JP2022533431A - ペプチド試料を調製する方法 - Google Patents
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Abstract
本出願は、生物学的試料からペプチド試料を調製するための方法、及び試料を調製するための前記方法を含む、タンパク質を検出又は定量するための方法に関する。本発明はさらに、健康状態又は疾患の検出又はモニタリングのための上記方法の使用に関する。
Description
本出願は、生物学的試料からペプチド試料を調製するための方法に関する。本出願はさらに、ペプチド試料を調製するための前記方法を実行する、タンパク質を検出及び定量するための方法に関する。最終的には、本出願は、健康状態又は疾患の検出又はモニタリングのための上記方法の使用に関する。
本発明の技術分野は、生物学的試料に由来するタンパク質の生化学分析の分野である。
本発明の技術分野は、生物学的試料に由来するタンパク質の生化学分析の分野である。
特定の疾患又は身体状態、例えば欠損症又は栄養失調などの検出及び進行のモニタリングには、「臨床タンパク質マーカー」と呼ばれる特異的タンパク質の検出及び定量が必要であり、該タンパク質は予防、診断、予後及び治療の選択のための重要なツールである。
複雑な生物学的試料の中の臨床タンパク質マーカーの検出は、プロテオーム解析又は質量分析については、ペプチド試料を調製するという最初のステップを必要とするが、該ペプチド試料の質は、その後の高感度かつ再現性の高い分析を可能にするために極めて重要である。実際、上記の試料環境の分析は、多数を占めるタンパク質の存在により、また場合によっては試料調製の際の細胞内容物の放出により、干渉を受ける。これは特に、ヘモグロビン、アルブミン又は免疫グロブリンが非常に多い血液由来物に当てはまる。
血液由来物を分析するための従来の方法は、液体又は固体の形態の生成物、例えば吸取紙上の乾燥血液（乾燥濾紙血）に適用されており、固体形態は実際に、多数の実用上、分析上、臨床上及び財政上の長所を有している。固体試料から小さな非タンパク質分子（アミノ酸、ステロイドホルモン、ビタミン及び薬剤）を抽出する方法は既に知られておりかつ実証されている。これに対し臨床タンパク質マーカーの分析は、多数を占めている他のタンパク質による干渉、タンパク質を調製又は消化する方法の効率及び再現性が低いこと、並びに固体担体中に不純物が存在する可能性があることから、多くの分析上の問題に直面する。質量分析法の最近の進歩により、既に実証済みの従来の臨床分析方法（免疫検出など）に代わる興味深い代替法が可能となっている。固体の血液試料と血清又は血漿試料との間のタンパク質組成の違い、加えてこれらのマトリックスの複雑さは、現行では、質量分析法による分析は再現性があまり良好でなく、感度もあまり高くなく、かつ許容可能な臨床使用にはさほど適合しないということを意味している。
従って、臨床タンパク質マーカーの、特に質量分析法による検出及び分析的モニタリングに先立ってペプチド試料を調製するための、再現性が高く、高感度で、迅速かつ臨床的に実証された方法を得ることが、強く必要とされている。
分析に先立ってペプチド試料を調製する方法は先行技術に述べられている。これらの方法は、タンパク質の変性、溶離、アルキル化及びトリプシン消化のステップを含んでいる。
国際公開公報第２０１４／１１８４７４号は、結腸直腸がんの検出のためにプロリダーゼの存在を測定する方法について述べており、この方法は、酵素消化のステップと、その後のウォーターズ（Waters）のＨＬＢ固相担体でタンパク質を清浄化するステップとを含んでいる。
Yakundiら（Journal of Pharmaceutical and Biomedical analysis, (オランダ), 2011, Vol.56, p.1057-1063）は、臨床応用のための、乾燥血液試料中のラニチジンを定量することを意図した方法について述べている。この方法は、質量分析法による分析に先立ってタンパク質を清浄化するステップを含むが、酵素消化のステップは含んでいない。
Rostingら（American Chemical Society, (米), 2015, Vol.87, p.7918-24）は、乾燥血液試料中のモデルタンパク質を検出する方法であって、質量分析法による分析の前に、酵素消化のステップとその後の固相抽出（ＳＰＥ）による前濃縮とを含む方法を開示している。
本発明者らはここに、ペプチド試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ調製の方法を開発したが、本方法は、変性、還元／アルキル化、少なくとも１つのポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマーを含んでいる固体担体でのクロマトグラフィによるタンパク質の清浄化、次いで酵素消化、のステップを連続して含んでいる。
本発明による方法は、少量の試料から多数の臨床マーカータンパク質を再現性良く検出することを可能とし、本方法は、固体試料又は血漿のような液体試料にうまく適用することが可能であり、かつ自動化することが可能である。質量分析法によるペプチド試料の分析は、タンパク質の検出における絶対的特異性という利点を有し、かつ基準の方法であると考えられる。本発明による調製方法と、その後の例えば質量分析法のような方法を使用する分析とにより、例えば免疫測定法のような臨床的に実証された試験にも統計的に匹敵する結果を得ることが可能となる。
