バルブが、増幅混合物スプリッターを介して2つの検出チャンバに流体接続されている、態様1～59のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。61. バルブが、増幅混合物スプリッターを介して3、4、5、6、7、8、9、または10個の検出チャンバに流体接続されている、態様1～60のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。62. 検出試薬チャンバにおよび検出チャンバに流体接続された第2のバルブをさらに含む、態様1～61のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。63. 検出チャンバが疎水性PTFEベントで通気される、態様1～62のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。64. 検出チャンバが、光学的に透明な表面を含む、態様1～63のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。65. 増幅チャンバが、10μL～500μLの流体を保持するように構成されている、態様1～64のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。66. 増幅試薬チャンバが、10μL～500μLの流体を保持するように構成されている、態様11～65のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。67. マイクロ流体カートリッジが、核酸を含む2μL～100μLの試料を受け入れるように構成されている、態様1～66のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。68. 増幅試薬チャンバが、5～200μlの増幅緩衝液を含む、態様1～67のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。69. 増幅チャンバが45μlの増幅緩衝液を含む、態様1～68のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。70. 検出試薬チャンバが、プログラマブルヌクレアーゼとガイド核酸と標識されたディテクター核酸とを含む5～200μlの流体を貯蔵する、態様1～69のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。71. 2、3、4、5、6、7、または8個の検出チャンバを含む、態様1～70のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。72. 2、3、4、5、6、7、または8個の検出チャンバが、単一の試料チャンバに流体接続されている、態様71のマイクロ流体カートリッジ。73. 検出チャンバが、最大100μL、200μL、300μL、または400μLの流体を保持する、態様1～72のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。74. 5～7つの層を含む、態様1～73のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。75. 図130Bに示す層を含む、態様1～74のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。76. スリップルアーチップに適合するように構成された試料投入口をさらに含む、態様1～75のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。77. スリップルアーチップが、試料を保持するシリンジに合うように適合されている、態様76のマイクロ流体カートリッジ。78. 試料投入口が気密封止可能である、態様76～77のいずれか1つのマイクロ流体カート
リッジ。79. スライドバルブをさらに含む、態様1～78のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。80. スライドバルブが増幅試薬チャンバを増幅チャンバに接続する、態様79のマイクロ流体カートリッジ。81. スライドバルブが増幅チャンバを検出試薬チャンバに接続する、態様79または80のマイクロ流体カートリッジ。82. スライドバルブが増幅試薬チャンバを検出チャンバに接続する、態様79～81のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。83. 態様1～82のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジを受け入れるように構成された、マニホールド。84. 検出チャンバに流体を圧送するように構成されたポンプと、検出チャンバを照明するように構成された照明源と、標識されたディテクター核酸によって生成された検出可能な信号を検出するように構成された検出器と、増幅チャンバを加熱するように構成されたヒーターとを含む、態様83のマニホールド。85. 検出チャンバを加熱するように構成された第2のヒーターをさらに含む、態様84のマニホールド。86. 照明源が広域スペクトル光源である、態様84～85のいずれか1つのマニホールド。87. 照明源の光が、5nm未満の帯域幅を有する照明をもたらす、態様84～86のいずれか1つのマニホールド。88. 照明源が発光ダイオードである、態様84～87のいずれか1つのマニホールド。89. 発光ダイオードが、白色光、青色光、または緑色光を生成する、態様88のマニホールド。90. 検出可能な信号が光である、態様84～89のいずれか1つのマニホールド。91. 検出器がカメラまたはフォトダイオードである、態様84～90のいずれか1つのマニホールド。92. 検出器が、100nm未満、75nm未満、50nm未満、40nm未満、30nm未満、20nm未満、10nm未満、または5nm未満の検出帯域幅を有する、態様84～91のいずれか1つのマニホールド。93. 検出チャンバと検出器との間に存在するように構成された光学フィルターをさらに含む、態様84～92のいずれか1つのマニホールド。94. 増幅チャンバが増幅試薬を含む、態様1～93のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。95. 増幅試薬チャンバが増幅試薬を含む、態様11～94のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。96. 増幅試薬が、プライマー、ポリメラーゼ、dNTP、増幅緩衝液を含む、態様94～95のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。97. 増幅チャンバが溶解緩衝液を含む、態様1～96のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。98. 増幅試薬チャンバが溶解緩衝液を含む、態様11～97のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。99. 増幅試薬が逆転写酵素を含む、態様94～98のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。100. 増幅試薬が熱サイクル増幅のための試薬を含む、態様94～99のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。101. 増幅試薬が等温増幅のための試薬を含む、態様94～99のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。102. 増幅試薬が、転写増幅（TMA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（cHDA）、鎖置換増幅（SDA）、ループ介在増幅（LAMP）、指数関数的増幅反応（EXPAR）、ローリングサークル増幅（RCA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、多置換増幅（MDA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（HIP）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、または改良多置換増幅（IMDA）のための試薬を含む、態様94～101のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。103. 増幅試薬がループ介在増幅（LAMP）のための試薬を含む、態様94～102のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。104. 溶解緩衝液および増幅緩衝液が単一の緩衝液である、態様16～103のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。105. 溶解緩衝液貯蔵チャンバが溶解緩衝液を含む、態様16～104のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。106. 溶解緩衝液のpHがpH 4～pH 5である、態様16～105のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。107. マイクロ流体カートリッジが逆転写試薬をさらに含む、態様1～106のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。108. 逆転写試薬が、逆転写酵素、プライマー、およびdNTPを含む、態様107のマイクロ流体カートリッジ。109. プログラマブルヌクレアーゼがRuvC触媒作用ドメインを含む、態様1～108のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。110. プログラマブルヌクレアーゼがV型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である、態様1～109のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。111. V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas12タンパク質である、態様110のマイクロ流体カートリッジ。112. Cas12タンパク質が、Cas12aポリペプチド、Cas12bポリペプチド、Cas12cポリペプチド、Cas12dポリペプチド、Cas12eポリペプチド、C2c4ポリペプチド、C2c8ポリペプチド、C2c5ポリペプチド、C2c10ポリペプチド、およびC2c9ポリペプチドを含む、態様111のマイクロ流体カートリッジ。113. Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様110～112のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。114. Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37から選択される、態様110～113のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。115. V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質がCas14タンパク質である、態様110のマイクロ流体カートリッジ。116. Cas14タンパク質が、Cas14aポリペプチド、Cas14bポリペプチド、Cas14cポリペプチド、Cas14dポリペプチド、Cas14eポリペプチド、Cas14fポリペプチド、Cas14gポリペプチド、Cas14hポリペプチド、Cas14iポリペプチド、Cas14jポリペプチド、またはCas14kポリペプチドを含む、態様115のマイクロ流体カートリッジ。117. Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様115～116のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。118. Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129から選択される、態様115～117のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。119. V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質がCasФタンパク質である、態様110のマイクロ流体カートリッジ。120. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様119のマイクロ流体カートリッジ。121. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321から選択される、態様119～120のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。122. 増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写するための1つまたは複数のチャンバをさらに提供する、態様1～121のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。123. インビトロ転写が、増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写のための試薬に接触させることを含む、態様122のマイクロ流体カートリッジ。124. インビトロ転写のための試薬がRNAポリメラーゼ、NTP、およびプライマーを含む、態様123のマイクロ流体カートリッジ。125. プログラマブルヌクレアーゼがHEPN切断ドメインを含む、態様1～124のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。126. プログラマブルヌクレアーゼがVI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である、態様1～125のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。127. VI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas13タンパク質である、態様126のマイクロ流体カートリッジ。128. Cas13タンパク質が、Cas13aポリペプチド、Cas13bポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13dポリペプチド、またはCas13eポリペプチドを含む、態様127のマイクロ流体カートリッジ。129. Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:137のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様127～128のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。130. Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:137から選択される、態様127～129のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。131. 標的核酸がウイルスに由来する、態様1～130のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。132. ウイルスが呼吸器ウイルスを含む、態様131のマイクロ流体カートリッジ。133. 呼吸器ウイルスが上気道ウイルスである、態様132のマイクロ流体カートリッジ。134. ウイルスがインフルエンザウイルスを含む、態様131のマイクロ流体カートリッジ。135. ウイルスがコロナウイルスを含む、態様131～133のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。136. コロナウイルス標的核酸が、SARS-CoV-2に由来する、態様135のマイクロ流体カートリッジ。137. コロナウイルス標的核酸が、N遺伝子、E遺伝子、またはそれらの組み合わせに由来する、態様135～136のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。138. コロナウイルス標的核酸が、SEQ ID NO:333～SEQ ID NO:338のいずれか1つの配列を有する、態様135～137のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。139. ガイド核酸がガイドRNAである、態様135～138のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。140. ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:328のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様135～139のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。141. ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:328のいずれか1つから選択される、態様135～140のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。142. 対照核酸をさらに含む、態様1～141のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。143. 対照核酸が検出チャンバ内に存在する、態様142のマイクロ流体カートリッジ。144. 対照核酸がRNasePである、態様142～143のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。145. 対照核酸がSEQ ID NO:379の配列を有する、態様142～144のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。146. ガイド核酸が、SEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様142～144のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。147. ガイド核酸が、SEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332のいずれか1つから選択される、態様142～146のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。148. ウイルスが、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む、態様134～147のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。149. ガイド核酸が、複数の標的配列を標的とする、態様1～148のマイクロ流体カートリッジ。150. システムが、ウイルスに対してタイリングされた複数のガイド配列を含む、態様1～149のマイクロ流体カートリッジ。151. 複数の標的配列が、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、および第3の病原体に由来する配列を含む、態様150のマイクロ流体カートリッジ。152. 標識されたディテクター核酸が、検出部分を含む一本鎖レポーターを含む、態様1～151のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。153. 検出部分が、フルオロフォア、FRET対、フルオロフォア/クエンチャー対、または電気化学的レポーター分子である、態様152のマイクロ流体カートリッジ。154. 電気化学的レポーター分子が、図149に示される種を含む、態様153のマイクロ流体カートリッジ。155. ディテクター核酸の切断により、標識されたディテクターが、検出可能な信号を生成した、態様1～154のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ。156. 検出可能な信号が、比色信号、蛍光信号、電流測定信号、または電位差測定信号である、態様155のマイクロ流体カートリッジ
。157. a）対象由来の試料を提供する工程;b）試料を態様1～156のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジに添加する工程;c）態様84～156のいずれか1つの検出可能な信号を標的核酸の存在または非存在と相関させる工程;およびd）任意で、検出可能な信号を定量し、それにより、試料中に存在する標的核酸の量を定量する工程を含む、標的核酸を検出する方法。158. 標的核酸を検出する方法における、態様1～156のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジの使用。159. ターゲティング核酸を検出する方法における、態様1～156のいずれか1つのシステムの使用。160. 態様30～63、66、150、153のいずれか1つの標的核酸を検出する方法における、プログラマブルヌクレアーゼの使用。161. 標的核酸を検出する方法における、態様66～87のいずれか1つの組成物の使用。162. 態様88、90～106または151のいずれか1つの試料中のウイルス由来の標的デオキシリボ核酸をアッセイする方法における、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼの使用。163. 態様88、90～106または152のいずれか1つの試料中のウイルス由来の標的リボ核酸をアッセイする方法における、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼの使用。164. 態様108～120、123～148または156のいずれか1つの試料中の標的核酸を検出する方法における、プログラマブルヌクレアーゼの使用。165. a）プログラマブルヌクレアーゼ、b）ガイド核酸、c）ガイド核酸が標的核酸のセグメントへ結合する際に切断され得る標識されたディテクター核酸を含む乾燥試薬を含む、ガラスキャピラリー。166. 乾燥試薬を1年超保存することができる、態様165のガラスキャピラリー。167. 乾燥試薬を最大7ヶ月、最大8ヶ月、最大9ヶ月、最大10ヶ月、または最大11ヶ月保存することができる、態様165のガラスキャピラリー。168. 乾燥試薬を室温で安定に保存することができる、態様165～167のいずれか1つのガラスキャピラリー。169. 乾燥試薬を4°Cで安定に保存することができる、態様165～168のいずれか1つのガラスキャピラリー。170. 標的核酸を含む試料を、キャピラリーを通して溶出させることができる、態様165～169のいずれか1つのガラスキャピラリー。171. 試料が乾燥試薬を再水和する、態様98のガラスキャピラリー。172. ガラスキャピラリーが、切断された標識されたディテクター核酸から放出された検出可能な信号の読み出しのための態様1～156のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジまたは態様83～93のいずれか1つのマニホールドに適合されており、検出可能な信号が光学信号である、態様165～170のいずれか1つのガラスキャピラリー。173. a）対象由来の試料を提供する工程;b）試料を態様165～172のいずれか1つのガラスキャピラリーに添加する工程;c）態様84～173のいずれか1つの検出可能な信号を標的核酸の存在または非存在と相関させる工程;およびd）任意で、検出可能な信号を定量し、それにより、試料中に存在する標的核酸の量を定量する工程を含む、標的核酸を検出する方法。174. a）プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、標識されたディテクター核酸を含む上部チャンバであって、標識されたディテクター核酸が、ガイド核酸が標的核酸のセグメントへ結合する際に切断され得、封止された第1の側面およびフィルターを含む第2の側面を有する、上部チャンバ、ならびにb）増幅のための試薬と標的核酸を有する試料とを含む下部チャンバであって、上部チャンバの第2の側面を介して上部チャンバに結合されている、下部チャンバを含む、スピンスルーカラム。175. 遠心分離されると、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、および標識されたディテクター核酸がフィルターを介して底部チャンバに流れる、態様174のスピンスルーカラム。176. 下部チャンバが、切断された標識されたディテクター核酸からの検出可能な信号について画像化され得る、態様174～175のいずれか1つのスピンスルーカラム。177. スピンスルーカラムが気密封止可能である密閉して封止され得る、態様174～176のいずれか1つのスピンスルーカラム。178. 上部チャンバが下部チャンバから熱的に隔離されている、態様174～177のいずれか1つのスピンスルーカラム。179. a）i）ディテクター核酸およびii）プログラマブルヌクレアーゼと標的核酸のセグメントにハイブリダイズする非天然のガイド核酸とを含む組成物と、試料を接触させる工程であって、非天然のガイド核酸がコロナウイルス標的核酸のセグメントへハイブリタイズされると、プログラマブルヌクレアーゼディテクター核酸である、工程;ならびにb）信号の変化についてアッセイする工程であって、信号の変化がディテクター核酸の切断によってもたらされる、工程を含む、試料中のコロナウイルス標的核酸のセグメントについてアッセイする方法。180. コロナウイルス標的核酸が、SARS-CoV-2に由来する、態様179の方法。181. コロナウイルス標的核酸が、E遺伝子、N遺伝子、またはそれらの組み合わせに由来する、態様179の方法。182. コロナウイルス標的核酸が、SEQ ID NO:333～SEQ ID NO:338のいずれか1つの配列を有する、態様179の方法。183. ガイド核酸がガイドRNAである、態様179～182のいずれか1つの方法。184. ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:332のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様179～183のいずれか1つの方法。185. ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:332のいずれか1つから選択される、態様179～184のいずれか1つの方法。186. コロナウイルス標的核酸を増幅する工程をさらに含む、態様179～185のいずれか1つの方法。187. コロナウイルス標的核酸の増幅が、試料を増幅用の試薬と接触させる工程を含む、態様186の方法。188. 増幅用の試薬への試料への接触が、ディテクター核酸への、ディテクター核酸および組成物への試料の接触の前に行われる、態様187の方法。189. 増幅用の試薬への試料の接触が、ディテクター核酸への、ディテクター核酸および組成物への試料の接触と同時に行われる、態様187の方法。190. 増幅が熱サイクル増幅を含む、態様186～189のいずれか1つの方法。191. 増幅が等温増幅を含む、態様186～189のいずれか1つの方法。192. 増幅が、転写増幅（TMA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（cHDA）、鎖置換増幅（SDA）、ループ介在増幅（LAMP）、指数関数的増幅反応（EXPAR）、ローリングサークル増幅（RCA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、多置換増幅（MDA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（HIP）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、または改良多置換増幅（IMDA）を含む、態様186～191のいずれか1つの方法。193. 増幅がループ介在増幅（LAMP）を含む、態様186～192のいずれか1つの方法。194. 増幅用試薬が、増幅プライマー、ポリメラーゼ、およびdNTPを含む、態様187～193のいずれか1つの方法。195. 増幅用試薬が、FIPプライマー、BIPプライマー、LFプライマー、およびLBプライマーを含む、態様187～194のいずれか1つの方法。196. 増幅プライマーが、SEQ ID NO:348～SEQ ID NO:353、またはSEQ ID NO:356～SEQ ID NO:359から選択される、態様194～195のいずれか1つの方法。197. コロナウイルス標的核酸を逆転写する工程をさらに含む、態様179～196のいずれか1つの方法。198. 逆転写が、試料を逆転写のための試薬に接触させることを含む、197の方法。199. 逆転写のための試薬が、逆転写酵素、オリゴヌクレオチドプライマー、およびdNTPを含む、198の方法。200. 逆転写のための試薬への試料の接触が、ディテクター核酸への、ディテクター核酸および組成物への試料の接触の前に、増幅用試薬への試料の接触の前に、またはその両方の前に行われる、態様198～199のいずれか1つの方法。201. 逆転写のための試薬への試料の接触が、ディテクター核酸への、ディテクター核酸および組成物への試料の接触と同時に、増幅用試薬への試料の接触と同時に、またはその両方と同時に行われる、態様198～200のいずれか1つの方法。202. 第2のディテクター核酸ならびにプログラマブルヌクレアーゼと対照核酸のセグメントにハイブリダイズする非天然のガイド核酸とを含む組成物に、対照核酸を接触させることによって、対照配列についてアッセイする工程をさらに含み、非天然のガイド核酸が対照核酸のセグメントにハイブリタイズすると、プログラマブルヌクレアーゼディテクター核酸である、態様179～201のいずれか1つの方法。203. 対照核酸がRNase Pである、態様202の方法。204. 対照核酸がSEQ ID NO:339の配列を有する、態様202～203のいずれか1つの方法。205. ガイド核酸が、SEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様179～204のいずれか1つ方法。206. ガイド核酸がSEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332である、態様179～205のいずれか1つの方法。207. ラテラルフローストリップ上で実行される、態様179～206のいずれか1つの方法。208. ラテラルフローストリップが、試料パッド領域、コントロールライン、および試験ラインを含む、態様207の方法。209. 試料を試料パッド領域に添加する工程をさらに含む、態様208の方法。210. 未切断レポーター分子の存在または非存在がコントロールラインで検出され、切断レポーター分子の存在または非存在が試験ラインに存在する、態様208～209のいずれか1つの方法。211. 態様1～81のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ内で実行される、態様179～210のいずれか1つの方法。212. 試料を溶解する工程をさらに含む、態様179～211のいずれか1つの方法。213. 試料の溶解が、試料を溶解緩衝液に接触させることを含む、態様212の方法。214. 溶解緩衝液が緩衝剤、pH 4～pH 5のpH、および還元剤を含む、態様213の方法。215. 還元剤が、N-アセチルシステイン、ジチオスレイトール、またはトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンである、態様214の方法。216. 緩衝剤が、トリス、ホスフェート、またはHEPESである、態様214～215のいずれか1つの方法。217. 溶解緩衝液がキレート剤をさらに含む、態様213～216のいずれか1つの方法。218. キレート剤がEDTAまたはEGTAである、態様217の方法。219. 溶解緩衝液がマグネシウム塩をさらに含む、態様213～218のいずれか1つの方法。220. マグネシウム塩が、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、または酢酸マグネシウムである、態様219の方法。221. プログラマブルヌクレアーゼがRuvC触媒作用ドメインを含む、態様179～220のいずれか1つの方法。222. プログラマブルヌクレアーゼがV型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である、態様179～221のいずれか1つの方法。223. V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas12タンパク質である、態様222の方法。224. Cas12タンパク質が、Cas12aポリペプチド、Cas12bポリペプチド、Cas12cポリペプチド、Cas12dポリペプチド、Cas12eポリペプチド、C2c4ポリペプチド、C2c8ポリペプチド、C2c5ポリペプチド、C2c10ポリペプチド、およびC2c9ポリペプチドを含む、態様223の方法。225. Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様223～224のいずれか1つの方法。226. Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37から選択される、態様223～225のいずれか1つの方法。227. V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質がCas14タンパク質である、態様222の方法。228. Cas14タンパク質が、Cas14aポリペプチド、Cas14bポリペプチド、Cas14cポリペプチド、Cas14dポリペプチド、Cas14eポリペプチド、Cas14fポリペプチド、Cas14gポリペプチド、Cas14hポリペプチド、Cas14iポリペプチド、Cas14jポリペプチド、またはCas14kポリペプチドを含む、態様227の方法。229. Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくと
も90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様227～228のいずれか1つの方法。230. Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129から選択される、態様227～229のいずれか1つの方法。231. V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質がCasФタンパク質である、態様222の方法。232. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様231の方法。233. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321から選択される、態様231～232のいずれか1つの方法。234. 増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写する工程をさらに含む、態様179～233のいずれか1つの方法。235. インビトロ転写が、増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写のための試薬に接触させることを含む、態様234の方法。236. インビトロ転写のための試薬がRNAポリメラーゼ、プライマー、およびNTPを含む、態様235の方法。237. プログラマブルヌクレアーゼがHEPN切断ドメインを含む、態様179～236のいずれか1つの方法。238. プログラマブルヌクレアーゼがVI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である、態様179～237のいずれか1つの方法。239. VI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas13タンパク質である、態様238の方法。240. Cas13タンパク質が、Cas13aポリペプチド、Cas13bポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13dポリペプチド、またはCas13eポリペプチドを含む、態様239の方法。241. Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:147のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様239～240のいずれか1つの方法。242. Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:147から選択される、態様239～241のいずれか1つの方法。243. 2つ以上のコロナウイルス標的核酸の多重化検出をさらに含む、態様179～242のいずれか1つの方法。244. 2つ以上のコロナウイルス標的核酸および対照核酸の多重化検出をさらに含む、態様179～243のいずれか1つの方法。245. 多重化検出が、試験管、ウェルプレート、ラテラルフローストリップ、またはマイクロ流体カートリッジ内で実行される、態様243～244のいずれか1つの方法。246. 試料溶解、逆転写、増幅、インビトロ転写、検出、またはそれらの任意の組み合わせが、単一の体積で行われる、態様179～245のいずれか1つの方法。247. 試料溶解、逆転写、増幅、インビトロ転写、検出、またはそれらの任意の組み合わせが、別々の体積で行われる、態様179～246のいずれか1つの方法。248. SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:332のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する非天然のガイド核酸を含む、組成物。249. ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:332のいずれか1つから選択される、態様248の組成物。250. 態様179～247のいずれか1つのディテクター核酸をさらに含む、態様248～249のいずれか1つの組成物。251. 態様179～247のいずれか1つのプログラマブルヌクレアーゼをさらに含む、態様248～250のいずれか1つの組成物。252. 態様187～247のいずれか1つの増幅用試薬をさらに含む、態様248～251のいずれか1つの組成物。253. 態様200～247のいずれか1つの逆転写のための試薬をさらに含む、態様248～252のいずれか1つの組成物。254. 態様135～254のいずれか1つのインビトロ転写用の試薬をさらに含む、態様248～253のいずれか1つの組成物。255. 態様213～247のいずれか1つの溶解緩衝液をさらに含む、態様248～254のいずれか1つの組成物。256. 態様244～247のいずれか1つの対照核酸をさらに含む、態様248～255のいずれか1つの組成物。257. 態様202～247のいずれか1つのガイド核酸をさらに含む、態様248～256のいずれか1つの組成物。258. 態様245～247のいずれか1つのラテラルフローストリップ中に存在する、態様248～257のいずれか1つの組成物。259. 態様1～156のいずれか1つのマイクロ流体カートリッジ中に存在する、態様248～258のいずれか1つの組成物。260. 態様179～247のいずれか1つの試料中のコロナウイルス標的核酸のセグメントについてアッセイする方法における、プログラマブルヌクレアーゼの使用。261. 標的核酸を検出する方法における、態様248～268のいずれか1つの組成物の使用。

以下の態様は、本明細書に開示される特徴の組み合わせの非限定的な順列を列挙する。特徴の組み合わせの他の順列も企図される。特に、これらの番号付けされた態様のそれぞれは、列挙された順序とは無関係に、前または後のすべての番号付けされた態様に依存するかまたは関連すると考えられる。1. ウイルス由来の標的配列を標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化することができるプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって、検出可能な信号を生成することができる、レポーターを含む、標的核酸を検出するためのシステム。2. レポーターが、検出部分を含む一本鎖レポーターを含む、態様1のシステム。3. ウイルスがインフルエンザウイルスまたはコロナウイルスを含む、態様1のシステム。4. インフルエンザウイルスが、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む、態様3のシステム。5. ウイルスが呼吸器ウイルスを含む、態様1のシステム。6. 呼吸器ウイルスが上気道ウイルスである、態様5のシステム。7. ガイド核酸が、複数の標的配列を標的とする、態様1のシステム。8. システムが、ウイルスに対してタイリングされた複数のガイド配列を含む、態様1のシステム。9. 複数の標的配列が、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、および第3の病原体に由来する配列を含む、態様7のシステム。10. 一本鎖レポーターが、5’末端に検出部分を含む、態様2のシステム。11. 一本鎖レポーターがビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を含む、態様2のシステム。12. 一本鎖レポーターが、基材にコンジュゲートさせることができる3’末端に化学機能ハンドルを含む、態様2のシステム。13. 基材が磁気ビーズである、態様12のシステム。14. 基材が反応チャンバの表面である、態様12のシステム。15. 反応チャンバの下流が試験ラインである、態様14のシステム。16. 試験ラインがストレプトアビジンを含む、態様15のシステム。17. 試験ラインの下流がフロー制御ラインである、態様15のシステム。18. フロー制御ラインが抗IgG抗体を含む、態様17のシステム。19. 抗IgG抗体が抗ウサギIgG抗体を含む、態様18のシステム。20. 活性化ヌクレアーゼが一本鎖レポーターを切断することができ、ビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を放出する、態様11のシステム。21. ビオチン-dT/FAM部分が、試験ラインでストレプトアビジンに結合することができる、態様20のシステム。22. レポーターが電気活性レポーターである、態様1のシステム。23. 電気活性レポーターがビオチンおよびメチレンブルーを含む、態様22のシステム。24. レポーターが酵素-核酸である、態様1のシステム。25. 酵素-核酸がインベルターゼ酵素である、態様24のシステム。26. 酵素-核酸の酵素が立体障害型酵素である、態様24のシステム。27. 酵素-核酸の核酸の切断により、酵素が機能的となる、態様24のシステム。28. 検出可能な信号が、比色信号、蛍光信号、電流測定信号、または電位差測定信号である、態様1のシステム。29. 標的配列を標的とするガイド核酸;ガイド核酸および標的配列と複合体を形成した場合に活性化することができるプログラマブルヌクレアーゼ;ならびに、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって、検出可能な信号を生成することができる、レポーターに、試料を接触させる工程を含む、試料中の標的核酸を検出するための方法。30. 標的核酸が外因性病原体に由来する、態様29の方法。31. 外因性病原体がウイルスを含む、態様30の方法。32. ウイルスがインフルエンザウイルスまたはコロナウイルスを含む、態様31の方法。33. インフルエンザウイルスが、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む、態様32の方法。34. ウイルスが呼吸器ウイルスを含む、態様31の方法。35. 呼吸器ウイルスが上気道ウイルスである、態様34の方法。36. 検出可能な信号が、試料中のウイルスの存在を示す、態様31の方法。37. ウイルスを含む試料が採取された対象を診断する工程をさらに含む、態様31の方法。38. 対象がヒトである、態様37の方法。39. 試料が、頬スワブ、鼻スワブまたは尿である、態様29の方法。40. レポーターが、検出部分を含む一本鎖レポーターを含む、態様29の方法。41. ガイド核酸が、複数の標的配列を標的とする、態様29の方法。42. 方法が、ウイルスに対して複数のガイド配列をタイリングする工程を含む、態様31のシステム。43. 複数の標的配列が、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、および第3の病原体に由来する配列を含む、態様42の方法。44. 一本鎖レポーターが、5’末端に検出部分を含む、態様40の方法。45. 一本鎖レポーターがビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を含む、態様40の方法。46. 一本鎖レポーターが、基材にコンジュゲートさせることができる3’末端に化学機能ハンドルを含む、態様40の方法。47. 基材が磁気ビーズである、態様46の方法。48. 基材が反応チャンバの表面である、態様46の方法。49. 反応チャンバの下流が試験ラインである、態様48の方法。50. 試験ラインがストレプトアビジンを含む、態様49の方法。51. 試験ラインの下流がフローコントロールラインである、態様49の方法。52. フローコントロールラインが抗IgG抗体を含む、態様51の方法。53. 抗IgG抗体が抗ウサギIgG抗体を含む、態様52の方法。54. 活性化ヌクレアーゼが、一本鎖レポーターを切断することができ、ビオチン-dT/FAM部分またはビオチン-dT/ROX部分を放出する、態様45の方法。55. ビオチン-dT/FAM部分が、試験ラインでストレプトアビジンに結合することができる、態様54の方法。56. レポーターが電気活性レポーターである、態様29の方法。57. 電気活性レポーターがビオチンおよびメチレンブルーを含む、態様56の方法。58. レポーターが酵素-核酸である、態様29の方法。59. 酵素-核酸がインベルターゼ酵素である、態様58の方法。60. 酵素-核酸の酵素が立体障害型酵素である、態様58の方法。61. 酵素-核酸の核酸の切断により、酵素が機能的となる、態様58の方法。62. 検出可能な信号が、比色信号、蛍光信号、電流測定信号、または電位差測定信号である、態様29の方法。63. 呼吸器ウイルスが下気道ウイルスである、態様5のシステム。64. 呼吸器ウイルスが下気道ウイルスである、態様34の方法。65. a）DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼと; b）標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸とを含み、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼが、ガイド核酸に結合して複合体を形成する、組成物。66. RNAレポーターをさらに含む、態様65の組成物。67. ウイルス由来の標的デオキシリボ核酸をさらに含む、態様65および66のいずれか1つの組成物。68. 標的デオキシリボ核酸が核酸のアンプリコンである、態様65～67のいずれか1つの組成物。69. 核酸がデオキシリボ核酸またはリボ核酸である、態様68の組成物。70. DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼがVI型CRISPR/Cas酵素である、態様65～69のいずれか1つの組成物。71. DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼがCas13である、態様65～70のいずれか1つの組成物。72. DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼがCas13aである、態様65～71のいずれか1つの組成物。73. Cas13aがLbuCas13aまたはLwaCas13aである、態様72の組成物。74. pH 6.8～pH 8.2のpHを有する、態様65～73のいずれか1つの組成物。75. 標的デオキシリボ核酸が3’末端にグアニンを欠く、態様65～74のいずれか1つの組成物。76. 標的デオキシリボ核酸が一本鎖デオキシリボ核酸である、態様65～75のいずれか1つの組成物。77. 支持媒体をさらに含む、態様65～76のいずれか1つの組成物。78. ラテラルフローアッセイ装置をさらに含む、態様65～77のいずれか1つの組成物。79. 蛍光検出用に構成された装置をさらに含む、態様65～78のいずれか1つの組成物。80. 第2のガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼをさらに含み、第2のガイド核酸が、ガイド核酸を含む第2の標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む、態様65～79のいずれか1つの組成物。81. DNAレポーターをさらに含む、態様80の組成物。82. DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼがV型CRISPR/Cas酵素である、態様80および81のいずれか1つの組成物。83. DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼがCas12である、態様81～82のいずれか1つの組成物。84. Cas12が、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、またはCas12eである、態様83の組成物。85. DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼがCas14である、態様80～82のいずれか1つの組成物。86. Cas14が、Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、またはCas14hである、態様85の組成物。87. V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質がCasФタンパク質である、態様82の組成物。88. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様87の組成物。89. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321から選択される、態様87～88のいずれか1つの組成物。90. ガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼを含む複合体であって、ガイド核酸が、標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む、複合体に、試料を接触させる工程、ならびに、複数のRNAレポーターの少なくとも一部のRNAレポーターの切断によって生成される信号をアッセイする工程を含む、試料中のウイルス由来の標的デオキシリボ核酸をアッセイする方法。91. 試料中の核酸を増幅して標的デオキシリボ核酸を生成する工程;ガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼを含む複合体であって、ガイド核酸が、標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む、複合体に、標的デオキシリボ核酸を接触させる工程、ならびに、複数のRNAレポーターのうちの少なくとも一部のRNAレポーターの切断によって生じる信号についてアッセイする工程を含む、試料中のウイルス由来の標的シリボ核酸をアッセイする方法。92. DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼがVI型CRISPRヌクレアーゼである、態様90または91のいずれか1つの方法。93. DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼがCas13である、態様90～92のいずれか1つの方法。94. Cas13がCas13aである、態様93の方法。95. Cas13aがLbuCas13aまたはLwaCas13aである、態様94の方法。96. 複数のレポーターのうちの少なくとも一部のRNAレポーターの切断がpH 6.8～pH 8.2で起こる、態様90～95のいずれか1つの方法。97. 標的デオキシリボ核酸が3’末端にグアニンを欠く、態様90～96のいずれか1つの方法。98. 標的デオキシリボ核酸が一本鎖デオキシリボ核酸である、態様90～97のいずれか1つの方法。99. 標的デオキシリボ核酸がリボ核酸のアンプリコンである、態様90～98のいずれか1つの方法。100. 標的デオキシリボ核酸またはリボ核酸が生物に由来する、態様90～99のいずれか1つの方法。101. 生物がウイルス、細菌、植物または動物である、態様100の方法。102. 標的デオキシリボ核酸が核酸増幅方法によって生成される、態様90～101のいずれか1つの方法。103. 核酸増幅方法が等温増幅である、態様102の方法。104. 核酸増幅方法が熱増幅である、態様102の方法。105. 核酸増幅方法が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、転写増幅（TMA）、鎖置換増幅（SDA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、ループ介在増幅（LAMP）、ローリングサークル増幅（RCA）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、または改良多置換増幅（IMDA）、または核酸配列に基づく増幅（NASBA）である、態様102の方法。106. 信号が、蛍光、発光、比色、電気化学、酵素、熱量測定、光学、電流測定、または電位差測定である、態様90～105のいずれか1つの方法。107. 試料を、第2のガイド核酸およびDNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼ
に接触させる工程をさらに含み、第2のガイド核酸が、ガイド核酸を含む第2の標的デオキシリボ核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含む、態様90～106のいずれか1つの方法。108. 複数のDNAレポーターのうちの少なくとも一部のDNAレポーターの切断によって生じる信号についてアッセイする工程をさらに含む、態様39の方法。109. DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼがV型CRISPRヌクレアーゼである、態様107または108のいずれか1つの方法。110. DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼがCas12である、態様107～109のいずれか1つの方法。111. Cas12が、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、またはCas12eである、態様110の方法。112. DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼがCas14である、態様107～109の方法。113. Cas14が、Cas14a、Cas14b、Cas14c、Cas14d、Cas14e、Cas14f、Cas14g、またはCas14hである、態様112の方法。114 .DNA活性化プログラマブルDNAヌクレアーゼがCasФタンパク質である、態様107～109の方法。115. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、態様114の方法。116. CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321から選択される、態様114～115のいずれか1つの方法。117. ガイド核酸がcrRNAを含む、態様90～116のいずれか1つの方法。118. ガイド核酸がcrRNAおよびtracrRNAを含む、態様90～117のいずれか1つの方法。119. 信号が、少なくとも一部のRNAレポーターの切断前に存在する、態様90～118のいずれか1つの方法。120. 信号が、少なくとも一部のRNAレポーターの切断前に存在しない、態様90～119のいずれか1つの方法。121. 試料が、血液、血清、血漿、唾液、尿、粘膜試料、腹膜試料、脳脊髄液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽頭滲出液、尿道または膣分泌物、滲出液、浸出液、または組織を含む、態様90～120のいずれか1つの方法。122. 支持媒体上で実行される、態様90～121のいずれか1つの方法。123. ラテラルフローで実行される、態様90～122のいずれか1つの方法。124. 蛍光検出用に構成された装置で実行される、態様90～123のいずれか1つの方法。125. 標的核酸を提供する工程であって、ガイド核酸が標的核酸にハイブリダイズし、標的核酸の配列の少なくとも60％がF1c領域とB1領域との間またはF1とB1c領域との間に存在する、工程;および、i）F2領域の配列のF1c領域5’の配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域の配列のB1c領域5’の配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域の配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域の配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマーを設計する工程を含む、標的核酸を増幅するための複数のプライマーを設計する方法。126. i）F2領域に対応する配列のF1c領域5’に対応する配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域に対応する配列のB1c領域5’に対応する配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域に対応する配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域に対応する配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマー;ガイド核酸が標的核酸にハイブリタイズし、標的核酸の配列の少なくとも60％がF1c領域とB1領域との間またはF1領域とB1c領域との間に存在する、ガイド核酸;レポーター;および、ガイド核酸と複合体を形成した場合にレポーターを切断するプログラマブルヌクレアーゼに、試料を接触させる工程;ならびに、レポーターの切断によって生じる検出可能な信号を測定する工程であって、測定が試料中の標的核酸の検出をもたらす、工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法。127. F1c領域とB1領域との間の配列、またはB1c領域とF1領域との間の配列が、ガイド核酸配列に対して少なくとも50％逆相補的である、態様125～126のいずれか1つの方法。128. ガイド核酸配列が、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、またはそれらの組み合わせの50％以下に対して逆相補的である、態様125～127のいずれか1つの方法。129. ガイド核酸が、フォワードインナープライマーおよびバックワードインナープライマーにハイブリダイズしない、態様125～128のいずれか1つの方法。130. プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、標的核酸の3’である、態様125～129のいずれか1つの方法。131. プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、B1領域の3’およびF1c領域の5’であるか、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、F1領域の3’およびB1c領域の5’である、態様125～130のいずれか1つの方法。132. 標的核酸の3’末端が、F3c領域の5’末端の5’であるか、または標的核酸の3’末端が、B3c領域の5’末端の5’である、態様125～131のいずれか1つの方法。133. 標的核酸の3’末端が、F2c領域の5’末端の5’であるか、または標的核酸の3’末端が、B2c領域の5’末端の5’である、態様125～132のいずれか1つの方法。134. 標的核酸がF1c領域とB1領域との間に存在し、標的核酸の3’末端がF2c領域の3’末端の5’であるか、または標的核酸がB1c領域とF1領域との間に存在し、標的核酸の3’末端がB2c領域の3’末端の5’である、態様125～133のいずれか1つの方法。135. ガイド核酸が、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、またはそれらの任意の組み合わせの50％以下に逆相補的な配列を有する、態様125～134のいずれか1つの方法。136. ガイド核酸配列が、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、またはそれらの任意の組み合わせにハイブリタイズしない、態様125～135のいずれか1つの方法。137. ガイド核酸配列が、F3c領域、F2c領域、F1c領域、B1c領域、B2c領域、B3c領域、またはそれらの任意の組み合わせの配列の50％以下に逆相補的な配列を有する、態様125～136のいずれか1つの方法。138. ガイド核酸配列が、F3c領域、F2c領域、F1c領域、B1c領域、B2c領域、B3c領域、またはそれらの任意の組み合わせの配列にハイブリタイズしない、態様125～137のいずれか1つの方法。139. ガイド核酸にハイブリタイズするB2領域とB1領域との間またはF2領域とF1領域との間の配列を含む標的核酸を提供する工程;および、i）F2領域の配列のF1c領域5’の配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域の配列のB1c領域5’の配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域の配列を含むフォワードアウタープライマーと; iv）B3領域の配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマーを設計する工程を含む、標的核酸を増幅するための複数のプライマーを設計する方法。140. ガイド核酸にハイブリタイズするF1c領域とF2c領域との間またはB1c領域とB2c領域との間の配列を含む標的核酸を提供する工程;および、i）F2領域の配列のF1c領域5’の配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域の配列のB1c領域5’の配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域の配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域の配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマーを設計する工程を含む、標的核酸を増幅するための複数のプライマーを設計する方法。141. i）F2領域に対応する配列のF1c領域5’に対応する配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域に対応する配列のB1c領域5’に対応する配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域に対応する配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域に対応する配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマー;標的核酸が、ガイド核酸にハイブリタイズするB2領域とB1領域との間またはF2領域とF1領域との間の配列を含む、ガイド核酸;レポーター;および、ガイド核酸と複合体を形成した場合にレポーターを切断する、プログラマブルヌクレアーゼに、試料を接触させる工程;ならびに、レポーターの切断によって生じる検出可能な信号を測定する工程であって、測定が試料中の標的核酸の検出をもたらす、工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法。142. i）F2領域に対応する配列のF1c領域5’に対応する配列を含むフォワードインナープライマーと;ii）B2領域に対応する配列のB1c領域5’に対応する配列を含むバックワードインナープライマーと;iii）F3領域に対応する配列を含むフォワードアウタープライマーと;iv）B3領域に対応する配列を含むバックワードアウタープライマーとを含む複数のプライマー;標的核酸が、ガイド核酸にハイブリタイズするF1c領域とF2c領域との間またはB1c領域とB2c領域との間の配列を含む、ガイド核酸;レポーター;および、ガイド核酸と複合体を形成した場合にレポーターを切断する、プログラマブルヌクレアーゼに、試料を接触させる工程;ならびに、レポーターの切断によって生じる検出可能な信号を測定する工程であって、測定が試料中の標的核酸の検出をもたらす、工程を含む、試料中の標的核酸を検出する方法。143. プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、B2領域の3’およびB1領域の5’であるか、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、F2領域の3’およびF1領域の5’である、態様139または態様141のいずれか1つの方法。144. プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、B1c領域の3’およびB2c領域の5’であるか、またはプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）もしくはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、F1c領域の3’およびF2c領域の5’である、態様140または態様142のいずれか1つの方法。145. プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）が、標的核酸の3’である、態様139～144のいずれか1つの方法。146. PAMおよびPFSが、F1c領域の5’末端の5’、B1c領域の5’末端の5’、F3領域の3’末端の3’、B3領域の3’末端の3’、F2領域の3’末端の3’、B2領域の3’末端の3’、またはそれらの任意の組み合わせである、態様145の方法。147. PAMおよびPFSが、F2領域、B3領域、F1c領域、F2領域、B1c領域、B2領域、またはそれらの任意の組み合わせと重複しない、態様146の方法。148. PAMおよびPFSが、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、またはそれらの任意の組み合わせにハイブリタイズしない、態様145～147のいずれか1つの方法。149. 複数のプライマーがループフォワードプライマーをさらに含む、態様125～148のいずれか1つの方法。150. 複数のプライマーがループバックワードプライマーをさらに含む、態様125～149のいずれか1つの方法。151. ループフォワードプライマーがF1c領域とF2c領域との間に存在する、態様149～150のいずれか1つの方法。152. ループバックワードプライマーがB1c領域とB2c領域との間に存在する、態様150～151のいずれか1つの方法。153. 標的核酸が一塩基多型（SNP）を含む、態様125～152のいずれか1つの方法。154. 一塩基多型（SNP）がHERC2 SNPを含む、態様153の方法。155. 一塩基多型（SNP）ががんのリスク増加またはリスク減少に関連する、態様153の方法。156. 標的核酸が一塩基多型（SNP）を含み、検出可能な信号が、一塩基多型（SNP）を含む標的核酸に100％相補的なガイド核酸の存在下では、一塩基多型（SNP）を含む標的核酸に100％未満で相補的なガイド核酸の存在下よりも高い、態様126～138または141～155のいずれか1つの方法。157. 複数のプライマーおよびガイド核酸が、標的核酸を含む試料中に一緒に存在する、態様125～156のいずれか1つの方法。158. 試料を複数のプライマーに接触させることにより標的核酸が増幅される、態様126～138または141～157のいずれか1つの方法。159.
増幅および試料のガイド核酸への接触が同時に行われる、態様158の方法。160. 増幅および試料のガイド核酸への接触が異なる時間に行われる、態様158の方法。161. ポリメラーゼ、dATP、dTTP、dGTP、dCTP、またはそれらの任意の組み合わせを提供する工程をさらに含む、態様126～138または141～160のいずれか1つの方法。162. 標的核酸がウイルスに由来する、態様125～161のいずれか1つの方法。163. ウイルスが、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス、またはそれらの組み合わせを含む、態様162の方法。164. インフルエンザウイルスが、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む、態様163の方法。165. ウイルスが呼吸器ウイルスを含む、態様162～164のいずれか1つの方法。166. 呼吸器ウイルスが上気道ウイルスである、態様165の方法。167. フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、態様1～28のいずれか1つのシステム。168. 試料を、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせに接触させる工程をさらに含む、態様29～64のいずれか1つの方法。169. 標的デオキシリボ核酸を、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせを用いて増幅する工程をさらに含む、態様87の方法。170. 増幅が、試料をフォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、ループフォワードプライマー、ループバックワードプライマー、またはそれらの任意の組み合わせに接触させる工程をさらに含む、態様88～125のいずれか1つの方法。171. コロナウイルスがSARS CoV-2である、態様3、32または163のいずれか1つのシステムまたは方法。172. 核酸増幅方法がループ介在増幅（LAMP）である、態様105の方法。

以下の実施例は、例示であり、本明細書に記載の装置、システム、流体装置、キット、および方法の範囲を限定するものではない。

実施例1
インフルエンザの試験
個体からの生物学的試料を試験して、個体がインフルエンザを有するかどうかを判定することができる。生物学的試料を試験して、インフルエンザAまたはインフルエンザBウイルスを示す標的核酸の有無を検出することができる。

個体は、尿の生物学的試料を取得し、キットで提供された試薬チャンバ内の本明細書に記載の試薬に生物学的試料を適用する。試薬は、ウイルス中に存在し、ウイルスに特異的な核酸を標的とするガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および検出部分を有する一本鎖ディテクター核酸を含む。生物学的試料はインフルエンザウイルスを有し、ウイルス由来の標的核酸がガイド核酸に結合し、プログラマブルヌクレアーゼを活性化して標的核酸および一本鎖ディテクター核酸を切断する。

試料と試薬とを所定時間接触させた後、個体は、反応した試料および試薬を支持媒体上の試料パッド領域に適用することができる。支持媒体は、反応した試料および試薬を適用する試料パッド領域のための、および試験結果読み取り用の検出領域のための開口部を有する保護ハウジング内に収容されたラテラルフローアッセイ試験ストリップを含む。ハウジングはまた、基準マーカー、基準カラースケール、およびキットによって行われる試験を識別するバーコードを有する。反応した試料および試薬がラテラルフローアッセイ試験ストリップに沿って検出領域に移動すると、切断された一本鎖ディテクター核酸からの検出部分は、支持媒体上の捕捉分子および検出領域内の検出分子と結合して、支持媒体上で検出可能な信号を生成する。検出可能な信号は、支持媒体の検出領域内で線になることができる。試験が完了すると、陽性対照マーカーの線および陽性試験の別の線が検出領域開口部を通して見えるようになる。

反応した試料および試薬を支持媒体に適用してから所定の時間の後、個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。個体は、カメラを有する移動式装置で試験結果を読み取るために移動式アプリケーションを開き、移動式装置のカメラおよび移動式アプリケーションのGUIを使用して、ハウジング上の検出領域、バーコード、基準カラースケール、および基準マーカーを含む支持媒体の画像を得ることができる。移動式アプリケーションは、画像内のバーコードに基づいて試験を識別し、バーコードを用いた試験の識別に基づいて、同じ画像内の基準マーカーおよびハウジング上の基準カラースケールを用いて画像内の検出領域を分析し、ウイルスの有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個体に提示することができる。移動式アプリケーションは、試験結果を移動式アプリケーションに格納することができる。移動式アプリケーションは、遠隔装置と通信し、試験結果のデータを転送することができる。試験結果は、ヘルスケア専門家を含む別の個体によって遠隔装置から遠隔で見ることができる。

実施例2
インフルエンザの試験 - ディップスティック法
個体からの生物学的試料を試験して、個体がインフルエンザを有するかどうかを判定することができる。生物学的試料を試験して、インフルエンザAまたはインフルエンザBを示す標的核酸の有無を検出することができる。

個体は、尿の生物学的試料を取得し、キットで提供された試薬チャンバ内の本明細書に記載の試薬に生物学的試料を適用する。試薬は、ウイルス中に存在し、ウイルスに特異的な核酸を標的とするガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および一本鎖ディテクター核酸を含む。

試料と試薬とを所定時間接触させた後、個体は、支持媒体の一端を試薬チャンバに入れて、反応した試料および試薬を支持媒体上の試料パッド領域に適用することができる。支持媒体は、ラテラルフローアッセイ試験ストリップを含む。反応した試料および試薬が試験ストリップに沿って検出領域に移動すると、陽性対照マーカーの線が検出領域に見えるようになる。反応した試料および試薬を支持媒体に適用してから所定の時間後、支持媒体は、試験結果、基準マーカー、基準カラースケール、およびキットによって実施される試験を識別するバーコードを読み取るための検出領域のための開口部を有する保護ハウジングに入れることができる。

個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。個体は、カメラを有する移動式装置で試験結果を読み取るために移動式アプリケーションを開き、移動式装置のカメラおよび移動式アプリケーションを使用して、ハウジング上の検出領域、バーコード、基準カラースケール、および基準マーカーを含む支持媒体の画像を得ることができる。移動式アプリケーションは、画像内のバーコードに基づいて試験を識別し、バーコードを用いた試験の識別に基づいて、同じ画像内の基準マーカーおよびハウジング上の基準カラースケールを用いて画像内の検出領域を分析し、ウイルスの有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個体に提示することができる。

実施例3
インフルエンザの試験 - 支持媒体上でのインサイチュー切断
個体からの生物学的試料を試験して、個体がインフルエンザを有するかどうかを判定することができる。生物学的試料を試験して、インフルエンザAまたはインフルエンザBウイルスを示す標的核酸の有無を検出することができる。

個体は、尿の生物学的試料を取得し、キットで提供された支持媒体上の試料パッド領域で本明細書に記載の試薬に生物学的試料を適用する。試薬は、ウイルス中に存在し、ウイルスに特異的な核酸を標的とするガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、および一本鎖ディテクター核酸を含む。支持媒体は、試験結果、基準マーカー、基準カラースケール、およびキットによって実施される試験を識別するバーコードを読み取るための検出領域のための開口部を有する保護ハウジングに収容されたラテラルフローアッセイ試験ストリップを含む。

試料と試薬とを支持媒体上で所定時間接触させた後、反応した試料および試薬は、支持媒体に沿って支持媒体上の検出領域に移動する。個体は、任意で少量の緩衝液を配置して、反応した試料および試薬が検出領域に移動するのを助けることができる。反応した試料および試薬が試験ストリップに沿って検出領域に移動すると、陽性対照マーカーの線が検出領域に見えるようになる。

個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。移動式アプリケーションは、画像内のバーコードに基づいて試験を識別し、画像内の検出領域を分析し、ウイルスの有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個体に提示することができる。

実施例4
複数のインフルエンザウイルスの試験 - 複数のラテラルフローアッセイ
個体からの生物学的試料を試験して、個体が1つまたは複数のインフルエンザ株（例えば、インフルエンザA、インフルエンザB）を有するかどうかを判定することができる。生物学的試料を試験して、1つまたは複数の標的核酸の有無を検出することができ、ここで、個々の標的核酸はウイルスを示す。

個体は、尿の生物学的試料を取得し、キットで提供された複数の試薬チャンバに生物学的試料を適用して、インフルエンザウイルス株のパネルについて試験する。各試薬チャンバは、1つのインフルエンザウイルス株を検出するために特異的な試薬を含む。各試薬チャンバ内の試薬は、ウイルス中に存在する核酸を標的とするガイド核酸;プログラマブルヌクレアーゼ;および一本鎖ディテクター核酸を含む。

試料と試薬とを所定時間接触させた後、個体は、反応した試料および試薬を、試薬チャンバの1つから支持媒体上の適合する試料パッド領域に適用することができる。各試薬チャンバは、支持媒体上に適合する試料パッド領域を有する。支持媒体は、適合する試薬チャンバから反応した試料および試薬を適用する、適合する試料パッド領域のための、ならびに試験結果読み取り用の検出領域のための開口部を有する保護ハウジング内に収容された複数のラテラルフローアッセイ試験ストリップを含む。ハウジングはまた、基準マーカー、基準カラースケール、およびキットによって行われる試験を識別するバーコードを有する。反応した試料および試薬がラテラルフローアッセイ試験ストリップに沿って検出領域に移動すると、各ラテラルフロー試験ストリップの陽性対照マーカーが検出領域開口部を通して見えるようになる。

反応した試料および試薬を支持媒体に適用してから所定の時間の後、個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。移動式アプリケーションは、画像内のバーコードに基づいて試験を識別し、画像内の検出領域を分析し、ウイルス（インフルエンザA、インフルエンザB、またはインフルエンザAおよびB）の有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個体に提示することができる。

実施例5
複数のインフルエンザウイルス株の試験 - 多重化ラテラルフローアッセイ
個体からの生物学的試料を試験して、個体が1つまたは複数のインフルエンザ株（例えば、インフルエンザA、インフルエンザB）を有するかどうかを判定することができる。生物学的試料を試験して、1つまたは複数の標的核酸の有無を検出することができ、ここで、個々の標的核酸はウイルスを示す。

個体は、尿の生物学的試料を取得し、キットで提供された試薬チャンバに生物学的試料を適用して、インフルエンザウイルス株のパネルについて試験する。試薬チャンバは、複数のインフルエンザウイルス株を検出するための試薬の複数のセットを含む。1つのインフルエンザ株を検出するための試薬の1つのセットは、ウイルス中に存在し、ウイルスに特異的な核酸を標的とするガイド核酸;プログラマブルヌクレアーゼ;および一本鎖ディテクター核酸を含む。

試料と試薬とを所定時間接触させた後、個体は、反応した試料および試薬を支持媒体上の試料パッド領域に適用することができる。支持媒体は、試験ストリップ上の複数のディテクター分子を検出することができる多重化ラテラルフローアッセイ試験ストリップを含む。ラテラルフローアッセイ試験ストリップは、反応した試料および試薬を適用する試料パッド領域のための、および試験結果読み取り用の検出領域のための開口部を有する保護ハウジング内に収容された。ハウジングはまた、基準マーカー、基準カラースケール、およびキットによって行われる試験を識別するバーコードを有する。反応した試料および試薬がラテラルフローアッセイ試験ストリップに沿って検出領域に移動すると、各ラテラルフロー試験ストリップの陽性対照マーカーが検出領域開口部を通して見えるようになる。

反応した試料および試薬を支持媒体に適用してから所定の時間の後、個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。個体は、移動式装置を使用して試験結果を得ることができる。移動式アプリケーションは、画像内のバーコードに基づいて試験を識別し、画像内の検出領域を分析し、ウイルスの有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個体に提示することができる。

実施例6
流体装置を用いた呼吸器ウイルス由来の核酸の検出
この実施例は、流体装置を用いた呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の核酸の検出を例示する。試料中の呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）から標的核酸を検出するためのCRISPR-Cas反応は、流体装置を用いて行われる。

図1は、CRISPR-Cas反応のワークフローを示す概略図を示す。ワークフローの工程1は試料調製であり、ワークフローの工程2は呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）からの標的核酸の増幅である。ワークフローの工程3は、Cas反応インキュベーションである。ワークフローの工程4は、検出（読み出し）である。検出および読み出しがCas反応に組み込まれる場合、工程1および2は任意であり、工程3および4は同時に行うことができる。図2は、使用される試料調製のための流体装置を示す。試料調製流体装置は、様々な種類の生体試料を処理する。生物学的試料は、指先穿刺血液、尿、または糞便、鼻スワブ、頬スワブもしくは他の収集物を含むスワブである。試料は、図2の流体装置で調製され、次いで流体装置に導入される。

流体装置は、図3の3つの流体装置のうちの1つまたは図5の流体装置である。図3の3つの流体装置は、蛍光または電気化学的読み出しを用いてCas反応を実行する。反応の検出に使用される蛍光および電気化学プロセスを要約した分解図を図4に示す。図4は、（a）蛍光読み出しおよび（b）電気化学的読み出しを含む、使用される読み出しプロセスの概略図を示す。図5は、比色または電気化学的/血糖値測定器読み出しを含む、結合したインベルターゼ/Cas反応のための例示的な流体装置を示す。この図は、酵素インベルターゼと結合したCas反応を縮小化するための流体装置を示す。表面改質、ならびに（a）DNSまたは他の化合物を使用した光学的読み出し、および（b）電気化学的読み出し（電気化学分析器または血糖値測定器）を含む読み出しプロセスは、下部の分解図スキームに示されている。

呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の関心対象の標的核酸を含む試料を図2の流体装置に導入する。試料を濾過し、図3または図5の流体装置に導入し、ここで、関心対象の核酸を任意で増幅し、事前に複合体化したCas混合物とインキュベートする。Cas-gRNA複合体は、増幅された試料からのその適合する核酸標的に結合し、非特異的ヌクレアーゼへと活性化され、これは核酸ベースのレポーター分子を切断して信号読み出しを生成する。呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）からの関心対象の標的核酸は、図4に示すような蛍光読み出し、電気化学的読み出し、もしくは電気化学発光読み出し、または図5に示すような光学読み出しもしくは電気化学的読み出しを使用して検出される。

実施例7
CRISPR/Casシステムを使用したDETECTR反応による呼吸器ウイルス由来の標的核酸の電気化学的検出
この実施例は、CRISPR/Casシステムを使用したDETECTR反応における呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の標的核酸の電気化学的検出を記載する。このアッセイでは、陽性DETECTR反応物（標的核酸が存在するもの）の存在下で酵素によって切断されるビオチン化CRISPR-Casレポーター分子を使用する、ビオチン-ストレプトアビジン信号増強法が用いられる。

電気化学的検出は、（1）電極表面に固定化されたフェロセン標識オリゴの使用、および（2）本明細書にも開示される、DETECTRとインベルターゼ触媒反応との結合の代替として試験される。後の反応は、血糖値測定器で検出されるグルコースを直接、または間接的に生成する。電気化学的検出およびフェロセン標識オリゴを使用する検出は両方とも電位差測定であるが、インベルターゼ触媒反応は電流測定である。

レポーターは、DNAse酵素を使用して切断され、切断されると、レポーターが完全である場合と比較して酸化ピークでの電流が増加する。結果は、ベンチトップ型のゴールドスタンダード電気化学分析装置（uSTAT,Metrohm,USA）を使用して収集される。レポーターの配列は

である。電気活性レポーターの切断が電流の増加をもたらす、循環ボルタモグラムが得られる。

実施例8
CRISPR-Casシステムを使用したDETECTR反応による呼吸器ウイルス由来の標的核酸の検出のための蛍光ベース装置
この実施例は、CRISPR-Casシステムを使用したDETECTR反応における呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の標的核酸の検出のための蛍光ベース装置を記載する。2つのアプローチを使用して、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）から標的核酸を検出するためのDETECTR反応のための小型化装置を開発する。1つ目は、ガラスキャピラリー（Drummond Scientific、USA）を、DETECTR反応の単一の毛管現象駆動導管として使用する。試薬のフラッシュ乾燥製剤および液体製剤の両方が使用される。2つ目は、混合または試薬送達のための機械的作動を用いない市販のプラスチック（TOPAS）マイクロ流体チップ（Microfluidic Chip Shop、Germany）を使用する。

結果は、（1）携帯型フォトダイオードベースの蛍光センサ（ESELog、Quiagen Lake Constance、Germany）および（2）市販のトランスイルミネーター（E-GEL、Thermofisher、USA）を使用して収集される。このシステムの検出能力の主な進歩には、オンチップDETECR反応が含まれる。ワンポット逆転写-リコンビナーゼポリメラーゼ増幅-インビトロ転写（RT-RPA-IVT）-DETECTR反応からの蛍光のリアルタイム測定をチップ上で行う。

実施例9
呼吸器ウイルス由来の標的核酸の高感度かつ広域スペクトル検出のためのガイドプーリング
この実施例は、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の標的核酸の高感度かつ広域スペクトル検出のためのガイドプーリングを記載する。伝統的な検出には標的配列/生物あたり1つのgRNAが必要であるが、1つまたは複数のCRISPRエフェクタータンパク質を有する複数のgRNAの使用を含む本明細書に開示されるガイドプーリング方法は、感度の改善（単一の標的配列/生物にわたるガイドタイリングの場合）および広域スペクトル検出（単一の反応で複数の標的配列/生物を検出する場合）の両方に適している。したがって、ガイドプーリングは、伝統的な診断方法と比較して、迅速かつ低コストな初期トリアージ工程（例えば、血液由来病原体、パンデミックインフルエンザ、汎細菌検出などに対する「警戒」）として機能するだけでなく、検出感度性能を高めるための有用な方法である。

DETECTRアッセイを行うために、ガイドRNA（crRNA）を最初にCasタンパク質に複合体化させる。複合体化反応は、37℃で30分間行う。次いで、レポーターおよびさらなる緩衝液を加えて、複合体のマスターミックスを完成させる。最後に、複合体を試料に添加して、ガイドによって特異的に標的とされる配列を検出する。同じ標的の異なる配列または異なる配列セグメントを標的とするように設計された複数のガイドRNAをプールすることによって、単一の反応での検出スペクトルを広げ、検出効率を上げることが可能である。これを達成するために、ガイドRNAは高濃度でCasタンパク質に個々に複合体化される。複数のガイド-タンパク質複合体反応物をプールする。プーリング後、レポーターおよびさらなる緩衝液を添加して、DETECTRアッセイで使用するためのプールされた複合体を完成させる。

A. インフルエンザ株の検出のためのガイドプーリング
インフルエンザ株の検出のためのガイドプーリング方法は、異なるインフルエンザ株（例えば、IAVおよび/またはIBV由来の株）のためのガイドRNAを使用することを含んだ。複数のガイドRNA（例えば、15～20）は、1つのインフルエンザ株を標的とするように設計されている。

DETECTRアッセイにおいて使用されるプログラマブルヌクレアーゼは、LbCas12a（SEQ ID NO:27）である。レポーターは、FAM標識5’末端およびIowa Black FQ標識3’末端を有する8-mer ssDNAである。

ガイドRNA（crRNA）は、LbCas12aタンパク質と高濃度で個別に複合体化される。各crRNAを1×Mバッファー 2（20mM Tris HCl、pH 8、100mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、5％グリセロール、50 ug/mLヘパリン）中でLbCas12aと混合する。crRNAおよびタンパク質の濃度は、標準的な単一ガイド複合体化反応よりも少なくとも4倍高い。混合物を37℃で30分間インキュベートして、ガイド-タンパク質複合体を形成する。以下の表8は、複合体化反応物の配合を列挙する。体積は1回のDETECTR反応用であり、したがってスケールアップすることができる。

（表８）

ガイドプーリング。インキュベーションの完了時に、等体積の個々のガイド-タンパク質複合体化反応物を組み合わせることによってガイドプールを生成する。異なるn-plex（n＝異なるガイドの数）レベルのいくつかのプールが生成される。

5ulの複合体化反応物を各20μl DETECTRアッセイで使用する。アッセイにおけるガイドおよびタンパク質の有効濃度は、複合体化反応物におけるものの1/4である。

複合体マスターミックス。ガイドプールの複合体マスターミックスは、等体積の混合物2（ssDNAレポーターおよび追加の緩衝液を含み、配合を表9に列挙する）を加えることによって完成される。

（表９）

さらに、混合物2を個々のガイド-タンパク質複合体化反応物に添加して、単一のガイド複合体マスターミックスを生成する。複合体マスターミックスでは、ガイドおよびタンパク質の濃度は半分に希釈される。

DETECTRアッセイ。標的を200pMおよび20pMに希釈する。各DETECTRアッセイにおいて、10ulの複合体マスターミックスを10ulの試料と384ウェルプレートのウェル中で混合する。ガイドおよびタンパク質の有効濃度は、複合体化反応物における濃度の1/4である。反応は、37℃のTECAN Infinite 200 proプレートリーダーで行う。蛍光未処理データファイルは、内部ソフトウェアを使用して分析する。DETECTRアッセイの動態は、max＿rate（活性化したCasタンパク質によるレポーターの切断の推定速度）によって測定される。単一ガイドに対するガイドプールの活性を、200pMの標的（最終反応では100pMの標的）に対して測定する。

信号は、ガイドプーリングによって明確に増強される。例えば、n-plexレベルを10-、および20-plexに上げると信号が高くなり、単一ガイド検出からの検出感度が向上する。ガイドプールは、差分標的を検出するように調整することができる。

ガイドプーリングを使用すると、単一ガイドアッセイの検出限界に近い10pM標的の検出が改善され、ガイドのプーリングはアッセイの感度を改善する。

B. 最も性能の良い別個のgRNAをガイドプーリングしてRSVの検出のためのアッセイ感度を上げる
ガイドプーリングを使用して、RSV検出のためのアッセイの検出限界を改善した。RSVガイドについて33個のガイドRNAを、標的領域にわたってタイリングすることによって設計した。ガイドRNAを活性についてスクリーニングし、最高性能のガイドをプーリングのために選択した。RSV標的に対応するRNAをインビトロ転写（IVT）反応から生成した。Cas13aタンパク質を使用し、レポーターは、5’FAMおよび3’Iowa Black FQを有する5-mer ssRNAであった。図6Aは、検出効率について評価されたRSVについてのgRNAのパネルを示す。バックグラウンドを差し引いた行で正方形が暗いほど、RSV標的核酸を検出する効率が高いことを示す。図6Bは、バックグラウンドを差し引いた蛍光に対するgRNAのプールのグラフを示す。左端のグラフは、4pMの標的核酸の検出のためのRSV gRNAのプーリングを示す。中央のグラフは、800fMの標的核酸の検出のためのRSV gRNAのプーリングを示す。右端のグラフは、160fMの標的核酸の検出のためのRSV gRNAのプーリングを示す。RSV研究で使用したgRNA配列を以下の表10に要約する。

（表１０）

実施例10
呼吸器ウイルス由来の標的核酸の検出のためのCRISPR DETECTRアッセイにおけるCRISPR-Casタンパク質の温度および温度耐性の最適化
この実施例は、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の標的核酸の検出のためのCRISPR DETECTRアッセイにおけるCRISPR-Casタンパク質の温度および温度耐性の最適化を記載する。本開示のCRISPR診断は、V型（例えば、Cas12）およびVI型（例えば、Cas13）CRISPR-Casタンパク質の独特の生化学的特性を活用して、核酸の特異的検出を可能にする。これらのタンパク質は、ガイドRNA（gRNA）としても知られるCRISPR RNA（crRNA）によって、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の標的核酸に結合するように指示される。相補的な標的配列に結合すると、Casタンパク質は、周囲の一本鎖DNAまたは一本鎖RNAの無差別切断を開始する。クエンチングされた蛍光レポーターまたは他の切断レポーターに結合されると、蛍光または他の信号が、標的核酸の存在下でのみCasタンパク質によって生成される。CRISPR-Casタンパク質は、様々な天然環境から隔離されており、したがって、異なる高温耐性および最適な温度範囲を有する。温度に対するこれらの異なる耐性は、異なる段階でタンパク質を活性化または阻害して、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の核酸の標的増幅など、他の分子プロセスを発生させるために使用される。

標的核酸が呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）に由来し、Cas12変異体（SEQ ID NO:37）プログラマブルヌクレアーゼが使用されるDETECTRアッセイでは、V型タンパク質Cas12変異体は25℃～45℃の機能範囲を有し、35℃で最大活性を有する。V型タンパク質LbCas12a（SEQ ID NO:27）の場合、機能範囲は35℃～50℃であり、活性のピークは約40℃である。VI型タンパク質LbuCas13a（SEQ ID NO:131）の場合、機能範囲は25℃～40℃であり、30℃～35℃で最大活性を有する。Cas12変異体およびLbCas12aなどのV型タンパク質は、高温で安定かつ機能的である。標的核酸が呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）に由来するDETECTRアッセイでは、Cas12変異体は37℃の温度で活性を示す。この温度シフトは等温増幅法での使用に使用可能であり、増幅はより高い温度で行われるが、反応温度を下げた後、Casタンパク質はその機能性を損なうことなく活性化される。

標的核酸が呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）に由来するDETECTRアッセイでは、Cas12変異体は、30分間高温に曝露し、次いで反応温度を37℃に低下させた後に安定である。Cas12変異体は、0.5×NEバッファー4（New England Biolabs）＋0.05％ Tweenおよび1×Mバッファー3中で活性である。

実施例11
試料調製プロトコールおよび装置ワークフロー
この実施例は、試料調製プロトコールおよび装置ワークフローを記載する。診断分析のための材料の収集およびプロセシングは、通常、ポイントオブケア施設または臨床検査室で行われる。家庭での試料採取および診断分析用の核酸抽出のための、現在使用可能な方法はごくわずかである。本明細書に開示される装置は、核酸増幅含むまたは含まない、DETECTR反応を含むまたは含まない核酸抽出のための処方箋なしの溶液を提供する。これらのモジュールのいずれかまたはすべてから得られた生成物は、データ収集およびその後の分析のために読み出し装置に適用される。

粗試料調製プロトコールは、試料収集装置（例えば、スワブ）から、ゲノム核酸を放出する高分子成分への試料の解離を誘導する緩衝液への試料の溶出を含む。これらの成分は、pH変更、カオトロピック塩および界面活性剤（Tween 20、Triton X-100、デオキシコレート、ラウリル硫酸ナトリウムまたはCHAPS）のいずれか、またはすべてを含む。このプロトコールは、手持ち式装置に供給する段階的なワークフローで出現する。この装置には、試料調製プロトコールのための試薬成分を収容する少なくとも1つのチャンバがある。

図7は、本開示の試料調製装置の個々の部品を示す。図のA部は、単一のチャンバ試料抽出装置を示す。（a）インサートは試料回収装置を保持し、試料の抽出と、別の反応または検出装置への試料の分注との間の工程を調整し、（b）単一のチャンバは抽出緩衝液を含む。図のB部は、分注される際に核酸をさらに精製する材料で分注チャンバを充填することが選択肢であることを示す。（a）インサートは試料回収装置を保持し、試料抽出および核酸増幅の「段階」を調整する。ノッチ（赤色、青色および緑色）の各セットは、先行するセットから90°オフセットされており、（b）反応モジュールは、独立した反応の発生を可能にする基材によって分離された複数のチャンバを含む。（例えば、i. 核酸分離チャンバ、ii. 核酸増幅チャンバ、およびiii. DETECTR反応チャンバまたは分注チャンバ）各チャンバは、意図的に90°回転することなくインサートが次のチャンバに進行するのを防止するノッチ（黒色）を有する。最初の2つのチャンバは、抽出反応と増幅反応との間のインヒビターを除去する材料によって分離されてもよい。C部は、反応/分注チャンバの選択肢を示す:（a）単一の分注チャンバが、抽出された試料、または抽出/増幅もしくは抽出/増幅/DETECTR反応物のみを放出することができる、（b）二重の分注チャンバが、抽出/多重増幅生成物を放出することができる、（c）四重の分注チャンバが、多重増幅および単一のDETECTRまたは4つの単一増幅反応を可能にする。

図8は、試料プロセシング装置を使用した、試料ワークフローを示す図である。試料回収装置が、試料プロセシング装置のインサートに結合される（A）。インサートは、装置チャンバ内に配置され、最初に止まる（緑色タブが黒色タブと会う）まで押圧される（B）。この工程により、試料を核酸抽出試薬と接触させることができる。適切な時間の後、インサートを90°回転し（C）、次のノッチのセットまで押し下げる（D）。これらの作用により、試料が増幅チャンバに移送される。試料回収装置は、もはや試料または増幅生成物と接触していない。適切なインキュベーションの後、インサートを90°回転し（E）、次のノッチのセットまで押し下げる（F）。これらの作用で、試料がDETECTRに放出される（グリーン反応）。インサートを再び90°回転させ（G）、押し下げて（H）反応物を分注する。

粗試料調製プロトコールの例を表11に要約する。

（表１１）

図9は、残存臨床試料からインフルエンザA RNAを抽出するために使用される抽出緩衝液を示す。反復残存臨床試料を上記の表11に列挙した試薬に曝露した。NucleoSpinウイルスキットを使用して抽出プロセスを完了した。qPCR分析を行って、抽出されたRNAゲノムの質および量を評価した。低pH条件は、「ゴールドスタンダード」キット（RT-プール）で抽出した試料と同等のRNA量をもたらした。

図10は、低pH条件でインフルエンザAゲノムRNAの迅速な抽出が可能になることを示す。低pH条件への曝露時間の短縮は、ウイルス解離、およびNucleoSpinウイルスキットを使用して完了したその後の抽出の効率に影響を及ぼさなかった。抽出された生成物の量は、「ゴールドスタンダード」抽出（RT-pool）と同程度であった。

実施例12
CRISPR-Cas診断における等温増幅
この実施例は、DETECTRアッセイを伴う診断を含む、本開示のCRISPR-Cas診断における等温増幅の方法を記載する。CRISPR診断は、V型（例えば、Cas12）およびVI型（例えば、Cas13）CRISPR-Casタンパク質の独特の生化学的特性を活用して、核酸の特異的検出を可能にする。これらのタンパク質は、ガイドRNA（gRNA）としても知られるCRISPR RNA（crRNA）によってそれらの標的核酸に向けられる。相補的な標的配列に結合すると、Casタンパク質は、周囲の一本鎖DNAまたは一本鎖RNAの無差別切断を開始する。クエンチングされた蛍光レポーターまたは他の切断レポーターに結合されると、蛍光または他の信号が、標的核酸の存在下でのみCasタンパク質によって生成され得る。これらのタンパク質は単独で、標的核酸をpMまたはfM値域で検出することができる。この実施例に記載され、本明細書の他の箇所に開示される核酸増幅と組み合わせた場合、CRISPR診断の感度はaMまたはzMの値域まで向上した。PCRは、2つまたは3つの異なる温度間で温度を循環させると二本鎖DNA（dsDNA）を生成する、一般的に使用される核酸増幅法である。単一の温度で機能する核酸増幅法は、等温増幅として知られている。これらの方法には、LAMP、RPA、SIBA、SDA、およびNASBAが含まれる。これらの方法は、逆転写（RT）と組み合わせることができ、それによりこれらの方法が、最初に逆転写によってRNAをcDNAに変換することによってRNA標的を増幅することを可能にする。

感度の高い診断アッセイを可能にするために、V型（例えば、Cas12）およびCasVI（例えば、Cas13）タンパク質を使用するCRISPRベースの診断を、標的核酸の等温増幅法を使用して実行した。

RPA。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）を使用して、反応に逆転写酵素を含めることによってDNA配列またはRNA配列を増幅した（RT-RPA）。RPAおよびRT-RPAを使用して、V型（例えばCas12）Casタンパク質による検出に適したアンプリコンを生成することができる。

図11は、Cas12aによる、インフルエンザA、インフルエンザB、およびヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のウイルスRNAの検出へのRT-RPAの適用を示す。RPAプライマーの1つにT7プロモーターを含めることによって、RNAをDNAに変換するためのRNAポリメラーゼを使用するインビトロ転写（IVT）反応工程を、VI型（例えばCas13）タンパク質による検出のための標的RNAを生成するRPA反応の後に行った。図11では、Cas12aを使用して、インフルエンザA（IAV）、インフルエンザB（IBV）およびヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）RNAの4000コピーからRT-RPAアンプリコンの検出を行った。RT-RPA反応は、40℃で30分間行った。対照には、RT酵素なし、標的対照なし、およびプライマー対照なしが含まれた。RT-RPA反応後、RT-RPAアンプリコンをCas12a DETECTRアッセイに移した。

図12は、Cas13aを使用したウイルスRNAの検出を可能にする、IVT反応と組み合わせたRT-RPAの適用を示す。図12では、Cas13aを使用して、2fMのPPRウイルスRNAからRT-RPAアンプリコンの検出を行った。RT-RPA反応は、40℃で30分間行った。いくつかの逆転写酵素を、それらのRPA反応との適合性について評価した。対照には、RT酵素なし、標的なし、およびプライマーなしが含まれた。RT-RPA反応の後、RNAの生成のために、RT-RPAアンプリコンを37℃での10分間のIVT反応に移した。IVT反応の生成物を希釈し、37℃でCas13a反応物に添加した。オンターゲットおよびオフターゲットcrRNAを使用して、Cas13a反応の特異性を実証した。

RPAおよびCas13aを使用して、IVT反応をRT-RPAまたはRPA反応と組み合わせてRPA反応と同時にRNAを生成することによる、「ツーポット」DETECTRアッセイを行った。図13は、Cas13aによって検出される、RT-RPA-IVT「ツーポット」反応を使用したRNAウイルスからのRNAの生成を示す。ツーポット反応では、第1の反応はRT-RPA-IVTであり、第2の反応はCas13a検出アッセイであった。IVTの成分（T7 RNAポリメラーゼ、NTP）を、RNA転写緩衝液（Twist DxのRPA再水和緩衝液「緩衝液1」）またはRPA再水和緩衝液（20mMイミダゾール、pH 7.5;50mM KCl;5mM MgCl2;BSA 10μg/mL;0.01％ Igepal Ca-630;5％グリセロール「緩衝液2」）の存在下でRT-RPA反応に添加した。対照として、RNAポリメラーゼを含まないRT-RPAを添加した。2fMのPPRウイルスRNAをこれらの反応における標的RNAとして使用した。反応を37℃で15分間進行させ、オンターゲットおよびオフターゲットcrRNAを使用して特異性を証明した。

IVTおよびCas13a検出アッセイ反応をRT-RPAまたはRPA反応と組み合わせて、「ワンポット」アッセイで同時にRNAを生成および検出した。図14は、ワンポットCas13aアッセイの性能に対する様々な緩衝液の効果を示す。RT-RPAの成分を、IVT用（T7 RNAポリメラーゼ、NTP）およびCas13a検出用（Cas13a酵素、crRNA、蛍光切断レポーター）の両方の成分との単一の反応で合わせた。反応を3つの緩衝液（緩衝液1:RPA再水和緩衝液、緩衝液2:Cas13a緩衝液、緩衝液3:Cas12a緩衝液（20mM Tris-HCl、pH 8.0;100mM NaCl;5mM MgCl2;1mM DTT;5％グリセロール;50μg/mL ヘパリン））中で行った。RNAポリメラーゼを含まない反応物を対照として使用した。さらに、オンターゲットcrRNAとの反応とオフターゲットcrRNAとの反応とを比較することにより特異性を証明した。反応を40℃で10分間進行させた。

図15は、ワンポットCas13aアッセイを使用した、ヤギに感染するPPRウイルスからのウイルスRNAの特異的検出を示す。500 aMのウイルスRNAを反応物に添加し、反応物を40℃でインキュベートした。対照として、T7 RNAポリメラーゼを含まない同一の反応（「PPRV-noIVT」;右のグラフ）を使用して、Cas13aが検出するためのRNAの特異的生成を証明した。オンターゲットおよびオフターゲットcrRNAを使用して、アッセイ特異性を実証した。

図16は、40℃で実施されるワンポットCas13aアッセイを使用した、インフルエンザBの特異的検出を示す。40fMのウイルスRNAを反応に添加した。対照として、逆転写酵素を含まない（「-RT」と標識）同一の反応を使用して、Cas13aが検出するためのRNAの特異的生成を証明した。オンターゲットおよびオフターゲットcrRNAを使用して、アッセイ特異性を実証した。

図17は、universal transport media（UTM Copan）と呼ばれるユニバーサルウイルス輸送培地の存在下および非存在下での、40℃でのインフルエンザBウイルスからのRNAの検出のためのワンポットCas13aアッセイの耐性を示す。40fMのウイルスRNAを反応に添加した。対照として、逆転写酵素を含まない（-RT）同一の反応を使用して、Cas13aが検出するためのRNAの特異的生成を証明した。オンターゲットおよびオフターゲットcrRNAを使用して、アッセイ特異性を実証した。

図18は、様々な温度でインフルエンザA（a）、インフルエンザB（b）およびヒトRSV（c）RNAを検出するワンポットCas13aを示す。100,000個のウイルスゲノムを反応に添加し、0コピーを含む反応と比較した。反応は、30℃、32.5、35℃、37.5℃または40℃のいずれかで行った。アッセイは、35℃～37.5℃で最も強力であると決定された。

LAMP。ループ介在等温増幅（LAMP）も、DNA配列またはRNA配列を増幅するために逆転写酵素と組み合わせて使用した（RT-LAMP）。LAMP反応は、4つ、5つ、または6つのプライマーの組み合わせを使用して、RNAから標的DNAまたはcDNAを増幅する。LAMP反応の過程で、アンプリコンのコンカテマーが形成される。RT-LAMPまたはLAMPアンプリコンがCasタンパク質認識を支援する配列特徴（PAMまたはPFSなど）を含む場合、それらはCRISPR診断における標的核酸として使用することができる。

図19は、マムーサス・プリミゲニウス（ケナガマンモス）ミトコンドリア由来のDNA配列を使用した、内部増幅対照の検出のためのLAMP反応の最適化を示す図である。さらに、図19は、様々なcrRNAを使用したCas12aによるLAMPアンプリコンの特異的検出を示す。図19Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas12a検出を含むワークフローの概略図を示す。図19Bは、蛍光によって定量化される、マムーサス・プリミゲニウスに由来するDNA配列を使用した内部増幅対照のためのLAMP反応が起こる時間を示す図である。結果までの時間は、反応の最大蛍光の半分に達する時間によって決定した。対照には、オフターゲットHelaゲノムDNAおよび標的を含まない対照が含まれる。図19Cは、68℃の温度反応からの、37℃でのLAMPアンプリコンのCas12a特異的検出を示す。2つのオンターゲットcrRNAを試験した。HelaゲノムDNAアンプリコン、またテンプレートなしの対照（NTC）アンプリコンからの検出による特異性は示されなかった。