従来技術の方法と比較すると、本発明による方法は、細胞内容物の放出及び多数を占めるタンパク質の存在による干渉を排除することを可能とし、それにより化合物の分析の感度、特異性及び分析性能を改善することを可能にする。
本発明によるペプチド試料を調製するための方法は、任意の種類の生物学的試料、特に血液試料、より具体的には固体の血液試料であって、該試料のための再現性が高く臨床的に実証された方法がまだ利用可能でないものの分析に適している。吸取紙型の固体担体の使用は、非侵襲性であり（指先から採取される）、運搬（特に郵送による）が容易であり、かつ実行が容易であることから、広く認められた血液採取方法であり、該方法は、対象者自身によって、又は特に資格の無い人物によって行われることが可能であり、かつ試料が乾燥により無害化されるので危険はない。固体担体上の試料に対して実行される本発明の方法により、特に複数のマーカーに関する対象者の長期モニタリングのための、低コストの分析が可能となる。そのような手法は、分析検査室の利用機会が限られている集団のモニタリングにとって、かつ将来的な遠隔医療の発展にとって、有望である。
第１の主題によれば、本出願は、生物学的試料からのペプチド試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ調製のための方法であって、以下の連続したステップすなわち、ａ）前記試料中に存在するタンパク質の変性ステップ、ｂ）ステップａ）で生じたタンパク質の還元及びアルキル化のステップ、ｃ）ステップｂ）で生じたタンパク質の、固体ポリマー担体上での逆相クロマトグラフィによる清浄化のステップであって、前記固体担体は、少なくとも１つのポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマーを含んでいるステップ、並びにｄ）ステップｃ）で生じたタンパク質の、プロテアーゼによる消化のステップ、を含んでいる方法に関する。
本発明による方法は、変性、還元及びアルキル化されたタンパク質を清浄化する少なくとも１つのステップ、並びに酵素消化のステップを含み、タンパク質を清浄化する前記ステップは、前記タンパク質の酵素消化のステップに先立って行われる。
「生物学的試料」とは、ヒト又は動物の身体に由来する組織及び細胞並びにそれらの派生物、特に以下の生成物、すなわち血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液、痰、生検材料、並びに任意の分泌物及び体液、を含んでいる試料を意味する。
本発明による方法の第１の特定の態様によれば、生物学的試料は液体形態の血液由来物であって、全血、血清及び血漿から選択されたものである。
本発明による方法の第２の特定の態様によれば、生物学的試料は固体形態又は乾燥形態の血液由来物であって、全血、血清及び血漿から選択されたものである。さらなる特定の態様によれば、生物学的試料は、乾燥血液スポット（ＤＢＳ）とも呼ばれる固体担体上に沈着させた乾燥全血である。
典型的には、そのような試料の取得は、体積３０～５０μＬの血液一滴を適切な固体担体上に沈着させることと、その後の乾燥ステップとで構成される。これならば試料の固体担体は扱いが容易であり、かつ特に普通郵便で送ることができる。
適切な固体担体の中では、「Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）９０３ペーパー」又は「Ａｈｌｓｔｒｏｍ ＴＦＮ／２２６ペーパー」などの、その上に血液を沈着させることができる吸取紙又は採取紙を挙げることができる。
「ポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマー」とは、ジビニルベンゼンによって架橋されたポリスチレンを含んでいるポリマーを意味する。ポリスチレン、すなわちポリ（１‐フェニルエチレン）は、スチレンモノマーの重合によって得られる。ジビニルベンゼン、すなわちＤＶＢは、架橋剤として使用される式Ｃ１０Ｈ１０の芳香族炭化水素である。
本発明による方法では、タンパク質の清浄化のための固体担体は、少なくとも１つのポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマーを、おそらくは別のポリマー又は任意の他の適切な要素と組み合わせて、含んでいる。
逆相クロマトグラフィのステップの固体担体は、一方では大きさが１０～５０ｍｍ、好ましくは２０～４０ｍｍ、及び好ましくは３０ｍｍであり、他方では細孔径が５００～１０，０００オングストローム、及び好ましくは２０００～４０００オングストロームである、ポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマービーズの存在を特徴とする。
本発明の方法に使用することが可能な、少なくとも１つのポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマーを含んでいる固体担体の中では、特に、アジレント（Agilent）が販売するＲＰ‐Ｗ（登録商標）カートリッジを挙げることができる。
前記ＲＰ‐Ｗ（登録商標）カートリッジは、本発明の方法とは非常に異なる方法及び適用での使用に関して説明されている。実際、従来技術の方法では、典型的には組換え抗体の生産の際の上記カートリッジの使用について、「脱塩」ステップ、すなわち具体的には抗体のトリプシン消化に先立って抗体の変性に必要な６Ｍグアニジンの除去を確実にするためのステップに関して説明される。