図20は、RNase Pの成分であるヒトPOP7遺伝子

のLAMPおよびCas12特異的検出の最適化を示す。この配列は、ヒトDNAおよびRNAに存在し、試料抽出の効率の対照として使用される（試料対照）。図20Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas12a検出を含むワークフローの概略図を示す。図20Bは、蛍光によって定量化される、異なる温度でのRNase P POP7のためのLAMP/RT-LAMP反応の結果に至る時間を示す。結果までの時間は、反応の最大蛍光の半分に達する時間によって決定した。対照には、オフターゲットマウス肝臓RNA、および標的を含まない対照が含まれた。HelaトータルRNAおよびHelaゲノムRNAを、それぞれRT-LAMPおよびLAMP反応によって検出した。図20Cは、68℃の温度反応からの、LAMP/RT-LAMPアンプリコンの37℃でのCas12a特異的検出を示す3つのグラフを示す。2つのオンターゲットcrRNAを試験し、1つのオフターゲットcrRNAを試験した。マウストータルRNAアンプリコン、またテンプレートなしの対照（NTC）アンプリコンからの検出による特異性は示されなかった。

Cas12をRT-LAMP生成物の検出にも使用した。図21は、インフルエンザAウイルス用の、3つの異なるRT-LAMPアンプリコンの特異的検出を示す。この実験からのデータは、Cas12a適合部位周囲のRT-LAMPプライマーの設計が実験の特異性にとって重要であったことを示している。プライマーおよびcrRNAを最適化し、RT-LAMPによるインフルエンザA（IAV）の特異的検出のために組み合わせた。簡単に説明すると、3つの異なるプライマーセットを、IAVに特異的なRT-LAMPについて試験した。RT-LAMP反応は、IAV RNAの存在下で、またはテンプレートなしの対照（NTC）として行った。各アンプリコンについて、37℃でのCas12a検出アッセイにおいて、2つのオンターゲットcrRNAおよび1つのオフターゲットcrRNAを使用した。

図22は、インフルエンザB（IBV）RT-LAMPアンプリコンの特異的検出のための最適なcrRNAの同定を示す。RT-LAMP反応は、インフルエンザA（IAV）RNA、IBV RNA、またはテンプレートなし対照（NTC）の存在下、60℃で30分間行った。得られたアンプリコンについて、3つのオンターゲットcrRNAを使用して、37℃でのCas12aによるインフルエンザBの検出に最も特異的かつ効率的であるものを決定した。

多重化増幅のために、RT-LAMPまたはLAMP反応のプライマーを組み合わせた。RT-LAMPおよびLAMP中にコンカテマーが形成されるので、図23に示すように、多重RT-LAMPまたはLAMP反応においてアンプリコンを従来の手段で識別することは困難である。インフルエンザA（IAV）およびインフルエンザB（IBV）に対する多重化RT-LAMPを60℃で30分間行った。RT-LAMP反応物を、IAV、IBV、またはIAVおよびIBVの両方の10,000ウイルスゲノムコピーとインキュベートした。0ウイルスゲノムコピーを含む標的なし対照（NTC）を使用した。30分間のインキュベーション後の0.5μLのRT-LAMP生成物を1％アガロースゲル上で泳動した。図23は、RT-LAMP反応の生成物を示すバンドを有する1％アガロースゲルの結果を示す。ゲルに見られるように、IAV、IBV、およびIAV＋IBV試料を識別することは困難である。V型（例えばCas12）酵素の適用により、どのアンプリコンが多重化RT-LAMPまたはLAMP反応で増幅されたかが特定された。図24は、インフルエンザAおよびインフルエンザBについての多重RT-LAMP反応からのアンプリコン間のCas12a識別を示す。図24Aは、ウイルスRNAの提供、多重化RT-LAMP、およびCas12aインフルエンザA検出またはCas12aインフルエンザB検出を含むワークフローの概略図を示す。図24Bは、60℃で30分間の多重化RT-LAMP増幅後のRT-LAMPアンプリコンのCas12a検出を示す。多重化増幅は、インフルエンザA（IAV）およびインフルエンザB（IBV）のためのプライマーセットを含んだ。反応は、10000ウイルスゲノムコピーまたは対照として0コピーを含んだ。IAVのみ、IBVのみ、およびIAVとIBVとの組み合わせの標的を使用した。図24Cは、IAVおよびIBVの10,000ウイルスゲノムコピーについてRT-LAMPアンプリコンを37℃で30分間Cas12a検出した、バックグラウンドを差し引いた蛍光を示す。IAVおよびIBVに特異的なcrRNAによって、どのウイルス試料が存在したかの識別が可能になる。同様に、図25は、60℃で30分間の多重化RT-LAMP増幅後、インフルエンザA、インフルエンザB、およびマムーサス・プリミゲニウス（ケナガマンモス）ミトコンドリア内部増幅対照配列についての三つ組み多重化RT-LAMP反応間のCas12a識別を示す。多重化増幅は、インフルエンザA（IAV）、インフルエンザB（IBV）およびマンモス内部増幅対照（マンモスIAC）用のプライマーセットを含有した。反応は、100,000ウイルスゲノムコピーまたは500 aMのIACを含有した。IAVのみ、IBVのみ、多重化IAV＋IBV、および多重化IAV＋IBV＋マンモスIACの標的を使用した。IAV、IBVおよびマンモスIACに特異的なcrRNAを用いた37℃でのCas12a検出アッセイを実施して、アンプリコンと多重化反応物を識別した。

図26の概略図に示すように、LAMPまたはRT-LAMP反応のフォワードインナープライマー（FIP）またはバックワードインナープライマー（BIP）にT7プロモーター配列を含めることによって、得られたアンプリコンをインビトロ転写反応に添加してRNAを生成することができる。このRNAは、VI型（例えばCas13）検出アッセイで使用することができる。図26Aは、LAMPおよびRT-LAMPで使用されるプライマーの同一性を示す概略図を示す。プライマーLFおよびLBは、いくつかのLAMPおよびRT-LAMP設計では任意選択であるが、一般に反応の効率を上げる。図26Bは、様々なLAMPプライマーにおけるT7プロモーターの位置および配向を示す概略図を示す。

図27は、T7プロモーターが、F3プライマーもしくはB3プライマー（アウタープライマー）、またはインフルエンザA用のFIPプライマーもしくはBIPプライマーに含まれ得ることを示す。しかしながら、FIPプライマーもしくはBIPプライマーに位置するT7プロモーターのみが、Cas13a検出アッセイを可能にするのに十分なRNAを生成することができる。図27Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、インビトロ転写、およびCas13a検出を含むワークフローの概略図を示す。図27Bは、蛍光によって定量化された、異なるプライマーセットを使用したインフルエンザAのRT-LAMP反応の結果までの時間を示す。各プライマーセットは、異なる位置にT7プロモーター配列を含有した。結果までの時間は、反応の最大蛍光の半分に達する時間によって決定した。標的なしを特異性対照として使用した。結果は、B3＋T7およびBIP＋T7センスプライマーセットがRT-LAMP反応に最もよく機能することを実証した。反応は、68℃で30分間行った。図27Cは、異なるプライマーセットを37℃で10分間使用した、インフルエンザAについてのRT-LAMP反応の生成物のT7 RNAポリメラーゼによるインビトロ転写（IVT）を示す。次いで、37℃でのCas13a検出アッセイを使用して、IVT反応からのRNA生成物を検出した。3つの異なるオンターゲットcrRNAをオフターゲットcrRNAと共に使用して、特異性を実証した。BIP＋T7センスおよびアンチセンスプライマーセットは、オンターゲットcrRNA＃2と共にRNA生成に最もよく機能した。したがって、crRNA＃2と組み合わせたBIP＋T7センスプライマーセットは、IVT反応に先行するRT-LAMP反応後のRNAの検出に最もよく機能した。

SIBA。鎖侵入ベースの増幅（Strand invasion based amplification（SIBA））は、使用され得る別の等温法である。図28は、Cas12による、インフルエンザA用のRT-SIBAアンプリコンの検出を示す。Cas12についてのSIBAおよびRT-SIBA反応では、ガイドRNAは侵入オリゴに相補的ではなく、アンプリコンはPAMを含む。RT-SIBA反応は41℃で60分間、500aMの出発RNA濃度で実施した。RT-SIBA反応用の対照には、標的なし対照およびプライマーなし対照が含まれた。RT-SIBA反応終了後、2μLのアンプリコンを20μLのCas12a検出反応物に添加した。オンターゲットおよびオフターゲットcrRNAを使用して、Cas12による特異的検出を証明した。

実施例13
呼吸器ウイルス由来の標的核酸を検出のためのCRISPR DETECTRベースの診断アッセイのアッセイ条件の最適化
この実施例は、本明細書に開示される呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の標的核酸の検出のための、CRISPR-Cas DETECTRベースの診断アッセイのアッセイ条件の最適化を記載する。タンパク質濃度、crRNA、および緩衝液成分などのDETECTR反応の構成要素は、反応の速度および効率に影響を与える。緩衝液を最適化すると、感度および特異性が向上したアッセイの開発が可能になる。

Cas13M26（LbuCas13a（SEQ ID NO:131））は、反応の安定性を変化させることなく、tRNAの量を減少させた緩衝液中でのDETECTR反応において最適に機能する。反応中のtRNAの量を減少させるかまたはそれを完全に排除すると、活性化物質の非存在下で反応の安定性を劇的に変化させることなくCas13a検出アッセイの効率が上がる。Cas13aが、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の核酸を検出するためのDETECTRアッセイにおいて活性を示す緩衝液は、尿素およびSDSを欠くか、または少量で含む。さらに、Cas13aは、NaClもしくはKClを含み、30mM以下の塩を有する緩衝液中で、および/またはNaClもしくはKClのいずれかを含む緩衝液中の0～10mMのDTTで、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の核酸を検出するためのDETECTRアッセイにおいて活性を示す。Cas13aはまた、蛍光によって測定される場合、「U5」レポーター（/5-6FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ/）、「UU」レポーター（/56-FAM/TArUrUGC/3IABkFQ/）、ならびに「U5」レポーターと同じヌクレオチド配列を有するが、異なるフルオロフォアおよびクエンチャーを有するレポーター「TYE665U5」（/5-TYE665/rUrUrUrUrU/3IABkRQ/）を含む、多くのレポーターについて活性を示す。Cas13a DETECTRアッセイのための最適な緩衝液組成物およびpHには、約7.5のpHを有する緩衝液ならびに緩衝イミダゾール、ホスフェート、トリシンおよびSPGが含まれる。

Cas13aの性能は、NEバッファー 2（NEバッファー 2.1;1×緩衝液成分、50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、100μg/ml BSA、25℃でpH 7.9）およびCutsmart（1×緩衝液成分、50mM酢酸カリウム、20mM酢酸トリス、10mM酢酸マグネシウム、100μg/ml BSA、25℃でpH 7.9）において改善される。Cas13aは、Mバッファー1において最適に機能する。1×Mバッファー1は、20mMイミダゾールpH 7.5、50mM KCl、5mM MgCl2、10μg/μL BSA、0.01％ Igepal Ca-630、および5％グリセロールを含む。さらに、Cas13a性能は、5％グリセロール、BSAを含む緩衝液において改善され、NP-40がCas13a DETECTRアッセイを改善する。NP-40（Igecal-Ca 630）はCas13a検出アッセイの効率を高め、少量のBSAもアッセイの性能を向上させる。NP-40の濃度は0.05％～0.0625％が最も最適であり、BSAの濃度は2.5～0.625μg/mLが望ましい。

緩衝液は、Cas13a DETECTRアッセイの性能を阻害する、以下を含む化合物を欠く:硫酸ベリリウム、塩化マンガン、塩化亜鉛、クエン酸三ナトリウム、塩化銅、塩化イットリウム、1-6-ジアミノヘキサン、1-8-ジアミノオクタン、フッ化アンモニウム、エタノールアミン、サリチル酸リチウム、硫酸マグネシウム、シアン酸カリウム、およびフッ化ナトリウム。

LbCas12a（SEQ ID NO:27）は、pH 8.0の緩衝液および以下の緩衝液タイプ:AMPD、BIS-TRISプロパン、DIPSO、HEPES、MOPS、TAPS、TRIS、およびトリシン緩衝液を使用する、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）からの標的核酸を検出するためのDETECTRアッセイにおいて最適な活性を示す。LbCas12aは、低いKCl濃度（0～40mMまたは20mM未満の塩と、さらに少ないKCl）でDETECTRアッセイにおいて活性を示す。

Cas12変異体（SEQ ID NO:37）は、DIPSO、HEPES、MOPS、TAPS、イミダゾールおよびトリシンを含む緩衝液において、7.5のpHで最適に機能する。Cas12変異体は、約4mM（2～10nMで変動）の塩濃度で最もよく機能し、MgClおよびKClを含む緩衝液と比較して、MgOAcおよびKOAcを含む緩衝液（酢酸緩衝液）において活性の増加を示す。さらに、Cas12変異体はヘパリンによって阻害され、低塩が好ましい。

緩衝液は、以下を含む、Cas12変異体DETECRアッセイの性能を阻害する特定の化合物を欠く:塩酸ベンズアミジン、硫酸ベリリウム、塩化マンガン、臭化カリウム、ヨウ素ナトリウム、塩化亜鉛、リン酸水素二アンモニウム、クエン酸三リチウム、クエン酸三ナトリウム、塩化カドミウム、塩化銅、塩化イットリウム、1-6ジアミノヘキサン、1-8-ジアミノオクタン、フッ化アンモニウムおよび硫酸アンモニウム。アッセイ性能を高める化合物には、ポリビニルアルコールII型、DTT、DMSO、ポリビニルピロリドンK15、ポリエチレングリコール（PEG）600、およびポリプロピレングリコール400が含まれた。

SNPの分化は、crRNAの3’末端に沿った（PAMから遠位の）Cas12変異体でより強い。LbCas12a（SEQ ID NO:27）は、標的配列に沿ったすべての位置で強い変異感受性を示し、PAM近位（crRNA標的配列の5’末端に相補的）末端での感受性はこの領域の変異に対してより感受性であり、変異感受性は標的部位に依存する。

実施例14
CRISPR-Casシステムを使用したDETECTR反応における、呼吸器ウイルス由来の標的核酸の視覚的検出のためのラテラルフロー試験ストリップ
この実施例は、CRISPR-Casシステムを使用したDETECTR反応における、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）由来の標的核酸の検出の視覚的検出のためのラテラルフロー試験ストリップを記載する。DETECTR反応のための視覚的読み出しは、低コスト形式を有し、大量生産に適するように開発されている。ここでは、特注のラテラルフローストリップについて説明する。コロイド状金ナノ粒子が抗体にコンジュゲートされ、金ナノ粒子はアッセイにおける視覚的読み出しとして機能する。（1）Millenia Hybridetect 1、TwistDx（UK、現在はAbbottの一部）および（2）PCRD、Abingdon Health（UK）を含む2つの市販のラテラルフローストリップを試験する。

結果は、（1）ストリップの目視検査、および（2）ストリップの携帯電話カメラ写真の取得によって収集される。市販のラテラルフロー試験ストリップとは異なり、本明細書中に開示される特注のラテラルフローストリップの設計は、反応の上流のDETECTR反応チャンバに不可逆的にコンジュゲートされる、（1）6-フルオレセイン（FAM）部分;（2）ビオチン部分;および（3）DNAベースのオリゴリンカーから作製される新型のCRISPR-Casレポーター分子を含む。

Cas12変異体およびLbCas12aの読み出しのためのラテラルフローストリップ。ラテラルフローストリップを、Cas12変異体（SEQ ID NO:37）およびLbCas12a（SEQ ID NO:27）の読み出しについて試験する。複合体化反応は、反応あたり40nMのcrRNA、反応あたり40nMの最終タンパク質、および反応あたり500nMのレポーターの最終濃度を含む。複合体化反応物を37℃で30分間インキュベートし、レポーター基材を添加し、15uLの複合体化反応物をPCR管に分注する。5uLの希釈したPPRウイルスPCR生成物を添加し、標的（例えば、呼吸器ウイルス由来の標的核酸を含有する試料）および複合体を37℃で20分間インキュベートする。100uLのMIlenia GenLineディップスティックアッセイ緩衝液（TweenまたはTriton）を添加し、ディップスティックを標的および複合体を含む溶液に挿入する。試験ストリップを写真撮影し、ImageJを使用して上部バンドを定量化した。

MNT-ラテラルフロー、Au NPコンジュゲーション。抗FAMおよび抗ROXポリクローナル抗体は、特注のラテラルフローストリップにおいて下流で使用するために金ナノ粒子にコンジュゲートされる。材料には、Corning Spin-X UF 500uLコンセントレータおよびGold in a Boxコンジュゲーションキットが含まれる。PBS、pH 7.2（1×）をヌクレアーゼフリー水で1:1で希釈することによって、0.5×緩衝溶液を調製する。100ulのMNT抗体および100ulのFITC抗体を使用する。スピンコンセントレータを使用して、本来の緩衝液を、10％グリセロールを含む0.1 Mトリスグリセリン（pH 7）から0.5×PBSに、両方の抗体について交換する。100ulの0.5×PBSによる洗浄を行い、コンセントレータを各洗浄について18,000 rcg（xg）で1.5分間回転させた。抗体を100ulの0.5×PBS中に溶出させる。金のコンジュゲーションは、製造業者の使用説明書に従って行う。管をMNT1-10およびFITC1-10で標識し、7ulの各抗体を添加した。反応物を、室温の振盪インキュベータ中で30分間インキュベートする。各管に50uLのBSA遮断緩衝液を添加することによって反応を停止させ、管を4Cで保存する。

LbuCas13aの読み出しのためのラテラルフローストリップ。LbuCas13aの読み出しのためのラテラルフローストリップについて試験する。TwistDxラテラルフローストリップを使用して、FAM-U5-ビオチン（rep71レポーター）を試験する。アッセイは、様々な標的濃度で室温で実行される。複合体化反応は、反応あたり40nMのcrRNA、反応あたり40nMの最終タンパク質、および反応あたり500nMのレポーターの最終濃度を含む。複合化反応物を37℃で30分間インキュベートする。10nM、1nM、0.1nM、0.01nMの標的の、および標的を含まない希釈物を反応物に添加する。30uLの複合体化反応物を標的に添加し、室温で15分間インキュベートする。反応物を氷上に置き、10uLの反応物をラテラルフロー試料領域に直接ピペットで移す。50uLのMilenia GenLineディップスティックアッセイ緩衝液を加え、ストリップを撮影した。

キットを使用した3’アミノレポーターのNHSビーズへのコンジュゲーション。NHS FlexiBind磁気ビーズキットを使用して、ラテラルフロー装置（Milenia Hybrid）の意図された使用を可能にする3’アミノ改変ラテラルフローレポーターをコンジュゲートし、そこでリガンドが最初に検出され、コントロールラインがフローコントロールとして機能する。使用されるレポーターの配列は、

である。

ビーズのコンジュゲーションは以下のようにして行う。Rep75を洗浄/結合緩衝液（PBS、pH 7.4）中で100μMに再懸濁する。32.5nmolがIDTから送達され、5.4nmol（54μL）のrep75が使用される。20％ NHS FlexiBind磁気ビーズを20秒間ボルテックスすることによって再懸濁する。100μLのビーズスラリーを1.5mL微量遠心管にピペットで入れる。磁気ビーズは、溶液が透明になるまで磁気スタンド上でペレット化する。保存緩衝液を除去し、廃棄する。100μLの氷冷平衡緩衝液（1mM HCl）を直ちに添加する。反応物を磁石から取り出し、20秒間ボルテックスし、次いで磁石上に戻してビーズをペレット化する。上清を除去し、廃棄し、PBS中の100μM rep75の54μLを添加する。ビーズを室温で、間隔を空けて混合（2分間の休止、15秒間の1200 rpmでの混合）しながら2時間インキュベートする。管を磁気スタンド内に配置して、ビーズを磁石に移動させる。未結合リガンドを除去し、分析のために保存する。

20μLのNFW中の0.5μLの未処理レポーターを、20μLのNFW中の0.5μLのコンジュゲーション後上清に対して、もはや緑色と視認できなくなるまでプレートリーダー上で測定する。クエンチ緩衝液500μLを添加し、30秒間ボルテックスし、磁気ラックでペレット化する。上清を捨て、試料を5回洗浄する。ビーズを500μLのクエンチ緩衝液に再懸濁し、室温で1時間インキュベートする。ビーズを磁気ラックでペレット化し、緩衝液を除去して廃棄する。ビーズを100μLの洗浄/結合緩衝液（PBS、pH 7.4）に再懸濁し、ビーズを暗色の管内で氷上に維持する。

ラテラルフローによる未切断/非コンジュゲートレポーターの試験は、2×NG-40-B009 Naked Gold Solビーズ-40nm-15 OD-9mL、FITC抗体（Invitrogen TB265150）、抗IgG（Invitrogen A16098）、ストレプトアビジン（NEB N7021S）、pH 8.8、および3つのバッチ、すなわちバッチ1:AU（5μL）-＞抗IgG（μL）-＞Strep（0.5μL）、バッチ2:AU（5μL）-＞strep（1μL）-＞抗IgG（1μL）、およびバッチ3:AU（2.5μL）-＞strep（1μL）-＞抗IgG（1μL）を使用して行う。

最初の複合体反応によって、Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を用いてビーズを試験する。反応は、反応あたり40nMのcrRNA、反応あたり40nMのタンパク質、および反応あたり100、250、500、または1000nMのレポーターの最終濃度で行う。複合体を37℃で30分間インキュベートする。ビーズの40μMストックを1:10～4μMに希釈する。レポータービーズを5μLのPPRV希釈PCR生成物またはNFWに添加し、15μLの複合体化反応物を標的に添加した。反応物をThermomixerで2000 rpmで振盪しながら、37℃で30分間インキュベートする。ビーズを磁気ラックで2分間ペレット化する。10μLの反応物を新しい管に移し、50μLのディップスティックアッセイ緩衝液を添加し、60μLの希釈した反応物を磁石上に置いた後、溶液をラテラルフローストリップに添加する。反応をMileniaフローストリップ上で起こす。

図29は、典型的なレポーターを含む、Mileniaの市販ストリップのレイアウトを示す。この概略図は、右の試料適用領域、続いてすぐ左のウィッキング領域、続いて左のビオチンリガンド含有領域、続いて左の抗ウサギ抗体を配置した領域を含む、分析物非依存性万能ディップスティックを示す。試料および分析物特異的溶液を、ビオチンまたはFITCを有する分析物ディテクターと共にインキュベートする。試料をストリップ上で実行する。陽性結果は2つのバンドを示す-左端のバンドは対照バンドからのものであり、抗FITC抗体被覆金ナノ粒子の抗ウサギ抗体への結合に起因する。右側のバンドは、試験バンド自体に由来し、ビオチンリガンドによるビオチンを有する分析物ディテクターへの結合に起因し、ディテクターは分析物を複合体化し、分析物は、FITCを有する別のディテクターにさらに複合体化され、次にそれは、抗FITC抗体被覆金粒子に結合する。陰性結果では、コントロールラインにただ一つのバンドが見られる。

図30は、アンプリコンを含む、Milenia HybridDetect 1ストリップのレイアウトを示す。この概略図は、上の図の右端にFAMおよびビオチンプライマーを使用したPCRアンプリコンを上部に示す。陽性結果の場合、ストリップは2つのバンドを示す、すなわちこのPCRアンプリコンが試験ラインで固定化された部分に結合し、FAM分子（startとして示す）が抗FAM抗体被覆粒子に結合する。試験ラインの左側には、抗FAM抗体被覆ナノ粒子に結合する抗ウサギ抗体を含有するフローコントロールラインがある。陰性結果の場合、ストリップは1つのバンド、すなわち、試験ストリップ上に固定化された抗ウサギ抗体に結合した抗FAM抗体被覆ナノ粒子の結合のみを示す。

図31は、標準的なCasレポーターを含む、Milenia HybridDetect 1ストリップのレイアウトを示す。陽性結果が上部に示され、Casタンパク質が標準的なレポーターを切断し、ストリップ上に配置された抗ウサギ抗体への抗FAM抗体被覆ナノ粒子の結合に起因する、唯一のバンドが見られる。陰性結果が下部に示され、完全なレポーターがストリップ上に固定化された部分に結合し、コントロールラインにおいてすべての抗FAM抗体被覆ナノ粒子が完全なCasレポーター上のFAM分子に結合する。標的核酸を含む試料および水のみを含む対照を流した結果は、水のみの対照を用いても、偽陽性バンドが試験ラインに現れることを示す。

図32は、FAM分子（緑色のスタートで示す）に結合したビオチン-dT（ピンクの六角形で示す）へのDNAリンカーを含む改変Casレポーターを示す。この改変Casレポーター全体を、磁気ビーズ、またはストリップの上流にある反応チャンバの表面にコンジュゲートした。これは、改変CasレポーターのDETECTRチャンバ/ビーズの基材への固定化として概略図に示される。Cas（黄色のpac-manとして示される）による切断の間、ビオチン-FAM分子はDNAリンカーから放出される。他のアッセイフォーマットとは異なり、この特定のアッセイフォーマットは、反応チャンバへのCas切断反応全体を含む。このアッセイフォーマットでは、試験ラインは実際の試験ラインであり、コントロールラインは真のコントロールラインである。図33は、改変Casレポーターを含む、Milenia HybridDetectストリップのレイアウトを示す。上部には、陽性結果が示されており、Cas反応チャンバでは、Casタンパク質が改変CasレポーターのDNAリンカーセグメントを切断する。ビオチン-dT/FAM分子が放出され、試験ライン上を被覆したストレプトアビジンに結合する試験ストリップを流れ落ちる。抗FAM抗体被覆金ナノ粒子は、試験ラインにおいてビオチン-DT/FAMレポーターに結合する。さらに、抗FAM抗体被覆金ナノ粒子は、フローコントロールラインにおいて抗ウサギ抗体被覆に結合する。下部には、陰性結果が示され、抗FAM抗体被覆金ナノ粒子のみが、フローコントロールラインにおいて抗ウサギ抗体被覆に結合する。

図34は、単一の標的アッセイフォーマット（左）および多重化アッセイフォーマット（右）の一例を示す。上は、使用前のアッセイの概略図を示す図であり、抗FAM抗体被覆金ナノ粒子のみ（左）または抗FAM抗体被覆金ナノ粒子および抗ROX抗体被覆金ナノ粒子（右）が、コントロールラインおよび試験ラインの上流にある。コントロールラインにストレプトアビジンを配置し、試験ラインに標的Aのみ（左）または標的Aおよび標的B（右）を配置する。陽性結果を有するアッセイを中央の概略図に示し、陰性結果を有するアッセイを一番下の概略図に示す。

図35は、使用前のアッセイ（上）、陽性結果を有するアッセイ（中央左）、陰性結果を有するアッセイ（中央右）、および失敗した試験（下）の別の変形を示す。このアッセイでは、フローコントロールがストリップの左端にあり、抗IgGウサギ抗体で被覆された試験ラインが続き、ストレプトアビジンで被覆されたコントロールラインが続き、抗FAMまたは抗ビオチン抗体で被覆された金ナノ粒子が続く。Casレポーターは、反応チャンバ内のストリップの上流にある。切断された場合、Casレポーターが切断され（陽性結果）、FAM分子は抗FAM被覆金ナノ粒子に結合し、それは続いて試験ラインで結合し、抗ビオチン抗体被覆ナノ粒子がコントロールラインでDNA/RNAリンカー/ビオチン構築物に結合する。Casレポーターが切断されない場合（陰性結果）、完全なレポーターはコントロールラインでストレプトアビジンに結合し、それらはその後、そこで抗FAM被覆金ナノ粒子によって結合される。

抗ビオチン抗体への金ナノ粒子コンジュゲーション。抗ビオチン抗体の100μlアリコートを使用し、抗体をヌクレアーゼフリー水に懸濁させる。溶液中の7ulの希釈抗体を管に添加し、反応物を室温の振盪インキュベータ内で30分間インキュベートした。BSA遮断緩衝液50ulを添加して各管の反応を停止させ、管を4Cで保存した。

実施例15
CRISPR-Casシステムを使用したDETECTR反応において呼吸器ウイルスから標的核酸を電流測定検出するためのインベルターゼ結合アッセイでの下流使用のための、オリゴヌクレオチドのペプチド/酵素へのコンジュゲーション
この実施例は、CRISPR-Casシステムを使用したDETECTR反応において呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）から標的核酸を電流測定検出するためのインベルターゼ結合アッセイでの下流使用のための、オリゴヌクレオチドのペプチド/酵素へのコンジュゲーション方法を記載する。本明細書に開示される方法は、DETECTR反応の蛍光およびラテラルフローイムノクロマトグラフィ読み出しの代替として開発され、3’チオール修飾を使用したDETECTRレポーターへのインベルターゼ酵素の効率的なコンジュゲーションを含む。DETECTR反応の電流測定検出のためのインベルターゼ結合アッセイで使用するためのCRISPR-Casレポーター分子は、（1）5’-ビオチン部分および（2）3’-インベルターゼ酵素を含む。オリゴの配列は、

であり、インベルターゼ酵素は3’末端でコンジュゲートされている。コンジュゲーション用の試薬としては、パン酵母（S. セレビシエ（Cerevisiae））由来のインベルターゼ、ストレプトアビジン磁気ビーズ、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（TCEP）、N-スクシンイミジル4-（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート、SMCC（SMCC）、1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2、2-（Nモルホリノ）エタンスルホン酸（MES）、塩化ナトリウム5M無菌、およびビオチン標識オリゴが挙げられる。

緩衝液および溶液の調製。緩衝液には、（1）0.1Mホスフェート緩衝液、NaClなし、pH 7.2、（2）0.1Mホスフェート、0.1M NaCl、pH 7.2、（3）0.05M MES緩衝液、pH 5.5、および（4）0.1M NaClを含む0.05M MES緩衝液、pH 5.5が含まれる。TCEP溶液、SMCC溶液およびインベルターゼ溶液を固体から調製する。DNS試薬も調製する。

DNAオリゴのチオール活性化。1.5mLの微量遠心管中で、チオール-ビオチン標識オリゴ（15μL、水中1mM）をTCEP（3μL、水中0.5M）と混合する。12μLの当量緩衝液を添加して、反応物体積を30μLまでにする。以下の12個の反応混合物を調製する:低pHのMB406、塩緩衝液なし;低pHのMB406、塩緩衝液を含む;PBSを含むMB406、塩なし;PBSおよび塩緩衝液を含むMB406;低pHのMB407、塩緩衝液なし;低pHで塩緩衝液を含むMB407;PBSを含み、塩を含まないMB407;PBSおよび塩緩衝液を含むMB407;低pHのMB408、塩緩衝液なし;低pHで塩緩衝液を含むMB408;PBSを含むMB408、塩なし;PBSおよび塩を含むMB408。各緩衝液において、DNAオリゴの体積は15μLであり、TCEPの体積は3μLであり、緩衝液の体積は12μLであった。反応物を37℃の振盪インキュベータ内で3～5時間インキュベートする。反応を液体窒素中での急速凍結によって停止させる。微量遠心管を反応の次の工程まで-20℃で保存する。チオール活性化オリゴ管を、活性化インベルターゼ/または他の活性化タンパク質/ペプチドへのコンジュゲーションの3時間前に冷凍庫から取り出す。管を最初に37℃で3時間インキュベートし、次いでコンジュゲーション反応に使用する。

インベルターゼ酵素のSMCC活性化。インベルターゼの新鮮な溶液のラボストックボトルを調製する。10mgの固体を清浄な1.5mL微量遠心管に秤量し、860μLの緩衝液A（0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2）を添加して20mg/mLの溶液を作製する。1mgのSMCCを1.5mL微量遠心管に添加し、インベルターゼ溶液（400μL、0.1M NaCl中20mg/mL、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2）の添加によって反応を開始する。反応物を37℃の振盪インキュベータ内で24時間インキュベートする。

SMCC活性化インベルターゼの浄化。23時間15分後、反応物を振盪インキュベータ（37℃）から取り出す。SMCC活性化インベルターゼを8回洗浄し、400μLの緩衝液に再懸濁する。BCA法によりタンパク質を定量化する。

チオール-DNAオリゴの再活性化。オリゴを-20℃から取り出し、37℃の振盪インキュベータ中でインキュベートする。反応を開始し、振盪インキュベータ（37℃）内で48時間インキュベートする。反応物をインキュベータから取り出し、各反応物に（1）35μLのインベルターゼ溶液および（2）30μLのチオール-DNAオリゴ溶液を含めた。

ストレプトアビジンビーズとの結合。12.5μLのストレプトアビジンビーズを、予めインベルターゼ酵素とコンジュゲートした50μLのビオチン化DNAオリゴと1.5mL微量遠心管中で混合する。反応物を室温で5分間インキュベートし、磁気ラック上の緩衝液Aの50μLアリコートでビーズを5回洗浄して、溶液からすべての未結合DNAオリゴを除去し、すべての洗浄からの溶出液をインベルターゼ活性（したがって、ストレプトアビジンとビオチン分子との非効率的な結合）についてチェックした。最後の洗浄中、ビーズを50μLの緩衝液Aで再懸濁し、ビーズを4℃で保存した。

DNS/スクロースとのインキュベーション。5μLの20％スクロース、30μLのDNS試薬、インベルターゼ部分を有する25μLのビオチン化DNAを含有する反応物を調製する。高温（95 C）でのインキュベーション後に色の変化が観察される。

DNA-インベルターゼコンジュゲーション。コンジュゲーションは、ヘテロ二官能性リンカーであるスルホ-SMCCを用いて行われる。Millipore水中の1mMチオール-DNA 30uLに、pH 5.5の1Mリン酸ナトリウム緩衝液2uL、およびMillipore水中の30mM TCEP 2uLを添加し、混合する。この混合物を室温で1時間保持し、次いで、Tween-20を含まない緩衝液A（0.1M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.3、0.05％ Tween-20）を使用してAmicon-10Kによって8回精製する。インベルターゼコンジュゲーションのために、Tween-20を含まない緩衝液A中の20mg/mLインベルターゼ400uLを1mgのスルホ-SMCCと混合する。5分間ボルテックスした後、溶液を振盪器上に室温で1時間置く。次いで、混合物を遠心分離し、不溶性の過剰なスルホ-SMCCを除去した。次いで、透明な溶液を、Tween-20を含まない緩衝液Aを使用してAmicon-100Kによって8回精製する。スルホ-SMCC活性化インベルターゼの精製溶液を上記のチオール-DNAの溶液と混合する。得られた溶液を室温で48時間保持する。未反応のチオール-DNAを除去するために、溶液を、Tween-20を含まない緩衝液Aを使用してAmicon-100Kによって8回精製する。コンジュゲーションはまた、ホモ二官能性リンカーPDITCを用いて行われる。Millipore水中の1mMアミン-DNA 60uLに、30uLの緩衝液B（0.1Mホウ酸ナトリウム緩衝液、pH 9.2）を添加し、混合する。この溶液を、1mLのDMFに溶解した20mgのPDITCとさらに混合する。得られた溶液を振盪器に置いて、暗所で2時間室温に保つ。その後、溶液を6mLのMillipore水および6mLの1-ブタノールと混合する。15分間遠心分離した後、上部有機相を廃棄する。次いで、水相を4mLの1-ブタノールで3回抽出し、Tween-20を含まない緩衝液Aを使用してAmicon-10Kによって8回精製して、PDITC活性化アミン-DNA溶液を作製する。PDITC活性化比は、DNA生成物を脱塩した後に得られるMALDI-TOF質量分析によって測定すると90％を超える。次いで、Tween-20を含まない緩衝液A中の活性化DNA溶液に10mgのインベルターゼを添加して、約5mg/mLの最終濃度に到達する。得られた溶液を室温で48時間保持する。未反応のPDITC活性化アミン-DNAを除去するために、溶液を、Tween-20を含まない緩衝液Aを使用してAmicon-100Kによって8回精製する。Tweenはインベルターゼ活性に必要ではない;（2）1mg/mlのインベルターゼ反応は5分後に終了する可能性が高い;（3）2％スクロースインプットで、約15分後にRTで赤色が生じる;（4）DNSは0.2％未満のスクロースには効果的でない。

実施例16
呼吸器ウイルスから標的核酸を検出するためのCRISPR診断のためのラテラルフロー切断レポーター
この実施例は、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）から標的核酸を検出するためのCRISPR診断のためのラテラルフロー切断レポーターを記載する。本明細書に開示されるCasレポーターの1つの設計は、Casレポーターをラテラルフロー試験ストリップの上流の反応チャンバにつなぐことを含む。

図36は、つながれたラテラルフローCasレポーターの1つの設計を示す。左側は、3’末端での化学的コンジュゲーションのための機能性ハンドル（アミン、チオールなど）と、FAMレポーター分子にさらに接続された5’末端でのビオチン（菱形で示される）とを接続するDNAまたはRNAリンカーである。このCasレポーター全体を磁気ビーズにコンジュゲートさせ、反応チャンバの表面に固定化する。CRISPR-Cas切断反応の後、DNA/RNAリンカーが切断され、ビオチン/FAMレポーター部分が放出される。

図37は、磁気ビーズを使用するつながれた切断レポーターを使用する、CRISPR診断のためのワークフローを示す。最初に、CRISPR-Casタンパク質RNPが標的核酸とインキュベートされ、磁気ビーズがレポーターにコンジュゲートされた。磁気ビーズを磁石で捕捉し、上清を除去し、試料をチェイス緩衝液と共にラテラルフローストリップ上に置く。

つながれた切断レポーターを使用して、CRISPR診断からの読み出しを多重化することもできる。磁気ビーズにコンジュゲートさせたFAM-ビオチンおよびDIG-ビオチンレポーターを、Cas12変異体（SEQ ID NO:37）と共に、標的DNA（約0.5nM）の存在下または非存在下、37℃で30分間、2つの別々のDETECTR反応でインキュベートする。インキュベーション期間の後、磁気ビーズをペレット化し、上清をPCRDラテラルフローストリップ（Abingdon Health）に移した。

図38は、反応チャンバに到達する前にストレプトアビジン-ビオチンによって濾過される酵素-レポーター系の概略図を示す。レポーター構造は左に示されており、ビオチンと酵素とを接続するDNA/RNAリンカーを含む。標的の存在下（上に示す）では、Casタンパク質はCas反応チャンバ内でリンカーを切断し、捕捉チャンバ内または紙ストリップ上でのビオチンのストレプトアビジンへの結合をもたらし、酵素の基質を含む検出チャンバで酵素活性が示される。標的の非存在下（下に示す）では、Casタンパク質はCas反応チャンバ内でリンカーを切断せず、捕捉チャンバの内部の全部のレポーターの結合をもたらし、酵素の基質を含む検出チャンバ内に酵素は存在しない（したがって、酵素活性がない）。

実施例17
インフルエンザCRISPR診断のためのラテラルフローアッセイ
この実施例は、インフルエンザCRISPR診断のためのラテラルフローアッセイを記載する。図32に示すように、DNAまたはRNAリンカーを5’末端でビオチン-dT/FAMにコンジュゲートし、3’末端でDETECTRチャンバ/ビーズの基材にコンジュゲートする。これらのCasレポーターは、ラテラルフロー試験ストリップの上流の反応チャンバ内部にある。Cas酵素、およびインフルエンザウイルス由来の標的核酸を含有する試料を、増幅のための試薬と共に添加する。増幅された標的核酸は、Casタンパク質によってDNAまたはRNAリンカーのトランス切断を活性化する。Casタンパク質は、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas13、Cas13aまたはCas14である。ビオチン-dt/FAMレポーター部分は放出され、図33に示すように、下流の試験ラインへと流れ、そこでストレプトアビジンを結合する。ビオチン-dT/FAMレポーター部分は、抗FAM抗体被覆金ナノ粒子によって結合され、これはまた、フローコントロールラインで抗ウサギ抗体被覆に結合し、したがって陽性試験結果を明らかにする。試料中にインフルエンザウイルス由来の標的核酸が存在しない場合、Casレポーターは反応チャンバ内の基材に固定されたままであり、抗FAM抗体被覆金ナノ粒子は、フローコントロールラインで抗ウサギ抗体被覆に結合するだけであり、したがって陰性試験結果を明らかにする。

実施例18
多重化インフルエンザCRISPR診断
この実施例は、インフルエンザCRISPR診断のためのラテラルフローアッセイを記載する。DNAまたはRNAリンカーを5’末端でビオチン-dT/FAMにコンジュゲートし、第2のDNAまたはRNAリンカーを5’末端でビオチン-dT/ROXにコンジュゲートする。両方のレポーターは、図61に示されるように、3’末端でDETECTRチャンバ/ビーズの基材にコンジュゲートされる。これらのCasレポーターは、ラテラルフロー試験ストリップCas酵素の上流の反応チャンバ内部にあり、インフルエンザウイルス由来の標的核酸を含有する試料が増幅用試薬と共に添加される。増幅された標的核酸は、Casタンパク質によってDNAまたはRNAリンカーのトランス切断を活性化する。Casタンパク質は、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas13、Cas13aまたはCas14である。ビオチン-dt/FAMおよび/またはビオチン-dt/ROXレポーター部分は放出され、図33に示すように、下流の試験ラインへと流れ、そこでストレプトアビジンを結合する。レポーター部分は、抗FAM抗体および/または抗ROX抗体被覆金ナノ粒子によって結合され、これはまた、フローコントロールラインで抗ウサギ抗体被覆に結合し、したがって陽性試験結果を明らかにする。試料中にインフルエンザウイルス由来の標的核酸が存在しない場合、Casレポーターは反応チャンバ内の基材に固定されたままであり、抗FAM抗体被覆金ナノ粒子は、フローコントロールラインで抗ウサギ抗体被覆に結合するだけであり、したがって陰性試験結果を明らかにする。

実施例19
CRISPR診断を用いた対象のインフルエンザの診断
この実施例は、本開示のCRIPSR Cas診断を用いた、対象におけるインフルエンザの診断を記載する。頬スワブまたは鼻スワブなどの試料を対象から採取する。対象の疾病は、診断未確定である。試料を、本開示のCRISPR-Cas診断、例えば、実施例17のCRISPR-Cas診断に加える。ガイドはインフルエンザウイルスに対して設計されている。インフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルスまたはインフルエンザBウイルスである。インフルエンザに対応する試料中の標的核酸は、ガイド配列に結合し、したがってCasタンパク質によるCasレポーターのトランスコラテラル切断を活性化する。Casタンパク質は、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas13、Cas13aまたはCas14である。このように、CRISPR診断は陽性結果を明らかにし、対象はインフルエンザと診断される。

実施例20
インフルエンザCRISPR-Casコンパニオン診断
この実施例は、本開示のインフルエンザCRISPR-Casコンパニオン診断を記載する。頬スワブまたは鼻スワブなどの試料を対象から採取する。対象はインフルエンザを有し、インフルエンザ治療薬を処方され、服用している。試料を、本開示のCRISPR-Cas診断、例えば、実施例17のCRISPR-Cas診断に加える。ガイドはインフルエンザウイルスに対して設計されている。インフルエンザウイルスは、インフルエンザAウイルスまたはインフルエンザBウイルスである。インフルエンザに対応する試料中の標的核酸は、ガイド配列に結合し、したがってCasタンパク質によるCasレポーターのトランスコラテラル切断を活性化する。Casタンパク質は、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas13、Cas13aまたはCas14である。したがって、CRISPR診断は、インフルエンザ治療薬が対象においてインフルエンザウイルスを完全に排除していないことを示す結果を明らかにする。

実施例21
ディテクター核酸としてのインベルターゼ-核酸
この実施例は、プログラマブルヌクレアーゼシステムにおいて呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）から標的核酸を検出するためのディテクター核酸としてのインベルターゼ-核酸を示す。

図39は、標的核酸の検出に使用されるインベルターゼ-核酸を示す。インベルターゼ-核酸は、磁気ビーズ上に固定化されており、Casタンパク質、ガイドRNAおよび標的核酸を含む試料反応に添加される。標的認識は、Casタンパク質を活性化して、インベルターゼ-核酸の核酸を切断し、固定化された磁気ビーズからインベルターゼ酵素を遊離させる。この溶液は、スクロースおよびDNS試薬を含有し、インベルターゼがスクロースをグルコースに変換すると黄色から赤色に変色する「反応混合物」に移されるか、またはデジタル読み出しのために手持ち式血糖値測定器装置に移すことができる。

実施例22
DETECTR反応のアッセイレイアウトおよびワークフロー
この実施例は、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）からの標的核酸を検出するためのDETECTR反応のアッセイレイアウトおよびワークフローを記載する。プログラマブルヌクレアーゼベースの検出アッセイに対して、増幅および逆転写のための別個のチャンバを含むアッセイが提供される。プログラマブルヌクレアーゼは、Cas12、Cas13、またはCas14である。試料は、スワブによって収集される生体流体であり、貯蔵器に挿入される。ポンプは、アッセイ中の流体を駆動し、試料をチャンバからチャンバに移動させる。検出可能な信号は、比色、蛍光ベース、電気化学であり、かつ/または酵素（例えば、インベルターゼ）を使用して生成される。

図40は、DETECTRアッセイの1つのレイアウトを示す。このレイアウトでは、スワブ収集キャップがスワブ貯蔵器チャンバを密封する。スワブ貯蔵器チャンバに対して時計回りに、増幅反応混合物を保持するチャンバがある。増幅反応混合物を保持するチャンバに対して時計回りに、DETECTR反応混合物を保持するチャンバがある。これに対して時計回りに検出領域がある。検出領域に対して時計回りに、pHバランスウェルがある。カートリッジウェルのキャップが示され、様々な試薬混合物を含有するすべてのウェルを封止している。カートリッジ自体は、概略図の下部に正方形の層として示されている。右側には、各チャンバ/ウェル内の流体を駆動し、カートリッジ全体に接続される、機器パイパーポンプの図が示されている。カートリッジの下方には、機器と接続する回転バルブがある。図41は、図40のDETECTRアッセイにおける様々な反応の一ワークフローを示す。最初に、左上の図に示すように、スワブが200ulのスワブチャンバに挿入され、混合され得る。中央の左の図では、バルブを時計回りに「スワブチャンバポジション」まで回転させ、1uLの試料を採取する。左下の図では、バルブを時計回りに「増幅反応混合物」ポジションまで回転させ、1ulの試料を分注して混合する。右上の図では、2uLの試料が「増幅反応混合物」から吸引される。中央上の図では、バルブを時計回りに「DETECTR」ポジションまで回転させ、試料を分注して混合し、20ulの試料が吸引される。最後に、右下の図では、バルブを時計回りに検出領域ポジションまで回転させ、20ulの試料を分注する。回転バルブが閉位置にある間に、試料はスワブ溶解チャンバに充填され、キャップを使用して密封される。次いで、試料をインキュベートし、器具によって溶解緩衝液と混合する。試料溶解後、回転バルブが回転して試料ウェルと位置合わせし、2～4μLの試料を吸引する。次いで、回転バルブが回転して増幅チャンバと位置合わせ、そこで試料が増幅混合物と混合される。次いで、試料が吸引され、回転バルブがDETECTRチャンバまで回転する。DETECTRチャンバ内で、試料はDETECTR混合物と混合する。ピペットポンプの作動で、反応混合物が混合される。プロセスは、次に増幅チャンバから第2のDETECTRチャンバまで繰り返されてもよい。

図42は、本開示の方法およびシステムとも一致する、図41に示されるワークフローの変形例を示す。左側は、図41の右上に示されている図である。右側は修正図であり、そこでは、スワブ溶解チャンバに対して反時計回りに第1の増幅チャンバがあり、スワブ溶解チャンバに対して時計回りに第2の増幅チャンバがある。さらに、増幅チャンバ＃2に対して時計回りに2つのセット、すなわちそれぞれ「二重DETECTRチャンバ＃2」および「二重DETECTR チャンバ＃1」と標識された「二重」DETECTRチャンバがある。図43は、図42に示す修正されたレイアウトのワークフローの内訳を示す。具体的には、200ulの試料を保持するスワブ溶解チャンバから、20ulの試料を増幅チャンバ＃1に移動させることができ、20ulの試料を増幅チャンバ＃2に移動させることができる。増幅チャンバ＃1で増幅した後、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃1aに移動させ、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃1bに移動させることができる。さらに、増幅チャンバ＃2で増幅した後、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃2aに移動させ、20ulの試料を二重DETECTRチャンバ＃2bに移動させることができる。

図44は、図42および図43に示すカートリッジの変形例を示す。図45は、図44のカートリッジの上面図を示す。このレイアウトおよびワークフローは、図40～図41のレイアウトおよびワークフローと比較する再現を有する。図46は、ツーポットDETECTRアッセイのレイアウトを示す。上部には、カートリッジと接続する空気圧ポンプが示されている。中央には、貯蔵器を有する最上層を示すカートリッジの上面図が示されている。下部には、試料を含むスライドバルブ、および左側の溶解チャンバを指す矢印が示され、右側に増幅チャンバ、さらに右側にDETECTチャンバが続く。図57は、スライドバルブ装置の概略図を示す。図58は、スライドバルブ装置のレイアウトおよびワークフローを示す。最初の閉ポジション（i）において、試料を試料ウェルに充填し、溶解する。次いで、スライドバルブを器具によって作動させ、適切な量をチャネルに分注するピペットポンプを使用して試料を各チャネルに充填する（ii）。試料は、スライドバルブを作動させることによって増幅チャンバに送達され、ピペットポンプで混合される（iii）。増幅チャンバからの試料は、各チャネルに吸引され（iv）、次いで、スライドバルブおよびピペットポンプを作動させることによって、各DETECTRチャンバに分注され、混合される（v）。

実施例23
DETECTRアッセイ対PCRベース検出
この実施例は、本明細書に開示されるDETECTRアッセイと、ゴールドスタンダードである、標的核酸を検出するPCRベース方法との比較を記載する。試料を、DETECTRアッセイのための粗調製物（溶解のみ）として使用するか、またはPCRベースの検出法のために精製（溶解、結合、洗浄、および溶出）した。プログラマブルヌクレアーゼ（例えば、Casタンパク質）を使用するDETECTRアッセイを、粗試料に対して行う。プログラマブルヌクレアーゼは、試料中の標的核酸によって活性化され、それに逆相補的ガイドRNAを介して結合する。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、蛍光の検出可能な信号を生成するレポーターを無差別に切断する。標準的なPCRベース方法もまた使用して、試料中の標的核酸を検出した。

図47は、本明細書に開示されるDETECTRアッセイと、標的核酸を検出するゴールドスタンダードPCRベース方法との比較を示す。粗（左）から純粋（右）への試料調製評価の勾配を示すフローチャートが示されている。粗試料を純粋な試料にする試料調製工程には、溶解、結合、洗浄および溶出が含まれる。本明細書に開示されるDETECTRアッセイは、溶解の試料調製工程のみを必要とし、粗試料をもたらし得る。一方、PCRベース方法は、溶解、結合、洗浄および溶出を必要とし、非常に純粋な試料をもたらし得る。本明細書に開示されるDETECTRアッセイは、ゴールドスタンダードPCRベースの検出方法と同様に、呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）から標的核酸を同定することができる。

実施例24
DNAのCas13a検出
この実施例は、標的DNAのCas13a検出を記載する。Cas13aを使用して、インフルエンザA RNAから標的RT-LAMP DNAアンプリコンを検出した。図48Aは概略図を示す。RT-LAMP反応を、10,000ウイルスゲノムコピーまたは対照として0ウイルスゲノムコピーの開始RNA濃度で、55℃で30分間行った。2つの異なるプライマーセットは同じ結果を示した（図48Bおよび図48C）。RT-LAMP反応の完了後、1μLのアンプリコンを20μLのCas13a検出反応物に添加した。オンターゲットおよびオフターゲットcrRNAを使用して、Cas13aによる37℃でのRT-LAMP DNAアンプリコンの特異的検出を証明した。

図48Aは、DNA/RNA、LAMP/RT-LAMPの提供、およびCas13a検出を含むワークフローの概略図を示す。図48Bは、y軸上のバックグラウンドを差し引いた蛍光によって測定される、第1のプライマーセットを含む標的RT-LAMP DNAアンプリコンのCas13a特異的検出を示す。オンターゲットcrRNAの結果は、より濃い棒で示され、オフターゲットcrRNA対照の結果は、より淡い棒で示される。10,000ウイルスゲノムコピーの開始RNA濃度を左の2つの棒で示し、0ウイルスゲノムコピー（陰性対照）を右の2つの棒で示す。図48Cは、y軸上のバックグラウンドを差し引いた蛍光によって測定される、第2のプライマーセットを含む標的RT-LAMP DNAアンプリコンのCas13a特異的検出を示す。オンターゲットcrRNAの結果は、より濃い棒で示され、オフターゲットcrRNA対照の結果は、より淡い棒で示される。10,000ウイルスゲノムコピーの開始RNA濃度を左の2つの棒で示し、0ウイルスゲノムコピー（陰性対照）を右の2つの棒で示す。

Cas13aは、標的ssDNAおよび標的RNAを認識した。図49Aは、2.5nMのRNA、一本鎖DNA（ssDNA）または二本鎖（dsDNA）を標的核酸として使用するCas13検出アッセイを示し、検出は試験した標的核酸のそれぞれについて蛍光によって測定した。反応は、RNA-FQ（RNA蛍光クエンチレポーター）およびDNA-FQレポーター基材の両方を用いて37℃で20分間行った。結果は、Cas13が標的RNAおよび標的ssDNAの両方についてRNA-FQのトランス切断活性を開始することを示した。データを、各レポーター基材の最大蛍光信号に対して正規化した。図49Bは、2.5nMのRNA、ssDNAおよびdsDNAを標的核酸として使用するCas12検出アッセイを示し、検出は試験した標的核酸のそれぞれについて蛍光によって測定した。反応を、RNA-FQレポーター基材およびDNA-FQレポーター基材の両方を用いて37℃で20分間行った。結果は、以前に確立されたCas12の標的ssDNAまたは標的dsDNAのいずれかに対する選好、およびDNA-FQに対する特異性を裏づけた。データを、各レポーター基材の最大蛍光信号に対して正規化した。図49Cは、様々な濃度の標的RNA、標的ssDNAおよび標的dsDNAに対するCas13およびCas12の性能を示し、試験した標的核酸のそれぞれについて検出を蛍光によって測定した。反応を、RNA-FQレポーター基材およびDNA-FQレポーター基材の両方を用いて37℃で90分間行った。データを、各レポーター基材の最大蛍光信号に対して正規化した。結果は、標的ssDNAに対するCas13のピコモル感度を示した。

標的ssDNAを標的とする場合、Cas13aトランス切断活性はRNAレポーターに特異的であることが分かった。図50は、170nMの様々なレポーター基材を含む2.5nMの標的ssDNAを使用するLbuCas13a（SEQ ID NO:131）検出アッセイを示し、試験したレポーター基材のそれぞれについて蛍光によって検出を測定した。単一のRNA-FQレポーター基材（rep01-FAM-U5）を試験し、13個のDNA-FQレポーター基材を試験した。以下の表12は、試験したレポーターのそれぞれの配列を示す。

（表１２）レポーター配列

結果は、標的ssDNAによって活性化された場合でも、Cas13のトランス切断がRNAレポーターに特異的であることを示した。

複数のCas13ファミリーメンバーが標的ssDNAを検出した。図51Aは、10nMまたは0nMの標的RNAを使用するLbuCas13a（SEQ ID NO:131）およびLwaCas13a（SEQ ID NO:137）についてのCas13検出アッセイの結果を示す。検出は、レポーターの切断から生じる蛍光によって経時的に測定した。異なる配列をコードする3つの標的RNAを、対応するgRNAで評価した。結果は、両方のCas13ファミリーメンバーについて、3つすべての標的核酸の同様の検出を示した。図51Bは、10nMまたは0nMの標的ssDNAを使用するLbuCas13aおよびLwaCas13aについてのCas13検出アッセイの結果を示す。検出は、レポーターの切断から生じる蛍光によって経時的に測定した。標的RNAと同じ配列を有する、3つの標的DNAおよびそれらの対応するgRNAを評価した。結果は、標的ssDNA認識におけるCas13ファミリーの選好を示し、LbuCas13aはいくつかの標的核酸についてより速い検出を示し、LwaCas13aは他の標的についてより速い検出を示した。

標的ssDNAのCas13検出は、複数のpH値で強力であった。図52は、6.8～8.2の範囲の様々なpH値を有する緩衝液中で1nMの標的RNA（左）または標的ssDNA（右）を使用するLbuCas13a検出アッセイを示す。反応を、RNA-FQレポーター基材を用いて37℃で20分間行った。結果は、より高いpH（7.9～8.2）の緩衝液においてCas13 RNA検出の増強を示したが、Cas13 ssDNA検出はpH条件全体（6.8～8.2）で一貫していた。

標的ssDNAに対するCas13の選好は、標的RNAに対する選好とは異なることが分かった。図53Aは、1ヌクレオチド間隔で標的配列に沿ってタイリングされたガイドRNA（gRNA）を示す。図53Bは、1ヌクレオチド間隔でタイリングされたgRNAおよび標的外gRNAを含む0.1nM RNAまたは2nM標的ssDNAを使用した、LbuCas13a（SEQ ID NO:131）検出アッセイを示す。ガイドRNAを、標的核酸の配列に沿った位置によってランク付けした。図53Cは、標的ssDNAの性能によってランク付けされた図53Bからのデータを示す。結果は、ssDNAに対するgRNAの性能は、RNAに対する同じgRNAの性能と相関しないことを示した。図53Dは、標的RNAの3’末端上の各ヌクレオチドに対するgRNAの性能を示す。結果は、この位置での標的ヌクレオチド同一性にかかわらず、標的RNA上に高性能gRNAが存在することを示した。図53Eは、標的ssDNAの3’末端上の各ヌクレオチドに対するgRNAの性能を示す。結果は、この位置での標的のGが、他のgRNAよりも性能が劣ることを示した。

Cas13aは、核酸増幅法（PCR、LAMP）によって生成された標的DNAを検出した。図54Aは、様々なLAMP等温核酸増幅反応からの1μLの標的DNAアンプリコンを使用したLbuCas13a（SEQ ID NO:131）検出アッセイを示す。試験したLAMP条件には、ループフォワード（LF）およびループリバース（LB）の両方を有する6プライマー、LFのみを有する非対称LAMP、およびLBのみを有する非対称LAMPが含まれた。試験したすべてのLAMP反応は、LbuCas13aに適合する標的DNAを生成した。図54Bは、様々な量のPCR反応を標的DNAとして使用するLbuCas13a（SEQ ID NO:131）検出アッセイを示す。結果は、PCRが十分な標的ssDNAを生成してCas13検出が可能になることを示した。

実施例25
DETECTR反応のレイアウトおよびワークフロー
この実施例は、DETECTR反応のアッセイレイアウトおよびワークフローを記載する。プログラマブルヌクレアーゼベースの検出アッセイに対して、増幅および逆転写のための別個のチャンバを含むアッセイが提供される。プログラマブルヌクレアーゼは、Cas12、Cas13、またはCas14である。試料は、スワブによって収集される生体流体であり、貯蔵器に挿入される。生体流体試料を、インフルエンザウイルス由来の標的核酸の存在について試験する。ポンプは、アッセイ中の流体を駆動し、試料をチャンバからチャンバに移動させる。検出可能な信号は、比色、蛍光ベース、電気化学であり、かつ/または酵素（例えば、インベルターゼ）を使用して生成される。

図55Aは、空気圧バルブ装置の概略図を示す。ピペットポンプは、試料を吸引して分注する。空気マニホールドを空気圧ポンプに接続して、常閉バルブを開閉する。空気圧装置は、流体をある位置から次の位置に移動させ、システムの未使用部分を分離する。空気圧の設計は、他の装置と比較してチャネルクロストークが低減されている。図55Bは、示す空気圧バルブ装置で使用するためのカートリッジの概略図を示す。常閉バルブ（そのようなバルブの1つを矢印で示す）は、チャンバが使用されていないときに各チャンバをシステムの残りの部分から隔離するために、チャネルの上部にエラストマー封止を備える。空気圧ポンプは空気を使用して、カートリッジ内の必要なチャンバに流体を移動させるために必要に応じてバルブを開閉する。カートリッジは、複数の異なる試料媒体を組み込むことができる。カートリッジは、200μLの溶解緩衝液体積を収容でき、インキュベーション工程、例えば10分間のインキュベーションを行うことができる。カートリッジは、最大4つの増幅チャンバからの2μL試料の2つの吸引を収容する。2つの試料は、増幅チャンバ間または検出チャンバ間の交差汚染が制限されて、対応する検出チャンバに分注され得る。カートリッジは、試料インプットチャンバから増幅チャンバへの1～2μLの溶解試料の移送を収容する。カートリッジは、最大4つの増幅チャンバを備えてもよく、増幅チャンバごとに2つの検出チャンバを備え、合計で最大8つの検出チャンバを備えてもよい。各DETECTRチャンバは、例えば分光計によって画像化することができる。図55に示され、図56に例示されるように、カートリッジは、2つの増幅チャンバ、および増幅チャンバごとに2つの検出チャンバを有してもよい。

図56は、空気圧バルブ装置のバルブ回路レイアウトを示す。（i）に示すように、すべてのバルブを閉じた状態で、生体流体試料を試料ウェルに入れる。試料を試料ウェルに溶解する。溶解された試料は、（ii）に示すように、第1の振動バルブを開くことによって試料チャンバから第2のチャンバに移され、ピペットポンプを用いて試料を吸引する。次いで、試料は、（iii）に示すように、第1の振動バルブを閉じ、第2の振動バルブを開くことによって第1の増幅チャンバに移され、そこで増幅混合物と混合される。試料は増幅混合物と混合した後、（iv）に示すように、第2の振動バルブを閉じ、第3の振動バルブを開くことによって、次のチャンバに移動させる。試料を、（v）に示されるように、迅速な第3のバルブを閉じ、迅速な第4のバルブを開くことによって検出チャンバに移動させる。検出チャンバは、プログラマブルヌクレアーゼを含む。標的核酸が試料中に存在する場合、検出可能な信号が生成され得る。検出可能な信号は、検出チャンバ内で画像化することができる。試料は、（vi）に示すように、振動バルブの異なる系列を開閉することによって、チャンバの異なる系列を通って移動させることができる。所望のチャンバ系列内の個々のバルブの作動は、チャネル間の交差汚染を防止する。

図59は、本開示の空気圧バルブ装置のカートリッジの最上層の概略図を、適切な寸法を強調して示す。概略図は、2インチ×1.5インチの1つのカートリッジを示す。図60は、電気化学的寸法に適応させた、本開示の空気圧バルブ装置のカートリッジの変更された最上層の概略図を示す。この概略図では、3つの線が検出チャンバ（最も右側の4つのチャンバ）に示されている。これらの3本の線は、3電極システムを形成するために使い捨てカートリッジ内に共成形、3D印刷、または手動で組み立てられる配線（または「金属リード」）を表す。電極は、動作電極、カウンター電極、および基準電極と称される。電極をカートリッジにスクリーン印刷することもできる。使用される金属は、炭素、金、白金または銀であり得る。

実施例26
LAMPおよびDETECTR反応の組み合わせのためのプライマー設計
この実施例は、本明細書で提供される標的核酸を増幅および検出する、LAMPおよびDETECTR反応の組み合わせのためのプライマー設計を記載する。LAMPおよびDETECTR反応の組み合わせに使用するプライマーを設計するための戦略を試験し、複数の標的核酸について評価した。これらの実験から、DNA核酸標的のためのLAMPおよびDETECTR反応の組み合わせ、またはRNA核酸標的のためのRT-LAMPおよびDETECTR反応を促進するように設計ガイドラインのセットを決定した。

図61は、標的核酸配列のループ介在等温増幅（LAMP）用のプライマーを設計するためのスキームを示す。LAMPは、増幅中に核酸ループから形成される標的核酸配列を含むコンカテマーアンプリコンを生成する。ループを生成するために、LAMPは、フォワードアウタープライマー、バックワードアウタープライマー、フォワードインナープライマー、バックワードインナープライマー、任意でループフォワードプライマー、および任意でループバックワードプライマーを含む4～6個のプライマーを使用し得る。

図62は、LAMPプライマー、ガイドRNA配列、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）に対応するかまたはアニールする核酸配列、ならびにLAMPおよびDETECTRによる増幅および検出のための標的核酸配列の様々な領域の例示的な構成の概略図を示す。

図62Aは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNA（gRNA）の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、F1c領域とB1領域との間に存在する標的核酸の配列に逆相補的である。

図62Bは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNA配列の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、F1c領域とB1領域との間に存在する標的核酸の配列に部分的に逆相補的である。例えば、標的核酸は、ガイド核酸の少なくとも60％に逆相補的である、F1c領域とB1領域との間の配列を含む。この配置では、ガイドRNAは、図61に示すフォワードインナープライマーまたはバックワードインナープライマーと逆相補的ではない。

図62Cは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNAの例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、B1領域とB2領域との間のループ領域内に存在する標的核酸の配列にハイブリタイズする。プライマー配列は、PAMもPFSも含まず、PAMともPFSとも逆相補的ではない。

図62Dは、LAMPプライマーに対応するか、またはアニールする核酸配列の様々な領域に対するガイドRNAの例示的な配置の概略図を示す。この配置では、ガイドRNAは、F2c領域とF1c領域との間のループ領域内に存在する標的核酸の配列にハイブリタイズする。プライマー配列は、PAMもPFSも含まず、PAMともPFSとも逆相補的ではない。

LAMPおよびDETECTR反応の組み合わせためのプライマーセットおよびガイドRNAを、試料中の標的核酸の存在を検出する、それらの感度および特異性について試験した。未処理蛍光として測定されたDETECTR信号を、特定のLAMPプライマーセット用に設計された3つのガイドRNAの各々を用いて各LAMPプライマーセットについて測定した。DETECTR信号は、標的核酸配列を10000コピー含む試料および標的核酸配列を0コピー含む試料（陰性対照）において、各LAMPプライマーおよびガイドRNA対について測定した。

図63は、LAMPプライマー、ガイドRNA配列、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）に対応するかまたはアニールする核酸配列、ならびに増幅および検出のために組み合わせたLAMPおよびDETECTRについての標的核酸配列の様々な領域の例示的な構成の概略図をそれぞれ示す。右側では、概略図はまた、LAMP増幅を使用した標的核酸の増幅の後に、ガイドRNA配列を使用して標的核酸配列の存在を検出する、対応する蛍光データを示し、ここで蛍光信号は、DETECTR反応の出力であり、標的核酸の存在を示す。LAMPプライマー、ガイドRNA配列、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）、および標的核酸配列に対応するかまたはアニールする領域の配列および配置を図64A～図64Cに示す。3つの例示的なガイドRNA（gRNA1（SEQ ID NO:271）、gRNA2（SEQ ID NO:272）、およびgRNA3（SEQ ID NO:273））をそれぞれのプライマー構成で試験した。3つのガイドRNAのそれぞれについて測定された、標的核酸の検出を示す、DETECTR反応からの蛍光信号を、標的核酸配列を含有する試料（反応あたり1000ゲノムコピー）および標的核酸配列を含有しない陰性対照（反応あたり0ゲノムコピー）の2つの試料について比較した。gRNAおよびプライマーの配列を以下の表13に示す。

（表１３）例示的なLAMPプライマーおよびDETECTR gRNAセット

図63Aは、LAMPプライマーに対応またはアニールする核酸配列の様々な領域の配置（SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、およびSEQ ID NO:259～SEQ ID NO:262）、およびLAMPプライマーに対する3つのガイドRNA（gRNA1（SEQ ID NO:271）、gRNA2（SEQ ID NO:272）、およびgRNA3（SEQ ID NO:273））の位置の概略図を示す（左）。gRNA1はB2c領域と部分的に重複し、したがってB2領域と逆相補的である。gRNA2はB1領域と重複し、したがってB1c領域と逆相補的である。gRNA3はB3領域と部分的に重複し、かつB2領域と部分的に重複し、したがって、B3c領域と部分的に逆相補的であり、かつB2c領域と部分的に逆相補的である。相補的領域（B1c、B2c、B3c、F1c、F2c、およびF3c）は図示されていないが、図61に示されている領域に対応する。右側は、標的核酸の10,000ゲノムコピー（増幅前）または標的核酸の0ゲノムコピーの存在下でのDETECTR反応からの蛍光のグラフである。gRNA1およびgRNA3でのDETECTR反応は、低い蛍光強度を示し、標的核酸の検出が低いかまたは不検出を示した（右）。gRNA2は、gRNA2のBIPのB1c領域とのハイブリタイズ、およびガイドRNAの自己活性化およびCas切断活性によって、標的核酸の存在とは無関係に蛍光信号を生成した。gRNA2のBIPとのハイブリタイズは、プライマー二量体の形成による非標的配列の増幅をさらにもたらし得る。

図63Bは、LAMPプライマーに対応またはアニールする核酸配列の様々な領域の配置（SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:263～SEQ ID NO:265）、およびLAMPプライマーに対する3つのガイドRNA（gRNA1（SEQ ID NO:271）、gRNA2（SEQ ID NO:272）、およびgRNA3（SEQ ID NO:273））の位置の概略図を示す（左）。gRNA1はB1c領域と重複し、したがってB1領域と逆相補的である。gRNA2はLF領域と重複し、したがってLFc領域と逆相補的である。gRNA3はB2領域と部分的に重複し、かつLBc領域と部分的に重複し、したがって、B2c領域と部分的に逆相補的であり、かつLB領域と部分的に逆相補的である。右側は、標的核酸の10,000ゲノムコピーまたは標的核酸の0ゲノムコピーの存在下でのDETECTR反応からの蛍光のグラフである。3つのガイドRNAはすべて、標的核酸の存在下での高い蛍光信号によって証明されるように、DETECTR反応において標的核酸の存在を検出した（右）。gRNA1はまた、BIPによるプライマー二量体形成によって、標的核酸の非存在下で非特異的蛍光信号を生成した。gRNA2およびgRNA3は、実質的な非特異的蛍光信号を生成しなかった。

図63Cは、LAMPプライマーに対応またはアニールする核酸配列の様々な領域の配置（SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:265～SEQ ID NO:270）、およびLAMPプライマーに対する3つのガイドRNA（gRNA1（SEQ ID NO:271）、gRNA2（SEQ ID NO:272）、およびgRNA3（SEQ ID NO:273））の位置の概略図を示す（左）。gRNA1はB1c領域と重複し、したがってB1領域と逆相補的である。gRNA2はLF領域と部分的に重複し、かつF2c領域と部分的に重複し、したがってLFc領域と部分的に逆相補的であり、F2領域と部分的に逆相補的である。gRNA3はB2領域と重複し、したがって、B2c領域と逆相補的である。右側は、標的核酸の10,000ゲノムコピーまたは標的核酸の0ゲノムコピーの存在下でのDETECTR反応からの蛍光のグラフである。gRNA2およびgRNA3は、標的核酸の存在下での高い蛍光信号および標的核酸の非存在下での低い蛍光信号によって証明されるように、DETECTR反応において標的核酸の存在を特異的に検出した（右）。gRNA1は、標的核酸の存在下での高い蛍光信号および標的核酸の非存在下での中程度の蛍光信号によって証明されるように、DETECTR反応において標的核酸の存在を検出したが、BIPによるプライマー-二量体形成によって、さらに標的核酸の非存在下で蛍光信号を非特異的に生成した。

実施例27
LAMPおよびDETECTR反応の組み合わせによる標的核酸の検出
この実施例は、LAMPおよびDETECTR反応の組み合わせによる標的核酸の検出を記載する。RT-LAMPアッセイで使用するための10個のLAMPプライマーセット（＃1～＃10）を、標的核酸配列を含む試料に対する感度および特異性について試験した。RT-LAMP増幅後の検出は、SYTO 9検出またはDETECTRのいずれかを使用して行った。各プライマーセット中のLAMPプライマーの配列を表14に示す。

（表１４）RT-LAMP増幅および検出のためのLAMPプライマー

図65は、DNA結合色素を使用して検出された逆転写LAMP（RT-LAMP）反応の結果までの時間を示す図である。SYTO9蛍光の増加によって測定されるLAMP増幅を経時的に観察し、結果までの時間を、SYTO9蛍光強度最大値の半分に達する時間として決定した。10個のLAMPプライマーセットについて、RNAウイルス由来の標的配列の存在下（1000ゲノムコピー）または非存在下（0ゲノムコピー）で結果までの時間を比較した。プライマーセット、すなわち＃1（SEQ ID NO:148～SEQ ID NO:153）、＃7（SEQ ID NO:173～SEQ ID NO:178）、＃8（SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:176およびSEQ ID NO:179～SEQ ID NO:182）および＃10（SEQ ID NO:187～SEQ ID NO:192）は、標的配列を含む試料と標的配列を欠く陰性対照との間で明確な判別を示した。結果までの時間の減少は、標的核酸配列について陽性の試料を示す。

図66は、RT-LAMP反応からの生成物との5分間のインキュベーション後の、Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を使用したDETECTR反応からの蛍光信号を示す。LAMPプライマーセット＃1～6は、ガイドRNA＃2（SEQ ID NO:250）と共に使用するように設計され、LAMPプライマーセット＃7～10は、ガイドRNA＃1（SEQ ID NO:249）と共に使用するように設計された。各プライマーセット中のプライマーの配列を表14に示す。SEQ ID NO:249に対応する配列を有するガイドRNA（ガイドRNA＃1、上の棒グラフ）またはSEQ ID NO:250に対応する配列を有するガイドRNA（ガイドRNA＃2、下の棒グラフ）のいずれかを使用して、標的配列の存在下（1000ゲノムコピー）または非存在下（0ゲノムコピー）で各LAMPプライマーセットについてDETECTR信号を比較した。データは、DETECTRを使用して特異的LAMP増幅と非特異的LAMP増幅とを識別すると、標的配列を含む反応と標的なし対照反応との間で明確な差異を示す。DETECTR反応で使用されるgRNAの配列を表15に提供する。

（表１５）DETECTRによるRT-LAMP増幅のためのDETECTR gRNA

実施例28
RT-LAMPおよびSYTO9を用いたインフルエンザAおよびBウイルスの検出
この実施例は、LAMPおよびSYTO9を用いたインフルエンザAおよびBウイルスの検出を記載する。0、100、1000、10,000、もしくは100,000コピーのインフルエンザAウイルス（IAV）、または0、100、1000、10,000、もしくは100,000コピーのインフルエンザBウイルス（IBV）のいずれかの標的核酸を含む試料を、異なるLAMPプライマーのセットを使用してRT-LAMP増幅に供した。LAMPプライマーのセット（1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、または陰性対照）を、標的核酸配列を特異的に増幅する能力について比較した。増幅を、SYTO9を使用して結果までの時間として測定した。結果までの時間の減少は、標的核酸配列について陽性の試料を示す。

各反応RT-LAMP反応は、ヌクレアーゼフリー水中の反応物10μLあたり、1×NEB IsoAmp緩衝液、4.5mM MgSO₄、6.4 U/μL Bst 2.0（NEB）、0.75μL Warmstart RTx逆転写酵素、1μL 10×プライマーミックス、および0.2μL SYTO9の存在下で行った。

図67は、LAMPプライマーセット1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、または陰性対照を用いたRT-LAMP増幅後の、SYTO 9（DNA結合色素）を使用したインフルエンザAウイルス（IAV）由来の配列の検出を示す。プライマーセットごとに10の反応を行い、反応を2つ組で行った。個々のプロットは、LAMP増幅反応中の経時的な蛍光強度を示す。SYTO 9からの蛍光を、反応中に存在する標的配列の量の関数として経時的に測定した。行のプロットは、上から下へ、標的核酸の0、100、1000、10,000または100,000コピーの存在下での増幅を示す。列のプロットは、左から右に、プライマーセット1、2、IBV、4、5、6、7、8、9、10および11を使用した増幅を示す。プライマーセット1（SEQ ID NO:193～SEQ ID NO:198）は、平坦な陰性対照曲線を示し、LAMP増幅反応での使用の適合性を示す。プライマーセット2（SEQ ID NO:199-SEQ ID NO:204）は、LAMPを使用する標的核酸の増幅での使用によく適している。プライマーセット8（SEQ ID NO:220-SEQ ID NO:225）およびプライマーセット10（SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223-SEQ ID NO:225およびSEQ ID NO:229-SEQ ID NO:230）もまた、LAMPを使用する標的核酸の増幅によく機能する。プライマーセット8は、プライマーセット10よりも低い陰性対照増幅信号を生成する。

図69は、図67に示すSYTO 9蛍光トレースから決定された、異なるプライマーセットを用いたLAMP増幅後のIAV標的配列の増幅までの時間を示す。結果までの時間は、最大SYTO 9蛍光強度の半分に達する時間として決定した。増加する濃度の標的配列（反応あたり標的配列の0、100、1000、10,000または100,000ゲノムコピー）の存在下でSYTO9を使用して増幅を検出した。このアッセイは、すべてのプライマーセットについて、陰性対照反応（標的配列なし）と、標的配列の100,000ゲノムコピーを含む反応とを識別することができた。各プライマーセット中のLAMPプライマーの配列を表16に示す。

（表１６）RT-LAMPを用いたIAVおよびIBVウイルスの増幅および検出のためのプライマー

図68は、RT-LAMP増幅後のインフルエンザBウイルス（IBV）標的配列の増幅までの時間を示す。増加する濃度の標的核酸配列（反応あたり標的配列の0、100、1000、10,000または100,000ゲノムコピー）の存在下でSYTO 9を使用して増幅を検出した。RT-LAMP増幅を、表16に提供されるプライマーセット＃8（SEQ ID NO:220～SEQ ID NO:225）を使用して行った。

実施例29
LAMPおよびDETECTRを用いたインフルエンザAウイルスの検出
この実施例は、LAMPおよびDETECTRを用いたインフルエンザAウイルスの検出を記載する。インフルエンザAウイルス（IAV）標的核酸配列を含有するか、またはIAV標的核酸配列を欠く試料を、異なるLAMPプライマーのセットを使用してRT-LAMP増幅に供した。LAMPプライマーのセットを、標的核酸配列を特異的に増幅するそれらの能力について比較した。続いて、DETECTRを用いて試料中の標的核酸の有無を測定した。プログラマブルヌクレアーゼの活性化時の蛍光信号の増加によって測定されるDETECTR信号を、経時的に観察した。蛍光の増加は、標的核酸配列の存在を示す。

各RT-LAMP反応は、ヌクレアーゼフリー水中の反応物20μLあたり、1×NEB IsoAmp緩衝液、4.5mM MgSO₄、1.4mM dNTP（NEB）、6.4 U/μL Bst 2.0（NEB）、1.5μL Warmstart RTx、および2μL 10×プライマーミックスの存在下で行った。各DETECTR反応は、ヌクレアーゼフリー水中の1×プロセシング緩衝液、250nM crRNA、および200nM Sr-WT LbCas12a（SEQ ID NO:27）プログラマブルヌクレアーゼの存在下で行った。

図70は、LAMPプライマーセット1、2、4、5、6、7、8、9、10、または陰性対照を用いたRT-LAMP増幅後の、DETECTRを使用したインフルエンザAウイルス（IAV）由来の標的核酸配列の検出を示す。RT-LAMP増幅を、表16に提供されるプライマーセットを使用して行った。プライマーセットごとに10回の反応を行った。異なるgRNAを用いてDETECTRを行った。DETECTR反応で使用されるgRNAの配列を表17に提供する。DETECTR信号を、反応中に存在する標的配列の量の関数として測定した。個々のプロットは、LAMP増幅後のDETECTR反応中の経時的な蛍光強度を示す。各プロット上の個々のトレースは、増幅、その後のSEQ ID NO:251に対応するガイドRNA（R283 gRNA、青色）、SEQ ID NO:252に対応するガイドRNA（R781 gRNA、赤色）、SEQ ID NO:253に対応するガイドRNA（R782 gRNA、緑色）、またはSEQ ID NO:254に対応するガイドRNA（IBV gRNA、紫色）を用いたDETECTRを示す。行のプロットは、上から下へ、標的核酸の0、100、1000、10,000または100,000コピーの存在下でのLAMP増幅後のDETECTRを示す。列のプロットは、左から右に、プライマーセット1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、またはIBVを使用したLAMP増幅後のDETECTRを示す。プライマーセット1の使用は、RT-LAMPによる標的核酸の強力な増幅をもたらした。プライマーセット2はまた、RT-LAMPによる標的核酸配列の増幅と、DETECTRによる標的核酸配列の検出とを組み合わせた方法での使用によく適していることが分かった。プライマーセット8（SEQ ID NO:220～SEQ ID NO:225）およびプライマーセット10（SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223-SEQ ID NO:225、およびSEQ ID NO:229～SEQ ID NO:230）は、標的核酸の非存在下での非特異的増幅または検出のない、標的核酸の強力な増幅および検出によって示されるように、R782で分析したSEQ ID NO:253に対応するガイドRNAを使用して検出されるRT-LAMPおよびDETECTRの組み合わせ反応での使用によく適していた。IBVからの標的核酸配列も、標的のRT-LAMP増幅後のDETECTRによって検出された。

（表１７）IAVまたはIBVのDETECTRによるRT-LAMP増幅のためのDETECTR gRNA

実施例30
LAMPおよびDETECTRを用いたSNPの検出
この実施例は、LAMPおよびDETECTRを用いたSNPの検出を記載する。SNPを検出するためのLAMPおよびDETECTR反応の組み合わせに使用するプライマーを設計するための戦略を試験し、複数の標的SNPについて評価した。これらの実験から、DNA核酸標的のためのLAMPおよびDETECTR反応の組み合わせ、またはRNA核酸標的のためのRT-LAMPおよびDETECTR反応を促進するように設計ガイドラインのセットを決定した。