本発明による方法では、タンパク質の変性、還元、アルキル化及び酵素消化のステップは各々、適切な緩衝剤、濃度、温度及び継続時間の条件下で、当業者に周知の任意の方法によって行われる。好ましくは、変性は、タンパク質を変性させる作用薬、例えば８Ｍ尿素の添加によって行われ、還元は、タンパク質のジスルフィド結合を還元することができる作用薬、例えばＤＴＴの添加によって行われ、還元の際に放出されたシステインのアルキル化は、アルキル化剤、例えばヨード酢酸（ＩＡＡ）の添加によって行われる。
タンパク質の酵素消化は、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ‐Ｃ及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ‐Ｃから選択された少なくとも１つのプロテアーゼの添加によって行われることが好ましい。本発明による方法の特定の態様によれば、酵素消化は、２時間を超える継続時間で、好ましくは１０時間以上、好ましくは１４時間以上、好ましくは１４時間で行われる。
より具体的には、本発明による方法では、酵素消化は、存在する酵素の量と基質タンパク質の量との比が１／１０～１／２００、好ましくは１／５０～１／１００である状態で行われる。当分野を専門とする当業者は、前記の比を正確に確認かつ計算することができる。
前記第１の主題の別の特定の態様によれば、本出願は、固体形態又は乾燥形態の血液試料からペプチド試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製するための方法に関し、前記方法は、タンパク質の変性、還元及びアルキル化、清浄化並びにプロテアーゼによる消化のステップに先立って、前記固体血液試料からタンパク質を抽出するステップを含んでいる。
タンパク質の抽出は、当業者に周知の任意の抽出方法によって、特に試料と重炭酸アンモニウムとを周囲温度で、おそらくはオボアルブミンの存在下で、合わせることにより行われる。
第２の主題によれば、本出願は、生物学的試料の中の臨床マーカーと考えられる少なくとも１つのタンパク質の存在を検出するための方法に関し、前記検出方法は、本発明に従ってペプチド試料を調製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法と、その後の、前記試料中の少なくとも１つのタンパク質の存在を検出するステップとを含んでいる。
特定の実施形態によれば、本出願は、生物学的試料の中の少なくとも１つのタンパク質を検出及び定量する方法に関し、前記検出及び定量の方法は、本発明に従ってペプチド試料を調製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法と、その後の、前記試料中の少なくとも１つのタンパク質を検出及び定量するステップとを含んでいる。
前記少なくとも１つのタンパク質の検出及び／又は定量は、任意の既知の技術的手段によって、好ましくは質量分析法によって、より好ましくは質量分析法を液体クロマトグラフィと組み合わせて、すなわち液体クロマトグラフィ質量分析法（ＬＣ‐ＭＳ）によって、行われる。前記検出及び／又は定量のステップは、１つ、２つ又はそれ以上のタンパク質について実行することができる。前記質量分析法は、多重化して行うことが可能である。
複雑な生物学的試料の中のタンパク質のＬＣ‐ＭＳによる検出及び定量は、典型的には、ペプチド試料の調製、次に前記ペプチド試料のクロマトグラフィによる液相分離、その後の、タンパク質の質量分析法による分析と同定、おそらくは続いて定量、次いで結果の統計分析を含んでいる。
タンパク質の検出及び／又は定量は、対応する特異的タンパク質の検出を可能にする、標識又は非標識ペプチドで構成されている少なくとも１つの標準品を使用することにより行われる。前記標準品は当業者に良く知られており、当業者はこれを、対象とするタンパク質の性質に応じて市販の標準品から容易に選択することができる。
特定の実施形態によれば、本発明の主題は、以下のタンパク質すなわちアファミン、アルファ‐１アンチキモトリプシン、アルファ‐１Ｂ糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、アルファ‐１酸性糖タンパク質、アルブミン（ＡＬＢＵ）、アルファ‐２‐ＨＳ糖タンパク質、アルファ‐２アンチプラスミン、アルファ‐２マクログロブリン（Ａ２ＭＧ）、アンチトロンビン３（ＡＮＴ３）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ＡｐｏＢ１００）、アポリポタンパク質Ｃ２（ＡｐｏＣ２）、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アポリポタンパク質Ｍ、アポリポタンパク質（ａ）、アポリポタンパク質ａ１（ＡｐｏＡ１）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡｐｏＡ２）、アポリポタンパク質ａ４、ベータ‐２糖タンパク質１、ベータ‐２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ベータ‐Ａｌａ‐Ｈｉｓジペプチダーゼ、Ｃ４ｂ結合タンパク質（アルファ鎖）、ＣＤ５抗原様、ｃＤＮＡ‐ＦＬＪ５３３２７、セルロプラスミン（ＣＥＲＵ）、コリンエステラーゼ、クラステリン、凝固第Ｘ因子（ＣＦ‐Ｘ）、凝固第ＸＩ因子、凝固第ＸＩＩ因子、補体Ｃ１ｑ亜成分サブユニットＢ、補体Ｃ１ｑのサブユニットＣ、補体Ｃ１ｒ亜成分、補体Ｃ１ｓ亜成分、補体Ｃ２（Ｃ２）、補体Ｃ３（Ｃ３）、補体Ｃ４Ｂ（Ｃ４Ｂ）、補体Ｃ５、補体成分Ｃ８（ベータ鎖）、補体成分Ｃ９、補体Ｂ因子、補体