図71は、標的核酸配列のLAMP増幅および標的核酸配列内の一塩基多型（SNP）の検出のためのプライマーを設計するためのスキームを示す。例示的な配置では、標的核酸のSNPは、F1c領域とB1領域との間に位置する。

図72は、標的核酸のLAMP増幅およびDETECTRを使用した標的核酸の検出の方法のための、LAMPプライマー、ガイドRNA配列、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）またはプロトスペーサー隣接部位（PFS）、およびSNPを含む標的核酸の例示的な配置の概略図を示す。

図72Aは、LAMPプライマーに対応するかまたはアニールする核酸配列の様々な領域に対する、ガイドRNAの例示的な配置の概略図を示す。この配置では、標的核酸のPAMまたはPFSは、F1c領域とB1領域との間に位置する。ガイドRNA配列の全体は、F1c領域とB1c領域との間に存在し得る。SNPは、ガイドRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列内に位置するものとして示されている。

図72Bは、LAMPプライマーに対応するかまたはアニールする核酸配列の様々な領域に対する、ガイドRNA配列の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、標的核酸のPAMまたはPFSは、F1c領域とB1領域との間に配置され、標的核酸は、ガイド核酸の少なくとも60％に逆相補的なF1c領域とB1領域との間の配列を含む。この実施例では、ガイドRNAは、フォワードインナープライマーまたはバックワードインナープライマーと逆相補的ではない。SNPは、ガイドRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列内に位置するものとして示されている。

図72Cは、LAMPプライマーに対応するかまたはアニールする核酸配列の様々な領域に対する、ガイドRNA配列の例示的な配置の概略図を示す。この配置では、標的核酸のPAMまたはPFSは、F1c領域とB1領域との間に位置し、ガイドRNA配列全体は、F1c領域とB1領域との間に存在する。SNPは、ガイドRNAにハイブリダイズする標的核酸の配列内に位置するものとして示されている。

図73は、2つのPAM部位およびHERC2 SNPを含む核酸の例示的な配列を示す。SNPは、第1のPAM部位に対して9位または第2のPAM部位に対して14位に配置される。

図74は、LAMP増幅後の第1のPAM部位に対する9位、または第2のPAM部位に対する14位のHERC2 SNPを検出するためのDETECTR反応の結果を示す。SNP位置を三角形で示す。標的配列の検出を示す蛍光信号を、HERC2中のG SNP対立遺伝子またはA SNP対立遺伝子のいずれかを含む標的配列の存在下で経時的に測定した。SNPを含む標的核酸を、表18に示されるプライマーを使用して増幅した。

（表１８）HERC2 SNPの増幅および検出のためのLAMPプライマー

ガイドRNA（crRNAのみ）を使用して標的配列を検出して、第1のPAM部位を有するA対立遺伝子（SNP 9位「A SNP」）、第1のPAM部位を有するG対立遺伝子（SNP 9位「G SNP」）、第2のPAM部位を有するA対立遺伝子（SNP 14位、「A SNP」）、または第2のPAM部位を有するG対立遺伝子（SNP 14位、「G SNP」）のいずれかを検出した。各条件のために設計された4つのガイドRNAを使用した。二つのPAM部位に対する二つのSNP対立遺伝子の検出に使用されるガイドRNAを、表19に提示する。SEQ ID NO:255に対応するガイドRNAは9位でA対立遺伝子を検出するように設計され、SEQ ID NO:256に対応するガイドRNAは9位でG対立遺伝子を検出するように設計され、SEQ ID NO:257に対応するガイドRNAは14位でA対立遺伝子を検出するように設計され、SEQ ID NO:258に対応するガイドRNAは14位でG対立遺伝子を検出するように設計された。9位G SNPガイドRNA（SEQ ID NO:256、左上）の存在下でのG対立遺伝子、および9位A SNPガイドRNA（SEQ ID NO:255、右下）の存在下でのA対立遺伝子について、高い蛍光信号が検出された。9位A SNPガイドRNA（SEQ ID NO:255、右上）の存在下でのG対立遺伝子、およびG SNPガイドRNA（SEQ ID NO:256、左下）の存在下での9位A対立遺伝子について最小蛍光信号が検出された。これは、9位G SNPおよび9位A SNPガイドRNAが、それぞれG対立遺伝子およびA対立遺伝子に対する特異性を示すことを示している。14位A SNPガイドRNA（SEQ ID NO:257）および14位G SNPガイドRNA（SEQ ID NO:258）は、14位A SNPまたはG SNPガイドRNAを有するSNPを検出した場合の高い蛍光信号によって示されるように、標的配列の存在とは無関係に両方の対立遺伝子を検出した。

図75は、標的核酸配列のLAMP増幅後のDETECTR反応からの蛍光のヒートマップを示す。DETECTR反応は、A対立遺伝子（SEQ ID NO:255）またはG対立遺伝子（SEQ ID NO:256）に特異的なガイドRNA（crRNAのみ）を使用して、2つのHERC2 SNP対立遺伝子間を識別した。陽性検出は、DETECTR反応における高い蛍光値によって示される。SEQ ID NO:255に対応するガイドRNAは、（i）A SNP陽性対照、HeLa試料、および試料2における高い蛍光信号、ならびに（ii）G SNP陽性対照、陰性対照および試料1における低い蛍光信号によって示されるように、A対立遺伝子に特異的であった。SEQ ID NO:256に対応するガイドRNAは、（i）G SNP陽性対照、HeLa試料、および試料1における高い蛍光信号、ならびに（ii）A SNP陽性対照、陰性対照および試料2における低い蛍光信号によって示されるように、G対立遺伝子に特異的であった。試料1はG対立遺伝子についてホモ接合性であり、試料2はA対立遺伝子についてホモ接合性であった。

（表１９）HERC2 SNPの増幅および検出のためのDETECTRガイドRNA

図76は、LAMPによる標的核酸の複合LAMP増幅およびDETECTRによる標的核酸の検出を示す。検出は、赤色LEDで試料を照らすことによって、DETECTRで視覚的に行った。各反応は、青色眼表現型（「青色眼」）または褐色眼表現型（「褐色眼」）のいずれかのSNP対立遺伝子を含む標的核酸配列を含有した。試料「褐色＊」および「青色＊」は、それぞれ、A対立遺伝子陽性対照およびG対立遺伝子陽性対照であった。各LAMP DETECTR反応には、褐色眼表現型（SEQ ID NO:255、「Br」）または青色眼表現型（SEQ ID NO:256、「Bl」）のいずれかのための9位ガイドRNAを使用した。標的核酸配列および対応するガイドRNAを含有する各管中の蛍光の増加によって示される通り、青色眼対立遺伝子または褐色眼対立遺伝子のいずれかの存在を目で視覚的に検出した。褐色眼対立遺伝子のガイドRNA（SEQ ID NO:255）は、褐色眼ガイドRNAおよび褐色眼標的核酸またはA SNP陽性対照のいずれかを含む管での高い蛍光信号（より明るい管）、ならびに褐色眼ガイドRNAおよび青色眼標的核酸またはG SNP陽性対照のいずれかを含む管での低い蛍光信号（より暗い管）によって示されるように、A対立遺伝子に特異的であった。青色眼対立遺伝子のガイドRNA（SEQ ID NO:256）は、青色眼ガイドRNAおよび青色眼標的核酸またはG SNP陽性対照のいずれかを含む管での高い蛍光信号（より明るい管）、ならびに青色眼ガイドRNAおよび褐色眼標的核酸またはA SNP陽性対照のいずれかを含む管での低い蛍光信号（より暗い管）によって示されるように、G対立遺伝子に特異的であった。

実施例31
コロナウイルスの検出のためのRT-LAMP DETECTR反応
この実施例は、コロナウイルスの検出のためのRT-LAMP DETECTR反応を記載する。SARS-CoV-2標的配列を、GISAIDから入手可能なすべての入手可能なゲノムを使用して設計した。手短に言うと、Clustal Omegaを使用してウイルスゲノムをアラインメントした。次に、SARS-CoV-2ゲノム上のLbCas12a標的部位を、SARS-CoV、2つのコウモリSARS様CoVゲノムおよび一般的なヒトコロナウイルスゲノムに対して濾過した。適合する標的部位を、CDCおよびWHOからの現行のプロトコールで使用されているものと最終的に比較した。PrimerExplorer v5（https://primerexplorer.jp/e/）を使用して、SARS-CoV-2のためのLAMPプライマーをN遺伝子およびE遺伝子の領域に対して設計した。図114Aは、3つのコロナウイルス株について、N遺伝子gRNAによって標的とされる標的部位の配列アラインメントを示す。N遺伝子gRNA＃1はCDC-N2アンプリコンと適合性であり、N遺伝子gRNA＃2はWHO N-Sarbecoアンプリコンと適合性である。図114Bは、3つのコロナウイルス株について、E遺伝子gRNAによって標的とされる標的部位の配列アラインメントを示す。試験した2つのE遺伝子gRNA（E遺伝子gRNA＃1およびE遺伝子gRNA＃2）は、WHO E-Sarbecoアンプリコンと適合性である。RNase P POP7プライマーは、Curtis、et al.（2018）によって最初に公開され、これらのプライマーセットと共に機能するように、適合性gRNAが設計された。

関心対象のウイルス遺伝子の合成遺伝子断片から標的RNAを生成した。最初に、T7プロモーターを含むフォワードプライマーを用いて、合成遺伝子断片に対してPCR工程を行った。次に、PCR生成物を、インビトロ転写（IVT）反応のテンプレートとして37℃で2時間使用した。次いで、IVT反応物をTURBO DNase（Thermo）で37℃にて30分間処理し、続いて75℃にて15分間の熱変性工程を行った。RNAを、RNA Clean and Concentrator 5のカラム（Zymo Research）を用いて精製した。RNAをNanodropおよびQubitによって定量化し、ヌクレアーゼフリー水で作用濃度まで希釈した。

ウイルスまたは対照RNA標的の予備増幅のためのRT-LAMP、およびトランス切断アッセイのためのLbCas12aを使用して、DETECTRアッセイを実施した。RT-LAMPは、6.5mMの濃度および10μLの最終体積のMgSO₄で調製した。LAMPプライマーを、F3およびB3について0.2μM、FIPおよびBIPについて1.6μM、LFおよびLBについて0.8μMの最終濃度で添加した。反応は、N遺伝子、E遺伝子およびRNase Pについて単独で、2μLのインプットRNAを用いて62℃で20分間行った。

LbCas12a（SEQ ID NO:27）のトランス切断のために、50nMのLbCas12a（NEBから入手可能）を62.5nMのgRNAと共に1×NEバッファー 2.1中で37℃で30分間プレインキュベートした。RNA-タンパク質複合体の形成後、ラテラルフロー切断レポーター（/56-FAM/TTATTATT/3Bio/、IDT）を500nMの最終濃度で反応物に添加した。RNA-タンパク質複合体を直ちに使用するか、または使用前に4℃で最大24時間保存した。

予備増幅工程の完了後、2μLのアンプリコンを18μLのLbCas12a-gRNA複合体および80μLの1×NEバッファー 2.1と合わせた。100μLのLbCas12aトランス切断アッセイを37℃で10分間進行させた。

次いで、ラテラルフローストリップ（Milenia HybriDetect 1、TwistDx）を反応管に添加し、約2～3分後に結果を可視化した。試料適用パッドに近い単一のバンドは陰性結果を示し、ストリップの上部に近い単一のバンドまたは2つのバンドは陽性結果を示した。

患者に最適化されたDETECTRアッセイを、以下のように変更した上記のRT-LAMP法を使用して実施した:DNA結合色素SYTO9（Thermo Fisher Scientific）を反応に含めて増幅反応を監視し、インキュベーション時間を30分に延長して低力価試料からデータを取得した。

患者に最適化された蛍光ベースのLbCas12aトランス切断アッセイを、以下の変更を加えて上記のように実施した;40nMのLbCas12aを40nMのgRNAと予めインキュベートし、その後、SYTO9色素（/5Alex594N/TTATTATT/3IAbRQSp/）の存在下での検出に適合する100nMの蛍光レポーター分子を複合体に添加した。2μLのアンプリコンを黒色384ウェルアッセイプレート中の18μLのLbCas12a-gRNA複合体と合わせ、Tecanプレートリーダーを使用して蛍光を監視した。

実施例32
SARS-CoV-2標的部位の増幅のためのプライマーセットのスクリーニング
この実施例は、SARS-CoV-2標的部位の増幅のためのプライマーセットのスクリーニングを記載する。ウイルスN遺伝子に対応するコロナウイルスRNAゲノムの領域を、異なるLAMPプライマーセット（セット1～セット11）を使用して増幅した。SARS-CoV-2 RNAを、1.5pM、5fM、または0fMのいずれかで含有する試料を各プライマーセットで増幅した。各試料中のSARS-CoV-2 RNAを、ウォームスタート逆転写酵素（「Warmstart RTx」）を使用して逆転写し、Bst 2.0 DNAポリメラーゼを使用してLAMP増幅した。アッセイを60℃で60分間行った。図77は、RT-LAMPおよびCas12 DETECTR反応を使用して試料を調製および検出する工程を概略的に示す。図97は、逆転写およびループ介在等温増幅（RT-LAMP）およびCas12検出を用いたコロナウイルスの検出のための技術仕様およびアッセイ条件を示す。

各増幅試料に対してDETECTRアッセイを実施し、結果が得られる時間を決定した。配列は、SARS-CoV-2のN遺伝子に指向するR1763に対応するgRNA配列、およびLbCas12aに対応するCas12プログラマブルヌクレアーゼを使用して検出した。DETECTRアッセイは、すべての試験したプライマーセットについて、増幅されたSARS-CoV-2標的配列に対して感受性であった。この実施例で使用されるgRNAの配列を表20に提供する。図78は、異なるプライマーセット（「2019-nCoV-set1」～「2019-nCoV-set12」）で増幅し、LbCas12aおよびSARS-CoV-2のN遺伝子に指向するgRNA（「R1763」、SEQ ID NO:323）を用いて検出したSARS-CoV-2 N遺伝子のDETECTRアッセイ結果を示す。結果までの時間が短いほど、肯定的な結果を示す。すべてのプライマーセットについて、結果までの時間は、試料に含まれる標的配列が多いほど短くなり、アッセイが標的配列に対して感受性であったことを示している。図79は、0fMおよび5fMの試料について図78にプロットされたDETECTR反応の個々のトレースを示す。各プロットにおいて、0fMトレースはベースラインの上には見えず、非特異的検出がほとんどないか全くないことを示している。R1763（SEQ ID NO:323）のために最も性能の良いプライマーセットは、SARS-CoV-2-N-set1であった。検出時間は、試験濃度で10分未満であった。

第2のアッセイでは、プライマーセットは、SarbecoのE遺伝子（gRNA R1764およびR1765で検出）およびSarbecoのN遺伝子（R1767で検出）に向けられた。図80は、N遺伝子、E遺伝子のいずれかを含有するか、または標的を含まない（「NTC」）試料に対するDETECTR反応の結果までの時間を示す。試料を、SARS-CoV-2のE遺伝子に指向する（「2019-nCoV-E-set13」から「2019-nCoV-E-set20」）か、またはSARS-CoV-2のN遺伝子に指向する（「2019-nCoV-N-set21」から「2019-nCoV-N-set24」）プライマーセットを使用して増幅した。標的部位配列を表21に提供する。最も性能の良いプライマーセットは、SARS-CoV-2-E-set14であった。R1767 N遺伝子gRNA（SEQ ID NO:327）を用いてSARS-CoV-2 N遺伝子の存在を検出し、R1764 E遺伝子gRNA（SEQ ID NO:324）またはR1765 E遺伝子gRNA（SEQ ID NO:325）のいずれかを用いてSARS-CoV-2 E遺伝子の存在を検出した。

RNase Pを増幅するための対照プライマーセットも試験した。図83は、POP7試料プライマーセットを使用したRNase Pの増幅を示す。試料を、LAMPを使用して増幅した。DETECTR反応は、RNase Pに指向するgRNA（「R779」、SEQ ID NO:330）およびCas12変異体（SEQ ID NO:37）を使用して行った。試料は、HeLaトータルRNAまたはHeLaゲノムDNAのいずれかを含有していた。一連の折れ線グラフを図83の下半分に示す。図83の下半分の上部には、標的としてHeLaトータルRNAを用いたDETECTR反応のグラフがあり、左から右に、標的濃度が20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl、0.16ng/μl、0.032ng/μl、0.0064ng/μl、0.00128ng/μl、および0ng/μlと低下していることを示す。x軸は、10の増分で0から30までの分単位の時間を示す。y軸は、任意の単位（AU）の未処理蛍光を0から50000まで10000刻みで示す。図83の下半分の下部には、標的としてHeLaゲノムDNAを用いたDETECTR反応のグラフがあり、左から右に、標的濃度が20ng/μl、4ng/μl、0.8ng/μl、0.16ng/μl、0.032ng/μl、0.0064ng/μl、0.00128ng/μl、および0ng/μlと低下していることを示す。x軸は、10の増分で0から30までの分単位の時間を示す。y軸は、任意の単位（AU）の未処理蛍光を0から50000まで10000刻みで示す。

実施例33
SARS-CoV-2標的核酸の検出の特異性
この実施例は、SARS-CoV-2標的核酸の検出の特異性を記載する。SARS-CoV-2に対応する標的RNAを含有する試料を、実施例2に記載のようにプライマーセット1を使用して増幅した。gRNAを、SARS-CoV-2のN遺伝子またはE遺伝子のいずれかを増幅するように設計された異なるプライマーセットとの適合性についてスクリーニングした。図98は、LbCas12aを使用してSARS-CoV-2を検出するための複数のgRNAを評価するDETECTRアッセイの結果を示す。標的核酸配列を、SARS-CoV-2 E遺伝子（「2019-nCoV-E-set13」から「2019-nCoV-E-set20」またはSARS-CoV-2 N遺伝子（「2019-nCoV-N-set21」から「2019-nCoV-N-set24」）を増幅するためのプライマーセットを使用して増幅した。SEQ ID NO:324に対応するgRNA（「R1764-E-Sarbeco-1」）およびSEQ ID NO:325に対応するgRNA（「R1765-E-Sarbeco-2」）は、SARS-CoV-2のE遺伝子に向けられたLAMPプライマーセットを使用して増幅された標的配列を検出することができた。SEQ ID NO:327（「R1767-N-Sarbeco」）に対応するgRNAは、SARS-CoV-2のN遺伝子に向けられたほとんどのLAMPプライマーセットを使用して増幅された標的配列を検出するのに十分であった。図98は、DETECTR反応を示す一連の折れ線グラフを示し、左から右に2019-nCoV-E-set13、2019-nCoV-E-set14、2019-nCoV-E-set15、2019-nCoV-E-set16、2019-nCoV-E-set17、2019-nCoV-E-set18、2019-nCoV-E-set19、2019-nCoV-E-set20、2019-nCoV-E-set21、2019-nCoV-E-set22、2019-nCoV-E-set23、および2019-nCoV-E-set24である。グラフの上の行において、右から2番目、3番目、および4番目のグラフは、R1767が最も迅速に最高の信号を示すことを示している。グラフの中央の行において、左から8番目までのグラフは、R1764およびR1765が最も迅速に最高の信号を示すことを示している。グラフの下の行において、左から6番目までのグラフは、R1764およびR1765が最も迅速に最高の信号を示すことを示している。すべてのグラフのx軸は、25の増分で0から75の範囲の分単位の時間を示し、y軸は、20000の増分で0から60000の範囲の任意の単位（AU）の未処理蛍光を示す。

SARS-CoV-2 RNAを、5fMまたは0fMのいずれかで含有する試料を、DETECTRアッセイを使用して増幅した。試料を、LbCas12a、およびSARS-CoV-2のN遺伝子に指向するgRNA R1763またはSARS-CoVのN遺伝子に指向するgRNA R1766のいずれかを使用して検出した。この実施例で使用されるgRNAの配列を表20に提供する。図81は、プライマーセット1（「2019-nCoV-set1」）で増幅され、LbCas12a（SEQ ID NO:27）、およびSARS-CoV-2のN遺伝子に指向するgRNA（「R1763-CDC-N2-Wuhan」、SEQ ID NO:323）またはSARS-CoVのN遺伝子に指向するgRNA（「R1766-CDC-N2-SARS」、SEQ ID NO:326）のいずれかを使用して検出されたSARS-CoV-2 N遺伝子のDETECTRアッセイ結果を示す。

図87Aは、このアッセイにおけるSARS-CoV-2のN-2遺伝子を検出するために使用されるCDC-N2標的部位の配列を概略的に示す。標的部位配列を表21に提供する。

（表２０）コロナウイルスの検出のための例示的なgRNA配列

実施例34
SARS-CoV-2の検出限界
この実施例は、SARS-CoV-2の検出限界を説明する。含まれるSARS-CoV-2標的核酸のコピー数を減少させた試料を、DETECTR反応を用いて検出した。図82は、SARS-CoV-2のN遺伝子に指向するプライマーセット（「2019-nCoV-N-set1」）を使用して増幅された、DETECTR反応におけるSARS-CoV-2の検出限界を決定するためのDETECTR反応の結果を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子標的核酸のコピーを15,000、4,000、1,000、500、200、100、50、20、または0のいずれかで含有する試料を検出した。N遺伝子RNAのゲルを以下に示す。試料は、SARS-CoV-2のN遺伝子に向けられるgRNA（SEQ ID NO:323）を使用して検出した。

図116は、SARS-CoV-2のDETECTR分析により、約30分でウイルスゲノムが10個まで同定されることを示す（20分間の増幅、10分間のDETECTR）。LbCas12a DETECTR分析の前に、重複するLAMP反応物を20分間増幅した。

図117は、図116で提供されたLbCas12a DETECTR分析について、5分での未処理蛍光を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子の検出限界は、反応あたり10ウイルスゲノムであると決定された（n＝6）。

実施例35
SARS-CoV-2検出のためのSARS-CoV-2プライマーセットの多重化
この実施例は、SARS-CoV-2検出のためのSARS-CoV-2プライマーセットの多重化を記載する。標的核酸を含有する試料を、SARS-CoV-2またはRNase Pのうちの1つまたは複数に指向するプライマーセットの組み合わせを使用して増幅した。SARS-CoV-2に指向するプライマーセットは、番号付けの「set」で表示される。図84は、多重化されたDETECTR反応の結果までの時間を示す。試料は、SARS-CoV-2のインビトロ転写されたN遺伝子（「N-gene IVT」）、SARS-CoV-2のインビトロ転写されたE遺伝子（「E-gene IVT」）、HeLaトータルRNA、または標的なし（「NTC」）のいずれかを含有した。試料を、SARS-CoV-2 N遺伝子（「set1」）、SARS-CoV-2 E遺伝子（「set14」）、またはRNase（「RNaseP」）に指向する1つまたは複数のプライマーセットを使用して増幅した。図85は、SARS-CoV-2 N遺伝子（「set1」）、SARS-CoV-2 E遺伝子（「set14」）、またはRNase Pのいずれかに指向するプライマーセットの異なる組み合わせを用いた多重化DETECTR反応の結果までの時間を示す。SARS-CoV-2のインビトロ転写N遺伝子（左「N-gene IVT」）、またはSARS-CoV-2のインビトロ転写E遺伝子（右「E-gene IVT」）を含有する試料を試験した。図86は、図84および図85からの最も優れた性能のプライマーセットの組み合わせを用いた多重化DETECTR反応の結果までの時間を示す。図84の下部には、様々なプライマーセットでのDETECTR反応の一連の折れ線グラフが示され、左から右に0.5X set1、0.5X set14、0.5X RNaseP、0.25X set1、0.25X set14、0.25X RNaseP、0.5X set1/RNaseP、0.5X set1/set14/RNaseP、0.5 set14/RNaseP、0.25X set1/RNaseP、0.25X set1/set14/RNaseP、0.25X set14/RNasePである。x軸は、分単位の時間を10増分で0から60の範囲で示す。y軸は、1e＋07の増分での0e＋00から3e＋07までの範囲である。グラフ上の各線は、N-gene IVT、E-gene IVT、HeLaトータルRNA、および非標的対照（NTC）を含む標的を示す。各グラフにおいて、NTC線は本質的に最も低い線であり、いくつかのグラフでは主として平坦である。左端のグラフでは、N-gene IVTの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から2番目のグラフでは、E-gene IVTの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から3番目のグラフでは、HeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示し、N-gene IVTおよびE-gene IVTの線が、40～50分近く遅れて信号を示す。左から4番目のグラフでは、N-gene IVTの線が最も迅速に最も高い信号を示し、続いてHeLaトータルRNAの線が、40～50分近く遅れて信号を示す。左から5番目のグラフでは、E-gene IVTの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から6番目のグラフでは、HeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から7番目のグラフでは、N-gene IVTおよびHeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から8番目のグラフでは、N-gene IVT、E-gene IVT、およびHeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から9番目のグラフでは、E-gene IVTおよびHeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から10番目のグラフでは、N遺伝子IVTおよびHeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示す。左から11番目のグラフでは、N-gene IVT、E-gene IVT、およびHeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示す。右端のグラフでは、E-gene IVTおよびHeLaトータルRNAの線が最も迅速に最も高い信号を示す。

図101は、LAMPプライマーセットをSARS-CoV-2標的の多重化増幅におけるそれらの有用性について評価する、DETECTRアッセイの結果を示す。試料を、SARS-CoV-2 N遺伝子（「set1」）またはSARS-CoV-2 E遺伝子（「set14」）、またはRNase P（「RNaseP」）に指向する1つまたは複数のプライマーセットを用いて増幅した。試料を、SARS-CoV-2のN遺伝子（SEQ ID NO:323、「N-gene」）、SARS-CoV-2のE遺伝子（SEQ ID NO:325、「E-gene」）、またはRNase P（SEQ ID NO:330）に指向するgRNAのいずれかで検出した。

実施例36
3つのコロナウイルスを識別するためのDETECTRアッセイの感度
この実施例は、3つのコロナウイルスを識別するためのDETECTRアッセイの感度を記載する。試料は、SARS-CoV-2のN遺伝子、SARS-CoVのN遺伝子、またはbat-SL-CoV45のN遺伝子に対応するRNAのいずれかを250pM含む。試料を、実施例2に記載されるように検出時に増幅した。試料は、SARS-CoV-2のN遺伝子に指向するgRNA（「R1763」）、SARS-CoVのN遺伝子に指向するgRNA（「R1766」）、またはSarbecoコロナウイルスのN遺伝子に指向するgRNA（「R1767」）のそれぞれを用いて検出した。この実施例で使用されるgRNAの配列を表20に提供する。図87Bは、SARS-CoV-2 N遺伝子（「N-Sarbeco」）標的部位の領域の配列を概略的に示す。標的部位配列を表21に提供する。図88は、SARS-CoV-2のN遺伝子（「N-2019-nCoV」）、SARS-CoVのN遺伝子（「N-SARS-CoV」）またはbat-SL-CoV45のN遺伝子（「N-bat-SL-CoV45」）のいずれかを含む試料について、SARS-CoV-2のN遺伝子（「R1763」、SEQ ID NO:323）、SARS-CoVのN遺伝子（「R1766」、SEQ ID NO:326）、またはSarbecoコロナウイルスのN遺伝子（「R1767」、SEQ ID NO:327）のいずれかに指向するgRNAの感度を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2、SARS-CoV、およびbat-SL-CoV45は、sarbecoコロナウイルスの株である。LbCas12a（SEQ ID NO:27）を用いて試料を検出した。図88は、DETECTR反応の折れ線グラフを示す。グラフは左から右へ、N-2019-nCoV、N-SARS-CoV、およびN-bat-SL-CoV45を含む、異なる標的を示す。x軸は、25の増分で0から75までの分単位の時間を示す。y軸は、任意の単位（AU）の未処理蛍光を0から100万まで25万刻みで示す。各グラフの3本の線は、R1763、R1766、およびR1767を含む。左端のグラフでは、R1766の線が平坦に見える一方、R1763およびR1767の線は最も迅速に最も高い信号を示す。中央のグラフでは、R1763の線が平坦に見える一方、R1766およびR1767の線は最も迅速に最も高い信号を示す。右端のグラフでは、R1763の線が平坦に見える一方、R1766およびR1767の線は最も迅速に最も高い信号を示す。

図99は、コロナウイルスの3つの異なる株、SARS-CoV-2（「COVID-2019」）、SARS-CoV、またはbat-SL-CoV45の識別における有用性について複数のgRNAを評価する、DETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2（「N-2019-nCoV」）、SARS-CoV（「N-SARS-CoV」）、またはbat-SL-CoV45（「N-bat-SL-CoV45」）のいずれかのN遺伝子アンプリコンを含有する試料を試験した。試料を、SARS-CoV-2のN遺伝子に向けられるgRNA（SEQ ID NO:323、「COVID-2019 gRNA」）、SARS-CoVのN遺伝子に向けられるgRNA（SEQ ID NO:326、「SARS-CoV gRNA」）、または複数のコロナウイルス種のN遺伝子に向けられるgRNA（SEQ ID NO:327、「multi-CoV gRNA」）で検出した。

（表２１）例示的なコロナウイルスN遺伝子およびE遺伝子の遺伝子断片

実施例37
4つのコロナウイルスのE遺伝子の検出感度
この実施例は、3つのコロナウイルスのE遺伝子の検出感度を記載する。試料は、SARS-CoV-2のE遺伝子、SARS-CoVのE遺伝子、bat-SL-CoV45のE遺伝子、またはbat-SL-CoV21のE遺伝子に対応するRNAのいずれかを250pM含む。試料を、実施例2に記載されるように検出時に増幅した。試料を、E遺伝子に向けられる第1のgRNA（R1764）、またはE遺伝子に向けられる第2のgRNA（R1765）のそれぞれを使用して検出した。この実施例で使用されるgRNAの配列を表20に提供する。図89は、SARS-CoV-2 E遺伝子（「E-Sarbeco」）標的部位の領域の配列を概略的に示す。標的部位配列を表21に提供する。図90は、SARS-CoV-2のE遺伝子（「E-2019-nCoV」）、SARS-CoVのE遺伝子（「E-SARS-CoV」）、bat-SL-CoV45のE遺伝子（「E-bat-SL-CoV45」）またはbat-SL-CoV21のE遺伝子（「E-bat-SL-CoV21」）のいずれかを含む試料について、コロナウイルスN遺伝子に指向する2つのgRNAの感受性を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。試料を、LbCas12a（SEQ ID NO:27）、およびSEQ ID NO:324に対応するgRNA（「R1764-E遺伝子1」）またはSEQ ID NO:325に対応するgRNA（「R1765-E遺伝子2」）のいずれかを用いて検出した。蛍光強度を経時的に測定した。

図100は、コロナウイルスの3つの異なる株、SARS-CoV-2（「COVID-2019」）、SARS-CoV、またはbat-SL-CoV45の識別における有用性について複数のgRNAを評価する、DETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2（「N-2019-nCoV」）、SARS-CoV（「N-SARS-CoV」）、またはbat-SL-CoV45（「N-bat-SL-CoV45」）のいずれかのE遺伝子アンプリコンを含有する試料を試験した。試料を、SEQ ID NO:324（「E遺伝子gRNA＃1」）またはSEQ ID NO:325（「E遺伝子gRNA＃2」）に対応する複数のコロナウイルスのE遺伝子に指向するgRNAを用いて検出した。E遺伝子に指向するgRNAを用いた試料の検出によって、関連するコロナウイルス株を広域に標的とすることができた。

実施例38
Cas12変異体を用いるラテラルフローDETECTR反応を用いたコロナウイルスの検出
この実施例は、ラテラルフローDETECTR反応を用いたコロナウイルスの検出を記載する。図106は、PCRDラテラルフロー装置に適合するディテクター核酸の設計を示す。例示的な適合ディテクター核酸である、rep072、rep076、およびrep100が提供される（左）。これらのディテクター核酸をPCRDラテラルフロー装置（右）で使用して、標的核酸の存在または非存在を検出することができる。右上の概略図は、標的核酸を含有しない試料と接触させた場合に生成される例示的なバンド構成を示す。右下の概略図は、標的核酸を含有する試料と接触させた場合に生成される例示的なバンド構成を示す。PCRDラテラルフロー装置に適合する例示的なレポーターを表22に提供する。ラテラルフロー切断レポーターRep100は、信号ラインの使用によってラテラルフローストリップ上の試料の検出を可能にする。Rep072レポーターは、プログラマブルヌクレアーゼによるレポーターの切断後にIgGライン上でのみ信号を与える。磁気ビーズに結合しているrep076レポーターと同様に、rep100レポーターは、切断されるとPCRDストリップ上のFAM-ビオチンラインで信号を生成する。しかしながら、rep076とは異なり、rep100レポーターはDIG-ビオチンラインで捕捉され、それにより磁気ビーズの必要性がなくなる。

コロナウイルス由来のRNA標的配列を含む試料を、等温増幅を使用して増幅した。インビトロ転写コロナウイルスN遺伝子を0fM（「-」）または5fM（「＋」）のいずれかで含有する試料を、逆転写LAMP（RT-LAMP）増幅アッセイを使用して60分間増幅した。Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を使用して、DETECTR反応を0分間、2.5分間、5分間、または10分間のいずれかで行った。図91は、Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を使用してSARS-CoV-2 N遺伝子標的RNAの有無を検出するためのラテラルフローDETECTR反応の結果を示す。ラテラルフロー試験ストリップを示す。インビトロ転写されたSARS-CoV-2 N遺伝子RNA（「N-gene IVT」）を含有する（「＋」）かまたは欠く（「-」）試料を試験した。横線の上部セット（「試験」と表記）は、DETECTR反応の結果を示した。DETECTR反応は、インビトロ転写されたコロナウイルス標的配列を含む試料に対して感受性であった。

（表２２）コロナウイルスの検出のための例示的なレポーター配列

実施例39
ラテラルフローDETECTR反応を用いたSARS-CoV-2の検出
この実施例では、ラテラルフローDETECTR反応を用いたSARS-CoV-2の検出を記載する。図92は、プログラマブルヌクレアーゼを使用した標的核酸の検出を概略的に示す。簡潔には、トランスコラテラル切断活性を有するCasタンパク質が、ガイド核酸およびガイド核酸の領域に逆相補的な標的配列に結合すると活性化される。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、レポーター核酸を切断し、それによって、検出可能な信号を生成する。図93は、試料中の標的核酸の存在または非存在の検出を概略的に示す。試料中の選択核酸は、等温増幅を用いて増幅される。増幅された試料を、図92に示されるように、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸およびレポーター核酸に接触させる。試料が標的核酸を含む場合、検出可能な信号が生成される。SARS-CoV-2に対応する標的核酸の有無を、標的核酸のインビトロ転写および等温予備増幅後にDETECTR反応を用いて検出した。Cas12プログラマブルヌクレアーゼを使用して試料を検出した。試料は、SARS-CoV-2ウイルスRNAまたはRNase P（陰性対照）に対応する配列のいずれかを含有した。図92および図93に記載されるDETECTR反応を使用して、SARS-CoV-2に向けられるgRNAを使用して試料を検出した。図94は、試料中のSARS-CoV-2（「2019-nCoV」）RNAの存在または非存在を検出するためのDETECTRラテラルフロー反応の結果を示す。RNase Pの検出を試料の品質対照として使用する。試料をインビトロで転写および増幅し（左）、Cas12プログラマブルヌクレアーゼを用いて検出した（右）。インビトロ転写されたSARS-CoV-2 RNA（「2019-nCoV IVT」）を含有する（「＋」）または欠く（「-」）試料を、Cas12プログラマブルヌクレアーゼ、およびSARS-CoV-2に指向するgRNAを用いて0分間または5分間アッセイした。反応は、SARS-CoV-2を含有する試料に対して感受性であった。

実施例40
DETECTR反応を使用したSARS-CoV-2についての臨床試料の試験
この実施例は、DETECTR反応を用いた臨床試料のSARS-CoV-2についての試験を記載する。臨床試料をRT-PCRを用いて増幅し、LbCas12aを用いて検出した。試料は、SARS-CoV-2のN遺伝子もしくはE遺伝子またはRNase P（陰性対照）のいずれかに指向するgRNA（「crRNA」）を使用して検出した。図95は、LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用して、患者試料中のSARS-CoV-2の存在または非存在を決定するDETECTR反応の結果を示す。図95の右側には、棒グラフのセットがある。上の棒グラフは、15分間のRT-PCRアンプリコン試験を示し、x軸上でcrRNAが変化し、左から右にN遺伝子、E遺伝子、およびRNase PのcrRNAを示す。y軸は、20000刻みで0から60000の範囲の未処理蛍光を任意の単位（AU）で示す。各crRNA群内には、試験された様々な標的、左から右に、試料1、試料1 NTC、試料2、試料2 NTC、およびDETECTR NTCがある。下の棒グラフは15分間のRT-PCRアンプリコン試験を示し、x軸上で標的が変化し、左から右に試料1、試料1 NTC、試料2、試料2 NTC、およびDETECTR NTCの標的を示す。y軸は、任意の単位（AU）の未処理蛍光を0から60000まで20000刻みで示す。各標的群内には、試験された様々なcrRNAがあり、左から右に、N遺伝子、E遺伝子、およびRNase Pである。

SARS-CoV-2について陽性または陰性の患者の臨床試料を、ラテラルフローDETECTR反応を使用してアッセイした。試料を増幅し、RT-PCRを用いて逆転写し、Cas12プログラマブルヌクレアーゼを用いて検出した。陰性対照試料（「NTC」）もアッセイした。DETECTR反応を5分間行った。図96は、患者試料中のSARS-CoV-2の存在または非存在を検出するための、ラテラルフローDETECTR反応の結果を示す。試料を、SARS-CoV-2に指向するgRNAまたはRNase Pに指向するgRNAのいずれかで検出した。E遺伝子の領域に指向するプライマーを使用して、RT-PCRを用いて標的領域を増幅した。

実施例41
改善されたRT-LAMP増幅および検出のための緩衝液スクリーニング
この実施例は、改善されたRT-LAMP増幅および検出のための緩衝液のスクリーニングを記載する。HeLaトータルRNA（「トータルRNA」）、SARS-CoV-2 N遺伝子RNAおよびHeLaトータルRNA（「N遺伝子＋トータルRNA」）を含有するか、または標的を含まない（「NTC」）試料を、RT-LAMPを用いて異なる緩衝液条件下で増幅した。

図102は、一般的な試料緩衝液に対するRT-LAMP増幅反応の感受性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。様々な緩衝希釈度（左から右へ:1×、0.5×、0.25×、0.125×、または緩衝液なし）の、ユニバーサルトランスポート培地（UTM、上部）またはDNA/RNA Shield緩衝液（下）中で反応を測定した。

実施例42
DETECTRアッセイにおけるSARS-CoV-2の検出限界
この実施例は、DETECTRアッセイにおけるSARS-CoV-2の検出限界を記載する。異なるコピー数のSARS-CoV-2ウイルスゲノムを用いて、DETECTR反応を行った。図103は、SARS-CoV-2（COVID-19感染症に起因するウイルス）についてのDETECTRアッセイの検出限界（LoD）を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。試料は、SARS-CoV-2のN遺伝子に向けられたgRNA（SEQ ID NO:323、「R1763-N遺伝子」）、またはRNase Pに向けられたgRNA（SEQ ID NO:330、「R779-RNase P」）のいずれかを使用して検出した。各条件を7回繰り返した。DETECTRアッセイは、反応あたり約625～約150コピーまで、SARS-CoV-2 RNAの存在を再現的かつ特異的に検出することができた。

実施例43
DETECTRによる多重化RT-LAMP増幅の標的特異性
この実施例は、DETECTR反応による多重化RT-LAMP増幅の標的特異性を記載する。図104は、LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用した2-plex多重化RT-LAMP反応において、SARS-CoV-2のN遺伝子（「R1763-N-gene」）に指向するgRNAの標的特異性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2（「2019-nCoV N遺伝子IVT」）、SARS-CoV（「SARS-CoV N遺伝子IVT」）、もしくはbat-SL-CoV45（「bat-SL-CoV45 N遺伝子IVT」）のいずれかからのインビトロ転写コロナウイルスN遺伝子配列、またはコロナウイルスの異なる株（CoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43、またはCoV-NL63）を有する患者からの臨床残存試料を、2-plex多重化RT-LAMP増幅を用いて増幅した。HeLaトータルRNAをRNase Pの陽性対照として使用した。標的核酸を含まない対照（「NTC」）を陰性対照として試験した。2-plex多重化RT-LAMP増幅は、1つがSARS-CoV-2 N遺伝子に向けられ、1つがRNasePに向けられる、2つのプライマーセットを使用して試料を増幅した。増幅された試料は、RNase Pに向けられるgRNA（SEQ ID NO:330、「R779-RNase P」）またはSARS-CoV-2のN遺伝子に向けられるgRNA（SEQ ID NO:323、「R1763-N遺伝子」）のいずれかを使用して検出された。両方のgRNAは、2-plex多重化RT-LAMP増幅アッセイで増幅された試料を検出することができた。