Ｄ因子、補体Ｉ因子、シスタチンＣ（ＣｙｓＣ）、コルチコイド結合グロブリン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン（アルファ鎖）（ＦＩＢＡ）、フィブリノゲン（ベータ鎖）（ＦＩＢＢ）、フィブロネクチン、ファイブリン‐１、ゲルゾリン、ハプトグロビン、ヘモグロビンサブユニットアルファ、ヘモペキシン、ヘパリンコファクター２、インスリン様成長因子結合タンパク質の酸不安定サブユニット、インスリン様成長因子結合タンパク質３、ハプトグロビン（ＨＰＴ）、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢ３）、リポ多糖類結合タンパク質、ルミカン、ニューロピリン２、オロソムコイド（ＯＲＭ）、ＰＥＤＦ、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、ＡＭＢＰタンパク質、プロトロンビン、レチノール結合タンパク質４、セロトランスフェリン（ＴＲＡＮＳＦ）、血清アミロイドＡ４タンパク質、チロキシン結合グロブリン、トランスサイレチン（プレアルブミン）（ＴＴＨＹ）、バソリン、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＫ依存性プロテインＣ、ビタミンＫ依存性プロテインＳ、レチノール結合タンパク質４（ＲＥＴ４）、からなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質を検出し、おそらくは続いて定量するための方法である。
より具体的な実施形態によれば、本発明の主題は、上記に定義された群から選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０個又は４０個超のタンパク質を検出し、おそらくは続いて定量するための方法である。
第３の主題によれば、本出願は、本発明に従って生物学的試料からペプチド試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製するのに適したキットに関し、前記キットは少なくとも、
●タンパク質の変性に適した試薬、
●ジスルフィド結合の還元に適した試薬及びおそらくはアルキル化剤、
●タンパク質の酵素消化に適した試薬、並びに
●固体担体であってポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマーの一群から選択された少なくとも１つのポリマーを含んでいる固体担体上の逆相クロマトグラフィに適した試薬、
を含んでいる。
前記試薬は、当業者に良く知られた既存の試薬から選択される。
●タンパク質の変性に適した試薬、
●ジスルフィド結合の還元に適した試薬及びおそらくはアルキル化剤、
●タンパク質の酵素消化に適した試薬、並びに
●固体担体であってポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマーの一群から選択された少なくとも１つのポリマーを含んでいる固体担体上の逆相クロマトグラフィに適した試薬、
を含んでいる。
前記試薬は、当業者に良く知られた既存の試薬から選択される。
第４の主題によれば、本出願は、本発明に従って生物学的試料からペプチド試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製するための方法の使用に関する。特定の実施形態によれば、本出願は、本発明に従って生物学的試料の中の少なくとも１つのタンパク質を検出し、かつおそらくは定量するための方法の使用に関する。
特定の実施形態によれば、本発明の主題は、本発明に従って生物学的試料からペプチド試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製するための方法の使用、並びに／又は、本発明による検出及び可能性として定量の方法の使用であって、以下のタンパク質、すなわちアファミン、アルファ‐１アンチキモトリプシン、アルファ‐１Ｂ糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、アルファ‐１酸性糖タンパク質、アルブミン（ＡＬＢＵ）、アルファ‐２‐ＨＳ糖タンパク質、アルファ‐２アンチプラスミン、アルファ‐２マクログロブリン（Ａ２ＭＧ）、アンチトロンビン３（ＡＮＴ３）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ＡｐｏＢ１００）、アポリポタンパク質Ｃ２（ＡｐｏＣ２）、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アポリポタンパク質Ｍ、アポリポタンパク質（ａ）、アポリポタンパク質ａ１（ＡｐｏＡ１）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡｐｏＡ２）、アポリポタンパク質ａ４、ベータ‐２糖タンパク質１、ベータ‐２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ベータ‐Ａｌａ‐Ｈｉｓジペプチダーゼ、Ｃ４ｂ結合タンパク質（アルファ鎖）、ＣＤ５抗原様、ｃＤＮＡ‐ＦＬＪ５３３２７、セルロプラスミン（ＣＥＲＵ）、コリンエステラーゼ、クラステリン、凝固第Ｘ因子（ＣＦ‐Ｘ）、凝固第ＸＩ因子、凝固第ＸＩＩ因子、補体Ｃ１ｑ亜成分サブユニットＢ、補体Ｃ１ｑのサブユニットＣ、補体Ｃ１ｒ亜成分、補体Ｃ１ｓ亜成分、補体Ｃ２（Ｃ２）、補体Ｃ３（Ｃ３）、補体Ｃ４Ｂ（Ｃ４Ｂ）、補体Ｃ５、補体成分Ｃ８（ベータ鎖）、補体成分Ｃ９、補体Ｂ因子、補体Ｄ因子、補体Ｉ因子、シスタチンＣ（ＣｙｓＣ）、コルチコイド結合グロブリン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン（アルファ鎖）（ＦＩＢＡ）、フィブリノゲン（ベータ鎖）（ＦＩＢＢ）、フィブロネクチン、ファイブリン‐１、ゲルゾリン、ハプトグロビン、ヘモグロビンサブユニットアルファ、ヘモペキシン、ヘパリンコファクター２、インスリン様成長因子結合タンパク質の酸不安定サブユニット、インスリン様成長因子結合タンパク質３、ハプトグロビン（ＨＰＴ）、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢ３）、リポ多糖類結合タンパク質、 ルミカン、ニューロピリン２、オロソムコイド（ＯＲＭ）、ＰＥＤＦ、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、ＡＭＢＰタンパク質、プロトロンビン、レチノール結合タンパク質４、セロトランスフェリン（ＴＲＡＮＳＦ）、血清アミロイドＡ４タンパク質、チロキシン結合グロブリン、トランスサイレチン（プレアルブミン）（ＴＴＨＹ）、バソリン、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＫ依存性プロテインＣ、ビタミンＫ依存性プロテインＳ、レチノール結合タンパク質４（ＲＥＴ４）、で構成されている群から選択された少なくとも１つのタンパク質の、検出及び可能性として定量のための使用である。
より具体的な実施形態によれば、本発明の主題は、本発明に従って生物学的試料からペプチド試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製するための方法の使用、並びに／又は、本発明による検出及び可能性として定量の方法の使用であって、上記に定義された群から選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０個若しくは４０個超のタンパク質の検出及び可能性として定量のための使用である。
第５の主題によれば、本出願は、本発明に従って生物学的試料からペプチド試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製するための方法の使用であって、
●神経変性、特にアルツハイマー病、
●神経疾患又は精神疾患、特に多発性硬化症及び自閉症、
●欠損症、感染症、炎症又は栄養不良の状態、
●慢性疾患又は進行性の疾患、特にがん、肝炎又は代謝性疾患、
から選択された特定の健康状態又は疾患の検出及び／又はモニタリングのための使用に関する。
●神経変性、特にアルツハイマー病、
●神経疾患又は精神疾患、特に多発性硬化症及び自閉症、
●欠損症、感染症、炎症又は栄養不良の状態、
●慢性疾患又は進行性の疾患、特にがん、肝炎又は代謝性疾患、
から選択された特定の健康状態又は疾患の検出及び／又はモニタリングのための使用に関する。
特定の疾患又は健康状態の検出及び／又はモニタリングは、臨床マーカーと考えられる少なくとも１つのタンパク質の検出及び／又は定量を、おそらくは少なくとも１つの非タンパク質臨床マーカーの検出及び／又は定量と組み合わせて行うことにより、行うことができる。
特定の態様によれば、本出願の主題は、本発明に従って生物学的試料からペプチド試料をｉｎ ｖｉｔｒｏで調製するための方法の使用であって、対象者、特に高齢の対象者の健康、栄養及びフレイルの状態を検出及び／又はモニタリングするための使用である。高齢の対象者とは、７５歳以上、より特定すると８５歳以上の対象者を意味する。より具体的には、本発明の使用は、アルブミン、アルファ‐１酸性糖タンパク質、トランスサイレチン及びＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）から選択された１以上のタンパク質の検出及び／又は定量を含む。
本発明のその他の利点及び特性は、全く限定的ではない実施形態の詳細な説明、及び添付図面について検討すれば明白となろう。
ＤＢＳ試料から本発明に従ってペプチド試料を調製する方法の実施形態（図１Ａ）、及び血漿から従来技術に従ってペプチド試料を調製する方法の実施形態（図１Ｂ）を表わす図。
３つの異なるプロトコール、すなわちａ）乾燥血液試料に対して適用された本発明の方法（「ＤＢＳ ＲＰＷ」）、ｂ）血漿試料に対して適用された本発明の方法（「血漿」）、ｃ）従来技術に従ってＤＢＳ試料を調製するための方法（「標準的なＤＢＳ調製」）、に従って調製された試料に対して行われた、２６種の様々なタンパク質のＬＣ‐ＭＳ分析の結果を比較して示すヒストグラム。各タンパク質について、「ＤＢＳ ＲＰＷ」条件及び「血漿」条件での質量分析法による分析の際に得られた面積の値を、標準的な試料調製方法で得られた面積の対応する値でそれぞれ割る。ＬＯＧ（面積／標準的ＤＢＳ調製後の面積）がｙ軸上に表わされ、２６種のタンパク質各々についての結果が、「ＤＢＳ ＲＰＷ」を明色のヒストグラムとし、「血漿」を暗色のヒストグラムとしてｘ軸上に表わされている。
９５例の血漿試料中の、２種の血清タンパク質すなわちＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（図３Ａ）及びセロトランスフェリン（ＴＲＡＮＳＦ）（図３Ｂ）の定量についての比較を示す図。各タンパク質について、臨床的に実証された免疫測定法による定量の結果がｘ軸上に表され（ＣＲＰはｍｇ／Ｌ、ＴＲＡＮＳＦはｇ／Ｌ）、本発明による方法を使用して調製された試料の質量分析法による定量の結果はｙ軸上に表されている（任意の単位）。