図105は、LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用した3-plex多重化RT-LAMP反応において、SARS-CoV-2のN遺伝子（「R1763-N-gene」）またはSARS-CoV-2のE遺伝子（「R1765-E-gene」）に指向するgRNAの標的特異性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2（「2019-nCoV N遺伝子IVT」）、SARS-CoV（「SARS-CoV N遺伝子IVT」）もしくはbat-SL-CoV45（「bat-SL-CoV45 N遺伝子IVT」）のいずれかからのインビトロ転写コロナウイルスN遺伝子配列、SARS-CoV-2（「2019-nCoV E遺伝子IVT」）もしくはSARS-CoV（「SARS-CoV E遺伝子IVT」）からのインビトロ転写コロナウイルスE遺伝子配列、または異なる株のコロナウイルス（CoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43、またはCoV-NL63）を有する患者からの臨床残存試料を、3-plex多重化RT-LAMP増幅を用いて増幅した。HeLaトータルRNAをRNase Pの陽性対照として使用した。標的核酸を含まない対照（「NTC」）を陰性対照として試験した。3-plex多重化RT-LAMP増幅は、1つがSARS-CoV-2 N遺伝子に向けられ、1つがSARS-CoV-2 E遺伝子に向けられ、1つがRNasePに向けられる、3つのプライマーセットを使用して試料を増幅した。増幅された試料は、RNase Pに向けられるgRNA（SEQ ID NO:330、「R779-RNase P」）、またはSARS-CoV-2のN遺伝子に向けられるgRNA（SEQ ID NO:323、「R1763-N遺伝子」）、またはSARS-CoV-2のE遺伝子に向けられるgRNA（SEQ ID NO:325、「R1765-E遺伝子」）のいずれかを使用して検出された。3つのgRNAはすべて、3-plex多重化RT-LAMP増幅アッセイで増幅された試料を検出することができた。

実施例44
N遺伝子gRNAおよびE遺伝子gRNAのコロナウイルス株特異性
この実施例は、N遺伝子gRNAおよびE遺伝子gRNAのコロナウイルス株特異性を記載する。ガイドRNAは、SARS-CoV-2のN遺伝子を特異的に検出するように設計した。ガイドRNAはまた、3つのSARS様コロナウイルス株（SARS-CoV、コウモリSARS様コロナウイルス（bat-SL-CoVZC45）、およびSARS-CoV-2）においてE遺伝子を検出するように設計された。合成インビトロ転写（IVT）SARS-CoV-2 RNA遺伝子標的をヌクレアーゼフリー水にスパイクした。試料を、LbCas12a（SEQ ID NO:27）を使用するCRISPR-Cas12ベースの検出アッセイで検出した。DETECTRアッセイには、62℃で20分間のRT-LAMP反応および37℃で10分間のCas12検出反応が含まれた。標的生成、qPCRおよびLAMP増幅のためのプライマーを表23に提供する。図107Aは、コロナウイルスのゲノム内のE（エンベロープ）遺伝子およびN（核タンパク質）遺伝子領域の位置を示すゲノムマップを示す。EおよびN遺伝子領域に関するプライマーおよびプローブの対応する領域またはアニーリング領域を、それぞれの遺伝子領域の下に示す。RT-LAMPプライマーは黒い長方形で示されており、FIPプライマー（灰色）のF1cとB1cの半分との結合位置は破線の境界を有する縞模様の長方形で表されている。世界保健機関（WHO）および疾病管理センター（CDC）によって用いられる試験で増幅された領域は、それぞれ「WHO Eアンプリコン」および「CDC N2アンプリコン」と呼ばれる。

ガイドRNAは、N遺伝子gRNAを使用する関連コロナウイルス株との交差反応性を有さず、予想されるE遺伝子gRNAへの交差反応性を有するSARS-CoV-2を識別することができた。図107Bは、LbCas12aプログラマブルヌクレアーゼ（SEQ ID NO:27）を使用して、様々なコロナウイルス株（SARS-CoV-2、SARS-CoV、またはbat-SL-CoVZC45）のN遺伝子またはE遺伝子に指向するgRNAの特異性または広範な検出有用性を評価するDETECTRアッセイの結果を示す。アッセイで使用したN遺伝子gRNA（左、「N遺伝子」）は、SARS-CoV-2に特異的であったが、E遺伝子gRNAは、3つのSARS様コロナウイルスを検出することができた（右、「E遺伝子」）。SARS-CoVおよびコウモリコロナウイルスを標的とする別個のN遺伝子gRNAは、SARS-CoV-2を検出することができなかった（中央、「N遺伝子関連種変異体」）。ガイドRNAは、SARS-CoV-2を特異的に標的とするか、または関連するコロナウイルス株を広く検出するように設計された。SARS-CoV-2 N遺伝子（「N-gene:SARS-CoV-2」）、SARS-CoV N遺伝子（「N-gene:SARS-CoV」）、bat-SL-CoVZC45 N遺伝子（「N-gene:bat-SL-CoVZC45」）、SARS-CoV-2 E遺伝子（「E-gene:SARS-CoV-2」）、SARS-CoV E遺伝子（「E-gene:SARS-CoV」）、またはbat-SL-CoVZC45 E遺伝子（「E-gene:bat-SL-CoVZC45」）のいずれかを含有する試料を、SARS-CoV N遺伝子を特異的に検出するように設計されたgRNA（SEQ ID NO:323、「N遺伝子」）、コロナウイルス変異体のN遺伝子を検出するように設計されたgRNA（SEQ ID NO:326、「N遺伝子（関連種変異体）」）、またはコロナウイルスE遺伝子を広く検出するように設計されたgRNA（SEQ ID NO:324、「E遺伝子」）のいずれかを用いて検出した。

（表２３）標的生成および増幅プライマー

実施例45
ラテラルフローDETECTRアッセイを用いたコロナウイルスの特異的かつ広範な検出
この実施例は、ラテラルフローDETECTRアッセイを用いたコロナウイルスの特異的かつ広範な検出を記載する。ラテラルフローDETECTRアッセイは、適切なバイオセーフティ実験室の必要条件内の最小限の機器で実行することができる。図107Cは、コロナウイルスラテラルフローDETECTRアッセイで用いられる例示的な実験機器を示す。適切なバイオセーフティ保護装置に加えて、用いられる装置は、試料回収装置、微量遠心管、37℃および62℃に設定されたヒートブロック、ピペットおよびチップ、およびラテラルフローストリップを含む。

DETECTRアッセイは、30～40分以内に実行し、ラテラルフローストリップ上で可視化することができる。従来のRNA抽出または試料マトリックスは、DETECTR（LAMP予備増幅およびN遺伝子、E遺伝子およびRNase PのCas12ベースの検出）へのインプットとして使用することができ、それは、蛍光リーダーまたはラテラルフローストリップによって可視化されるE遺伝子およびN遺伝子の両方が検出された場合、SARS-CoV-2 DETECTRアッセイを陽性とみなし、E遺伝子またはN遺伝子のいずれかが検出された場合、推定陽性とみなした。この解釈は、現行のFDA緊急使用許可（EUA）ガイダンスおよびEUAの下で最近承認されたポイントオブケア診断のものと一致する。図107Dは、対象におけるコロナウイルスの検出のためのDETECTRアッセイの例示的なワークフローを示す。患者試料は、鼻咽頭スワブを使用して収集される。従来のRNA抽出または試料マトリックスは、DETECTR（LAMP予備増幅およびNE遺伝子、EN遺伝子およびRNase PのCas12ベースの検出）へのインプットとして使用することができ、それは、蛍光リーダーまたはラテラルフローストリップによって可視化される試料は、未処理の試料マトリックスから直接検出するか、またはウイルスRNAを抽出し、次いで検出することができる。SARS-CoV-2 E遺伝子およびSARS-CoV N遺伝子をコードするウイルスRNA、ならびにヒトRNase PをコードするRNAを、RT-LAMPなどの等温増幅法を使用して増幅する。増幅された試料は、SARS-CoV-2 N遺伝子およびE遺伝子配列に指向するgRNAと複合体化したCas12プログラマブルヌクレアーゼを使用して検出される。Cas12プログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸との複合体形成時にssDNAレポーター核酸を切断する。次いで、ラテラルフロー読み出しを使用して試料を検出する。試料の収集は、約0分～約10分で行うことができ、増幅および検出は、約20分～約30分で行うことができ、試料の読み出しは、約2分で行うことができる。

図107Eは、ラテラルフロー試験ストリップ（左）を示し、SARS-CoV-2 N遺伝子についての陽性試験結果（左、上）およびSARS-CoV-2 N遺伝子についての陰性試験結果（左、下）を示す。試料中のSARS-CoV-2の陽性同定は、陽性試験を確証するためにE遺伝子とN遺伝子の両方の検出を必要とした。図107Dに図示および記載されているように、ラテラルアッセイを行った。表（右）は、RNaseP（陽性対照）、SARS-CoV-2 N遺伝子、およびコロナウイルスE遺伝子の非存在の存在を試験するラテラルフローストリップベースのコロナウイルス診断アッセイの、可能な試験指標および関連する結果を示す。2つのSARS-CoV-2ウイルス遺伝子標的および内部スパイクヒトRNase P対照の検出は、陽性結果を示す。

実施例46
未処理試料マトリックスからの直接的な患者試料の増幅および検出
この実施例は、未処理試料マトリックスからの直接的な患者試料の増幅および検出を記載する。未処理試料マトリックスから直接SARS-CoV-2核酸を増幅するRT-LAMPアッセイの能力を評価した。ユニバーサルトランスポート培地（UTM）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に入れ、SARS-CoV-2 IVT標的RNAをスパイクした、無症候性ドナーからの鼻スワブからなる試料を、RT-LAMP DETECTR反応を用いてアッセイした。鼻スワブは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）よりもユニバーサルトランスポート培地（UTM）に頻繁に収集されるので、UTM緩衝液からなる鼻スワブ試料マトリックスからアッセイを実行する効果を評価した。無症候性ドナーからの鼻スワブをUTMまたはPBSに収集した。

図110Aは、異なる緩衝液条件下でのRT-LAMP増幅の結果までの時間を示す。結果までの時間は、蛍光値が実験の最大値の1/3になる時間として計算した。増幅に失敗した反応は、20分での値で報告され、「no amp」と標識する。水、10％リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、または10％ユニバーサルトランスポート培地（UTM）のいずれかにおける異なる出発濃度の標的対照プラスミドについて、結果までの時間を決定した。結果まで時間が短いほど、増幅が速いことを示す。結果は、10％ PBSは10％ UTMよりもアッセイを阻害しないことを示す。図110Bは、5％ UTM、5％ PBSまたは水のいずれかにおける、SARS-CoV-2のN遺伝子、SARS-CoV-2のE遺伝子およびRNase Pの増幅効率を決定するためのRT-LAMPアッセイの結果を示す。インビトロ転写された0.5fMのN遺伝子、インビトロ転写された0.5fMのE遺伝子、および0.8ng/μLのHeLaトータルRNA（「N＋E＋トータルRNA」）を含む試料、または標的を含まない対照（「NTC」）を試験した。5％試料緩衝液最終体積中のN遺伝子、E遺伝子、およびRNase Pに対するRT-LAMPの増幅効率の評価は、RT-LAMPが5％の試料緩衝液濃度ですべての標的遺伝子について機能的であることを示した。最終標的濃度は、N遺伝子IVTが0.5fM、E遺伝子IVTが0.5fM、HeLaトータルRNAが0.08ng/μLであった。図110Cは、PBS中の鼻スワブからの直接的なRNAの増幅を示す。結果までの時間をPBS濃度の関数として測定した。鼻スワブ（「鼻スワブ」）を、HeLaトータルRNA（左、「トータルRNA:0.08ng/uL」）または水（右、「トータルRNA:0ng/uL」）のいずれかでスパイクした。鼻スワブを含まない試料（「スワブなし」）を対照として比較した。RT-LAMPでは、体積で10％以上のUTMまたは体積で20％以上のPBSの反応濃度でアッセイ性能が低下した。推定検出限界は、10％以上のUTMでは500コピー/μLに低下し、20％以上のPBSでは1,00コピー/μLに低下した。RT-LAMPは、RT-LAMP予備増幅反応あたり5％または10％のPBS最終体積で、最高性能でPBS中の鼻スワブから直接RNAを増幅することができる。鼻スワブをPBS中で調製し、HeLaトータルRNAまたは水でスパイクし、RNase PについてのRT-LAMP反応において様々な濃度で実行した。

実施例47
SARS-CoV-2に対するDETECTRアッセイの検出限界
この実施例は、SARS-CoV-2に対するDETECTRアッセイの検出限界を記載する。PBS中のドナー鼻スワブ試料マトリックス中にスパイクされたIVT SARS-CoV-2標的RNAを使用して、検出DETECTRアッセイのSARS-CoV-2についての分析検出限界（LoD）を、米国FDA緊急使用許可（EUA）が承認したCDCアッセイ（3つの標的のうちの2つ、N2およびN3について試験を実行する）と比較した。インビトロ転写されたウイルスRNAの5つの10段階希釈物を、DETECTRアッセイのために各希釈物における6回の反復でおよびCDCアッセイのために各希釈物における3回の反復で、101～105コピー/mLの濃度で試料マトリックスにスパイクした。図111Aは、SARS-CoV-2 N遺伝子（n＝6）のLbCas12a（SEQ ID NO:27）検出によって生成された未処理蛍光曲線を示す。曲線は、20分未満で飽和を示した。図111Bは、図111Aに示す未処理蛍光トレースから決定した、LbCas12aで検出されたSARS-CoV-2 N遺伝子についてのDETECTRアッセイの検出限界を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子の濃度（コピー/mL）を減少させながら蛍光強度を測定した。図111Cは、図111Aに示される未処理蛍光トレースから決定された、DETECTRアッセイの検出限界の結果までの時間を示す。結果まで時間が短いほど、増幅および検出が速いことを示す。SARS-CoV-2 DETECTRの推定LoDは約10コピー/μlであり、これはCDC N2およびN3アッセイのLoDに匹敵する。SARS-CoV-2のDETECTR分析は、30分未満で10個までのウイルスゲノムを同定した。LbCas12a DETECTR分析の前に、重複するLAMP反応物を20分間増幅した。さらなる分析は、SARS-CoV-2 N遺伝子の検出限界が、反応あたり10ウイルスゲノムであることを明らかにする（n＝6、図111B）。これらの反応の結果までの時間の評価は、SARS-CoV-2の10個のウイルスゲノムを5分未満で検出していることを強調する（n＝6、図111C）。

RT-LAMP DETECTR反応の分析検出限界を、SARS-CoV-2の検出について、米国FDA緊急使用許可で承認されたCDCアッセイで使用されるqRT-PCR検出アッセイと比較した。各希釈物における3回の反復で、対照IVTウイルス核タンパク質RNA（「CDC VTC nCoV転写物」）の7つの希釈物を使用して定量化のための標準曲線を構築し、CDCプロトコールを使用して検出した（図108D、左）。次いで、各希釈物における6回の反復で、同じ対照核タンパク質RNAの10個の2段階希釈物を使用して、DETECTRアッセイを行った（図108D、中央）。カリフォルニア州公衆衛生局によって試験されたCDCアッセイの推定希釈限界は、DETECTRアッセイの10コピー/μL反応物に対して、FDA添付文書における分析成績と一致して、1コピー/μL反応物であった。図108Dは、SARS-CoV-2の検出限界を決定するための、LbCas12a（中央）またはCDCプロトコール（左）を用いたDETECTRアッセイの結果を示す。信号は、反応当たりのウイルスゲノムのコピー数の関数として示される。アッセイの代表的なラテラルフロー結果を、0コピー/μLおよび10コピー/μLの場合について示す（右）。

ラテラルフロー装置を使用するSARS-CoV-2の検出について、検出限界（LoD）を測定した。図108Aは、標的核酸の存在下でのCas12プログラマブルヌクレアーゼによる、FAMおよびビオチンで標識されたディテクター核酸の切断を示す（上）。ラテラルフロー試験ストリップ（下）の概略図は、試験試料中の標的核酸の存在（「陽性」）または非存在（「陰性」）のいずれかを示すマーキングを示す。完全なFAM-ビオチン化レポーター分子は、コントロール捕捉ラインに流れる。合致する標的が認識されると、Cas-gRNA複合体はレポーター分子を切断し、それは標的捕捉ラインに流れる。

実施例48
SARS-CoV-2のDETECTRアッセイにおけるインキュベーション時間の影響
この実施例は、SARS-CoV-2のDETECTRアッセイにおけるインキュベーション時間の影響を記載する。試料をRT-LAMPを用いて増幅し、LbCas12a（SEQ ID NO:27）を用いて検出した。信号に対するCas12反応インキュベーション時間の影響を試験した。

図108Bは、0fMのSARS-CoV-2 RNAまたは5fMのSARS-CoV-2 RNAのいずれかを含有する試料について、反応時間の効果を決定するためのLbCas12aを使用したDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子では、RT-LAMPアンプリコンでのLbCas12a検出アッセイの蛍光信号は10分以内に飽和した。RT-LAMPアンプリコンを、2μLの5fMまたは0fMのSARS-CoV-2 N-gene IVT RNAから、62℃で20分間増幅することによって作製した。図108Aに示すように、FAM-ビオチンレポーター分子と、標識された核酸を捕捉するように設計されたラテラルフローストリップとを使用して、Cas12検出反応の可視化を達成した。未切断レポーター分子が第1の検出ライン（コントロールライン）で捕捉される一方、無差別なCas12切断活性が第2の検出ライン（試験ライン）で信号を生成する。蛍光またはラテラルフローを使用する場合でCas12によって生成された信号を比較するために、N遺伝子プライマーを使用して5fMまたは0fMのIVTテンプレートを使用してRT-LAMPを実施し、同一のアンプリコン上のCas12読み出しの性能を、蛍光プレートリーダーを使用して、0、2.5、5、および10分でのラテラルフローによって監視した。Cas12蛍光信号は1分未満で検出可能であり、ラテラルフローによる視覚信号は5分以内に達成された。図112Aは、0fMのSARS-CoV-2 RNAまたは5fMのSARS-CoV-2 RNAのいずれかを含有する試料について、反応時間の効果を決定するためのLbCas12aを使用したDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子では、RT-LAMPアンプリコンでのLbCas12a（SEQ ID NO:27）検出アッセイの蛍光信号は10分以内に飽和した。RT-LAMPアンプリコンを、2μLの5fMまたは0fMのSARS-CoV-2 N-gene IVT RNAから、62℃で20分間増幅することによって作製した。

図108Cは、図108BのDETECTRによってアッセイされた試料に相当する試料をアッセイするラテラルフロー試験ストリップを示す。0fMのSARS-CoV-2 RNA（「-」）または5fMのSARS-CoV-2 RNA（「＋」）のいずれかを含有する試料について、対照（C）または試験（T）に対応するバンドを反応時間の関数として示す。同じRT-LAMPアンプリコン上のLbCas12aは、5分以内にラテラルフローアッセイを通して可視信号を生成した。図112Bは、図112AのDETECTRによってアッセイされた試料に相当する試料をアッセイするラテラルフロー試験ストリップを示す。0fMのSARS-CoV-2 RNA（「-」）または5fMのSARS-CoV-2 RNA（「＋」）のいずれかを含有する試料について、対照（C）または試験（T）に対応するバンドを反応時間の関数として示す。図112Aに示すように、同じRT-LAMPアンプリコン上のLbCas12a（SEQ ID NO:27）は、5分以内にラテラルフローアッセイを通して可視信号を生成した。

実施例49
DETECTRアッセイを用いた患者試料中のSARS-CoV-2の検出
この実施例は、DETECTRアッセイを用いた患者試料中のSARS-CoV-2の検出を記載する。SARS-CoV-2感染が証明された6人の患者から採取した鼻スワブ試料、他のインフルエンザまたはコロナウイルス感染症を有する15人の患者から採取した鼻スワブ試料、および5人の健康なドナーから採取した鼻スワブ試料から抽出したRNAを試験した。インフルエンザ（n＝4）および他のヒトコロナウイルス感染症（一般的なヒト季節性コロナウイルス感染症（OC34、HKU1、229EおよびNL63、n＝7））の患者からのRNA抽出物を、UTM中で鼻スワブマトリックスにスパイクしたインビトロ転写SARS-CoV-2標的RNAおよび2人のSARS-CoV-2感染患者の鼻スワブから抽出したRNAと比較した。試料を、蛍光およびラテラルフロー読み出しを用いるSARS-CoV-2 DETECTRアッセイを使用して検出した。図109は、本開示のRT-LAMPを用いたSARS-CoV-2 DETECTRアッセイと、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）検出法を用いたSARS-CoV-2アッセイとを比較する表を示す。DETECTR RT-LAMPアッセイにおけるN遺伝子標的は、qRT-PCRアッセイで検出されるN遺伝子N2アンプリコンと重複する。図108Eは、患者試料のDETECTRデータを示す。COVID-19感染症患者6人（n＝11、反復5）およびインフルエンザまたは4つの季節性コロナウイルス（HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43）のうちの1つに感染している患者12人（n＝12）からの臨床試料を、SARS-CoV-2 DETECTRを用いて分析した（明暗を付けたボックス）。ラテラルフローストリップからの信号強度を、ImageJを使用して定量化し、バックグラウンドを5標準偏差上回る正の閾値を用いて、N遺伝子、E遺伝子またはRNase Pセット内の最大値に正規化した。SARS-CoV-2試験の最終決定は、図107Eの解釈マトリックスに基づいた。FluAはインフルエンザAを表し、FluBはインフルエンザBを表す。HCoVはヒトコロナウイルスを表す。図108Fは、COVID-19患者（SARS-CoV-2に対して陽性、「患者11」）、標的核酸を欠く標的なし対照試料（「NTC」）、および標的核酸を含有する陽性対照試料（「PC」）におけるSARS-CoV-2について試験するラテラルフロー試験ストリップを示す。SEQ ID NO:325に対応するgRNAを用いてE遺伝子を検出した。SEQ ID NO:323に対応するgRNAを用いてN遺伝子を検出した。3つすべての試料を、SARS-CoV-2 N遺伝子、SARS-CoV-2 E遺伝子、およびRNase Pの存在について試験した。Cas12ベースのアッセイの結果とCDC N1/N2 qRT-PCRアッセイの結果は100％一致し、DETECTR Cas12ベースのアッセイを使用してSARS-CoV-2感染患者を診断することの実現可能性を実証した。

SARS-CoV-2は11人の患者のうち9人のスワブで検出され、他の呼吸器ウイルスと交差反応しなかった。COVID-19患者からの2つの陰性スワブは、確立された検出限界未満であることが確認された。図118は、10個のCOVID-19感染患者試料および他のウイルス性呼吸器感染症についての12個の患者試料のラテラルフローDETECTR結果を示す。1つの鼻咽頭スワブ（A）および1つの中咽頭スワブ（B）を含む6人の患者からの10個の試料（COVID19-1～COVID19-5）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。結果を図119に提供される指針に従って分析した。図119は、SARS-CoV-2 DETECTRラテラルフロー結果の解釈のための規定を示す。図120A～図120Cは、11個のCOVID-19感染患者試料および他のウイルス性呼吸器感染症の12個の患者試料の蛍光DETECTR動態曲線を示す。6人の患者からの10個の鼻咽頭/中咽頭スワブ試料（COVID19-1～COVID19-6）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。

図120Aは、標準的な増幅および検出条件を使用して試験した試料を示し、12個のCOVID-19陽性患者試料のうち10個に、SARS-CoV-2 E遺伝子の存在を示す強い蛍光曲線が生じた（20分間の増幅、10分以内の信号）。12個の他のウイルス性呼吸器臨床試料では、E遺伝子信号は検出されなかった。

図120Bは、12個のCOVID-19陽性患者試料のうち10個について、時間を延長した増幅を使用してSARS-CoV-2 N遺伝子の存在について試験された試料が、強い蛍光曲線を生成することを示す（30分間の増幅、10分以内の信号）。12個の他のウイルス性呼吸器臨床試料では、N遺伝子信号は検出されなかった。

図120Cは、試料インプット対照である、RNase Pに対応するグラフを示す。

図120および図121に示すラテラルフローと蛍光ベースの読み出しとの間の100％の一致を考慮して、蛍光ベースの読み出しを使用して、本発明者らのDETECTRアッセイを使用して、急性呼吸器感染症患者からのさらなる60個の鼻咽頭スワブ試料をSARS-CoV2について盲目的に試験した。60個の試料のうち、30個はqRT-PCR試験でCOVID-19感染について陽性であり、30個はCOVID-19感染について陰性であったが、別のウイルス性呼吸器感染症について呼吸器ウイルスパネル（RVP）多重PCR試験による陽性、またはすべての試験による陰性のいずれかであった。CDC qRT-PCRアッセイと比較したSARS-CoV-2 DETECTRの陽性予測一致（PPA）および陰性予測一致（NPA）は、83個の全呼吸器スワブ試料におけるコロナウイルスの検出について、それぞれ95％および100％であった。

図121は、示される試験解釈を用いた臨床試料についてのSARS-CoV-2 DETECTRアッセイ結果のヒートマップを示す。24個の臨床試料（COVID-19陽性、12個）を、ImageJゲル分析器ツールによってSARS-CoV-2 DETECTRについて定量化したラテラルフローSARS-CoV-2 DETECTRアッセイの結果（上）は、アッセイの蛍光バージョンの結果（下）と98.6％（71/72ストリップ）一致していることを示す。両方のアッセイを30分間の増幅で実行し、Cas12反応信号を10分で得た。推定陽性はオレンジ色の（＋）で示される（下、列4）。

図122は、示される試験解釈を用いた臨床試料についてのSARS-CoV-2 DETECTRアッセイ結果のヒートマップを示す。上のプロットは、追加の30個のCOVID-19陽性臨床試料（陽性27、推定陽性1、陰性2）に対する蛍光SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの結果を示す。推定陽性はオレンジ色の（＋）で示される（上、列9）。下のプロットは、追加の30個のCOVID-19陰性臨床試料（陽性0、陰性30）に対する蛍光SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの結果を示す。

CDC qRT-PCRプロトコールと比較して、SARS-CoV-2 DETECTRアッセイは、鼻スワブ試料におけるコロナウイルスの検出について90％感受性であり、100％特異的であり、それぞれ100％および91.7％の陽性および陰性的中率に対応している。図108Gは、SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの性能特性を示す。fMは、フェムトモルを示し、NTCはテンプレートなしの対照を示し、PPVは陽性的中率を示し、NPVは陰性的中率を示す。83の臨床試料（COVID-19の陽性41、陰性42）を、SARS-CoV-2 DETECTRアッセイの蛍光バージョンを使用して評価した。1つの試料（COVID19-3）を、アッセイ品質管理の失敗により除外した。陽性コールおよび陰性コールは、図107Eに記載されている基準に基づいた。fMはフェムトモルを示し、NTCはテンプレートなしの対照を示し、PPAは陽性予測一致を示し、NPAは陰性予測一致を示す。

SARS-CoV-2 DETECTRアッセイ（RT-LAMP＋Cas12a）を、SARS-CoV-2、SARS-CoV、bast-SL-CoVZC45由来のIVT RNA生成物および一般的なヒトコロナウイルス由来の臨床試料で評価した。図113は、異なるヒトコロナウイルス株に対するgRNAの交差反応性を決定するためのDETECTRアッセイの結果を示す。SARS-CoV-2 N遺伝子、SARS-CoV N遺伝子、bat-SL-CoVZC45 N遺伝子、SARS-CoV-2 E遺伝子、SARS-CoV E遺伝子もしくはbat-SL-CoVZC45 E遺伝子のインビトロ転写RNAを含有する試料、またはCoV-HKU1、CoV-299E、CoV-OC43もしくはCoV-NL63について陽性の臨床試料を試験した。HeLaトータルRNAをRNase Pの陽性対照として試験し、標的核酸を欠く試料（「NTC」）を陰性対照として試験した。SEQ ID NO:323に対応するgRNAを用いてN遺伝子を検出した。SEQ ID NO:325に対応するgRNAを用いてE遺伝子を検出した。SEQ ID NO:330に対応するgRNAを用いてRNase Pを検出した。SARS-CoV-2 DETECTRアッセイは、インビトロ転写SARS-CoV-2をスパイクした試料およびSARS-CoV-2感染症患者由来の鼻スワブ試料からのみ陽性であり、DETECTRアッセイがSARS-CoV-2に特異的であることを示した。N遺伝子はSARS-CoV-2でのみ検出されたが、E遺伝子はSARS-CoV-2およびbat-SL-CoVZC45でのみ検出された。E遺伝子gRNAがSARS-CoV E遺伝子標的部位を検出することができたにもかかわらず、SARS-CoV E遺伝子が検出されなかったのは、RT-LAMPプライマーセットがSARS-CoV E遺伝子を増幅することができなかったからである。一般的なヒトコロナウイルスにおいてRNase Pが検出されたのは、これらの試料が臨床試料から抽出されたRNAであるからである。結果を、蛍光プレートリーダーでの15分間のLbCas12a（SEQ ID NO:27）検出アッセイ信号で示す。図113は、x軸上の標的を示し、左から右にSARS-CoV-2＿N遺伝子、SARS-Cov N遺伝子、bat-SL-CovZC45 N遺伝子、SARS-2 E遺伝子、SARS-CoV E遺伝子、Bat-SL-CoVZC45 E遺伝子、Cov-HKUI、Cov-299E、Cov-OC43、Cov-NL63、HeLaトータルRNA、およびNTCである。各標的群内には3本の棒があり、左から右に、N遺伝子、E遺伝子、およびRNasePを含む様々なgRNAを示す。y軸は、1000の増分で0から3000の範囲の任意の単位（AU）の未処理蛍光を示す。

図115A～図115Bは、COVID-19感染患者試料のDETECTR動態曲線を示す。5人の患者からの10個の鼻スワブ試料（COVID19-1～COVID19-10）を、2つの異なる遺伝子、N2およびE、ならびに試料インプット対照、RNase Pを使用してSARS-CoV-2について試験した。図115Aは、標準的な増幅および検出条件を使用して、10人の患者のうち9人に、SARS-CoV-2 E遺伝子の存在を示す強い蛍光曲線が生じたことを示す（20分間の増幅、10分以内の信号）。図115Bは、10人の患者のうち8人について、SARS-CoV-2 N遺伝子が強い蛍光曲線を生成するのに必要とする増幅時間が延長されたことを示す（30分間の増幅、10分以内の信号）。図115Cは、試料インプット対照としてのRNase Pが、試験した全試料22のうち17で陽性であったことを示す（20分間の増幅、10分以内の信号）。

実施例50
改変LAMPプライマーおよびgRNAを用いた、RNase P POP7対照遺伝子の検出の改善
この実施例は、改変LAMPプライマーおよびgRNAを用いた、RNase P POP7対照遺伝子の検出の改善を記載する。RNase P POP7 RNAを含有する試料を、RT-LAMPおよびDETECTR反応を使用してアッセイして、プライマーセット、およびRNase P POP7に指向するgRNAの増幅および検出効率を評価した。0.16ng/μLのトータルRNAまたは0ng/μLのトータルRNAのいずれかを含有する試料を、異なるプライマーセットを用いたRT-LAMPによって60℃で60分間増幅した。図123は、異なるプライマーセットを用いたRNase P POP7のRT-LAMP増幅について、結果までの時間を示す。プライマーセット1～10を用いて増幅した試料について、結果までの時間を決定した。プライマーセット1は、SEQ ID NO:360-SEQ ID NO:365に対応し、プライマーセット9は、SEQ ID NO:366-SEQ ID NO:371に対応する。プライマーセット9は、0.16ng/μLのトータルRNAを含有する試料について、プライマーセット1およびプライマーセット2～8および10よりも結果までの時間が改善されたことを示した。さらに、プライマーセット9は、プライマーセット1およびプライマーセット2、3、7、8、および10よりも、トータルRNAを含まない試料（0ng/μLのトータルRNA）の非特異的増幅が少ないことを示した。

RT-LAMPによって生成されたアンプリコンに対してDETECTR反応を行った。R779（SEQ ID NO:330）、R780（SEQ ID NO:332）またはR1965（SEQ ID NO:331）に対応するgRNAを用いて試料を検出した。図124は、プライマーセット1またはプライマーセット9を用いてRT-LAMPを使用して増幅され、R779、R780またはR1965 gRNAで検出されたRNase P POP7に行われたDETECTR反応の経時的な未処理蛍光を示す。DETECTR反応は、37℃で90分間行った。セット1プライマーによって生成されたアンプリコンは、R779によってバックグラウンドなし（点線）で検出された。清浄な検出は、セット9によって生成されたアンプリコン上のR1965およびR780によっても見られた。結果は、R1965がR779またはR780よりも速く検出することを示している。図124は、DETECTR反応の2つの折れ線グラフを示す。左側のグラフはセット1（オリジナル）を示し、右側のグラフはセット9を示す。各グラフ内には、R779、R780、およびR1965を含む3つのcrRNAがある。実線は0.16ng/ulのトータルRNAを示し、破線は0ng/ulを示す。x軸は、10の増分で0から30までの分単位の時間を示す。y軸は、任意の単位（AU）の未処理蛍光を0から60000まで20000刻みで示す。左のグラフでは、R1965が最も迅速に最も高い信号を示し、次いでR779、および0ng/ulのトータルRNAでのR1965であった。右のグラフでは、R1965が最も迅速に最も高い信号を示し、R780が続く。

次いで、プライマーセット1（SEQ ID NO:360～SEQ ID NO:365）またはプライマーセット9（SEQ ID NO:366～SEQ ID NO:371）を用いるRT-LAMPを使用して増幅され、R779 gRNA（SEQ ID NO:330）またはR1965 gRNA（SEQ ID NO:331）で検出されたRNase P POP7について検出限界を試験した。図125Aは、プライマーセット1またはプライマーセット9を用いるRT-LAMPを使用して増幅されたトータルRNAの10倍希釈物を含む試料における、RNase P POP7検出の結果までの時間を示す。増幅は、60℃で30分間行った。図125Bは、図125Aに示され、gRNA 779（SEQ ID NO:330）またはgRNA 1965（SEQ ID NO:331）を使用して検出されたRNase P POP7アンプリコンのDETECTR反応を示す。プライマーセット1を使用して増幅した試料をgRNA 779で検出し、プライマーセット9を使用して増幅した試料をgRNA 1965で検出した。DETECTR反応は、37℃で90分間行った。プライマーセット9は、プライマーセット1と比較して、低RNA濃度での結果までの時間が速いことから分かるように、検出限界までの時間の改善を示した。さらに、プライマーセット9は、プライマーセット1で増幅し、gRNA 1965で検出した試料と比較して、gRNA 779で検出した場合のDETECTR反応の速度および感度の改善を示した。図125Aは、RT-LAMP RNase P POP7-LAMPと題された棒グラフを示す。x軸は濃度を示し、左から右に、2ng/ul、0.2ng/ul、0.02ng/ul、0.002ng/ul、0.0002ng/ul、0.00002ng/ul、0.000002ng/ul、および0ng/ulを含む。y軸は、10の増分で0から30までの分単位で結果までの時間を示す。x軸上の各群内には、使用されるプライマーセットを示す2本の棒があり、左から右に向かってセット1（オリジナル）およびセット9である。図125Bは、RNase P POP7プライマーセット比較-DETECTRと題された折れ線グラフを示す。各グラフのx軸は、10の増分で0から30までの分単位の時間を示す。各グラフのy軸は、任意の単位（AU）の未処理蛍光を0から50000まで10000刻みで示す。グラフは、左から右へ減少する濃度、2ng/ul、0.2ng/ul、0.02ng/ul、0.002ng/ul、および0ng/ulを示している。各グラフ内には2本の線があり、それらはR779およびR1965を含む様々なcrRNAである。左端のグラフでは、両方のcrRNAが最終的に同じ未処理蛍光値に達するが、R1965の線はより速く最大蛍光に達する。左から2番目のグラフでは、両方のcrRNAが最終的に同じ未処理蛍光値に達するが、R1965の線はより速く最大蛍光に達する。左から3番目のグラフでは、両方のcrRNAが最終的に同じ未処理蛍光値に達するが、R1965の線はより速く最大蛍光に達する。左から4番目のグラフでは、R1965の線が、最も速く最大蛍光に達する。

実施例51
コロナウイルスの溶解および増幅のためのウイルス溶解緩衝液
この実施例は、コロナウイルスの溶解および増幅のためのウイルス溶解緩衝液を記載する。鼻スワブまたは唾液試料を、コロナウイルス感染症を有すると疑われる個体から収集する。鼻スワブおよび唾液試料を、ウイルスキャプシドを溶解し、ウイルスゲノムを放出するように配合されたウイルス溶解緩衝液に懸濁する。ウイルス溶解緩衝液は、ウイルスゲノムのRT-LAMP増幅、および標的核酸のDETECTR検出に適合し、コロナウイルスDETECTR反応のための一工程試料調製溶液を提供する。

実施例52
マイクロ流体カートリッジでのDETECTRアッセイを使用したSNPの検出
この実施例は、マイクロ流体カートリッジでのDETECTRアッセイを使用したSNPの検出を記載する。このアッセイは、図126Bに示すマイクロ流体カートリッジで行った。カートリッジを加熱するように構成されたカートリッジマニホールドをオンにした。青色眼個体からの5μLの試料を、試料のLAMP増幅のための成分を含有する45μLのLAMPマスターミックス溶液と合わせた。試料は、カートリッジに添加する前に予め混合した。予め混合した試料を増幅チャンバ内のカートリッジに充填し、チャンバを透明テープで密封した。95μLの青色眼RNP（G SNP）をDETECTRチャンバに充填した。充填したチップを予熱したマニホールド上に移し、透明テープで密封した。

マニホールドの第1ヒーターは60℃、第2ヒーターは37℃に設定した。試料を60℃で30分間インキュベートした。30分後、マニホールド内の第1ポンプを始動させて、試料を含むLAMP緩衝液を、カートリッジを通してポンプ圧送した。マニホールド内の第2ポンプを始動させて、95μLのDETECTR溶液を検出チャンバに押し入れた。試料を37℃で30分間インキュベートした。蛍光を、ブラックボックス蛍光検出器を使用して可視化した。

対照アッセイを、加熱ブロックを使用して微小遠心管中で行った。第1の管において、青色眼個体からの5μLの試料を45μLのLAMPマスターミックス溶液と合わせた。第2の管において、褐色眼個体からの5μLの試料を45μLのLAMPマスターミックス溶液と合わせた。小型乾燥浴中60℃で30分間、試料をインキュベートした。5μLの各増幅試料を、AおよびG SNPの検出のために95μLの1×RNP溶液に移した。反応物を37℃の熱ブロックに移した。

実施例53
マイクロ流体カートリッジにおけるSNPの増幅および検出
この実施例は、マイクロ流体カートリッジにおけるSNPの増幅および検出を記載する。これらのアッセイは、図128Bに示すマイクロ流体カートリッジで実施した。以下の溶液を調製した:LAMPマスターミックス（1×IsoAmp緩衝液（NEB）、4.5mM MgSO₄、1.4mM dNTP、1:5 Bst 2.0（NEB）、1×プライマーマスターミックスおよび1:10標的DNA）、およびCRISPR複合体（1×Mバッファー3、40nM crRNA、および40nM Cas12変異体（SEQ ID NO:37）;37℃でインキュベートした後、1μMレポーター基材を添加した）。

カートリッジのPMMA層を、RNAse Zapに20分間浸漬し、洗浄液の残余をヌクレアーゼフリー水中で二回洗浄することによって清浄にした。窒素流を使用してカートリッジを乾燥させた。カートリッジの層を組み立てた。CRISPR反応ワークフローの上半分を高ゾルのエポキシで遮断し、透明になるまで20分間乾燥させた。80μLのLAMPマスターミックスを、10μLのプライマーミックスおよび10μLの純粋なDNA抽出物と微量遠心管で予め備混合した。溶液を上下にピペット操作することによって混合した。この溶液70μLを、ピペットを用いてカートリッジの増幅チャンバに充填した。チャンバを、PCR接着剤の小さな長方形片（Biorad、MSB-1001）を使用して密封した。

カートリッジを加熱マニホールドに入れ、アルミニウムブロックを60℃のオンチップ温度まで加熱した。試料を60℃で30分間インキュベートして、LAMPを使用して試料を増幅した。青色眼gRNAを含有するCRISPR試薬100μLを下部DETECTRチャンバに添加した。上部および下部チャンバを、PCR接着剤の小さな長方形片で密封した。カートリッジ内のバルブを作動させることによって、CRISPR試薬を5μLの増幅試料と混合した。マニホールドを3D印刷されたAPSのシュラウドで覆い、光を遮断した。アルミニウムブロックを37℃のオンチップ温度に加熱した。CRISPR反応物を37℃で30分間インキュベートした。得られた蛍光を目で観察した。