本発明は以降の実施例を読めば一層よく理解されるが、該実施例は本発明を例証するために、かつ本発明の範囲を限定しないように、示されている。
実施例１：乾燥血液試料（ＤＢＳ）からのペプチド試料の調製及びＬＣ‐ＭＳによる比較分析。
本発明による方法の効率性について、ＬＣ‐ＭＳによる２６種のタンパク質の検出及び定量によって、本発明の方法を使用して処理されたＤＢＳ試料の分析（「ＤＢＳ‐ＲＰＷ」）及び、個々に、従来技術の方法を使用して処理された血漿試料の分析（「血漿」）を、ＤＢＳ試料から直接行われた分析（「標準的ＤＢＳ」）と比較することにより、評価した。本発明の方法のステップは図１Ａに図解されており、血漿から、かつ従来技術の方法に従って試料を調製する方法のステップは、図１Ｂに図解されている。実験は２連で行い、ＬＣ‐ＭＳ分析はそれぞれ２回行った。２６種のタンパク質は、以下すなわちＡ１ＢＧ、Ａ２ＭＧ、ＡＮＴ３、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＢ１００、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＥ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＲＵ、ＣＦ＿Ｘ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４Ｂ、ＣＲＰ、ＣｙｓＣ、ＦＩＢＡ、ＨＰＴ、ＦＩＢＢ、ＩＧＦＢ３、ＰＬＭＮ、ＯＲＭ、ＲＥＴ４、ＴＲＡＮＳＦ、ＴＴＨＹ、ＡＬＢＵである。
本発明による方法の効率性について、ＬＣ‐ＭＳによる２６種のタンパク質の検出及び定量によって、本発明の方法を使用して処理されたＤＢＳ試料の分析（「ＤＢＳ‐ＲＰＷ」）及び、個々に、従来技術の方法を使用して処理された血漿試料の分析（「血漿」）を、ＤＢＳ試料から直接行われた分析（「標準的ＤＢＳ」）と比較することにより、評価した。本発明の方法のステップは図１Ａに図解されており、血漿から、かつ従来技術の方法に従って試料を調製する方法のステップは、図１Ｂに図解されている。実験は２連で行い、ＬＣ‐ＭＳ分析はそれぞれ２回行った。２６種のタンパク質は、以下すなわちＡ１ＢＧ、Ａ２ＭＧ、ＡＮＴ３、ＡｐｏＡ１、ＡｐｏＡ２、ＡｐｏＢ１００、ＡｐｏＣ２、ＡｐｏＥ、Ｂ２Ｍ、ＣＥＲＵ、ＣＦ＿Ｘ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４Ｂ、ＣＲＰ、ＣｙｓＣ、ＦＩＢＡ、ＨＰＴ、ＦＩＢＢ、ＩＧＦＢ３、ＰＬＭＮ、ＯＲＭ、ＲＥＴ４、ＴＲＡＮＳＦ、ＴＴＨＹ、ＡＬＢＵである。
本発明によるＤＢＳ試料からの本発明による調製の方法「ＤＢＳ‐ＲＰＷ」は、以下のように行なわれる。タンパク質を抽出するために、「ＤＢＳパンチ」を、試料を含有している固体担体（２２６型の吸取紙）の打ち抜きを行うことによって得る。前記パンチを９６ウェルプレートに移し、次いで、２００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを添加した後にＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）の装置Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）Ｃｏｍｐａｃｔで卓上ミキサを使用して３５０ｒｐｍで３０分間撹拌することにより、タンパク質を抽出する。該試料を次に、２００μＬの８Ｍ尿素を添加して再度１０分間撹拌することにより変性させる。次いで試料中のタンパク質のジスルフィド結合を、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中で２００ｍＭとしたＤＴＴを２１μＬ、及び１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）を１２μＬ添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）のＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔを用いて３５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１時間撹拌することにより、還元する。次いで放出されたシステインを、１８μＬの１Ｍ ＩＡＡ、６μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０）を添加して３７℃で３０分間再度撹拌することにより、アルキル化する。アルキル化のステップを、２００ｍＭ ＤＴＴを２０μＬ添加して停止させる。次いで該試料を１０μＬのギ酸の添加により酸性化した後に、２１０μＬの上清を２つの新たなウェルに移す。
その後、試料を清浄化するステップを、アジレントが販売するＲＰ‐Ｗ（登録商標）カートリッジで行う。該カートリッジを、１００μＬのアセトニトリル（７０％）／ＴＦＡ（０．１％）／水（２９．９％）溶液を３００μＬ／分で用いて洗浄及び調整し、５０μＬの０．１％ギ酸溶液を１０μＬ／分で用いて平衡化する。試料をＲＰ‐Ｗカートリッジ（カタログ番号Ｇ５４９６‐６００８６）に５μＬ／分でロードする。カートリッジに含まれるＲＰ‐Ｗ相を、５０μＬの０．１％ＴＦＡ溶液を１０μＬ／分で用いて洗浄し、次にこの清浄化された試料を、２０μＬのアセトニトリル（７０％）／ギ酸（０．１％）／水（２９．９％）溶液を５μＬ／分で用いてカートリッジから溶離させる。溶離物を蒸発乾固させる（Ｓｐｅｅｄｖａｃ（商標））。この乾燥試料を、３７．４μＬの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）に再懸濁し、５．６μｇのトリプシン／ＬｙｓＣを添加してトリプシン消化を行う。この反応を、撹拌しながら（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔで３５０ｒｐｍ）３７℃で１４時間続ける。この消化反応を３μＬのギ酸の添加により停止させる。９６ウェルプレートをフィルムで密閉し、該試料のＬＣ‐ＭＳシステムに注入する準備が完了する。
「ＤＢＳ標準」試料の調製は以下のように行なわれる、すなわちランセットで指先を穿刺して得られた１滴又は２滴の毛細血管血を、各ＤＢＳ上に沈着させる。チューブに採取した静脈全血７０μＬを、ピペットを使用してＤＢＳ上に沈着させることも可能である。沈着させた後、そのカードを周囲温度で２時間放置乾燥させる。これを個別のプラスチック袋に入れ、使用法に応じて周囲温度で、４℃で、又は凍結して（－２０℃又は－８０℃）、保管することができる。分析の前に、カードを周囲温度に戻す。その後、各スポットについて直径６ｍｍのパンチを取り出して、２ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＬｏＢｉｎｄ（登録商標）チューブに移し入れる。
「血漿」試料の調製は以下のように行なわれる、すなわち該方法は図１Ｂに図解されているが同図は従来技術において既知の典型的な方法を表わしており、かつ下記ステップを含む。すなわち、液状であるか又は「Ｗｈａｔｍａｎ９０３ペーパー」若しくは「Ａｈｌｓｔｒｏｍ ＦＮ／２２６ペーパー」担体上に沈着している２μＬの血漿から、タンパク質を変性及び還元し、次いでアルキル化、酵素消化（トリプシン／ＬｙｓＣの存在下で３７℃にて１４時間）を行い、その後、得られたペプチドの清浄化のステップをＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８型のカラムで行い、続いてＬＣ‐ＭＳによる分析を行う。
結果を図２に示す。大多数のタンパク質について正の値が認められる。これは、標準的な方法と比較してより広い検出可能量（より高感度）であることを示しており、かつ標準的な血漿の値とＤＢＳ ＲＰＷの値との良好な一致も示されている。
全体として、本発明の方法を使用してＤＢＳ試料を処理した後（ＤＢＳ ＲＰＷ）に見出された質量分析の強度は、標準的ＤＢＳの後に直接得られたものより１９倍強度が高い。これらの強度は、大多数のタンパク質について、標準的な方法を使用して調製された血漿試料で得られた強度と一致する。
本発明に従ってペプチド試料を調製する方法について実証し、かつ同法の性能を規定するために、次の検討を行った。すなわち、患者からＤＢＳ上に採取された１０種の独立した試料（本発明によるＤＢＳ‐ＲＰＷ法）をこの検討に使用した。各患者について、２つのＤＢＳパンチを独立にかつ２連で分析した。このように独立にかつ２連で２回計測された、７６種のタンパク質に対応している９１種のペプチドの変動係数（ＣＶ）を計算した。これにより、ＤＢＳを分析するための方法全体（分析前及び分析上）のばらつきを評価することが可能となる。ペプチド全てについて得られたＣＶの中央値は９．３％である。ＣＶには２～５２％の幅がある。比較すると、同じ検討の間、ＤＢＳと同時に患者から採取した血漿について今回得られた全てのＣＶの中央値は６．７％であり、ＣＶの範囲は２～４８％であった。計測値の臨床的関連性を実証するために、血漿で得られた値（従って臨床医学に使用されている値）と、ＤＢＳで得られた値との間の相関を計算した。３５例のペプチドが「標準的な血漿」と「ＤＢＳ‐ＲＰＷ」との間の非常に強い相関（相関係数＞０．８）を示し、３２例が中程度の相関（０．６～０．８）を示し、２４例が弱い相関（＜０．６）を示している。
時系列で、かつ病状を特定せずに集めた９５人の様々な患者の血漿について、一方では本発明の方法を使用して調製された試料の質量分析により、かつ並行してモンペリエ病院の生化学部門の機器ＣＯＢＡＳ（登録商標）６０００（ロシュ・ダイアグノスティックス（Roche Diagnostic））を用いる免疫測定により、分析した。得られた結果を図３に示すが、それぞれＣＲＰ（図３Ａ）及びセロトランスフェリン（図３Ｂ）の分析である。２つの方法によって得られた結果についてＲソフトウェアを使用して比較した。この比較から、定量された２つのタンパク質各々について統計的に有意な相関が示されている。
従って、こうして得られた結果から、本発明によってペプチド試料を調製する方法を含んでいる分析方法の、臨床的関連性を実証することが可能となる。
Claims (9)
- 生物学的試料からのペプチド試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ調製のための方法であって、以下の連続したステップ、
ａ）前記試料中に存在するタンパク質の変性ステップ、
ｂ）ステップａ）で生じたタンパク質の還元及びアルキル化のステップ、
ｃ）ステップｂ）で生じたタンパク質の、固体ポリマー担体上での逆相クロマトグラフィによる清浄化のステップであって、前記固体担体は、少なくとも１つのポリスチレン‐ジビニルベンゼンポリマーを含んでいるステップ、並びに
ｄ）プロテアーゼによる、ステップｃ）で生じたタンパク質の消化のステップ、