図128Cに示すカートリッジを使用して上記のアッセイを繰り返したが、上半分をエポキシで封止しなかった。両方のアッセイにおいて、陽性結果に対応する蛍光を目で観察することができた。マニホールド内のカートリッジをカートリッジの上部から照明すると、検出チャンバの照明が不均一になった。

実施例54
改変マイクロ流体カートリッジにおけるSNPの増幅および検出
この実施例は、改変マイクロ流体カートリッジにおけるSNPの増幅および検出を記載する。このアッセイは、図129Aに示すマイクロ流体カートリッジで行った。LAMPマスターミックスおよびCRISPR複合体溶液を、実施例53に記載のように調製した。カートリッジのPMMA層を、RNAse Zapに20分間浸漬し、洗浄液の残余をヌクレアーゼフリー水中で二回洗浄することによって清浄にした。窒素流を使用してカートリッジを乾燥させた。カートリッジの層を組み立てた。

40μLのLAMPマスターミックスを、5μLのプライマーミックスおよび5μLの純粋なDNA抽出物と微量遠心管で予め備混合した。溶液を上下にピペット操作することによって混合した。この溶液50μLを、ピペットを用いてカートリッジの増幅チャンバに充填した。チャンバを、PCR接着剤の小さな長方形片（Biorad、MSB-1001）を使用して密封した。下側のDETECTRチャンバに、Cas12変異体（SEQ ID NO:37）と、褐色眼SNPに指向するgRNAとを含むCRISPR試薬溶液95μLを添加し、上側のDETECTRチャンバに、陰性試薬溶液（5×Mバッファー3）95μLを添加した。チャンバを、PCR接着剤の小さな長方形片（Biorad、MSB-1001）を使用して密封した。

カートリッジを加熱マニホールド上に組み立て、増幅チャンバにおいてアルミニウムブロックを60℃のオンチップ温度まで加熱した。アッセイを開始する2分前に加熱を開始した。増幅を60℃で30分間行った。カートリッジのバルブを作動させて、CRISPR試薬を5μLの増幅試料と混合した。検出チャンバのマニホールドヒーターを予熱なしで37℃に加熱した。DETECTR反応を37℃で30分間行い、得られた蛍光を目視で観察した。チャンバを、小型PCRキットからのLEDまたはThorLabs製のLEDのいずれかで照明することによって画像化した。

アッセイを、以下の変更を加えた同じ設計の新しいカートリッジで繰り返した:ヒーターが前の実行によってまだ温かいため、CRISPR試薬を装置に予め充填せず、増幅および検出工程を30分ではなく15分間実行した。

図129Bに示すマイクロ流体カートリッジで第3のアッセイを行った。増幅チャンバに50μLのヌクレアーゼフリー水を充填し、チャンバをPCR接着剤の小片で密封した。50μLの1μM ATTO-488色素および45μLのヌクレアーゼフリー水を下側CRISPRチャンバに充填し、95μLのヌクレアーゼフリー水を上部CRISPRチャンバに充填した。両方のチャンバをPCR接着剤の小片で密封した。図137Bに示すように、カートリッジを加熱マニホールド上に組み立てた。試料を増幅チャンバ内で10秒間インキュベートした。第1のポンプを3秒間作動させて、5μLの流体を増幅チャンバからCRISPRチャンバ（検出チャンバとも呼ばれる）内へ駆動した。第2のポンプを5秒間作動させて、検出試薬をCRISPERチャンバ内へと駆動した。試料をCRISPRチャンバ内で10秒間インキュベートした後、LEDで照射した。以下のパラメータ:増幅チャンバ内で30分間のインキュベーション、ポンプ1を1秒間作動、ポンプ2を20秒間作動、およびLEDで照射する前にCRISPRチャンバ内で15分間のインキュベーション、でアッセイを繰り返した。ポンプ時間を長くすると、チャンバ間の流体移送が改善された。

実施例55
DETECTR反応でのマイクロ流体装置の使用
この実施例は、DETECTR反応のためのマイクロ流体装置の使用を記載する。図126A、図126B、図127A、図127B、図128A、図128B、図128C、図128D、図129A、図129B、図129C、または図129Dのいずれかに示すマイクロ流体カートリッジに、増幅試薬およびDETECTR試薬を充填する。増幅チャンバに50μLの増幅試薬を添加し、DETECTRチャンバに95μLのDETECTR試薬を添加する。カートリッジのウェルは密閉されている。カートリッジは、図136A、図136B、図137B、図137C、または図138A～Bのいずれかに示すように加熱マニホールドに充填される。カートリッジは特定の向きで挿入される。ねじを締めてカートリッジを定位置に保持する。開口部は、サイズに合わせて切断された透明なqPCRテープで封止して気密シールを形成する。熱電対を増幅チャンバに挿入して、温度を記録する。図130Aに示すソレノイドに通電して、バルブを閉じる。インジケータLED灯が点灯する。60℃および37℃に設定された二つのヒーターをオンにする。試料を増幅チャンバ内で60℃で30分間インキュベートする。ソレノイドへの通電を停止してバルブを開く。ポンプ1を15秒間作動させて、流体を増幅チャンバからDETECTR反応チャンバに移動させる。15秒後、ポンプ2を15秒間作動させて、流体をDETECTR試薬貯蔵器からDETECTR反応チャンバに移動させる。DETECTR反応チャンバ内で37℃で30分間、試料をインキュベートする。インジケータ灯が消える。LEDがオンにされ、蛍光が画像、視覚評価、またはフォトダイオード検出によって測定される。

30分間の60℃ LAMPインキュベーションの終了時に、ソレノイドバルブが開き、蠕動運動ポンプ＃1が100％ PWMで10秒間係合する。LAMP緩衝液は、DETECTR反応チャンバに通じる蛇行チャネルと、DETECTR試薬貯蔵器に通じる直線チャネルとの交点にバルブを通ってポンプ圧送される。DETECTR反応チャンバに通じる蛇行チャネルは、DETECTR試薬貯蔵器に通じるチャネルよりも大きい断面積を有する。これは、蛇行チャネル内の流体抵抗を低減し、緩衝液のすべてをDETECTR反応チャンバに向けることを意図している。しかしながら、この研究（23個以上のチップを試験する）全体を通して、緩衝液はほぼ毎回両側に分割されており、緩衝液体積の約半分が不適切な方向に移動している。次の流体工程では、ソレノイドバルブが閉じ、DETECTR試薬がDETECTR反応チャンバに向かってポンプ圧送され、途中でLAMP生成物を回収する。これにより、両方の緩衝液が蛇行チャネルを同時に通過する際にいくらか混合されるが、このプロセスはまた、DETECTRチャンバに運ばれ得る気泡を生成する。

DETECTR中の蛍光測定に気泡が干渉するのを防ぐために、反応チャンバに収まる量よりも多い量の緩衝液を貯蔵器に充填し、必要以上に長いポンピング時間を使用することができる。これにより、チャンバが試薬で完全に満たされ、すべての気泡がはじけたことが保証される。DETECTR反応チャンバは70μLの容積を有し、95μLのDETECTR試薬に加えて25μLのLAMPが各チャンバに送達される。第2の流体工程（DETECTR試薬をDETECTR反応チャンバへ）は、すべての緩衝液を送達するのに約20～30秒間かかるが、この工程は45秒間実行される。この結果、DETECTR反応チャンバは完全に満たされ、余剰の試薬は蛇行チャネルに戻される。気泡に加えて、DETECTR反応チャンバが完全に充填されていない場合、37℃のインキュベーション中にチャンバの上部に凝縮物が形成され、これもまた、上から行われる蛍光測定を干渉する。

実施例56
DETECTR反応のためのマイクロ流体装置の熱試験
この実施例は、DETECTR反応のためのマイクロ流体装置の熱試験を記載する。加熱マニホールドの熱性能を、緩衝液中に浸漬された熱電対を用いて、温度までの時間および設定点への加熱の精度を測定することによって試験した。標準アッセイの温度設定（60℃ LAMP/37℃ DETECTR）の下では、LAMP緩衝液は8.5分で60℃に加熱されるが、DETECTR緩衝液は約21分で34℃の最高温度に達する。これは、より低い温度に達するのにより長い時間がかかる（かつ、DETECTR緩衝液が設定温度に到達しない）ため、多少直感に反する。特定の温度に達するために、ヒーター制御装置は、オン状態で費やす時間の長さを変える。この状態の切り替えは、パルス幅変調（PWM）値、すなわちオン状態で費やす所与の単位時間の割合によって定量化される。ヒーター制御装置はまた、現在の温度と設定温度との間の差に関するフィードバックのためにヒーターの温度をサンプリングする。これらの2つの値の差が大きいほど、得られるPWM値は高くなる。ヒーター温度が設定点に近づくにつれて、PWM値は低下して変化速度を遅くし、設定温度のオーバーシュートを回避する。室温ヒーターとLAMP設定点との差は約35℃であり、一方、DETECTRヒーターとその設定点との差は約12℃である。LAMPインキュベーションは約20％の最大PWM値で加熱し、DETECTRインキュベーションは約12％の最大PWM値で加熱する。本発明者らの現在の設定は、緩衝液をアッセイ温度まで迅速に加熱することよりも、精度、および設定温度をオーバーシュートしないことに重点を置いて設計されている。

特定のPWM値を使用して、本発明の設定温度までより速く加熱することができる。しかしながら、これは手動プロセスであり、目標温度のオーバーシュート、マニホールドプロトタイプの損傷、およびマイクロ流体チップの溶融を引き起こし得る。LAMPヒーターPWM値を100％に設定すると、LAMP緩衝液（熱電対で測定）は90秒で60℃に加熱されるが、ヒーター温度は100℃に達する。DETECTRヒーターPWMを100％に設定すると、DETECTR緩衝液は60秒で37℃に加熱され、ヒーターは80℃に達する。DETECTR緩衝液が37℃に達したときにヒーターをオフにすると、約60℃の最大緩衝液温度が得られる。チップのDETECTR側の温度は、30分間の60℃のLAMPインキュベーション中に上昇するので、室温よりも高い。これは時々変動するが、通常、DETECTR側の開始までに25～29℃である。

図139A、図139B、図140A、および図140Bは、60℃に加熱された増幅チャンバ（図139Aおよび図140A）または37℃に加熱されたDETECTRチャンバ（図139Bおよび図140B）の熱試験概要を示す。図140Aは、BOBv2 LAMP温度対時間（61℃設定点）と題するグラフを示す。x軸は、200の増分で0から1800までの分単位の時間を示す。y軸は、5の増分で20から65までの℃単位の温度を示す。グラフは、ヒーターおよび緩衝液を表す2本の線を含む。ヒーターおよび緩衝液の両方の線は、最終的に同じ温度に達するが、ヒーターの線はより迅速に最高温度を達成する。図140Bは、BOBv2 LAMP温度対時間（40℃設定点）と題するグラフを示す。x軸は、200の増分で0から1800までの分単位の時間を示す。y軸は、2の増分で25から43までの℃単位の温度を示す。グラフは、ヒーターおよび緩衝液を表す2本の線を含む。ヒーターの線は、より迅速に高温に達する。

実施例57
マイクロ流体カートリッジを使用したHERC2 SNPの検出
この実施例は、マイクロ流体カートリッジを使用したHERC2 SNPの検出を記載する。ヌクレアーゼフリー水中に2μMのF3プライマー、2μMのB3プライマー、16μMのFIPプライマー、16μMのBIPプライマー、8μMのLFプライマーおよび8μMのLBプライマーを含むプライマーミックスを調製した。1×Mバッファー3、40nM crRNA、および50nM Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を含む複合体化反応物を調製した。37℃で30分間インキュベートした後、40nMレポーター基材を添加した。1×IsoAmp緩衝液、4.5mM MgSO₄、dNTPおよび1×プライマーミックスを含むLAMP混合物を調製した。DETECTR試薬をマイクロ流体カートリッジに充填し、PCRテープでウェルを密封した。LAMP混合物をプライマーと混合し、カートリッジに充填した。Chip Shopタンクの狭い端部をパラフィルムで覆い、LAMP反応チャンバ上方のルアー接続部に挿入した。Chip Shopタンクに200μLの20mM NaOHを充填した。カートリッジを加熱マニホールドに挿入し、ねじを締めた。頬スワブをタンクに添加し、穏やかに撹拌し、2分間インキュベートした。Drummondマイクロピペットを使用して、10μLの溶解試料を、パラフィルムを通してLAMP反応チャンバに送達した。タンクを取り出し、サイズに合わせて切断したqPCRテープでチャンバを密封した。

図141Aは、マイクロ流体カートリッジからのLAMP生成物をインプットとして使用して、ゲイン100でプレートリーダー上で実行されたDETECTR結果を示す。試料は、単一の非テンプレート対照（NTC）と共に2つ組で実行された。19μLのDETECTRマスターミックス（装置で使用したのと同じ混合物）を384ウェルプレートのウェルにピペットで入れ、1μLのLAMPアンプリコンを加えた。1つの試料について、10μLのアンプリコンが不注意で添加され、その試料を「10μL標的」と表示する。ドナーはA-SNPについてホモ接合性であるので、ガイドR570はR571よりも速い信号を生成すると予想された。2つの試料間にわずかな差が観察された。図141Aは、x軸が10の増分で0から30の範囲の分単位の時間を示し、y軸が20,000の増分で0から60,000の範囲の任意単位（AU）の未処理蛍光を示す、折れ線グラフを示す。下の2本の平坦線は、R570 NTCおよびR571 NTCである。高信号を急速に実現する線は、左から右に、R570 10ul、R 570 1ul、およびR571 1ulを含む。

図141Bは、マイクロ流体チップからの試料を使用してプレートリーダー上で実施される3つのLAMP生成物を示す。LAMP反応は、チップが実行された順序で番号付けされる（最初に実行されたLAMP＿1など）。ドナーはSNP Aについてホモ接合性であり、したがって、crRNA 570が最初に現れる。ATTO 488を蛍光標準として使用した。これらの測定は、プレートリーダーで60のゲインで行った。3つのLAMP反応の結果は密集し、マイクロ流体カートリッジおよび加熱マニホールドでの増幅に良好なランツーラン（run-to-run）再現性を示した。各LAMP反応を各crRNAで3つ組で実行し、グラフで認識できる誤差範囲を生成した。図141Bは、x軸が10の増分で0から30の範囲の分単位の時間を示し、y軸が2000の増分で0から8000の範囲の任意単位（AU）の未処理蛍光を示す、折れ線グラフを示す。グラフの底部付近の平坦な線は、10nM ATTO488なしおよびNTCである。6000 AU付近の平坦な破線は、100nMのATTO488なしである。高い信号を迅速に達成する線は、ほぼ左から右に向かって、LAMP＿1 R570およびLAMP＿3 R570、LAMP＿2 R570、LAMP＿3 R571、LAMP＿1 R571、LAMP＿2 R571である。

別のアッセイを行った。上記のように溶液を調製し、増幅チャンバの上部にルアーコネクタを追加した、図129Aに示すマイクロ流体カートリッジ上で試料に実行した。頬スワブ試料を上記のように調製した。カートリッジを装填し、増幅を30分、ポンプ1を10秒、ポンプ2を40秒、DETECTRを30分に設定してアッセイを実行した試料をプレートリーダーで測定した。図142Aは、アッセイ後のマイクロ流体カートリッジの画像である。左のウェルの緑色の外観と比較して右のウェルのより青い外観は、インプットされた青色光を拡散させる右のウェル内の気泡に起因する可能性が高い。図142Bは、30分間のLAMP増幅後にプレートリーダーで測定したDETECTR反応の結果を示す。1つの反応チャンバ内の気泡がESEログからの信号と干渉したので、定量的測定値は信頼されるべきではない。しかしながら、10分および20分の時点は、同様の信号を有していた。さらに、両方のウェルは、DETECTRの30分後にLEDがオンになったときに視覚的に明るく見えた。プレートリーダーでのDETECTR結果は、両方のSNPについて、30分後に信号が高いことを示した。図142Bは、左から右へR570、R571、および、なしと題する折れ線グラフを示す。各グラフのx軸は、20の増分で0から80の範囲の秒単位の時間を示し、y軸は、20000の増分で0から60000の範囲の任意単位（AU）の未処理蛍光を示す。左端のグラフでは、NTC線は下部で平坦であるが、抽出DNA線は迅速に高い蛍光信号を達成する。中央のグラフでは、NTC線は下部で平坦であるが、抽出DNA線は迅速に高い蛍光信号を達成する。右のグラフでは、10nMのATTOの線が下部で平坦であり、10nM ATTOの線が中央付近で平坦であり、100nM ATTOの線が上部で平坦である。

実施例58
マイクロ流体カートリッジを使用したコロナウイルスの検出
この実施例は、マイクロ流体カートリッジを使用したコロナウイルスの検出を記載する。1×Mバッファー3、40nM crRNA、および50nM Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を含む複合体化反応物を調製した。37℃で30分間インキュベートした後、40nMレポーター基材を添加した。95μLのDETECTR試薬を各DETECTR試薬ウェルに充填し、qPCRテープで密封した。N遺伝子LAMPマスターミックスの管（537μL）を32μLの100mM MgSO₄と混合し、40μLの混合物をカートリッジに充填した。μLあたり様々なコピー数の10μLのTwist SARS-Cov-2標準、または陰性対照として1×TEをLAMP反応チャンバに添加した。カートリッジをマニホールドに挿入し、締め付けた。LAMP反応チャンバをqPCRテープで密封した。温度を設定し（62℃ LAMP、40℃ DETECTR（熱オフセットを考慮））、自動化ワークフローを開始した。光学ノイズを最小限に抑えるために、3D印刷された光学カバーをカートリッジ上に配置した。0分、2分、5分、10分、20分、および30分でDETECTR測定を行った。装置の検出下限を推定するために、LAMP反応のRNAのコピー数を変化させた。

図143A、図143B、図143Cおよび図143Dは、コロナウイルスDETECTR反応の結果を示す。10コピーがLAMPにインプットされた2つの反応チャンバは、DETECTR信号の急速な増加をもたらした。すべてのNTCは陰性であった。10コピーがLAMPに入力されると、以下の図143Cのフォトダイオード測定値に示されるように、DETECTR信号は反応の過程にわたって徐々に増加した。図143Dの陰性対照は、汚染がないことを示した。

アッセイを繰り返した。図144A、図144B、図144Cおよび図144Dは、反復コロナウイルスDETECTR反応の結果を示す。

実施例59
マイクロ流体カートリッジにおけるインフルエンザB DETECTRアッセイのターンアラウンドタイム
この実施例は、マイクロ流体カートリッジにおけるインフルエンザB DETECTRアッセイのターンアラウンドタイムを記載する。ヌクレアーゼフリー水中に2μMのF3プライマー、2μMのB3プライマー、16μMのFIPプライマー、16μMのBIPプライマー、8μMのLFプライマーおよび8μMのLBプライマーを含むプライマーミックスを調製した。1×Mバッファー3、40nM crRNA、および50nM Cas12変異体（SEQ ID NO:37）を含む複合体化反応物を調製した。37℃で30分間インキュベートした後、40nMレポーター基材を添加した。95μLのDETECTR試薬を各DETECTR試薬ウェルに充填し、qPCRテープで密封した。40μLのLAMP混合物をカートリッジに添加した。2μLの1pM IBV標的を198μLのウイルス溶解緩衝液に添加し、Chip Shopタンクに充填した。Drummondマイクロピペットを使用して、10μLの溶解試料を、パラフィルムを通してLAMP反応チャンバに送達した。タンクを取り外し、チャンバを密閉した。

図145A、図145B、図146A、図146Bおよび図146Cは、マイクロ流体カートリッジにおけるインフルエンザB DETECTR反応のフォトダイオード測定値を示す。10分間の増幅時間によって、バックグラウンド上の信号が増加した（これは視覚的にも観察された）。5分間の増幅時間は、信号の目に見える増加をもたらさなかった。図145Aは、凝集したDETECTR信号:検出マニホールドでのIBV LAMPrey時点試験、と題する折れ線グラフを示す。x軸は、5の増分で0から25までの分単位の時間を示す。y軸は、未処理蛍光を0から0.5まで0.1刻みで示す。中央付近の3本の線は、15分LAMP、5分LAMP、およびNTCであり、3本の線の1番上の線は15分lampである。グラフの一番上の線は10分LAMPである。図145Bは、DETECTR信号:15分 IBV LAMP、と題された折れ線グラフを示す。x軸は、10の増分で0から30までの範囲の分単位の時間を示す。y軸は、未処理蛍光を0から0.5まで0.1刻みで示す。中央付近の2本の線はチャネル1およびチャネル2であり、チャネル1の線の方が高い。

実施例60
ガラスキャピラリーに貯蔵された試薬を用いるDETECTRアッセイ
この実施例は、DETECTR反応におけるガラスキャピラリーの使用を記載する。ガラスキャピラリーは、受動的な毛細管作用によって流体の流れを可能にすることができ、それによって動力駆動の流れ（例えば、機械式ポンプによる）が不要になる。ガラスキャピラリーはまた、長期間安定して試薬を貯蔵することができる。

DETECTR反応に必要な試薬は、乾燥形態でキャピラリーの内部に提供される。キャピラリーを水和させると、試薬が可溶化し、それらをキャピラリーから回収器区画または容器に溶出させる。CRISPR-Cas複合体は、この様式で活性を失うことなく貯蔵および回収され得る。

DETECTR試薬混合物は、5×Mバッファー2（20mM Tris HCl、pH 8、100mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、5％グリセロール、50 ug/mLヘパリン）中でSEQ ID NO:374のガイド核酸を、SEQ ID NO:37の5μMのプログラマブルヌクレアーゼと事前複合体化することによって調製した。20μlの体積収容能力を有する23.5mmのキャピラリーに0.5μlの試薬混合液滴を充填し、次いで室温で一晩乾燥させた。212日後、キャピラリーを、蛍光レポーターを有する0μMまたは0.170μMのいずれかのssDNA基質と、0μM、0.1μMまたは1μMのいずれかの標的核酸とを含有する5×Mバッファー2の20μlアリコートで再水和した。ガイド核酸、ssDNA基質、および標的核酸の配列は、以下の表24に提供される。2分間の室温再水和の後、各キャピラリーの内容物を384ウェルプレート上の個別のウェルへ移した。ウェルを37℃で90分間インキュベートし、その間に各ウェルからの蛍光読み出しを監視した。

（表２４）

DETECTR実験の結果を図147に示す。蛍光増加は、0.17μMレポーター核酸ならびに0.1μMおよび1.0μM標的核酸のいずれかとの反応について検出された。結果は、予め複合体化されたガイド核酸-プログラマブルヌクレアーゼ複合体が、風乾および長期保存後に触媒活性を維持したことを示している。再水和は迅速であり、キャピラリー内の乾燥または凍結乾燥を理想的な貯蔵方法にする。

実施例61
連続した増幅およびCRISPR反応のためのスピンカラム
この実施例は、核酸増幅反応およびCRISPR反応のための試薬を混合するように設計された装置を記載する。増幅反応およびCRISPR反応は、多くの場合で別々の緩衝液および条件を必要とする。したがって、単一の試料に対する連続した増幅およびCRISPR反応の実施は、試料を周囲環境に曝露することを必要とし得る。この実施例は、汚染を低減するために密封されたままで、異なる試薬を含む別々の区画を通って試料を移動させることができる多区画スピンカラムを記載する。

スピンカラムは、図148のパネルAに示す構造を有することができる。このスピンカラムは、CRISPR試薬を充填することができる上部区画101と、等温増幅試薬を充填することができる下部区画102とを有する。単一のキャップ103は、両方の区画を外部環境から密封することができる。上部区画は、膜またはフィルターなどの弱透過性材料104によって下部区画から隔離されている。上部区画内の下向きの力または圧力を使用して、試薬を、弱透過性材料を通して下部区画内に移動させることができる。これは、スピンカラムを遠心分離すること、キャップを圧縮すること、または上部区画を選択的に加熱することによって達成することができる。上部区画は、下部区画から取り外し可能であってもよい。例えば、上部区画は、下部区画内に嵌合する管であってもよい。

スピンカラムは、図148に示す方法で使用することができる。パネルAに示すように、上部区画にCRISPR試薬を充填し、下部区画に増幅試薬および試料を充填することができる。両方の区画は、スピンカラムの上部のキャップを閉じることによって外部環境から密封される。次いで、パネルBに示すように、試料を増幅反応に供することができる。この段階中、スピンカラムを増幅反応に適した温度（例えば、37～65℃）でインキュベートすることができる。次に、パネルCに示すように、CRISPR試薬を、遠心分離によって上部区画から弱透過性材料を通して下部区画に引き込む。次いで、パネルDでは、スピンカラムをCRISPR反応に適した第2の温度でインキュベートすることができる。任意で、透明なスピンカラム材料を通して試料から信号を検出することができる（パネルE、例えば、CRISPR反応が蛍光信号を生成する場合）。

実施例62
DETECTR反応のための電気化学的に検出可能なレポーター分子
この実施例は、DETECTR反応に使用するための電気化学的に検出可能な部分を有するレポーター分子を記載する。レポーター分子は、フェロセン部分にコンジュゲートした改変チミン核酸塩基と、ホスホジエステル結合を介して5’末端にコンジュゲートした蛍光部分（例えば、フルオレセイン）とを含むssDNAである。レポーター分子は、3’末端でビオチン化され得る。2つのssDNAレポーター分子の配列は、5’-YXXTTATTXX-3’および5’-YXXTTATTATTXXZ-3’であり、Xはフェロセン標識チミジン（図149のパネルA）であり、Yは6-カルボキシフルオロセイン（図149のパネルB）であり、Zは3’ビオチン部分（図149のパネルC）である。

DETECTR反応において、レポーター分子は、プログラマブルヌクレアーゼ（例えば、SEQ ID NO:37の配列を有するCas12変異体）からのトランスコラテラル切断を受け得る。レポーター分子の切断は、電気化学的にプログラマブルな、フェロセン含有ssDNAサブユニットを動員する。フェロセンは、比較的高い酸化電位を有し、したがって、低い酸化電位の生体分子のバックグラウンドに対して電位差測定的に検出することができる。電気化学信号の大きさは、レポーター分子の切断に伴って増加する。対照的に、レポーター分子からの蛍光信号の強度は、トランスコラテラル切断の程度に対して不変である。したがって、蛍光読み出しを使用して、存在するレポーター分子の総濃度を定量化することによって電気化学測定値を較正することができ、電気化学測定値と蛍光測定値との組み合わせを使用して、切断されたレポーター分子の割合を決定することができる。ビオチンは、レポーターまたはレポーターの断片の捕捉部分として役立つ（例えば、ストレプトアビジンと共に）。

アッセイは、5’-YXXTTATTXX-3’レポーターオリゴヌクレオチド、HERC2を標的とするプログラマブルヌクレアーゼ、およびHERC2標的核酸を用いて行った。検出は、DropSensのμSTAT ECL機器およびDropSensのスクリーン印刷炭素電極を用いて行った。DETECTR反応物のアリコートを、その開始後の複数の時点で収集した。

図176は、矩形波ボルタンメトリーで測定したDETECTR反応の結果を示す。反応は、50fMの標的核酸および2.4μMのレポーター核酸を用いた。図176に見られ得るように、酸化（パネルA）および還元（パネルB）曲線の信号強度は、DETECTR反応の開始直後に回収した試料よりも、DETECTR反応の開始から33分後に回収した試料の方が大きかった。エラーバーは、同じ溶液の2つの測定値の標準偏差を表し、各測定からの3つのトレースを使用する。

図177は、サイクリックボルタンメトリーで測定したDETECTR反応の結果を示す。反応は、24μMのレポーター核酸および500pMの標的核酸を用いた。図177に見られ得るように、信号は、DETECTR反応の0分時点と26分時点との間で増加した。図177に示す各トレースは、同じ溶液の3回のスキャンの平均である。エラーバーは標準偏差を表す。

実施例63
連続した増幅およびCRISPR反応を自動化するための装置
この実施例は、試料に複数の増幅およびCRISPR反応を実施することができる装置を記載する。装置は、試料を分割して、単一のインプット試料の異なるアリコートに対して、増幅およびCRISPR反応の複数の異なる系列を実施することができる。装置は、試薬を貯蔵し、試料を反応させるための複数の区画を含むマイクロ流体チップを収容する。装置は、CRISPR反応から生成される信号（例えば、光信号）を検出するように構成され、したがって、単一の試料インプットからの複数の測定を容易にする。装置の可能な適用は、別個の系列の増幅およびCRISPR反応を行って、単一の生物学的試料を多数のウイルスについてアッセイすることである。

マイクロ流体チップの概略を図150に示す。装置に挿入されると、生物学的試料は第1の区画（V1）に輸送され、そこで試料は、試料の種類ならびに実施されるアッセイの数および種類に応じて様々な溶液（例えば、溶解緩衝液）と組み合わせることができる。いくつかのアッセイでは、試料を充填する前に、V1に希釈緩衝液を予め充填する。装置は、制御された量の試料（例えば、5μl）を第1の区画から第2の区画（V2）に移動させることができ（例えば、ポンプを介して）、そこでP1からの増幅試薬と混合することができる。装置は、V2の温度を制御して増幅反応を促進する。装置は、V2からの増幅生成物の一部をV3またはV4のいずれかに輸送し、そこで試料は、CRISPR反応のための試薬と混合される。V3およびV4からの試料は、廃棄物区画（それぞれV5およびV6）に輸送され得る。

装置の描写を図151に提供する。装置は、試料投入口ポート102の下にマイクロ流体チップ101を保持するように構成される。投入口ポートは、試料をマイクロ流体チップ104内の第1の区画に引き込むことができる突起103（例えば、空気圧で駆動される針）を含む。マイクロ流体チップは取り外して交換することができ、マイクロ流体チップ内の区画内の温度を調節する温度制御要素105上に保持される。装置は、吸光度、および複数のマイクロ流体チップ区画からの蛍光を測定するように構成されたダイオードアレイ106を含む。装置は、電源として電池107を用いる。

実施例64
二重増幅、ウイルス溶解緩衝液システムを用いたインフルエンザDETECTR反応
この実施例は、インフルエンザウイルス核酸を検出するためのアッセイを記載する。アッセイは、周囲温度RT-LAMP増幅と、ガイド核酸駆動のプログラマブルヌクレアーゼベースの検出との組み合わせである。LAMPプロトコールは、多くの場合、複数のタイプの反応を実行する装置では実現が不可能な厳格な動作温度を必要とする。例えば、いくつかの増幅反応に必要な高温は、CRISPR反応のための試薬を損傷する可能性がある。この実施例は、周囲温度を含む、装置内での実施により適した温度範囲で動作できるLAMP増幅用の活性化物質を開示する。この実施例はまた、インフルエンザに関連する核酸を含有するスワブなどの試料をインプットすると、溶解および増幅が同時にできるLAMP活性化物質を含有するウイルス溶解緩衝液を提供する。

様々な潜在的なLAMP活性化物質を、LAMP活性化能力およびウイルス溶解緩衝液適合性について試験した。LAMP活性化能力は、個々のLAMP活性化物質の非存在下で二重LAMP-DETECTRアッセイを行うことによって評価した。これらのアッセイでは、緩衝液、活性化物質、dNTPおよびプライマーの4つのうちの3つを用いてLAMPを行った。DETECTR反応は、SEQ ID NO:37および以下の表25に示すガイド核酸（ターゲティングHERC2）を含む頬スワブ試料に対して行った。DETECTR反応を90分間にわたって蛍光で監視した。LAMP増幅中に存在する4つの試薬すべてを用いて、別個の対照アッセイを実施した。図152に示すように、LAMP反応は、4つの試薬のいずれかが欠けることよって阻害された。異なる抽出条件を2つの列に示す。左の列は粗い溶解を示し、右の列は標準的な商業的抽出方法を示す。

（表２５）

図153は、インフルエンザ核酸を標的とする二重LAMP-DETECTRアッセイの結果を示す。第1および第3の列のパネルは、活性化物質を欠くLAMP反応について否定的な結果を示す。試料は、

に対応する標的配列を標的とした、

に対応するgRNAで検出した。2番目および4番目の列のパネルは、活性化物質の存在下で緩衝液中（2番目の列のパネル）およびウイルス溶解緩衝液（4番目の列のパネル）中で行われたLAMP反応の結果を示す。

実施例65
平行増幅およびCRISPR反応のための多チャンバ射出成形カートリッジ
この実施例は、1つのインプット試料に対して複数の増幅およびDETECTR反応を実行することができる、完全に一体化された装置を記載する。装置は、試料を挿入するための投入口ポート、増幅およびDETECTR反応のための試薬を含む射出成形カートリッジ、複数の反応についての試料を分配するための流体システム、反応物を分析するための検出構成要素、および反応を処理するためのハードウェアを含む。試料を投入口ポートに挿入することで試料を装置内に密封し、試料および周囲環境の汚染を防止する。

図154のパネル（a）は、射出成形カートリッジを示す。射出成形カートリッジは、試料を挿入するための投入口ポート101を含む。入口ポートの底部は狭く、スワブが挿入時に所定の位置にしっかりと嵌り、密閉することができる。投入口ポートの上部は、入口ポートを気密封止するように構成されたキャップ102に取り付けられている。射出成形カートリッジは、試料の一部を規定の体積に分配する計量チャネル103aを含む、流体チャネル103（例えば、マイクロ流体チャネル）を含み、試料および試薬は、それを通じて流れることができる。チャネルは、ポンプ（例えば、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、空気圧ポンプマニホールドに接続するポートなど）と、流体の流れを誘導および計量する切り替え可能バルブ104とを収容することができる位置設定によって相互接続される。いくつかのチャネルは、反応のための区画105を含むか、またはそこで終結する。カートリッジは、流体チャネルおよび反応区画全体にわたって試薬を輸送するために、ポート107に連結された試薬貯蔵区画のアレイ106を含む。射出成形カートリッジは、接続してカートリッジ内に貯蔵された試薬を気密封止する、2つの部品108および109から構成される。射出成形カートリッジチャンバは、レーザ接合密封層をさらに含む。

図154のパネル（b）は、射出成形カートリッジを収容することができる装置を示す。装置は、射出成形カートリッジを定位置にしっかりと保持するように設計された上部プラットフォーム110および下部プラットフォーム111を含む。装置は、射出成形カートリッジ内の液圧を制御するポンプおよび切り替え可能バルブのアレイ112と、射出成形カートリッジ内の温度を調節する加熱要素113とを含む。装置内に収容された蛍光光度計114は、射出成形カートリッジ内の検出チャンバからの蛍光を測定することができる。計算装置115は、装置内の蛍光光度計、モーター、および加熱要素を制御する。

図155は、ユーザのインプットを最小限に抑える装置を用いるアッセイ方法を示す。この方法は、ユーザのインプットを必要とするオフチップ調製工程、および装置によって制御されるオンチップ自動化プロセスを含む。射出成形カートリッジは、試薬用の複数の区画を含む。アッセイで使用する前に、区画に溶解緩衝液、増幅試薬、ならびに蛍光ベースのレポーター、プログラマブルヌクレアーゼ、およびガイド核酸を含むDETECTR試薬を充填する必要がある。射出成形カートリッジは、複数の異なる増幅試薬およびDETECTR試薬（例えば、異なる標的配列を有する増幅試薬およびDETECTR試薬）のセットを貯蔵することができる複数の区画を有する。充填の前に、プログラマブルヌクレアーゼおよびガイド核酸を37℃で30分間インキュベートする必要がある。試薬が充填されると、射出成形カートリッジを気密封止し、次いで装置内に装填することができる。射出成形カートリッジは、再充填可能であってもよく、または試薬が予め充填されていてもよい。そのような場合、装置は、DETECTR反応を行う前に、ガイド核酸およびプログラマブルヌクレアーゼを混合し、予熱することができる。

射出成形カートリッジは、試料挿入のための投入口ポートを含む。射出成形カートリッジに試薬が調製され、密封されると、試料をスワブ上に収集し、投入口ポートに挿入することができる。投入口ポートは、スワブを投入口ポート内の区切り点でしっかりと嵌めて、試料を射出成形カートリッジ内に固定することができるように構成される。試料が射出成形カートリッジ内に固定されると、投入口ポートを密閉蓋で密閉することができる。

（試薬および試料を充填した）密封された射出成形カートリッジを装置に挿入することができ、これにより試料の調製および分析が自動化される。装置は、最初に試料を200μlの溶解緩衝液と2分間インキュベートする。装置は、60℃で10～60分間の等温増幅のために、80または180μlのLAMPマスター混合物への20μlの試料のアリコートを計量する。DETECTR試薬を含む90または190μlの溶液へ、得られたアンプリコンの10μlアリコートを計量し、470nmおよび520nmでのリアルタイムの励起および検出と同時に37℃でインキュベートする。装置は、このデータ（例えば、無線信号として）を収集し、分析のために計算装置に転送する。装置は、単一の試料上の異なる核酸配列を標的とする、多数の連続かつ平行増幅および検出反応を実行および検出することができる。

図156は、装置用の光学アセンブリを示す。図156のパネル（a）は、470nmの光を生成し、520nmまたは594nmの光を検出して、それぞれレポーター分子を励起および検出することができるダイオードのアレイ116を示す。図156のパネル（b）は、琥珀色および青色LEDが照明したダイオードアレイを示す。図156のパネル（c）は、ダイオードアレイによって照明された射出成形カートリッジを示す。

図157は、射出成形カートリッジの可能な設計を示す。射出成形カートリッジは、試料を回収し、次いで最大400μlの緩衝液と混合するための試料チャンバ117を含む。試料チャンバはポンプを含み、回転バルブを介して、試料を複数の増幅チャンバ119に分配する一連の流体チャネル118（例えば、マイクロ流体チャネル）に接続されている。試料チャンバの出口の回転バルブ内の計量バルブは、回転ごとに試料チャンバからの20μlのアリコートを流体チャネルへと分注する。増幅チャンバは、貯蔵された試薬の増幅チャンバへの流れを制御するポンプおよびバルブでそれぞれ構成された抵抗チャネル118bを介して、増幅試薬チャンバ（増幅反応のための試薬を含む）120に結合される。各増幅チャンバの後端は、流体チャネル121の第2の系列を通って検出チャンバ122の系列に入る流れを計量するバルブに接続されている。検出チャンバは、貯蔵された試薬の検出チャンバへの流れを制御するポンプおよびバルブでそれぞれ構成された抵抗チャネル118bを介して、検出試薬チャンバ（検出反応のための試薬を貯蔵する）123に結合される。この射出形成カートリッジは、1つの試料チャンバ、5つの増幅チャンバ、および10個の検出チャンバを含む。

実施例66
単一試料に複数の増幅およびDETECTR反応を実施するための射出成形カートリッジの設計
この実施例は、別個の増幅およびDETECTR反応のために試料を分配することができる射出成形カートリッジの設計を提供する。射出成形カートリッジは、スワブ（例えば、頬スワブ）から試料を収集するように設計されている。別個の増幅反応とDETECTR反応との組み合わせにより、試料を複数の配列についてアッセイすることが可能になる。例えば、8つのDETECTR反応を使用して、8つの別個のウイルスまたは7つのウイルスおよび内部対照を照会することができる。射出成形カートリッジは、試料および試薬の移動、加熱、および検出を自動化する装置内に収まるように設計されている。

図158は、1つの試料チャンバ124、4つの増幅チャンバ125、および8つの検出チャンバ126を有する射出成形カートリッジ設計を示す。各増幅チャンバおよび検出チャンバは、抵抗チャネル129bによって、1つの増幅試薬チャンバ127または1つの検出試薬チャンバ128にそれぞれ接続されている。各系列のチャンバは、図158に示すように流体チャネル129によって接続されている。試料チャンバを増幅チャンバに接続する流体チャネルは、幅が300μm～1mmである。

図159は、図158の射出成形カートリッジの代替設計を示し、溶解試薬チャンバ130が試料チャンバ124に接続されている。バルブ（v1）は、溶解試薬チャンバと試料チャンバとの間の流れを媒介する。V1～V18は、チャンバ間の流れを制御するためのバルブに対応する。

図160は、図159に示すものと類似の射出成形カートリッジの上部の設計を示す。射出成形カートリッジは、圧力駆動流のためのマニホールドに接続することができる。標識されたチャンバC1およびC2は、図159の溶解試薬チャンバおよび試料チャンバに対応する。標識されたチャンバC3～C6は、図159の増幅試薬チャンバに対応する。標識されたチャンバC7～C10は、図159の増幅チャンバに対応する。標識されたチャンバC11～C18は、図159の検出試薬チャンバに対応する。標識されたチャンバC19～C26は、図159の検出チャンバに対応する。この設計では、試料チャンバおよび溶解試薬チャンバは、射出成形カートリッジの中心付近に配置される。C3～C6およびC11～C18からの流れを制御するバルブは、射出成形カートリッジ131の上部から制御することができる。検出試薬チャンバおよび検出チャンバはまた、増幅チャンバからさらに離間されて、検出試薬（例えば、CRISPR反応のための試薬）を増幅反応の温度からをさらに隔離する。いくつかの場合では、検出試薬（例えば、CRISPR反応試薬）は、増幅反応に要する温度で安定しないからである。