を含む方法。 - 前記生物学的試料は、全血、血清及び血漿からなる群から選択された液体形態の血液試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記生物学的試料は、全血、血清及び血漿からなる群から選択された血液試料であること、前記試料は固体形態又は乾燥形態であること、並びに前記方法は、タンパク質の変性ステップに先立ち、固体形態又は乾燥形態の前記試料からの前記タンパク質の抽出ステップを含むこと、を特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 固体形態又は乾燥形態の前記血液試料は、採取紙、好ましくは吸取紙型の紙に沈着しているＤＢＳ（乾燥血液スポット）型の試料である、請求項３に記載の方法。
- プロテアーゼによるタンパク質の消化のステップは、トリプシン／エンドプロテイナーゼＬｙｓ‐Ｃが酵素量／基質タンパク質量の比を１／１０～１／２００、好ましくは１／５０～１／１００として存在する状態で、継続時間を２時間以上、好ましくは１０時間以上、好ましくは１４時間以上、好ましくは１４時間として行われることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
- ＤＢＳ型の試料はステップｄ）の際に、トリプシン／エンドプロテイナーゼＬｙｓ‐Ｃが酵素量／基質タンパク質量の比を１／５０～１／１００として存在する状態で、継続時間を２時間以上として処理される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
- 生物学的試料の中のタンパク質を検出又は定量する方法であって、請求項１～６のいずれか１項に記載のペプチド試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ調製のための方法と、その後の分析技法による、好ましくは質量分析法による、好ましくは液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ‐ＭＳ）技法による、少なくとも１つのタンパク質の検出又は定量のステップとを含む方法。
- 前記少なくとも１つのタンパク質は、以下のタンパク質、すなわちアファミン、アルファ‐１アンチキモトリプシン、アルファ‐１Ｂ糖タンパク質（Ａ１ＢＧ）、アルファ‐１酸性糖タンパク質、アルブミン（ＡＬＢＵ）、アルファ‐２‐ＨＳ糖タンパク質、アルファ‐２マクログロブリン（Ａ２ＭＧ）、アンチトロンビン３（ＡＮＴ３）、アポリポタンパク質Ｂ１００（ＡｐｏＢ１００）、アポリポタンパク質Ｃ２（ＡｐｏＣ２）、アポリポタンパク質Ｄ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アポリポタンパク質Ｍ、アポリポタンパク質（ａ）、アポリポタンパク質ａ１（ＡｐｏＡ１）、アポリポタンパク質Ａ２（ＡｐｏＡ２）、アポリポタンパク質ａ４、ベータ‐２糖タンパク質１、ベータ‐２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ベータ‐Ａｌａ‐Ｈｉｓジペプチターゼ、Ｃ４ｂ結合タンパク質（アルファ鎖）、ＣＤ５抗原様、ｃＤＮＡ‐ＦＬＪ５３３２７、セルロプラスミン（ＣＥＲＵ）、コリンエステラーゼ、クラステリン、凝固第Ｘ因子（ＣＦ‐Ｘ）、凝固第ＸＩ因子、凝固第ＸＩＩ因子、補体Ｃ１ｑ亜成分サブユニットＢ、補体Ｃ１ｑのサブユニットＣ、補体Ｃ１ｒ亜成分、補体Ｃ１ｓ亜成分、補体Ｃ２（Ｃ２）、補体Ｃ３（Ｃ３）、補体Ｃ４Ｂ（Ｃ４Ｂ）、補体Ｃ５、補体成分Ｃ８（ベータ鎖）、補体成分Ｃ９、補体Ｂ因子、補体Ｄ因子、補体Ｉ因子、シスタチンＣ（ＣｙｓＣ）、コルチコイド結合グロブリン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノゲン（アルファ鎖）（ＦＩＢＡ）、フィブリノゲン（ベータ鎖）（ＦＩＢＢ）、フィブロネクチン、ファイブリン‐１、ゲルゾリン、ハプトグロビン、ヘモグロビンサブユニットアルファ、ヘモペキシン、ヘパリンコファクター２、インスリン様成長因子結合タンパク質の酸不安定サブユニット、インスリン様成長因子結合タンパク質３、ハプトグロビン（ＨＰＴ）、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ１、インターアルファトリプシンインヒビター重鎖Ｈ２、インスリン様成長因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢ３）、リポ多糖類結合タンパク質、 ルミカン、ニューロピリン２、オロソムコイド（ＯＲＭ）、ＰＥＤＦ、プラスミノゲン（ＰＬＭＮ）、タンパク質ＡＭＢＰ、プロトロンビン、レチノール結合タンパク質４、セロトランスフェリン（ＴＲＡＮＳＦ）、血清アミロイドＡ４タンパク質、チロキシン結合グロブリン、トランスサイレチン（プレアルブミン）（ＴＴＨＹ）、バソリン、ビタミンＤ結合タンパク質、ビタミンＫ依存性プロテインＣ、ビタミンＫ依存性プロテインＳ、レチノール結合タンパク質４（ＲＥＴ４）から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
- 請求項１～８のいずれか１項に記載の方法の使用であって、
－神経変性、特にアルツハイマー病、
－神経疾患又は精神疾患、特に多発性硬化症及び自閉症、
－欠損症、感染症、炎症又は栄養不良の状態、
－慢性疾患又は進行性の疾患、特にがん、肝炎又は代謝性疾患、
から選択された健康状態の検出又は進行のモニタリングのためのペプチド試料の調製のための使用。
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