図161は、回転バルブ134によって接続された試料チャンバ132および溶解試薬チャンバ133を含む射出成形カートリッジの一部の設計を示し、それはレーザ接合透明ポリカーボネートで密封されている。試料を含むスワブを試料チャンバに挿入することができる。溶解緩衝液は、回転バルブ134の部分回転によって溶解試薬チャンバから試料チャンバに圧送することができる。回転バルブは、試料チャンバから所定体積の液体を、増幅チャンバ136に通じるチャネル135bに移送することができる計量チャネル135aを含む。したがって、装置は、アリコートを試料チャンバから個々の増幅チャンバの各々に順次移送することができる。各増幅チャンバから出る流れは、ベントに接続されたバルブ137によって制御される。パネルAは、溶解試薬チャンバを試料チャンバに接続する回転バルブを示す。パネルBは、回転バルブが部分的に回転された後の射出成形カートリッジを示す（パネルAに関連して）。

図162は、増幅試薬チャンバ138と、スライドバルブ140によって接続された増幅チャンバ139とを含む、射出成形カートリッジの一部の設計を示す。スライドバルブは、4つのポジション、すなわち、第1の計量チャネル141を介して増幅チャンバに流体を送達するための第1のポジション（パネルAに示す）、増幅チャンバから出て計量チャネル142および143に入る流体を計量するための2つのポジション（これらの2つのポジションのうちの1つをパネルBに示す）、ならびに計量チャネルが、別個の検出チャンバに通じる流体チャネル144および145に接続する第4のポジション（パネルCに示す）を有する。増幅試薬チャンバと増幅チャンバとの間にあるバルブ146は、スライドバルブが4つのポジションのうちの第1のポジションにある場合（パネルAに示す）、2つのチャンバ間の流れを制御する。

図163は、プラスチックシェルを有する射出成形カートリッジの設計を示す。設計は、気密封止キャップ148を有する、試料チャンバに通じる試料投入口ポート147を含む。試料投入口ポートは、スワブ149を収容するように設計されている。溶解緩衝液は、スワブの挿入前に試料投入口ポートの上部に充填することができる。スワブの挿入で封止を破壊し、溶解緩衝液を試料投入口ポートの底を通して試料チャンバに流入させる。挿入されると、スワブは適所でプラスチック突起150のセットに固定され、試料の汚染を最小限に抑える。試料投入口ポート上のキャップを閉じると、さらに汚染を防ぐ。設計は長方形であるので、検出チャンバ151は、蛍光検出中に励起光が通過するために平坦面を有する。増幅チャンバを通って流れるスライドバルブ152は、射出成形カートリッジの後部付近に見ることができる。射出成形カートリッジの上部は、Oリング154で終端する複数のポート153を含み、カートリッジを、個々のカートリッジチャンバに圧力を加えることができる空気圧ポンピングマニホールドに接続させる。パネルAは、射出成形カートリッジの設計を示す。パネルBは、パネルAに示されているものと類似の射出成形カートリッジの機能的モデルの写真である。パネルCの射出成形カートリッジは、破断可能なシールと、スワブを保持するための突起とを欠く試料投入口ポートによってパネルAの射出成形カートリッジとは異なる。

図164のパネルAは、射出成形カートリッジ設計の底面図を示す。この設計は、広い平坦な試薬チャンバ（例えば、増幅試薬チャンバ）を特徴としており、異なる溶液を単一のチャンバに順次流すのではなく、流体をポンピングして試薬チャンバを出たり入ったりさせることにより、迅速な加熱および急速な流体混合を可能にする。カートリッジの高さが低いので、ヒーターが反応区画の周りに巻き付くことができる。同じ種類のチャンバを接続するチャネル155の長さは、混合に使用される場合に等しい流体抵抗を提供する。スライドバルブ156の底部、増幅試薬チャンバ157および検出チャンバ158は、カートリッジの底部から見ることができる。パネルBは、射出成形チップの上面図を示す。上部159および底部160のプラスチックケーシング片は、射出成形チップの周りに気密封止を形成する。プラスチックケーシング片上の連結クリップ161は、単一ユニットへの容易な組み立てを助長する。頂部にOリングがあるポート162によって、射出成形カートリッジは、射出成形カートリッジ全体の流れを制御することができる空気圧ポンピングマニホールドに結合することができる。試料投入口ポート163は、破断可能なシール164によって栓をされた上部チャンバを含む。

実施例67
単一試料の平行増幅およびCRISPR反応を行うことができる射出成形カートリッジ
この実施例は、単一の試料に複数の増幅およびCRISPR反応を実施するように設計された射出成形カートリッジを記載する。このカートリッジは、4つの増幅チャンバおよび8つの検出チャンバを有する。単一の試料が最初に試料チャンバで希釈され、次いで4つの増幅チャンバ間で分配される。各増幅チャンバからの増幅生成物は、2つの別個の検出チャンバに分割される。各増幅チャンバは、CRISPR（例えば、DETECTR）反応を光学的（例えば、蛍光）に監視できるように透明である。各増幅および検出チャンバは、固有の試薬貯蔵チャンバ（例えば、増幅試薬チャンバ）に接続されている。いくつかのチャンバに同一の試薬を充填してもよく、または各チャンバに異なる試薬（例えば、異なる配列を標的とする増幅試薬およびDETECTR試薬）を充填してもよい。したがって、射出成形カートリッジは、単一のインプット試料に対して、増幅およびCRISPR反応の最大8つの独自の系列を実行することができる。

射出成形カートリッジは、カートリッジ内の試料の分配、試薬の充填、加熱および検出を制御することができる装置に挿入するように構成される。カートリッジは、空気圧式送達マニホールドと共に複数のバルブを含み、それによって装置は、装置内のチャンバおよび流体チャネルの流れ、圧力、および温度を全体的に制御することができる。装置はまた、検出チャンバの構成成分を測定することができる光学検出器（例えば、蛍光光度計）を備えることができる。

図165は、試料チャンバ101および増幅チャンバ102を含む射出成形カートリッジの一部の設計を示す。パネルAおよびBは上面図を提供し、パネルC～Eは射出成形カートリッジを底から表示している。パネルAに示されるように、分析される試料を含むスワブ103を試料投入口ポート104に挿入することができる。試料投入口ポートは、射出成形カートリッジの内容物を周囲環境から封止する気密封止キャップ105を有する。試料が試料チャンバに挿入されると、回転バルブ106は、溶解緩衝液を溶解緩衝液貯蔵チャンバ107から試料チャンバに輸送することができる。パネルAは、溶解緩衝液貯蔵チャンバと試料チャンバとを接続する回転バルブを示す。試料溶解が完了すると、回転バルブは、試料の20μlアリコートを、回転されて試料を4つの増幅試薬チャンバ110につながるマイクロ流体チャネル109に送達することができる、計量チャネル108に移送することができる。パネルBは、計量チャネルを試料チャンバに接続するように配置された回転バルブを示す。

パネルCに示されるボトムアップ図から明らかなように、増幅試薬チャンバの内容物は、増幅チャンバ101に流入することができる。混合は、2つのチャンバ間で内容物を前後に移動させることによって行われる。混合が完了したら、試料を増幅チャンバに完全に移し、制御された期間インキュベートする。パネルDに示すように、射出成形カートリッジは、制御装置内の加熱要素の上に配置することができ、したがって増幅中の温度制御を可能にする。

増幅チャンバに出入りする流れの方向は、スライドバルブ111によって媒介される。パネルCは、各増幅試薬チャンバを増幅チャンバに接続する第1の位置にあるスライドバルブを示す。増幅反応が完了すると、パネルは、第2および第3の位置（その1つをパネルEに示す）にスライドすることができ、それにより試料が増幅チャンバから計量チャネル112に移動することができる。スライダーは、次に、計量チャネルが検出試薬チャンバに通じるチャネル113と重なる第4の位置をとることができる。したがって、試料は、増幅後に8つの別個の構成要素に分割される。

図166のパネルAは、検出試薬チャンバおよび検出チャンバを含む射出成形カートリッジの一部分の設計を提供する。増幅後、試料は増幅チャンバから検出試薬チャンバ114に流入する。次いで、試料は、検出試薬チャンバから流れ、下向きに検出チャンバ115内にカスケードする。射出成形カートリッジは、カートリッジの上部に嵌合し、そのチャンバを密封するプラスチックカバー片と接続する。パネルBは、プラスチックカバー片116を有する射出成形カートリッジを示す。パネルBの側面図に示すように、検出チャンバは、蛍光励起および検出を可能にする平坦で透明な表面を有する。検出チャンバは、検出チャンバの温度を上昇させることができる制御装置内の第2のヒーターの上に配置される。検出チャンバ間の黒いボスは、チャンバ間の光汚染を最小限に抑え、したがって光学実験（例えば、発光検出、蛍光など）の精度および感度を向上させる。

図167のパネルAおよびBは、射出成形カートリッジの全体図を提供する。増幅チャンバ102、溶解緩衝液貯蔵チャンバ107、増幅試薬チャンバ110、および検出試薬チャンバ114は開いており、溶液および試薬を充填することができる。所望の試薬が装置に充填されると、プラスチックカバー片を射出成形カートリッジに取り付け、装置内のチャンバおよび流体チャネルを密封することができる。パネルCは、プラスチックカバー片116が取り付けられた射出成形カートリッジの作動中の物理的モデルの写真を示す。プラスチックカバー片は、射出成形カートリッジ内のチャンバおよび流体チャネル全体に流れを導くことができる空気圧マニホールドに接続することができる、頂部にOリングの付けいた投入口ポート118のアレイを含む。カートリッジの全体寸法は、試料投入口ポートの高さを含めて92mm×80mm×52.5mm、試料投入口を除いて92mm ×80mm×19.5mmである。保持リングは、射出成形カートリッジと投入口ポートとの間に封止ルを形成し、そうでなければ別個で分離可能である。

実施例68
射出成形カートリッジからの蛍光検出の励起および検出のためのダイオードアレイ
この実施例は、多チャンバカートリッジにおける蛍光読み出しDETECTR反応のための検出スキームを網羅する。カートリッジは、増幅を受けた試料の別々の部分に対して別々のDETECTR反応を行うように設計されている。図168は、各チャンバからの光を検出することができるダイオードアレイと、チャンバを照明するように配置された白色発光ダイオード103とを含む装置102に収容された射出成形カートリッジ101を示す。射出成形カートリッジは、8つの検出チャンバ104を有する。左側の4つ（橙色）の検出チャンバは色素ATTO 594を含み、右側の4つのチャンバは色素ATTO 488を含む。594個の色素を含む検出チャンバの前面（装置の開口部を指している）は、橙色のゲルフィルターでコーティングされている。488個の色素を含む検出チャンバの前面は、黄色フィルターでコーティングされている。白色光は、検出チャンバを側面から照らし、検出チャンバ内の蛍光色素を励起する。白色光に面する検出チャンバの側面は、光学フィルターまたは色吸収性ゲルでコーティングされてもよい。装置は、検出チャンバから放出された光を検出するダイオードを含み、したがって、装置が蛍光レポーターとのDETECTR反応を監視することを可能にする。

図169のパネルAおよびBは、白色光、検出器ダイオードを制御するため、および検出器ダイオード上で収集されたデータを監視するためのグラフィックユーザインターフェースを示す。グラフィックユーザインターフェースにより、ユーザは、温度遮断点（例えば、検出器ダイオードを、その温度が50℃を超える場合に遮断するように構成する）、ダイオードを通るバイアス電圧または電流、および各検出器ダイオードのサンプリングレート（例えば、100 Hz）を設定することができる。グラフィックは、各検出器ダイオードからの蛍光読み出しデータを表示することができる。

図170は、ダイオードアレイの較正試験の結果を示す。8つのデータポイントの各セットは、単一の試験において8つの検出器ダイオードによって収集されたデータに対応する。データセットAは、装置内に射出成形カートリッジを含めずに収集した。データセットB～Hは、装置内に空の射出成形カートリッジを用いて収集した。データセットBは、空のカートリッジで収集した。データセットCおよびDを、緩衝液を含むが色素を含まないカートリッジを用いて収集した。データセットE、FおよびGを、1nM、10nMおよび100nMの色素を含有するカートリッジを用いて収集し、ダイオード1～4を、ATTO 488を含有するウェルおよびATTO 594を含有するウェル5～8上に収集した。データセットHは、ウェル1～3に100nMのATTO 488、ウェル4に1μMのATTO 488、ウェル5～7に100nMのATTO 594、ウェル8に1μMのATTO 594を用いて収集した。図170は、A、B、C、D、E、F、G、およびHと指定された8つのセクションの棒グラフを示す。セクション1はLEDオン、チップなしであり、セクションBはLEDオン、空チップであり、セクションCはLEDオン、100ulの1×TEを含むチップであり、セクションDはLEDオン、90ulの1×TEを含むチップであり、セクションEは90ulの1nM色素であり、セクションFは90ulの10nM色素であり、セクションGは90ulの100nM色素であり、セクションHは100nMおよび1 uMである。各セクション内には7本の棒があり、左から右にダイオード1、ダイオード2、ダイオード3、ダイオード4、ダイオード5、ダイオード6、ダイオード7、およびダイオード8である。y軸は、任意の単位（a.u.）の蛍光を2.4から3.0まで0.1刻みで示す。

実施例69
ダイオードアレイを用いて測定されたHERC2 DETECTRアッセイ
この実施例は、実施例68のダイオードアレイを使用して実施例67の射出成形カートリッジで実施されるDETECTRアッセイを記載する。DETECTRアッセイのための試薬を検出チャンバに直接充填した。アッセイは、SEQ ID NO:37を有するプログラマブルヌクレアーゼ、HERC2 G SNP対立遺伝子を標的とするSEQ ID NO:256を有するガイド核酸、および切断により蛍光応答を増加させるレポーター核酸を用いた。4つのウェルは、5μMのレポーター、150nMのプログラマブルヌクレアーゼ、600nMのガイド核酸、および500pMの標的核酸を含有した。2つのウェルは、5μMのレポーター、150nMのプログラマブルヌクレアーゼ、600nMのガイド核酸を含有し、標的核酸を含有しなかった。2つのウェルは、緩衝液のみ含有した。レポーターは、ATTO 488またはATTO 594のいずれかを含有した。

図171は、8個のダイオード検出器アレイによって測定された8個の検出チャンバからの蛍光トレースを示す。レポーター、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸および標的核酸を含む検出チャンバは、時間と共に直線状に増加する蛍光応答を提供した。DETECTR試薬を含むが標的核酸を欠く検出チャンバ、および緩衝液のみを含む検出チャンバは、蛍光の増加を示さなかった。したがって、活性なトランスコラテラルレポーター切断を含む検出チャンバは、蛍光によって識別可能であった。図171は、x軸が5の増分で0から35の範囲の分単位のDETECTR時点を示し、y軸が0.02の増分で-0.02から0.12の範囲の任意単位（a.u.）の正味蛍光を示す、折れ線グラフを示す。直線的に増加する4本の線は、左/最高から右/最低までG-SNP-488nm、G-SNP-594nm、G-SNP-488nm、およびG-SNP-488nmである。前記一覧の最後の2つは、ほぼ重複している。底部付近の高い方の平坦線は、DETECTR MM-488nmに対応する。底部の低い方の平坦線は、DETECTR MM-594nmおよび1×TE-594nmに対応する。

図172は、DETECTR試薬添加の30分後の検出チャンバの画像を示す。検出チャンバ1、4、5および8は標的核酸を含み、残りの検出チャンバよりも目に見えて明るい。

実施例70
ウイルス溶解緩衝液中での標的核酸の増幅
この実施例は、ウイルス溶解緩衝液中での標的核酸の増幅を記載する。様々な緩衝液組成、還元剤、およびインキュベーション温度の、標的核酸に対する影響を試験した。様々な緩衝液中の試料を、LAMP増幅を用いて増幅し、得られた蛍光を測定した。蛍光が高いほど、増幅を多いことを示した。

図173は、異なる溶解条件下でLAMPを使用したSeraCare標的核酸の増幅の結果を示す。試料を様々な緩衝液中で増幅した。試料を室温（左のプロット）または95℃（右のプロット）のいずれかで5分間インキュベートした。試料は、標的を含まない（「NTC」）か、反応あたり2.5、25、または250コピーのいずれかを含む。25μLの反応物において5μLの試料を使用してアッセイを3つ組で行った。

図174は、異なる溶解条件下でLAMPを使用したSeraCare標準標的核酸の増幅の結果を示す。試料を様々な緩衝液中で増幅した。試料は、標的を含まない（「NTC」）か、反応あたり1.5、2.5、15、25、150、または250コピーのいずれかを含む。15μLの反応物において3μLの試料、または25μLの反応物において5μLの試料を使用してアッセイを3つ組で実施した。

この実験の結果は、特定の緩衝液がLAMP増幅に対してより貢献することを実証した。

実施例71
COVID-19患者試料由来の標的核酸の、ウイルス溶解緩衝液中での増幅
この実施例は、COVID-19患者試料由来の標的核酸の、ウイルス溶解緩衝液中での増幅を記載する。COVID-19陽性患者から収集した試料を、様々な成分を含むウイルス溶解緩衝液に溶解し、増幅した。SARS-CoV-2 N遺伝子およびRNasePに対応する標的核酸を、実施例22に記載されるようにLAMPを使用して増幅した。様々なウイルス溶解緩衝液製剤を試験した。

図175は、6つの異なるウイルス溶解緩衝液（「VLB」、「VLB-D」、「VLB-T」、「緩衝液」、「緩衝液A」、「緩衝液B」）の存在下での、SARS-CoV-2 N遺伝子（「N」）およびRNase P試料インプット対照核酸（「RP」）の増幅を示す。緩衝液-Aは還元剤Aを含む緩衝液を含有し、緩衝液-Bは還元剤Bを含む緩衝液を含有する。陰影付けの正方形は増幅速度を示し、陰影が濃いほど速い増幅を示す。増幅を、力価の高い、中力価または低力価のCOVID-19陽性患者試料（それぞれ「16.9」、「30.5」、「33.6」）に対して95℃（「95 C」）または室温（「RT」）で行った。試料を2つ組で測定した。

本発明の好ましい態様を本明細書に示し説明してきたが、そのような態様が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本開示から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、および置換が考えられるであろう。本明細書に記載の本開示の態様に対する様々な代替形態が、本開示を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

Claims

a）バルブに流体接続された増幅チャンバ;
b）試料計量チャネルに接続されているバルブに流体接続された検出チャンバ;
c）抵抗チャネルを介して前記検出チャンバに流体接続された検出試薬チャンバであって、プログラマブルヌクレアーゼとガイド核酸と標識されたディテクター核酸とを含み、前記標識されたディテクター核酸が、標的核酸のセグメントへの前記ガイド核酸の結合により切断され得る、前記検出試薬チャンバ
を含む、標的核酸を検出するためのマイクロ流体カートリッジ。
前記試料計量チャネルが、チャネル内またはチャンバ内に分配される液体の体積を制御する、請求項1記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料計量チャネルが、前記検出チャンバに流体接続されている、請求項2記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルが、蛇行経路、角度のついた経路、または遠回り経路を有する、請求項1～3のいずれか一項記載の抵抗チャネル。
前記バルブが、回転バルブ、空気圧バルブ、油圧バルブ、エラストマーバルブである、請求項1～4のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルが前記バルブと流体接続されている、請求項1～5のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記バルブが、「基材」または「オーバーモールド」を含むケーシングを含む、請求項1～6のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記バルブがソレノイドによって作動される、請求項1～7のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記バルブが、手動で、磁気的に、電気的に、熱的に、双安定回路によって、圧電材料によって、電気化学的に、相変化によって、レオロジー的に、空気圧的に、逆止バルブによって、毛細管現象によって、またはそれらの任意の組み合わせによって制御される、請求項1～8のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記回転バルブが、少なくとも3つ、少なくとも4つ、または少なくとも5つのチャンバを流体接続する、請求項5～9のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバに流体接続された増幅試薬チャンバをさらに含む、請求項1～10のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバに流体接続された試料チャンバをさらに含む、請求項11記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料チャンバに接続された試料投入口をさらに含む、請求項12記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料投入口が密閉可能である、請求項13記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料投入口が試料の周りにシールを形成する、請求項14記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料チャンバが溶解緩衝液を含む、請求項12～15のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料チャンバに流体接続された溶解緩衝液貯蔵チャンバをさらに含む、請求項12～16のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記溶解緩衝液貯蔵チャンバが溶解緩衝液を含む、請求項17記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記溶解緩衝液が二重溶解/増幅緩衝液である、請求項16～18のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記溶解緩衝液貯蔵チャンバが、第2のバルブを介して前記試料チャンバに流体接続されている、請求項17～19のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料チャンバが、前記増幅試薬チャンバを介して前記増幅チャンバに流体接続されている、請求項12～20のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料チャンバが、前記増幅チャンバを介して前記増幅試薬チャンバに流体接続されている、請求項12～20のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバと増幅チャンバとの間で流体を双方向に導くように構成されている、請求項11～22のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが前記増幅チャンバに流体接続されている、請求項1～23のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが前記検出試薬チャンバを介して前記検出チャンバに流体接続されている、請求項1～24のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出チャンバの上方にある試薬ポートをさらに含み、前記試薬ポートが、前記検出試薬チャンバから前記検出チャンバに流体を送達するように構成されている、請求項1～25のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが前記検出チャンバを介して前記検出試薬チャンバに流体接続されている、請求項1～26のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルが、前記検出チャンバへのおよび前記検出試薬チャンバへの逆流を低減するように構成されている、請求項1～27のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料計量チャネルが、所定の体積の流体を前記検出試薬チャンバから前記検出チャンバに導くように構成されている、請求項2～27のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバと検出チャンバとが熱的に隔離されている、請求項1～29のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが前記検出チャンバに流体接続されている、請求項1～30のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが、第2の抵抗チャネルを介して前記検出チャンバに流体接続されている、請求項1～31のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルまたは前記第2の抵抗チャネルが蛇行抵抗チャネルである、請求項1～32のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルまたは前記第2の抵抗チャネルが、少なくとも2つのヘアピン部を含む、請求項1～33のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルまたは前記第2の抵抗チャネルが、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つの直角部を含む、請求項1～34のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが、密閉可能な試料投入口を含む、請求項1～35のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料投入口が、スワブの周りにシールを形成するように構成されている、請求項36記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバから前記検出チャンバに流体を圧送するための第1のポンプに接続するように構成されている、請求項1～37のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバから前記検出チャンバに流体を圧送するための第2のポンプに接続するように構成されている、請求項1～38のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
第1のポンプまたは前記第2のポンプが、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである、請求項38～39のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが、空気圧を受けるように構成されたポートに流体接続されている、請求項1～40のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが、チャネルを介して前記ポートに流体接続されている、請求項41記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバが、空気圧を受けるように構成された第2のポートに接続されている、請求項11～42のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバが、第2のチャネルを介して前記第2のポートに流体接続されている、請求項43記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバから前記増幅チャンバに流体を圧送するための第3のポンプに接続するように構成されている、請求項11～44のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記第3のポンプが、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである、請求項45記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが、空気圧を受けるように構成されたポートに接続されている、請求項1～46のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが、第3のチャネルを介して第3のポートに流体接続されている、請求項1～47のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバから前記検出チャンバに流体を圧送するための第4のポンプに接続するように構成されている、請求項1～48のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記第4のポンプが、空気圧ポンプ、蠕動運動ポンプ、油圧ポンプ、またはシリンジポンプである、請求項49記載のマイクロ流体カートリッジ。
ガスマニホールドに結合するように構成された複数のポートをさらに含み、前記複数のポートが、空気圧を受けるように構成されている、請求項1～50のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記マイクロ流体カートリッジのいずれかのチャンバが、請求項50記載の複数のポートに接続されている、請求項1～51のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記バルブが電流電気信号の印加により開かれる、請求項1～52のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが円形である、請求項1～53のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが細長い、請求項1～53のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが六角形である、請求項1～53のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルの領域が、正味の流れ方向に対して垂直な方向に流れを導くように成形される、請求項2～56のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルの領域が、前記抵抗チャネルの2つの末端で画定される軸に対して垂直な方向に流れを導くように成形される、請求項2～56のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記抵抗チャネルの領域が、前記マイクロ流体カートリッジのz軸に沿って流れを導くように成形される、請求項2～58のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記バルブが、増幅混合物スプリッターを介して2つの検出チャンバに流体接続されている、請求項1～59のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記バルブが、増幅混合物スプリッターを介して3、4、5、6、7、8、9、または10個の検出チャンバに流体接続されている、請求項1～60のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバにおよび前記検出チャンバに流体接続された第2のバルブをさらに含む、請求項1～61のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出チャンバが疎水性PTFEベントで通気される、請求項1～62のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出チャンバが、光学的に透明な表面を含む、請求項1～63のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが、10μL～500μLの流体を保持するように構成されている、請求項1～64のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバが、10μL～500μLの流体を保持するように構成されている、請求項11～65のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
核酸を含む2μL～100μLの試料を受け入れるように構成されている、請求項1～66のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバが、5～200μlの増幅緩衝液を含む、請求項1～67のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが45μlの増幅緩衝液を含む、請求項1～68のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出試薬チャンバが、前記プログラマブルヌクレアーゼと前記ガイド核酸と前記標識されたディテクター核酸とを含む5～200μlの流体を貯蔵する、請求項1～69のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
2、3、4、5、6、7、または8個の検出チャンバを含む、請求項1～70のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記2、3、4、5、6、7、または8個の検出チャンバが、単一の試料チャンバに流体接続されている、請求項71記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出チャンバが、最大100μL、200μL、300μL、または400μLの流体を保持する、請求項1～72のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
5～7つの層を含む、請求項1～73のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
図130Bに示す層を含む、請求項1～74のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
スリップルアーチップに適合するように構成された試料投入口をさらに含む、請求項1～75のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記スリップルアーチップが、試料を保持するシリンジに合うように適合されている、請求項76記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記試料投入口が気密封止可能である、請求項76～77のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
スライドバルブをさらに含む、請求項1～78のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記スライドバルブが前記増幅試薬チャンバを前記増幅チャンバに接続する、請求項79記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記スライドバルブが前記増幅チャンバを前記検出試薬チャンバに接続する、請求項79または80記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記スライドバルブが前記増幅試薬チャンバを前記検出チャンバに接続する、請求項79～81のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
請求項1～82のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジを受け入れるように構成されたマニホールド。
前記検出チャンバに流体を圧送するように構成されたポンプと、前記検出チャンバを照明するように構成された照明源と、前記標識されたディテクター核酸によって生成された検出可能な信号を検出するように構成された検出器と、前記増幅チャンバを加熱するように構成されたヒーターとを含む、請求項83記載のマニホールド。
前記検出チャンバを加熱するように構成された第2のヒーターをさらに含む、請求項84記載のマニホールド。
前記照明源が広域スペクトル光源である、請求項84～85のいずれか一項記載のマニホールド。
前記照明源の光が、5nm未満の帯域幅を有する照明をもたらす、請求項84～86のいずれか一項記載のマニホールド。
前記照明源が発光ダイオードである、請求項84～87のいずれか一項記載のマニホールド。
前記発光ダイオードが、白色光、青色光、または緑色光を生成する、請求項88記載のマニホールド。
前記検出可能な信号が光である、請求項84～89のいずれか一項記載のマニホールド。
前記検出器がカメラまたはフォトダイオードである、請求項84～90のいずれか一項記載のマニホールド。
前記検出器が、100nm未満、75nm未満、50nm未満、40nm未満、30nm未満、20nm未満、10nm未満、または5nm未満の検出帯域幅を有する、請求項84～91のいずれか一項記載のマニホールド。
前記検出チャンバと前記検出器との間に存在するように構成された光学フィルターをさらに含む、請求項84～92のいずれか一項記載のマニホールド。
前記増幅チャンバが増幅試薬を含む、請求項1～93のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバが増幅試薬を含む、請求項11～94のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬が、プライマー、ポリメラーゼ、dNTP、増幅緩衝液を含む、請求項94～95のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅チャンバが溶解緩衝液を含む、請求項1～96のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬チャンバが溶解緩衝液を含む、請求項11～97のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬が逆転写酵素を含む、請求項94～98のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬が熱サイクル増幅のための試薬を含む、請求項94～99のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬が等温増幅のための試薬を含む、請求項94～99のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬が、転写増幅（TMA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、環状ヘリカーゼ依存性増幅（cHDA）、鎖置換増幅（SDA）、ループ介在増幅（LAMP）、指数関数的増幅反応（EXPAR）、ローリングサークル増幅（RCA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、RNA標的を増幅する簡便な方法（SMART）、単一プライマー等温増幅（SPIA）、多置換増幅（MDA）、核酸配列に基づく増幅（NASBA）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（HIP）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR）、または改良多置換増幅（IMDA）のための試薬を含む、請求項94～101のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記増幅試薬がループ介在増幅（LAMP）のための試薬を含む、請求項94～102のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記溶解緩衝液および前記増幅緩衝液が単一の緩衝液である、請求項16～103のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記溶解緩衝液貯蔵チャンバが溶解緩衝液を含む、請求項16～104のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記溶解緩衝液がpH 4～pH 5のpHを有する、請求項16～105のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
逆転写試薬をさらに含む、請求項1～106のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記逆転写試薬が、逆転写酵素、プライマー、およびdNTPを含む、請求項107記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記プログラマブルヌクレアーゼがRuvC触媒作用ドメインを含む、請求項1～108のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記プログラマブルヌクレアーゼがV型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である、請求項1～109のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas12タンパク質である、請求項110記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas12タンパク質が、Cas12aポリペプチド、Cas12bポリペプチド、Cas12cポリペプチド、Cas12dポリペプチド、Cas12eポリペプチド、C2c4ポリペプチド、C2c8ポリペプチド、C2c5ポリペプチド、C2c10ポリペプチド、およびC2c9ポリペプチドを含む、請求項111記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項110～112のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37から選択される、請求項110～113のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質がCas14タンパク質である、請求項110記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas14タンパク質が、Cas14aポリペプチド、Cas14bポリペプチド、Cas14cポリペプチド、Cas14dポリペプチド、Cas14eポリペプチド、Cas14fポリペプチド、Cas14gポリペプチド、Cas14hポリペプチド、Cas14iポリペプチド、Cas14jポリペプチド、またはCas14kポリペプチドを含む、請求項115記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項115～116のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129から選択される、請求項115～117のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記V型CRIPSR/Casエフェクタータンパク質がCasФタンパク質である、請求項110記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項119記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321から選択される、請求項119～120のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写するための1つまたは複数のチャンバをさらに提供する、請求項1～121のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記インビトロ転写が、前記増幅されたコロナウイルス標的核酸をインビトロ転写のための試薬に接触させることを含む、請求項122記載のマイクロ流体カートリッジ。
インビトロ転写のための前記試薬がRNAポリメラーゼ、NTP、およびプライマーを含む、請求項123記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記プログラマブルヌクレアーゼがHEPN切断ドメインを含む、請求項1～124のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記プログラマブルヌクレアーゼがVI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である、請求項1～125のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記VI型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas13タンパク質である、請求項126記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas13タンパク質が、Cas13aポリペプチド、Cas13bポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13dポリペプチド、またはCas13eポリペプチドを含む、請求項127記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:147のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項127～128のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:147から選択される、請求項127～129のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記標的核酸がウイルスに由来する、請求項1～130のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ウイルスが呼吸器ウイルスを含む、請求項131記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記呼吸器ウイルスが上気道ウイルスである、請求項132記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ウイルスがインフルエンザウイルスを含む、請求項131記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ウイルスがコロナウイルスを含む、請求項131～133のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記コロナウイルス標的核酸がSARS-CoV-2に由来する、請求項135記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記コロナウイルス標的核酸が、N遺伝子、E遺伝子、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項135～136のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記コロナウイルス標的核酸が、SEQ ID NO:333～SEQ ID NO:338のいずれか1つの配列を有する、請求項135～137のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ガイド核酸がガイドRNAである、請求項135～138のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:328のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項135～139のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:328のいずれか1つから選択される、請求項135～140のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
対照核酸を含む、請求項1～141のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記対照核酸が検出チャンバ内に存在する、請求項142記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記対照核酸がRNasePである、請求項142～143のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記対照核酸がSEQ ID NO:379の配列を有する、請求項142～144のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ガイド核酸が、SEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項142～144のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ガイド核酸が、SEQ ID NO:330～SEQ ID NO:332のいずれか1つから選択される、請求項142～146のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記インフルエンザウイルスが、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、またはそれらの組み合わせを含む、請求項134～147のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ガイド核酸が、複数の標的配列を標的とする、請求項1～148のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
ウイルスに対してタイリングされた複数のガイド配列を含む、請求項1～149のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記複数の標的配列が、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、および第3の病原体に由来する配列を含む、請求項150記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記標識されたディテクター核酸が、検出部分を含む一本鎖レポーターを含む、請求項1～151のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出部分が、フルオロフォア、FRET対、フルオロフォア/クエンチャー対、または電気化学的レポーター分子である、請求項152記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記電気化学的レポーター分子が、図149に示される種を含む、請求項153記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記ディテクター核酸の切断により、標識されたディテクターが、検出可能な信号を生成した、請求項1～154のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジ。
前記検出可能な信号が、比色信号、蛍光信号、電流測定信号、または電位差測定信号である、請求項155記載のマイクロ流体カートリッジ。
a）対象由来の試料を提供する工程;
b）前記試料を請求項1～156のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジに添加する工程;
c）請求項84～156のいずれか一項記載の検出可能な信号を前記標的核酸の存在または非存在と相関させる工程;および
d）任意で、前記検出可能な信号を定量し、それにより、前記試料中に存在する前記標的核酸の量を定量する工程
を含む、標的核酸を検出する方法。
標的核酸を検出する方法における、請求項1～156のいずれか一項記載のマイクロ流体カートリッジの使用。
ターゲティング核酸を検出する方法における、請求項1～156のいずれか一項記載のシステムの使用。
請求項30～63、66、150、153のいずれか一項記載の標的核酸を検出する方法における、プログラマブルヌクレアーゼの使用。
標的核酸を検出する方法における、請求項66～87のいずれか一項記載の組成物の使用。
請求項88、90～106、または151のいずれか一項記載の試料中のウイルス由来の標的デオキシリボ核酸をアッセイする方法における、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼの使用。
請求項88、90～106、または152のいずれか一項記載の試料中のウイルス由来の標的リボ核酸をアッセイする方法における、DNA活性化プログラマブルRNAヌクレアーゼの使用。
請求項108～120、123～148、または156のいずれか一項記載の試料中の標的核酸を検出する方法における、プログラマブルヌクレアーゼの使用。
SEQ ID NO:348～SEQ ID NO:353のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含む非天然の核酸を含む、組成物。
SEQ ID NO:354～SEQ ID NO:359のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含む非天然の核酸を含む、組成物。
前記核酸が、SEQ ID NO:348～SEQ ID NO:353のいずれか1つから選択される配列を含む、請求項165記載の組成物。
前記核酸が、SEQ ID NO:354～SEQ ID NO:359のいずれか1つから選択される配列を含む、請求項166記載の組成物。
SEQ ID NO:348～SEQ ID NO:353の核酸を含み、かつ、単一の反応チャンバに添加されるように構成されている、請求項165記載の組成物。
前記単一の反応チャンバが、請求項1～164のいずれか一項記載の増幅チャンバである、請求項169記載の組成物。
SEQ ID NO:354～SEQ ID NO:359の核酸を含み、かつ、単一の反応チャンバに添加されるように構成されている、請求項166記載の組成物。
前記単一の反応チャンバが、請求項1～164のいずれか一項記載の増幅チャンバである、請求項171記載の組成物。
表5に列挙されるディテクター核酸のいずれか1つをさらに含む、請求項165～172のいずれか一項記載の組成物。
コロナウイルス標的核酸をさらに含む、請求項165～173のいずれか一項記載の組成物。
前記コロナウイルス標的核酸が、E遺伝子、N遺伝子、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項174記載の組成物。
前記コロナウイルス標的核酸が、SEQ ID NO:333～SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:375～SEQ ID NO:376、またはそれらの断片のいずれか1つを含む、請求項174～175のいずれか一項記載の組成物。
ガイド核酸をさらに含む、請求項165～176のいずれか一項記載の組成物。
前記ガイド核酸が、SEQ ID NO:323～SEQ ID NO:332またはSEQ ID NO:18～SEQ ID NO:26のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含む、請求項84記載の組成物。
前記ガイド核酸が、SEQ ID NO:271～SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:374、またはSEQ ID NO:249～SEQ ID NO:258から選択される、請求項177～178のいずれか一項記載の組成物。
増幅のための試薬をさらに含む、請求項165～179のいずれか一項記載の組成物。
増幅のための前記試薬がポリメラーゼおよびdNTPを含む、請求項180記載の組成物。
逆転写のための試薬をさらに含む、請求項165～181のいずれか一項記載の組成物。
逆転写のための前記試薬が逆転写酵素およびdNTPを含む、請求項182記載の組成物。
対照核酸をさらに含む、請求項165～183のいずれか一項記載の組成物。
前記対照核酸がRNase Pである、請求項184記載の組成物。
前記対照核酸がSEQ ID NO:379の配列を有する、請求項184～185のいずれか一項記載の組成物。
プログラマブルヌクレアーゼをさらに含む、請求項165～186のいずれか一項記載の組成物。
前記プログラマブルヌクレアーゼがV型CRISPR/Casエフェクタータンパク質である、請求項187記載の組成物。
前記V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas12タンパク質である、請求項188記載の組成物。
前記Cas12タンパク質が、Cas12aポリペプチド、Cas12bポリペプチド、Cas12cポリペプチド、Cas12dポリペプチド、Cas12eポリペプチド、C2c4ポリペプチド、C2c8ポリペプチド、C2c5ポリペプチド、C2c10ポリペプチド、およびC2c9ポリペプチドを含む、請求項189記載の組成物。
前記Cas12タンパク質がCas12aタンパク質である、請求項190記載の組成物。
前記Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項189～191のいずれか一項記載の組成物。
前記Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:37との少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項189～192のいずれか一項記載の組成物。
前記Cas12タンパク質が、SEQ ID NO:27～SEQ ID NO:37のいずれか1つから選択される、請求項189～193のいずれか一項記載の組成物。
前記Cas12タンパク質がSEQ ID NO:37の配列を有する、請求項189～194のいずれか一項記載の組成物。
前記V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCas14タンパク質である、請求項188記載の組成物。
前記Cas14タンパク質が、Cas14aポリペプチド、Cas14bポリペプチド、Cas14cポリペプチド、Cas14dポリペプチド、Cas14eポリペプチド、Cas14fポリペプチド、Cas14gポリペプチド、Cas14hポリペプチド、Cas14iポリペプチド、Cas14jポリペプチド、またはCas14kポリペプチドを含む、請求項197記載の組成物。
前記Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項196～197のいずれか一項記載の組成物。
前記Cas14タンパク質が、SEQ ID NO:38～SEQ ID NO:129から選択される、請求項107～109のいずれか一項記載の組成物。
前記V型CRISPR/Casエフェクタータンパク質がCasФタンパク質である、請求項188のいずれか一項記載の組成物。
前記CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項200記載の組成物。
前記CasФタンパク質が、SEQ ID NO:274～SEQ ID NO:321から選択される、請求項200～201のいずれか一項記載の組成物。
前記プログラマブルヌクレアーゼがCas13タンパク質である、請求項187記載の組成物。
前記Cas13タンパク質が、Cas13aポリペプチド、Cas13bポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13cポリペプチド、Cas13dポリペプチド、またはCas13eポリペプチドを含む、請求項203記載の組成物。
前記Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:147のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する、請求項203～204のいずれか一項記載の組成物。
前記Cas13タンパク質が、SEQ ID NO:130～SEQ ID NO:147から選択される、請求項203～205のいずれか一項記載の組成物。
インビトロ転写のための試薬をさらに含む、請求項165～206のいずれか一項記載の組成物。
インビトロ転写のための前記試薬がRNAポリメラーゼおよびNTPを含む、請求項207記載の組成物。
溶解緩衝液をさらに含む、請求項165～208のいずれか一項記載の組成物。
レポーター分子をさらに含む、請求項165～209のいずれか一項記載の組成物。
前記レポーター分子が、表12または表22に列挙される配列のいずれか1つとの少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92％、少なくとも95％、少なくとも97％、または少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含む、請求項210記載の組成物。
試験管、ウェルプレート、ラテラルフローストリップ、またはマイクロ流体カートリッジ内に存在する、請求項165～211のいずれか一項記載の組成物。
単一の体積で存在する、請求項165～212のいずれか一項記載の組成物。
別々の体積で存在する、請求項165～213のいずれか一項記載の組成物。